KR101256448B1 - 세포의 산화적 손상과 연관된 병리상태를 치료하기 위한ｄｈａ, ｅｐａ 또는 ｄｈａ 유래의 ｅｐａ의 용도 - Google Patents

세포의 산화적 손상과 연관된 병리상태를 치료하기 위한ｄｈａ, ｅｐａ 또는 ｄｈａ 유래의 ｅｐａ의 용도 Download PDF

Info

Publication number
KR101256448B1
KR101256448B1 KR1020087017876A KR20087017876A KR101256448B1 KR 101256448 B1 KR101256448 B1 KR 101256448B1 KR 1020087017876 A KR1020087017876 A KR 1020087017876A KR 20087017876 A KR20087017876 A KR 20087017876A KR 101256448 B1 KR101256448 B1 KR 101256448B1
Authority
KR
South Korea
Prior art keywords
dha
epa
derived
incorporated
glycerides
Prior art date
Application number
KR1020087017876A
Other languages
English (en)
Other versions
KR20080081334A (ko
Inventor
페드롤 후안 카를 도밍고
가르시아 호세 안토니오 빌레가스
Original Assignee
브루디 테크놀로지 에스엘
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Family has litigation
First worldwide family litigation filed litigation Critical https://patents.darts-ip.com/?family=37728386&utm_source=google_patent&utm_medium=platform_link&utm_campaign=public_patent_search&patent=KR101256448(B1) "Global patent litigation dataset” by Darts-ip is licensed under a Creative Commons Attribution 4.0 International License.
Priority claimed from ES200503202A external-priority patent/ES2277557B1/es
Application filed by 브루디 테크놀로지 에스엘 filed Critical 브루디 테크놀로지 에스엘
Publication of KR20080081334A publication Critical patent/KR20080081334A/ko
Application granted granted Critical
Publication of KR101256448B1 publication Critical patent/KR101256448B1/ko

Links

Images

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/185—Acids; Anhydrides, halides or salts thereof, e.g. sulfur acids, imidic, hydrazonic or hydroximic acids
    • A61K31/19—Carboxylic acids, e.g. valproic acid
    • A61K31/20—Carboxylic acids, e.g. valproic acid having a carboxyl group bound to a chain of seven or more carbon atoms, e.g. stearic, palmitic, arachidic acids
    • A61K31/202—Carboxylic acids, e.g. valproic acid having a carboxyl group bound to a chain of seven or more carbon atoms, e.g. stearic, palmitic, arachidic acids having three or more double bonds, e.g. linolenic
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K8/00—Cosmetics or similar toiletry preparations
    • A61K8/18—Cosmetics or similar toiletry preparations characterised by the composition
    • A61K8/30—Cosmetics or similar toiletry preparations characterised by the composition containing organic compounds
    • A61K8/33—Cosmetics or similar toiletry preparations characterised by the composition containing organic compounds containing oxygen
    • A61K8/36—Carboxylic acids; Salts or anhydrides thereof
    • A61K8/361—Carboxylic acids having more than seven carbon atoms in an unbroken chain; Salts or anhydrides thereof
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A23—FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
    • A23L—FOODS, FOODSTUFFS, OR NON-ALCOHOLIC BEVERAGES, NOT COVERED BY SUBCLASSES A21D OR A23B-A23J; THEIR PREPARATION OR TREATMENT, e.g. COOKING, MODIFICATION OF NUTRITIVE QUALITIES, PHYSICAL TREATMENT; PRESERVATION OF FOODS OR FOODSTUFFS, IN GENERAL
    • A23L33/00—Modifying nutritive qualities of foods; Dietetic products; Preparation or treatment thereof
    • A23L33/10—Modifying nutritive qualities of foods; Dietetic products; Preparation or treatment thereof using additives
    • A23L33/115—Fatty acids or derivatives thereof; Fats or oils
    • A23L33/12—Fatty acids or derivatives thereof
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/06—Organic compounds, e.g. natural or synthetic hydrocarbons, polyolefins, mineral oil, petrolatum or ozokerite
    • A61K47/24—Organic compounds, e.g. natural or synthetic hydrocarbons, polyolefins, mineral oil, petrolatum or ozokerite containing atoms other than carbon, hydrogen, oxygen, halogen, nitrogen or sulfur, e.g. cyclomethicone or phospholipids
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P13/00—Drugs for disorders of the urinary system
    • A61P13/12—Drugs for disorders of the urinary system of the kidneys
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P19/00—Drugs for skeletal disorders
    • A61P19/02—Drugs for skeletal disorders for joint disorders, e.g. arthritis, arthrosis
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P21/00—Drugs for disorders of the muscular or neuromuscular system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P21/00—Drugs for disorders of the muscular or neuromuscular system
    • A61P21/02—Muscle relaxants, e.g. for tetanus or cramps
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A61P25/14—Drugs for disorders of the nervous system for treating abnormal movements, e.g. chorea, dyskinesia
    • A61P25/16—Anti-Parkinson drugs
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A61P25/28—Drugs for disorders of the nervous system for treating neurodegenerative disorders of the central nervous system, e.g. nootropic agents, cognition enhancers, drugs for treating Alzheimer's disease or other forms of dementia
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P27/00—Drugs for disorders of the senses
    • A61P27/02—Ophthalmic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P27/00—Drugs for disorders of the senses
    • A61P27/02—Ophthalmic agents
    • A61P27/12—Ophthalmic agents for cataracts
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P29/00—Non-central analgesic, antipyretic or antiinflammatory agents, e.g. antirheumatic agents; Non-steroidal antiinflammatory drugs [NSAID]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P39/00—General protective or antinoxious agents
    • A61P39/06—Free radical scavengers or antioxidants
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
    • A61P9/02—Non-specific cardiovascular stimulants, e.g. drugs for syncope, antihypotensives
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
    • A61P9/10—Drugs for disorders of the cardiovascular system for treating ischaemic or atherosclerotic diseases, e.g. antianginal drugs, coronary vasodilators, drugs for myocardial infarction, retinopathy, cerebrovascula insufficiency, renal arteriosclerosis
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61Q—SPECIFIC USE OF COSMETICS OR SIMILAR TOILETRY PREPARATIONS
    • A61Q19/00—Preparations for care of the skin
    • A61Q19/08—Anti-ageing preparations
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A23—FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
    • A23V—INDEXING SCHEME RELATING TO FOODS, FOODSTUFFS OR NON-ALCOHOLIC BEVERAGES AND LACTIC OR PROPIONIC ACID BACTERIA USED IN FOODSTUFFS OR FOOD PREPARATION
    • A23V2002/00—Food compositions, function of food ingredients or processes for food or foodstuffs
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/06—Organic compounds, e.g. natural or synthetic hydrocarbons, polyolefins, mineral oil, petrolatum or ozokerite
    • A61K47/08—Organic compounds, e.g. natural or synthetic hydrocarbons, polyolefins, mineral oil, petrolatum or ozokerite containing oxygen, e.g. ethers, acetals, ketones, quinones, aldehydes, peroxides
    • A61K47/12—Carboxylic acids; Salts or anhydrides thereof

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Neurology (AREA)
  • Neurosurgery (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Cardiology (AREA)
  • Heart & Thoracic Surgery (AREA)
  • Orthopedic Medicine & Surgery (AREA)
  • Oil, Petroleum & Natural Gas (AREA)
  • Physical Education & Sports Medicine (AREA)
  • Ophthalmology & Optometry (AREA)
  • Emergency Medicine (AREA)
  • Birds (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Polymers & Plastics (AREA)
  • Dermatology (AREA)
  • Pain & Pain Management (AREA)
  • Gerontology & Geriatric Medicine (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Rheumatology (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Nutrition Science (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Hospice & Palliative Care (AREA)
  • Vascular Medicine (AREA)

Abstract

본 발명은 산화적 손상과 연관된 과정을 치료하기 위한 약물을 제조하기 위한 도코사헥사엔산(DHA) 또는 에이코사펜타엔산(EPA) 또는 DHA 유래의 EPA가 농축된 산의 용도에 관한 것이다. 특히, 본 발명은 신경퇴행성 병리상태, 안구 병리상태, 허혈성 병리상태, 염증 병리상태, 아테롬성 동맥경화증, DNA에 대한 산화적 손상 및 신체적 운동과 연관된 과정을 치료하기 위함이다.
도코사헥사엔산, 에이코사펜타엔산, DHA 유래의 EPA, 산화적 손상, 항산화 효과

