ES2384701T3

ES2384701T3 - Utilización del DHA para el tratamiento de una patología asociada con el daño celular oxidativo

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Publication number: ES2384701T3
Application number: ES06841516.5T
Authority: ES
Inventors: Joan Carles Domingo Pedrol; Jose Antonio Villegas Garcia
Original assignee: Brudy Technology SL
Current assignee: Brudy Technology SL
Priority date: 2005-12-21
Filing date: 2006-12-20
Publication date: 2014-07-02
Anticipated expiration: 2026-12-20
Also published as: KR20080081334A; CA2632949C; KR101256448B1; WO2007071733A3; NO20083187L; RU2008126805A; CN101346138B; US20130274337A1; US9265745B2; EP1962825A2; NO341240B1; US9259408B2; JP2009523414A; EP3263101A1; WO2007071733A2; RU2437583C2; AU2006327064A1; CA2632949A1; BRPI0621131A2; IL192154A0

Abstract

Utilización del ácido docosahexaenoico o ácido eicosapentaenoico o EPA derivado de DHA para la fabricación de una composición farmacéutica caracterizada por el hecho de que - dicho ácido docosahexaenoico o ácido eicosapentaenoico o EPA derivado de DHA está incorporado en un monoglicérido, diglicérido, triglicérido, fosfolípido o éster etílico, -se encuentra en un porcentaje en peso de entre el 20 y el 100% respecto al total de ácidos grasos, destinada al tratamiento de una patología asociada al daño celular oxidativo.

Description

Utilización del DHA para el tratamiento de una patología asociada con el daño celular oxidativo

5 Campo de la Invención

[0001] La presente invención se refiere a la utilización de ácido docosahexaenoico (DHA) para la fabricación de un medicamento o nutracéutico para el tratamiento de procesos que implican un daño oxidativo asociado.

Antecedentes de la Invención

[0002] Los ácidos grasos omega-3 son necesarios para mantener la integridad funcional celular, y en general son necesarios en la salud humana. El ácido docosahexaenoico (22:6 n-3, DHA), un componente omega-3 importante del aceite de pescado y de las algas marinas, se concentra en el cerebro, en los fotorreceptores y en la sinapsis de

15 la retina. Dietas enriquecidas en DHA son metabolizadas inicialmente por el hígado y después distribuidas a través de las lipoproteínas de la sangre para resolver las necesidades de los diferentes órganos. La administración de DHA se traduce en un aumento de su concentración a nivel tisular, induciendo además un incremento en la concentración del ácido omega-3 eicosapentaenoico (EPA) al cual esta ligado metabólicamente, mientras que la administración de EPA sólo incrementa su concentración disminuyendo la de DHA a nivel celular.

[0003] En general, el DHA se incorpora en los fosfolípidos de la membrana celular y tienen efectos en la composición y en la funcionalidad de la misma, en la producción de especies reactivas del oxígeno (ROS), en la oxidación lipídica de la membrana, en la regulación transcripcional, en la biosíntesis de eicosanoides y en la transducción intracelular de la señal. Además, en el sistema nervioso central, el DHA está implicado en el desarrollo

25 de la capacidad de aprendizaje relacionada con la memoria, en las funciones excitables de la membrana, en la biogénesis de las células fotorreceptoras y en la transducción de la señal dependiente de proteína quinasa. Una terapia dietética potencial estaría basada en la corrección de los niveles óptimos de ácidos grasos omega-3 para evitar que determinadas patologías puedan originarse o progresar, tal como patologías inflamatorias, procesos tumorales, enfermedades cardiovasculares, depresión y enfermedades neurológicas.

[0004] En el sistema nervioso central, tanto el cerebro como la retina, exhiben una capacidad inusual de retención del DHA incluso en situaciones de privación dietética muy prolongada de ácidos grasos omega-3. Varios estudios han descrito el efecto protector del DHA en las neuronas, donde está presente en niveles muy altos. Por ejemplo, está implicado en la protección de las células neuronales de la muerte por apoptosis. Recientemente, se ha

35 demostrado que el DHA, que se encuentra disminuido en el hipocampo de ratas envejecidas, es capaz de proteger cultivos primarios de dichas células contra la citotoxicidad inducida por el glutamato.

[0005] También se ha demostrado que en los fotorreceptores de la retina, el DHA modula los niveles de las proteínas pro- y anti-apoptóticas de la familia Bcl-2 Los segmentos externos del fotorreceptor de la retina contienen rodopsina así como el contenido más alto en DHA que cualquier otro tipo de célula. El DHA se concentra en los fosfolípidos de las membranas externas del disco del segmento del fotorreceptor. Bajo condiciones de reducción de la concentración de DHA óptima se han observado disfunciones retinianas. La célula epitelial pigmentaria de la retina (RPE) es muy activa en la captación, conservación y transporte de DHA. El alto contenido de DHA en el fotorreceptor y en las células RPE está ligado principalmente a dominios en la membrana con unas características

45 físicas que contribuyen a la modulación de receptores, canales iónicos, transportadores, etc., así como también parece regular la concentración de fosfatidilserina.

[0006] Hasta la fecha no se conoce si estos efectos están totalmente mediados por el propio DHA o por algún derivado metabólico. Se han identificado en la retina ciertos derivados del DHA. Aunque los enzimas implicados en la síntesis de dichos derivados no se han identificado con exactitud, hay resultados recientes que sugieren la participación de una fosfolipasa A2 (PLA2) seguida de una lipoxigenasa (LOX). La PLA2 libera el DHA de los fosfolípidos de membrana y la LOX lo convierte en sus derivados metabólicamente activos.

[0007] Las especies reactivas del oxígeno (ROS) se producen durante la función celular normal. Los ROS incluyen

55 el anión superóxido, el peróxido de hidrógeno y el radical oxidrilo. Su alta reactividad química conduce a la oxidación de proteínas, del DNA o de lípidos. La superóxido dismutasa (SOD), la catalasa (CAT) y la glutatión-peroxidasa (GPx) son las enzimas antioxidantes primarias que protegen contra el daño molecular y celular causado por la presencia de ROS. El estrés oxidativo activa múltiples vías metabólicas; algunas son citoprotectoras, y otras conducen a la muerte de la célula. Estudios recientes indican que el desequilibrio entre la producción y la degradación de los ROS son factores de riesgo importantes en la patogénesis de muchas enfermedades en algunos casos relacionado con un deterioro del sistema antioxidante.

[0008] El DHA se presenta como una diana de los ROS que provoca daño en la célula del fotorreceptor y en la RPE. La degeneración retiniana inducida por la luz promueve la pérdida de DHA de los fotorreceptores. Por ejemplo, 65 cuando las células RPE están dañadas o mueren, se deteriora la función del fotorreceptor ya que las células RPE son esenciales para su supervivencia. Así, la muerte de la célula RPE por efecto del estrés oxidativo deteriora la

visión, particularmente cuando las células de la mácula están afectadas ya que es la responsable de la agudeza visual. La patofisiología de muchas degeneraciones retinianas (e.g., degeneraciones maculares relativas a la edad y enfermedad de Stargardt) implica estrés oxidativo que conduce a la apoptosis de las células de RPE. De hecho, la apoptosis de la célula RPE parece ser el factor dominante en la degeneración macular observada con la edad. Estos

5 estudios sugieren que dichas células han desarrollado mecanismos antioxidantes muy eficaces para protegerse de su alto contenido en DHA y presentan una notable capacidad adaptativa.

[0009] Por otra parte, está perfectamente aceptada la relación entre los radicales libres y el envejecimiento, basado en las evidencias que los radicales libres producidos durante la respiración aerobia causan un daño oxidativo que se 10 acumula, y provoca una pérdida gradual de los mecanismos homeostáticos, una interferencia en los patrones de expresión génica y una pérdida de la capacidad funcional de la célula, lo que conduce al envejecimiento y a la muerte. Existe una interrelación entre la generación de oxidantes, la protección antioxidante y la reparación del daño oxidativo. Se han realizado numerosos estudios para determinar si las defensas antioxidantes declinan con la edad. Entre ellos, el análisis de los principales componentes de estas: actividad o expresión de las enzimas SOD, CAT, 15 GPx, glutatión reductasa, glutatión-S-transferasa y la concentración de compuestos de bajo peso molecular con propiedades antioxidantes. Por ejemplo, la sobreexpresión de SOD y CAT en Drosophila melanogaster aumenta la expectativa de vida un 30% y disminuye el daño por oxidación proteico. En este contexto, la exposición del tejido cutáneo in vitro e in vivo a los rayos UV genera radicales libres y otras especies reactivas del oxígeno, provocando estrés oxidativo celular, que se ha documentado que contribuye de manera importante al envejecimiento. La

20 exposición excesiva de la piel a la radiación ultravioleta puede dar lugar a un daño agudo o crónico. En condiciones agudas se puede provocar un eritema o quemaduras, mientras que en la sobreexposición crónica aumenta el riesgo de cáncer de piel y de envejecimiento. Además, se sabe que las células cutáneas pueden responder al estrés oxidativo agudo o crónico aumentando la expresión de una variedad de proteínas, tales como las enzimas que están implicadas en el mantenimiento de la integridad de la célula y la resistencia al daño oxidativo.

25 [0010] En la técnica se conoce que los telómeros son regiones de ADN no codificante ubicadas en los extremos de los cromosomas eucarióticos. Están constituídos por secuencias de ADN altamente conservadas, repetidas en tandem (TTAGGG)n y proteínas asociadas, y presentan una estructura especial que impide su unión a los extremos de otros cromosomas, previniendo la fusión telomérica. Cumplen un papel esencial en la preservación de la

30 integridad cromosómica, protegiendo al ADN codificante de la acción enzimática y de su degradación, contribuyendo al mantenimiento de la estabilidad cromosómica.

[0011] En contraste con las secuencias codificantes que tienen una replicación semiconservativa, los telómeros sufren pérdidas progresivas de sus secuencias repetitivas durante las sucesivas divisiones celulares. Actualmente,

35 se considera que se requiere un mínimo de longitud telomérica para mantener la función de los telómeros, y que cuando los mismos alcanzan un tamaño crítico tienen dificultades para separarse durante la mitosis, generando asociaciones teloméricas (TAS) e inestabilidad cromosómica. Dicha inestabilidad cromosómica estaría relacionada con un aumento en la probabilidad de producir errores capaces de generar cambios genéticos de importancia.

40 [0012] Debido a la multiplicidad de dobles enlaces, los ácidos grasos omega-3 se consideran dianas moleculares para la generación y propagación de los radicales libres durante los procesos de estrés oxidativo relacionados con la generación de peróxidos lipídicos. Hay resultados contradictorios obtenidos en diferentes estudios respecto a la susceptibilidad frente al estrés oxidativo debido a la suplementación dietética con ácidos grasos omega-3. En algunos estudios en humanos, se ha observado un incremento de la oxidación de las LDL, mientras que en otros no

45 se observó ningún efecto. En estudios con animales, el tratamiento con ácidos grasos omega-3 provoca un aumento

o una disminución de la susceptibilidad a la oxidación de las LDL. Por otra parte, una sobreexpresión de los genes implicados en el sistema de defensa antioxidante se ha demostrado en hígado de ratones alimentados con una dieta enriquecida en el aceite de pescados durante 3 meses.

50 [0013] Además, diferentes estudios in vitro con una línea celular de origen glial han demostrado que las membranas ricas en ácidos grasos omega-3 son más susceptibles al daño oxidativo. La suplementación a largo plazo de estas células con altas concentraciones de DHA dio lugar a niveles incrementados de peróxidos lipídicos en el medio de cultivo, y un mayor porcentaje de muerte celular por apoptosis inducida por la exposición a peróxido de hidrógeno. Sin embargo, se ha demostrado que la administración intramniótica de docosahexaenoato de etilo reduce la

55 peroxidación lipídica en los cerebros fetales de las ratas. Este comportamiento se ha sugerido que es por un efecto secuestrante de radicales libres vía la activación de enzimas antioxidantes. Un aumento en la capacidad antioxidante del cerebro es importante para la defensa endógena primaria contra el estrés oxidativo porque el cerebro es relativamente rico en ácidos grasos poliinsaturados y es relativamente pobre en enzimas antioxidantes.

60 [0014] Estos resultados contradictorios sugieren que la hipótesis basada en la premisa de que la oxidación de un ácido graso aumenta como el número de enlaces dobles, no tiene aplicabilidad in vivo ya que otros mecanismos potenciales pueden actuar para la disminución del daño oxidativo tales como una estructura tridimensional de los ácidos grasos omega-3 en los lípidos y en las lipoproteínas de la membrana que hacen los dobles enlaces menos susceptibles al ataque de los ROS, la inhibición de enzimas pro-oxidantes como la PLA2 o la mayor expresión de

65 enzimas antioxidantes.

[0015] Por otro lado, la idea de asociar ejercicio físico con la producción de radicales libres proviene de comienzos de los años 80 debido a la observación del daño en los lípidos de membrana durante fenómenos de isquemiareperfusión en tejidos hipóxicos (véase Lovlin et al., Eur. J. Appl. Physiol. Occup. Physiol. 1987; 56 (3); 313-6). Al mismo tiempo se observó un aumento del cociente GSSG/GSH en las células musculares de rata (véase Lew H et

5 al. FEBS Lett, 1985; 185 (2): 262-6, Sen CK et al., J. Apl. Physiol. 1994; 77(5): 2177-87) así como en sangre de humanos (véase MacPhail DB et al., Free Radic Res Commun 1993; 18(3):177-81, Gohil K. et al. J. Appl Physiol. 1988 Jan; 64(1): 115-9). Los radicales libres afectan también al ADN y el ejercicio físico agudo aumenta el daño en el ADN, tal como se evidencia por el aumento de 8-OhdG. El esfuerzo físico extenuante (correr una maratón) produce daño al ADN evidenciable durante varios días después de la prueba y lesiona células inmunocompetentes (lo que puede estar relacionado con la disminución inmunitaria que se constata en deportistas tras una prueba de este tipo).

