CN105274106A - 花生AhWRI-1启动子及制备方法和应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了AP2/EREBP类转录因子<i>AhWRI-1</i>基因启动子及其应用，属于生物技术领域。该启动子的核苷酸序列如SEQ？ID？NO.1中所示。本发明从花生中克隆出转录因子<i>AhWRI-1</i>基因的启动子，利用本发明提供的启动子构建重组表达载体，然后将所述表达载体利用农杆菌介导的方法转化拟南芥，启动下游重组基因在种子中特异性的表达，而在其它组织中不表达，是一个组织特异性的启动子。因此可将其应用于转基因工程中，使得目的基因表达产物在种子中积累，增加种子中的表达量，能发挥更好的效果，同时避免植物自身能量和物质的浪费，因此该启动子在基因工程育种及转基因研究中具有重要应用价值。

Description

花生AhWRI-1启动子及制备方法和应用

技术领域

本发明涉及植物基因工程和生物技术领域，具体涉及一种花生AP2/EREBP类转录因子AhWRI-1基因启动子，同时还涉及一种花生启动子P_AhWRI-1的制备方法及其在植物基因工程中的应用。

背景技术

通过转基因手段进行作物品种的选育，其优势在于转基因不受生物体亲缘关系的限制，理论上讲，用于转化的基因可以来源于任何物种或人工合成的基因。2014年全球转基因植物种植面积达到1.8亿公顷，年增长率在3％-4％之间，目前转基因技术已成为植物品种改良的重要手段。

在植物转基因中有两个必需元件，分别是启动子和基因。启动子是生物体内的一段DNA片段，是位于基因转录起始位点上游的顺式调控序列，与反式作用的识别因子结合，通过RNA聚合酶同反式作用因子相互作用，启动基因的转录。它是调控基因表达过程中的重要因子，其决定了动植物在发育过程中基因表达的空间、时间及表达强度的特异性。按照作用方式和功能，启动子可分为组成型、特异性和诱导性启动子，在某些情况下一类启动子也会兼有其它类型启动子的特性。

启动子在构建能够高水平表达异源表达载体的过程中起到关键作用，它决定了外源基因的转录效率和基因的表达水平。组成型启动子驱动的外源基因在转基因植株的所有发育时期和组织中稳定表达。对许多双子叶植物的转化，通常都使用含花椰菜花叶病毒(CaMV)的35S启动子或胭脂氨酸合成酶nos启动子的质粒载体，而在单子叶植物转化中最常用的是含有水稻肌动蛋白Act启动子、玉米泛素Ubi启动子及35S启动子的质粒载体。但是很多时候外源基因在受体植物中的持续高效表达不仅造成生物体内能源的浪费，而且在所有组织中的表达有可能对植株本身具有毒害作用，甚至引起转基因安全问题。因此，组织特异性启动子和诱导性启动子的研究和应用日益受到育种工作者的重视。

组织特异性启动子是指驱动的基因仅在某一特定组织或器官中表达，或者只是在植物生长发育过程中的某一个特定阶段表达。如根特异性启动子、拟南芥叶片特异性启动子、番茄果实特异性启动子、水稻花药特异性启动子、胚乳特异性启动子、棉花纤维特异性启动子等。特异性启动子不仅可以使得外源基因在受体中发挥作用，而且能有效减少对植物的不利影响。

花生是全世界范围内广泛种植的经济和油料作物，花生果仁中含有丰富的脂肪酸和蛋白，是重要的油脂和蛋白来源。花生油中脂肪酸主要是由不饱和脂肪酸油酸和亚油酸构成，两者占花生油总脂肪酸含量的80％左右，是一种较为健康的食用油，在世界食用油消费和休闲食品供应中占据重要地位。随着人民生活水平的提高，花生的营养保健功能日益受到重视，食品加工占总产量的比例进一步增加。而随着城市化的推进，耕地面积不断减少，这要求我们需要进一步提高花生的产量和品质。转基因技术的日益成熟为提高花生产量和品质提供了新的途径，但是面临着转基因的安全风险。在转基因研究中使用特异性表达的启动子是解决这一风险的可行性方法。

