CN102884201A - 生产二十碳五烯酸的微生物、脂肪酸组成物及其制作方法与用途 - Google Patents

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Abstract

本发明有关于分离的微生物以及其菌株与突变株、生物质、微生物油、组成物及培养物；生产微生物油、生物质及突变株的方法；及使用分离的微生物、生物质及微生物油的方法。

Description

生产二十碳五烯酸的微生物、脂肪酸组成物及其制作方法与用途
发明领域
本发明有关于分离的微生物以及其菌株与突变株、生物质、微生物油、组成物及培养物；生产微生物油、生物质及突变株的方法；及使用分离的微生物、生物质及微生物油的方法。
发明背景
脂肪酸的分类是基于碳链的长度与饱和度特性。脂肪酸是基于链中所存在的碳数而称作短链、中链或长链脂肪酸，当碳原子之间并无双键存在时称作饱和脂肪酸，当双键存在时称作不饱和脂肪酸。当仅存在一个双键时，不饱和的长链脂肪酸为单元不饱和；当存在一个以上的双键时，则为多元不饱和。
多元不饱和脂肪酸(PUFA)的分类是基于自脂肪酸甲基端开始的第一个双键的位置：ω-3(n-3)脂肪酸在第三个碳具有第一个双键，而ω-6(n-6)脂肪酸则在第六个碳具有第一个双键。例如，二十二碳六烯酸(“DHA”)是一种链长为22个碳及具有6个双键的ω-3长链多元不饱和脂肪酸(LC-PUFA)，通常命名为“22:6n-3。其它ω-3 LC-PUFA包括经命名为“20:5 n-3的二十碳五烯酸(“EPA”)，及经命名为“22:5 n-3的ω-3二十二碳五烯酸(“DPA n-3)。DHA及EPA已被称作“必需”脂肪酸。ω-6 LC-PUFA包括经命名为“20:4 n-6的二十碳四烯酸(“ARA”)及经命名为“22:5 n-6的ω-6二十二碳五烯酸(“DPAn-6)。
ω-3脂肪酸是生物学上的重要分子，其等因位于细胞膜中而影响细胞生理、调节生物活性化合物的生产与基因表现及作为生物合成受质。Roche，H.M.于期刊“Proc.Nutr.Soc.”第58期第397-401页乙文(1999年)。例如，DHA构成人类大脑皮层中的约15％至20％的脂质，构成视网膜中的30％至60％的脂质，以高浓度存在于睪丸与精子中，及为母乳中的一重要组分。Bergé，J.P.与Barnathan，G.于期刊“Adv.Biochem.Eng.Biotechnol.”第96期第49-125页乙文(2005年)。DHA构成脑中的高达97％的ω-3脂肪酸，及视网膜中的高达93％的ω-3脂肪酸。此外，DHA是胎儿与婴儿发育以及成人认知功能的维护所必需。同上。因为在人体中无法重新合成ω-3脂肪酸，而必需自营养来源获得所述脂肪酸。
亚麻仁油与鱼油被认为是良好的ω-3脂肪酸膳食来源。亚麻仁油不含有EPA、DHA、DPA或ARA，但却含有十八碳三烯酸(C18:3 n-3)，其是使身体能够制造EPA的一种结构单元。然而有证据显示代谢转换作用的速率可能缓慢与不定，特别在健康不佳的个体中。鱼油则依特定的物种与其等的饮食，而在脂肪酸组成的类型与水平方面有显著的差异。例如，相较于野生鱼类，水产养殖所饲养的鱼的ω-3脂肪酸水平较低。而且，鱼油具有含环境污染物的风险，及可能伴随着安定性问题与鱼的腥臭或味道。
破囊壶菌是破囊壶菌目(Thraustochytriales)的微生物。破囊壶菌包括裂殖壶菌属(Schizochytrium)与破囊壶菌属(Thraustochytrium)的成员，及经确认包括DHA与EPA在内的ω-3脂肪酸的一种替代来源。见第5,130,242号美国专利。相较于对应的鱼油或微型藻油，自所述海生异营性微生物所生产的油通常具有较单纯的多元不饱和脂肪酸廓型。Lewis，T.E.于期刊“Mar.Biotechnol.”第1期第580-587页乙文(1999年)。已报导破囊壶菌物种的菌株所生产的ω-3脂肪酸，在该生物体所生产的总脂肪酸中占了高百分比。第5,130,242号美国专利；Huang，J.等人于期刊“J.Am.Oil.Chem.Soc.”第78期第605-610页乙文(2001年)；Huang，J.等人于期刊“Mar.Biotechnol.”第5期第450-457页乙文(2003年)。然而，分离出的破囊壶菌在其身分与所生产的LC-PUFA量方面有所不同，藉此一些先前所述的菌株在培养中所具有的ω-6脂肪酸水平可能不佳及/或可能展现低的生产力。有鉴于此，对于展现高生产力与适合需要的LC-PUFA廓型的微生物分离作用的需求，仍持续存在。
发明概要
本发明有关于在ATCC登录号PTA-10212所保藏物种的一种分离的微生物。
本发明有关于具有在ATCC登录号PTA-10212所保藏物种的特性的一种分离的微生物。
本发明有关于一种分离的微生物，其所包含的一种18s rRNA含有SEQ IDNO：1的一种多核苷酸序列或与SEQ ID NO：1的相同度至少94％的一种多核苷酸序列。
本发明有关于一种分离的微生物，其包含的一种18s rRNA多核苷酸序列与在ATCC登录号PTA-10212所保藏微生物的一种18s rRNA多核苷酸序列的相同度至少94％。
本发明有关于在ATCC登录号PTA-10208所保藏物种的一种分离的微生物，其中该微生物所生产的总脂肪酸包含超过约10重量％的二十碳五烯酸。
本发明有关于具有在ATCC登录号PTA-10208所保藏物种的特性的一种分离的微生物，其中该微生物所生产的总脂肪酸包含超过约10重量％的二十碳五烯酸。
本发明有关于生产一个甘油三酯部分的一种分离的微生物，其中该甘油三酯部分中的二十碳五烯酸含量至少约12重量％。
在一些实施例中，本发明的分离的微生物是一种突变型菌株。
本发明有关于在ATCC登录号PTA-10212、PTA-10213、PTA-10214、PTA-10215、PTA-10208、PTA-10209、PTA-10210或PTA-10211所保藏的一种分离的微生物。
本发明有关于包含本发明的任一微生物或其混合物的一种生物质。
本发明有关于一种分离的生物质，其中该生物质的细胞干重中的至少约20重量％为脂肪酸，其中超过约10重量％的脂肪酸为二十碳五烯酸，及其中该脂肪酸包含各低于约5重量％的二十碳四烯酸与二十二碳五烯酸n-6。在一些实施例中，至少约25重量％的脂肪酸为二十二碳六烯酸。
在一些实施例中，本发明有关于包含甘油三酯(triacylglycerol)的一种分离的生物质，其中至少约12重量％的甘油三酯为二十碳五烯酸。
在一些实施例中，本发明有关于本发明的任一分离的生物质，其中该脂肪酸进一步包含各低于约5重量％的油酸、亚麻油酸、十八碳三烯酸、二十烯酸及芥子酸。
本发明有关于包含本发明的任一微生物或其混合物的一种分离的培养物。
本发明有关于供非人类动物或人类用的一种食用产品、化妆品或药学组成物，其包含本发明的任一微生物或生物质或其混合物。
本发明有关于一种微生物油，其包含至少约20重量％的二十碳五烯酸与各低于约5重量％的二十碳四烯酸、二十二碳五烯酸n-6、油酸、亚麻油酸、十八碳三烯酸、二十烯酸、芥子酸及十八碳四烯酸。在一些实施例中，该微生物油进一步包含至少约25重量％的二十二碳六烯酸。
本发明有关于包含至少约10重量％的甘油三酯部分的一种微生物油，其中该甘油三酯部分中的至少约12重量％的脂肪酸为二十碳五烯酸，其中该甘油三酯部分中的至少约25重量％的脂肪酸为二十二碳六烯酸，及其中该甘油三酯部分中的低于约5重量％的脂肪酸为二十碳四烯酸。
本发明有关于供非人类动物或人类用的一种食用产品、化妆品或药学组成物，其包含本发明的任一微生物油。在一些实施例中，该食用产品是一种婴儿奶粉。在一些实施例中，该婴儿奶粉是适合早产婴儿使用。在一些实施例中，该食用产品是一种乳、一种饮料、一种治疗用饮品、一种营养饮品或其组合物。在一些实施例中，该食用产品是用于非人类动物或人类食品中的一种添加剂。在一些实施例中，该食用产品是一种营养增补剂。在一些实施例中，该食用产品是一种动物饲料。在一些实施例中，该动物饲料是一种水产养殖用饲料。在一些实施例中，该动物饲料是一种家畜饲料、一种动物园动物饲料、一种役畜饲料、一种牲畜饲料或其组合物。
本发明有关于用于生产含有ω-3脂肪酸的一种微生物油的一种方法，该方法包括：在一培养中培育本发明的任一分离的微生物或其混合物，以生产一种含有ω-3脂肪酸的油。在一些实施例中，该方法进一步包括萃取该油。
本发明有关于用于生产含有ω-3脂肪酸的一种微生物油的一种方法，该方法包含自本发明的任一生物质萃取一种含有ω-3脂肪酸的油。在一些实施例中，该微生物油使用一种有机溶剂萃取制程萃取，例如己烷萃取作用。在一些实施例中，该微生物油使用一种无溶剂萃取制程萃取。
本发明有关于藉由本发明的一种方法所生产的一种微生物油。
本发明有关于用于生产本发明的一种生物质的一种方法，其包括：在一培养中培育本发明的任一分离的微生物或其混合物，以生产一种生物质。
本发明有关于用于生产本发明的一种突变型菌株的一种方法，其包括：诱发本发明的任一微生物的突变，及分离的该突变型菌株。
本发明有关于本发明的任一分离的微生物、生物质或微生物油或其混合物在制造用于治疗发炎或相关病况的一药剂的用途。
本发明有关于本发明的任一分离的微生物、生物质或微生物油或其混合物用于治疗发炎或相关病况的用途。
本发明有关于用于治疗发炎或相关病况的本发明的任一分离的微生物、生物质或微生物油或其混合物。
本发明有关于在需要的一个体中用于治疗发炎或一相关病况的一种方法，其包括对于该个体投予本发明的任一分离的微生物、生物质或微生物油或其混合物及一种药学上可接受的载剂。
较佳实施例的详细说明
本发明有关于分离的微生物以及其菌株与突变株，以及其生物质、微生物油、组成物及培养物。本发明有关于生产来自本发明的微生物的微生物油、生物质及突变株的方法，及使用该生物、生物质及微生物油的方法。所述的微生物是非常高产的及产生独特的脂肪酸廓型，其特征部分在于高水平的ω-3脂肪酸，特别是高水平的EPA。
微生物
本发明有关于分离的微生物及自其所衍生的菌株。自本发明的一种分离的微生物所“衍生”的一菌株，可为一种天然或人工衍生物诸如例如一突变株、变异株或重组菌株。如在此所用的“分离的”一词并不一定反映一分离物经纯化的程度，而是指自天然形式或天然环境的分离作用或隔离作用。一分离物可包括但不限于一种分离的微生物、一种分离的生物质、一种分离的培养物、一种分离的微生物油及一种分离的序列(诸如在此所揭露的一种分离出的多核苷酸序列)。如在此所用的“微生物”一词，包括但不限于“微型藻”、“破囊壶菌”等词及与所述的任一保藏微生物相关联的分类学分类。本发明所及的任一微生物及包括所述的保藏微生物所用的“破囊壶菌目(Thraustochytriales)”、“破囊壶菌”、“裂殖壶菌属(Schizochytrium)”及“破囊壶菌属(Thraustochytrium)”等词，以目前的分类学分类及包括可取得的系谱信息为基础，及无意受限于分类学分类在本申请案申请日之后修订的情事。
在一些实施例中，本发明有关于在ATCC登录号PTA-10212所保藏物种的一种分离的微生物。与ATCC登录号PTA-10212相关联的分离的微生物，在此称作破囊壶菌属物种(Thraustochytrium sp.)ATCCPTA-10212。与ATCC登录号PTA-10212相关联的分离的微生物，依据布达佩斯条约(Budapest Treaty)于2009年7月14日保藏于美国维吉尼亚州20110-2209马纳沙斯(Manassas)大学大道10801号的美国典型培养物保藏中心(American Type Culture Collection)的专利保藏库(Patent Depository)。在一些实施例中，本发明有关于在ATCC登录号PTA-10212所保藏的一种分离的菌株。
在一些实施例中，本发明有关于具有在ATCC登录号PTA-10212所保藏物种的特性的一种分离的微生物或自其所衍生的一菌株。在ATCC登录号PTA-10212所保藏物种的特性可包括其生长与表现型性质(表现型性质的实例包括形态学与繁殖性质)、其物理与化学性质(诸如干重与脂质廓型)、其基因序列及其组合，其中所述特性可区别该物种与先前鉴定的物种。在一些实施例中，本发明有关于具有在ATCC登录号PTA-10212所保藏物种的特性的一种分离的微生物，其中该特性包括一种含有SEQ ID NO：1的一多核苷酸序列或与SEQ ID NO：1的相同度至少94％、95％、96％、97％、98％或99％的一种多核苷酸序列的18s rRNA、在ATCC登录号PTA-10212所保藏物种的形态学与繁殖性质及在ATCC登录号PTA-10212所保藏物种的脂肪酸廓型。在一些实施例中，本发明的分离的微生物具有与在ATCC登录号PTA-10212所保藏微生物实质上相同的表现型性质。在一些实施例中，本发明的分离的微生物具有与在ATCC登录号PTA-10212所保藏微生物实质上相同的生长性质。在一些实施例中，本发明有关于一种分离的微生物，其所包含的一种18s rRNA含有SEQ ID NO：1的一多核苷酸序列或与SEQID NO：1的相同度至少94％、95％、96％、97％、98％或99％的一种多核苷酸序列。在一些实施例中，本发明有关于一种分离的微生物，其所包含的一种18srRNA多核苷酸序列与在ATCC登录号PTA-10212所保藏微生物的18s rRNA多核苷酸序列的相同度至少94％。
在一些实施例中，本发明有关于在ATCC登录号PTA-10212所保藏微生物的一种突变型菌株。在其它实施例中，该突变型菌株系在ATCC登录号PTA-10213、PTA-10214或PTA-10215所保藏的一菌株。与ATCC登录号PTA-10213、PTA-10214及PTA-10215相关联的微生物，依据布达佩斯条约(Budapest Treaty)于2009年7月14日保藏于美国维吉尼亚州20110-2209马纳沙斯(Manassas)大学大道10801号的美国典型培养物保藏中心(American Type Culture Collection)的专利保藏库(Patent Depository)。
在一些实施例中，本发明有关于在ATCC登录号PTA-10208所保藏物种的一种分离的微生物。与ATCC登录号PTA-10208相关联的分离的微生物在此称作裂殖壶菌属(Schizochytrium sp)ATCCPTA-10208。与ATCC登录号PTA-10208相关联的微生物，依据布达佩斯条约(Budapest Treaty)于2009年7月14日保藏于美国维吉尼亚州20110-2209马纳沙斯(Manassas)大学大道10801号的美国典型培养物保藏中心(American Type Culture Collection)的专利保藏库(PatentDepository)。在一些实施例中，本发明有关于在ATCC登录号PTA-10208所保藏的一种分离的菌株。
在一些实施例中，本发明有关于在ATCC登录号PTA-10208所保藏物种的一种分离的微生物，其中该微生物所生产的总脂肪酸包含超过约10重量％、超过约11重量％、超过约12重量％、超过约13重量％、超过约14重量％、超过约15重量％、超过约16重量％、超过约17重量％、超过约18重量％、超过约19重量％或超过约20重量％的EPA。在一些实施例中，本发明有关于在ATCC登录号PTA-10208所保藏物种的一种分离的微生物，其中该微生物所生产的总脂肪酸包含约10重量％至约55重量％、约10重量％至约50重量％、约10重量％至约45重量％、约10重量％至约40重量％、约10重量％至约35重量％、约10重量％至约30重量％、约15重量％至约55重量％、约15重量％至约50重量％、约15重量％至约45重量％、约15重量％至约40重量％、约15重量％至约35重量％、约15重量％至约30重量％、约20重量％至约55重量％、约20重量％至约50重量％、约20重量％至约45重量％、约20重量％至约40重量％、约20重量％至约35重量％或约20重量％至约30重量％的EPA。
在一些实施例中，本发明有关于具有在ATCC登录号PTA-10208所保藏物种的特性的一种分离的微生物，其中该微生物所生产的总脂肪酸包含超过约10重量％的二十碳五烯酸。在ATCC登录号PTA-10208所保藏微生物的特性包括其生长与表现型性质(表现型性质的实例包括形态学与繁殖性质)、其物理与化学性质(诸如干重与脂质廓型)、其基因序列及其组合，其中所述特性可区别该物种与先前鉴定的物种。在一些实施例中，本发明有关于具有在ATCC登录号PTA-10212所保藏物种的特性的一种分离的微生物，其中该特性包括一种含有SEQ ID NO：2的多核苷酸序列的18s rRNA、在ATCC登录号PTA-10208所保藏物种的形态学与繁殖性质及在ATCC登录号PTA-10208所保藏物种的脂肪酸廓型。在一些实施例中，本发明的分离的微生物所具有的物理与化学性质，与在ATCC登录号PTA-10208所保藏的微生物实质上相同。