[0016] Sin embargo, otros autores no observaron efectos (salvo daños menores) tras nadar durante 90 minutos, correr durante 60 minutos o realizar un esfuerzo extenuante remando. Al mismo tiempo, investigaciones realizadas

15 en deportistas entrenados y desentrenados no encontraron diferencias en la excreción urinaria de 8-oxo-dG, incluso, los que encontraron tal daño, consideraron que puede ser secundario a reacciones posteriores al esfuerzo y no a la acción del ejercicio sobre el ADN de forma aguda.

[0017] El hecho de que el ejercicio físico intenso produce estrés oxidativo es algo universalmente aceptado, sin embargo su origen no está bien determinado.

[0018] Los estudios realizados con ácidos grasos n-3 en relación con el rendimiento deportivo se centraron en el efecto antiinflamatorio y, de hecho, los primeros ensayos buscaron la posible acción de estos nutrientes mejorando la absorción alveolo-capilar al disminuir la bronconstricción inducida por el ejercicio físico intenso. En este sentido,

25 Mickleborough observó que al suministrar una dieta de 3,2 g de EPA y 2,2 g de DHA se atenuaban las citocinas proinflamatorias disminuyendo la presencia de TNF-α y de IL-1β en atleta de élite, al tiempo que disminuía la broncoconstricción. Walser relacionó los efectos vasculares de los ácidos grasos n-3 con efectos positivos en personas con intolerancia al ejercicio físico. En este mismo sentido van Houten et al. estudiaron que una ingesta alta de ácidos grasos n-3 se asociaban con una mejor recuperación en pacientes que realizaban rehabilitación cardíaca tras un síndrome coronario.

[0019] La ausencia de resultados positivos sobre el rendimiento físico en estos estudios analizados se debe a que se ha evaluado a pacientes, no a personas sanas, y que lo que se ha investigado son efectos vasculares y antiinflamatorios.

35 [0020] Al mismo tiempo se han realizado investigaciones en base al siguiente concepto teórico: si aumentan los ácidos grasos libres en plasma por encima de 1 mmol/L (lo que ocurre cuando el glucógeno se agota), la competencia con el transporte de triptófano hace que éste aumente con el posterior aumento de serotonina, neurotransmisor relacionado con la llamada “fatiga central” en los deportes de larga duración. En este sentido, se sabe que los ácidos grasos n-3 disminuyen la cantidad de ácidos grasos libres en plasma probablemente regulando al alza la oxidación de ácidos grasos mediante la activación del factor nuclear de transcripción PPARα. Sin embargo, estos ensayos no fueron satisfactorios, así Huffman (2004) utilizando una dosis de 4 g de ácido grasos n-3 (cápsulas de 500 mg conteniendo 300 mg de EPA y 200 mg de DHA) realizó un estudio en corredores populares de ambos sexos no encontrando disminuciones de TRP libre ni menor percepción del esfuerzo, ni aumento del rendimiento de

45 forma estadísticamente significativa, aunque si existía una tendencia estadística a mejorar el rendimiento en los sujetos que consumieron ácidos grasos n-3, dejando los autores la posibilidad de que fuera el bajo número de sujetos estudiados (5 hombres y 5 mujeres) lo que había disminuido potencia estadística al estudio.

[0021] Otra investigación posterior en la que se evaluó la eficacia de los ácidos n-3 en relación con el rendimiento no encontró diferencias significativas empleando aceite de maíz como placebo. Raastad administrando 1,60 g de EPA y 1,04 g de DHA al día durante varias semanas, no encontró mejorías en jugadores de fútbol (véase, Raastad et al. Scand J Med Sci Sports 1997; 7(1): 25-31).

[0022] Por otro lado, se conoce que los ácidos grasos libres interfieren con la utilización de la glucosa en el músculo,

55 puesto que sus homólogos a nivel intracelular, los acil-CoA en las mitocondrias inhiben la piruvato deshidrogenasa (inhibición por producto), asimismo, estimulan la glucogenolisis y la gluconeogénesis, causando una suave hiperglucemia durante el ayuno, de hecho, la infusión continua de ácidos grasos poliinsaturados durante el ayuno ayuda a mantener la glucemia, quizás activando la glucosa-6-fosfatasa a nivel hepático. También se sabe que la composición de los ácidos grasos en el músculo altera la sensibilidad a la insulina, indicando que un alto contenido de ácidos grasos poliinsaturados en la membrana plasmática mejora la sensibilidad a la insulina y un alto contenido de ácidos grasos saturados produce un efecto contrario.

[0023] El ejercicio incrementa la captación de glucosa, la perfusión capilar, la velocidad de síntesis de glucógeno y la sensibilidad a la insulina. Durante la contracción muscular se producen cambios en la temperatura, el pH intracelular, 65 en la relación ATP/ADP, así como en la concentración intracelular del Ca++ y otros metabolitos que podrían actuar como mensajeros en la regulación del funcionamiento celular con el ejercicio. En este sentido, el Ca++, regula

numerosas proteínas intracelulares, incluyendo calmodulina kinasa, proteína kinasa C (PKC) y calcineurina que son importantes intermediarios en las señales de transducción intracelular. En el ejercicio aerobio, se inactiva la acetil-CoA carboxilasa por la AMP quinasa (AMPK) lo que conlleva una caída en los niveles de malonil-CoA, desinhibiendo carnitina palmitol transferasa con el consecuente aumento del transporte de ácidos grasos al interior de la

5 mitocondria (favoreciendo así la oxidación de ácidos grasos).

[0024] Los efectos de la activación de AMPK probablemente incluyen el estímulo de la expresión de GLUT4 y hexoquinasa, así como de enzimas mitocondriales. Sin embargo, sorprendentemente, la activación de AMPK no es la única vía (independiente de la insulina) en la cual el ejercicio aumenta la respuesta a la glucosa en el músculo

10 esquelético. Véase Mora y Pessin, J. Biol. Chem. 2000; 275 (21): 16323-16328, demostraron que el incremento de la respuesta a la glucosa en el músculo, de hecho, existen factores de transcripción como MEF2A y MEF2D que activan el GLUT4, y estos factores se activan con el ejercicio.

[0025] El aumento de lípidos intramusculares es común a los estados de obesidad y entrenamiento físico, pero el

15 resultado es que en los obesos se asocia a la resistencia a la insulina, mientras que en los deportistas la gran actividad de la carnitina palmitoil transferasa hace que los ácidos grasos deriven a la beta oxidación. Existen fuertes evidencias de que una dieta rica en ácidos grasos n-3, aun aumentando la glucemia y la insulinemia (señales de resistencia a la insulina), actúan a nivel del receptor de la insulina manteniendo el nivel de translocación de la proteína GLUT-4, lo cual se ha visto de manera específica con el DHA (véase, Jaescchke H. Proc. Soc Exp Biol.

20 Med 1995; 209: 104-11).

[0026] El documento WO2004/112776 describe una composición que comprende ácido docosahexaenoico en forma de un éster, triglicérido, diglicérido, monoglicérido, fosfolípidos, glicolípido, esfingolípido o sulfolípido; y un carotenoide, tal como astaxantina, para el uso profiláctico y/o terapéutico en la curación de enfermedades

25 inflamatorias inducidas por traumas o estrés.

[0027] El documento EP0342795 proporciona una composición que mejora la función cerebral que contiene ácido docosahexaenoico (DHA) o uno de sus derivados o precursores como principio activo y que tiene un efecto de mejorar la función cerebral y curar el malfuncionamiento cerebral, que se puede utilizar para medicamentos y

30 alimentos funcionales o se puede mezclar de manera apropiada con un portador, un excipiente o un diluyente para proporcionar un agente líquido, un agente en polvo, un agente granular, un agente en forma de comprimidos o un agente que toma cualquier otra forma deseada. Dicho agente médico o alimento que contiene ácido docosahexaenoico o por lo menos uno de sus derivados puede mejorar, cuando es ingerido por el cuerpo humano, la capacidad de aprendizaje y memoria del paciente.

35 [0028] Colquhoun A. et al. “Gamma-linolenic acid and eicosapentaenoic acid induce modifications in mitochondrial metabolism, reactive oxygen species generation, lipid peroxidation and apoptosis in Walker 256 rat carcinosarcomacells”, Biochimica and Biphysica Acta, Molecular and Cell Biology of Lipids, Elsevier, Ámsterdam, NL, vol. 1533, no. 3, 31 Octubre 2001, páginas 207-219, descrube que los PUFA presentan actividades prooxidsantes al disminuir la

40 función mitocondrial, lo cual conduce a una pérdida de potencial de membrana mitocondrial y a un incremento en la producción de ROS. En particular, describe las propiedades antitumorales y prooxidantes del ácido y-linolénico (GLA) y ácido eicosapentaenoico (EPA).

[0029] Christensen M S et al. “Intestinal and lymphatic transport of eicosapentaenoic (EPA), docosahexaenoic (DHA)

45 and decanoic acids: dependence on intramolecular triacylglycerol structure”, The American Journal of Clinical Nutrition, American Society for Nutrition, US, vol. 61, 1 enero 1995, páginas 56-61, describe triacilgliceroles específicos que tienen DHA en la posición sn-2 y ácido decanoico en las posiciones sn-1 y sn-3, y su uso en la administración entérica (alimentación intragástrica) de ratas.

50 Descripción de la Invención

[0030] La presente invención se refiere a la utilización de ácido docosahexaenoico tal como se define en las reivindicaciones 1 a 9 para el tratamiento de una patología asociada con el daño celular oxidativo, en la que dicha patología asociada con el daño celular oxidativo es una patología neurodegenerativa, una patología ocular, una

55 patología isquémica, o aterosclerosis

[0031] Según la reivindicación 10, dicha patología neurodegenerativa es una del grupo que comprende esclerosis múltiple, enfermedad de Alzheimer, enfermedad de Parkinson, esclerosis lateral amiotrófica y distrofia muscular.

60 [0032] Según la reivindicación 11, dicha patología ocular es una del grupo que comprende retinosis pigmentaria, degeneración macular, y cataratas.

[0033] Según la reivindicación 12, dicha patología isquémica es un infarto de miocardio o infarto cerebral.

[0034] La presente invención también se refiere a la utilización de ácido docosahexaenoico, que se incorpora específicamente en por lo menos una posición de un glicerol a través de un enlace éster, para la preparación de un nutracéutico, preferiblemente un producto lácteo, caracterizado porque dicho ácido docosahexaenoico

-: se encuentra en un porcentaje en peso entre el 40 y el 100% con respecto al total de ácidos grasos; o

5 - está incorporado en una posición sn-2, para el tratamiento de una patología asociada con el daño celular oxidativo, en la que dicha patología asociada con el daño celular oxidativo es una patología neurodegenerativa, una patología ocular, una patología isquémica, o aterosclerosis.

[0035] Las realizaciones correspondientes a la presente invención también se muestran con detalle a continuación, siendo las restantes útiles para entender la invención pero no formando parte de la misma.

[0036] La presente memoria concierne al hallazgo inesperado de que la administración de ácido docosahexaenoico (de aquí en adelante también referido como DHA) o ácido eicosapentaenoico (EPA) o EPA derivado de DHA ya sea

15 libre o incorporado en un triglicérido, entre otros, actúa como un antioxidante celular.

[0037] De la misma manera y teniendo en cuenta la relación metabólica entre el DHA y el EPA (retroconversión de DHA a EPA), todos los efectos descritos posteriormente observados para la administración de DHA deben ser aplicables a sistemas mixtos DHA/EPA o incluso a sistemas monocomponentes de EPA, aunque no se nombre específicamente el EPA.

[0038] Por lo tanto, es objeto de la presente memoria la utilización del ácido docosahexaenoico para la fabricación de una composición farmacéutica para el tratamiento del daño celular oxidativo.

25 [0039] Otro objeto de la presente memoria es la utilización de ácido docosahexaenoico (DHA) en una posición específica del esqueleto de un glicérido, estando las otras dos posiciones del glicérido también especificadas en su composición para el tratamiento del daño celular oxidativo.

[0040] Un objeto adicional de la presente memoria es la utilización de ácido docosahexaenoico (DHA) para la fabricación de una composición para el tratamiento del daño celular oxidativo a nivel de ADN. En particular, la utilización de DHA tiene aplicación como agente protector en el proceso natural de acortamiento de los telómeros, provocando un acortamiento más lento de los telómeros durante la replicación del DNA en una situación de estrés oxidativo, y como agente inhibidor de la senescencia prematura, provocada por ROS, en un tratamiento de daño celular oxidativo.

35 [0041] Es también objeto de la presente memoria la utilización de ácido docosahexaenoico para la fabricación de una composición para el tratamiento del envejecimiento celular y de patologías hereditarias que llevan asociados desórdenes en la cadena respiratoria mitocondrial, así como una composición para el tratamiento del Síndrome de Down.

[0042] Otro objeto adicional de la presente memoria es la utilización de ácido docosahexaenoico (DHA) para la fabricación de una composición para el tratamiento del daño celular oxidativo asociado con el ejercicio físico. En particular, la utilización de DHA tiene aplicación como agente potenciador del rendimiento deportivo y regulador de los niveles de glucosa en sangre durante el esfuerzo físico.

45 [0043] Es también objeto de la presente memoria la utilización de ácido docosahexaenoico para la fabricación de una composición destinada a la mejora del rendimiento deportivo, así como una composición para mantener los niveles de glucosa en sangre (normoglucemia) durante un esfuerzo físico mediante, principalmente, la administración de un alimento, un producto lácteo o cualquiera de las formas de administración adecuadas utilizadas habitualmente por gente que realiza ejercicio físico.

