EA031136B1 - Микроорганизмы, продуцирующие эйкозапентаеновую кислоту, композиции жирных кислот и способы их получения и применения - Google Patents

Микроорганизмы, продуцирующие эйкозапентаеновую кислоту, композиции жирных кислот и способы их получения и применения Download PDF

Info

Publication number
EA031136B1
EA031136B1 EA201290656A EA201290656A EA031136B1 EA 031136 B1 EA031136 B1 EA 031136B1 EA 201290656 A EA201290656 A EA 201290656A EA 201290656 A EA201290656 A EA 201290656A EA 031136 B1 EA031136 B1 EA 031136B1
Authority
EA
Eurasian Patent Office
Prior art keywords
fraction
dgk
pta
epa
isolated
Prior art date
Application number
EA201290656A
Other languages
English (en)
Other versions
EA201290656A1 (ru
Inventor
Кирк Е. Эпт
Пол Уоррен Беренс
Джон Милтон Хансен
Джозеф В. Пфайфер III
Трэйси Линн Шталь
Росс Зиркл
Original Assignee
ДСМ АйПи АССЕТС Б.В.
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Family has litigation
First worldwide family litigation filed litigation Critical https://patents.darts-ip.com/?family=44277725&utm_source=google_patent&utm_medium=platform_link&utm_campaign=public_patent_search&patent=EA031136(B1) "Global patent litigation dataset” by Darts-ip is licensed under a Creative Commons Attribution 4.0 International License.
Application filed by ДСМ АйПи АССЕТС Б.В. filed Critical ДСМ АйПи АССЕТС Б.В.
Publication of EA201290656A1 publication Critical patent/EA201290656A1/ru
Publication of EA031136B1 publication Critical patent/EA031136B1/ru

Links

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A23—FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
    • A23K—FODDER
    • A23K20/00—Accessory food factors for animal feeding-stuffs
    • A23K20/10—Organic substances
    • A23K20/158—Fatty acids; Fats; Products containing oils or fats
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
    • C12N1/12—Unicellular algae; Culture media therefor
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A23—FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
    • A23C—DAIRY PRODUCTS, e.g. MILK, BUTTER OR CHEESE; MILK OR CHEESE SUBSTITUTES; MAKING THEREOF
    • A23C9/00—Milk preparations; Milk powder or milk powder preparations
    • A23C9/152—Milk preparations; Milk powder or milk powder preparations containing additives
    • A23C9/1528—Fatty acids; Mono- or diglycerides; Petroleum jelly; Paraffine; Phospholipids; Derivatives thereof
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A23—FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
    • A23D—EDIBLE OILS OR FATS, e.g. MARGARINES, SHORTENINGS, COOKING OILS
    • A23D9/00—Other edible oils or fats, e.g. shortenings, cooking oils
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A23—FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
    • A23D—EDIBLE OILS OR FATS, e.g. MARGARINES, SHORTENINGS, COOKING OILS
    • A23D9/00—Other edible oils or fats, e.g. shortenings, cooking oils
    • A23D9/007—Other edible oils or fats, e.g. shortenings, cooking oils characterised by ingredients other than fatty acid triglycerides
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A23—FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
    • A23K—FODDER
    • A23K10/00—Animal feeding-stuffs
    • A23K10/10—Animal feeding-stuffs obtained by microbiological or biochemical processes
    • A23K10/12—Animal feeding-stuffs obtained by microbiological or biochemical processes by fermentation of natural products, e.g. of vegetable material, animal waste material or biomass
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A23—FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
    • A23K—FODDER
    • A23K50/00—Feeding-stuffs specially adapted for particular animals
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A23—FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
    • A23K—FODDER
    • A23K50/00—Feeding-stuffs specially adapted for particular animals
    • A23K50/40—Feeding-stuffs specially adapted for particular animals for carnivorous animals, e.g. cats or dogs
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A23—FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
    • A23K—FODDER
    • A23K50/00—Feeding-stuffs specially adapted for particular animals
    • A23K50/80—Feeding-stuffs specially adapted for particular animals for aquatic animals, e.g. fish, crustaceans or molluscs
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A23—FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
    • A23L—FOODS, FOODSTUFFS, OR NON-ALCOHOLIC BEVERAGES, NOT COVERED BY SUBCLASSES A21D OR A23B-A23J; THEIR PREPARATION OR TREATMENT, e.g. COOKING, MODIFICATION OF NUTRITIVE QUALITIES, PHYSICAL TREATMENT; PRESERVATION OF FOODS OR FOODSTUFFS, IN GENERAL
    • A23L2/00—Non-alcoholic beverages; Dry compositions or concentrates therefor; Their preparation
    • A23L2/52—Adding ingredients
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A23—FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
    • A23L—FOODS, FOODSTUFFS, OR NON-ALCOHOLIC BEVERAGES, NOT COVERED BY SUBCLASSES A21D OR A23B-A23J; THEIR PREPARATION OR TREATMENT, e.g. COOKING, MODIFICATION OF NUTRITIVE QUALITIES, PHYSICAL TREATMENT; PRESERVATION OF FOODS OR FOODSTUFFS, IN GENERAL
    • A23L33/00—Modifying nutritive qualities of foods; Dietetic products; Preparation or treatment thereof
    • A23L33/10—Modifying nutritive qualities of foods; Dietetic products; Preparation or treatment thereof using additives
    • A23L33/115—Fatty acids or derivatives thereof; Fats or oils
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A23—FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
    • A23L—FOODS, FOODSTUFFS, OR NON-ALCOHOLIC BEVERAGES, NOT COVERED BY SUBCLASSES A21D OR A23B-A23J; THEIR PREPARATION OR TREATMENT, e.g. COOKING, MODIFICATION OF NUTRITIVE QUALITIES, PHYSICAL TREATMENT; PRESERVATION OF FOODS OR FOODSTUFFS, IN GENERAL
    • A23L33/00—Modifying nutritive qualities of foods; Dietetic products; Preparation or treatment thereof
    • A23L33/40—Complete food formulations for specific consumer groups or specific purposes, e.g. infant formula
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/185—Acids; Anhydrides, halides or salts thereof, e.g. sulfur acids, imidic, hydrazonic or hydroximic acids
    • A61K31/19—Carboxylic acids, e.g. valproic acid
    • A61K31/20—Carboxylic acids, e.g. valproic acid having a carboxyl group bound to a chain of seven or more carbon atoms, e.g. stearic, palmitic, arachidic acids
    • A61K31/201—Carboxylic acids, e.g. valproic acid having a carboxyl group bound to a chain of seven or more carbon atoms, e.g. stearic, palmitic, arachidic acids having one or two double bonds, e.g. oleic, linoleic acids
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/185—Acids; Anhydrides, halides or salts thereof, e.g. sulfur acids, imidic, hydrazonic or hydroximic acids
    • A61K31/19—Carboxylic acids, e.g. valproic acid
    • A61K31/20—Carboxylic acids, e.g. valproic acid having a carboxyl group bound to a chain of seven or more carbon atoms, e.g. stearic, palmitic, arachidic acids
    • A61K31/202—Carboxylic acids, e.g. valproic acid having a carboxyl group bound to a chain of seven or more carbon atoms, e.g. stearic, palmitic, arachidic acids having three or more double bonds, e.g. linolenic
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K35/00—Medicinal preparations containing materials or reaction products thereof with undetermined constitution
    • A61K35/66—Microorganisms or materials therefrom
    • A61K35/68—Protozoa, e.g. flagella, amoebas, sporozoans, plasmodium or toxoplasma
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K8/00—Cosmetics or similar toiletry preparations
    • A61K8/18—Cosmetics or similar toiletry preparations characterised by the composition
    • A61K8/30—Cosmetics or similar toiletry preparations characterised by the composition containing organic compounds
    • A61K8/33—Cosmetics or similar toiletry preparations characterised by the composition containing organic compounds containing oxygen
    • A61K8/36—Carboxylic acids; Salts or anhydrides thereof
    • A61K8/361—Carboxylic acids having more than seven carbon atoms in an unbroken chain; Salts or anhydrides thereof
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P29/00—Non-central analgesic, antipyretic or antiinflammatory agents, e.g. antirheumatic agents; Non-steroidal antiinflammatory drugs [NSAID]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P3/00—Drugs for disorders of the metabolism
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P3/00—Drugs for disorders of the metabolism
    • A61P3/02—Nutrients, e.g. vitamins, minerals
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61Q—SPECIFIC USE OF COSMETICS OR SIMILAR TOILETRY PREPARATIONS
    • A61Q19/00—Preparations for care of the skin
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C11—ANIMAL OR VEGETABLE OILS, FATS, FATTY SUBSTANCES OR WAXES; FATTY ACIDS THEREFROM; DETERGENTS; CANDLES
    • C11B—PRODUCING, e.g. BY PRESSING RAW MATERIALS OR BY EXTRACTION FROM WASTE MATERIALS, REFINING OR PRESERVING FATS, FATTY SUBSTANCES, e.g. LANOLIN, FATTY OILS OR WAXES; ESSENTIAL OILS; PERFUMES
    • C11B1/00—Production of fats or fatty oils from raw materials
    • C11B1/10—Production of fats or fatty oils from raw materials by extracting
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C11—ANIMAL OR VEGETABLE OILS, FATS, FATTY SUBSTANCES OR WAXES; FATTY ACIDS THEREFROM; DETERGENTS; CANDLES
    • C11B—PRODUCING, e.g. BY PRESSING RAW MATERIALS OR BY EXTRACTION FROM WASTE MATERIALS, REFINING OR PRESERVING FATS, FATTY SUBSTANCES, e.g. LANOLIN, FATTY OILS OR WAXES; ESSENTIAL OILS; PERFUMES
    • C11B3/00—Refining fats or fatty oils
    • C11B3/02—Refining fats or fatty oils by chemical reaction
    • C11B3/04—Refining fats or fatty oils by chemical reaction with acids
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
    • C12N1/10—Protozoa; Culture media therefor
    • C12N1/105—Protozoal isolates
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
    • C12N1/12—Unicellular algae; Culture media therefor
    • C12N1/125—Unicellular algae isolates
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P7/00—Preparation of oxygen-containing organic compounds
    • C12P7/64—Fats; Fatty oils; Ester-type waxes; Higher fatty acids, i.e. having at least seven carbon atoms in an unbroken chain bound to a carboxyl group; Oxidised oils or fats
    • C12P7/6409—Fatty acids
    • C12P7/6427—Polyunsaturated fatty acids [PUFA], i.e. having two or more double bonds in their backbone
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P7/00—Preparation of oxygen-containing organic compounds
    • C12P7/64—Fats; Fatty oils; Ester-type waxes; Higher fatty acids, i.e. having at least seven carbon atoms in an unbroken chain bound to a carboxyl group; Oxidised oils or fats
    • C12P7/6409—Fatty acids
    • C12P7/6427—Polyunsaturated fatty acids [PUFA], i.e. having two or more double bonds in their backbone
    • C12P7/6432—Eicosapentaenoic acids [EPA]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P7/00—Preparation of oxygen-containing organic compounds
    • C12P7/64—Fats; Fatty oils; Ester-type waxes; Higher fatty acids, i.e. having at least seven carbon atoms in an unbroken chain bound to a carboxyl group; Oxidised oils or fats
    • C12P7/6409—Fatty acids
    • C12P7/6427—Polyunsaturated fatty acids [PUFA], i.e. having two or more double bonds in their backbone
    • C12P7/6434—Docosahexenoic acids [DHA]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P7/00—Preparation of oxygen-containing organic compounds
    • C12P7/64—Fats; Fatty oils; Ester-type waxes; Higher fatty acids, i.e. having at least seven carbon atoms in an unbroken chain bound to a carboxyl group; Oxidised oils or fats
    • C12P7/6436—Fatty acid esters
    • C12P7/6445—Glycerides
    • C12P7/6458—Glycerides by transesterification, e.g. interesterification, ester interchange, alcoholysis or acidolysis
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P7/00—Preparation of oxygen-containing organic compounds
    • C12P7/64—Fats; Fatty oils; Ester-type waxes; Higher fatty acids, i.e. having at least seven carbon atoms in an unbroken chain bound to a carboxyl group; Oxidised oils or fats
    • C12P7/6436—Fatty acid esters
    • C12P7/6445—Glycerides
    • C12P7/6472—Glycerides containing polyunsaturated fatty acid [PUFA] residues, i.e. having two or more double bonds in their backbone
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A23—FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
    • A23V—INDEXING SCHEME RELATING TO FOODS, FOODSTUFFS OR NON-ALCOHOLIC BEVERAGES AND LACTIC OR PROPIONIC ACID BACTERIA USED IN FOODSTUFFS OR FOOD PREPARATION
    • A23V2002/00—Food compositions, function of food ingredients or processes for food or foodstuffs
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K2800/00—Properties of cosmetic compositions or active ingredients thereof or formulation aids used therein and process related aspects
    • A61K2800/10—General cosmetic use
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12R—INDEXING SCHEME ASSOCIATED WITH SUBCLASSES C12C - C12Q, RELATING TO MICROORGANISMS
    • C12R2001/00—Microorganisms ; Processes using microorganisms
    • C12R2001/89—Algae ; Processes using algae
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12R—INDEXING SCHEME ASSOCIATED WITH SUBCLASSES C12C - C12Q, RELATING TO MICROORGANISMS
    • C12R2001/00—Microorganisms ; Processes using microorganisms
    • C12R2001/90—Protozoa ; Processes using protozoa
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
    • Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
    • Y02A40/00—Adaptation technologies in agriculture, forestry, livestock or agroalimentary production
    • Y02A40/80—Adaptation technologies in agriculture, forestry, livestock or agroalimentary production in fisheries management
    • Y02A40/81—Aquaculture, e.g. of fish
    • Y02A40/818—Alternative feeds for fish, e.g. in aquacultures

Abstract

Изобретение направлено на изолированные микроорганизмы, а также их штаммы и мутантные формы, биомассы, микробные масла, композиции и культуры; способы получения микробных масел, биомасс и мутантов и способы применения указанных изолированных микроорганизмов, биомассы и микробных масел.

Description

Изобретение относится к изолированным микроорганизмам и происходящим от них штаммам. Штамм, который происходит от (является производным) изолированного микроорганизма, согласно настоящему изобретению может представлять собой природное или искусственное производное, такое как, например, мутант (мутантная форма), вариант или рекомбинантный штамм. Термин изолированный, используемый в настоящем изобретении, не обязательно отражает то, до какой степени изолят был очищен, но указывает на изоляцию или отделение от нативной формы или от нативной среды обитания. Изолят может включать, но не ограничен перечисленными, изолированный микроорганизм, изолированную биомассу, изолированную культуру, изолированное микробное масло и изолированную последова
- 3 031136 тельность (например, изолированную полинуклеотидную последовательность, описанную в настоящем изобретении). Термин микроорганизм, при использовании в настоящем изобретении, включает, но не ограничен перечисленными, термины микроводоросли, траустохитрид и таксономические классы, связанные с любым из депонированных микроорганизмов, описанным в настоящем изобретении. Термины Thraustochytriales, траустохитриды, Schizochytrium и Thraustochytrium при использовании в отношении любого из микроорганизмов согласно настоящему изобретению, в том числе депонированных микроорганизмов, описанных в настоящем изобретении, основаны на существующих таксономических классах, включающих имеющуюся филогенетическую информацию, и не предназначены для ограничения в том случае, если таксономическая классификация пересмотрена после даты подачи настоящей заявки.
В некоторых вариантах реализации настоящее изобретение направлено на изолированный микроорганизм, который относится к виду, депонированному в ATCC под номером PTA-10212. Изолированный микроорганизм, ассоциированный с номером PTA-10212 в ATCC, также известен в настоящем изобретении как Thraustochytrium sp. ATCC PTA-10212. Изолированный микроорганизм, ассоциированный с номером PTA-10212, в ATCC депонирован в соответствии с Будапештским договором от 14 июля 2009 г. в Американской коллекции типовых культур, патентный депозитарий, 10801 University Boulevard, Manassas, VA 20110-2209. В некоторых вариантах реализации настоящее изобретение относится к изолированному штамму, депонированному в ATCC под номером PTA-10212.
В некоторых вариантах реализации настоящее изобретение относится к изолированному микроорганизму, обладающему характеристиками вида, депонированного в ATCC под номером PTA-10212, или штамму, полученному на его основе. Характеристики микроорганизма, относящегося к виду, депонированному в ATCC под номером PTA-10212, могут включать особенности роста и фенотипические свойства (примеры фенотипических свойств включают морфологические и репродуктивные свойства), его физические и химические свойства (такие как сухой вес и липидные профили), последовательности его генов и их комбинации, при этом такие характеристики отличают данный вид от на ранее идентифицированных видов. В некоторых вариантах реализации настоящее изобретение относится к изолированному микроорганизму, обладающему характеристиками вида, депонированного в ATCC под номером PTA10212, при этом указанные характеристики включают 18S рРНК, содержащую полинуклеотидную последовательность SEQ ID NO: 1 или полинуклеотидную последовательность, имеющую по меньшей мере 94, 95, 96, 97, 98 или 99% идентичности SEQ ID NO: 1, морфологические и репродуктивные свойства вида, депонированного в ATCC под номером PTA-10212, и профили жирных кислот вида, депонированного в ATCC под номером PTA-10212. В некоторых вариантах реализации изолированные микроорганизмы согласно настоящему изобретению имеют фенотипические свойства, в существенной степени идентичные свойствам микроорганизма, депонированного в ATCC под номером PTA-10212. В некоторых вариантах реализации изолированные микроорганизмы согласно настоящему изобретению имеют особенности роста, по существу идентичные свойствам микроорганизма, депонированного в ATCC под номером PTA-10212. В некоторых вариантах реализации настоящее изобретение направлено на изолированный микроорганизм, который содержит 18S рРНК, содержащую полинуклеотидную последовательность SEQ ID NO: 1 или полинуклеотидную последовательность, которая имеет по меньшей мере 94, 95, 96, 97, 98 или 99% идентичности с SEQ ID NO: 1. В некоторых вариантах реализации настоящее изобретение направлено на изолированный микроорганизм, содержащий полинуклеотидную последовательность 18S рРНК, которая имеет по меньшей мере 94% идентичности с полинуклеотидной последовательностью 18S рРНК микроорганизма, депонированного в ATCC под номером PTA-10212.
В некоторых вариантах реализации настоящее изобретение относится к мутантному штамму микроорганизма, депонированного в ATCC под номером PTA-10212. В других вариантах реализации, указанный мутантный штамм представляет собой штамм, депонированный в ATCC под номером PTA10213, PTA-10214 или PTA-10215. Микроорганизмы, ассоциированные с номерами в ATCC PTA-10213, PTA-10214 и PTA-10215, были депонированы в соответствии с Будапештским договором от 14 июля 2009 г. в Американской коллекции типовых культур, патентный депозитарий, 10801 University Boulevard, Manassas, VA 20110-2209.
В некоторых вариантах реализации настоящее изобретение относится к изолированному микроорганизму, который относится к виду, депонированному в ATCC под номером PTA-10208. Изолированный микроорганизм, ассоциированный с номером PTA-10208 в ATCC также упоминается в настоящем изобретении как Schizochytrium sp. ATCC PTA-10208. Микроорганизм, ассоциированный с номером PTA10208 в ATCC, был депонирован в соответствии с Будапештским договором от 14 июля 2009 г. в Американской коллекции типовых культур, патентный депозитарий, 10801 University Boulevard, Manassas, VA 20110-2209. В некоторых вариантах реализации изобретение направлено на изолированный штамм, депонированный в ATCC под номером PTA-10208.
В некоторых вариантах реализации настоящее изобретение относится к изолированному микроорганизму, который относится к виду, депонированному в ATCC под номером PTA-10208, при этом пул жирных кислот, продуцируемых таким микроорганизмом, включает более примерно 10%, более примерно 11%, более примерно 12%, более примерно 13%, более примерно 14%, более примерно 15%, более
- 4 031136 от от от от от примерно примерно примерно примерно примерно кислот, продуцируемых микроорганизмом, включает от примерно до примерно 50%, до примерно 35%, до примерно 50%, до примерно 35%, до примерно 50%, от от от от от примерно примерно примерно примерно примерно до примерно 45%, до примерно 30%, до примерно 45%, до примерно 30%, до примерно 45%, от от от от от примерно примерно примерно примерно примерно до до до до до до примерно 16%, более примерно 17%, более примерно 18%, более примерно 19% или более примерно 20 вес.% ЭПК. В некоторых вариантах реализации настоящее изобретение относится к изолированному микроорганизму, который относится к виду, депонированному в ATCC под номером PTA-10208, при этом совокупность жирных примерно 55%, примерно 40%, примерно 55%, примерно 40%, примерно 55%, примерно 40%, от примерно 20 до примерно 35% или от примерно 20 до примерно 30 вес.% ЭПК.
В некоторых вариантах реализации настоящее изобретение относится к изолированному микроорганизму, обладающему характеристиками вида, депонированного в ATCC под номером PTA-10208, при этом совокупность жирных кислот, продуцируемых таким микроорганизмом, включает более 10 вес.% эйкозапентаеновой кислоты. Характеристики микроорганизма, депонированного в ATCC под номером PTA-10208, включают особенности его роста и его фенотипические свойства (примеры фенотипических свойств включают морфологические и репродуктивные свойства), его физические и химические свойства (такие, как сухой вес и липидный профиль), последовательности генов указанного микроорганизма и комбинации указанных признаков, при этом такие характеристики отличают такой вид от ранее идентифицированных видов. В некоторых вариантах реализации настоящее изобретение относится к изолированному микроорганизму, обладающему характеристиками вида, депонированного в ATCC под номером PTA-10212, при этом такие характеристики включают в себя 18S рРНК, содержащую полинуклеотидную последовательность SEQ ID NO: 2, морфологические и репродуктивные свойства вида, депонированного в ATCC под номером PTA-10208, и профиль жирных кислот вида, депонированного в ATCC под номером PTA-10208. В некоторых вариантах реализации изолированные микроорганизмы согласно настоящему изобретению имеют физические и химические свойства, в значительной степени идентичные свойствам микроорганизма, депонированного в ATCC под номером PTA-10208.
В некоторых вариантах реализации настоящее изобретение направлено на мутантный штамм микроорганизма, депонированного в ATCC под номером PTA-10208. В других вариантах реализации указанный мутантный штамм представляет собой штамм, депонированный в ATCC под номером PTA10209, PTA-10210, или PTA-10211. Микроорганизмы, ассоциированные с номерами доступа в ATCC PTA-10209, PTA-10210 и PTA-10211, были депонированы в соответствии с Будапештским договором от 25 сентября 2009 г. в Американской коллекции типовых культур, патентный депозитарий, 10801 University Boulevard, Manassas, VA 20110-2209.
В некоторых вариантах реализации настоящее изобретение направлено на изолированный микроорганизм согласно настоящему изобретению, который продуцирует фракцию триацилглицеринов, при этом содержание ЭПК в такой фракции триацилглицеринов составляет по меньшей мере 12%, по меньшей мере примерно 13%, по меньшей мере, примерно 14%, по меньшей мере примерно 15%, по меньшей мере примерно 16%, по меньшей мере примерно 17%, по меньшей мере примерно 18%, по меньшей мере примерно 19% или по меньшей мере 20 вес.%. В некоторых вариантах реализации настоящее изобретение относится к изолированному микроорганизму, который продуцирует фракцию триацилглицеринов, при этом содержание ЭПК в такой фракции триацилглицеринов составляет от примерно
55%, от примерно 12 до примерно 50%, от примерно 12 до примерно 45%, от примерно
40%, от примерно 12 до примерно 35%, от примерно 12 до примерно 30%, от примерно
45%, от примерно 15 до примерно 40%, от примерно 15 до примерно 35%, от примерно
30% или от примерно 20 до примерно 30 вес.%.
В некоторых вариантах реализации настоящее изобретение направлено на мутантную форму, вариант или рекомбинантную форму изолированного микроорганизма согласно настоящему изобретению, которая продуцирующую фракцию триацилглицеринов, причём содержание ЭПК в указанной фракции триацилглицеринов составляет по меньшей мере 10%, по меньшей мере примерно 11%, по меньшей мере примерно 12%, по меньшей мере примерно 13%, по меньшей мере примерно 14%, по меньшей мере примерно 15%, по меньшей мере примерно 16%, по меньшей мере примерно 17%, по меньшей мере примерно 18%, по меньшей мере примерно 19% или по меньшей мере примерно 20 вес.%. В некоторых вариантах реализации настоящее изобретение направлено на мутантную форму, вариант или рекомбинантную форму изолированного микроорганизма согласно настоящему изобретению, продуцирующую фракцию триацилглицеринов, при этом содержание ЭПК в такой фракции триацилглицеринов составляет от от от от от от вес.%. Мутантные штаммы могут быть получены с помощью хорошо известных способов. Стандарт12 до примерно до примерно до примерно до примерно примерно примерно примерно примерно примерно примерно до примерно 55%, до примерно 40%, до примерно 55%, до примерно 40%, до примерно 55%, до примерно 40%, от примерно 20 до примерно 35% или от примерно 20 до примерно от от от от от примерно примерно примерно примерно примерно до примерно 50%, до примерно 35%, до примерно 50%, до примерно 35%, до примерно 50%, от от от от от примерно примерно примерно примерно примерно до примерно 45%, до примерно 30%, до примерно 45%, до примерно 30%, до примерно 45%,
- 5 031136 ные способы включают облучение, воздействие высоких температур, а также обработку мутагеном. Штамм-вариант может представлять собой другой природный изолят и/или подштамм вида, описанного в настоящем изобретении. Рекомбинантные штаммы могут быть получены любым известным в молекулярной биологии способом экспрессии экзогенных генов или изменения функции или экспрессии эндогенного гена. В некоторых вариантах реализации мутантная форма, вариант или рекомбинантная форма продуцирует большее количество омега-3 жирных кислот, в частности, ЭПК, по сравнению со штаммом дикого типа. В некоторых вариантах реализации мутантная форма, вариант или рекомбинантная форма штамма продуцирует меньшее количество одной или более жирной кислоты, например, меньшее количество ДГК, АРК, n-6 ДПК или их комбинации. В некоторых вариантах реализации мутантная форма, вариант или рекомбинантная форма штамма продуцирует большее количество сухого веса клеток на литр культуры, чем штамм дикого типа. Такие мутантные формы, варианты или рекомбинантные формы штаммов представляют собой примеры штаммов, полученных от изолированного микроорганизма согласно настоящему изобретению.
В некоторых вариантах реализации изолированные микроорганизмы согласно настоящему изобретению, в том числе их мутантные формы, варианты и рекомбинантные формы, содержат некоторый профиль жирных кислот в одной или более фракции, изолированной из микроорганизма. Одна или более фракция, выделенная из микроорганизма, включают фракцию общего пула (всей совокупности) жирных кислот, фракцию стериновых эфиров, фракцию триацилглицеринов, фракцию свободных жирных кислот, фракции стеринов, фракцию диацилглицеринов, полярную фракцию (в том числе фракцию фосфолипидов), и их комбинации. Профиль жирных кислот для конкретной фракции может включать любой профиль жирных кислот, ассоциированный с конкретной фракцией, как описано в настоящем изобретении.
Изобретение относится к способу получения мутантной формы, включающему осуществление мутагенеза любого из микроорганизмов согласно настоящему изобретению и выделение мутантного штамма.
Культуры и изолированные биомассы
Настоящее изобретение относится к культуре, которая содержит один или более изолированный микроорганизм согласно настоящему изобретению. В данной области известны различные параметры ферментации для инокуляции, выращивания и восстановления микробной флоры, например, микроводорослей и траустохитрид. См., например, патент США № 5130242, включенный в настоящую заявку посредством ссылки в полном объеме. Жидкие или твердые среды могут содержать природную или искусственную морскую воду. Источники углерода для гетеротрофного роста включают, но не ограничены перечисленными, глюкозу, фруктозу, ксилозу, сахарозу, мальтозу, растворимый крахмал, патоку, фукозу, глюкозамин, декстран, жиры, масла, глицерин, ацетат натрия и маннит. Источники азота включают, но не ограничены перечисленными, пептон, дрожжевой экстракт, полипептон, солодовый экстракт, мясной экстракт, казаминовую кислоту, кукурузный экстракт, органические источники азота, глутамат натрия, мочевину, неорганические источники азота, ацетат аммония, сульфат аммония, хлорид и нитрат аммония.
Типичная среда для роста микроорганизма, депонированного в ATCC под номером PTA-10212, представлена в табл. 1.