在一些实施例中，本发明有关于在ATCC登录号PTA-10208所保藏微生物的一种突变型菌株。在其它实施例中，该突变型菌株在ATCC登录号PTA-10209、PTA-10210或PTA-10211所保藏的一菌株。与ATCC登录号PTA-10209、PTA-10210及PTA-10211相关联的微生物，依据布达佩斯条约(Budapest Treaty)在2009年9月25日保藏于于美国维吉尼亚州20110-2209马纳沙斯(Manassas)大学大道10801号的美国典型培养物保藏中心(American Type Culture Collection)的专利保藏库(Patent Depository)。
在一些实施例中，本发明有关于本发明的生产一个甘油三酯部分的一种分离的微生物，其中该甘油三酯部分的EPA含量是至少约12重量％、至少约13重量％、至少约14重量％、至少约15重量％、至少约16重量％、至少约17重量％、至少约18重量％、至少约19重量％或至少约20重量％。在一些实施例中，本发明有关于生产一个甘油三酯部分的一种分离的微生物，其中该甘油三酯部分的EPA含量是约12重量％至约55重量％、约12重量％至约50重量％、约12重量％至约45重量％、约12重量％至约40重量％、约12重量％至约35重量％、约12重量％至约30重量％、约15重量％至约4重量5％、约15重量％至约40重量％、约15重量％至约35重量％、约15重量％至约30重量％或约20重量％至约30重量％。
在一些实施例中，本发明有关于本发明的生产一个甘油三酯部分的一种分离的微生物的一突变株、变异株或重组体，其中该甘油三酯部分的EPA含量是至少约10重量％、至少约11重量％、至少约12重量％、至少约13重量％、至少约14重量％、至少约15重量％、至少约16重量％、至少约17重量％、至少约18重量％、至少约19重量％或至少约20重量％。在一些实施例中，本发明有关于本发明的生产一个甘油三酯部分的一种分离的微生物的一突变株、变异株或重组体，其中该甘油三酯部分的EPA含量是约12重量％至约55重量％、约12重量％至约50重量％、约12重量％至约45重量％、约12重量％至约40重量％、约12重量％至约35重量％、约12重量％至约30重量％、约15重量％至约55重量％、约15重量％至约50重量％、约15重量％至约45重量％、约15重量％至约40重量％、约15重量％至约35重量％、约15重量％至约30重量％、约20重量％至约55重量％、约20重量％至约50重量％、约20重量％至约45重量％、约20重量％至约40重量％、约20重量％至约35重量％或约20重量％至约30重量％。可藉由众所周知的程序产生突变型菌株。常用的程序包括辐射、高温处理及以诱突变剂处理。变异型菌株可为所述物种的其它天然存在的分离株及/或亚分离株。可藉由分子生物学中用于表现外源基因或改变内源基因的功能或表现的任何众所周知的方法，产生重组型菌株。在一些实施例中，该突变株、变异株或重组型菌株所生产的ω-3脂肪酸及尤其EPA的量，高于野生型菌株。在一些实施例中，该突变株、变异株或重组型菌株生产较低量的一或多种脂肪酸，诸如较低量的DHA、ARA、DPAn-6或其组合。在一些实施例中，该突变株、变异株或重组型菌株所生产的每升培养液的细胞干重，高于野生型菌株。所述突变株、变异株或重组型菌株是自本发明的一种分离的微生物所衍生的菌株实例。
在一些实施例中，本发明的一种分离的微生物及包括其突变株、变异株及重组体，包含自该微生物所分离出的一或多个部分中的脂肪酸廓型。自该微生物所分离出的一或多个部分包括总脂肪酸部分、固醇酯部分、甘油三酯部分、游离脂肪酸部分、固醇部分、甘油二酯部分、极性部分(包括磷脂部分)及其组合。一特定部分的脂肪酸廓型可包括与在此所揭露的该特定部分相关联的脂肪酸廓型中的任一者。
本发明有关于产生一突变株的一种方法，其包括诱发本发明的任一微生物的突变及分离该突变型菌株。
培养与分离生物质
本发明有关于包含本发明的一或多种分离的微生物的培养。用于接种、生长及回收微生物丛诸如微型藻与破囊壶菌的各种发酵作用参数，是本领域中所知。如见第5,130,242号美国专利，其在此并入本案以为参考数据。液态或固态培养基可含有天然或人造海水。供异营性生长的碳源包括但不限于葡萄糖、果糖、木糖、蔗糖、麦芽糖、可溶性淀粉、糖蜜、海藻糖、葡萄糖胺、葡聚糖、脂肪类、油类、甘油、乙酸钠及甘露糖醇。氮源包括但不限于蛋白胨、酵母提取物、聚蛋白胨、麦芽提取物、肉提取物、酪蛋白胺基酸、玉米浸液、有机氮源、麸胺酸钠、尿素、无机氮源、乙酸铵、硫酸铵、氯化铵及硝酸铵。
供在ATCC登录号PTA-10212所保藏微生物生长的一种典型的培养基，示于表1中：
表1：PTA-10212容器培养基
Figure BPA00001595252700101
氮进料：
  成分   浓度
 MSG·1H2O   17克/升   0-150、10-100或15-50
典型的培养条件包括下列：
Figure BPA00001595252700102
Figure BPA00001595252700111
在一些实施例中，在ATCC登录号PTA-10212所保藏的微生物或其突变株、变异株或重组体，当以甘油作为碳源时以异营性方式生长，但当以葡萄糖作为碳源时则不生长。
供在ATCC登录号PTA-10208所保藏微生物生长的一种典型的培养基，示于表2中：
表2：PTA-10208容器培养基
  成分   浓度   范围
  Na2SO4   8.8克/升   0-25、2-20或3-10
  NaCl   0.625克/升   0-25、0.1-10或0.5-5
  KCl   1.0克/升   0-5、0.25-3或0.5-2
  MgSO4·7H2O   5.0克/升   0-10、2-8或3-6
  (NH4)2SO4   0.42克/升   0-10、0.25-5或0.05-3
  CaCl2   0.29克/升   0.1-5、0.15-3或0.2-1
  T154(酵母提取物)   1.0克/升   0-20、0.1-10或0.5-5
  KH2PO4   1.765克/升   0.1-10、0.5-5或1-3
  高压灭菌后(金属)
  柠檬酸   46.82毫克/升   0.1-5000、10-3000或40-2500
  FeSO4·7H2O   10.30毫克/升   0.1-100、1-50或5-25
  MnCl2·4H2O   3.10毫克/升   0.1-100、1-50或2-25
  ZnSO4·7H2O   9.3毫克/升   0.01-100、1-50或2-25
  CoCl2·6H2O   0.04毫克/升   0-1、0.001-0.1或0.01-0.1
  Na2MoO4·2H2O   0.04毫克/升   0.001-1、0.005-0.5或0.01-0.1
  CuSO4·5H2O   2.07毫克/升   0.1-100、0.5-50或1-25
  NiSO4·6H2O   2.07毫克/升   0.1-100、0.5-50或1-25
  高压灭菌后(维生素)
  硫胺素   9.75毫克/升   0.1-100、1-50或5-25
  钙1/2-泛酸盐   3.33毫克/升   0.1-100、0.1-50或1-10
  生物素   3.58毫克/升   0.1-100、0.1-50或1-10
  高压灭菌后(碳)
  葡萄糖   30.0克/升   5-150、10-100或20-50
氮进料：
  成分   浓度
  NH4OH   23.6毫升/升   0-150、10-100或15-50
典型的培养条件包括下列：
Figure BPA00001595252700131
在一些实施例中，该培养基所包含的以饱和度水平的百分比形式显示的溶氧是至少约0.1％、至少约0.5％、至少约1％、至少约1.5％、至少约2％、至少约5％、至少约7％、至少约10％、至少约20％、至少约30％、至少约40％、至少约50％、至少约60％、至少约70％、至少约80％或至少约90％。在一些实施例中，该培养基所包含的以饱和度水平的百分比形式显示的溶氧是约0.1％至约2％、约0.1％至约5％、约0.1％至约10％、约0.1％至约20％、约0.1％至约30％、约0.1％至约50％、约0.1％至约100％、约5％至约10％、约5％至约20％、约5％至约30％、约5％至约50％、约5％至约100％、约7％至约10％、约7％至约20％、约7％至约30％、约7％至约50％、约7％至约100％、约10％至约20％、约10％至约30％、约10％至约50％、约10％至约100％、约20％至约30％、约20％至约50％或约20％至约100％。
本发明有关于本发明的一种微生物的分离的生物质。本发明的一种分离的生物质，藉由诸如第5,130,242号美国专利与第2002/0001833号美国申请公开案中所述用于分离一种生物质的任一公用方法获得的一种所采集的细胞生物质，所述专利与公开案中的各者在此并入本案以为参考数据。
在一些实施例中，在包含碳、氮与营养素的来源及约950ppm至约8500ppm的氯离子的pH值约6.5至约9.5的一培养基中，在约15℃至约30℃生长约6日至约8日之后，自每升培养液所分离出的生物质的细胞干重是至少约10克、至少约15克、至少约20克、至少约25克、至少约30克、至少约50克、至少约60克、至少约70克、至少约80克、至少约100克、至少约120克、至少约140克、至少约160克、至少约180克或至少约200克。在一些实施例中，在包含碳、氮与营养素的来源及约950ppm至约8500ppm的氯离子的约pH 6.5、约pH 7、约pH 7.5、约pH 8.0、约pH 8.5、约pH 9或约pH 9.5的一培养基中，在约15℃、约16℃、约17℃、在约18℃、在约19℃、在约20℃、在约21℃、在约22℃、在约23℃、在约24℃、在约25℃、在约26℃、在约27℃、在约28℃、在约29℃或在约30℃生长约6日、约7日或约8日之后，自每升培养液所分离出的生物质的细胞干重是至少约10克、至少约15克、至少约20克、至少约25克、至少约30克、至少约50克、至少约60克、至少约70克、至少约80克、至少约100克、至少约120克、至少约140克、至少约160克、至少约180克或至少约200克。在一些实施例中，在包含碳、氮与营养素的来源及约950ppm至约8500ppm的氯离子的约pH 6.5至约pH 9.5的培养基中，在约15℃至约30℃生长约6日至约8日之后，自每升培养液所分离出的生物质的细胞干重是约10克至约200克。在一些实施例中，在包含碳、氮与营养素的来源及约950ppm至约8500ppm的氯离子的约pH 6.5、约pH 7、约pH 7.5、约pH 8.0、约pH 8.5、约pH 9或约pH 9.5的一培养基中，在约15℃、约16℃、约17℃、在约18℃、在约19℃、在约20℃、在约21℃、在约22℃、在约23℃、在约24℃、在约25℃、在约26℃、在约27℃、在约28℃、在约29℃，或在约30℃生长约6日、约7日或约8日之后，自每升培养液所分离出的生物质的细胞干重是约10克至约200克、约10克至约100克、约10克至约50克、约15克至约200克、约15克至约100克、约15克至约50克、约20克至约200克、约20克至约100克、约20克至约50克、约50克至约200克或约50克至约100克。在一些实施例中，所分离出的培养物并未含有聚乙烯吡咯啶酮。
在一些实施例中，在包含碳、氮与营养素的来源及约950ppm至约8500ppm的氯离子的pH值约6.5至约8.5或pH值约6.5至约9.5的培养基中，在约15℃至约30℃生长约6日、约7日或约8日之后，分离出的培养物所具有的ω-3脂肪酸生产力是至少约0.2克/升/日、至少约0.3克/升/日、至少约0.4克/升/日、至少约0.5克/升/日、至少约1克/升/日、至少约1.2克/升/日、至少约1.5克/升/日、至少约1.7克/升/日、至少约2克/升/日、至少约3克/升/日、至少约3.5克/升/日、至少约4克/升/日、至少约4.5克/升/日、至少约5克/升/日、至少约6克/升/日或至少约8克/升/日。在一些实施例中，在包含碳、氮与营养素的来源及约950ppm至约8500ppm的氯离子的pH值约6.5至约9.5的一培养基中，在约15℃至约30℃生长约6日、约7日或约8日之后，分离出的培养物所具有的ω-3脂肪酸生产力是约0.2克/升/日至约20克/升/日、约0.4克/升/日至约20克/升/日、约0.4克/升/日至约2克/升/日、约1克/升/日至约2克/升/日、约1克/升/日至约20克/升/日、约2克/升/日至约15克/升/日、约2克/升/日至约10克/升/日、约3克/升/日至约10克/升/日、约4克/升/日至约9克/升/日、约4克/升/日至约8克/升/日、约4克/升/日至约7克/升/日或约4克/升/日至约6克/升/日。
在一些实施例中，在包含碳、氮与营养素的来源及约950ppm至约8500ppm的氯离子的pH值约6.5至约8.5或pH值约6.5至约9.5的培养基中，在约15℃至约30℃生长约6日、约7日或约8日之后，分离出的培养物所包含的EPA生产力是至少约0.2克/升/日、至少约0.3克/升/日、至少约0.4克/升/日、至少约0.5克/升/日、至少约0.6克/升/日、至少约0.7克/升/日、至少约0.8克/升/日、至少约0.9克/升/日、至少约1克/升/日、至少约1.2克/升/日、至少约1.5克/升/日、至少约1.7克/升/日、至少约2克/升/日、至少约3克/升/日、至少约4克/升/日或至少约5克/升/日。在一些实施例中，在包含碳、氮与营养素的来源及约950ppm至约8500ppm的氯离子的pH值约6.5至约8.5或pH值约6.5至约9.5的培养基中，在约15℃至约30℃生长约6日、约7日或约8日之后，EPA生产力是约0.2克/升/日至约5克/升/日、约0.2克/升/日至约4克/升/日、约0.2克/升/日至约3克/升/日、约0.2克/升/日至约2克/升/日、约0.2克/升/日至约1克/升/日、约0.2克/升/日至约0.8克/升/日、约0.2克/升/日至约0.7克/升/日、约1克/升/日至约5克/升/日、约1克/升/日至约4克/升/日、约1克/升/日至约3克/升/日或约1克/升/日至约2克/升/日。在一些实施例中，前述的任一EPA生产力是与前述的任一ω-3脂肪酸生产力相关联。在一些实施例中，该培养物进一步包含的DHA生产力是约0克/升/日至约5克/升/日、约0克/升/日至约4克/升/日、约0克/升/日至约3克/升/日、约0克/升/日至约2克/升/日、约0克/升/日至约1克/升/日、约0.2克/升/日至约5克/升/日、约0.2克/升/日至约4克/升/日、约0.2克/升/日至约3克/升/日、约0.2克/升/日至约2克/升/日、约0.2克/升/日至约1克/升/日、约1克/升/日至约5克/升/日、约2克/升/日至约5克/升/日、约2克/升/日至约4克/升/日或约2克/升/日至约3克/升/日。在一些实施例中，DHA生产力是低于约5克/升/日、低于约4克/升/日、低于约3克/升/日、低于约2克/升/日、低于约1克/升/日、低于约0.5克/升/日、低于约0.2克/升/日或约0克/升/日。
在一些实施例中，发酵体积(培养体积)是至少约2升、至少约10升、至少约50升、至少约100升、至少约200升、至少约500升、至少约1000升、至少约10,000升、至少约20,000升、至少约50,000升、至少约100,000升、至少约150,000升、至少约200,000升或至少约250,000升。在一些实施例中，发酵体积是约2升至约300,000升、约2升、约10升、约50升、约100升、约200升、约500升、约1000升、约10,000升、约20,000升、约50,000升、约100,000升、约150,000升、约200,000升、约250,000升或约300,000升。