发明内容

本发明的目的在于：提供一种P_AhWRI-1启动子序列及其制备方法。该启动子的时空表达模式可用于研究基因的表达形式，优点在于，来源于植物内源的组织特异性启动子能够精确定位所调控的基因，驱动目的基因在转基因植物的特定组织或时期表达，避免造成植物自身能源和物质的浪费，提高外源基因在转基因植物中的表达效率，限制其表达部位，更好的发挥功能，可应用于植物基因工程研究和花生的转基因研究。

本发明的另一个目的在于：提供一种花生P_AhWRI-1的制备方法，该方法通过对花生基因组DNA进行PCR扩增，获得花生P_AhWRI-1启动子，该方法操作简单，结果稳定可靠。

本发明的再一个目的在于：提供一种含有植物高效表达启动子的重组载体，其含有所述的启动子核苷酸序列。该载体大小适合，在植物中易与转化，所带有的标记基因GUS表达强度高，容易检测。

本发明还有一个目的在于：提供一种花生P_AhWRI-1启动子在种子中的应用。

为了完成上述目的，本发明采用如下技术方案：

一种分离的花生转录因子AhWRI-1基因的启动子，其序列为下列核苷酸序列之一：

(a)序列表中SEQIDNO.1所示的核苷酸序列；

(b)在严谨条件下能与(a)的DNA序列杂交并且具有相同功能的核苷酸序列；

(c)与(a)或(b)的DNA序列具有90％以上的同源性，并且具有启动子功能的核苷酸序列。

一种花生启动子P_AhWRI-1的制备方法，包括以下步骤：

(1)利用SDS裂解法提取基因组DNA，所用引物为：

P_AhWRI-1S：5＇-ACGCGTCGACCCCTAACCGTTCTATCTCTTTTCTCCCAC＇-3＇；

P_AhWRI-1A：5＇-CGCGGATCCCTCACCACCACCACCACCACCCTC-3＇；

(2)以基因组DNA为模板，以P_AhWRI-1S、P_AhWRI-1A为引物进行PCR扩增，反应体系为25μL，包括：1×PCRbuffer、MgCl₂1.5mmol/L、dNTP0.2mmol/L、PfuTaq酶1.5单位、模板30～100ng，体系中每种引物的浓度均为0.5mol/L；

扩增过程为：95℃预变性1min；94℃变性10s，55℃退火30s，72℃延伸2min，35个循环；72℃延伸10min；

(3)PCR产物经质量体积比1.0％的琼脂糖凝胶检测，用凝胶回收试剂盒回收目的片段；按目的片段、pMD18-T载体3:1的摩尔比混合，加入5个单位的T₄DNA连接酶，10×反应缓冲液2.5μL，用无菌水补充体积至25μL，16℃连接过夜，获得连接液；

(4)用冻融法转化DH5ɑ菌株的感受态细胞，将连接液涂布于含有氨苄青霉素50mg/L的LB固体培养基平板上，37℃培养过夜，挑选白斑，进行菌落PCR检测，将阳性重组子接种于含氨苄青霉素50μg/mL的LB液体培养基中，37℃200r/min振荡培养过夜，用小量碱法提取质粒，SalⅠ/XbaⅠ双酶切1μg质粒，用0.8％的琼脂糖凝胶电泳检测；将检测正确的阳性重组质粒克隆，将目的片段连入pMD18-T载体，获得载体pMD18-P_AhWRI-1，即得到所述的P_AhWRI-1启动子。

其中LB固体培养基的制备方法如下：分别称取10g胰蛋白胨、5g酵母提取物、10g氯化钠和8g琼脂依次溶解于蒸馏水中，定容于1000mL；然后分装于500mL三角瓶中，121℃、6.859×10⁴Pa下高压消毒15分钟，4℃冷藏备用。

其中LB液体培养基的制备方法如下：分别称取10g胰蛋白胨、5g酵母提取物和10g氯化钠溶解于蒸馏水中，定容于1000mL，然后分装于500mL三角瓶中，121℃、6.859×10⁴Pa下高压消毒15分钟，4℃冷藏备用。

一种含有AhWRI-1基因的启动子的重组载体。

所述的花生AhWRI-1基因启动子的重组载体的构建方法，包括以下步骤：

首先用SalⅠ/XbaⅠ双酶切克隆载体pMD18-P_AhWRI-1，同时用SalI/XbaI双酶切pBI-P_AhSAD-GUS质粒；酶切反应在37℃培养箱中进行，反应4～6小时后用质量体积比为1％的琼脂糖胶电泳检测；