- 6 031136
Таблица 1
Питательная среда PTA-10212
Компонент концентрация диапазон
Na2SO4 г/л 31.0 0-50, 15-45 или 25-35
NaCl г/л 0.625 0-25, 0.1-10 или 0.5-5
КС1 г/л 1.0 0-5, 0.25-3 или 0.5-2
MgSO4-7H2O г/л 5.0 0-10, 2-8 или 3-6
(NH4)2SO4 г/л 0.44 0-10, 0.25-5 или 0.05-3
msg-ih2o г/л 6.0 0-10, 4-8 или 5-7
CaCl2 г/л 0.29 0.1-5, 0.15-3 или 0.2-1
T 154
(дрожжевой экстракт)г/л 6.0 0-20, 0.1-10 или 1-7
KH2PO4 г/л 0.8 0.1-10, 0.5-5 или 0.6-1.8
После автоклавирования (Металлы)
Лимонная кислота
мг/л 3.5 0.1-5000, 10-3000 или 3-2500
FeSO47H2O мг/л 10.30 0.1-100, 1-50 или 5-25
МпС12-4Н2О мг/л 3.10 0.1-100, 1-50 или 2-25
ZnSO47H2O мг/л 3.10 0.01-100, 1-50 или 2-25
СоС12-6Н2О мг/л 0.04 0-1,0.001-0.1 или 0.01-0.1
Na2MoO4-2H2O мг/л 0.04 0.001-1, 0.005-0.5 или 0.01-0.1
CuSO4-5H2O мг/л 2.07 0.1-100, 0.5-50 или 1-25
NiSO46H2O мг/л 2.07 0.1-100, 0.5-50 или 1-25
(Витамины)
После
Тиамин мг/л 9.75 0.1-100, 1-50 или 5-25
Витамин В12 мг/л 0.16 0.01-100, 0.05-5 или 0.1-1
СаА-пантотенат мг/л 2.06 0.1-100, 0.1-50 или 1-10
Биотин мг/л 3.21 0.1-100, 0.1-50 или 1-10
После автоклавирования (Источник углерода) Глицерин г/л 30.0
5-150, 10-100 или 20-50
Источник азота:
Концентрация г/л 17
Компонент msg-ih2o
Типичные условия культивирования включают следующие:
pH примерно 6.5 - примерно 9.5, примерно 6.5 - примерно 8.0 или примерно 6.8 -примерно 7.8;
0-150, 10-100 или 15-50 температура:
примерно 15 - примерно 30 градусов по Цельсию, примерно 18 - примерно 28 градусов по Цельсию или от примерно 21 до примерно 23 градусов по Цельсию;
растворенный кислород: насыщение примерно 0.1 - примерно 100%, насыщение примерно 5 - примерно 50% или насыщение примерно 10 - примерно 30%; и/или контролируемое содержание глицерина @: примерно 5 - примерно 50 г/л, примерно 10 - примерно 40 г/л или примерно 15 - примерно 35 г/л.
В некоторых вариантах реализации микроорганизм, депонированный в ATCC под номером PTA10212, или его мутантная форма, вариант или рекомбинантная форма, растет при гетеротрофном питании на глицерине в качестве источника углерода, но не растет на глюкозе в качестве источника углерода.
Типичная среда для роста микроорганизма, депонированного в ATCC под номером PTA-10208, представлена в табл. 2.
- 7 031136
Таблица 2
Питательная среда PTA-10208
Компонент концентрация диапазон
Na2SO4 г/л 8.8 0-25, 2-20 или 3-10
NaCl г/л 0.625 0-25, 0.1-10 или 0.5-5
КС1 г/л 1.0 0-5, 0.25-3 или 0.5-2
MgSO4-7H2O г/л 5.0 0-10, 2-8 или 3-6
(NH4)2SO4 г/л 0.42 0-10, 0.25-5 или 0.05-3
CaCl2 г/л 0.29 0.1-5, 0.15-3 или 0.2-1
T 154
(дрожжевой экстракт)г/л 1.0 0-20, 0.1-10 или 0.5-5
KH2PO4 г/л 1.765 0.1-10,0.5-5 или 1-3
После
Лимонная кислота мг/л 46.82 0.1-5000, 10-3000 или
FeSO47H2O мг/л 10.30 0.1-100, 1-50 или 5-25
МиС12‘4Н2О мг/л 3.10 0.1-100, 1-50 или 2-25
ZnSO47H2O мг/л 9.3 0.01-100, 1-50 или 2-25
СоС126Н2О мг/л 0.04 0-1,0.001-0.1 или 0.01-0.1
Na2MoO4-2H2O мг/л 0.04 0.001-1, 0.005-0.5 или 0.01-0.
CuSO45H2O мг/л 2.07 0.1-100, 0.5-50 или 1-25
NiSO46H2O мг/л 2.07 0.1-100, 0.5-50 или 1-25
40-2500
После (Витамины)
Тиамин мг/л 9.75 0.1-100, 1-50 или 5-25
СаУ-пантотенат мг/л 3.33 0.1-100, 0.1-50 или 1-10
Биотин мг/л 3.58 0.1-100, 0.1-50 или 1-10
5-150, 10-100 или 20-50
После автоклавирования (Источник углерода) Глюкоза г/л 30.0
Источник азота:
Компонент NH4OH Концентрация мл/л 23.6 0-150, 10-100 или 15-50
Типичные условия культивирования включают следующие:
pH примерно 6.5 - примерно 8.5, примерно 6.5 - примерно 8.0 или примерно 7.0 примерно 8.0;
температура: примерно 17 - примерно 30 градусов по Цельсию, примерно
- примерно 28 градусов по Цельсию или примерно от 22 до примерно 24 градусов по Цельсию;
растворенный кислород: насыщение примерно 2 - примерно 100% , насыщение примерно 5 - примерно 50% или примерно 7 - примерно 20%; и/или контролируемое содержание глюкозы@: примерно 5 - примерно 50 г/л, примерно 10 - примерно 40 г/л или примерно 20 - примерно 35 г/л.
В некоторых вариантах реализации культуральная среда содержит по меньшей мере примерно 0,1%, по меньшей мере примерно 0,5%, по меньшей мере примерно 1%, по меньшей мере примерно 1,5%, по меньшей мере примерно 2%, по меньшей мере примерно 5%, по меньшей мере примерно 7%, по меньшей мере примерно 10%, по меньшей мере примерно 20%, по меньшей мере примерно 30%, по меньшей мере примерно 40%, по меньшей мере примерно 50%, по меньшей мере примерно 60%, по меньшей мере примерно 70%, по меньшей мере примерно 80% или по меньшей мере примерно 90% растворенного кислорода в процентах степени насыщения. В некоторых вариантах культуральная среда содержит от примерно 0,1 до примерно 2%, от примерно 0,1 до примерно 5%, от примерно 0,1 до примерно 10%, от примерно 0,1 до примерно 20%, от примерно 0,1 до примерно 30%, от примерно 0,1 до примерно 50%, от примерно 0,1 до примерно 100%, от примерно 5 до примерно 10%, от примерно 5 до примерно 20%, от примерно 5 до примерно 30%, от примерно 5 до примерно 50%, от примерно 5 до примерно 100%, от примерно 7 до примерно 10%, от примерно 7 до примерно 20%, от примерно 7 до примерно 30%, от примерно 7 до примерно 50%, от примерно 7 до примерно 100%, от примерно 10 до примерно 20%, от примерно 10 до примерно 30%, от примерно 10 до примерно 50%, от примерно 10 до примерно 100%, от примерно 20 до примерно 30%, от примерно 20 до примерно 50% или от примерно 20 до примерно 100% растворенного кислорода в процентах степени насыщения.
Настоящее изобретение относится к изолированной биомассе микроорганизма согласно настоящему изобретению. Изолированная биомасса согласно настоящему изобретению представляет собой собранную клеточную биомассу, полученную с помощью любого известного способа выделения биомассы, такого как описано в патенте США № 5130242 и в заявке на патент США № 2002/0001833, каждый из которых включен в настоящее изобретение посредством ссылки в полном объеме.
- 8 031136
В некоторых вариантах реализации сухой вес клеток биомассы, изолированной из литра культуры, составляет по меньшей мере примерно 10 г, по меньшей мере примерно 15 г, по меньшей мере примерно 20 г, по меньшей мере примерно 25 г, по меньшей мере примерно 30 г, по меньшей мере примерно 50 г, по меньшей мере примерно 60 г, по меньшей мере примерно 70 г, по меньшей мере примерно 80 г, по меньшей мере примерно 100 г, по меньшей мере примерно 120 г, по меньшей мере примерно 140 г, по меньшей мере примерно 160 г, по меньшей мере примерно 180 г или по меньшей мере примерно 200 г после роста в течение от 6 до 8 дней при температуре примерно от 15 до 30°C в культуральной среде с pH от примерно 6,5 до примерно 9,5 содержащей источники углерода, азота и питательные вещества и от примерно 950 до примерно 8500 м.д. ионов хлорида. В некоторых вариантах реализации сухой вес клеток биомассы, изолированной из литра культуры, составляет по меньшей мере примерно 10 г, по меньшей мере примерно 15 г, по меньшей мере примерно 20 г, по меньшей мере примерно 25 г, по меньшей мере примерно 30 г, по меньшей мере примерно 50 г, по меньшей мере примерно 60 г, по меньшей мере примерно 70 г, по меньшей мере примерно 80 г, по меньшей мере примерно 100 г, по меньшей мере примерно 120 г, по меньшей мере примерно 140 г, по меньшей мере примерно 160 г, по меньшей мере примерно 180 г или по меньшей мере примерно 200 г после роста в течение от примерно 6 дней, примерно 7 дней или примерно 8 дней при температуре примерно 15°C, примерно 16°C, примерно 17°C, при температуре примерно 18°C, при температуре примерно 19°C, при температуре примерно 20°C, при температуре примерно 21°C, при температуре примерно 22°C, при температуре примерно 23°C, при температуре примерно 24°C, при температуре примерно 25°C, при температуре примерно 26°C, при температуре примерно 27°C, при температуре примерно 28°C, при температуре примерно 29°C или при температуре примерно 30°C в культуральной среде при pH примерно 6,5, pH примерно 7, pH примерно 7,5, pH приблизительно 8,0, pH приблизительно 8,5, pH приблизительно 9 или pH приблизительно 9,5, содержащей источники углерода, азота и питательные вещества и от приблизительно 950 м.д. до приблизительно 8500 м.д. ионов хлорида. В некоторых вариантах реализации сухой вес клеток биомассы, изолированной из литра культуры, составляет приблизительно от 10 до 200 г после роста в течение от 6 до 8 дней при температуре приблизительно от 15 до 30°C в культуральной среде при pH от 6,5 до 9,5 содержащей источники углерода, азота и питательные вещества, и от приблизительно 950 до приблизительно 8500 м.д. ионов хлорида. В некоторых вариантах реализации сухой вес клеток биомассы, изолированной из литра культуры, составляет приблизительно от 10 до 200 г, от 10 до 100 г, от 10 до 50 г, приблизительно от 15 до 200 г, приблизительно от 15 до 100 г, приблизительно от 15 до 50 г, приблизительно от 20 до 200 г, приблизительно от 20 до 100 г, приблизительно от 20 до 50 г, приблизительно от 50 до 200 г или приблизительно от 50 до 100 г после роста в течение приблизительно 6 дней, приблизительно 7 дней или приблизительно 8 дней при температуре приблизительно 15°C, приблизительно 16°C, приблизительно 17°C, при температуре приблизительно 18°C, при температуре приблизительно 19°C, при температуре приблизительно 20°C, при температуре приблизительно 21°C, при температуре приблизительно 22°C, при температуре приблизительно 23°C, при температуре приблизительно 24°C, при температуре приблизительно 25°C, при температуре приблизительно 26°C, при температуре приблизительно 27°C, приблизительно 28°C, при температуре приблизительно 29°C, или приблизительно 30°C в культуральной среде с pH приблизительно 6,5, pH приблизительно 7, pH приблизительно 7,5, pH приблизительно 8,0, pH приблизительно 8,5, pH приблизительно 9 или pH приблизительно 9,5, содержащей источники углерода, азота и питательные вещества, и от приблизительно 950 до приблизительно 8500 м.д. ионов хлорида. В некоторых вариантах реализации изолированная культура не содержит поливинилпирролидон.
В некоторых вариантах реализации изолированная культура характеризуется продукцией омега-3 жирных кислот по меньшей мере приблизительно 0,2 г/л/день, по меньшей мере приблизительно 0,3 г/л/день, по меньшей мере приблизительно 0,4 г/л/день, в мере приблизительно 0,5 г/л/день, по меньшей мере приблизительно 1 г/л/день, по меньшей мере приблизительно 1,2 г/л/день, по меньшей мере приблизительно 1,5 г/л/день, по меньшей мере приблизительно 1,7 г/л/день, по меньшей мере приблизительно 2 г/л/день, по меньшей мере приблизительно 3 г/л/день, по меньшей мере приблизительно 3,5 г/л/день, по меньшей мере приблизительно 4 г/л/день, по меньшей мере приблизительно 4,5 г/л/день, в мере приблизительно 5 г/л/день, по меньшей мере приблизительно 6 г/л/день или по меньшей мере приблизительно 8 г/л/день после роста в течение 6 дней, приблизительно 7 дней или приблизительно 8 дней при температуре от приблизительно 15 до приблизительно 30°C в культуральной среде при pH приблизительно от 6,5 до 8,5 или pH от приблизительно 6,5 до 9,5, содержащей источники углерода, азота и питательные вещества и от приблизительно 950 до приблизительно 8500 м.д. ионов хлорида. В некоторых вариантах реализации изолированная культура характеризуется продукцией омега-3 жирных кислот по меньшей мере приблизительно от 0,2 до приблизительно 20 г/л/день, от приблизительно 0,4 до приблизительно 20 г/л/день, от приблизительно 0,4 до приблизительно 2 г/л/день, от приблизительно 1 до приблизительно 2 г/л/день, от приблизительно 1 до приблизительно 20 г/л/день, от приблизительно 2 до приблизительно 15 г/л/день, от приблизительно 2 до приблизительно 10 г/л/день, от приблизительно 3 до приблизительно 10 г/л/день, от приблизительно 4 до приблизительно от приблизительно 9 г/л/день, от приблизительно 4 до приблизительно 8 г/л/день, от приблизительно 4 до приблизительно 7 г/л/день, или от приблизительно 4 до приблизительно 6 г/л/день после роста в течение приблизительно 6 дней, приблизи
- 9 031136 тельно 7 дней, или приблизительно 8 дней при температуре от приблизительно 15 до приблизительно 30°C в культуральной среде при pH приблизительно от 6,5 до 9,5, содержащей источники углерода, азота и питательные вещества, и от приблизительно 950 м.д. до приблизительно 8500 м.д. ионов хлорида.
В некоторых вариантах реализации изолированная культура характеризуется продукцией ЭПК по меньшей мере приблизительно 0,2 г/л/день, по меньшей мере приблизительно 0,3 г/л/день, по меньшей мере приблизительно 0,4 г/л/день, по меньшей мере приблизительно 0,5 г/л/день, по меньшей мере приблизительно 0,6 г/л/день, по меньшей мере приблизительно 0,7 г/л/день, по меньшей мере приблизительно 0,8 г/л/день, по меньшей мере приблизительно 0,9 г/л/день, по меньшей мере приблизительно 1 г/л/день, по меньшей мере приблизительно 1,2 г/л/день, по меньшей мере приблизительно 1,5 г/л/день, по меньшей мере приблизительно 1,7 г/л/день, по меньшей мере приблизительно 2 г/л/день, по меньшей мере приблизительно 3 г/л/день, по меньшей мере приблизительно 4 г/л/день, или по меньшей мере приблизительно 5 г/л/день после роста в течение 6 дней, примерно 7 дней, или примерно 8 дней при температуре примерно от 15 до 30°C в культуральной среде с pH от примерно 6,5 до примерно 8,5 и pH от примерно 6,5 до примерно 9,5 содержащей источники углерода, азота и питательные вещества, и от примерно 950 до примерно 8500 м.д. ионов хлорида. В некоторых вариантах продукция ЭПК составляет от примерно 0,2 до 5 г/л/день, от примерно 0,2 до примерно 4 г/л/день, от примерно 0,2 до примерно 3 г/л/день, от примерно 0,2 до примерно 2 г/л/день, от примерно 0,2 до примерно 1 г/л/день, от примерно 0,2 до примерно 0,8 г/л/день, от примерно 0,2 до примерно 0,7 г/л/день, от примерно 1 до примерно 5 г/л/день, от примерно 1 до примерно 4 г/л/день, от примерно 1 до примерно 3 г/л/день или от примерно 1 до примерно 2 г/л/день после роста в течение 6 дней, примерно 7 дней или примерно 8 дней при температуре примерно от 15 до 30°C в культуральной среде при pH примерно от 6,5 до 8,5 или pH примерно от 6,5 до pH 9,5, содержащей источники углерода, азота и питательные вещества, и примерно от примерно 950 м.д. до примерно 8500 м.д. ионов хлорида. В некоторых вариантах реализации любая из вышеупомянутых продукция ЭПК связана с любой из вышеупомянутых продукцией омега-3 жирных кислот. В некоторых вариантах реализации культура дополнительно характеризуется продукцией ДГК от примерно 0 до 5 г/л/день, от примерно 0 до примерно 4 г/л/день, от примерно 0 до примерно 3 г/л/день, от примерно 0 до 2 г/л/день, от примерно 0 до 1 г/л/день, от примерно 0,2 до примерно 5 г/л/день, от примерно 0,2 до примерно 4 г/л/день, от примерно 0,2 до 3 г/л/день, от примерно 0,2 до примерно 2 г/л/день, от примерно 0,2 до 1 г/л/день, от примерно 1 до 5 г/л/день, от примерно 2 до 5 г/л/день, от примерно 2 до примерно 4 г/л/день или от примерно 2 до 3 г/л/день. В некоторых вариантах производительности ДГК составляет менее 5 г/л/день, менее чем примерно 4 г/л/день, не более 3 г/л/день, менее чем примерно 2 г/л/день, менее чем примерно 1 г/л/день, менее чем примерно 0,5 г/л/день, менее чем примерно 0,2 г/л/день или примерно 0 г/л/день.
В некоторых вариантах ферментационный объем (объем культуры) составляет по меньшей мере примерно 2 л, по меньшей мере примерно 10 л, по меньшей мере примерно 50 л, по меньшей мере примерно 100 л, по меньшей мере примерно 200 л, по меньшей мере примерно 500 л, по меньшей мере примерно 1000 л, по меньшей мере примерно 10000 л, по меньшей мере примерно 20000 л, по меньшей мере примерно 50000 л, по меньшей мере примерно 100.000 л, по меньшей мере примерно 150000 л, по меньшей мере примерно 200000 литров или по меньшей мере примерно 250000 л. В некоторых вариантах реализации ферментационный объем составляет от примерно 2 до примерно 300000 л, примерно 2 л, примерно 10 л, примерно 50 л, примерно 100 л, примерно 200 л, примерно 500 л, примерно 1000 л, примерно 10000 л, примерно 20000 л, примерно 50000 л, примерно 10000 л, примерно 150000 л, примерно 200000 л, примерно 250000 л или примерно 300000 л.
В некоторых вариантах реализации изобретения относится к изолированной биомассе, содержащей жирные кислоты согласно настоящему изобретению. В некоторых вариантах реализации по меньшей мере примерно 20%, по меньшей мере примерно 25%, по меньшей мере примерно 30%, по меньшей мере примерно 35%, по меньшей мере примерно 40%, по меньшей мере примерно 45%, по меньшей мере примерно 50%, по меньшей мере примерно 55%, по меньшей мере примерно 60%, по меньшей мере примерно 65%, по меньшей мере примерно 70%, по меньшей мере примерно 75% или по меньшей мере примерно 80% от сухого веса биомассы клеток составляют жирные кислоты. В некоторых вариантах реализации больше примерно 20%, больше примерно 25%, больше примерно 30%, больше примерно 35%, больше примерно 40%, больше примерно 45%, больше примерно 50%, больше примерно 55 % или больше примерно 60% от сухого веса клеток биомассы составляют жирные кислоты. В некоторых вариантах реализации от примерно 20 до примерно 55%, от примерно 20 до примерно 60%, от примерно 20 до примерно 70%, от примерно 20 до примерно 80%, от примерно 30 до примерно 55%, от примерно 30 до примерно 70%, от примерно 30 до примерно 80%, от примерно 40 до примерно 60%, от примерно 40 до примерно 70%, от примерно 40 до примерно 80%, от примерно 50 до примерно 60%, от примерно 50 до примерно 70%, от примерно 50 до примерно 80%, от примерно 55 до примерно 70%, от примерно 55 до примерно 80%, от примерно 60 до примерно 70% или от примерно 60 до примерно 80% от веса сухого веса клеток биомассы составляют жирные кислоты. В некоторых вариантах реализации биомасса включает более 10%, по меньшей мере примерно 12%, по меньшей мере примерно 15%, по меньшей мере примерно 20%, по меньшей мере примерно 25%, по меньшей мере примерно 30%, по меньшей мере примерно
- 10 031136
35%, по меньшей мере примерно 40% или по меньшей мере примерно 45% от массы жирных кислот, таких как ЭПК. В некоторых вариантах реализации биомасса включает от примерно 10 до примерно 55%, от примерно 12 до примерно 55%, от примерно 15 до примерно 55%, от примерно 20 до примерно 55%, от примерно 20 до примерно 40%, или примерно 20 до примерно 30 вес.% жирных кислот, как ЭПК. В некоторых вариантах, биомасса содержит фракцию триацилглицеринов, в которой по меньшей мере примерно 12%, по меньшей мере примерно 13%, по меньшей мере примерно 14%, по меньшей мере примерно 15%, по меньшей мере примерно 16%, по меньшей мере примерно 17%, по меньшей мере примерно 18%, по меньшей мере примерно 19% или по меньшей мере примерно 20% от веса фракции триацилглицеринов составляет ЭПК. В некоторых вариантах реализации биомасса содержит фракцию триацилглицеринов, в которой содержание ЭПК из фракции триацилглицеринов составляет по меньшей мере от примерно 12 до примерно 55%, от примерно 12 до примерно 50%, от примерно 12 до примерно 45%, по меньшей мере от примерно 12 до примерно 40%, по меньшей мере от примерно 12 до примерно 35% или по меньшей мере от примерно 12 до примерно 30%, от примерно 15 до примерно 55%, от примерно 15 до примерно 50%, от примерно 15 до примерно 45%, от примерно 15 до примерно 40%, от примерно 15 до примерно 35%, от примерно 15 до примерно 30%, от примерно 20 до примерно 55%, от примерно 20 до примерно 50%, от примерно 20 до примерно 45%, по меньшей мере от примерно 20 до примерно 40%, по меньшей мере от примерно 20 до примерно 35% или от примерно 20 до примерно 30 вес.%. В некоторых вариантах реализации по меньшей мере примерно 20%, по меньшей мере примерно 25%, по меньшей мере примерно 30%, по меньшей мере примерно 35%, по меньшей мере примерно 40%, по меньшей мере примерно 50% или по меньшей мере примерно 60 вес.% сухого веса клеток биомассы составляет ДГК. В некоторых вариантах реализации от примерно 20 до примерно 60%, от примерно 25 до примерно 60%, от примерно 25 до примерно 50%, от примерно 25 до примерно 45%, от примерно 30 до примерно 50% или от примерно 35 до примерно 50 вес.% сухого веса клеток биомассы составляет ДГК. В некоторых вариантах реализации указанная биомасса включает примерно 10% или менее, примерно 9% или менее, примерно 8% или менее примерно 7% или менее, примерно 6% или менее, примерно 5% или менее, примерно 4% или менее, примерно 3% или менее, примерно 2% или менее или примерно 1% или менее по весу жирных кислот, таких как ДГК. В некоторых вариантах реализации биомасса включает от примерно 1 до примерно 10%, от примерно 1 до примерно 5%, от примерно 2 до примерно 5%, от примерно 3 до примерно 5% или от примерно 3 до примерно 10 вес.% жирных кислот, каких как ДГК. В некоторых вариантах реализации биомасса по существу не содержит ДГК. В некоторых вариантах реализации биомасса содержит от примерно 0,1 до менее чем 5%, от примерно 0,1 до примерно 4%, от примерно 0,1 до примерно 3%, от примерно 0,1 до примерно 2%, от примерно 0,2% до менее 5%, от примерно 0,2 до примерно 4%, от примерно 0,2 до примерно 3%, от примерно 0,2 до примерно 2%, от примерно 0,3 до примерно 2%, от примерно 0,1 до примерно 0,5%, от примерно 0,2 до примерно 0,5%, от примерно 0,1% до 0,4%, от примерно 0,2 до примерно 0,4%, от примерно 0,5 до примерно 2%, от примерно 1 до примерно 2%, от примерно 0,5 до примерно 1,5% или от примерно 1 до примерно 1,5 вес.% жирных кислот, таких как АРК. В некоторых вариантах реализации биомасса включает менее 5%, 4% или менее, примерно 3% или менее, примерно 2% или менее, примерно 1,5% или менее, примерно 1% или менее, примерно 0,5% или менее, примерно 0,4% или менее, примерно 0,3% или менее, примерно 0,2% или менее или примерно 0,1% или менее по весу жирных кислот, таких как АРК. В некоторых вариантах реализации биомасса по существу не содержит АРК. В некоторых вариантах реализации биомасса включает от примерно 0,4 до примерно 2%, от примерно 0,4 до примерно 3%, от примерно 0,4 до примерно 4%, от примерно 0,4 до примерно 5%, от примерно 0,4% до менее 5%, от примерно 0,5% до 1%, от примерно 0,5 до примерно 2%, от примерно 0,5 до примерно 3%, от примерно 0,5 до примерно 4%, от примерно 0,5 до примерно 5%, от примерно 0,5% до менее 5%, от примерно 1% до 2%, от примерно 1 до примерно 3%, от примерно 1 до примерно 4%, от примерно 1 до примерно 5%, или примерно 1% до менее 5 вес.% жирных кислот, таких как ДПК n-6. В некоторых вариантах реализации биомасса включает примерно 5% или менее, менее примерно 5%, 4% или менее, примерно 3% или менее, примерно 2% или менее, примерно 1% или менее, примерно 0,75% или менее, примерно 0,6% или менее или примерно 0,5% или менее по весу жирных кислот, таких как ДПК n-6. В некоторых вариантах реализации биомасса по существу не содержит ДПК n-6. В некоторых вариантах реализация биомасса содержит жирные кислоты, включающие примерно 5% или менее, менее примерно 5, 4% или менее, примерно 3% или менее, или примерно 2% или менее по весу олеиновой кислоты (18:1 n-9), линолевой кислоты (18:2 n-6), линоленоой кислоты (18:3 n-3), эйкозеновой кислоты (20:1 n-9), эруковой кислоты (22:01 n-9) или их комбинации.
Характеристики изолированной биомассы согласно настоящему изобретению связаны с эндогенными или нативными свойствами изолированной биомассы, но не с экзогенно введенными веществами. В некоторых вариантах реализации изолированная биомасса не содержит поливинилпирролидон или не была изолирована из культуры, содержащей поливинилпирролидон.
Настоящее изобретение относится к способу получения биомассы. В некоторых вариантах реализации способ получения биомассы согласно настоящему изобретению включает выращивание любого из изолированных микроорганизмов согласно настоящему изобретению или их смесей в культуре для полу
- 11 031136 чения биомассы. Настоящее изобретение направлено на биомассу, полученную таким способом.
Микробные масла
Изобретение направлено на микробное масло, содержащее профиль жирных кислот согласно настоящему изобретению. Микробное масло согласно настоящему изобретению представляет собой неочищенное масло или очищенное масло, содержащее фракцию триацилглицеринов, составляющую по меньшей мере примерно 35 вес.%. Неочищенное масло представляет собой масло, которое экстрагируют из биомассы микроорганизмов без дальнейшей обработки. Очищенное масло представляет собой масло, полученное путем обработки неочищенного масла с помощью стандартных способов очистки, осветления и/или дезодорации. См., например, патент США № 5130242, включенный в настоящее изобретение посредством ссылки в полном объеме. Микробное масло также включает конечное масло, как описано в настоящем изобретении, которое представляет собой очищенное масло, которое было разбавлено растительным маслом. В некоторых вариантах конечное масло представляет собой очищенное масло, которое было разбавлено подсолнечным маслом с высоким содержанием олеиновой кислоты. Термин микробный, используемый в настоящем изобретении, включает, но не ограничен перечисленными, термины относящийся к микроводорослям, относящийся к траустохитридам и таксономические классификации, связанные с любым из депонированных микроорганизмов, описанных в настоящем изобретении. Термины Thraustochytriales, траустохитрид, Schizochytrium и Thraustochytrium, используемые в отношении любого микробного масла депонированного микроорганизма, описанного в настоящем изобретении, основаны на существующей таксономической классификации, включающей доступную филогенетическую информацию, и не являются ограничивающими в случае, если таксономическая классификация была пересмотрена после даты подачи настоящей заявки.