Description

세포의 산화적 손상과 연관된 병리상태를 치료하기 위한 ＤＨＡ, ＥＰＡ 또는 ＤＨＡ 유래의 ＥＰＡ의 용도{Use of DHA, EPA or DHA-derived EPA for treating a pathology associated with cellular oxidative damage}
본 발명은 산화적 손상과 연관된 과정을 치료하기 위한 약물의 제조를 위한 도코사헥사엔산(DHA) 또는 에이코사펜타엔산(EPA) 또는 DHA 유래의 EPA가 농축된 산의 용도에 관한 것이다.
오메가-3 지방산은 세포의 기능적 온전성을 위해 필수적이며 일반적으로 사람 건강을 위해 필수적이다. 어유 및 해조류의 중요한 오메가-3 성분인 도코사헥사엔산 (22:6 n-3, DHA)은 뇌, 광수용체 및 망막의 시냅스 속에 농축되어 있다. DHA-농축된 식이는 초기에 간에 의해 대사되며 이후에는 혈중 지단백질을 통해 분포되어 각종 기관의 요구를 충족시킨다. DHA의 투여는 조직 수준에서 이의 농도를 증가시켜, 대사적으로 연관된 오메가-3 에이코사펜타엔산 (EPA)의 농도의 증가를 또한 유도하는 반면에, EPA의 투여는 세포 수준에서 오직 이의 농도만을 증가시켜 DHA의 농도를 감소시킨다.
일반적으로, DHA는 세포 막의 인지질 내로 혼입되며, 이의 조성 및 기능성, 반응성 산소 종(ROS)의 생성, 막 지질 산화, 전사 조절, 에이코사노이드의 생합성 및 세포내 신호전달(signal transduction)에 효과를 미친다. 게다가, 중추신경계에서, DHA는 기억과 관련된 학습 능력의 발달, 막의 흥분 기능, 광수용체 세포의 생물발생 및 퀴나제 단백질에 의존적인 신호의 전달에 관여한다. 잠재적 식이 요법은 염증성 병리상태, 종양 과정, 심혈관 질환, 우울증 및 신경계 장애와 같은 특정 병리상태가 발생하거나 진행하는 것을 예방하기 위해 오메가-3 지방산의 최적 수준을 교정하는 것에 기초할 수 있다.
중추신경계에서, 뇌와 망막 둘다는 매우 장기간 지속된 오메가-3 지방산의 식이적 결핍의 상황하에서도 DHA를 보유하는 비정상적 기능을 나타낸다. 몇몇 연구는 뉴론에 대한 DHA의 보호 효과를 기술한 바 있으며, 이러한 보호 효과는 매우 고 수준으로 존재함을 기술하였다. 예를 들면, 이는 아폽토시스(apoptosis)에 의한 사멸로부터 신경세포를 보호하는데 관여한다. 최근에는, 고령의 랫트의 해마에서 감소된 양으로 발견되는 DHA는 글루타메이트에 의해 유도된 세포독성에 대해 상기 세포의 1차 배양물을 보호할 수 있는 것으로 나타났다.
망막의 광수용체에서, DHA는 또한 Bcl-2 계열의 프로-아폽토시스 및 안티-아폽토시스 단백질의 수준을 조절하는 것으로도 나타났다. 망막 광수용체의 외부 절편은 로돕신을 함유할 뿐만 아니라 다른 임의의 세포 유형보다 높은 DHA 함량을 함유한다. DHA는 광수용체 절편 원반의 외막의 인지질에 농축되어 있다. 망막 기능부전은 최적의 DHA 농도가 감소된 조건하에 관찰되었다. 망막 색소성 상피세포(RPE)는 DHA 흡수, 보존 및 수송에서 매우 활발한 역할을 한다. 광수용체 및 RPE 세포 중의 높은 DHA 함량은 수용체, 이온성 채널, 운반체 등의 조절에 기여하는 물리적 특성을 갖는 막 내의 도메인과 주로 연관되는 한편, 또한 포스파티딜세린의 농도를 조절하는 것으로 보인다.
현재까지 이러한 효과들은 전적으로 DHA 자체 또는 대사성 유도체에 의해 매개되는 것으로 공지되어 있지 않다. DHA의 특정 유도체가 망막에서 동정되었다. 상기 유도체의 합성에 관여하는 효소가 정확히 동정되지는 않았지만, 몇몇 최근의 결과들은 A2 포스포리파제(PLA2)의 참여 다음에 리폭시게나제(LOX)가 참여함을 제시한다. PLA2는 막 인지질로부터 DHA를 방출하고 LOX는 이를 이의 대사적 활성 유도체로 전환시킨다.
반응성 산소 종(ROS)은 정상적 세포 기능 동안에 생성된다. ROS는 슈퍼옥사이드 음이온, 과산화수소 및 옥시드릴 라디칼을 포함한다. 이의 높은 화학적 반응성은 단백질, DNA 또는 지질의 산화를 유도한다. 슈퍼옥사이드 디스뮤타제(SOD), 카탈라제(CAT) 및 글루타티온 퍼옥시다제(GPx)는 ROS의 존재에 의해 유발되는 분자성 및 세포성 손상으로부터 보호하는 주요 항산화 효소이다. 산화적 스트레스는 많은 대사성 채널을 활성화시키고; 일부는 세포보호성인 반면에 다른 것은 세포의 사멸을 유도한다. 최근의 연구는 ROS 생산과 분해 간의 불균형이 많은 질환의 발병기전에서 중요한 위험 인자이며, 일부 경우에 항산화 시스템의 악화와 관련됨을 나타낸다.
DHA는 광수용체의 세포 및 RPE에 대한 손상을 유발하는 ROS의 표적으로서 제시된다. 빛에 의해 유도된 망막 퇴행은 광수용체에서의 DHA의 상실을 촉진한다. 예를 들면, RPE 세포가 손상되거나 사멸되는 경우에 광수용체 기능이 손상되는데, 그 이유는 RPE 세포가 광수용체의 생존에 필수적이기 때문이다. 따라서, 산화적 스트레스의 효과하에 RPE 세포의 사멸은, 특히 황반의 세포가 영향을 받았을 때, 시력의 악화를 유도하는데, 그 이유는 황반의 세포가 시각적 예민함을 책임지고 있기 때문이다. 많은 망막 퇴행(예를 들면, 연령 및 스타르가르트 병과 관련된 황반 퇴행)의 병리상태에는 RPE 세포 아폽토시스를 유도하는 산화적 스트레스가 관여한다. 게다가, RPE 세포 아폽토시스는 연령에 따라 관찰되는 황반 퇴행에서의 주된 인자인 것으로 보인다. 이러한 연구는 상기 세포가 이의 높은 DHA 함량으로부터 자체를 보호하는 고도로 효과적인 항산화 기작을 전개하며 주목할만한 적응 기능을 나타냄을 시사한다.
또한, 유리 라디칼과 노화 간의 관련성은 산소호흡 동안 생성된 유리 라디칼이 산화적 손상(이는 축적되어 항상성 기작의 점진적 손실, 유전자 발현 패턴의 간섭 및 세포의 기능성 성능의 손실을 유도하여, 노화 및 사멸을 유도한다)을 유발한다는 증거에 기초하여 완벽히 잘 인정되고 있다. 산화제의 생성, 항산화제 보호 및 산화적 손상의 회복 간에서는 상호관계가 존재한다. 항산화제 방어가 연령에 따라 감퇴되는지 여부를 결정하기 위해 많은 연구들이 수행되었다. 이들 연구는 이의 주요 성분: SOD, CAT, GPx 효소, 글루타티온 리덕타제, 글루타티온-S-트랜스퍼라제의 활성 또는 발현 및 항산화 특성을 지닌 저분자량의 화합물의 농도의 분석을 포함하였다. 예를 들면, 드로소필라 멜라노가스터(Drosophila melanogaster)에서의 SOD 및 CAT의 과발현은 기대수명을 30%까지 증가시키며 단백질 산화에 의한 손상을 감소시킨다. 이러한 맥락에서, UV 광선에 대한 피부 조직의 시험관내 및 생체내 노출은 유리 라디칼과 다른 반응성 산소 종을 생성시켜, 노화에 현저하게 기여하는 것으로 입증된 세포의 산화적 스트레스를 유도한다. 피부가 UV 방사선에 과도하게 노출되면 급성 또는 만성 손상이 유발될 수 있다. 급성 조건하에, 홍반 또는 화상이 발생할 수 있으며, 만성 과도 노출은 피부암과 노화의 위험성을 증가시킨다. 게다가, 피부 세포는 세포 온전성 및 산화적 손상에 대한 내성을 유지시키는데 관여하는 효소와 같은 각종 단백질의 발현을 증가시킴으로써 만성 또는 급성 산화적 스트레스에 반응할 수 있다.
당업계에서 텔로미어는 진핵생물의 염색체의 말단에 위치하는 비-암호화 DNA 영역인 것으로 널리 공지되어 있다. 이는 일렬(tandem)(TTAGG)n로 반복된 고도로 보존된 DNA 서열 및 관련 단백질로 구성되며 텔로미어 융합을 방지하는 다른 염색체의 말단에 대한 연결을 방해하는 특별한 구조를 갖고 있다. 텔로미어는 염색체 온전성의 보존에서 필수적 역할을 하여, 효소 작용 및 이의 분해로부터 암호화 DNA를 보호하고 염색체 안전성의 유지에 기여한다.
반보존적 복제를 갖는 암호화 서열과 달리, 텔로미어는 연속적 세포 분열 동안에 이의 반복적 서열이 점진적으로 손실된다. 오늘날, 텔로미어 기능을 유지하기 위해서는 최소의 텔로미어 길이가 요구되고 텔로미어가 임계 크기에 도달하는 경우에 유사분열시 분열이 어렵게되어 텔로미어 연합(telomeric association; TAS) 및 염색체 불안정이 발생하는 것으로 고려된다. 이러한 염색체 불안정성은 현저한 유전적 변화를 발생시킬 수 있는 오류가 일어날 가능성의 증가와 관련된다.
다수의 이중 결합으로 인해, 오메가-3 지방산은 지질 퍼옥사이드의 생성과 관련된 산화적 스트레스 과정 동안에 유리 라디칼의 생성 및 증식에 대한 분자 표적인 것으로 고려된다. 그러나, 오메가-3 지방산의 식이 보충에 기인하는 산화적 스트레스에 대한 감수성에 관한 각종 연구에서는 모순된 결과가 수득되었다. 사람에서의 일부 연구는 LDL의 증가된 산화를 제시한 반면에, 다른 연구에서는 이러한 효과가 발견되지 않았다. 동물을 이용한 연구에서는, 오메가-3 지방산으로의 처리가 LDL의 산화에 대한 감수성의 증가 또는 감소를 유도하는 것으로 발견되었다. 반면에, 항산화 방어 시스템에 관여하는 유전자의 과발현이 3개월 동안 어유가 풍부한 식이를 공급한 마우스의 간에서 발견되었다.
게다가, 아교세포 기원의 세포주를 이용한 다양한 시험관내 연구는 오메가-3 지방산이 풍부한 막이 산화적 손상에 대해 보다 감수성임을 제시하였다. 이들 세포에 고농도의 DHA를 장기간 보충시킨 결과, 세포 배지 중의 지질 퍼옥사이드의 수준이 증가하였으며 과산화수소에의 노출에 의해 유도된 아폽토시스로 인해서 높은 비율의 세포가 사멸하였다. 그러나, 에틸 도코사헥사에노에이트의 양막내 투여가 랫트의 태아 뇌 속의 지질 과산화를 감소시키는 것으로도 나타났다. 이러한 반응은 항산화 효소의 활성화를 통한 유리-라디칼 격리 효과 때문인 것으로 제시되었다. 뇌에는 다중불포화 지방산이 비교적 풍부하고 항산화 효소가 비교적 적기 때문에, 뇌의 항산화능의 증가는 산화적 스트레스에 대한 1차적 내인성 방어를 위해 중요하다.
이러한 모순된 결과들은 지방산의 산화가 이중 결합의 수에 따라 증가한다는 전제에 기초한 가설이 생체내 적용 가능성이 없음을 시사하는데, 그 이유는 다른 잠재적 기작, 예를 들면, 이중 결합이 ROS에 의한 공격에 덜 감수성이도록 만드는 막의 지질 및 지단백질 중의 오메가-3 지방산의 3차원 구조, PLA2와 같은 산화촉진제 (pro-oxidant) 효소의 억제 또는 항산화제 (anti-oxidant) 효소의 보다 많은 발현이 산화적 손상을 감소시키는 작용을 할 수 있기 때문이다.
반면, 저산소성 조직에서의 허혈-재관류 현상 동안에 막 지질의 손상이 관찰되었기 때문에 신체적 운동을 유리 라디칼의 생성과 관련시키는 개념이 80년대 초반부터 도래하고 있다[참조: Lovlin et al., Eur. J. Appl. Physiol. Occup. Physiol. 1987, 56 (3) 313-6]. 동시에, GSSH/GSH 비율의 증가가 랫트 근육세포[참조: Lew H. Et al. FEBS Lett, 1985; 185(2): 262-6, Sen CK et al., J. Appl. Physiol. 1994; 77(5): 2177-87] 및 사람 혈액[참조: MacPhail Db et al., Free Radic Res Commun 1993; 18(3): 177-81, Gohil K. et al. J. Appl. Physiol. 1988 Jan; 64(1): 115-9]에서 관찰되었다. 유리 라디칼은 또한 DNA에도 영향을 주며, 급격합 신체적 운동은 8-0xodG의 증가로 입증되는 바와 같이 DNA의 손상을 증가시킨다. 고강도의 신체적 활동(마라톤 달리기)은 DNA의 손상(이는 시험 후 수일 동안 명백하다)을 유발하며 또한 면역적격 세포의 손상(이는 이러한 시험 후 스포츠맨에서 나타난 면역 감소와 연관될 수 있다)을 유발한다.
그러나, 다른 저자들은 90분 동안 수영, 60분 동안 달리기 또는 조정(漕艇) 에 의한 고강동 활동을 한 후에 어떠한 효과(보다 경미한 손상은 제외)도 관찰하지 못하였다. 동시에, 훈련된 및 훈련되지 않은 스포츠맨들에 대한 조사는, 활동에 대한 후속적 반응에 부수적이고 급성 방식으로 DNA에 대한 운동의 작용이 아닌 것으로 고려되는 손상을 발견하였지만, 8-oxo-dG의 뇨 배설에서의 어떠한 차이도 발견해내지 못하였다.
산화적 스트레스를 생성하는 집중적인 신체적 운동 현상은 당업계에 널리 공지되어 있지만, 이의 원인은 아직 잘 결정되지 않았다.
스포츠 수행과 관련된 n-3 지방산을 이용하여 실시된 연구는 소염 효과에 집중하였으며, 실제로 첫번째 분석은 집중적인 신체적 운동-유도된 기관지수축을 감소시킴으로써 폐포-모세관 흡수를 개선시키는 이들 영양소의 가능한 작용을 찾아내고자 시도하였다. 이와 관련하여, 미클보로우(Mickleborough)는 3.2g EPA와 2.2g DHA 식이를 투여한 후, 엘리트 운동선수에서 TNF-α 및 IL-1β의 존재가 감소됨으로써 전염증성(proinflammatory) 사이토킨이 감쇠되는 것과 함께 기관지수축이 감소됨을 증명하였다. 월서(Walser)는 n-3 지방산 혈관 효과를 신체적 운동에 대해 불내성을 나타내는 사람들에서의 양성 효과와 관련시켰다. 이와 관련하여, 판 호이텐(van Houten) 등은 고 n-3 지방산 섭취가 관상동맥증후군 후에 심장재활을 실시하는 환자에서 보다 우수한 회복과 연관되었음을 연구하였다.
분석된 연구에서의 신체적 수행능에서 명백한 결과가 없었던 것은 건강하지 않은 사람인 환자에 대해 평가되었으며 조사된 것이 혈관 및 염증 효과였기 때문이다.
동시에, 다음의 이론적 개념에 기초한 연구가 수행되었다. 혈장중 유리 지방산이 1mmol/L(글리코겐이 모두 다 사용된 경우에 발생함) 이상으로 증가되는 경우, 트립토판 수송과의 경쟁은 이를 증가시키고 후속적으로 장기간 스포츠에서의 소위 "중추 피로"와 관련된 신경전달물질인 세로토닌이 증가된다. 이와 관련하여, n-3 지방산은 전사 핵 인자 PPARα를 활성화시켜 지방산 산화를 상향 조절함으로써 혈장중 유리 지방산의 양을 감소시키는 것으로 공지되어 있다. 그러나, 이러한 분석법은 성공적이지 못하였는데, 그 이유는 후프만(Huffman)(2004)이 4g의 n-3 지방산의 용량 요법(300 mg EPA 및 200 mg DHA를 함유하는 500g 캡슐)을 사용하여 두 성별 모두의 경주자에서 연구를 수행하였을 때, n-3 지방산이 투여된 피험자에서 수행능의 증가에 대한 통계학적 경향이 있었지만, 유리 TRP의 어떠한 감소도 발견하지 못하였고 노력의 성과가 거의 인지되지 않았을 뿐 아니라 수행능의 통계학적 증가도 발견하지 못하였으며, 연구에 대한 검정력의 감소 원인이 연구된 피험자의 수(5명의 남성 및 5명의 여성)가 적었기 때문이라는 가능성을 저자들에게 열어두고 있기 때문이다.
수행능과 관련된 n-3 산의 효능을 평가한 다른 후속적 조사는 위약으로서 옥수수 오일을 사용하여 어떠한 유의차도 발견하지 못하였다. 라스타드(Raastad)는 수주 동안 1일당 1.60g EPA 및 1.04g DHA를 투여하였을 때 풋볼 선수에서 어떠한 개선도 발견하지 못하였다[참조: Raastad et al. Scand J. Med Sci Sports 1997; 7(1): 25-31].
반면, 세포내 수준에서의 지방산의 유사체, 아실-CoA가 미토콘드리아내에서 피루베이트 데하이드로게나제(억제 부산물)을 억제하고 또한 글리코겐분해 및 글루코스신합성을 자극하여 공복 동안 완만한 고혈당을 유발하기 때문에, 유리 지방산은 근육내 글루코즈의 이용을 방해하고, 실제로 공복 동안 다중불포화 지방산의 연속적 투여는 간 수준에서 글루코즈-6-포스파타제를 활성화시켜 혈당을 유지하도록 돕는 것으로 공지되어 있다. 또한, 근육내 지방산의 조성은 인슐린 민감성을 변경하는 것으로 공지되어 있으며, 이는 원형질 막 중의 다중불포화 지방산의 높은 함량이 인슐린 민감성을 개선시키고 포화 지방산의 높은 함량이 반대 효과를 야기함을 나타낸다.
운동은 글루코즈 흡수, 모세관 관류, 글리코겐 합성속도 및 인슐린 민감성을 증가시킨다. 근육 수축 동안 온도, 세포내 pH, ATP/ADP 비율 뿐만 아니라 Ca++ 세포내 농도 및 운동에 의한 세포 기능성 조절에서 메신저로서 작용할 수 있는 기타 대사산물에서 변화가 야기된다. 이와 관련하여, Ca++는 세포내 시그날 전달에서 중요한 매개체인 칼모둘린 키나제, 단백질 키나제 C(PKC) 및 칼시뉴린을 포함하는 다량의 세포내 단백질을 조절한다. 유산소 운동 동안, 아세틸-CoA 카복실라제가 AMP 키나제(AMPK)에 의해 불활성화되고, 이는 말로닐-CoA 수준의 저하를 유도하여 카르니틴 팔미톨 트랜스퍼라제를 탈억제하여 미토콘드리아내 지방산 수송의 증가를 야기한다(이에 따라 지방산 산화가 촉진된다).
AMPK 활성화 효과는 대체로 GLUT4의 자극 및 헥소키나제 발현 뿐만 아니라 미토콘드리아 효소를 포함한다. 그러나, 놀랍게도, AMPK 활성화는 운동이 골격근내 글루코즈에 대한 반응을 증가시키는 고유한 방식이 아니다(인슐린 독립적). 문헌[참조: Mora and Pessin, J. Biol. Chem. 2000; 275 (21): 16323-16328]은 근육내 글루코즈 반응의 증가를 제시하였으며, 실제로 GLUT4를 활성화시키는 MEF2A 및 MEF2D와 같은 몇가지 전사 인자가 있으며 이들 인자는 운동에 의해 활성화된다.
근육내 지질의 증가는 비만 상태 및 신체적 훈련에서 공통된 것이지만, 그 결과는 비만한 사람은 인슐린 내성과 관련되는 반면에, 스포츠맨에서는 카르니틴 팔미톨 트랜스퍼라제의 큰 활성이 지방산이 베타 산화되도록 한다는 것이다. n-3 지방산이 풍부한 식이는, 혈당 및 혈중인슐린이 증가되더라도(인슐린 내성의 신호) 인슐린 수용체 수준에서 GLUT-4 단백질 전좌를 유지시키는 작용을 하며, 이는 DHA의 경우에 특이적으로 나타났다[참조: Jaescchke H. Proc. Soc Exp Biol. Med 1995; 209: 104-11].
본 발명은 특히 도코사헥사엔산(본원에서 DHA로도 언급됨) 또는 에이코사펜타엔산(EPA) 또는 DHA 유래의 EPA의 투여가 유리 형태인지 또는 트리글리세라이드에 혼입된 형태인와 관계없이 세포성 항산화제로서 작용한다는 예상치못한 발견에 관한 것이다.
이러한 방식으로 DHA와 EPA 간의 대사적 관련성(DHA의 EPA로의 역전환)을 고려하여, DHA의 투여에 대해 이전에 관찰된 기술된 모든 효과는, EPA가 구체적으로 언급되지 않더라도, 혼합된 시스템 DHA/EPA 또는 심지어 EPA의 단일성분 시스템에 적용될 수 있어야 한다.
따라서, 본 발명의 목적은 세포의 산화적 손상의 치료를 위한 약제학적 조성물의 제조를 위한 도코사헥사엔산의 용도이다.
