CN104801204A - 用于除去蛋白质聚集体的具有磺酸基团的膜 - Google Patents

用于除去蛋白质聚集体的具有磺酸基团的膜 Download PDF

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Abstract

本发明涉及具有高电荷密度的带负电荷的微孔过滤介质，其包括多孔基质和位于所述基质的内表面和外表面上的聚合的交联的聚合物涂层。所述涂层可以由反应物溶液形成，所述反应物溶液包含带负电荷的可交联的可聚合的丙烯酰氨基烷基单体和丙烯酰氨基交联剂，在所述基质上原位聚合。所述带负电荷的微孔过滤介质适合用作从蛋白质溶液选择性地除去蛋白质聚集体的预过滤膜。

Description

用于除去蛋白质聚集体的具有磺酸基团的膜
本申请是2010年02月26日提交的名称为“用于除去蛋白质聚集体的具有磺酸基团的膜”的201080009642.8号申请的分案申请。
技术领域
本发明总体涉及用于从蛋白质溶液中除去生物物质的介质。更具体而言，本发明涉及用聚合的交联涂层组合物饱和的带负电荷的滤膜以及制备和使用所述滤膜的方法。
背景技术
在衍生自完整有机体或哺乳动物细胞培养物来源的基于蛋白质的治疗性生物分子的生产过程中除去蛋白质聚集体和病毒颗粒是经常遇到的分离任务。例如，衍生自血浆的蛋白质溶液例如免疫球蛋白(IgG)和其他蛋白质(天然的或重组的)例如单克隆抗体(mAb)、肽、糖和/或核酸通常包含堵塞并且污染病毒截留滤器等的蛋白质聚集体，其包含蛋白质三聚体或更大的蛋白质聚合物。
通过过滤从蛋白质溶液除去病毒颗粒的常见问题是使用相对低容量的超滤滤器，这显著增加成本并且减慢过滤操作。由于病毒颗粒的尺寸仅比蛋白质分子的尺寸大约3-5倍，即约25nm对约5-10nm，所以不得不仔细选择滤器的孔径使其处于这些个体的尺寸之间，通常约20nm。因此，约大于三聚体或更大的蛋白质聚合物的蛋白质聚集体以及变性蛋白质、脂质、甘油三酯等不能通过典型的病毒截留滤器，引起孔阻塞并且显著降低滤器的容量(通量)。即使在0.01-0.1％的低浓度下这些不需要的和不期望的组分也会快速堵塞病毒截留滤器。
但是，由于不断增加的溶液效价，蛋白质聚集仍然是基于蛋白质的治疗性生物分子的生物加工生产中日益严峻的问题。蛋白质聚集体在纯化过程的不同阶段形成，并且为了维持病毒截留滤器足够的通量，需要在蛋白质聚集体到达病毒截留滤器之前将其除去。从蛋白质溶液选择性除去约大于三聚体或更大的蛋白质聚合物的蛋白质聚集体的可选择方法包括使用昂贵的凝胶色谱或者分子排阻色谱。选择性除去蛋白质聚集体的最方便的方式是使蛋白质和/或其他生物分子的溶液在到达位于下游的病毒颗粒超滤截留滤器之前通过上游的过滤介质，由此在上游选择性截留蛋白质聚集体，允许蛋白质溶液中的蛋白质单体流过病毒截留滤器。
从蛋白质溶液除去蛋白质聚集体和病毒颗粒的一种方法包括两步超滤法，在各步骤中使用超滤膜。参见例如Antoniou的第6,365,395号美国专利，其中在第一过滤步骤中在上游从蛋白质溶液除去蛋白质聚集体，在第二过滤步骤中，在下游从不含蛋白质聚集体的蛋白质溶液除去病毒颗粒。
Siwak等人的第7,118,675号美国专利教导了用于从蛋白质流除去蛋白质聚集体和病毒颗粒的另一种两步过滤法，其中首先将蛋白质流通过一层或多层吸附性深层滤器、带电荷的或表面改性的多孔膜或者小的色谱介质床过滤，以产生不含蛋白质聚集体的蛋白质流。之后是使回收的溶液经过超滤膜以除去病毒颗粒的第二步骤。
可用于预处理蛋白质流的一种方法采用使用与无机助滤剂组合的纤维素介质的深层过滤。例如，可商购自Millipore Corporation的Prefilter当被用于在病毒过滤前预处理蛋白质流时可增加细小病毒滤器的通量。但是，该预滤器表现出对苛性碱处理的抗性不足以及相对较高的有机可提取物。由于经常需要使用苛性碱溶液清洁或消毒病毒滤器，因此当将病毒滤器与预滤器组合时如果可以通过相同的处理将二者串联消毒则该消毒方法将变得显著地更有效和经济。因此，期望提供能够抵抗暴露于苛性碱水溶液(例如0.1N NaOH 1小时)而不损失预过滤性质的用于蛋白质溶液的预处理介质。另外，通常在蛋白质纯化过程后期进行病毒过滤，此时需要将进入流体流的有机可提取物的量最小化。基于纤维素和助滤剂的深层滤器已显示出与膜相比显著更高水平的可提取物，并因此就生物分子等的后期纯化而言可能具有潜在问题。
因此，期望提供过滤介质以及使用和制备所述过滤介质的方法和装置，用于通过上游的预过滤方法从包含蛋白质和/或生物分子的溶液中除去蛋白质聚集体和其他堵塞性和结垢性组分，所述预过滤方法避免下游过滤介质(例如与下游的从包含蛋白质和/或生物分子的溶液超滤除去病毒颗粒联合使用的那些下游过滤介质)的过早堵塞。
通过本文提供的本发明的描述，本发明的这些优点以及另外的发明特征将是显而易见的。
发明内容
对应于上述与在衍生自完整有机体或哺乳动物细胞培养物来源的生物分子和基于蛋白质的治疗性生物分子的生产中除去蛋白质聚集体和病毒颗粒相关的需要，本发明在某些实施方案中教导了具有高电荷密度的带负电荷的微孔过滤介质，其具有苛性碱稳定性(即可以抵抗被碱性溶液的降解)并且适合用于在超滤除去病毒颗粒的上游从蛋白质溶液选择性除去蛋白质聚集体。
本发明在某些实施方案中教导了在进行下游的蛋白质流的病毒过滤或其他生物加工步骤之前在上游从蛋白质流除去蛋白质聚集体。在上游除去蛋白质聚集体可减少否则会出现在下游病毒滤器的污染和堵塞，由此增加它们的通量和流量。
在某些实施方案中，本发明教导了用于从蛋白质溶液除去蛋白质聚集体的一次性的带负电荷的微孔介质，由此省去了与在使用间隔清洁和储存过滤介质相关的费用，还省去了与根据政府管理机构的要求验证此类清洁操作相关的费用和时间。
在某些实施方案中，本发明提供具有高电荷密度的带负电荷的经涂覆的微孔介质，其包括微孔基质和交联的涂层组合物，所述交联的涂层组合物通过暴露于电子束并且在不存在化学聚合自由基引发剂的条件下在该基质的外表面和内表面上原位聚合。所述交联的涂层组合物优选由带负电荷的自由基可聚合的丙烯酰氨基烷基单体和丙烯酰氨基交联剂形成。
在某些实施方案中，本发明提供具有高电荷密度的带负电荷的经涂覆的微孔介质，其包括微孔基质和交联的涂层组合物，所述交联的涂层组合物由具有包含带负电荷的悬垂的磺酸的基团及其盐的可聚合的多官能丙烯酰氨基烷基单体和多官能丙烯酰氨基交联剂形成，在所述基质的外表面和内表面原位聚合。尽管聚合优选地在不存在化学聚合自由基引发剂的条件下通过将单体/交联剂/介质系统暴露于电离辐射例如电子束而引发，但是也可使用适合的化学聚合自由基引发剂以引发聚合。
在另一个实施方案中，本发明教导了带负电荷的经涂覆的微孔介质，其包括微孔基质和由反应物溶液形成的交联的涂层组合物，所述反应物溶液包含2-丙烯酰氨基-2-甲基丙磺酸(AMPS)单体及其盐的可聚合的单体和N,N’-亚甲基双丙烯酰胺(MBAm)交联剂，在所述基质的内表面和外表面上原位聚合。所得聚合的交联的涂层组合物仅包含酰胺-酰胺交联键。
在另一个实施方案中，本发明教导了带负电荷的经涂覆的微孔膜，其包括微孔基质和AMPS及其盐的交联的聚合涂层组合物，其中所述交联的涂层组合物在所述基质的内表面和外表面上原位聚合。
