CN101346138B - Dha、epa或dha衍生的epa用于治疗细胞氧化损伤相关疾病的用途 - Google Patents
Dha、epa或dha衍生的epa用于治疗细胞氧化损伤相关疾病的用途 Download PDFInfo
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Abstract
本发明涉及一种富含二十二碳六烯酸(DHA)或二十碳五烯酸(EPA)或DHA衍生的EPA的酸用于制备一种药物的用途，所述药物用于治疗与氧化损伤相关的病变。具体而言，所述药物用于治疗与神经变性性疾病、眼部疾病、缺血性疾病和炎性疾病相关的病变、与动脉粥样硬化相关的病变、与DNA氧化损伤相关的病变和与体育锻炼相关的病变。
Description
技术领域
本发明涉及一种富含二十二碳六烯酸(DHA)或二十碳五烯酸(EPA)或DHA衍生的EPA的酸用于制备一种药物的用途，所述药物用于治疗与氧化损伤相关的病变。
背景技术
ω-3脂肪酸是维持细胞功能完整性所必需的，并且通常是人类健康所必需的。二十二碳六烯酸(22：6 n-3，DHA)——鱼油和海藻中的一种重要的ω-3组分——主要存在于脑中，以及视网膜的光感受器和突触中。富含DHA的饮食最初由肝脏代谢，然后经由血液中脂蛋白进行分布以满足各个器官的需要。给予DHA会导致其在组织水平上的浓度增加，还会导致与其代谢相关的ω-3二十碳五烯酸(EPA)浓度的增加，而给予EPA仅会在细胞水平上增加其自身浓度并降低DHA浓度。
通常，将DHA掺入到细胞膜的磷脂中，这会影响细胞膜的组成和功能、影响活性氧簇(ROS)的产生、影响膜脂质的氧化、影响转录调控、影响类花生酸的生物合成并且影响细胞内信号转导。此外，在中枢神经系统中，DHA涉及与记忆相关的学习能力的发育、涉及膜的应激功能、涉及感光细胞的生物发生并且涉及依赖于激酶蛋白(quinase protein)的信号转导。一种潜在饮食疗法的基础是修正ω-3脂肪酸的最适浓度以防止某种疾病的发生或发展，例如炎性疾病、肿瘤病变、心血管疾病、抑郁和神经障碍。
在中枢神经系统中，脑和视网膜都显示出不同寻常的保留DHA的能力，甚至是在较长期食用缺乏ω-3脂肪酸的饮食的情况下。几项研究已经描述了DHA对神经元的保护作用，其中DHA以非常高的浓度存在。例如，DHA涉及保护神经元细胞免遭由细胞凋亡导致的死亡。最近已经证明了DHA(发现DHA在年长大鼠海马内含量会有所下降)能够保护所述细胞的原代培养物抵御谷氨酸盐产生的细胞毒性。
在视网膜的光感受器中，还已经证明了DHA可调节Bcl-2家族的促凋亡蛋白和抗凋亡蛋白的水平。视网膜光感受器的外部区段含有视紫红质，并且具有比其他任何类型细胞都要高的DHA含量。DHA集中于光感受器节段外膜(segment disc’s outer membrane)的磷脂中。在降低最佳DHA浓度的情况下，观察到了视网膜功能障碍。视网膜色素上皮细胞(RPE)在DHA的吸收、贮留和转运中起到了非常积极的作用。光感受器和RPE细胞中高含量的DHA主要以如下生理特性与膜中的结构域相关联，其生理特性是有助于调节受体、离子通道、载体等，同时DHA似乎还可调节磷酯酰丝氨酸的浓度。
目前尚不清楚这些作用完全是由DHA自身介导的还是由任何代谢衍生物介导的。已经在视网膜中鉴别出了某些DHA衍生物。尽管涉及所述衍生物合成的酶还没有被准确鉴别出来，但是最近的一些研究结果表明A2磷脂酶(PLA2)和脂氧合酶(LOX)先后参与了所述合成过程。PLA2将DHA从膜磷脂上释放出来，LOX将DHA转化成其代谢活性衍生物。
活性氧簇(ROS)是在行使正常细胞功能的过程中产生的。ROS包括超氧阴离子、过氧化氢和oxydril自由基。它们的高化学反应性导致了蛋白、DNA或脂质的氧化。超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化氢酶(CAT)和谷胱甘肽过氧化物酶(GPx)是主要的抗氧化物酶，这些酶可抵御由于ROS的存在所导致的分子和细胞损伤。氧化应激激活了许多代谢通道；其中一些是细胞保护性的，而另一些会导致细胞死亡。最近的研究表明ROS的产生与降解之间的不平衡在许多疾病的发病机制中是一个显著的危险因素，这种不平衡在某些情况下与所述抗氧化系统衰退相关。
DHA是ROS的靶标，所述ROS会对光感受器细胞和RPE造成损伤。光诱发的视网膜变性会促进光感受器中的DHA丧失。例如，当RPE细胞损伤或死亡时，光感受器功能就会退化，因为RPE细胞是光感受器存活所必需的。因此，氧化应激作用下的RPE细胞死亡会导致视力退化，特别是当黄斑细胞受到影响时，因为黄斑细胞决定了视力敏度。许多视网膜变性(例如与年龄相关的黄斑变性和与眼底黄色斑点症相关的黄斑变性)的病理生理学涉及会导致RPE细胞凋亡的氧化应激。事实上，RPE细胞凋亡似乎是所观察到的与年龄相关的黄斑变性的主要因素。这类研究表明所述细胞已经发展出了高度有效的抗氧化机制(利用高含量的DHA)以保护它们自己并且显示出显著的适应能力。
此外，自由基和衰老之间的关系已被十分普遍地接受了，所根据的证据是无氧呼吸过程中产生的自由基会导致氧化损伤，所述氧化损伤会积累并导致稳态机制的逐渐丧失、对基因表达模式的干扰以及细胞功能的丧失，导致衰老和死亡。氧化剂的产生、抗氧化剂的保护作用和对氧化损伤的修复之间存在相互联系。已经进行了许多研究来确定抗氧化剂防护是否会随年龄增长而下降。这些研究包括对其主要组分的分析：SOD、CAT、GPx酶、谷胱甘肽还原酶、谷胱甘肽-S-转移酶的活性或表达，以及具有抗氧化剂特性的低分子量化合物的浓度。例如，黑腹果蝇(Drosophila melanogaster)体内SOD和CAT的过表达会将预期寿命增加30％并且降低蛋白质氧化导致的损伤。在上下文中，在体外和体内将表皮组织暴露于UV线之下会产生自由基以及其他活性氧簇，导致细胞氧化应激，已经证明这会明显促进衰老。使皮肤过多暴露于紫外线辐射之下会导致急性或慢性损伤。在急性情况下，会产生红斑或烧伤，而慢性的过度暴露会增加患皮肤癌和衰老的风险。此外，已知表皮细胞会通过增加各种蛋白的表达来对急性或慢性氧化应激起反应，所述蛋白例如维持细胞完整性和抵抗氧化损伤所涉及的酶。
在本领域中，已经公知端粒是位于真核染色体末端的非编码的DNA区域。这些端粒由高度保守的DNA序列、重复的串联(TTAGG)n和相关蛋白构成，并且具有一种特别结构，所述结构可妨碍与其他染色体末端的连接以防止端粒融合。这些端粒在保持染色体完整性、保护编码DNA免遭酶的作用及其降解、帮助保持染色体稳定性方面起到必不可少的作用。
与半保留复制的编码序列相反，所述端粒在连续的细胞分裂过程中逐渐丧失了其重复序列。现今，认为需要一个尽可能小的端粒长度来保持端粒功能，当这些端粒达到临界大小时，它们难以在有丝分裂过程中分裂，从而导致端粒联合(TAS)和染色体的不稳定性。所述染色体的不稳定性将伴随着产生误差的概率的增加，所述误差能够导致显著的遗传改变。
由于具有多个双键，所述ω-3脂肪酸被认为在氧化应激过程中是自由基产生和传播的分子靶标，所述氧化应激过程与脂质过氧化物的产生相关。然而，ω-3脂肪酸饮食补充物在各种氧化应激敏感性研究中却获得了矛盾的结果。在人体内进行的一些研究已经证实对LDL的氧化作用增加，而另一些研究则未发现这类作用。在用动物进行的研究中，已经发现使用ω-3脂肪酸的处理会导致对LDL的氧化作用的敏感性增加或降低。另一方面，已经在用富含鱼油饮食喂养3个月的小鼠肝脏内发现了抗氧化剂防御系统中所涉及基因的过表达。
此外，用胶质源性细胞系进行的各种体外研究已经证实富含ω-3脂肪酸的膜对氧化损伤更加敏感。给这些细胞长期补充高浓度DHA会导致培养基中脂质过氧化物的水平升高以及细胞死亡的百分比增加，所述细胞死亡是由于暴露于过氧化氢所诱导的凋亡导致的。然而，还已经证实了羊膜内给予二十二碳六烯酸乙酯可降低大鼠胎儿大脑中的脂质过氧化作用。认为这种反应是由于通过活化抗氧化酶实现的自由基螯合作用所导致的。脑抗氧化能力的增加对于抗氧化应激的主要内源防御(primary endogenous defence)很重要，因为脑内的多不饱和脂肪酸含量相对较高而抗氧化酶含量相对较低。
这些矛盾的结果表明基于脂肪酸的氧化作用会随双键数目而增加的前提的假说并不适用于体内，因为其他可能的机制可能会降低氧化损伤，例如膜蛋白和膜脂质中ω-3脂肪酸的三维结构使得双键对ROS的攻击较不敏感；对促氧化酶(例如PLA2)的抑制或者对抗氧化酶的较高表达。
另一方面，将体育锻炼和自由基的产生联系起来的想法起源于80年代早期，因为在对含氧量低的组织进行的缺血-再灌注事件中观察到了对膜脂质的损伤(参见Lovlin et al.，Eur.J.Appl.Physiol.Occup.Physiol.1987，56(3)313-6)。同时，在大鼠肌细胞内(参见Lew H.Etal.FEBS Lett，1985；185(2)：262-6，Sen CK et al.，J.Appl.Physiol.1994；77(5)：2177-87)和人血液内(参见MacPhail Db et al.，FreeRadic Res Commun 1993；18(3)：177-81，Gohil K.et al.J.Appl.Physiol.1988 Jan；64(1)：115-9)观察到GSSH/GSH比例的增加。自由基还会影响到DNA，并且剧烈的体育锻炼会增加对DNA的损伤，这可以由8-OxodG的增加来证实。力竭性体育运动(跑马拉松)会导致对DNA的损伤(这在试验后一段时间内很明显)并且还会导致对免疫活性细胞的损伤(这可以与进行这类试验后的运动员体内免疫力下降联系起来)。
