CN113646066A - 蛋白质的纯化方法 - Google Patents

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Abstract

一种包含目标蛋白质的含蛋白质溶液的纯化方法，所述方法包括以下的工序：(α1)使含蛋白质溶液与包含聚酮的多孔介质接触的工序、以及(α2)使与包含聚酮的多孔介质进行了接触的含蛋白质溶液通过除病毒膜的工序。

Description

蛋白质的纯化方法
技术领域
本发明涉及回收纯化蛋白质的方法、及去除蛋白质中所含的蛋白质聚集体的方法。另外，本发明涉及蛋白质的纯化方法。
背景技术
蛋白质是工业上从食品到药物都重要的生物高分子。近些年，应用了蛋白质的生物药物在药物开发中受到注目。其中，尤其受到注目的免疫球蛋白(抗体)，在药物、诊断药或对应的抗原蛋白质的分离纯化材料等用途中，其利用价值正在提高。抗体是控制免疫反应的生理活性物质，可从免疫的动物血液或具有抗体产生能力的细胞的细胞培养液或动物的腹水培养液中获得。其中，含有这些抗体的血液、培养液包含除抗体以外的蛋白质、或源自细胞培养中使用的原料液体的复杂的污染成分，其溶液中有时含有抗体的二聚体及更高阶的聚集体。
作为去除蛋白质聚集体的方法，有：通过超离心去除的方法；使用超滤膜的方法(例如，参照专利文献1。)；组合了蛋白A柱、离子交换柱、及分子排阻柱的方法(例如，参照专利文献2。)；以及使用疏水凝胶的方法(例如，参照非专利文献1。)等。超离心法能用于研究领域，但不适用于大量生产工艺。基于超滤膜的方法的分级精度低，因此纯化度可能并不充分。另外，使用了现有的柱、凝胶的方法具有如下问题：使用昂贵的柱的成本问题、梯度洗脱等操作可能繁杂的问题、因持续使用而可能劣化的问题、纯化蛋白质被稀释所致的纯化后的浓缩或干燥工序的负担大的问题等。进而，使用了柱、凝胶的方法存在蛋白质的纯化花费时间、蛋白质可能变性的问题。
然而，已知通过以钯或镍作为催化剂使一氧化碳与烯烃聚合而得到的、一氧化碳与烯烃完全交替共聚而成的脂肪族聚酮(以下有时称为“聚酮”。)。聚酮具有高结晶性，因此由例如聚酮形成的纤维或薄膜具有高力学物性、高熔点、耐有机溶剂性、及耐化学药品性等特性。聚酮主要用于水处理、气体除尘、气体分离、及电池用的分隔件等(例如，参照专利文献3、4。)。已知尼龙作为能够去除蛋白质聚集体的介质的材料(例如参照专利文献5。)。
生物药物中，需要改善病毒安全性的措施。药物制造厂商对在制造工序中导入去除/灭活病毒工序进行了研究。其中，利用使用去除病毒的过滤器的过滤来去除病毒的方法是在能够不使有用的蛋白质变性的情况下减少病毒的有效方法。
报告了病毒之中、特别是细小病毒在血浆分级制剂领域中由于人细小病毒B19所导致的感染的事例；在生物药物领域中小鼠的细小病毒对中国仓鼠卵巢(CHO、ChineseHamster Ovary)细胞的污染的事例。另外例如也报告了钩端螺旋体种类(Leptospiraspecies)等微小细菌残留于生物药物的事例。
作为小病毒的细小病毒由于不具有包膜，因此物理化学性稳定，对于药物的制造工艺中通常进行的灭活工序、即加热、低pH、化学药品处理具有耐性。因此，作为作用机理与灭活法不同的去除病毒的方法，利用去除病毒膜进行的病毒去除以及细菌去除的需求提高。
作为去除病毒用的过滤膜，已知由纤维素这样的天然原材料形成的膜、或由聚偏二氟乙烯(PVDF)、聚醚砜(PES)这样的合成高分子原材料形成的去除病毒的膜(例如参照专利文献6、7、或非专利文献2至5。)。
现有技术文献
专利文献
专利文献1：日本特开昭56-59716号公报
专利文献2：日本专利第2638680号公报
专利文献3：日本特开2015-203048号公报
专利文献4：国际公开2013/035747号公报
专利文献5：日本特开2005-145852号公报
专利文献6：美国专利申请公开第2016/0176921号公报
专利文献7：国际公开2016/031834号公报
专利文献8：日本特开2014-151272号公报
专利文献9：国际公开第2003/055934号
专利文献10：国际公开2016/031834号公报
非专利文献
非专利文献1：HLC MAILGRAM，东曹株式会社，2003年8月25日，第97卷,第3号,p.10
非专利文献2：Manabe.S、Removal of virus through novel membranefiltration method.,Dev.Biol.Stand.,(1996)88：81-90.
非专利文献3：Brandwein H等人，Membrane filtration for virus removal.、Dev Biol(Basel).,(2000)102：157-63.
非专利文献4：Aranha-Creado等人，Clearance of murine leukaemia virusfrom monoclonal antibody solution by a hydrophilic PVDF microporous membranefilter.,Biologicals.(1998)Jun；26(2):167-72.
非专利文献5：L.Moce-Llivina等人、Comparison of polyvinylidene fluorideand polyether sulfone membranes in filtering viral suspensions、Journal ofVirological Methods,(2003)April,Vol.109,Issue 1,Pages 99-101.
发明内容
发明要解决的问题
本发明要解决的课题在于提供回收纯化蛋白质的方法。另外，其它课题在于提供去除蛋白质中所含的蛋白质聚集体的方法。
另外，本发明人等发现：在使蛋白质溶液通过包含尼龙的介质的过程中，蛋白质聚集体产生比初始浓度更高的馏分，而存在难以控制纯化工艺的课题。因此，本发明要解决的其它课题在于提供容易控制纯化工艺的蛋白质的纯化方法。进而其它课题在于提供适于各种方法的新的介质。
另外，在生物药物的制剂制造工艺中，在制剂制造工艺的最终工序中经常使用除病毒膜。在使用了除病毒膜的工序中，若在其前道工序(预滤器工序等)发生压力损失，则每单位时间的处理量变小，因此优选预滤器工序中的压力损失小、能有效地去除蛋白聚集体等的纯化方法。进而，除病毒膜经常在制剂制造工艺的最终工序中使用，但优选的是：通过除病毒膜对蛋白质制剂进行的过滤能够在短时间内处理更大量的蛋白质，且具有足够高的除病毒性能而能够去除病毒。然而，蛋白质制剂中通常包含作为成为除病毒膜的堵塞原因的物质的生物体高分子，可能成为使除病毒膜堵塞的原因。因此，本发明要解决的其它课题在于提供通过除病毒膜将蛋白质纯化时，减少了除病毒膜的堵塞(闭塞)的蛋白质的纯化方法。
用于解决问题的方案
本发明人等为了解决上述课题而进行了深入研究，结果发现通过包含聚酮的介质将蛋白质纯化、回收的方法。另外，发现了通过包含聚酮的介质能够去除蛋白质聚集体。进而，本发明人等进行了深入研究，结果发现：在使用包含聚酮的介质时，未观察到在使用包含尼龙的介质时所看到的蛋白质聚集体产生比初始浓度更高的馏分的现象，容易控制纯化工艺。
此外，本发明人等发现：在除病毒膜将蛋白质溶液过滤之前，使目标蛋白质溶液与特定的多孔介质接触，由此能够减少除病毒膜的堵塞，且能够有效地纯化蛋白质。
即，作为本发明，可列举出以下的方案。
〔A1〕一种包含目标蛋白质的含蛋白质溶液的纯化方法，其包括以下的工序：
(α1)使含蛋白质溶液与包含聚酮的多孔介质接触的工序、以及
(α2)使与包含聚酮的多孔介质进行了接触的含蛋白质溶液通过除病毒膜的工序。
〔A1-2〕根据〔A1〕所述的方法，其中，聚酮为包含70摩尔％以上的1-氧代三亚甲基重复单元的聚酮。
〔A2〕一种包含目标蛋白质的含蛋白质溶液的纯化方法，其包括以下的工序：
(β1)使含蛋白质溶液与比表面积为4.0m2/mL以上且孔隙率为50％以上的多孔介质接触的工序、以及
(β2)使与多孔介质进行了接触的含蛋白质溶液通过除病毒膜的工序。
〔A3〕根据〔A1〕、〔A1-2〕、或〔A2〕所述的方法，其中，多孔介质为膜状。
〔A4〕根据〔A1〕～〔A3〕中任一项所述的方法，其中，多孔介质与除病毒膜直接连接。
需要说明的是，上述〔A1〕～〔A3〕在所引用的项目编号用范围表示且在该范围内配置有具有〔A1-2〕等分支编号的项目的情况，是指也引用了具有〔A1-2〕等分支编号的项目。以下也同样。
〔A5〕根据〔A4〕所述的方法，其中，对工序(α1)或(β1)中使用的多孔体施加的压力为对工序(α2)或(β2)中使用的除病毒膜施加的压力的1/40～1/2。
〔A6〕根据〔A1〕～〔A5〕中任一项所述的方法，其中，施加恒定压力进行过滤。
〔A7〕根据〔A1〕～〔A6〕中任一项所述的方法，其中，含蛋白质溶液中的病毒的去除率至少为99.9％。
〔A8〕根据〔A1〕～〔A7〕中任一项所述的方法，其中，目标蛋白质为多克隆抗体或单克隆抗体。
〔A9〕根据〔A1〕～〔A8〕中任一项所述的方法，其中，含蛋白质溶液中的蛋白质浓度为100mg/mL以下。
〔A10〕根据〔A1〕～〔A9〕中任一项所述的方法，其中，被除病毒膜去除的病毒为细小病毒。
〔A11〕根据〔A1〕、或〔A3〕～〔A10〕中任一项所述的方法，其中，聚酮的比表面积(聚酮表面积(m2)/聚酮体积(mL))为12m2/mL以上。