将克隆载体pMD18-P_AhWRI-1酶切下的3Kb的小片段和pBI-P_AhSAD-GUS酶切下的10Kb的大片段用DNA凝胶回收试剂盒回收；按3Kb的小片段、10Kb的大片段以摩尔浓度3:1的比例混合，加入T4DNA连接酶5个单位、10×反应缓冲液2μL，用无菌水补充体积至20μL，16℃过夜；

用冻融法转化DH5ɑ菌株的感受态细胞，在含有卡那霉素的LB固体培养基平板上筛选，16小时后挑取正常生长的菌斑进行菌落PCR检测，挑取阳性菌落提质粒，经酶切验证对正确的重组质粒命名为pBI-P_AhWRI-1。

所述的启动子在种子中的应用。

本发明的积极有益效果(优点)：

1、本发明的启动子的时空表达模式可用于研究基因的表达形式，优点在于，来源于植物内源的组织特异性启动子能够精确定位所调控的基因，驱动目的基因在转基因植物的特定组织或时期表达，避免造成植物自身能源和物质的浪费，提高外源基因在转基因植物中的表达效率，限制其表达部位，可应用于植物基因工程研究和花生的转基因研究中。

2、本发明的启动子能够调控下游GUS基因表达，并通过组织化学分析，获得具有种子中表达功能的花生启动子。这一具有组织特异性表达的启动子在植物基因工程和转基因安全中具有应用价值，如改良种子营养成份、提高种子含油量、改良脂肪酸组份、食用、限制外源基因扩散等方面。

3、本发明克隆到花生来源的启动子P_AhWRI-1，从改善种子的营养品质、提高种子含油量、改良种子脂肪酸组份、转基因安全性防控等方面考虑，这种启动子具有应用潜力。用P_AhWRI-1替换pBI-P_AhSAD-GUS质粒上的P_AhSAD启动子，构建pBI-P_AhWRI1重组植物表达载体，其中的GUS基因受P_AhWRI-1的调控。通过转基因实验证明，该启动子在种子中高强度特异性的驱动GUS基因的表达，以及在其它组织中完全不驱动GUS基因表达，可以用此启动子代替CaMV35S强启动子驱动与种子发育、改善种子品质相关的基因和提高含油量相关的基因，使得该基因在种子中过量表达，创制出营养丰富、含油量更高、脂肪酸组份构成更健康、品质更高的种子；构建含有该启动子驱动的致死基因的载体，转化受体植株，人工创制种子致死型转基因植株，防控外源基因扩散，可应用于转基因植株的安全防控领域。

4、本发明的基因启动子P_AhWRI-1制备方法，操作简单、结果稳定可靠，易于实施；提供的含有该启动子核苷酸序列植物的重组载体，大小适合，在植物中易与转化，所带有的标记基因GUS表达强度高，容易检测。通过该载体转化拟南芥可以获得GUS基因在植物中高效表达的拟南芥转基因植株。

附图说明

图1为本发明中的一种PCR扩增P_AhWRI-1片段电泳图；

泳道1为PCR扩增结果；泳道M代表500bpladder的核酸Marker；

图2为本发明中的一种AhWRI-1基因的5′RACE电泳图；

泳道1代表AhWRI-1的5′RACE；泳道M代表500bpladder的核酸Marker。

图3为本发明中的一种构建的pBI-P_AhWRI-1载体示意图；

图4为本发明中的一种构建的pBI-P_AhWRI-1载体的酶切验证图；

泳道M代表500bpladder的核酸Marker；泳道1为SalI/BamHI双酶切后的效果图。

图5为本发明中的转化载体pBI-P_AhWRI-1的部分转基因拟南芥植株PCR鉴定图；

泳道M代表500bpladder的核酸Marker；泳道P代表pBI-P_AhWRI-1质粒的PCR扩增结果；泳道CK代表野生型拟南芥的PCR扩增结果；泳道1-10代表部分阳性株的PCR扩增结果。

图6为本发明中的P_AhWRI-1驱动GUS的转基因植株的组织化学染色结果。

A：1日苗(无色)；B：2日苗(无色)；C：5日苗(无色)；D：10日苗(无色)；E：15日苗(无色)；F：花序和茎生叶(无色)；G：花(无色)；H：种子(蓝色)；I：果皮(无色)。

