CN115838701A - A类大豆皂苷乙酰基转移酶GmSSAcT1的制备方法及所用微生物 - Google Patents

Abstract

本发明公开了A类大豆皂苷乙酰基转移酶GmSSAcT1的制备方法及所用微生物。本发明属于生物技术领域，涉及A类大豆皂苷乙酰基转移酶GmSSAcT1的制备方法及所用微生物。本发明提供的制备乙酰基转移酶的方法，包括将乙酰基转移酶基因表达载体导入微生物中，得到产乙酰基转移酶的重组微生物；乙酰基转移酶基因表达载体为在出发表达载体中插入乙酰基转移酶基因得到的表达乙酰基转移酶的重组载体。本发明获得的乙酰基转移酶酶具有大豆皂苷A乙酰基转移酶的作用，在大豆分子辅助育种，人类健康保健等领域有广泛的应用前景。

Description

A类大豆皂苷乙酰基转移酶GmSSAcT1的制备方法及所用微 生物

技术领域

本发明属于生物技术领域，涉及A类大豆皂苷乙酰基转移酶GmSSAcT1的制备方法及所用微生物。

背景技术

大豆(Glycine max(L.)Merr.)原产中国。现有大豆种质资源丰富，有适应于热带、温带、高低纬度地区广泛种植的多个品种。大豆属豆科(Leguminosae)、蝶形花亚科(Papilionozdeae)、大豆属(Glycine)植物，属内分为Glycine和Soja两个亚属。除了人们所熟知的蛋白和油脂，大豆籽粒中还含有丰富的对人体健康有益的特异性代谢物(Plantspecialized metabolites)，如异黄酮、大豆皂苷等化合物。其中，大豆皂苷属于奥利烷型的三萜皂苷，在豆科植物的各个组织会大量积累三萜类皂苷。根据修饰基团的不同，目前大豆中报道的皂苷类型主要有54种，根据羟基修饰基团的不同可主要分为A类皂苷、B类皂苷(热不稳定的DDMP(2,3-dihydro-2,5-dihydroxy-6-methyl-4H-pyran-4-one；22位链接DDMP基团)和E(22位为羰基)类皂苷)，分别由Soyasapogenol A和Soyasapogenol B经不同的糖基化修饰后产生。

大豆皂醇A具有护肝及抗病毒的作用，皂苷Ab具有消炎的作用；DDMP类皂苷都具有抗心脑血管疾病的作用，DDMP类的大豆皂苷βg具有抗氧化的功效。除此大豆皂苷还有许多重要的商业应用价值，如作为食品添加剂、化妆品制造原料、杀虫剂等。

A类皂苷的糖基化发生于C-3及C-22位两个位点，其中C-3位的糖链有三个糖组成，而C-22位的糖链通常由两个糖组成。C-22位的第一个糖是阿拉伯糖，末端糖基是木糖或者葡萄糖，而且终产物A类皂苷的C-22末端糖需要进一步乙酰化的修饰。研究表明，大豆中苦涩味的主要来源即为A类皂苷，A类皂苷C-22位第二位糖的乙酰化修饰是导致苦味的直接原因，因此大豆育种工作者致力于筛选A类皂苷缺失的品系以及含有未乙酰化修饰A类皂苷的大豆品系。但是关于A类大豆皂苷乙酰基转移酶(Soyasaponin acetyltransferase；GmSSAcT1)的研究进展缓慢，到目前为止尚未在任何物种中克隆其编码的cDNA序列。

发明内容

本发明所要解决的问题是如何获得A类大豆乙酰基转移酶，以定向筛选A类皂苷缺失的品系以及含有未乙酰化修饰A类皂苷的大豆品系。

为了解决上述问题，本发明提供了一种制备乙酰基转移酶的方法。

本发明提供的制备乙酰基转移酶的方法，包括：将乙酰基转移酶基因表达载体导入微生物中，得到产乙酰基转移酶的重组微生物；所述乙酰基转移酶基因表达载体为在出发表达载体中插入乙酰基转移酶基因得到的表达乙酰基转移酶的重组载体。