〔A12〕一种含蛋白质溶液的制造方法，其中，利用〔A1〕～〔A11〕中任一项所述的方法制造实质上不包含病毒的含蛋白质溶液。
〔A13〕一种除病毒膜用预滤器，其具备包含聚酮的多孔介质。
〔A13-2〕根据〔A13〕所述的除病毒膜用预滤器，其中，聚酮为包含70摩尔％以上的1-氧代三亚甲基重复单元的聚酮。
〔A14〕一种用于除病毒膜用预滤器的聚酮的应用。
〔A15〕一种用于制造除病毒膜用预滤器的聚酮的应用。
〔A16〕根据〔A14〕或〔A15〕所述的应用，其中，聚酮为包含70摩尔％以上的1-氧代三亚甲基重复单元的聚酮。
〔B1〕一种从含蛋白质溶液中回收纯化蛋白质的方法，所述方法包括以下的工序：
(a1)使含蛋白质溶液与包含聚酮的介质接触的工序；以及
(a2)从与包含聚酮的介质进行了接触的含蛋白质溶液中回收纯化蛋白质的工序。
〔B1-2〕根据〔B1〕所述的方法，其中，聚酮为包含70摩尔％以上的1-氧代三亚甲基重复单元的聚酮。
〔B2〕一种选择性去除蛋白质聚集体的方法，其中，从含蛋白质溶液中选择性去除含蛋白质溶液中所含的蛋白质聚集体，所述方法包括以下的工序：
(b1)使含蛋白质溶液与包含聚酮的介质接触的工序。
〔B3〕根据〔B1〕、〔B1-2〕、或〔B2〕所述的方法，其中，蛋白质为抗体。
〔B4〕根据〔B3〕所述的方法，其中，抗体为源自血浆产物或源自细胞培养液的抗体。
〔B5〕根据〔B3〕所述的方法，其中，抗体为单克隆抗体。
〔B6〕根据〔B2〕～〔B5〕中任一项所述的方法，其中，蛋白质聚集体为蛋白质的二聚体、三聚体和/或多聚体。
〔B7〕根据〔B1〕～〔B6〕中任一项所述的方法，其中，(a1)或(b1)的工序包括使含蛋白质溶液通过包含聚酮的介质的工序，
〔B8〕根据〔B1〕～〔B7〕中任一项所述的方法，其中，含蛋白质溶液的pH为4以上且10以下。
〔B9〕根据〔B1〕～〔B8〕中任一项所述的方法，其中，含蛋白质溶液的电导率为0mS/cm以上且100mS/cm以下。
〔B10〕根据〔B1〕～〔B9〕中任一项所述的方法，其中，使含蛋白质溶液通过包含聚酮的介质的流速相对于包含聚酮的介质的膜体积1mL为0.1mL/分钟以上。
〔B11〕根据〔B1〕～〔B10〕中任一项所述的方法，其中，包含聚酮的介质的表面积相对于纯化对象的蛋白质1.0g至少为0.0001m2以上。
〔B12〕根据〔B1〕～〔B11〕中任一项所述的方法，其中，包含聚酮的介质为多孔成型体。
〔B13〕根据〔B12〕所述的方法，其中，多孔成型体为微多孔膜、无纺布、织布、整体式多孔体、凝胶或颗粒层。
〔B14〕根据〔B12〕或〔B13〕所述的方法，其中，多孔成型体具有三维均匀的膜孔径。
〔B15〕根据〔B12〕～〔B14〕中任一项所述的方法，其中，多孔成型体的孔径为50nm以上且1000nm以下。
〔B16〕一种包含聚酮的介质，其用于从含蛋白质溶液中选择性去除蛋白质的聚集体。
〔B16-2〕根据〔B16〕所述的介质，其中聚酮为包含70摩尔％以上的1-氧代三亚甲基重复单元的聚酮。
〔B17〕根据〔B16〕或〔B16-2〕所述的介质，其中，蛋白质为抗体。
〔B18〕根据〔B17〕所述的介质，其中，抗体为源自血浆产物或源自细胞培养液的抗体。
〔B19〕根据〔B17〕所述的介质，其中，抗体为单克隆抗体。
〔B20〕根据〔B16〕～〔B19〕中任一项所述的介质，其中，蛋白质聚集体为蛋白质的二聚体、三聚体和/或多聚体。
〔B21〕根据〔B16〕～〔B20〕中任一项所述的介质，其中，包含聚酮的介质为多孔成型体。
〔B22〕根据〔B21〕所述的介质，其中，多孔成型体为微多孔膜、无纺布、织布、整体式多孔体、凝胶或颗粒层。
〔B23〕根据〔B21〕或〔B22〕所述的介质，其中，多孔成型体具有三维均匀的膜孔径。
〔B24〕根据〔B21〕～〔B23〕中任一项所述的介质，其中，多孔成型体的孔径为50nm以上且1000nm以下。
〔B25〕一种聚酮的、用于从含蛋白质溶液中选择去除蛋白质的聚集体的应用。
〔B25-2〕根据〔B25〕所述的应用，其中，聚酮为包含70摩尔％以上的1-氧代三亚甲基重复单元的聚酮。
发明的效果
根据本发明，能够有效地回收经纯化的目标蛋白质。另外，根据本发明，能够有效地去除目标蛋白质中所含的蛋白质聚集体。进而，根据本发明，能够相对较容易地控制目标蛋白质纯化(聚集体去除)。进而，根据本发明，能够提供适于纯化上述蛋白质的介质。进而能够提供在通过除病毒膜将蛋白质纯化时，减少了除病毒膜的堵塞(闭塞)的蛋白质的纯化方法。
附图说明
图1是实施例B1的色谱图。
图2是图1所示的色谱图的一部分的放大图。
图3是示出实施例B1的各级分中所含的聚集体和单体的含有重量的表。
图4是示出实施例B1的、用评价对象中流通的抗体的累积重量除以评价对象的膜体积而得到的值、与级分中的单体或聚集体的浓度相对于在评价对象中流通之前的单体或聚集体的浓度的比例的关系的图。
图5是示出实施例B2的、用评价对象中流通的抗体的累积重量除以评价对象的膜体积而得到的值、与级分中的单体或聚集体的浓度相对于在评价对象中流通之前的单体或聚集体的浓度的比例的关系的图。
图6是示出实施例B3的、用评价对象中流通的抗体的累积重量除以评价对象的膜体积而得到的值、与级分中的单体或聚集体的浓度相对于在评价对象中流通之前的单体或聚集体的浓度的比例的关系的图。
图7是示出实施例B4的、用评价对象中流通的抗体的累积重量除以评价对象的膜体积而得到的值、与级分中的单体或聚集体的浓度相对于在评价对象中流通之前的单体或聚集体的浓度的比例的关系的图。
图8是示出实施例B5的、用评价对象中流通的抗体的累积重量除以评价对象的膜体积而得到的值、与级分中的单体或聚集体的浓度相对于在评价对象中流通之前的单体或聚集体的浓度的比例的关系的图。
图9是示出实施例B6的、用评价对象中流通的抗体的累积重量除以评价对象的膜体积而得到的值、与级分中的单体或聚集体的浓度相对于在评价对象中流通之前的单体或聚集体的浓度的比例的关系的图。
图10是示出实施例B7的、用评价对象中流通的抗体的累积重量除以评价对象的膜体积而得到的值、与级分中的单体或聚集体的浓度相对于在评价对象中流通之前的单体或聚集体的浓度的比例的关系的图。
图11是示出实施例B8的、用评价对象中流通的抗体的累积重量除以评价对象的膜体积而得到的值、与级分中的单体或聚集体的浓度相对于在评价对象中流通之前的单体或聚集体的浓度的比例的关系的图。
图12是示出实施例B9的、用评价对象中流通的抗体的累积重量除以评价对象的膜体积而得到的值、与级分中的单体或聚集体的浓度相对于在评价对象中流通之前的单体或聚集体的浓度的比例的关系的图。
图13是示出实施例B10的、用评价对象中流通的抗体的累积重量除以评价对象的膜体积而得到的值、与级分中的单体或聚集体的浓度相对于在评价对象中流通之前的单体或聚集体的浓度的比例的关系的图。
图14是示出比较例B1的、用评价对象中流通的抗体的累积重量除以评价对象的膜体积而得到的值、与级分中的单体或聚集体的浓度相对于在评价对象中流通之前的单体或聚集体的浓度的比例的关系的图。
具体实施方式
以下，对本发明的方式(以下有时在本说明书中简称“实施方式”。)进行具体地说明。需要说明的是，以下所示的实施方式示例出用于将该发明的技术构思具体化的方法等，不限定于这些示例。
1.回收纯化蛋白质的方法
实施方式的从含蛋白质溶液中回收纯化蛋白质的方法包括以下的工序：(α1)使含蛋白质溶液与包含聚酮的介质接触的工序、以及(α2)从与包含聚酮的介质进行了接触的含蛋白质溶液中回收纯化蛋白的工序。
一个实施方式中，聚酮是一氧化碳与1种以上的烯烃的共聚物。作为聚酮，可示例出下述式(1)所示的聚合物。
Figure BDA0003284304490000101
作为聚酮，可示例出包含任选被羰基取代的R1基团的重复单元交替排列而成的聚合物。式(1)中，作为R1，可示例出碳数2以上且20以下的亚烷基。R1基团中的取代基可以包含选自由氢原子、卤素原子、羟基、醚基、伯氨基、仲氨基、叔氨基、季铵基、磺酸基、磺酸酯基、羧酸基、羧酸酯基、磷酸基、磷酸酯基、硫醇基、硫醚基、烷氧基甲硅烷基、及硅烷醇基组成的组中的1个以上。该聚合物中，也可以包含除重复单元以外的单元。作为除重复单元以外的单元的含量，作为上限值可示例出聚酮中低于10重量％，作为其它方式可示例出低于9重量％，作为其它方式可示例出低于8重量％，作为其它方式可示例出低于7重量％，作为其它方式可示例出低于6重量％，作为其它方式可示例出低于5重量％，作为其它方式可示例出低于4重量％，作为其它方式可示例出低于3重量％，作为其它方式可示例出低于2重量％，作为其它方式可示例出低于1重量％，作为进一步的其它方式可示例出低于0.5重量％。另外，作为除重复单元以外的单元的含量的下限值可示例出0重量％以上，作为其它方式可示例出0.1重量％以上，作为其它方式可示例出0.2重量％以上，作为其它方式可示例出0.3重量％以上，作为其它方式可示例出0.4重量％以上，作为进一步的其它方式可示例出0.5重量％以上。该聚合物中，羰基彼此或亚烷基彼此任选部分地键合。将R1之后键合羰基、该羰基之后键合R1的交替共聚物称为完全交替共聚物。作为聚酮中的完全交替共聚部分的含量，作为下限值可示例出95重量％以上，作为其它方式可示例出96重量％以上，作为进一步的其它方式可示例出97重量％以上，作为其它方式可示例出98重量％以上，作为进一步的其它方式可示例出99重量％以上。作为聚酮中的完全交替共聚部分的含量，作为上限值可示例出100重量％以下，作为其它方式可示例出99重量％以下，作为进一步的其它方式可示例出98重量％以下，作为进一步的其它方式可示例出97重量％以下。从改善耐热性或耐光性的观点出发，优选聚酮中的完全交替共聚物的含量为95重量％以上的方式。