然而，其他作者并没有观察到在持续游泳90分钟、持续跑步60分钟或通过划船进行力竭性运动之后的任何作用(除了极小的损伤之外)。同时，对受过训练的和未受过训练的运动者进行的研究并没有发现二者的8-oxo-dG尿分泌有任何差异，即使是在那些发现了这样一种损伤的研究中也没有发现差异，认为这种损伤是所述运动的后续反应所带来的，而并不是因剧烈运动对DNA的作用产生的。
剧烈体育锻炼产生氧化应激这一事件是本领域所公知的，但是其根源尚未得到完全确认。
使用n-3脂肪酸进行的运动绩效相关的研究集中于抗炎性作用上，事实上，最初的测定试图发现这些营养物可能通过减少剧烈体育锻炼导致的支气管收缩来改善肺泡-毛细血管吸收的作用。在这一点上，Mickleborough证明了在给予3.2g EPA和2.2g DHA的方案之后，它们通过减少优秀运动员体内的TNF-α和IL-1β减少了促炎性细胞因子，同时支气管收缩也减少。Walser将n-3脂肪酸的血管效应与表明了对体育锻炼不耐受的人体内阳性作用联系起来。另一方面，van Houten等研究了n-3脂肪酸的高摄取与在患冠状动脉综合征后进行心脏康复治疗的患者的良好恢复相关联。
在对运动绩效进行的分析研究中，缺少阳性结果的原因是仅对患者而非健康人群进行了评估并且研究的是血管效应和抗炎性作用。
同时，基于下述理论构想进行了研究：当使血浆内游离脂肪酸浓度高于1mmol/L(发生在糖原耗尽时)时，能够进行的色氨酸转运可使其随后续5-羟色胺(在长时间运动中的一种与所谓“中枢疲劳”有关的神经递质)的增加而增加。另一方面，已知n-3脂肪酸可能会通过上调脂肪酸氧化来减少血浆内游离脂肪酸的量，所述脂肪酸氧化是通过激活转录核因子PPARα来实现的。然而，这些测定并不成功，因为Huffman(2004)通过使用4g n-3脂肪酸(500g含300mg EPA和200mg DHA的胶囊)的剂量方案对两种性别跑步者进行的研究并没有发现游离TRP有任何减少也没有发现运动知觉减少，也没有发现在绩效方面有任何统计学意义上的绩效增加，尽管在服用了n-3脂肪酸的受试者中存在改善绩效的统计学趋势，使得对于作者来说存在下述悬而未决的可能性：即导致所述研究的统计检定力降低的原因是所研究的受试者的数量较少(5名男性和5名女性)。
另一项后续研究使用玉米油作为安慰剂，并且评估了n-3脂肪酸对绩效的作用，该研究没有发现任何显著性差异。Raastad每天给予足球运动员1.6g EPA和1.04g DHA并持续数周，在他们体内并没有发现任何的改善(参见Raastad et al.Scand J.Med Sci Sports 1997；7(1)：25-31)。
另一方面，已知游离脂肪酸会干扰肌肉对葡萄糖的利用，因为其在胞内水平上的类似物乙酰辅酶A会在线粒体内抑制丙酮酸脱氢酶(通过产物抑制)，还会刺激糖原分解和糖原生成作用，在空腹期间导致平稳的高血糖，事实上，在空腹期间连续给予多不饱和脂肪酸有助于可能通过在肝脏水平激活葡萄糖-6-磷酸酶来维持血糖。还已知肌肉中一种脂肪酸组合物可以改变胰岛素敏感性，表明质膜中高含量的多不饱和脂肪酸可提高胰岛素的敏感性而高含量的饱和脂肪酸会产生相反的效果。
体育锻炼会提高葡萄糖吸收、毛细血管灌流、糖原合成率和胰岛素敏感性。在肌肉收缩过程中，温度、胞内pH、ATP/ADP比例、Ca++胞内浓度以及其他代谢产物会发生变化，它们可作为锻炼时的细胞功能调节的信使。在这一点上，Ca++会调节大量的胞内蛋白，包括钙调蛋白激酶、蛋白激酶C(PKC)和神经钙蛋白，所述胞内蛋白是胞内信号转导过程中的重要介质。在有氧锻炼过程中，乙酰辅酶A羧化酶会被AMP激酶(AMPK)所失活，这会导致丙二酰辅酶A水平下降，从而去除了对肉碱棕榈酰转移酶的抑制，导致线粒体内脂肪酸转运的增加(因此促进了脂肪酸氧化)。
AMPK的激活作用可能包括刺激GLUT4和己糖激酶以及多种线粒体酶的表达。然而，令人吃惊的是，AMPK激活并不是锻炼增加骨骼肌对葡萄糖应答的唯一途径(不依赖于胰岛素)。参见Mora and Pessin，J.Biol.Chem.2000；275(21)：16323-16328，该文献显示在增加肌肉内葡萄糖应答的过程中，确实存在数种可激活GLUT4和那些可通过体育锻炼来激活的因子的转录因子如MEF2A和MEF2D。
肌内脂质的增加在肥胖状态下和体育训练过程中较常见，但是结果是对于肥胖人群来说肌内脂质的增加与胰岛素抵抗有关，而在运动员体内高活性的肉碱棕榈酰转移酶会使得脂肪酸经历β氧化。存在确凿的证据证明富含n-3脂肪酸的饮食——甚至伴随着糖血症和血胰岛素血症(insulinaemia)(胰岛素抵抗的信号)的增加——会在胰岛素受体水平上起作用以维持GLUT-4蛋白的易位水平，这已经特别地使用DHA证实过了(参见Jaescchke H.Proc.Soc Exp Biol.Med 1995；209：104-11)。
发明内容
本发明涉及出乎意料的发现：给予的二十二碳六烯酸(本文中也称为DHA)或二十碳五烯酸(EPA)或DHA衍生的EPA——无论是游离形式或是结合到甘油三酯中等等——可作为细胞抗氧化剂。
通过这种方式并且考虑到DHA和EPA之间的代谢关联(DHA可逆转为EPA)，此前所观察到并公开的关于给予DHA的所有作用一定适用于DHA/EPA的混合体系或者甚至适用于EPA的单组分体系，尽管EPA并没有被特别指出。
因此，本发明的一个目的是使用二十二碳六烯酸制备一种用于治疗细胞氧化损伤的药物组合物。
本发明的另一个目的是使用位于甘油主链的一个特定位点上的二十二碳六烯酸(DHA)用于治疗细胞氧化损伤，其中甘油酯的其余两个位点在它们的组成上也是特定的。
本发明的另一个目的是使用二十二碳六烯酸(DHA)制备一种用于在DNA水平治疗细胞氧化损伤的组合物。具体而言，二十二碳六烯酸适用于在端粒缩短的自然过程中作为保护剂以及在治疗细胞氧化损伤的过程中作为过早性衰老的抑制剂。
本发明的一个目的是使用二十二碳六烯酸制备一种用于治疗细胞衰老和遗传疾病的组合物以及一种用于治疗唐氏综合征的组合物，其中所述遗传疾病与线粒体呼吸链障碍有关。
本发明的另一个目的是使用二十二碳六烯酸(DHA)制备一种用于治疗与体育锻炼相关的细胞氧化损伤的组合物。具体而言，二十二碳六烯酸适用于作为运动绩效增强剂以及在体育运动过程中作为血糖水平调节剂。
本发明的另一个目的是使用二十二碳六烯酸制备一种用于增强运动绩效的组合物以及一种用于在体育锻炼后维持血糖水平的组合物，所述维持主要是通过给予食品、乳制品或者利用人们进行体育锻炼时通常使用的任何合适的给予形式来实现。
在本发明中，短语“细胞氧化损伤”是指任何涉及内源或外源的细胞氧化剂种类的产生和降解之间失衡的过程。
令人吃惊的是，本发明的发明人发现DHA能够抑制活性氧簇(ROS)的产生，不管是涉及过氧化物的依赖性诱导还是涉及超氧化物的依赖性诱导。更具体地说，DHA减少了超氧阴离子的产生以及在氧化级联中产生的所有衍生种类，例如极其明显地减少了脂质过氧化反应。此外，发现抗氧化酶活性增加，这表明细胞通过诱导抗氧化剂(主要是酶)的表达以及通过抑制促氧化剂(例如A2磷脂酶)的表达来实现细胞适应。
在本发明的一个实施方案中，所述二十二碳六烯酸掺入甘油一酯、甘油二酯、甘油三酯、磷脂、乙酯或游离脂肪酸中。优选地，所述二十二碳六烯酸形成甘油三酯的形式。
在本发明中，“二十二碳六烯酸掺入甘油酯中”是指甘油一酯、甘油二酯、甘油三酯和磷脂的三个酯化位点中至少有一个被二十二碳六烯酸酯化，且任选地其余酯化位点中至少有一个还被一种选自下列的酸酯化：短链、中链或长链脂肪酸和磷酸。优选地，所述甘油为甘油三酯。
选择甘油三酯作为DHA的化学构造是根据从一项研究中获得的数据，所述研究比较了四种分别为乙酯、磷脂、游离脂肪酸和甘油三酯形式的ω-3脂肪酸在口服后的生物利用度，研究数据表明再酯化的甘油三酯的生物可用度高于其他制品。
在本发明的一个优选的实施方案中，发现所述二十二碳六烯酸占总脂肪酸的重量百分数为20-100％、优选地占总脂肪酸的40-100％，并且更优选地，所述二十二碳六烯酸占总脂肪酸的重量百分数为66-100％。
在另一个优选地实施方案中，所述二十二碳六烯酸通过酯键结合到甘油的至少一个特定位点上(结构化脂质)，以制备一种用于治疗细胞氧化损伤的药物组合物。
这类甘油还可包括至少一种脂肪酸和/或一种磷酸以使得所述二十二碳六烯酸可以结合到选自sn-1、sn-2和sn-3的位点上；还可任选地包括至少一种选自短链和/或中链脂肪酸和磷酸的酸，并且当结合到sn-2位上时，所述甘油还可任选地包括至少一种选自脂肪酸和磷酸的酸。
在这一点上，当任选地提及该术语时，应该理解的是结合到选自sn-1、sn-2和sn-3的位点上的二十二碳六烯酸可能还包括或可能不包括至少一种选自短链和/或中链脂肪酸和磷酸的酸；或者另外应该理解的是结合到sn-2位上的二十二碳六烯酸可能还包括或可能不包括至少一种选自长链脂肪酸和磷酸的酸。
令人惊奇的是，本发明的发明人已经发现与使用二十二碳六烯酸制备一种用于治疗细胞氧化损伤的药物组合物的疗效相比，使用结构化甘油会使疗效产生出乎意料的增加至少两倍或者甚至三倍，所述结构化甘油中已经选定了二十二碳六烯酸的位置和结合到甘油上的其余化合物组成。