[0044] Tal como se describe en el presente documento, la expresión “daño celular oxidativo” significa todo proceso que conlleva un desequilibrio entre la generación y degradación de especies oxidantes celulares con un origen endógeno u exógeno.

55 [0045] Sorprendentemente, tal como se describe en el presente documento, los inventores han encontrado que el DHA es capaz de inhibir la producción de especies reactivas al oxígeno (ROS), tanto relacionadas con una inducción dependiente de peróxidos como de superóxidos. Concretamente disminuye la producción de anión superóxido y con ello de todas las especies derivadas que se obtienen en la cascada oxidativa, como por ejemplo una disminución muy importante de la peroxidación lipídica. Además, se ha determinado un incremento en la actividad enzimática antioxidante, lo que sugiere una adaptación de la célula induciendo la expresión de agentes antioxidantes, básicamente enzimas, y reprimiendo la expresión de agentes prooxidantes como la fosfolipasa A2.

[0046] En una realización descrita en el presente documento, dicho ácido docosahexaenoico está incorporado en un

65 monoglicérido, diglicérido, triglicérido, fosfolípido, éster etílico o ácido graso libre. Preferiblemente, dicho ácido docosahexaenoico está incorporado en un triglicérido.

[0047] Tal como se describe en el presente documento, por “ácido docosahexaenoico incorporado en un glicérido” se entiende un monoglicérido, diglicérido, triglicérido, fosfolípido, con al menos una de las tres posiciones esterificadas con un ácido docosahexaenoico, y opcionalmente, con al menos una de las restantes posiciones

5 esterificadas además con un ácido seleccionado entre un ácido graso de cadena corta, media o larga y un ácido fosfórico. Preferiblemente, dicho glicerol es un triglicérido.

[0048] La elección del triglicérido como estructura química del DHA se basa en los datos derivados de un estudio en el que se comparaba la biodisponibilidad de cuatro concentrados de ácidos omega-3 en forma de esteres etílicos, fosfolípidos, ácidos grasos libres y triglicéridos después de una administración oral, y que demostraron que los triglicéridos reesterificados presentan una biodisponibilidad superior a las otras preparaciones.

[0049] En una realización preferida tal como se describe en el presente documento, dicho ácido docosahexaenoico se encuentra en un porcentaje en peso de entre el 20 y el 100 % respecto al total de ácidos grasos, preferiblemente

15 entre el 40 y el 100 % respecto al total de ácidos grasos y más preferiblemente dicho ácido docosahexaenoico se encuentra en un porcentaje en peso de entre el 66 y el 100 % respecto al total de ácidos grasos.

[0050] En otra realización preferida, dicho ácido docosahexaenoico está incorporado en por lo menos una posición específica de un glicerol mediante un enlace éster, un lípido estructurado, para la fabricación de una composición farmacéutica para el tratamiento del daño celular oxidativo.

[0051] Dicho glicerol puede comprender, además, por lo menos un ácido graso y/o un ácido fosfórico de manera que estando dicho ácido docosahexaenoico incorporado en una posición seleccionada entre sn-1, sn-2 y sn-3 puede comprender además, opcionalmente, por lo menos un ácido seleccionado entre un ácido graso de cadena corta y/o

25 cadena media y un ácido fosfórico, y estando incorporado en la posición sn-2 puede comprender además, opcionalmente, por lo menos un ácido seleccionado entre un ácido graso y un ácido fosfórico.

[0052] En este sentido, cuando se refiere al término “opcionalmente” se entiende que dicho ácido docosahexaenoico incorporado en una posición seleccionada entre sn-1, sn-2 y sn-3 puede o no comprender además por lo menos un ácido seleccionado entre un ácido graso de cadena corta y/o cadena media y un ácido fosfórico, o bién que dicho ácido docosahexadecanoico incorporado en la posición sn-2 puede o no comprender además por lo menos un ácido seleccionado entre un ácido graso de cadena larga y un ácido fosfórico.

[0053] Sorprendentemente, tal como se describe en el presente documento, los invetores han encontrado que la

35 utilización de gliceroles estructurados, donde se ha seleccionado la posición del ácido docosahexaenoico y la composición del resto de compuestos unidos al glicerol, conduce a un incremento inesperado, de por lo menos el doble e incluso el triple, de la eficacia terapéutica de la utilización del ácido docosahexaenoico para la fabricación de una composición farmacéutica para el tratamiento del daño celular oxidativo.

[0054] La definición común se refiere a grasas que contienen los ácidos grasos situados en posiciones específicas en el esqueleto del glicerol. Por similitud con la biodistribución in vivo de los ácidos grasos, los ácidos grasos poliinsaturados (PUFAs) de cadena larga se localizan preferencialmente en la posición sn-2 del glicerol y teniendo en cuenta el proceso de absorción intestinal, los triglicéridos son hidrolizados por las lipasas a ácidos grasos libres, di- y monoglicéridos, de los cuales los ácidos grasos y los sn-2 monoglicéridos son absorbidos directamente por las

45 células epiteliales intestinales, llamadas enterocitos.

[0055] Mediante la utilización de ácido docosahexaenoico incorporado en una posición específica del esqueleto de un glicerol, mediante un enlace éster, proporciona mayor bioactividad, mayor protección antioxidante a igual porcentaje molar respecto al total de ácidos grasos y menor dependencia de la dosis de administración con respecto al efecto antioxidante del ácido docosahexaenoico en un glicérido.

[0056] Ventajosamente, tal como se describe en el presente documento, los inventores han encontrado que la utilización de ácido docosahexaenoico incorporado en una posición del glicerol seleccionada entre sn-1, sn-2 y sn-3 y, opcionalmente, comprendiendo además dicho glicerol por lo menos un ácido seleccionado entre un ácido graso

55 de cadena corta y/o cadena media y un ácido fosfórico, proporciona mayor bioactividad, mayor protección antioxidante a igual porcentaje molar respecto al total de ácidos grasos y menor dependencia de la dosis de administración con respecto al efecto antioxidante del ácido docosahexaenoico en un glicerol.

[0057] También ventajosamente, tal como se describe en el presente documento, los inventores han encontrado que la utilización de ácido docosahexaenoico incorporado en la posición sn-2 de un glicerol y, opcionalmente, comprendiendo además dicho glicerol por lo menos un ácido seleccionado entre un ácido graso de cadena larga y un ácido fosfórico también proporciona mayor bioactividad, mayor protección antioxidante a igual porcentaje molar respecto al total de ácidos grasos y menor dependencia de la dosis de administración con respecto al efecto antioxidante del ácido docosahexaenoico en un glicerol.

65 [0058] Preferiblemente, los ácidos también presentes en un glicerol con el ácido docosahexaenoico serán ácidos [0059] Por lo tanto, todavía más preferiblemente, la presente memoria se refiere a la utilización de ácido

5 docosahexaenoico incorporado en un glicerol donde una de las posiciones sn-1 y sn-3 están libres o ocupadas por un ácido graso de cadena media (C9-C14) – o cadena corta (C1-C8) o un ácido fosfórico y cuya prosición sn-2 está ocupada por el DHA funcional. De esta manera se consigue aumentar todavía más la biodisponibilidad del DHA ya que se absorbe más eficientemente en las células intestinales.

[0060] Por lo tanto, la síntesis de glicéridos estructurados donde el ácido docosahexaenoico se ha incorporado en cualquier posición del glicerol cuando éste no compite con otros ácidos grasos y donde el ácido docosahexaenoico se ha incorporado en la posición sn-2 del glicérido cuando éste compite con por lo menos un ácido graso presenta mejoras con respecto a su efecto antioxidante y, por lo tanto, es una forma preferible para la fabricación de una composición para el tratamiento del daño celular oxidativo.

15 [0061] Tal como se describe en el presente documento, los inventores han comprobado que una célula enriquecida con una composición con DHA, tal como se describe en el presente documento, está mejor preparada para hacer frente a una nueva situación de estrés oxidativo y minimizar de esta forma los efectos adversos que de ella se puedan derivar. Es decir, la presencia del DHA en las biomembranas induce una respuesta adaptativa celular frente al estrés oxidativo. La respuesta adaptativa es un fenómeno celular por el cual la exposición a un agente tóxico (en concentraciones subletales) provoca una respuesta celular que protegerá posteriormente a la célula contra los efectos deletéreos del mismo tóxico a concentraciones letales, dicho en otras palabras, es un efecto benéfico desencadenado con bajo nivel de exposición a un agente que es dañino a altos niveles.

25 [0062] La administración de DHA posee las siguientes ventajas sustanciales: a) Incremento de la actividad antioxidante celular; b) Ausencia de citotoxicidad celular a las dosis administradas; c) Ausencia de modificaciones significativas en el status oxidante celular a las dosis administradas; d) Actividad antioxidante celular adaptativa.

[0063] Por todo lo anterior, en una realización preferida la presente memoria se refiere a la utilización del ácido docosahexaenoico para la fabricación de una composición farmacéutica para el tratamiento de una patología asociada al daño celular oxidativo, siendo dicha patología una patología neurodegenerativa, preferiblemente seleccionada del grupo que comprende: esclerosis múltiple, Alzheimer, Parkinson, esclerosis lateral amiotrófica y

35 distrofia muscular, entre otras.

[0064] En otra realización, tal como se describe en el presente documento, la patología asociada a un daño oxidativo es una patología ocular, preferiblemente una seleccionada del grupo que comprende retinosis pigmentaria, degeneración macular y cataratas, entre otras.

[0065] En aún otra realización, la patología asociada con un daño oxidativo es una patología isquémica, preferiblemente un infarto de miocardio, infarto cerebral, etc.

[0066] En todavía aún otra realización, tal como se describe en el presente documento, la patología asociada con un

45 daño oxidativo es un proceso inflamatorio, preferiblemente seleccionado del grupo que comprende artritis, vasculitis, glomerulonefritis y lupus eritomatoso, entre otras.

[0067] En otra realización preferida, la patología asociada a un daño oxidativo es ateroesclerosis.

[0068] Otro aspecto, tal como se describe en el presente documento, es la utilización del DHA como agente protector en el proceso natural de acortamiento de los telómeros, y como agente inhibidor de la senescencia prematura.

[0069] Los mecanismos que producen las asociaciones teloméricas (TAS) son aún desconocidos pero los autores

55 de la presente invención sugieren que éstos podrían estar asociados al déficit en la actividad de la enzima telomerasa que sintetiza las secuencias repetitivas de ADN características de los telómeros, estabilizando así la longitud de los mismos.

[0070] La telomerasa es muy activa en células fetales, pero presenta poca actividad en las células de los tejidos de adultos. Las TAS han sido raramente encontradas en células normales, por el contrario, se las ha observado en células infectadas por virus o tumorales.

[0071] Se ha determinado que existe una reducción progresiva del número de repeticiones teloméricas in vitro, así como en función del envejecimiento celular, in vivo, que lleva asociado una inhibición de la actividad de telomerasa

65 en la senescencia. Así mismo, los autores de la presente invención han estudiado la longitud telomérica en fibroblastos y linfocitos de personas sanas centenarias, encontrando un acortamiento telomérico durante la [0072] Aunque el acortamiento de los telómeros ocurre de forma natural con la replicación celular, se ha observado

5 una senescencia prematura y roturas de los telómeros cuando se induce daño oxidativo en el DNA. Los telómeros son más sensibles al daño oxidativo y sus roturas se reparan menos eficazmente que otras partes del genoma. Esto conduce a una acumulación del daño telomérico, que produce un acortamiento más rápido durante la replicación del DNA que reduce la esperanza de vida replicativa celular. Las especies reactivas del oxígeno (ROS), particularmente aniones superóxido, peróxido de hidrógeno y radicales del oxidrilo, pueden acelerar las pérdidas en los telómeros

10 durante la replicación en algunos tipos celulares aunque también inducen senescencia prematura independientemente del acortamiento de los telómeros.

[0073] Sorprendentemente, los autores de la presente memoria han encontrado que la utilización del ácido docosahexaenoico en un tratamiento del daño celular oxidativo a nivel de ADN permite disminuir la velocidad de

15 acortamiento de los telómeros y, por tanto, inhibir la senescencia celular.

[0074] Los presentes inventores han encontrado una correlación inversa entre la velocidad de acortamiento del telómero y la capacidad antioxidante celular en más de 20 cepas humanas de fibroblastos. La mayoría de los parámetros celulares de estos fibroblastos prematuramente envejecidos son idénticos al envejecimiento normal de

20 dichas células (morfología, acumulación del lipofuscina y cambios en la expresión génica). Los fibroblastos con menor defensa antioxidante acortan sus telómeros más rápidamente y viceversa. La velocidad de acortamiento del telómero es más alta en células con una defensa antioxidante más baja. Además, los secuestrantes de radicales libres disminuyen la velocidad de acortamiento del telómero.

25 [0075] Estos datos están en concordancia con los que demuestran un papel importante de las enzimas antioxidantes, glutation peroxidasa y superóxido dismutasa, en la velocidad de acortamiento de los telómeros en fibroblastos humanos. Estos datos confirman que la longitud de los telómeros está determinada principalmente por la relación entre el estrés oxidativo y la capacidad de la defensa antioxidante celular. Así, la longitud de los telómeros dependiente de la edad es una medición acumulativa de la historia del daño oxidativo que una célula ha

30 experimentado a lo largo de su vida.

[0076] Una correlación entre el estrés oxidativo y la velocidad en el acortamiento de los telómeros se ha demostrado para patologías hereditarias que llevan asociadas desordenes en la cadena respiratoria mitocondrial y para el Síndrome de Down.

35 [0077] Por lo tanto, la relación existente entre el daño celular oxidativo en el ADN y el acortamiento de los telómeros y su efecto en la senescencia celular permite utilizar el ácido docosahexanoico como un potente agente protector en el proceso natural de acortamiento de los telómeros e inhibidor de la senescencia prematura.