上述式(1)的R1基的碳数可示例出2以上且8以下，作为其它方式可示例出2以上且3以下，作为进一步的其它方式可示例出2。构成聚酮的重复单元特别优选包含大量下述式(2)所示的1-氧代三亚甲基重复单元。另外，上述式(1)的R1基团中可以包含芳香环，也可以不包含芳香环。
Figure BDA0003284304490000111
从确保包含聚酮的介质的强度的方面考虑，构成聚酮的重复单元中的1-氧代三亚甲基重复单元的比例优选为70摩尔％以上，更优选为90摩尔％以上，进一步优选为95摩尔％以上。1-氧代三亚甲基重复单元的比例也可以为100摩尔％。此处，“100摩尔％”是指：在元素分析、NMR(核磁共振)、气相色谱等公知的分析方法中，除聚合物末端基之外，未观察到除1-氧代三亚甲基以外的重复单元。典型地，构成聚酮的重复单元的结构和各结构的量可以通过NMR进行确认。
一个实施方式中，作为包含聚酮的介质(以下也称为“聚酮介质”。)的形状，只要是能将蛋白质纯化的形状就没有特别限定，可示例出微珠、凝胶、海绵、或粉末等形状，作为其它方式可示例出纤维或膜(平膜或中空纤维膜)。作为聚酮介质形状的其它方式，可示例出平膜或中空纤维膜；作为进一步的其它方式可示例出平膜，作为进一步的其它方式可示例出中空纤维膜。聚酮介质也可以为多孔成型体。多孔成型体也可以为微多孔膜、无纺布、织布、整体式多孔体、凝胶或颗粒层。
一个实施方式中，聚酮介质为膜时，作为膜体积，只要是能将蛋白质纯化的膜体积就没有特别限定。作为膜体积的下限值，相对于纯化对象的蛋白质1.0g可示例出0.10mL以上，作为其它方式可示例出0.50mL以上，作为其它方式可示例出1.0mL以上，作为进一步的其它方式可示例出1.5mL以上。作为膜体积的上限值，相对于纯化对象的蛋白质1.0g可示例出100000mL以下，作为其它方式可示例出10000mL以下，作为其它方式可示例出1000mL以下，作为其它方式可示例出100mL以下，作为进一步的其它方式可示例出10mL以下。
一个实施方式中，作为聚酮介质的表面积，只要是能将蛋白质纯化的表面积就没有特别限定。作为表面积的下限值，相对于纯化对象的蛋白质1.0g可示例出0.0001m2以上，作为其它方式可示例出0.001m2以上，作为其它方式可示例出0.01m2以上，作为其它方式可示例出0.1m2以上，作为其它方式可示例出1.0m2以上，作为进一步的其它方式可示例出5.0m2以上。作为表面积的上限值，相对于纯化对象的蛋白质1.0g可示例出1000000m2以下，作为其它方式可示例出100000m2以下，作为其它方式可示例出10000m2以下，作为其它方式可示例出1000m2以下，作为其它方式可示例出100m2以下，作为进一步的其它方式可示例出30m2以下。表面积由比表面积计算。比表面积是指相对于聚酮介质的体积的聚酮的表面积。表面积由比表面积计算，是比表面积与聚酮介质的体积的乘积。
聚酮介质为多孔成型体时，作为聚酮介质的孔径，只要是能将蛋白质纯化的孔径就没有特别限定。孔径的上限值可示例出1000nm以下，作为其它方式可示例出900nm以下，作为其它方式可示例出800nm以下，作为其它方式可示例出700nm以下，作为其它方式可示例出600nm以下，作为其它方式可示例出500nm以下，作为进一步的其它方式可示例出400nm以下。作为孔径的下限值，可示例出50nm以上，作为其它方式可示例出60nm以上，作为其它方式可示例出70nm以上，作为其它方式可示例出80nm以上，作为其它方式可示例出90nm以上，作为进一步的其它方式可示例出100nm以上。
聚酮介质的孔径分布任选三维均匀或不均匀。三维均匀的膜孔径可以通过膜的三维扫描型电子显微镜(SEM)图像加以确认。在测定SEM时，例如可以使用FIB-SEM FEIHelios NanoLab 600(FEI公司制)，作为测定方法，可列举出专利文献8的第[0032]段中记载的方法作为例子。
作为成为多孔膜的原料的聚酮的制造方法，没有特别限制，可以使用例如专利文献9中记载那样的公知的方法进行制造。一个实施方式中，聚酮通过在液体介质中、在催化剂的存在下使烯属不饱和化合物与一氧化碳悬浮聚合而得到。作为液体介质，只要是能用于聚酮的悬浮聚合的液体就可以是任意液体，从聚合活性、流动性和处理性的观点出发，优选水溶性有机溶剂。作为液体介质，例如可以列举出甲醇、乙醇、丙醇、异丙醇、丁醇、六氟异丙醇、乙二醇等醇类；间甲酚等酚类；苯胺等胺类；丙酮、甲乙酮等酮类；二乙醚、乙二醇、聚乙二醇、四氢呋喃、二甘醇双甲醚等醚类；乙腈等腈类；乙酸、乙酸甲酯等酯类等，这些当中可以单独使用或作为多种混合溶剂而使用。
一个实施方式中，作为成为纯化对象的蛋白质，只要是蛋白质单体与蛋白质聚集体能通过聚酮介质分离的蛋白质就没有特别限定。例如，作为成为纯化对象的蛋白质，可列举出白蛋白、球蛋白、或纤维蛋白原。另外，作为成为纯化对象的蛋白质，作为其它方式可示例出抗体。
一个实施方式中，对于作为生理活性物质的一个例子的抗体而言，如生化学中一般的定义所述，可列举出作为脊椎动物的感染防御机制的B淋巴细胞所产生的糖蛋白分子(也称为γ球蛋白或免疫球蛋白)。例如，实施方式中纯化的抗体作为人的药物使用，与位于作为给予对象的人的体内的抗体具有实质相同的结构。
抗体可以为人抗体，也可以为除人以外的牛和小鼠等哺乳动物来源抗体蛋白质。或者抗体也可以为与人IgG的嵌合抗体蛋白质、及人源化抗体。与人IgG的嵌合抗体是指：可变区为小鼠等除人以外的生物来源但其它恒定区被置换为人源的免疫球蛋白的抗体。另外，人源化抗体是指：可变区中互补决定区(complementarity-determining region：CDR)为除人以外的生物来源但其它框架区(framework region：FR)为人源的抗体。人源化相比于嵌合抗体可进一步降低免疫原性。
抗体的类别(同种型)和亚类没有特别限定。例如，抗体根据恒定区的结构不同而分为IgG、IgA、IgM、IgD和IgE这5类。然而，实施方式的过滤方法中成为纯化对象的抗体也可以为5类中的任一种。另外，人抗体中，IgG中有IgG1至IgG4这4个亚类，IgA中有IgA1和IgA2这2个亚类。然而，实施方式的过滤方法中成为纯化对象的抗体的亚类也可以为任一种。需要说明的是，实施方式的过滤方法中成为纯化对象的抗体中也可以包含蛋白质与Fc区结合的Fc融合蛋白质等抗体相关蛋白质。
进而，抗体也可以根据来源进行分类。然而，实施方式的过滤方法中成为纯化对象的抗体可以是天然的人抗体、利用基因重组技术而制造的重组人抗体、单克隆抗体、或多克隆抗体中的任意者。这些抗体中，作为实施方式的过滤方法中成为纯化对象的抗体，从作为抗体药物的需求、重要性的观点出发，单克隆抗体是适宜的，但不限定于此。
作为抗体，可示例出包含IgM、IgD、IgG、IgA或IgE中的任意者的单克隆抗体或多克隆抗体。另外，抗体例如可以为源自血浆产物，或者也可以为源自细胞培养液。通过细胞培养而得到抗体时，作为细胞，可以使用动物细胞或微生物。作为动物细胞，种类没有特别限定，可列举出CHO细胞、Sp2/0细胞、NS0细胞、Vero细胞、PER.C6细胞等。作为微生物，种类没有特别限定，可列举出大肠杆菌、酵母等。
一个实施方式中，通过聚酮介质进行过滤之前的蛋白质中除了目标蛋白质的单体以外可以包含生物体高分子。作为生物体高分子，只要是成为除病毒的过滤器的堵塞原因的物质就没有特别限定，作为目标蛋白质的聚集体的其它方式，可示例出目标蛋白质与除目标蛋白质以外的蛋白质的聚集体。一个实施方式中蛋白质的聚集体可示例出多个其单体聚集而形成者。生物体高分子有时也称为生物体高分子集合体。
一个实施方式中，只要是蛋白质单体与蛋白质聚集体能通过聚酮介质分离的蛋白质，所包含的蛋白质单体的分子量就没有特别限定。作为所包含的蛋白质单体的分子量的下限值可示例出0.1kDa以上，作为其它方式可示例出1kDa以上，作为其它方式可示例出10kDa以上，作为其它方式可示例出50kDa以上，作为进一步的其它方式可示例出100kDa以上。作为分子量的上限值可示例出10000kDa以下，作为其它方式可示例出5000kDa以下，作为其它方式可示例出1000kDa以下，作为其它方式可示例出500kDa以下，作为进一步的其它方式可示例出200kDa以下。
一个实施方式中，作为含蛋白质溶液，蛋白质只要溶解于溶液中就没有特别限定。能用作溶液的缓冲液的种类没有特别限定，例如可示例出溶解了tris盐、乙酸盐、Tween、山梨糖醇、麦芽糖、甘氨酸、精氨酸、赖氨酸、组氨酸、磺酸盐、磷酸盐、柠檬酸或氯化钠的缓冲液。
一个实施方式中，作为蛋白质溶液的浓度，蛋白质只要溶解于溶液中就没有特别限定。作为蛋白质溶液浓度的下限值可示例出0.01mg/mL以上，作为其它方式可示例出0.05mg/mL以上，作为其它方式可示例出0.1mg/mL以上，作为其它方式可示例出0.5mg/mL以上，作为其它方式可示例出1.0mg/mL以上，作为进一步的其它方式可示例出5.0mg/mL以上。作为蛋白质溶液浓度的上限值可示例出100mg/mL以下，作为其它方式可示例出90mg/mL以下，作为其它方式可示例出80mg/mL以下，作为其它方式可示例出70mg/mL以下，作为其它方式可示例出60mg/mL以下，作为其它方式可示例出50mg/mL以下，作为其它方式可示例出40mg/mL以下，作为其它方式可示例出30mg/mL以下，作为其它方式可示例出25mg/mL以下，作为进一步的其它方式可示例出20mg/mL以下。