所述一般性定义涉及含有位于甘油主链中特定位置上的脂肪酸的脂肪。与体内脂肪酸生物分布相似，所述长链多不饱和脂肪酸(PUFA)优选地位于甘油的sn-2位并且考虑到肠道吸收过程，利用脂肪酶将甘油三酯水解为游离脂肪酸、甘油二酯和甘油一酯，由此所述游离脂肪酸和sn-2甘油一酯可被肠道上皮细胞(称为肠上皮细胞)直接吸收。
使用经由酯键结合到甘油主链特定位置上的二十二碳六烯酸可产生增加的生物活性；在占脂肪酸总量的摩尔百分数相同的条件下可产生增加的抗氧化保护作用；以及对可使甘油酯内二十二碳六烯酸产生抗氧化作用的给药剂量的依赖性降低。
有利的是，本发明的发明人已经发现使用结合到甘油的选自sn-1、sn-2和sn-3的位点上的二十二碳六烯酸——所述甘油任选地还包括至少一种选自短链和/或中链脂肪酸和磷酸的酸——可产生增加的生物活性；在占脂肪酸总量的摩尔百分数相同的条件下可产生增加的抗氧化保护作用；以及对可使甘油内二十二碳六烯酸产生抗氧化作用的给药剂量的依赖性降低。
还有利的是，本发明的发明人已经发现使用结合到甘油的sn-2位上的二十二碳六烯酸——所述甘油任选地还包括至少一种选自长链脂肪酸和磷酸的酸——也可产生增加的生物活性；在占脂肪酸总量的摩尔百分数相同的条件下可产生增加的抗氧化保护作用；以及对可使甘油酯内二十二碳六烯酸产生抗氧化作用的给药剂量的依赖性降低。
优选地，与二十二碳六烯酸一起存在于甘油中的酸为短链脂肪酸(C1-C8)或中链脂肪酸(C9-C14)或磷酸，因为这些酸不具有功能活性而仅具有能量活性，因此这些酸不会与二十二碳六烯酸竞争。
因此，更优选地，本发明涉及使用结合到甘油中的二十二碳六烯酸，其中sn-1和sn-3位之一是游离的或者是被中链脂肪酸(C9-C14)或短链脂肪酸(C1-C8)或磷酸所占据，并且其中sn-2位被功能性DHA所占据。因此，可使DHA实现较高的增长，因为这样的DHA可被肠道细胞更有效地吸收。
因此，合成结构化甘油酯可提高其抗氧化作用，其中当二十二碳六烯酸未与其他脂肪酸竞争时它可以结合到甘油的任一位置上而当DHA与至少一种脂肪酸竞争时它会结合到甘油酯的sn-2位上；因此合成结构化甘油酯是制备一种用于治疗氧化性细胞损伤的组合物的优选方式。
本发明的发明人已经发现可更好地制备富含本发明的含DHA的组合物的细胞以对抗新的氧化应激形式，并且因此使由此产生的有害作用最小。即生物膜中存在的DHA会诱导对氧化应激的细胞适应性应答。适应性应答为一种当与有毒试剂(低于致死浓度)接触时可引起细胞应答的细胞现象，所述细胞应答随后会保护所述细胞免遭处于致死浓度的相同有毒试剂的有害作用，或者换言之，适应性应答是一种通过与低浓度的试剂接触而产生有益效应，所述试剂在高浓度时是有害的。
给予DHA具有下列实质性优点：
a)增加细胞抗氧化活性；
b)所给予的剂量不具有细胞毒性；
c)所给予的剂量不会对细胞抗氧化状态造成明显改变；
d)适应性细胞抗氧化活性。
由于上述全部原因，本发明的一个优选的实施方案涉及使用二十二碳六烯酸制备一种用于治疗与细胞氧化性损伤相关的疾病的药物组合物，所述疾病为神经变性疾病，优选地选自下列疾病：多发性硬化、阿耳茨海默氏病、帕金森病、肌萎缩侧索硬化和肌肉萎缩症等等。
在本发明的另一个实施方案中，与氧化损伤相关的疾病为眼部疾病，优选地为一种选自色素性视网膜变性(pigmentary retinosis)、黄斑变性和白内障等等的疾病。
在另一个实施方案中，与氧化损伤相关的疾病为缺血性疾病，特别是心肌梗塞、脑梗塞等。
在本发明的另一个实施方案中，与氧化损伤相关的疾病为炎性病变，优选地选自关节炎、血管炎、肾小球肾炎和红斑狼疮等等。
在另一个优选的实施方案中，与氧化损伤相关的疾病为动脉粥样硬化。
本发明的另一方面为使用DHA作为在端粒缩短的自然过程中的保护剂并且使用DHA作为过早性衰老的抑制剂。
产生端粒联合(TAS)的机制仍旧是未知的，但是本发明的发明人认为端粒联合与端粒酶的酶活性不足有关，所述端粒酶合成端粒特有的DNA重复序列，从而稳定端粒长度。
端粒酶在胎儿细胞中非常活跃，但是在成人组织细胞中没有过多的活性。TAS很少存在于正常细胞中，但是在病毒感染的细胞或肿瘤细胞中已经观察到了TAS。
已经观察到体外端粒重复的数目以及体内细胞衰老的功能逐渐下降，这与衰老过程中端粒酶活性的抑制有关。类似地，本发明的发明人已经研究了来自于一直健康的人的成纤维细胞和淋巴细胞中的端粒长度，已经发现在所述成纤维细胞的体外增殖过程中存在端粒缩短且端粒长度与供体年龄之间存在负相关性。
尽管随着细胞复制自然会发生端粒缩短，但是当在DNA中诱导氧化损伤时观察到了过早性衰老和端粒破损。端粒对氧化损伤更加敏感并且与基因组的其它部分相比对端粒破损的修复效率较低。这会积累端粒损伤，所述损伤会在DNA复制过程中使端粒缩短更快，降低了细胞复制的预期寿命。活性氧簇(ROS)——特别是超氧阴离子、过氧化氢和oxidril自由基——在某些细胞类型的复制过程中会加速端粒的缺失，尽管他们不论是否使端粒缩减，都会诱导过早性衰老。
令人惊奇的是，本发明的发明人已经发现使用二十二碳六烯酸在DNA水平上治疗细胞氧化损伤可减缓端粒的缩减速率并且因此会抑制细胞衰老。
本发明的发明人已经在超过20种人类成纤维细胞株中发现了端粒缩减速率和细胞抗氧化能力之间存在负相关性。这些过早衰老的成纤维细胞的大多数细胞参数与正常衰老的成纤维细胞的细胞参数相同(形态学、脂褐素的积累和基因表达的变化)。具有较低抗氧化防护的成纤维细胞缩减其端粒的速率更快，反之亦然。在具有较低抗氧化防护的细胞中端粒缩减速率更快。此外，自由基清除剂会减缓端粒的缩减速率。
这些数据与人成纤维细胞中端粒缩减速率数据一致，所述数据证实了抗氧化酶、谷胱甘肽过氧化物酶和超氧化物歧化酶的重要作用。这些数据证实端粒长度主要由氧化应激和细胞抗氧化防护能力之间的关系决定。因此，与年龄相关的端粒长度是细胞整个生命周期所经历的氧化损伤历史的累积量度。
对于线粒体呼吸链障碍相关的遗传疾病和唐氏综合征，已经证实了氧化应激与端粒缩减速率之间的关系。
因此，DNA中的氧化细胞损伤与端粒缩减之间的现有关系以及其在细胞衰老中的作用使得可以使用二十二碳六烯酸作为在端粒缩短的自然过程中的强保护剂并且使用二十二碳六烯酸作为过早性衰老的抑制剂。
另一方面，与基于化学合成和其后的纯化过程(色谱分离、分子蒸馏等)的其他方法相比，使用酶来生产富含ω-3脂肪酸的油具有多种优势。前者需要极端的pH和高温条件，所述条件可以通过氧化作用、顺反异构化或双键迁移来部分地破坏所有顺式ω-3PUFA的全部双键。酶法合成所用的温和条件(温度低于50℃、pH 6-8且较少的化学试剂)提供了一种合成选择，保留了ω-3PUFA的原始结构同时增加了酰基甘油酯的结构选择性，从营养学的观点来看所述结构是最有利的化学结构。
含有DHA的药物组合物可以以油或乳剂的形式存在，所述组合物可通过口服、舌下、静脉内、肌内、局部、皮下或直肠途径来给药，或者甚至仅通过使本发明的活性成分微乳剂以液体或蒸气形式与位于呼吸道入口的嗅觉器官相接触来给药。因此，可通过微乳剂的喷射、喷雾或雾化或者通过吸入来进行给药。
任选地，所述药物组合物还包括另一种活性成分。
类似地，所述含有DHA的药物组合物可被用在食品工业中以使食品(例如乳制品，如酸乳酪、乳等)中富含天然抗氧化剂例如DHA。
因此，在本发明的另一个实施方案中，将所述药物组合物给予已经接受了对抗与氧化损伤相关疾病疗法的患者。
本发明的另一个目的是使用DHA作为运动绩效增强剂以及在体育运动过程中作为血糖水平调节剂。
通过这种方式，本发明的发明人吃惊地发现在体育锻炼过程中使用所述二十二碳六烯酸会使运动绩效增加，同时在进行这类体育锻炼之后(未给予碳水化合物)维持血糖水平(糖血)。
在本发明的上下文中，术语“业余运动员”或“非竞赛运动员”是指任何以零散方式和非专业方式进行体育锻炼的人。且短语“竞赛运动员”或“受过训练的运动员”是指任何以正规方式和/或专业水平进行体育锻炼的人。类似地，术语“体育锻炼”和“体育运动”可等价的互换使用，术语“运动员”用于指男性和女性。
运动绩效
为了评价运动绩效，存在几种可验证这类运动绩效提高的参数。
在进行有氧运动的运动员体内，当在UV 2(无氧阈)时的最大氧耗百分数％VO2max增加时认为绩效增加，因为在赛季期间受过良好训练的运动员体内的VO2max很难增加。在该阈值时的VO2max百分数的细微变化是直接与绩效增加相关的数据。
发明人已经证实当将基础的三角运动试验(triangular efforttrial)与用DHA处理4个月后进行的试验比较时，通气阈值2时的氧耗量(VO2)的增加的绝对值(p＜0.019)和相对于体重的相对值(p＜0.036)均具有统计学显著性。竞赛自行车运动员(p＜0.047)和非竞赛自行车运动员中均显示出该参数的增加，后者的该参数的差异不具有统计学显著性(图24)。
另一个与运动绩效增加有关的参数是心搏频率的增加，其中设定了运动试验的UV2；因为如果在该无氧阈时心搏频率增加，则认为该运动员能够略增加以较高强度保持有氧代谢的能力。本发明的发明人已经观察到，当将在基础试验中得到的心搏频率与在服用DHA 4个月后的三角试验中得到的心搏频率进行比较时在UV2时的心搏频率有所增加(p＝0.082)。在具有高竞赛水平的自行车运动员小组中显著地证明了这些数据(p＜0.017)(图25)。