본 발명의 다른 목적은 세포의 산화적 손상을 치료하기 위한, 글리세롤 주쇄의 특정 위치에 있는 도코사헥사엔산 (DHA)의 용도이며, 이때 글리세라이드의 나머지 두 위치도 또한 이의 조성에 있어 특정된다.
본 발명의 추가의 목적은 세포의 산화적 손상을 DNA 수준에서 치료하기 위한 약제학적 조성물을 제조하기 위한 도코사헥사엔산(DHA)의 용도이다. 특히, 도코사헥사엔산의 용도는 세포의 산화적 손상의 치료에서 텔로미어의 천연적 단축 과정에서의 보호제로서 및 조기 노화의 억제제로서 적용되는 것이다.
또한, 본 발명의 목적은 세포 노화 및 미토콘드리아 호흡 연쇄에서의 장애와 관련된 유전성 병리상태의 치료를 위한 조성물 및 다운 증후군의 치료를 위한 조성물을 제조하기 위한 도코사헥사엔산의 용도이다.
본 발명의 추가 목적은 신체적 운동과 관련된 세포의 산화적 손상의 치료를 위한 조성물을 제조하기 위한 도코사헥사엔산(DHA)의 용도이다. 특히, 도코사헥사엔산의 용도는 스포츠 수행능의 증진제로서 및 신체적 활동 동안 혈당 수준의 조절제로서 적용하는 것이다.
또한, 본 발명의 목적은 스포츠 수행능을 증진시키기 위한 조성물 및 주로 식품, 유제품 또는 신체적 운동을 하는 동안에 사람들에 의해 전형적으로 사용되는 임의의 적합한 투여 형태의 투여에 의해서 신체적 운동 후 혈당 수준을 유지하기 위한 조성물의 제조를 위한 도코사헥사엔산의 용도이다.
본 발명에서, "세포의 산화적 손상"이란 표현은 내인성 또는 외인성 기원의 세포성 산화제 종의 생성 및 분해 간의 불균형과 관련되는 임의의 과정을 의미한다.
놀랍게도, 본 발명의 발명자들은, 퍼옥사이드 또는 슈퍼옥사이드의 의존적 유도와 관련되는지와 관계없이, DHA가 반응성 산소 종(ROS)의 생성을 억제할 수 있다는 것을 발견하였다. 보다 구체적으로, DHA는 슈퍼옥사이드 음이온의 생산을 감소시키고 이와 함께 산화적 다단계증폭반응(cascade)에서 생성된 모든 유도된 종을 감소시키고, 예를 들면, 지질 과산화가 매우 현저하게 감소된다. 게다가, 항산화 효소 활성의 증가가 발견되었는데, 이는 항산화제, 기본적으로는 효소의 발현을 유도하고 A2 포스포리파제와 같은 산화촉진제의 발현을 억제함에 의한 세포의 적응을 시사한다.
본 발명의 하나의 양태에서, 상기 도코사헥사엔산은 모노글리세라이드, 디글리세라이드, 트리글리세라이드, 인지질, 에틸 에스테르 또는 유리 지방산 내로 혼입된다. 바람직하게는, 상기 도코사헥사엔산은 트리글리세라이드 내로 혼입된다.
본 발명에서, "글리세라이드 내로 혼입된 도코사헥사엔산"은 세 위치중 하나 이상의 위치가 도코사헥사엔산으로 에스테르화되고 임의로 나머지 위치중 하나 이상의 위치가 단쇄, 중쇄 또는 장쇄 지방산 및 인산으로부터 선택된 하나의 산으로 추가로 에스테르화된 모노글리세라이드, 디글리세라이드, 트리글리세라이드, 인지질을 의미한다. 바람직하게는, 상기 글리세롤은 트리글리세라이드이다.
DHA의 화학 구조로서의 트리글리세라이드의 선택은 경구 투여 후 에틸 에스테르, 인지질, 유리 지방산 및 트리글리세라이드의 형태의 4종의 오메가-3 산 농축물의 생체이용율을 비교하는 연구로부터 얻은 데이타에 기초하며, 당해 데이타는 재에스테르화된 트리글리세라이드가 다른 제제보다 높은 생체이용율을 나타냈음을 입증하였다. 본 발명의 바람직한 양태에서, 상기 도코사헥사엔산은 총 지방산에 대해서 20중량% 내지 100중량%, 바람직하게는 40중량% 내지 100중량로 발견되고, 보다 바람직하게는 상기 도코사헥사엔산은 총 지방산에 대해 66중량% 내지 100중량%로 존재한다.
다른 바람직한 양태에서, 상기 도코사헥사엔산은, 세포의 산화적 손상의 치료를 위한 약제학적 조성물을 제조하기 위해서, 에스테르 결합을 통해서 구조화된 지질, 글리세롤의 하나 이상의 특정 위치내로 혼입된다.
이러한 글리세롤은, 상기 도코사헥사엔산이 sn-1, sn-2 및 sn-3으로부터 선택된 위치내로 혼입되도록 하나 이상의 지방산 및/또는 하나의 인산을 추가로 포함할 수 있고, 임의로 단쇄 및/또는 중쇄 지방산 및 인산으로부터 선택된 하나 이상의 산을 추가로 포함할 수 있고, sn-2 위치로 혼입되는 경우에, 임의로 지방산 및 인산으로부터 선택된 하나 이상의 산을 추가로 포함할 수 있다.
이와 관련하여, 임의로 당해 용어를 언급하는 경우, sn-1, sn-2 및 sn-3으로부터 선택된 위치내로 혼입된 상기 도코사헥사엔산이 단쇄 및/또는 중쇄 지방산 및 인산으로부터 선택된 하나 이상의 산을 추가로 포함할 수 있거나 포함하지 않을 수 있거나, 또는 sn-2 위치로 혼입된 상기 도코사헥사엔산이 장쇄 지방산 및 인산으로부터 선택된 하나 이상의 산을 추가로 포함할 수 있거나 포함하지 않을 수 있음이 이해되어야 한다.
놀랍게도, 본 발명의 발명자들은 도코사헥사엔산의 위치가 선택되었고 당해 화합물의 나머지 부분이 글리세롤에 결합된 구조화된 글리세롤의 사용이 세포의 산화적 손상 치료용 약제학적 조성물의 제조를 위한 도코사헥사엔산의 사용의 치료학적 효능을 예기치 않게 2배 또는 심지어 3배 이상 증가시킨다는 것을 밝혀냈다.
공통의 정의는 글리세롤 주쇄 내의 특정 위치에 위치하는 지방산을 함유하는 지방에 관한 것이다. 생체내 지방산 생분포와 유사함으로써, 장쇄 다중불포화 지방산(PUFA)은 바람직하게는 글리세롤의 sn-2 위치에 위치하고, 장의 흡수 과정을 고려하여, 트리글리세라이드는 리파제에 의해 유리 지방산, 디글리세라이드 및 모노글리세라이드로 가수분해되고, 이로부터 유리 지방산 및 sn-2 모노글리세라이드가 장세포라 지칭되는 장 상피 세포에 의해 직접 흡수된다.
에스테르 결합을 통해 글리세롤 주쇄의 특정 위치로 혼입된 도코사헥사엔산을 사용함으로써, 증가된 생물활성, 존재하는 지방산의 전량에 대한 동일 몰백분율에서의 증가된 항산화 보호 및 글리세라이드 중의 도코사헥사엔산의 항산화 효과와 관련해 투여 용량에 대한 의존성 감소가 제공된다.
유리하게도, 본 발명의 발명자들은 sn-1, sn-2 및 sn-3으로부터 선택된 글리세롤의 위치로 혼입된 도코사헥사엔산 및 임의로 단쇄 및/또는 중쇄 지방산 및 인산으로부터 선택된 하나 이상의 산을 추가로 포함하는 상기 글리세롤의 사용이, 증가된 생물활성, 존재하는 지방산의 전량과 관련해 동일 몰백분율에서의 증가된 항산화 보호 및 글리세롤 중의 도코사헥사엔산의 항산화 효과와 관련해 투여 용량에 대한 의존성 감소를 제공한다는 것을 밝혀냈다.
또한 유리하게도, 본 발명의 발명자들은 글리세롤의 sn-2 위치로 혼입된 도코사헥사엔산 및 임의로 장쇄 지방산 및 인산으로부터 선택된 하나 이상의 산을 추가로 포함하는 상기 글리세롤의 사용이, 증가된 생물활성, 존재하는 지방산의 전량에 대한 동일 몰백분율에서의 증가된 항산화 보호 및 글리세롤 중의 도코사헥사엔산의 항산화 효과와 관련해 투여 용량에 대한 의존성 감소를 제공한다는 것을 밝혀냈다.
바람직하게는, 도코사헥사엔산을 함유한 글리세롤 중에 또한 존재하는 산은 단쇄 지방산(C1-C8) 또는 중쇄 지방산(C9-C14) 또는 인산일 수 있는데, 그 이유는 이들 산이 기능적 활성은 갖지 않고 오직 에너지 활성만을 가져서 도코사헥사엔산과 경쟁하기 않기 때문이다.
따라서, 보다 바람직하게는, 본 발명은 sn-1 및 sn-3 위치 중 하나가 유리되어 있거나 중쇄 지방산(C9-C14) 또는 단쇄 지방산(C1-C8) 또는 인산에 의해 점유되어 있고 sn-2 위치가 기능적 DHA에 의해 점유되어 있는 글리세롤 내로 혼입된 도코사헥사엔산의 용도에 관한 것이다. 따라서, DHA가 장 세포에 보다 효율적으로 흡수될 수 있기 때문에 더욱 많은 DHA의 증가가 달성된다.
따라서, 도코사헥사엔산이 다른 지방산과 경쟁하지 않는 경우에 글리세롤의 임의의 위치에 혼입되고 DHA가 하나 이상의 지방산과 경쟁하는 경우에 글리세라이드의 sn-2 위치에 혼입된 구조화된 글리세라이드의 합성은 이의 항산화 효과와 관련된 개선을 보이며, 따라서 이는 세포의 산화적 손상의 치료를 위한 약제학적 조성물을 제조하기 위한 바람직한 방법이다.
본 발명의 발명자들은 본 발명에 따르는 DHA 조성이 풍부한 세포가 새로운 산화적 스트레스 상황에 직면하는데 있어 보다 잘 대체하며 따라서 산화적 스트레스로부터 유도될 수 있는 유해 효과를 감소시킴을 밝혀냈다. 즉, 생체막 내의 DHA의 존재는 산화적 스트레스에 대한 세포의 적응 반응을 유도한다. 적응 반응은 독성제(치사 농도 이하에서)에 대한 노출이 치사 농도의 동일 독성제의 유해한 효과로부터 세포를 후속적으로 보호할 수 있는 세포성 반응을 자극하도록 하는 세포성 현상이거나, 달리 말하면, 높은 수준에서는 해로운 제제에 대한 낮은 수준의 노출에 의해 촉발되는 유익한 효과이다.
DHA의 투여는 다음과 같은 상당한 이점을 갖는다:
a) 증가된 세포성 항산화 활성;
b) 투여된 용량에서 세포성 세포독성의 부재;
c) 투여된 용량에서 세포성 산화 상태의 실질적 변경의 부재;
d) 적응성 세포성 항산화 활성.
상기한 모든 것들로 인해서, 바람직한 양태에서 본 발명은 세포의 산화적 손상과 연관된 병리상태를 치료하기 위한 약제학적 조성물의 제조를 위한 도코사헥사엔산의 용도에 관한 것이며, 상기 병리상태는 바람직하게는 특히 다발성 경화증, 알츠하이머병, 파킨슨병, 근위축성 측삭경화증 및 근위축증으로부터 선택된 신경퇴행성 병리상태이다.
본 발명의 다른 양태에서, 산화적 손상과 연관된 병리상태는 바람직하게는 특히 색소성 망막증, 황반변성 및 백내장을 포함하는 그룹으로부터 선택된 안구 병리상태이다.
또 다른 양태에서, 산화적 손상과 연관된 병리상태는 허혈성 병리상태, 특히 심근경색, 뇌경색 등이다.
본 발명의 또 다른 양태에서, 산화적 손상과 연관된 병리상태는 바람직하게는 특히 관절염, 혈관염, 사구체신염 및 홍반성 루푸스로부터 선택되는 염증 과정이다.
다른 바람직한 양태에서, 산화적 손상과 연관된 병리상태는 아테롬성 동맥경화증이다.
본 발명의 다른 측면은 천연적 텔로미어 단축 과정에서의 보호제로서 및 조기 노화의 억제제로서의 DHA의 용도이다.
텔로미어 연합(TAS)을 생성하는 기작은 아직 알려져있지 않지만, 본 발명의 발명자들은 이것이 텔로미어에 특징적인 DNA의 반복적 서열을 합성하여 텔로미어의 길이를 안정화시키는 효소 텔로머라제의 활성의 결핍과 연관될 수 있음을 제시한다.
텔로머라제는 태아 세포에서 매우 활성적이지만, 성체 조직 세포에서는 그다지 활성적이지 않다. TAS는 좀처럼 정상 세포에서는 발견되지 않지만, 바이러스에 의해 감염된 세포 또는 종양 세포에서 관찰되었다.
시험관내 텔로미어 반복부(telomeric repetition)의 수 뿐만 아니라 생체내 세포 노화시 기능이 점진적으로 감소되고, 이것은 노화에서의 텔로머라제 활성의 억제와 연관됨이 관찰되었다. 마찬가지로, 본 발명의 발명자들은 100명의 건강한 사람으로부터의 섬유모세포 및 림프구에서의 텔로미어 길이를 연구하여, 섬유모세포의 시험관내 증식 동안의 텔로미어 단축 뿐만 아니라 텔로미어 길이와 공여자의 연령 간의 역 상관관계를 밝혀내었다.
텔로미어 단축이 세포 복제에 따라 천연적으로 일어나는 것이지만, DNA에서 산화적 손상이 유도되는 경우에 조기 노화 및 텔로미어의 파괴가 관찰되었다. 텔로미어는 산화적 손상에 보다 민감하고 이의 파괴는 게놈의 다른 부분에 비해서 덜 효율적으로 복구된다. 이는 DNA 복제 동안에 보다 빠른 단축을 유발하여 세포의 기대 복제 수명을 감소시키는, 텔로미어 손상의 축적을 유도한다. 반응성 산소 종(ROS), 특히 슈퍼옥사이드 음이온, 과산화수소 및 옥시드릴 라디칼은 일부 세포 유형의 복제 동안에 텔로미어의 손실을 가속화시킬 수 있지만, 이들은 또한 텔로미어 단축과 관계없이 조기 노화를 유도한다.
놀랍게도, 본 발명의 발명자들은 DNA 수준에서의 세포의 산화적 손상의 치료를 위한 도코사헥사엔산의 사용이 텔로미어의 단축속도를 감소시킬 수 있고 따라서 세포의 노화를 억제할 수 있음을 밝혀냈다.
본 발명자들은 20종 이상의 섬유모세포 사람 계통(strain)에서 텔로미어의 단축속도와 세포의 항산화능 간의 역 상관관계를 밝혀내었다. 이러한 조기 노화된 섬유모세포의 세포성 파라메터의 대부분은 이들 세포의 정상적 노화와 동일하다(형태, 지방갈색소의 축적 및 유전자 발현의 변화). 항산화 방어가 낮은 섬유모세포는 이의 텔로미어가 더욱 빨리 단축되며, 역으로 항산화 방어가 높은 섬유모세포는 이의 텔로미어가 더욱 느리게 단축된다. 텔로미어의 단축속도는 항산화 방어가 낮은 세포에서 더욱 높다. 게다가, 유리 라디칼 스캐빈저(scavenger)는 텔로미어의 단축속도를 감소시킨다.
이들 데이타는 사람 섬유모세포에서 텔로미어의 단축속도에서의 항산화 효소인 글루타티온 퍼옥시다제 및 슈퍼옥사이드 디스뮤타제의 중요한 역할을 보여주는 데이타이다. 이들 데이타는 텔로미어의 길이가 산화적 스트레스와 세포의 항산화 방어능 간의 관계에 의해 주로 결정됨을 증명한다. 따라서, 연령-의존적 텔로미어의 길이는 세포가 이의 일생에 따라 겪은 산화적 손상의 내력이 축적된 측정치이다.
산화적 스트레스와 텔로미어의 단축속도 간의 상관관계는 미토콘드리아 호흡 연쇄의 장애와 연관된 유전성 병리상태 및 다운 증후군의 경우에 나타났다.
따라서, DNA의 산화적 세포성 손상과 텔로미어 단축 및 세포 노화에서의 이의 효과 간에 존재하는 관계는, 도코사헥사엔산을 천연적 텔로미어 단축 과정에서의 강력한 보호제로서 및 조기 노화의 억제제로서 사용할 수 있도록 한다.
한편, 오메가-3 지방산이 풍부한 오일의 생산을 위한 효소의 사용은 화학적 합성에 기초하는 다른 방법 및 후속적 정제 공정(크로마토그래피에 의한 분리, 분자적 증류 등)에 비해서 몇가지 이점이 있다. 후속적 정제 공정은 모두 시스인 오메가-3 PUFA의 모든 이중 결합을 산화에 의해 또는 시스-트랜스 이성체화 또는 이중결합의 이동에 의해 부분적으로 파괴할 수 있는 pH 및 고온의 극단적 조건을 요구한다. 효소적 합성에서 사용되는 온화한 조건(50℃ 미만의 온도, pH 6 내지 8 및 적은 양의 화학적 시약)은 아실글리세라이드에서의 구조적 선택성이 증가된 오메가-3 PUFA의 본래 구조를 보존시키는 대안적 합성법을 제공하며, 이러한 본래 구조는 영양학적 관점에서 보다 바람직한 화학 구조인 것으로 고려된다.
DHA를 포함하는 약제학적 조성물은 경구, 설하, 정맥내, 근육내, 국소, 피하 또는 직장 경로로 투여될 수 있거나 심지어 액체 또는 증기 형태의 본 발명의 마이크로에멀젼의 활성 성분을 호흡기도의 입구에 위치하는 후각 기관과 단순히 접촉되도록 함으로써 투여될 수 있는 오일 또는 에멀젼의 형태로 제공될 수 있다. 따라서, 투여는 마이크로에멀젼의 분무, 연무화 또는 미립화 또는 흡입에 의해 수행할 수 있다.
임의로, 약제학적 조성물은 제2 활성 성분을 추가로 포함한다.
유사하게, DHA를 포함하는 약제학적 조성물은 식품(예를 들면, 요거트, 우유 등과 같은 유제품)을 DHA와 같은 천연 항산화제로 강화시키기 위한 목적으로 식품산업에서 사용될 수 있다.
따라서, 본 발명의 다른 양태에서, 상기 약제학적 조성물은 산화적 손상과 연관된 병리상태에 대한 치료를 이미 받고있는 환자에게 투여된다.
본 발명의 또 다른 목적은 스포츠 수행능에서의 증진제로서 및 신체적 활동 동안의 혈당 수준의 조절제로서의 DHA의 사용이다.
이러한 방식으로, 놀랍게도, 본 발명의 발명자들은 신체적 운동 동안 상기 도코사헥사엔산의 사용이 스포츠 수행능의 증가를 유도하여 이러한 신체적 운동 후에 혈당 수준(혈당량)을 (탄수화물의 투여 없이도) 유지시킨다는 것을 밝혀냈다.
이러한 본 발명의 범주에서, "아마츄어" 또는 "비경쟁 스포츠맨"이란, 산발적 방식으로 그리고 비전문적으로 신체적 운동을 하는 임의의 사람을 의미한다. 그리고, "경쟁 스포츠맨" 또는 "훈련된 스포츠맨"이란, 규칙적 방식으로 및/또는 전문적 수준에서 신체적 운동을 하는 임의의 사람을 의미한다. 마찬가지로, "신체적 운동" 및 "신체적 활동"이란 용어는 동등하게 그리고 상호교환적으로 사용되며, "스포츠맨"란 용어는 남성 및 여성에 대해 사용된다.
스포츠 수행능
스포츠 수행능을 평가하기 위해, 이러한 스포츠 수행능의 향상에 관한 평가를 제공할 수 있도록 하는 몇가지 파라메터가 있다.
유산소 스포츠를 하는 스포츠맨에서, 최대 산소 소비율 VO2max가 매우 잘 훈련된 스포츠맨에서는 경쟁 시즌 동안 거의 증가하지 않기 때문에 UV 2(무산소성 역치)에서의 최대 산소 소비율 %VO2max이 증가되는 경우에 수행능이 증가된 것으로 고려된다. 역치에서의 VO2max 비율에서의 적은 변화는 수행능의 증가와 직접적으로 관련되는 데이타이다.
본 발명자들은, 기저 3각 활동 시험(basal triangular effort trial)을 DHA로 4개월 동안 처리한 후에 실시한 시험과 비교한 경우에, 환기역치(ventilatory threshold) 2에서 체중에 대한 상대적 산소 소비(VO2) 값(p<0.036) 및 절대 산소 소비(VO2) 값(p<0.019)가 통계학적으로 유의적으로 증가함을 제시하였다. 이러한 파라메터의 증가는 경쟁 사이클선수(p<0.047) 및 비경쟁 사이클 선수 둘다에서 나타나며, 비전문 사이클 선수에서의 차이는 통계적으로 유의적이지 않다(도 24).
스포츠 수행능의 증가와 관련된 다른 파라메터는 심박수의 증가이며, 이때, 무산소성 역치에서 심박수가 증가되는 경우에 스포츠맨은 유산소 대사를 보다 고 강도로 유지하는 능력을 다소 증가시킬 수 있는 것으로 고려되기 때문에 활동 시험의 UV2는 고정된다. 본 발명자들은 기저 시험에서 수득된 심박수 파라메터를 4개월간 DHA를 소비한 후 3각 시험에서 수득된 것과 비교한 경우에 p=0.082에 대해 UV2에서의 심박수의 증가를 관찰하였다. 이러한 데이타는 경쟁 수준이 높은 사이클선수의 하위그룹(subgroup)에서 현저하게 나타난다(p<0.017)(도 25).
이와 관련하여, 통계적학적으로 유의적인 UV2에 도달하는데 필요한 시간이 증가된다(도 26).
마지막으로, 동일한 활동 수준에 대한 심박수는 스포츠맨이 유산소적으로 훈련되는 경우에 낮다. 본 발명자들은 스포츠맨이 2000ml 02/분을 소비하는 시점에서 두 시험 모두에 대한 데이타를 비교하는 경우에 DHA가 투여된 사이클선수에서는 심박수가 통계학적으로 유의적 방식(p<0.043)으로 감소됨을 관찰하였다(도 27). 이러한 연구로부터, 4개월 동안 DHA를 섭취한 스포츠맨에서, UV2에서의 절대 및 상대적 산소 소비량의 증가(각각 p<0.008 및 p<0.015), UV2에 상응하는 부하량(charge)의 증가(p<0.063) 및 스포츠맨이 2000 ml/분의 산소 소비를 나타내는 경우에 심박수의 감소(p<0.062)가 관찰된 것으로 결론지을 수 있다. 이들 모두는 2.1g DHA/24시간(70중량%에서 500mg의 캡슐 6개)를 4개월 동안 매일 3회 용량으로 나누어서 섭취한 후에 스포츠 수행능의 증가를 나타내는 파라메터이다.