一个实施方式中，缓冲液的浓度只要使上述的溶解物溶解就没有特别限定。作为缓冲液的浓度的下限值可示例出0mmol/L以上，作为其它方式可示例出0.5mmol/L以上，作为其它方式可示例出1.0mmol/L以上，作为其它方式可示例出5mmol/L以上，作为其它方式可示例出10mmol/L以上，作为其它方式可示例出15mmol/L以上，作为进一步的其它方式可示例出25mmol/L以上。
一个实施方式中，蛋白质溶液或缓冲液的pH只要是蛋白质单体与蛋白质聚集体能通过聚酮介质分离的pH就没有特别限定。作为pH的下限值可示例出4.0以上，作为其它方式可示例出4.5以上，作为进一步的其它方式可示例出5.0以上，作为进一步的其它方式可示例出5.5以上，作为进一步的其它方式可示例出6.0以上。作为pH的上限值可示例出10.0以下，作为其它方式可示例出9.0以下，作为进一步的其它方式可示例出8.0以下，作为进一步的其它方式可示例出8.5以下，作为进一步的其它方式可示例出8.0以下，作为进一步的其它方式可示例出7.5以下，作为进一步的其它方式可示例出7.0以下。作为pH的测定方法，没有特别限定，例如可列举出使用了氢电极、醌氢醌电极、锑电极、玻璃电极的方法。其中优选使用了玻璃电极的方法。
蛋白质溶液或缓冲液的电导率只要是蛋白质单体与蛋白质聚集体能通过聚酮介质分离的电导率就没有特别限定。作为电导率的下限值可示例出0mS/cm以上，作为其它方式可示例出1mS/cm以上，作为其它方式可示例出2mS/cm以上，作为其它方式可示例出3mS/cm以上，作为其它方式可示例出4mS/cm以上，作为进一步的其它方式可示例出5mS/cm以上。作为电导率的上限值可示例出100mS/cm以下，作为其它方式可示例出90mS/cm以下，作为进一步的其它方式可示例出80mS/cm以下，作为进一步的其它方式可示例出70mS/cm以下，作为进一步的其它方式可示例出60mS/cm以下，作为进一步的其它方式可示例出50mS/cm以下，作为进一步的其它方式可示例出40mS/cm以下。电导率的测定方法没有特别限定，例如可以利用JIS K0130“电导率测定法通则”中规定的方法。例如可列举出交流2电极方式、交流4电极方式、或电磁感应方式。其中优选为交流2电极方式。
一个实施方式中，作为纯化蛋白质，只要是纯化蛋白质中的目标蛋白质的聚集体(二聚体或多聚体)含量低于纯化前、即与聚酮接触之前的含蛋白质溶液中的蛋白质中的目标蛋白质的聚集体含量的蛋白质就没有特别限定。
一个实施方式中，作为蛋白质的聚集体，可示例出2个目标蛋白质的单体缔合而成的二聚体、3个目标蛋白质的单体缔合而成的三聚体、或4个以上目标蛋白质的单体缔合而成的多聚体、或者其混合物。需要说明的是，多聚体有时包含二聚体和三聚体。蛋白质的聚集体中，也有时包含除目标蛋白质以外的蛋白质。另外，蛋白质的聚集体可以为不可逆的聚集体，也可以为可逆的聚集体。
一个实施方式中，作为回收纯化蛋白质的操作，只要能够获得纯化蛋白质就没有特别限定，可以在溶解了纯化蛋白质的原样的溶液的状态下回收，也可以在冻结干燥的状态下回收。
一个实施方式中，作为使含蛋白质溶液与聚酮接触的操作，只要能使含蛋白质溶液与聚酮接触就没有特别限定，可列举出使含蛋白质溶液通过聚酮介质；或将聚酮介质浸渍于含蛋白质溶液中等。从相对容易地进行目标蛋白质纯化的控制的观点出发，优选使聚酮介质通过含蛋白质溶液。
一个实施方式中，作为使含蛋白质溶液通过聚酮介质的操作，可示例出利用注射器或泵等而使含蛋白质溶液通过聚酮介质。作为使含蛋白质溶液通过聚酮介质的方法，流向了聚酮介质中的某部分的含蛋白质溶液通过聚酮介质、且能从聚酮介质的其它部分回收含蛋白质溶液即可。另外，在使含蛋白质溶液通过聚酮介质的前后，也可以使与含蛋白质溶液不同的缓冲液通过聚酮介质。在回收含蛋白质溶液时，可以回收全部通过聚酮介质的含蛋白质溶液，也可以根据单位恒定体积获得级分。可以通过收集含有该纯化蛋白质的级分合并成一份，从而能够回收纯化蛋白质。另外，作为使含蛋白质溶液通过聚酮介质的流速，没有特别限定，作为下限值，相对于聚酮介质1mL，可示例出0.1mL/分钟以上，作为其它方式可示例出0.5mL/分钟以上，作为其它方式可示例出1.0mL/分钟以上，作为进一步的其它方式可示例出5mL/分钟以上。
一个实施方式中，作为使含蛋白质溶液浸渍于聚酮介质中的操作，可示例出将聚酮介质投入含蛋白质溶液中。此时，对于投入了聚酮介质的含蛋白质溶液，可以进行基于摇床等的振荡、基于搅拌子等的搅拌，也可以将溶液静置。浸渍后，通过从含蛋白质溶液中去除聚酮介质，从而能够回收纯化蛋白质。作为聚酮介质的去除方法，可示例出离心分离、过滤等。
2.去除蛋白质聚集体的方法
实施方式的从含蛋白质溶液中选择性去除含蛋白质溶液中所含的蛋白质聚集体的方法包括(b1)使含蛋白质溶液与包含聚酮的介质进行了接触的工序。
一个实施方式中，作为聚酮，只要是上述的聚酮就没有特别限定。
一个实施方式中，作为聚酮介质的形状，只要是上述的形状就没有特别限定。
聚酮介质为多孔成型体时，作为聚酮介质的孔径，只要是上述的孔径就没有特别限定。
聚酮介质的孔径分布任选三维均匀或不均匀。三维均匀的膜孔径可以通过膜的三维SEM图像等加以确认。
一个实施方式中，作为成为纯化对象的蛋白质，只要是上述的纯化对象的蛋白质就没有特别限定。另外，对于该纯化对象的蛋白质的分子量，只要是上述的分子量就也没有特别限定。
一个实施方式中，作为含蛋白质溶液，只要是上述的含蛋白质溶液就没有特别限定。
一个实施方式中，蛋白质溶液或缓冲液的浓度只要是上述的浓度就没有特别限定。
蛋白质溶液或缓冲液的pH只要是上述的pH就没有特别限定。pH的测定方法只要是上述的方法就没有特别限定。
蛋白质溶液或缓冲液的电导率只要是上述的电导率就没有特别限定。电导率的测定方法只要是上述的方法就没有特别限定。
一个实施方式中，蛋白质的聚集体没有特别限定，可示例出上述的蛋白质聚集体。
一个实施方式中，作为使含蛋白质溶液与聚酮介质接触的操作，只要是上述的接触方法就没有特别限定。从相对容易地进行聚集体去除的控制的观点出发，优选使含蛋白质溶液通过聚酮介质。
一个实施方式中，作为使含蛋白质溶液通过聚酮介质的操作，只要是进行上述通过的方法就没有特别限定。如上所述，可示例出利用注射器或泵等使含蛋白质溶液通过聚酮介质。作为使含蛋白质溶液通过聚酮介质方法，流向了聚酮介质中的某部分含蛋白质溶液通过聚酮介质、且能从聚酮介质的其它部分回收含蛋白质溶液即可。另外，在使含蛋白质溶液通过聚酮介质的前后，也可以使与含蛋白质溶液不同的缓冲液通过聚酮介质。另外，作为使含蛋白质溶液通过聚酮介质的流速，没有特别限定，作为下限值，相对于聚酮介质1mL，可示例出0.1mL/分钟以上，作为其它方式可示例出0.5mL/分钟以上，作为其它方式可示例出1.0mL/分钟以上，作为进一步的其它方式可示例出5mL/分钟以上。
一个实施方式中，聚酮介质为膜时，作为膜体积，只要是上述的膜体积就没有特别限定。
一个实施方式中，作为聚酮介质的表面积，只要是上述的表面积就没有特别限定。
一个实施方式中，作为使含蛋白质溶液浸渍于聚酮介质中的操作，可示例出将聚酮介质投入含蛋白质溶液中。此时，对于包含聚酮介质的含蛋白质溶液，可以进行基于摇床等的振荡、基于搅拌子等的搅拌，也可以将溶液静置。浸渍后，通过从含蛋白质溶液中去除聚酮介质，从而能够回收纯化蛋白质。作为聚酮载体的去除方法，可示例出离心分离、过滤等。
一个实施方式中，作为去除蛋白质聚集体的操作，如上所述，只要通过使含蛋白质溶液与聚酮接触而能使蛋白质聚集体含量选择性地低于与聚酮接触之前的含蛋白质溶液中的目标蛋白质的聚集体含量就没有特别限定。作为接触方法的例子，可列举出使含蛋白质溶液通过聚酮介质、或将聚酮在含蛋白质溶液中进行浸渍、振荡、搅拌，或进行静置等。作为选择性减少，可示例出蛋白质聚集体的量与目标蛋白质单体的量相比减少。
3.用于去除蛋白质聚集体的介质
实施方式的用于选择性去除蛋白质的聚集体的介质只要是包含聚酮的介质就没有特别限定。介质实质上可以由聚酮形成。
一个实施方式中，聚酮只要是上述的聚酮就没有特别限定。
一个实施方式中，作为聚酮介质的形状，只要是上述的形状就没有特别限定。
一个实施方式中，聚酮介质为膜时，作为膜体积，只要是上述的膜体积就没有特别限定。
一个实施方式中，作为聚酮介质的表面积，只要是上述的表面积就没有特别限定。
聚酮介质为多孔体时，作为聚酮介质的孔径，只要是上述的孔径就没有特别限定。
一个实施方式中，聚酮介质的孔径分布任选三维均匀或不均匀。三维均匀的膜孔径可以通过膜的三维SEM图像加以确认。
一个实施方式中，作为成为纯化对象的蛋白质，只要是上述的纯化对象的蛋白质就没有特别限定。另外，对于该纯化对象的蛋白质的分子量，只要是上述的分子量就也没有特别限定。
一个实施方式中，蛋白质的聚集体没有特别限定，可示例出上述的蛋白质聚集体、或其它蛋白质聚集体。
实施方式的包含聚酮的介质可以如上述1.或2.所述那样使用。由此，能够有效地去除目标蛋白质的聚集体。
4.蛋白质的纯化方法
实施方式的蛋白质的纯化方法包括如下工序：(α1)使含蛋白质溶液与包含聚酮的多孔介质(以下有时称为“聚酮多孔介质”。)接触的工序；以及(α2)使与包含聚酮的多孔介质进行了接触的含蛋白质溶液通过除病毒膜的工序。