在这一点上，达到在统计学上显著的UV2所需的时间增加(图26)。
最终，如果运动员经受过有氧训练则达到相同运动水平时的心搏频率较低。本发明的发明人已经发现当在运动员消耗2000ml O2/分钟时将两个试验在该点的上述数据进行比较时，被给予DHA的自行车运动员的心搏频率以统计学显著性(p＜0.043)方式下降(图27)。
由这些研究可以总结出在持续服用DHA 4个月的运动员体内已经观察到在UV2时绝对和相对氧耗量均增加(分别为p＜0.008和p＜0.015)、对应于UV2的负荷增加(p＜0.063)并且当运动员的氧耗量为2000ml/分钟时心搏频率下降(p＜0.062)。所有这些参数都表明在以2.1g DHA/24小时(6粒药物含量为70重量％的500mg胶囊)的剂量(分为每日3次)服用4个月后，运动绩效增加。示出的所述量为本发明的示例性且非限制性的量。
在运动试验之后，还分析了几项与氧化损伤相关的生物化学变量。
1.血浆总抗氧化能力(PTAC)。当进行矩形运动时，PTAA的增加是全面的且具有统计学显著性(p＜0.05)。当考虑全部自行车运动员或仅考虑竞赛自行车运动员时，在给予DHA 3周后的运动员体内上述增加较高，而对于业余运动员，基础试验与服用DHA 3周后进行的试验之间没有任何差异(图28)。
2.丙二酰二醛(MDA)MDA是将脂质过氧化物与硫代巴比土酸反应后获得的主要产物，所述脂质过氧化物是通过氧化应激产生的。结果表明当进行所有运动试验时对血浆脂质的氧化损伤都有显著增加(p＜0.035)。在摄取DHA 3周后，进行运动试验时对脂质的氧化损伤比开始时低(p＜0.05)。受过训练的运动员体内的这种差异比业余运动员体内的差异大得多(图29)。
3.8-氧-7，8-二氢-2’-脱氧鸟苷(8-oxodG)。8-oxodG是一种氧化应激生物标记。当进行矩形运动试验时对DNA的氧化损伤增加(p＜0.011)。这种氧化损伤在给予DHA 3周后会下降(p＜0.035)。非竞赛自行车运动员内的氧化应激下降比竞赛自行车运动员体内的氧化应激下降更明显，但是这种差异不具有统计学显著性(图30)。
血糖研究
为研究血糖水平，用自行车矩形运动试验，维持最大负荷等于75％VO2max所对应的速率并且维持斜率常数为2％，所述VO2max是按照进行最大矩形运动试验计算的。试验时间为90分钟且试验过程中耗水量无限制。
由于未摄取含糖类饮料，所以预计会出现低血糖。与预期的一样，在第一次运动试验中第二次取样的样品(试验结束20分钟后的样本与试验开始前20分钟的起始样本比较)中出现低血糖。然而，DHA给药4个月后获得的数据表明血糖的维持量具有统计学显著性，这在先前并未被观察到过并且这代表了本研究中一项惊人的发现。
通常，在矩形运动试验过程中可观察到血糖水平呈统计学显著性下降(p＜0.0009)。然而，该行为会随着所要分析的运动员类型不同而不同(p＜0.003)：对于通常的竞赛自行车运动员来说，试验过程中血糖的下降没有显著变化，但是对于业余自行车运动员来说，基础试验过程中血糖的下降比通常的竞赛自行车运动员体内血糖的下降要高；并且服用DHA 3周或4个月后，所述下降基本消失(图31、32和33)。
在以75％VO2max进行90分钟且不饮用含糖类饮料的运动试验中，正常血糖量的存在代表了这样一项发现，所述发现将体育运动过程中的DHA行为与所观察到的和上文提到的涉及增加胰岛素敏感性的行为联系在一起。在这一点上，继1997年的关于AMPK(AMP激活的蛋白激酶)的出版物(Winder和Hardie)之后，Goodyear和Kahn(1998)推断胰岛素或者锻炼所导致的骨骼肌内葡萄糖应答的分子机制是不同的，所述1997年的出版物公开了下述事实：在锻炼过程中IIa型纤维中AMPK含量较高，认为AMPK具有抑制乙酰辅酶A羧化酶和促进葡萄糖转运等功能的多效作用。这可能解释了下述发现，即运动员体内的升糖反应(glycemicresponse)与根据对静态人群进行的研究所预计的升糖反应不同。
根据上述关于DHA对运动绩效和血糖的作用的研究，可以推断出下述结论：
1)已经证明持续摄取DHA超过3周可使竞赛自行车运动员和业余自行车运动员二者体内的血浆总抗氧化能力(PTAC)以全面且具有统计学显著性(p＜0.05)的方式增加。对脂质的氧化损伤也较低(p＜0.05)(受过训练的运动员体内的差异比业余自行车运动员体内的差异要大)。最终，已经证明了在摄取DHA 3周后对DNA的损伤下降(p＜0.035)，所述损伤是利用尿标记物(8-oxodG)测得的。
2)已经证明持续摄取DHA 4个月后，运动绩效更高(在UV2时的负荷、心搏频率以及VO2max的百分数均增加)。在摄取DHA 4个月后以75％VO2max进行90分钟运动试验中还观察到具有统计学显著性的正常血糖量。
这两种效应(运动绩效的增强和长期锻炼期间血糖量正常)之间的关联既非预期的也非本领域中已知的。
此外，应该可以推断出这种效应之间的关联是所需要的并且是目前尚未发现的增进机能的辅助手段。
本发明的另一个目的是使用二十二碳六烯酸制备一种通过任何合适给药方法用于增强运动绩效并且在体育锻炼之后维持正常血糖水平的组合物。
应该考虑欧盟食品科学委员会推荐的下述用于在体育锻炼过程中饮用的饮料组合物的组分(参见http://ec.europa.eu/food/fs/sc/scf/out64_en.pdf)。
在这一点上，含有糖类的目的在于维持血糖量以避免快速消耗肌糖原和肝糖原。应该考虑到是糖类浓度产生的渗透压的增加会导致胃排空减少的缺陷，同时会伴有许多运动员不希望有的胃满的感觉。因此，通过加入DHA来制备具有较低浓度糖类的饮料在增强运动绩效方面具有不容置疑的强大优势。
因此，本发明的另一方面涉及一种含有DHA的药物组合物，所述组合物可被用在食品工业中以使食品(例如乳制品，如酸乳酪、乳等)中富含天然抗氧剂如DHA；或者所述组合物可被制成合适的给药方式，选自用在体育锻炼之前、期间和之后的任何特征的饮料；补充能量的棒；增进机能的棒；用作食物的固体和制品；饮食补充物和多维生素制品(例如，胶囊、片剂、丸剂、冻干形式，或者任何合适的给药形式)；增进机能的辅助手段；带有用于皮肤吸收的纳米微囊剂的纺织品，以及其他任何合适的给药方法。
附图说明
图1.包皮细胞(foreskin cell)培养基中DHA浓度对ROS的胞内产生过程的影响。实验前，在存在甘油三酯(其中DHA占总脂肪酸重量的70％)的条件下将所述细胞培养3天。(A)使用DHR123对细胞进行ROS检测，所述细胞用40或60mM AAPH处理过180分钟。所述数据为三次独立实验的平均值。(B)使用CDCFDA对细胞进行ROS检测，所述细胞用黄嘌呤/黄嘌呤氧化酶体系处理过180分钟。为进行比较，加入用100μM维生素E(对照)获得的数据。所述数据为三次独立实验的平均值。
图2.包皮细胞培养基中DHA占甘油三酯的比例对ROS的胞内产生过程的相应影响。(A)实验前，在存在每种甘油三酯的条件下将所述细胞培养3天。X轴上的浓度为可使用DHA含量为70重量％的甘油三酯获得的浓度的等效值。使用DHR123对细胞进行ROS检测，所述细胞用40mMAAPH处理过180分钟。所述数据为三次独立实验的平均值。(B)油中DHA浓度分别为20％、50％和70％时抗氧化保护作用的图示。
图3.DHA浓度对包皮细胞中TBARS的产生的影响。以所示浓度进行实验前，在存在甘油三酯(其中DHA占总脂肪酸重量的70％)的条件下将所述细胞培养3天。使用40mM AAPH诱导氧化应激6小时并且等待24小时。所述数据为三次独立实验的平均值。
图4.包皮细胞培养基中DHA浓度对超氧阴离子的产生的影响。实验前，在存在甘油三酯(其中DHA占总脂肪酸重量的70％)的条件下将所述细胞培养3天。在用40mM AAPH进行细胞氧化诱导后立即利用化学发光法进行超氧阴离子检测，并且在一些实验中还存在10mM Tyron或0.1875UA/μl的外源SOD。所述数据代表三次独立实验。
图5A.包皮细胞培养基中DHA浓度对SOD活性的影响。以0.5μM(A)、5μM(B)和50μM(C)的DHA浓度进行实验前，在存在甘油三酯(其中DHA占总脂肪酸重量的70％)的条件下将所述细胞培养3天。通过分析鲁米诺所产生的化学发光的降低来间接分析SOD活性，鲁米诺所产生的化学发光的降低是内源SOD活性所导致的。使用可立即生成超氧阴离子的0.1mM黄嘌呤/0.05U/ml黄嘌呤氧化酶体系进行氧化诱导。所述数据代表三次独立实验。
图5B.包皮细胞培养基中DHA浓度对SOD活性的影响。实验前，在存在甘油三酯(其中DHA占总脂肪酸重量的70％)的条件下将所述细胞培养3天。评估未诱导细胞系统或用40mM AAPH诱导的细胞系统内的SOD活性。所述数据代表三次独立实验。
图6.包皮细胞培养基中DHA浓度对GPx活性的影响。实验前，在存在甘油三酯(其中DHA占总脂肪酸重量的70％)的条件下将所述细胞培养3天。评估未诱导细胞系统或用40mM AAPH诱导的细胞系统内的GPx活性。所述数据代表三次独立实验。
图7.ARPE-19细胞培养基中DHA浓度对ROS的胞内产生的影响。实验前，在存在甘油三酯(其中DHA占总脂肪酸重量的70％)的条件下将所述细胞培养3天。使用DHR123(A)或CDCFDA(B)对细胞进行ROS检测，所述细胞用40或60mM AAPH处理过180分钟。所述数据为三次独立实验的平均值。