具体实施方式

以下实施例可以更好地理解本发明，但所述实施例并不表示对本发明的任何限制。

实施例1：一种分离的花生P_AhWRI-1启动子的制备方法，包括以下步骤：

(1)利用SDS裂解法提取基因组DNA

本发明所用花生(ArachishypogeaeL.)供试材料播种于大田，田间正常管理。利用SDS裂解法(J.萨姆布鲁克.D.W.拉塞尔著，黄培堂等译，分子克隆实验指南(第三版)科学出版社)提取基因组DNA。

所用引物为：

P_AhWRI-1S：5＇-ACGCGTCGACCCCTAACCGTTCTATCTCTTTTCTCCCAC-3＇，

P_AhWRI-1A：5＇-CGCGGATCCCTCACCACCACCACCACCACCCTC-3＇；

(2)以基因组DNA为模板，进行PCR扩增。反应体积为25μL，体系如下：10×buffer(不含MgCl₂)2.5μL，dNTPsmixture(10mmol/L)1.0μL，引物P_AhWRI-1S(10μmol/L)2.5μL，引物P_AhWRI-1A(10μmol/L)2.5μL，Taq酶(5单位/μl)0.2μL，模板约100ng。

反应步骤为：95℃预变性1min；94℃变性10s，55℃退火30s，72℃延伸2min，35个循环；72℃延伸10min。

(3)PCR产物经1.0％(质量体积比)琼脂糖凝胶检测(图1)，凝胶回收试剂盒回收目的片段。按回收片段：载体(0.3pmo1回收片段：0.1pmol载体)＝3:1的比例混合样品，加入T₄DNA连接酶5个单位，10×反应缓冲液2.5μL，用无菌水补充体积至25μL，16℃连接过夜，获得连接液。

(4)冻融法转化DH5ɑ菌株的感受态细胞。将连接液涂布于含有氨苄青霉素50mg/L的LB固体培养基平板上，37℃培养过夜，各挑选白斑3个，做菌落PCR检测；PCR反应体系为25μL，内含：1×PCRbuffer、MgCl₂1.5mmol/L、dNTP0.2mmol/L、引物浓度为0.5mol/L，Pfu酶1.5单位，用灭菌牙签挑取少量菌斑做模版，根据具体情况设置循环参数；

将阳性重组子接种于含氨苄青霉素50μg/mL的LB液体培养基，37℃200r/min振荡培养过夜，小量碱法(J.萨姆布鲁克.D.W.拉塞尔著，黄培堂等译，分子克隆实验指南(第三版)科学出版社)提取质粒，SalⅠ/XbaⅠ酶切质粒1μg，0.8％琼脂糖凝胶电泳检测。检测将目的片段正确连入pMD18-T载体的阳性重组克隆，得到P_AhWRI-1启动子。

其中LB固体培养基配方如下：分别称取10g胰蛋白胨、5g酵母提取物和10g氯化钠、8g琼脂依次溶解于蒸馏水中，定容于1000毫升，然后分装于500毫升三角瓶中，121℃、6.859×10⁴Pa下高压消毒15分钟，4℃冷藏备用；

LB液体培养基配方如下：分别称取10g胰蛋白胨、5g酵母提取物和10g氯化钠溶解于蒸馏水中，定容于1000mL；然后分装于500mL三角瓶中，121℃、6.859×10⁴Pa下高压消毒15分钟，4℃冷藏备用。

为了确保载体中启动子的序列信息，以M13F/M13R(M13F：5＇-AGCGGATAACAATTTCACACAGGA-3＇；M13R：5＇-GTAAAACGACGGCCAGT-3＇)为引物，将pMD18-P_AhWRI-1进行测序，分析结果，获得了P_AhWRI-1，其序列为SEQIDNO:1所示的核苷酸序列。

分离的花生P_AhWRI-1启动子的鉴定：

根据RACE试剂盒(SMART^TMRACEcDNAAmplificationKit，购自Clontech公司，货号：634941)操作说明，以花生叶片RNA为模版合成first-strand(第一链)cDNA，步骤如下：取1.0-2.75μLRNA，1.0μL5ˊCDSPrimerA，加ddH₂O补齐至3.75μL；72℃温浴3min，42℃冷却2min，加入1μLSMARTerⅡAoligo，加入5.25μL混合液(含5×first-strand(第一链)buffer2.0μL、1.0μLDTT、1.0μLdNTPsmixture、0.25μLRNaseInhibitor以及1.0μLSMARTScribeReverseTranscriptase)，42℃温浴90min，72℃加热10min以终止反应，获得first-strandcDNA模板的储存液。加入100μLEDTA稀释，得到first-strandcDNA模板的工作液；