另外，实施方式的蛋白质的纯化方法包括如下工序：(β1)使含蛋白质溶液与比表面积为4.0m2/mL以上且孔隙率50％以上的多孔介质接触的工序；以及(β2)使与多孔介质进行了接触的含蛋白质溶液通过除病毒膜的工序。
一个实施方式中，作为聚酮，只要是上述的聚酮就没有特别限定。
一个实施方式中，多孔介质的形状只要是与上述的聚酮介质同样的形状就没有特别限定。
作为多孔介质的孔径，只要与上述的聚酮介质为多孔成型体时的聚酮介质的孔径同样就没有特别限定。
多孔介质的孔径分布任选三维均匀或不均匀。三维均匀的膜孔径可以通过膜的三维SEM图像加以确认。
一个实施方式中，作为多孔介质的形状只要是能将蛋白质纯化的形状就没有特别限定，可示例出微珠、凝胶、海绵或粉末等形状，作为其它方式可示例出纤维、或膜(平膜或中空纤维膜)。作为多孔介质的形状的其它方式，可示例出平膜或中空纤维膜，作为进一步的其它方式可示例出平膜，作为进一步的其它方式可示例出中空纤维膜。多孔介质也可以为多孔成型体。多孔成型体也可以为微多孔膜、无纺布、织布、整体式多孔体、凝胶或颗粒层。
一个实施方式中，作为比表面积为4.0m2/mL以上且孔隙率50％以上的多孔介质的材料，可示例出聚酮或尼龙，作为其它方式可示例出聚酮。聚酮可以利用例如专利文献4中记载的方法制造。尼龙可以利用公知的方法制造。
一个实施方式中，多孔介质为膜时，作为膜体积，只要是能纯化蛋白质的膜体积，则没有特别限定。作为膜体积的下限值，相对于纯化对象的蛋白质1.0g可示例出0.10mL以上，作为其它方式可示例出0.50mL以上，作为其它方式可示例出1.0mL以上，作为进一步的其它方式可示例出1.5mL以上。作为膜体积的上限值，相对于纯化对象的蛋白质1.0g可示例出100000mL以下，作为其它方式可示例出10000mL以下，作为其它方式可示例出1000mL以下，作为其它方式可示例出100mL以下，作为进一步的其它方式可示例出10mL以下。
一个实施方式中，作为多孔介质的表面积，只要是能将蛋白质纯化的表面积就没有特别限定。作为表面积的下限值，相对于纯化对象的蛋白质1.0g可示例出0.0001m2以上，作为其它方式可示例出0.001m2以上，作为其它方式可示例出0.01m2以上，作为其它方式可示例出0.1m2以上，作为其它方式可示例出1.0m2以上，作为进一步的其它方式可示例出5.0m2以上。作为表面积的上限值，相对于纯化对象的蛋白质1.0g可示例出1000000m2以下，作为其它方式可示例出100000m2以下，作为其它方式可示例出10000m2以下，作为其它方式可示例出1000m2以下，作为其它方式可示例出100m2以下，作为进一步的其它方式可示例出30m2以下。表面积由比表面积计算。比表面积是指相对于聚酮介质的体积的聚酮的表面积。表面积由比表面积计算，是比表面积与聚酮介质的体积的乘积。
一个实施方式中，相对于多孔介质的体积的多孔介质的比表面积可示例出4.0m2/mL以上，作为进一步的其它方式可示例出5.0m2/mL以上，作为进一步的其它方式可示例出6.0m2/mL以上，作为进一步的其它方式可示例出7.0m2/mL以上，作为进一步的其它方式可示例出8.0m2/mL以上，作为进一步的其它方式可示例出9.0m2/mL以上，作为进一步的其它方式可示例出10.0m2/mL以上，作为进一步的其它方式可示例出11.0m2/mL以上，作为进一步的其它方式可示例出12.0m2/mL以上。进而，多孔介质的比表面积可示例出50m2/mL以下，作为进一步的其它方式可示例出49.0m2/mL以上，作为进一步的其它方式可示例出48.0m2/mL以上，作为进一步的其它方式可示例出47.0m2/mL以上，作为进一步的其它方式可示例出46.0m2/mL以上，作为进一步的其它方式可示例出45.0m2/mL以上，作为进一步的其它方式可示例出44.0m2/mL以上，作为进一步的其它方式可示例出43.0m2/mL以上，作为进一步的其它方式可示例出42.0m2/mL以上，作为进一步的其它方式可示例出41.0m2/mL以上，作为进一步的其它方式可示例出40.0m2/mL以上，作为进一步的其它方式可示例出39.0m2/mL以上，作为进一步的其它方式可示例出38.0m2/mL以上，作为进一步的其它方式可示例出37.0m2/mL以上，作为进一步的其它方式可示例出36.0m2/mL以上，作为进一步的其它方式可示例出35.0m2/mL以上，作为进一步的其它方式可示例出34.0m2/mL以上，作为进一步的其它方式可示例出33.0m2/mL以上，作为进一步的其它方式可示例出32.0m2/mL以上，作为进一步的其它方式可示例出31.0m2/mL以上，作为进一步的其它方式可示例出30.0m2/mL以上，作为进一步的其它方式可示例出29.0m2/mL以上，作为进一步的其它方式可示例出28.0m2/mL以上，作为进一步的其它方式可示例出27.0m2/mL以上，作为进一步的其它方式可示例出26.0m2/mL以上，作为进一步的其它方式可示例出25m2/mL以下，作为进一步的其它方式可示例出24m2/mL以下，作为进一步的其它方式可示例出23m2/mL以下，作为进一步的其它方式可示例出22m2/mL以下，作为进一步的其它方式可示例出21m2/mL以下。
具有上述比表面积的多孔介质的孔隙率可示例出50％以上、作为进一步的其它方式可示例出55％以上、作为进一步的其它方式可示例出60％以上、作为进一步的其它方式可示例出65％以上、作为进一步的其它方式可示例出68％以上、作为进一步的其它方式可示例出69％以上、作为进一步的其它方式可示例出70％以上、作为进一步的其它方式可示例出71％以上、作为进一步的其它方式可示例出72％以上、作为进一步的其它方式可示例出73％以上、作为进一步的其它方式可示例出74％以上、作为进一步的其它方式可示例出75％以上、作为进一步的其它方式可示例出76％以上。进而，多孔介质的孔隙率可示例出99％以下，作为进一步的其它方式可示例出95％以下，作为进一步的其它方式可示例出90％以下。
一个实施方式中，作为成为纯化对象的蛋白质，只要是包含直接用于除病毒膜时成为除病毒膜的堵塞的原因的物质(生物体高分子)的蛋白质、且与多孔介质接触后使除病毒膜的堵塞减少那样的蛋白质就没有特别限定。例如，作为成为纯化对象的蛋白质，可列举出白蛋白、球蛋白、或纤维蛋白原。作为抗体，只要是上述的抗体就没有特别限定，例如可示例出包含IgM、IgD、IgG、IgA或IgE中的任意者的单克隆抗体或多克隆抗体。抗体例如可以为源自血浆产物，或者也可以为源自细胞培养液。通过细胞培养而得到抗体时，作为细胞，可以使用动物细胞或微生物。作为动物细胞，种类没有特别限定，可列举出CHO细胞、Sp2/0细胞、NS0细胞、Vero细胞、PER.C6细胞等。作为微生物，种类没有特别限定，可列举出大肠杆菌、酵母等。
一个实施方式中，只要是包含除病毒膜的堵塞原因物质(生物体高分子)而发生除病毒膜堵塞的蛋白质、且与多孔介质接触后使除病毒膜的堵塞减少那样的蛋白质，其分子量就没有特别限定。作为分子量的下限值可示例出0.1kDa以上，作为其它方式可示例出1kDa以上，作为其它方式可示例出10kDa以上，作为其它方式可示例出50kDa以上，作为进一步的其它方式可示例出100kDa以上。作为分子量的上限值，作为10000kDa以下可示例出的其它方式，可示例出5000kDa以下；作为其它方式可示例出1000kDa以下，作为其它方式可示例出500kDa以下，作为进一步的其它方式可示例出200kDa以下。
一个实施方式中，蛋白质溶液或缓冲液的pH只要是能使目标蛋白质与除病毒膜堵塞原因物质(生物体高分子)通过多孔介质分离的pH就没有特别限定。作为pH的下限值可示例出4.0以上，作为其它方式可示例出4.5以上，作为进一步的其它方式可示例出5.0以上，作为进一步的其它方式可示例出5.5以上，作为进一步的其它方式可示例出6.0以上。作为pH的上限值，可示例出10.0以下，作为其它方式可示例出9.0以下，作为进一步的其它方式可示例出8.0以下，作为进一步的其它方式可示例出8.5以下，作为进一步的其它方式可示例出8.0以下，作为进一步的其它方式可示例出7.5以下，作为进一步的其它方式可示例出7.0以下。作为pH的测定方法，没有特别限定，例如可列举出使用了氢电极、醌氢醌电极、锑电极、玻璃电极的方法。其中优选使用了玻璃电极的方法。
蛋白质溶液或缓冲液的电导率只要是能使目标蛋白质单体与除病毒膜堵塞原因物质(生物体高分子)通过多孔介质分离的电导率就没有特别限定。作为电导率的下限值可示例出0mS/cm以上，作为其它方式可示例出1mS/cm以上，作为其它方式可示例出2mS/cm以上，作为其它方式可示例出3mS/cm以上，作为其它方式可示例出4mS/cm以上，作为进一步的其它方式可示例出5mS/cm以上。作为电导率的上限值可示例出100mS/cm以下，作为其它方式可示例出90mS/cm以下，作为进一步的其它方式可示例出80mS/cm以下，作为进一步的其它方式可示例出70mS/cm以下，作为进一步的其它方式可示例出60mS/cm以下，作为进一步的其它方式可示例出50mS/cm以下，作为进一步的其它方式可示例出40mS/cm以下。电导率的测定方法没有特别限定，例如可以利用JIS K0130“电导率测定法通则”中规定的方法。例如可列举出交流2电极方式、交流4电极方式或电磁感应方式。其中优选为交流2电极方式。