在另一个实施方案中，本发明教导了微孔膜，其具有覆盖所述微孔基质的全部内表面和外表面的聚合的交联的涂层组合物，还包含补加的改性单体，其优选地以少于带负电荷的包含磺酸的基团单体或交联剂的量存在。
在其他实施方案中，本发明提供了经涂覆的微孔膜，适合用于预过滤装置中，用于从终端常规过滤(NFF)法中的蛋白质溶液选择性除去蛋白质聚集体。将蛋白质溶液通过包括一层或多层本文教导的经涂覆的微孔膜的过滤介质预过滤，以回收几乎不含蛋白质聚集体的蛋白质溶液。
在其他实施方案中，本发明提供了制备具有高电荷密度的带负电荷的经涂覆的微孔介质的方法，其中所述微孔基质用交联的涂层组合物涂覆，与交联的涂层组合物接触，或用交联的涂层组合物饱和，所述交联的涂层组合物包含带负电荷的包含磺酸基团的可聚合的丙烯酰氨基烷基单体和丙烯酰氨基交联剂以及任选存在的化学自由基引发剂，沉积在所述微孔基质的全部内表面和外表面。
在其他实施方案中，本发明提供了制备具有高电荷密度的带负电荷的经涂覆的微孔介质的方法，其中在微孔基质的全部外表面和内表面上用聚合的交联的涂层组合物涂覆，所述交联的涂层组合物包含可聚合的AMPS及其盐的单体和丙烯酰氨基交联剂例如MBAm，使得所述交联的涂层组合物在所述微孔基质的全部内表面和外表面上原位聚合。
在另一个实施方案中，本发明提供了用聚合的交联的涂层组合物涂覆的微孔基质的制备方法，其包括以下步骤：a)提供微孔基质；b)任选地用润湿液洗涤所述微孔基质从而将基质的全部内表面和外表面润湿；c)任选地用第二种润湿液洗涤所述微孔基质的润湿表面以置换第一种润湿液，使所述基质的外表面和内表面被第二种液体润湿；d)使所述基质与反应物溶液接触，所述反应物溶液包含带负电荷的可聚合的丙烯酰氨基烷基单体、丙烯酰氨基交联剂例如MBAm和任选存在的自由基聚合引发剂；e)使带负电荷的交联的丙烯酰氨基烷基单体涂层组合物沉积在所述基质的内表面和外表面上；f)从反应物溶液中取出用交联的涂层组合物饱和的经涂覆的基质；g)使交联的丙烯酰氨基烷基涂层组合物聚合，在所述基质的全部内表面和外表面上形成聚合的交联的涂层组合物；h)在水和/或有机溶剂中清洗所述经涂覆的微孔基质，以除去任何未反应的物质和寡聚体物质；以及i)干燥所述经涂覆的微孔基质。
在另一个实施方案中，本发明提供了通过两步过滤法从蛋白质溶液中选择性分离蛋白质聚集体和病毒颗粒，其包括首先在常规过滤模式下将蛋白质溶液通过具有一层或多层本文所教导的经涂覆的微孔膜的预过滤装置过滤，然后回收基本不含蛋白质聚集体的蛋白质溶液。第二个过滤步骤包括在NFF模式或切向流过滤(TFF)模式下将回收的蛋白质溶液通过一个或多个超滤病毒去除膜过滤，以截留病毒颗粒并且允许不含病毒颗粒的蛋白质溶液从其通过。
在其他实施方案中，本发明提供了带负电荷的经涂覆的微孔膜，其适合用于使用终端NFF法的预过滤装置中，用于从蛋白质的水溶液中选择性地除去蛋白质聚集体和其他结垢性和堵塞性组分。
在其他实施方案中，本发明提供了使用预过滤装置的预过滤法，所述预过滤装置包括一个或多个本文教导的一次性的经涂覆的微孔膜，用于通过使用NFF法从生物溶液中选择性地除去蛋白质聚集体。
在另一个实施方案中，本发明提供在除去病毒颗粒之前从含有生物分子的水溶液中选择性地除去蛋白质聚集体的方法，包括在NFF操作模式下将含有生物分子的水溶液通过一个或多个本文教导的经涂覆的微孔膜过滤，和回收基本不含蛋白质聚集体的含有生物分子的溶液。
本发明的另一个目的是提供在下游除去病毒颗粒之前从包含生物分子的水溶液中选择性地除去蛋白质聚集体、变性蛋白质、脂质、甘油三酯等的方法，包括在NFF操作模式下将生物分子水溶液通过一个或多个本文教导的预过滤经涂覆的微孔膜过滤，和回收基本不含蛋白质聚集体、变性蛋白质、脂质、甘油三酯等的生物分子水溶液。
在另一个实施方案中，本发明提供了在NFF操作模式中使用一个或多个本文教导的带负电荷的经涂覆的微孔膜从蛋白质溶液中选择性地除去蛋白质聚集体的方法。
在其他实施方案中，本发明提供在NFF模式中使用一个或多个本文教导的带负电荷的经涂覆的微孔膜从蛋白质溶液中选择性地除去蛋白质聚集体，之后通过一个或多个超滤病毒去除膜以NFF或TFF模式除去病毒颗粒的方法。
本发明还提供处理包含带正电荷的生物分子的生物流体的方法，其包括使所述生物流体与本文教导的带负电荷的经涂覆的微孔膜接触。
本发明还提供包括一种或多种本文教导的具有高电荷密度的带负电荷的微孔经涂覆的基质的滤器装置、色谱装置和/或膜组件。
本发明另外的特征和优点将列于下文的详细描述和权利要求中。对于本领域技术人员显而易见的是，可以在不脱离本发明的范围和精神的前提下对本发明进行多种修改和更改。应理解前文的一般性描述和下文对权利要求的详细描述以及附图仅为示例性和阐释性的，其旨在提供本发明教导的各种实施方案的阐释。本文所述的具体实施方案仅以举例说明的方式提供并且不以任何形式具有限制性。
附图说明
图1是阐明本发明方法的第一个实施方案的流程图。
图2是阐明本发明方法的另一个实施方案的流程图。
图3用图示说明了根据另一个实施方案的预滤器/滤器组合的通过量性能测量，在30psig操作压力下，在一系列不同电导率和pH溶液条件范围内使用热休克SeraCare IgG(等电点约6-9)测试液进行；
图4说明了在通过量测量期间根据另一个实施方案的结合至膜预滤器的蛋白质物质的SDS-PAGE分析，用1M NaCl溶液洗脱。
图5说明了在通过量测量期间根据另一个实施方案的结合至膜预滤器的蛋白质物质的SDS-PAGE分析，用去离子水洗脱。
图6图示了用SEC定量的洗脱的蛋白的分子量，其中在水洗脱样品中未检测到蛋白质，而在盐洗脱物质中发现大量的高分子量(HMW)种类，其中进料溶液中HMW种类的量低于检测水平，而根据另一实施方案，23％的HMW种类从预滤器膜洗脱，表明聚集体的优先结合。
图7图示说明了病毒去除的分离的(decoupled)预过滤模式；以及
图8图示说明了病毒去除的加入-经过(spike-across)(联合)预过滤模式。
具体实施方式
在进一步详细描述本发明之前将定义大量的术语。这些术语的使用不限制本发明的范围，仅用于辅助对本发明的描述。
除非另外指明，否则对于本说明书和所附的权利要求，表示成分的数量、物质的百分数或比例、反应条件的所有数字和在说明书和权利要求中使用的其他数值应理解为在所有条件下均由术语“约”来修饰。
因此，除非有相反的说明，否则下文说明书和所附权利要求中列出的数值参数为近似值，其可以根据本发明待获得的期望性质而变化。最低限度地，并且不意图将同等专利的教导的应用限制于权利要求的范围，各数值参数至少应根据所报告的有效数字的数并且通过采用常规的舍入技术来解释。
尽管限定本发明的宽范围的数值范围和参数是近似值，但是具体实施例中列出的数值尽可能准确地报告。然而，任何数值不可避免地包含必然由它们各自的测量中存在的标准偏差而引起的误差。此外，本文公开的所有范围应理解为包括该范围内包含的所有子范围。例如，范围“1-10”包括最小值1和最大值10之间(包括它们在内)的任意和所有子范围，即具有等于或大于1的最小值和等于或小于10的最大值的任意和所有子范围，例如5.5-10。
除非上下文明确表明其他含义，否则在本文中使用的单数形式“一”、包括复数个所指物。
本文中使用的“AMPS”指2-丙烯酰氨基-2-甲基丙烷磺酸及其盐。