所述乙酰基转移酶是如下任一种的蛋白质：

A1)氨基酸序列如SEQ ID No.1所示的蛋白质；

A2)将A1)的蛋白质经过氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的与A1)所示的蛋白质具有80％以上的同一性且具有催化大豆皂苷Aa或Ab功能的蛋白质；

A3)在A1)或A2)的N末端或/和C末端连接蛋白质标签得到的融合蛋白质。

上述蛋白质可人工合成，也可先合成其编码基因，再进行生物表达得到。

上述蛋白质中，所述标签是指利用DNA体外重组技术，与目的蛋白一起融合表达的一种多肽或者蛋白，以便于目的蛋白的表达、检测、示踪和/或纯化。所述标签可为Flag标签、His标签、MBP标签、HA标签、myc标签、GST标签和/或SUMO标签等。

所述基因编码所述蛋白，所述基因选自下述任一种：

B1)编码链的编码序列是SEQ ID No.2的cDNA分子或DNA分子；

B2)与B1)限定的DNA分子具有80％以上的同一性且编码所述大豆皂苷A乙酰基转移酶的DNA分子。

上述方法中，所述乙酰基转移酶蛋白来源于大豆(Glycine max(L.)Merr.)。

本发明提供了一种应用，所述应用可为下述任一种：

U1)上述蛋白质在作为大豆皂苷A乙酰基转移酶中的应用；

U2)上述蛋白质、或调控所述蛋白质基因表达的物质或调控所述蛋白活性或含量的物质在制备大豆皂苷A乙酰基转移酶中的应用。

本文中，调控所述蛋白质活性和/或含量的物质可为调控基因表达的物质，所述基因编码所述蛋白质GmSSAcT1。

本文中，所述调控基因表达的物质可为进行如下6种调控中至少一种调控的物质：1)在所述基因转录水平上进行的调控；2)在所述基因转录后进行的调控(也就是对所述基因的初级转录物的剪接或加工进行的调控)；3)对所述基因的RNA转运进行的调控(也就是对所述基因的mRNA由细胞核向细胞质转运进行的调控)；4)对所述基因的翻译进行的调控；5)对所述基因的mRNA降解进行的调控；6)对所述基因的翻译后的调控(也就是对所述基因翻译的蛋白质的活性进行调控)。

上述应用中，所述调控所述蛋白质基因表达的物质和所述调控所述蛋白活性或含量的物质可为与所述蛋白质相关的生物材料，所述生物材料可为下述B1)至B7)中的任一种：

B1)编码上述蛋白质的核酸分子；

B2)含有B1)所述核酸分子的表达盒；

B3)含有B1)所述核酸分子的重组载体、或含有B2)所述表达盒的重组载体；

B4)含有B1)所述核酸分子的重组微生物、或含有B2)所述表达盒的重组微生物、或含有B3)所述重组载体的重组微生物；

B5)含有B1)所述核酸分子的转基因植物细胞系、或含有B2)所述表达盒的转基因植物细胞系；

B6)含有B1)所述核酸分子的转基因植物组织、或含有B2)所述表达盒的转基因植物组织；

B7)含有B1)所述核酸分子的转基因植物器官、或含有B2)所述表达盒的转基因植物器官。

上述应用中，B1)所述核酸分子为编码链的编码序列是SEQ ID No.2的cDNA分子或DNA分子。

本文所述核酸分子可以是DNA，如cDNA、基因组DNA或重组DNA；所述核酸分子也可以是RNA，如gRNA、mRNA、siRNA、shRNA、sgRNA、miRNA或反义RNA。

本领域普通技术人员可以很容易地采用已知的方法，例如定向进化或点突变的方法，对本发明的编码蛋白质GmSSAcT1的核苷酸序列进行突变。那些经过人工修饰的，具有与本发明分离得到的蛋白质GmSSAcT1的核苷酸序列75％或75％以上同一性的核苷酸，只要编码蛋白质GmSSAcT1且具有蛋白质GmSSAcT1功能，均是衍生于本发明的核苷酸序列并且等同于本发明的序列。