图8.ARPE-19细胞培养基中甘油三酯中DHA浓度对ROS的胞内产生的相应影响。实验前，在存在每种甘油三酯的条件下将所述细胞培养3天。X轴上的浓度为可使用DHA含量为70重量％的甘油三酯获得的浓度的等效值。使用DHR123对细胞进行ROS检测，所述细胞用40mM AAPH处理过180分钟。所述数据为三次独立实验的平均值。(B)油中DHA浓度分别为20％、50％和70％时抗氧化保护作用的图示。
图9.DHA浓度对ARPE-19细胞中TBARS的产生的影响。以所示浓度进行实验前，在存在甘油三酯(其中DHA占总脂肪酸重量的70％)的条件下将所述细胞培养3天。使用40mM AAPH诱导氧化应激6小时并且等待24小时。所述数据为三次独立实验的平均值。
图10.ARPE-19细胞培养基中DHA浓度对超氧阴离子的产生的影响。实验前，在存在甘油三酯(其中DHA占总脂肪酸重量的70％)的条件下将所述细胞培养3天。在用40mM AAPH进行细胞氧化诱导后立即利用化学发光法进行超氧阴离子检测。所述数据代表三次独立实验。
图11.ARPE-19细胞培养基中DHA浓度对GPx活性的影响。实验前，在存在甘油三酯(其中DHA占总脂肪酸重量的70％)的条件下将所述细胞培养3天。评估未诱导细胞系统或用40mM AAPH诱导的细胞系统内的GPx活性。所述数据代表三次独立实验。
图12.ARPE-19细胞培养基中DHA浓度对SOD活性的影响。实验前，在存在甘油三酯(其中DHA占总脂肪酸重量的70％)的条件下将所述细胞培养3天。评估未诱导细胞系统或用40mM AAPH诱导的细胞系统内的SOD活性。所述数据代表三次独立实验。
图13.通过化学合成(A和C)或酶法合成(B和D)获得的DHA浓度对ARPE-19细胞(A和B)或包皮细胞(C和D)内抗氧化应激的细胞保护作用百分数的影响。
图14.通过化学合成获得的油的纯化程度对ARPE-19细胞内由DHA诱导的抗氧化应激的细胞保护作用百分数的影响。
图15.化学结构对ARPE-19细胞内由DHA诱导的抗氧化应激的细胞保护作用百分数的影响。
图16.DHA浓度对ARPE-19细胞内谷胱甘肽胞内浓度的影响。存在BSO的影响。
图17.重新合成的谷胱甘肽对ARPE-19细胞内由DHA诱导的抗氧化应激的细胞保护作用百分数的影响。
图18.DHA浓度对包皮细胞内谷胱甘肽胞内浓度的影响。存在BSO的影响。
图19.通过化学合成获得的油的纯化程度对ARPE-19细胞内由EPA诱导的抗氧化应激的细胞保护作用百分数的影响。DHA的比较研究。
图20.EPA浓度对包皮细胞内抗氧化应激的细胞保护作用百分数的影响。DHA的比较研究。
图21.EPA浓度对包皮细胞内谷胱甘肽胞内浓度的影响。存在BSO的影响。
图22为比较柱状图，示出了不同剂量的结构化甘油三酯和非结构化甘油三酯中DHA百分比对细胞保护作用百分数的影响。
当将非结构化的甘油三酯的化学结构(甘油三酯)与其中sn-1和sn-3位已经被正辛酸(结构化的)所置换的相同结构进行比较时(二者均通过酶学方法实现且DHA含量的起始水平为20％和70％)，所述图22示出了上述添加物所实现的惊人效果。
从图中可以看出，浓度相同时，结合到甘油酯(结构化的)——特别是甘油三酯——sn-2位上的二十二碳六烯酸的保护作用百分数比含非结构DHA的甘油酯的保护作用百分数高3倍。
在图22中，保护作用百分数说明了对照细胞与相对于对照细胞用DHA处理过的细胞的活性氧簇的胞内浓度差异间的关系，两种细胞均经受了以百分数形式表示的相同的氧化应激。换言之，保护作用百分数的存在说明与对照细胞相比，在处理过的细胞内活性氧簇胞内生成的降低程度具有统计学显著性。
图23为比较图，示出了在加入或未加入DHA的氧化应激条件下培养的人成纤维细胞内的端粒平均长度与细胞群的传代数间的关系。
所述图23示出了在存在DHA的氧化应激条件下进行观察时，上述添加物所实现的惊人效果，与对照或无DHA的情况相比存在DHA时端粒缩短指数较低。
图24为示出了在基础水平和服用DHA 4个月后，竞赛、非竞赛和全体自行车运动员在“通气阈值2”(UV2)时的绝对氧耗量的图。
图25为示出了在基础水平和服用DHA 4个月后，竞赛、非竞赛和全体自行车运动员在UV2时的心搏频率的图。
图26为示出了在基础水平和服用DHA 4个月后，竞赛、非竞赛和全体自行车运动员达到UV2所需时间的图。
图27为示出了在基础水平和服用DHA 4个月后，竞赛、非竞赛和全体自行车运动员的通气阈值时的氧耗量为2000ml/min时心搏频率的图。
图28为示出了在基础水平和服用DHA 3周后，竞赛、非竞赛和全体运动员的血浆总抗氧化能力的图。在每种情况下，均示出了进行运动试验之前的抗氧化能力(左柱)和之后的抗氧化能力(右柱)。
图29为示出了在基础水平和服用DHA 3周后，根据MDA浓度测得的对竞赛、非竞赛和全体运动员血浆脂质的氧化损伤的图。在每种情况下，均示出了进行运动试验之前的氧化损伤(左柱)和之后的氧化损伤(右柱)。
图30为示出了在基础水平和服用DHA 3周后，使用氧化应激标记物8-oxodG测得的对竞赛、非竞赛和全体运动员DNA的氧化损害的图。在每种情况下，均示出了进行运动试验之前的氧化损伤(左柱)和之后的氧化损伤(右柱)。
图31为示出了体育锻炼过程中未服用DHA或者服用了DHA3周或4个月的竞赛运动员体内的血糖的图。
图32为示出了体育锻炼过程中未服用DHA或者服用了DHA3周或4个月的非竞赛运动员体内的血糖的图。
图33为示出了体育锻炼过程中未服用DHA或者服用了DHA3周或4个月的竞赛和非竞赛运动员体内的血糖的图。
具体实施方式
下列实施例为本发明的说明性且非限制性实施例。
实施例
用于评估抗氧化活性的材料和方法
细胞培养物
所用细胞模型为获取自美国典型微生物菌种保藏中心(AmericanType Culture Collection)的包皮细胞(未分化的表皮成纤维细胞，CRL-2076)和ARPE-19细胞(视网膜色素上皮细胞，CRL-2302)。使细胞培养物置于特别设计用于这一目的的具有合适生长条件的培养箱中，所述生长条件为温度37℃、CO2浓度5％和湿度95％。将ARPE-19细胞在装有DMEM-F12培养基(Biological Industries)的培养瓶中生长至0.3×104细胞/cm2的汇合度，所述DMEM-F12培养基补加了10％胎牛血清、青霉素抗生素(100U/mL)、链霉素(100μg/mL)和谷氨酰胺(BiologicalIndustries)。使CRL-2076成纤维细胞在装有伊思考夫改良杜尔贝可培养基(Iscove’s Modified Dulbecco’s Medium，IMDM)(BiologicalIndustrie)的培养瓶中维持生长，所述培养基中补加了10％胎牛血清、青霉素抗生素(100U/mL)、链霉素(100μg/mL)和谷氨酰胺(BiologicalIndustries)。将所述细胞由75ml培养瓶转移至6、12或96孔板中，使其在37℃下贴附于底物24小时以便进行实验(106个细胞/mL)。
将DHA整合到所述细胞中
加入不同浓度的DHA-TG(0.5-50μM)，以含20、50和70％DHA的DHA-TG(油密度0.92g/mL)为原料，通过将油溶于乙醇中制备储液(1∶100)并且使用用血清制备的培养基制备工作溶液。在37℃下，将细胞用补加了DHA-TG的培养基培养3天。
诱导氧化应激
使用不同的诱导剂氧化性地刺激细胞：
a)黄嘌呤/黄嘌呤氧化酶体系(0.8mM/10-2U/mL)，催化将次黄嘌呤和黄嘌呤氧化为尿酸的氧化反应，同时将O2还原为O·-2和H2O2。
b)2，2’-偶氮二-(2-脒基丙烷)二盐酸盐(AAPH)(1-100mM)被广泛用作自由基的亲水引发剂，诱导脂质和蛋白质的过氧化反应。AAPH会通过已形成的过氧自由基的作用来氧化DNA、蛋白质和脂质。AAPH还会作用于内源防护系统，因为它会使关键性的酶SOD失活，从而失去CAT和GPx的保护能力。
产生活性氧簇(ROS)
使用二氢罗丹明123(DHR123，Molecular Probes)和2，7-二氯荧光素二乙酸盐(H2DCFDA，Molecular Probes)作为荧光探针通过荧光技术通过一个连续系统中测量人皮肤CRL-2076成纤维细胞和ARPE-19视网膜上皮细胞的原代培养物中的ROS水平，每30分钟测量一次直至180分钟。对于这两种情况，这是一种非特异性测量ROS产生的方法。将荧光探针加入到细胞(1×106个细胞/mL)中至终浓度为10μM。使用激发波长为488nm且发射波长为525nm的Mithras荧光读数器测量氧化探针(2，7-二氯荧光素和罗丹明123)的荧光，记录为时间的函数。使用通过下文概述的MTT分光光度技术确定的细胞存活率来调制所获得的荧光。
细胞存活率