В некоторых вариантах реализации жирная кислота, описанная в настоящем изобретении, может представлять собой сложный эфир жирной кислоты. В некоторых вариантах реализации сложный эфир жирной кислоты включает эфир омега-3 жирной кислоты, омега-6 жирной кислоты и их комбинации. В некоторых вариантах реализации сложный эфир жирной кислоты представляет собой кислот эфир ДГК, эфир ЭПК или их комбинации. В некоторых вариантах реализации масло или его фракция, как описано в настоящем изобретении, этерифицируют для получения масла или его фракции, содержащего сложные эфиры жирных кислот. Термин сложный эфир относится к замещению водорода в карбоксильной группе в молекуле жирной кислоты другим заместителем. Типичные сложные эфиры известны специалистам в данной области, они рассмотрены в работах Higuchi, T. and V. Stella in Pro-drugs as Novel Delivery Systems, Vol. 14, A.C.S. Symposium Series, Bioreversible Carriers in Drug Design, Ed. Edward B. Roche, American Pharmaceutical Association, Pergamon Press, 1987, и Protective Groups in Organic Chemistry, McOmie ed., Plenum Press, New York, 1973. Примеры сложных эфиров включают метил, этил, пропил, бутил, пентил, трет-бутил, бензил, нитробензил, метоксибензил, бензгидрил, и трихлорэтил. В некоторых вариантах реализации эфир представляет собой защитную сложноэфирную группу карбоновой кислоты, сложные эфиры с аралкилом (например, бензилом, фенэтилом), сложные эфиры с низшим алкенилом (например, аллил, 2-бутенил), сложные эфиры с низшим алкокси-низшим алкилом (например, метоксиметилом, 2-метоксиэтиломо, 2-этоксиэтилом), сложные эфиры с низшим алканоилокси-низшим алкилом (например, ацетоксиметилом, пивалоилоксиметилом, 1-пивалоилоксиэтилом), сложные эфиры с низшим алкоксикарбонил-низшим алкилом (например, метоксикарбонилметилом, изопропоксикарбонилметилом), сложные эфиры с карбокси-низшим алкилом (например, карбоксиметилцеллюлозой), сложные эфиры с низшим алкоксикарбонилокси-низшим алкилом (например, 1(этоксикарбонилокси)этил, 1-(циклогексилоксикарбонилокси)этил), сложные эфиры с карбамоилоксинизшим алкилом (например, карбамоилоксиметил) и т. п. В некоторых вариантах реализации присоединенный заместитель представляет собой линейную или циклическую углеводородну группу, например, О-С.-алкиловый. Ci-Cg-циклоалкиловый, О-С.-алкениловый или C1-C6 ариловый эфир. В некоторых вариантах реализации указанный сложный эфир представляет собой алкиловый эфир, например, метиловый эфир, этиловый эфир или пропиловый эфир. В некоторых вариантах реализации заместитель в эфире присоединен к молекуле свободной жирной кислоты, когда жирная кислота находится в очищенном или полуочищенном состоянии. Кроме того сложный эфир жирной кислоты образуется при конверсии триацилглицеринов в сложный эфир.
Настоящее изобретение относится к способам получения микробного масла. В некоторых вариантах реализации способ включает выращивание любого из изолированных микроорганизмов согласно настоящему изобретению или их смеси в культуре для получения микробного масла, содержащего омега-3 жирные кислот. В некоторых вариантах реализации способ дополнительно включает экстракцию микробного масла. В некоторых вариантах реализации способ включает в экстракцию микробного масла, содержащего омега-3 жирные кислоты, из любой биомассы согласно настоящему изобретению или их смеси. В некоторых вариантах реализации способ включает в себя гетеротрофно растущий изолированный микроорганизм, при этом указанная культура включает источник углерода, как описано в настоящем изобретении. Микробное масло можно экстрагировать из свежесобранной биомассы или его можно экстрагировать из предварительно собранной биомассы, которая хранилась в условиях, предотвращающих порчу. Для культивирования микроорганизмов согласно настоящему изобретению, для выделения био
- 12 031136 массы культуры, для экстракции масла из микробной биомассы, а также для анализа профиля жирных кислот масла, экстрагированного из биомассы можно применять известные способы. См., например, патент США № 5130242, включенный в настоящее изобретение посредством ссылки в полном объеме. Изобретение направлено на микробное масло, полученное с помощью любого из способов согласно настоящему изобретению.
В некоторых вариантах реализации микробное масло экстрагируют с помощью ферментативной экстракции. В некоторых вариантах реализации микробное масло экстрагируют путем механической экстракции. В некоторых вариантах реализации механический способ экстракции включает один или более из следующих этапов: (1) обработка пастеризованного ферментативного бульона с помощью гомогенизатора для осуществления лизиса клеток и высвобождения масла из клеток; (2) добавление изопропилового спирта к ферментативному бульону после гомогенизации для разрушения эмульсии масла и воды; (3) центрифугирование смеси для восстановления масляной фазы, и (4) высушивание под вакуумом с добавлением антиоксидантов. В некоторых вариантах реализации неочищенное масло подвергают очистке. В некоторых вариантах реализации очистка неочищенного масла включает один или более из следующих этапов: (1) перекачивание неочищенного масла в рафинировочный чан и нагревание масла с последующим добавлением раствора кислоты при перемешивании, (2) добавление каустического раствора после обработки кислотой; (3) нагревание масла с последующим центрифугированием для отделения тяжелой фазы от очищенного масла; (4) удаление оставшихся полярных соединений, следов металлов, продуктов окисления от рафинированного масла с помощью, например, кислоты, TriSyl®, глины и/или фильтрации; (5) холодная фильтрации беленой масло для дальнейшего удаления высокую точку плавления компонентов из нефти для достижения желаемого уровня прозрачности; (6) нагревание масла с последующим охлаждением масла и выдерживание его в течение периода времени, необходимого для кристаллизации высокоплавких триглицеридов и восков; (7) добавление вспомогательного порошка для фильтрования в охлажденное масло, а затем удаление кристаллизовавшихся твердых частиц путем фильтрации; (8) использование дезодоранта после холодной фильтрации, выполняемой при высокой температуре и вакууме для удаления, например, пероксидов и оставшихся низкомолекулярных соединений, которые могут вызвать неприятный запах и вкус; (9) перенесение масла в чан с подачей дезодоранта, деаэрация, и дезодорирование, например, с помощью колонки, наполненной дезодорантом и (10) охлаждение, например, в атмосфере азота в конце цикла дезодорации и добавление подходящих антиоксидантов к дезодорированному маслу для обеспечения устойчивости к окислению.
В некоторых вариантах реализации микробное масло включает фракцию стериновых эфиров примерно 0%, по меньшей мере примерно 0,1%, по меньшей мере примерно 0,2%, по меньшей мере примерно 0,5%, по меньшей мере примерно 1%, по меньшей мере примерно 1,5%, по меньшей мере примерно 2%, или по меньшей мере примерно 5 вес.%. В некоторых вариантах реализации микробное масло включает долю стериновых эфиров примерно от 0 до примерно 1,5%, примерно от 0 до примерно 2%, примерно от 0 до примерно 5%, примерно от 1 до примерно 1,5%, примерно от 0,2 до примерно 1,5%, примерно от 0,2 до примерно 2% или примерно от 0,2 до примерно 5 вес.%. В некоторых вариантах реализации микробное масло включает долю стериновых эфиров примерно 5% или менее, примерно 4% или менее, примерно 3% или менее, примерно 2% или менее, примерно 1% или менее, примерно 0,5% или менее, примерно 0,3% или менее, примерно 0,2% или менее, примерно 0,5% или менее, примерно 0,4% или менее, примерно 0,3% или менее или примерно 0,2% или менее по весу.
В некоторых вариантах реализации микробное масло включает фракцию триацилглицеринов меньшей мере примерно 35%, по меньшей мере примерно 40%, по меньшей мере примерно 45%, меньшей мере примерно 50%, по меньшей мере примерно 55%, по меньшей мере примерно 60%, меньшей мере примерно 65%, по меньшей мере примерно 70%, по меньшей мере примерно 75%, меньшей мере примерно 80%, по меньшей мере примерно 85% или по меньшей мере 90 вес.%. В некоторых вариантах реализации микробное масло включает фракцию триацилглицеринов примерно 98%, примерно 70%, примерно 70%, примерно 50%, примерно 98%, примерно 96%, мерно 95, примерно 97 или примерно 98 вес.%.
В некоторых вариантах реализации микробное масло включает фракцию диацилглицеринов по мере мере мере мере примерно по по по по от от от от от от примерно примерно примерно примерно примерно примерно до примерно 90%, до примерно 70%, до примерно 65%, до примерно 95%, до примерно 95%, до примерно 97%, от от от от от от примерно примерно примерно примерно примерно примерно до примерно 80%, до примерно 65%, до примерно 55%, до примерно 95%, до примерно 98%, до примерно 98%, примерно 90, приот примерно от примерно от примерно от примерно от примерно от примерно до до до до до до примерно примерно примерно
10%, по
13%, по
16%, по 19% или меньшей мере примерно 11%, по меньшей мере примерно 12%, по меньшей мере примерно 14%, по меньшей мере примерно 15%, по меньшей мере примерно 17%, по меньшей мере примерно 18%, по по меньшей мере 20 вес.%. В некоторых вариантах реализации микменьшей меньшей меньшей меньшей робное масло включает фракцию диацилглицеринов примерно от 10 до примерно 45%, от примерно 10 до примерно 40%, от примерно 10 до примерно 35%, от примерно 10 до примерно 30%, от примерно 15 до примерно 40%, от примерно 15 до примерно 35% или от примерно 15 до примерно 30 вес.%. В неко- 13 031136
10%,
13%,
16%,
19% по меньшей мере примерно 11%, по меньшей мере примерно 12%, по меньшей мере примерно 14%, по меньшей мере примерно 15%, по меньшей мере примерно 17%, по меньшей мере примерно 18%, или по меньшей мере 20 вес.%. В некоторых вариантах реализации меньшей меньшей меньшей меньшей мере мере мере мере по по по микробное масло торых вариантах реализации микробное масло включает фракцию 1,2-диацилглицеринов по меньшей мере примерно 0,2%, по меньшей мере примерно 0,3%, по меньшей мере примерно 0,4%, по меньшей мере примерно 0,5%, по меньшей мере примерно 1%, по меньшей мере примерно 5%, по примерно примерно примерно примерно включает долю диацилглицеринов примерно от 0,2 до примерно 45%, от примерно 0,2 до примерно 30%, от примерно 0,2 до примерно 20%, от примерно 0,2 до примерно 10%, от примерно 0,2 до примерно 5%, от примерно 0,2 до примерно 1%, от примерно 0,2 до примерно 0,8%, от примерно 0,4 до примерно 45%, от примерно 0,4 до примерно 30%, от примерно 0,4 до примерно 20%, от примерно 0,4 до примерно 10%, от примерно 0,4 до примерно 5%, от примерно 0,4 до примерно 1%, от примерно 0,4 до примерно 0,8%, от примерно 0,5 до примерно 1%, от примерно 0,5 до примерно 0,8%, от примерно 10 до примерно 45%, от примерно 10 до примерно 40%, от примерно 10 до примерно 35%, от примерно 10 до примерно 30%, от примерно 15 до примерно 40%, от примерно 15 до примерно 35%, от примерно 15 до примерно 30% или от примерно 15 до примерно 25 вес.%. В некоторых вариантах реализации микробное масло включает в себя фракцию 1,3-диацилглицеринов по меньшей мере примерно 0,1%, по меньшей мере примерно 0,2%, по меньшей мере примерно 0,5%, по меньшей мере примерно 1%, по меньшей мере примерно 2%, по меньшей мере примерно 2,5% или по меньшей мере примерно 3 вес.%. В некоторых вариантах реализации микробное масло включает фракцию стеринов по меньшей мере примерно 0,3%, по меньшей мере примерно 0,4%, по меньшей мере примерно 0,5%, по меньшей мере примерно 1%, по меньшей мере примерно 1,5%, по меньшей мере примерно 2% или по меньшей мере примерно 5 вес.%.
В некоторых вариантах реализации микробное масло включает фракцию стеринов от примерно 0,3 до примерно 5%, от примерно 0,3 до примерно 2%, от примерно 0,3 до примерно 1,5%, от примерно 0,5 до примерно 1,5%, от примерно на 1% до 1,5%, от примерно 0,5 до примерно 2%, от примерно 0,5 до примерно 5%, от примерно 1 до примерно 2%, или от примерно 1 до примерно 5 вес.%. В некоторых вариантах реализации микробное масло включает фракцию стеринов примерно 5% или менее, примерно 4% или менее, примерно 3% или менее, примерно 2% или менее, примерно 1,5% или менее или примерно 1% или менее по весу.
В некоторых вариантах реализации микробное масло содержит фракцию фосфолипидов по меньшей мере примерно 2%, по меньшей мере примерно 5% или по меньшей мере примерно на 8 вес.%. В некоторых вариантах реализации микробное масло содержит фракцию фосфолипидов от примерно 2 до примерно 25%, от примерно 2 до примерно 20%, от примерно 2 до примерно 15%, от примерно 2 до примерно 10%, от примерно 5 до примерно 25%, от примерно 5 до примерно 20%, от примерно 5 до примерно 20%, от примерно 5 до примерно 10% или от примерно 7 до примерно 9 вес.%. В некоторых вариантах реализации микробное масло содержит фракцию фосфолипидов менее 20%, менее чем примерно 15%, менее чем примерно 10%, менее чем примерно 9% или менее чем примерно 8 вес.%. В некоторых вариантах реализации микробное масло по существу не содержит фосфолипидов. В некоторых вариантах реализации микробное масло содержит неомыляемые вещества менее чем примерно 2%, менее чем примерно 1,5%, менее 1%, или менее чем примерно 0,5% от веса масла. Липидные классы, присутствующие в микробном масле, такие как фракции триацилглицеринов, могут быть разделены с помощью флэш-хроматографии и проанализированы с помощью тонкослойной хроматографии (ТСХ), либо разделены и проанализированы с помощью других способов, известных в данной области.
В некоторых вариантах реализации микробное масло и/или одна или более из его фракций, выбранная из фракции триацилглицеринов, фракции свободных жирных кислот, фракции стеринов, фракции диацилглицеринов и их комбинации, включает ЭПК по меньшей мере примерно 5%, по меньшей мере примерно 10%, более чем примерно 10%, по меньшей мере примерно 12%, по меньшей мере примерно 13%, по меньшей мере примерно 14%, по меньшей мере примерно 15%, по меньшей мере примерно 16%, по меньшей мере примерно 17%, по меньшей мере о 18%, по меньшей мере примерно 19%, по меньшей мере примерно 20%, по меньшей мере примерно 25%, по меньшей мере примерно 30%, по меньшей мере примерно 35%, по меньшей мере примерно 40% или по меньшей мере 45 вес.%. В некоторых вариантах реализации микробное масло и/или одна или более из его фракций, выбранная из фракции триацилглицеринов, фракции свободных жирных кислот, фракции стеринов, фракции диацилглицеринов и их комбинации, включает ЭПК от примерно 5 до примерно 55%, от примерно 5 до примерно 50%, от примерно 5 до примерно 45%, от примерно 5 до примерно 40%, от примерно 5 до примерно 35%, от примерно 5 до примерно 30%, примерно 45%, примерно 30%, примерно 50%, примерно 40%, по меньшей мере от примерно 12 до примерно 35%, или по меньшей мере от примерно 12 до примерно 30%, от примерно 15 до примерно 55%, от примерно 15 до примерно 50%, от примерно 15 до примерно 45%, от примерно 15 до примерно 40%, от примерно 15 до примерно 35%, от примерно 15 от от по по примерно 10 до примерно 55%, от примерно 10 до примерно 50%, от примерно 10 примерно 10 до примерно 40%, от примерно 10 до примерно 35%, от примерно 10 меньшей мере от примерно 12 до примерно 55%, по меньшей мере от примерно 12 меньшей мере от примерно 12 до примерно 45%, по меньшей мере от примерно 12 до до до до
- 14 031136 до примерно 30%, от примерно 15 до примерно 25%, от примерно 15 до примерно 20%, от примерно 20 до примерно 55%, от примерно 20 до примерно 50%, от примерно 20 до примерно 45%, от примерно 20 до примерно 40% или от примерно 20 до примерно 30 вес.%. В некоторых вариантах реализации микробное масло и/или одна или более из его фракций, выбранная из фракции триглицеринов, фракции диацилглицеринов, фракции стеринов, фракции стериновых сложных эфиров, фракции свободных жирных кислот, фракции фосфолипидов и их комбинации, включает ДГК по меньшей мере примерно 5%, по меньшей мере примерно 10%, по меньшей мере примерно 15%, по меньшей мере примерно 20%, по меньшей мере примерно 25%, по меньшей мере примерно 30%, по меньшей мере примерно 35%, по меньшей мере примерно 40%, по меньшей мере о 50%, или по меньшей мере примерно 60 вес.%. В некоторых вариантах реализации микробное масло и/или одна или более из его фракций выбранная из фракции триацилглицеринов, фракции диацилглицеринов, фракции стеринов, фракции стериновых сложных эфиров, фракции свободных жирных кислот, фракции фосфолипидов и их комбинации, включает ДГК от примерно 5 до примерно 60%, от примерно 5 до примерно 55%, от примерно 5 до примерно 50%, от примерно 5 до примерно 40%, от примерно 10 до примерно 60%, от примерно 10 до примерно 50%, от примерно 10 до примерно 40%, от примерно 20 до примерно 60%, от примерно 25 до примерно 60%, от примерно 25 до примерно 50%, от примерно 25 до примерно 45%, от примерно 30 до примерно 50%, от примерно 35 до примерно 50% или от примерно 30 до примерно 40 вес.%. В некоторых вариантах реализации микробное масло и/или одна или более из его фракций выбранная из фракции триацилглицеринов, фракции диацилглицеринов, фракции стеринов, фракции стериновых сложных эфиров, фракции свободных жирных кислот, фракции фосфолипидов и их комбинации, включает ДГК примерно 10% или менее, примерно 9% или менее, примерно 8% или менее, примерно 7% или менее, примерно 6% или менее, примерно 5% или менее, примерно 4% или менее, примерно 3% или менее, примерно 2% или менее, или примерно 1% или менее по весу. В некоторых вариантах реализации микробное масло и/или одна или более из его фракций, выбранная из фракции триацилглицеринов, фракции диацилглицеринов, фракции стеринов, фракции стериновых сложных эфиров, фракции свободных жирных кислот, фракции фосфолипидов и их комбинации, включает жирные кислоты, какие как ДГК, примерно от 1 до примерно 10%, от примерно 1 до примерно 5%, от примерно 2 до примерно 5%, от примерно 3 до примерно 5% или от примерно 3 до примерно 10 вес.%. В некоторых вариантах реализации микробное масло и/или одна или боле из его фракций выбранная из фракции триацилглицеринов, фракции диацилглицеринов, фракции стеринов, фракции стериновых сложных эфиров, фракции свободных жирных кислот, фракции фосфолипидов и их комбинации, по существу не содержит ДГК. В некоторых вариантах реализации микробное масло и/или одна или боле из его фракций, выбранная из фракции триацилглицеринов, фракции диацилглицеринов, фракции стеринов, фракции стериновых сложных эфиров, фракции свободных жирных кислот, фракции фосфолипидов и их комбинации, включает АРК от примерно 0,1 до примерно 5%, от примерно 0,1 до менее чем 5%, от примерно 0,1 до примерно 4%, от примерно 0,1 до примерно 3%, от примерно 0,1 до примерно 2%, от примерно 0,2 до примерно 5%, от примерно 0,2 до менее чем 5%, от примерно 0,2 до примерно 4%, от примерно 0,2 до примерно 3%, от примерно 0,2 до примерно 2%, от примерно 0,3 до примерно 2%, от примерно 0,1 до примерно 0,5%, от примерно 0,2 до примерно 0,5%, от примерно 0,1 до примерно 0,4%, от примерно 0,2 до примерно 0,4%, от примерно 0,5 до примерно 2%, от примерно 1 до примерно 2%, от примерно 0,5 до примерно 1,5% или от примерно 1 до примерно 1,5 вес.%. В некоторых вариантах реализации микробное масло и/или одна или более из его фракций, выбранная из фракции триацилглицеринов, фракции диацилглицеринов, фракции стеринов, фракции стериновых сложных эфиров, фракции свободных жирных кислот, фракции фосфолипидов и их комбинации, включает АРК примерно 5% или менее, менее чем примерно 5%, 4% или менее чем примерно 3% или менее, примерно 2% или менее, примерно 1,5% или менее, примерно 1% или менее, примерно 0,5% или менее, примерно 0,4% или менее, примерно 0,3% или менее, примерно 0,2% или менее или примерно 0,1% или менее по весу. В некоторых вариантах реализации микробное масло и/или одна или более из его фракций, выбранная из фракции триацилглицеринов, фракции диацилглицеринов, фракции стеринов, фракции стериновых сложных эфиров, фракции свободных жирных кислот, фракции фосфолипидов и их комбинации по существу не содержит АРК. В некоторых вариантах реализации микробное масло нефти и/или одна или более из его фракций, выбранная из фракции триацилглицеринов, фракции диацилглицеринов, фракции стеринов, фракции стериновых сложных эфиров, фракции свободных жирных кислот, фракции фосфолипидов и их комбинации включает ДПК n-6 от примерно 0,4 до примерно 2%, от примерно 0,4 до примерно 3%, от примерно 0,4 до примерно 4%, от примерно 0,4 до примерно 5%, от примерно 0,4 до менее чем 5%, от примерно 0,5 до примерно 1%, от примерно 0,5 до примерно 2%, от примерно 0,5 до примерно 3%, от примерно 0,5 до примерно 4%, от примерно 0,5 до примерно 5%, от примерно 0,5 до менее чем 5%, от примерно 1 до примерно 2%, от примерно 1% до 3%, от примерно 1 до примерно 4%, от примерно 1 до примерно 5% или от примерно 1 до менее чем 5 вес.%. В некоторых вариантах реализации микробное масло и/или одна или более из его фракций, выбранная из фракции триацилглицеринов, фракции диацилглицеринов, фракции стеринов, фракции стериновых сложных эфиров, фракции свободных жирных кислот, фракции фосфолипидов и их комбинации, включает ДПК n-6 примерно 5%, менее чем примерно 5%, примерно 4% или менее, примерно 3% или менее, примерно 2% или
- 15 031136 менее, примерно 1% или менее, примерно 0,75% или менее, примерно 0,6% или менее или примерно 0,5% или менее по весу. В некоторых вариантах реализации микробное масло и/или одна или более из его фракций, выбранная из фракции триацилглицеринов, фракции диацилглицеринов, фракции стеринов, фракции стериновых сложных эфиров, фракции свободных жирных кислот, фракции фосфолипидов и их комбинации, по существу не содержит ДПК n-6. В некоторых вариантах реализации микробное масло и/или одна или более из его фракций, выбранная из фракции триацилглицеринов, фракции диацилглицеринов, фракции стеринов, фракции стериновых сложных эфиров, фракции свободных жирных кислот, фракции фосфолипидов и их комбинации, включает жирные кислоты, включающие примерно 5% или менее, менее чем примерно 5%, примерно 4% или менее, примерно 3% или менее или примерно 2% или менее по весу олеиновой кислоты (18:1 n-9), линолевой кислоты (18:2 n-6), линоленовой кислоты (18:3 n3), эйкозеновой кислоты (20:1 n-9), эруковой кислоты (22:01 n-9), стеаридоновой кислоты (18:4 n-3) или их комбинации.
Молекула триацилглицерина содержит 3 центральных атома (C(sn-1)H2R1-(sn-2)H2R2-C(sn-3)H2R3), что делает возможным образование различных позиционных изомеров. В некоторых вариантах реализации микробное масло содержит фракцию триацилглицеринов, при этом по меньшей мере примерно 2%, по меньшей мере примерно 3%, по меньшей мере примерно 5%, по меньшей мере примерно 10%, по меньшей мере примерно 15%, по меньшей мере примерно 20%, по меньшей примерно 30%, по меньшей мере примерно 35%, или по меньшей мере примерно 40% триацилглицеринов в указанной фракции триацилглицеринов содержат ДГК по двум положениям в молекуле триацилглицерина (двухзамещенная ДГК), выбранным из любых двух положений sn-1, sn-2 и sn-3 позиции, на основе процента относительной площади пиков на хроматограмме ВЭЖХ. В некоторых вариантах реализации микробное масло содержит фракцию триацилглицеринов, при этом примерно от 2 до примерно 55%, от примерно 2 до примерно 50%, от примерно 2 до примерно 45%, от примерно 2 до примерно 40%, от примерно 2 до примерно 35%, от примерно 2 до примерно 30%, от примерно 2 до примерно 25%, от примерно 5 до примерно 55%, от примерно 5 до примерно 50%, от примерно 5 до примерно 45%, от примерно 5 до примерно 40%, от примерно 5 до примерно 35%, от примерно 5 до примерно 30%, от примерно 5 до примерно 25%, от примерно 10 до примерно 55%, от примерно 10 до примерно 50%, от примерно 10 до примерно 45%, от примерно 10 до примерно 40%, от примерно 10 до примерно 35%, от примерно 10 до примерно 30%, от примерно 10 до примерно 25%, от примерно 10 до примерно 20%, от примерно 20 до примерно 40%, от примерно 20 до примерно 35%, или от примерно 20 до примерно 25% триацилглицеринов в указанной фракции триацилглицеринов содержит ЭПК по двум положениям в молекуле триацилглицерина, выбранным из любых двух положений sn-1, sn-2 или sn-3, на основании процента относительной площади пиков на хроматограмме ВЭЖХ. В некоторых вариантах реализации микробное масло содержит фракцию триацилглицеринов, при этом по меньшей мере примерно 0,5%, по меньшей мере примерно 1%, по меньшей мере примерно 1,5% или по меньшей мере примерно 2% триацилглицеринов в указанной фракции триацилглицеринов содержит ДГК по всем из трех положений sn-1, sn-2 и sn-3 (трехзамещенная ДГК) на основании процента относительной площади пиков на хроматограмме ВЭЖХ. В некоторых вариантах реализации микробное масло включает фракцию триацилглицеринов, при этом от примерно 0,5 до примерно 5%, от примерно 0,5 до примерно 3%, от примерно 0,5 до примерно 2,5%, от примерно 0,5 до примерно 2%, от примерно 1 до примерно 5%, от примерно 1 до примерно 3%, или от примерно 1 до примерно 2% триацилглицеринов в указанной фракции триацилглицеринов содержит ДГК по всех трех положениях sn-1, sn-2 и sn-3 на основании процента относительной площади пиков на хроматограмме ВЭЖХ. В некоторых вариантах реализации микробное масло содержит фракцию триацилглицеринов, при этом по меньшей мере примерно 10%, по меньшей мере примерно 15%, по меньшей мере примерно 20%, по меньшей мере примерно 25%, по меньшей мере примерно 30%, по меньшей мере примерно 35%, в мере примерно 40%, по меньшей мере примерно 45%, по меньшей мере примерно 50%, по меньшей мере примерно 55% или по меньшей мере примерно 60% триацилглицеринов в такой фракции триацилглицеринов содержат ДГК в одном положении в молекуле триацилглицерина, выбранном из любого из положений sn-1, sn-2 или sn-3, на основании процента относительной площади пиков на хроматограмме ВЭЖХ. В некоторых вариантах реализации микробное масло содержит фракцию триацилглицеринов, при этом примерно 10 до примерно 80%, от примерно 10 до примерно 70%, от примерно 10 до примерно 60%, от примерно 15 до примерно 80%, от примерно 15 до примерно 75%, от примерно 15 до примерно
70%, от примерно 15 до примерно 65%, от примерно 15 до примерно 60%, от примерно 35 до примерно
80%, от примерно 35 до примерно 75%, от примерно 35 до примерно 65%, от примерно 35 до примерно
60%, от примерно 40 до примерно 80%, от примерно 40 до примерно 75%, от примерно 40 до примерно
70%, от примерно 40 до примерно 65%, от примерно 40 до примерно 60%, или примерно 40 до примерно 55% триацилглицеринов в указанной фракции триацилглицеринов содержит ДГК в одном положении в молекуле триацилглицерина, выбранном из любого одного из положений sn-1, sn-2 или sn-3 на основании процента относительной площади пиков на хроматограмме ВЭЖХ.
