BRPI0621131A2

BRPI0621131A2 - uso de dha, epa ou epa derivado de dha para tratar uma patologia associada com dano oxidativo celular

Info

Publication number: BRPI0621131A2
Application number: BRPI0621131-3A
Authority: BR
Inventors: Pedrol Joan Carles Domingo; Garcia Jose Antonio Villegas
Original assignee: Brudy Technology S L
Priority date: 2005-12-21
Filing date: 2006-12-20
Publication date: 2011-11-29
Also published as: EP2510927A3; US20080292681A1; EP1962825A2; WO2007071733A3; AU2006327064A1; US9265745B2; EP2510927A2; EP1962825B1; US9259408B2; RU2008126805A; CA2632949A1; AU2006327064B2; PL1962825T3; ES2384701T3; ES2384701T1; NO20083187L; US20130274337A1; KR101256448B1; CN101346138B; NO341240B1

Abstract

USO DE DHA, EPA OU EPA DERIVADO DE DHA PARA TRATAR UMA PATOLOGIA ASSOCIADA COM DANO OXIDATIVO CELULAR. O presente invento se refere ao uso de um ácido enriquecido em ácido docosahexaenóico (DHA) ou ácido eicosapentaenóico (EPA) ou EPA derivado de DHA para fabricar uma droga para o tratamento de processos que envolvem dano oxidativo associado. Em particular, ela é para o tratamento de processos associados com patologias neurodegenerativas oculares, isquêmicas e inflamatórias, aterosclerose, com dano oxidativo ao DNA e com exercício físico.

Description

Uso de DHA, EPA ou EPA derivado de DHA para tratar uma patologia associada com dano oxidativo celular

Refere-se o presente invento ao uso de um ácido enriquecido em ácido docosahexaenóico (DHA) ou ácido eicosapentaenóico (EPA) ou EPA derivado de DHA para fabricar uma droga para o tratamento de processos que envolvem dano oxidativo associado.

Os ácidos graxos Omega-3 são necessários para manter a integridade funcional celular, e são necessários em geral para a saúde humana. O ácido docosahexaenóico (22:6 n-3, DHA), um importante componente Omega-3 do óleo de peixe e de algas marinhas, está concentrado no cérebro, nos fotorreceptores e nas sinapses da retina. As dietas enriquecidas com DHA são inicialmente metabolizadas pelo fígado e depois disso distribuídas via as lipoproteínas no sangue a fim de satisfazer as necessidades dos vários órgãos. A administração de DHA leva a um aumento de sua concentração no nível dos tecidos, induzindo também um aumento na concentração de ácido eicosapentaenóico (EPA) Omega-3 que está ligado metabolicamente, enquanto que a administração de EPA só aumenta sua concentração diminuindo aquela do DHA no nível celular.

Em geral, o DHA é incorporado aos fosfolipídios da membrana celular, que têm efeitos sobre sua composição e funcionalidade, na produção de espécies reativas de oxigênio (ROS), na oxidação do lipídio da membrana, na regulação da transcrição, na biossíntese de eicosanóides e na transdução de sinais intracelulares. Além disso, no sistema nervoso central, o DHA está envolvido no desenvolvimento da capacidade de aprender relacionada com a memória, nas funções excitáveis da membrana, na biogênese de células fotorreceptoras e na transdução de sinais dependentes da proteína quinase. Uma terapia dietética potencial seria baseada em corrigir os níveis ótimos de ácidos graxos Omega-3 para evitar o surgimento ou a progressão de certas patologias, tais como patologias inflamatórias, processos tumorais, doenças cardiovasculares, depressão e desordens neurológicas.

No sistema nervoso central, ambos cérebro e retina mostram uma capacidade não usual de reter DHA, mesmo sob situações de deficiência dietética muito prolongada de ácidos graxos Omega-3. Vários estudos descreveram o efeito protetor de DHA em neurônios, nos quais ela está presente em níveis muito altos. Por exemplo, ela está envolvida em proteger as células neuronais da morte por apoptose. Recentemente, foi mostrado que DHA, encontrado em quantidades reduzidas no hipocampo de ratos de idade avançada, é capaz de proteger culturas primárias de ditas células contra a citotoxicidade induzida pelo glutamato.

Nos fotorreceptores da retina, o DHA também tem mostrado modular os níveis de proteínas pró- e anti- apoptóticas da família Bcl-2. Os segmentos externos dos fotorreceptores da retina contêm rodopsina, bem como um teor maior de DHA que qualquer outro tipo de célula. O DHA está concentrado nos fosfolipídios das membranas externas do segmento de disco dos fotorreceptores. As disfunções da retina foram observadas sob condições de redução da concentração ótima de DHA. As células epiteliais pigmentarias da retina (RPE) desempenham um papel muito ativo na captura, conservação e transporte do DHA. O eievado teor de DHA nas céiuias fotorreceptoras e RPE está ligado principalmente aos domínios da membrana com características físicas para contribuir com a modulação de receptores, canais iônicos, transportadores, etc., enquanto também parece regular a concentração de fosfatidilserina.

Não se sabe até hoje se estes efeitos são inteiramente mediados pelo próprio DHA ou por quaisquer derivados metabólicos. Certos derivados de DHA têm sido identificados na retina. Embora as enzimas envolvidas na síntese de alguns derivados não tenham sido precisamente identificadas, alguns resultados recentes sugerem a participação de uma fosfolipase A2 (PLA2) seguida por uma lipoxigenase (LOX). A PLA2 libera o DHA dos fosfolipídios da membrana e a LOX converte-o em seus derivados metabolicamente ativos.

As espécies de oxigênio reativo (ROS) são produzidas durante o funcionamento celular normal. As ROS incluem o ânion superóxido, peróxido de hidrogênio e o radical oxidrila. Sua alta reatividade química leva à oxidação de proteínas, de DNA ou de lipídios. A superóxido dismutase (SOD), a catalase (CAT) e a glutationa peroxidase (GPx) são as enzimas antioxidantes primárias que protegem contra o dano molecular e celular causado pela presença das ROS. O estresse oxidativo ativa muitos canais metabólicos; alguns são çitoprotetores, enquanto que outros levam à morte da célula. Estudos recentes indicam que o desequilíbrio entre a produção e o colapso de ROS é um fator de risco significativo na patogênese de muitas doenças, em alguns casos relacionada com uma deterioração do sistema antioxidante.

O DHA é apresentado como um alvo das ROS que produz danos à célula do fotorreceptor e às células RPE. A degeneração da retina induzida pela luz promove a perda de DHA nos fotorreceptores. Por exemplo, quando as células RPE são danificadas ou morrem, a função fotorreceptora se deteriora porque as células RPE são essenciais para a sua sobrevivência. Assim, a morte da célula RPE sob o efeito do estresse oxidativo leva a uma deterioração da visão, particularmente quando as células da mácula são afetadas, uma vez que ela é responsável pela acuidade da visão. A patofisiologia de muitas dègenerações retinais (p.ex. degeneração macular relacionada com a idade e a doença de Stargardt) envolve o estresse oxidativo que leva à apoptose da célula RPE. De fato, a apoptose da célula RPE parece ser o fator dominante na degeneração macular senil. Tais estudos sugerem que ditas células tenham desenvolvido mecanismos antioxidantes altamente efetivos para protegê-las do seu alto teor de DHA e mostram uma notável capacidade adaptativa.

Além disso, a relação entre os radicais livres e o envelhecimento é perfeitamente bem aceita, com base na evidência de que os radicais livres produzidos durante a respiração aeróbica causam danos oxidativos que se acumulam e levam a uma perda gradual dos mecanismos homeostáticos, interferência nos padrões de expressão genética e uma perda da capacidade funcional da célula, levando a envelhecimento e morte. Existe uma inter-relação entre a geração de oxidantes, proteção antioxidante e reparo do dano oxidativo. Muitos estudos foram executados para determinar se as defesas antioxidantes declinam com a idade. Estes incluíram a análise dos seus principais componentes: atividade ou expressão das enzimas SOD, CAT1 GPx1 glutationa reductase, glutationa-S-transferase e a concentração de compostos de baixo peso molecular com propriedades antioxidantes. Por exemplo, uma sobre-expressão de SOD e CAT em Drosophila melanogaster aumenta a expectativa de vida em 30% e reduz o dano por oxidação de proteína. Neste contexto, a exposição in vitro e in vivo de tecido cutâneo a raios UV gera radicais livres e outras espécies de oxigênio reativo, levando a estresse oxidativo celular, documentado como contribuindo significativamente para o envelhecimento. A exposição excessiva da pele à radiação ultravioleta pode originar um dano agudo ou crônico. Sob condições agudas, podem ser produzidos eritema ou queimaduras, enquanto a sõbre-exposição crônica aumenta o risco de câncer com a idade.

Além disso, é sabido que as células cutâneas podem responder ao estresse oxidativo agudo ou crônico aumentando a expressão de uma variedade de proteínas, tais como as enzimas envolvidas na manutenção da integridade celular e resistência ao dano oxidativo.

No estado da técnica, é bem sabido que os telômeros são regiões de DNA não codificadoras situadas nas extremidades dos cromossomos eucarióticos. Estes são constituídos por seqüências de DNA altamente conservadas, repetidas no padrão (TTAGG)n e proteínas associadas, e têm uma estrutura especial que impede a ligação às extremidades de outros cromossomos, evitando a fusão telomérica. Eles têm um papel essencial na preservação da integridade cromossômica, protegendo o DNA codificador da ação enzimática e sua degradação, contribuindo para a manutenção da estabilidade cromossômica.

Em contraste com as seqüências codificadoras que tem replicação semiconservativa, ps telômeros sofrem uma perda progressiva de suas seqüências repetitivas durante a sucessiva divisão celular. Hoje em dia, considera-se que um comprimento telomérico mínimo é exigido para manter a função do telômero e quando este atinge um tamanho crítico eles têm dificuldades para a divisão na mitose, gerando associação telomérica (TAS) e instabilidade cromossômica. Dita instabilidade cromossômica seria associada com um aumento na probabilidade de produzir erros capazes de gerar alterações genéticas significativas.

Devido à multiplicidade de duplas ligações, os ácidos graxos Omega-3 são considerados como sendo alvos moleculares para geração e propagação de radicais livres durante os processos de estresse oxidativo relativos à geração de peróxidos lipídicos. Foram obtidos resultados contraditórios, entretanto, em vários estudos de suscetibilidade a estresse oxidativo devido a suplementos dietéticos de ácidos graxos Omega-3. Alguns estudos em humanos mostraram oxidação aumentada do LDL1 enquanto outros encontraram nenhum efeito. Em estudos com animais, tem sido encontrado que o tratamento com ácidos graxos Omega-3 leva a suscetibilidade aumentada ou reduzida à oxidação do LDL. Por outro lado, foi encontrada uma sobre- expressão dos genes envolvidos no sistema de defesa antioxidante nos fígados de camundongos alimentados em uma dieta enriquecida em óleo de peixe por três meses.

Além disso, vários estudos in vitro com uma linhagem celular de origem glial mostraram que membranas ricas em ácidos graxos Omega-3 são mais suscetíveis ao dano oxidativo. A suplementação de longa duração destas células com altas concentrações de DHA resultou em níveis aumentados de peróxidos lipídicos no meio de cultura, e a uma maior percentagem de células mortas devido à apoptose induzida pela exposição a peróxido de hidrogênio. Também foi mostrado, entretanto, que a administração intra-amniótica de docosahexaenoato de etila reduz a peroxidação lipídica nos cérebros fetais de ratos. Foi sugerido quê esta resposta é devida ao efeito seqüestrante de radicais livres via ativação de enzimas antioxidantes. Um aumento na capacidade antioxidante do cérebro é importante para a defesa endógena primária contra o estresse oxidativo, porque o cérebro é relativamente rico em ácidos graxos poli- insaturados e relativamente pobre em enzimas antioxidantes.

Estes resultados contraditórios sugerem que a hipótese baseada na premissa de que a oxidação de um ácido graxo aumenta com o número de duplas ligações não tem aplicabilidade in vivo, uma vez que outros mecanismos potenciais podem atuar para reduzir o dano oxidativo, tais como a estrutura tridimensional dos ácidos graxos Omega-3 nos lipídeos e lipoproteínas da membrana que tornam as ligações duplas menos suscetíveis a um ataque pelas ROS, uma inibição das enzimas pró-oxidantes tais como PLA2 ou uma expressão maior de enzimas antioxidantes.

Por outro lado, a idéia de associar exercício físico com a produção de radicais livres vêm do começo dos anos 80 devido à observação dos danos em lipídeos de membrana durante eventos de isquemia-reperfusão em tecido hipóxido (vide Lovlin et al., Eur. J. Appl. Physiol. Occup. Physiol. 1987, 56 (3) 313-6). Ao mesmo tempo, um aumento na razão GSSH/GSH foi observado nas células musculares de ratos (vide Lew H. Et al. FEBS Lett, 1985; 185(2): 262-6, Sen CK et al., J. Appl. Physiol. 1994; 77(5): 2177-87) bem como no sangue humano (vide MacPhaiI Db et al., Free Radie Res Commun 1993; 18(3): 177-81, Gohil K. et al. J. Appl. Physiol. 1988 Jan; 64(1): 115-9). Os radicais livres também afetam o DNA e exercícios físicos agudos danificam o DNA1 como evidenciado pelo aumento de 8-oxo-dG. O esforço físico exaustivo (correr uma maratona) causa danos nas células imunocompetentes (que pode ser associado com a diminuição imune mostrada em esportistas após tal prova).