산화적 손상과 관련된 몇가지 생화학적 변수를 또한 활동 시험 후에 분석하였다.
1. 혈장 총 항산화능(Plasma Total Antioxidant Capacity; PTAC). 4각 시험을 실시하는 동안에 PTAA는 전반적으로 통계학적으로 유의적으로 증가한다(p<0.05). 이러한 증가는 전체 사이클 선수 또는 경쟁 사이클 선수 둘다로서 고려하였을 때 3주 동안 DHA를 투여한 후 스포츠맨에서 더욱 높으며, 아마츄어 스포츠맨의 경우에에는 3주 동안 DHA를 섭취한 후 실시된 시험 및 기저 시험 간에 어떠한 차이도 나타나지 않는다(도 28).
2. 말로닐알데히드(MDA). MDA는 대체로 산화적 스트레스에 의해 수득된 지질 퍼옥사이드를 티오바비투르산과 반응시킨 후에 수득된다. 모든 활동 시험을 실시하는 동안에 원형질 지질에 대한 산화적 손상이 유의적으로 증가하는 것으로 나타난다(p<0.035). 3주 동안의 DHA 섭취 후, 활동 시험을 실시하는 동안의 지질에 대한 산화적 손상은 시작시의 것보다 낮다(p<0.05). 이러한 차이는 아마츄어 스포츠맨의 경우보다 훈련된 스포츠맨의 경우에 보다 더욱 중요하다(도 29).
3. 8-옥소-7,8-디하이드로-2-'-데옥시구아노신(8-oxodG). 8-oxodG는 산화적 스트레스 바이오마커(biomarker)이다. 4각 활동 시험을 실시하는 동안에 DNA에 대한 산화적 손상이 증가된다(p<0.011). 이러한 산화적 손상은 3주 동안 DHA를 투여한 후에 감소한다(p<0.035). 이러한 산화적 스트레스의 감소는 경쟁 사이클 선수에서보다 비경쟁 사이클 선수에서 더욱 중요하며, 이러한 차이는 통계적으로 유의적이지 않다(도 30).
혈당량 연구
혈당 수준을 연구하기 위해, 4각 활동 시험을 2%의 값에서 기울기 상수를 유지하면서 최대 3각 활동 시험에 걸쳐 계산된 VO2max의 75%에 상응하는 속도에 동등한 유지 최대 부하량을 갖는 자전거 롤러상에서 실시하였다. 시험 시간은 90분이며, 시험 동안 물은 마음대로 소비하도록 한다.
탄수화물 함유 음료가 섭취되지 않았기 때문에, 저혈당증이 예상되었다. 이러한 2차 추출의 저혈당증(시작 20분 전에 수득된 출발 샘플에 관해서 시험 종결후 20분)은 예상한 바와 같이 1차 활동 시험에서 나타난다. 그러나, 4개월 동안 DHA 투여 후에 수득된 데이타는 이전에는 관찰되지 않은 통계학적으로 유의적인 혈당량 유지를 나타내며, 이는 실현된 조사에서 놀라운 발견을 나타낸다.
일반적으로, 4각 활동 시험 전반에 걸쳐서 혈청 글루코즈 수준의 통계학적으로 유의적인 감소(p<0.0009)가 관찰된다. 그러나, 분석될 스포츠맨의 유형에 따라서 거동은 상이하다(p<0.003): 통상적인 경쟁 사이클 선수의 경우에 시험 동안에 혈당량의 감소에서의 유의적 변화가 없었지만, 아마츄어 사이클 선수의 경우에 기저 시험 동안 혈당량의 감소는 통상적인 경쟁 사이클 선수에서보다 높으며, 3주 또는 4개월 동안 DHA를 섭취한 후에 이러한 감소는 실질적으로 소멸된다(도 31, 32 및 33).
탄수화물 함유 음료를 음용하지 않고 90분 동안 실시하는 75%의 V02max에서의 활동 시험 동안의 정상혈당의 존재는 신체적 활동 동안의 DHA의 거동을 인슐린 민감성의 증가와 관련하여 상기 관찰되고 언급된 것과 연관시키는 발견을 나타낸다. 이와 관련하여, 구디어(Goodyear) 및 칸(Kahn)(1998)은 인슐린 또는 운동에 의한 골격근내 글루코스에 대한 반응에 기초하는 분자적 기작은, AMPK가 다른 어떠한 작용보다도 아세틸-CoA 카복실라제를 억제하고 글루코즈 수송을 촉진하는 다면발현성 효과를 갖는다는 것을 고려하여 AMPK(AMP-활성화된 단백질 키나제)가 운동 동안에 섬유 Iia에서 높았다는 사실에 관한 1997년의 간행물(Winder and Hardie)과 상이하다고 결론지었다. 아마도, 이것은 정주성(sedentary) 사람에서 실시된 연구에 따라 예측되는 혈당 반응과 상이한 스포츠맨에서의 혈당 반응에 관한 발견을 설명할 수 있다.
스포츠 수행능 및 혈당량에 대한 DHA의 작용에 관한 이러한 연구들로부터, 다음과 같은 결론이 내려질 수 있다:
1) 3주 이상 동안의 연속적 DHA 섭취는 경쟁적 및 아마츄어 사이클 선수 둘다에서 일반적으로 및 통계학적으로 유의적인 방식으로(p<0.05) 혈장 총 항산화능(PTAC)을 증가시킨다는 것이 증명된다. 또한, 지질에 대한 산화적 손상은 낮다(p<0.05) (차이는 아마츄어 사이클 선수에서보다 훈련된 스포츠맨에서 더욱 중요하다). 마지막으로, 뇨 마커(8-oxodG)에 의해 측정된 DNA에 대한 손상은 3주 동안 DHA를 섭취한 후에 감소된다(p<0.035).
2) DHA를 4개월간 연속적으로 섭취한 후에 스포츠 수행능이 보다 높다는 것이(부하량 및 심박수 뿐만 아니라 UV2에서의 VO2max의 비율의 증가) 증명되었다. 또한, DHA를 소비한지 4개월 후에 실시된, 75%의 V02max에서 90분 동안의 활동 시험에서 통계학적으로 유의적인 정상혈당이 관찰되었다.
두 효과(스포츠 수행능의 증진 및 장기간 운동 동안의 정상혈당)의 연관성은 당업계에서 예측되지 못했뿐만 아니라 공지되지 않은 결과이다.
게다가, 이러한 효과들의 연관성이 바람직하며 아직 공지되지 않은 운동능력향상 보조제(ergogenical aid)일 수 있는 것으로 결론지을 수 있다.
본 발명의 다른 목적은 임의의 적합한 수단에 의해 투여되는, 스포츠 수행능을 증진시키고 신체적 운동 후의 혈당 수준을 유지시키기 위한 조성물을 제조하기 위한 도코사헥사엔산의 용도이다.
식품에 관한 유럽연합 과학 위원회(European Union Scientific Committee on Food)는 신체적 운동 동안에 섭취될 음료의 조성물용으로 다음 성분들을 권장하고 있음이 고려되어야 한다(참조: http://ec.europa.eu/food/fs/sc/scf/out64_en. pdf):
Figure 112008052358016-pct00001
이와 관련하여, 탄수화물의 포함은 근육 및 간 글리코겐의 빠른 소비를 피하기 위해 혈당을 유지시키는 것을 목적으로 한다. 대다수의 스포츠맨에 있어 바람직하지 않은 위 포만감과 관련된 탄수화물 농도의 존재를 야기하는 오스몰농도의 증가로 인해 감소된 위 배출능(gastric emptying)의 결점들이 고려되어야 한다. 따라서, DHA를 부가하여 저 농도의 탄수화물을 함유하는 음료를 제조하는 것은 스포츠 수행능에 있어 확실히 흥미로운 운동능력향상 이점이 될 것이다.
따라서, 본 발명의 다른 측면은, 식품(예: 요거트, 우유 등과 같은 유제품)을 DHA와 같은 천연 항산화제로 강화시킬 목적으로 식품 산업에서 사용될 수 있고 또한 추가로 신체적 운동 전, 동안 및 후를 위한 모든 음료; 에너지 제공 바(bar); 운동능력향상 바 (ergogenical bar); 식량공급용 고형물 및 제제; 식이 보충물 및 종합 비타민 제제(예를 들면, 캡슐, 정제, 환제, 동결건조 형태 또는 임의의 적합한 투여 수단의 형태); 운동능력향상 보조제; 피부 흡수용 나노캡슐을 갖는 텍스타일 및 임의의 다른 적합한 투여 수단을 포함하는 그룹으로부터 선택되는 적합한 투여 형태로 혼입될 수 있는, DHA를 포함하는 약제학적 조성물에 관한 것이다.
도 1. ROS의 세포내 생성에 대한 음경표피 세포 배양 배지 중의 DHA의 농도의 효과. 당해 세포를 실험 전에 3일 동안 총 지방산에 대해 70중량%의 DHA를 함유하는 트리글리세라이드의 존재하에 배양하였다. (A) ROS 검출을 180분 동안 40 또는 60 mM AAPH로 처리된 세포상에서 DHR 123을 이용하여 실시하였다. 데이타는 3회의 독립적 실험의 평균치를 나타낸다. (B) ROS의 검출을 180분 동안 크산틴/크산틴 옥시다제 시스템으로 처리된 세포상에서 CDCFDA를 이용하여 실시하였다. 비교를 위해 100μM 비타민 E(대조군)으로 수득된 데이타를 포함시켰다. 데이타는 3 회의 독립적 실험의 평균치를 나타낸다.
도 2. ROS의 세포내 생성에 대한 음경표피 세포 배양 배지 중의 트리글리세라이드의 DHA의 비율의 경쟁 효과. (A) 당해 세포를 실험 전에 3일 동안 각각의 트리글리세라이드의 존재하에 배양하였다. x-축상의 농도는 DHA 함량이 70중량%인 트리글리세라이드로 수득된 해당량이다. ROS의 검출은 180분 동안 40 mM AAPH로 처리된 세포상에서 DHR 123를 이용하여 실시하였다. 데이타는 3회의 독립적 실험의 평균치를 나타낸다. (B) 20%, 50% 및 70%의 오일중 DHA 농도에 대한 항산화 보호의 도시.
도 3. 음경표피 세포에서의 TBARS의 생산에 대한 DHA 농도의 효과. 당해 세포를 표시한 농도에서, 실험 전에 3일 동안 총 지방산에 대해 70중량%의 DHA를 함유하는 트리글리세라이드의 존재하에 배양하였다. 산화적 스트레스는 6시간 및 24시간의 잠복시간 동안 40 mM AAPH로 유도하였다. 데이타는 3회의 독립적 실험의 평균치를 나타낸다.
도 4. 슈퍼옥사이드의 음이온의 생성에 대한 음경표피 세포 배양 배지 중의 DHA의 농도의 효과. 당해 세포를 실험 전에 3일 동안 총 지방산에 대해 70중량%의 DHA를 함유하는 트리글리세라이드의 존재하에 배양하였다. 슈퍼옥사이드의 음이온의 검출을 40 mM AAPH을 이용한 세포의 산화적 유도 직후에, 일부 실험에서는 10 mM Tyron 또는 0.1875 UA/㎕의 외인성 SOD의 존재하에 화학발광에 의해 실시하였다. 데이타는 3회의 독립적 실험의 평균치를 나타낸다.
도 5A. SOD 활성에 대한 음경표피 세포 배양 배지 중의 DHA 농도의 효과. 당해 세포를 0.5μM(A), 5μM(B) 및 50μM(C)의 DHA 농도에서, 실험 전에 3일 동안 총 지방산에 대해 70중량%의 DHA를 함유하는 트리글리세라이드의 존재하에 배양하였다. SOD 활성은 내인성 SOD 활성의 결과로서 루미놀에 의해 생성된 화학발광의 감소를 분석함으로써 간접적으로 분석하였다. 산화적 유도는 슈퍼옥사이드 음이온을 즉각적으로 생성하는 0.1mM 크산틴 / 0.005 U/ml 크산틴 옥시다제 시스템을 이용하여 실시하였다. 데이타는 3회의 독립적 실험의 평균치를 나타낸다.
도 5B. SOD 활성에 대한 음경표피세포 배양 배지 중의 DHA 농도의 효과. 당해 세포를 실험 전에 3일 동안 총 지방산에 대해 70중량%의 DHA를 함유하는 트리글리세라이드의 존재하에 배양하였다. SOD 활성을 유도되지 않은 세포 시스템 또는 40 mM AAPH로 유도된 시스템상에서 평가하였다. 데이타는 3회의 독립적 실험의 평균치를 나타낸다.
도 6. GPx 활성에 대한 음경표피 세포 배양 배지 중의 DHA 농도의 효과. 당해 세포를 실험 전에 3일 동안 총 지방산에 대해 70중량%의 DHA를 함유하는 트리글리세라이드의 존재하에 배양하였다. GPx 활성을 유도되지 않은 세포 시스템 또는 40 mM AAPH로 유도된 시스템상에서 평가하였다. 데이타는 3회의 독립적 실험의 평균치를 나타낸다.
도 7. ROS의 세포내 생성에 대한 ARPE-19 세포 배양 배지 중의 DHA 농도의 효과. 당해 세포를 실험 전에 3일 동안 총 지방산에 대해 70중량%의 DHA를 함유하는 트리글리세라이드의 존재하에 배양하였다. (A) ROS의 검출은 180분 동안 40 또는 60 mM AAPH로 처리된 세포상에서 DHR 123(A) 또는 CDCFDA(B)를 이용하여 실시하 였다. 데이타는 3회의 독립적 실험의 평균치를 나타낸다.
도 8. ROS의 세포내 생성에 대한 ARPE-19 세포 배양 배지 중의 트리글리세라이드의 DHA 농도의 효과. 당해 세포를 실험 전에 3일 동안 각각의 트리글리세라이드의 존재하에 배양하였다. x-축상의 농도는 DHA 비율이 70중량%인 트리글리세라이드로 수득된 해당량이다. ROS의 검출은 180분 동안 40 mM AAPH로 처리된 세포상에서 DHR 123를 이용하여 실시하였다. 데이타는 3회의 독립적 실험의 평균치를 나타낸다. (B) 20%, 50% 및 70%의 오일중 DHA 농도에 대한 항산화 보호의 도시.
도 9. ARPE-19 세포에서의 TBARS의 생산에 대한 DHA 농도의 효과. 당해 세포를 표시한 농도에서, 실험 전에 3일 동안 총 지방산에 대해 70중량%의 DHA를 함유하는 트리글리세라이드의 존재하에 배양하였다. 산화적 스트레스는 6시간 및 24시간의 잠복시간 동안 40 mM AAPH로 유도하였다. 데이타는 3회의 독립적 실험의 평균치를 나타낸다.
도 10. 슈퍼옥사이드 음이온의 생성에 대한 ARPE-19 세포 배양 배지 중의 DHA 농도의 효과. 당해 세포를 실험 전에 3일 동안 총 지방산에 대해 70중량%의 DHA를 함유하는 트리글리세라이드의 존재하에 배양하였다. 슈퍼옥사이드 음이온의 검출을 AAPH 40 mM를 이용한 세포의 산화적 유도 직후에 화학발광에 의해 실시하였다. 데이타는 3회의 독립적 실험의 평균치를 나타낸다.
도 11. GPx 활성에 대한 ARPE-19 세포 배양 배지 중의 DHA 농도의 효과. 당해 세포를 실험 전에 3일 동안 총 지방산에 대해 70중량%의 DHA를 함유하는 트리글리세라이드의 존재하에 배양하였다. GPx 활성을 유도되지 않은 세포 시스템 또는 40 mM AAPH로 유도된 세포 시스템상에서 평가하였다. 데이타는 3회의 독립적 실험의 평균치를 나타낸다.
도 12. SOD 활성에 대한 ARPE-19 세포 배양 배지 중의 DHA 농도의 효과. 당해 세포를 실험 전에 3일 동안 총 지방산에 대해 70중량%의 DHA를 함유하는 트리글리세라이드의 존재하에 배양하였다. SOD 활성을 유도되지 않은 세포 시스템 또는 40 mM AAPH로 유도된 세포 시스템상에서 평가하였다. 데이타는 3회의 독립적 실험의 평균치를 나타낸다.
도 13. ARPE-19 세포(A 및 B) 또는 음경표피 세포(C 및 D)에서의 산화적 스트레스에 대한 세포성 보호%에 대한 화학적 합성(A 및 C) 또는 효소적 합성(B 및 D)에 의해 수득된 DHA 농도의 효과.
도 14. ARPE-19 세포에서 DHA에 의해 유도된 산화적 스트레스에 대한 세포성 보호%에 대한 화학적 합성으로 수득된 오일의 정제 정도의 영향.
도 15. ARPE-19 세포에서 DHA에 의해 유도된 산화적 스트레스에 대한 세포성 보호%에 대한 화학 구조의 영향.
도 16. ARPE-19 세포에서 글루타티온의 세포내 농도에 대한 DHA 농도의 효과. BSO의 존재하의 영향.
도 17. ARPE-19 세포에서 DHA에 의해 유도된 산화적 스트레스에 대한 세포성 보호%에 대한 글루타티온 신생(de novo) 합성의 영향.
도 18. 음경표피 세포에서 글루타틴온의 세포내 농도에 대한 DHA 농도의 영향. BSO의 존재하의 영향.
도 19. ARPE-19 세포에서 EPA에 의해 유도된 산화적 스트레스에 대한 세포성 보호%에 대한 화학적 합성으로 수득된 오일의 정제 정도의 영향. DHA와의 비교 연구.
도 20. 음경표피 세포에서 산화적 스트레스에 대한 세포성 보호%에 대한 EPA 농도의 효과. DHA와의 비교 연구.
도 21. 음경표피 세포에서 글루타티온의 세포내 농도에 대한 EPA 농도의 효과. BSO의 존재하의 영향.
도 22는 세포 보호%와 관련해 상이한 용량에서의 구조화된 및 비구조화된 트리글리세라이드 중의 DHA 비율의 효과를 보여주는 비교 막대 그래프이다.
상기 도 22는 비구조화된 글리세라이드 화학 구조(트리글리세라이드)를 sn-1 및 sn-3 위치가 카프릴산으로 대체된 동일한 구조(구조화됨)와 비교하는 경우에(상기 두 글리세라이드 모두는 20% 및 70%의 DNA 함량의 2가지 출발 수준을 가지는 효소 공급원 기원이다) 본 첨가의 목적하는 놀라운 결과를 보여준다.
상기 도면으로부터, 동일한 농도에서 글리세라이드, 특히 트리글리세라이드의 sn-2 위치로 혼입된 도코사헥사엔산(구조화됨)의 보호 비율은 비구조화된 DHA의 보호 비율에 비해서 약 3배 더 높다는 것이 관찰될 수 있다.
상기 도 22에서, 보호 비율은 대조군 세포 및 DHA로 처리된 세포 둘다를 백분율로 표시된 동일한 산화적 스트레스에 적용하였을 때 대조군 세포와 DHA로 처리된 세포의 반응성 산소 종의 세포내 농도에서의 차이의 관계를 나타낸다. 즉, 보호%의 존재는, 처리된 세포에서는 반응성 산소 종의 세포내 생성이 대조군에 비해 서 통계학적으로 유의적으로 덜하다는 것을 나타낸다.
도 23은 혼입된 DNA의 존재 또는 부재 하에 산화적 스트레스 하에 배양된 사람 섬유모세포내 텔로미어의 평균 길이를 세포집단의 계대 횟수(pass number)와 대비하여 보여주는 비교 그래프이다.
상기 도 23은 산화적 스트레스 조건하에 DHA의 존재하의 텔로미어 단축 지수가 대조군 또는 DHA 부재하의 경우보다 낮다는 것이 관찰되었다는 점에서 본 첨가의 목적하는 놀라운 결과를 보여준다.
도 24는 기저 수준에서 및 DHA를 4개월 섭취한 후에 경쟁, 비경쟁 및 모든 사이클 선수에 대한 "환기역치 2"(UV2)에서의 절대 산소 소비율을 도시한 그래프이다.
도 25는 기저 수준에서 및 DHA를 4개월 섭취한 후에 경쟁, 비경쟁 및 모든 사이클 선수에 대한 UV2에서의 심박수를 도시한 그래프이다.
도 26은 기저 수준에서 및 DHA를 4개월 섭취한 후에 경쟁, 비경쟁 및 모든 사이클 선수에 대한 UV2에 도달하는데 필요한 시간을 도시한 그래프이다.
도 27은 기저 수준에서 및 DHA를 4개월 섭취한 후에 경쟁, 비경쟁 및 모든 사이클 선수에 대한, 2000 ml/분 O2의 소비 동안 환기 역치에서의 심박수를 도시한 그래프이다.
도 28은 기저 수준에서 및 DHA를 3주 섭취한 후에 경쟁, 비경쟁 및 모든 사이클 선수에 대한 혈장 총 항산화능을 도시한 그래프이다. 각 경우에, 활동 시험 전의 항산화능(좌측 막대) 및 활동 시험 후의 항산화능(우측 막대)를 나타낸다.
도 29는 기저 수준에서 및 DHA를 3주 섭취한 후에 경쟁, 비경쟁 및 모든 스포츠맨에 대한 MDA 농도에 따른 원형질 지질에 대한 산화적 손상을 도시한 그래프이다. 각 경우에, 활동 시험 전의 산화적 손상(좌측 막대) 및 활동 시험 후의 산화적 손상(우측 막대)을 나타낸다.