本文中使用的术语“生物分子”或“生物学分子”旨在表示为生命体的一部分的任何有机分子或其类似物。因此，生物分子包括但不限于氨基酸的聚合物例如肽和蛋白质(包括抗体和酶)和核苷酸的聚合物例如DNA或RNA分子以及DNA和RNA探针。碳水化合物和脂质也包括于生物分子的定义内。意图将前文所述每一种分子的合成生产的类似物包括于术语“生物分子”的定义内。
本文中与本发明的膜基质和方法一起使用的术语“清洁膜”表示生产时具有以下特征的膜或膜基质：
a.通过本文所述的NVR提取检测测定，每平方厘米膜少于约50微克可提取物，优选地，每平方厘米膜少于约25微克可提取物；或者
b.通过本文所述的TOC可提取物检测测定，每平方厘米膜少于约25微克可提取物。
本文使用的用于本发明的经涂覆的微孔膜的术语“苛性碱抗性”或“苛性碱稳定性”表示在环境温度下暴露于0.1NaOH两小时后渗透性或吸附特性无可测量的变化的膜。
本文使用的术语“交联的聚合物”表示由两种或多种单体形成的聚合物，所述单体具有两个或多个可参与聚合反应或者能够交联分离的聚合物链的反应位点。
本文使用的“MBAm”指N,N’-亚甲基双丙烯酰胺。
本文使用的“NFF”指常规过滤。
本文使用的术语“聚合物”旨在包括由一种或多种可聚合单体形成的聚合组合物。
本文使用的术语“多官能单体”指具有多于一个不饱和官能基团的单体。
本文使用的术语“反应物溶液”指至少包含具有一个或多个带负电荷的包含磺酸的基团及其盐的多官能可聚合的单体和多官能丙烯酰氨基交联剂的溶液。反应物溶液的优选实施方案的实例是包含AMPS及其盐的可聚合单体和MBAm交联剂的水溶液。
本文使用的用于本发明的膜和方法的表面涂层的术语“表面”指微孔介质或膜的全部表区域，包括微孔介质或膜的外部表面或外表面和内部表面或内表面。术语“外部表面”或“外表面”指看得见的表面，例如膜的平面或者微孔表面。术语“内部表面”或“内表面”旨在表示微孔网状结构的内部表面，即微孔介质或膜的间隙区域。
本文使用的“TFF”指切向流过滤。
微孔基质
就本发明而言，将超滤基质定义为相对于基于International Union ofPure and Applied Chemistry(IUPAC),"Terminology for membranes andmembrane processes"，Pure Appl.Chem.出版,1996,68,1479的如下定义的基质膜：
微滤：压力驱动的基于膜的分离方法，其中排阻大于0.1μm的颗粒和溶解的大分子；和
超滤：压力驱动的基于膜的分离方法，排阻小于0.1μm并且大于约2nm的颗粒和溶解的大分子。
当与膜、基质、滤器或介质一起使用时，本文所使用的术语“微滤”或“微孔”可为若干种形式中的任何一种，包括但不限于薄板、管和中空纤维。
当与膜、基质、滤器或介质一起使用时，本文所使用的术语“超滤”可为若干种形式中的任何一种，包括但不限于薄板、管和中空纤维。
根据跨越膜厚度的孔径或者对于中空纤维而言跨越纤维的微孔壁的孔径的均一性，将可用于本发明的实施的多孔膜分为对称的或不对称的。本文使用的术语“对称膜”指具有基本均一的跨越膜横截面的孔径的膜。术语“非对称膜”指跨越膜横截面的平均孔径不恒定的膜。
例如，在非对称膜中，孔径可随着穿过膜横截面的位置平稳地或不连续地地变化。应理解“非对称膜”的定义内包括一个外表面上的孔径与相对的外表面上的孔径的比例基本大于1的膜。
本文教导的用于本发明中的代表性膜包括由带负电荷的微孔膜或基质形成并且具有诸如Moya的第5,629,084号美国专利和Steuck的第4,618,533号美国专利中教导的表面化学(例如亲水性或疏水性)的那些。由多种物质制备而成的多种微孔基质可用于本发明的实施中。此类微孔基质的实例包括多糖、无纺布、陶瓷、金属、棉、纤维素包括纤维素/二氧化硅混合物以及纤维素衍生物例如醋酸纤维素、基于聚合物的玻璃纤维、以及它们的组合。
在本文教导的优选的实施方案中用于接受交联的涂层组合物的微孔基质为基于微孔聚合物的膜。
可用于生产可用于本发明的微孔基质和膜的代表性聚合物包括但不限于取代或未取代的聚丙烯酰胺、聚苯乙烯、聚甲基丙烯酰胺、聚酰亚胺、聚丙烯酸酯、聚碳酸酯、聚甲基丙烯酸酯、聚乙烯基亲水聚合物、聚苯乙烯、聚砜、聚醚砜、共聚物或苯乙烯和二乙烯基苯、芳香族聚砜、聚四氟乙烯(PTFE)、全氟化热塑性聚合物、聚烯烃、芳香族聚酰胺、脂肪族聚酰胺、超高分子量聚乙烯、聚偏二氟乙烯(PVDF)、聚醚醚酮(PEEK)、聚酯、以及它们的组合。
可用于本发明的微孔基质还可由色谱介质制成，包括分子排阻介质、离子交换介质以及疏水或亲水介质。在特别优选的实施方案中，微孔膜基质为聚醚砜膜。本领域技术人员能够容易地确认可用于形成适于本发明的微孔基质的其他聚合物。在所述微孔膜基质为亲水性的实施方案中，用于基质的优选的物质包括聚酰胺、醋酸纤维素和纤维素。
聚合的交联的涂层组合物
聚合的交联的涂层组合物由反应物溶液形成，所述反应物溶液至少具有一个或多个包含带负电荷的含有悬垂的磺酸的基团和/或其盐的可聚合多官能丙烯酰氨基烷基单体和多官能丙烯酰氨基交联剂。在优选的实施方案中，反应物溶液是包含2-丙烯酰氨基-2-甲基丙磺酸(AMPS)及其盐的可聚合的单体和多官能丙烯酰氨基交联剂例如N,N’-亚甲基双丙烯酰胺(MBAm)的水溶液，其中所得聚合的交联的涂层组合物仅包含酰胺-酰胺交联键。
反应物溶液优选地包含2-丙烯酰氨基-2-甲基丙磺酸(AMPS)及其盐的可聚合的单体和N,N’-亚甲基双丙烯酰胺(MBAm)交联剂的水溶液。一般而言，以反应物溶液的重量计，AMPS单体以约1重量％-约20重量％，优选约3重量％-约6重量％的浓度存在于反应物溶液中。以AMPS单体的重量计，MBAm交联剂优选以约5重量％-约100重量％的浓度存在于反应物溶液中。
交联的涂层组合物在不存在任何化学聚合自由基引发剂的条件下，通过暴露于电子束辐射而在微孔基质的表面以及内部孔壁原位聚合。优选地，聚合的交联的涂层组合物覆盖微孔基质的全部外表面和内表面。
交联的涂层组合物还可包含补加的改性单体，其优选以小于具有含有带负电荷的悬垂磺酸的基团的多官能丙烯酰氨基烷基单体或多官能丙烯酰氨基交联剂的量存在。
制备带负电荷的经涂覆的多孔基质的方法
将反应物溶液施用至微孔基质的外表面和内表面，使得基质的全部内表面和外表面被反应物溶液饱和。以直接涂覆的形式实现反应物溶液至微孔基质的内表面和外表面上的期望的沉积，并且不需要或使用中间结合化学组分或部分例如氨基酸等。
优选使用容易被聚合溶液润湿的微孔基质。这将与使用有机溶剂预润湿不能润湿的基质和进行溶剂交换相关的时间和费用最小化。
但是，当使用不能润湿的微孔基质时，为了用聚合的交联的/接枝的聚合物组合物基本饱和全部内表面和外表面，形成经涂覆的微孔基质的第一步优选包括用溶剂组合物洗涤基质，所述溶剂组合物为例如不会膨胀或溶解微孔基质并且润湿微孔基质的外表面以及孔的内壁的水和有机溶剂的混合物。
用于该目的的适合的水-有机溶剂组合物包括甲醇/水、乙醇/水、丙酮/水、四氢呋喃/水等。该润湿步骤的目的为确保随后与微孔基质接触的可聚合的AMPS单体及其盐和MBAm交联剂将微孔基质的全部内表面和外表面润湿。如下文所述，当试剂浴自身能够润湿微孔基质的全部表面时可省去该初步润湿步骤。当试剂浴包含高浓度的(例如15重量％或更高)有机反应物时可以实现这一点。