Entretanto, outros autores não observam quaisquer efeitos (exceto por danos menores) após nadar por 90 minutos, correr por 60 minutos ou fazer um esforço exaustivo por remo. Ao mesmo tempo, pesquisas em esportistas treinados e não treinados não encontraram qualquer diferença na excreção urinária de 8-oxo-dG, mesmo aqueles que encontraram tal dano, considerado como sendo secundário a reações subseqüentes ao esforço e não à ação do exercício sobre o DNA na forma aguda.

O evento de exercício físico intensivo produzir estresse oxidativo é muito bem conhecido do estado da técnica, mas sua origem ainda não foi determinada.

Estudos executados com ácidos graxos n-3 relacionados com o desempenho de esportistas foi focado no efeito anti-inflamatório e, de fato, os primeiros ensaios tentaram encontrar a possível ação destes nutrientes melhorando a absorção alveolar-capilar pela diminuição da broncoconstrição induzida pelo exercício físico intenso. A este respeito, Mikleborough provou que após administrar um regime de 3,2 g de EPA e 2,2 g de DHA1 as citocinas pró-inflamatórias foram atenuadas pela diminuição da presença de TNF-a e IL-Ib em um atleta de elite, juntamente com a diminuição na broncoconstrição. Walser relacionou os efeitos vasculares de ácidos graxos n-3 com efeitos positivos em pessoas demonstrando intolerância a exercício físico. Aeste respeito, Houten et al. estudaram que a alta ingestão de um ácido graxo n-3 estava associada com uma recuperação melhor em pacientes em reabilitação após uma síndrome córonária.

A ausência de resultados positivos no desempenho físico nos estudos analisados se deve à avaliação de pacientes, não de pessoas saudáveis, e o que foi pesquisado foram os efeitos vasculares e inflamatórios.

Ao mesmo tempo, pesquisas foram executadas com base no seguinte conceito teórico: aumentando os ácidos graxos livres no plasma acima de 1 mmol/L (que ocorre quando é usado glicogênio), a capacidade de transporte de tríptofano aumenta com o subseqüente aumento de serotonina, um neurotransmissor relacionado com a assim chamada "fadiga central" em esportes de longa duração. A este respeito, é sabido que os ácidos graxos n-3 diminuem a quantidade de ácidos graxos livres no plasma provavelmente pela regulação para cima da oxidação de ácidos graxos pela ativação do fator de transcrição nuclear PPARa. Entretanto, estes ensaios não tiveram sucesso, desde Huffman (2004), usando um regime de dosagem de 4 g de ácido graxo n-3 (cápsulas de 500 mg contendo 300 mg de EPA e 200 mg de DHA), executou um estudo em corredores de ambos os sexos sem encontrar qualquer diminuição em TRP livre nem uma pequena percepção de esforço, nem qualquer aumento estatístico de desempenho, embora houvesse uma tendência estatística para melhorar o desempenho em sujeitos em quem o ácido graxo n-3 foi administrado, deixando aberta a possibilidade para os autores de que a causa da diminuição de poder estatístico para o estudo fosse o baixo número de indivíduos estudados (5 homens e 5 mulheres).

Uma outra pesquisa subseqüente, em que foi avaliada a eficácia dos ácidos n-3 relacionada com o desempenho, não encontrou quaisquer diferenças significativas usando óleo de milho como placebo. Raastad administrou 1,60 g de EPA e 1,04g de DHA por dia por vários dias, e não encontrou qualquer melhoria em jogadores de futebol (vide Raastad et al. Scand J. Med Sci Sports 1997; 7(1): 25-31).

Por outro lado, é sabido que ácidos graxos livres interferem com o uso de glicose no músculo, uma vez que seus análogos no nível intracelular, acil- CoA, na mitocôndria, inibem a piruvato dehidrogenase (inibição por produto), além disso, estimula a glicogenólise e a glicogenogênese, causando uma hiperglicemia leve durante o jejum, de fato, a administração contínua de ácidos graxos poli-insaturados durante o jejum ajuda a manter a glicemia, talvez pela ativação de glicose-6-fosfatase no nível hepático. Também é sabido que uma composição de ácidos graxos no músculo altera a sensibilidade a insulina, mostrando que um alto teor de ácidos graxos poli-insaturados na membrana plasmática melhora a sensibilidade a insulina e um alto teor de ácidos graxos saturados produz o efeito oposto.

O exercício aumenta a absorção de glicose, perfusão capilar, taxa de síntese de glicogênio e sensibilidade a insulina. Durante a contração muscular, são produzidas alterações na temperatura, pH intracelular, razão ATP/ADP, bem como a concentração intracelular de Ca++ e de outros metabólitos que poderiam atuar como mensageiros na regulação do funcionamento celular com o exercício. A este respeito, o Ca++ regula uma grande quantidade de proteínas intracelulares, incluindo calmodulin quinase, proteína quinase G (PKC) e calcineurina que são intermediários importantes nos sinais de transdução intracelular. Durante o exercício aeróbico, a acetil- CoA carboxilase é desativada pela AMP quinase (AMPK) que leva a uma queda nos níveis de malonil-Coa, desinibindo a carnitina-palmitol transferase com o aumento resultante de ácidos graxos para dentro das mitocôndrias (promovendo assim a oxidação dos ácidos graxos).

Os efeitos a ativação de AMPK provavelmente incluem a estimulação da expressão de GLUT4 e hexoquinase, bem como de enzimas mitocondriais. Entretanto, surpreendentemente, a ativação de AMPK não é a única forma (independente de insulina) em que o exercício aumenta a resposta a glicose na musculatura esquelética. Vide Mora and Pessin1 J. Biol. Chem. 2000; 275 (21): 16323- 16328, que mostraram que no aumento na resposta a glicose no músculo, de fato, há vários fatores de transcrição tais como MEF2A e MEF2D ativando GLUT4, e aqueles fatores são ativados pelo exercício.

Um aumento nos Iipideos intramusculares é comum em estados de obesidade e treinamento físico, mas o resultado é que para pessoas obesas, ele está associado com resistência a insulina, enquanto em esportistas a grande atividade de carnitina-palmitol transferase faz os ácidos graxos sofrerem oxidação beta. Há fortes evidências de que uma dieta rica em ácidos graxos n-3, mesmo com um aumento de glicemia e insulinemia (sinais de resistência a insulina), atua num nível de receptor de insulina, mantendo o nível de translocação da proteína GLUT-4, que tem especificamente mostrado com DHA (vide Jaescchke H. Proc. Soc Exp Biol. Med 1995; 209: 104-11).

O presente invento diz respeito à descoberta inesperada de que a administração de ácido docosahexaenóico (aqui chamado de DHA) ou ácido eicosapentaenóico (EPA) ou EPA derivado de DHA, seja na forma livre ou incorporado num triglicerídeo, entre outros, atua como antioxidante celular,

Desta forma, e levando em conta a relação metabólica entre DHA e EPA (retroconversão de DHA em EPA), todos os efeitos descritos observados previamente para a administração de DHA devem ser aplicáveis a sistemas misturados DHA/EPA ou mesmo em sistemas monocomponente de EPA, mesmo se o EPA não for especificamente mencionado.

Um objetivo do presente invento é, portanto, o uso de ácido docosahexaenóico para fabricar uma composição farmacêutica para o tratamento de dano oxidativo celular.

Um outro objetivo do presente invento é o uso de ácido docosahexaenóico (DHA) numa posição específica de uma espinha dorsal de glicerol, as duas posições restantes da glicerida sendo também especificadas na sua composição para o tratamento de dano celular oxidativo.

Um outro objeto do presente invento é o uso de ácido docosahexaenóico (DHA) para fabricar uma composição para o tratamento de dano oxidativo celular no nível do DNA. Em particular, o uso de ácido docosahexaenóico tem aplicação como agente protetor no processo natural de encolhimento de telômeros e como agente inibidor de envelhecimento precoce num tratamento de dano oxidativo celular.

Também é um objetivo do presente invento o uso de ácido docosahexaenóico para fazer uma composição para o tratamento de envelhecimento celular e de patologias hereditárias associadas com desordem na cadeia respiratória mitocondrial, bem como uma composição para o tratamento da Sindrome de Down.

Um outro objetivo do presente invento é o uso de ácido docosahexaenóico (DHA) para fabricar uma composição para o tratamento de dano oxidativo celular associado com exercício físico. Em particular, o uso de ácido docosahexaenóico tem aplicação como agente melhorador no desempenho esportivo e como agente regulador de níveis de glicose no sangue durante o esforço físico.

Também é um objetivo do presente invento o uso de ácido docosahexaenóico para fabricar uma composição para melhorar o desempenho esportivo, bem como uma composição para manter os níveis sangüíneos de glicose após o exercício físico por meio de, principalmente, a administração de um alimento, um produto diário ou de qualquer forma de administração adequada tipicamente usada pelas pessoas ao fazerem exercícios físicos.

No presente invento, a expressão "dano oxidativo celular" significa qualquer processo que envolva um desequilíbrio entre a geração e a degradação de espécies oxidativas celulares de origem endógena ou exógena.

Surpreendentemente, os inventores do presente invento encontraram que o DHA é capaz de inibir a produção de espécies reativas de oxigênio (ROS), sejam elas relacionadas com uma indução dependente de peróxidos ou de superóxidos. Mais especificamente, ele reduz a produção do ânion superóxido e com isso de todas as espécies derivadas produzidas na cascata oxidativa, tal como por exemplo uma redução altamente significativa de peroxidação lipídica. Além disso, foi encontrado um aumento na atividade da enzima antioxidante, o que sugere uma adaptação da célula pela indução da expressão de agentes antioxidantes, basicamente enzimas, e pela repressão de agentes pró-oxidantes, tais como a fosfolipase-A2.

Numa forma de realização do presente invento, dito ácido docosahexaenóico é incorporado num monoglicerídeo, diglicerídeo, triglicerídeo, fosfolipídio, éster etila ou ácido graxo livre. Preferencialmente, dito ácido docosahexaenóoico é incorporado num triglicerídeo.

No presente invento, "ácido docosahexaenóico incorporado num glicerídeo" é considerado como significando um monoglicerídeo, diglicerídeo, triglicerídeo, fosfolipídeo, com pelo menos uma das três posições esterificada com um ácido docosahexaenóico e, opcionalmente, pelo menos uma das posições esterificadas remanescentes adicionalmente com um ácido escolhido dentre um ácido graxo de cadeia curta, média ou longa e um ácido fosfórico. Preferencialmente, dito glicerol é um triglicerídeo.

A escolha de triglicerídeo como estrutura química do DHA é baseada nos dados tirados de um estudo que comparou a biodisponibilidade de quatro concentrados de ácido Omega-3 na forma de ésteres etila, fosfolipídios, ácidos graxos livres e triglicérides seguindo a administração oral, que demonstrou que os triglicérides re-esterificados apresentavam uma maior biodisponibilidade que as outras preparações.

Numa forma preferida de realização do presente invento, dito ácido docosahexaenóico é encontrado numa percentagem em peso de entre 20 e 100% em relação aos ácidos graxos totais, preferencialmente de entre 40 e 100% em relação aos ácidos graxos totais, e mais preferencialmente dito ácido docosahexaenóico está numa percentagem em peso entre 66 e 100% em relação aos ácidos graxos totais.

Numa outra forma preferida de realização, dito ácido docosahexaenóico é incorporado em pelo menos uma posição específica de um glicerol via uma ligação éster, um lipídio estruturado, para fabricar uma composição farmacêutica para o tratamento de dano oxidativo celular.

Tal glicerol pode adicionalmente compreender pelo menos um ácido graxo e/ou ácido fosfórico de modo que dito ácido docosahexaenóico seja incorporada numa posição escolhida dentre sn-1, sn-2 e sn-3, pode adicionalmente compreender, opcionalmente, pelo menos um ácido escolhido dentre um ácido graxo de cadeia curta e/ou média e um ácido fosfórico, e quando incorporado na posição sn-2 pode adicionalmente compreender, opcionalmente, pelo menos um ácido escolhido dentre um ácido graxo e um ácido fosfórico.

A este respeito, ao se referir ao termo opcionalmente, deve ser entendido que dito ácido docosahexaenóico incorporado numa posição escolhida dentre sn-1, sn-2 e sn-3 pode ou não adicionalmente compreender pelo menos um ácido escolhido dentre um ácido graxo de cadeia curta e/ou média e um ácido fosfórico, ou de outra forma que dito ácido docosahexaenóico incorporado na posição sn-2 pode ou não adicionalmente compreender pelo menos um ácido escolhido dentre um ácido graxo de cadeia longa e um ácido fosfórico.