40 [0078] Por otro lado, el uso de enzimas para la producción de aceites enriquecidos en ácidos grasos omega-3 tiene diversas ventajas respecto a otros métodos basados en una síntesis química y posteriores procesos de purificación (separaciones cromatogràficas, destilaciones moleculares, etc.). Estos últimos requieren condiciones extremas de pH y altas temperaturas que pueden parcialmente destruir los dobles enlaces all-cis de los PUFAs omega-3 por oxidación, por isomerización cis-trans o por migración del doble enlace. Las condiciones suaves utilizadas en las

45 síntesis enzimáticas (temperatura inferior a 50oC, pH entre 6-8 y menos reactivos químicos) proporciona una alternativa sintética que preserva la estructura original del PUFA omega-3 con un incremento en su selectividad estructural en los acilgliceroles, considerados como la estructura química más favorable desde un punto de vista nutricional.

50 [0079] La composición farmacéutica que comprende DHA se puede encontrar en forma de aceite o emulsión, los cuales se pueden administrar por vía oral, sublingual, intravenosa, intramuscular, tópica, subcutánea, rectal o incluso por simple puesta en contacto con los órganos olfativos situados en la entrada de las vías respiratorias del principio activo de la microemulsión, tal como se describe en el presente documento, en forma liquida o de vapor. Así la administración puede realizarse por pulverización, nebulización o atomización de las microemulsiones o también la

55 administración puede ser realizada por inhalación.

[0080] Opcionalmente, dicha composición farmacéutica comprende, además, un segundo principio activo.

[0081] De la misma manera, la composición farmacéutica que comprende DHA se puede utilizar en la industria

60 alimentaria con el fin de enriquecer los productos alimenticios (p.e. productos lácteos como yogures, leche, etc) con un agente antioxidante natural como el DHA.

[0082] Por lo tanto, en otra realización, tal como se describe en el presente documento, dicha composición farmacéutica se administra a un paciente que ya está recibiendo un tratamiento contra una patología asociada a un

65 daño oxidativo.

[0084] De esta manera, los autores de la presente memoria han encontrado que de manera sorprendente, la

5 utilización de dicho ácido docosahexaenoico durante el ejercicio físico conduce a un aumento del rendimiento deportivo a la vez que mantiene los niveles de glucosa en sangre (glucemia) durante el esfuerzo físico (sin tomar carbohidratos).

[0085] En este contexto, tal como se describe en el presente documento, se entiende por “cicloturista” o “deportista no competitivo”, cualquier persona que realiza ejercicio físico de forma esporádica y no profesionalmente. Y por “deportista competitivo” o “deportista entrenado”, cualquier persona que realiza ejercicio físico de forma habitual y/o a nivel profesional. Asimismo, se utilizan los términos “ejercicio físico” y “esfuerzo físico” de manera indistinta y equivalente, al igual que el término “deportista” que se utiliza para hombres y mujeres.

15 Rendimiento deportivo

[0086] Con el fin de evaluar el rendimiento deportivo existen una serie de parámetros que permiten dar una valoración de si existe una mejora de dicho rendimiento deportivo.

[0087] En deportistas que realizan deportes aerobios se considera un aumento del rendimiento el incremento del porcentaje del consumo máximo de oxígeno %VO2max en el UV 2 (umbral anaerobio), ya que el VO2máx apenas aumenta durante la temporada competitiva en los deportistas muy entrenados. Pequeñas variaciones en el porcentaje del VO2max en el umbral es un dato directamente relacionado con un aumento del rendimiento.

25 [0088] Los presentes inventores han observado un incremento estadísticamente significativo del consumo de oxígeno (VO2) tanto en valores absolutos (plt;0,019) como relativos al peso (plt;0,036) en el umbral ventilatorio 2 al comparar las pruebas de esfuerzo triangulares basales con las realizadas tras cuatro meses de tratamiento con DHA. El incremento de este parámetro se aprecia tanto en ciclistas que compiten (plt;0,047) como en cicloturistas aunque en estos últimos no es estadísticamente significativo. (figura 24)

[0089] Otro parámetro relacionado con un aumento del rendimiento deportivo es el aumento de la frecuencia cardíaca en la que se establece el UV 2 de la prueba de esfuerzo, ya que en el caso en que la frecuencia cardíaca en el umbral anaerobio aumenta, se considera que el deportista es capaz de incrementar ligeramente su capacidad de mantener el metabolismo aerobio en intensidades más elevadas. Los presentes inventores han observado un

35 incremento de la frecuencia cardiaca en el UV2 para una p=0,082 al comparar dicho parámetro obtenido en la prueba basal con el obtenido en la prueba triangular tras 4 meses de ingesta de DHA. Este dato se observa mucho más marcadamente (plt;0,017) en el subgrupo de ciclistas de alto nivel competitivo (Figura 25).

[0090] En este mismo sentido, existe un aumento del tiempo que se tarda en alcanzar el UV 2 estadísticamente significativo (plt;0,072) (Figura 26).

[0091] Finalmente, la frecuencia cardíaca para un mismo nivel de esfuerzo es menor si el deportista está más entrenado aeróbicamente. Los presentes inventores han observado que en los ciclistas que consumen DHA la frecuencia cardiaca disminuye de forma estadísticamente significativa (plt;0,043) cuando comparamos ese dato en

45 ambas pruebas en el instante en que el deportista consume 2000 ml/min de O2 (Figura 27).

[0092] Como conclusión de estos estudios se puede indicar que en deportistas que han tomado DHA durante 4 meses se ha observado un incremento en el consumo de oxígeno absoluto y relativo en el UV2 (plt;0,008 y plt;0,015 respectivamente), incremento en la carga correspondiente al UV2 (plt;0,063) y descenso en la frecuencia cardiaca que el deportista mantiene cuando presenta un consumo de oxígeno de 2000 ml/min (plt;0,062). Todos estos son parámetros que nos indican un aumento del rendimiento deportivo después de la ingesta de 2,1 g/24 h de DHA (6 cápsulas de 500 mg al 70%), distribuidos en tres tomas diarias durante cuatro meses. Dichas cantidades se expresan a modo de ejemplo y no pretenden de ningún modo ser limitativas de la presente invención.

55 [0093] También se analizaron diversas variables bioquímicas relacionadas con el daño oxidativo después de las pruebas de esfuerzo:

1.: Capacidad antioxidante total del plasma (CAT). Existe un incremento de la CAT de forma generalizada y estadísticamente significativa (plt;0,05) durante la realización de las pruebas rectangulares. Estos incrementos son mayores en los deportistas después de consumir tres semanas DHA, tanto al ser considerados de forma global como en los ciclistas que compiten, no apareciendo esta diferencia entre la prueba basal y la prueba realizada a las 3 semanas de consumo de DHA por los cicloturistas (Figura 28)

2.: Malonildialdehído (MDA). El MDA es el producto mayoritario de los obtenidos al hacer reaccionar los peróxidos

65 lipídicos producidos por el estrés oxidativo con el ácido tiobarbitúrico. Se observa un incremento significativo del daño oxidativo a lípidos plasmáticos durante la realización de todas las pruebas de esfuerzo (plt;0,035). Tras la

5 3. 8-oxo-7,8-dihidro-2’-deoxiguanosina(8-oxodG). El 8-oxodG es un biomarcador del estrés oxidativo. Existe un aumento del daño oxidativo al ADN durante la realización de las pruebas de esfuerzo rectangular (plt;0,011). Este daño oxidativo disminuye tras la ingesta de DHA durante 3 semanas (plt;0,035). Este descenso del daño oxidativo es más acusado en los ciclistas que no compiten que en los ciclistas que compiten, aunque esta última diferencia no es significativa estadísticamemte (Figura 30)

Estudios de glucemia

[0094] Con el fin estudiar los niveles de glucosa en sangre se realizó una prueba de esfuerzo rectangular en rodillo de bicicleta con carga máxima mantenida equivalente a una velocidad correspondiente al 75% de su VO2max

15 calculado en la prueba de esfuerzo triangular maximal, manteniendo constante la pendiente al 2%. La duración de la prueba es de 90 minutos y el consumo de agua durante la misma se realiza ad libitum.

[0095] Al no ingerir bebidas con carbohidratos, lo esperable era una hipoglucemia. Esta hipoglucemia de la segunda extracción (a los veinte minutos de finalizar la prueba con respecto a la muestra inicial obtenida veinte minutos antes de empezar), se manifiesta en la primera prueba de esfuerzo, tal como era de esperar. Sin embargo, los datos obtenidos después de un consumo de DHA de cuatro meses presentan un mantenimiento de la glucemia estadísticamente significativo, lo cual no ha sido observado anteriormente y supone un hallazgo sorprendente en la investigación realizada.

25 [0096] De forma generalizada, se observa un descenso estadísticamente significativo (plt;0,0009) de los niveles de glucosa sérica a lo largo de la prueba de esfuerzo rectangular. Sin embargo, este comportamiento es distinto dependiendo del tipo de deportista a analizar (plt;0,003): en el caso de ciclistas que compiten habitualmente, no se aprecia variación significativa en el descenso de glucemia durante las pruebas pero en el caso de los cicloturistas, el descenso de glucemia durante la prueba basal es mayor que el que ocurre en ciclistas que compiten habitualmente y tras consumo de DHA durante 3 semanas o cuatro meses, dicho descenso desaparece prácticamente (Figuras 31, 32 y 33).

[0097] La existencia de normoglucemia durante una prueba de esfuerzo al 75% del VO2max durante 90 minutos sin la ingesta de una bebida con carbohidratos supone un hallazgo que conecta el comportamiento del DHA durante el

35 esfuerzo físico con el observado y ya comentado previamente en relación con el aumento de la sensibilidad a la insulina. En este sentido, Goodyear y Kahn, en 1998 concluyeron que los mecanismos moleculares subyacentes en la respuesta a la glucosa en el músculo esquelético por la insulina o el ejercicio, son diferentes después de que en 1997 Winder y Hardie publicaran que la AMPK (AMP-activated protein kinase), estaba elevada en las fibras IIa durante el ejercicio, teniendo en cuenta que AMPK tiene un efecto pleiotrópico inactivando la acetil-CoA carboxilasa y favoreciendo el transporte de la glucosa entre otras acciones. Quizás esto explique el hallazgo de una respuesta glucémica distinta en el deportista a la esperable por los estudios realizados en sedentarios.

[0098] Como conclusión de dichos estudios sobre la acción del DHA sobre el rendimiento deportivo y la glucemia se puede indicar lo siguiente:

45 1) Se ha demostrado que la ingesta continuada de DHA por encima de tres semanas produce un incremento de la Capacidad Antioxidante Total del Plasma (CAT) de forma generalizada y estadísticamente significativa (plt;0,05) tanto en ciclistas de nivel competititvo como en amateur. Asimismo, el daño oxidativo a lípidos es menor (plt;0,05) (diferencia que es mucho más acusada para deportistas entrenados que para los cicloturistas). Finalmente, se ha observado que el daño al ADN medido con un marcador urinario (8-oxodG) disminuye tras la ingesta de DHA durante tres semanas (plt;0,035).

2) Se ha demostrado que tras cuatro meses de ingesta continuada de DHA aumenta el rendimiento deportivo (aumenta la carga y frecuencia cardíacas, así como el porcentaje del VO2max en el UV2). También se ha observado

55 una normoglucemia estadísticamente significativa en la prueba de esfuerzo de 90 minutos al 75% del VO2max realizada a los cuatro meses de consumo de DHA.

[0099] La unión de ambos efectos (aumento del rendimiento y normoglucemia durante un esfuerzo de larga duración), es un resultado no esperado ni conocido en la técnica anterior.

[0100] Debemos concluir que esta asociación de efectos es deseable y puede suponer una ayuda ergogénica aún no conocida.

[0101] Otro objeto de la presente memoria es la utilización de ácido docosahexaenoico para la fabricación de una

65 composición destinada a la mejora del rendimiento deportivo y el mantenimiento de los niveles de glucosa en sangre después de un ejercicio físico, administrado mediante cualquier medio adecuado.

80 kcal/1000 ml Energía 350 kcal/1000 ml

20 mmol/l (460 mg/l) Na+ 50 mmol/l (1150 mg/l) 200 mOsml/kg agua Osmolalidad 330 mOsml/kg de agua Al menos el 75% de la Energía calórica debe provenir de carbohidratos con alta carga glucémica (glucosa, maltodextrina, sacarosa) Vitamina B1 0,2 mg/100 g de carbohidratos.

[0103] En este sentido, el hecho de incluir carbohidratos deriva del mantenimiento de la glucemia con el interés de evitar el rápido agotamiento del glucógeno muscular y hepático. Debe considerarse el inconveniente del vaciamiento

10 gástrico disminuido debido al aumento de la osmolalidad que genera la presencia de concentraciones de carbohidrato, asociado a la sensación de plenitud gástrica que muchos deportistas no desean. Por consiguiente, preparar una bebida con menor concentración de carbohidratos añadiendo DHA podría significar una ventaja ergogénica de indudable interés en el rendimiento deportivo.

15 [0104] Por tanto, otro aspecto de la presente memoria se refiere a una composición farmacéutica que comprende DHA que se puede utilizar en la industria alimentaria con el fin de enriquecer los productos alimenticios (p.e. productos lácteos como yogures, leche, etc) con un agente antioxidante natural como el DHA, o incluso, incorporado en una forma de administración adecuada seleccionada del grupo que comprende una bebida en todas sus características para antes, durante y después del ejercicio físico; barritas energéticas; barritas ergogénicas; sólidos y

20 preparados para avituallamiento; complementos dietéticos y preparados polivitamínicos (en forma de, por ejemplo, cápsulas, pastillas, comprimidos, liofilizados, o cualquier medio de administración adecuado); ayudas ergogénicas; textiles con nanocápsulas para absorción dérmica y cualquier otro medio de administración adecuado.