将微孔基质润湿后，使在溶剂中的包含自由基可聚合的AMPS单体及其盐和MBAm交联剂的试剂浴与微孔基质接触，由此饱和基质的内表面和外表面。用于试剂浴的具体溶剂取决于用于形成微孔基质的具体聚合物或物质。必要的是AMPS单体和MBAm交联剂溶解于所述溶剂中，所述溶剂不会腐蚀微孔基质并且所述基质不会不利地影响聚合反应。代表性的适合的溶剂包括水或有机溶剂例如醇、酯、丙酮或它们的相容性含水混合物。
将微孔基质浸渍于反应物溶液中使得内表面和外表面完全被反应物溶液饱和后，从溶液中取出微孔基质以在溶液外部进行聚合反应从而不浪费可聚合的AMPS单体。因此，可分批地或连续地进行该反应。当以连续方法操作时，用反应物溶液饱和微孔基质薄板，然后将其转移至反应区，在反应区中将其暴露于电子束能量以进行聚合反应。
可在不存在化学聚合自由基引发剂的条件下通过使用电离辐射引发聚合，或者，可使用自由基化学引发剂代替电离辐射。
当使用自由基引发剂时，在润湿微孔基质前将其加入聚合溶液，通常以0.01-1％的量加入。根据自由基引发剂的化学性质，可通过加热或UV辐射引发聚合。UV活化的引发剂(即光引发剂)的实例为1-[4-(2-羟基乙氧基)苯基]-2-羟基-2-甲基-1-丙烷-1-酮(可以商品名2959购自CibaSpecialty Chemicals,Basel,Switzerland)。
当不使用化学自由基聚合引发剂聚合反应物溶液时，为了实现AMPS单体的聚合，所述原位发生的聚合依赖于以至少约0.1M拉德至约6M拉德的剂量将饱和基质的内表面和外表面的反应物溶液暴露于电子束辐射，得到全部内表面和外表面被聚合的交联的涂层组合物涂覆的微孔基质。已发现可实现用交联的聚合物完全涂覆微孔基质，而不需要化学自由基聚合引发剂。
当通过电子束递送了期望剂量的辐射后，在水和/或甲醇中清洗经涂覆的微孔基质，以除去未反应的物质和寡聚体物质。然后将经涂覆的基质干燥并并测试再润湿、流动和其他性质。
以下实施例举例说明本发明并且不意图限制本发明。
在以下实施例中适用：
膜通过量，以每单位膜面积体积表示，其是在通量降低(对于恒压模式)或压力增加(对于恒流模式)超过某一实际阈值之前可以通过所述膜过滤的溶液的体积。在以下实施例中，数值V75是当以30psi恒压进行试验时当起始通量减少75％时预滤器和病毒截留滤器的组合的通过量。
流动时间
流动时间是涂层厚度对基质孔径的作用的量度。如果涂层很薄，则基质孔径的变化小并且流动时间的变化小。如果涂层厚度大，则基质孔径的变化和流动时间的变化大。在改性之前和之后测量基质的流动时间，以测定已出现的孔堵塞的程度。计算被改性基质所保留的原始流量的百分数。一般而言，原始流量截留越大，基质越合意。
在特定的和可重现的条件下测量流动时间。本文中使用的用于测定流动时间的标准方法为测量在27.5英寸汞柱真空下500ml水流过玻璃滤器支持物中的47mm基质圆盘所需的以秒计算的时间。
根据G.R.Bolton等人，Biotechnol.Appl.Biochem.(2006)43,55–63记载的步骤生成包含聚集体的蛋白质溶液。将50nM醋酸盐缓冲液(pH 5.0,100mM NaCl)中的0.1g/l人IgG(HS-475；SeraCare Life Sciences,Oceanside,CA,U.S.A.)溶液在60℃下加热1h以将蛋白质变性并且形成聚集体。以9体积％将该溶液加(spike)回未变性的IgG中。在整个实施例中将该溶液用于测量膜通过量。
经涂覆的基质被水自发润湿的能力是经涂覆的基质的重要性质。通过将经涂覆的基质置于水上并且测量经涂覆的基质被润湿透的以秒计算的时间来测定再润湿时间。这通过经涂覆的基质在湿润时变得较深而用肉眼进行观察。
涂覆基质的通用步骤
以下步骤描述了通过电子束辐射处理经涂覆的微孔基质以产生具有高电荷密度的带负电荷的经涂覆的微孔基质的通用方法。在甲醇中将基质润湿，在水中洗涤并且在可聚合的AMPS单体/MABm交联剂反应物水溶液中浸渍若干分钟以确保完全交换。如果可聚合的AMPS单体/MABm交联剂反应水溶液能够直接润湿基质，则预润湿交换步骤不是必要的。
用于引发基质表面上的AMPS单体的聚合的电子束技术包括例如Steuck的第4,944,879号美国专利中记载的方法，将其公开内容援引加入本文。例如，Steuck教导了使网或者单个样品通过由电子束处理器生成的电子帘。处理器递送约100kV至约200kV的期望剂量。移动的网或样品以适合在所述帘下产生期望的暴露时间的速度输送。暴露时间与剂量的组合决定了剂量率。典型的暴露时间为约0.5秒至约10秒。剂量率一般为约0.01kGy(千戈瑞)至约6kGy(即0.1至约6M拉德)。
通过电子束递送期望剂量的辐射后，在水和/或甲醇中洗涤经处理的微孔基质，以除去未反应的物质和寡聚体物质。然后将基质干燥并测试再润湿、流动和其他性质。
以下步骤描述了通过使用光引发剂处理经涂覆的微孔基质以产生具有高电荷密度的带负电荷的经涂覆的微孔基质的方法。将基质在甲醇中润湿，在水中洗涤并且在包含自由基光引发剂的可聚合的AMPS单体/MABm交联剂反应水溶液中浸渍若干分钟以确保完全交换。如果可聚合的AMPS单体/MABm交联剂反应水溶液能够直接润湿基质，则预润湿交换步骤不是必需的。
用于在基质表面上引发AMPS单体聚合的光引发剂包括例如J.-P.Fouassier,Photoinitiation,Photopolymerization,and Photocuring:Carl HanserVerlag,Munich,Germany,1995,第20-93页和第21页的表3-1中记载的那些。
通过将用AMPS/交联剂/光引发剂溶液饱和的多孔基质暴露于剂量足以引起光引发剂降解和自由基生成的紫外线、可见光或红外线辐射而实现AMPS聚合。紫外线辐射的适合的来源可以包括由Fusion UV Systems,Inc.(Gaithersburg,MD)生产的在具有两个UV光源(一个在顶部且一个在底部)的UV输送机。
当通过光源递送了期望剂量的辐射之后，在水和/或甲醇中洗涤经处理的微孔基质以除去未反应的物质和寡聚体物质。然后将基质干燥并测试再润湿、流动和其他性质。
使用带负电荷的经涂覆的多孔基质
在一个实施方案中，本发明提供从包含蛋白质和/或生物分子的溶液中选择性地除去蛋白质聚集体(包括但不限于蛋白质三聚体和更大的蛋白质聚合物)以及其他堵塞性和结垢性不期望的组分的方法。
在本发明的另一个实施方案中，首先用截留介质过滤蛋白质溶液以选择性地截留包含蛋白质三聚体和更大的蛋白质聚合物的蛋白质聚集体并同时允许蛋白质单体从其通过。使用具有一层或更多层吸附性膜的装置进行该过滤步骤。当使用这些物质时，实现了基本完全的蛋白质聚集体去除同时允许回收大于约85％的蛋白质单体，优选大于约90％的蛋白质单体，最优选大于约98％的蛋白质单体。
图1描绘了采用恒压过滤模式的本发明方法10的优选实施方案之一。蛋白质溶液12被加压贮器14截留并且经管道18通过容器内的压力被泵入过滤介质单元16。使该溶液经历常规过滤模式，聚集体被介质截留并且不含聚集体的溶液以滤液的形式从第一步骤10排出。使该滤液经管道20用于进一步的下游加工例如第二过滤步骤22(下文中详细阐述)，然后到达出口管道24。通过以该方式操作，蛋白质聚集体被介质单元16截留，同时蛋白质单体通过介质16。