一个实施方式中，作为纯化蛋白质，只要是纯化蛋白质中的除病毒膜堵塞原因物质(生物体高分子)含量低于纯化前、即与多孔介质接触之前的含蛋白质溶液中的蛋白质中的除病毒膜堵塞原因物质(生物体高分子)的蛋白质就没有特别限定。
一个实施方式中，作为使含蛋白质溶液与多孔介质接触的操作，只要能使含蛋白质溶液与多孔介质接触就没有特别限定，可列举出使含蛋白质溶液通过多孔介质、或将多孔介质浸渍于含蛋白质溶液中等。从相对较容易地进行目标蛋白质纯化的控制的观点出发，优选使含蛋白质溶液通过多孔介质。
一个实施方式中，作为使含蛋白质溶液通过多孔介质的操作，可示例出利用注射器或泵等使含蛋白质溶液通过多孔介质的操作。作为使含蛋白质溶液通过多孔介质的方法，流向了多孔介质中的某部分的含蛋白质溶液通过多孔介质且能从多孔介质的其它部分回收含蛋白质溶液即可。另外，在使含蛋白质溶液通过多孔介质的前后，也可以使与含蛋白质溶液不同的缓冲液通过多孔介质。在回收含蛋白质溶液时，可以回收全部通过多孔介质的含蛋白质溶液，也可以根据单位恒定体积获得级分。可以通过收集含有该纯化蛋白质的级分合并成一份，从而能够回收纯化蛋白质。另外，作为使含蛋白质溶液通过多孔介质的流速，没有特别限定，作为下限值，相对于聚酮介质1mL，可示例出0.1mL/分钟以上，作为其它方式可示例出0.5mL/分钟以上，作为其它方式可示例出1.0mL/分钟以上，作为进一步的其它方式可示例出5mL/分钟以上。
一个实施方式中，作为使含蛋白质溶液浸渍于多孔介质中的操作，可示例出将多孔介质投入含蛋白质溶液中。此时，对于被投入了多孔介质的含蛋白质溶液，可以进行基于摇床等的振荡、基于搅拌子等的搅拌，也可以将溶液静置。浸渍后，可以通过从含蛋白质溶液中去除多孔介质，从而能够回收纯化蛋白质。作为多孔介质的去除方法，可示例出离心分离、过滤等。
一个实施方式中，作为成为纯化对象的蛋白质，只要是上述的纯化对象的蛋白质就没有特别限定。另外，对于该纯化对象的蛋白质的分子量，只要是上述的分子量就也没有特别限定。
一个实施方式中，通过多孔介质进行过滤前的蛋白质除了目标蛋白质的单体以外可以包含生物体高分子。作为生物体高分子，只要是成为除病毒的过滤器的堵塞的原因的物质就没有特别限定，作为目标蛋白质的聚集体的其它方式，可示例出目标蛋白质与除目标蛋白质以外的蛋白质的聚集体。一个实施方式中，蛋白质的聚集体可示例出多个该单体聚集而形成者。
一个实施方式中，作为含蛋白质溶液，只要是上述的含蛋白质溶液就没有特别限定。
一个实施方式中，蛋白质溶液或缓冲液的浓度只要是上述的浓度就没有特别限定。
蛋白质溶液或缓冲液的pH只要是上述的pH就没有特别限定。pH的测定方法只要是上述的方法就没有特别限定。
蛋白质溶液或缓冲液的电导率只要是上述的电导率就没有特别限定。电导率的测定方法只要是上述的方法就没有特别限定。
一个实施方式中，作为蛋白质的聚集体，只要是上述的蛋白质聚集体就没有特别限定。
一个实施方式中，除病毒膜只要是实质上能去除病毒者就没有特别限定，作为例子具有约15nm以上且约75nm以下的标称孔尺寸。例如，标称孔尺寸20nm的膜中，例如能够去除细小病毒(直径18nm以上且26nm以下)，另一方面，大小为160kD(约8nm)这样的蛋白质例如单克隆抗体能够通过。例如使用标称孔尺寸35nm以上的膜，例如能够去除逆转录病毒(直径80nm以上且100nm以下)。
一个实施方式中，除病毒膜具有100kD～1000kD的分级分子量。在这方面，膜的分级分子量(MWCO)是指90％能通过膜的分子和颗粒的标称分级分子量(nominal molecularweight)。
一个实施方式中，作为除病毒膜的材料，只要是能够去除病毒的膜就没有特别限定，可列举出聚醚砜、聚砜、聚偏氟乙烯、纤维素、纤维素衍生物或它们的混合物。分别可以利用公知的方法制造(参照专利文献6、7、或非专利文献2～5。)
一个实施方式中，将工序(α1)中使用的聚酮多孔介质或工序(β1)中使用的多孔介质与工序(α2)或工序(β2)中使用的除病毒膜连接时，可以将两者直接连接，也可以在期间存在其它过滤工序。
一个实施方式中，在将工序(α1)中使用的聚酮多孔介质或工序(β1)中使用的多孔介质与工序(α2)或工序(β2)中使用的除病毒膜连接时，就对工序(α1)中使用的聚酮多孔介质或工序(β1)中使用的多孔介质施加的压力而言，作为上限，可示例出对除病毒膜施加的压力的1/2以下，作为其它方式可示例出1/2.5以下，作为其它方式可示例出1/3以下，作为其它方式可示例出1/3.5以下，作为其它方式可示例出1/4以下。进而作为下限可示例出1/40以上，作为其它方式可示例出1/35以上，作为其它方式可示例出1/30以上，作为其它方式可示例出1/25以上、1/20以上。
一个实施方式中，在与多孔介质接触后，每单位时间用除病毒膜进行处理的任意蛋白质为每单位时间不与多孔介质接触的情况下用除病毒膜进行处理的任意蛋白质的1.05倍以上，作为其它方式可示例出1.1倍以上，作为其它方式可示例出1.2倍以上，作为其它方式可示例出1.5倍以上，作为其它方式可示例出2.0倍以上，作为其它方式可示例出2.5倍以上，作为其它方式可示例出3.0倍以上，作为其它方式可示例出3.5倍以上，作为其它方式可示例出4.0倍以上，作为其它方式可示例出4.5倍以上，作为其它方式可示例出5.0倍以上。
用除病毒膜处理后的含蛋白质溶液中的病毒的去除率至少为99.9％。
一个实施方式中，预滤器是设置于除病毒膜前面的膜，通过减少通过除病毒膜的含蛋白质溶液中所含的除病毒膜的堵塞原因物质，从而能够改善目标蛋白质的处理量、Flux。
实施例
以下对实施方式的实施例进行说明，但这些并非用于对实施方式进行任何限定。
〔实施例A1〕
(1)包含聚酮的多孔介质的制作
利用专利文献4的第[0062]至[0071]段中记载的方法，作为包含聚酮的多孔介质，制作了具有记载于表1中的特性的聚酮多孔膜PK1。
(2)聚酮多孔膜的比表面积
利用BET比表面积测定装置(Macsorb HMmodel-1201，Moutech公司制)测定了评价对象的聚酮多孔膜PK1的比表面积。将结果示于表1。
(3)抗体溶液的制备
使用过滤膜(Asahi Kasei Medical Co.,Ltd.制、商品名BioOptimal(注册商标)MF-SL)将包含CRL12445抗体生产细胞的培养液过滤，得到包含杂质和0.74g/L的单克隆抗体的抗体溶液(培养上清液)。
(4)抗体蛋白单体溶液的制备
商业上典型的方法中，用蛋白A亲和色谱和离子交换色谱等色谱法将(3)中得到的抗体溶液纯化，用包含氯化钠的15mmol/L tris-HCl缓冲液(pH7.0、5mS/cm)替换缓冲液，制备了抗体蛋白单体溶液。溶液的电导率利用电导率计CM-40S(DKK-TOACORPORATION制)进行测定。
(5)抗体蛋白聚集体溶液的制备
在(4)中得到的抗体蛋白单体溶液的一部分中加入盐酸，调节至pH2.5并维持1小时。然后，使用氢氧化钠水溶液进行中和后，用包含氯化钠的15mmol/L tris-HCl缓冲液(pH7.0、5mS/cm)更换缓冲液，制备了包含大量抗体蛋白聚集体的抗体蛋白聚集体溶液。
(6)包含聚集体的抗体溶液的制备
将(4)中得到的抗体蛋白单体溶液与(5)中得到的抗体蛋白聚集体溶液混合，制备了包含4％的抗体蛋白聚集体的溶液。此处所谓的4％表示溶液中所含的抗体蛋白中的二聚体、及二聚体以上的聚集体的比例。如(7)中说明所述，聚集体量利用尺寸排阻色谱进行测定。
(7)聚集体量的测定
对于(6)中制作的包含抗体蛋白聚集体的溶液，利用下述的条件，使用尺寸排阻色谱(SEC：Size Exclusion Chromatography)装置测定了聚集体量。
柱：ACQUITY UPLC BEH200 SEC1.7μm(Waters公司制)柱温度：30℃系统：ACQUITYUPLC H CLASS(Waters公司制)
流动相：0.1mol/L磷酸氢二钠+0.2mol/L L(+)-精氨酸水溶液(用盐酸调节为pH6.7)
(8)聚酮多孔膜模块的制作
将(1)中得到的聚酮多孔膜PK1切成直径2.5cm的圆形状，在重叠3张的状态下夹持于有效膜面积为3.8cm2的注射器支架(ADVANTEC KS-25不锈钢注射器支架)上，作为实施例A1的聚酮多孔膜模块。将实施例A1的聚酮多孔膜模块中的聚酮多孔膜PK1的使用膜体积示于表1。
(9)除病毒膜的制作
将利用专利文献10的第[0066]～[0088]段中记载的方法制作的中空纤维膜以有效膜面积为2.8cm2的方式组装而成的过滤器用作除病毒膜。需要说明的是，有效膜面积由中空纤维膜的内径和有效长度而计算。
(10)压力比的测定
在(8)中制作的实施例A1的聚酮多孔膜模块与除病毒膜之间设置有液体压力计的状态下使其连接，通过196kPa的压力流通水，测定了对除病毒膜施加的压力(kPa)。将从196kPa中减去对除病毒膜施加的压力值而得到的值作为对聚酮多孔膜施加的压力，将用对除病毒膜施加的压力除以对聚酮多孔膜施加的压力而得到的数值作为压力比记载于表1中。
(11)抗体处理量1的测定
将(8)中制作的实施例A1的聚酮多孔膜模块与(9)中得到的除病毒膜连接，将(6)中制作的包含聚集体的抗体溶液作为死端，以196kPa的恒定压力进行通液。此时，将过滤至除病毒膜每单位面积中的每单位时间的抗体溶液处理速度(LMH＝处理液量(L)/除病毒膜面积(m2)/时间)低于20LMH的时间点的液量作为处理液量(L)，由得到的抗体溶液的浓度与处理液量的乘积计算出抗体处理量。将用抗体处理量除以使用过的除病毒膜面积而得到的值作为抗体处理量1记载于表1中。