도 30은 기저 수준에서 및 DHA를 3주 섭취한 후에 경쟁, 비경쟁 및 모든 스포츠맨에 대한, 산화적 스트레스 바이오마커 8-oxodG를 사용한 DNA에 대한 산화적 손상을 도시한 그래프이다. 각 경우에, 활동 시험 전의 산화적 손상(좌측 막대) 및 활동 시험 후의 산화적 손상(우측 막대)을 나타낸다.
도 31은 DHA를 섭취하지 않거나 3주 또는 4개월 동안 DHA를 섭취한 경쟁 스포츠맨에서의 신체적 활동 동안의 혈당량을 도시한 그래프이다.
도 32는 DHA를 섭취하지 않거나 3주 또는 4개월 동안 DHA를 섭취한 비경쟁 스포츠맨에서의 신체적 활동 동안의 혈당량을 도시한 그래프이다.
도 33은 DHA를 섭취하지 않거나 3주 또는 4개월 동안 DHA를 섭취한 경쟁 및 비경쟁 스포츠맨에서의 신체적 활동 동안의 혈당량을 도시한 그래프이다.
하기 실시예는 본 발명의 예시적 및 비제한적 실시예로서 포함된다.
항산화 활성을 평가하기 위한 재료 및 방법
세포 배양
사용된 세포 모델은 아메리칸 타입 컬쳐 컬렉션(American Type Culture Collection)으로부터 입수한 음경표피 세포(미분화 표피 섬유모세포, CRL-2076) 및 ARPE-19 세포(망막 색소성 상피 세포, CRL-2302)이다. 세포 배양물을 적합한 온도(37℃), CO2 조건(5%) 및 습도(95%)의 성장 조건하에 본 목적을 위해 특수하게 설계된 항온처리기 내에서 유지시켰다. ARPE-19 세포를 10% 소 태아 혈청, 페니실린 항생제(100 U/mL), 스트렙토마이신(100㎍/mL) 및 글루타민(Biological Industries)이 보충된 DMEM-F12 배지(Biological Industries)를 함유한 배양 플라스크 내에서 0.3×104개 세포/cm2의 컨플루언스(confluence)까지 성장하도록 유지시켰다. CRL-2076 섬유모세포를 배양 플라스크 내에서 10% 소 태아 혈청, 페니실린 항생제(100 U/mL), 스트렙토마이신(100㎍/mL) 및 글루타민(Biological Industries)이 보충된 이스코브 변형 둘베코 배지(Iscove's modified Dulbecco's medium)(Biological Industries) 중에서 성장하도록 유지시켰다. 실험을 수행할 수 있기 위해 세포를 24시간 동안 37℃에서 부착용 기판상에서 75ml 플라스크로부터 6웰, 12웰 또는 96웰 플레이트(106개 세포/mL)로 옮겼다.
세포내로의 DHA의 통합
모액(1:100)용 에탄올 중에 오일을 용해시키고 혈청으로 제조된 배양 배지 중의 실험 용액(working solution)을 제조함으로써 만들어진 DHA-TG를 20%, 50% 및 70%로 농축된 DHA-TG(오일 밀도 0.92 g/mL)로 출발하여 각종 농도(0.5 내지 50μM)로 부가하였다. 세포를 37℃에서 3일 동안 보충된 DHA-TG 배지로 배양하였다.
산화적 스트레스의 유도
다양한 유도 세포(inducer cell)를 사용하여 세포를 산화시켜 스트레스를 가하였다:
a) 하이포크산틴 및 크산틴의 뇨산으로의 산화와 O2의 O·-2 및 H2O2로의 환원을 촉매하는 크산틴/크산틴 옥시다제 시스템 0.8 mM/10-2 U/mL.
b) 지질 과산화 및 단백질 과산화를 유도함으로써 유리 라디칼의 친수성 개시제로서 광범위하게 사용되는 2,2'-아조비스-(2-아미디노프로판)디하이드로클로라이드(AAPH) 1 내지 100 mM. AAPH는 형성된 퍼옥실(peroxil) 라디칼의 작용을 통해서 DNA, 단백질 및 지질을 산화시킨다. AAPH는 주요 효소인 SOD를 탈활성화시켜 CAT 및 GPx의 보호능을 상실시키기 때문에 추가로 내인성 방어 시스템에 작용한다.
반응성 산소 종(ROS)의 생성
ROS 수준을 180분이 될 때까지 매 30분 마다 측정하는 연속적 시스템에서 형광 프로브로서 디하이드로로다민 123(DHR123, 제조원: Molecular Probes) 및 2,7-디클로로플루오레세인 디아세테이트(H2DCFDA, 제조원: Molecular Probes)를 사용하여 사람 피부 CRL-2076 섬유모세포 및 ARPE-19 망막 상피 세포의 1차 배양물에서 측정하였다. 두 경우 모두에서, 이는 ROS 생성의 비특이적 측정치이다. 형광성 프로브를 세포에 10μM의 최종 농도로 부가하였다(1×106개 세포/mL). 산화된 프로브(2,7-디클로로플루오레세인 및 로다민 123)의 형광을 488 nm의 여기 파장 및 525 nm의 방출 파장에서 시간의 함수로서 Mithras 형광 판독기로 측정하였다. 수득된 형광을 하기 개요된 MTT 분광광도계 기술을 사용하여 세포 생존성 측정으로 조정하였다.
세포 생존성
각종 샘플의 세포독성 효과를 평가하기 위해 세포 생존성 연구를 수행하였다. 당해 방법은 수성 배지 중에서 가용성인 MTT 시약(3-(4,5-디메틸티아졸-2-일)-2,5-디페닐테트라조일 브로마이드, Sigma)를 배양 배지에 부가하는 것으로 이루어진다. 생존성 세포는 상기 화합물을 대사시키며 포르마잔 염으로 전환시킨다. 상기 염은 수성 배지중에서 불용성이고 DMSO 중에서 가용성이고 세포 생존성을 측정하는데 유용한 비색 화합물이다. 당해 방법은 7.5mg/ml(과량으로) MTT 용액을 웰당 20㎕으로 부가하는 것으로 이루어진다. 이것을 37℃에서 1시간 동안 항온처리하여 생존성 세포가 당해 화합물을 대사하여 포르마잔 염을 생성하는 한편, 비-생존성 세포는 그렇지 않도록 한다. 1시간 동안 항온처리한 후, 세포를 침전시키고 포르마잔 염을 용해시킬 수 있는 DMSO 100㎕를 부가한다. 마지막으로, 550nm에서의 흡광도를 플레이트 판독기에서 판독한다. 생존성 결과는 대조군을 100% 생존을 갖는다고 가정하여 대조군과 비교한 광학밀도 백분율로서 표시한다. 웰당 배지 용적을 약 200㎕으로 하여 웰당 약 20,000개 세포(성장 비율의 함수로서 세포의 적합한 개수의 분석에 따름)를 접종시켜 96웰 플레이트상에서 세포 생존성 곡선을 작도하였다. IC50 값을 찾아내기 위해 충분히 넓은 범위의 농도에서 세포를 생성물에 72시간 동안 노출시킨 후에 생성물의 효능성의 연구를 실시하였다. 실험 결과를 시그마 플롯 8.0을 사용하여 힐(Hill) 방정식에 대해 조정하여 IC50(대조군과 비교하여 배양물의 생존성을 50%까지 감소시키는데 필요한 DHA 농도로서 정의됨)을 측정하였다.
단백질의 측정
측정은 단백질이 0.5 내지 20㎍/ml의 농도 범위에서 희석된 샘플 중에서 측정될 수 있도록 하는 최적화된 디진코닌산(dizinconinic acid) 제형을 이용하는 단백질의 비색 검출 및 총 정량에 기초한다. 당해 방법은 알칼리 배지중 단백질에 의해 Cu+2로 환원되는 Cu+1에 대한 검출제를 이용한다. BCA의 두 분자가 제1 구리 이온으로 킬레이트화됨에 의해 자주색 반응 생성물이 형성된다. 수용성 착물은 562nm에서 흡수한다. 보정 곡선을 사용하여 방정식을 수득하고, 이때 결과는 ㎍/단백질 mL로서 나타낸다. 사용되는 시판 키트는 MicroBCA(제조원: Pierce, No. 23235)이다.
ROS 생성의 직접적 분석
지질 하이드로퍼옥사이드 생성의 측정
세포 용해물상에서 말로닐디알데히드(MDA)의 측정을 UV-Vis 분광광도측정법에 의해 지질 과산화의 마커로서 사용하였다. MDA 및 4-하이드록시알켄알(HAE)은 다중불포화 지방산 및 관련 에스테르의 과산화로부터 유도되는 생성물이다. 이들 알데히드의 직접적 측정은 지질 과산화의 적절한 지수(convenient index)를 구성한다. 시판되는 지질 과산화 키트(제조원: Calbiochem, No. 437634)을 사용하면서, 45℃에서 MDA와 반응하는 발색성 시약(아세토니트릴 중의 N-메틸-2-페닐-인돌)을 사용하였다. MDA의 1개 분자와 발색성 시약의 2개 분자와의 축합은 586nm에서 최 대 흡광도를 갖고 검출 한계치가 0.1μM인 안정한 발색단을 생성시킨다. 40 mM AAPH를 이용하여 6시간 및 24시간의 잠복시간 동안 유도를 실시하였다. 세포(107개 세포/mL)를 액체 N2 중에서 동결 및 해동 사이클에 의해 용해시켰다. MDA 및 단백질을 측정하기 위해 샘플을 분획화하였다. 결과는 MDA μM/단백질 mg로 표시하였다.
슈퍼옥사이드 음이온 생성의 측정
슈퍼옥사이드 음이온의 직접적 측정을 루미놀(Calbiochem, No. 574590)로 측정되는 마이크로플레이트상에서 화학발광 기술에 의해 실시하였다. 슈퍼옥사이드 음이온을 검출하기 위한 화학발광은 루미놀과의 높은 반응 특이성으로 인해서 모든 세포내 슈퍼옥사이드 생성 부위로 접근할 수 있는 잠재성, 최소 세포내 독성 및 다른 화학 기술에 비해서 증가된 민감성 때문에 사용되는 기술이다. 화학발광은 그 빛이 표준 조도계에서 신속하게 측정되는 광자를 생성하는 반응에서 루미놀을 산화시키는 슈퍼옥사이드 음이온에 기초한다. 본 발명의 시험에서, 본 발명자들은 ELISA로부터의 마이크로플레이트상의 화학발광 판독기, MITHRAS를 사용하였으며, 추가로 라디칼의 짧은 반감기를 고려하여, 시험의 민감성을 증가시키고 반응을 증폭시키기 위해 인핸서(enhancer)를 사용하였다. 상기 시약은 독성이 아니고 아세포 시스템 성분을 변성시키기 않기 때문에 살아있는 세포에서 사용될 수 있다. ROS 생성에 대한 시험관내 차단 분석법용으로 흔히 사용되고 세포 막을 투과할 수 있는 특이적 슈퍼옥사이드 음이온 격리제인 Tyron(4,5-디하이드록시-1,3-벤젠 디설 폰산, 제조원: Sigma)을 사용하여 슈퍼옥사이드 음이온의 생성을 억제하는 능력을 또한 조사하였으며, 내인성 항산화 방어에서 제1선 효소를 구성하는 슈퍼옥사이드 디스뮤타제(SOD, Sigma)를 효소 차단제로서 사용하였다. AAPH 산화적 스트레스 유도 처리를 한 세포에서의 화학발광 측정을 총 4100초 동안에 120초/사이클의 횟수로 매 60초마다 분석하였다. 결과는 화학발광 UA/단백질 mg로 표시한다.
항산화 효소 활성의 측정
글루타티온 퍼옥시다제(GPx) 활성의 측정
GPx는 하이드로퍼옥사이드의 환원된 글루타티온으로의 환원을 촉매하며, 세포를 산화적 손상으로부터 보호하는 기능을 한다. 이는 셀레노시스테인의 환원된 형태를 재생시키는 최종 전자 공여체로서 글루타티온을 사용한다. GPx의 간접 측정은 글루타티온 리덕타제와의 커플링된 반응에 의해 수득된다. GPx의 작용에 의한 하이드로퍼옥사이드와의 반응에 의해 생성된 산화된 글루타티온(GSSG)은 조효소로서 NADPH를 사용하는 글루타티온 리덕타제에 의해 이의 환원된 상태로 재순화된다. NADPH의 NADP+로의 산화는 340nm에서의 이의 흡광도의 감소를 동반한다. 340nm에서의 흡광도 감소속도는 샘플의 GPx 활성에 직접적으로 비례한다. ELISA 마이크로플레이트 분광광도측정 키트(제조원; Cayman, No. 703102)를 1차 배양물의 세포 용해물 중에서 GPx를 검출하기 위해 사용하였다. 세포는 37℃에서 24시간 동안 기판에 부착시켜 배양하였다. 세포 용해물을 Tris 50mM(pH 7.5), EDTA 5mM 및 DTT 1mM에서 초음파 처리하여 수득하였다. GPx의 활성은 분당 A340nm의 변화(ΔA340) 를 측정하여 수득되며, 샘플로부터의 NADPH 나노몰/분/단백질 mg로서 표시한다.
슈퍼옥사이드 디스뮤타제 활성(SOD)의 측정
당해 화학발광 방법은 SOD의 양성 대조군(Calbiochem No. 574590)과 비교한 세포 상청액 중의 SOD 활성의 분석에 기초한다. 크산틴 옥시다제-크산틴-루미놀 시스템 중의 SOD의 존재는 SOD 활성에 비례하는 슈퍼옥사이드 음이온의 불균등화(dismutation)가 감소됨에 따라 생성되는 화학발광의 감소를 유도한다. 분석은 최종 반응 시간 520초까지 50 msec의 간격으로 MITHRAS 조도계상에서 실시한다.
세포 용해물 중의 슈퍼옥사이드 디스뮤타제 활성(SOD)를 크산틴 옥시다제/하이포크산틴 시스템에 의해 생성되는 슈퍼옥사이드 라디칼을 검출하기 위해 테트라졸륨 염을 사용하는 반응에 의해 또한 측정하였다. 세포질성 및 미토콘드리아성인 3가지 유형의 SOD(Cu-Zn-SOD; Mn-SOD 및 Fe-SOD)를 측정하기 위해 마이크로플레이트상에서 분광광도측정 방법이 사용된다. SOD 1유닛(unit)은 생성된 슈퍼옥사이드 음이온의 50%를 불균등화시키는데 요구되는 효소의 양으로서 정의된다. 1차 배양물로부터의 세포 용해물 중에서 SOD를 검출하기 위해, 제조업자에 의해 최적화된 프로토콜에 따라서 Cayman 키트(N. 706002)를 사용하였다. 분석법의 동작범위(dynamic range)는 0.025 내지 0.25 SOD 유닛/ml이다.
세포내 내인성 항산화제 농도의 측정
환원된 글루타티온 세포내 농도(GSH)의 측정
세포 용해물 중 환원된 글루타티온(GSH)를 측정하기 위한 직접적 동역학 분석법. 글루타티온은 세포 내부에서 조직내 주요 항산화제인 환원된 형태(총 글루타티온의 90 내지 95%)로 주로 발견될 수 있다. 이의 역할은 생체이물질을 해독시키고 하이드로퍼옥사이드를 제거하여 세포의 산화환원 상태를 유지시킨다. 사용되는 기술은 설포살리실산(Sigma-Aldrich CS0260 키트)으로 미리 단백질제거된 생물학적 샘플(세포 용해물) 중의 총 글루타티온(GSSG + GSH)를 측정한다. GSH는 5,5'-디티오비스(2-니트로벤조산)(DTNB)을 5-티오(2-니트로벤조산)(TNB)으로 연속적으로 환원시키고, 형성된 GSSG는 글루타티온 리덕타제 및 NADPH에 의해 재순화된다. TNB는 분광광도측정법에 의해 412nm에서 측정된다. 감마-글루타밀시스테인 신테타제를 특이적으로 억제하는 부티오닌 설폭시민(BSO)을 합성 억제제로서 사용하였다.
사람 피부 모델에서의 DHA의 항산화 활성의 평가
당해 시험관내 분석법에서는, 표준 영양 요건과 배양 조건을 갖는 1차 배양물인 것 이외에도 각종 산화 유도제에 대한 시험관내 반응이 우수하고 따라서 DHA의 잠재적 화장품 용도를 위한 생체내 반응이 추론될 수 있는 우수한 시험관내 모델을 구성하기 때문에 적합한 세포 유형인 음경표피 세포(미분화 표피 섬유모세포, ATCC CRL-2076)를 세포 모델로서 사용하였다.
결과
모든 연구 조건하에 활성인 세포 모델을 달성하기 위해 조건을 초기에 설계하였다. 이는 수득된 결과가 대사적으로 활성인 세포를 가리킨다는 것을 의미한다. 선행 연구는 이미, 음경표피 세포에서 1000μM 미만의 DHA는 3일째 연구에서 세포 생존성에 영향을 주지 않음을 보여주었다. 크산틴/크산틴 옥시다제 시스템 또는 AAPH를 이용한 산화적 스트레스의 연구 동안에 세포 생존성은 전혀 영향받지 않았다. 3일 동안 음경표피 세포의 배양물 중의 50μM 농도 이하의 DHA의 혼입은 각각 슈퍼옥사이드 음이온에 대해 보다 특이적이고, 하이드로퍼옥사이드의 검출을 위한 2종의 프로브 디하이드로로다민(DHR123) 및 2,7-디클로로플루오레세인(H2DCFDA)와 관련된 세포성 형광으로서 측정된 세포의 산화적 수준을 유의하게 증가시키지 않는 것으로 나타났다. 일단 이러한 조건들이 확립되면, 음경표피 세포의 막으로 혼입된 DHA의 전반적 항산화능을 크산틴/크산틴 옥시다제 또는 AAPH에 의해 유도된 산화적 스트레스에 대해 평가하였다.
40mM AAPH을 이용하여 온화한 산화적 스트레스를 유도하고 ROS 검출제로서 DHR123를 이용하는 경우에, DHA는 0.5μM (59% 보호) 및 5μM (33% 보호) 농도 둘다에서 반응성 산소 종의 생성에 대한 억제 효과를 나타내며, 10 μM(26% 보호)의 DHA에서는 낮은 효과가 나타나며 50 μM의 DHA에서는 효과가 없다(도 1A). 세포를 60 mM AAPH를 이용하여 엄중한 유도에 적용한 경우, DHA는 0.5μM (40% 보호) 및 5μM (29% 보호) 농도 둘다에서 ROS의 생성에 대해 보호 효과를 나타내지만, 보다 높은 DHA 농도에서는 효과가 상실된다(도 1A).
본 발명자들은 0.5 μM DHA가 크산틴/크산틴 옥시다제에 의해 유도된 산화적 스트레스에 대해 보호 효과를 발휘하고 산화 과정에서 생성된 산소 반응성 종, 즉 슈퍼옥사이드 음이온 및 하이드로퍼옥사이드 둘다에 대해 격리 효과를 나타냈음을 주목하였다. 항산화능을 비타민 E와 같은 지질 항산화제와 비교하는 경우, 본 발명자들은 당해 DHA가 유사한 보호 동역학을 발휘함을 관찰하였다(DHA는 세포 산화를 33.46%까지 억제하며 비타민 E는 30%까지 억제한다).
DHA의 보호 동역학 반응은 유도를 수행한 후 60분 내지 120분에서 항상 최대의 항산화 효과를 나타내며, 이는 DHA의 하이드로퍼옥사이드 및 슈퍼옥사이드 음이온 격리 능력에서의 포화를 의미한다. 항산화제의 농도 증가가 ROS 격리 효과의 상실을 유도하며, 0.5μM 농도가 가장 효과적인 항산화능을 갖기 때문에, 항산화제 거동은 결정적으로 용량-의존적이다. 이와 관련하여, 시스템의 효율을 최적화시키는데 있어 결정적인 다른 파라메터는 총 지방산에 대한 DHA의 비율이다. 도 2에 도시된 바와 같이, 트리글리세라이드의 동일한 농도에서 DHA의 비율이 50 또는 20%로 감소되면, 세포 산화능이 급격하게 감소되고, 낮은 또는 중간 농도에서는 산화촉진제로 되돌아간다. 이러한 결과들은 DHA의 세포성 항산화 효과가 전적으로 이의 농도에만 의존하지 않고 DHA의 분자적 국소화, 당해 경우에는 트리글리세라이드의 구조내의 DHA의 분포 또한 결정적 인자임을 나타내는 것으로 보인다.
ROS 생성의 특이적 억제에 관해서는, 본 발명자들은 지질 퍼옥사이드(TBARS) 및 슈퍼옥사이드 음이온의 생성을 분석하였다. 수득된 결과는 AAPH로 처리된 세포가, 유도되지 않은 세포와 비교해서, 티오바비투르산(TBARS)에 대해 반응성인 기질을 보다 높은 농도(MDA의 μM/단백질 mg로 표시함)로 생성하였음을 보여주었다(도 3). 예상한 바와 같이, 음경표피 세포 막내로의 DHA의 혼입은 기저 세포성 지질 과산화를 용량-의존적 방식으로 다소 증가시켰다(0.5, 5 및 50 μM)(도 3). 40 mM AAPH를 이용하여 산화적 유도 처리한 세포에서는, DHA는 막 수분지질(hydrolipidic) 퍼옥사이드의 생성으로부터 섬유모세포를 보호하는 항산화 활성을 나타내며, 이의 작용은 농도-의존적 유형과 반대되는 것이다. DHA에 의한 보호는 0.5 μM DHA의 경우에 87%였고, 5 μM DHA의 경우에 85%였고, 50 μM DHA-TG의 경우에 48%였다(도 3).