或者，可使用泵以产生该系统的恒压，但这不是优选的，因为需要通过阀门或者泵速将泵输出小心地控制于恒压并且需要反馈系统以确保该压力保持恒定。
本发明的另一个实施方案示于图2中，其中使用了恒流操作模式。在该系统中使用位于贮器28(通常是不加压的，与图1中的实施方案的贮器14相比较)和第一过滤步骤30之间的泵26以保持恒流。将蛋白质溶液31经管道32泵送至泵入口34，然后经管道36泵送至第一过滤步骤30。使蛋白质溶液31经历常规过滤模式，聚集体被第一步骤30的滤器截留，其中不含聚集体的溶液以滤液的形式从第一步骤30排出。使该滤液通过管道38用于进一步的下游加工例如第二过滤步骤40(下文中详细阐述)，然后到达出口管道42。
如果期望，可在第一过滤步骤30的出口(未显示)增加再循环回路(未显示)，并且将滤液经过过滤步骤30再循环一次或更多次，以进一步降低滤液中的聚集体水平。使用阀门(未显示)是控制再循环回路和下游管道之间的流动的最简单的方法。但是，另外的再循环次数一般是不需要的并且不必要地增加了生产时间和成本。已发现一次再循环通常是足够的。
在第二过滤步骤中(22或40)，在除去聚集体之后进行病毒去除过滤。通过常规滤器(NFF)或者例如2000年11月3日提交的并且全文援引加入本文的第6,365,395号美国专利记载的切向流过滤(TFF)滤器从不含聚集体的溶液中除去病毒。
对于除去蛋白质聚集体，首先将蛋白质溶液通过本文教导的具有高电荷密度的带负电荷的经涂覆的微孔介质预滤器预过滤。优选使用终端NFF模式进行预过滤。终端过滤指其中被过滤的全部流体流都经过滤器而无再循环或滞留物流的过滤。任何不能通过滤器的物质或者保留在滤器的上表面或者保留在滤器内。
当在第一步骤中使用本文教导的用于除去蛋白质聚集体的经涂覆的微孔介质预滤器在上游过滤蛋白质溶液时，可在下游的第二步骤中使用病毒颗粒截留滤器。在一个实施方案中，所述蛋白质聚集体去除滤器可在使用后丢弃。
当使用第二过滤步骤以选择性地截留病毒颗粒时(例如Antoniou的第6,365,395号美国专利所记载，其全文援引加入本文)可通过TFF或者通过终端NFF用一个或多个超滤膜实现过滤，其中通过该两步过滤法产生的蛋白质溶液是不包含聚集体并且不包含病毒的蛋白质。所述一个或多个超滤膜截留病毒颗粒同时允许蛋白质单体从其通过。
在TFF病毒过滤步骤之后，可任选地用水或含水缓冲液洗涤所述超滤膜，以回收被该膜截留的任何蛋白质。
当首先用本文教导的具有高电荷密度的带负电荷的微孔经涂覆的膜预过滤包含蛋白质三聚体和更大的蛋白质聚合物的蛋白质溶液时，蛋白质聚集体被选择性地截留，同时允许蛋白质单体从其通过。使用具有一层或多层带负电荷的经涂覆的微孔膜的预滤器实现该预过滤步骤，其中实现了从蛋白质溶液基本完全除去蛋白质聚集体同时允许回收大于约85％的蛋白质单体，优选大于约90％的蛋白质单体，并且更优选大于98％的蛋白质单体。
使用在预过滤步骤中使用的带负电荷的经涂覆的微孔膜以从生物分子溶液中除去堵塞性组分与目前使用的常规蛋白质和病毒颗粒分离方法相比具有实质性优点。由于以NFF模式操作第一步骤(除去堵塞性组分)的过滤装置，因此其是一次性的并且不对验证步骤等进行清洁方法。此外，常规操作模式的购买和操作较低廉，因为与TFF超滤型系统相比建立此类系统需要较少的资金。另外，由于在除去病毒颗粒的第二过滤步骤中使用的膜不会被蛋白质聚集体结垢或堵塞，因此延长了其使用寿命。
本文教导的本发明提供的另一优点包括在第一预过滤步骤中使用的经涂覆的微孔膜不必需是超滤膜。
总之，可以看出用NFF聚集体去除步骤获得的通过量和通量的提高。Vmax比不使用NFF聚集体去除步骤获得的Vmax高至少900％。
本发明提供在进行下游病毒过滤或其他加工步骤之前在上游从蛋白质流和/或溶液除去蛋白质聚集体的简单方法。该预过滤步骤减少了否则会出现在下游病毒截留滤器等的结垢和堵塞。此外，其在不需要TFF的条件下进行，TFF的购买和运行均更昂贵并且需要在使用间隔进行清洗。本发明允许丢弃聚集体滤器，使得能够省去在使用间隔清洗和储存膜的费用以及向管理机构例如FDA验证在如此进行中所使用的操作的费用和时间。
当从基本不含蛋白质聚集体的蛋白质溶液除去病毒颗粒时，将来自蛋白质聚集体去除步骤的滤液引入第二过滤步骤。该第二过滤步骤采用能够以TFF模式或NFF模式运行的一个或多个病毒截留滤(通常为超滤)膜。
在任一模式中，过滤于在膜表面上截留病毒颗粒(通常具有20-100纳米(nm)直径)同时允许蛋白质单体和一部分蛋白质二聚体通过所述膜的条件下进行。
用于第二步病毒颗粒去除步骤中的代表性的适合的超滤病毒截留膜包括由再生纤维素、聚醚砜、聚芳砜、聚砜、聚酰亚胺、聚酰胺、聚偏二氟乙烯(PVDF)等形成的那些，并且包括可获自Millipore Corporation ofBillerica,MA,USA的NFP、Pro和膜。可将这些膜以滤柱NFF形式例如NFP病毒滤器，或者以TFF盒例如同样可获自Millipore Corporation of Billerica,MA,USA的盒形式提供。
用于本发明方法中的病毒滤器的特征为在20-100nm的病毒颗粒直径的感兴趣的尺寸范围内对病毒颗粒和其他颗粒的对数截留值(LRV；筛分系数的负对数)随颗粒的直径单调增加。按照经验，LRV随颗粒投射面积(颗粒直径的平方)的大小连续增加。
当从蛋白质溶液除去小尺寸病毒颗粒时，获得至少约3的令人满意的LRV。但是分子量筛截降低，由此减少了蛋白质回收。因此，优选可得到令人满意的LRV和蛋白质回收的膜。用于本发明方法中的膜能够产生对病毒颗粒为3的LRV并且当病毒颗粒大小为10-100nm直径时可增加至高达约8或者更高。
接着可将不含蛋白质聚集体的蛋白质流通过一个或多个超滤膜过滤，从而以至少3LRV的截留水平截留病毒颗粒，并且允许不含病毒颗粒且不含蛋白质聚集体的蛋白质溶液从其通过。
本发明还提供包括一个或多个本文教导的带负电荷的微孔经涂覆的基质的装置，例如过滤装置、色谱装置、大分子转移装置、流量分布器装置和/或膜组件。所述装置可为任何适合的形式，例如，所述装置可包括滤器元件，其包括基本为平面或褶皱形式的本文教导的带负电荷的微孔经涂覆的基质。在另一个实施方案中，所述滤器元件可具有中空的基本为圆柱状的形式。
如果期望，所述装置可包括与上游和/或下游的支持物或引流层组合的本文教导的预滤器微孔经涂覆的膜。所述装置可包括多个膜例例如用于提供多层滤器元件，或叠加以提供膜组件，例如用于膜色谱法中的膜组件。可以通过包括壳体和端盖构建滤柱以提供流体密封以及至少一个入口和至少一个出口。所述装置可被构建成以错流或切向流(TFF)模式以及终端模式(NFF)操作。因此，待处理的包含蛋白质的溶液或流体可例如切向地通过膜表面或者垂直地通过膜表面。
在另一个实施方案中，本文教导的微孔经涂覆的膜可单独使用或成组使用，使得包含蛋白质的溶液平行或串流接触一个或多个预滤器元件。例如，本文教导的经涂覆的微孔膜可成组使用，例如密封在相同壳体内的叠加的多层(通常为3-8层)。参见，例如，Boeddinghaus等人的第2,788,901号美国专利和Ostreicher的第5,085,784号美国专利。