上述75％或75％以上同一性，可为80％、85％、90％或95％以上的同一性。

本文中，同一性是指氨基酸序列或核苷酸序列的同一性。可使用国际互联网上的同源性检索站点测定氨基酸序列的同一性，如NCBI主页网站的BLAST网页。例如，可在高级BLAST2.1中，通过使用blastp作为程序，将Expect值设置为10，将所有Filter设置为OFF，使用BLOSUM62作为Matrix，将Gap existence cost，Per residue gap cost和Lambda ratio分别设置为11，1和0.85(缺省值)并进行检索以对氨基酸序列的同一性进行计算，然后即可获得同一性的值(％)。

本文中，所述80％以上的同一性可为至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的同一性。

本文所述微生物可为酵母、细菌、藻或真菌。其中，细菌可来自埃希氏菌属(Escherichia)，欧文氏菌(Erwinia)，根癌农杆菌属(Agrobacterium)、黄杆菌属(Flavobacterium)，产碱菌属(Alcaligenes)，假单胞菌属(Pseudomonas)，芽孢杆菌属(Bacillus)等。

本发明还提供了一种重组大肠杆菌，所述重组大肠杆菌含有上述蛋白的编码基因。

所述重组大肠杆菌表达所述大豆皂苷A乙酰基转移酶。

上述重组大肠杆菌中，所述大豆皂苷A乙酰基转移酶可选自下述任一种蛋白质：

1)氨基酸序列如SEQ ID No.1所示的蛋白质；

2)将1)所示的蛋白质经过氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的与1)所示的蛋白质具有80％以上的同一性且具有大豆皂苷A乙酰基转移酶的蛋白质；

3)在1)或2)的N末端或/和C末端连接蛋白标签得到的融合蛋白质。

所述重组大肠杆菌的构建方法包括将所述大豆皂苷A乙酰基转移酶基因导入受体菌中得到所述重组大肠杆菌。

本发明公开了大豆皂苷A乙酰基转移酶GmSSAcT1的制备方法及所用微生物。本发明提供的蛋白质，来源于大豆(Glycine max(L.)Merr.)，命名为GmSSAcT1蛋白，是如下(a)或(b)：(a)由序列表中序列1所示的氨基酸序列组成的蛋白质；(b)将序列表中序列1的氨基酸残基序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有大豆皂苷A乙酰基转移酶功能的由(a)衍生的蛋白质。本发明提供的GmSSAcT1蛋白，具有大豆皂苷A乙酰基转移酶的作用。本发明为培育低苦涩味大豆提供了改造思路。在实际应用中，可以通过敲除大豆皂苷A乙酰基转移酶GmSSAcT1的编码基因，培育低苦涩味大豆。本发明在大豆分子辅助育种，人类健康保健等领域有广泛的应用前景。

附图说明

图1为GmSSAcT1在大豆植物表达的组织特异性。

图2为GmSSAcT1-His纯化SDS-PAGE分析。

图3为NaOH水解法制备去乙酰化的大豆皂苷Ab(null-acetyl Ab，图3中a)和Aa(null-acetyl Aa；图3中b)。

图4为GmSSAcT1酶促反应。a.LC-MS分析酶促反应中(去乙酰化的大豆皂苷Aa为底物)终产物大豆皂苷Aa的生成情况。高分辨质谱提取离子，质荷比m/z 1239.6004对应去乙酰化的大豆皂苷Aa，质荷比m/z 1365.6297对应大豆皂苷Aa；b.LC-MS分析酶促反应中(去乙酰化的大豆皂苷Aa为底物)中间产物生成情况。高分辨质谱提取离子，质荷比m/z1281.6110对应单乙酰化的大豆皂苷Aa，质荷比m/z 1323.6216对应双乙酰化的大豆皂苷Aa；c.LC-MS分析酶促反应中(去乙酰化的大豆皂苷Ab为底物)终产物大豆皂苷Aa的生成情况。高分辨质谱提取离子，质荷比m/z 1269.6110对应去乙酰化的大豆皂苷Aa，质荷比m/z1437.6533对应大豆皂苷Aa；d.LC-MS分析酶促反应中(去乙酰化的大豆皂苷Aa为底物)中间产物生成情况。高分辨质谱提取离子，质荷比m/z 1311.6216对应单乙酰化的大豆皂苷Ab，质荷比m/z 1353.6321对应双乙酰化的大豆皂苷Ab，质荷比m/z 1395.6427对应三乙酰化的大豆皂苷Ab。