이어서, 슈퍼옥사이드 음이온의 생성을 분석하였다. 40 mM AAPH을 이용하여 산화적 스트레스 처리한 음경표피 세포는 일정한 슈퍼옥사이드 음이온 수준을 유지하는 유도되지 않은 세포에 비해서 2.5배 더 많은 슈퍼옥사이드 음이온 생산량을 산출하였다(도 4). 산화적 유도의 부재하에, DHA가 통합된 세포는 대조군과 비교하여 보다 높은 수준의 세포내 슈퍼옥사이드 음이온을 나타내지 않는다(도 4). 산화적 스트레스 조건하에(도 4), DHA는 슈퍼옥사이드의 음이온의 생성을 0.5 μM의 농도에서는 16.5%까지 억제하고, 5μM의 농도에서는 10%까지 억제하고, 50μM의 농도에서는 9%까지 억제한다. 당해 방법의 특이성은 Tyron(4,5-디하이드록시-1,3-벤젠 디설폰산, 세포내 슈퍼옥사이드 음이온의 고도로 특이적인 격리제로서 작용하는, 세포 막을 투과할 수 있는 화합물) 또는 세포외 SOD(세포내 슈퍼옥사이드 음이온의 불균등화를 통한 내인성 항산화 방어에서의 제1선 효소 차단제)에 의해 확인하였다. 미리 통합된 DHA의 존재 또는 부재하에, 내인성 SOD 또는 Tyron의 존재하에, AAPH를 이용하여 스트레스를 가한 세포에서의 슈퍼옥사이드 음이온의 생성은 완전히 억제되었으며 기저치를 달성하였다(도 4).
마지막으로, 본 발명자들은 제1선 세포성 항산화 효소의 활성을 변형시킴으로써 DHA가 항산화 활성을 갖게 되는지를 분석하였다. DHA가 통합되었거나 통합되지 않은 음경표피 세포에서의 SOD 및 GPx의 활성을 분석하였다. 첫번째 경우에, 크산틴/크산틴 옥시다제 시스템을 슈퍼옥사이드 음이온(총 측정 시간 520초, 매 50 msec마다 측정함)의 즉각적 생성기로서 사용하였다. 수득된 결과는 슈퍼옥사이드 음이온의 불균등화 및 비-생산이 직접적 관찰과 함께 우수한 산화적 유도를 신속한 동역학으로 나타냈다. 산화적 유도한지 15초 후에 달성된 최대 화학발광을 SOD 활성의 간접적 및 정량적 측정치로서 해석하였다(도 5A). 통합된 DHA의 부재하에, 310 U.A. 화학발광/106개 세포의 값이 달성되었으며, DHA 0.5μM(52% 항산화 보호)와 함께 예비항온처리한 시스템에서는 150 U.A. 화학발광/106개 세포로 저하되었다(도 5A). 항산화 효능은 각각 5 및 50 μM의 DHA로 처리된 세포에서는 52% 및 42%로 유지되었다(도 5A). 게다가, AAPH가 생성된 퍼옥실 라디칼의 분산에 의해 DNA, 단백질 및 지질을 산화시킨다는 것을 알고 있고 있기 때문에, 항산화제로서의 DHA는 슈퍼옥사이드 음이온의 불균등화를 책임지는 SOD의 불활성화를 방지하여, 세포내에서 카탈라제 및 글루타티온 퍼옥시다제의 내인성 항산화 방어를 유지시킬 수 있다. 이러한 측면은 도 5B에서 확인되며, 당해 도면에서 SOD 활성은 DHA가 존재하는 경우에 기저 상태에서 증가하지 않는 것으로 나타나지만(-10/-15%), 산화적 스트레스 과정 고유의 SOD 활성의 상실은 DHA가 존재하는 경우에 억제되어 SOD 활성이 유지되거나 심지어 증가된다(10/20%). GPx 활성(도 6)의 경우, 이것은 적당한 DHA 농도에서 세포성 기저 상태에서 증가되는 것으로 확인되지만(5μM에서 17%까지), 높은 농도에서는 감소된다(50μM에서 -20%). 이러한 거동은 산화적 스트레스 상태에서 온전하게 유지된다(도 6). 이러한 결과들은 DHA가 시험된 전체 농도 범위에 걸쳐서 SOD를 생성함에 의해 슈퍼옥사이드 음이온의 불균등화와 관련되는 내인성 항산화 방어 시스템과 함께 공동으로 작용하며, 또한 GPx 활성을 증가시키기 때문에 적당한 농도에서 하이드로퍼옥사이드의 생성을 조절할 수 있음을 제시한다.
망막 세포 모델에서 DHA의 항산화 활성의 평가
당해 시험관내 연구에서, 세포 모델은, 각종 산화 유도제에 대한 시험관내 반응이 우수하고 표준 영양 요건과 배양 조건을 갖는 1차 배양물이기 때문에 적합한 세포 유형인 ARPE-19 세포(색소성 망막 상피 세포, ATCC CRL-2302)에 기초한다. 이는 또한 망막 색소성 상피 세포의 생물학적 및 기능적 특성을 유지하기 때문에 우수한 안구 모델을 구성한다.
결과
당해 세포주로 실시된 분석법은 앞의 단락에서 음경표피 세포에 대해 기술한 바와 유사하다. 기본적 요건은 모든 실험 조건(산화적 스트레스에 대한 DHA의 효과)하에 세포 생존성을 유지시킨다는 점에서 동일하다. 분석된 용량의 DHA의 혼입은 기저 세포성 산화 상태에서의 어떠한 유의적 변경도 포함하지 않았다.
40mM AAPH을 이용하여 온화한 산화적 스트레스를 유도하고 ROS 검출제로서 DHR123를 이용하는 경우에, DHA는 0.5μM (43% 보호) 및 5μM (32% 보호)의 농도에서 반응성 산소 종의 생성에 대한 억제 효과를 나타내지만, 50 μM(26% 보호)의 DHA에서는 낮은 효과가 나타난다(도 7A). 세포를 60 mM AAPH를 이용하여 엄중한 유도에 적용한 경우, DHA는 0.5μM 농도(13% 보호)에서 ROS 생성에 대한 보호 효과를 나타내며 보다 높은 농도의 DHA에서는 보호 효과가 더 낮다(도 7A). 이러한 결 과들은 음경표피 세포로 수득된 결과와 유사하지만, 한가지 주목할만한 상이한 효과는 엄중한 산화적 유도에 대해 관찰되는 보다 낮은 보호이다. ROS 검출을 위해 퍼옥시다제에 대해 보다 특이적인 CDCFDA를 사용한 경우에, DHA는 AAPH에 의해 유도된 산화적 스트레스에 대해 보호 효과를 발휘하는 것으로 나타난다(도 7B).
DHA의 보호 동역학은 유도를 수행한 후 60분 내지 120분에서 항상 최대의 항산화 효과를 나타내며, 이는 DHA의 하이드로퍼옥사이드 및 슈퍼옥사이드 음이온 격리 능력에서의 포화를 의미한다. 정량적으로, 항산화제의 농도 증가가 ROS 격리 효과의 상실을 유도하며, 0.5μM 농도가 가장 효과적인 항산화능을 갖기 때문에, 항산화능은 결정적으로 용량-의존적이다(도 7A 및 7B). 이와 관련하여, 시스템의 효율을 최적화시키는데 있어 결정적인 다른 파라메터는 총 지방산에 대한 DHA의 비율이다. 총 지방산에 대한 DHA의 비율이 70%에서 50 내지 20%로 유의적으로 및 비례하지 않게 감소되면, 최적 농도(0.5 내지 5μM)에서의 세포 산화능이 감소되어 높은 농도에서의 산화능과 동일하게 되지만(도 8A 및 8B), 비율이 없는 상태에서의 음경표피 세포와 달리 DHA는 산화촉진성이 된다. 이러한 결과들은 DHA의 세포성 항산화 효과가 전적으로 이의 농도에만 의존하지 않고 DHA의 분자적 국소화, 당해 경우에는 트리글리세라이드의 구조내의 DHA의 분포 또한 결정적 인자임을 확인시켜 주었다.
ROS 생성의 특이적 억제제에 관해서는, 지질 퍼옥사이드(TBARS)(도 9) 및 슈퍼옥사이드 음이온(도 10)의 생성을 분석하였다. 수득된 결과는 음경표피 세포로 수득된 결과가 매우 유사하다. AAPH로 처리된 세포는 유도되지 않은 세포와 비교해서, 티오바비투르산(TBARS)에 대해 반응성인 기질 및 슈퍼옥사이드 음이온을 보다 높은 농도로 생성한다. 산화적 유도에 적용된 세포에서는 DHA가 이의 농도에 대한 역비율로 막 지질 하이드로퍼옥사이드의 생성으로부터 이들을 억제하는 세포성 항산화 활성을 나타내지만, ARPE-19 세포 막내로의 DHA의 혼입은 기저 세포성 지질 과산화를 용량-의존적 방식으로 다소 증가시킨다(0.5, 5 및 50 μM). DHA에 의한 보호는 0.5 μM DHA의 경우에 64%였고, 5 μM DHA의 경우에 58%였고, 50 μM DHA의 경우에 42%였다(도 9). 이어서, 슈퍼옥사이드 음이온의 생성을 분석하였다. 산화적 유도의 부재하에, DHA가 통합된 세포는 대조군과 비교하여 보다 높은 수준의 세포내 슈퍼옥사이드 음이온을 나타내지 않는다(도 10A). 40 mM AAPH에 의한 산화적 스트레스는 슈퍼옥사이드 음이온을 생성하며, 이것은 DHA에 의해 부분적으로 억제된다(0.5 내지 50μM의 농도에서 20 내지 16%). 이러한 억제는 DHA가 존재할 때의 SOD 활성과 일치한다(도 10B). SOD 활성은 DHA가 존재할 때에 기저 상태에서 증가하지 않는 것으로 확인되지만(-10/-15%), 음경표피 세포에서와 같이, 산화적 스트레스 과정 고유의 SOD 활성 상실은 DHA가 존재하는 경우에 억제되어 기저 SOD 활성이 유지된다.
마지막으로, DHA가 제1선 세포성 항산화제로서의 GPx 효소의 활성을 변경시켰는지를 알아내기 위해 분석을 실시하였다(도 11). GPx 활성은 시험된 모든 DHA 농도(12 내지 40%)에서 세포성 기저 상태에서 증가하며, 이러한 거동은 산화적 유도 상태에서 온전하게 유지되며, 이는 또한 2.5배 더 높은 GPx 활성을 나타낸다(도 11). 음경표피 세포의 경우에서와 같이, 이러한 결과들은 DHA가 부분적으로는 내인성 세포성 효소 시스템 항산화 방어의 활성을 조절함으로써 이의 항산화 효과를 발휘함을 제시한다.
트리글리세라이드 내로 혼입된 DHA의 항산화 활성에 있어 합성 방법의 영향
당해 시험관내 분석법에서는, 각종 산화 유도제에 대한 우수한 시험관내 반응으로 인해 적합한 세포주인 ARPE-19 세포(망막 색소성 상피 세포, ATCC CRL-2302) 및 음경표피 세포(미분화 표피 섬유모세포, ATCC CRL-2076)를 세포 모델로서 사용하였다. 참치 오일 트리글리세라이드(DHA20%-TG, DHA 중의 20mol%) 또는 화학적 방법(CHEM) 또는 효소적 방법(ENZ)에 의해 수득된 DHA가 50mol% 또는 70mol% 농축된 오일 유도체(DHA50%-TG 및 DHA70%-TG)를 활성 성분으로서 사용하였다.
결과
ARPE-19 세포에서 40 mM AAPH를 이용하여 온화한 산화적 스트레스를 유도하고 ROS 세포내 검출제로서 DHR123 또는 H2DCFDA를 사용하는 경우, 천연 DHA (DHA20%-TG) 및 화학적으로 수득된 트리글리세라이드내로 혼입된 DHA(DHA50%-TG-CHEM 및 DHA70%-TG-CHEM)는 0.5 μM 및 5 μM 농도 둘다에서 반응성 산소 종의 생성에서의 억제 효과를 나타내며 50 μM에서는 보다 낮은 효과를 나타낸다(도 13A). 이러한 효과는 DHA의 함량에 의존하며 DHA70%-TG-CHEM > DHA50%-TG-CHEM > DHA20%-TG 순이다. 동일한 농도(0.5, 5 및 50 μM)에서, 효소적으로 수득된 오일은 모든 DHA 함량(DHA70%-TG-ENZ 및 DHA50%-TG-ENZ)에서 보다 높은 활성을 나타낸다(도 13B). 음경표피 세포를 이용한 연구와 유사하게, 당해 결과는 보다 놀라웠다. 산화촉진 활성은 보다 높은 용량의 DHA70%-TG-CHEM 및 DHA50%-TG-CHEM의 경우에 나타났으며(도 13C)은 항산화 활성은 효소적 기원의 오일(DHA70%-TG-ENZ 및 DHA50%-TG-ENZ)의 경우에 모든 농도에서 나타났다(도 13D). 크로마토그래피 방법에 의해 화학적으로 수득된 오일(DHA70%-Tg-BPM)의 내재성 중합체의 제거는 ARPE-19 세포에서 보다 많은 항산화 활성의 감소를 유발하며 고 농도(5 및 50μM)에서는 산화촉진성이 된다(도 14). 효소적 합성에 의해 수득된 트리글리세라이드내로 혼입된 DHA의 항산화 활성도 또한 에틸 에스테르, 유리 지방산 또는 혈청 알부민에 연결된 지방산과 같은 다른 화학적 구조내로 혼입된 DHA에 의해 나타난 것보다 높다(2배 이상)(도 15).
DHA의 혼입으로 나타난 세포성 항산화 활성은 SOD 및 GPx 효소 활성의 유지와 같은 이미 고려된 모든 측면과 관련될 뿐만 아니라 글루타티온 세포내 농도(GSH)의 증가와 관련된다. ARPE-19 세포(도 16)에서, DHA는, BSO(GSH 합성의 특이적 억제제)의 부가가 GSH 세포내 농도의 감소(도 15)와 직접적으로 관련하여 DHA의 보호 효과를 제거하기 때문에(도 17), GSH 신생 합성과 직접 관련된 GSH 세포내 농도의 증가를 유도한다. 유사한 거동은 음경표피 세포에서 나타난다(도 18).
효소적 합성에 의한 DHA의 항산화 활성에서 수득된 개선은 또한 에이코사펜타엔산(EPA)과 같은 다른 오메가-3 지방산에도 적용될 수 있다. ARPE-19 세포를 이용한 연구에서, 효소적으로 수득된 EPA(EPA70%-TG-ENZ)는 DHA(DHA70%-TG-ENZ)의 경우에 관찰된 것보다 매우 낮더라도 항산화 활성을 갖는 것으로 나타난 반면에, 화학적으로 수득되고 중합체를 함유하지 않는 EPA(EPA-70%-TG-BPM)는 매우 산화촉진성인 것으로 나타난다(도 19). 게다가, 효소적으로 수득된 EPA(EPA70%-Tg-ENZ)는 음경표피 세포에서 DHA(DHA70%-TG-ENZ)에 대한 항산화 활성보다 더욱 높은 현저한 항산화 활성을 나타내며(도 20), DHA의 경우와 마찬가지로 GSH 세포내 농도의 증가와 관련된다(도 21).
망막 세포 모델에서 구조화된 트리글리세라이드내로 혼입된 DHA의 항산화 활성의 평가
당해 시험관내 분석법에서는, 표준 영양 요건과 배양 조건을 갖는 1차 배양물인 것 이외에도 각종 산화 유도제에 대한 시험관내 반응이 우수하기 때문에 적합한 세포 유형인 ARPE-19 세포(망막 색소성 상피 세포, ATCC CRL-2302)를 세포 모델로서 사용하였다. 또한, 당해 세포는 망막 색소성 상피 세포의 생물학적 및 기능적 특성을 유지하기 때문에 우수한 안구 모델이다. 활성 성분으로서 효소적 방법을 통해서 sn-1 및 sn-3 위치의 지방산이 옥탄산으로 대체된, 참치 오일(DHA 20%-TG, DHA 중의 20mol%) 또는 70% DHA가 농축된 오일(DHA70%-TG, DHA 중의 70mol%)로부터 유도된 구조화된 트리글리세라이드를 사용하였다. 이들 신규 화합물에서, DHA의 몰 함량은 DHA20%-TG중 7% 및 DHA70%-TG중 22%이다.
결과(도 22 참조)
40mM AAPH을 이용하여 온화한 산화적 스트레스를 유도하고 ROS 검출제로서 DHR123를 이용하는 경우에, 표준 트리글리세라이드(DHA20%-TG 및 DHA70%-TG)내로 혼입된 DHA는 0.5μM 및 5μM 농도 둘다에서 반응성 산소 종의 생성에 대한 억제 효과를 나타내며 50 μM에서는 보다 낮은 효과를 나타낸다(도 22). 이러한 효과는 DHA의 함량에 의존하며 DHA70%-TG > DHA20%-TG 순이다. 동일한 농도에서, 실제 DHA 농도가 2 내지 3배 낮은 구조화된 오일은 DHA20%-TG의 경우에 동일한 활성(0.5μM 농도의 경우) 또는 보다 높은 활성(5μM 및 50μM의 경우)을 나타낸다. DHA70%-TG의 경우, 구조화된 트리글리세라이드의 효능은 최적 농도(0.5μM 및 5μM)보다 다소 낮지만, 고 농도(50μM)에서의 거동은 반대가 되며 일반적으로 보다 안정하고 덜 용량-의존적 거동을 나타낸다.
사람 피부 모델에서 노화와 연관된 텔로미어의 길이의 보호제로서의 DHA 활성의 평가
당해 시험관내 분석법에서는, 표준 영양 요건과 배양 조건을 갖는 1차 배양물인 것 이외에도 각종 산화 유도제에 대한 시험관내 반응이 우수하고 따라서 DHA의 잠재적 화장품 용도를 위한 생체내 반응이 추론될 수 있는 우수한 시험관내 모델을 구성하기 때문에 적합한 세포 유형인 음경표피 세포(미분화 표피 섬유모세포, ATCC CRL-2076)를 세포 모델로서 사용하였다.
방법
세포 배양
사용된 세포 모델은 아메리칸 타입 컬쳐 컬렉션(American Type Culture Collection)으로부터 입수한 음경표피 세포(미분화 표피 섬유모세포, CRL-2076)이다. 세포 배양물을 적합한 온도(37℃), CO2 조건(5%) 및 습도(95%)의 성장 조건하에 본 목적을 위해 특수하게 설계된 항온처리기 내에서 유지시켰다. CRL-2076 섬유모세포를 배양 플라스크 내에서 10% 소 태아 혈청, 페니실린 항생제(100 U/mL), 스트렙토마이신(100㎍/mL) 및 글루타민(Biological Industries)이 보충된 이스코브 변형 둘베코 배지(Biological Industries) 중에서 성장하도록 유지시켰다.
DHA의 세포내로의 통합
모액(1:100)용 에탄올 중에 오일을 용해시키고 혈청으로 제조된 배양 배지 중의 실험 용액(working solution)을 제조함으로써 만들어진, 효소적으로 합성된 DHA-TG 70%를 0.5μM 농도로 부가하였다. 세포를 37℃에서 3일 동안 보충된 DHA-TG 배지로 배양하였다.
산화적 스트레스의 유도
지질 과산화 및 단백질 과산화를 유도함으로써 유리 라디칼의 친수성 개시제로서 광범위하게 사용되는 2,2'-아조비스-(2-아미디노프로판)디하이드로클로라이드(AAPH)를 40 mM의 농도로 사용하여, 세포에 산화적으로 스트레스를 가하였다. AAPH는 형성된 퍼옥실 라디칼의 작용을 통해서 DNA, 단백질 및 지질을 산화시킨다. AAPH는 주요 효소인 SOD를 불활성화시켜 CAT 및 GPx의 보호능을 상실시키기 때문에 추가로 내인성 방어 시스템에 작용한다.
텔로미어 길이의 측정
고도의 반복적 DNA로 구성된 텔로미어 영역은 원위치(in situ) 하이브리드화 기술에 의해 평가할 수 있다. 텔로미어 서열에 대해 상보적인 프로브를 사용하는 형광을 이용한 원위치 하이브리드화(FISH)는 텔로미어의 존재 또는 부재를 검출할 수 있게 할 뿐만 아니라 세포당 또는 염색체 그룹당 텔로미어를 정량할 수 있게 한다. 유동 FISH라 불리는 방법은 프로브로서 pan-텔로미어 PNA(펩타이드 핵산)을 사용하는 FISH 기술과 함께 유세포측정을 사용하고, 형광 강도를 사용하여 개별적 세포내 염색체 말단에서의 평균 텔로미어 길이를 측정할 수 있게 한다. 본 발명의 목적을 위해, 중기에서 PAN 표지된 염색체의 형광 강도를 측정한다. 당해 결과는 반복적 텔로미어의 1kb에 대한 각각의 TFU에 상응하는 텔로미어 형광 단위(TFU)로서 표시한다.
결과
혼입된 DHA의 존재 또는 부재하에 산화적 스트레스 조건하에 배양된 사람 섬유모세포에서의 텔로미어의 평균 길이의 변화를 유동-FISH로 분석하였다(도 23). 선형 회귀분석을 사용하여 텔로미어의 길이와 세포 집단의 계대 횟수 간의 관계를 분석하였다. 모든 분석된 배양물에 대해서, 회귀선에서의 기울기는 텔로미어 단축 지수로서 직접적으로 이해될 수 있다. 사람 섬유모세포에서, 과량의 세포내 유리 라디칼을 유도하는 AAPH로의 처리는 텔로미어 단축 지수를 두드러지게 가속화시킨다. 한편, 세포 항산화 방어를 증가시키는 것으로 입증된 0.5μM 농도의 DHA의 혼입은 DHA 부재하의 수치와 비교해 상기 지수를 50%까지 감소시킨다. 게다가, DHA의 혼입은 섬유모세포의 표준 대조군과 비교해서도 텔로미어 단축 지수를 감소시킬 수 있다.