进行细胞存活率研究以评估各种样本的细胞毒性作用。该方法包括将可溶于水性介质的MTT试剂(3-(4，5-二甲基噻唑-2-基)-2，5-二苯基四唑溴，Sigma)加入孵育培养基中。成活的细胞可代谢这种化合物并将其转化为甲臜盐。该盐为一种不溶于水性介质、可溶于DMSO并且可用于测量细胞存活率的显色化合物。所述方法包括每孔加入20μl 7.5mg/ml(过量)的MTT溶液。使其在37℃下孵育1小时以使得所述成活细胞可代谢该化合物并产生甲臜盐，而非成活细胞则不能。在孵育1小时后，沉淀细胞，并加入100μl DMSO，使甲臜盐溶解。最后用酶标仪读取550nm处的吸光度。将存活率结果表示为相对于对照的光密度百分数，将对照记为具有100％的存活率。利用96孔板绘制细胞存活率曲线，其中每孔接种约20,000个细胞(在根据细胞生长率函数分析适合的细胞数目后接种)且每孔的培养基体积约为200μl。在使细胞与浓度范围足够宽的各种浓度产物接触72小时后，研究所述产物的效率以找出IC50值。利用Sigma Plot 8.0修正实验结果使其适用于Hill方程以确定IC50，IC50定义为将培养物存活率降为对照的50％时所需的DHA浓度。
测定蛋白质
所述测定基于比色检测和利用了优化的2，2’-联喹啉-4，4’-二甲酸(dizinconinic acid)制剂的总蛋白质定量，所述二喹啉甲酸组分使得可以测量稀释样本中浓度范围为0.5-20μg/ml的蛋白。该方法使用Cu+1检测剂，所述检测剂在碱性介质中可被蛋白质还原为Cu+2。两个BCA分子与所述亚铜离子螯合可形成紫色反应产物。所述水溶性复合物在562nm处有吸收。利用校准曲线可获得一个方程，结果以μg/mL的蛋白表示。所用的商业化试剂盒为Pierce的MicroBCA(No.23235)。
直接分析产生的ROS
测量产生的脂质氢过氧化物
利用紫外可见分光光度法测得的细胞裂解产物中的丙二酰二醛(MDA)可用作脂质过氧化反应的标记物。MDA和4-羟基烯烃(hydroxyalkenal，HAE)是多不饱和脂肪酸及相关酯的过氧化反应产物。对这些醛的直接测量给出了一种简便的脂质过氧化反应指数。通过Calbiochem的商业化脂质过氧化反应试剂盒(No.437634)，使用了在45℃下可与MDA反应的显色剂(溶于乙腈的N-甲基-2-苯基-吲哚)。一个MDA分子与两个发色剂分子缩合可产生一个在586nm处有最大吸收的稳定发色团，检测极限为0.1μM。使用40mM AAPH诱导6小时并且等待24小时。通过在液氮中循环冻融来裂解细胞(107细胞/mL)。对样本分级分离以测量MDA和蛋白质。结果表示为μM MDA/mg蛋白。
测量产生的超氧阴离子
使用鲁米诺(Calbiochem，No.574590)利用化学发光技术在微量板上直接测量超氧阴离子。使用化学发光法检测超氧阴离子的原因在于鲁米诺可能接近所有产生超氧化物的胞内位点、在于鲁米诺反应的高特异性、极小的胞内毒性以及与其他化学技术有较高的灵敏性。化学发光法是根据超氧阴离子氧化鲁米诺的反应可产生光子，所述光子可使用标准照度计来迅速地测量。在我们的测试中，我们对ELISA的微量板使用MITHRAS化学发光读数器并且给出了自由基的短半衰期，使用增强剂来增加测试的灵敏度并且放大应答。该试剂可被用于活细胞，因为所述试剂无毒且不会使亚细胞系统组分变性。还可使用特异性超氧阴离子螯合剂——Tyron(4，5-二羟基-1，3-苯二磺酸，Sigma)来研究抑制超氧阴离子生成的能力，所述Tyron常常被用于在体外对ROS的生成进行阻断测试，它可透过细胞膜；且超氧化物歧化酶(SOD，Sigma)可用作酶阻断剂，成为内源抗氧化防护体系中首要的酶。每60秒分析一次细胞的化学发光测量值，持续分析4100秒，频率为120秒/循环，所述细胞经过了AAPH氧化应激诱导处理。结果表示为UA化学发光/mg蛋白。
测定抗氧化酶活性
测量谷胱甘肽过氧化物酶(GPx)活性
GPx催化氢过氧化物的还原反应成为还原态谷胱甘肽，该过程具有保护细胞免遭氧化损伤的功能。GPx使用谷胱甘肽作为最终的电子供体以再生还原态的硒代半胱氨酸。通过与谷胱甘肽还原酶相偶联的反应来间接测量GPx。利用谷胱甘肽还原酶并使用NADPH作为辅酶将由反应产生的氧化态谷胱甘肽(GSSG)回收再循环为还原态谷胱甘肽，所述反应通过使GPx作用于氢过氧化物来实现。随着NADPH被氧化为NADP+，其在340nm处的吸光度会降低。340nm处吸光度的降低速度与样本的GPx活性成正比。使用Cayman的ELISA微量板分光光度试剂盒(No.703102)来检测原代培养物的细胞裂解物中的GPx。在37℃下使细胞贴附于底物上培养24小时。通过在50mM Tris(pH 7.5)、5mM EDTA和1mM DTT中超声来获得细胞裂解物。通过测定A340nm/min(ΔA340)的变化来获得GPx的活性，表示为纳摩尔NADPH/min/mg样本蛋白。
测量超氧化物歧化酶活性(SOD)
该化学发光法基于与SOD(Calbiochem No.574590)阳性对照相比的细胞上清液中的SOD活性分析。黄嘌呤氧化酶-黄嘌呤-鲁米诺系统中存在SOD会导致所产生的化学发光降低，对超氧阴离子歧化作用的下降与SOD活性成比例。用MITHRAS照度计进行分析，时间间隔为50ms直至终反应时间为520s。
还通过使用四唑盐检测超氧化物自由基的反应测定细胞裂解物中超氧化物歧化酶活性(SOD)，所述自由基由黄嘌呤氧化酶/次黄嘌呤体系生成。在微量板上使用分光光度法测量3种类型的SOD(Cu-Zn-SOD、Mn-SOD和Fe-SOD)，所述SOD为胞质和线粒体内的SOD。定义1单位SOD为歧化50％的生成的超氧阴离子时所需的酶量。按照生产商所优化的方案使用Cayman试剂盒(N.706002)检测原代培养物的细胞裂解物内的SOD。该测定法的动力学范围为0.025-0.25SOD单位/ml。
测定胞内内源抗氧化剂浓度
测量还原态谷胱甘肽的胞内浓度(GSH)
使用直接的动力学测定法测量细胞裂解物内的还原态谷胱甘肽(GSH)。细胞内的谷胱甘肽可主要以还原态形式(总谷胱甘肽的90-95％)存在，成为组织内的主要抗氧化剂。其作用是去除外源物的毒性并移除氢过氧化物以保持细胞的氧化还原态。利用所述技术测量生物样本(细胞裂解物)中的总谷胱甘肽(GSSG+GSH)，所述生物样本已经用磺基水杨酸进行过去蛋白处理(Sigma-Aldrich CS0260试剂盒)。GSH导致5，5’-二硫代双(2-硝基苯甲酸)(DTNB)被连续地还原为5-硫代(2-硝基苯甲酸)(TNB)，并且利用谷胱甘肽还原酶和NADPH回收再利用所形成的GSSG。利用分光光度法在412nm处测量TNB。特异性抑制γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶的丁硫氨酸亚砜胺(BSO)可用作合成抑制剂。
评估人皮肤模型中DHA的抗氧化活性
在此体外测定中，使用包皮细胞(未分化的表皮成纤维细胞，ATCCCRL-2076)作为细胞模型用于测定DHA的潜在美容用途，由于包皮细胞在体外可对各种氧化诱导剂可作出很好的应答所以它们是一种合适的细胞类型，此外包皮细胞还是一种仅需要常规营养和培养条件的原代培养物，因此成为一种可外推至体内应答的良好体外模型。
结果
设定起始条件以在所有研究条件下获得活性细胞模型。这是指结果是利用代谢活性细胞获得的。在先的研究已经证实在包皮细胞中浓度低于1000μM的DHA不会影响研究(为期3天)中的细胞存活率。也不会影响使用黄嘌呤/黄嘌呤氧化酶体系或AAPH的氧化应激研究中的细胞存活率。还已经证实连续3天向包皮细胞培养物加入浓度最高达50μM的DHA不会明显增加细胞氧化水平，所述氧化水平是使用两种探针即二氢罗丹明(DHR123)和2，7-二氯荧光素(H2DCFDA)并根据细胞荧光测得的，所述探针分别对超氧阴离子和氢过氧化物检测具有较高特异性。一旦确立了这些条件，即可评估掺入到包皮细胞膜中的DHA抗氧化应激的总抗氧化能力，所述氧化应激是由黄嘌呤/黄嘌呤氧化酶体系或AAPH诱导产生的。
当使用40mM AAPH诱导适度的氧化应激并且使用DHR123作为ROS检测剂时，浓度为0.5μM(59％的保护作用)和5μM(33％的保护作用)的DHA均对活性氧簇生成显示出抑制作用，浓度为10μM(26％的保护作用)的DHA作用较弱而浓度为50μM的DHA没有作用(图1A)。当使用60mM AAPH对细胞进行剧烈诱导时，浓度为0.5μM(40％的保护作用)和5μM(29％的保护作用)的DHA均显示出抗ROS生成的保护作用，而较高浓度的DHA则失去这种保护作用(图1A)。
我们还注意到0.5μM的DHA可抵御黄嘌呤/黄嘌呤氧化酶体系诱导的氧化应激(图1B)，这表明DHA对活性氧簇——氧化过程中产生的超氧阴离子和氢过氧化物——具有螯合作用。比较DHA与亲脂抗氧化剂如维生素E的抗氧化能力(图1B)，我们发现它们具有类似的保护作用动力学(DHA将细胞氧化抑制了33.46％而维生素E抑制了30％)。
DHA保护作用动力学应答表明DHA总是在诱导后的60-120分钟期间产生最大的抗氧化作用，因此说明DHA的氢过氧化物和超氧阴离子螯合能力达到饱和。抗氧化作用基本上是剂量依赖性的，因为增加DHA浓度会导致ROS螯合能力下降，浓度为0.5μM时具有最有效的抗氧化能力。在这一点上，另一个用于使系统效率最优化的重要参数是DHA占总脂肪酸的比例。如图2所示，在甘油三酯浓度相同时，DHA比例下降至50％或20％会明显降低细胞的抗氧化能力，并且在低浓度或中浓度时DHA会恢复为促氧化剂。这些结果似乎说明DHA的细胞抗氧化作用并不仅取决于其浓度，其分子定位(即DHA在甘油三酯结构中的分布)也是决定性因素。