具体实施方式

下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐明本发明，而不是为了限制本发明的范围。以下提供的实施例可作为本技术领域普通技术人员进行进一步改进的指南，并不以任何方式构成对本发明的限制。

下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。

实施例1、GmSSAcT1蛋白及其编码基因的获得

以大豆品种Williams 82开花后40天后种子的cDNA为模板，用引物GmSSAcT1F:5’-ATGGCAGTGGAAAATATCAAAGTCCACGAAG-3’)；GmSSAcT1 R:5’-TCACTCATCTTTCAGTCCTCCATGAAAAATAGT-3’)进行PCR扩增,得到约1.5Kb的PCR产物(即GmSSAcT1基因的编码区)。经过测序，该PCR产物为1536bp，GmSSAcT1基因的编码序列如SEQ ID No.2所示的核苷酸序列，该基因编码的蛋白命名为GmSSAcT1，编码蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示，该蛋白包含511个氨基酸。

GmSSAcT1基因在大豆的不同发育期及不同组织器官中的表达情况研究：大豆不同发育时期及不同组织器官材料取自在玻璃温室种植的大豆，对应时期的材料收集后利用液氮速冻，然后在-80℃保存。RNA的提取过程：首先利用液氮预冷研钵及研锤，将不同的材料倒入预冷的研钵中进行研磨，将研磨好的材料粉末取适量进行RNA提取，提取步骤参照天根植物RNA提取试剂盒(DP432)操作说明进行提取。提取结束后利用琼脂糖凝胶电泳检测所提取RNA的完整性，28S rRNA和18S rRNA条带的亮度比约为2:1，说明提取的RNA是没有降解的。然后利用NanoDrop 1000检测所提取RNA的浓度及纯度，OD₂₆₀/OD₂₈₀比值接近于2则说明提取的RNA纯度较好，没有蛋白质的污染。本实验选取满足以上条件的RNA进行下一步的反转录。反转录步骤参照东洋纺(FSQ-301)反转录试剂盒的说明进行操作。利用反转录得到的cDNA进行下一步的荧光实时定量PCR实验。

实验中所用到的引物及内参基因引物信息为(GmSSAcT1 RT-F:ATCATCAACACAATCACT；GmSSAcT1 RT-R:AATCACATTGGCATAGAA；TUB RT-F：TGGCCGTTACCTGACAGCAT；TUB RT-R：CTCGGAGGGATGTCACACAC)。

结果见图1。GmSSAcT1基因在不同发育时期的种子和根中表达较高，相对于内参基因的表达量，在根的不同发育时期平均表达量分别达到0.09，0.05和0.12，在种子的不同发育时期平均表达量分别达到0.08，0.15和0.24，随着种子的不断成熟，GmSSAcT1基因的表达量也在不断增加。而在其他组织中表达量都相对较低。

实施例2、转GmSSAcT1重组菌株的获得

1.重组质粒pEASY-GmSSAcT1-His的获得

(1)提取大豆栽培种Williams 82开花后40天的种子总RNA，反转录得到cDNA，以该cDNA为模板，用GmSSAcT1 F和GmSSAcT1 R组成的引物对进行PCR扩增，得到扩增产物(序列是SEQ ID NO.2，含有GmSSAcT1的编码序列(CDS))，并进行切胶回收。

GmSSAcT1 F:ATGGCAGTGGAAAATATCAAAGTCCACGAAG；

GmSSAcT1 R:CTCATCTTTCAGTCCTCCATGAAAAATAGT。

(2)将步骤(1)回收的平端产物和pEASY Blunt E2载体(购买自全式金，货号CE211)骨架连接，得到重组质粒。根据测序结果，对测序正确的重组质粒进行结构描述如下：在pEASY Blunt E2载体的开环克隆区(根据载体说明书的位置标示，插入区段位置为5196-5238bp)插入了序列表中序列2自5’末端第1至1536位核苷酸所示的DNA分子，将此重组载体命名为重组载体pEASY-GmSSAcT1-His，pEASY-GmSSAcT1-His可以表达带有His标签的GmSSAcT1-His融合蛋白，预期分子量约为57.5KD)。