Claims (47)

  1. 글리세라이드에 혼입된 도코사헥사엔산(DHA), 에이코사펜타엔산(EPA) 또는 DHA 유래의 EPA를 포함하고, 여기서 글리세라이드에 혼입된 상기 DHA, EPA 또는 DHA 유래의 EPA가 효소적으로 수득되고, 상기 DHA, EPA 또는 DHA 유래의 EPA가 총 지방산에 대하여 40 내지 100중량%이거나, 상기 DHA, EPA 또는 DHA 유래의 EPA가 글리세라이드의 sn-2 위치에 혼입되는, 세포 항산화제로서 영양적으로 사용하기 위한 식품.
  2. 제1항에 있어서, 상기 식품이 세포의 산화적 손상에 의해 영향을 받은 피험자에게 투여됨을 특징으로 하는 식품.
  3. 제2항에 있어서, 세포의 산화적 손상이 노화, 신체적 운동 및 신체적 운동 동안 또는 후의 저혈당증으로부터 선택되는 생리학적 상태와 연관됨을 특징으로 하는 식품.
  4. 글리세라이드에 혼입된 도코사헥사엔산(DHA), 에이코사펜타엔산(EPA) 또는 DHA 유래의 EPA를 포함하고, 여기서 글리세라이드에 혼입된 상기 DHA, EPA 또는 DHA 유래의 EPA가 효소적으로 수득되고, 상기 DHA, EPA 또는 DHA 유래의 EPA가 총 지방산에 대하여 40 내지 100중량%이거나, 상기 DHA, EPA 또는 DHA 유래의 EPA가 글리세라이드의 sn-2 위치에 혼입되는, 항노화제로서 사용하기 위한 식품.
  5. 글리세라이드에 혼입된 도코사헥사엔산(DHA), 에이코사펜타엔산(EPA) 또는 DHA 유래의 EPA를 포함하고, 여기서 글리세라이드에 혼입된 상기 DHA, EPA 또는 DHA 유래의 EPA가 효소적으로 수득되고, 상기 DHA, EPA 또는 DHA 유래의 EPA가 총 지방산에 대하여 40 내지 100중량%이거나, 상기 DHA, EPA 또는 DHA 유래의 EPA가 글리세라이드의 sn-2 위치에 혼입되는, 신체적 운동을 하는 개체에서의 스포츠 수행능 증진제로서 사용하기 위한 식품.
  6. 글리세라이드에 혼입된 도코사헥사엔산(DHA), 에이코사펜타엔산(EPA) 또는 DHA 유래의 EPA를 포함하고, 여기서 글리세라이드에 혼입된 상기 DHA, EPA 또는 DHA 유래의 EPA가 효소적으로 수득되고, 상기 DHA, EPA 또는 DHA 유래의 EPA가 총 지방산에 대하여 40 내지 100중량%이거나, 상기 DHA, EPA 또는 DHA 유래의 EPA가 글리세라이드의 sn-2 위치에 혼입되는, 신체적 운동 동안 개체의 혈당 수준 유지를 위해 사용하기 위한 식품.
  7. 제1항 내지 제6항 중의 어느 한 항에 있어서, 상기 식품이 유제품임을 특징으로 하는 식품.
  8. 제1항 내지 제6항 중의 어느 한 항에 있어서, 글리세라이드에 혼입된 상기 DHA, EPA 또는 DHA 유래의 EPA가 효소적으로 수득되고, 상기 DHA, EPA 또는 DHA 유래의 EPA가 총 지방산에 대하여 40 내지 100중량%이거나, 상기 DHA, EPA 또는 DHA 유래의 EPA가 글리세라이드의 sn-2 위치에 혼입된, 글리세라이드에 혼입된 상기 DHA, EPA 또는 DHA 유래의 EPA가 신체적 운동 전, 동안 및 후를 위한 모든 음료; 에너지 제공 바(bar); 운동능력향상 바 (ergogenical bar); 식량공급용 고형물 및 제제; 식이 보충물 및 종합 비타민 제제; 운동능력향상 보조제 (ergogenical aid); 및 피부 흡수용 나노캡슐을 갖는 텍스타일을 포함하는 그룹으로부터 선택되는 수단을 통해서 투여됨을 특징으로 하는 식품.
  9. 제8항에 있어서, 식이 보충물 또는 종합 비타민 제제가 캡슐, 정제, 환제, 또는 동결건조 형태임을 특징으로 하는 식품.
  10. 제2항 또는 제3항에 있어서, 세포의 산화적 손상이 반응성 산소 종(ROS)의 생성을 포함함을 특징으로 하는 식품.
  11. 제2항 또는 제3항에 있어서, 세포의 산화적 손상이 DNA 텔로미어(telomere)의 단축을 포함함을 특징으로 하는 식품.
  12. 제2항 또는 제3항에 있어서, 세포의 산화적 손상이 조기 세포 노화를 포함함을 특징으로 하는 식품.
  13. 글리세라이드에 혼입된 도코사헥사엔산(DHA), 에이코사펜타엔산(EPA) 또는 DHA 유래의 EPA를 포함하고, 여기서 글리세라이드에 혼입된 상기 DHA, EPA 또는 DHA 유래의 EPA가 효소적으로 수득되고, 상기 DHA, EPA 또는 DHA 유래의 EPA가 총 지방산에 대하여 40 내지 100중량%이거나, 상기 DHA, EPA 또는 DHA 유래의 EPA가 글리세라이드의 sn-2 위치에 혼입되는, 세포 항산화제로서 사용하기 위한 화장품.
  14. 글리세라이드에 혼입된 도코사헥사엔산(DHA), 에이코사펜타엔산(EPA) 또는 DHA 유래의 EPA를 포함하고, 여기서 글리세라이드에 혼입된 상기 DHA, EPA 또는 DHA 유래의 EPA가 효소적으로 수득되고, 상기 DHA, EPA 또는 DHA 유래의 EPA가 총 지방산에 대하여 40 내지 100중량%이거나, DHA, EPA 또는 DHA 유래의 EPA가 글리세라이드의 sn-2 위치에 혼입되는, 항노화제로서 사용하기 위한 화장품.
  15. 글리세라이드에 혼입된 도코사헥사엔산(DHA), 에이코사펜타엔산(EPA) 또는 DHA 유래의 EPA를 포함하고, 여기서 글리세라이드에 혼입된 상기 DHA, EPA 또는 DHA 유래의 EPA가 효소적으로 수득되고, DHA, EPA 또는 DHA 유래의 EPA가 총 지방산에 대하여 40 내지 100중량%이거나, DHA, EPA 또는 DHA 유래의 EPA가 글리세라이드의 sn-2 위치에 혼입되는, 신체적 운동을 하는 개체에서의 스포츠 수행능 증진제로서 사용하기 위한 화장품.
  16. 글리세라이드에 혼입된 도코사헥사엔산(DHA), 에이코사펜타엔산(EPA) 또는 DHA 유래의 EPA를 포함하고, 여기서 글리세라이드에 혼입된 상기 DHA, EPA 또는 DHA 유래의 EPA가 효소적으로 수득되고, 상기 DHA, EPA 또는 DHA 유래의 EPA가 총 지방산에 대하여 40 내지 100중량%이거나, 상기 DHA, EPA 또는 DHA 유래의 EPA가 글리세라이드의 sn-2 위치에 혼입되는, 신체적 운동 동안 개체의 혈당 수준 유지를 위해 사용하기 위한 화장품.
  17. 글리세라이드에 혼입된 도코사헥사엔산(DHA), 에이코사펜타엔산(EPA) 또는 DHA 유래의 EPA를 포함하는 세포의 산화적 손상 치료용 약제학적 조성물로서,
    글리세라이드에 혼입된 상기 DHA, EPA 또는 DHA 유래의 EPA가 효소적으로 수득되고, 상기 DHA, EPA 또는 DHA 유래의 EPA가 총 지방산에 대하여 40 내지 100중량%이거나, 상기 DHA, EPA 또는 DHA 유래의 EPA가 글리세라이드의 sn-2 위치에 혼입되고,
    상기 세포의 산화적 손상이 신경퇴행성 병리상태, 안구 병리상태, 허혈성 병리상태, 염증 과정 및 아테롬성 동맥경화증으로부터 선택되는 질환과 연관되고, 이때 상기 신경퇴행성 병리상태가 다발성 경화증, 알츠하이머병, 파킨슨병, 근위축성 측삭경화증 및 근위축증으로부터 선택될 수 있고; 상기 안구 병리상태가 색소성 망막증, 황반변성 및 백내장으로부터 선택될 수 있고; 상기 허혈성 병리상태가 심근경색 및 뇌경색으로부터 선택될 수 있고; 상기 염증 과정이 관절염, 혈관염, 사구체신염 및 홍반성 루푸스로부터 선택될 수 있음을 특징으로 하는 약제학적 조성물.
  18. 삭제
  19. 제17항에 있어서, 세포의 산화적 손상이 반응성 산소 종(ROS)의 생성을 포함함을 특징으로 하는 약제학적 조성물.
  20. 제17항에 있어서, 세포의 산화적 손상이 DNA 텔로미어의 단축을 포함함을 특징으로 하는 약제학적 조성물.
  21. 제17항에 있어서, 세포의 산화적 손상이 조기 세포 노화를 포함함을 특징으로 하는 약제학적 조성물.
  22. 삭제
  23. 삭제
  24. 삭제
  25. 삭제
  26. 삭제
  27. 삭제
  28. 삭제
  29. 삭제
  30. 삭제
  31. 삭제
  32. 삭제
  33. 삭제
  34. 삭제
  35. 삭제
  36. 삭제
  37. 삭제
  38. 삭제
  39. 삭제
  40. 삭제
  41. 삭제
  42. 삭제
  43. 삭제
  44. 삭제
  45. 삭제
  46. 삭제
  47. 삭제
KR1020087017876A 2005-12-21 2006-12-20 세포의 산화적 손상과 연관된 병리상태를 치료하기 위한ｄｈａ, ｅｐａ 또는 ｄｈａ 유래의 ｅｐａ의 용도 KR101256448B1 (ko)