Surpreendentemente, os inventores do presente invento descobriram que o uso de gliceróis estruturados, em que a posição do ácido docosahexaenóico foi escolhida e a composição do resto do composto ligado ao glicerol, leva a um aumento inesperado, de pelo menos o dobrou ou mesmo o triplo, da eficiência terapêutica do uso de ácido docosahexaenóico para fabricar uma composição farmacêutica para o tratamento de dano oxidativo celular.

A definição comum se refere a gorduras contendo ácidos graxos situados em posições específicas na espinha dorsal glicerol. Pela similaridade com a biodistribuição in vivo de ácidos graxos, os ácidos graxos poli-insaturados de cadeia longa (PUFAs) são situados preferencialmente na posição sn-2 do glicerol e tendo em conta o processo de absorção intestinal, os triglicerídeos são hidrolisados por lípases em ácidos graxos livres, di- e monoglicerideos, a partir dos quais os ácidos graxos livres e os monoglicerideos sn-2 são absorvidos diretamente pelas células epiteliais intestinais, chamadas de enterócitos.

Usando ácido docosahexaenóico incorporado em uma posição específica da espinha dorsal de glicerol, via uma ligação éster, provê uma bioatividade aumentada, uma proteção antioxidante aumentada na mesma percentagem molar com relação à quantidade total de ácidos graxos presente e uma dependência diminuída da dosagem de administração com relação ao efeito antioxidante do ácido docosahexaenóico na glicerida.

Vantajosamente, os inventores do presente invento encontraram que o uso de ácido docosahexaenóico incorporado numa posição do glicerol escolhida dentre sn-1, sn-2 e sn-3, e opcionalmente dito glicerol compreendendo adicionalmente pelo menos um ácido escolhido dentre um ácido graxo de cadeia curta e/ou média e um ácido fosfórico, provê uma bioatividade aumentada, uma proteção antioxidante aumentada na mesma percentagem molar com relação à quantidade total de ácidos graxos presente e uma dependência diminuída da dosagem de administração com relação ao efeito antioxidante do ácido docosahexaenóico no glicerol.

Também vantajosamente, os inventores do presente invento descobriram que o uso de ácido docosahexaenóico incorporado numa posição sn-2 de um glicerol e opcionalmente dito glicerol adicionalmente compreendendo pelo menos um ácido escolhido dentre um ácido graxo de cadeia. longa e um ácido fosfórico, provê também uma bioatividade aumentada, uma proteção antioxidante aumentada na mesma percentagem molar com relação à quantidade total de ácidos graxos presente e uma dependência diminuída da dosagem de administração com relação ao efeito antioxidante do ácido docosahexaenóico no glicerol.

Preferencialmente, também os ácidos presentes num glicerol com o ácido docosahexaenóico seriam ácidos graxos de cadeia curta (C1-C8) ou ácidos graxos de cadeia média (C9-C14) ou um ácido fosfórico, uma vez que estes não têm atividade funcional mas apenas atividade energética e, portanto, não competirão com o ácido docosahexaenóico.

Portanto, ainda mais preferencialmente, o presente invento se refere ao uso de ácido docosahexaenóico incorporado num glicerol em que uma das posições sn-1 e sn-3 estão livres ou ocupadas por um ácido graxo de cadeia média (C9- C-14) ou ácido graxo de cadeia curta (C1-C8) ou um ácido fosfórico e em que a posição sn- 2 é ocupada por um DHA funcional. Assim, um aumento ainda maior de DHA é alcançado uma vez que ele é mais eficientemente absorvido nas células intestinais.

Portanto, a síntese de gliceridas estruturadas em que o ácido docosahexaenóico foi incorporado em qualquer posição do glicerol quando ele não compete com outros ácidos graxos e em que o DHA foi incorporado na posição sn-2 da glicerida quando ele compete com pelo menos um ácido graxo, mostra aperfeiçoamentos relacionados a seu efeito antioxidante e, portanto, é uma forma preferida de fabricar uma composição para o tratamento do dano oxidativo celular.

Os inventores do presente invento descobriram que uma célula enriquecida com uma composição eom DHA, de acordo com o presente invento, está melhor preparada para encarar uma nova situação de estresse oxidativo e assim para minimizar os efeitos adversos que podem derivar dela. Isto é, a presença de DHA nas biomembranas induz uma resposta celular adaptativa ao estresse oxidativo. A resposta adaptativa é um fenômeno celular pelo qual a exposição a um agente tóxico (em concentrações sub-letais) provoca uma resposta celular que subseqüentemente protegerá a célula contra os efeitos deletérios do mesmo agente tóxico em concentrações letais ou, posto de outra maneira, é um efeito benéfico liberado por um baixo nível de exposição a um agente que é prejudicial em altos níveis.

A administração de DHA tem as seguintes vantagens substanciais:

a) atividade antioxidante celular aumentada;

b) ausência de citotoxicidade celular nas dosagens administradas;

c) ausência de alterações significativas no estado oxidativo celular nas dosagens administradas;

d) atividade antioxidante celular adaptativa.

Devido a tudo acima, numa forma preferencial de realização o presente invento se refere ao uso de ácido docosahexaenóico para fabricar uma composição farmacêutica para tratar de uma patologia associada com dano oxidativo celular, dita patologia sendo uma patologia neurodegenerativa, preferencialmente escolhida dentre o grupo compreendendo: esclerose múltipla, mal de Alzheimer, mal de Parkinson, esclerose lateral amiotrópica e distrofia muscular, dentre outras.

Numa outra forma de realização do presente invento, a patologia associada com o dano oxidativo é uma patologia ocular, preferencialmente uma escolhida dentre o grupo que compreende retinose pigmentar, degeneração macular e catarata, dentre outras.

Ainda numa oútra forma de realização, a patologia associada com o dano oxidativo é uma patologia isquêmica, particularmente um infarto do miocárdio, infarto cerebral, etc.

Ainda em uma outra forma de realização do presente invento, a patologia associada com o dano oxidativo é um processo inflamatório, preferencialmente escolhido dentre o grupo que compreende artrite, vasculite, glomerulonefrite e eritomatose lupus, dentre outros. Em uma outra forma preferida de realização, a patologia associada com o dano oxidativo é aterosclerose.

Um outro aspecto do presente invento é o uso de DHA como agente protetor contra o processo natural de encurtamento dos telômeros e como um agente inibidor de senescência prematura.

Os mecanismos de produção de associações teioméricas (TAS) ainda são desconhecidos mas os autores do presente invento sugerem que poderia estar associada com um déficit na atividade da enzima telomerase que sintetiza as seqüências repetitivas de DNA características dos telômeros, com isso estabilizando o seu comprimento.

A telomerase é muito ativa em células fetais, mas não tem muita atividade em células de tecido adultas. TAS raramente é encontrada em células normais, mas tem sido observadas em células infectadas por vírus ou células tumorais.

Foi observado que há uma redução progressiva no número i,5 de repetições teioméricas in vitro, bem como em função do envelhecimento celular, in vivo, que está associada com uma inibição da atividade telomerase na senescência. Da mesma forma, os autores do presente invento estudaram o comprimento telomérico em fibroblastos e linfócitos a partir de pessoas saudáveis centenárias, tendo encontrado um encurtamento telomérico durante a propagação in vitro dos fibroblastos, bem como a correlação reversa entre os comprimentos teloméricos e a idade do doador.

Embora o encurtamento telomérico ocorra naturalmente com a replicação celular, foi observada uma senescência prematura e quebras de telômeros ao induzir o dano oxidativo no DNA. Os telômeros são mais sensíveis ao dano oxidativo e as quebras são menos eficientemente reparadas que outras partes do genoma. Isto leva a uma acumulação de dano telomérico que produz um encurtamento mais rápido durante a replicação do DNA reduzindo a expectativa de vida replicativa celular. As espécies reativas de oxigênio (ROS), particularmente os ânions superóxido, peróxido de hidrogênio e radicais oxidrila, podem acelerar as perdas nos telômeros durante a replicação de alguns tipos celulares, mesmo que eles induzam senescência prematura independente do encurtamento telomérico.

Surpreendentemente, os autores do presente invento descobriram que o uso de ácido docosahexaenóico para o tratamento do dano oxidativo celular no nível de DNA permite reduzir a taxa de encurtamento dos telômeros e, portanto, inibir o envelhecimento celular.

Os presentes inventores descobriram uma correlação reversa entre a taxa de encurtamento de telômeros e a capacidade antioxidante celular em mais de 20 cepas de fibroblastos humanos. A maioria dos parâmetros celulares destes fibroblastos prematuramente envelhecidos são os mesmos do envelhecimento normal destas células (morfologia, acumulação de Iipofuscina e alterações na expressão gênica). Os fibroblastos com uma defesa antioxidante mais baixa encurtam seus telômeros mais rápido e vice-versa. A taxa de encurtamento do telômero é maior em células com uma defesa antioxidante menor. Além disso, recuperadores de radicais livres reduzem a taxa de encurtamento dos telômeros.

Estes dados estão em concordância com aqueles mostrando um papel importante das enzimas antioxidantes, glutationa peroxidase e superóxido dismutase, na taxa de encurtamento de telômeros em fibroblastos humanos. Estes dados provam que o comprimento dos telômeros é determinado principalmente pela relação entre o estresse oxidativo e a capacidade de defesa antioxidante celular. Assim, o comprimento dos telômeros dependente da idade é uma medida acumulativa da história do dano oxidativo que uma célula tenha sofrido ao longo de sua vida.

Uma correlação entre o estresse oxidativo e a taxa de encurtamento de telômeros foi mostrado para patologias hereditárias associadas com desordens na cadeira respiratória mitocondrial e para a Síndrome de Down.

Portanto, a relação existente entre o dano oxidativo celular em DNA e o encurtamento dos telômeros e seus efeitos na senescência celular permitem o uso do ácido docosahexaenóiço como um poderoso agente protetor no processo natural de encurtamento de telômeros e como um agente inibidor de senescência prematura.

Por outro lado, o uso de enzimas para a produção de óleos enriquecidos com ácidos graxos Omegá-3 tem várias vantagens com relação aos outros métodos baseados na síntese química e processos subseqüentes de purificação (separações cromatográficas, destilação molecular, etc.). Esta última requer condições extremas de pH e altas temperaturas que poderiam parcialmente destruir todas as duplas ligações eis- de PUFAs Omega-3 por oxidação, por isomerização cis-trans ou migração de dupla ligação. As condições brandas usadas na síntese enzímática (temperatura abaixo de 50°C, pH de 6 a 8 e menos reagentes químicos) provê uma alternativa sintética conservando a estrutura original de PUFAs Omega-3 còm um aumento na seletividade estrutural nas acilgliceridas, considerada como sendo a estrutura química mais favorável a partir do ponto de vista nutricional.

A composição farmacêutica compreendendo DHA pode ser encontrada na forma de um óleo ou de uma emulsão, que pode ser administrada pelas rotas oral, sublingual, intravenosa, intramuscular, tópica, subeutânea ou retal, ou mesmo ao meramente colocar o ingrediente ativo da microemulsão do presente invento, na forma líquida ou em vapor, em contato com os órgãos olfativos situados na entrada do trato respiratório. Assim, a administração pode ser executada pela pulverização, ou atomização das microemulsões ou por inalação. Opcionalmente, dita composição farmacêutica compreende adicionalmente um segundo ingrediente ativo.

Similarmente, a composição farmacêutica compreendendo DHA pode ser usada na industria alimentícia para os fins de enriquecer produtos alimentícios (p.ex., laticínios tais como iogurtes, leite, etc.) com um agente antioxidante naturai tai como DHA.

Portanto, em uma outra forma de realização do presente invento, dita composição farmacêutica é administrada a um paciente que já recebe um tratamento contra uma patologia associada com o dano oxidativo.

Um outro objetivo do presente invento é o uso de DHA como um agente de melhoria no desempenho esportivo e como um agente regulador para os níveis de glicose no sangue durante o esforço físico.

Desta forma, os autores do presente invento surpreendentemente descobriram que o uso de dito ácido docosahexaenóico durante o exercício físico leva a um aumento no desempenho esportivo mantendo os níveis de glicose no sangue após tal exercício físico (sem administrar carboidratos).

Neste contexto do presente invento, por "amador" ou "esportista não competidor" entende-se qualquer pessoa que pratica exercício físico de forma esporádica e não profissional. E por "esportista competidor" ou "esportista treinado" entende-se qualquer pessoa que pratica exercício físico de forma regular e/ou no nível profissional. Da mesma forma, os termos "exercício físico" e "esforço físico" são usados de forma equivalente e intercambiável, bem como o termo "esportista" é usado por homens e mulheres.

Desempenho esportivo.

A fim de avaliar o desempenho esportivo, há vários parâmetros que permitem valorar o aperfeiçoamento de tal desempenho esportivo.