2.重组菌株BL21-pEASY-GmSSAcT1-His的获得

将上述步骤1得到的重组质粒pEASY-GmSSAcT1-His导入大肠杆菌BL21(DE3)得到重组菌株BL21-pEASY-GmSSAcT1-His。

构建步骤如下：首先提取步骤1得到的重组质粒，吸取100ng重组质粒加入到100微升BL21(DE3)感受态细胞中，轻轻吸打混匀后置于冰上放置20分钟，然后在42℃水浴锅中热激90秒，迅速冰浴2分钟，在超净工作台中加入900微升LB培养基后置于37℃摇床培养1小时，然后菌液6000g转速离心弃去上清，重新加入100微升LB培养基重悬菌体，重悬菌体均匀涂布于带有氨苄抗性的LB平板上37℃培养12小时，挑取长出的菌落进行PCR鉴定，电泳结果如有大小合适的条带即证明重组菌株构建成功。

3.大豆皂苷A乙酰基转移酶GmSSAcT1重组蛋白的制备

1)将重组菌接种至LB液体培养基(含100μg/mL氨苄青霉素)，37℃振荡培养(200rpm)至OD₆₀₀＝0.8，然后加入IPTG(使其在培养体系中的终浓度为0.2g/L)同时培养条件改为16℃，200rpm振荡培养16小时。

2)收集完成步骤1的培养体系，离心收集菌体。

3)超声破碎上述步骤2)中得到的菌体细胞，并采用Nickle-Argrose凝胶进行亲和层析纯化蛋白，得到GmSSAcT1-His蛋白液(蛋白浓度为1μg/μL)。GmSSAcT1-His蛋白液的SDS-PAGE电泳结果见图2，在蛋白marker 55和70之间获得大小约为57KD的条带，与GmSSAcT1-His融合蛋白的预期分子量一致(57.5kD)。

4.大豆皂苷A乙酰基转移酶GmSSAcT1蛋白活性测定

1)测定底物制备

利用碱水解法处理大豆皂苷Aa(购买自上海吉至生化科技有限公司，货号S60970-10mg)和大豆皂苷Ab(购买自上海同田生物技术有限公司，货号E-2399)在500mM的NaOH溶液(70％甲醇/水)中处理2小时，然后加入甲酸溶液(70％甲醇/水)进行中和，中和后的溶液即含有去乙酰化大豆皂苷Aa或者Ab。

利用LC-MS检测转化率，检测条件如下：液相色谱型号为Agilent 1290，质谱型号为Agilent 6550QTOF。色谱柱为C18柱(孔径大小1.8微米,长度2.1×100毫米)；流动相：A相为水(含0.1％甲酸)，B相为乙腈(含0.1％甲酸)；洗脱程序为：1:99v/v(0分钟)，1:99v/v(0.1分钟)，99.5:0.5(15.5分钟)，99.5:0.5(17.0分钟)；流速0.4m升/分钟；流动相温度35℃。毛细管电压4000V；载气温度,225℃；干燥气流速，13升/分钟；鞘气温度350℃；鞘气流速12升/分钟。进样量为1微升，数据采集采用正离子模式(m/z 50–1700)。

由图3可知，大豆皂苷Aa和Ab能够生成去乙酰化的大豆皂苷Aa和Ab，在NaOH溶液处理后，乙酰化的大豆皂苷Aa和Ab完全检测不到，同时能够检测到去乙酰化的大豆皂苷，在此过程中部分乙酰化的大豆皂苷(包括单乙酰化的大豆皂苷Aa，二乙酰化的大豆皂苷Aa，单乙酰化的大豆皂苷Ab，二乙酰化的大豆皂苷Ab，三乙酰化的大豆皂苷Ab)完全检测不到，说明大豆皂苷去乙酰化的转化率达到100％。