显示于图1的本发明的一个实施方案描绘了第一方法步骤10，其中采用恒压过滤模式。蛋白质溶液12被加压贮器14截留并且经管道18通过容器内的压力被泵入过滤介质单元16。使蛋白质溶液12经历常规过滤模式，蛋白质聚集体被包含在过滤介质单元16内的本文教导的带负电荷的微孔经涂覆的介质预滤器截留，不含蛋白质聚集体的溶液以滤液的形式从第一步骤10排出。接着使该滤液经管道20用于进一步的下游加工例如第二过滤方法步骤22(如上文所述)，并且其中滤液经出口管道24离开方法步骤22。通过以该方式操作，蛋白质聚集体被具有本文教导的带负电荷的微孔经涂覆的介质预滤器的介质单元16截留，同时蛋白质单体等通过介质单元16，由此得到不含蛋白质聚集体的溶液。
或者，可使用泵以产生该系统的恒压，但这不是优选的，因为需要通过阀门或者泵速将泵输出小心地控制于恒压并且需要反馈系统以确保将该压力保持恒定。
本发明的另一个实施方案显示于图2中，其描绘了第一方法步骤30，其中使用了恒流操作模式。在该系统中，泵26位于贮器28(通常是不加压的，与显示于图1中的实施方案的加压贮器14相比较)和过滤介质单元35之间，用于维持恒流。经管道32将蛋白质溶液31泵送至泵入口34，并且经管道36泵送至过滤介质单元35。同样，用于第一步骤30中的预滤器为本文教导的并且也在图1中使用的带负电荷的微孔经涂覆的介质。使蛋白质溶液31经历常规过滤模式，其中蛋白质聚集体被过滤介质单元35内的预滤器截留，不含蛋白质聚集体的溶液以的形式滤液排出并且使其通过管道38用于进一步的下游加工，例如第二过滤方法步骤40(如上文所述)，然后到达出口管道42。通过以该方式操作，蛋白质聚集体被具有本文教导的带负电荷的微孔经涂覆的介质预滤器的介质单元35截留，同时蛋白质单体等通过介质单元35，从而得到不含蛋白质聚集体的溶液。
再循环回路(未显示)可位于第一过滤步骤(10、30)的出口处(未显示)并且如果需要，将经过第一过滤步骤的滤液再循环一次或更多次，以进一步降低滤液中的聚集体水平。使用阀门(未显示)是控制再循环回路和下游管道之间的流动的最简单的方法。已发现一次再循环是足够的。另外的再循环次数一般不是必需的并且不必要地增加了生产时间和成本。
以下实施例举例说明本发明并且为本发明的示例性说明，但是不意图以任何方式限制本发明的范围。
据推测本发明的膜预滤器主要通过在其带负电荷的表面上带正电荷的蛋白质聚集体的离子结合而运行。基于对所述预滤器如何运行的机制的这一理解，可适当地确定运行条件、选择验证策略以及解决可能的故障。
可通过在一系列溶液条件下分析预滤器的性能而研究预滤器运行的机制。例如，改变测试溶液的电导率和pH并且测量预滤器/滤器组合的通过量。在30psig操作压力下将热休克SeraCare IgG(等电点或“pI”为约6-9)(SeraCare Life Sciences,Inc.,Milford,MA,USA)用于测试溶液中。如图3所示，预滤器在低于聚集体等电点的pH范围内以及约2-16ms/cm的电导率范围内最有效。随着pH接近pI，聚集体上的净正电荷减少，且整体电荷相互作用随电导率增加而减弱。预滤器在高pH和高电导率下的相对较差的性能似乎验证了离子相互作用是从抗体流中除去聚集体的主要原因。
除去(洗脱)在通过量检测期间结合至膜预滤器的蛋白质物质并且通过十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)和分子排阻色谱(SEC)进行分析。研究了两种洗脱条件：用1M NaCl溶液(显示于图4中)和去离子水(显示于图5中)洗脱。从SDS-PAGE数据可以看出，在图5的去离子水中未观察到蛋白质洗脱，而在图4的1M盐洗出液中存在强的抗体和聚集体条带。如图6所示用SEC定量洗脱蛋白质的分子量。尽管未在水洗脱样品中检测到蛋白质，但是在盐洗脱物质中发现大量的高分子量(HMW)种类，示于图6中。进料溶液中HMW种类的量低于检测水平，但是从预滤器膜洗脱了大量的(23％)HMW种类，表明聚集体的优先结合，同样示于图6中。这进一步验证了聚集体至膜表面的离子结合是预滤器运行的主要机制这一假设。
实施例
实施例1
制备包含4.5重量％2-丙烯酰氨基-2-甲基丙磺酸钠盐(AMPS-Na)和0.9％N,N’-亚甲基双丙烯酰胺的水溶液。将具有0.22um孔径级别的亲水性聚醚砜膜(可以MilliporeSHF的形式商购获得)切割成14cm乘14cm的方块并且在该溶液中浸渍30秒以确保完全润湿。吸掉多余的溶液并且在惰性环境下将该膜暴露于2M拉德的电子束辐射。接着用去离子水清洗膜并且在空气中干燥。将三层该膜密封在通气的聚丙烯装置内，膜过滤面积为3.1cm2。将支持物与包含两层Pro细小病毒去除膜的相似装置串联。首先用醋酸盐缓冲液检测该装置组合的渗透性，然后用如上文所述制备的包含聚集体的多克隆抗体溶液检测通过量。表1示出了该滤器组合的组合通过量。
实施例2
遵循实施例1列出的步骤，但是用4.0重量％2-丙烯酰氨基-2-甲基丙磺酸(AMPS)代替AMPS-Na。
实施例3
制备包含4.5重量％2-丙烯酰氨基-2-甲基丙磺酸钠盐(AMPS-Na)和0.9％N,N’-亚甲基双丙烯酰胺的水溶液。将具有0.22um孔径级别的疏水性聚醚砜膜(MilliporeSHF的未亲水化前体)切割成14cm乘14cm的方块并且在异丙醇中浸渍1分钟，转移至去离子水中5分钟，然后在单体溶液中浸渍3分钟。去掉多余的溶液并且在惰性环境下将该膜暴露于2M拉德的电子束辐射。接着用去离子水清洗膜并且在空气中干燥。遵循实施例1中列出的检测步骤。
实施例4
遵循实施例1中列出的步骤，使用可以商品名Micropes获自PolyporeInc.’s unit Membrana GMBH,Wuppertal,Germany的具有0.8um孔径级别的亲水性聚醚砜膜。
实施例5
制备包含4.5重量％2-丙烯酰氨基-2-甲基丙磺酸钠盐(AMPS-Na)、0.9％N,N’-亚甲基双丙烯酰胺和0.2％UV引发剂1-[4-(2-羟基乙氧基)苯基]-2-羟基-2-甲基-1-丙烷-1-酮(可以商品名2959获自CibaSpecialty Chemicals,Basel,Switzerland)的水溶液。将具有0.65um孔径级别的疏水性聚偏二氟乙烯膜切割成14cm乘14cm的方块并且在异丙醇中浸渍1分钟，转移至去离子水中5分钟，然后在单体溶液内浸渍3分钟。去掉多余的溶液并且在惰性环境下将该膜暴露于紫外线辐射。接着用去离子水清洗膜并且在空气中干燥。遵循实施例1中列出的检测步骤。
实施例6
制备包含4.5重量％2-丙烯酰氨基-2-甲基丙磺酸钠盐(AMPS-Na)、0.9％N,N’-亚甲基双丙烯酰胺和0.2％UV引发剂1-[4-(2-羟基乙氧基)苯基]-2-羟基-2-甲基-1-丙烷-1-酮(可以商品名2959获自CibaSpecialty Chemicals,Basel,Switzerland)的水溶液。将具有0.65um孔径级别的亲水性超高分子量聚乙烯膜切割成14cm乘14cm的方块并且在该溶液中浸渍30秒以确保完全润湿。去掉多余的溶液并且在惰性环境下将该膜暴露于紫外线辐射。接着用去离子水清洗膜并且在空气中干燥。遵循实施例1中列出的检测步骤。
实施例7
制备如实施例1所述的改性膜。制造包含1、2、3和6层该膜的模制聚丙烯装置并且如实施例1所述进行检测。
实施例8
遵循实施例1的步骤，将AMPS-Na浓度从2％变化至6％。