Em esportistas fazendo esportes aeróbicos, é considerado um aumento de desempenho quando há um aumento na percentagem de consumo máximo de oxigênio %V02max no UV 2 (limiar anaeróbio), uma vez que VO2maX dificilmente aumenta durante uma temporada competitiva em esportistas muito bem treinados. Poucas alterações na percentagem de VO2Hiax no limiar são dados diretamente relacionados a um aumento no desempenho.

Os inventores mostraram que houve um aumento estatisticamente significativo do consumo de oxigênio (VO2)1 tanto os valores absoluto (p < 0,019) e relativo (p < 0,036) ao peso no limiar ventilatório 2 ao comparar testes de esforço triangular basal com aqueles efetuados após quatro meses de tratamento com DHA. O aumento deste parâmetro é mostrado para ciclistas competidores (p < 0,047) e ciclistas não competidores, sendo que a diferença nos últimos não é estatisticamente significativa (figura 24).

Um outro parâmetro relacionado com um aumento no desempenho esportivo é o aumento na freqüência cardíaca em que o UV2 do teste de esforço é estabelecido, uma vez que no caso em que a freqüência cardíaca aumenta no limiar anaeróbico, considera-se que o esportista é capaz de aumentar ligeiramente sua habilidade de manter o metabolismo aeróbico em intensidades maiores. Os inventores observaram um aumento na freqüência cardíaca em UV2 para ρ = 0,082 ao comparar dito parâmetro obtido no teste basal com aquele obtido no teste triangular após 4 meses consumindo DHA. Estes dados são notadamente mostrados (p < 0,017) no subgrupo dos ciclistas com um nível altamente competitivo (figura 25).

A este respeito, há um aumento no tempo necessário para atingir o UV2 estatisticamente significativo (figura 26).

Finalmente, a freqüência cardíaca para o mesmo nível de esforço é menor se os esportistas são aerobicamente treinados. Os inventores viram que em ciclistas que receberam DHA a freqüência cardíaca diminuiu de forma estatisticamente significativa (p < 0,043) ao comparar estes dados para ambos os testes no ponto em que os esportistas consomem 2000 mL de 02/min. (figura 27).

Pode-se concluir a partir destes estudos que nos esportistas que tomaram DHA por 4 meses, foi observado um aumento no consumo de oxigênio, absoluto e relativo, no UV2 (p < 0,008 e ρ < 0,015, respectivamente), um aumento na carga correspondente ao UV2 (p < 0,063) e uma diminuição na freqüência cardíaca quando os esportistas apresentam um consumo de oxigênio de 2000 mL/min (p < 0,062). Todos estes são parâmetros que indicam um aumento no desempenho esportivo após tomar 2,1 g DHA/24 h (6 cápsulas de 500 mg a 70% em peso), distribuídos em 3 doses diárias por 4 meses. Ditas quantidades são expressas por meio de exemplo e não são Iimitativas do presente invento.

Várias variáveis bioquímicas relacionadas com o dano oxidativo foram também analisadas após os testes de esforço.

1. Capacidade antioxidante total do plasma (PTAC). Há um aumento geral e estatisticamente significativo do PTAA (p < 0,05) ao executar testes retangulares.

Estes aumentos são maiores em esportistas que receberam DHA por três semanas, tanto considerados como um todo ou como ciclistas competidores, sem mostrar qualquer diferença entre o teste basal e o teste realizado após consumir DHA por três semanas pelos esportistas amadores (figura 28).

2. Malonildialdeído (MDA). MDA é o principal produto obtido após reagir peróxidos lipídicos produzidos pelo estresse oxidativo com ácido tiobarbitúrico. É mostrado um aumento significativo do dano oxidativo aos lipídios plasmáticos ao executar todos os testes de esforço (p < 0,035). Após a ingestão de DHA por 3 semanas, o dano oxidativo aos lipídios ao executar o teste de esforço é menor que aquele no início (p < 0,05). Esta diferença é muito mais importante para esportistas treinados que para esportistas amadores (figura 29).

3. 8-oxo-7,8-dihidro-2-'-desoxiguanosina (8-oxodG) 8-oxodG é um biomarcador de estresse oxidativo. Há um aumento de dano oxidativo ao DNA ao executar testes de

esforço retanguiares (p < 0,011). Este dano oxidativo diminui após administrar DHA por 3 semanas (p < 0,035). Esta diminuição no estresse oxidativo é mais importante em ciclistas não competidores que em ciclistas competidores, esta diferença não sendo estatisticamente significativa (figura 30).

Estudos de glicemia.

Afim de estudar os níveis de glicose no sangue, um teste de esforço triangular foi executado em uma bicicleta ergométrica com uma carga máxima mantida equivalente à taxa correspondente a 75% do VO2m3X calculado sobre o teste de esforço triangular máximo, mantendo a curvatura constante num valor de 2%. O tempo de teste é de 90 minutos e o consumo de água por todo o teste foi executado ad libitum.

Uma vez que não foram ingeridas bebidas com carboidratos, era esperada uma hipoglicemia. Esta hipoglicemia de segunda extração (vinte minutos após o término do teste com relação à amostra de partida obtida vinte minutos antes do início), é mostrada no primeiro teste de esforço, como esperado. Entretanto, os dados obtidos após a administração de DHA por quatro meses mostraram uma manutenção estatisticamente significativa de glicemia, que não foi previamente observada e representa um achado surpreendente na pesquisa realizada.

Geralmente, é observada uma diminuição estatisticamente significativa (p < 0,0009) de níveis dè glicose no soro por todo o teste de esforço retangular. Entretanto, o comportamento é diferente dependendo do tipo de esportista a ser analisado (p < 0,003): no caso de ciclistas que competem usualmente, não houve variação significativa na diminuição de glicemia durante os testes, mas no caso de ciclistas amadores, a diminuição de glicemia durante o teste basal é maior que nos ciclistas que competem usualmente e após tomar DHA por 3 semanas ou quatro meses, dita diminuição virtualmente desaparece (figuras 31, 32 e 33).

A existência de normoglicemia durante o teste de esforço a 75% de VO2max por 90 minutos sem beber a bebida com carboidratos representa um achado que conecta o comportamento de DHA durante o esforço físico com aquilo observado e mencionado acima em relação com o aumento da sensibilidade a insulina. A este respeito, Goodyear e Kahn (1998) concluíram que os mecanismos moleculares subjacentes à resposta à glicose nos músculos do esqueleto pela insulina ou exercício são diferentes após a publicação em 1997 (Winder e Hardie) sobre o fato que AMPK (proteína AMP-quinase ativada) estava alta em fibras lia durante exercício, considerando que AMPK tem um efeito pleiotrópico inibindo acetil-CoA carboxilase e promovendo o transporte de glicose dentre outras ações. Talvez isso possa explicar o achado sobre a resposta glicêmica diferente em esportistas daquela esperada de acordo com os estudos realizados em pessoas sedentárias.

A partir destes estudos sobre a ação de DHA sobre o desempenho esportivo e glicemia, pode-se concluir o seguinte:

1) Foi provado que a ingestão contínua de DHA por mais de 3 semanas produz um aumento na capacidade antioxidante total do plasma (PTAC) de forma geral e estatisticamente significativa (p < 0,05) em ciclistas amadores e competitivos.

Também, o dano oxidativo a lipídios é menor (p < 0,05) (diferença que é mais importante para esportistas treinados que para ciclistas amadores). Finalmente, foi mostrado que o dano ao DNA medido pelo marcador urinário (8-oxodG) diminui após tomar DHA por três semanas (p < 0,035),

2) Foi provado que após 4 meses de ingestão contínua de DHA, o desempenho esportivo é maior (aumento de carga e freqüência cardíaca, bem como a percentagem de VO2m3X no UV2). Também foi observada uma normoglicemia estatisticamente significativa no teste de esforço por 90 minutos a 75% de VO2max executado após quatro meses consumindo DHA.

A associação de ambos efeitos (uma melhora no desempenho esportivo e a normoglicemia durante exercício de longa duração) é um resultado que não era esperado nem conhecido no estado da técnica.

Além disso, poderia ser concluído que esta associação de efeitos é desejável e poderia ser um auxiliar ergogênico ainda não conhecido.

Um outro objetivo do presente invento é o uso de ácido docosahexaenóico para fabricar uma composição para melhoria de desempenho esportivo e para manter os níveis de glicose no sangue após exercício físico, administrada por qualquer meio adequado.

Deve ser considerado que o Comitê Científico da União Européia para Alimentos recomenda òs seguintes componentes para uma composição de bebida a ser tomada durante um exercício físico (vide

http://ec.europa.eu/food/fs/sc/scf/out64_en.pdf).

<table>table see original document page 18</column></row><table> A este respeito, a inclusão de carboidratos é objetivada para manter a glicemia a fim de evitar o rápido consumo de glicogênio muscular e hepático. Deve ser considerada as desvantagens de esvaziamento gástrico diminuído devido ao aumento de osmolaridade gerando a presença de concentrações de carboidratos, associado com a sensação de satisfação gástrica indesejável para muitos esportistas. Por conseguinte, preparar uma bebida com menor concentração ae carboidratos peia adição de DHA poderia ser uma vantagem ergogênica de interesse indubitável no desempenho de esportistas.

Conseqüentemente, um outro aspecto do presente invento se refere a uma composição farmacêutica compreendendo DHA que pode ser usada na industria alimentícia para os fins de enriquecer produtos alimentícios (p.ex., produtos laticínios tais como iogurtes, leite, etc.) com um agente antioxidante natural tal como DHA, ou adicionalmente, incorporado numa forma de administração adequada escolhida dentre o grupo compreendendo uma bebida em todas as suas características para antes, durante e depois de um exercício físico; uma barra energética; barras ergogênicas; sólidos e preparados para provisionamento; suplementos dietéticos e preparados polivitamínicos (na forma de, por exemplo, cápsulas, tabletes, pílulas, na forma liofilizada, ou qualquer meio adequado de administração); auxiliares ergogênicos; têxteis com nanocápsulas para absorção pela pele e qualquer outro meio adequado de administração.

Descrição das figuras.

Figura 1. Efeito da concentração de DHA em meio de cultura de células do prepúcio na geração intracelular de ROS. As células foram cultivadas na presença de um triglicéride com 70% em peso de DHA em relação aos ácidos graxos totais por três dias antes do experimento. (A) A detecção de ROS foi executada com DHR 123 ém células tratadas com 40 ou 60 mM AAPH por 180 min. Os dados mostram a média de três experimentos independentes. (B) A detecção de ROS foi executada com CDCFDA em células tratadas com o sistema xantina/xantina oxidase por 180 min. Por comparação, os dados obtidos com 100 μΜ de Vitamina E (controle) foram incorporados. Os dados representam a média de três experimentos independentes.

Figura 2. Efeito comparativo da proporção de DHA de um triglicéride em meio de cultura de células de prepúcio na geração intracelular de ROS. (A) As células foram cultivadas na presença de cada triglicéride por três dias antes do experimento. A concentração no eixo X é a equivalente àquela que seria obtida com um triglicéride tendo um teor de DHA de 70% em peso. A detecção de ROS foi executada com DHR 123 em células tratadas com 40 mM AAPH por 180 min. Os dados representam a média de três experimentos independentes. (B) Representação da proteção antioxidante em relação à concentração de DHA no óleo de 20, 50 e 70%. Figura 3. Efeito da concentração de DHA na produção de TBARS em células de prepúcio. Estas células foram cultivadas na presença de um triglicéride com 70% em peso de DHA em relação aos ácidos graxos totais e por três dias antes do experimento na concentração indicada. O estresse oxidativo foi induzido com 40 mM de AAPH por 6 h e 24 h de latência. Os dados representam a média de três experimentos independentes.

Figura 4. Efeito da concentração de DHAem meio de cultura de células de prepúcio na geração de ânions superóxido. As células foram cultivadas na presença de um triglicéride com 70% em peso de DHA em relação aos ácidos graxos totais e por três dias antes do experimento. A detecção dos ânions superóxido foi executada por quimiluminescência imediatamente seguinte à indução oxidativa das células com 40 mM de AAPH e em alguns experimentos na presença de 10 mM de Tyron ou de 1,1875 UΑ/μL de SOD exógeno. Os dados são representativos de três experimentos independentes.

Figura 5A. Efeito da concentração de DHA em meio de cultura de células de prepúcio na atividade SOD. As células foram cultivadas na presença de um triglicéride com 70% em peso de DHA em relação aos ácidos graxos totais e por três dias antes do experimento nas concentrações de DHA de 0,5 (A)1 5 (B) e 50 μΜ (C). A atividade SOD foi analisada indiretamente pela análise da diminuição da quimiluminescência gerada pelo Iuminol como conseqüência da atividade endógena de SOD. A indução oxidativa foi executada com o sistema 0,1 mM de xantina/0,005 U/mL de xantina oxidase que gera imediatamente os ânions superóxido. Os dados são representativos de três experimentos independentes.

Figura 5B. Efeito da concentração de DHA em meio de cultura de células de prepúcio na atividade SOD. As células foram cultivadas na presença de um triglicéride com 70% em peso de DHA em relação aos ácidos graxos totais e por três dias antes do experimento na concentração indicada. A atividade SOD foi avaliada no sistema celular não induzido ou no sistema induzido com 40 mM de AAPH. Os dados são representativos de três experimentos independentes.