在特异性抑制ROS生成方面，我们分析了脂质过氧化物(TBARS)和超氧阴离子的生成。所获得结果表明与未诱导的细胞相比，用AAPH处理过的细胞会产生较高浓度的可与硫代巴比土酸反应的物质(TBARS)，表示为μM MDA/mg蛋白(图3)。与预计的一样，将DHA掺入到包皮细胞的膜中会以剂量依赖性方式(0.5、5和50μM)使基础的细胞脂质过氧化反应略有增加(图3)。在用40mM AAPH进行了氧化诱导的细胞内，DHA具有保护所述成纤维细胞避免产生膜脂质氢过氧化物的抗氧化能力，其作用是反浓度依赖性的。0.5μM DHA的保护作用为87％、5μM DHA的保护作用为85％且50μM DHA-TG的保护作用为48％(图3)。
然后分析了超氧阴离子的生成。用40mM AAPH进行氧化应激处理过的包皮细胞会产生超氧阴离子，其生成量是未诱导细胞的2.5倍，生成的超氧阴离子维持在恒定水平(图4)。与对照相比，含有DHA且未经氧化诱导的细胞内不具有更高水平的胞内超氧阴离子(图4)。在氧化应激条件下(图4)，浓度为0.5μM的DHA会抑制超氧阴离子的生成达16.5％、浓度为5μM的DHA会抑制超氧阴离子的生成达10％且浓度为50μM的DHA会抑制超氧阴离子的生成达9％。通过加入Tyron(4，5-二羟基-1，3-苯二磺酸，一种可透过细胞膜并可作为胞内超氧阴离子的高度特异性螯合剂的化合物)和胞外SOD(内源抗氧化防护系统中歧化胞内超氧阴离子的首要酶阻断剂)证实了所述方法的特异性。在存在外源SOD或Tyron的情况下，用AAPH刺激的细胞内(先前已经掺入或未掺入DHA)超氧阴离子的产生会被完全抑制并且达到基础值(图4)。
最后，我们分析了DHA是否会通过改变首要的细胞抗氧化酶活性来行使其抗氧化活性。分析了包皮细胞(含有或不含有DHA)中SOD和GPx的活性。在含有DHA的情况下，黄嘌呤/黄嘌呤氧化酶体系可用作超氧阴离子的瞬时产生器(总测量时间为520秒，每50秒测量一次)。所得结果表明这是具有快速动力学的良好氧化诱导，同时可直接观察到歧化反应并且未产生超氧阴离子。氧化诱导后15秒所达到的最大化学发光可作为SOD活性的间接和定性的量度(图5A)。在不含DHA的情况下，数值达到了310U.A.化学发光/106细胞，而在与0.5μM DHA预孵育的系统中该值下降至150U.A.化学发光/106细胞(52％的抗氧化保护作用)(图5A)。在用5μM和50μM DHA处理过的细胞内，抗氧化效率分别维持在52％和42％的保护作用(图5A)。此外，已知AAPH会通过扩散所产生的过氧自由基来氧化DNA、蛋白质和脂质，作为抗氧化剂的DHA可防止能歧化超氧阴离子的SOD的失活，维持胞内的过氧化氢酶和谷胱甘肽过氧化物酶的内源抗氧化防护系统。图5B证实了这一方面，其中已证实处于基态时DHA的存在不会使SOD活性增加(-10/-15％)，但是存在DHA时会抑制由于氧化应激过程导致的SOD活性丧失，保持甚至增加SOD活性(10/20％)。至于GPx活性(图6)，发现处于细胞基态时适当浓度的DHA会使GPx活性增加(5μM时高达17％)，但是高浓度的DHA会使GPx活性下降(50μM时下降20％)。处于氧化应激状态时可完全维持这种效应(图6)。这些结果表明在所有测试浓度下DHA均可与内源抗氧化防护系统协作，所述防护系统涉及通过产生的SOD来歧化超氧阴离子，并且适当浓度的DHA还能够控制氢过氧化物的生成，因为它会增加GPx活性。
评估视网膜细胞模型中DHA的抗氧化活性
在此体外研究中，所述细胞模型基于ARPE-19细胞(视网膜色素上皮细胞，ATCC CRL-2302)，由于ARPE-19细胞在体外可对各种氧化诱导剂作出很好的应答所以它们是一种合适的细胞类型，此外ARPE-19细胞还是一种仅需要常规的营养和培养条件的原代培养物。ARPE-19细胞还可构成一种良好的眼科模型，因为它具有所述视网膜色素上皮细胞的生物特性和功能特性。
结果
使用该细胞系进行的测定类似于前述部分中所述的对包皮细胞进行的测定。在所有工作条件下(DHA的作用，氧化应激的作用)，保持细胞存活所需的基本需求是相同的。在基础细胞氧化态下，以所要分析剂量掺入的DHA也不会导致任何显著变化。
当使用40mM AAPH诱导适度的氧化应激并且使用DHR123作为ROS检测剂时，浓度为0.5μM(43％的保护作用)和5μM(32％的保护作用)的DHA均对活性氧簇生成表现出抑制作用，但浓度为50μM(4％的保护作用)的DHA的作用较弱(图7A)。当使用60mM AAPH对细胞进行剧烈诱导时，浓度为0.5μM(13％的保护作用)的DHA具有抗ROS生成的保护作用，而较高浓度的DHA的作用较弱(图7A)。上述结果类似于使用包皮细胞获得的结果，但是一个明显不同的作用是观察到的抗剧烈氧化诱导的保护作用较弱。通过，用对过氧化物更加特异的CDCFDA进行ROS检测，也证明DHA可产生抗氧化应激的保护作用，所述氧化应激是由AAPH诱导的(图7B)。
DHA保护作用动力学也总是在诱导后的60-120分钟期间显示出最大的抗氧化作用，因此说明DHA的氢过氧化物和超氧阴离子螯合能力达到饱和。在量上，抗氧化能力基本上是剂量依赖性的，因为增加DHA浓度会导致ROS螯合能力下降，浓度为0.5μM时具有最有效的抗氧化能力(图7A和7B)。在这一点上，另一个用于使系统效率最优化的重要参数是DHA占总脂肪酸的比例。将DHA占脂肪酸的比例从70％降低至50-20％可显著地且不成比例地降低最佳浓度(0.5-5μM)的DHA的细胞抗氧化能力，当DHA为高浓度时(图8A和8B)，与包皮细胞不同的是DHA以不成比例的方式变为促氧化剂。这些结果证实了DHA的细胞抗氧化作用并不仅取决于其浓度，其分子定位(即DHA在甘油三酯结构中的分布)也是决定性因素。
在特异性抑制ROS生成方面，分析了脂质过氧化物(TBARS)(图9)和超氧阴离子(图10)的生成。所获得结果非常类似于用包皮细胞获得的结果。与未诱导的细胞相比，用AAPH处理过的细胞会产生较高浓度的可与硫代巴比土酸反应的物质(TBARS)以及较高浓度的超氧阴离子。将DHA掺入到ARPE-19细胞的膜中会以剂量依赖性方式(0.5、5和50μM)使细胞的基础脂质过氧化反应略有增加，但是在氧化诱导处理过的细胞内，DHA具有抑制所述细胞产生膜脂质氢过氧化物的细胞抗氧化活性，所述活性与其浓度成反比。0.5μM DHA的保护作用为64％、5μM DHA的保护作用为58％且50μM DHA的保护作用为42％(图9)。然后分析超氧阴离子的生成。与对照相比，含有DHA且未进行氧化诱导过的细胞内不具有较高水平的胞内超氧阴离子(图10A)。使用40mM AAPH诱导的氧化应激可生成超氧阴离子，超氧阴离子产量可被DHA部分抑制(浓度为0.5-50μM时抑制20-16％)。存在DHA时，该抑制作用与SOD活性一致(图10B)。未发现处于基态时DHA的存在会使SOD活性增加(-10/15％)，但是如在包皮细胞中的情况一致，存在DHA时会抑制由于氧化应激过程导致的SOD活性丧失，保持基础SOD活性。
最后，进行了一项分析以研究DHA是否会改变作为首要细胞抗氧化剂的GPx酶的活性(图11)。处于细胞基态时所测试的所有浓度的DHA均会增加GPx活性(12-40％)，且处于氧化诱导状态时可完全地维持这种效应，同样表现出使GPx活性升高2.5倍(图11)。与包皮细胞的情况一样，这些结果表明通过调节内源细胞酶系统抗氧化防护系统，DHA可实现其抗氧化作用的一部分。
合成方法对掺入甘油三酯中的DHA抗氧化活性的影响
在此体外测量中，ARPE-19细胞(视网膜色素上皮细胞，ATCCCRL-2302)和包皮细胞(未分化的表皮成纤维细胞，CRL-2076)可用作细胞模型，由于这两种细胞在体外可对各种氧化诱导剂作出很好的应答所以它们是合适的细胞系。通过化学方法(CHEM)或酶学方法(ENZ)获得的金枪鱼油甘油三酯(DHA20％-TG，DHA占20％(摩尔百分数))或含有50％或70％(摩尔百分数)DHA的油衍生物(DHA50％-TG和DHA70％-TG)可用作活性成分。
结果
当使用40mM AAPH在ARPE-19细胞中诱导适度的氧化应激并且使用DHR123或H2DCFDA作为ROS胞内检测剂时，浓度为0.5μM和5μM的天然DHA(DHA20％-TG)和掺入通过化学方法获得的甘油三酯中的DHA(DHA50％-TG-CHEM和DHA70％-TG-CHEM)均对活性氧簇的生成具有抑制作用，浓度为50μM时具有较弱的作用(图13A)。该作用取决于DHA的含量，依次为DHA70％-TG-CHEM＞DHA50％-TG-CHEM＞DHA20％-TG。浓度相同时(0.5、5和50μM)，通过酶学方法获得的油在所有DHA含量时(DHA70％-TG-ENZ和DHA50％-TG-ENZ)均显示出较高的活性(图13B)。在与包皮细胞类似的研究中，结果甚至更加令人吃惊。与高剂量DHA70％-TG-CHEM和DHA50％-TG-CHEM所显示出的促氧化活性(图13C)不同，所有浓度的酶来源的油(DHA70％-TG-ENZ和DHA50％-TG-ENZ)均具有抗氧化性(图13D)。利用色谱法移除化学方法获得的油中的本征聚合物(DHA70％-Tg-BPM)会使得ARPE-19细胞中的抗氧化活性下降得更多，在高浓度时变为促氧化性(5和50μM)(图14)。掺入甘油三酯中的DHA的抗氧化活性也高于(至少两倍)掺入其他化学结构(例如乙酯、游离脂肪酸或与血清白蛋白连接的脂肪酸)中的DHA的抗氧化活性，所述甘油三酯是通过酶法合成获得的(图15)。