Applications Claiming Priority (9)

Application Number Priority Date Filing Date Title
ES200503202A ES2277557B1 (es) 2005-12-21 2005-12-21 Utilizacion de acido docosahexaenoico para el tratamiento del daño celular oxidativo.
ESP-200503202 2005-12-21
ESP-200602418 2006-09-25
ES200602417A ES2315124B1 (es) 2005-12-21 2006-09-25 Mejoras en el objeto de la patente principal p 200503202, por "utilizacion de acido docosahexaenoico para el tratamiento del daño oxidativo celular".
ES200602418A ES2315125B1 (es) 2005-12-21 2006-09-25 Mejoras en el objeto de la patente principal p 200503202, por "utilizacion de acido docosahexaenoico para el tratamiento del daño oxidativo celular".
ESP-200602417 2006-09-25
ES200603231A ES2316263B1 (es) 2005-12-21 2006-12-20 Mejoras en el objeto de la patente principal p 200503202, por "utilizacion de acido docosahexaenoico para el tratamiento del daño oxidativo celular".
PCT/EP2006/070016 WO2007071733A2 (en) 2005-12-21 2006-12-20 Use of dha, epa or dha-derived epa for treating a pathology associated with cellular oxidative damage
ESP-200603231 2006-12-20

Publications (2)

Publication Number Publication Date
KR20080081334A KR20080081334A (ko) 2008-09-09
KR101256448B1 true KR101256448B1 (ko) 2013-04-19

Family

ID=37728386

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
KR1020087017876A KR101256448B1 (ko) 2005-12-21 2006-12-20 세포의 산화적 손상과 연관된 병리상태를 치료하기 위한ｄｈａ, ｅｐａ 또는 ｄｈａ 유래의 ｅｐａ의 용도

Country Status (16)

Country Link
US (3) US9265745B2 (ko)
EP (3) EP2510927A3 (ko)
JP (1) JP2009523414A (ko)
KR (1) KR101256448B1 (ko)
CN (1) CN101346138B (ko)
AU (1) AU2006327064B2 (ko)
BR (1) BRPI0621131A2 (ko)
CA (1) CA2632949C (ko)
ES (1) ES2384701T3 (ko)
IL (1) IL192154A (ko)
MX (1) MX2008008171A (ko)
NO (1) NO341240B1 (ko)
NZ (1) NZ569676A (ko)
PL (1) PL1962825T3 (ko)
RU (1) RU2437583C2 (ko)
WO (1) WO2007071733A2 (ko)

Families Citing this family (24)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US8252742B2 (en) * 2004-12-30 2012-08-28 Hill's Pet Nutrition, Inc. Methods for enhancing the quality of life of a senior animal
ES2277557B1 (es) 2005-12-21 2008-07-01 Proyecto Empresarial Brudy, S.L. Utilizacion de acido docosahexaenoico para el tratamiento del daño celular oxidativo.
AU2006327064B2 (en) 2005-12-21 2012-04-26 Brudy Technology, S.L. Use of DHA, EPA or DHA-derived EPA for treating a pathology associated with cellular oxidative damage
US20100119600A1 (en) * 2007-06-01 2010-05-13 Joar Opheim Substances for reducing occurrence of major cardiac events comprising red yeast rice extract and omega-3 polyunsaturated fatty acid or derivative thereof
US8343753B2 (en) 2007-11-01 2013-01-01 Wake Forest University School Of Medicine Compositions, methods, and kits for polyunsaturated fatty acids from microalgae
US8207363B2 (en) 2009-03-19 2012-06-26 Martek Biosciences Corporation Thraustochytrids, fatty acid compositions, and methods of making and uses thereof
BRPI0924012A2 (pt) * 2009-04-17 2019-09-24 Cela Vista Pharmaceuticals Ltd processo para obtenção de uma composição rica em ácidos graxos ômega 3 de um óleo de origem marinha, com um teor de af interior 90 mg/g composição, suplemento nutricional produto alimentar, composição farmacêutica, e, uso de um composto
DK2526197T3 (en) 2010-01-19 2018-10-01 Dsm Ip Assets Bv MICRO; PRODUCING EICOSAPENTAIC ACID AND DOCOSAHEXAENIC ACID, FATIC ACID COMPOSITIONS, AND METHODS FOR PREPARING AND USING THEREOF
US20120252888A1 (en) * 2011-03-29 2012-10-04 Palupa Medical Ltd. Compositions and Methods for Treating Neurologic Disorders
US10709680B2 (en) * 2011-07-18 2020-07-14 Physicians Recommended Nutriceuticals, Llc Methods for treating dry eye
US20160310456A1 (en) * 2013-03-12 2016-10-27 Physicians Recommended Nutriceuticals, Llc Compositions and methods for using same for reducing levels of arachidonic acid in tissue having undergone an invasive procedure
CN105410925A (zh) 2011-07-21 2016-03-23 帝斯曼知识产权资产管理有限公司 脂肪酸组合物
JP6295278B2 (ja) * 2013-02-28 2018-03-14 アニダ ファーマ インコーポレイテッド 聴器毒性を治療する方法
CN103585140A (zh) * 2013-11-22 2014-02-19 苏州麦可旺志生物技术有限公司 Epa在制备溴酸钾诱导氧化应激性肾损伤药物中的应用
US11718577B2 (en) 2013-12-18 2023-08-08 Commonwealth Scientific And Industrial Research Organisation Lipid compositions comprising triacylglycerol with long-chain polyunsaturated fatty acids
CA3241340A1 (en) * 2013-12-18 2015-06-25 Grains Research And Development Corporation Lipid comprising long chain polyunsaturated fatty acids
EP3151826A4 (en) 2014-06-06 2018-01-24 Marine Ingredients, LLC Omega-3 compositions, dosage forms, and methods of use
KR20180051737A (ko) * 2016-11-08 2018-05-17 차의과학대학교 산학협력단 대장염-관련 암 발생을 줄이는 ω-3 폴리불포화지방산 활성 성분으로 포함하는 항암 조성물
US20170150690A1 (en) 2017-02-13 2017-06-01 Bayer Cropscience Lp Cotton variety fm 1888gl
US20170156280A1 (en) 2017-02-13 2017-06-08 Bayer Cropscience Lp Cotton variety st 5517gltp
JP7133306B2 (ja) * 2017-12-01 2022-09-08 国立大学法人九州大学 アシルステリルグルコシド、アシルステリルグルコシドの製造方法、組成物、抗酸化剤、血中脂質低下剤、抗肥満剤、抗腫瘍剤及びアテローム性動脈硬化症の予防又は治療剤
CN110846346B (zh) * 2019-11-26 2021-06-22 瞿瀚鹏 富含Sn-2位DHA的微生物油脂及其制备方法和应用
CN113749255B (zh) * 2021-09-15 2022-11-29 江南大学 一种磷脂组合物在修复肌肉损伤的应用
WO2023122827A1 (en) * 2021-12-28 2023-07-06 Scf Pharma Inc. Polyunsaturated fatty acid monoglycerides, compositions, methods and uses thereof

Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPH11239465A (ja) * 1997-06-16 1999-09-07 Nippon Suisan Kaisha Ltd 健常人が運動能力を高める食品
WO2005013908A2 (en) * 2003-08-05 2005-02-17 Board Of Supervisors Of Louisiana State University And Agricultural And Mechanical College Neuroprotection protects against cellular apoptosis, neural stroke damage, alzheimer’s disease and retinal degeneration

Family Cites Families (36)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2524217B2 (ja) * 1988-04-18 1996-08-14 マルハ株式会社 脳機能改善組成物、学習能力増強剤、記憶力増強剤、痴呆予防剤または痴呆治療剤
GB2218984B (en) * 1988-05-27 1992-09-23 Renafield Limited Process for preparing high-concentration mixtures of polyunsaturated fatty acids & their esters and their prophylactic or therapeutic uses
GB2223943A (en) 1988-10-21 1990-04-25 Tillotts Pharma Ag Oral disage forms of omega-3 polyunsaturated acids
SE9101642D0 (sv) * 1991-05-30 1991-05-30 Kabi Pharmacia Ab Phospholipids
CA2119000A1 (en) * 1993-03-19 1994-09-20 David Frederick Horrobin Formulation for use in smokers
ATE446101T1 (de) * 1993-06-09 2009-11-15 Martek Biosciences Corp Verwendung von docosahexaensäure zur herstellung eines arzneimittels zur behandlung der senilen demenz und alzheimer-erkrankung
US20050027004A1 (en) 1993-06-09 2005-02-03 Martek Biosciences Corporation Methods of treating senile dementia and Alzheimer's diseases using docosahexaenoic acid and arachidonic acid compositions
JPH07255417A (ja) * 1994-03-25 1995-10-09 Kanebo Ltd 機能性健康食品
FR2731015B1 (fr) * 1995-02-24 1997-05-30 Sci Sartone Procede d'enrichissement enzymatique d'huiles d'origine marine et les triglycerides d'acides gras polyinsatures ainsi obtenus
EP0823475B1 (en) * 1995-04-17 2009-06-17 National Institute of Advanced Industrial Science and Technology Novel microorganisms capable of producing highly unsaturated fatty acids and process for producing highly unsaturated fatty acids by using the microorganisms
MY118354A (en) * 1995-05-01 2004-10-30 Scarista Ltd 1,3-propane diol derivatives as bioactive compounds
JP3558423B2 (ja) * 1995-09-11 2004-08-25 旭化成ケミカルズ株式会社 ドコサヘキサエン酸を構成脂肪酸とするリン脂質の製造方法
JP3985035B2 (ja) * 1995-09-14 2007-10-03 独立行政法人産業技術総合研究所 （ｎ−６）系ドコサペンタエン酸含有油脂ならびに該油脂の製造方法および用途
AU3120797A (en) * 1996-05-08 1998-07-31 Weider Nutrition Group, Inc. Structured glycerols and structured phosphatides
DK0935667T3 (da) * 1996-07-23 2007-04-10 Nagase Chemtex Corp Fremgangsmåde til fremstilling af docosahexaensyre og docosapentaensyre
JPH11239464A (ja) * 1997-06-16 1999-09-07 Nippon Suisan Kaisha Ltd 運動時の危険因子除去能を有する組成物
WO1998057628A1 (fr) 1997-06-16 1998-12-23 Nippon Suisan Kaisha, Ltd. Composition capable de supprimer le facteur de risque pendant l'exercice
GB9901809D0 (en) * 1999-01-27 1999-03-17 Scarista Limited Highly purified ethgyl epa and other epa derivatives for psychiatric and neurological disorderes
IT1308613B1 (it) * 1999-02-17 2002-01-09 Pharmacia & Upjohn Spa Acidi grassi essenziali nella prevenzione di eventi cardiovascolari.
JP2002040014A (ja) * 2000-07-19 2002-02-06 Nippon Steel Corp 炭素含有耐火物の耐摩耗性、耐食性及び耐酸化性の評価方法
EP1249523A1 (fr) * 2001-04-12 2002-10-16 Michel Beckers Cylindre brouilleur et son utilisation
ITMI20020269A1 (it) 2002-02-12 2003-08-12 Victorix Assets Ltd Uso di steri etilici di acidi poliinsaturi omega-3 in pazienti con insufficienza cardiaca
AR039170A1 (es) 2002-03-28 2005-02-09 Bio Dar Ltd Co-granulos de dha y romero y metodos de uso
US20040209953A1 (en) * 2002-12-06 2004-10-21 Wai Lee Theresa Siu-Ling Glyceride compositions and methods of making and using same
US7041840B2 (en) * 2002-12-18 2006-05-09 Alberta Research Council Inc. Antioxidant triacylglycerols and lipid compositions
JP2005000033A (ja) * 2003-06-10 2005-01-06 Shinbijuumu:Kk 食品
GB0314624D0 (en) * 2003-06-23 2003-07-30 Advanced Bionutrition Europ Lt Inflammatory disease treatment
JP2005068060A (ja) * 2003-08-22 2005-03-17 Nrl Pharma Inc ラクトフェリンを含有する医薬組成物ならびに加工食品の製造法
US20050130937A1 (en) * 2003-10-22 2005-06-16 Enzymotec Ltd. Lipids containing omega-3 and omega-6 fatty acids
US7842722B2 (en) * 2003-12-19 2010-11-30 Alcon, Inc. Composition and methods for inhibiting the progression macular degeneration and promoting healthy vision
US20050163873A1 (en) 2004-01-14 2005-07-28 Robert Ritch Methods and formulations for treating glaucoma
ITMI20040069A1 (it) 2004-01-21 2004-04-21 Tiberio Bruzzese Uso di composizioni di acidi grassi n-3 ad elevata concentrazione per il trattamento di disturbi del sistema nervoso centrale
WO2006077495A1 (en) 2005-01-24 2006-07-27 Pronova Biocare As Use of a fatty acid composition containing dha for the production of a medical product or a food stuff for the treatment of amyloidos-rerelated diseases
FR2882894B1 (fr) 2005-03-11 2009-04-03 Larena Sa Composition alimentaire suppletive
ES2264886B1 (es) * 2005-05-12 2008-02-01 Proyecto Empresarial Brudy, S.L. Utilizacion de acido docosahexaenoico para el tratamiento de enfermedades tumorales.
AU2006327064B2 (en) 2005-12-21 2012-04-26 Brudy Technology, S.L. Use of DHA, EPA or DHA-derived EPA for treating a pathology associated with cellular oxidative damage

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPH11239465A (ja) * 1997-06-16 1999-09-07 Nippon Suisan Kaisha Ltd 健常人が運動能力を高める食品
WO2005013908A2 (en) * 2003-08-05 2005-02-17 Board Of Supervisors Of Louisiana State University And Agricultural And Mechanical College Neuroprotection protects against cellular apoptosis, neural stroke damage, alzheimer’s disease and retinal degeneration
WO2005013908A3 (en) * 2003-08-05 2005-11-17 Univ Louisiana State Neuroprotection protects against cellular apoptosis, neural stroke damage, alzheimer’s disease and retinal degeneration

Also Published As

Publication number Publication date
NZ569676A (en) 2012-03-30
NO341240B1 (no) 2017-09-25
EP1962825A2 (en) 2008-09-03
RU2008126805A (ru) 2010-01-27
PL1962825T3 (pl) 2014-09-30
WO2007071733A3 (en) 2007-09-07
BRPI0621131A2 (pt) 2011-11-29
AU2006327064A1 (en) 2007-06-28
CA2632949A1 (en) 2007-06-28
EP2510927A3 (en) 2013-05-01
NO20083187L (no) 2008-09-19
MX2008008171A (es) 2008-11-12
ES2384701T3 (es) 2014-07-02
EP2510927A2 (en) 2012-10-17
CA2632949C (en) 2012-05-22
US20130274337A1 (en) 2013-10-17
ES2384701T1 (es) 2012-07-11
JP2009523414A (ja) 2009-06-25
IL192154A (en) 2015-04-30
EP1962825B1 (en) 2014-04-02
US20080292681A1 (en) 2008-11-27
IL192154A0 (en) 2008-12-29
EP3263101A1 (en) 2018-01-03
US20160151258A1 (en) 2016-06-02
KR20080081334A (ko) 2008-09-09
CN101346138B (zh) 2013-03-13
CN101346138A (zh) 2009-01-14
US9265745B2 (en) 2016-02-23
US9259408B2 (en) 2016-02-16
RU2437583C2 (ru) 2011-12-27
WO2007071733A2 (en) 2007-06-28
AU2006327064B2 (en) 2012-04-26

Similar Documents

Publication Publication Date Title
KR101256448B1 (ko) 세포의 산화적 손상과 연관된 병리상태를 치료하기 위한ｄｈａ, ｅｐａ 또는 ｄｈａ 유래의 ｅｐａ의 용도
JP6556640B2 (ja) 細胞の酸化的損傷に関連した病変を治療するためのｄｈａ、ｅｐａまたはｄｈａ由来のｅｐａの使用
da Silva Marineli et al. Chia (Salvia hispanica L.) enhances HSP, PGC-1α expressions and improves glucose tolerance in diet-induced obese rats
JP5614817B2 (ja) ミトコンドリアの機能およびエネルギー生産を高めるためのヒドロキシチロソールの組合せ
Haram et al. Adaptation of endothelium to exercise training: insights from experimental studies
Martorell et al. Effect of DHA on plasma fatty acid availability and oxidative stress during training season and football exercise
Goncharov et al. Nutraceuticals in sports activities and fatigue
Sung et al. Role of l-carnitine in sports performance: Focus on ergogenic aid and antioxidant
Dalimova et al. Influence of the supramolecular complex of glycyrrhizic acid with quercetin on age-related functional changes in rat brain mitochondria
WO2013086327A1 (en) Nutritional compositions comprising curcumin and phosphatidylserine-docosahexaenoic acid for improving cognition
Joseph et al. Fish oil prophylaxis attenuates rotenone-induced oxidative impairments and mitochondrial dysfunctions in rat brain
Thyagaraju et al. Oral supplementation of β-Carotene significantly ameliorates testicular oxidative stress in the streptozotocin-diabetic rat
Pathade et al. Antioxidants Therapy in Cognitive Dysfunction Associated with Diabetes Mellitus: An Overview
Bajracharya The influence of diet and exercise on physiological and mitochondrial functions of Drosophila parkin mutants
Gliwa The antioxidant and anti-inflammatory activities of alkylresorcinols from rye bran
TUMI et al. Biochemical studies on the effect of methanolic extract of Arbutus pavarii" leaves" as an antioxidant in treatment of hypercholesterolemia in albino rats

Legal Events

Date Code Title Description
A201 Request for examination
E701 Decision to grant or registration of patent right
GRNT Written decision to grant
FPAY Annual fee payment

Payment date: 20170317

Year of fee payment: 5

FPAY Annual fee payment

Payment date: 20190409

Year of fee payment: 7