Figura 6. Efeito da concentração de DHA em meio de cultura de células de prepúcio na atividade GPx. As células foram cultivadas na presença de um triglicéride com 70% em peso de DHA em relação aos ácidos graxos totais e por três dias antes do experimento. A atividade GPx foi avaliada no sistema celular não induzido ou no sistema celular induzido com 40 mM de AAPH. Os dados são representativos de três experimentos independentes.

Figura 7. Efeito da concentração de DHA em meio de cultura de células ARPE-19 na geração intracelular de ROS. As células foram cultivadas na presença de um triglicéride com 70% em peso de DHA em relação aos ácidos graxos totais e por três dias antes do experimento. (A) A detecção de ROS foi executada com DHR 123 (A) ou com CDCFDA (B) em células tratadas com 40 ou 60 mM de AAPH por 180 min. Os dados representam a média de três experimentos independentes.

Figura 8. Efeito comparativo da concentração de DHA de um triglicéride em meio de cultura de células ARPE-19 na geração intracelular de ROS. As células foram cultivadas na presença de um triglicéride por três dias antes do experimento. A concentração no eixo X é a equivalente que seria obtida com o triglicéride tendo uma proporção de DHA de 70% em peso. A detecção de ROS foi executada com DHR 123 em células tratadas com 40 mM de AAPH por 180 min. Os dados representam a média de três experimentos independentes. (B) Representação da proteção antioxidante em relação à concentração de DHA no óleo de 20, 50 e 70%.

Figura 9. Efeito da concentração de DHA na produção de TBARS em células ARPE-19. As células foram cultivadas na presença de um triglicéride com 70% em peso de DHA em relação aos ácidos graxos totais e por três dias antes do experimento na concentração indicada. O estresse oxidativo foi induzido com 40 mM de AAPH por 6 h e 24 h de latência. Os dados representam a média de três experimentos independentes.

Figura 10. Efeito da concentração de DHA em meio de cultura de células ARPE-19 na geração de ânions superóxido. As células foram cultivadas na presença de um triglicéride com 70% em peso dè DHA em relação aos ácidos graxos totais e por três dias antes do experimento. A detecção dos ânions superóxido foi executada por quimiluminescência imediatamente em seguida à indução oxidativa das células com AAPH 40 mM. Os dados são representativos de três experimentos independentes.

Figura 11. Efeito da concentração de DHA em meio de cultura de células ARPE-19 na atividade GPx. As células foram cultivadas na presença de um triglicéride com 70% em peso de DHA em relação aos ácidos graxos totais e por três dias antes do experimento. A atividade GPx foi avaliada no sistema celular não induzido ou no sistema celular induzido com 40 mM de AAPH. Os dados são representativos de três experimentos independentes.

Figura 12. Efeito da concentração de DHA em meio de cultura de células ARPE-19 na atividade SOD. As células foram cultivadas na presença de um triglicéride com 70% em peso de DHA em relação aos ácidos graxos totais e por três dias antes do experimento. A atividade SOD foi avaliada no sistema celular não induzido ou no sistema celular induzido com 40 mM de AAPH. Os dados são representativos de três experimentos independentes.

Figura 13. Efeito da concentração de DHA obtido por síntese química (A e C) ou síntese enzimática (B e D) na percentagem de proteção celular versus estresse oxidativo em células ARPE-19 (A e B) ou células de prepúcio (C e D).

Figura 14. Influência do grau de purificação do óleo obtido por síntese química na percentagem de proteção celular versus estresse oxidativo induzido por DHAem células ARPE-19.

Figura 15. Influência da estrutura química na percentagem de proteção ceiuiar versus estresse oxidativo induzido por DhiA em céiuias ARPE-19.

Figura 16. Efeito da concentração de DHA na concentração intracelular de glutationa em células ARPE-19. Influência da presença de BSO.

Figura 17. Influência da síntese de novo de glutationa na percentagem de proteção celular versus estresse oxidativo induzido por DHA em células ARPE-19.

Figura 18. Efeito da concentração de DHA na concentração intracelular de glutationa em células de prepúcio. Influência da presença de BSO.

Figura 19. Influência do grau de purificação do óleo obtido por síntese química na percentagem de proteção celular versus estresse oxidativo induzido por EPA em células ARPE-19. Estudo comparativo com DHA.

Figura 20. Efeito da concentração de EPA na percentagem de proteção celular versus estresse oxidativo em células de prepúcio. Estudo comparativo com DHA.

Figura 21. Efeito da concentração de EPA na concentração intracelular de glutationa nas células de prepúcio. Influência da presença de BSO.

Figura 22. É um gráfico de barras comparativo mostrando o efeito da percentagem de DHA num triglicéride estruturado e não estruturado em diferentes dosagens com respeito à percentagem de proteção celular.

Dita figura 22 mostra os resultados surpreendentes do objeto do presente invento quando comparado com a estrutura química de um glicerídeo não estruturado (triglicéride) com a mesma estrutura em que as posições sn-1 e sn-3 foram substituídas com ácido caprílico (estruturado), ambos a partir de uma fonte enzímática com dois níveis de partida em teor de DHA de 20 e 70%.

A partir da figura, pode ser observado que na mesma concentração, a percentagem de proteção do ácido docosahexaenóico incorporado na posição sn-2 de um glicerídeo (estruturado), em particular um triglicéride, exibe uma eficiência que é aproximadamente 3 vezes maior que aquela de um glicerídeo contendo DHA não estruturado.

Em tal figura 22, a percentagem de proteção indica à relação entre a diferença na concentração intracelular de espécies reativas de oxigênio de células de controle e aquelas tratadas com DHA em relação com as células de controle, ambas submetidas ao mesmo estresse oxidativo expresso em percentagem. Em outras palavras, a existência de uma percentagem de proteção indica nas células tratadas uma perda estatisticamente significativa de geração intracelular de espécies reativas de oxigênio com relação ao controle.

A figura 23 é um gráfico comparativo mostrando o comprimento médio do telômero em fibroblastos humanos cultivados sob estresse oxidaíivo com ou sem DHA incorporado versus o número de passagem de populações celulares.

Dita figura 23 mostra os resultados surpreendentes do objetivo do presente invento observando que na presença de DHA sob condições de estresse oxidativo, o índice de encurtamento de telômero é menor com relação ao controle ou sem DHA

A figura 24 é um gráfico que representa o consumo absoluto de oxigênio no "limiar ventilatório 2" (UV2) para ciclistas competidores, não competidores e todos os ciclistas no nível basal e após 4 meses tomando DHA.

A figura 25 é um gráfico que representa a freqüência cardíaca em UV2 para ciclistas competidores, não competidores e todos os ciclistas no nível basal e após 4 meses tomando DHA.

A figura 26 é um gráfico que representa o tempo necessário para atingir o UV2 para ciclistas competidores, não competidores e todos os ciclistas no nível basal e após 4 meses tomando DHA.

A figura 27 é um gráfico que representa a freqüência cardíaca durante o consumo de 2000 mL/min. de O2 no limiar ventilatório para ciclistas competidores, não competidores e todos os ciclistas no nível basal e após 4 meses tomando DHA.

A figura 28 é um gráfico que representa a capacidade antioxidante total do plasma para esportistas competidores, não competidores e todos os esportistas no nível basal e após 3 semanas tomando DHA. Em cada caso, é mostrada a capacidade antioxidante antes (barra esquerda) e a capacidade antioxidante depois (barra direita) do teste de esforço.

A figura 29 é um gráfico que representa o dano oxidativo a lipídios plasmátícos de acordo com a concentração de MDA para esportistas competidores, não competidores e todos os esportistas no nível basal e após 3 semanas tomando DHA. Em cada caso, é mostrado o dano oxidativo antes (barra esquerda) e o dano oxidativo depois (barra direita) do teste de esforço.

A figura 30 é um gráfico que representa o dano oxidativo ao DNA usando o biomarcador de estresse oxidativo 8-oxodG para esportistas competidores, não competidores e todos os esportistas no nível basal e após 3 semanas tomando DHA. Em cada caso, é mostrado o dano oxidativo antes (barra esquerda) e o dano oxidativo depois (barra direita) do teste de esforço.

A figura 31 é um gráfico que representa a glicemia em esportistas competidores durante um esforço físico que não tomaram DHA ou tomaram por 3 semanas ou 4 meses.

A figura 32 é um gráfico que representa a glicemia em esportistas não competidores durante um esforço físico que não tomaram DHA ou tomaram por 3 semanas ou 4 meses.

A figura 33 é um gráfico que representa a glicemia em esportistas competidores e não competidores durante um esforço físico que não tomaram DHA ou tomaram por 3 semanas ou 4 meses.

Os seguintes exemplos são incluídos a título de ilustração, sendo exemplos não Iimitativos do presente invento.

Exemplos.

MATERIAIS E MÉTODOS PARA AVALIAR A ATIVIDADE ANTIOXIDANTE.

Culturas de células

Os modelos celulares usados foram células de prepúcio (fibroblastos epidermais não diferenciados, CRL-2076) e células ARPE-19 (células epiteliais pigmentares da retina, CRL-2302) obtidos de American Type Culture Collection. As culturas celulares foram mantidas em condições de crescimento adequadas de temperatura (37°C), concentração de CO2 (5%) e umidade (95%) em uma incubadora especialmente projetada para esta finalidade. As células ARPE-19 foram mantidas em crescimento até a confluência de 0,3 χ 104 células/cm2 em frascos de cultura com meio DMEM-F12 (Biological Industries) suplementado com 10% de soro bovino fetal, antibióticos penicilina (100 U/mL), estreptomicina (100 μg/mL) e glutamina (Biological Industries). Os fibroblastos GRL-2076 foram mantidos crescendo em frascos de cultura em meio de Dulbecco modificado por Iscove (Biological Industries) suplementado com 10% de soró fetal bovino, antibióticos penicilina (100 U/mL), estreptomicina (100 μg/mL) e glutamina (Biological Industries). As células foram transferidas por aderência ao substrato 24 h a 37°C a partir dos frascos de 75 mL para placas de 6, 12 ou 96 cavidades a fim de poder executar o experimento (106 células/mL).

Integração do DHA às células

O DHA-TG foi adicionado em várias concentrações (0,5 a 50 μΜ) partindo do DHA-TG enriquecido com 20, 50 e 70% (densidade do óleo de 0,92 g/mL), feito pela dissolução do óleo em etanol para a solução de estoque (1:100) e preparando as soluções de trabalho num meio de cultura preparado com soro. As células foram cultivadas com meio suplementado com DHA-TG por 3 dias a 37°C.

Indução de estresse oxidativo

Vários indutores foram usados para estressar oxidativamente as células:

a) sistema xantina/xantina oxidase 0,8 mM/10'2 U/mL que catalisa a oxidação de hipoxantina e xantina em ácido úrico, com redução de O2 a O·'2 e H2O2.

b) di-hidrocloreto de 2,2'-azobis-(2-amidinopropano) (AAPH) de 1 a 100 mM, largamente usado como iniciador hidrofílico de radicais livres pela indução de peroxidação lipídica

e de proteína. O AAPH oxida o DNA1 as proteínas e os lipídios através da ação dos radicais peroxila formados. Ele atua adicionalmente no sistema de defesa endógeno, uma vez que desativa a enzima chave, a SOD1 perdendo com isso a capacidade protetora de CAT e de GPx.

Geração de espécies reativas de oxigênio (ROS)

O nível de ROS foi medido nas culturas primárias de fibroblastos CRL-2076 humanos e em células epiteliais da retina ARPE-19 empregando- se a técnica fluorimétrica usando dihidrorodamina 123 (DHR 123, Molecular Probes) e diacetato de 2,7-diclorofluoresceína (H2DCFDA, Molecular Probes) como sondas fluorescentes num sistema contínuo medindo a cada 30 minutos até 180 minutos. Em ambos os casos, esta é uma medida não específica da geração de ROS. As sondas fluorescentes foram adicionadas às células (1 χ 106 células/mL) numa concentração final de 10 μΜ. A fluorescência das sondas oxidadas (2,7-diclorofluoresceína e rodamina 123) foi medida em leitor de fluorescência Mithras num comprimento de onda de excitação de 488 nm e num comprimento de onda de emissão de 525 nm em função do tempo. A fluorescência obtida é modulada com as determinações de viabilidade celular pela técnica espectrofotométrica MTT descrita abaixo.