2)大豆皂苷A乙酰基转移酶GmSSAcT1蛋白的酶活分析

大豆皂苷A乙酰基转移酶GmSSAcT1酶促反应体系：总反应体积为50微升，包括：0.05摩/升的磷酸钾(pH 7.5)、160微摩/升的Acetyl-CoA、20微摩/升的去乙酰化的大豆皂苷Aa或Ab和1微克步骤三制备的GmSSAcT1-His纯化蛋白，加水补齐到50微升。

在28℃进行酶促反应60分钟后加入50微升甲醇终止反应，利用LC-qTOF-MS/MS检测产物，LC-qTOF-MS/MS检测条件如下：液相色谱型号为Agilent 1290，质谱型号为Agilent6550QTOF。色谱柱为C18柱(孔径大小1.8微米,长度2.1×100毫米)；流动相：A相为水(含0.1％甲酸)，B相为乙腈(含0.1％甲酸)；洗脱程序为：1:99v/v(0分钟)，1:99v/v(0.1分钟)，99.5:0.5(15.5分钟)，99.5:0.5(17.0分钟)；流速0.4m升/分钟；流动相温度35℃。毛细管电压4000V；载气温度,225℃；干燥气流速，13升/分钟；鞘气温度350℃；鞘气流速12升/分钟。进样量为1微升，数据采集采用正离子模式(m/z 50–1700)。

结果取三次独立试验的平均值±标准方差。

结果如图4所示，GmSSAcT1-His蛋白不仅可以催化去乙酰化的大豆皂苷Aa或Ab生成Aa或Ab，还可以生成中间产物单乙酰化，双乙酰化或三乙酰化的Aa或Ab。

其中LC-MS分析酶促反应中，以去乙酰化的大豆皂苷Aa为底物，终产物大豆皂苷Aa的生成情况如下：高分辨质谱提取离子，质荷比m/z 1239.6004对应去乙酰化的大豆皂苷Aa，质荷比m/z 1365.6297对应大豆皂苷Aa(图4中a)。

LC-MS分析酶促反应中，以去乙酰化的大豆皂苷Aa为底物，中间产物生成情况如下：高分辨质谱提取离子，质荷比m/z 1281.6110对应单乙酰化的大豆皂苷Aa，质荷比m/z1323.6216对应双乙酰化的大豆皂苷Aa(图4中b)。

LC-MS分析酶促反应中，以去乙酰化的大豆皂苷Ab为底物，终产物大豆皂苷Aa的生成情况如下：高分辨质谱提取离子，质荷比m/z 1269.6110对应去乙酰化的大豆皂苷Ab，质荷比m/z 1437.6533对应大豆皂苷Ab(图4中c)。

LC-MS分析酶促反应中，去乙酰化的大豆皂苷Ab为底物，中间产物生成情况如下：高分辨质谱提取离子，质荷比m/z 1311.6216对应单乙酰化的大豆皂苷Ab，质荷比m/z1353.6321对应双乙酰化的大豆皂苷Ab，质荷比m/z 1395.6427对应三乙酰化的大豆皂苷Ab(图4中d)。

对GmSSAcT1蛋白的体外生化参数进行分析，GmSSAcT1蛋白对于去乙酰化的大豆皂苷有较高的底物亲和力，同时Kcat结果也表明GmSSAcT1蛋白有较高的催化速率(表1)。

表1GmSSAcT1蛋白的体外生化参数

底物	Km(μM)<sup>3</sup>	Kcat(s<sup>-1</sup>)	Kcat/Km(s<sup>-1</sup>μM<sup>-1</sup>)
				去乙酰化大豆皂苷Aa<sup>1</sup>	24.87±3.14	107.47±9.73	4.34±0.19
去乙酰化大豆皂苷Ab	48.4±5.98	371.05±32.21	7.7±0.32
				乙酰辅酶A<sup>2</sup>	29.3±7.69	86.52±1.59	3.12±0.65