在一些实施例中，本发明有关于包含本发明的一脂肪酸廓型的一种分离的生物质。在一些实施例中，生物质的细胞干重中的至少约20％、至少约25％、至少约30％、至少约35％、至少约40％、至少约45％、至少约50％、至少约55％、至少约60％、至少约65％、至少约70％、至少约75％或至少约80％为脂肪酸。在一些实施例中，生物质的细胞干重中的超过约20％、超过约25％、超过约30％、超过约35％、超过约40％、超过约45％、超过约50％、超过约55％或超过约60％为脂肪酸。在一些实施例中，生物质的细胞干重中的约20重量％至约55重量％、约20重量％至约60重量％、约20重量％至约70重量％、约20重量％至约80重量％、约30重量％至约55重量％、约30重量％至约70重量％、约30重量％至约80重量％、约40重量％至约60重量％、约40重量％至约70重量％、约40重量％至约80重量％、约50重量％至约60重量％、约50重量％至约70重量％、约50重量％至约80重量％、约55重量％至约70重量％、约55重量％至约80重量％、约60重量％至约70重量％或约60重量％至约80重量％为脂肪酸。在一些实施例中，该生物质所包含的脂肪酸重量中的超过约10％、至少约12％、至少约15％、至少约20％、至少约25％、至少约30％、至少约35％、至少约40％或至少约45％为EPA。在一些实施例中，该生物质所包含的脂肪酸重量中的约10％至约55％、约12％至约55％、约15％至约55％、约20％至约55％、约20％至约40％或约20％至约30％为EPA。在一些实施例中，该生物质包含一个甘油三酯部分，其中该甘油三酯部分的重量中的至少约12％、至少约13％、至少约14％、至少约15％、至少约16％、至少约17％、至少约18％、至少约19％或至少约20％为EPA。在一些实施例中，该生物质包含一个甘油三酯部分，其中该甘油三酯部分中的EPA含量至少约12重量％至约55重量％、约12重量％至约50重量％、约12重量％至约45重量％、至少约12重量％至约40重量％、至少约12重量％至约35重量％或至少约12重量％至约30重量％、约15重量％至约55重量％、约15重量％至约50重量％、约15重量％至约45重量％、约15重量％至约40重量％、约15重量％至约35重量％、约15重量％至约30重量％、约20重量％至约55重量％、约20重量％至约50重量％、约20重量％至约45重量％、至少约20重量％至约40重量％、至少约20重量％至约35重量％或约20重量％至约30重量％。在一些实施例中，生物质的细胞干重的至少约20重量％、至少约25重量％、至少约30重量％、至少约35重量％、至少约40重量％、至少约50重量％或至少约60重量％为DHA。在一些实施例中，生物质的细胞干重中的约20重量％至约60重量％、约25重量％至约60重量％、约25重量％至约50重量％、约25重量％至约45重量％、约30重量％至约50重量％或约35重量％至约50重量％为DHA。在一些实施例中，该生物质所包含的脂肪酸重量中的约10％以下、约9％以下、约8％以下、约7％以下、约6％以下、约5％以下、约4％以下、约3％以下、约2％以下或约1％以下为DHA。在一些实施例中，该生物质所包含的脂肪酸重量中的约1％至约10％、约1％至约5％、约2％至约5％、约3％至约5％或约3％至约10％为DHA。在一些实施例中，该生物质实质上不含DHA。在一些实施例中，该生物质所包含的脂肪酸重量中的约0.1％至约5％以下、约0.1％至约4％、约0.1％至约3％、约0.1％至约2％、约0.2％至约5％以下、约0.2％至约4％、约0.2％至约3％、约0.2％至约2％、约0.3％至约2％、约0.1％至约0.5％、约0.2％至约0.5％、约0.1％至约0.4％、约0.2％至约0.4％、约0.5％至约2％、约1％至约2％、约0.5％至约1.5％或约1％至约1.5％为ARA。在一些实施例中，该生物质所包含的脂肪酸重量中的低于约5％、约4％以下、约3％以下、约2％以下、约1.5％以下、约1％以下、约0.5％以下、约0.4％以下、约0.3％以下、约0.2％以下或约0.1％以下为ARA。在一些实施例中，该生物质实质上不含ARA。在一些实施例中，该生物质所包含的脂肪酸重量中的约0.4％至约2％、约0.4％至约3％、约0.4％至约4％、约0.4％至约5％、约0.4％至约5％以下、约0.5％至约1％、约0.5％至约2％、约0.5％至约3％、约0.5％至约4％、约0.5％至约5％、约0.5％至约5％以下、约1％至约2％、约1％至约3％、约1％至约4％、约1％至约5％或约1％至约5％以下为DPA n-6。在一些实施例中，该生物质所包含的脂肪酸重量中的约5％以下、低于约5％、约4％以下、约3％以下、约2％以下、约1％以下、约0.75％以下、约0.6％以下或约0.5％以下为DPA n-6。在一些实施例中，该生物质实质上不含DPA n-6。在一些实施例中，该生物质所包含的脂肪酸具有约5重量％以下、低于约5重量％、约4重量％以下、约3重量％以下或约2重量％以下的油酸(18:1 n-9)、亚麻油酸(18:2 n-6)、十八碳三烯酸(18:3 n-3)、二十烯酸(20:1 n-9)、芥子酸(22:1 n-9)或其组合。
本发明的一种分离的生物质的特性是与分离的生物质的内源或原有性质相关联，而非与外部引入物质的性质相关联。在一些实施例中，分离的生物质并未含有聚乙烯吡咯啶酮，或并非自含有聚乙烯吡咯啶酮的培养物中分离。
本发明有关于生产一生物质的一种方法。在一些实施例中，用于产生本发明的一种生物质的方法包含在一培养中培育本发明的任一分离的微生物或其混合物，以生产一种生物质。本发明有关于藉由该方法所生产的一种生物质。
微生物油
本发明有关于包含本发明的一脂肪酸廓型的一种微生物油。本发明的一种微生物油是一种“粗制油”或一种“精制油”，其包含至少约35重量％的一个甘油三酯部分。“粗制油”是自微生物的生物质萃取及未经进一步加工处理的油。“精制油”是藉由精制、脱色及/或除臭的标准制程处理粗制油而制得的油。如见第5,130,242号美国专利，其在此并入本案以为参考数据。一种微生物油亦包括如此述的一种“最终油”，其是经植物油稀释的一种精制油。在一些实施例中，最终油是经高油酸的葵花籽油稀释的一种精制油。如在此所用的“微生物”一词，包括但不限于“微型藻”、“破囊壶菌”及与所述的任一保藏微生物相关联的分类学分类。参照所述保藏微生物的任一微生物油所用的“破囊壶菌目(Thraustochytriales)”、“破囊壶菌”、“裂殖壶菌属(Schizochytrium)”及“破囊壶菌属(Thraustochytrium)”等词，是基于目前的分类学分类及包括可取得的系谱信息，及无意受限于分类学分类在本申请案申请日之后修订的情事。
在一些实施例中，如此述的脂肪酸可为脂肪酸酯。在一些实施例中，脂肪酸酯包括一种ω-3脂肪酸、ω-6脂肪酸及其组合的酯类。在一些实施例中，该脂肪酸酯是一种DHA酯类、一种EPA酯类或其组合物。在一些实施例中，如此述的油或其部分是酯化产生包含脂肪酸酯的油或其部分。“酯”一词是指脂肪酸分子的羧酸基中的氢经另一个取代基置换。典型的酯类是本领域技术人员所知，其相关论述提供于培格曼(Pergamon Press)出版公司于1987年出版的美国药事协会(American Pharmaceutical Association)由Edward B.Roche所编辑的A.C.S.研讨会系列第14册(Bioreversible Carriers in Drug Design)的Higuchi，T.与V.Stella所著“作为新颖输送系统的前驱药(Pro-drugs as Novel Delivery Systems)”乙文及美国纽约的普列南(Plenum Press)出版公司于1973年出版及由McOmie编辑的“有机化学中的保护基(Protective Groups in Organic Chemistry)”乙书。酯类的实例包括甲基、乙基、丙基、丁基、戊基、特-丁基、苄基、硝苄基、甲氧基苄基、二苯甲基、及三氯乙基。在一些实施例中，该酯是一种羧酸保护性酯基、具有芳烷基的酯基(如苄基、苯乙基)、具有低级烯基的酯基(如烯丙基、2-丁烯基)、具有低级烷氧基-低级烷基的酯类(如甲氧基甲基、2-甲氧基乙基、2-乙氧基乙基)、具有低级烷酰氧基-低级烷基的酯类(如乙酰氧基甲基、三甲基乙酰氧基甲基、1-三甲基乙酰氧基乙基)、具有低级烷氧羰基-低级烷基的酯类(如甲氧羰基甲基、异丙氧羰基甲基)、具有羧基-低级烷基的酯类(如羧基甲基)、具有低级烷氧基羰氧基-低级烷基的酯类(如1-(乙氧基羰氧基)乙基、1-(环己氧基羰氧基)乙基)、具有胺甲酰氧基-低级烷基的酯类(如胺甲酰氧基甲基)等。在一些实施例中，所添加的取代基是直链或环状烃基，如一个C1-C6烷基、C1-C6环烷基、C1-C6烯基或C1-C6芳基酯。在一些实施例中，该酯是一种烷基酯，如一种甲基酯、乙基酯或丙基酯。在一些实施例中，在脂肪酸处于纯化或半纯化状态时，将酯取代基添加至游离脂肪酸分子中。任选地，在甘油三酯转换为酯之际，形成该脂肪酸酯。
本发明有关于生产微生物油的方法。在一些实施例中，该方法包括在一培养中培育本发明的任一分离的微生物或其混合物，以生产包含ω-3脂肪酸的一种微生物油。在一些实施例中，该方法进一步包括萃取该微生物油。在一些实施例中，该方法包括自本发明的任一生物质或其混合物中萃取一种包含ω-3脂肪酸的微生物油。在一些实施例中，该方法包括以异营性方式培养分离的微生物，其中该培养包含如此述的一碳源。该微生物油可萃取自刚采集的生物质，或可萃取自存放在防损坏条件下的先前所采集的生物质。可使用已知方法以培养本发明的微生物，以自培养中分离一种生物质，以自该生物质中萃取一种微生物油，及分析自该生物质所萃取出的油的脂肪酸廓型。如见第5,130,242号美国专利，其在此并入本案以为参考数据。本发明有关于藉由本发明的任一方法所生产的一种微生物油。
在一些实施例中，藉由一种酵素萃取方法萃取微生物油。在一些实施例中，藉由一种机械萃取方法萃取微生物油。在一些实施例中，该机械萃取方法包括下列一或多者：(1)将一种经巴氏杀菌的发酵液处理通过一均质机，以助于细胞分解及自细胞释出油；(2)在均质化之后，在发酵液中添加异丙醇，以破坏油与水的乳化液；(3)将混合物离心，以回收油相；及(4)添加抗氧化剂及在真空中干燥。在一些实施例中，将粗制油纯化。在一些实施例中，粗制油的纯化作用包括下列一或多者：(1)将粗制油泵送至一精制槽中及加热该油，接着在混合作用下添加一种酸溶液；(2)在酸处理之后，在该油中添加一种苛性碱溶液；(3)将粗制油再加热然后离心，以将重相与精制油分离；(4)藉由使用例如酸、TriSyl
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黏土及/或过滤作用，移除剩余的极性化合物、微量金属及来自精制油的氧化产物；(5)脱色后的油进行冷过滤，以自该油中进一步移除高熔点组分而达到所欲的澄清度水平；(6)加热该油，之后将油冷却及放置一段时间，造成高熔融的三酸甘油酯与蜡结晶；(7)在冷却后的油中添加一种助滤剂，然后藉由过滤作用移除结晶的固体物；(8)在冷过滤之后，使用在高温与真空中运作的一种除臭器，以移除例如可造成变味与败味的过氧化物与剩余的任何低分子量化合物；(9)将该油转移至除臭器进料槽中，例如在一种填充柱除臭器中脱气与除臭；及(10)例如在除臭循环结束时，在一氮封装置下进行冷却，及在除臭后的油中添加适宜的抗氧化剂，以提供氧化安定性。
在一些实施例中，该微生物油所包含的固醇酯部分是约0重量％、至少约0.1重量％、至少约0.2重量％、至少约0.5重量％、至少约1重量％、至少约1.5重量％、至少约2重量％或至少约5重量％。在一些实施例中，该微生物油所包含的固醇酯部分是约0重量％至约1.5重量％、约0重量％至约2重量％、约0重量％至约5重量％、约1重量％至约1.5重量％、约0.2重量％至约1.5重量％、约0.2重量％至约2重量％或约0.2重量％至约5重量％。在一些实施例中，该微生物油所包含的固醇酯部分是约5重量％以下、约4重量％以下、约3重量％以下、约2重量％以下、约1重量％以下、约0.5重量％以下、约0.3重量％以下、约0.2重量％以下、约0.5重量％以下、约0.4重量％以下、约0.3重量％以下或约0.2重量％以下。
在一些实施例中，该微生物油所包含的甘油三酯部分是至少约35重量％、至少约40重量％、至少约45重量％、至少约50重量％、至少约55重量％、至少约60重量％、至少约65重量％、至少约70重量％、至少约75重量％、至少约80重量％、至少约85重量％或至少约90重量％。在一些实施例中，该微生物油所包含的甘油三酯部分是约35重量％至约98重量％、约35重量％至约90重量％、约35重量％至约80重量％、约35重量％至约70重量％、约35重量％至约70重量％、约35重量％至约65重量％、约40重量％至约70重量％、约40重量％至约65重量％、约40重量％至约55重量％、约40重量％至约50重量％、约65重量％至约95重量％、约75重量％至约95重量％、约75重量％至约98重量％、约80重量％至约95重量％、约80重量％至约98重量％、约90重量％至约96重量％、约90重量％至约97重量％、约90重量％至约98重量％、约90重量％、约95重量％、约97重量％或约98重量％。
在一些实施例中，该微生物油所包含的甘油二酯部分是至少约10重量％、至少约11重量％、至少约12重量％、至少约13重量％、至少约14重量％、至少约15重量％、至少约16重量％、至少约17重量％、至少约18重量％、至少约19重量％或至少约20重量％。在一些实施例中，该微生物油所包含的甘油二酯部分是约10重量％至约45重量％、约10重量％至约40重量％、约10重量％至约35重量％、约10重量％至约30重量％、约15重量％至约40重量％、约15重量％至约35重量％或约15重量％至约30重量％。在一些实施例中，该微生物油所包含的1，2-甘油二酯部分是至少约0.2重量％、至少约0.3重量％、至少约0.4重量％、至少约0.5重量％、至少约1重量％、至少约5重量％、至少约10重量％、至少约11重量％、至少约12重量％、至少约13重量％、至少约14重量％、至少约15重量％、至少约16重量％、至少约17重量％、至少约18重量％、至少约19重量％或至少约20重量％。在一些实施例中，该微生物油所包含的甘油二酯部分是约0.2重量％至约45重量％、约0.2重量％至约30重量％、约0.2重量％至约20重量％、约0.2重量％至约10重量％、约0.2重量％至约5重量％、约0.2重量％至约1重量％、约0.2重量％至约0.8重量％、约0.4重量％至约45重量％、约0.4重量％至约30重量％、约0.4重量％至约20重量％、约0.4重量％至约10重量％、约0.4重量％至约5重量％、约0.4重量％至约1重量％、约0.4重量％至约0.8重量％、约0.5重量％至约1重量％、约0.5重量％至约0.8重量％、约10重量％至约45重量％、约10重量％至约40重量％、约10重量％至约35重量％、约10重量％至约30重量％、约15重量％至约40重量％、约15重量％至约35重量％、约15重量％至约30重量％或约15重量％至约25重量％。在一些实施例中，该微生物油所包含的1，3-甘油二酯部分是至少约0.1重量％、至少约0.2重量％、至少约0.5重量％、至少约1重量％、至少约2重量％、至少约2.5重量％或至少约3重量％。在一些实施例中，该微生物油所包含的固醇部分是至少约0.3重量％、至少约0.4重量％、至少约0.5重量％、至少约1重量％、至少约1.5重量％、至少约2重量％或至少约5重量％。
在一些实施例中，该微生物油所包含的固醇部分是约0.3重量％至约5重量％、约0.3重量％至约2重量％、约0.3重量％至约1.5重量％、约0.5重量％至约1.5重量％、约1重量％至约1.5重量％、约0.5重量％至约2重量％、约0.5重量％至约5重量％、约1重量％至约2重量％或约1重量％至约5重量％。在一些实施例中，该微生物油所包含的固醇部分是约5重量％以下、约4重量％以下、约3重量％以下、约2重量％以下、约1.5重量％以下或约1重量％以下。
在一些实施例中，该微生物油所包含的磷脂部分是至少约2重量％、至少约5重量％或至少约8重量％。在一些实施例中，该微生物油所包含的磷脂部分是约2重量％至约25重量％、约2重量％至约20重量％、约2重量％至约15重量％、约2重量％至约10重量％、约5重量％至约25重量％、约5重量％至约20重量％、约5重量％至约20重量％、约5重量％至约10重量％或约7重量％至约9重量％。在一些实施例中，该微生物油所包含的磷脂部分是低于约20重量％、低于约15重量％、低于约10重量％、低于约9重量％或低于约8重量％。在一些实施例中，该微生物油实质上不含磷脂。在一些实施例中，该微生物油所包含的不皂化物是低于约2％、低于约1.5％、低于约1％，或低于约0.5％的油重量。该微生物油中所存在的脂质类型，诸如甘油三酯部分，可藉由急骤层析法分离及藉由薄层层析法(TLC)分析，或藉由本领域中已知的其它方法分离与分析。