以first-strandcDNA模板的工作液为模板进行两轮PCR反应，第一轮PCR以GSP1和UPM为引物，GSP1引物：5′–GTCCCACAGATGAGCTTCAAACCTCCCT–3′；

UPM引物：5′–CTAATACGACTCACTATAGGGCAAGCAGTGGTATCAACGCAGAGT–3′；反应体系如下：10×buffer(含MgCl₂)5μL，dNTPsmixture(浓度各2.5mmol/L)1.0μL，GSP1(浓度10μmol/L)2.5μL，UPM(浓度10μmol/L)5.0μL，Taq酶(5U/μL)0.2μL，first-strandcDNA模板的工作液2.5μL，无菌水补至50μL。反应程序如下：94℃预变性1min；98℃变性10s，72℃延伸2min，共7个循环；98℃变性10s，68℃延伸2min，共33个循环；72℃延伸10min。

第二轮PCR：以第一轮PCR的反应产物50倍的稀释液作为模板，以GSP2和NUP为引物进行扩增，反应体系如下：10×buffer(含MgCl₂)5μL，dNTPsmixture(浓度各2.5mmol/L)1.0μL，GSP2(浓度10μmol/L)2.5μL，NUP(浓度10μmol/L)2.5μL，Taq酶(5U/μL)0.2μL，模板溶液1.0μL，无菌水补至50μL，反应程序同第一轮PCR。PCR产物用1.0％的(质量体积比，以下相同)琼脂糖凝胶电泳检测，PCR扩增结果如图2。

GSP2引物：5′–TGTCCACCTATGCCTGGTTACTCCTCTGT–3′；

NUP引物：5′–AAGCAGTGGTATCAACGCAGAGT–3′。

凝胶回收试剂盒(购自天根生化科技北京有限公司，以下相同)纯化回收后，连接到pMD18-T载体(购自TaKaRa公司，以下相同)，转化大肠杆菌DH5ɑ菌株的感受态细胞(购自大连宝生物工程有限公司，以下相同)，转化后的感受态均匀涂在氨苄青霉素LB固体培养基(50mg/L)上，培养16小时后挑取阳性菌斑，并在氨苄青霉素LB液体培养基(50mg/L)中扩繁，提取质粒并经酶切验证后以M13F/M13R为引物，经测序后和SEQIDNO:1所示核苷酸序列比对，两者完全同源，证明所获得的SEQIDNO:1所示核苷酸序列是花生P_AhWRI-1启动子。M13F：5＇-AGCGGATAACAATTTCACACAGGA-3＇；

M13R：5＇-GTAAAACGACGGCCAGT-3＇。

实施例2：花生P_AhWRI-1植物表达载体的构建和根癌农杆菌菌株EHA105(购于上海沪尚生物科技有限公司)的转化构建重组载体，是将质粒pBI-P_AhSAD-GUS(质粒pBI-P_AhSAD-GUS，河南省农业科学院经济作物研究所保存，下同)上的P_AhSAD启动子序列用克隆得到P_AhWRI-1片段替换获得。

为完成此目的，首先用SalⅠ/XbaⅠ双酶切克隆载体pMD18-P_AhWRI-1，同时用SalⅠ/XbaⅠ双酶切pBI-P_AhSAD-GUS质粒；酶切反应在37℃培养箱中进行，约反应4～6小时后，用1％(质量体积比，下同)的琼脂糖胶电泳检测。

将克隆载体pMD18-P_AhWRI-1酶切下的约3Kb的片段和pBI-P_AhSAD-GUS酶切下的约10Kb的片段用DNA凝胶回收试剂盒回收。按照pMD18-P_AhWRI-1酶切下的约3Kb的片段和pBI-P_AhSAD-GUS切下的约10Kb的片段(150ng3Kb的片段：50ng10Kb的片段)＝3:1的比例(摩尔浓度比)混合样品，加入T4DNA连接酶5个单位，10×反应缓冲液2μL，无菌水补充体积至20μL，16℃连接，过夜，获得连接液。