实施例9
将在实施例1中制备的膜暴露于γ辐射两次，每次各30kGy，总剂量为60kGy。如实施例1所述在暴露前和暴露后检测聚集体去除效率。
实施例10
在25psi恒压下用0.5N氢氧化钠溶液将实施例1中制备的膜冲洗1小时，然后于30psi下用去离子水冲洗60min，并且如实施例1所述检测聚集体去除效率。
比较例1
除了不使用预过滤步骤以外，如实施例1中所述进行通过量检测。将来自Millipore Corporation的两层Pro细小病毒去除膜密封在通气的聚丙烯装置内。首先用醋酸盐缓冲液检测该装置组合的渗透性，然后用如上文所述制备的包含聚集体的多克隆抗体溶液检测通过量。表1示出了该滤器组合的组合通过量。
比较例2
使用来自Millipore Corporation的预滤器从蛋白质流除去蛋白质聚集体。将具有5cm2过滤面积的商购装置与包含Pro的装置串联并且如上文所述进行检测。
表1
用于单克隆抗体应用的病毒过滤步骤的开发中的一个方面是确定用于验证通过该过滤步骤实现的病毒去除仅通过分子排阻(SEC)完成的策略。根据对病毒结合至预滤器的了解开发病毒验证策略和建议。
已证明预滤器(含有硅藻土的纤维素纤维)通过混合模式吸附去除哺乳动物病毒。由于法规要求证明在病毒过滤步骤的验证中仅通过分子排阻(SEC)除去病毒，因此预滤器必须与病毒滤器分离，如图7所示。先将进料物质通过预滤器过滤，然后加入病毒，之后进行病毒过滤。在许多情况下，将预滤器与病毒滤器分离即使在无病毒加入的情况下也会导致容量降低。图7图解描绘了病毒去除的分离的预过滤模式。而图8图解描绘了病毒去除的加入-经过(联用)预过滤模式。
本发明的基于膜的带负电荷的预滤器在病毒清除应用中的一个潜在益处是能够在病毒验证期间通过预滤器加入病毒以将容量最大化并且提高使用便利性。
如果经过预过滤步骤观察到最低限度的病毒去除，则有可能经过该预滤器添加，消除任何潜在的分离作用，并且提供对来自病毒添加的污染物的另外的纯化。
对噬菌体和哺乳动物病毒与该带负电荷的预滤器的结合进行评价。这可在两个阶段中完成：第一个阶段用于评价作为哺乳动物病毒模型的噬菌体。由于经过预滤器去除的主要机制是基于电荷的结合，因此具有相似等电点的噬菌体针对所选择的相关哺乳动物病毒。
表2：检测病毒总结
方案阶段 病毒 估算的尺寸(nm) 估算的pI
噬菌体 ΦX-174 25 6.6
噬菌体 PP7 25-35 4
哺乳动物 MMV 18-26 4
哺乳动物 XMuLV 80-110 6
收集自联用的装置的进料样品经过预滤器得到的最低限度的(<0.2logs)噬菌体(Phi-X 174和PP7)截留和约0.6-1logs的MMV。平均截留了约2logs的XMuLV。这很可能归因于该病毒和该检测中的其他病毒之间的尺寸差异。这些结果表明在联用模式中涉及经过预滤器添加的病毒验证策略是可能的。
本文教导的带负电荷的微孔经涂覆的介质的有利性质包括在清洗或消毒操作中耐受与强碱性溶液接触而不会损失过滤性质的化学抗性以及其他期望的表面、化学和机械性质。
使用本文教导的并且以NFF模式操作的带负电荷的经涂覆的微孔介质用于从生物溶液除去堵塞性和结垢性组分例如蛋白质聚集体的预过滤方法与目前使用的分离方法相比具有若干优点，因为经涂覆的微孔介质是一次性的，由此不需要对验证步骤进行的清洁方法。另外，NFF操作模式与TFF超滤型系统相比较低廉。
另外，本文教导的并且在从蛋白质溶液除去病毒的上游使用的带负电荷的经涂覆的微孔介质通过在上游截留结垢性组分而抑制在下游使用的病毒颗粒截留超滤介质的结垢，由此延长了超滤病毒颗粒截留介质的使用寿命。
本发明的带负电荷的经涂覆的微孔介质的性质使它们在生物分子例如蛋白质、氨基酸、核酸和病毒颗粒的预过滤、检测、分离和/或纯化中的用途具有吸引力。核酸的实例包括修饰的或未修饰的、合成或天然的RNA和DNA。
本文教导的带负电荷的经涂覆的微孔介质还可用于各种应用中，例如预过滤和过滤包含蛋白质、带正电荷的原子、分子、生物分子和颗粒的流体以及从电泳凝胶转移大分子例如将核酸和蛋白质从电泳凝胶转移至固定化基质。
本文教导的带负电荷的经涂覆的微孔介质还可用于分离或纯化存在于生物流体中的各种组分。因此，例如，所述经涂覆的微孔介质可用于在治疗性血液成份分离中从血清纯化人白蛋白以及分离基因工程化细胞培养物或发酵液中的组分。所述经涂覆的微孔介质还可用于纯化例如病毒疫苗和基因治疗载体例如腺病毒相关病毒颗粒。
本发明为在病毒过滤或其他下游加工步骤的上游或之前从蛋白质流除去蛋白质聚集体提供了简单的预过滤方法。本文教导的预过滤方法减少了否则会出现在病毒截留滤器等的堵塞和结垢，由此与未引入本文教导的经涂覆的微孔膜的常规过滤方法相比增加了通过量和通量。
本文引用的所有参考文献，包括专利、专利申请和出版物在内，均全文援引加入本文。
上文所列公开可包括多个具有独立的实用性的不同发明。尽管这些发明中的每一个都以其优选的形式公开，但是不应认为本文所公开和举例说明的其具体实施方案具有限制性，因为可以对其进行许多修改。本发明的主题包括本文公开的各要素、特征、功能和/或性质的所有新颖的和非显而易见的组合和亚组合。
下文中的权利要求具体地指出了被认为是新颖的和非显而易见的某些组合和亚组合。体现于特征、功能、要素和/或性质的其他组合和亚组合中的发明可在要求本申请或相关申请的优先权的申请中主张。此类权利要求，不论是涉及不同的发明还是涉及相同的发明，并且不论与原始权利要求的范围相比是更宽、更窄、相等还是不同，也被认为包括于本公开的发明的主题内。

Claims (32)

1.带负电荷的过滤介质，其包括：
用带负电荷的聚合的交联的丙烯酰氨基烷基涂层涂覆的多孔基质，所述涂层通过暴露于电子束并且在不存在化学聚合自由基引发剂的条件下在所述基质表面原位聚合，
其中所述涂层由具有一个或多个带负电荷的悬垂基团的可聚合的丙烯酰氨基烷基单体和丙烯酰氨基交联剂形成，并且聚合的交联的涂层仅包含酰胺-酰胺交联键。
2.如权利要求1所述的介质，其中所述带负电荷的悬垂基团是磺酸。
3.如权利要求1所述的介质，其中所述可聚合的丙烯酰氨基烷基单体包括2-丙烯酰氨基-2-甲基丙磺酸及其盐，并且所述丙烯酰氨基交联剂包括N,N’-亚甲基双丙烯酰胺。
4.如权利要求3所述的介质，其中所述涂层由反应物水溶液形成，所述反应物溶液包含以所述反应物溶液的重量计约1-约20重量％的2-丙烯酰氨基-2-甲基丙磺酸及其盐和以所述2-丙烯酰氨基-2-甲基丙磺酸及其盐的重量计约5-约100重量％的N,N’-亚甲基双丙烯酰胺。
5.如权利要求1所述的介质，其中所述多孔基质包括选自以下组中的物质：取代或未取代的聚丙烯酰胺、聚苯乙烯、聚甲基丙烯酰胺、聚酰亚胺、聚丙烯酸酯、聚碳酸酯、聚甲基丙烯酸酯、聚乙烯聚合物、聚砜、聚醚砜、苯乙烯和二乙烯基苯的共聚物、芳香族聚砜、聚四氟乙烯(PTEE)、全氟化热塑性聚合物、聚烯烃、芳香族聚酰胺、脂肪族聚酰胺、超高分子量聚乙烯、聚偏二氟乙烯(PVDF)、聚醚醚酮(PEEK)、多糖、聚酯、纤维素、纤维素衍生物、玻璃纤维、棉、陶瓷、金属、无纺布以及它们的组合。
6.如权利要求1所述的介质，其中所述多孔基质包括微孔膜。
7.如权利要求1所述的介质，其中所述多孔基质包括一个或多个褶皱的微孔膜。
8.如权利要求1所述的介质，其具有中空圆柱状形式。