在一些实施例中，该微生物油及/或其选自甘油三酯部分、游离脂肪酸部分、固醇部分、甘油二酯部分中的一或多个部分及其组合，是包含至少约5重量％、至少约10重量％、超过约10重量％、至少约12重量％、至少约13重量％、至少约14重量％、至少约15重量％、至少约16重量％、至少约17重量％、至少约18重量％、至少约19重量％、至少约20重量％、至少约25重量％、至少约30重量％、至少约35重量％、至少约40重量％或至少约45重量％的EPA。在一些实施例中，该微生物油及/或其选自甘油三酯部分、游离脂肪酸部分、固醇部分、甘油二酯部分中的一或多个部分及其组合，是包含约5重量％至约55重量％、约5重量％至约50重量％、约5重量％至约45重量％、约5重量％至约40重量％、约5重量％至约35重量％、约5重量％至约30重量％、约10重量％至约55重量％、约10重量％至约50重量％、约10重量％至约45重量％、约10重量％至约40重量％、约10重量％至约35重量％、约10重量％至约30重量％、至少约12重量％至约55重量％、至少约12重量％至约50重量％、至少约12重量％至约45重量％、至少约12重量％至约40重量％、至少约12重量％至约35重量％或至少约12重量％至约30重量％、约15重量％至约55重量％、约15重量％至约50重量％、约15重量％至约45重量％、约15重量％至约40重量％、约15重量％至约35重量％、约15重量％至约30重量％、约15重量％至约25重量％、约15重量％至约20重量％、约20重量％至约55重量％、约20重量％至约50重量％、约20重量％至约45重量％、约20重量％至约40重量％或约20重量％至约30重量％的EPA。在一些实施例中，该微生物油及/或其选自甘油三酯部分、甘油二酯部分、固醇部分、固醇酯部分、游离脂肪酸部分、磷脂部分中的一或多个部分及其组合，是包含至少约5重量％、至少约10重量％、至少约15重量％、至少约20重量％、至少约25重量％、至少约30重量％、至少约35重量％、至少约40重量％、至少约50重量％或至少约60重量％的DHA。在一些实施例中，该微生物油及/或其选自甘油三酯部分、甘油二酯部分、固醇部分、固醇酯部分、游离脂肪酸部分、磷脂部分中的一或多个部分及其组合，是包含约5重量％至约60重量％、约5重量％至约55重量％、约5重量％至约50重量％、约5重量％至约40重量％、约10重量％至约60重量％、约10重量％至约50重量％、约10重量％至约40重量％、约20重量％至约60重量％、约25重量％至约60重量％、约25重量％至约50重量％、约25重量％至约45重量％、约30重量％至约50重量％、约35重量％至约50重量％或约30重量％至约40重量％的DHA。在一些实施例中，该微生物油及/或其选自甘油三酯部分、甘油二酯部分、固醇部分、固醇酯部分、游离脂肪酸部分、磷脂部分中的一或多个部分及其组合，是包含约10重量％以下、约9重量％以下、约8重量％以下、约7重量％以下、约6重量％以下、约5重量％以下、约4重量％以下、约3重量％以下、约2重量％以下或约1重量％以下的DHA。在一些实施例中，该微生物油及/或其选自甘油三酯部分、甘油二酯部分、固醇部分、固醇酯部分、游离脂肪酸部分、磷脂部分中的一或多个部分及其组合，其所包含的脂肪酸重量中的约1％至约10％、约1％至约5％、约2％至约5％、约3％至约5％或约3％至约10％为DHA。在一些实施例中，该微生物油及/或其选自甘油三酯部分、甘油二酯部分、固醇部分、固醇酯部分、游离脂肪酸部分、磷脂部分中的一或多个部分及其组合，实质上不含DHA。在一些实施例中，该微生物油及/或其选自甘油三酯部分、甘油二酯部分、固醇部分、固醇酯部分、游离脂肪酸部分、磷脂部分中的一或多个部分及其组合，是包含约0.1重量％至约5重量％、约0.1重量％至约5重量％以下、约0.1重量％至约4重量％、约0.1重量％至约3重量％、约0.1重量％至约2重量％、约0.2重量％至约5重量％、约0.2重量％至约5重量％以下、约0.2重量％至约4重量％、约0.2重量％至约3重量％、约0.2重量％至约2重量％、约0.3重量％至约2重量％、约0.1重量％至约0.5重量％、约0.2重量％至约0.5重量％、约0.1重量％至约0.4重量％、约0.2重量％至约0.4重量％、约0.5重量％至约2重量％、约1重量％至约2重量％、约0.5重量％至约1.5重量％或约1重量％至约1.5重量％的ARA。在一些实施例中，该微生物油及/或其选自甘油三酯部分、甘油二酯部分、固醇部分、固醇酯部分、游离脂肪酸部分、磷脂部分中的一或多个部分及其组合，是包含约5重量％以下，低于约5重量％、约4重量％以下、约3重量％以下、约2重量％以下、约1.5重量％以下、约1重量％以下、约0.5重量％以下、约0.4重量％以下、约0.3重量％以下、约0.2重量％以下或约0.1重量％以下的ARA。在一些实施例中，该微生物油及/或其选自甘油三酯部分、甘油二酯部分、固醇部分、固醇酯部分、游离脂肪酸部分、磷脂部分中的一或多个部分及其组合，实质上不含ARA。在一些实施例中，该微生物油及/或其选自甘油三酯部分、甘油二酯部分、固醇部分、固醇酯部分、游离脂肪酸部分、磷脂部分中的一或多个部分及其组合，包含约0.4重量％至约2重量％、约0.4重量％至约3重量％、约0.4重量％至约4重量％、约0.4重量％至约5重量％、约0.4重量％至约5重量％以下、约0.5重量％至约1重量％、约0.5重量％至约2重量％、约0.5重量％至约3重量％、约0.5重量％至约4重量％、约0.5重量％至约5重量％、约0.5重量％至约5重量％以下、约1重量％至约2重量％、约1重量％至约3重量％、约1重量％至约4重量％、约1重量％至约5重量％或约1重量％至约5重量％以下的DPA n-6。在一些实施例中，该微生物油及/或其选自甘油三酯部分、甘油二酯部分、固醇部分、固醇酯部分、游离脂肪酸部分、磷脂部分中的一或多个部分及其组合，包含约5重量％、低于约5重量％、约4重量％以下、约3重量％以下、约2重量％以下、约1重量％以下、约0.75重量％以下、约0.6重量％以下或约0.5重量％以下的DPA n-6。在一些实施例中，该微生物油及/或其选自甘油三酯部分、甘油二酯部分、固醇部分、固醇酯部分、游离脂肪酸部分、磷脂部分中的一或多个部分及其组合，实质上不含DPA n-6。在一些实施例中，该微生物油及/或其选自甘油三酯部分、甘油二酯部分、固醇部分、固醇酯部分、游离脂肪酸部分、磷脂部分中的一或多个部分及其组合，其所包含的脂肪酸具有约5重量％以下，低于约5重量％、约4重量％以下、约3重量％以下或约2重量％以下的油酸(18:1 n-9)、亚麻油酸(18:2 n-6)、十八碳三烯酸(18:3 n-3)、二十烯酸(20:1 n-9)、芥子酸(22:1 n-9)、十八碳四烯酸(18:4 n-3)或其组合物。
甘油三酯分子含有3个中心碳原子(C(sn-1)H2R1-(sn-2)H2R2-C(sn-3)H2R3)，而容许形成不同的位置异构物。在一些实施例中，该微生物油包含一个甘油三酯部分，其中该甘油三酯部分中的至少约2％、至少约3％、至少约5％、至少约10％、至少约15％、至少约20％、至少约30％、至少约35％或至少约40％的甘油三酯，是在甘油三酯的选自sn-1、sn-2及sn-3位置中的任二者的二个位置上含有DHA(双取代DHA)，以HPLC层析上的峰的相对面积百分比为基础。在一些实施例中，该微生物油包含一个甘油三酯部分，其中该甘油三酯部分中的约2％至约55％、约2％至约50％、约2％至约45％、约2％至约40％、约2％至约35％、约2％至约30％、约2％至约25％、约5％至约55％、约5％至约50％、约5％至约45％、约5％至约40％、约5％至约35％、约5％至约30％、约5％至约25％、约10％至约55％、约10％至约50％、约10％至约45％、约10％至约40％、约10％至约35％、约10％至约30％、约10％至约25％、约10％至约20％、约20％至约40％、约20％至约35％或约20％至约25％的甘油三酯，在甘油三酯的选自sn-1、sn-2及sn-3位置中的任二者的二个位置上含有EPA，以HPLC层析上的峰的相对面积百分比为基础。在一些实施例中，该微生物油包含一个甘油三酯部分，其中该甘油三酯部分中的至少约0.5％、至少约1％、至少约1.5％或至少约2％的甘油三酯，在sn-1、sn-2及sn-3位置皆含有DHA(三取代DHA)，以HPLC层析上的峰的相对面积百分比为基础。在一些实施例中，该微生物油包含一个甘油三酯部分，其中该甘油三酯部分中的约0.5％至约5％、约0.5％至约3％、约0.5％至约2.5％、约0.5％至约2％、约1％至约5％、约1％至约3％或约1％至约2％的甘油三酯，在sn-1、sn-2及sn-3位置皆含有DHA，以HPLC层析上的峰的相对面积百分比为基础。在一些实施例中，该微生物油包含一个甘油三酯部分，其中该甘油三酯部分中的至少约10％、至少约15％、至少约20％、至少约25％、至少约30％、至少约35％、至少约40％、至少约45％、至少约50％、至少约55％或至少约60％的甘油三酯，在甘油三酯的选自sn-1、sn-2及sn-3位置中的任一者的一个位置上含有DHA，以HPLC层析上的峰的相对面积百分比为基础。在一些实施例中，该微生物油包含一个甘油三酯部分，其中该甘油三酯部分中的约10％至约80％、约10％至约70％、约10％至约60％、约15％至约80％、约15％至约75％、约15％至约70％、约15％至约65％、约15％至约60％、约35％至约80％、约35％至约75％、约35％至约65％、约35％至约60％、约40％至约80％、约40％至约75％、约40％至约70％、约40％至约65％、约40％至约60％或约40％至约55％的甘油三酯，在甘油三酯的选自sn-1、sn-2及sn-3位置中的任一者的一个位置上含有DHA，以HPLC层析上的峰的相对面积百分比为基础。
组成物
本发明有关于包含本发明的一种微生物、本发明的一种分离的生物质、本发明的一种微生物油或其组合物的组成物。
基于该组成物的需求，本发明的一种微生物、生物质或微生物油可藉由任一已知技术而进一步进行化学或物理改质或加工处理。
在微生物细胞或生物质用于一组成物中之前，可藉由包括但不限于冷冻干燥、风干、喷雾干燥、隧道式干燥、真空干燥(冷冻真空干燥)及一种类似制程的方法而加以干燥。任选地，所采集与清洗的生物质未经干燥即可直接用于一组成物中。如见第5,130,242号美国专利与第6,812,009号美国专利，其中各者在此并入本案以为参考数据。
可使用本发明的微生物油作为起始原料，以更有效率地生产富含一种脂肪酸诸如EPA的产物。例如，本发明的微生物油可进行本领域中已知的各种纯化技术，诸如蒸馏作用或尿素包合作用，以生产具有更高浓度的EPA或另一种脂肪酸的一种效能更高的产物。本发明的微生物油亦可用于化学反应中，以生产自该油中的脂肪酸所衍生的化合物，诸如EPA或另一种脂肪酸的酯类与盐类。
本发明的一组成物可包括一或多种赋形剂。如在此所用的“赋形剂”，是指用于本发明的组成物中以赋予该组成物所欲特性的一组分或组分混合物，该组成物包括食品以及药学、化妆品及工业用组成物。本发明的一赋形剂当添加至药学组成物时，可被述为一种“药学上可接受的”赋形剂，其是指在正确的医学判断范围内，该赋形剂适于与人类及非人类动物的组织接触的化合物、物质、组成物、盐及/或剂型，及在所欲的接触期间并无过度的毒性、刺激、过敏性反应或其它有问题的并发症及匹配合理的效益/风险比。在一些实施例中，“药学上可接受的”一词，是指经联邦或州政府的主管机关核准或在美国药典或其它一般所认可的国际药典中列为用于动物及特别是人类。可使用各种的赋形剂。在一些实施例中，该赋形剂可为但不限于碱剂、安定剂、抗氧化剂、黏着剂、分离剂、涂布剂、外相组分、控制释出型组分、溶剂、表面活性剂、保湿剂、缓冲剂、填料、软化剂或其组合物。除了在此所论及的所述赋形剂之外，还可包括列于但不受限于“雷明顿：药剂学的科学与应用(Remington：The Science andPractice of Pharmacy)”乙书第21版(2005年)的赋形剂。在此将一赋形剂纳入一特定类别(如“溶剂”)中，意欲说明而非限制赋形剂的角色。一特定的赋形剂可归属于多个类别。
本发明的组成物包括但不限于食用产品、药学组成物、化妆品及工业用组成物。
在一些实施例中，该组成物是一种食用产品。一种食用产品是供非人类动物或人类食用的任一食品，及包括固态与液态组成物。一种食用产品可为动物或人类食品中的一种添加剂。食品包括但不限于一般食品；液体产品包括乳类、饮料、治疗用饮品及营养饮品；机能性食品；增补剂；保健食品；婴儿奶粉，包括早产婴儿用奶粉；供怀孕或哺乳妇女用的食品；成人食品；老人食品；及动物食品。
在一些实施例中，本发明的一种微生物、生物质或微生物油可直接使用作为下列一或多者或包括在其中作为一种添加剂：一种油、酥油、涂酱、其它脂肪成分、饮料、酱料、乳制或黄豆制食品(诸如乳、酸奶、奶酪与冰淇淋)、一种烘焙物、一种营养品如作为一种营养增补剂(胶囊或锭剂形式)、一种维生素增补剂、一种膳食增补剂、一种粉状饮品及一种粉状食用产品的制品或半制品。在一些实施例中，该营养增补剂是一种素食用胶囊形式，及并非自动物来源的任一组分形成及亦不含有所述组分。
可包括本发明的一种微生物油的食品组成物的部份清单，包括但不限于黄豆制产物(乳、冰淇淋、酸奶、饮品、鲜乳油、涂酱、奶精)；汤与汤粉；面团、面糊及烘培食品包括例如精致糕点制品、早餐谷片、蛋糕、奶酪蛋糕、派、杯子蛋糕、饼干、棒、面包、卷、比司克面包(biscuit)、松糕、糕饼、司康(scone)、脆面包丁、脆饼干、甜点、点心蛋糕、派、果诺力(granola)/点心棒及烘烤糕饼；糖果；硬质糖果甜点；巧克力与其它糖果甜点；口香糖；液态食用产品例如乳类、能量饮品、婴儿奶粉、碳酸饮品、茶、液体膳食、果汁、水果制饮品、蔬菜制饮品；多种维生素糖浆、代用餐、药用食品及糖浆；粉状饮料配料；面食；加工鱼产品；加工肉产品；加工家禽产品；肉汁酱与酱料；调味料(西红柿酱、美乃滋等)；植物油式涂酱；乳制品；酸奶；奶油；冷冻乳制品；冰淇淋；冷冻甜点；霜冻酸奶；半固态食用产品诸如婴儿食品；布丁与明胶甜点；加工或未加工的奶酪；松饼配料；食物棒包括能量补给棒；华夫脆饼(waffle)配料；色拉酱；代用蛋配料；坚果与坚果式涂酱；加盐零食诸如洋芋片与其它脆片或脆物、玉米片、墨西哥玉米片、挤制零食、爆米花、卷条脆饼、炸马铃薯片及坚果；及特种零食诸如沾酱、干果零食、肉类零食、猪皮、健康食物棒及米/玉米糕。
在一些实施例中，本发明的一种微生物油可用于增补婴儿奶粉。可单独以本发明的一种微生物油或组合自一种生产二十碳四烯酸(ARA)的微生物例如高山被孢霉(Mortierella alpina)或舒马克氏孢霉(Mortierella sect.schmuckeri)所衍生的一种物理精制油，而增补婴儿奶粉。任选地，能以本发明的一种微生物油组合富含ARA的一种油，包括ARASCO
Figure BPA00001595252700271
(美国马里兰州哥伦比亚的马泰克生物科学(Martek Biosciences)公司)，而增补婴儿奶粉。
在一些实施例中，该组成物是一种动物饲料。“动物”是包括属于动物界的非人类生物体，及包括而不限于水生动物与陆生动物。“动物饲料”或“动物食品”一词是指预定供非人类动物用的任一食品，不论是用于鱼类；经济鱼类；观赏鱼类；仔鱼；二枚贝类；软件动物；甲壳动物；贝介类；虾；虾苗；丰年虾；轮虫；卤虫；滤食性生物；两栖动物；爬虫类动物；哺乳类动物；家畜；农场动物；动物园动物；运动用动物；种畜；竞赛用动物；表演用动物；传承用动物；稀有或濒临绝种的动物；同伴动物；宠物诸如狗、猫、天竺鼠、兔、大鼠、小鼠或马；灵长类动物诸如猴(如卷尾猴、恒河猴、非洲绿猴、赤猴、食蟹猴及草原猴)、猿、红毛猩猩、狒狒、长臂猿及黑猩猩；犬科动物诸如狗与狼；猫科动物诸如猫、狮及虎；马科动物诸如马、驴及斑马；供食用的动物诸如母牛、牛、猪与羊；有蹄动物诸如鹿与长颈鹿；或啮齿动物诸如小鼠、大鼠、仓鼠及天竺鼠等。动物饲料包括但不限于水产养殖用饲料、包括宠物饲料的家畜饲料、动物园动物饲料、役畜饲料、牲畜饲料及其组合。
在一些实施例中，该组成物是其肉或产物供人类食用的任一动物的一种饲料或饲料增补剂，诸如取其肉、蛋或乳供人类食用的任一动物。当喂食至所述动物时，营养素诸如LC-PUFA可被纳入所述动物的肉、乳、蛋或其它产物中，以增加所述营养素的含量。
在一些实施例中，该组成物是一种喷雾干燥式物质，其可碎裂形成供浮游动物、丰年虾、轮虫及滤食性生物食用的适合颗粒尺寸。在一些实施例中，喂食该组成物的浮游动物、丰年虾或轮虫，进而用于喂食仔鱼、鱼、贝介类、二枚贝类或甲壳动物。
在一些实施例中，该组成物是一种药学组成物。适宜的药学组成物包括但不限于一种消炎组成物、用于治疗冠状动脉心脏病的药物、用于治疗动脉硬化的药物、一种化学治疗剂、一种活性赋形剂、一种骨质疏松症药物、一种抗忧郁药物、一种抗痉挛药物、一种抗幽门螺旋杆菌(Helicobacter pylori)药物、用于治疗神经退化性疾病的药物、用于治疗肝脏退化性疾病的药物、一种抗生素、一种降胆固醇组成物及一种降三酸甘油酯组成物。在一些实施例中，该组成物是一种药用食品。药用食品包括在医师视导下服用或外部投药的组成物中的食品及预定用于一种病况的膳食管理，而该病况的独特营养需求是以公认的科学原理为基础及藉由医学评估而建立的。
在一些实施例中，可将微生物油配制于一剂型中。该剂型可包括但不限于包含有效量的微生物油的锭剂、胶囊、扁囊剂、小丸剂、丸剂、散剂及颗粒剂；及非经肠剂型，其包括但不限于液剂、悬液剂、乳剂及干粉剂。本领域中亦已知所述配方亦可含有药学上可接受的稀释剂、填料、崩散剂、黏合剂、润滑剂、表面活性剂、疏水性载剂、水溶性载剂、乳化剂、缓冲液、保湿剂、增湿剂、助溶剂、防腐剂等。投药形式可包括但不限于含有微生物油及一或多种适宜的药学上可接受的载剂的锭剂、糖衣锭、胶囊、胶囊锭及丸剂。
就口服而言，微生物油可与本领域中所熟知的药学上可接受的载剂组合。所述载剂有助于将本发明的微生物油配制为锭剂、丸剂、糖衣锭、胶囊、液体、凝胶体、糖浆、浆剂、悬液剂等，以供待治疗的个体口服使用。在一些实施例中，该剂型是锭剂、丸剂或胶囊锭。可藉由添加一种固态赋形剂而制得供口服使用的药学制剂，选择性地将所产生的混合物研磨，及在若为所欲的适宜助剂的添加作用后，加工处理颗粒剂的混合物，以制得锭剂或糖衣锭核心。适宜的赋形剂包括但不限于填料，诸如糖类，其包括但不限于乳糖、蔗糖、甘露糖醇及山梨糖醇；纤维素制剂诸如但不限于玉米淀粉、小麦淀粉、米淀粉、马铃薯淀粉、明胶、黄蓍胶、甲基纤维素、羟基丙基甲基纤维素、羧基甲基纤维素钠及聚乙烯吡咯啶酮(PVP)。若为所欲者，可添加破碎剂，诸如但不限于交联聚乙烯吡咯啶酮、洋菜或褐藻酸或其盐类诸如褐藻酸钠。可供口服使用的药学制剂，包括但不限于由明胶制成的推合式胶囊以及由明胶与一种塑化剂诸如甘油或山梨糖醇制成的软式密封胶囊。在一些实施例中，该剂型是一种素食用剂型，其中该剂型并非自动物来源的任一组分形成及亦不含有所述组分。在一些实施例中，该素食用剂型是一种素食用胶囊。