- 16 031136
Композиции
Настоящее изобретение относится к композициям, содержащим микроорганизм согласно настоящему изобретению, к изолированной биомассе согласно настоящему изобретению, к микробному маслу согласно настоящему изобретению или их комбинации.
Микроорганизмов, биомасса и микробное масло согласно настоящему изобретению может быть дополнительно химически или физически модифицировано или обработано в соответствии с требованиями конкретной композиции с помощью любых известных способов.
Клетки микроорганизмов или биомассы могут быть высушены перед применением в композиции с помощью способов, включающих, но не ограниченных перечисленными, сублимационную сушку, воздушную сушку, сушку распылением, туннельную сушку, вакуумную сушку (лиофилизацию) и аналогичные процессы. Кроме того, собранную и промытую биомассу можно применять в композиции непосредственно, без сушки. См., например, патенты США № 5130242 и 6812009, каждый из которых включен в настоящую заявку посредством ссылки в полном объеме.
Микробное масло согласно настоящему изобретению можно применять в качестве исходного материала для получения более эффективного продукта, обогащенного жирной кислотой, такой как ЭПК. Например, микробное масло согласно настоящему изобретению можно подвергать различным способам очистки, известным в данной области, таким как дистилляция или аддукция мочевиной, для получения более эффективного продукта с более высокой концентрацией ЭПК или другой жирной кислоты. Микробное масло согласно настоящему изобретению также можно применять в химических реакциях для получения соединений, полученные из жирных кислот в маслах, таких как сложные эфиры и соли ЭПК или другой жирной кислоты.
Композиция согласно настоящему изобретению может включать один или более эксципиент. При использовании в настоящем изобретении эксципиент относится к компоненту или смеси компонентов, которые применяют в композиции согласно настоящему изобретению для достижения желаемые характеристики композиции, в том числе в пищевой, а также в фармацевтической, косметической и промышленной композициях. Эксципиент согласно настоящему изобретению может быть описан как фармацевтически приемлемый эксципиент при добавлении к фармацевтической композиции, что означает, что эксципиент представляет собой соединение, вещество, композицию, соль и/или дозированную форму, которые по результатам тщательной медицинской оценки пригодны для контакта с тканями человека и животного, отличного от человека, без чрезмерной токсичности, раздражения, аллергической реакции или других проблемных осложнений в течение необходимой длительности контакта, и соразмерны с разумным соотношением польза/риск. В некоторых вариантах реализации термин фармацевтически приемлемый означает утвержденный контролирующими органами федерального или государственного управления или указанный в Фармакопеи США или другой общепризнанной международной фармакопее для применения у животных, и в особенности, у человека. Можно применять различные эксципиенты. В некоторых вариантах реализации наполнитель может представлять собой, без ограничений, щелочной агент, стабилизатор, антиоксидант, адгезирующее вещество, разделительное вещество, вещество для покрытия, компонент внешней фазы, компонент для контролируемого высвобождения, растворитель, поверхностно-активное вещество, увлажняющее вещество, буферное вещество, наполнитель, смягчающее вещество или их комбинации. Эксципиенты, в дополнение к тем, которые рассмотрены в настоящем изобретении, могут включать эксципиенты, перечисленные в справочнике Remington: The Science and Practice of Pharmacy, 21st ed. (2005), но неограниченные ими. Отнесение эксципиента к конкретному классу в настоящем изобретении (например, растворитель) предназначено для иллюстрации, а не ограничения роли эксципиента. Один конкретный эксципиент может быть отнесен к нескольким классам.
Композиции согласно настоящему изобретению включают, но не ограничены перечисленными, пищевые продукты, фармацевтические композиции, косметические композиции и промышленные композиции.
В некоторых вариантах реализации композиция представляет собой пищевой продукт. Пищевой продукт представляет собой любую пищу для потребления животным, отличным от человека, или человеком, и включает в себя как твердые, так и жидкие композиции. Пищевой продукт может представлять собой добавку к корму для животных или к пище человека. Продукты включают, но не ограничены перечисленными, распространенные продукты питания, жидкие продукты, в том числе молоко, напитки, терапевтическое напитки и питательные напитки, функциональные продукты питания; пищевые добавки, нутрицевтики, продукты детского питания, в том числе формулы для недоношенных младенцев; продукты для беременных и кормящих женщин, продукты для взрослых; продукты для пожилых людей и продукты животного происхождения.
В некоторых вариантах реализации микроорганизм, биомасса и микробное масло согласно настоящему изобретению можно применять непосредственно или в виде добавки в составе одного или более из следующих: масла, шортенинга, пастообразного продукта, других жирных ингредиентов, напитков, соусов, продуктов на основе молока или сои (таких как молоко, йогурт, сыр и мороженое), печеных изделий, питательных продуктов, например, в качестве пищевой добавки (в капсулах или в таблетках), витаминной добавки, диетической добавки, порошкового напитка, готовых изделий или полуфабрикатов из
- 17 031136 порошковых пищевых продуктов. В некоторых вариантах реализации пищевая добавка находится в виде вегетарианской капсулы, которая не была получена из и не содержит в своем составе компонентов животного происхождения.
Неполный список пищевых композиций, которые могут включать микробное масло согласно настоящему изобретению, включает, но не ограничен перечисленными, соевые продукты (молоко, мороженое, йогурты, напитки, кремы, пастообразные продукты, забеливатели); супы и суповые смеси, тесто, жидкое тесто, выпечку, включая, например, хлебобулочные изделия из муки тонкого помола, сухие завтраки, торты, ватрушки, чизкейки, кексы, печенье, батончики, хлеб, роллы, бисквиты, маффины, пирожные, булочки, сухарики, крекеры, сладости, закусочные кексы, пироги, мюсли/закуски, и тосты; конфеты, карамель, шоколад и другие кондитерские изделия; жевательную резинку; жидкие пищевые продукты, например молоко, энергетические напитки, детское питание, газированные напитки, чай, жидкие продукты питания, фруктовые соки, сокосодержащие напитки, напитки на растительной основе; поливитаминные сиропы, заменители питания, лекарственные продукты, и сиропы; порошковые смеси для приготовления напитков, макаронные изделия; продукты переработки рыбы, продукты переработки мяса, продукты переработки птицы; подливки и соусы, приправы (кетчуп, майонеза и т.п.); спреды на основе растительного масла; молочные продукты; йогурт; масла, замороженные молочные продукты, мороженое, замороженные десерты, замороженные йогурты; полужидкие пищевые продукты, например продукты детского питания, пудинги и желатиновые десерты, обработанный и необработанный сыр; блинные смеси, пищевые батончики, в том числе энергетические батончики, вафельные смеси; приправы для салатов, смеси для яйцезаменителей; орехи и ореховые спреды, соленые закуски, такие как картофельные чипсы и другие чипсы или сухарики, кукурузные чипсы, тортильи, экструдированные закуски, попкорн, соленые крендельки, картофельные чипсы и орехи, а также специальные закуски, такие как подливы, сухие фруктовые закуски, мясные закуски, шкварки, батончики для здорового питания и рисовые/кукурузные лепешки.
В некоторых вариантах реализации микробное масло согласно настоящему изобретению можно применять как добавку к детской смеси. В детскую смесь можно добавлять микробное масло согласно настоящему изобретению в отдельности или в сочетании с физически очищенным маслом, полученным из микроорганизмов, продуцирующих арахидоновую кислоту (АРК). АРК-продуцирующие микроорганизмы представляют собой, например, Mortierella alpina или Mortierella sect. schmuckeri. Кроме того, в детскую смесь может быть добавлено микробное масло согласно настоящему изобретению в сочетании с маслом, обогащенным АРК, в том числе ARASCO® (Martek Biosciences, Columbia, MD).
В некоторых вариантах реализации композиция согласно настоящему изобретению представляет собой корм для животных. Животное включает организма, отличного от человека, относящегося к царству Животных, и включает в себя, без ограничения, водных животных и наземных животных. Термин корм для животных или пища для животных относится к любому пищевому продукту, предназначенному для животных, отличных от человека, будь то рыбы, промысловые рыбы, декоративные рыбы, личинки рыб, двустворчатые моллюски, моллюски, ракообразные, съедобные моллюски и ракообразные, креветки, личинки креветок, артемии; коловратки, солоноводные креветки, фильтраторы, земноводные; пресмыкающиеся; млекопитающие, домашние животные, сельскохозяйственные животные, животные, содержащиеся в зоопарке, спортивные животные, племенной скот; гоночные животные, животные для представлений; фамильные животные, редкие или находящиеся под угрозой исчезновения животные, животные-компаньоны, домашние животные, такие как собаки кошки, морские свинки, кролики, крысы, мыши и лошади; приматы, такие как обезьяны (например, обезьяны рода капуцинов, резусы, африканские зеленые мартышки, мартышки-гусары, яванские макаки, церкопитеки), приматы, орангутанги, павианы, гиббоны и шимпанзе; псовые, такие как собаки и волки, кошачьи, такие как кошки, львы, и тигры, непарнокопытные, такие как лошади, ослы и зебры, кормовые животные, такие как коровы, крупный рогатый скот, свиньи и овцы; копытные животные, такие как олени, жирафы или грызуны, такие как мыши, крысы, хомяки и морские свинки, и так далее. Корма для животных, включают, но не ограничены перечисленными, корма для аквакультуры, корма для домашних животных, в том числе корма для домашних питомцев, корма для зоологических животных, корма для рабочих животных, корма для скота и их комбинации.
В некоторых вариантах реализации композиция представляет собой корм или кормовую добавку для любого животного, чье мясо или продукты потребляются людьми, например, такого животного, мясо, яйца, молоко которого предназначены для потребления человеком. При кормлении таким животным, питательные вещества, такие как ДЦ-ПНЖК, могут быть включаться в мясо, молоко, яйца и другие продукты таких животных, что способствует увеличению содержания этих питательных веществ в соответствующих продуктах.
В некоторых вариантах реализации композиция представляет собой высушенное распылением вещество, которое может быть раскрошено с образованием частиц соответствующего размера для потребления зоопланктоном, артемиями, коловратками и фильтраторами. В некоторых вариантах реализации зоопланктон, артемии, коловратки или кормят композицией, и их, в свою очередь применяют в качестве корма для личинок рыб, рыб, моллюсков, двустворчатых моллюсков или ракообразных.
- 18 031136
В некоторых вариантах реализации композиция представляет собой фармацевтическую композицию. Подходящие фармацевтические композиции включают, но не ограничены перечисленными, противовоспалительные композиции, лекарственное средство для лечения ишемической болезни сердца, лекарственное средство для лечения атеросклероза, химиотерапевтическое средство, активный эксципиент, лекарственное средство для лечения остеопороза, антидепрессант, противосудорожное средство, лекарственное средство против Helicobacter pylori, препарат для лечения нейродегенеративных заболеваний, препарат для лечения дегенеративных заболеваний печени, антибиотик, композицию, снижающую уровень холестерина, а также композицию, снижающую уровень триацилглицеринов. В некоторых вариантах реализации композиция представляет собой продукт лечебного питания. Продукт лечебного питания включает продукт питания, который представлен в виде композиции для потребления или внешнего введения под наблюдением врача, и который предназначены для конкретной диетотерапии патологического состояния, при котором, как устанавливается в результате медицинского обследования на основании признанных научных принципов, существуют особые пищевые потребности.
В некоторых вариантах реализации микробное масло может входить в состав лекарственной формы. Лекарственные формы могут включать, но не ограничены перечисленными, таблетки, капсулы, крахмальные капсулы, шарики, пилюли, порошки и гранулы, а также парентеральные лекарственные формы, которые включают, но не ограничены перечисленными, растворы, суспензии, эмульсии и сухие порошки, содержащие эффективное количество микробного масла. Как также известно в данной области, такие препараты могут также содержать фармацевтически приемлемые разбавители, наполнители, разрыхлители, связующие вещества, смазывающие вещества, поверхностно-активные вещества, гидрофобные наполнители, водорастворимые наполнители, эмульгаторы, буферы, увлажняющие вещества, увлажнители, растворители, консерванты и т. п. Формы для введения могут включать, но не ограничены перечисленными, таблетки, драже, капсулы, капсуловидные таблетки и пилюли, содержащие микробное масло и один или более подходящий фармацевтически приемлемый носитель.
Для перорального введения микробное масло может быть объединено с фармацевтически приемлемыми носителями, хорошо известными в данной области. Такие носители позволяют микробное масло согласно настоящему изобретению помещать в композиции в виде таблеток, пилюль, драже, капсул, жидкостей, гелей, сиропов, растворов, суспензий и т. п., предназначенных для перорального приема субъектом, подлежащим лечению. В некоторых вариантах реализации лекарственная форма представляет собой таблетки, пилюли или капсулы. Фармацевтические препараты для перорального применения могут быть получены путем добавления твердого эксципиента, возможного измельчения полученной смеси и обработку смесь гранул после добавления подходящих вспомогательных веществ при необходимости для получения таблеток или драже. Подходящие эксципиенты включают, но не ограничены перечисленными, наполнители, такие как сахара, включающие, но не ограниченные перечисленными, лактозу, сахарозу, маннит и сорбит; препараты целлюлозы, такие как, кукурузный крахмал, пшеничный крахмал, рисовый крахмал, картофельный крахмал, желатин, трагакант, метилцеллюлоза, гидроксипропилметилцеллюлоза, натрийкарбоксиметилцеллюлоза и поливинилпирролидон (ПВП), но не ограниченные перечисленными. При желании могут быть добавлены разрыхлители, такие как, но не ограниченные перечисленными, перекрестно сшитый поливинилпирролидон, агар или альгиновая кислота или ее соль, такая как альгинат натрия. Фармацевтические препараты, которые можно применять перорально, включают, но не ограничены перечисленными, твердые капсулы из желатина, а также мягкие герметичные капсулы из желатина и пластификатора, такого как глицерин или сорбит. В некоторых вариантах реализации лекарственная форма представляет собой вегетарианским лекарственную форму, при этом такая лекарственная форма не образована из и не содержит компоненты животного происхождения. В некоторых вариантах реализации вегетарианская лекарственная форма представляет собой вегетарианскую капсулу.
В некоторых вариантах реализации композиция является косметическим средством. Косметическое средство включает, но не ограничено перечисленными, эмульсии, кремы, лосьоны, маски, мыло, шампуни, лосьоны для умывания, кремы, кондиционеры, средства для макияжа, средства для ванн, а также жидкие дисперсии. Косметические средства могут быть медицинскими или немедицинскими.
В некоторых вариантах реализации композиция представляет собой композицию для промышленного применения. В некоторых вариантах реализации композиция представляет собой исходное вещество материал для одного или нескольких производителей. Промышленный продукт включает, но не ограничен перечисленными, полимер; фотографическое светочувствительное вещество; моющее средство; промышленное масло или промышленное поверхностно-активное вещество. Например, в патенте США № 7259006 описано применения ДГК-содержащего жира и масла для производства бегеновой кислоты и производства фотографического светочувствительного вещества с применением бегеновой кислоты.
- 19 031136
Способы применения композиций
В некоторых вариантах реализации композиции можно применять для лечения патологического состояния у людей или у животных, отличных от человека. В некоторых вариантах реализации композицию можно применять для питания людей или животных, отличных от человека.
Термины лечить и лечения относятся к терапевтическому лечению и профилактическим или превентивным мерам, в котором объект, целью которых является предотвращение или замедление (уменьшение) нежелательного физиологического состояния, заболевания или нарушения или получение благоприятного или желаемого клинического результата. Для целей настоящего изобретения благоприятный или желаемый клинический результат включает, но не ограничен перечисленными, облегчение или устранение симптомов или признаков, связанных с патологическим состоянием, заболеванием или нарушением, уменьшение степени выраженности состояния, заболевания или нарушения; стабилизацию состояния, заболевания или нарушения (т.е. случаи, когда патологическое состояние, заболевание или нарушение не ухудшается); задержку развития или прогрессирования состояния, заболевания или нарушения; облегчение патологического состояния, заболевания или нарушения; ремиссию (частичную или полную, детектируемую или недетектируемую) патологического состояния, заболевания или нарушения, или оздоровление или улучшение патологического состояния, заболевания или нарушения. Лечение включает выявление клинически значимого ответа без чрезмерных побочных эффектов. Лечение также включает продление продолжительности жизни, по сравнению с ожидаемой продолжительностью жизни в случае отсутствия лечения.
В некоторых вариантах реализации композицию применяют для лечения патологического состояния, заболевания или нарушения, такого как акне, острое воспаление, возрастная макулопатия, аллергия, болезнь Альцгеймера, артрит, астма, атеросклероз, аутоиммунное заболевание, заболевания, связанные с изменением липидного спектра крови, кисты груди, кахексия, рак, сердечный рестеноза, сердечнососудистые заболевания, хронические воспаления, ишемическая болезнь сердца, муковисцидоз, дегенеративное заболевание печени, сахарный диабет, экзема, желудочно-кишечные расстройства, болезни сердца, высокое содержание триацилглицеринов, гипертония, гиперактивность, иммунологические заболевания, ингибирование опухолевого роста, воспалительное заболевание, кишечные расстройства, нарушение функции почек, лейкемия, депрессия, рассеянный склероз, нейродегенеративное заболевание, остеоартроз, остеопороз, пероксисомное заболевание, преэклампсия, преждевременные роды, псориаз, легочное расстройство ревматоидный артрит, риск развития сердечных заболеваний или тромбоз.
В некоторых вариантах реализации композицию применяют для увеличения гестационного срока плода в третьем триместре беременности.
В некоторых вариантах реализации композицию применяют для контроля кровяного давления.
В некоторых вариантах реализации композицию применяют для улучшения или поддержания когнитивной функции.
В некоторых вариантах реализации композицию применяют для улучшения или поддержания памяти.
Композицию или лекарственную форму можно вводить в организм субъекта любым путем, совместимым с композицией или лекарственной формой. Говорят, что вещество вводят, если вещество вводится в организм субъекта самим субъектом, или в случае, если введение осуществляет другой человек, вещество вводят в организм человека при помощи какого-либо аппарата или устройства. Введение, таким образом, включает, например, самостоятельное ведение, введение другим человеком или непрямое введение. Термин непрерывное или последовательное, при использовании в настоящем изобретении в отношении термина введения означает, что частота введения составляет по меньшей мере один раз в день. Стоит отметить, однако, что частота введения может быть больше чем один раз в день и при этом введение быть непрерывным или последовательным, например, два или даже три раза в день, при условии, что уровни дозировки, указанные в настоящем документе, не превышены. Средства и способы введения известны в данной области и специалист в данной области может найти соответствующую информацию в различных фармакологических источниках. Например, справочную информацию можно найти в Modern Pharmaceutics, Banker & Rhodes, Informa Healthcare, USA, 4th ed. (2002); и Goodman & Gilman's The Pharmaceutical Basis of Therapeutics, McGraw-Hill Companies, Inc., New York, 10th ed. (2001).
Под субъектом, индивидом или пациентом понимают любого объекта, будь то человек или объект, отличный от человека, для которого необходима диагностика, прогнозирование, терапия или введение композиции или лекарственной формы. Объекты, являющиеся млекопитающими, включают, но не ограничены перечисленными, людей, домашних животных, сельскохозяйственных животных, содержащихся в зоопарке животных, спортивные животных, домашних животных, таких как собаки, кошки, морские свинки, кролики, крысы, мыши или лошади; приматов, таких как обезьяны (например, обезьяна рода капуцинов, резус, африканские зеленые мартышки, мартышки-гусары, яванские макаки, церкопитеки), приматы, орангутанги, павианы, гиббоны и шимпанзе; псовых, таких как собаки и волки, кошачьих, таких как кошки, львы и тигры, непарнокопытных, таких как лошади, ослы и зебры, кормовых животных, таких как коровы, крупный рогатый скот, свиньи и овцы; копытных животных, таких как олени,
- 20 031136 жирафы или грызунов, таких как мыши, крысы, хомяки и морские свинки и так далее. Термин объект также включает модельных животных, например, животных, используемых для моделирования болезней. В некоторых вариантах термин субъект включает ценных животных, как экономически ценных, так и ценных иным образом, например, экономически ценный племенной скот, беговых животных, животных, используемых в представлениях, фамильных животных, редких или находящихся под угрозой исчезновения животных или домашних животных. В некоторых вариантах реализации субъект представляет собой человека. В некоторых вариантах реализации субъект не является человеком.
Композицию можно вводить в виде пищевого количества, терапевтически эффективного количества, профилактически эффективного количества, терапевтической дозы или профилактической дозы. Пищевое количество относится к количеству, эффективного, при необходимой дозе и при необходимом периоде времени, для достижения желаемого результата, связанного с питанием. Результат, связанный с питанием, может представлять собой, например, повышение уровня желаемого компонента жирных кислот у субъекта. Терапевтически эффективное количество или терапевтическая доза относится к количеству, эффективного, при необходимой дозе и при необходимом периоде времени, для достижения желаемого терапевтического результата. Терапевтический результат может представлять собой, например, ослабление симптомов, увеличение продолжительности жизни, улучшение подвижности и тому подобное. Терапевтический результат не обязательно должен представлять собой излечение. Профилактически эффективное количество или профилактическая доза относится к количеству, эффективного, при необходимой дозе и при необходимом периоде времени, для достижения желаемого профилактического результата. Как правило, поскольку профилактическую дозу субъекты получают до начала заболевания или на ранней стадии заболевания, профилактически эффективное количество будет меньше, чем терапевтически эффективное количество, применяемое для лечения поздней стадии заболевания.
Субъекту можно водить различную дозу композиции, лекарственной формы или фармацевтической композиции на основании количества ЭПК или других содержащих жирные кислоты компонентов микроорганизма, биомассы и микробного масло, которое должно быть введено объекту. Термин суточная доза, ежедневная доза и объем суточной дозы относятся в настоящем изобретении к общему количеству ЭПК или другому жирно кислотному компоненту, вводимому в сутки (в период 24 ч). Так, например, введение по ЭПК объекту в суточной дозе 2 мг означает, что субъект получает всего 2 мг ЭПК ежедневно, независимо от того, вводят ЭПК в виде единичной дозированной формы, содержащей 2 мг ЭПК, или как альтернатива, в виде четырех дозированных лекарственных форм, каждая из которых содержит по 0,5 мг ЭПК (всего 2 мг ЭПК). В некоторых вариантах реализации суточное количество ЭПК вводят в одной лекарственной форме, либо в двух лекарственных формах. Лекарственные формы согласно настоящему изобретению можно применять в виде одного применения или нескольких применений. Например, при ежедневном приеме четырех таблеток, если при этом каждая таблетка содержит 0,5 мг ЭПК, все четыре таблетки можно принимать один раз в сутки, или 2 таблетки можно принимать два раза в сутки, или можно применять по 1 таблетке каждые 6 ч. В некоторых вариантах суточная доза составляет от примерно 100 мг до примерно 15 г ЭПК. В некоторых вариантах реализации суточная доза составляет от примерно 0,5 мг до примерно 250 мг, от примерно 100 мг до примерно 250 мг, от примерно 100 мг до примерно 500 мг, от примерно 100 мг до примерно 1 г, от примерно 1 до примерно 2,5 г, от примерно 1 до примерно 5 г, от примерно 1 до примерно 10 г, от примерно 1 до примерно 15 г, от примерно 5 до примерно 10 г, от примерно 5 до примерно 15 г, от примерно 10 до примерно 15 г, от примерно 100 мг до примерно 10 г, от примерно 100 мг до примерно 5 г или от примерно 100 мг до примерно 2,5 г ЭПК, ДГК или их комбинации. В некоторых вариантах реализации композиция представляет собой лекарственную форму, которая содержит от примерно 0,5 до примерно 250 мг, от примерно 100 до примерно 250 мг, от примерно 0,5 до примерно 500 мг, от примерно 100 до примерно 500 мг, от примерно 0,5 мг до примерно 1 г или от примерно 100 мг до примерно 1 г ЭПК, ДГК или их комбинации, на лекарственную форму.
Введение композиции или лекарственной формы согласно настоящему изобретению можно осуществлять с помощью различных схем. Например, в некоторых вариантах реализации введение осуществляют ежедневно в последовательные дни, или, как альтернатива, введение осуществляют через день (раз в два дня). Введение может осуществляться в один или несколько дней.
Введение композиции и лекарственной формы может быть совмещено с другими схемами, используемыми для лечения данного заболевания. Например, способ согласно настоящему изобретению может быть совмещен с режимом питания (например, низкоуглеводной диетой, рационом с высоким содержанием белка, диетой с высоким содержанием волокон и т.д.), режимом физической нагрузки, режимом, направленным на снижение веса, режимом отказа от курения или их комбинации. Способ согласно настоящему изобретению можно также применять в комбинации с другими фармацевтическими продуктами в лечении данного заболевания. Композицию или лекарственную форму согласно настоящему изобретению можно вводить до или после приема других средств или фармацевтических продуктов.
- 21 031136
Наборы, содержащие композиции
Настоящее изобретение направлено на наборы или упаковки, содержащие одну или более единицу, содержащую композицию согласно настоящему изобретению. Наборы или пакеты могут включать единицы продукта питания, фармацевтической композиции, косметического средства или промышленной композиции, содержащие микроорганизм, биомассу или микробное масло согласно настоящему изобретению или их комбинации. Наборы или упаковки могут также включать добавку, содержащую микроорганизм, биомассу или микробное масло согласно настоящему изобретению или их комбинации для получения пищевого продукта, косметического средства, фармацевтической композиции, или промышленной композиции.
В некоторых вариантах реализации набор или упаковка содержит одну или более единицу фармацевтической композиции для введения в соответствии со способами согласно настоящему изобретению. Набор или упаковка может содержать одну дозированную единицу, или более одной дозированной единицы (например, множество дозированных единиц). Если в наборе или в упаковке присутствует множество дозированных единиц, они могут быть дополнительно организованы для последовательного введения.
Наборы согласно настоящему изобретению могут дополнительно содержать инструкции, относящиеся к единицам или лекарственным формам из наборов. Такие инструкции могут быть в форме, установленной правительственным органом, регулирующим производство, применение или продажу фармацевтических препаратов, с указанием одобрения правительственным органом применения или продажи для введения человеку для лечения патологического состояния или нарушения. Инструкция может быть в любой форме, которая передает информацию о применении единиц или лекарственных форм, в комплекте в соответствии со способом согласно настоящему изобретению. Например, инструкции могут находиться в печатной форме или в виде предварительной записи на медиа-устройстве.
В ходе обследования пациента медицинский работник может определить, что введение одного из способов согласно настоящему изобретению является подходящим для пациента, или врач может определить, что состояние пациента может быть улучшено путем введения одного из способов согласно настоящему изобретению. Перед назначением какого-либо режима лечения, врач может объяснить пациенту, например, различные риски и благоприятные эффекты, связанные с режимом лечения. Пациенту может быть предоставлена полная информация обо всех известных и предполагаемых рисках, связанных с режимом лечения. Такая консультация может быть предоставлена в устной форме, а также в письменной форме. В некоторых вариантах реализации врач может предоставить пациенту документацию по режиму лечения, например, информацию о продукте, учебные материалы и тому подобное.
Настоящее изобретение направлено на способы информирования потребителей о способах лечения, включающие распространение лекарственных форм с информацией для потребителей в точке продажи. В некоторых вариантах реализации распространение происходит в точке продажи, в которой доступен фармацевт или врач.
Термин информация для потребителей может включать, но не ограничен перечисленными, текст на английском языке, текст на языке, отличным от английского, визуальный образ, график, телефонную запись, сайт в Интернете, а также непосредственный доступ к представителю по работе с клиентами. В некоторых вариантах реализации информация для потребителей обеспечивает инструкции по применению лекарственных форм в соответствии со способами согласно настоящему изобретению, применение в соответствии с возрастом, показания, противопоказания, соответствующую дозировку, предупреждения, номер телефона или адрес сайта в Интернете. В некоторых вариантах реализации способ дополнительно включает предоставление профессиональной информации соответствующими специалистами, способными отвечать на вопросы, касающиеся применения потребителем описанных в настоящем изобретении режимов лечения в соответствии со способами согласно настоящему изобретению. Термин профессиональная информация включает, но не ограничена перечисленными, информацию, касающуюся режима лечения при введении в соответствии со способами согласно настоящему изобретению, обеспечивающими возможность медицинских работников отвечать на вопросы потребителя.