9.如权利要求1所述的介质，其中在用带负电荷的聚合的交联的丙烯酰氨基烷基涂层涂覆所述基质前，用润湿液洗涤所述多孔基质以将所述基质润湿。
10.制备带负电荷的经涂覆的过滤介质的方法，其包括以下步骤：
a)提供具有内表面和外表面的多孔基质；
b)提供反应物溶液，所述反应物溶液包含具有一个或多个带负电荷的悬垂基团的可聚合的丙烯酰氨基单体和丙烯酰氨基交联剂；
c)使所述多孔基质与所述反应物溶液接触；
d)在所述多孔基质上由所述反应物溶液形成带负电荷的交联的涂层组合物；
e)在不存在化学聚合自由基引发剂的条件下，通过暴露于电子束使所述带负电荷的交联的涂层组合物在所述多孔基质上原位聚合；以及
f)在所述多孔基质上形成聚合的带负电荷的交联的涂层，其中聚合的交联的涂层仅包含酰胺-酰胺交联键。
11.如权利要求10所述的方法，其在步骤(a)和(b)之间还包括用润湿液洗涤所述多孔基质以将所述基质润湿的步骤(a1)。
12.如权利要求11所述的方法，其在步骤(a1)和(b)之间还包括用第二种润湿液洗涤所述润湿的多孔基质以置换所述第一种润湿液从而用所述第二种液体润湿所述多孔基质的另外的洗涤步骤。
13.如权利要求10所述的方法，其中步骤(c)包括将所述多孔基质浸渍于反应物溶液浴中，将所述基质的内表面和外表面饱和，从所述反应物溶液浴取出经涂覆的基质，并且从所述经涂覆的基质除去任何多余的反应物溶液。
14.如权利要求10所述的方法，其中暴露于所述电子束提供约0.1至约6M拉德的辐射剂量，持续至少约0.1秒。
15.如权利要求10所述的方法，其中所述带负电荷的悬垂基团为磺酸。
16.如权利要求10所述的方法，其中所述可聚合的丙烯酰氨基烷基单体包括2-丙烯酰氨基-2-甲基丙磺酸及其盐，并且所述丙烯酰氨基交联剂包括N,N’-亚甲基双丙烯酰胺。
17.如权利要求16所述的方法，其中所述涂层由反应物水溶液形成，所述反应物水溶液包含以所述反应物溶液的重量计约1-约20重量％的2-丙烯酰氨基-2-甲基丙磺酸及其盐和以所述2-丙烯酰氨基-2-甲基丙磺酸及其盐的重量计约5-约100重量％的N,N’-亚甲基双丙烯酰胺。
18.如权利要求10所述的方法，其中所述多孔基质包括选自以下组中的物质：取代或未取代的聚丙烯酰胺、聚苯乙烯、聚甲基丙烯酰胺、聚酰亚胺、聚丙烯酸酯、聚碳酸酯、聚甲基丙烯酸酯、聚乙烯聚合物、聚砜、聚醚砜、苯乙烯和二乙烯基苯的共聚物、芳香族聚砜、聚四氟乙烯(PTEE)、全氟化热塑性聚合物、聚烯烃、芳香族聚酰胺、脂肪族聚酰胺、超高分子量聚乙烯、聚偏二氟乙烯(PVDF)、聚醚醚酮(PEEK)、多糖、聚酯、纤维素、纤维素衍生物、玻璃纤维、棉、陶瓷、金属、无纺布以及它们的组合。
19.如权利要求10所述的方法，其中所述多孔基质包括微孔膜。
20.带负电荷的经涂覆的多孔膜，其包括：
具有内表面和外表面的多孔膜，以及
带负电荷的聚合的交联的丙烯酰氨基烷基涂层，所述涂层仅具有酰胺-酰胺交联键且在所述多孔膜的内表面和外表面上原位聚合，
其中所述涂层由具有一个或多个带负电荷的悬垂基团的可聚合的丙烯酰氨基烷基单体和丙烯酰氨基交联剂形成，其中聚合的交联的涂层仅包含酰胺-酰胺交联键，
其中所述涂层是通过将所述涂层在不存在化学聚合自由基引发剂的条件下暴露于电子束进行聚合，所述电子束提供约0.1至约6M拉德的辐射剂量，持续至少约0.1秒。
21.如权利要求20所述的膜，其中所述带负电荷的悬垂基团包括磺酸。
22.如权利要求20所述的方法，其中所述可聚合的丙烯酰氨基烷基单体包括2-丙烯酰氨基-2-甲基丙磺酸及其盐，并且所述丙烯酰氨基交联剂包括N,N’-亚甲基双丙烯酰胺。
23.如权利要求22所述的膜，其中所述涂层由反应物水溶液形成，所述反应物水溶液包含以所述反应物水溶液的重量计约1-约20重量％的2-丙烯酰氨基-2-甲基丙烷磺酸及其盐和以所述2-丙烯酰氨基-2-甲基丙磺酸及其盐的重量计约5-约100重量％的N,N’-亚甲基双丙烯酰胺。
24.如权利要求20所述的膜，其中所述多孔膜包括选自以下组中的物质：取代或未取代的聚丙烯酰胺、聚苯乙烯、聚甲基丙烯酰胺、聚酰亚胺、聚丙烯酸酯、聚碳酸酯、聚甲基丙烯酸酯、聚乙烯聚合物、聚砜、聚醚砜、苯乙烯和二乙烯基苯的共聚物、芳香族聚砜、聚四氟乙烯(PTEE)、全氟化热塑性聚合物、聚烯烃、芳香族聚酰胺、脂肪族聚酰胺、超高分子量聚乙烯、聚偏二氟乙烯(PVDF)、聚醚醚酮(PEEK)、多糖、聚酯、纤维素、纤维素衍生物、玻璃纤维、棉、陶瓷、金属、无纺布以及它们的组合。
25.制备带负电荷的聚合的交联的经涂覆的多孔介质的方法，其包括以下步骤：
a)提供具有内表面和外表面的多孔基质；
b)提供反应物溶液，所述反应物溶液包含具有一个或多个带负电荷的悬垂基团的可聚合的丙烯酰氨基单体和丙烯酰氨基交联剂；
c)使所述多孔基质与所述反应物溶液接触；
d)在所述多孔基质上由所述反应物溶液形成仅具有酰胺-酰胺交联键的带负电荷的交联的涂层组合物；
e)使所述带负电荷的交联的涂层组合物在多孔基质上原位聚合；以及
f)在所述多孔基质上形成聚合的带负电荷的交联的涂层，其中聚合的交联的涂层仅包含酰胺-酰胺交联键，其中所述涂层是通过将所述涂层暴露于电子束进行聚合，所述电子束提供约0.1至约6M拉德的辐射剂量，持续至少约0.1秒，其中所述涂层通过使用化学聚合自由基引发剂而进行聚合。
26.如权利要求25所述的方法，其在步骤(a)和(b)之间还包括用润湿液洗涤所述多孔基质以将所述基质润湿的步骤(a1)。
27.如权利要求26所述的方法，其在步骤(a1)和(b)之间还包括用第二种润湿液洗涤所述润湿的多孔基质以置换所述第一种润湿液从而用所述第二种液体润湿所述多孔基质的另外的洗涤步骤。
28.如权利要求25所述的方法，其中步骤(c)包括将所述多孔基质浸渍于反应物溶液浴中，将所述基质的内表面和外表面饱和，从所述反应物溶液浴取出所述经涂覆的基质并且从所述经涂覆的基质除去任何多余的反应物溶液。
29.如权利要求25所述的方法，其中所述可聚合的丙烯酰氨基烷基单体包括2-丙烯酰氨基-2-甲基丙磺酸及其盐，并且所述丙烯酰氨基交联剂包括N,N’-亚甲基双丙烯酰胺。
30.如权利要求25所述的方法，其中所述涂层由反应物水溶液形成，所述反应物水溶液包含以所述反应物水溶液的重量计约1-约20重量％的2-丙烯酰氨基-2-甲基丙磺酸及其盐和以所述2-丙烯酰氨基-2-甲基丙磺酸及其盐的重量计约5-约100重量％的N,N’-亚甲基双丙烯酰胺。
31.流体处理装置，其包括：
壳体，其包括至少一个入口、至少一个出口并且限定所述入口和出口之间的流体流径，置于所述入口和出口之间并且跨越所述流体流径的是若干个带负电荷的微孔膜，
各膜包括微孔基质和带负电荷的聚合的交联的涂层，所述涂层仅具有酰胺-酰胺交联键并且在不存在化学聚合自由基引发剂的条件下通过暴露于电子束而在所述微孔基质的表面原位聚合，其中所述涂层由反应物溶液形成，所述反应物溶液包含具有一个或多个带负电荷的悬垂基团的可聚合的丙烯酰氨基烷基单体和丙烯酰氨基交联剂。
32.如权利要求31所述的装置，其中所述可聚合的丙烯酰氨基烷基单体包括2-丙烯酰氨基-2-甲基丙磺酸及其盐，并且所述丙烯酰氨基交联剂包括N,N’-亚甲基双丙烯酰胺。
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