在一些实施例中，该组成物是一种化妆品。化妆品包括但不限于乳液、乳霜、洗剂、面膜、肥皂、洗发精、洗涤剂、面霜、润发乳、彩妆、沐浴剂及乳浊液。化妆品用剂可为药用或非药用。
在一些实施例中，该组成物是一种工业用组成物。在一些实施例中，该组成物是用于一或多种制品中的一种起始原料。一制品包括但不限于一种聚合物；一种摄影感光材料；一种清洁剂；一种工业用油；或一种工业用清洁剂。例如，第7,259,006号美国专利述及含DHA的脂肪与油在二十二酸的生产作用及使用二十二酸的摄影敏感性材料的生产作用的用途。
使用该组成物的方法
在一些实施例中，该组成物可用于治疗人类或非人类动物中的病况。在一些实施例中，该组成物可供人类或非人类动物的营养之用。
“治疗”与“治疗作用”等词是指治疗性治疗与预防性或防止性措施，其中的目标是预防或减缓(减轻)一种非所欲的生理状况、疾病或失调，或获得有益或所欲的临床结果。就本发明的目的而言，有益的或所欲的临床结果包括但不限于减轻或消除与病况、疾病或失调相关联的症状或征象；降低病况、疾病或失调的程度；稳定病况、疾病或失调(亦即该病况、疾病或失调不再恶化)；延迟该病况、疾病或失调的初发或恶化；改善该病况、疾病或失调；缓解该病况、疾病或失调(不论部分或全面及不论可侦测或不可侦测)；或增进或改善病况、疾病或失调。治疗作用包括引发临床上显著的反应，而无过度的副作用。治疗作用亦包括延长存活，相较于未接受治疗的预期存活时间而言。
在一些实施例中，该组成物是用于治疗病况、疾病或失调诸如青春痘、急性发炎、年龄相关性黄斑部病变、过敏症、阿滋海默氏(Alzheimer)症、关节炎、气喘、动脉粥状硬化、自体免疫疾病、血脂异常、乳房囊肿、恶病质、癌症、心脏血管再狭窄化、心血管疾病、慢性发炎、冠状动脉心脏病、囊肿纤维症、肝脏的退化性疾患、糖尿病、湿疹、胃肠疾患、心脏病、高三酸甘油酯水平、高血压、过动症、免疫疾病、抑制肿瘤生长、发炎性病症、肠胃疾病、肾功能障碍、白血病、重郁症、多发性硬化症、神经退化性疾病、骨关节炎、骨质疏松症、过氧化体疾病、子癫前症、早产、牛皮癣、肺部疾病、类风湿性关节炎、心脏病风险或血栓症。
在一些实施例中，该组成物是用于增加第三孕期胎儿的妊娠期长度。
在一些实施例中，该组成物是用于控制血压。
在一些实施例中，该组成物是用于增进或维护认知功能。
在一些实施例中，该组成物是用于增进或维护记忆力。
该组成物可藉由与该组成物或剂型相容的任一途径或剂型投药至个体的体内。若物质是由该个体导入个体的体内，或若该物质是由他人、机器或装置导入个体的体内，则该物质视为“投药”。因此，“投药”包括如自我投药、由他人投药及间接投药作用。如在此参照“投药作用”所用的“连续的”或“接连的”等词，是指投药频率至少每日一次。然而，应察知投药频率可高于每日一次及仍为“连续的”或“接连的”，如每日二次或甚至三次，只要未超过在此所指定的剂量水平即可。用于投药的方式与方法是本领域中所知，及技术人员可参考各种的药理学参考书以寻求导引。例如可查阅美国保健信息(Informa Healthcare)出版公司的由Banker与Rhodes所著的“现代药剂学(Modern Pharmaceutics)”乙书第4版(2002年)；及美国纽约的麦格罗-希尔(McGraw-Hill)有限公司的“古德曼与吉尔曼的治疗学的药学基础(Goodman & Gilman’s The Pharmaceutical Basis ofTherapeutics)”乙书第10版(2001年)。
“个体(subject)”、“个体(individual)”或“病患”，是指人类或非人类的任一个体，而诊断、预后、疗法或组成物的投药作用或剂型等所需保护的。哺乳类动物个体包括但不限于人类；家畜；农场动物；动物园动物；运动用动物；宠物诸如狗、猫、天竺鼠、兔、大鼠、小鼠或马；灵长类动物诸如猴(如卷尾猴、恒河猴、非洲绿猴、赤猴、食蟹猴及草原猴)、猿、红毛猩猩、狒狒、长臂猿及黑猩猩；犬科动物诸如狗与狼；猫科动物诸如猫、狮及虎；马科动物诸如马、驴及斑马；供食用的动物诸如母牛、牛、猪与羊；有蹄动物诸如鹿与长颈鹿；啮齿动物诸如小鼠、大鼠、仓鼠及天竺鼠等。个体一词亦涵盖模式动物，如疾病模式动物。在一些实施例中，个体一词包括在经济上或其它方面有价值的动物，如经济上重要的种畜、竞赛用动物、展示用动物、传承用动物、稀有或濒临绝种的动物或同伴动物。在特定的实施例中，该个体是人类个体。在特定的实施例中，该个体是非人类个体。
该组成物可依“营养量”、“治疗有效量”、“预防有效量”、“治疗性剂量”或“预防性剂量”投药。“营养量”是指在所需的剂量与时间长度有效达成所需营养结果的量。营养结果可为如一个体所需的脂肪酸组分水平的增加。“治疗有效量”或“治疗性剂量”是指在所需的剂量与时间长度有效达成所需的治疗结果的量。治疗结果可为如减轻症状、延长存活、改善活动性等。治疗结果不必定为“治愈”。“预防有效量”或“预防性剂量”是指在所需的剂量与时间长度有效达成所需的预防结果的量。典型地，因预防性剂量在疾病之前或在较早期阶段用于个体中，预防有效量将低于用于治疗晚期疾病的治疗有效量。
可基于待投药至个体的该微生物、生物质或微生物油的EPA或其它脂肪酸组分的量，而将该组成物的各种剂量、剂型或药学组成物投药至该个体。“每日剂量”、“每日剂量水平”及“每日给药量”等词，在此是指每日(每24小时期间)投予的EPA或其它脂肪酸组分的总量。因此，例如，以2毫克的每日剂量将EPA投药至一个体，是指该个体每日领受总共2毫克的EPA，不论EPA是以一个包含2毫克EPA的单一剂型投药，或任选地以各包含0.5毫克EPA的四个剂型(总共为2毫克EPA)投药。在一些实施例中，每日的EPA量是以一个单一剂型或以二个剂型投药。可单次服用或分多次服用本发明的剂型。例如，若每日服用四个锭剂，各锭剂包含0.5毫克的EPA，则可每日一次服用所有四个锭剂，或每日二次各服用2个锭剂，或每6小时服用1个锭剂。在一些实施例中，每日剂量是约100毫克至约15克的EPA。在一些实施例中，每日剂量是约0.5毫克至约250毫克、约100毫克至约250毫克、约100毫克至约500毫克、约100毫克至约1克、约1克至约2.5克、约1克至约5克、约1克至约10克、约1克至约15克、约5克至约10克、约5克至约15克、约10克至约15克、约100毫克至约10克、约100毫克至约5克或约100毫克至约2.5克的EPA、DHA或其组合物。在一些实施例中，该组成物是每个剂型包含约0.5毫克至约250毫克、100毫克至约250毫克、约0.5毫克至约500毫克、约100毫克至约500毫克、约0.5毫克至约1克或约100毫克至约1克的EPA、DHA或其组合物的一种剂型。
可使用各种方式，达成本发明的组成物或剂型的投药作用。例如，在一些实施例中，接连地每日进行投药，或任选地隔日进行投药(每二日一次)。投药作用可在一或多日进行。
组成物与剂型的投药作用可与用于治疗该病况的其它方法组合。例如，本发明的方法可组合饮食疗法(如低碳水化合物饮食、高蛋白质饮食、高纤维饮食等)、运动疗法、减重疗法、戒烟疗法或其组合。本发明的方法亦可与治疗该病况的其它药学产物组合使用。本发明的组成物或剂型可在其它疗法或药学产物之前或之后投药。
包含该组成物的套组
本发明有关于含有一或多个单位的本发明的组成物的套组或包装。该套组或包装可包括一种含有本发明的微生物、生物质或微生物油或其组合物的食用产品、药学组成物、化妆品或工业用组成物单元。该套组或包装亦可包括一种包含本发明的微生物、生物质或微生物油或其组合物的添加剂，其用于制备一种食品、化妆品、药学组成物或工业用组成物。
在一些实施例中，该套组或包装含有待依据本发明的方法投药的一或多个单位的一种药学组成物。该套组或包装可含有一剂量单位或超过一剂量单位(亦即多个剂量单位)。若在该套组或包装中具有多个剂量单位，则可选择性地配置该多个剂量单位以供循序投药之用。
本发明的套组可选择性地包含与该套组的单位或剂型相关的说明。所述说明可为管理药学产品的制造、使用或销售的政府机关所指定的形式，该通知亦反映该机关核准其制造、使用或销售以供投药至人类治疗一病况或疾患。该说明可为传递依据本发明的方法使用该套组中的单位或剂型的相关信息的任一形式。例如，所述说明可为印刷品的形式，或为一种预录的媒体装置的形式。
在检查病患的期间，医学专业人员可判定施用本发明的方法中的一种适于该病患，或医师可判定藉由施用本发明的方法中的一种可改善病患的状况。在指定任一疗法之前，医师可就例如与该疗法相关联的各种风险与效益方面辅导病患。可对病患全盘揭露与该疗法相关联的所有已知与疑似风险。该项辅导能以口头方式以及以书面方式提供。在一些实施例中，医师可提供病患有关该疗法的文献数据，诸如产品信息、教育材料等。
本发明有关于教育消费者有关所述治疗方法的方法，该方法包括在销售点分发该剂型与消费者信息。在一些实施例中，是在具有药剂师或健康照护提供者的销售点进行分发。
“消费者信息”一词可包括但不限于英语本文、非英语本文、视觉图像、图表、电话录音、网站及与现场消费者服务代表联络的方式。在一些实施例中，消费者信息将提供有关依据本发明的方法使用所述剂型、适当的使用年龄、适应症、禁忌、适当的剂量、警语、电话号码或网址的说明。在一些实施例中，该方法进一步包括提供专业信息给相关人员，所述人员负责回答消费者有关依据本发明方法使用所揭露疗法的问题。“专业信息”一词包括但不限于有关依据本发明方法投药的疗法的信息，其设计有助于医学专业人员回答消费者的问题。
“医学专业人员”包括例如医师、医师助理、护士、执业护理师、药剂师及消费者服务代表。
在整体地说明本发明之后，可藉由参考在此提供的实例而获得进一步的了解。所述实例仅为了说明的目的，及并非意欲作为限制。
实施例1、微生物的分离
在低潮期间，自包括沿着北美洲西海岸(加州、俄勒岗州及华盛顿州)及夏威夷的海湾与潮口的潮间栖息地收集试样。将水、沉积物、活的植物物质及腐败的植物/动物碎屑置于无菌的50毫升管中。将各试样的一部分以及水涂抹在分离用培养基的固态洋菜平皿上。分离用培养基包含：500毫升的人工海水、500毫升的蒸馏水、1克的葡萄糖、1克的甘油、13克的洋菜、1克的麸胺酸盐、0.5克的酵母提取物、0.5克酪蛋白水解物、1毫升的维生素溶液(100毫克/升的硫胺素、0.5毫克/升的生物素、0.5毫克的B12)、1毫升的微量矿物质溶液(每升含有6.0克FeCl36H2O、6.84克H3BO3、0.86克MnCl24H2O、0.06克ZnCl2、0.026CoCl26H20、0.052克NiSO4H2O、0.002克CuSO45H2O及0.005克Na2MoO42H2O的PII金属)及各500毫克的盘尼西林G与硫酸链霉素。洋菜平皿于20至25℃的黑暗中培养。在2至4日后，在放大后检视洋菜平皿，以无菌的牙签挑取细胞菌落及再画线接种在新的培养基平皿上。将细胞重复地画线接种在新的培养基上直至移除受污染的生物体为止。分离的微生物中的二种保藏在ATCC登录号PTA-10212与PTA-10208。
在ATCC登录号PTA-10212所保藏的分离的微生物的分类特征
在ATCC登录号PTA-10212所保藏的分离的微生物(“PTA-10212)的培养呈现为白色、湿的涂抹菌落形式，而无可见的分离的孢子囊群。
在固态与液态FFM、固态KMV、KMV泥(1％)、KMV肉汁及MH肉汁中培养PTA-10212，以进一步检视生长特性。观察到PTA-10212在KMV与MH生长快速。如见美国波士顿的琼斯与巴雷特(Jones and Bartlett)出版社的Margulis，L.、Corliss，J.O.、Melkonian，M.、Chapman，D.J.(编辑)的“原生生物界手册(Handbook of Protoctista)”乙书第388-398页的Porter D.于1989年的“网黏菌门(Phylum Labyrinthulomycota)”乙文(KMV)；Honda等人于期刊“Mycol.Res.”第102期第439-448页乙文(1998年)(MH)；及第5,130,242号美国专利(FFM)，其中各者在此完整地并入本案以为参考数据。
PTA-10212在固态FFM培养基生长数日之后、在KMV培养基与MH肉汁中生长72小时之后，进行下列观察。孢子囊并未群集在任一培养基之中或之上，及孢子囊非常地小(5至10微米)。PTA-10212并未展现裂殖壶菌属(Schizochytrium)分裂型所特有的大量的四分子。在转移至新的固态培养基约24小时之后，出现变形虫状细胞。所述变形虫状细胞在数日之后消失，及在液态或泥状培养基中不明显。不同于Yokoyama，R.等人于期刊“Mycoscience”第48(6)期第329-341页乙文(2007年)所述的当生长于液态培养基时具有“位于烧瓶底部的小型沙粒”外观的Aurantiochytrium，PTA-10212并不沉降至烧瓶底部而是悬浮于KMV与MH液态培养基中。孢子囊的稠密度不如裂殖壶菌属(Schizochytrium)或Oligochytrium典型所具有者，其等亦具有PTA-10212中所缺乏的强健的外质网络。当大部分的物种在数小时期间藉由较大型孢子囊的分裂而进行小孢子囊或同化细胞的营养分裂时，PTA-10212形成哑铃状的拉长型同化细胞，其然后形成薄的峡部及当哑铃的终端分开时被拉断。所产生的细胞似乎是小型同化细胞。未观察到变形虫状细胞直接转形成为哑铃状的同化细胞。观察到典型的二鞭毛游走孢子游动，但相当地少。PTA-10212并无繁殖力，其藉由营养分裂而分裂。虽然观察到游走孢子游动，但未观察到直接释出游走孢子。营养细胞非常小(2微米至5微米)。
使用流通技术进一步检视PTA-10212，其中藉由将一小部分的生长于洋菜的生长菌落悬浮于一滴的半强度海水中而制备载玻片。藉由该技术，观察到初生孢子囊为球状及直径约10微米。壁非常薄，及当原生质体的均体分裂起始时并未观察到残迹。重复的均体分裂产生8至16个较小(直径4至5微米)的次生孢子囊。次生孢子囊维持静息达数小时，然后再度释出一种无定形的原生质体。无定形原生质体藉由收聚与牵引作用分裂，最初产生典型的哑铃状中间阶段，及最后产生4至8个直径2.5至2.8微米的小型球体。后者休止数分钟至1至2小时，然后改变形状(拉长)及变成二鞭毛的游走孢子，2.3至2.5x3.7至3.9微米。游走孢子的数量众多，及当其等休止时可精确测量。游走孢子然后圆满完成及开始一个新的发育周期。游走孢子比Sicyoidochytrium minutum大及比威瑟氏吾肯氏壶菌(Ulkenia visurgensis)小。
以其18s rRNA基因与已知物种的相似性为基础，进一步分析PTA-10212的特性。藉由标准程序，自PTA-10212制备基因组DNA。如见美国纽约冷泉港(ColdSpring Harbor)的冷泉港实验室出版(Cold Spring Harbor Laboratory Press)公司于2001年出版的Sambrook J.与Russell D.的“分子选殖：实验室手册”(MolecularCloning：A Laboratory Manual)乙书第三版。简述为：(1)将来自对数中期培养的500微升细胞离心。将细胞再度离心，及以小孔径的管头自细胞片状沉淀物移除所有的水；(2)将片状沉淀物再悬浮于200微升的分解缓冲液(20mM Tris pH8.0、125微克/毫升的蛋白酶K、50mM氯化钠、10mM EDTA pH 8.0、0.5％SDS)中；(3)细胞在50℃进行分解1小时；(4)将分解作用混合物量吸至2毫升的锁相凝胶管(PLG-Eppendorf)中；(5)添加等体积的P∶C∶I及让其混合1.5小时；(6)该管于12,000x g离心5分钟；(7)自PLG管内将凝胶上方的含水相移除，及在含水相中添加等体积的氯仿，及混合30分钟；(8)该管于14,000x g离心约5分钟；(9)自氯仿将顶层(含水相)吸出，及置于一个新的管中；(10)添加0.1体积的3M NaOAC及加以混合(倒置数次)；(11)添加2体积的100％乙醇及加以混合(倒置数次)，而基因组DNA沉淀物在本时期形成；(12)在微量离心机中，该管于4℃及14,000x g离心约15分钟；(13)将液体平缓地倒除，及基因组DNA剩余在该管的底部；(14)以0.5毫升的70％乙醇清洗片状沉淀物；(15)在微量离心机中，该管于4℃及14,000x g离心约5分钟；(16)将乙醇平缓地倒除，及干燥基因组DNA的片状沉淀物；及(17)在基因组DNA的片状沉淀物中直接添加适宜体积的水与核糖核酸酶。以先前所述的引物(Honda等人于期刊“J.Euk.Micro.”第46(6)期第637-647页乙文(1999年)进行18s rRNA基因的聚合酶链反应扩增作用。用于染色体DNA模板的聚合酶链反应条件如下：位于50微升的总体积中的0.2μM dNTP、0.1μM的各引物、8％DMSO、200奈克的染色体DNA、2.5U HerculaseII融合DNA聚合酶(史崔塔基因(Stratagene)公司)及Herculase