Leyendas de las figuras [0105]

Figura 1. Efecto de la concentración de DHA en el medio de cultivo de células Foreskin sobre la generación intracelular de ROS. Las células se han cultivado en presencia de un triglicérido con un 70% en peso de DHA

30 respecto al total de ácidos grasos durante tres días antes del experimento. (A) La detección de ROS se realizó con DHR 123 en células tratadas con 40 ó 60 mM de AAPH durante 180 min. Los datos representan la media de tres experimentos independientes. (B) La detección de ROS se realizó con CDCFDA en células tratadas con el sistema xantina/xantina oxidasa durante 180 min. A modo de comparación se incorporan los datos obtenidos con Vitamina E (control) 100 µM. Los datos representan la media de tres experimentos independientes.

35 Figura 2. Efecto comparativo de la riqueza en DHA de un triglicérido en el medio de cultivo de células Foreskin sobre la generación intracelular de ROS. (A) Las células se han cultivado en presencia de cada triglicérido durante tres días antes del experimento. La concentración del eje de las abcisas es la equivalente que obtendría con un triglicérido de una riqueza en DHA del 70% en peso. La detección de ROS se realizó con DHR 123 en células

40 tratadas con 40 mM de AAPH durante 180 min. Los datos representan la media de tres experimentos independientes. (B) Representación de la protección antioxidante respecto a la concentración en DHA en el aceite del 20, 50 y 70%.

Figura 3. Efecto de la concentración del DHA sobre la producción de TBARS en células Foreskin. Las células se han

45 cultivado en presencia de un triglicérido con un 70% en peso de DHA respecto al total de ácidos grasos durante tres días antes del experimento a la concentración indicada. El estrés oxidativo se ha inducido con AAPH 40 mM durante 6 h y 24 h de latencia. Los datos representan la media de tres experimentos independientes.

Figura 4. Efecto de la concentración de DHA en el medio de cultivo de células Foreskin sobre la generación de

50 aniones superóxido. Las células se han cultivado en presencia de un triglicérido con un 70% en peso de DHA respecto al total de ácidos grasos durante tres días antes del experimento. La detección de aniones superóxido se realizó por quimioluminiscencia inmediatamente después de la inducción oxidativa de las células con AAPH 40 mM y en algunos experimentos en presencia de Tirón 10 mM o de 0,1875 UA/µl de SOD exógena. Los datos son representativos de tres experimentos independientes.

55 Figura 5A. Efecto de la concentración de DHA en el medio de cultivo de células Foreskin sobre la actividad SOD. Las células se han cultivado en presencia de un triglicérido con un 70% en peso de DHA respecto al total de ácidos grasos durante tres días antes del experimento a una concentración de DHA de 0,5 (A), 5 (B) y 50 µM (C). La actividad SOD se ha evaluado de forma indirecta mediante el análisis del decremento de la quimioluminiscencia

5 Figura 5B. Efecto de la concentración de DHA en el medio de cultivo de células Foreskin sobre la actividad SOD. Las células se han cultivado en presencia de un triglicérido con un 70% en peso de DHA respecto al total de ácidos grasos durante tres días antes del experimento. La actividad SOD se ha evaluado sobre el sistema celular no inducido o inducido con AAPH 40 mM. Los datos son representativos de tres experimentos independientes.

Figura 6. Efecto de la concentración de DHA en el medio de cultivo de células Foreskin sobre la actividad GPx. Las células se han cultivado en presencia de un triglicérido con un 70% en peso de DHA respecto al total de ácidos grasos durante tres días antes del experimento. La actividad GPx se ha evaluado sobre el sistema celular no inducido o inducido con AAPH 40 mM. Los datos son representativos de tres experimentos independientes.

15 Figura 7. Efecto de la concentración de DHA en el medio de cultivo de células ARPE-19 sobre la generación intracelular de ROS. Las células se han cultivado en presencia de un triglicérido con un 70% en peso de DHA respecto al total de ácidos grasos durante tres días antes del experimento. (A) La detección de ROS se realizó con DHR 123 (A) o con CDCFDA (B) en células tratadas con 40 ó 60 mM de AAPH durante 180 min. Los datos representan la media de tres experimentos independientes.

Figura 8. Efecto comparativo de la riqueza en DHA de un triglicérido en el medio de cultivo de células ARPE-19 sobre la generación intracelular de ROS. Las células se han cultivado en presencia de cada triglicérido durante tres días antes del experimento. La concentración del eje de las abcisas es la equivalente que se obtendría con un triglicérido de una riqueza en DHA del 70% en peso. La detección de ROS se realizó con DHR 123 en células

25 tratadas con 40 mM de AAPH durante 180 min. Los datos representan la media de tres experimentos independientes. (B) Representación de la protección antioxidante respecto a la concentración en DHA en el aceite del 20, 50 y 70%.

Figura 9. Efecto de la concentración del DHA sobre la producción de TBARS en células ARPE-19. Las células se han cultivado en presencia de un triglicérido con un 70% en peso de DHA respecto al total de ácidos grasos durante tres días antes del experimento a la concentración indicada. El estrés oxidativo se ha inducido con AAPH 40 mM durante 6 h y 24 h de latencia. Los datos representan la media de tres experimentos independientes.

Figura 10. Efecto de la concentración de DHA en el medio de cultivo de células ARPE-19 sobre la generación de

35 aniones superóxido. Las células se han cultivado en presencia de un triglicérido con un 70% en peso de DHA respecto al total de ácidos grasos durante tres días antes del experimento. La detección de aniones superóxido se realizó por quimioluminiscencia inmediatamente después de la inducción oxidativa de las células con AAPH 40 mM. Los datos son representativos de tres experimentos independientes.

Figura 11. Efecto de la concentración de DHA en el medio de cultivo de células ARPE-19 sobre la actividad GPx. Las células se han cultivado en presencia de un triglicérido con un 70% en peso de DHA respecto al total de ácidos grasos durante tres días antes del experimento. La actividad GPx se ha evaluado sobre el sistema celular no inducido o inducido con AAPH 40 mM. Los datos son representativos de tres experimentos independientes.

45 Figura 12. Efecto de la concentración de DHA en el medio de cultivo de células ARPE-19 sobre la actividad SOD. Las células se han cultivado en presencia de un triglicérido con un 70% en peso de DHA respecto al total de ácidos grasos durante tres días antes del experimento. La actividad SOD se ha evaluado sobre el sistema celular no inducido o inducido con AAPH 40 mM. Los datos son representativos de tres experimentos independientes.

Figura 13. Efecto de la concentración de DHA obtenido por síntesis química (A y C) o enzimática (B y D) sobre el porcentaje de protección celular frente al estrés oxidativo en células ARPE-19 (A y B) o Foreskin (C y D).

Figura 14. Influencia del grado de purificación del aceite obtenido por síntesis química sobre el porcentaje de protección celular frente al estrés oxidativo inducido por el DHA en células ARPE-19.

55 Figura 15. Influencia de la estructura química sobre el porcentaje de protección celular frente al estrés oxidativo inducido por el DHA en células ARPE-19.

Figura 16. Efecto de la concentración de DHA sobre la concentración intracelular de glutation en células ARPE19.Influencia de la presencia de BSO.

Figura 17. Influencia de la síntesis de novo de glutation sobre el porcentaje de protección celular frente al estrés oxidativo inducido por el DHA en células ARPE-19.

65 Figura 18. Efecto de la concentración de DHA sobre la concentración intracelular de glutation en células Foreskin.Influencia de la presencia de BSO.

5 Figura 20. Efecto de la concentración de EPA sobre el porcentaje de protección celular frente al estrés oxidativo en células Foreskin. Estudio comparativo con DHA.

Figura 21. Efecto de la concentración de EPA sobre la concentración intracelular de glutation en células Foreskin. Influencia de la presencia de BSO.

Figura 22. Es una gráfica de barras comparativa del efecto del porcentaje de DHA en un triglicérido estructurado y no estructurado a diferentes dosis con respecto al porcentaje de protección de las células.

[0106] Dicha figura 22 muestra los resultados sorprendentes del objeto de la presente adición al comparar una

15 estructura química glicérido (triglicérido) no estructurada, respecto a la misma donde las posiciones sn-1 y sn-3 se han substituido por ácido caprílico (estructurada), ambos de origen enzimático con dos niveles iniciales en contenido en DHA del 20 y del 70%.

[0107] A partir de dicha figura puede observarse que a la misma concentración el porcentaje de protección del ácido docosahexaenoico incorporado en la posición sn-2 de un glicérido (estructurado), en particular, de un triglicérido, presenta una eficacia de aproximadamente 3 veces superior a la de un glicérido que contiene DHA no estructurado.

[0108] En dicha figura 22, el porcentaje de protección indica la relación entre la diferencia en la concentración intracelular de especies reactivas del oxígeno de las células control y las tratadas con DHA respecto a las control

25 sometidas ambas al mismo estrés oxidativo expresado en porcentaje. Dicho de otro forma, la existencia de un porcentaje de protección indica en las células tratadas una menor generación intracelular de especies reactivas del oxígeno estadísticamente significativa respecto al control.

Figura 23.- Es una gráfica comparativa de la longitud media del telómero en fibroblastos humanos cultivados bajo estrés oxidativo con o sin DHA incorporado frente al número de pases de las poblaciones celulares.

[0109] Dicha figura 23 muestra los resultados sorprendentes del objeto de la presente adición al observarse que en presencia de DHA en una situación de estrés oxidativo el índide de acortamiento de los telómeros es menor con respecto al control o sin DHA.

35 La Figura 24 es la representación gráfica del consumo de oxígeno absoluto en el “umbral ventilatorio 2” (UV2) para ciclistas competitivos, no competitivos y total a nivel basal y después de 4 meses de ingestión de DHA.

La Figura 25 es la representación gráfica de la frecuencia cardíaca en el UV2 para ciclistas competitivos, no competitivos y total a nivel basal y después de 4 meses de ingestión de DHA.

La Figura 26 es la representación gráfica del tiempo para alcanzar el UV2 para ciclistas competitivos, no competitivos y total a nivel basal y después de 4 meses de ingestión de DHA.

45 La Figura 27 es la representación gráfica de la frecuencia cardiaca durante el consumo de 2000 ml/min de oxígeno para ciclistas competitivos, no competitivos y total a nivel basal y después de 4 meses de ingestión de DHA.

La Figura 28 es la representación gráfica de la capacidad antioxidante total del plasma para deportistas competitivos, no competitivos y total a nivel basal y después de 3 semanas de ingestión de DHA. En cada caso se indica la capacidad antioxidante antes (barra izquierda) y la capacidad antioxidante después (barra derecha) de la prueba de esfuerzo.

La Figura 29 es la representación gráfica del daño oxidativo a lípidos plasmáticos en función de la concentración de MDA para deportistas competitivos, no competitivos y total a nivel basal y después de 4 meses de ingestión de DHA.

55 En cada caso se indica el daño oxidativo antes (barra izquierda) y el daño oxidativo después (barra derecha) de la prueba de esfuerzo.

La Figura 30 es la representación gráfica del daño oxidativo al ADN utilizando el biomarcador del estrés oxidativo 8oxodG para deportistas competitivos, no competitivos y total a nivel basal y después de 3 semanas de ingestión de DHA. En cada caso se indica el daño oxidativo antes (barra izquierda) y el daño oxidativo después (barra derecha) de la prueba de esfuerzo.

La Figura 31 es la representación gráfica de la glucemia en deportistas que compiten durante un esfuerzo físico que no han tomado DHA o lo han hecho durante 3 semanas o 4 meses.

65 La Figura 32 es la representación gráfica de la glucemia en deportistas que no compiten durante un esfuerzo físico

La Figura 33 es la representación gráfica de la glucemia en deportistas que compiten y no compiten durante un esfuerzo físico que no han tomado DHA o lo han hecho durante 3 semanas o 4 meses. 5 [0110] A continuación se incluyen los siguientes ejemplos a modo ilustrativo y no limitativos de la invención.

Ejemplos

MATERIALES Y MÉTODOS PARA EVALUAR LA ACTIVIDAD ANTIOXIDANTE

Cultivos celulares

[0111] Como modelos celulares se han utilizado células Foreskin (fibroblastos de epidermis no diferenciados, CRL

15 2076) y células ARPE-19 (células epiteliales pigmentarias de retina, CRL-2302) que se han obtenido de la American Type Culture Collection. Los cultivos celulares se han mantenido en las condiciones adecuadas de crecimiento: temperatura (37ºC), concentración de CO2 (5%) y humedad (95%) en un incubador especial para esta finalidad. Las células ARPE-19 se mantienen en crecimiento hasta confluencia de 0,3x104 células/cm2 en frascos de cultivo con medio DMEM-F12 (Biological Industries) supplementado con 10% de suero fetal bovino, antibióticos penicilina (100 U/mL) y estreptomicina (100 µg/mL) y glutamina (Biological Industries). Los fibroblastos CRL-2076 se mantienen en crecimiento en frascos de cultivo en medio Dulbecco modificado por Iscove (Biological Industries) supplementado con 10% de suero fetal bovino, antibióticos penicilina (100 U/mL) y estreptomicina (100 µg/mL) y glutamina (Biological Industries). Las células son traspasadas para adherencia al sustrato 24 h a 37ºC desde los frascos de 75 ml a placas de 6, 12 o 96 pocillos para poder realizar el experimento (106 células/mL).

Integración del DHA a las células

[0112] Se añadió el DHA-TG en concentraciones diferentes (0,5-50 µM) partiendo de DHA-TG con una riqueza del 20, 50 y 70% (densidad del aceite 0,92 g/ mL), disolviendo el aceite en etanol para la solución stock (1:100) y preparando las soluciones de trabajo en medio de cultivo acondicionado con suero. Las células se cultivaron con medio suplementado de DHA-TG durante 3 días a 37ºC.