冻融法转化连接液至DH5ɑ菌株的感受态细胞，在含有卡那霉素(50μg/mL)的固体LB培养基平板上筛选，16小时后挑取正常生长的菌斑进行菌落PCR，挑取阳性菌落提质粒，经酶切验证正确的重组质粒，命名为pBI-P_AhWRI-1；构建成植物表达载体pBI-P_AhWRI-1(图3、图4)。

利用冻融法将pBI-P_AhWRI-1转入根癌农杆菌EHA105，用卡那霉素(50μg/mL)和利福平(50μg/mL)双抗性平板筛选，48小时后挑斑，菌落用PCR检测验证，挑取阳性菌斑，保存菌株，命名为pBI-P_AhWRI-1EHA105。

其中的冻融法步骤如下：(1)取0.2mL农杆菌EHA105感受态，于冰水中缓慢融化；(2)加入约2μg重组质粒DNA,轻轻混匀，冰浴30min后,投入液氮速冻5min，然后37℃水浴5min，融化细胞；(3)加入800μL不含抗生素的LB液体培养基，28℃轻摇培养4～5h；(4)12000rpm离心30s,去上清,细胞重悬于0.2mL的LB培养基中；(5)将培养物均匀涂布在含Rif(50mg/L)、Str(50mg/L)和Kan(50mg/L)的琼脂板上，28℃培养2天，待平板上出现转化子后挑菌，进行PCR检测。

实施例3：P_AhWRI-1植物表达载体pBI-P_AhWRI-1在拟南芥中的遗传转化及转基因植株筛选

参照文献中的方法进行拟南芥转化(ZhangX.R,etal.Agrobacterium-mediatedtransformationofArabidopsisthalianausingthefloraldipmethod.Nature,2006,1:1-6)。制备含有植物表达载体pBI-P_AhWRI-1的根癌农杆菌EHA105菌液，在转化拟南芥前一天，将pBI-P_AhWRI-1EHA105转入含有卡那霉素50μg/mL、利福平50μg/mL的LB液体培养基200mL中，28℃、220r/min过夜培养。第二天，用紫外分光光度计(SPEKOL1300)于276纳米波长下检测菌液的吸光值，当菌液的吸光值在1.6～2.0之间时取出。室温(20～25℃，下同)以4000g离心10min，弃上清，沉淀悬浮于等体积的5％蔗糖溶液中(质量体积比)。将浑浊的蔗糖溶液倒入直径为15cm的培养皿中，转化前加入终浓度为0.02％(体积比)的SilwetL-77(购自北京五洲元业科贸中心)，混匀。把待转化的拟南芥整个花序轻轻的浸没在蔗糖中，15秒后取出植株花序。转化后的植株用黑色塑料袋包好，放在植物生长箱中培养。

第二天将塑料袋揭开，隔一周再做一次转化。培养一个月左右收获种子，将种子在培养箱或日光下干燥3～5天。将转化收获的T0代种子用70％(体积比)的酒精和0.01％(质量比)的升汞分别消毒3分钟和10分钟，然后用蒸馏水洗涤数次(5～7次)，均匀地吹打到含卡那霉素(50mg/L)的MS固体筛选培养基表面(MS固体筛选培养基组成：MS大量元素母液100mL；MS微量元素母液10mL；MS有机母液10mL；MS铁盐10mL；肌醇10mL；蔗糖30g；用1mol/L的NaOH调pH至5.8，8g琼脂粉，定容至1L，121℃，6.859×10⁴Pa下高压消毒15分钟，备用。各种母液配方见表1)。4℃避光放置3～5天后，转入植物生长培养箱【光周期16(白天)/8(黑暗)小时，温度：白天22℃，黑夜20℃】培养。根据表达载体上所特有的卡那霉素抗性筛选阳性苗。

表1MS培养基母液配方

当叶片长到足够大时(3～4叶期)，取少许绿苗叶片，提取DNA，进行PCR阳性检测，反应体系为25μL，内含：1×PCRbuffer，MgCl₂1.5mmol/L，dNTP0.2mmol/L、引物浓度为0.5mol/L，Pfu酶1.5单位，模板约100ng；