Figure BPA00001595252700362
缓冲液(史崔塔基因(Stratagene)公司)。聚合酶链反应的操作程序包括下列步骤：(1)95℃达2分钟；(2)95℃达35秒；(3)55℃达35秒；(4)72℃达1分钟又30秒；(5)重复步骤2至4达30个循环；(6)72℃达5分钟；及(7)保持在4℃。
聚合酶链反应扩增作用使用上述的染色体模板而产生具有预期大小的一种独特的DNA产物。依据厂商的说明书，将聚合酶链反应产物植入载体pJET1.2/平整(弗曼塔斯(Fermentas)公司)中，及使用所提供的标准引物测定插入序列。
系谱分析在中等的证明之下，将PTA-10212置于包括厚皮破囊壶菌属(Thraustochytrium pachydermum)与聚合破囊壶菌(Thraustochytrium aggregatum)的谱系内。厚皮破囊壶菌属(T.pachydermum)的孢子囊具有非常厚的细胞壁。聚合破囊壶菌(T.aggregatum)形成明显可见的不透明孢子囊群的群集。PTA-10212并未显示所述特性中的任一者。在其它分类群诸如吾肯氏壶菌属(Ulkenia)、T.gaertnerium、A.limiacinum及红树林裂殖壶菌(S.mangrovei)中，曾述及存在众多的变形虫状细胞；然而，与所述分类群相关联的叙述说明，与分离的微生物所观察到的特性不同。此外，PTA-10212并未显现对于所述分类群中任一者的系谱亲和性。
表3显示来自在ATCC登录号PTA-10212所保藏微生物的18s rRNA序列与国家生物科技信息中心(National Center for Biotechnology Information)(NCBI)电子数据库中的DNA序列的比较。使用二种不同的计算，测定相同度百分比。“计算#1将出现在序列中的来自非同源区域或部份序列的任一“间隔”纳入考虑(AlignX-载体NTI预设设定)。“计算#2并不包括间隔的计算罚分(AlignX-载体NTI“相同度”矩阵设定)。
表3：18s rRNA序列的比较
Figure BPA00001595252700371
(p)：指部份序列
如表3所示，发现就相同度％而言，来自在ATCC登录号PTA-10212所保藏微生物的18s rRNA基因序列(SEQ ID NO：1)，与NCBI数据库可取得的18s rRNA基因序列相近，虽然并非一致。一般认为在生物体属于不同的属或种之际，仍可具有非常相近的18s rRNA基因序列。
基于上述的特性分析，在ATCC登录号PTA-10212所保藏的分离的微生物据信代表一种新的破囊壶菌属(Thraustochytrium)物种，及因此亦命名为破囊壶菌属物种(Thraustochytrium sp.)ATCCPTA-10212。
在ATCC登录号PTA-10208所保藏的分离的微生物的分类特征
在ATCC登录号PTA-10208所保藏的微生物(“PTA-10208)，经认定为在ATCC登录号PTA-9695所保藏微生物(“PTA-9695)的一种亚分离株(自培养物分离出的个别细胞及保有一种分离与独特的培养株形式)，“PTA-9695是述于第12/407,687号美国专利申请案与PCT/US2009/001720，其中各者在此完整地并入本案以为参考数据。
PTA-10208具有PTA-9695的分类特征。发现PTA-9695在释出时具有活跃地游动离开成熟孢子囊的二鞭毛游走孢子，其壁残迹在释出孢子之后仍清楚可见(在位相差)。测得PTA-9695孢子囊的直径为12.5微米至25微米，而游走孢子的尺寸为2.5微米至2.8微米x4.5微米至4.8微米。每个PTA-9695孢子囊具有8至24个孢子。稳定后的PTA-9695游走孢子增大，及迅速进行均体分裂而形成四分体、八分体，及最后形成孢子囊聚簇。四分体形成作用在孢子囊成熟前的非常早期的阶段开始。所述特性与裂殖壶菌属(Schizochytrium)相符。就相同度％而言，发现PTA-10208亦具有PTA-9695的18s rRNA基因序列(SEQ ID NO：2)，其与Honda等人于期刊“J.Euk.Micro.”第46(6)期第637-647页乙文(1999年)中所提供的聚合破囊壶菌(T.aggregatum)的18s rRNA基因序列非常相近的，虽然并非一致。所发表的聚合破囊壶菌(Thraustochytrium aggregatum)的18s rRNA序列是一种部份序列，在序列中间具有约71个DNA核苷酸的一个间隔。PTA-9695据信代表一种新的裂殖壶菌属(Schizochytrium)物种。因此，亚分离株PTA-10208亦命名为裂殖壶菌属物种(Schizochytrium sp.)ATCCPTA-10208。
实施例2、在ATCC登录号PTA-10212所保藏的分离的微生物的生长特性
在如后述的个别发酵操作中，检视在ATCC登录号PTA-10212所保藏的分离的微生物的生长特性。典型的培养基与培养条件示于表1。
在添加碳(甘油)与氮的具有1000ppm的氯离子与20％溶氧的22.5℃与pH7.3的培养中，PTA-10212在体积为10升的发酵槽中培养138小时之后，产生26.2克/升的细胞干重。脂质产率为7.9克/升；ω-3产率为5.3克/升；EPA产率为3.3克/升；及DHA产率为1.8克/升。脂肪酸含量为30.3重量％；EPA含量为41.4％的脂肪酸甲基酯类(FAME)；及DHA含量为26.2％的FAME。脂质生产力为1.38克/升/日，及在所述条件下的ω-3生产力为0.92克/升/日，而EPA生产力为0.57克/升/日及DHA生产力为0.31克/升/日。
在添加碳(甘油)与氮的具有1000ppm的氯离子与20％溶氧的22.5℃与pH7.3的培养中，PTA-10212在体积为10升的发酵槽中培养189小时之后，产生38.4克/升的细胞干重。脂质产率为18克/升；ω-3产率为12克/升；EPA产率为5克/升；及DHA产率为6.8克/升。脂肪酸含量为45重量％；EPA含量为27.8％的FAME；及DHA含量为37.9％的FAME。脂质生产力为2.3克/升/日，及在所述条件下的ω-3生产力为1.5克/升/日，EPA生产力为0.63克/升/日及DHA生产力为0.86克/升/日。
在添加碳(甘油)与氮的具有1000ppm的氯离子与20％溶氧的22.5℃与pH6.8-7.7的培养中，PTA-10212在体积为10升的发酵槽中培养189小时之后，产生13克/升的细胞干重。脂质产率为5.6克/升；ω-3产率为3.5克/升；EPA产率为1.55克/升；及DHA产率为1.9克/升。脂肪酸含量为38重量％；EPA含量为29.5％的FAME；及DHA含量为36％的FAME。脂质生产力为0.67克/升/日，及在所述条件下的ω-3生产力为0.4克/升/日，EPA生产力为0.20克/升/日及DHA生产力为0.24克/升/日。
在添加碳(甘油)与氮的具有1000ppm的氯离子与20％溶氧的22.5至28.5℃与pH 6.6-7.2的培养中，PTA-10212在体积为10升的发酵槽中培养191小时之后，产生36.7克/升至48.7克/升的细胞干重。脂质产率为15.2克/升至25.3克/升；ω-3产率为9.3克/升至13.8克/升；EPA产率为2.5克/升至3.3克/升；及DHA产率为5.8克/升至11克/升。脂肪酸含量为42.4％至53重量％；EPA含量为9.8％至22％的FAME；及DHA含量为38.1％至43.6％的FAME。脂质生产力为1.9克/升/日至3.2克/升/日，及在所述条件下的ω-3生产力为1.2克/升/日至1.7克/升/日，EPA生产力为0.31克/升/日至0.41克/升/日及DHA生产力为0.72克/升/日至1.4克/升/日。
在ATCC登录号PTA-10208所保藏的分离的微生物的生长特性
在如后述的个别发酵操作中，检视在ATCC登录号PTA-10208所保藏的分离的微生物的生长特性。典型的培养基与培养条件示于表2。
在添加碳(葡萄糖)与氮的具有1000ppm的氯离子及氮进料期间的20％溶氧与之后的10％溶氧的22.5℃与pH 7.0的培养中，PTA-10208在体积为10升的发酵槽中培养200小时之后，产生95克/升的细胞干重。脂质产率为53.7克/升；ω-3产率为37克/升；EPA产率为14.3克/升；及DHA产率为21克/升。脂肪酸含量为57重量％；EPA含量为27.7％的FAME；及DHA含量为39.1％的FAME。脂质生产力为6.4克/升/日，及在所述条件下的ω-3生产力为4.4克/升/日，EPA生产力为1.7克/升/日及DHA生产力为2.5克/升/日。
在添加碳(葡萄糖)与氮的具有1000ppm的氯离子及氮进料期间的20％溶氧与之后的10％溶氧的22.5℃与pH 7.5的培养中，PTA-10208在体积为10升的发酵槽中培养139小时之后，产生56克/升的细胞干重。脂质产率为53克/升；ω-3产率为34克/升；EPA产率为11.5克/升；及DHA产率为22克/升。脂肪酸含量为58重量％；EPA含量为21.7％的FAME；及DHA含量为41.7％的FAME。脂质生产力为9.2克/升/日，及在所述条件下的ω-3生产力为5.9克/升/日，EPA生产力为2克/升/日及DHA生产力为3.8克/升/日。
在添加碳(葡萄糖)与氮的具有1000ppm的氯离子及氮进料期间的20％溶氧与之后的10％溶氧的22.5℃与pH 7.0的培养中，PTA-10208在体积为2000升的发酵槽中培养167小时之后，产生93.8克/升的细胞干重。脂质产率为47.2克/升；ω-3产率为33.1克/升；EPA产率为10.5克/升；及DHA产率为20.4克/升。脂肪酸含量为50.6重量％；EPA含量为23％的FAME；及DHA含量为42.6％的FAME。脂质生产力为6.8克/升/日，及在所述条件下的ω-3生产力为4.7克/升/日，EPA生产力为1.5克/升/日及DHA生产力为2.9克/升/日。
在添加碳(葡萄糖)与氮的具有1000ppm的氯离子及氮进料期间的20％溶氧与之后的10％溶氧的22.5℃与pH 7.0的培养中，PTA-10208在体积为2000升的发酵槽中培养168小时之后，产生105克/升的细胞干重。脂质产率为46.4克/升；ω-3产率为33克/升；EPA产率为10.7克/升；及DHA产率为20.3克/升。脂肪酸含量为43.9重量％；EPA含量为24％的FAME；及DHA含量为43.7％的FAME。脂质生产力为6.6克/升/日，及在所述条件下的ω-3生产力为4.7克/升/日，EPA生产力为1.5克/升/日及DHA生产力为2.9克/升/日。
在添加碳(葡萄糖)与氮的具有1000ppm的氯离子及氮进料期间的20％溶氧与之后的10％溶氧的22.5℃与pH 7.0的培养中，PTA-10208在体积为2000升的发酵槽中培养168小时的后，产生64.8克/升的细胞干重。脂质产率为38.7克/升；ω-3产率为29.9克/升；EPA产率为8.5克/升；及DHA产率为16.7克/升。脂肪酸含量为59.6重量％；EPA含量为23％的FAME；及DHA含量为42.3％的FAME。脂质生产力为5.53克/升/日，及在所述条件下的ω-3生产力为3.8克/升/日，EPA生产力为1.2克/升/日及DHA生产力为2.3克/升/日。
实施例3、微生物菌株ATCC PTA-10208与PTA-10212的脂肪酸廓型
藉由溶剂萃取作用分析四个生物质试样(PTA-10208试样#1；PTA-10208试样#2；PTA-10212试样#1；及PTA-10212试样#2)的总粗制油含量，藉由高性能液相层析法/蒸发光散射检测作用(HPLC/ELSD)测定脂质种类，藉由HPLC/质谱法(HPLC/MS)分析甘油三酯(TAG)，及藉由具有火焰离子化侦检作用的气相层析法(GC-FID)测定脂肪酸(FA)廓型。藉由使用己烷的溶剂研磨作用测定各冷冻干燥生物质的粗脂质含量，及与藉由直接转酯化作用所产生的FAME总量(毫克/克)相比较，及藉由GC/FID分析将所产生的脂肪酸甲基酯类(FAME)量化。亦藉由转酯化作用将所萃取的粗脂质中的脂肪酸量化，及使用GC/FID分析将所产生的FAME量化。使用具有ELSD与大气压力化学离子化-MS(APCI-MS)鉴定的正相HPLC，测定所萃取的粗脂质中的所有中性脂质(NL)与游离脂肪酸(FFA)的重量百分比。该方法分离与量化固醇酯(SE)、TAG、游离脂肪酸(FFA)、1，3-甘油二酯(1，3-DAG)、固醇、1，2-甘油二酯(1，2-DAG)及甘油单酯(MAG)。结果示于下列表4与表5。
自四个生物质试样(PTA-10208试样#1；PTA-10208试样#2；PTA-10212试样#1；及PTA-10212试样#2)所萃取的粗制油中分离出TAG与磷脂(PL)。使用低压急骤层析法分离TAG，及使用固相萃取作用(SPE)分离PL。藉由薄层层析法(TLC)确认各分离部分的身分。依循使用GC-FID的直接转酯化作用，测定所分离出的TAG与PL部分的FAME形式的脂肪酸廓型。结果示于下列表6与表7。
亦在来自微生物菌株ATCCPTA-10212的二个附加的生物质试样(PTA-10212试样#3与PTA-10212试样#4)，测定所分离出的脂质种类的总粗制油含量与脂肪酸廓型。藉由己烷萃取作用自各试样制得粗制油，及使用低压急骤层析法分离个别的脂质种类。使用GC-FID，测定生物质、粗制油及分离部分的FAME形式的脂肪酸廓型。结果示于下列表8至表11。
自先前使用FRIOLEX
Figure BPA00001595252700411
方法所萃取的来自微生物菌株ATCCPTA-10212的粗制油试样(PTA-10212试样#5)，分离个别的脂质种类，及使用GC-FID测定各种类的FAME形式的脂肪酸廓型。结果示于下列表12与表13。
使用具有ELSD与APCI-MS鉴定的正相HPLC，自微生物菌株ATCCPTA-10208的粗制油试样(PTA-10208试样#3)，分离个别的脂质种类。
实验程序
粗制油萃取作用-使用溶剂研磨作用，自冷冻干燥的生物质试样，萃取粗制油。例如，将约3克的生物质称重置入一瑞典式管中。在瑞典式管中添加3个滚珠轴承与30毫升的己烷，以氯丁二烯橡胶塞密封该管及置于振荡器中2小时。使用布赫纳(Buchner)漏斗与惠特曼(Whatman)滤纸，将所产生的浆料过滤。收集过滤后的液体，在真空中移除溶剂，及以重量分析方式测定剩余粗脂质的量。
脂肪酸分析-针对生物质、所萃取的粗脂质及分离出的脂质种类的试样分析FAME形式的脂肪酸组成。简言之，将冷冻干燥的生物质与分离出的脂质种类直接称重置入一螺旋盖试管中，同时将粗制油的试样溶于己烷中而得约2毫克/毫升的浓度。在各管中添加含有内标准的甲苯及位于甲醇中的1.5N盐酸。所述管进行涡漩，然后加盖及加热至100℃达2小时。然后让所述管冷却，及添加位于水中的饱和氯化钠。所述管再度进行涡漩，及离心而使得各层分离。然后将一部分的有机层置入一个GC小瓶中，及藉由GC-FID分析。藉由使用Nu-Check-Prep GLC参考标准(美国明尼苏达州伊利森(Elysian)的努伽克(NuCheck)公司)所产生的三点校正曲线，而量化FAME。存在于萃取物中的脂肪酸是以毫克/克的形式及以重量百分比的形式表示。假设藉由GC-FID分析时的反应与内标准相当，而估算试样中的脂肪含量。
HPLC/ELSD/MS方法-
梯度
  时间，分钟     ％A     ％B
  0     100     0
  5     100     0
  15     85     10
  20     0     100
  25     0     100
  26     100     0
  35     100     0
Figure BPA00001595252700431
固相萃取作用-使用置于一个Vac Elut装置(美国加州帕洛阿尔托(Palo Alto)的瓦瑞安(Varian)公司)中的2克的胺丙基匣(瑞典乌普萨拉(Uppsala)的百特基(Biotage)公司)，藉由固相萃取作用(SPE)自粗脂质分离PL部分。以15毫升的己烷调节该匣，及将约60毫克的各试样溶于1毫升的三氯甲烷及施用至该匣。以15毫升的2∶1的三氯甲烷∶异丙醇清洗该管柱，以洗提所有的中性脂质，及予以弃置。然后以15毫升的位于乙醚中的2％乙酸(HOAc)洗提脂肪酸，及予以弃置。以15毫升的6∶1的甲醇∶氯仿洗提PL部分，将其收集、在氮气下干燥及加以称重。
急骤层析法-使用急骤层析法分离存在于粗制油中的脂质种类。将溶于己烷中的约200毫克的粗制油注入至管柱顶部。该层析法系统采用硅胶(Silica Gel)60(美国纽泽西州吉布斯敦(Gibbstown)的EMD化学公司)，及移动相是由5毫升/分钟(表6至表7)或3毫升/分钟(表8至表13)的石油醚与乙酸乙酯所组成。使用分级梯度，以选择性地自该管柱洗提各脂质种类。该移动相梯度自100％石油醚开始及以50％乙酸乙酯终结。使用一种吉尔森(Gilson)FC 204大床式分液收集器(美国威斯康星州米德顿(Middleton)的吉尔森(Gilson)有限公司)，在10毫升试管中收集分液。藉由薄层层析法(TLC)分析各管，及将含有个别脂质种类的所述管(如藉由TLC板上的具有预期滞留因子(Rf)的单一点所判定)汇集、浓缩至干及加以称重。然后以重量分析方式测定总分液含量。