Inducción de estrés oxidativo

35 [0113] Se usaron para estresar oxidativamente a las células diferentes inductores: a) sistema xantina/xantina oxidasa 0,8 mM/10-2 U/mL que cataliza la oxidación de hipoxantina y xantina a ácido úrico, con reducción del O2 a O·-2 y H2O2. b) 2,2’-azobis-(2-amidinopropano) dihidrocloruro (AAPH) 1-100 mM ampliamente usado como iniciador hidrofílico de radicales libres por inducción de la peroxidación lipídica y proteico. El AAPH oxida al DNA, a las proteínas y a los lípidos por acción de los peroxil radicales formados. Además actúa a nivel del sistema de defensa endógeno, ya que inactiva el enzima clave, la SOD, con lo que pierde la capacidad protectora de la CAT y de la GPx.

Generación de especies reactivas del oxígeno (ROS)

45 [0114] El nivel de ROS fue medido en cultivos primarios de fibroblastos humanos de piel CRL-2076 y en células epiteliales de retina ARPE-19 empleando la técnica fluorimétrica usando como sondas fluorescentes dihidrorodamina 123 (DHR123, Molecular Probes) y diacetato de 2,7-diclorofluoresceína (H2DCFDA, Molecular Probes) en un sistema continuo midiendo cada 30 min hasta 180 minutos. En ambos casos se trata de una medición inespecífica de la generación de ROS. Las sondas fluorescentes se añadieron a las células (1x106 células/ mL) a una concentración final de 10 IM. La fluorescencia de las sondas oxidadas (2,7-diclorofluoresceína y rodamina 123) fue medición en un lector de fluorescencia Mithras a una longitud de onda de excitación de 488 nm y una longitud de onda de emisión de 525 nm en function del tiempo. La fluorescencia obtenida se modula con las determinaciones de viabilidad celular por la técnica espectrofotométrica del MTT abajo reseñada.

55 Viabilidad celular

[0115] Para evaluar el efecto citotóxico de las diferentes muestras se han realizado estudios de viabilidad celular. Este método consiste en la adición del reactivo MTT (bromuro de 3-(4,5-dimetiltiazol-2-il)-2,5-difeniltetrazolio, Sigma), soluble en medio acuoso, al medio de incubación. Las células viables metabolizan este compuesto y es convertido en sal de formazán. Esta sal es un compuesto colorimétrico insoluble en medio acuoso, soluble en DMSO y que se puede usar como una medición de la viabilidad celular. El método consiste en la adición de 20 µl por pocillo de una disolución de MTT de 7.5 mg/ml (en exceso). Se incuba durante una hora a 37ºC de forma que las células viables metabolizan el compuesto y produzcan la sal formazán mientras que las no viables no lo metabolizarán. Tras una hora de incubación se precipitan las células y se añaden 100 µl de DMSO, el cual disolverá la sal formazán. Por 65 último se mide la absorbancia a 550 nm en un lector de placas. Los resultados de viabilidad se expresan como porcentaje de densidad óptica con respecto a los controles considerando que estos últimos poseen un 100% de

viabilidad. Se han realizado curvas de viabilidad celular en placas de 96 pocillos sembrando unas 20.000 células por pocillo (tras un análisis del número de células idóneo en función de su ratio de crecimiento) con un volumen aproximado de 200 µl de medio por pocillo. El estudio de la eficiencia del producto se realiza después de la exposición de las células al producto durante 72 h en un intervalo de concentraciones lo suficientemente amplio para

5 determinar el valor de la IC50. Los resultados experimentales se han ajustado a la ecuación de Hill mediante el software Sigma Plot 8.0 para determinar la IC50, definida como la concentración de DHA necesaria para disminuir la viabilidad del cultivo al 50% respecto al control.

Determinación de proteínas

[0116] La determinación se basa en la detección colorimétrica y cuantificación total de las proteínas con una formulación ácida bicinconínica optimizada que permite medir proteínas en muestras diluidas en un rango de concentración de 0.5-20 µg/ml. El método emplea un detector de Cu+1, el cual es reducido por las proteínas en medio alcalino a Cu+2. El producto púrpura de reacción se forma por la quelación de dos moléculas de BCA con el

15 ión cuproso. El complejo soluble en agua absorbe a 562 nm. Mediante una curva de calibración obtenemos una ecuación, obteniendo los resultados expresados en µg/mL de proteínas. El kit comercial empleado es el MicroBCA de Pierce (Nº 23235).

Análisis directo de la generación de ROS

Medición de generación de hidroperóxidos lipídicos

[0117] Se empleó la medición del malonildialdehído (MDA) en lisados celulares como marcador de peroxidación lipídica por espectrofotometría UV-Vis. El MDA y los 4-hidroxialquenals (HAE) son productos derivados de la

25 peroxidación de ácidos grasos poliinsaturados y ésteres relacionados. La medición directa de estos aldehídos constituye un índice conveniente de la peroxidación lipídica. Se empleó un reactivo cromogénico (N-metil-2-fenilindol en acetonitrilo) que reacciona con el MDA a 45ºC utilizando el kit comercial de peroxidación lipídica de Calbiochem (Nº 437634). La condensación de una molécula de MDA con dos moléculas del reactivo cromogénico da un cromóforo estable con máxima absorbancia a 586 nm siendo el límite de detección de 0.1 IM. La inducción se realizo durante 6 h con AAPH 40 mM y 24 horas de latencia. Se lisaron las células (107 células/mL) mediante ciclos de congelación y descongelación en N2 líquido. Se fraccionaron las muestras para medir MDA y proteína. Los resultados se expresaron en IM de MDA/mg de proteínas.

Medición de generación de anión superoxido

35 [0118] La medición directa del anión superóxido se realizó mediante la técnica de Quimioluminiscencia en microplaca mediada por luminol (Calbiochem, Nº 574590). La quimioluminiscencia para la detección del anión superóxido es una técnica empleada debido a su potencial para acceder a todos los sitios intracelulares de generación de superóxido, por la alta especificidad de la reacción con luminol, por la mínima toxicidad intracelular y la sensibilidad incrementada respecto a otras técnicas químicas. Su fundamento es que el anión superóxido oxida al luminol en una reacción que produce fotones de luz que son rápidamente medidos en un luminómetro estándar. En nuestros ensayos empleamos un lector de quimiolumiscencia en microplaca de ELISA, MITHRAS y además, dado la corta vida media del radical, se empleó un enhancer para incrementar la sensibilidad del ensayo y amplificar la respuesta. Debido a que este reactivo no es tóxico y no desnaturaliza los componentes de los sistemas

45 subcelulares, puede ser usado en células vivas. También se investigó la capacidad de inhibir la producción de anión superóxido utilizando un secuestrante específico de anión superóxido, el tirón (ácido 4,5-dihidroxi-1,3-benceno disulfónico, Sigma) empleado frecuentemente para ensayos in vitro de bloqueo en la producción de ROS siendo permeable a la membrana celular y por otra parte, se empleó superóxido dismutasa (SOD, Sigma) como bloqueante enzimático, que constituye una enzima de primera línea en la defensa antioxidante endógena. La medición de quimioluminiscencia en las células sometidas al tratamiento inductor de estrés oxidativo con AAPH se analizó cada 60 segundos durante un tiempo total de medición de 4100 segundos, a una frecuencia de 120 seg/ciclo. Se expresaron los resultados en UA de quimioluminiscencia / mg proteína.

Determinación de la actividad de enzimas antioxidantes

Medición de la actividad glutatión peroxidasa (GPx)

[0119] La GPx cataliza la reducción de hidroperóxidos a glutatión reducido y la función es proteger a la célula del daño oxidativo. Usa glutatión como último donante de electrones para regenerar la forma reducida de la selenocisteína. La medición indirecta de GPx se obtiene por la reacción acoplada con glutatión reductasa. El glutatión oxidado (GSSG) producido por la reacción con los hidroperóxidos por acción de la GPx es reciclado a su estado reducido por la glutation reductasa usando como coenzima el NADPH. La oxidación de NADPH a NADP+ se acompaña de la disminución de su absorbancia a 340 nm. La tasa de disminución de la absorbancia a 340 nm es directamente proporcional a la actividad GPx de la muestra. Para la detección de la GPx en lisados celulares de 65 cultivos primarios se empleó el kit espectrofotométrico en microplaca de ELISA de Cayman (Nº 703102). Se cultivaron las células por adherencia al sustrato 24 h a 37ºC. El lisado celular se obtuvo por sonicación en Tris 50

Medición de la actividad superóxido dismutasa (SOD)

5 [0120] Esta metodología quimioluminiscente se basa en el análisis de la actividad SOD en el sobrenadante celular respecto a un control positivo de SOD (Calbiochem Nº 574590). La presencia de SOD en el sistema xantina oxidasaxantina-luminol provoca una disminución de la quimioluminiscencia producida como consecuencia de la dismutación del anión superóxido proporcional a la actividad SOD. El análisis se realiza en un luminómetro MITHRAS a intervalos de 50 ms hasta un tiempo de reacción final de 520 seg.

[0121] También se ha determinado la actividad superóxido dismutasa (SOD) en lisados celulares mediante la reacción que emplea sales de tetrazolium para la detección de radicales superóxido generados por el sistema xantina oxidasa/hipoxantina. Se emplea un método espectrofotomé-trico en microplaca para medir los 3 tipos de

15 SOD (Cu-Zn-SOD; Mn-SOD y Fe-SOD; es decir citosólica y mitocondrial). Una unidad de SOD se define como la cantidad de enzima requerida para dismutar el 50% del anión superóxido generado. Para detección de SOD en lisados celulares de cultivos primarios se ha usado el kit de Cayman (Nº 706002) siguiendo el protocolo optimizado por el fabricante. El rango dinámico del ensayo es 0.025-0.25 unidades SOD/ml.

Determinación de la concentración de antioxidantes endógenos intracelulares

Medición de la concentración intracelular de glutation reducido (GSH)

[0122] Ensayo cinético directo de medición de glutatión reducido (GSH) en lisados celulares. El glutatión se halla

25 presente dentro de las células principalmente en su forma reducida (90-95% del glutatión total), siendo el principal antioxidante en tejidos. Su función es la detoxificación de xenobióticos y la eliminación de hidroperóxidos para mantener el estado redox celular. La técnica empleada mide glutatión total (GSSG + GSH) en una muestra biológica (lisado celular) previamente desproteinizado con ácido sulfosalicílico (Kit de Sigma-Aldrich CS0260). El GSH causa una reducción continua del ácido 5,5´-ditiobis(2-nitrobenzoico) (DTNB) a 5-tio(2-nitrobenzoico) (TNB) y el GSSG formado es reciclado por la glutatión reductasa y NADPH. El TNB es medido espectrofotométricamente a A de 412 nm. Como inhibidor de la síntesis de GSH se ha utilizado sulfoximina de butionina (BSO) que inhibe específicamente la enzima gamma-glutamilcisteína sintetasa.

EVALUACIÓN DE LA ACTIVIDAD ANTIOXIDANTE DEL DHA EN UN MODELO DE PIEL HUMANO

35 [0123] En el presente estudio in vitro se han utilizado como modelo celular, células Foreskin (fibroblastos de epidermis no diferenciados, ATCC CRL-2076) que constituyen un tipo celular adecuado por su buena respuesta in vitro a diferentes inductores oxidantes, además de ser un cultivo primario con requerimientos nutricionales y condiciones de cultivo normales, y constituye un buen modelo in vitro extrapolable a la respuesta in vivo, para una potencial aplicación cosmética del DHA.

Resultados

[0124] Inicialmente, se han establecido las condiciones necesarias para disponer de un modelo celular activo en

45 todas las condiciones de estudio. Esto quiere decir que los resultados obtenidos hacen referencia a células metabolitamente activas. Estudios previos ya habían demostrado que en células Foreskin concentraciones inferiores a 1000 µM de DHA no afectaban a la viabilidad celular en estudios a 3 días. Tampoco se ve afectada la viabilidad celular durante los estudios de estrés oxidativo con el sistema xantina/xantina oxidasa o con AAPH. También, se ha demostrado que la incorporación de DHA hasta una concentración de 50 µM en un cultivo de células Foreskin durante 3 días no incrementa de manera significativa el nivel oxidativo celular medido como la fluorescencia celular asociada a dos sondas, la dihidrorodamina (DHR 123) y la 2,7-diclorofluoresceína (H2DCFDA), más específica para anión superóxido y para la detección de hidroperóxidos, respectivamente. Una vez establecidas estas condiciones se procedió a evaluar la capacidad antioxidante general del DHA incorporado en la membrana de las células Foreskin frente al estrés oxidativo inducido por xantina/xantina oxidasa o por AAPH.

55 [0125] Al inducir un estrés oxidativo moderado con AAPH 40 mM y usando la DHR123 como detector de ROS, el DHA muestra un efecto inhibidor en la generación de las especies reactivas del oxígeno, tanto a la concentración de 0,5 IM (59% de protección) como a 5 IM (33% de protección), presentando un menor efecto a 10 IM (26% de protección) o nulo a 50 IM de DHA (Fig. 1A). Cuando las células se someten a una inducción severa con AAPH 60 mM, el DHA muestra un efecto protector frente a la generación de ROS, tanto a la concentración 0,5 IM (40% de protección) como a 5 IM (29% de protección) perdiéndolo a concentraciones superiores de DHA (Fig. 1A).