(12)抗体处理量2的测定
作为抗体处理量2，计算出：相对于实施例A1的聚酮多孔膜模块每单位体积(L)的未使用实施例A1的聚酮多孔膜模块而仅用除病毒膜处理时的处理量，使用实施例A1的聚酮多孔膜模块时的除病毒膜的处理量的改善量(kg)。首先与(11)同样地，将过滤至除病毒膜每单位面积的每单位时间的抗体溶液处理速度(LMH＝处理液量(L)/除病毒膜面积(m2)/时间)低于20LMH的时间点的液量作为处理液量(L)，由得到的抗体溶液的浓度与处理液量的乘积计算出抗体处理量(kg/m2)。从该值中减去未使用实施例A1的聚酮多孔膜模块而仅用除病毒膜能处理的抗体量，并除以表1中记载的使用膜体积(L)而得到的值作为抗体处理量2(kg/L)记载于表1中。由结果可知：实施例A1的聚酮多孔膜模块的比表面积大，因此大幅改善了除病毒膜的抗体处理量。
〔实施例A2〕
利用使用具有记载于表1中的特性的聚酮多孔膜PK2制作的实施例A2的聚酮多孔膜模块，除此以外进行与实施例A1同样的操作，结果记载于表1中。与PK1相比，PK2的孔径大，因此示出：比表面积变小，抗体处理的改善量稍变小，但压力损失进一步变小。
〔实施例A3〕
利用专利文献4的第[0074]～[0077]段中记载的方法，制作了由具有记载于表1中的特性的聚酮多孔中空纤维膜(内径520μm、外径840μm)PK3形成的有效膜体积为0.12mL的实施例A3的聚酮多孔膜模块。除此以外进行与实施例A1同样的操作，结果记载于表1中。由结果可知：实施例A3的聚酮多孔膜模块通过中空纤维结构来抑制压力损失、且由于比表面积大，因此显示出高抗体处理量。
〔比较例A1〕
未实施与工序(α1)或(β1)相应的工序，仅使用了与工序(α2)或工序(β2)相应的除病毒膜，除此以外进行与实施例A1同样的操作，结果记载于表1中。由结果可知：与实施例A1至实施例A3相比，通过除病毒膜的抗体处理量小。
〔比较例A2〕
作为与工序(α1)或工序(β1)相应的工序，使用尼龙1(尼龙膜(Whatman(注册商标)：7402-002)、GE Healthcare公司制、孔径0.2μm、膜体积0.12mL)，除此以外进行与实施例A1同样的操作，结果记载于表1中。由结果可知：与实施例A1至实施例A3相比，由于介质的材料不同或由于比表面积小，因此通过除病毒膜的抗体处理量中的每单位体积多孔介质的处理改善量小。
〔比较例A3〕
作为与工序(α1)或工序(β1)相应的工序，使用尼龙2(尼龙膜(Acrodisc(注册商标)Syring Filter：PN4906)、Pall公司制、孔径0.2μm、膜体积0.04mL)，除此以外进行与实施例A1同样的操作，结果记载于表1中。由结果可知：与实施例A1至实施例A3相比，由于介质的材料不同或由于比表面积小，因此通过除病毒膜的抗体处理量中的、每单位体积多孔介质的处理改善量小。
[表1]
Figure BDA0003284304490000321
〔实施例B1〕
(1)包含聚酮的介质的制作
利用专利文献4的第[0062]至[0071]段中记载的方法，制作了具有记载于表2的特性的聚酮膜1(孔径0.2μm)作为包含聚酮的介质。将制作的聚酮膜1切成直径2.5cm的圆状。用数显指示器ID-C112XBS(Mitutoyo公司制)测定了膜厚，结果为100μm。将2张切取的膜置于不锈钢支架KS-25(Advantech公司制、有效膜面积3.8cm2)上。计算出支架中的聚酮膜的有效膜体积为0.08mL。
(2)聚酮膜的表面积
使用BET比表面积测定装置(Macsorb HMmodel-1201，Moutech公司制)测定聚酮膜1的比表面积。由该测定结果，计算出聚酮膜1的表面积为0.65m2。
(3)抗体溶液的制备
使用过滤膜(Asahi Kasei Medical Co.,Ltd.制、商品名BioOptimal(注册商标)MF-SL)将包含CRL12445抗体生产细胞的培养液过滤，得到包含杂质和0.74g/L的单克隆抗体的抗体溶液(培养上清液)。
(4)基于亲和柱的抗体蛋白质的纯化
在用磷酸缓冲液(20mmol/L磷酸钠+150mmol/LNaCl(pH8.0))平衡化的蛋白A柱(GEHealthcare Life Sciences制、填充了MabSelect Sure的柱)中添加(3)中准备的抗体溶液，使抗体蛋白质吸附于蛋白A上。接着，使磷酸缓冲液(20mmol/L的磷酸钠+150mmol/LNaCl(pH8.0))流通柱进行清洗后，使洗脱缓冲液(100mmol/L柠檬酸钠(pH3.6))流通柱，从蛋白A柱上洗脱抗体蛋白质，回收了杂质减少到一定程度的含抗体溶液。需要说明的是，利用以下的(8)所述的方法测定了该抗体蛋白质，结果仅确认了作为单体的抗体蛋白质的峰(下述(8)中的(3)的峰)，未能确认到聚集体(1)、聚集体(2)的峰。需要说明的是，缓冲液的pH的测定使用pH计HM-30R(DKK-TOACORPORATION制)。下述的缓冲液的pH的测定也是同样。
(5)聚集体的制备
在(4)中得到的抗体溶液的一部分中加入盐酸，调节至pH2.5并维持1小时。然后，使用氢氧化钠水溶液进行中和，制备了包含大量抗体聚集体的抗体溶液。
(6)包含聚集体的抗体溶液的制备
将(4)中得到的抗体溶液用包含任意量的氯化钠的15mmol/L tris-HCl缓冲液(pH7.0、5mS/cm)进行缓冲液更换而得到的溶液、与将(5)中得到的包含大量抗体聚集体的抗体溶液用包含任意量的氯化钠的15mmol/L tris-HCl缓冲液(pH7.0、5mS/cm)进行缓冲液更换而得到的溶液以任意的比例混合，制备了包含抗体蛋白聚集体的抗体溶液(以下有时简称“SM”。)。利用电导率计CM-40S(DKK-TOACORPORATION制)测定了抗体溶液的电导率。
(7)使含抗体溶液流通聚酮膜
使(6)中制作的包含抗体聚集体成分(杂质)和单体成分(目标生理活性物质)的抗体溶液通过(1)中置于支架上的聚酮膜1。抗体溶液的通过使用AKTA purifier(GEHealthcare公司制)，按每次通过的抗体溶液的总量的1/10体积来回收级分。加入的量为9mL(5.10mg/mL的浓度、抗体蛋白质的总量45.9mg)、流速为0.45mL/分钟。
(8)聚集体量的测定
利用下述的条件、使用尺寸排阻色谱(SEC：Size Exclusion Chromatography)装置测定了(6)中制作的包含聚集体的抗体溶液和(7)中回收的各级分中所含的蛋白质。
柱：ACQUITY UPLC BEH200 SEC1.7μm(Waters公司制)柱温度：30℃系统：ACQUITYUPLC H CLASS(Waters公司制)
流动相：0.1mol/L磷酸氢二钠+0.2mol/L L(+)-精氨酸水溶液(用盐酸调节为pH6.7)
测定了(7)中得到的最后的级分，结果得到图1所示例的色谱图，将图1放大的图是图2。溶液中所含的蛋白质大部分来源于CHO细胞CRL12445所产生的抗体，因此图2的(1)和(2)中所出现的峰是抗体的聚集体，(3)中所出现的峰可以判断为单体。由色谱图的峰的面积计算出的聚集体(1)的比例为1.18％，聚集体(2)的比例为1.83％、单体的比例为96.99％。对其它级分和包含抗体蛋白聚集体的抗体溶液也同样地进行该操作，测定了聚集体和单体的比例。需要说明的是，在以下的实施例和比较例中，将最初出现的聚集体的峰作为聚集体(1)，将第二个出现的聚集体的峰作为聚集体(2)。
(9)聚集体去除性能的评价
利用分光光度计(SpectraMax Plus384、Molecular Devices,LLC.制)测定了各级分的抗体浓度。由抗体浓度及(8)中测定的聚集体和单体比例计算出包含抗体蛋白聚集体的抗体溶液SM和各级分FT1至FT10中所含的聚集体和单体的含有重量。将该结果示于图3。
由各级分的聚集体和单体的含有重量可以得到图4所示的图。横轴的M/V是用评价对象中流通的抗体的累积重量除以评价对象的膜体积而得到的值。纵轴的C/C0是示出各级分中所含的聚集体·单体的浓度相对于首次制作的包含聚集体的抗体溶液为何种程度的比例的值。纵轴的C表示各级分的单体或聚集体(1)、(2)的浓度，C0表示在评价对象中流通之前的单体或聚集体(1)、(2)的浓度。
图4中，特别是，在M/V为400mg/mL以下的级分中，与单体相比聚集体(1)和聚集体(2)的比例减少，因此确认了在该条件下抗体聚集体被去除。
〔实施例B2〕
仅变更缓冲溶液，进行与实施例B1同样的操作。将乙酸与乙酸钠混合，制作了乙酸缓冲液(15mmol/L乙酸缓冲液、pH5.5、电导率15mS/cm)。使用乙酸缓冲液进行了缓冲液更换的抗体溶液(抗体浓度5.06mg/mL)，使之流通聚酮膜1后，利用与实施例B1的(9)同样的方法评价了聚集体去除性能。结果示于图5。图5中，特别是，在M/V为400mg/mL以下的级分中，与单体相比聚集体(1)和聚集体(2)的比例减少，因此确认了在该条件下抗体聚集体被去除。
〔实施例B3〕
仅变更膜的孔径，进行与实施例B1同样的操作。使抗体溶液以10mL(5.12mg/mL的浓度、抗体蛋白质的总量51.2mg)、流速0.50mL/分钟流通聚酮膜2(孔径0.1μm、膜厚112μm、重叠2张、有效膜体积0.09mL、表面积1.37m2)，利用与实施例B1的(9)同样的方法评价了聚集体去除性能。结果示于图6。图6中，特别是，在M/V为500mg/mL以下的级分中，与单体相比聚集体(1)和聚集体(2)的比例减少，因此确认了在该条件下抗体聚集体被去除。