通过掺入DHA所显示出的细胞抗氧化活性涉及先前考虑的所有方面例如维持SOD和GPx酶活性，而且还涉及谷胱甘肽(GSH)胞内浓度的增加。在ARPE-19细胞中(图16)，DHA诱导GSH胞内浓度增加，所述浓度增加与GSH的重新合成直接相关，因为加入BSO(GSH合成的特异性抑制剂)会消除DHA的保护作用(图17)，直接导致GSH胞内浓度的降低(图15)。包皮细胞表现出了类似的情况(图18)。
通过酶法合成获得的DHA的抗氧化活性的改善也适用于另一种ω-3脂肪酸例如二十碳五烯酸(EPA)。在使用ARPE-19细胞进行的研究中，证实通过酶学方法获得的EPA(EPA70％-TG-ENZ)具有抗氧化活性，但是与使用DHA(DHA70％-TG-ENZ)时观察到的抗氧化活性相比非常低，同时也证实了通过化学方法获得的EPA(不含聚合物(EPA-70％-TG-BPM))则具有很高的促氧化性(图19)。此外，在包皮细胞中通过酶学方法获得的EPA(EPA70％-Tg-ENZ)显示出显著的抗氧化活性，甚至高于DHA(DHA70％-TG-ENZ)的抗氧化活性(图20)，同DHA一样EPA的抗氧化活性与GSH胞内浓度的增加有关(图21)。
评估掺入结构化甘油三酯中的DHA在视网膜细胞模型中的抗氧化活
性
在此体外研究中，将ARPE-19细胞(视网膜色素上皮细胞，ATCCCRL-2302)用作细胞模型，由于ARPE-19细胞在体外可对各种氧化诱导剂作出很好的应答所以它们是一种合适的细胞类型，此外ARPE-19细胞还是一种仅需要常规的营养和培养条件的原代培养物。此外，ARPE-19细胞是一种良好的眼科模型，因为它具有所述视网膜色素上皮细胞的生物特性和功能特性。已经使用衍生自金枪鱼油的结构化甘油三酯(DHA20％-TG，DHA占20％(摩尔百分数))或含有70％DHA的油(DHA70％-TG，DHA占70％(摩尔百分数))用作活性成分，其中通过酶学方法用辛酸置换sn-1和sn-3位的脂肪酸。在这些新化合物中，DHA20％-TG中DHA的摩尔含量为7％且DHA70％-TG中DHA的摩尔含量为22％。
结果(参见图22)
当使用40mM AAPH诱导适度的氧化应激并且使用DHR123作为ROS检测剂时，浓度为0.5μM和5μM的掺入常规甘油三酯中的DHA(DHA20％-TG和DHA70％-TG)均对活性氧簇的生成表现出抑制作用，浓度为50μM的DHA的作用较弱(图22)。该作用取决于DHA的含量，即为DHA70％-TG＞DHA20％-TG。浓度相同时，实际DHA浓度低2-3倍的结构化油显示出与DHA20％-TG相同(浓度为0.5μM)或更高(浓度为5μM和50μM)的活性。对于DHA70％-TG，结构化甘油三酯的效力稍微低于最佳浓度(0.5μM和5μM)，但是高浓度(50μM)时的情况相反，通常显示出更稳定且剂量依赖性更弱的作用。
评估人皮肤模型中DHA作为一种与年龄相关的端粒长度保护剂的活性
在此体外测定法中，可使用包皮细胞(未分化的表皮成纤维细胞，ATCC CRL-2076)作为细胞模型用于测定DHA的潜在美容用途，由于包皮细胞在体外可对各种氧化诱导剂作出很好的应答所以它们是一种合适的细胞类型，此外包皮细胞还是一种仅需要常规的营养和培养条件的原代培养物，因此成为一种可外推至体内应答的良好体外模型。
方法学
细胞培养物
所用的细胞模型为获取自美国典型微生物菌种保藏中心的包皮细胞(未分化的表皮成纤维细胞，CRL-2076)。将细胞培养物置于特别设计用于这一目的的具有合适生长条件的培养箱中，所述生长条件为温度37℃、CO2浓度5％和湿度95％。使CRL-2076成纤维细胞在装有伊思考夫改良杜尔贝可培养基(Biological Industrie)的培养瓶中维持生长，所述培养基中补加了10％胎牛血清、青霉素抗生素(100U/mL)、链霉素(100μg/mL)和谷氨酰胺(Biological Industries)。
将DHA整合到所述细胞中
加入浓度为0.5μM的通过酶法合成的DHA-TG 70％，通过将油溶于乙醇中制备储液(1∶100)并且使用用血清制备的培养基制备工作溶液。在37℃下，将细胞用补加了DHA-TG的培养基培养3天。
诱导氧化应激
使用浓度为40mM的2，2’-偶氮二-(2-脒基丙烷)二盐酸盐(AAPH)氧化性地刺激细胞，AAPH被广泛用作自由基的亲水引发剂，诱导脂质和蛋白质的过氧化反应。AAPH会通过已形成的过氧自由基的作用来氧化DNA、蛋白质和脂质。AAPH还会作用于内源防护系统，因为它会使关键性的酶SOD失活，从而失去CAT和GPx的保护能力。
测量端粒长度
可利用原位杂交技术来评估由高度重复的DNA构成的端粒区域。所述荧光原位杂交方法(FISH)可检测是否存在端粒并且将每个细胞或每个染色体组的端粒定量，所述杂交方法使用与所述端粒序列互补的探针。被称为flow FISH的方法联合使用流式细胞术和FISH技术(使用pan-端粒PNA(肽核酸)作为探针)，并且可以利用荧光强度来测量位于各个细胞染色体末端的平均端粒长度。我们的目的在于测量PAN标记的分裂中期染色体的荧光强度。将结果表式为端粒荧光单位(TFU)，每1TFU对应1kb的重复端粒。
结果
利用flow-FISH分析人成纤维细胞内的端粒平均长度的变化，所述人成纤维细胞是在加入或未加入DHA的氧化应激条件下培养的(图23)。使用线性回归分析端粒长度与细胞群传代数之间的关系。对于所有分析的培养物来说，可以直接将回归的斜率理解为端粒缩短指数。在人成纤维细胞中，AAPH的处理会显著加快端粒缩减指数，所述AAPH会诱导产生过量的胞内自由基。另一方面，与未加入DHA的情况相比，加入浓度为0.5μM的DHA可将所述指数降低50％，已经证明加入0.5μM DHA可增加细胞抗氧化防护。此外，与正常的成纤维细胞对照相比，加入DHA能够降低端粒缩减指数。
Claims (14)
1.二十二碳六烯酸(DHA)或二十碳五烯酸(EPA)用于制备治疗细胞氧化损伤的药物组合物的用途，其特征在于
所述二十二碳六烯酸或二十碳五烯酸被掺入到甘油酯中；
其中所述掺入到甘油酯中的DHA或EPA是通过酶学方法获得的，并且所述DHA或EPA分子保留有双键；
并且其中所述DHA或EPA占总脂肪酸的重量百分数为40%-100%，或者所述DHA或EPA结合到甘油酯的sn-2位上。
2.权利要求1的用途，其中所述细胞氧化损伤与下列病症或状况相关：
a)一种选自衰老、体育锻炼、体育锻炼期间或之后的低血糖的生理状况；或
b)一种选自神经变性疾病、眼部疾病、缺血性疾病、炎性病变、动脉粥样硬化的疾病；其中所述神经变性疾病可选自多发性硬化、阿耳茨海默氏病、帕金森病、肌萎缩侧索硬化和肌肉萎缩症；其中所述眼部疾病可选自色素性视网膜变性、黄斑变性和白内障；其中所述缺血性疾病可选自心肌梗塞和脑梗塞；并且其中所述炎性病变可选自关节炎、血管炎、肾小球肾炎和红斑狼疮。
3.掺入到甘油酯中的二十二碳六烯酸(DHA)或二十碳五烯酸(EPA)用于制备作为细胞抗氧化剂的治疗或非治疗性组合物或食品的用途，
其中所述掺入到甘油酯中的DHA或EPA是通过酶学方法获得的，并且所述DHA或EPA分子具有双键；
并且其中所述DHA或EPA占总脂肪酸的重量百分数为40%-100%。
4.掺入到甘油酯中的DHA或EPA用于制备作为抗衰老剂的治疗或非治疗性组合物或食品的用途，
其中所述掺入到甘油酯中的DHA或EPA是通过酶学方法获得的，并且所述DHA或EPA分子具有双键；
并且其中所述DHA或EPA占总脂肪酸的重量百分数为40%-100%。
5.掺入到甘油酯中的DHA或EPA用于制备作为体育锻炼的个体的运动绩效增强剂的治疗或非治疗性组合物或食品的用途，
其中所述掺入到甘油酯中的DHA或EPA是通过酶学方法获得的，并且所述DHA或EPA分子具有双键；
并且其中所述DHA或EPA占总脂肪酸的重量百分数为40%-100%。
6.掺入到甘油酯中的DHA或EPA用于制备在体育锻炼过程中维持个体体内的血糖水平的治疗或非治疗性组合物或食品的用途，
其中所述掺入到甘油酯中的DHA或EPA是通过酶学方法获得的，并且所述DHA或EPA分子具有双键；
并且其中所述DHA或EPA占总脂肪酸的重量百分数为40%-100%。
7.权利要求3-6任一项的用途，其中所述用途被用在食品工业中。
8.权利要求3-7任一项的用途，其中所述用途被用在乳制品中。
9.权利要求5-6任一项的用途，其中将所述DHA或EPA通过一种合适的方法给予，所述方法选自用在体育锻炼之前、期间和之后的任何特征的饮料；补充能量的棒；增进机能的棒；用作食物的固体和制品；饮食补充物和多维生素制品；增进机能的辅助手段；带有用于皮肤吸收的纳米微囊剂的纺织品，以及其他任何合适的给予方法。
10.权利要求9的用途，其中所述饮食补充物和多维生素制品的形式为胶囊、片剂、丸剂、冻干形式，或者任何合适的给予形式。
11.权利要求1-2任一项的用途，其中所述细胞氧化损伤包括活性氧簇(ROS)的产生。
12.权利要求11的用途，其中所述ROS为超氧阴离子。
13.权利要求1-2任一项的用途，其中所述细胞氧化损伤包括DNA端粒的缩短。
14.权利要求1-2任一项的用途，其中所述细胞氧化损伤包括过早性细胞衰老。
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