Viabilidade celular

Os estudos de viabilidade celular foram executados a fim de avaliar o efeito citotóxico de várias amostras. Este método consiste de adicionar o reagente MTT (brometo de 3-(4,5-dimetiltiazol-2-il)-2,5-difeniltetrazol, Sigma), solúvel em meio aquoso, ao meio de incubação. As células viáveis metabolizam este composto e ele é convertido no sal formazana. Este sal é um composto colorimétrico insolúvel em meio aquoso, solúvel em DMSO e utilizável para medir a viabilidade celular. O método consiste de adicionar 20 μL por cavidade de uma solução 7,5 mg/mL (em excesso) de MTT. Esta é incubada por uma hora a 37°C de modo que as células viáveis metabolizam o composto e produzem o sal formazana, enquanto as não viáveis não metabolizam. Após incubar por uma hora as células são precipitadas e 100 μL de DMSO são adicionados, que dissolverão o sal formazana. Finalmente, a absorbância a 550 nm é lida num leito de placa. Os resultados de viabilidade são expressos como uma percentagem de densidade óptica em relação aos controles, tomando os últimos como tendo 100% de viabilidade. As curvas de viabilidade celular são desenhadas sobre placas de 96 cavidades semeando cerca de 20.000 células por cavidade (segundo a análise do número adequado de células em função da sua razão de crescimento) com um volume aproximado de 200 μΙ_ de meio por cavidade. O estudo da eficiência do produto é executado após expor as células ao produto por 72h em uma faixa suficientemente ampla de concentrações para encontrar o valor de IC50. Os resultados experimentais são ajustados à equação de Hill usando Sigma Plot 8.0 para determinar o IC50, definido como a concentração de DIHA necessária para reduzir a viabilidade da cultura em 50% com reiação ao controie.

Determinação de proteínas

A determinação é baseada na detecção colorimétrica e quantificação total das proteínas com uma formulação otimizada de ácido dizincônico que permite que as proteínas sejam medidas em amostras diluídas numa faixa de concentração de 0,5 a 20 μg/mL. O método usa um detector para Cu+, que é reduzido pelas proteínas em meio alcalino para Cu2+. O produto púrpura de reação é formado pela quelação de duas moléculas de BCA com o íon cuproso. O complexo solúvel em água absorve em 562 nm. Por meio de uma curva de calibração, pode ser obtida uma equação, com os resultados expressos em μg/mL. de proteínas. O kit comercial usado é o MicroBCA de Pierce (No. 23235).

Análise direta da geração de ROS

Medida da geração de hidroperóxidos lipídicos

A medida de malonildialdeído (MDA) em Iisados celulares foi usada como marcador de peroxidação lipídica por espectrometria de UV-vis, O MDA e os 4-hidroxialcenais (HAE) sãò produtos derivados da peroxidação de ácidos graxos poli- insaturados é dos relativos ésteres. As medidas diretas destes aldeídos constitui um índice conveniente de peroxidação lipídica. Um reagente cromogênico (N-metil-2-fenil- indol em acetonitrila) que reage com o MDA a 45°C foi empregado, usando o kit de peroxidação lipídica comercial de Calbiochem (No. 437634). A condensação de uma molécula de MDA com duas moléculas do reagente cromogênico resulta num cromóforo estável com absorbância máxima em 586 nm, com o limite de detecção sendo 0,1 μΜ.

A indução foi executada por 6 h com 40 mM de AAPH e 24 horas de latência. As células (107 células/mL) foram Iisadas por meio de ciclos de resfriamento e derretimento em N2 líquido. As amostras foram fracionadas a fim de se medir MDAe proteína. Os resultados foram expressos em μΜ de MDA/mg de proteína.

Medida de geração de ânion superóxido.

A medida direta do ânion superóxido foi executada por meio da técnica de quimiluminescência em microplacas medida por Iuminol (Calbiochem, No. 574590). A quimiluminescência para detectar o ânion superóxido é uma técnica usada devido a seu potencial para ganhar acesso a todos os sítios intracelulares de geração de superóxido, devido à alta especificidade da reação com luminol, à mínima toxicidade intracelular e à sensibilidade aumentada em relação a outras técnicas químicas. Ela é baseada no ânion superóxido que oxida o luminol numa reação que produz fótons de luz que são rapidamente medidos num iluminômetro padrão. Em nossos testes, usamos um leitor de quimiluminescência em microplaca dé ELISA, MITHRAS e além disso, dada a breve meia-vida do radical, foi usado um melhorador para aumentar a sensibilidade do teste e amplificar a resposta. O reagente pode ser usado em células vivas, uma vez que não é tóxico e não desnatura os componentes subcelulares do sistema. A capacidade de inibir a produção do ânion superóxido também foi investigada usando um agente seqüestraste específico para o ânion superóxido, Tyron (ácido 4,5-dihidroxi-1,3-benzeno- dissulfônico, Sigma) freqüentemente usado para ensaios de bloco in vitro na produção de ROS, sendo permeável à membrana celular e superóxido dismutase (SOD, Sigma) foi usado como um bloqueador de enzima, constituindo uma enzima de primeira linha na defesa antioxidante endógena. A medida de quimiluminescência nas células submetidas ao tratamento de indução de estresse oxidativo AAPH foi analisada a cada 60 segundos para um tempo total de 4100 segundos, a uma freqüência de 120 s/ciclo. Os resultados foram expressos em UA de quimiluminescência/mg de proteína.

Determinação de atividade antioxidante de enzima

Medição da atividade de glutationa peroxidase (GPx)

A GPx catalisa a redução de hidroperóxidos em glutationa reduzida, a função sendo a de proteger a célula do dano oxidativo. Ela usa a glutationa como último doador de elétrons para regenerar a forma reduzida de selenocisteína. A medida indireta de GPx é obtida por reação acoplada com glutationa redutase. A glutationa oxidada (GSSG) produzida pela reação com os hidroperóxidos pela ação da GPx é reciclada ao seu estado reduzido pela glutationa redutase usando NADPH como coenzima. A oxidação de NADPH èm NADP+ é acompanhada pela redução de sua absorbância em 340 nm. A taxa de redução da absorbância em 340 nm é diretamente proporcional à atividade GPx na amostra. O kit espectrofotométrico microplaca ELISA de Cayman (No. 703102) foi usado para detectar o GPx em lisados celulares de culturas primárias. As células foram cultivadas por aderência ao substrato por 24 h a 37°C. O lisado celular foi obtido por sonicação em Tris 50 mM pH 7,5, EDTA 5 mM e DTT 1 mM. A atividade de GPx foi obtida pela determinação da mudança de A340 nm/min. (ΔΑ340), expressa como nanomoles NADPH/min./mg de proteína da amostra.

Medição da atividade superóxido dismutase (SOD)

A metodologia de quimiluminescência é baseada na análise de atividade SOD no supernadante celular em relação a um controle positivo de SOD (Calbiochem, No. 574590). A presença de SOD no sistema xantina óxidase-xantina- luminol leva a uma redução da quimiluminescência produzida como uma redução da dismutação do ânion superóxido proporcional à atividade SOD. A análise é executada num iluminômetro MITHRAS em intervalos de 50 ms até o tempo final de 520 s. A atividade superóxido dismutase (SOD) em lisados celulares por meio da reação usando sais de tetrazólium para detectar radicais superóxido gerados pelo sistema xantina oxidase/hipoxantina também tem sido determinada. Um método espectrofotométrico é usado em uma microplaca para medir os 3 tipos de SOD (Cu-Zn-SOD; Mn-SOD e Fe-SÕD), ou seja citosólico e mitocondrial. Uma unidade de SOD é definida como a quantidade de enzima necessária para dismutar 50% do ânion superóxido gerado. A fim de detectar SOD em lisados celulares a partir de culturas primárias, foi usado um kit Cayman (N. 706002) seguindo o protocolo otimizado do fabricante. A faixa dinâmica do ensaio foi de 0,025 a 0,25 unidades de SOD/mL. Determinação da concentração antioxidante endógena intracelular Medida da concentração intracelular de glutationa reduzida (GSH)

Ensaio cinético direto para medir a glutationa reduzida (GSH) em lisados celulares. A glutationa pode ser encontrada dentro das células principalmente na forma reduzida (de 90 a 95% da glutationa total), sendo o antioxidante principal nos tecidos. Seu papel é o de desintoxicar xenobióticos e remover hidroperóxidos para manter o estado redox celular. A técnica empregada mede a glutationa total (GSSG + GSH) em uma amostra biológica (lisado celular) previamente desproteinizada com ácido sulfosalicílico (kit Sigma-Aldrich CSO260). O GSH causa uma redução contínua de ácido 5,5'-ditiobis(2-nitrobenzóico) (DTNB) em ácido 5-tio-2- nitrobenzóico (TNB) e o GSSG formado é reciclado por glutationa redutase e NADPH. O TNB é medido espectrofotometricamente em 412 nm. A butionina sulfoximina (BSO) que inibe especificamente a gama-glutamilcisteina sintetase foi usada como inibidor de síntese.

AVALIAÇÃO DA ATIVIDADE ANTIOXIDANTE DE DHA EM UM MODELO DE PELE HUMANA

Neste ensaio in vitro, células de prepúcio (fibroblastos epidermais não diferenciados, ATCC CRL-2076) foram usados como modelo celular, sendo um tipo celular adequado devido a sua boa resposta in vitro aos vários indutores oxidantes, em adição a ser uma cultura primária com exigências nutricionais e condições de cultura normais, constituindo assim um bom modelo in vitro extrapolável para a resposta in vivo, para uma aplicação cosmética potencial de DHA.

Resultados

As condições foram colocadas inicialmente para alcançar um modelo celular ativo sob todas as condições de estudo. Isto significa que os resultados obtidos se referem a células metabolicamente ativas. Estudos anteriores já mostraram que nas células de prepúcio concentrações de menos de 1000 μΜ de DHA não afetam a viabilidade celular em estudos em 3 dias. Nem a viabilidade celular foi afetada por estes estudos de estresse oxidativo com o sistema xantina/xantina oxidase ou com AAPH. Também foi mostrado que a incorporação de DHA até uma concentração de 50 μΜ em uma cultura de células de prepúcio por 3 dias não aumenta significativamente o nível oxidativo celular medido como fluorescência celular associada com duas sondas, dihidrorodamina (DHR 123) e 2,7-diclorofluoresceína (H2DCFDA), mais especifica para o ãnion superóxido e para a detecção de hidroperóxidos, respectivamente. Uma vez que estas condições tenham sido estabelecidas, a capacidade antioxidante geral do DHA incorporado na membrana das células de prepúcio foi avaliada contra o estresse oxidativo induzido por xantina/xantina oxidase ou por AAPH.

Ao induzir um estresse oxidativo moderado com 40 mM de AAPH e usando DHR123 como detèctor ROS, o DHA mostra um efeito inibidor na geração das espécies reativas de oxigênio, tanto na concentração de 0,5 μΜ (59% de proteção) e em 5 μΜ (33% de proteção), mostrando um efeito menor em 10 μΜ (26% de proteção) ou nenhum efeito em 50 μΜ de DHA (fig. 1A). Quando as células são submetidas à severa indução com 60 mM de AAPH, o DHA mostra um efeito protetivo contra a geração de ROS tanto em concentrações de 0,5 mM (40% de proteção) e 5 μΜ (29% de proteção), mas perde em concentrações maiores de DHA (Fig. 1A).

Também se deve notar que a proteção que 0,5 μΜ de DHA exerce contra o estresse oxidativo induzido por xantina/xantina oxidase (Fig 1B), que mostra um efeito seqüestraste sobre as espécies reativas de oxigênio, tanto o ânion superóxido e os hidroperóxidos gerados no processo oxidativo. Comparando a capacidade antioxidante em relação a um antioxidante lipofílico tal como a vitamina E (Fig. 1B), observa-se que eles exercem a mesma cinética de proteção (com DHA inibindo a oxidação celular em 33,46% e a vitamina E em 30%).

A resposta cinética de proteção do DHA sempre apresenta um efeito antioxidante máximo entre 60 e 120 minutos após executar a indução, isto denotando uma saturação na capacidade seqüestraste de hidroperóxidos e ânion superóxido do DHA. O comportamento antioxidante é criticamente dependente da dosagem, uma vez que o aumento da concentração dele leva a uma perda da capacidade seqüestraste de ROS, com a concentração de 0,5 μΜ sendo a concentração que tem a capacidade antioxidante mais efetiva. A este respeito, um outro parâmetro crítico em termos de otimizar a eficiência do sistema é a proporção de DHA em relação ao total de ácidos graxos. Como mostrado na fig. 2, em concentrações idênticas de triglicéride, uma redução na proporção de DHA para 50 ou 20% reduz drasticamente a capacidade antioxidante celular, e ela se reverte para pró-oxidante em concentrações baixas ou moderadas. Estes resultados parecem indicar que o efeito antioxidante celular do DHA não depende exclusivamente da concentração, mas também é um fator decisivo a sua localização molecular, no caso sua distribuição da sua estrutura no triglicéride.

A respeito da inibição específica da produção de ROS, foi analisada a geração de peróxidos lipídicos (TBARS) e de ânions superóxido. Os resultados obtidos mostraram que as células tratadas com AAPH geraram uma maior concentração de substâncias reativas ao ácido tiobarbitúrico (TBARS) comparadas com as células não induzidas, expressas como μΜ de MDA/mg de proteínas (Fig. 3). Como esperado, a incorporação de DHA na membrana de células de prepúcio aumentou ievemente a peroxiaação iipiaica ceiuiar basai ae forma dependente de dose (0,5, 5 e 50 μΜ) (Fig. 3). Nas células submetidas à indução oxidativa com 40 mM AAPH, o DHA apresenta uma atividade antioxidante protegendo os fibroblastos de gerar peróxidos hidrolipídicos de membrana, sua ação sendo do tipo inverso de dependente de concentração. A proteção com DHA foi de 87% para 0,5 μΜ DHA, 85% para 5 μΜ e 48% para 50 μΜ DHA-TG (Fig. 3).