所用引物为：

P_AhWRI-1S：5＇-ACGCGTCGACCCCTAACCGTTCTATCTCTTTTCTCCCAC-3＇，

P_AhWRI-1A：5＇-CGCGGATCCCTCACCACCACCACCACCACCCTC-3＇；

根据具体情况设置循环参数，结果表明获得了转基因阳性苗。

将获得的转基因阳性苗进行培养，待绿苗长出两片真叶后，将其移栽到蛭石中，待植株长出花序后，取一片真叶用SDS方法提取基因组DNA，做PCR鉴定。PCR鉴定时采用的引物序列为P_AhWRI1S和P_AhWRI1A；

PCR反应体系如下：基因组DNA模板1μL(约50ng)、10×Taq酶反应缓冲液2uL、25mmol/L的MgCl₂1.2uL、2mmol/L的dNTP1.5uL、10umol/L引物各0.2uL、0.3单位Taq酶，加无菌水至20μL。

反应程序为：94℃预变性5min，94℃变性45s、55℃退火45s、72℃延伸2min，32个循环，72℃延伸5min。用1％琼脂糖凝胶电泳检测PCR反应产物，结果表明：P_AhWRI-1植物表达载体pBI-P_AhWRI-1的T-DNA区段已经成功转入拟南芥(图5)，共获得30株阳性苗。

实施例4：花生P_AhWRI-1启动子的功能分析

本发明首次克隆得到P_AhWRI-1的序列，并对其进行了功能分析。从实施例3中，采用拟南芥转化及PCR检测步骤中筛选得到的阳性苗T1代，自交收获种子(即T2代)。取T2代10个株系的不同时期组织进行GUS染色。

T2代取染色过程如下：将样品浸泡在GUS染液中，抽真空5分钟，37℃过夜。第二天用酒精-乙酸溶液(体积比为1:1)进行脱色，直至叶片变为无色，之后用50％的酒精漂洗3-5次，体式显微镜(OLYMPUSSZX16)拍照。苗期取不同时间段的整个植株；生殖生长期，取嫩叶、成熟叶片、开过的花朵、未开的花蕾、不同时期的角果及幼胚，开花后的幼胚用解剖针在显微镜下取出。植株被染成蓝色的部位就是GUS基因表达的部位。其中GUS染液的组成为：X-gluc0.5mg/mL，磷酸缓冲液50mmol/L，铁氰化钾和亚铁氰化钾各0.5mmol/L，EDTA10mmol/L，Triton-x-1000.001％(体积比)，甲醇20％(体积比)。

染色结果发现(表2、图6)：在拟南芥的整个生长过程中，只有种子被染成蓝色在其它组织中未出现蓝色。由此可见，该启动子驱动的GUS基因主要在种子中表达，其它组织中不表达。

实验结果表明，花生P_AhWRI-1启动子具有如下生物学功能：该启动子驱动的GUS基因在拟南芥的种子中特异性的表达，在其它组织中不表达。P_AhWRI-1调控下的GUS基因具有一定时空表达特性，这说明P_AhWRI-1具有驱动下游报告基因GUS在受体植物中表达的功能。在该启动子的调控下，GUS基因能够主要在转基因植株的种子中精细表达，而在其它组织中完全不表达。

这一具有组织特异性表达的启动子在植物基因工程和转基因安全(改良种子营养成份、提高种子含油量、改良脂肪酸组份、食用、限制外源基因扩散)中具有应用价值。如利用该启动子驱动改善种子营养或增加含油量的目的基因，首先构建P_AhWRI-1驱动目的基因的过表达载体，转化受体植株，则目的基因在P_AhWRI-1启动子的驱动下，只在种子表达，可以提高目的基因在上述组织中的表达量，在其它组织中完全不表达，导致种子按照设计者的方案增加营养成份或高含油量表型，节省了植株的能量，提高了效率；构建含有该启动子驱动的致死基因的载体，转化受体植株，人工创制种子致死转基因植株，防控基因扩散，可应用于转基因植株的安全防控领域。

表2P_AhWRI-1转基因拟南芥T2代株系的GUS染色统计表

注：Y表示蓝色，N表示无色。

Claims (7)