Медицинский работник включает, например, врача, фельдшера, медицинскую сестру, медицинскую сестру высшей квалификации, фармацевта и представителя по работе с клиентами.
После общего описания настоящего изобретения для дальнейшего понимания настоящего изобретения следует руководствоваться примерами, приведенные в настоящем заявке. Приведенные примеры предназначены только для иллюстрации и не ограничивают настоящее изобретение.
Пример 1.
Выделение микроорганизмов.
Образцы литоральных организмов собирали во время отлива на западном побережье Северной Америки, включая заливы и дельты, (Калифорния, Орегон и Вашингтон) и Гавайях. Воду, осадок, живой растительный материал и гниющие растительные/животные остатки помещали в стерильные пробирки объемом 50 мл. Часть материала из каждого образца вместе с водой наносили на чашки с твердой агаризованной средой для выделения. Среда для выделения содержала 500 мл искусственной морской воды, 500 мл дистиллированной воды, 1 г глюкозы, 1 г глицерина, 13 г агара, 1 г глутамата, 0,5 г дрожжевого
- 22 031136 экстракта, 0,5 г гидролизата казеина, 1 мл раствора витаминов (100 мг/л тиамина, 0,5 мг/л биотина, 0,5 мг B12), 1 мл раствора микроэлементов (металлы PII, содержание на 1 л: 6,0 г FeCl36H2O, 6.84 г H3BO3, 0.86 г MnCl24H2O, 0.06 г ZnCl2, 0.026 г CoCl26H2O, 0.052 г NiSO4H2O, 0.002 г CuSO45H2O и 0.005 г Na2MoO42H2O) и по 500 мг пенициллина G и стрептомицин сульфата. Чашки с агаром инкубировали в темноте при 20-25°C. После 2-4 дней чашки с агаром изучали под увеличением и колонии клеток отбирали стерильной зубочисткой и рассевали способом штриха на чашку со свежей средой. Клетки пересевали на свежую среду до тех пор, пока загрязняющие колонию организмы не были удалены. Два из изолированных микроорганизмов были депонированы в ATCC под номерами PTA-10212 и PTA-10208.
Таксономические характеристики изолированных микроорганизмов, помещенных в ATCC под номером PTA-10212.
Культуры изолированных микроорганизмов, депонированных в ATCC под номером PTA-10212 (РТА-10212), выглядели как белые, мокрые, вязкие колонии без видимых сорусов.
РТА-10212 выращивали на твердой и жидкой среде FFM (fluid filter medium, жидкая фильтрационная среда), твердой среде KMV (Kazama's modified Vishniac's medium, модифицированная среда Вишняка), KMV каше (1%), бульоне KMV и бульоне MH (Mueller Hinton broth, бульон Мюллер-Хинтона) бульоне для последующего изучения ростовых характеристик. PTA-10212 быстро рос на KMV и MH. См., например, Porter D., 1989. Phylum Labyrinthulomycota. в Margulis, L., Corliss, J.O., Melkonian, M., Chapman, D.J. (Eds.) Handbook of Protoctista, Jones and Bartlett, Boston, p. 388-398 (KMV); Honda et al., Mycol. Res. 102:439-448 (1998) (MH); и патент США № 5130242 (FFM), каждая из которых включена в настоящую заявку посредством ссылки в полном объеме.
Последующие наблюдения были сделаны после выращивания PTA-10212 в течение нескольких дней на твердой среде FFM, после 72 ч культивирования на среде KMV и бульоне MH. Спорангии не были схлопнувшимися/раскрытыми на любой из сред и были очень маленькими (5-10 мкм). PTA-10212 не демонстрировал большого количества тетрад, характерного для деления Schizochytrium. Амебоидные клетки появлялись в течение 24 ч после переноса на твердую свежую среду. Такие амебоидные клетки исчезали после нескольких дней и не были обнаружены в жидкой или кашеобразной среде. В отличие от Aurantiochytrium, описанного Yokoyama, R. et al., Mycoscience 48(6): 329-341 (2007), образующего маленькие песчинки на дне колбы при выращивании в жидкой среде, PTA-10212 не оседал на дно колбы, но находился во взвешенном состоянии как в жидкой среде KMV, так и в жидкой среде MH. Спорангии не были такими же плотными, как типичные спорангии Schizochytrium или Oligochytrium, которые также имели крепкую эктоплазматическую сеть, отсутствующую у PTA-10212. В то время как большинство видов претерпевает вегетативное деление маленьких спорангиев или ассимилирующих клеток путем дробления большого спорангия за несколько часов, PTA-10212 формирует гантелеобразные удлиненные ассимилирующие клетки, которые затем формируют тонкую перемычку, вытягивающуюся обособленно на концах разделенных гантелей. В результате появляются маленькие ассимилирующие клетки. Прямое изменение амебоидных клеток в гантелеобразные ассимилирующие клетки не наблюдали. Типичные для двухжгутиковых зооспоры наблюдали плавающими, но относительно редко. PTA-10212 не пролиферировал, не делился с помощью вегетативного деления. Непосредственное появление зооспор не наблюдали, хотя замечали плавающие зооспоры. Вегетативные клетки были очень маленькими (от 2 до 5 мкм).
PTA-10212 в дальнейшем исследовали с использованием фильтрационного способа, для которого были приготовлены стекла, содержащие небольшие порции агара с растущими колониями в капле морской воды, разведенной в половину. С помощью этого способа первичные спорангии наблюдали как шаровидные и имеющие примерно 10 мкм в диаметре. Стенки были очень тонкими, и при инициации бинарного деления протопластов потомков не наблюдали. Повторное бинарное деление порождало 8-16 маленьких (4-5 мкм в диаметре) вторичных спорангиев. Вторичные спорангии оставались в покое в течение нескольких часов перед высвобождением аморфных протопластов. Аморфные протопласты разделялись путем расщепления и выталкивания, изначально формируя типичные гантелеобразные промежуточные стадии и в конце приводя к образованию 4-8 небольших шаровидных телец, 2.5-2.8 мкм в диаметре. Последние остаются неподвижными на протяжении от нескольких до 1-2 ч, затем изменяют форму (удлиняются) и преобразуются в двухжгутиковые зооспоры, 2.3-2.5х3.7-3.9 мкм. Зооспоры изобиловали и могли быть точно измерены при переходе в стадию покоя. Затем зооспоры округлялись и начинали новый цикл развития. Зооспоры были больше, чем зооспоры Sicyoidochytrium minutum и меньше, чем зооспоры Ulkenia visurgensis.
В дальнейшем PTA-10212 характеризовали, основываясь на сходстве его 18S рРНК гена с генами 18S рРНК уже известных видов. Геномную ДНК PTA-10212 выделяли с помощью стандартных протоколов. См., например, Sambrook J. and Russell D. 2001. Molecular cloning: A laboratory manual, 3rd edition. Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York. Кратко: (1) 500 мкл клеток из культуры, находящейся в лаг-фазе, центрифугировали. Клетки повторно центрифугировали и от осадка удаляли жидкость с помощью наконечника с маленьким диаметром; (2) Осадок ресуспендировали в 200 мкл лизирующего буфера (20 мМ Трис pH 8.0, 125 мкг/мл протеиназы K, 50 мМ NaCl, 10 мМ ЭДТА pH 8.0, 0.5% SDS); (3) клетки лизировали при 50°C в течение 1 ч; (4) лизат переносили в PLG-пробирки (phaselock gel, PLG-Eppendorf) объемом 2 мл; (5) равный объем смеси фенол:хлороформ:изоамиловый спирт
- 23 031136 добавляли и перемешивали в течение 1.5 ч; (6) пробирки центрифугировали при 12,000xg в течение 5 мин; (7) отбирали водную фазу над гелем в PLG-пробирки и добавляли равный объем хлороформа к водной фазе, перемешивали в течение 30 мин; (8) пробирки центрифугировали при 14,000xg в течение 5 мин; верхнюю фракцию (водную фазу) отбирали и переносили в новые пробирки; (10) добавляли 0.1 объем 3 М NaOAC и перемешивали (переворачивая несколько раз); (11) добавляли 2 объема 100% EtOH и перемешивали (переворачивая несколько раз), наблюдая формирование осадка геномной ДНК на этой стадии; пробирки центрифугировали при 14000xg в течение примерно 15 мин; (13) жидкость осторожно выливали таким образом, чтобы осадок геномной ДНК остался на дне пробирки; (14) осадок промывали 0.5мл 70% EtOH; (15) пробирки центрифугировали при 4°C и 14000xg в течение примерно 15 мин; (16) EtOH осторожно выливали и осадок геномной ДНК высушивали; и (17) к осадку геномной ДНК добавляли необходимый объем H2O и РНКазы. ПЦР-амплификацию гена 18S рРНК выполняли с праймерами, описанными ранее (Honda et. al., J. Euk. Micro. 46(6): 637-647 (1999). Условия проведения ПЦР с пробой хромосомной ДНК были следующими: 0.2 мкМ дНТП, 0.1 мкМ каждого праймера, 8% ДМСО, 200 нг хромосомной ДНК, 2.5 ед. ДНК-полимеразы Herculase® II Fusion (Stratagene) и буфер Herculase® (Stratagene) в общем объеме 50 мкл. ПЦР протокол включал следующие шаги: (1) 95°C 2 мин; (2) 95°C 35 с; (3) 55°C 35 с; (4) 72°C 1 мин; (5) цикл, включающий 2-4 шаги, повторяли 30 раз; (6) 72°C 5 мин; и хранили при 4°C.
ПЦР амплификация с использованием пробы хромосомной ДНК, описанной выше, дала четкий ДНК фрагмент ожидаемого размера. Продукт ПЦР клонировали в вектор pJET1.2/blunt (Fermentas) в соответствии с коммерческим протоколом и последовательность фрагмента определили, используя стандартные праймеры.
Филогенетический анализ поместил PTA-10212 в группу, включающую Thraustochytrium pachydermum и Thraustochytrium aggregatum с небольшой вероятностью (with moderate support). Спорангии T. pachydermum имеют очень толстые клеточные стенки. T. aggregatum формирует отчетливо видимые группы сорусов, которые являются темными. PTA-10212 не показывает ни одной из этих характеристик. Присутствие большого количества амебоидных клеток описывали для других таксонов, таких как Ulkenia, T. gaertnerium, A. limiacinum, и S. mangrovei; однако, описания, связанные с этими таксонами, отличаются от характеристик, наблюдаемых для изолята. Кроме того, PTA-10212 не показывал филогенетического сходства с какими-либо другими таксонами.
В табл. 3 показано сравнение последовательности 18S рРНК микроорганизма, депонированного в ATCC под номером PTA-10212 с ДНК последовательностями из электронной базы Национального Центра Биотехнологической Информации (NCBI). Процент идентичности определяли, используя два способа расчета. Способ расчета #1 учитывает любые пробелы, которые возникают в последовательностях либо вследствие негомологичных областей, либо из-за неполной последовательности (установки по умолчанию AlignX-VectorNTI). Способ расчета #2 не включает штрафы за пробелы (установки матрицы AlignX-VectorNTI IDENTITY).
Таблица 3
Сравнение последовательностей 18S рРНК
Thraustochytrids % Идентичности Способ расчета #1 % Идентичности Способ расчета #2
Thraustochytrium pachydermum 85% 93%
Thraustochytrium aggregatum (p) 83% 92%
Thraustochytrium gaertnerium 82% 92%
Ulkenia visurgensis 82% 92%
Schizochytrium sp. PTA-9695 80% 92%
Schizochytrium mangrovei 80% 91%
Schizochytrium sp. ATCC 20888 80% 90%
Aurantiochytrium limiacinum 79% 90%
(р): указывает неполные последовательности.
Как показано в табл. 3, было установлено, что с точки зрения % идентичности последовательность гена 18S рРНК (SEQ ID NO: 1) из микроорганизма, депонированного в ATCC под номером доступа PTA10212, связана, хотя и не идентична, с последовательностями генов 18S рРНК, имеющимися в базе данных NCBI. Общепризнанно, что организмы имеют близкие последовательности 18S рРНК генов, и при этом принадлежать к разным родам или видам.
Исходя из вышеизложенной характеристики, изолированный микроорганизм, депонированный в ATCC под номером PTA-10212, как предполагается, представляет новый вид Thraustochytrium и, следовательно, также обозначен как Thraustochytrium sp. ATCC PTA-10212.
Таксономические характеристики изолированного микроорганизма, депонированного в ATCC под номером PTA-10208.
Микроорганизм, депонированный в ATCC под номером PTA-10208 (PTA-10208), идентифициро
- 24 031136 вали как суб-изолят (индивидуальная клетка, изолированная из культуры и поддерживаемая как новая отдельная и отличающаяся культура) микроорганизма, депонированного в ATCC под номером PTA-9695 (PTA-9695), описанного в заявке на патент США № 12/407687 и PCT/US2009/001720, каждый из которых включен в настоящее изобретение посредством ссылки в полном объеме.
PTA-10208 разделяет характеристики PTA-9695. PTA-9695 образовывал двухжгутиковые зооспоры при выделении, которые активно уплывают от зрелых спорангиев, остатки стенок которых были ясно видны (в фазовом контрасте) после высвобождения спор. PTA-9695 спорангии были размером от 12.5 до 25 мкм в диаметре и зооспоры были размером от 2.5 мкм до 2.8х от 4.5 от 4.8 мкм. В отдельных спорангиях PTA-9695 было от 8 до 24 спор. Высвободившиеся зооспоры PTA-9695 удлиняются и быстро подвергаются бинарному делению, приводящему к тетрадам, октадам и, наконец, к группам спорангиев. Формирование тетрад начиналось на самой ранней стадии созревания спорангиев. Эти характеристики согласуются с характеристиками рода Schizochytrium. В пересчете на % идентичности последовательность гена 18S рРНК PTA-9695(SEQ ID NO: 2), которая является общей для PTA-10208, оказалась тесно связанной, хотя и не идентичной, с последовательностью гена 18S рРНК T. aggregatum, полученной Honda, D. et al., J. Euk. Micro. 46(6): 637-647 (1999). Последовательность 18S рРНК, опубликованная для Thraustochytrium aggregatum, является неполной последовательностью, содержащей пробел из примерно 71 нуклеотидов ДНК в середине последовательности. PTA-9695, как предполагается, представляет новый вид Schizochytrium. Таким образом, суб-изолят PTA-10208 также обозначен как Schizochytrium sp. ATCC PTA-10208.
Пример 2.
Ростовые характеристики изолированного микроорганизма, депонированных в ATCC под номером доступа PTA-10212.
Изолированный микроорганизм, депонированный в ATCC под номером PTA-10212, исследовали на предмет ростовых характеристик в индивидуальных ферментерах, как описано ниже. Типичная среда и условия культивирования указаны в табл. 1.
В культурах с подачей углерода (глицерина) и азота с содержанием Cl 1000 м.д., при 22.5°C, с содержанием кислорода 20%, при pH 7.3, PTA-10212 формировал 26.2 г/л сухого веса клеток после 138 ч культивирования в ферментере объемом 10 л. Содержание липидов составило 7.9 г/л, омега-3 - 5.3 г/л, ЭПК - 3.3 г/л и ДГК - 1.8 г/л. Содержание жирных кислот составило 30.3% от общего веса; содержание ЭПК составило 41.4% метиловых эфиров жирных кислот (МЭЖК) и содержание ДГК составило 26.2% МЭЖК. Продукция липидов составила 1.38 г/л в сутки и продукция омега-3 составила 0.92 г/л в сутки при этих условиях, с продукцией ЭПК, равной 0.57 г/л в сутки, и продукцией ДГК, равной 0.31 г/л в сутки.
В культурах с подачей углерода и азота с содержанием Cl 1000 м.д., при 22.5°C, с содержанием кислорода 20%, при pH 7.3, PTA-10212 формировал 38.4 г/л сухого веса клеток после 189 ч культивирования в ферментере объемом 10 л. Содержание липидов составило 18 г/л, омега-3 - 12 г/л, ЭПК - 5 г/л и ДГК - 6.8 г/л.
Содержание жирных кислот составило 45% от общего веса; содержание ЭПК составило 27.8% МЭЖК и содержание ДГК составило 37,9% МЭЖК. Продукция липидов составила 2,3 г/л в сутки и продукция омега-3 была 1,5 г/л в сутки при этих условиях, при этом продукция ЭПК составила 0.63 г/л в сутки, а продукция ДГК составила 0.86 г/л в сутки.
В культурах с подачей углерода (глицерина) и азота с содержанием Cl 1000 м.д., при 22.5°C, с содержанием кислорода 20%, при pH 6.8-7.7, PTA-10212 формировал 13 г/л сухого веса клеток после 189 ч культивирования в ферментере объемом 10 л. Содержание липидов составило 5.6 г/л, омега-3 - 3.5 г/л, ЭПК - 1.55 г/л и ДГК - 1.9 г/л. Содержание жирных кислот составило 38% от общего веса; содержание ЭПК составило 29,5% МЭЖК и содержание ДГК составило 36% МЭЖК. Продукция липидов составила 0.67 г/л в сутки и продукция омега-3 составила 0.4 г/л в сутки при этих условиях, с продукцией ЭПК, равной 0.20 г/л в сутки, и продукцией ДГК, равной 0.24 г/л в сутки.
В культурах с подачей углерода (глицерина) и азота с содержанием Cl 1000 м.д., при 22.5-28.5°C, с содержанием кислорода 20%, при pH 6.6-7.2, PTA-10212 формировал 36.7-48.7 г/л сухого веса клеток после 191 ч культивирования в ферментере объемом 10 л. Содержание липидов составило 15.2-25.3 г/л, омега-3 - 9.3-13.8 г/л, ЭПК - 2.5-3.3 г/л и ДГК - 5.8-11 г/л. Содержание жирных кислот составило 42.453% от общего веса; содержание ЭПК составило 9,8-22% МЭЖК и содержание ДГК составило 38.143.6% МЭЖК. Продукция липидов составила 1.9-3.2 г/л в сутки и продукция омега-3 составила 1.2-1.7 г/л в сутки при этих условиях, с продукцией ЭПК, равной 0.31-0.41 г/л в сутки, и продукцией ДГК, равной 0.72-1.4 г/л в сутки.
Ростовые характеристики изолированного микроорганизма, депонированного в ATCC под номером PTA-10208.
Изолированный микроорганизм, депонированный в ATCC под номером PTA-10208, исследовали на предмет ростовых характеристик в индивидуальных ферментерах, как описано ниже. Типичная среда и условия культивирования указаны в табл. 2.
В культурах с подачей углерода (глюкозы) и азота с содержанием Cl 1000 м.д., при 22.5°C, при pH
- 25 031136
7.0, с содержанием кислорода 20% в течение азотного кормления и с содержанием кислорода 10% впоследствии, PTA-10208 формировал 95 г/л сухого веса клеток после 200 ч культивирования в ферментере объемом 10 л. Содержание липидов составило 53.7 г/л, омега-3 - 37 г/л, ЭПК - 14.3 г/л и ДГК - 21 г/л. Содержание жирных кислот составило 57% от общего веса; содержание ЭПК составило 27.7% МЭЖК и содержание ДГК составило 39.1% МЭЖК. Продукция липидов составила 6.4 г/л в сутки и продукция омега-3 составила 4.4 г/л в сутки при этих условиях, с продукцией ЭПК, равной 1.7 г/л в сутки, и продукцией, равной ДГК 2.5 г/л в сутки.
В культурах с подачей углерода (глюкозы) и азота с содержанием Cl 1000 м.д., при 22.5°C, при pH 7.5, с содержанием кислорода 20% в течение азотного кормления и с содержанием кислорода 10% впоследствии, PTA-10208 формировал 56 г/л сухого веса клеток после 139 ч культивирования в ферментере объемом 10 л. Содержание липидов составило 53 г/л, омега-3 - 34 г/л, ЭПК - 11.5 г/л и ДГК - 22 г/л. Содержание жирных кислот составило 58% от общего веса, содержание ЭПК составило 21.7% МЭЖК и содержание ДГК составило 41.7% МЭЖК. Продукция липидов составила 9.2 г/л в сутки и продукция омега-3 составила 5.9 г/л в сутки при этих условиях, с продукцией ЭПК 2 г/л в сутки и продукцией ДГК 3.8 г/л в сутки.
В культурах с подачей углерода (глюкозы) и азота с содержанием Cl 1000 м.д., при 22.5°C, при pH 7.0, с содержанием кислорода 20% в течение азотного кормления и с содержанием кислорода 10% впоследствии, PTA-10208 формировал 93.8 г/л сухого веса клеток после 167 ч культивирования в ферментере объемом 2000 л. Содержание липидов составило 47.2 г/л, омега-3 - 33.1 г/л, ЭПК - 10.5 г/л и ДГК 20.4 г/л. Содержание жирных кислот составило 50.6% от общего веса, содержание ЭПК составило 23% МЭЖК и содержание ДГК составило 42.6% МЭЖК. Продукция липидов составила 6.8 г/л в сутки, и продукция омега-3 составила 4.7 г/л в сутки при этих условиях, с продукцией ЭПК 1.5 г/л в сутки и продукцией ДГК 2.9 г/л в сутки.
В культурах с подачей углерода (глюкозы) и азота с содержанием Cl 1000 м.д., при 22.5°C, при pH 7.0, с содержанием кислорода 20% в течение азотного кормления и с содержанием кислорода 10% впоследствии, PTA-10208 формировал 105 г/л сухого веса клеток после 168 ч культивирования в ферментере объемом 2000 л. Содержание липидов составило 46.4 г/л, омега-3 - 33 г/л, ЭПК - 10.7 г/л и ДГК - 20.3 г/л. Содержание жирных кислот составило 43.9% от общего веса, содержание ЭПК составило 24% МЭЖК и содержание ДГК составило 43.7% МЭЖК. Продукция липидов составила 6.6 г/л в сутки, и продукция омега-3 составила 4.7 г/л в сутки при этих условиях, с продукцией ЭПК 1.5 г/л в сутки и продукцией ДГК 2.9 г/л в сутки.
В культурах с подачей углерода (глюкозы) и азота с содержанием Cl 1000 м.д., при 22.5°C, при pH 7.0, с содержанием кислорода 20% в течение азотного кормления и с содержанием кислорода 10% впоследствии, PTA-10208 формировал 64.8 г/л сухого веса клеток после 168 ч культивирования в ферментере объемом 2000 л. Содержание липидов составило 38.7 г/л, омега-3 - 29.9 г/л, ЭПК - 8.5 г/л и ДГК - 16.7 г/л. Содержание жирных кислот составило 59.6% от общего веса, содержание ЭПК составило 23% МЭЖК и содержание ДГК составило 42.3% МЭЖК. Продукция липидов составила 5.53 г/л в сутки, и продукция омега-3 составила 3.8 г/л в сутки при этих условиях, с продукцией ЭПК 1.2 г/л в сутки и продукцией ДГК 2.3 г/л в сутки.
Пример 3.
Профили жирных кислот штаммов микроорганизмов ATCC PTA-10208 и PTA-10212.
Четыре образца биомассы (PTA-10208 Образец #1; PTA-10208 Образец #2; PTA-10212 Образец #1; и PTA-10212 Образец #2) проанализировали на общее содержание неочищенных масел с помощью экстрагирования растворителем, классы липидов определяли с помощью высокоэффективной жидкостной хроматографии с испарительным детектором светорассеяния (ИДСР) (HPLC/ELSD), триацилглицерин (ТАГ) анализировали с помощью ВЭЖХ/масс-спектрометрии (HPLC/MS) и профили жирных кислот (ЖК) определяли с помощью газовой хроматографии с пламенно-ионизационным детектором детектором (ГХ-ПИД). Содержание неочищенных жиров определяли для каждого замороженного образца биомассы, используя перемалывание с гексаном, и сравнивали с суммарным количеством МЭЖК (мг/г), образованным путем прямой переэтерификации и приводящей к образованию метиловых эфиров жирных кислот (МЭЖК), подсчитанных с помощью ГХ-ПИД. Жирные кислоты, выделенные из неочищенных жиров, также подсчитывали с помощью переэтерификации и с помощью анализа методом ГХ-ПИД образующихся МЭЖК. Весовой процент всех нейтральных жиров (НЖ) и свободных жирных кислот (СЖК) определяли в выделенных неочищенных жирах с помощью ВЭЖХ с нормальной фазой с ИДСР и с помощью масс-спектрометрии с химической ионизацией при атмосферном давлении (APCI-MS). Способ разделяет и определяет количества стериновых эфиров (СЭ), ТАГ, свободных жирных кислот (СЖК), 1,3-диацилглицеринов (1,3-ДАГ), стеринов, 1,2-диацилглицеринов (1,2-ДАГ) и моноацилглицеринов (МАГ). Результаты приведены в табл. 4 и 5 ниже.
ТАГ и фосфолипиды (ФЛ) изолировали из неочищенных масел, выделенных из четырех образцов биомасс (PTA-10208 Образец #1; PTA-10208 Образец #2; PTA-10212 Образец #1; и PTA-10212 Образец #2). ТАГ изолировали, используя флэш-хроматографию с низким давлением, и ФЛ изолировали, используя твердофазную экстракцию (ТФЭ).
- 26 031136
Идентичность каждой из изолированных фракций подтверждали с помощью тонкослойной хроматографии (ТСХ). Профили жирных кислот из изолированных фракций ТАГ и ФЛ были определены после прямой переэтерификации с помощью газового хроматографа с пламенно-ионизационным детектором (ГХ-ПИД) как МЭЖК. Результаты представлены в табл. 6 и 7 ниже.
Общее содержание неочищенных масел и профилей жирных кислот из изолированных классов жиров также определяли для двух дополнительных образцов биомасс из штамма микроорганизмов ATCC PTA-10212 (PTA-10212 Образец #3 и PTA-10212 Образец #4). Неочищенные масла получали из каждого образца путем гексановой экстракции и индивидуальные классы жиров изолировали, используя флэшхроматографию с низким давлением. Профили жирных кислот из биомасс, неочищенные масла и изолированные фракции были определены с помощью ГХ-ПИД как МЭЖК. Результаты приведены в табл. 711 ниже.
Индивидуальные классы липидов изолировали из образца неочищенных масел из штамма микроорганизмов ATCC PTA-10212 (PTA-10212 Образец #5), первоначально выделяя с помощью способа FRIOLEX®, и профили жирных кислот каждого класса определяли помощью ГХ-ПИД как МЭЖК. Результаты приведены в табл. 12 и 13 ниже.
Индивидуальные классы жиров изолировали из образца неочищенных масел из штамма микроорганизмов ATCC PTA-10208 (PTA-10208 Образец #3), используя ВЭЖХ с нормальной фазой с ИДСР и идентификацию с помощью APCI-MS.
Экспериментальные процедуры.
Выделение неочищенных масел - неочищенные масла выделяли из образцов замороженной сухой биомассы, используя растворяющее измельчение. Например, примерно 3 г биомассы взвешивали в Шведской пробирке. В Шведскую пробирку добавляли 3 шарика и 30 мл гексана, которую запечатывали неопреновой пробкой и помещали в шейкер на 2 ч. Полученную суспензию фильтровали через воронку Бюхнера и фильтровальную бумагу Whatman. Отфильтрованную жидкость собирали, растворитель уда ляли под вакуумом и оставшееся количество неочищенных жиров определяли гравиметрически.
Анализ жирных кислот - образцы биомассы, выделенные неочищенные жиры и изолированные классы жиров анализировали на состав жирных кислот как МЭЖК. Коротко, замороженные сухие биомассы и классы изолированных жиров взвешивали прямо в завинчивающихся крышках тестовых пробирок, в то время как образцы неочищенных масел растворяли в гексане, доводя концентрацию примерно до 2 мг/мл. В каждую пробирку добавляли толуол, содержащий внутренний стандарт, и 1.5 H HCl в метаноле. Пробирки перемешивали на вортексе (вихревой мешалке), затем закрывали и нагревали до 100°C в течение 2 ч. Пробирки охлаждали и добавляли водонасыщенный NaCl. Пробирки перемешивали на вортексе снова и центрифугировали, позволяя слоям разделиться. Часть органического слоя, затем, переносили в сосуд для ГХ и анализировали с помощью ГХ-ПИД. Определяли количество МЭЖК, используя калибровочную кривую с 3 точками, построенную с помощью стандарта Nu-Check-Prep GLC Reference Standard (NuCheck, Elysian, MN). Жирные кислоты, присутствующие в экстракте, выражали в мг/г и весовом проценте. Содержание жира в образцах оценивали при условии равного ответа на внутренний стандарт при анализе с помощью ГХ-ПИД.
Метод ВЭЖХ/ИДСР/МС.