TLC分析-在硅胶板上进行薄层层析法。使用由石油醚∶乙醚∶乙酸(80∶20∶1)所组成的溶剂系统洗提所述板，及使用碘蒸气显现。然后将各点的Rf(值与文献所报导的各脂质种类的数值相比较。
TAG与PL部分的分析-分析所分离出的TAG与PL部分的脂肪酸甲基酯(FAME)形式的脂肪酸组成。将TAG部分溶于己烷，而得约1至2毫克/毫升的浓度。在氮气下，将溶液的1毫升等分试样浓缩至干。在各管中添加含有内标准的甲苯及位于甲醇中的1.5N盐酸。所述管进行涡漩，然后加盖及加热至100℃达2小时。在含有PL部分的所述管中直接添加内标准与盐酸甲醇，及予以加热。然后让所述管冷却，及添加位于水中的饱和氯化钠。所述管再度进行涡漩及离心而使得各层分离。然后将一部分的有机层置入一个GC小瓶中，及藉由GC-FID分析。藉由使用Nu-Check-Prep GLC 502B参考标准(美国明尼苏达州伊利森(Elysian)的努伽克(NuCheck)公司)所产生的三点校正曲线，量化FAME。存在于萃取物中的脂肪酸以毫克/克及以FAME的百分比表示。
结果
PTA-10208试样#1
使用GC/FID测定PTA-10208试样#1的生物质与所萃取的粗脂质的脂肪酸廓型。藉由将28.6毫克的生物质直接称重置入一个FAME管中，而就地将生物质中的脂肪酸转酯化；藉由将55.0毫克的粗脂质称重置入一个体积为50毫升的烧瓶中及将1毫升转移至另一个FAME管中，而制备所萃取的粗脂质的一试样。使用具FID检测的GC，测定生物质的估计粗脂质含量为53.2％(以FAME总和的形式)；同时自干燥生物质萃取52.0％(重量/重量)的脂质，而得97.8％的总脂质回收率。使用GC/FID，测定粗脂质为91.9％的脂肪酸(以FAME总和的形式)。粗脂质中所含有的主要脂肪酸为C16:0(182.5毫克/克)、C20:5 n-3(186.8毫克/克)及C22:6n-3(423.1毫克/克)。
藉由将55.0毫克的粗脂质称重置入一个体积为50毫升的烧瓶中及将一等分试样转移至一个HPLC小瓶中以进行HPLC/ELSD/MS分析，而测定所萃取的粗脂质的脂质种类廓型。依据HPLC/ELSD/MS分析，粗脂质含有0.2％的固醇酯(SE)、95.1％的TAG、0.4％的固醇及0.5％的1，2-甘油二酯(DAG)。TAG部分中的5％包括在TAG峰后直接洗提出的峰，但并未产生一个可辨识的质谱。
藉由急骤层析法的测定，自该试样所分离出的TAG构成约92.4％的粗制油。在SPE分离作用后，藉由重量或TLC并未检测到PL。TAG中所含有的主要脂肪酸(＞50毫克/克)为C16:0(189毫克/克)、C20:5 n-3(197毫克/克)及C22:6 n-3(441毫克/克)。
PTA-10208试样#2
使用GC/FID测定PTA-10208试样#2的生物质与所萃取的粗脂质的脂肪酸廓型。藉由将32.0毫克的生物质直接称重置入一个FAME管中，而就地将生物质中的脂肪酸转酯化；藉由将60.1毫克的粗脂质称重置入一个体积为50毫升的烧瓶中及将1毫升转移至另一个FAME管中，而制备所萃取的粗脂质的试样。使用具FID检测的GC，测定生物质的估计粗脂质含量为52.4％(以FAME总和的形式)，同时自干燥生物质萃取48.0％(重量/重量)的脂质，而得91.7％的总脂质回收率。使用GC/FID，测定粗脂质为95.3％的脂肪酸(以FAME总和的形式)。粗脂质中所含有的主要脂肪酸为C16:0(217.5毫克/克)、C20:5 n-3(169.3毫克/克)及C22:6n-3(444.1毫克/克)。
藉由将60.1毫克的粗脂质称重置入一个体积为50毫升的烧瓶中及将一等分试样转移至一个HPLC小瓶中以进行HPLC/ELSD/MS分析，而测定所萃取的粗脂质的脂质种类廓型。依据HPLC/ELSD/MS分析，粗脂质含有0.2％的SE、95.7％的TAG、0.3％的固醇及0.7％的1，2-DAG。TAG部分中的5.1％包括在TAG峰后直接洗提出的峰，但并未产生一个可辨识的质谱。
自该试样所分离出的TAG构成约93.9％的粗制油。在SPE分离作用后，藉由重量或TLC并未检测到PL。TAG中所含有的主要脂肪酸(＞50毫克/克)为C16:0(218毫克/克)、C20:5 n-3(167毫克/克)及C22:6 n-3(430毫克/克)。
PTA-10208试样#3
使用HPLC/ELSD/MS，分析在ATCC登录号PTA-10208所保藏微生物的粗制油的一试样(试样PTA-10208#3)。回收总共98.38％的脂质，其中固醇酯(SE)部分占0.32％，TAG部分占96.13％，1，3-甘油二酯(DAG)部分占0.22％，1，2-DAG部分占0.78％，及固醇部分占0.93％。
PTA-10212试样#1
使用GC/FID测定PTA-10212试样#1的生物质与所萃取的粗脂质的脂肪酸廓型。藉由将27.0毫克的生物质直接称重置入一个FAME管中，而就地将生物质中的脂肪酸转酯化；藉由将52.5毫克的粗脂质称重置入一个体积为50毫升的烧瓶中及将1毫升转移至另一个FAME管中，而制备所萃取的粗脂质的一试样。使用具FID检测的GC，测定生物质的估计粗脂质含量为38.3％(以FAME总和的形式)，同时自干燥生物质萃取36.3％(重量/重量)的脂质，而得94.6％的总脂质回收率。使用GC/FID，测定粗脂质为83.2％的脂肪酸(以FAME总和的形式)。粗脂质中所含有的主要脂肪酸为C16:0(328.5毫克/克)、C20:5 n-3(90.08毫克/克)及C22:6n-3(289.3毫克/克)。
藉由将52.5毫克的粗脂质称重置入一个体积为50毫升的烧瓶中及将一等分试样转移至一个HPLC小瓶中以进行HPLC/ELSD/MS分析，而测定所萃取的粗脂质的脂质种类廓型。依据HPLC/ELSD/MS分析，粗脂质含有0.2％的SE、64.2％的TAG、1.9％的FFA、2.8％的1，3-DAG、1.4％的固醇、18.8％的1，2-DAG及0.5％MAG。TAG部分中的3.4％包括在TAG峰后直接洗提出的峰，但并未产生一个可辨识的质谱。
自该试样所分离出的TAG构成约49.8％的粗制油。所分离出的PL构成约8.1％的粗制油。在TAG部分中所含有的主要脂肪酸(＞50毫克/克)为C16:0(400毫克/克)、C20:5 n-3(91毫克/克)及C22:6 n-3(273毫克/克)。在PL部分中所含有的主要脂肪酸(＞50毫克/克)为C16:0(98毫克/克)、C20:5 n-3(33毫克/克)及C22:6n-3(227毫克/克)。
PTA-10212试样#2
使用GC/FID测定PTA-10212试样#2的生物质与所萃取的粗脂质的脂肪酸廓型。藉由将29.5毫克的生物质直接称重置入一个FAME管中，而就地将生物质中的脂肪酸转酯化；藉由将56.5毫克的粗脂质称重置入一个体积为50毫升的烧瓶中及将1毫升转移至另一个FAME管中，而制备所萃取的粗脂质的试样。使用具FID检测的GC，测定生物质的估计粗脂质含量为40.0％(以FAME总和的形式)，同时自干燥生物质萃取41.3％(重量/重量)的脂质，而得106.1％的总脂质回收率。使用GC/FID，测定粗脂质为82.8％的脂肪酸(以FAME总和的形式)。粗脂质中所含有的主要脂肪酸为C16:0(327.3毫克/克)、C20:5 n-3(92.5毫克/克)及C22:6 n-3(277.6毫克/克)。
藉由将56.5毫克的粗脂质称重置入一个体积为50毫升的烧瓶中及将一等分试样转移至一个HPLC小瓶中以进行HPLC/ELSD/MS分析，而测定所萃取的粗脂质的脂质种类廓型。依据HPLC/ELSD/MS分析，粗脂质含有0.2％的SE、58.2％的TAG、2.3％的FFA、3.4％的1，3-DAG、1.7％的固醇、23.4％的1，2-DAG及0.6％的MAG。TAG部分中的3.3％包括在TAG峰后直接洗提出的峰，但并未产生一个可辨识的质谱。
自该试样所分离出的TAG构成约51.9％的粗制油。所分离出的PL构成约8.8％的粗制油。在TAG部分中所含有的主要脂肪酸(＞50毫克/克)为C16:0(402毫克/克)、C20:5 n-3(92毫克/克)及C22:6 n-3(245毫克/克)。在PL部分中所含有的主要脂肪酸(＞50毫克/克)为C16:0(121毫克/克)、C20:5 n-3(48毫克/克)及C22:6n-3(246毫克/克)。
表4：PTA-10208与PTA-10212的生物质与所萃取的粗脂质的脂肪酸廓型(毫克/克)
Figure BPA00001595252700471
表5：PTA-10208与PTA-10212的生物质与所萃取的粗脂质的脂肪酸廓型(％)
Figure BPA00001595252700501
Figure BPA00001595252700521
表6：PTA-10208与PTA-10212所分离的TAG的脂肪酸廓型
Figure BPA00001595252700522
Figure BPA00001595252700531
Figure BPA00001595252700541
表7：PTA-10212所分离的PL的脂肪酸廓型
Figure BPA00001595252700551
Figure BPA00001595252700561
PTA-10212试样#3
PTA-10212试样#3的生物质中的FAME总和形式的脂质含量经估算为34％，及在溶剂萃取作用后所得的粗制油量为37重量％，而得生物质中所存在的脂肪的回收率为109％。在使用急骤层析法的份化作用后，约46％的粗制油被分离为TAG，28％被分离为DAG，该粗制油含有309毫克/克的DHA与264毫克/克的EPA。所分离出的TAG含有341毫克/克的DHA与274毫克/克的EPA。所分离出的DAG部分含有262毫克/克的DHA与237毫克/克的EPA。该生物质、所萃取的粗制油及分离部分的总脂肪酸廓型，分别以毫克/克与％FAME的形式计算而示于表8与表9。
表8：PTA-10212试样#3的生物质与所萃取的粗脂质的脂肪酸廓型(毫克/克)
Figure BPA00001595252700581
  生物质   粗制油   TAG   DAG
  C24:0   0.0   1.7   3.9   0.0
  C22:4 n-9   0.0   0.0   0.0   0.0
  C24:1 n-9   0.0   0.0   4.2   0.0
  C22:5 n-6   3.2   8.3   10.7   6.1
  C22:5 n-3   3.8   10.4   15.1   6.6
  C22:6 n-3   131.2   309.4   341.1   261.9
  FAME总和   342.4   871.1   973.2   682.6
表9：PTA-10212试样#3的生物质与所萃取的粗脂质的脂肪酸廓型(％)
Figure BPA00001595252700601
  生物质   粗制油   TAG   DAG
  C24:0   0.0   0.2   0.4   0.0
  C22:4 n-9   0.0   0.0   0.0   0.0
  C24:1 n-9   0.0   0.0   0.4   0.0
  C22:5 n-6   0.9   1.0   1.1   0.9
  C22:5 n-3   1.1   1.2   1.6   1.0
  C22:6 n-3   38.3   35.5   35.1   38.4
  总％FAME   100.0   100.0   100.0   100.0
PTA-10212试样#4
PTA-10212试样#4含有以FAME总和形式所测定的约23％的脂质，使用己烷萃取作用回收其中的107％。在使用急骤层析法的份化作用后，约42％的粗制油被分离为TAG，18％被分离为DAG。该粗制油含有275毫克/克的DHA与209毫克/克的EPA。所分离出的TAG含有296毫克/克的DHA与205毫克/克的EPA。所分离出的DAG部分含有245毫克/克的DHA与219毫克/克的EPA。该生物质、所萃取的粗制油及分离出的部分的总脂肪酸廓型，示于表10(毫克/克)与表11(％FAME)。
表10：PTA-10212试样#4的生物质与所萃取的粗脂质的脂肪酸廓型(毫克/克)
Figure BPA00001595252700631
  生物质   粗制油   TAG   DAG
  C24:0   0.0   2.6   0.8   0.0
  C22:4 n-9   0.1   0.0   0.0   0.0
  C24:1 n-9   0.0   0.0   1.1   0.5
  C22:5 n-6   1.4   6.1   7.9   4.5
  C22:5 n-3   4.0   15.8   20.8   12.9
  C22:6 n-3   87.7   275.0   296.4   244.8
  FAME总和   232.2   790.1   894.8   672.4
表11：PTA-10212试样#4的生物质与所萃取的粗脂质的脂肪酸廓型(％)
Figure BPA00001595252700651
  生物质   粗制油   TAG   DAG
  C24:0   0.0   0.3   0.1   0.0
  C22:4 n-9   0.0   0.0   0.0   0.0
  C24:1 n-9   0.0   0.0   0.1   0.1
  C22:5 n-6   0.6   0.8   0.9   0.7
  C22:5 n-3   1.7   2.0   2.3   1.9
  C22:6 n-3   37.8   34.8   33.1   36.4
  总％FAME   100.0   100.0   100.0   100.0
PTA-10212试样#5
使用FRIOLEX
Figure BPA00001595252700671
方法(英国米尔顿凯恩斯(Milton Keynes)的英国GEA威斯伐里亚分离器(GEA Westfalia Separator UK)有限公司)，自PTA-10212的生物质萃取粗制油试样，以产生微生物油PTA-10212试样#5。使用低压急骤层析法，自PTA-10212试样#5分离个别的脂质种类，及测定各种类的重量百分比。使用GC-FID测定各种类的脂肪酸廓型。
简言之，藉由将240毫克的粗制油溶于600微升的己烷中及施用于管柱顶部，而制备试样。在使用急骤层析法的试样份化作用后，所有部分的合并重量为240毫克，而得100％的回收率。固醇酯部分占0.9％，TAG部分占42.6％，游离脂肪酸(FFA)部分占1.3％，固醇部分占2.2％，DAG部分占41.6％。FRIOLEX
Figure BPA00001595252700672
粗制油与分离部分的总脂肪酸廓型，分别以毫克/克与％FAME的形式计算及示于表12与表13。
表12：PTA-10212试样#5的粗制油的脂肪酸廓型(毫克/克)
Figure BPA00001595252700681
Figure BPA00001595252700691
表13：PTA-10212试样#5的粗制油的脂肪酸廓型(％)
  粗制油   TAG   DAG
  脂肪酸   ％FAME   ％FAME   ％FAME
  C12:0   0   0.1   0.1
  C14:0   1   0.9   1.0
  C14:1   0   0.0   0.0
  C15:0   1.3   1.3   1.1
  C16:0   22.5   24.0   16.1
  C16:1   2.3   1.8   3.1
  C18:0   1   1.5   0.3
  C18:1 n-9   0.6   0.9   0.1
  C18:1 n-7   0   0.2   0.1
  C18:2 n-6   0.2   0.4   0.1
  C20:0   0.2   0.4   0.0
  C18:3 n-3   0   0.0   0.0
  C20:1 n-9   0   0.1   0.1
  C18:4 n-3   0.4   0.3   0.5
  C20:2 n-6   0   0.0   0.0
  C20:3 n-6   0   0.1   0.0
  C22:0   0   0.2   0.0
  C20:4 n-7   0   0.1   0.1
  C20:3 n-3   0   0.0   0.0
  C20:4 n-6   1.6   1.8   1.6
  C22:1 n-9   0   0.0   0.0
  C20:4 n-5   0   0.2   0.1
  C20:4 n-3   0.8   1.0   0.8
  C20:5 n-3   26.8   24.7   30.2
  C24:0   0.3   0.5   0.1
  C22:4 n-9   0   0.2   0.1
  C24:1 n-9   0   0.0   0.0