1.一种分离的花生转录因子AhWRI-1基因的启动子，其特征在于，其序列为下列核苷酸序列之一：

（a）序列表中SEQIDNO.1所示的核苷酸序列；

（b）在严谨条件下能与（a）的DNA序列杂交并且具有相同功能的核苷酸序列；

（c）与（a）或（b）的DNA序列具有90%以上的同源性，并且具有启动子功能的核苷酸序列。

2.一种花生启动子P _AhWRI-1 的制备方法，其特征在于，该方法包括以下步骤：

（1）利用SDS裂解法提取基因组DNA，所用引物为：

P _AhWRI-1 S：5＇-ACGCGTCGACCCCTAACCGTTCTATCTCTTTTCTCCCAC＇-3＇；

P _AhWRI-1 A：5＇-CGCGGATCCCTCACCACCACCACCACCACCCTC-3＇；

（2）以基因组DNA为模板，以P _AhWRI-1 S、P _AhWRI-1 A为引物进行PCR扩增，反应体系为25μL，包括：1×PCRbuffer、MgCl₂1.5mmol/L、dNTP0.2mmol/L、PfuTaq酶1.5单位、模板30~100ng，体系中每种引物的浓度均为0.5mol/L；

扩增过程为：95℃预变性1min；94℃变性10s，55℃退火30s，72℃延伸2min，35个循环；72℃延伸10min；

（3）PCR产物经质量体积比1.0%的琼脂糖凝胶检测，用凝胶回收试剂盒回收目的片段；按目的片段、pMD18-T载体3:1的摩尔比混合，加入5个单位的T₄DNA连接酶，10×反应缓冲液2.5μL，用无菌水补充体积至25μL，16℃连接过夜，获得连接液；

（4）用冻融法转化DH5ɑ菌株的感受态细胞，将连接液涂布于含有氨苄青霉素50mg/L的LB固体培养基平板上，37℃培养过夜，挑选白斑，进行菌落PCR检测，将阳性重组子接种于含氨苄青霉素50μg/mL的LB液体培养基中，37℃200r/min振荡培养过夜，用小量碱法提取质粒，SalⅠ/XbaⅠ双酶切1μg质粒，用0.8%的琼脂糖凝胶电泳检测；将检测正确的阳性重组质粒克隆，将目的片段连入pMD18-T载体，获得载体pMD18-P _AhWRI-1 ，即得到所述的P _AhWRI-1 启动子。

3.如权利要求2所述的花生P _AhWRI-1 启动子的制备方法，其特征在于，其中LB固体培养基的制备方法如下：分别称取10g胰蛋白胨、5g酵母提取物、10g氯化钠和8g琼脂依次溶解于蒸馏水中，定容于1000mL；然后分装于500mL三角瓶中，121℃、6.859×10⁴Pa下高压消毒15分钟，4℃冷藏备用。

4.如权利要求2所述的花生P _AhWRI-1 启动子的制备方法，其特征在于，其中LB液体培养基的制备方法如下：分别称取10g胰蛋白胨、5g酵母提取物和10g氯化钠溶解于蒸馏水中，定容于1000mL，然后分装于500mL三角瓶中，121℃、6.859×10⁴Pa下高压消毒15分钟，4℃冷藏备用。

5.一种含有权利要求1所述的AhWRI-1基因的启动子的重组载体。

6.如权利要求5所述的花生AhWRI-1基因启动子的重组载体的构建方法，其特征在于，该方法包括以下步骤：

首先用SalⅠ/XbaⅠ双酶切克隆载体pMD18-P _AhWRI-1 ，同时用SalI/XbaI双酶切pBI-P _AhSAD -GUS质粒；酶切反应在37℃培养箱中进行，反应4~6小时后用质量体积比为1%的琼脂糖胶电泳检测；

将克隆载体pMD18-P _AhWRI-1 酶切下的3Kb的小片段和pBI-P _AhSAD -GUS酶切下的10Kb的大片段用DNA凝胶回收试剂盒回收；按3Kb的小片段、10Kb的大片段以摩尔浓度3:1的比例混合，加入T4DNA连接酶5个单位、10×反应缓冲液2μL，用无菌水补充体积至20μL，16℃过夜；

用冻融法转化DH5ɑ菌株的感受态细胞，在含有卡那霉素的LB固体培养基平板上筛选，16小时后挑取正常生长的菌斑进行菌落PCR检测，挑取阳性菌落提质粒，经酶切验证对正确的重组质粒命名为pBI-P _AhWRI-1 。

7.权利要求书1所述的启动子在种子中的应用。