〔实施例B4〕
仅变更膜的孔径，进行与实施例B1同样的操作。使抗体溶液以12mL(5.08mg/mL的浓度、抗体蛋白质的总量61.0mg)、流速0.60mL/分钟流通聚酮膜3(孔径0.4μm、膜厚85μm、重叠3张、膜体积0.10mL、表面积0.40m2)，利用与实施例B1的(9)同样的方法评价了聚集体去除性能。结果示于图7。图7中，特别是，在M/V为300mg/mL以下的级分中，与单体相比聚集体(1)和聚集体(2)的比例减少，因此确认了在该条件下抗体聚集体被去除。
〔实施例B5〕
仅变更缓冲液的电导率，进行与实施例B1同样的操作。使抗体溶液以9mL(抗体浓度5.21mg/mL、15mmol/L tris-HCl缓冲液、pH7.0、电导率35mS/cm))、流速0.45mL/分钟流通聚酮膜1，利用与实施例B1的(9)同样的方法评价了聚集体去除性能。结果示于图8。图8中特别是，在M/V为500mg/mL以下的级分中，与单体相比聚集体(1)和聚集体(2)的比例减少，因此确认了在该条件下抗体聚集体被去除。
〔实施例B6〕
变更抗体的种类和膜的种类，进行与实施例B1同样的操作。使包含人单克隆抗体AE6F4的溶液10mL(抗体浓度4.52mg/mL)以流速为0.50mL/分钟流通聚酮膜4(孔径0.1μm、膜厚101μm、重叠2张、膜体积0.08mL、表面积0.94m2)，评价了聚集体去除性能。结果示于图9。图9中，特别是，在M/V为400mg/mL以下的级分中，与单体相比聚集体(1)和聚集体(2)的比例减少，因此确认了在该条件下抗体聚集体被去除。
〔实施例B7〕
仅变更流通液体的流速，进行与实施例B3同样的操作。使抗体溶液10mL(抗体浓度5.07mg/mL)以流速为3.0mL/分钟流通聚酮膜2，评价了聚集体去除性能。结果示于图10。图10中，特别是，在M/V为500mg/mL以下的级分中，与单体相比聚集体(1)和聚集体(2)的比例减少，因此确认了在该条件下抗体聚集体被去除。
〔实施例B8〕
仅变更流通的溶液的抗体浓度，进行与实施例B3同样的操作。使抗体溶液10mL(抗体浓度14.57mg/mL)以流速为0.50mL/分钟通过聚酮膜2，评价了聚集体去除性能。结果示于图11。图11中，特别是，在M/V为500mg/mL以下的级分中，与单体相比聚集体(1)和聚集体(2)的比例减少，因此确认了在该条件下抗体聚集体被去除。
〔实施例B9〕
变更膜的形状，进行与实施例B1同样的操作。利用专利文献4的第[0074]～[0077]段中记载的方法制作表2中記载的聚酮中空纤维膜1(内径282μm、外径563μm)，以有效膜体积为0.15mL的方式制作模块。以流速为2.5mL/分钟流通抗体溶液24mL(抗体浓度5.05mg/mL)，评价了聚集体去除性能。结果示于图12。图12中，特别是，在M/V为600mg/mL以下的级分中，与单体相比聚集体(1)和聚集体(2)的比例减少，因此确认了在该条件下抗体聚集体被去除。
〔实施例B10〕
仅变更抗体和聚酮的接触方法、聚集体去除性能的评价方法，进行与实施例B1同样的操作。将聚酮中空纤维膜1冻结粉碎而得到的聚酮粉末(重量0.036g、表面积0.10m2)浸渍于抗体溶液5mL(抗体浓度0.90mg/mL)中，进行溶液的振荡。5小时后收集溶液，通过离心分离去除粉末后，利用实施例B1的(8)和(9)所述的方法进行聚集体量和抗体浓度的测定。测定收集液的单体、聚集体的重量，求出C/C0。结果示于图13。与单体相比聚集体(1)和聚集体(2)的比例减少，因此确认了在该条件下抗体聚集体被去除。
(比较例B1)
仅变更所使用的膜，进行与实施例B1同样的操作。使抗体溶液13mL(抗体浓度4.87mg/mL)以流速0.65mL/分钟流通尼龙膜(Whatman(注册商标)：7402-002、GEHealthcare公司制、孔径0.2μm、直径2.5cm、膜厚160μm、重叠2张、有效膜体积0.12mL、表面积0.52m2)，利用与实施例B1的(9)同样的方法评价了聚集体去除性能。结果示于图14。图14中启示出，M/V为400mg/mL附近的级分中，与单体相比聚集体(2)超过最初的浓度，变得难以控制纯化工艺。
将实施例B1至B9和比较例B1中使用的条件示于表2。
[表2]
Figure BDA0003284304490000391

Claims (38)

1.一种包含目标蛋白质的含蛋白质溶液的纯化方法，其包括以下的工序：
(α1)使所述含蛋白质溶液与包含聚酮的多孔介质接触的工序、以及
(α2)使与所述包含聚酮的多孔介质进行了接触的含蛋白质溶液通过除病毒膜的工序。
2.一种包含目标蛋白质的含蛋白质溶液的纯化方法，其包括以下的工序：
(β1)使所述含蛋白质溶液与比表面积为4.0m2/mL以上且孔隙率为50％以上的多孔介质接触的工序、以及
(β2)使与所述多孔介质进行了接触的含蛋白质溶液通过除病毒膜的工序。
3.根据权利要求1或2所述的方法，其中，所述多孔介质为膜状。
4.根据权利要求1～3中任一项所述的方法，其中，所述多孔介质与所述除病毒膜直接连接。
5.根据权利要求4所述的方法，其中，对所述工序(α1)或(β1)中使用的所述多孔体施加的压力为对工序(α2)或(β2)中使用的所述除病毒膜施加的压力的1/40以上且1/2以下。
6.根据权利要求1～5中任一项所述的方法，其中，施加恒定压力进行过滤。
7.根据权利要求1～6中任一项所述的方法，其中，所述含蛋白质溶液中的病毒的去除率至少为99.9％。
8.根据权利要求1～7中任一项所述的方法，其中，所述目标蛋白质为多克隆抗体或单克隆抗体。
9.根据权利要求1～8中任一项所述的方法，其中，所述含蛋白质溶液中的蛋白质浓度为100mg/mL以下。
10.根据权利要求1～9中任一项所述的方法，其中，被所述除病毒膜去除的病毒为细小病毒。
11.根据权利要求1、或3～10中任一项所述的方法，其中，所述聚酮的比表面积即聚酮表面积(m2)/聚酮体积(mL)为12m2/mL以上。
12.一种含蛋白质溶液的制造方法，其中，利用权利要求1～11中任一项所述的方法制造实质上不包含病毒的含蛋白质溶液。
13.一种除病毒膜用预滤器，其具备包含聚酮的多孔介质。
14.一种从含蛋白质溶液中回收纯化蛋白质的方法，所述方法包括以下的工序：
(a1)使所述含蛋白质溶液与包含聚酮的介质接触的工序；以及
(a2)从与所述包含聚酮的介质进行了接触的含蛋白质溶液中回收所述纯化蛋白质的工序。
15.一种选择性去除蛋白质聚集体的方法，其中，从含蛋白质溶液中选择性去除所述含蛋白质溶液中所含的蛋白质聚集体，所述方法包括以下的工序：
(b1)使所述含蛋白质溶液与包含聚酮的介质进行了接触的工序。
16.根据权利要求14或15所述的方法，其中，所述蛋白质为抗体。
17.根据权利要求16所述的方法，其中，所述抗体为源自血浆产物或源自细胞培养液的抗体。
18.根据权利要求16所述的方法，其中，所述抗体为单克隆抗体。
19.根据权利要求15～18中任一项所述的方法，其中，所述蛋白质聚集体为所述蛋白质的二聚体、三聚体和/或多聚体。
20.根据权利要求14～19中任一项所述的方法，其中，所述(a1)或(b1)的工序是使所述含蛋白质溶液通过所述包含聚酮的介质的工序。
21.根据权利要求14～20中任一项所述的方法，其中，所述含蛋白质溶液的pH为4以上且10以下。
22.根据权利要求14～21中任一项所述的方法，其中，所述含蛋白质溶液的电导率为0mS/cm以上且100mS/cm以下。
23.根据权利要求14～22中任一项所述的方法，其中，使所述含蛋白质溶液通过所述包含聚酮的介质的流速相对于包含聚酮的介质的膜体积1mL为0.1mL/分钟以上。
24.根据权利要求14～23中任一项所述的方法，其中，所述包含聚酮的介质的表面积相对于纯化对象的蛋白质1.0g至少为0.0001m2以上。
25.根据权利要求14～24中任一项所述的方法，其中，所述包含聚酮的介质为多孔成型体。
26.根据权利要求25所述的方法，其中，所述多孔成型体为微多孔膜、无纺布、织布、整体式多孔体、凝胶或颗粒层。
27.根据权利要求25或26所述的方法，其中，所述多孔成型体具有三维均匀的膜孔径。
28.根据权利要求25～27中任一项所述的方法，其中，所述多孔成型体的孔径为50nm至1000nm。
29.一种包含聚酮的介质，其用于从含蛋白质溶液中选择性去除蛋白质聚集体。
30.根据权利要求29所述的介质，其中，所述蛋白质为抗体。
31.根据权利要求30所述的介质，其中，所述抗体为源自血浆产物或源自细胞培养液的抗体。
32.根据权利要求30所述的介质，其中，所述抗体为单克隆抗体。
33.根据权利要求29～32中任一项所述的介质，其中，所述蛋白质聚集体为所述蛋白质的二聚体、三聚体和/或多聚体。
34.根据权利要求29～33中任一项所述的介质，其中，所述包含聚酮的介质为多孔成型体。
35.根据权利要求34所述的介质，其中，所述多孔成型体为微多孔膜、无纺布、织布、整体式多孔体、凝胶或颗粒层。
36.根据权利要求34或35所述的介质，其中，所述多孔成型体具有三维均匀的膜孔径。
37.根据权利要求34～36中任一项所述的介质，其中，所述多孔成型体的孔径为50nm以上且1000nm以下。
38.一种聚酮的、用于从含蛋白质溶液中选择去除蛋白质的聚集体的应用。
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