[0126] También podemos destacar la protección que ejerce el DHA 0,5 IM contra el estrés oxidativo inducido por la xantina/xantina oxidasa (Fig. 1B), lo que muestra un efecto secuestrante de las especies reactivas del oxigeno, tanto

65 anión superóxido como hidroperóxidos generados en el proceso oxidativo. Comparando la capacidad antioxidante respecto a un antioxidante lipofílico como es la vitamina E (Fig. 1B), observamos que ejercen una cinética de [0127] El comportamiento en la cinética de protección del DHA presenta siempre un máximo efecto antioxidante entre los 60-120 minutos de efectuada la inducción, denotando una saturación en la capacidad secuestrante de

5 hidroperóxidos y anión superóxido del DHA. El comportamiento antioxidante es dosis dependiente de modo crítico, ya que al aumentar la concentración del mismo pierde la capacidad secuestrante de ROS siendo la concentración de 0,5 IM la más efectiva en su capacidad antioxidante. En este sentido otro parámetro crítico a nivel de optimización de la eficiencia del sistema es la proporción de DHA respecto al total de ácidos grasos. Como se muestra en la Figura 2, a idénticas concentraciones de triglicérido, la disminución de la proporción de DHA a 50 ó 20% reduce de manera drástica la capacidad antioxidante celular, tornándose pro-oxidante a concentraciones bajas o moderadas. Estos resultados parecen indicar que el efecto antioxidante celular del DHA, no depende exclusivamente de la concentración del mismo, sino que también es un factor decisivo su localización molecular en este caso su distribución en la estructura del triglicérido.

15 [0128] En cuanto a la inhibición específica en la producción de ROS se han analizado la generación de peróxidos lipídicos (TBARS) y de aniones superóxido. Los resultados obtenidos indicaron que las células tratadas con AAPH, generaron una mayor concentración de sustancias reactivas al ácido tiobarbitúrico (TBARS) respecto a las células no inducidas, expresado como IM de MDA/mg de proteínas (Fig. 3). Como era de esperar, la incorporación de DHA en la membrana de las células Foreskin incrementa ligeramente de una forma dosis dependiente (0.5, 5 y 50 IM) la peroxidación lipídica basal celular (Fig. 3). En las células sometidas a una inducción oxidativa con AAPH 40 mM, el DHA presenta una actividad antioxidante protegiendo a los fibroblastos de la generación de hidroperóxidos lipídicos de membrana siendo su acción del tipo concentración dependiente inversa. La protección con DHA, fue del 87 % para 0,5 IM DHA; 85 % para 5 IM y 48 % para DHA-TG 50 IM (Fig. 3).

25 [0129] Se analizó posteriormente la generación del anión superóxido. Células Foreskin sometidas a un estrés oxidativo con AAPH 40 mM generaron una producción de anión superóxido 2,5 veces superior a las células no inducidas, que mantuvieron el nivel de anión superóxido constante (Fig. 4). En ausencia de inducción oxidativa, las células con DHA integrado no presentan un nivel superior de anión superóxido intracelular respecto al control (Fig. 4). En condiciones de estrés oxidativo (Fig. 4), el DHA inhibe la generación del anión superóxido en un 16,5% a una concentración de 0,5 μM; en un 10% a una concentración de 5 μM y en un 9% a una concentración de 50 μM. Se confirmó la especificidad del método mediante la adición de Tirón (ácido 4,5-dihidroxi-1,3-benceno disulfónico, compuesto permeable a la membrana celular que opera como secuestrante altamente específico de anión superóxido intracelular) o de SOD extracelular (bloqueante enzimático de primera línea en la defensa antioxidante endógena vía dismutación del anión superóxido intracelular). La producción del anión superóxido en células

35 estresadas con AAPH con o sin DHA previamente integrado en presencia de SOD exógena o de Tirón fue totalmente inhibida obteniéndose unos valores básales (Fig. 4).

[0130] Finalmente se analizó si el DHA ejercía su actividad antioxidante a través de una modificación de la actividad de los enzimas antioxidantes celulares de primera línea. Se analizaron la actividad de la SOD y de la GPx en células Foreskin con o sin DHA integrado. En el primer caso se utilizó el sistema xantina/xantina oxidasa como generador de aniones superóxido instantáneo (tiempo total de medición 520 seg, midiendo cada 50 mseg). De acuerdo con los resultados obtenidos, se logró una buena inducción oxidativa con una cinética rápida observándose directamente la dismutación y no la producción de anión superóxido. Se interpreto como medición indirecta y cualitativa de la actividad SOD el máximo de quimioluminiscencia que se alcanzo a los 15 seg de la inducción oxidativa (Fig. 5A). Sin 45 DHA integrado, se alcanzaron valores de 310 U.A. quimioluminiscencia /106 células, disminuyendo a 150 U.A. quimioluminis-cencia / 106 células en un sistema preincubado con DHA 0,5 μM (52% de protección antioxidante) (Fig. 5A). La eficiencia antioxidante se mantuvo en un 52% y en un 42% de protección en células tratadas con 5 y 50 μM de DHA, respectivamente (Fig. 5A). Además, conociendo que el AAPH, oxida tanto el DNA, las proteínas y los lípidos por difusión de los peroxil radicales generados, el DHA como antioxidante podría impedir la inactivación de la SOD, encargada de la dismutación del anión superóxido, manteniendo en la célula la defensa antioxidante endógena de la catalasa y la glutatión peroxidasa. Este aspecto se ve confirmado en la Figura 5B, donde se puede observar que la actividad SOD no se encuentra incrementada en estado basal en presencia de DHA (-10/-15%), pero que la pérdida de actividad de la SOD inherente al proceso de estrés oxidativo esta inhibido en presencia de DHA manteniendo o incluso incrementando la actividad de la SOD (10/20%). En cuanto a la actividad GPx (Fig. 6),

55 esta se encuentra incrementada en estado basal celular a concentraciones de DHA modestas (hasta un 17% a 5 IM), pero desciende a concentraciones altas (-20% a 50 IM). Este comportamiento se mantiene intacto en estado de estrés oxidativo (Fig. 6). Estos resultados sugieren que el DHA colabora con el sistema de defensa antioxidante endógeno en cuanto a la dismutación del anión superóxido, generando SOD en todo el rango de concentraciones ensayado y también es capaz de controlar la generación de hidroperóxidos a concentraciones moderadas ya que incrementa la actividad GPx.

EVALUACIÓN DE LA ACTIVIDAD ANTIOXIDANTE DEL DHA EN UN MODELO CELULAR DE RETINA

[0131] En el presente estudio in vitro se han utilizado como modelo celular, células ARPE-19 (células epiteliales

65 pigmentarias de retina, ATCC CRL-2302) que constituyen un tipo celular adecuado por su buena respuesta in vitro a diferentes inductores oxidantes, además de ser un cultivo primario con requerimientos nutricionales y condiciones de

Resultados

5 [0132] El estudio realizado con esta línea celular es análogo al descrito para las células Foreskin en el apartado anterior. Los requerimientos básicos han sido los mismos con respecto al mantenimiento de la viabilidad celular en todas las condiciones de trabajo (efecto del DHA, del estrés oxidativo). La incorporación del DHA en las dosis analizadas tampoco ha supuesto una alteración significativa en el estado oxidativo celular basal.

[0133] Al inducir un estrés oxidativo moderado con AAPH 40 mM y usando la DHR123 como detector de ROS, el DHA muestra un efecto inhibidor en la generación de las especies reactivas del oxígeno, tanto a la concentración de 0,5 IM (43% de protección) como a 5 IM (32% de protección), presentando un menor efecto a 50 IM (4% de protección) de DHA (Fig. 7A). Cuando las células se someten a una inducción severa con AAPH 60 mM, el DHA

15 muestra un efecto protector frente a la generación de ROS, tanto a la concentración 0,5 IM (13% de protección) y menor a concentraciones superiores de DHA (Fig. 7A). Estos resultados son similares a los obtenidos con las células Foreskin, aunque cabe destacar como aspecto diferencial la menor protección observada frente a una inducción oxidativa severa. Utilizando para la detección de ROS la CDCFDA más específica de peróxidos, también se pone de manifiesto la protección que ejerce el DHA contra el estrés oxidativo inducido por AAPH (Fig. 7B).

[0134] También la cinética de protección del DHA presenta siempre un máximo efecto antioxidante entre los 60-120 minutos de efectuada la inducción, denotando una saturación en la capacidad secuestrante de hidroperóxidos y anión superóxido del DHA. Cuantitativamente, la capacidad antioxidante es dosis dependiente de modo crítico, ya que al aumentar la concentración del mismo pierde la capacidad secuestrante de ROS siendo la concentración de

25 0,5 IM la más efectiva en su capacidad antioxidante (Fig. 7A y 7B). En este sentido otro parámetro crítico a nivel de optimización de la eficiencia del sistema es la proporción de DHA respecto al total de ácidos grasos. La disminución de la proporción de DHA respecto al total de ácidos grasos del 70% al 50-20% reduce de manera importante y no proporcional su capacidad antioxidante celular a las concentraciones óptimas (0,5-5 IM), igualándose a concentraciones elevadas (Fig. 8A y 8B), pero a diferencia de las células Foreskin en ninguna proporción se torna el DHA pro-oxidante. Estos resultados confirman que el efecto antioxidante celular del DHA, no depende exclusivamente de la concentración del mismo, sino que también es un factor decisivo su localización molecular en este caso su distribución en la estructura del triglicérido.

[0135] En cuanto a la inhibición específica en la producción de ROS se han analizado la generación de peróxidos

35 lipídicos (TBARS) (Fig. 9) y de aniones superóxido (Fig. 10). Los resultados obtenidos son muy similares a los obtenidos con las células Foreskin. Las células tratadas con AAPH, generan una mayor concentración de sustancias reactivas al ácido tiobarbitúrico (TBARS) y de aniones superóxido respecto a las células no inducidas. La incorporación de DHA en la membrana de las células ARPE-19 incrementa ligeramente de una forma dosis dependiente (0.5, 5 y 50 IM) la peroxidación lipídica basal celular, pero en las células sometidas a una inducción oxidativa, el DHA presenta una actividad antioxidante celular inhibiéndolas de la generación de hidroperóxidos lipídicos de membrana con una relación inversa a su concentración. La protección con DHA, fue del 64 % para 0,5 IM DHA; 58 % para 5 IM y 42 % para DHA50 IM (Fig. 9). Se analizó posteriormente la generación del anión superóxido. En ausencia de inducción oxidativa, las células con DHA integrado no presentan un nivel superior de anión superóxido intracelular respecto al control (Fig. 10A). Un estrés oxidativo con AAPH 40 mM genera una

45 producción de anión superóxido que es inhibido parcialmente por el DHA (20-16% a concentraciones de 0,5- 50 μM). Esta inhibición esta de acuerdo con la actividad SOD en presencia de DHA (Fig. 10B). La actividad SOD no se encuentra incrementada en estado basal en presencia de DHA (-10/-15%), pero al igual que en las células Foreskin, la pérdida de actividad de la SOD inherente al proceso de estrés oxidativo esta inhibido en presencia de DHA manteniendo la actividad de la SOD basal.

[0136] Finalmente se analizó si el DHA alteraba la actividad del enzima GPx como antioxidante celular de primera línea (Fig. 11). La actividad GPx se encuentra incrementada en estado basal celular a todas las concentraciones de DHA ensayadas (12-40%) y este comportamiento se mantiene intacto en estado de inducción oxidativa que además presenta una actividad GPx 2,5 veces superior (Fig. 11). Al igual que en las células Foreskin, estos resultados

55 sugieren que el DHA ejerce parte de su efecto antioxidante modulando la actividad del sistema enzimático de defensa antioxidante endógeno celular.

INFLUENCIA DEL MÉTODO DE SINTÉSIS EN LA ACTIVIDAD ANTIOXIDANTE DEL DHA INCORPORADO EN

UN TRIGLICERIDO

[0137] En el presente estudio in vitro se han utilizado como modelos celulares, células ARPE-19 (células epiteliales pigmentarias de retina, ATCC CRL-2302) y células Foreskin (fibroblastos de epidermis no diferenciados, ATCC CRL2076) que constituyen líneas celulares adecuadas por su buena respuesta in vitro a diferentes inductores oxidantes. Como principio activo se han utilizado triglicéridos de aceite de atún (DHA20%-TG, 20% molar en DHA) o derivados

65 de de un aceite enriquecido al 50 o al 70% molar en DHA (DHA 50%-TG y DHA70%-TG) obtenidos por métodos químicos (CHEM) o enzimáticos (ENZ).

[0138] Al inducir un estrés oxidativo moderado con AAPH 40 mM en células ARPE-19 y usando DHR123 o

5 H2DCFDA como detectores intracelulares de ROS, el DHA natural (DHA20%-TG) y el incorporado en un triglicérido obtenido químicamente (DHA50%-TG-CHEM y DHA70%-TG-CHEM) muestra un efecto inhibidor en la generación de las especies reactivas del oxígeno, tanto a la concentración de 0,5 IM como a 5 IM, presentando un menor efecto a 50 IM de DHA (Fig. 13A). Este efecto es dependiente del contenido en DHA siendo DHA70%-TG-CHEM gt; DHA50%-TG-CHEM gt; DHA20%-TG (Fig. 13A). A las mismas concentraciones (0,5, 5 y 50 µM), aceites obtenidos enzimáticamente muestran una actividad superior a todos los contenidos en DHA (DHA70%-TG-ENZ y DHA50%-TG-ENZ) (Fig. 13B). En un estudio análogo con células Foreskin se obtienen resultados más sorprendentes. La actividad pro-oxidante observada con DHA70%-TG-CHEM y DHA50%-TG-CHEM a altas dosis (Fig. 13C) se torna anti-oxidante a todas las concentraciones con aceites de origen enzimático (DHA70%-TG-ENZ y DHA50%-TG-ENZ) (Fig. 13D). La eliminación de los polímeros intrínsecos de los aceites obtenidos químicamente mediante métodos

15 cromatográficos (DHA70%-TG-BPM) provoca una disminución aún mayor de la actividad anti-oxidante en células ARPE-19, tornándose pro-oxidante a altas concentraciones (5 y 50 µM) (Fig. 14). La actividad anti-oxidante del DHA incorporado en un triglicérido obtenido por síntesis enzimática también resulta superior (como mínimo del doble) a la mostrada por el DHA incorporado en otras estructuras químicas como esteres etílicos, ácido graso libre o ácido graso unido a albúmina sérica (Fig. 15).