Оборудование Agilent 1100 ВЭЖХ, Alltech 3300 ИДСР, Agilent 1100 МС-детектор
Колонка Phenomenex Luna Silica, 250 х 4.6 мм, размер частиц 5 мкм / предохранительная колонка
Подвижная фаза А - 99.5% Гексаны (Omnisolv) 0.4% Изопропиловый спирт (Omnisolv) 0.1% Уксусная кислота В - 99.9% Спирт (Omnisolv, 95:5 Ethanol:IPA) 0.1% Уксусная кислота
Градиент
Время, мин. % А %в
0 100 0
5 100 0
15 85 10
20 0 100
25 0 100
26 100 0
35 100 0
- 27 031136
Температура колонок
Скорость потока Вводимый объем Детекция ИДСР мед
30°С
1.5 мл/мин.
pL
Температура 35°С, газовый поток 1.2 л/мин. диапазон массовых чисел 200 - 1200, Fragmentor 225 V Температура сухого газа 350°С
Температура выпаривания 325°С
Капиллярный вольтаж 3500 V ток короны 10 мкА
Твердофазная экстракция - фракцию ФЛ отделяли от неочищенных жиров с помощью твердофазной экстракции (ТФЭ), используя аминопропиловый катридж объемом весом 2 г (Biotage, Uppsala, Sweden), помещенный в аппарат (Vac Elut Varian Inc, Palo Alto, USA). Картридж обрабатывали 15 мл гексана и ~60 мг каждого образца растворяли в 1 мл CHCl3 и наносили на картридж. Колонку промывали 15 мл раствора 2:1 CHCl3: изопропиловый спирт, чтобы элюировать все нейтральные жиры, которые удаляли. Жирные кислоты затем элюировали 15 мл 2% уксусной кислоты (HOAc) в эфире, который удаляли. Фракцию ФЛ элюировали 15 мл раствора 6:1 метанол: хлороформ, собирали, высушивали под азотом и взвешивали.
Флэш-хроматография - флэш-хроматографию использовали, чтобы разделить классы жиров, представленных в неочищенных маслах. Примерно 200 мг неочищенных масел, растворенных в гексане, вводили в головку колонки. В хроматографической системе использовали Silica Gel 60 (EMD Chemical, Gibbstown, NJ) с подвижной фазой, включающей петролейный эфир и этил ацетат при 5 мл/мин (табл. 67) или 3 мл/мин (табл. 8-13). Градиентный шаг использовали, чтобы селективно элюировать каждый класс жиров из колонки. Подвижная фаза градиента начиналась со 100% петролейного эфира и заканчивалась 50% этил ацетатом. Фракции собирали в тестовые пробирки объемом 10 мл, используя крупнодонный коллектор фракций Gilson FC 204 (Gilson, Inc., Middleton, WI). Каждую пробирку анализировали с помощью тонкослойной хроматографии (ТСХ) и пробирки, содержавшие индивидуальные классы жиров (если судить по одиночным пятнам на ТСХ чашке с ожидаемым фактором удерживания (retention factor, Rf)) объединяли, концентрировали высушиванием и взвешивали. Общее содержание фракции затем определяли гравиметрически.
Анализ с помощью ТСХ - тонкослойную хроматографию проводили на чашках силикогеля. Чашки элиюровали, используя систему растворителей, состоящую из петролейного эфира: этилового эфира: уксусной кислоты (80:20:1) и проявляли, используя пары йода. Значения Rf каждого пятна затем сравнивали с известными из литературы значениями для каждого класса жиров.
Анализ фракций ТАГ и ФЛ - изолированные фракции ТАГ и ФЛ анализировали на состав жирных кислот как метиловые эфиры ирных кислот (МЭЖК). Фракции ТАГ растворяли в гексане, чтобы получить концентрацию примерно 1-2 мг/мл. По 1 мл аликвот растворов концентрировали с помощью высушивания азотом. Толуол, содержащий внутренний стандарт, и 1.5 HCl в метаноле добавляли в каждую пробирку. Пробирки перемешивали на вортексе, затем закрывали и нагревали до 100°C в течение 2 ч.
Внутренний стандарт и HCl метанол добавляли непосредственно в пробирки, содержащие фракцию ФЛ, и нагревали. Пробирки остужали и добавляли водонасыщенный NaCl. Пробирки снова перемешивали на вортексе и центрифугировали, позволяя слоям разделиться. Часть органического слоя затем помещали в сосуд для ГХ и анализировали с помощью ГХ-ПИД. МЭЖК определяли количественно с помощью калибровочной кривой по трем точкам, полученной с помощью стандарта Nu-Check-Prep GLC 502В Reference Standard (NuCheck, Elysian, MN). Жирные кислоты, присутствующие в экстракте, выражали в мг/г и как % МЭЖК.
Результаты.
PTA-10208 Образец #1.
Биомассы профилей жирных кислот и выделенные неочищенные жиры из PTA-10208 Образец #1 определяли с помощью ГХ/ПИД. Жирные кислоты в биомассе, переэтерифицировали in situ, взвешивая 28.6 мг биомассы непосредственно в МЭЖК пробирку, в то время как пробы выделенных неочищенных жиров готовили, взвешивая 55.0 мг неочищенных жиров в объемную колбу объемом 50 мл, и переносили 1 мл в отдельную МЭЖК пробирку. Расчетное содержание неочищенных жиров в биомассе определили как 53.2% (как сумма МЭЖК), используя ГХ с ПИД, в то время как 52.0% в/в жиров выделяли из сухой биомассы, получая 97.8% всех восстановленных жиров. Неочищенные липиды определяли как 91.9% жирных кислот (как сумма МЭЖК), используя ГХ/ПИД. Мажорные жирные кислоты, содержащиеся в неочищенных жирах, были C16:0 (182.5 мг/г), C20:5 n-3 (186.8 мг/г) и C22:6 n-3 (423.1 мг/г).
Классы профилей жиров, выделенных из неочищенных жиров, определяли, взвешивая 55.0 мг неочищенных жиров в объемную колбу объемом 50 мл, и переносили аликвоты в сосуд для ВЭЖХ для проведения ВЭЖХ/ИДСР/МС. В соответствии с анализом ВЭЖХ/ИДСР/МС неочищенные жиры содержали 0.2% стериновых эфиров (СЭ), 95.1% ТАГ, 0.4% стеринов и 0.5% 1,2-диацилглицеринов (ДАГ). 5% фракции ТАГ содержало пик, который элюировался непосредственно после пика ТАГ, но не давал узнаваемый масс-спектр.
Изолированные из проб ТАГ, также были определены с помощью флэш-хроматографии, давая при
- 28 031136 мерно 92.4% неочищенных масел. PL не определяли взвешиванием или ТСХ после ТФЭ изоляции. Мажорные жирные кислоты (>50 мг/г), содержавшиеся в ТАГ, были C16:0 (189 мг/г), C20:5 n-3 (197 мг/г) и C22:6 n-3 (441 мг/г).
PTA-10208 Образец #2.
Биомассы профилей жирных кислот и выделенные неочищенные жиры из PTA-10208 Образец #2 определяли с помощью ГХ/ПИД. Жирные кислоты в биомассе, переэтерифицировали in situ, взвешивая 32.0 мг биомассы непосредственно в МЭЖК пробирку, в то время как пробы выделенных неочищенных жиров готовили, взвешивая 55.0 мг неочищенных жиров в объемную колбу объемом 50 мл, и переносили 1 мл в отдельную МЭЖК пробирку. Расчетное содержание неочищенных жиров в биомассе определили как 52.4% (как сумма МЭЖК), используя ГХ с ПИД-детекцией, в то время как 48.0% (в/в) жиров выделяли из сухой биомассы, получая 91.7% всех восстановленных жиров. Неочищенные липиды определяли как 95.3% жирных кислот (как сумма МЭЖК), используя ГХ/ПИД. Мажорные жирные кислоты, содержащиеся в неочищенных жирах, были C16:0 (217.5 мг/г), C20:5 n-3 (169.3 мг/г) и C22:6 n-3 (444.1 мг/г).
Классы профилей жиров, выделенных из неочищенных жиров, определяли, взвешивая 60.1 мг неочищенных жиров в объемную колбу объемом 50 мл, и переносили аликвоты в сосуд для ВЭЖХ для проведения ВЭЖХ/ИДСР/МС. В соответствии с анализом ВЭЖХ/ИДСР/МС неочищенные жиры содержали 0.2% SE, 95.7% ТАГ, 0.3% стеринов и 0.7% 1,2-диацилглицеринов (ДАГ). 5.1 % фракции ТАГ содержало пик, который элюировался непосредственно после пика ТАГ, но не давал узнаваемый массспектр.
Изолированные из проб ТАГ давали примерно 93.9% неочищенных масел. PL не определяли взвешиванием или ТСХ после ТФЭ изоляции. Мажорные жирные кислоты (>50 мг/г), содержавшиеся в ТАГ, были C16:0 (218 мг/г), C20:5 n-3 (167 мг/г) и C22:6 n-3 (430 мг/г).
PTA-10208 Образец #3.
Образец неочищенных масел из микроорганизма, депонированного в ATCC под номером PTA10208 (Образец PTA-10208 #3), анализировали, используя ВЭжХ/ИДСР/MS. 98.38% общих жиров восстановили с рассчитанной фракцией стериновых эфиров 0.32%, с рассчитанной фракцией ТАГ 96.13%, с рассчитанной фракцией 1,3-диацилглицеринов (ДАГ) 0,22%, с рассчитанной фракцией 1,2-ДАГ 0.78% и с рассчитанной стеринов 0.93%.
PTA-10212 Образец #1.
Биомассы профилей жирных кислот и выделенные неочищенные жиры из PTA-10212 Образец #1 определяли с помощью ГХ/ПИД. Жирные кислоты в биомассе переэтерифицировали in situ, взвешивая 27.0 мг биомассы непосредственно в МЭЖК пробирку, в то время как пробы выделенных неочищенных жиров готовили, взвешивая 52.5 мг неочищенных жиров в объемную колбу объемом 50 мл, и переносили 1 мл в отдельную МЭЖК пробирку. Расчетное содержание неочищенных жиров в биомассе определили как 38.3% (как сумма МЭЖК), используя ГХ с ПИД-детекцией, в то время как 36.3% (в/в) жиров выделяли из сухой биомассы, получая 94.6% всех восстановленных жиров. Неочищенные липиды определяли как 83.2% жирных кислот (как сумма МЭЖК), используя ГХ/ПИД. Мажорные жирные кислоты, содержащиеся в неочищенных жирах, были C16:0 (328.5 мг/г), C20:5 n-3 (90.08 мг/г) и C22:6 n-3 (289.3 мг/г).
Классы профилей жиров, выделенных из неочищенных жиров, определяли, взвешивая 52.5 мг неочищенных жиров в объемную колбу объемом 50 мл, и переносили аликвоты в сосуд для ВЭЖХ для проведения анализа методом ВЭЖХ/ИДСР/МС. В соответствии с анализом методом ВЭЖХ/ИДСР/МС, неочищенные жиры содержали 0.2% SE, 64.2% ТАГ, 1.9% СЖК, 2.8% 1,3-ДАГ, 1.4% стеринов, 18.8% 1,2-ДАГ и 0.5 % МАГ. 3.4 % фракции ТАГ содержало пик, который элюировался непосредственно после пика ТАГ, но не давал узнаваемый масс-спектр.
Изолированные из проб ТАГ давали примерно 49.8% неочищенных масел. Изолированные PL давали примерно 8.1% неочищенных масел. Мажорные жирные кислоты (>50 мг/г), содержавшиеся в фракции ТАГ, были C16:0 (400 мг/г), C20:5 n-3 (91 мг/г) и C22:6 n-3 (273 мг/г). Мажорные жирные кислоты (>50 мг/г), содержавшиеся в фракции ФЛ, были C16:0 (98 мг/г), C20:5 n-3 (33 мг/г) и C22:6 n-3 (227 мг/г).
PTA-10212 Образец #2.
Биомассы профилей жирных кислот и выделенные неочищенные жиры из PTA-10212 Образец #2 определяли с помощью ГХ/ПИД. Жирные кислоты в биомассе, переэтерифицировали in situ, взвешивая 29.5 мг биомассы непосредственно в МЭЖК пробирку, в то время как пробы выделенных неочищенных жиров готовили, взвешивая 56.5 мг неочищенных жиров в объемную колбу объемом 50 мл, и переносили 1 мл в отдельную МЭЖК пробирку. Расчетное содержание неочищенных жиров в биомассе определили как 40.0% (как сумма МЭЖК), используя ГХ с ПИД-детекцией, в то время как 41.3% (в/в) жиров выделяли из сухой биомассы, получая 106.1% всех восстановленных жиров.
Неочищенные липиды определяли как 82.8% жирных кислот (как сумма МЭЖК), используя ГХ/ПИД. Мажорные жирные кислоты, содержащиеся в неочищенных жирах, были C16:0 (327.3 мг/г), C20:5 n-3 (92.5 мг/г) и C22:6 n-3 (277.6 мг/г).
Классы профилей жиров, выделенных из неочищенных жиров, определяли, взвешивая 56.5 мг неочищенных жиров в объемную колбу объемом 50 мл, и переносили аликвоты в сосуд для ВЭЖХ для проведения анализа методом ВЭЖХ/ИДСР/МС. В соответствии с анализом методом ВЭЖХ/ИДСР/МС,
- 29 031136 неочищенные жиры содержали 0.2% SE, 58.2% ТАГ, 2.3% СЖК, 3.4% 1,3-ДАГ, 1.7% стеринов, 23.4% 1,2-ДАГ и 0.6% МАГ. 3.3 % фракции ТАГ содержало пик, который элюировался непосредственно после пика ТАГ, но не давал узнаваемый масс-спектр.
Изолированные из проб ТАГ давали примерно 51.9% неочищенных масел. Изолированные ФЛ давали примерно 8.8% неочищенных масел. Мажорные жирные кислоты (>50 мг/г), содержавшиеся в указанной фракции ТАГ, были C16:0 (402 мг/г), C20:5 n-3 (92 мг/г) и C22:6 n-3 (245 мг/г). Мажорные жирные кислоты (>50 мг/г), содержавшиеся в указанной фракции ФЛ, были C16:0 (121 мг/г), C20:5 n-3 (48 мг/г) и C22:6 n-3 (246 мг/г).
Таблица 4
Профили жирных кислот биомасс и выделенных неочищенных липидов из PTA-10208 и PTA-10212 (мг/г)
РТА10208 Образе #1 Биомас са РТА10208 Образец #1 Неочищен ные жиры РТА10208 Образе ц #2 Биомас са РТА10208 Образец #2 Неочищен ные жиры РТА10212 Образе ц#1 Биомас са РТА10212 Образец #1 Неочищен ные жиры РТА10212 Образе ц #2 Биомас са РТА10212 Образец #2 Неочищенн ые жиры
Жири ые кисло ты МЭЖК (мг/г) МЭЖК (мг/г) МЭЖК (мг/г) МЭЖК (мг/г) МЭЖК (мг/г) МЭЖК (мг/г) МЭЖК (мг/г) МЭЖК (мг/г)
С12:0 1.47 2.43 1.80 3.14 0.99 1.90 0.87 1.91
С14:0 11.62 20.12 16.72 31.03 5.51 12.91 5.97 13.69
С14:1 0.00 0.00 0.00 0.00 0.00 0.00 0.00 0.00
С15:0 2.43 3.75 3.60 6.22 9.13 20.42 9.39 20.81
С16:0 105.04 182.47 117.72 217.49 145.87 328.45 147.87 327.27
С16:1 0.00 0.00 0.06 0.01 6.26 14.53 7.46 16.89
С18:0 5.37 8.96 4.77 8.37 6.77 15.39 6.77 15.15
С18:1 п-9 0.00 3.26 0.00 3.09 0.03 4.04 0.08 5.87
С18:1 п-7 0.00 0.00 0.00 0.00 0.00 0.00 0.00 0.00
С18:2 п-6 0.00 0.00 0.00 0.00 0.00 0.00 0.00 0.00
С20:0 1.48 1.79 1.40 1.85 1.60 3.09 1.67 3.20
С18:3 п-3 0.00 0.00 0.00 0.00 0.00 0.00 0.00 0.00
С20:1 п-9 0.00 0.00 0.00 0.00 0.00 0.00 0.00 0.00
С18:4 п-3 0.91 1.61 1.10 2.00 2.28 2.56 2.21 2.64
С20:2 п-6 0.00 0.00 0.00 0.00 0.00 0.00 0.00 0.00
С20:3 п-6 0.00 0.00 0.00 0.00 0.00 0.00 0.00 0.00
С22:0 0.10 0.00 0.08 0.00 0.30 0.12 0.35 0.24
С20:4 п-7 0.81 0.45 0.67 0.41 0.00 0.00 0.00 0.00
С20:4 п-6 7.22 12.23 6.84 12.18 1.19 2.26 1.31 2.32
С22:1 п-9 0.00 0.00 0.00 0.00 0.00 0.00 0.00 0.00
С20:4 п-5 0.63 0.52 0.00 0.46 0.00 0.00 0.00 0.00
С20:4 п-3 3.45 5.45 3.33 5.58 0.00 2.40 0.00 2.34
С20:3 п-3 0.09 0.00 0.11 0.00 0.00 0.00 0.00 0.00
С20:5 107.31 186.83 92.99 169.32 40.32 90.08 43.15 92.54
- 30 031136
п-3
С22:4 п-9 0.00 0.00 0.00 0.00 0.00 0.00 0.00 0.00
С24:0 0.60 0.00 0.52 0.00 2.81 6.83 2.74 6.53
С24:1 п-9 1.55 3.26 0.85 2.04 0.43 1.34 0.42 1.24
С22:5 п-6 9.66 15.84 10.27 17.98 2.42 4.68 2.32 4.21
С22:5 п-3 20.44 35.13 9.92 17.50 2.41 4.94 2.69 5.23
С22:6 п-3 246.98 423.10 245.96 444.08 139.58 289.34 137.35 277.57
Сумм а МЭЖ К 527.15 907.18 518.71 942.75 367.89 805.29 372.63 799.68
Таблица 5
Профили жирных кислот биомасс и выделенных неочищенных липидов из PTA-10208 и PTA-10212 (%)
РТА10208 Образец# 1 Биомасса РТА10208 Образе ц #1 Неочи щенные жиры РТА10208 Образец# 2 Биомасса РТА10208 Образец #2 Неочище иные жиры РТА10212 Образец #1 Биомасса РТА10212 Образец# 1 Неочище иные жиры РТА10212 Образец# 2 Биомасса РТА10212 Образец #2 Неочище иные жиры
Жирн ые кисло ты % мэжк % МЭЖК % МЭЖК % МЭЖК % МЭЖК % МЭЖК % МЭЖК % МЭЖК
С12:0 0.28 0.27 0.35 0.33 0.27 0.24 0.23 0.24
С14:0 2.20 2.22 3.22 3.29 1.50 1.60 1.60 1.71
С14:1 0.00 0.00 0.00 0.00 0.00 0.00 0.00 0.00
С15:0 0.46 0.41 0.69 0.66 2.48 2.54 2.52 2.60
С16:0 19.93 20.11 22.70 23.07 39.65 40.79 39.68 40.93
С16:1 0.00 0.00 0.01 0.00 1.70 1.80 2.00 2.11
С18:0 1.02 0.99 0.92 0.89 1.84 1.91 1.82 1.89
С18:1 п-9 0.00 0.36 0.00 0.33 0.01 0.50 0.02 0.73
С18:1 п-7 0.00 0.00 0.00 0.00 0.00 0.00 0.00 0.00
С18:2 п-6 0.00 0.00 0.00 0.00 0.00 0.00 0.00 0.00
С20:0 0.28 0.20 0.27 0.20 0.43 0.38 0.45 0.40
С18:3 п-3 0.00 0.00 0.00 0.00 0.00 0.00 0.00 0.00
С20:1 п-9 0.00 0.00 0.00 0.00 0.00 0.00 0.00 0.00
- 31 031136
С18:4 п-3 0.17 0.18 0.21 0.21 0.62 0.32 0.59 0.33
С20:2 п-6 0.00 0.00 0.00 0.00 0.00 0.00 0.00 0.00
С20:3 п-6 0.00 0.00 0.00 0.00 0.00 0.00 0.00 0.00
С22:0 0.02 0.00 0.01 0.00 0.08 0.02 0.09 0.03
С20:4 п-7 0.15 0.05 0.13 0.04 0.00 0.00 0.00 0.00
С20:4 п-6 1.37 1.35 1.32 1.29 0.32 0.28 0.35 0.29
С22:1 п-9 0.00 0.00 0.00 0.00 0.00 0.00 0.00 0.00
С20:4 п-5 0.12 0.06 0.00 0.05 0.00 0.00 0.00 0.00
С20:4 п-3 0.65 0.60 0.64 0.59 0.00 0.30 0.00 0.29
С20:3 п-3 0.02 0.00 0.02 0.00 0.00 0.00 0.00 0.00
С20:5 п-3 20.36 20.59 17.93 17.96 10.96 11.19 11.58 11.57
С22:4 п-9 0.00 0.00 0.00 0.00 0.00 0.00 0.00 0.00
С24:0 0.11 0.00 0.10 0.00 0.76 0.85 0.74 0.82
С24:1 п-9 0.29 0.36 0.16 0.22 0.12 0.17 0.11 0.16
С22:5 п-6 1.83 1.75 1.98 1.91 0.66 0.58 0.62 0.53
С22:5 п-3 3.88 3.87 1.91 1.86 0.65 0.61 0.72 0.65
С22:6 п-3 46.85 46.64 47.42 47.10 37.94 35.93 36.86 34.71
Сумм а МЭЖ К% 100 100 100 100 100 100 100 100
Таблица 6
Профили жирных кислот выделенных ТАГ из PTA-10208 и PTA-10212
РТА10208 Образе ц #1 РТА10208 Образе ц #1 РТА10208 Образец #2 РТА10208 Образец #2 РТА10212 Образец# 1 РТА10212 Образе ц#1 РТА10212 Образец #2 РТА10212 Образец# 2
Жирн ые кисло ты мэжк (мг/г) % МЭЖК МЭЖК (мг/г) % МЭЖК МЭЖК (мг/г) % МЭЖК МЭЖК (мг/г) % МЭЖК
С12:0 2.57 0.27 3.35 0.36 0.00 0.00 0.00 0.00
СИЮ 21.07 2.23 31.37 3.41 14.05 1.61 14.45 1.69
С14:1 0.00 0.00 0.00 0.00 0.00 0.00 0.00 0.00
С15:0 3.89 0.41 6.17 0.67 23.27 2.66 23.14 2.71
С16:0 189.28 20.07 218.78 23.75 399.51 45.75 402.43 47.07
- 32 031136
C16:l 0.00 0.00 0.00 0.00 15.23 1.74 17.62 2.06
С18:0 9.21 0.98 8.07 0.88 22.70 2.60 23.10 2.70
С18:1 п-9 3.35 0.36 3.64 0.40 6.12 0.70 7.48 0.87
С18:1 п-7 0.00 0.00 0.00 0.00 <0.1 <0.1 <0.1 <0.1
С18:2 п-6 0.00 0.00 0.00 0.00 0.00 0.00 0.00 0.00
С20:0 1.86 0.20 1.55 0.17 4.76 0.55 5.32 0.62
С18:3 п-3 0.00 0.00 0.00 0.00 0.00 0.00 0.00 0.00
С20:1 п-9 0.00 0.00 0.00 0.00 0.00 0.00 0.00 0.00
С18:4 п-3 1.64 0.17 2.00 0.22 2.25 0.26 2.24 0.26
С20:2 п-6 0.00 0.00 0.00 0.00 0.00 0.00 0.00 0.00
С20:3 п-6 0.00 0.00 0.00 0.00 0.00 0.00 0.00 0.00
С22:0 0.00 0.00 0.00 0.00 0.55 0.06 0.89 0.10
Unknown 0.00 0.00 0.00 0.00 0.00 0.00 0.00 0.00
С20:4 п-7 0.39 0.04 0.05 0.01 0.00 0.00 0.00 0.00
С20:3 п-3 0.00 0.00 0.00 0.00 0.00 0.00 0.00 0.00
С20:4 п-6 12.79 1.36 11.82 1.28 2.33 0.27 2.25 0.26
С22:1 п-9 0.00 0.00 0.00 0.00 0.00 0.00 0.00 0.00
С20:4 п=5 0.39 0.04 0.07 0.01 0.00 0.00 0.00 0.00
С20:4 п-3 5.52 0.59 5.09 0.55 2.87 0.33 2.98 0.35
С20:5 п-3 197.14 20.90 166.68 18.10 91.17 10.44 91.78 10.74
С24:0 0.00 0.00 0.00 0.00 6.93 0.79 7.36 0.86
С22:4 п-9 0.00 0.00 0.00 0.00 0.00 0.00 0.00 0.00
С24:1 п-9 1.08 0.11 <0.1 <0.1 0.00 0.00 0.00 0.00
С22:5 п-6 15.88 1.68 16.57 1.80 4.01 0.46 3.39 0.40
С22:5 п-3 36.05 3.82 16.00 1.74 4.53 0.52 5.07 0.59
С22:6 п-3 440.99 46.76 429.83 46.67 273.02 31.26 245.38 28.70
Сумм а 943.11 - 921.03 - 873.31 - 854.89 -
Общи й% МЭЖ К - 100.00 - 100.00 - 100.00 - 100.00
- 33 031136
Таблица 7
Профили жирных кислот выделенных ФЛ из PTA-10212
РТА-10212 Образец #1 РТА-10212 Образец# 1 РТА-10212 Образец #2 РТА-10212 Образец #2
Жирные кислоты МЭЖК (мг/г) % МЭЖК МЭЖК (мг/г) % МЭЖК
С12:0 0.00 0.00 0.00 0.00
С14:0 0.93 0.22 1.89 0.39
С14:1 0.00 0.00 0.00 0.00
С15.0 3.44 0.82 5.07 1.05
С16:0 98.29 23.50 120.98 25.00
С16:1 1.15 0.27 3.07 0.63
С18:0 3.25 0.78 3.72 0.77
С18:1 п-9 1.12 0.27 0.95 0.20
С18:1 п-7 <0.1 <0.1 0.02 0.003
С18:2п-6 0.00 0.00 0.00 0.00
С20:0 <0.1 <0.1 <0.1 <0.1
С18:3 п-3 0.00 0.00 0.00 0.00
С20:1 п-9 0.00 0.00 0.00 0.00
С18:4п-3 3.71 0.89 3.24 0.67
С20:2 п-6 0.00 0.00 0.00 0.00
С20:3 п-6 0.00 0.00 0.00 0.00
С22:0 0.00 0.00 0.00 0.00
Неизвестн ый 42.33 10.12 44.71 9.24
С20:4 п-7 0.00 0.00 0.00 0.00
С20:3 п-3 0.00 0.00 0.00 0.00
С20:4 п-6 0.84 0.20 1.54 0.32
С22:1 п-9 0.00 0.00 0.00 0.00
С20:4 п-5 0.00 0.00 0.00 0.00
С20:4 п-3 <0.1 <0.1 0.27 0.06
С20:5 п-3 33.39 7.98 47.91 9.90
С24:0 <0.1 <0.1 0.01 0.001
С22:4 п-9 0.00 0.00 0.00 0.00
С24:1 п-9 0.00 0.00 0.00 0.00
С22:5 п-6 3.08 0.74 3.82 0.79
С22:5 п-3 <0.1 <0.1 0.66 0.14
С22:6 п-3 226.68 54.20 246.09 50.85
Сумма МЭЖК 418.21 - 483.94 -
Общий% МЭЖК - 100 - 100
PTA-10212 Образец #3.
Липидное содержание биомассы PTA-10212 Образец #3 оценивали как 34% как сумму МЭЖК и количество неочищенных масел, полученное после экстракции с растворителями, составило 37 вес.%, давая 109% восстановленных жиров, присутствующих в биомассе. После фракционирования с использованием флэш-хроматографии, примерно 46% неочищенных масел изолировали как ТАГ, 28% - изолировали как ДАГ. Неочищенные масла содержали 309 мг/г ДГК и 264 мг/г ЭПК. Изолированный ТАГ содержал 341 мг/г ДГК и 247 мг/г ЭПК. Изолированная фракция ДАГ содержала 262 мг/г ДГК и 237 мг/г ЭПК. Общие профили жирных кислот биомасс, выделенных неочищенных масел и изолированных фракций представлены ниже в табл. 8 и 9, подсчитанные в виде мг/г и % МЭЖК соответственно.