A geração do ânion superóxido foi então analisada. As células de prepúcio submetidas a um estresse oxidativo com 40 mM de AAPH geraram uma produção de ãnion superóxido 2,5 vezes maior que as células não induzidas, que mantiveram um nível constante de ãnion superóxido (Fig. 4). Na ausência de indução oxidativa as células com DHA integrado não mostraram um nível maior de ânion superóxido intracelular em relação ao controle (Fig. 4). Sob condições de estresse oxidativo (Fig. 4) o DHA inibe a geração do ãnion superóxido em 16,5% numa concentração de 0,5 mM, em 10% numa concentração de 5 mM e em 9% numa concentração de 50 mM. A especificidade do método foi confirmada pela adição de Tyron (ácido 4,5-dihidróxi-1,3-benzeno-sulfônico, um composto que é permeável à membrana celular que opera como um agente seqüestraste altamente específico do ânion superóxido intracelular) ou de SOD extracelular (bloqueador enzimático de primeira linha na defesa antioxidante endógena via dismutação do ânion superóxido intracelular). A produção do ânion superóxido em células estressadas com AAPH, com ou sem o DHA previamente integrado, na presença de SOD exógeno ou de Tyron, foi totalmente inibida e alcançou valores basais (Fig. 4).

Finalmente, foi analisado se o DHA sofreu sua atividade antioxidante modificando a atividade das enzimas antioxidantes celulares de primeira linha. A atividade da SOD e da GPx nas células de prepúcio com ou sem DHA integrado foi analisada. No primeiro caso, o sistema xantina/xantina oxidase foi usado como gerador instantâneo de ânions superóxido (tempo total medido de 520 s, medindo a cada 50 ms). Os resultados obtidos mostraram uma boa indução oxidativa com cinética rápida, com observação direta da dismutação e não produção do ânion superóxido. A máxima quimiluminescência alcançada 15 s após a indução oxidativa foi interpretada como uma medida indireta e qualitativa da atividade SOD (Fig. 5A). Sem DHA integrado, foram alcançados valores de 310 U.A. quimiluminescência/106 células, caindo para 150 U.A. quimiluminescência / 106 células em um sistema pré-incubado com DHA 0,5 μΜ (proteção antioxidante de 52%) (Fig. 5A). A eficiência foi mantida em 52% e 42% de proteção em células tratadas com 5 e 50 μΜ de DHA1 respectivamente (Fig. 5A). Além disso, sabendo que o AAPH oxida o DNA, as proteínas e os lipídios por difusão dos radicais peroxila gerados, o DHA como antioxidante pode evitar a desativação da SOD entrusted(*) com a dismutação do ânion superóxido, mantendo na célula a defesa antioxidante endógena da catalase e da glutationa peroxidase. Este aspecto é confirmado na figura 5B, em que a atividade SOD é mostrada não sendo aumentada no estado basal com DHA estando presente (-10/-15%), mas a perda de atividade SOD inerente ao processo de estresse oxidativo é inibida com o DHA estando presente mantendo ou mesmo aumentando a atividade de SOD (10/20%). Para a atividade GPx (Fig. 6), esta foi aumentada no estado basal celular em concentrações modestas de DHA (até 17% em 5 μΜ), mas cai em concentrações altas (-20% em 50 μΜ). Este comportamento é mantido intacto em um estado de estresse oxidativo (Fig. 6). Estes resultados sugerem que o DHA colabora com o sistema de defesa antioxidante endógeno uma vez que se refere à dismutação do ânion superóxido pela geração de SOD por toda a faixa de concentrações testadas, e também é capaz de controlar a geração de hidroperóxidos em concentrações moderadas, uma vez que aumenta a atividade GPx.

AVALIAÇÃO DA ATIVIDADE ANTIOXIDANTE DE DHANUM MODELO CELULAR DE RETINA

Neste estudo in vitro, o modelo celular foi baseado em células ARPE-19 (células epiteliais pigmentárias da retina, ATCC CRL-2302), sendo um tipo celular adequado devido a sua boa resposta aos vários indutores oxidantes, bem como por ser uma cultura primária com exigências nutricionais e condições de cultura normais. Ele também constitui um bom modelo ocular, uma vez que mantém as propriedades funcionais e biológicas das células epiteliais pigmentarias da retina.

Resultados

O ensaio executado com esta linhagem celular é similar àquele descrito para as células de prepúcio na seção anterior. As exigências básicas foram as mesmas em relação a manter a viabilidade celular sob todas as condições de trabalho (efeito do DHA, estresse oxidativo). A incorporação de DHA nas doses analisadas não envolveu qualquer alteração significativa no estado oxidativo celular basal.

Na indução de um estresse oxidativo moderado com 40 mM de AAPH e usando DHR123 como detector de ROS1 o DHA mostra um efeito inibitório na geração de espécies reativas de oxigênio, nas concentrações de 0,5 μΜ (43% de proteção) e 5 μΜ (32% de proteção), mas com um efeito menor em 50 μΜ (4% de proteção) de DHA (Fig. 7A). Quando as células são submetidas a indução severa com 60 mM de AAPH, o DHA mostra um efeito protetor contra a geração de ROS, à concentração de 0,5 μΜ (13% de proteção) e menor em concentrações maiores de DHA (Fig. 7A). Estes resultados são similares àqueles obtidos com as células de prepúcio, embora um efeito diferencial notável seja abaixa proteção observada contra uma indução oxidativa severa. Usando o CDCFDA para a detecção de ROS1 mais específico a peróxidos, também foi revelada a proteção que o DHA exerce contra o estresse oxidativo induzido por AAPH (Fig. 7B).

A cinética de proteção do DHA também sempre apresenta um efeito antioxidante máximo de 60 a 120 minutos após executar a indução, denotando uma saturação na capacidade sequestrante de hidroperóxidos e do ânion superóxidõ do DHA. Quantitativamente, a capacidade antioxidante é criticamente dependente de dosagem, uma vez que quando a concentração de DHA é aumentada há uma perda da capacidade sequestrante de ROS, com a concentração de 0,5 μΜ sendo a mais efetiva em sua capacidade antioxidante (figs. 7A e 7B). A este respeito, um outro parâmetro crítico em termos de otimização da eficiência do sistema é a razão de DHA para os ácidos graxos totais. Reduzir a proporção de DHA em relação aos ácidos graxos totais de 70% para de 50 a 20% significativamente e não proporcionalmente reduz sua capacidade antioxidante celular em concentrações ótimas (0,5 a 5 μΜ), tornando-a igual à das altas concentrações (Fig. 8A e 8B), embora diferentemente das células de prepúcio, em nenhuma proporção o DHA se torna pró-oxidante. Estes resultados confirmam que o efeito antioxidante celular do DHA não depende exclusivamente de sua concentração, mas também um fator decisivo é sua localização molecular, neste caso sua distribuição na estrutura do triglicéride.

A respeito da inibição específica da produção de ROS, a geração de peróxidos lipídicos (TBARS) (Fig. 9) e de ânions superóxidõ (Fig. 10) foram analisadas. Os resultados obtidos são muito similares àqueles obtidos com as células do prepúcio. As células tratadas com AAPH geram uma concentração maior de substâncias reativas ao ácido tíobarbitúrico (TBARS) e de ânions superóxidõ em relação às células não induzidas. A incorporação de DHA na membrana das células ARPE-19 levemente e dependendo da dose (0,5, 5 e 50 μm) aumentam a peroxidação lipídica basal celular, embora nas células submetidas à indução oxidativa, o DHA apresenta uma atividade antioxidante celular inibindo-as de gerarem membrana lipídica de hidroperóxidos em uma razão inversa à de sua concentração. A proteção com DHA foi de 64% para 0,5 μΜ de DHA1 58% para 5 μΜ e 42% de 50 μΜ de DHA (Fig. 9). A geração do ânion superóxidõ foi então analisada. Na ausência de uma indução oxidativa, as células com DHA integrado não apresentam um nível maior de ânion superóxidõ intracelular em relação ao controle (Fig. 10A). Um estresse oxidativo com de 40 mM AAPH gera uma produção de ânion superóxidõ que é parcialmente inibida pelo DHA (de 20 a 16% em concentrações de 0,5 a 50 mM). Esta inibição está em concordância com a atividade SOD com o DHA estando presente (Fig. 10 Β) A atividade SOD não aumentou no estado basal com o DHA estando presente (-10/15%) mas como nas células de prepúcio, a perda de atividade SOD inerente ao processo de estresse oxidativo é inibida com o DHA estando presente mantendo a atividade SOD basal.

Finalmente, foi executada uma análise para verificar se o DHA alterou a atividade da enzima GPx como antioxidante celular de primeira linha (Fig. 11). A atividade GPx é aumentada no estado celular basal em todas as concentrações de DHA testadas (de 12 a 40%) e este comportamento é mantido intacto no estado de indução oxidativa, que também apresenta uma atividade de GPx 2,5 vezes maior (Fig. 11). Como no caso das células epiteliais estes resultados sugerem que o DHA exerce parte de seu efeito antioxidante modulando a atividade do sistema de defesa antioxidante enzimático celular endógeno.

INFLUÊNCIA DO MÉTODO DE SÍNTESE NA ATIVIDADE ANTIOXIDANTE DE DHA INCORPORADO EM UM TRIGLICÉRIDE.

No presente ensaio in vitro, células ARPE-19 (células epiteliais pigmentárias da retina, ATCC CRL-2302) e células do prepúcio (fibroblastos epidermais não diferenciados, ATCC CRL-2076) foram usados como modelo celular, sendo linhagens celulares adequadas devido a sua boa resposta in vitro aos vários indutores oxidantes. Os triglicérides de óleo de atum (DHA 20%-TG, 20% molar em DHA) ou derivados de óleo enriquecidos com de 50 a 70% molar em DHA (DHA50%-TG e DHA70%-TG) obtido por métodos químicos (CHEM) ou métodos enzimáticos (ENZ) foram usados como ingrediente ativo.

Resultados

Ao induzir um estresse oxidativo moderado com 40 mM AAPH em células ARPE-19 e usando DHR ou H2DCFDA como detectores de ROS intracelular, o DHA natural (DHA20%-TG) e aquele incorporado num triglicéride obtido quimicamente (DHA50%-TG-CHEM e DHA70%-TG-CHEM) mostraram um efeito inibitório na geração das espécies reativas de oxigênio, tanto nas concentrações de 0,5 mM e 5 mM, mostrando um efeito menor em 50 mM (figura 13A). Este efeito depende do teor de DHA, sendo DHA70%-TG-CHEM > DHA50%-TG-CHEM > DHA20%-TG. Nas mesmas concentrações (0,5, 5 e 50 mM), os óleos obtidos enzimaticamente mostram uma atividade mais alta em todos os teores de DHA (DHA70%-TG-ENZ e DHA50%-TG- ENZ) (Fig. 13B). Num estudo similar com células de prepúcio, os resultados foram ainda mais surpreendentes. A atividade pró-oxidativa mostrada com DHA70%-TG-CHEM e DHA50%-TG-CHEM em alta dose (Fig. 13C) se torna antioxidante em todas as concentrações com óleos com origem enzimática (DHA70%-TG-ENZ e DHA50%-TG- ENZ) (Fig. 13D). A remoção de polímeros intrínsecos de óleos obtidos quimicamente por meio de métodos cromatográficos (DHA70%-TG-BPM) causa uma diminuição ainda maior de atividade antioxidante em células ARPE-19, tornando-se pró-oxidante em altas concentrações (5 e 50 mM) (Fig. 14). A atividade antioxidante de DHA incorporado em um triglicéride obtido por síntese enzimática também é alta (pelo menos o dobro) daquela mostrada pelo DHA incorporado em outras estruturas químicas tais como ésteres etila, ácido graxo livre ou ácido graxo ligado a albumina de soro (Fig. 15).

A atividade antioxidante celular mostrada com a incorporação de DHA está relacionada a todos os aspectos considerados anteriormente tais como manutenção das atividades SOD e GPx, mas também a um aumento na concentração intracelular de glutationa (GSH). Em células ARPE-19 (Fig. 16), o DHA induz um aumento na concentração intracelular de GSH diretamente relacionada com a síntese de novo de GSH1 uma vez que a adição de BSO (inibidor especifico da síntese de GSH) elimina o efeito protetor de DHA (Fig. 17) numa relação direta com uma diminuição da concentração intracelular de GSH (Fig. 15). Um comportamento similar é mostrado para células do prepúcio (Fig. 18).