[0139] La actividad anti-oxidante celular demostrada con la incorporación de DHA esta relacionada con todos los aspectos relacionados anteriormente como el mantenimiento de las actividades enzimáticas de la SOD y de la GPx, pero además con el incremento de la concentración intracelular de glutation (GSH). En células ARPE-19 (Fig. 16), el DHA induce un aumento de la concentración intracelular de GSH directamente relacionada con la síntesi de novo de

25 GSH ya que la adición de BSO (inhibidor específico de la síntesis de GSH) elimina el efecto protector del DHA (Fig. 17) en relación directa con el decremento de la concentración intracelular de GSH (Fig. 15). Un comportamiento análogo se ha observado en células Foreskin (Fig. 18).

[0140] La mejora obtenida en la actividad anti-oxidante del DHA mediante una síntesis enzimática también es aplicable a otro ácido graso omega-3 como el ácido ecosapentaenoico (EPA). En un estudio con células ARPE-19 se demuestra que el EPA obtenido enzimáticamente (EPA70%-TG-ENZ) muestra una actividad anti-oxidante, aunque muy inferior a la observada con DHA (DHA70%-TG-ENZ), mientras que un EPA obtenido químicamente y libre de polímeros (EPA70%-TG-BPM) se muestra muy pro-oxidante (Fig. 19). Además el EPA (EPA70%-TG-ENZ) obtenido enzimáticamente muestra en células Foreskin una notable actividad anti-oxidante incluso superior al DHA

35 (DHA70%-TG-ENZ) (Fig. 20), relacionada al igual que en el caso del DHA con el aumento de la concentración intracelular de GSH (Fig. 21).

EVALUACIÓN DE LA ACTIVIDAD ANTIOXIDANTE DEL DHA INCORPORADO EN UN TRIGLICERIDO ESTRUCTURADO EN UN MODELO CELULAR DE RETINA

[0141] En el presente estudio in vitro se han utilizado como modelo celular, células ARPE-19 (células epiteliales pigmentarias de retina, ATCC CRL-2302) que constituyen un tipo celular adecuado por su buena respuesta in vitro a diferentes inductores oxidantes, además de ser un cultivo primario con requerimientos nutricionales y condiciones de cultivo normales. Además, constituye un buen modelo ocular ya que conserva las propiedades biológicas y

45 funcionales de las células epiteliales pigmentarias de retina. Como principio activo se han utilizado triglicéridos estructurados derivados de aceite de atún (DHA20%-TG, 20% molar en DHA) o de un aceite enriquecido al 70% en DHA (DHA70%-TG, 70% molar en DHA), en los cuales mediante métodos enzimáticos se les ha sustituido los ácidos grasos de las posiciones sn-1 y sn-3 por ácido octanoico. En estos nuevos compuestos el contenido molar en DHA es del 7% en el DHA20%-TG y del 22% en el DHA70%-TG.

Resultados (Véase figura 22)

[0142] Al inducir un estrés oxidativo moderado con AAPH 40 mM y usando la DHR123 como detector de ROS, el DHA incorporado en un triglicérido normal (DHA20%-TG y DHA70%-TG) muestra un efecto inhibidor en la

55 generación de las especies reactivas del oxígeno, tanto a la concentración de 0,5 IM como a 5 IM, presentando un menor efecto a 50 IM de DHA (Fig. 22). Este efecto es dependiente del contenido en DHA siendo DHA70%-TG gt; DHA20%-TG. A las mismas concentraciones los aceites estructurados, con una concentración real de DHA 2-3 veces inferior, muestran una actividad igual (para la concentración de 0.5 µM) o superior (para las concentraciones de 5 y 50 µM) en el caso del DHA20%-TG. En el caso del DHA70%-TG, la eficacia del triglicérido estructurado es ligeramente inferior a las concentraciones óptimas (0.5 y 5 µM), pero se invierte el comportamiento a altas concentraciones (50 µM) mostrando globalmente un comportamiento más estable y menos dependiente de la dosis.

EVALUACIÓN DE LA ACTIVIDAD DEL DHA COMO PROTECTOR DE LA LONGITUD DEL TELÓMERO ASOCIADO A LA EDAD EN UN MODELO DE PIEL HUMANO

65 [0143] En el presente estudio in vitro se han utilizado como modelo celular, células Foreskin (fibroblastos de epidermis no diferenciados, ATCC CRL-2076) que constituyen un tipo celular adecuado por su buena respuesta in vitro a diferentes inductores oxidantes, además de ser un cultivo primario con requerimientos nutricionales y condiciones de cultivo normales, y constituye un buen modelo in vitro extrapolable a la respuesta in vivo, para una potencial aplicación cosmética del DHA.

Metodología

Cultivos celulares

10 [0144] Como modelos celulares se han utilizado células Foreskin (fibroblastos de epidermis no diferenciados, CRL2076) que se han obtenido de la American Type Culture Collection. Los cultivos celulares se han mantenido en las condiciones adecuadas de crecimiento: temperatura (37ºC), concentración de CO2 (5%) y humedad (95%) en un incubador especial para esta finalidad. Los fibroblastos CRL-2076 se mantienen en crecimiento en frascos de cultivo en medio Dulbecco modificado por Iscove (Biological Industries) suplementado con 10% de suero fetal bovino,

15 antibióticos penicilina (100 U/mL) y estreptomicina (100 µg/mL) y glutamina (Biological Industries).

Integración del DHA a las células

[0145] Se añadió el DHA-TG 70% sintetizado enzimáticamente a una concentración de 0,5 µM, disolviendo el aceite

20 en etanol para la solución stock (1:100) y preparando las soluciones de trabajo en medio de cultivo acondicionado con suero. Las células se cultivaron con medio suplementado de DHA-TG durante 3 días a 37ºC.

Inducción de estrés oxidativo

25 [0146] Se usó para estresar oxidativamente a las células el compuesto 2,2’-azobis-(2-amidinopropano) dihidrocloruro (AAPH) a una concentración de 40 mM ampliamente usado como iniciador hidrofílico de radicales libres por inducción de la peroxidación lipídica y proteica. El AAPH oxida al DNA, a las proteínas y a los lípidos por acción de los radicales peroxil formados. Además actúa a nivel del sistema de defensa endógeno, ya que inactiva el enzima clave, la SOD, con lo que pierde la capacidad protectora de la CAT y de la GPx.

Medición de la longitud del telómero

[0147] Las regiones teloméricas constituidas por ADN altamente repetitivo pueden evaluarse mediante técnicas de hibridación in situ. El método de hibridación in situ con fluorescencia (FISH) empleando sondas complementarias a 35 las secuencias teloméricas permitió detectar la presencia o ausencia de telómeros, así como cuantificar los mismos por célula y por grupo cromosómico. El método denominado flow FISH utiliza la citometría de flujo combinada con la técnica de FISH empleando como sonda un PNA (peptide nucleic acid) pan-telomérico y que permite medir, mediante intensidades de fluorescencia, las longitudes teloméricas promedio de los extremos cromosómicos en células individuales. Para nuestro objetivo, se analizó la intensidad de fluorescencia de los PAN marcados de

40 cromosomas en metafase. Los resultados se expresan como unidades de fluorescencia telomérica (TFU) con cada TFU correspondiente a 1 kb de telómeros repetidos.

Resultados

45 [0148] Los cambios en la longitud media de los telómeros en fibroblastos humanos cultivados bajo estrés oxidativo con o sin DHA incorporado se analizaron por flow-FISH (Figura 23). Se utilizó una regresión lineal para analizar la relación entre la longitud de los telómeros y el número de pases de las poblaciones celulares. Para todos los cultivos analizados, las pendientes de las regresiones se pueden interpretar directamente como índices de acortamiento de los telómeros. En fibroblastos humanos, el tratamiento con AAPH, que induce un exceso de radicales libres

50 intracelulares, acelera perceptiblemente el índice de acortamiento de los telómeros. En cambio, la incorporación de DHA a una concentración de 0,5 µM, que se ha demostrado que incrementa las defensas antioxidantes celulares, reduce dicho índice al 50% de su valor sin DHA. Además, la incorporación de DHA es capaz de reducir el índice de acortamiento de los telómeros, incluso respecto al control normal de fibroblastos.

55 - .

Claims

REIVINDICACIONES

1.- Utilización del ácido docosahexaenoico, que se incorpora específicamente en por lo menos una posición de un 5 glicerol a través de un enlace éster, para la preparación de una composición farmacéutica, caracterizada porque dicho ácido docosahexaenoico

-

se encuentra en un porcentaje en peso entre el 40 y el 100% con respecto al total de ácidos grasos; o

-

está incorporado en una posición sn-2, para el tratamiento de una patología asociada con el daño celular oxidativo,

10 en la que dicha patología asociada con el daño celular oxidativo es una patología neurodegenerativa, una patología ocular, una patología isquémica, o aterosclerosis.
2.- Utilización, según la reivindicación 1, caracterizada porque dicho ácido docosahexaenoico se encuentra en un porcentaje en peso entre el 66 y el 100% con respecto al total de ácidos grasos.

15 3.- Utilización, según la reivindicación 1, caracterizada porque dicho ácido docosahexaenoico está incorporado en un monoglicérido, diglicérido o triglicérido.
4.- Utilización, según la reivindicación 1, caracterizada porque dicho ácido docosahexaenoico está incorporado en 20 un triglicérido.
5.- Utilización, según la reivindicación 1, en la que dicho glicerol comprende además por lo menos un ácido graso.
6.- Utilización, según la reivindicación 5, en la que dicho glicerol comprende además por lo menos un ácido 25 seleccionado entre un ácido graso de cadena corta y/o de cadena media.
7.- Utilización, según la reivindicación 6, en la que dicho ácido graso de cadena corta es un ácido graso C1-C8.
8.- Utilización, según la reivindicación 6, en la que dicho ácido graso de cadena media es un ácido graso C9-C14.

30 9.- Utilización, según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, caracterizada porque dicha composición farmacéutica incluye además otro principio activo.
10.- Utilización, según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en la que dicha patología neurodegenerativa es 35 una del grupo que comprende esclerosis múltiple, enfermedad de Alzheimer, enfermedad de Parkinson, esclerosis lateral amiotrófica y distrofia muscular.
11.- Utilización, según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en la que dicha patología ocular es una del grupo que comprende retinosis pigmentaria, degeneración macular, y cataratas.

40 12.- Utilización, según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en la que dicha patología isquémica es un infarto de miocardio o infarto cerebral.
13.- Utilización del ácido docosahexaenoico, que se incorpora específicamente en por lo menos una posición de un 45 glicerol a través de un enlace éster, para la preparación de un nutracéutico, caracterizada porque dicho ácido docosahexaenoico

-

se encuentra en un porcentaje en peso entre el 40 y el 100% con respecto al total de ácidos grasos; o

-

está incorporado en una posición sn-2, para el tratamiento de una patología asociada con el daño celular oxidativo,

50 en la que dicha patología asociada con el daño celular oxidativo es una patología neurodegenerativa, una patología ocular, una patología isquémica, o aterosclerosis.
14.- Utilización según la reivindicación 13, caracterizada porque dicho nutracéutico es un producto lácteo.

FIGURA 1B FIGURA 2A

NO INDUCIDAS

INDUCIDAS

3,50 3,00

uM MDA/ m g pro

2,50

1,00 0,50 0,00

Tiempo (seg)

NO INDUCIDAS INDUCIDAS

CONTROL DHA

DHA

DHA

NO INDUCIDAS INDUCIDAS

CONTROL

DHA 0.5

DHA 5

DHA 50

NO INDUCIDAS

INDUCIDAS

6,000 5,000

uM MDA /mg prot

4,000

2,000 1,000 0,000

FIGURA 11

NO INDUCIDAS INDUCIDAS

CONTROL

DHA 0.5

DHA 5

DHA 50

NO INDUCIDAS INDUCIDAS

CONTROL

DHA 0.5

DHA 5

DHA 50

CÉLULAS FORESKIN CÉLULAS ARPE-19

DHA70%-TG DHA50%-TG DHA20%-TG DHA20%-TG DHA50%-TG DHA70%-TG

%PROTECCIÓN

DHA50%-TG-ENZ DHA50%-TG-QUIM DHA50%-TG-BPM

% PROTECCIÓN

0,5 µM 5 µM

[DHA]

% INCREMENTO [GSH]

CONTROL 0,5 µM DHA 5 µM DHA 50 µM DHA

% PROTECCIÓN

0,5 µM DHA 5 µM DHA 50 µMDHA [ÁCIDO GRASO]

% INCREMENTO [GSH]

CONTROL 0,5 µM DHA 5 µM DHA 50 µM DHA

%PROTECCIÓN

DHA70%-TG-ENZ EPA70%-TG-ENZ EPA 50%-TG-BMP [ÁCIDO GRASO]

DHA70%-TG-ENZ EPA70%-TG-ENZ [ÁCIDO GRASO]

% INCREMENTO [GSH]

CONTROL 0,5 µM EPA 5 µM EPA

% PROTECCIÓN

(aceite de pescado) [DHA] �M

TIEMPO DEL UMBRAL VENTILATORIO 2

COMP NO COMP TOTAL

CAPACIDAD ANTIOXIDANTE TOTAL DEL PLASMA DAÑO OXIDATIVO A LÍPIDOS PLASMÁTICOS DAÑO OXIDATIVO AL ADN