- 34 031136
Таблица 8 Профили жирных кислот биомассы и выделенных неочищенных липидов из PTA-10212 Образец #3 (мг/г)
Биомас са Неочи щенные масла ТАГ ДАГ
Вес % но 37.2% 46.0% 27.9%
Жирные кислоты мэжк (мг/г) МЭЖК (мг/г) МЭЖК (мг/г) МЭЖК (мг/г)
С12:0 0.0 0.0 0.0 0.0
С14:0 3.6 10.3 11.5 9.4
С14:1 0.0 0.0 0.0 0.0
С15:0 4.1 10.6 9.8 6.6
С16:0 70.5 181.8 231.7 111.3
С16:1 6.7 19.1 18.7 17.1
С18:0 2.4 10.2 14.2 0.0
С18:1 п-9 0.0 6.7 0.0 0.0
С18:1 п-7 0.0 1.2 0.0 0.0
С18:2п-6 0.0 1.8 0.0 0.0
С20:0 0.0 2.4 0.0 0.0
С18:3п-3 0.0 0.0 0.0 0.0
С20:1 п-9 0.0 0.3 0.0 1.7
С18:4п-3 1.9 3.4 3.2 4.4
С20:2 п-6 0.0 0.0 0.0 0.0
С20:3 п-6 0.0 0.0 0.0 0.0
С22:0 3.3 0.0 0.0 0.0
С20:4 п-7 0.0 2.1 1.5 0.0
С20:3 п-3 0.0 0.0 0.0 0.0
С20:4 п-6 6.8 17.9 21.4 13.8
С22:1 п-9 0.0 0.0 0.0 0.0
С20:4 п-5 0.0 1.3 1.3 0.0
С20:4 п-3 3.0 8.5 10.9 6.4
С20:5 п-3 102.0 263.6 274.2 237.4
С24:0 0.0 1.7 3.9 0.0
С22:4 п-9 0.0 0.0 0.0 0.0
С24:1 п-9 0.0 0.0 4.2 0.0
С22:5 п-6 3.2 8.3 10.7 6.1
С22:5 п-3 3.8 10.4 15.1 6.6
С22:6 п-3 131.2 309.4 341.1 261.9
Сумма МЭЖК 342.4 871.1 973.2 682.6
- 35 031136
Таблица 9
Профили жирных кислот биомассы и выделенных неочищенных липидов из PTA-10212 Образца #3 (%)
Биомасса Неочищенные масла ТАГ ДАГ
Вес % НО 37.2% 46.0% 27.9%
Жирные кислоты МЭЖК (мг/г) МЭЖК (мг/г) МЭЖК (мг/г) МЭЖК (мг/г)
С12:0 0.0 0.0 0.0 0.0
С14:0 1.1 1.2 1.2 1.4
С14:1 0.0 0.0 0.0 0.0
С15:0 1.2 1.2 1.0 1.0
С16:0 20.6 20.9 23.8 16.3
С16:1 2.0 2.2 1.9 2.5
С18:0 0.7 1.2 1.5 0.0
С18:1 п-9 0.0 0.8 0.0 0.0
С18:1 п-7 0.0 0.1 0.0 0.0
С18:2п-6 0.0 0.2 0.0 0.0
С20:0 0.0 0.3 0.0 0.0
С18:3 п-3 0.0 0.0 0.0 0.0
С20:1 п-9 0.0 0.0 0.0 0.2
С18:4п-3 0.6 0.4 0.3 0.6
С20:2 п-6 0.0 0.0 0.0 0.0
С20:3 п-6 0.0 0.0 0.0 0.0
С22:0 1.0 0.0 0.0 0.0
С20:4 п-7 0.0 0.2 0.2 0.0
С20:3 п-3 0.0 0.0 0.0 0.0
С20:4 п-6 2.0 2.1 2.2 2.0
С22:1 п-9 0.0 0.0 0.0 0.0
С20:4 п-5 0.0 0.1 0.1 0.0
С20:4 п-3 0.9 1.0 1.1 0.9
С20:5 п-3 29.8 30.3 28.2 34.8
С24:0 0.0 0.2 0.4 0.0
С22:4 п-9 0.0 0.0 0.0 0.0
С24:1 п-9 0.0 0.0 0.4 0.0
С22:5 п-6 0.9 1.0 1.1 0.9
С22:5 п-3 1.1 1.2 1.6 1.0
С22:6п-3 38.3 35.5 35.1 38.4
Общий % МЭЖК 100.0 100.0 100.0 100.0
PTA-10212 Образец #4.
PTA-10212 Образец #4 содержал приблизительно 23% жиров, определенных как сумма МЭЖК, из которых 107% было восстановленных с помощью гексановой экстракции. После фракционирования с использованием флэш-хроматографии, примерно 42% неочищенных масел изолировали как ТАГ, 18% изолировали как ДАГ. Неочищенные масла содержали 275 мг/г ДГК и 209 мг/г ЭПК. Изолированный ТАГ содержал 296 мг/г ДГК и 205 мг/г ЭПК. Изолированная фракция ДАГ содержала 245 мг/г ДГК и 219 мг/г ЭПК. Общие профили жирных кислот биомасс, выделенных неочищенных масел и изолированных фракций представлены ниже в табл. 10 (мг/г) и табл. 11 (% МЭЖК).
- 36 031136
Таблица 10
Профили жирных кислот биомассы и выделенных неочищенных липидов из PTA-10212 Образец #4 (мг/г)
Биомасса Неочищенные масла ТАГ ДАГ
Вес % НО 24.7% 42.2% 18.4%
Жирные кислоты МЭЖК (мг/г) МЭЖК (мг/г) МЭЖК (мг/г) МЭЖК (мг/г)
С12:0 0.0 0.0 2.1 2.4
С14:0 2.0 8.3 9.8 9.6
С14:1 0.0 0.0 0.0 0.0
С15:0 4.8 16.8 0.4 0.9
С16:0 63.3 210.6 285.7 138.0
С16:1 1.6 6.7 7.4 7.5
С18:0 2.8 12.2 19.9 4.6
С18:1 п-9 0.0 3.7 0.7 1.1
С18:1 п-7 0.0 0.0 0.3 1.2
С18:2п-6 0.0 0.0 0.0 0.0
С20:0 0.0 3.3 6.0 1.5
С18:3 п-3 0.0 0.0 0.0 0.0
С20:1 п-9 0.0 0.0 0.7 1.2
С18:4п-3 1.4 3.8 3.6 5.0
С20:2 п-6 0.0 0.0 0.0 0.0
С20:3 п-6 0.0 0.0 0.4 0.0
С22:0 1.5 0.0 1.9 0.0
С20:4 п-7 0.0 0.0 0.9 0.6
С20:3 п-3 0.0 0.0 0.0 0.0
С20:4 п-6 2.5 10.1 13.0 10.3
С22:1 п-9 0.0 0.0 0.0 0.0
С20:4 п-5 0.0 0.0 0.8 0.7
С20:4 п-3 1.4 6.3 8.6 6.0
С20:5 п-3 57.6 209.1 205.4 219.0
С24:0 0.0 2.6 0.8 0.0
С22:4 п-9 0.1 0.0 0.0 0.0
С24:1 п-9 0.0 0.0 1.1 0.5
С22:5 п-6 1.4 6.1 7.9 4.5
С22:5 п-3 4.0 15.8 20.8 12.9
С22:6 п-3 87.7 275.0 296.4 244.8
Сумма МЭЖК 232.2 790.1 894.8 672.4
- 37 031136
Таблица 11
Профили жирных кислот биомассы и выделенных неочищенных липидов из PTA-10212 Образец #4 (%)
Биомасса Неочищенные масла ТАГ ДАГ
Вес % НО 24.7% 42.2% 18.4%
Жирные кислоты МЭЖК (мг/г) МЭЖК (мг/г) МЭЖК (мг/г) МЭЖК (мг/г)
С12:0 0.0 0.0 0.2 0.4
С14:0 0.9 1.0 1.1 1.4
С14:1 0.0 0.0 0.0 0.0
С15:0 2.1 2.1 0.0 0.1
С16:0 27.3 26.7 31.9 20.5
С16:1 0.7 0.8 0.8 1.1
С18:0 1.2 1.5 2.2 0.7
С18:1 п-9 0.0 0.5 0.1 0.2
С18:1 п-7 0.0 0.0 0.0 0.2
С18:2п-6 0.0 0.0 0.0 0.0
С20:0 0.0 0.4 0.7 0.2
С18:3п-3 0.0 0.0 0.0 0.0
С20:1 п-9 0.0 0.0 0.1 0.2
С18:4п-3 0.6 0.5 0.4 0.7
С20:2 п-6 0.0 0.0 0.0 0.0
С20:3 п-6 0.0 0.0 0.0 0.0
С22:0 0.6 0.0 0.2 0.0
С20:4 п-7 0.0 0.0 0.1 0.1
С20:3 п-3 0.0 0.0 0.0 0.0
С20:4 п-6 1.1 1.3 1.5 1.5
С22:1 п-9 0.0 0.0 0.0 0.0
С20:4 п-5 0.0 0.0 0.1 0.1
С20:4 п-3 0.6 0.8 1.0 0.9
С20:5 п-3 24.8 26.5 23.0 32.6
С24:0 0.0 0.3 0.1 0.0
С22:4 п-9 0.0 0.0 0.0 0.0
С24:1 п-9 0.0 0.0 0.1 0.1
С22:5 п-6 0.6 0.8 0.9 0.7
С22:5 п-3 1.7 2.0 2.3 1.9
С22:6 п-3 37.8 34.8 33.1 36.4
Общий % МЭЖК 100.0 100.0 100.0 100.0
PTA-10212 Образец #5.
Пробу неочищенных масел выделяли из биомассы PTA-10212, используя способ FRIOLEX® (GEA Westfalia Separator UK Ltd., Milton Keynes, England) для получения микробного масла PTA-10212 Образца #5. Индивидуальные классы жиров изолировали из PTA-10212 Образец #5, используя флэшхроматографию с низким давлением, и определяли весовой процент каждого класса. Профиль жирных кислот каждого класса определяли с помощью ГХ-ПИД.
Коротко, образцы приготавливали, растворяя 240 мг неочищенных масел в 600 мкл гексана, и добавляли в головку колонки. После фракционирования образца с использованием флэш-хроматографии, объединенный вес всех фракций составил 240 мг, давая 100% восстановленных. Рассчитанная фракция стериновых эфиров составила 0.9%, рассчитанная фракция ТАГ - 42.6%, рассчитанная фракция свободных жирных кислот (СЖК) - 1.3%, рассчитанная фракция стеринов - 2.2%, рассчитанная фракция ДАГ 41.6%. Общие профили ирных кислот FRIOLEX® неочищенных масел и изолированных фракций представлены ниже в табл. 12 и 13, подсчитанными в мг/г и % МЭЖК соответственно.
- 38 031136
Таблица 12
Профили жирных кислот неочищенных масел из PTA-10212 Образец #5 (мг/г)
Неочищенные масла ТАГ ДАГ
Вес % но 42.6% 41.6%
Жирные кислоты МЭЖК (мг/г) МЭЖК (мг/г) МЭЖК (мг/г)
С12:0 0 0.7 1.0
С14:0 7.7 7.7 8.5
С14:1 0 0.0 0.0
С15:0 10.3 11.7 9.3
С16:0 179.3 217.7 134.6
С16:1 18.1 16.3 25.9
С18:0 8.1 13.2 2.3
С18:1 п-9 4.7 8.4 0.7
С18:1 п-7 0 1.8 1.0
С18:2п-6 1.8 3.3 0.7
С20:0 1.9 3.6 0.2
С18:3 п-3 0 0.0 0.0
С20:1 п-9 0 0.7 1.0
С18:4п-3 3.1 2.8 3.8
С20:2 п-6 0 0.0 0.0
С20:3 п-6 0 0.6 0.4
С22:0 0 1.5 0.0
С20:4 п-7 0 1.0 0.7
С20:3 п-3 0 0.0 0.0
С20:4 п-6 12.7 16.1 13.6
С22:1 п-9 0 0.0 0.0
С20:4 п-5 0 1.5 0.8
С20:4 п-3 6.5 9.3 6.4
С20:5 п-3 213.3 223.7 252.8
С24:0 2.3 4.4 0.6
С22:4 п-9 0 1.9 0.9
С24:1 п-9 0 0.0 0.0
С22:5 п-6 7.9 9.5 8.3
С22:5 п-3 13 20.6 9.7
С22:6 п-3 305.6 327.4 353.8
Сумма МЭЖК 796.6 905.3 837.4
- 39 031136
Таблица 13
Профили жирных кислот неочищенных масел из PTA-10212 Образец #5 (%)
Неочищен ные масла ТАГ ДАГ
Жирные кислоты % МЭЖК % МЭЖК % МЭЖК
С12:0 0 0.1 0.1
С14:0 1 0.9 1.0
С14:1 0 0.0 0.0
С15:0 1.3 1.3 1.1
С16:0 22.5 24.0 16.1
С16:1 2.3 1.8 3.1
С18:0 1 1.5 0.3
С18:1 п-9 0.6 0.9 0.1
С18:1 п-7 0 0.2 0.1
С18:2п-6 0.2 0.4 0.1
С20:0 0.2 0.4 0.0
С18:3п-3 0 0.0 0.0
С20:1 п-9 0 0.1 0.1
С18:4п-3 0.4 0.3 0.5
С20:2 п-6 0 0.0 0.0
С20:3 п-6 0 0.1 0.0
С22:0 0 0.2 0.0
С20:4 п-7 0 0.1 0.1
С20:3 п-3 0 0.0 0.0
С20:4 п-6 1.6 1.8 1.6
С22:1 п-9 0 0.0 0.0
С20:4 п-5 0 0.2 0.1
С20:4 п-3 0.8 1.0 0.8
С20:5 п-3 26.8 24.7 30.2
С24:0 0.3 0.5 0.1
С22:4 п-9 0 0.2 0.1
С24:1 п-9 0 0.0 0.0
С22:5 п-6 1 1.1 1.0
С22:5 п-3 1.6 2.3 1.2
С22:6п-3 38.4 36.2 42.3
Общий % МЭЖК 100 100 100
Пример 4.
Относительное количество и состав жирных кислот в каждом представленном ТАГ изомере в выделенных неочищенных жирах определяли для каждого из образцов PTA-10208 Образец #1, PTA-10208 Образец #2, PTA-10212 Образец #1, PTA-10212 Образец #2, и PTA-10212 Образец #3, PTA-10212 Образец #4, и PTA-10212 Образец #5 из примера 3 с помощью разделения методом безводной обратнофазовой ВЭЖХ и детекции методом APCI-MS (МС с химической ионизации при атмосферном давлении).
- 40 031136
Метод анализа ТАГ.
Оборудование
Колонка (-ки)
Подвижная фаза
Градиент
Agilent 1100 ВЭЖХ
Agilent 1100 МСД
Две Phenomenex Luna С18 (2), 150 х 4.6 мм, размер частиц 3 мкм, связанных в серию А - Ацетонитрил
В - IP A w/ 0.1% Ацетат Аммония
Время, мин. % А %В
0 80 20
120 20 80
125 20 80
126 80 20
140 80 20
Температура колонок Скорость потока Вводимый объем MSD 20°С 0.5 мл/мин. 5 мкл Массовый ряд 350-1150 Fragmentor 225 V Температура сухого газа 350°С, Температура выпаривания 325°С Капиллярный вольтаж 3500 V ток короны 10 μ А
PTA-10208 Образец #1.
Неочищенные жиры, изолированные из PTA-10208 Образец #1, приготавливали для ТАГ анализа, взвешивая 5.5 мг масла в сосуд для ВЭЖХ и разбавляя 1 мл гексана.
Таблица 14
Идентификация видов ТАГ в PTA-10208 Образец #1
Время удерживания CN Идентификация Площадь процент [М + Н] + |М + ΝΗ4] Мажорные (ДАГ) Фрагменты
41.76 30 ЭПК/ЭПК/ЭПК 1.2 945.8 962.7 643.5
42.97 30 эпк/эпк/дгк 5.4 971.7 988.8 643.4, 669.5
44.17 30 дгк/дгк/эпк 8.8 997.7 1014.7 669.5, 695.5
45.39 30 дгк/дгк/дгк 7.4 1023.7 1040.7 695.5
46.32 32 ДГК/ЭПК/АРК 1.1 973.8 990.8 645.4, 671.5
47.53 32 дгк/дпк/эпк 2.0 999.8 1016.8 671.5,697.5
48.88 32 ДГК/ЭПК/АРК дгк/дгк/дпк 2.6 973.8 1025.7 990.7 1042.8 645.4, 671.5 697.5
50.23 32 дгк/дпк/эпк 1.8 999.8 1016.8 671.5, 697.4
51.47 32 дгк/дпк/дгк 1.5 1025.7 1042.8 695.5, 697.5
54.64 34 ЭПК/14:0/ДГК 1.8 897.7 914.7 569.5, 595.5
55.80 34 ДГК/ДГК/14:0 2.2 923.6 940.8 595.5, 695.5
60.73 36 ЭПК/ЭПК/16:0 3.4 899.7 916.8 597.5, 643.3
61.87 36 ДГК/16:0/ЭПК 11.8 925.8 942.7 597.5, 623.5, 669.5
63.0 36 ДГК/16:0/ДГК 17.7 951.8 968.8 623.5, 695.5
65.47 38 ЭПК/ЭПК/18:0 2.3 927.7 944.8 625.5
66.58 38 ДГК/ДПК/16:0 2.9 953.8 970.8 623.5, 625.5, 697.6
67.31 38 ЭПК/АРК/16:0 1.0 901.7 918.8 597.6, 599.5, 645.4
68.39 38 ДГК/16:0/АРК 2.0 927.7 944.8 625.6
69.52 38 ДГК/16:0/ДПК 2.3 953.8 970.8 623.5, 625.5
70.16 38 ДГК/ДГК/18:0 0.9 979.5 996.7 651.5
73.81 40 ЭПК/16:0/14:0 1.0 825.7 842.7 523.5,569.5,597.5
74.73 40 ДГК/14:0/16:0 1.5 851.7 868.7 523.4, 623.5
80.96 42 ЭПК/16:0/16:0 1.8 853.6 870.8 551.5,597.4
81.93 42 ДГК/16:0/16:0 6.5 879.8 896.8 551.5,623.5
85.50 44 ДПК/16:0/16:0 0.9 881.7 898.8 551.4, 625.4
88.92 44 18:0/16:0/ДГК 0.9 907.9 924.8 579.4, 651.5
PTA-10208 Образец #2.
Неочищенные жиры, изолированные из PTA-10208 Образец #2, приготавливали для ТАГ анализа, взвешивая 5.3 мг масла в сосуд для ВЭЖХ и разбавляя 1 мл гексана.
- 41 031136
Таблица 15
Идентификация видов ТАГ в PTA-10208 Образец #2
Время удерживания CN Идентификация Площадь процент [М + Н] [Μ + NH4] Мажорные (ДАГ) Фрагменты
41.70 30 эпк/эпк/эпк 1.0 945.7 962.8 643.5
42.92 30 эпк/эпк/дгк 4.3 971.7 988.8 643.5, 669.5
44.11 30 дгк/дгк/эпк 6.9 997.8 1014.8 669.5, 695.5
45.33 30 дгк/дгк/дгк 6.2 1023.8 1040.8 695.5
46.26 32 ДГК/ЭПК/АРК 0.5 973.7 990.7 645.4, 671.5
47.47 32 дгк/дпк/эпк 1.1 999.8 1016.8 671.5, 697.5
48.86 32 ДГК/ЭПК/АРК 1.9 973.7 990.8 645.5, 671.5
дгк/дгк/дпк 1025.7 1042.8 697.5
50.16 32 дгк/дпк/эпк 1.5 999.6 1016.9 671.5, 697.4
51.37 32 дгк/дпк/дгк 1.1 1025.7 1042.8 695.5, 697.5
54.57 34 ЭПК/14:0/ДГК 2.0 897.7 914.7 569.5, 595.4
55.78 34 ДГК/ДГК/14:0 2.9 923.6 940.8 595.5, 695.5
60.74 36 ЭПК/ЭПК/16:0 3.1 899.6 916.8 597.5, 643.5
61.94 36 ДГК/16:0/ЭПК 13.00 925.7 942.8 597.5, 623.5, 669.5
63.10 36 ДГК/16:0/ДГК 20.0 951.8 968.8 623.5, 695.5
65.60 38 ЭПК/ЭПК/18:0 1.6 927.7 944.8 625.5
66.71 38 ДГК/ДПК/16:0 2.0 953.7 970.8 623.6, 625.4, 697.6
67.46 38 ДГК/14:0/14:0 1.3 823.5 840.7 495.4, 595.5
ЭПК/АРК/16:0 901.8 918.8 597.6, 599.5, 645.4
68.60 38 ДГК/16:0/АРК 2.0 927.8 944.8 599.5, 623.5, 671.5
69.69 38 ДГК/16:0/ДПК 2.7 953.7 970.8 623.5, 625.5
70.39 38 ДГК/ДГК/18:0 0.7 979.8 996.8 651.5
73.88 40 ЭПК/16:0/14:0 1.1 825.7 842.8 523.5,569.3,597.3
74.94 40 ДГК/14:0/16:0 2.9 851.8 868.7 523.5, 623.5
81.17 42 ЭПК/16:0/16:0 1.9 853.8 870.8 551.5, 597.6
82.16 42 ДГК/16:0/16:0 9.7 879.7 896.7 551.5, 623.5
85.72 44 ДПК/16:0/16:0 0.6 881.7 898.8 551.4, 625.5
89.15 44 18:0/16:0/ДГК 1.2 907.7 924.8 579.4, 651.5
РТА-10212 Образец #1.
Неочищенные жиры, изолированные из PTA-10212 Образец #1, приготавливали для ТАГ анализа, взвешивая 5.3 мг масла в сосуд для ВЭЖХ и разбавляя 1 мл гексана.
- 42 031136
Идентификация видов ТАГ в PTA-10212 Образец #1
Таблица 16
Время удерживания CN Идентификация Площадь процент [М + Н] [M + NH4] + (ДАГ) Фрагменты
43.01 30 эпк/эпк/дгк 1.2 971.7 988.7 643.5 ,669.5
44.24 30 дгк/дгк/эпк 2.6 997.7 1014.8 669.5, 695.4
45.41 30 дгк/дгк/дгк 2.4 1023.8 1040.8 695.5
54.78 34 ДГК/ЭПК/14:0 0.7 897.7 914.8 569.3, 595.4
ДГК/ДГК/16:1 949.7 966.7 621.3, 695.3
59.53 35 ДГК/15:0/ДГК 0.9 937.8 954.8 609.6, 695.5
60.88 36 ЭПК/16:0/ЭПК 1.5 899.7 916.7 597.5, 643.2
62.03 36 ЭПК/16:0/ДГК 8.3 925.8 942.7 597.6, 623.4
63.17 36 ДГК/16:0/ДГК 13.1 951.7 968.8 623.5, 695.5
66.82 38 ДГК/18:0/ЭПК 1.5 953.7 970.8 625.6
68.63 38 ДГК/АРК/16:0 0.7 927.7 944.7 599.5, 623.3, 671.5
69.79 38 ДГК/ДПК/16:0 0.7 953.8 970.8 623.5, 625.5
70.41 38 ДГК/ДГК/18:0 0.7 979.7 996.7 651.5, 695.3
72.79 40 ЭПК/16:0/16:1 0.5 851.7 868.6 549.4
73.82 40 ДГК/18:1/14:0 1.8 877.7 894.7 549.5, 621.5, 623.3
75.00 40 ДГК/16:0/14:0 1.7 851.8 868.8 523.5, 623.5
77.55 41 ЭПК/15:0/16:0 0.8 839.7 856.7 537.5, 583.4
78.59 41 ДГК/16:0/15:0 2.5 865.6 882.8 537.3, 623.5
81.32 42 ЭПК/16:0/16:0 5.5 853.7 870.7 551.5, 597.5
82.19 42 ДГК/16:0/16:0 21.7 879.8 896.7 551.5, 623.5
85.74 43 ДГК/17:0/16:0 2.0 ND 910.7 565.5, 623.5, 637.7
88.23 44 ДПК/16:0/16:0 0.8 881.7 898.8 551.7, 625.5
89.19 44 ДГК/16:0/18:0 3.2 907.9 924.8 579.5, 623.3, 651.5
93.18 46 16:0/16:0/16:1 1.2 ND 822.8 549.5, 551.6
94.57 46 16:0/16:0/14:0 1.1 779.7 796.7 523.4, 551.3
95.91 46 ДГК/12:0/24:0 0.7 935.9 952.8 567.5, 607.6
97.88 47 16:0/16:0/15:0 1.4 ND 810.7 537.5, 551.4
101.14 48 16:0/16:0/16:0 7.5 807.6 824.7 551.5
104.26 49 16:0/16:0/17:0 0.7 ND 838.7 551.4, 565.5
107.35 50 16:0/16:0/18:0 1.7 ND 852.8 551.5, 579.5
108.58 50 ДГК/16:0/24:0 0.7 991.8 1008.9 623.5,663.7, 735.5
113.28 52 16:0/16:0/20:0 0.6 ND 880.9 551.5, 607.4
124.24 56 16:0/16:0/24:0 0.6 ND 936.8 551.5, 663.5
ND=не определено.
РТА-10212 Образец #2.
Неочищенные жиры, изолированные из PTA-10212 Образец #2, приготавливали для ТАГ анализа, взвешивая 3.6 мг масла в сосуд для ВЭЖХ и разбавляя 1 мл гексана.
- 43 031136
Идентификация видов ТАГ в PTA-10212 Образец #2
Таблица 17
Время удерживания CN Идентификация Площадь процент [М + Н] [M + NH4] (ДАГ) Фрагменты
42.99 30 эпк/эпк/дгк 1.4 971.7 988.7 643.4 ,669.5
44.22 30 дгк/дгк/эпк 3.3 997.8 1014.7 669.5, 695.5
45.4 30 дгк/дгк/дгк 2.4 1023.7 1040.8 695.5
54.80 34 ДГК/ЭПК/14:0 0.6 897.7 914.7 569.5
ДГК/ДГК/16:1 ND 966.7 621.3
59.49 35 ДГК/15:0/ДГК 0.5 ND 954.8 609.6
60.83 36 ЭПК/16:0/ЭПК 1.6 899.7 916.6 597.5, 643.3
62.02 36 ЭПК/16:0/ДГК 9.9 925.8 942.7 597.5, 623.5
63.16 36 ДГК/16:0/ДГК 13.0 951.8 968.8 623.6, 695.5
66.8 38 ДГК/18:0/ЭПК 0.7 953.7 970.6 625.5
68.65 38 ДГК/АРК/16:0 0.4 ND 944.8 599.6, 623.4
69.76 38 ДГК/ДПК/16:0 0.4 953.6 970.8 623.5
70.44 38 ДГК/ДГК/18:0 0.3 979.8 996.7 ND
72.74 40 ЭПК/16:0/16:1 0.4 ND 868.6 549.5
73.77 40 ДГК/18:1/14:0 1.6 877.6 894.8 549.5, 621.9
74.97 40 ДГК/16:0/14:0 1.4 851.8 868.7 523.5, 623.7
77.73 41 ЭПК/15:0/16:0 0.3 ND 856.7 537.5
78.53 41 ДГК/16:0/15:0 2.2 865.8 882.7 537.5
81.32 42 ЭПК/16:0/16:0 6.3 853.8 870.8 551.4, 597.5
82.15 42 ДГК/16:0/16:0 22.8 879.7 896.7 551.5, 623.5
85.67 43 ДГК/17:0/16:0 1.6 ND 910.8 565.5
89.08 44 ДПК/16:0/16:0 2.6 ND 898.8 551.5
ДГК/16:0/18:0 907.8 924.8 579.5
93.09 46 16:0/16:0/16:1 0.9 ND 822.8 549.6, 551.3
94.47 46 16:0/16:0/14:0 1.1 ND 796.7 523.5, 551.5
95.78 46 ДГК/12:0/24:0 0.5 ND 952.8 607.5
97.8 47 16:0/16:0/15:0 1.6 ND 810.7 537.3, 551.5
100.99 48 16:0/16:0/16:0 9.5 ND 824.7 551.4
104.11 49 16:0/16:0/17:0 0.6 ND 838.7 551.7, 565.5
107.23 50 16:0/16:0/18:0 2.1 ND 852.8 551.3, 579.5
108.45 50 ДГК/16:0/24:0 0.7 ND 1009.0 663.5
113.11 52 16:0/16:0/20:0 0.5 ND 880.9 551.3, 607.7
124.07 56 16:0/16:0/24:0 0.8 ND 937.0 551.5, 663.5
ND=не определено.