A melhoria obtida na atividade antioxidante de DHA por uma síntese enzimática também é aplicável a um outro ácido graxo Omega-3 tal como o ácido eicosapentaenóico (EPA) Num estudo com células ARPE-19, o EPA obtido enzimaticamente (EPA70%-TG-ENZ) mostra ter uma atividade antioxidante, embora muito mais baixa que aquela observada com DHA (DHA70%-TG-ENZ), enquanto que o EPA obtido quimicamente e livre de polímeros (EPA70%-TG-BPM) é mostrado como sendo muito pró-oxidativo (Fig. 19). Além disso, o EPA (EPA70%-TG-ENZ) obtido enzimaticamente mostra nas células de prepúcio uma atividade antioxidante excepcional ainda mais alta que aquela do DHA (DHA70%-TG-ENZ) (Fig. 20), relacionada com, da mesma forma que o DHA, o aumento da concentração intracelular de GSH (Fig. 21).

AVALIAÇÃO DA ATIVIDADE ANTIOXIDANTE DO DHA INCORPORADO NUM TRIGLICÉRIDE ESTRUTURADO EM UM MODELO CELULAR DE RETINA.

Neste ensaio in vitro, as células ARPE-19 (células epiteliais pigmentárias da retina, ATCC CRL-2302) foram usadas como modelo celular, sendo um tipo celular adequado devido a sua boa resposta aos vários indutores oxidantes, bem como por ser uma cultura primária com exigências nutricionais e condições de cultura normais. Além disso, ele também é um bom modelo ocular, uma vez que mantém as propriedades funcionais e biológicas das células epiteliais pigmentarias da retina. Como ingrediente ativo foi usado triglicéride estruturado derivado de óleo de atum (DHA20%- TG1 20% molar em DHA) ou óleo enriquecido com 70% de DHA (DHA70%-TG, 70% molar em DHA), em que através de métodos enzimáticos os ácidos graxos nas posições sn-1 e sn-3 foram substituídos com ácido octanóico. Nestes novos compostos, o teor molar de DHA foi de 7% no DHA20%-TG e 22% no DHA70%-TG.

Resultados (vide figura 22) Ao induzir um estresse oxidativo moderado com 40 mM AAPH e usando DHR como detector de ROS intracelular, o DHA incorporado num triglicéride normal (DHA20%-TG e DHA70%-TG) mostraram um efeito inibitório na geração das espécies reativas de oxigênio, tanto nas concentrações de 0,5 mM e 5 mM, mostrando um efeito menor em 50 mM (figura 22). Este efeito depende do teor de DHA, sendo DHA7u%-TG > DHA20%-TG. Nas mesmas concentrações, os óieos estruturados com concentrações reais de DHA de 2 a 3 vezes menor, mostram a mesma atividade (para a concentração de 0,5 M) ou maior (para as concentrações de 5 mM e 50 mM) no caso de DHA20%-TG. No caso de DHA70%-TG, a eficácia do triglicéride estruturado é levemente menor que as concentrações ótimas (0,5 mM e 5 mM), mas o comportamento em altas concentrações é invertido (50 mM) mostrando em geral um comportamento mais estável e menos dependente da dose.

AVALIAÇÃO DA ATIVIDADE DE DHA GOMO AGENTE PROTETOR DO COMPRIMENTO DE UM TELÔMERO ASSOCIADO À IDADE NUM MODELO DE PELE HUMANA.

Metodologia Cultura de células

Os modelos celulares usados foram células de prepúcio (fibroblastos epidermais não diferenciados, CRL-2076) obtidos de American Type Culture Collection. As culturas celulares foram mantidas em condições de crescimento adequadas de temperatura (37°C), concentração de CO2 (5%) e umidade (95%) em uma incubadora especialmente projetada para esta finalidade. Os fibroblastos CRL-2076 foram mantidos crescendo em frascos de cultura em meio de Dulbecco modificado por Iscove (Biological Industries) suplementado com 10% de soro fetal bovino, antibióticos penicilina (100 U/mL), estreptomicina (100 μg/mL) e glutamina (Biological Industries).

Integração do DHA nas células

O DHA-TG 70% enzimaticamente sintetizado foi adicionado a uma concentração de 0,5 μΜ, feita pela dissolução do óleo em etanol para a solução estoque (1:100) e preparando as soluções de trabalho em um meio de cultura preparado com soro. As células foram cultivadas com meio suplementado com DHA-TG por 3 dias a 37°C.

Indução do estresse oxidativo

O di-hidrocloreto de 2,2'-azobis(2-amidinopropano) (AAPH) foi usado para estressar oxidativamente as células numa concentração de 40 mM, largamente usado como um iniciador hidrofílico de radicais livres pela indução de peroxidação Iipidica e protéica. O AAPH oxida o DNA1 as proteínas e os lipídios através da ação dos radicais peroxila formados. Ele adicionalmente atua no sistema de defesa endógeno, uma vez que desativa a enzima chave, a SOD1 perdendo com isso a capacidade protetora de CAT e de GPx.

Medida do comprimento dos telômeros

As regiões teloméricas constituídas por DNA altamente repetitivo podem ser avaliadas por técnicas de hibridização in situ. O método de hibridização in situ com fluorescência (FISH) usando sondas complementares às seqüências teloméricas que permitem detectar a presença ou ausência dos telômeros, bem como para quantificar os telômeros por célula ou por grupo cromossômico. O método chamado de fluxo FISH usa citometria de fluxo em combinação com a técnica FISH usando um PNA (ácido nucléico peptídeo) pan-telomérico como sonda e permite medir, usando as intensidades de fluorescência, os comprimentos teloméricos médios nas extremidades do cromossomo de células individuais. Para o presente propósito, a intensidade de fluorescência de PAN rotulado com cromossomos na metáfase. Os resultados são expressos como unidade de fluorescência de telômero (TFU), correspondendo cada TFU a 1 kb de telômeros repetitivos.

Resultados

As alterações no comprimento médio de telômeros em fibroblastos humanos cultivados sob condições de estresse oxidativo com ou sem DHA incorporado foram analisados por fluxo-FISH (figura 23). Uma regressão linear foi usada para analisar a relação entre o comprimento dos telômeros e o número de passagem das populações celulares. Para todas as culturas analisadas, as curvaturas na regressões podem ser entendidas diretamente como o índice de encurtamento dos telômeros. Nos fibroblastos humanos, o tratamento com AAPH, que induz um excesso de radicais livres intracelulares, acelera notadamente o índice de encurtamento de telômeros. Por outro lado, a incorporação de DHA numa concentração de 0,5 mM, que tem provado aumentar a defesa antioxidante da célula, reduz dito índice em 50% em relação ao seu valor sem DHA. Além disso, a incorporação de DHA é capaz de reduzir o índice de encurtamento de telômeros, mesmo com relação ao controle normal de fibroblastos.

Claims

1. "Produto alimentício", caracterizado pelo fato de compreender ácido docosahexaenóico (DHA), ácido eicosapentaenóico (EPA) ou EPA derivado de DHA, para uso nutricional como antioxidante.

2. "Produto", de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato que dito produto alimentício é administrado a um indivíduo afetado por dano oxidativo celular.

3. "Produto", de acordo com a reivindicação 2, caracterizado pelo fato que o dano oxidativo é associado com: - uma condição fisiológica dentre envelhecimento, exercício físico, hipoglicemia durante ou após exercício físico; ou - uma doença dentre uma patologia neurodegenerativa, uma patologia ocular, uma patologia isquêmica, um processo inflamatório, aterosclerose; em que dita patologia neurodegenerativa pode ser esclerose múltipla, mal de Alzheimer, mal de Parkinson, esclerose lateral amiotrópica e distrofia muscular; em que dita patologia ocular pode ser retinose pigmentaria, degeneração macular e catarata; em que dita patologia isquêmica pode ser infarto do miocárdio e infarto cerebral; e em que dito processo inflamatório pode ser artrite, vasculite, glomeronefrite e eritromatose lupus.

4. "Método para o gerenciamento dietético de dano oxidativo celular em um indivíduo", caracterizado pelo fato de compreender a administração de uma quantidade efetiva de DHA, EPA ou EPA derivado de DHA a dito indivíduo.

5. "Método", de acordo com a reivindicação 4, caracterizado pelo fato que o dano oxidativo é associado com: - uma condição fisiológica dentre envelhecimento, exercício físico, hipoglicemia durante ou após exercício físico; ou - uma doença dentre uma patologia neurodegenerativa, uma patologia ocular, uma patologia isquêmica, um processo inflamatório, aterosclerose; em que dita patologia neurodegenerativa pode ser esclerose múltipla, mal de Alzheimer, mal de Parkinson, esclerose lateral amiotrópica e distrofia muscular; em que dita patologia ocular pode ser retinose pigmentaria, degeneração macular e catarata; em que dita patologia isquêmica pode ser infarto do miocárdio e infarto cerebral; e em que dito processo inflamatório pode ser artrite, vasculite, glomeronefrite e eritromatose lupus.

6. "Uso não terapêutico de ácido docosahexaenóico (DHA), ácido eicosapentaenóico (EPA) ou EPA derivado de DHA", caracterizado pelo fato de ser como antioxidante.

7. "Uso não terapêutico de ácido docosahexaenóico (DHA), ácido eicosapentaenóico (EPA) ou EPA derivado de DHA", caracterizado pelo fato de ser como agente anti-envelhecimento.

8. "Uso não terapêutico de ácido docosahexaenóico (DHA), ácido eicosapentaenóico (EPA) ou EPA derivado de DHA", caracterizado pelo fato de ser como melhorador de desempenho em indivíduos submetidos a exercício físico.

9. "Uso não terapêutico de ácido docosahexaenóico (DHA), ácido eicosapentaenóico (EPA) ou EPA derivado de DHA", caracterizado pelo fato de para manter os níveis de glicose sangüíneos em indivíduos durante exercício físico.

10. "Uso não terapêutico", de acordo com as reivindicações de 6 a 9, caracterizado pelo fato que dito uso é executado peia indústria alimentícia.

11. "Uso não terapêutico", de acordo com as reivindicações de 6 a 10, caracterizado pelo fato que dito uso é executado em laticínios.

12. "Uso não terapêutico", de acordo com as reivindicações -8 ou 9, caracterizado pelo fato que dito DHA, EPA ou EPA derivado de DHA é administrado através de meios adequados escolhidos dentre o grupo que consiste de uma bebida em todas as suas características para antes, durante e após o exercício físico; barras energéticas, garras ergogênicas, sólidos e preparados para provisionamento; suplementos dietéticos e preparados polivitamínicos; auxiliares ergogênicos; têxteis e nanocápsulas para absorção pela pele; e qualquer outro meio adequado de administração.

13. "Uso não terapêutico", de acordo com a reivindicação -12, caracterizado pelo fato que dito suplemento dietético e preparado polivitamínico estão na forma de cápsulas, tabletes, pílulas, forma Iiofilizada ou qualquer meio adequado de administração.

14. "Uso não terapêutico", de acordo com as reivindicações de 6 a 9, caracterizado pelo fato que dito uso é executado em aplicações cosméticas.

15. "Uso de DHA, EPA ou EPA derivado de DHA", caracterizado pelo fato de ser para a fabricação de uma composição farmacêutica para tratar de dano oxidativo celular.

16. "Uso", de acordo com a reivindicação 15, caracterizado pelo fato que o dano oxidativo celular é associado com; - uma condição fisiológica dentre envelhecimento, exercício físico, hipoglicemia durante ou após exercício físico; ou - uma doença dentre uma patologia neurodegenerativa, uma patologia ocular, uma patologia isquêmica, um processo inflamatório, aterosclerose; em que dita patologia neurodegenerativa pode ser esclerose múltipla, mal de Alzheimer, mal de Parkinson, esclerose lateral amiotrópica e distrofia muscular; em que dita patologia ocular pode ser retinose pigmentaria, degeneração macular e catarata; em que dita patologia isquêmica pode ser infarto do miocárdio e infarto cerebral; e em que dito processo inflamatório pode ser artrite, vasculite, glomeronefrite e eritromatose lupus.

17. "Produto alimentício, método e uso", o produto de acordo com as reivindicações 2 ou 3, o método de acordo com as reivindicações 4 ou 5 e o uso de acordo com as reivindicações 15 ou 16, caracterizado pelo fato que o dano oxidativo celular compreende a produção de espécies reativas de oxigênio (ROS).

18. "Produto alimentício, método e uso", o produto de acordo com as reivindicações 2 ou 3, o método de acordo com as reivindicações 4 ou 5 e o uso de acordo com as reivindicações 15 ou 16, caracterizado pelo fato que a ROS é o ânion superóxido.

19. "Produto alimentício, método e uso", o produto de acordo com as reivindicações 2 ou 3, o método de acordo com as reivindicações 4 ou 5 e o uso de acordo com as reivindicações 15 ou 16, caracterizado pelo fato que o dano oxidativo celular compreende o encurtamento dos telõmeros de DNA.

20. "Produto alimentício, método e uso", o produto de acordo com as reivindicações 2 ou 3, o método de acordo com as reivindicações 4 ou 5 e o uso de acordo com as reivindicações 15 ou 16, caracterizado pelo fato que o dano oxidativo celular compreende o envelhecimento celular prematuro.