注:1:反应体系中含有120μM乙酰辅酶A；2:反应体系中含有100μM去乙酰化大豆皂苷Ab。

以上对本发明进行了详述。对于本领域技术人员来说，在不脱离本发明的宗旨和范围，以及无需进行不必要的实验情况下，可在等同参数、浓度和条件下，在较宽范围内实施本发明。虽然本发明给出了特殊的实施例，应该理解为，可以对本发明作进一步的改进。总之，按本发明的原理，本申请欲包括任何变更、用途或对本发明的改进，包括脱离了本申请中已公开范围，而用本领域已知的常规技术进行的改变。按以下附带的权利要求的范围，可以进行一些基本特征的应用。

Claims (9)

1.制备乙酰基转移酶的方法，包括：将乙酰基转移酶基因表达载体导入微生物中，得到产乙酰基转移酶的重组微生物；所述乙酰基转移酶基因表达载体为在出发表达载体中插入乙酰基转移酶基因得到的表达乙酰基转移酶的重组载体；

所述乙酰基转移酶是如下任一种的蛋白质：

A1)氨基酸序列如SEQ ID No.1所示的蛋白质；

A2)将A1)的蛋白质经过氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的与A1)所示的蛋白质具有80％以上的同一性且具有催化大豆皂苷Aa或Ab功能的蛋白质；

A3)在A1)或A2)的N末端或/和C末端连接蛋白质标签得到的融合蛋白质，

所述基因编码所述蛋白，所述基因选自下述任一种：

B1)编码链的编码序列是SEQ ID No.2的cDNA分子或DNA分子；

B2)与B1)限定的DNA分子具有80％以上的同一性且编码所述大豆皂苷A乙酰基转移酶的DNA分子。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述乙酰基转移酶蛋白来源于大豆。

3.应用，其特征在于：所述应用为下述任一种：

U1)权利要求1所述的蛋白质在作为大豆皂苷A乙酰基转移酶中的应用；

U2)权利要求1所述的蛋白质、或调控所述蛋白质基因表达的物质或调控所述蛋白活性或含量的物质在制备大豆皂苷A乙酰基转移酶中的应用。

4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于：所述调控所述蛋白质基因表达的物质和所述调控所述蛋白活性或含量的物质为与所述蛋白质相关的生物材料，所述生物材料为下述B1)至B7)中的任一种：

B1)编码权利要求1中所述蛋白质的核酸分子；

B2)含有B1)所述核酸分子的表达盒；

B3)含有B1)所述核酸分子的重组载体、或含有B2)所述表达盒的重组载体；

B4)含有B1)所述核酸分子的重组微生物、或含有B2)所述表达盒的重组微生物、或含有B3)所述重组载体的重组微生物；

B5)含有B1)所述核酸分子的转基因植物细胞系、或含有B2)所述表达盒的转基因植物细胞系；

B6)含有B1)所述核酸分子的转基因植物组织、或含有B2)所述表达盒的转基因植物组织；

B7)含有B1)所述核酸分子的转基因植物器官、或含有B2)所述表达盒的转基因植物器官。

5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于：B1)所述核酸分子为编码链的编码序列是SEQ ID No.2的cDNA分子或DNA分子。

6.一种重组大肠杆菌，其特征在于：所述重组大肠杆菌含有权利要求1所述的蛋白的编码基因。

7.如权利要求6所述的重组大肠杆菌，其特征在于：所述重组大肠杆菌表达所述大豆皂苷A乙酰基转移酶。

8.如权利要求6或7所述的重组大肠杆菌，其特征在于：所述大豆皂苷A乙酰基转移酶选自下述任一种蛋白质：

1)氨基酸序列如SEQ ID No.1所示的蛋白质；

2)将1)所示的蛋白质经过氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的与1)所示的蛋白质具有80％以上的同一性且具有催化大豆皂苷Aa或Ab功能的蛋白质；

3)在1)或2)的N末端或/和C末端连接蛋白标签得到的融合蛋白质。

9.如权利要求6至8中任一所述的重组大肠杆菌，其特征在于：所述重组大肠杆菌的构建方法包括将所述大豆皂苷A乙酰基转移酶基因导入受体菌中得到所述重组大肠杆菌。

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