  C22:5 n-6   1   1.1   1.0
  C22:5 n-3   1.6   2.3   1.2
  C22:6 n-3   38.4   36.2   42.3
  总％FAME   100   100   100
实施例4
使用非水逆相HPLC分离作用与APCI-MS检测作用，针对来自实施例3的PTA-10208试样#1、PTA-10208试样#2、PTA-10212试样#1、PTA-10212试样#2及PTA-10212试样#3、PTA-10212试样#4及PTA-10212试样#5中的各试样，测定存在于所萃取的粗脂质中的各TAG异构物的相对量与脂肪酸组成。
TAG方法-
Figure BPA00001595252700721
梯度
  时间，分钟     ％A     ％B
  0     80     20
  120     20     80
  125     20     80
  126     80     20
  140     80     20
Figure BPA00001595252700722
PTA-10208试样#1
藉由将5.5毫克的油称重置入一个HPLC小瓶中及以1毫升的己烷稀释，而制备用于TAG分析的自PTA-10208试样#1所分离的粗脂质。
表14：鉴定PTA-10208试样#1中的TAG物种
Figure BPA00001595252700731
PTA-10208试样#2
藉由将5.3毫克的油称重置入一个HPLC小瓶中及以1毫升的己烷稀释，而制备用于TAG分析的自PTA-10208试样#2所分离的粗脂质。
表15：鉴定PTA-10208试样#2中的TAG物种
Figure BPA00001595252700751
Figure BPA00001595252700761
PTA-10212试样#1
藉由将称重5.3毫克的油称重置入一个HPLC小瓶中及以1毫升的己烷稀释，而制备用于TAG分析的自PTA-10212试样#1所分离的粗脂质。
表16：鉴定PTA-10212试样#1中的TAG物种
Figure BPA00001595252700781
ND＝未检测出
PTA-10212试样#2
藉由将称重3.6毫克的油称重置入一个HPLC小瓶中及以1毫升的己烷稀释，而制备用于TAG分析的自PTA-10212试样#2所分离的粗脂质。
表17：鉴定PTA-10212试样#2中的TAG物种
Figure BPA00001595252700801
ND＝未检测出
PTA-10212试样#3
在己烷中制备PTA-10212试样#3的TAG部分的试样，及藉由HPLC/APCI/MS分析以测定个别TAG异构物的身分。
表18：鉴定PTA-10212试样#3中的TAG物种
Figure BPA00001595252700802
Figure BPA00001595252700811
ND＝未检测出
PTA-10212试样#4
在己烷中制备PTA-10212试样#4的TAG部分的试样，及藉由HPLC/APCI/MS分析以测定个别TAG异构物的身分。
表19：鉴定PTA-10212试样#4中的TAG物种
Figure BPA00001595252700812
Figure BPA00001595252700821
Figure BPA00001595252700831
ND＝未检测出
PTA-10212试样#5
在己烷中制备PTA-10212试样#5的TAG部分的试样，及藉由HPLC/APCI/MS分析以测定个别TAG异构物的身分。
表20：鉴定PTA-10212试样#5中的TAG物种
Figure BPA00001595252700832
Figure BPA00001595252700851
实施例5
经由精制、脱色及除臭而进一步加工处理粗制油，以制得精制油。以高油酸的葵花籽油稀释该精制油，以制得DHA含量约400毫克/克的最终油。分离个别的脂质种类，及使用GC-FID测定各种类的FAME形式的脂肪酸廓型。
PTA-10208最终油
PTA-10208最终油#1至5的脂肪酸廓型汇总于表21至22，包括与所分离的TAG部分相关联(表23至24)及与所分离的固醇/DAG部分相关联(表24至26)的廓型。
亦使用急骤层析法(表27)及具有ELSD与APCI-MS验证的正相HPLC(表28)，测定最终油中的个别脂质种类。
表21：PTA-10208最终油的脂肪酸廓型(毫克/克)
Figure BPA00001595252700861
Figure BPA00001595252700871
表22：PTA-10208最终油的脂肪酸廓型(％)
Figure BPA00001595252700872
Figure BPA00001595252700881
表23：所分离的TAG脂肪酸廓型：PTA-10208最终油(毫克/克)
Figure BPA00001595252700891
Figure BPA00001595252700901
表24：所分离的TAG脂肪酸廓型：PTA-10208最终油(％)
Figure BPA00001595252700911
表25：所分离的固醇/DAG脂肪酸廓型：PTA-10208最终油(毫克/克)
Figure BPA00001595252700921
Figure BPA00001595252700931
表26：所分离的固醇/DAG脂肪酸廓型：PTA-10208最终油(％)
Figure BPA00001595252700941
Figure BPA00001595252700951
表27：藉由急骤层析法的脂质种类分离作用(重量％)
Figure BPA00001595252700961
表28：藉由HPLC-ELSD的脂质种类分离作用(重量％)
Figure BPA00001595252700962
ND＝未检测出
PTA-10212最终油
DHA以41.63％与366.9毫克/克存在于PTA-10212最终油中，而EPA以16.52％存在。测定个别脂肪酸廓型及汇总于表29。
表29：PTA-10212最终油的脂肪酸廓型(％FAME)
  脂肪酸   ％FAME
  C6:0   ND
  C7:0   ND
  C8:0   ND
  C9:0   ND
  C10:0   ND
  C11:0   ND
  C12:0   ND
  C13:0   ND
  C14:0   0.84
  C14:1   ND
  C15:0   1.33
  C16:0   27.09
  C16:1   1.03
  C17:0   0.34
  C17:1   ND
  C18:0   1.26
  C18:1 n-9   2.14
  C18:1 n-7   0.18
  C19:0   ND
  C18:2 n-6   0.58
  C20:0   0.32
  C18:3 n-3   ND
  C20:1 n-9   ND
  C18:3 n-6   ND
  C20:2 n-6   0.26
  C20:3 n-6   ND
  C22:0   0.14
  C20:3 n-3   ND
  C20:4 n-6   1.34
  C22:1 n-9   ND
  C23:0   ND
  C20:5 n-3   16.53
  C24:0   0.53
  C24:1 n-9   ND
  C22:5 n-6   1.50
  C22:5 n-3   1.30
  C22:6 n-3   41.63
  未知   0.87
ND＝未检测出
实施例6
使用实施例4所述的技术，进行实施例5所述的PTA-10208最终油的甘油三酯(TAG)的分析。进行各脂肪酸部分的鉴定作用，及汇总于下列表30。
表30：鉴定PTA-10208最终油中的TAG物种
Figure BPA00001595252700991
Figure BPA00001595252701001
实施例7
在如表1与表2的培养基中，以添加碳与氮的培养形式，制备在ATCC登录号PTA-10208与10212所保藏的分离的微生物的一个已二天的接种体烧瓶。
依据下列程序进行诱突变作用：
将一个已T＝2日的无菌烧瓶中的约50毫升，倒入一个无菌的40毫升玻璃均质机中。该培养物在均质机中接受50次倾没型搅拌。将该培养物吸量出，及过滤通过置于一个50毫升的无菌管中的一个无菌的50微米筛网过滤器(该筛网作为留住菌落的较大型群集及同时让较小的聚簇与单细胞通过该50微米筛网的构件)。在一个无菌的50毫升管中收集全部的浓缩浸出物。浸渍过的培养物进行涡漩，及以1∶100倍的水平稀释。稀释后的浸出试样进行涡漩，然后将200微升的接种体添加至一个100x15毫米、含有4至5个玻璃珠(3毫米玻璃珠)的培养基洋菜平皿上。将各平皿平缓地搅拌，以使得玻璃珠将接种体均匀地涂布在平皿上。自平皿上移除玻璃珠，及让平皿加盖静置约5分钟而干燥。当该程序在暗光中进行时，将无菌通风橱与邻近区域的灯光关闭。仅存在使该程序得以进行的间接与微弱的极少量的光。
当照射所述试样时，将五重复的平皿的盖移开，及将平皿置于XL交联器(美国纽约的斯贝克(Spectronics Corporation)公司)的底板上。该交联器所输送的功率以微焦耳为单位，及其水平是寻求达到90％至95％的杀死率。五重复的对照组平皿是使用相同的操作程序接种未经诱发突变的细胞。使用细胞数目计算杀死％。一旦照射完成后，将平皿取出及加盖，及依序以封口膜(parafilm)与铝箔包裹平皿。该平皿在第一周务必在黑暗中生长，藉此其等无法修补受损的基因。
将平皿置于22.5℃房中约10日，然后计数菌落。当进行最终计数之后，以一个无菌的接种环挑取菌落及再画线接种在新的培养基平皿上。将各菌落分植在个别的平皿上。当平皿生长稠密时，使用一接种环采集一试样，及接种至含有50毫升的培养基的一个无菌的250毫升摇瓶中。将该烧瓶置于22.5℃房中的一个200rpm振荡器上。在T＝7日，将该摇瓶的培养物采集置入一个50毫升的无菌管中。测定pH值，及将试样离心以收集生物质的片状沉淀物。将各试样冲洗及再悬浮于异丙醇与蒸馏水的50∶50混合物中，然后再度离心。将所收集的片状沉淀物冷冻干燥、称重及进行FAME分析。表31与表32的数据分别代表以上述方法自菌株PTA-10208与PTA-10212所产生的突变株。
表31：PTA-10208突变株
表32：PTA-10212突变株
Figure BPA00001595252701032
Figure BPA00001595252701041
能以任一与所有变化组合所述的各种方面、实施例及选项。
在本说明书所提及的所有公开案、专利及专利申请案在此并入本案以为参考资料，如同每个个别的公开案、专利及专利申请案个别地与单独地在此并入本案以为参考数据。
Figure IPA00001595252200011
Figure IPA00001595252200021
Figure IPA00001595252200031
PCT/RO/134表
  申请人或代理人档案号124418-1PWCN   国际申请号PCT/US2010/028175
关于微生物保藏的说明
(专利合作条约实施细则13之2)
Figure QPA00001595252100011
PCT/RO/134表(1998年7月，2004年1月再版)

Claims (46)

1.一种在ATCC登录号PTA-10212所保藏物种的分离的微生物。
2.一种具有在ATCC登录号PTA-10212所保藏物种的特性的分离的微生物。
3.一种分离的微生物，其所包含的一种18s rRNA含有SEQ ID NO：1的一种多核苷酸序列或与SEQ ID NO：1的相同度至少94％的一种多核苷酸序列。
4.一种分离的微生物，其所包含的一种18s rRNA多核苷酸序列与在ATCC登录号PTA-10212所保藏微生物的一种18s rRNA多核苷酸序列的相同度为至少94％。
5.一种在ATCC登录号PTA-10208所保藏物种的分离的微生物，其中该微生物所生产的总脂肪酸包含超过约10重量％的二十碳五烯酸。
6.一种具有在ATCC登录号PTA-10208所保藏物种的特性的分离的微生物，其中该微生物所生产的总脂肪酸包含超过约10重量％的二十碳五烯酸。
7.一种生产一个甘油三酯部分的分离的微生物，其中该甘油三酯部分中的二十碳五烯酸含量为至少约12重量％。
8.如权利要求1至7任一所述的分离的微生物，其中该微生物是一种突变型菌株。
9.一种在ATCC登录号PTA-10212保藏的分离的微生物。
10.一种在ATCC登录号PTA-10213保藏的分离的微生物。
11.一种在ATCC登录号PTA-10214保藏的分离的微生物。
12.一种在ATCC登录号PTA-10215保藏的分离的微生物。
13.一种在ATCC登录号PTA-10208保藏的分离的微生物。
14.一种在ATCC登录号PTA-10209保藏的分离的微生物。
15.一种在ATCC登录号PTA-10210保藏的分离的微生物。
16.一种在ATCC登录号PTA-10211保藏的分离的微生物。
17.一种包含如权利要求1至16任一所述的微生物或其混合物的生物质。
18.一种分离的生物质，其中该生物质的细胞干重中的至少约20重量％为脂肪酸，其中超过约10重量％的脂肪酸为二十碳五烯酸，及其中该脂肪酸包含各低于约5重量％的二十碳四烯酸与二十二碳五烯酸n-6。
19.如权利要求18所述的分离的生物质，其中至少约25重量％的脂肪酸为二十二碳六烯酸。
20.一种包含甘油三酯的分离的生物质，其中至少约12重量％的甘油三酯为二十碳五烯酸。
21.如权利要求18至20任一所述的分离的生物质，其中该脂肪酸包含各低于约5重量％的油酸、亚麻油酸、十八碳三烯酸、二十烯酸及芥子酸。
22.一种包含如权利要求1至16任一所述的微生物或其混合物的分离的培养物。
23.一种供非人类动物或人类用的食用产品、化妆品或药学组成物，其包含如权利要求1至21任一所述的微生物或生物质或其混合物。
24.一种微生物油，其包含至少约20重量％的二十碳五烯酸及各低于约5重量％的二十碳四烯酸、二十二碳五烯酸n-6、油酸、亚麻油酸、十八碳三烯酸、二十烯酸、芥子酸及十八碳四烯酸。
25.如权利要求24所述的微生物油，其进一步包含至少约25重量％的二十二碳六烯酸。
26.一种包含至少约10重量％的甘油三酯部分的微生物油，其中该甘油三酯部分中的至少约12重量％的脂肪酸为二十碳五烯酸，其中该甘油三酯部分中的至少约25重量％的脂肪酸为二十二碳六烯酸，及其中该甘油三酯部分中的低于约5重量％的脂肪酸为二十碳四烯酸。
27.一种供非人类动物或人类用的食用产品、化妆品或药学组成物，其包含如权利要求24至26任一所述的微生物油。
28.如权利要求23至27任一所述的食用产品，其中该食用产品是一种婴儿奶粉。
29.如权利要求28所述的食用产品，其中该婴儿奶粉适合早产婴儿使用。
30.如权利要求23或27所述的食用产品，其中该食用产品是乳、饮料、治疗用饮品、营养饮品或其组合物。
31.如权利要求23或27项所述的食用产品，其中该食用产品是用于非人类动物或人类食品中的添加剂。
32.如权利要求23或27项所述的食用产品，其中该食用产品是营养增补剂。
33.如权利要求23或27项所述的食用产品，其中该食用产品是动物饲料。
34.如权利要求33项所述的动物饲料，其中该动物饲料是水产养殖用饲料。
35.如权利要求33项的动物饲料，其中该动物饲料是家畜饲料、动物园动物饲料、役畜饲料、牲畜饲料或其组合物。
36.一种用于生产含有ω-3脂肪酸的微生物油的方法，该方法包括：
在培养基中培育如权利要求1至16任一所述的分离的微生物或其混合物，以生产一种含有ω-3脂肪酸的油。
37.如权利要求36项所述的方法，其进一步包括萃取该油。
38.一种用于生产含有ω-3脂肪酸的微生物油的方法，该方法包括自如权利要求17至21任一所述的生物质萃取一种含有ω-3脂肪酸的油。
39.一种藉由如权利要求36至38项中任一所述的方法所生产的微生物油。
40.一种用于生产如权利要求17至21任一所述的生物质的方法，其包括：
在一培养基中培育如权利要求1至16项任一所述的分离的微生物或其混合物，以生产一种生物质。
41.一种藉由如权利要求40所述的方法所生产的生物质。
42.一种产生如权利要求8所述的突变型菌株的方法，其包括：
诱发如权利要求1至16任一所述的微生物突变；及
分离该突变型菌株。
43.如权利要求1至21、24至26、39及41中任一所述的分离的微生物、生物质或微生物油或其混合物在制造用于治疗发炎或相关病况的药剂的用途。
44.如权利要求1至21、24至26、39及41中任一所述的分离的微生物、生物质或微生物油或其混合物在用于治疗发炎或相关病况的用途。
45.一种用于治疗发炎或相关病况的如权利要求1至21、24至26、39及41中任一所述的分离的微生物、生物质或微生物油或其混合物。
46.一种在需要的个体中用于治疗发炎或相关病况的方法，其包括对于该个体投予如权利要求1至21、24至26、39及41中任一所述的分离的微生物、生物质或微生物油或其混合物及一种药学上可接受的载剂。
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