РТА-10212 Образец #3.
Пробу фракции ТАГ PTA-10212 Образец #3 приготавливали в гексане и анализировали с помощью ВЭЖХ/APCI/MS, чтобы определить идентичность индивидуальных ТАГ изомеров.
- 44 031136
Идентификация видов ТАГ в PTA-10212 Образец #3
Таблица 18
Время удерживания CN Идентификация Площадь процент [М + Н] + [Μ + NH4] + (ДАГ) Фрагменты
20.016 1 эпк/эпк/эпк 3.7 945.5 962.7 643.5
20.471 2 эпк/эпк/дгк 8.6 971.6 988.7 643.5, 669.5
20.970 3 дгк/дгк/эпк 6.5 997.7 1014.7 695.5, 669.5
21.441 4 дгк/дгк/дгк 3.7 1023.7 1040.7 695.5
21.855 5 эпк/эпк/дпк 0.7 973.7 990.7 645.3, 671.3
22.107 6 дгк/эпк/дпк ЭПК/ ЭПК /АРК 1.9 999.5 947.5 1016.7 964.6 697.5, 671.4 643.3, 645.3
22.573 7 ЭПК/АРК/ДГК 2.2 973.7 990.7 671.5, 645.5
23.057 8 дгк/эпк/дпк 1.4 999.6 1016.7 696.5, 671.4
23.548 9 ДГК/ДГК/ДПК ДГК/14:0/ЭПК 0.8 1025.7 897.7 1042.7 914.7 695.5, 697.5 569.4, 595.3
24.034 10 ДГК/16:1/ЭПК 1.2 923.5 940.7 595.5, 621.3
24.306 И ЭПК/16:1/ЭПК 0.7 897.6 914.7 595.3
24.509 12 ДГК/16:1/ДГК 0.8 949.6 966.7 621.3
24.783 13 ДГК/14:0/ДГК 0.5 923.7 940.8 595.5
25.571 14 ЭПК/15:0/ДГК 1.0 911.7 928.7 583.4, 609.4
26.026 15 ДГК/15:0/ДГК 0.7 937.7 954.7 609.3
ή 2U.J / и 16 ^ЛГТТ/· /1 Г .Г\ /^ЛГТТ/· 1 и. V/<71114. Ί Л 899.7 ги ζ: ί yiu. / ст с jy ! .J
26.832 17 ЭПК/16:0/ДГК 14.3 925.7 942.7 597.3, 623.4
27.272 18 ДГК/16:0/ДГК 13.2 951.7 968.7 623.5
27.842 19 ДПК/14:0/АРК 0.5 901.6 918.7 599.4, 623.4
28.048 20 ЭПК/18:0/ЭПК 1.0 927.6 944.7 623.4
28.271 21 ДГК/16:0/АРК 1.0 927.7 944.7 599.5, 623.5
28.564 22 ДПК/16:1/ДПК АРК/16:1/АРК 2.3 953.7 901.8 970.6 918.6 623.5 597.4
29.060 23 ДГК/16:0/АРК 2.6 927.7 944.7 599.3, 625.5
29.381 24 ДГК/18:0/ЭПК 0.8 953.8 970.3 625.4, 651.5
29.512 25 ДГК/16Ю//ДПК 1.0 953.8 970.8 623.4, 625.4
30.654 26 ДГК/16:0/16:1 1.4 877.8 894.7 549.5, 623.5
31.015 27 ДГК/16:0/14:0 0.6 851.7 868.7 523.3, 623.7
32.216 28 ДГК/16:0/15:0 0.8 865.8 882.7 537.5, 623.3
33.063 29 ЭПК/16:0/16:0 4.1 853.5 870.7 551.5, 597.5
33.438 30 ДГК/16:0/16:0 9.7 879.7 896.7 551.5, 623.5
35.518 31 ДПК/16:0/16:0 0.9 881.7 898.7 551.5, ND
35.798 32 ДГК/18:0/16:0 1.3 907.8 924.7 579.4, 651.3
39.578 33 16:0/16:016:0 1.3 ND 824.8 551.5
ЫО=не определено.
РТА-10212 Образец #4.
Пробу фракции ТАГ PTA-10212 Образец #4 приготавливали в гексане и анализировали с помощью ВЭЖХ/APCI/MS, чтобы определить идентичность индивидуальных ТАГ изомеров.
- 45 031136
Таблица 19
Идентификация видов ТАГ в PTA-10212 Образец #4
Время удерживания CN Идентификация Площадь процент [М + Н] + [M + NH4] + (ДАГ) Фрагменты
20.1 1 эпк/ эпк / эпк 2.3 945.5 962.7 643.5
20.6 2 ЭПК/ ЭПК/ДГК 4.4 971.6 988.7 643.5,669.5
21.1 3 ДГК/ДГК/ЭПК 4.7 997.7 1014.7 695.5, 669.5
21.6 4 ДГК/ДГК/ДГК ЭПК/ЭПК/ДПК 4.1 1023.7 973.7 1040.7 990.7 695.5 645.3, 671.3
22.0 5 ЭПК/ЭПК/ДПК 0.2 973.7 990.7 645.3, 671.3
22.3 6 ДГК/ЭПК/ДПК ЭПК/ ЭПК /АРК 1.4 999.5 947.5 1016.7 964.6 697.5, 671.4 645.3
22.7 7 ЭПК/АРК/ДГК 1.1 973.7 990.7 671.5, 645.5
23.2 8 ДГК/ЭПК/ДПК 0.5 999.6 1016.7 696.5,671.4
23.7 9 ДГК/ДПК/ДГК 0.2 1025.8 1043.8 697.7
24.6 10 ДГК/16:1/ДГК 0.3 949.6 966.7 621.3
24.9 И ДГК/14:0/ЭПК 0.4 923.5 940.7 595.4
25.3 12 ЭПК/15:0/ЭПК 0.4 885.5 902.5 583.5
25.7 13 ЭПК/15:0/ДГК 1.0 911.7 928.7 583.4, 609.4
26.2 14 ДГК/15:0/ДГК 0.6 937.7 954.7 609.3
26.6 15 ЭПК/16:0/ЭПК 4.9 899.7 916.7 597.5
27.0 16 ЭПК/16:0/ДГК 12.8 925.7 942.7 597.3, 623.4
27.5 17 ДГК/16:0/ДГК 15.2 951.7 968.7 623.5
28.3 18 ЭПК/18:0/ЭПК 2.0 927.6 944.7 623.4
28.7 19 ДПК/16:1/ДПК АРК/16:1/АРК 2.3 953.7 901.8 970.6 918.6 623.5 597.4
29.3 20 ДГК/16:0/АРК 1.4 927.7 944.7 599.3, 623.4
29.6 21 ДГК/16:0/ДПК 1.5 953.8 970.3 625.4, 651.5
30.0 22 ДГК/18:0/ДГК 0.7 979.7 996.7 651.5
30.9 23 ДГК/16:0/16:1 ЭПК/16:0/16:1 0.7 877.8 825.6 894.7 842.6 549.5, ND 549.5, ND
31.3 24 ДГК/14:0/16:0 0.6 851.7 868.7 523.3, 595.3
32.5 25 ДГК/16:0/15:0 1.5 865.8 882.7 537.5, 623.4
33.4 26 ЭПК/16:0/16:0 4.4 853.5 870.7 551.5, 597.5
33.8 27 ДГК/16:0/16:0 14.5 879.7 896.7 551.5, 623.5
35.0 28 ДПК/16:0/16:0 ДГК/15:0/18:0 2.3 881.6 893.8 898.7 910.7 551.5, 625.5 565.5, ND
35.8 29 ДПК/16:0/16:0 1.3 881.7 898.7 551.5, ND
36.2 30 ДПК/16:0/16:0 ДГК/16:0/18:0 2.6 881.7 907.8 898.7 924.7 551.5,625.5 579.4, 623.5
40.0 31 16:0/16:016:0 3.4 ND 824.8 551.5
42.2 32 16:0/16:0/18:0 0.7 ND 852.8 551.3, 579.5
43.0 33 ДГК/16:0/24:0 0.9 991.7 1008.8 623.3, 663.5
ND не определено.
РТА-10212 Образец #5.
Пробу фракции ТАГ PTA-10212 Образец #5 приготавливали в гексане и анализировали с помощью ВЭЖХ/APCI/MS, чтобы определить идентичность индивидуальных ТАГ изомеров.
- 46 031136
Таблица 20
Идентификация видов ТАГ в PTA-10212 Образец #5
Время удерживания CN Идентификация Площадь процент [М + Н] + [Μ + ΝΗ4] + (ДАГ) Фрагменты
21.0 1 эпк/эпк/эпк 1.7 945.7 962.8 643.5
21.5 2 эпк/эпк/дгк 5.5 971.6 988.7 643.5 ,669.5
22.0 3 дгк/дгк/эпк 7.6 997.7 1014.7 695.5, 669.5
22.5 4 дгк/дгк/дгк 4.5 1023.8 1040.7 695.5
23.0 5 эпк/эпк/дпк 0.5 973.8 990.8 645.5, 671.5
23.3 6 дгк/эпк/дпк ЭПК/ ЭПК /АРК 1.5 999.7 947.6 1016.7 964.8 697.5, 671.5 645.5
23.7 7 ЭПК/АРК/ДГК дгк/дпк/дгк 1.9 973.6 1025.7 990.7 1042.7 671.5, 645.4 695.5, 697.5
24.2 8 дгк/эпк/дпк 1.1 999.7 1016.7 669.5, 671.4, 696.5
24.8 9 дгк/дгк/дпк ДГК/14:0/ЭПК 0.6 1025.7 897.7 1042.9 914.7 695.5, 697.5 595.5
25.3 10 ДГК/16:1/ЭПК 0.7 923.8 940.8 595.5, 621.3
25.6 И ДГК/14:0/ЭПК 0.6 897.7 914.7 569.3, 595.4
25.8 12 ДГК/16:1/ДГК 0.5 949.7 966.7 621.3, 695.5
26.0 13 ДГК/16:1/ЭПК 0.4 923.7 940.8 595.5, 621.3
26.9 14 ЭПК/15:0/ДГК 0.7 911.7 928.7 583.5, 609.3
27.4 15 ДГК/15:0/ДГК 0.7 937.6 954.8 609.3
27.8 16 ЭПК/16:0/ЭПК 4.9 899.7 916.7 597.5
28.2 17 ЭПК/16:0/ДГК 14.3 925.7 942.8 597.5, 623.5
28.7 18 ДГК/16:0/ДГК 12.2 951.7 968.8 623.5
29.3 19 ДПК/14:0/АРК 0.6 901.7 918.8 597.3
29.5 20 ЭПК/18:0/ЭПК 1.5 927.7 944.8 625.5
30.0 21 ДГК/16:0/АРК 3.4 953.7 970.8 623.4
30.6 22 ЭПК/ЭПК/18:0 2.1 927.7 944.7 599.5, 625.5, 669.3
31.0 23 ДГК/18:0/ЭПК 1.7 953.8 970.8 625.4, 651.5
31.3 24 ДГК/18:0/ДГК 0.9 979.7 996.8 651.5, 695.3
31.9 26 16:0/ДГК/14:0 0.8 851.7 868.7 595.5, 623.5
32.3 27 18:1/14:0/ДГК 1.7 877.7 894.7 549.5, 595.5
32.6 28 ДГК/16:0/14:0 0.9 851.8 868.7 523.4, 623.5
33.5 29 ЭПК/15:0/16:0 ДГК/20:0/ЭПК 0.7 839.7 981.7 856.7 998.8 537.5, 583.3 653.5, 679.6
79 П 9Л ЭХ) ΤΤΓΊ/*/1 /2.Л/1 С. Л Д1 IX/ 1 и. V/ 1 J.U 1 -» 1 .Ζ, оиэ. / ООП Ί ΟΟΖ.. / С ОТ С JJ / .Э, UZ.J
34.8 31 ЭПК/16:0/16:0 3.9 853.8 870.7 551.5, 597.5
35.2 32 ДГК/16:0/16:0 10.6 879.7 896.7 551.5, 623.5
36.4 33 ДПК/16:0/16:0 1.5 881.7 898.7 551.5, 625.5
37.4 33 ДПК/16:0/16:0 1.2 881.7 898.7 551.5, 625.5
37.7 34 ДГК/16:0/18:0 1.9 907.7 924.7 579.4
38.4 35 ЭПК/24:0/ДГК 0.5 1037.8 1054.8 709.5,735.6
38.8 36 ДГК/24:0/ДГК 1.0 1064.8 1081.8 735.7
Пример 5.
Неочищенные масла дополнительно обрабатывали переработкой, отбеливанием и дезодорантами, чтобы получить рафинированные масла. Рафинированные масла разводили подсолнечным маслом с высоким содержанием олеиновой кислоты, чтобы получить конечные масла с содержанием ДГК примерно 400 мг/г. Индивидуальные классы липидов изолировали и определяли профили жирных кислот каждого класса с помощью ГХ-ПИД как МЭЖК.
РТА-10208 конечные масла.
Профили жирных кислот конечных масел PTA-10208#1-5 суммированы в табл. 21-22, включая профили связанных изолированных фракций ТАГ (табл. 23-24) и изолированных фракций стеринов/ДАГ (табл. 24-26).
Индивидуальные классы жиров в конечных маслах определяли, используя флэш-хроматографию (табл. 27) и ВЭЖХ с нормальной фазой с ИДСР и подтверждение с помощью APCI-MS (табл. 28).
- 47 031136
Таблица 21
Профили жирных кислот конечных масел PTA-10208 (мг/г)
РТА-10208 Конечное масло #1 РТА-10208 Конечное масло #2 РТА-10208 Конечное масло #3 РТА10208 Конечное масло #4 РТА10208 Конечное масло #5
Жирные кислоты МЭЖК (мг/г) МЭЖК (мг/г) МЭЖК (мг/г) МЭЖК (мг/г) МЭЖК (мг/г)
С12:0 2.5 2.4 2.8 2.7 2.7
С14:0 16.1 14.9 21.0 18.4 17.5
С14:1 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0
С15:0 3.8 3.6 4.4 3.9 3.9
С16:0 192.1 179.1 193.1 184.3 194.6
С16:1 0.4 0.5 0.5 0.5 0.5
С17:0 0.6 0.5 0.9 0.8 2.1
С18:0 12.8 13.9 11.5 12.3 12.9
С18:1 п-9 23.5 82.0 25.7 26.0 29.5
С18:1 п-7 0.2 0.7 0.1 0.1 0.1
С18:2п-6 3.7 8.1 4.0 4.1 4.3
С20:0 4.3 4.1 3.7 4.0 4.0
С18:3 п-3 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0
С20:1 п-9 <0.1 0.1 <0.1 <0.1 <0.1
С18:4п-3 2.4 2.5 2.8 2.7 2.8
С20:2 п-6 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0
С20:3 п-6 0.2 0.1 0.1 0.1 0.1
С22:0 1.2 1.8 1.0 1.1 1.1
С20:4 п-7 1.7 1.6 1.7 1.8 1.6
С20:3 п-3 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0
С20:4 п-6 12.9 12.1 13.5 13.5 13.3
С22:1 п-9 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0
С20:4 п-5 1.6 1.4 1.5 1.7 1.5
С20:4 п-3 6.0 5.7 6.0 6.0 6.1
С20:5 п-3 173.8 163.3 196.4 209.6 197.9
С24:0 1.4 1.6 1.3 1.3 1.0
С22:4 \п-9 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0
С24:1 п-9 3.4 3.2 2.3 2.6 2.3
С22:5 п-6 14.9 14.0 14.4 13.0 12.9
С22:5 п-3 43.9 41.3 32.8 40.3 36.9
С22:6 п-3 394.8 373.7 373.2 374.3 364.2
Сумма МЭЖК 918.1 932.2 914.7 925.1 914.1
- 48 031136
Профили жирных кислот конечных масел PTA-10208 (%)
Таблица 22
РТА-10208 Конечное масло #1 РТА-10208 Конечное масло #2 РТА-10208 Конечное масло #3 РТА10208 Конечное масло #4 РТА10208 Конечное масло #5
Жирные кислоты % МЭЖК % МЭЖК % МЭЖК % МЭЖК % МЭЖК
С12:0 0.3 0.3 0.3 0.3 0.3
С14:0 1.8 1.6 2.3 2.0 1.9
С14:1 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0
С15:0 0.4 0.4 0.5 0.4 0.4
С16:0 20.9 19.2 21.1 19.9 21.3
С16:1 <0.1 <0.1 <0.1 <0.1 0.1
С17:0 0.1 0.1 0.1 0.1 0.2
С18:0 1.4 1.5 1.3 1.3 1.4
С18:1 п-9 2.6 8.8 2.8 2.8 3.2
С18:1 п-7 <0.1 0.1 <0.1 <0.1 <0.1
С18:2п-6 0.4 0.9 0.4 0.4 0.5
С20:0 0.5 0.4 0.4 0.4 0.4
С18:3 п-3 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0
С20:1 п-9 <0.1 <0.1 <0.1 <0.1 <0.1
С18:4п-3 0.3 0.3 0.3 0.3 0.3
С20:2 п-6 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0
С20:3 п-6 <0.1 <0.1 <0.1 <0.1 <0.1
С22:0 0.1 0.2 0.1 0.1 0.1
С20:4 п-7 0.2 0.2 0.2 0.2 0.2
С20:3 п-3 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0
С20:4 п-6 1.4 1.3 1.5 1.5 1.5
С22:1 п-9 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0
С20:4 \п-5 0.2 0.2 0.2 0.2 0.2
С20:4 \п-3 0.7 0.6 0.7 0.7 0.7
С20:5 п-3 18.9 17.5 21.5 22.7 21.6
С24:0 0.1 0.2 0.1 0.1 0.1
С22:4 п-9 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0
С24:1 п-9 0.4 0.3 0.2 0.3 0.2
С22:5 п-6 1.6 1.5 1.6 1.4 1.4
С22:5 п-3 4.8 4.4 3.6 4.4 4.0
С22:6 п-3 43.0 40.1 40.8 40.5 39.9
- 49 031136
Таблица 23
Профили жирных кислот изолированных ТАГ конечных масел РТА-10208 (мг/г)
РТА-10208 Конечное масло #1 РТА-10208 Конечное масло #2 РТА-10208 Конечное масло #3 РТА10208 Конечное масло #4 РТА10208 Конечное масло #5
Жирные кислоты МЭЖК (мг/г) МЭЖК (мг/г) МЭЖК (мг/г) МЭЖК (мг/г) МЭЖК (мг/г)
С12:0 2.5 2.3 2.7 2.5 2.6
С14:0 16.3 15.1 21.3 18.6 18.1
С14:1 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0
С15:0 3.9 3.6 4.4 4.0 4.0
С16:0 194.2 181.9 196.1 186.1 199.8
С16:1 0.4 0.4 0.6 0.5 0.7
С17:0 0.6 0.5 0.9 0.8 0.8
С18:0 12.9 14.2 11.7 12.5 13.2
С18:1 п-9 24.3 84.0 26.8 26.1 34.0
С18:1 п-7 0.1 0.7 0.1 0.1 0.3
С18:2 п-6 3.2 7.7 3.4 3.5 4.0
С20:0 4.4 4.2 3.8 4.0 4.2
С18:3 п-3 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0
С20:1 п-9 <0.1 0.2 <0.1 <0.1 0.1
С18:4п-3 2.5 2.4 2.8 2.6 2.7
С20:2 п-6 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0
С20:3 п-6 0.2 0.2 0.1 0.1 0.1
С22:0 1.2 1.9 1.0 1.1 1.1
С20:4 п-7 1.7 1.6 1.8 1.8 1.7
С20:3 п-3 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0
С20:4 п-6 13.2 12.3 13.8 13.7 13.8
С22:1 п-9 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0
С20:4 п-5 1.6 1.5 1.6 1.7 1.5
С20:4 п-3 6.1 5.7 6.1 5.9 6.2
С20:5 п-3 176.0 166.1 199.0 211.2 204.2
С24:0 1.2 1.3 1.0 1.1 1.2
С22:4 п-9 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0
С24:1 п-9 3.3 3.2 2.2 2.5 2.4
С22:5 п-6 15.0 14.2 14.7 13.2 13.5
С22:5 п-3 44.4 42.0 33.3 40.5 38.3
С22:6 п-3 397.9 378.4 376.4 375.5 375.5
Сумма МЭЖК 926.9 945.7 925.5 929.6 944.1
- 50 031136
Таблица 24
Профили жирных кислот изолированных ТАГ конечных масел PTA-10208 (%)
РТА-10208 Конечное масло #1 РТА-10208 Конечное масло #2 РТА-10208 Конечное масло #3 РТА10208 Конечное масло #4 РТА10208 Конечное масло #5
Жирные кислоты % МЭЖК % МЭЖК % МЭЖК % МЭЖК % МЭЖК
С12:0 0.3 0.2 0.3 0.3 0.3
С14:0 1.8 1.6 0.3 0.3 0.3
С14:1 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0
С15-.0 0.4 0.4 0.5 0.4 0.4
С16:0 20.9 19.2 21.2 20.0 21.2
С16:1 <0.1 <0.1 0.1 0.1 0.1
С17:0 0.1 0.1 0.1 0.1 0.1
С18:0 1.4 1.5 1.3 1.3 1.4
С18:1 п-9 2.6 8.9 2.9 2.8 3.6
С18:1 п-7 <0.1 0.1 <0.1 <0.1 <0.1
С18:2п-6 0.3 0.8 0.4 0.4 0.4
С20:0 0.5 0.4 0.4 0.4 0.4
С18:3п-3 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0
С20:1 п-9 <0.1 <0.1 <0.1 <0.1 <0.1
С18:4п-3 0.3 0.3 0.3 0.3 0.3
С20:2 п-6 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0
С20:3 п-6 <0.1 <0.1 <0.1 <0.1 <0.1
С22:0 0.1 0.2 0.1 0.1 0.1
С20:4 п-7 0.2 0.2 0.2 0.2 0.2
С20:3 п-3 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0
С20:4 п-6 1.4 1.3 1.5 1.5 1.5
С22:1 п-9 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0
С20:4 п-5 0.2 0.2 0.2 0.2 0.2
С20:4 п-3 0.7 0.6 0.7 0.6 0.7
С20:5 п-3 19.0 17.6 21.5 22.7 21.6
С24:0 0.1 0.1 0.1 0.1 0.1
С22:4 п-9 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0
С24:1 п-9 0.4 0.3 0.2 0.3 0.3
С22:5 п-6 1.6 1.5 1.6 1.4 1.4
С22:5 п-3 4.8 4.4 3.6 4.4 4.1
С22:6п-3 42.9 40.0 40.7 40.4 39.8
- 51 031136
Таблица 25
Профили жирных кислот изолированных стеринов/ДАГ конечных масел PTA-10208 (мг/г)
РТА-10208 Конечное масло #1 РТА-10208 Конечное масло #2 РТА-10208 Конечное масло #3 РТА10208 Конечное масло #4 РТА10208 Конечное масло #5
Жирные кислоты МЭЖК (мг/г) МЭЖК (мг/г) МЭЖК (мг/г) МЭЖК (мг/г) МЭЖК (мг/г)
С12:0 1.9 2.1 2.9 2.1 1.9
С14:0 9.9 9.5 9.7 10.3 8.0
С14:1 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0
С15-.0 2.4 2.3 2.2 2.3 2.0
С16:0 132.6 128.6 110.1 116.8 106.4
С16:1 0.2 0.3 <0.1 0.3 0.4
С17:0 0.3 0.2 0.3 0.3 0.3
С18:0 7.3 8.1 6.4 6.8 6.1
С18:1 п-9 15.0 55.1 47.4 19.0 30.1
С18:1 п-7 0.4 0.7 0.1 <0.1 0.2
С18:2п-6 13.1 16.7 21.6 13.5 18.4
С20:0 2.0 2.1 1.2 1.8 1.4
С18:3п-3 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0
С20:1 п-9 <0.1 <0.1 <0.1 <0.1 <0.1
С18:4п-3 2.3 2.4 2.4 2.4 2.0
С20:2 п-6 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0
С20:3 п-6 <0.1 <0.1 <0.1 <0.1 <0.1
С22:0 0.6 1.0 0.5 0.6 0.5
С20:4 п-7 0.8 0.9 2.1 0.9 0.7
С20:3 п-3 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0
С20:4 п-6 5.7 5.8 4.8 6.1 4.5
С22:1 п-9 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0
С20:4 п-5 <0.1 <0.1 <0.1 0.6 <0.1
С20:4 п-3 2.7 2.7 2.1 2.7 2.0
С20:5 п-3 92.9 94.5 91.9 111.6 84.8
С24:0 1.2 1.3 1.1 1.1 1.3
С22:4 п-9 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0
С24:1 п-9 1.9 2.0 1.2 1.5 1.2
С22:5 п-6 7.8 8.0 6.7 7.0 5.5
С22:5 п-3 22.2 22.9 13.9 20.7 14.2
С22:6п-3 246.3 252.7 223.5 240.3 196.3
Sum of МЭЖК 569.3 619.8 552.1 568.7 488.2
- 52 031136
Таблица 26
Профили жирных кислот изолированных стеринов/ДАГ конечных масел PTA-10208 (%)
РТА-10208 Конечное масло #1 РТА-10208 Конечное масло #2 РТА-10208 Конечное масло #3 РТА10208 Конечное масло #4 РТА10208 Конечное масло #5
Жирные кислоты % МЭЖК % МЭЖК % МЭЖК % МЭЖК % МЭЖК
С12:0 0.3 0.3 0.5 0.4 0.4
С14:0 1.7 1.5 1.8 1.8 1.6
С14:1 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0
С15:0 0.4 0.4 0.4 0.4 0.4
С16:0 23.3 20.8 19.9 20.5 21.8
С16:1 <0.1 <0.1 <0.1 <0.1 0.1
С17:0 0.0 0.0 0.1 0.1 0.1
С18:0 1.3 1.3 1.2 1.2 1.2
С18:1 п-9 2.6 8.9 8.6 3.3 6.2
С18:1 п-7 0.1 0.1 <0.1 <0.1 <0.1
С18:2п-6 2.3 2.7 3.9 2.4 3.8
С20:0 0.4 0.3 0.2 0.3 0.3
С18:3 п-3 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0
С20:1 п-9 <0.1 <0.1 <0.1 <0.1 <0.1
С18:4п-3 0.4 0.4 0.4 0.4 0.4
С20:2 п-6 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0
С20:3 п-6 <0.1 <0.1 <0.1 <0.1 <0.1
С22:0 0.1 0.2 0.1 0.1 0.1
С20:4 п-7 0.1 0.1 0.4 0.2 0.1
С20:3 п-3 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0
С20:4 п-6 1.0 0.9 0.9 1.1 0.9
С22:1 п-9 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0
С20:4 п-5 <0.1 <0.1 <0.1 0.1 <0.1
С20:4 п-3 0.5 0.4 0.4 0.5 0.4
С20:5 п-3 16.3 15.2 16.6 19.6 17.4
С24:0 0.2 0.2 0.2 0.2 0.3
С22:4 п-9 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0
С24:1 п-9 0.3 0.3 0.2 0.3 0.2
С22:5 п-6 1.4 1.3 1.2 1.2 1.1
С22:5 п-3 3.9 3.7 2.5 3.6 2.9
С22:6 п-3 43.3 40.8 40.5 42.3 40.2
Таблица 27
Разделение классов липидов с помощью флэш-хроматографии (весовой %)
Разделение классов жиров РТА-10208 Конечное масло #1 РТА-10208 Конечное масло #2 РТА-10208 Конечное масло #3 РТА10208 Конечное масло #4 РТА10208 Конечное масло #5
ТАГ 93.4 95.4 94.0 95.7 95.1
Стерины/ДАГ 3.1 2.9 2.6 3.0 2.9
Восстановленные (%) 96.5 98.3 96.6 98.7 98.0
- 53 031136
Таблица 28 Разделение классов липидов с помощью ВЭЖХ-ИДСР (весовой %)
Стерин овые эфиры ТАГ сжк Стерин Ы 1,3ДАГ 1,2ДАГ МАГ Общий
РТА-10208 Конечное масло #1 0.4 90.8 ND 0.8 0.5 0.5 N.D. 93.0
РТА-10208 Конечное масло #2 0.4 88.5 ND 0.6 0.6 0.6 N.D. 90.7
РТА-10208 Конечное масло #3 0.3 89.4 ND 0.8 0.6 0.5 N.D. 91.6
РТА-10208 Конечное масло #4 0.3 88.0 ND 0.8 0.5 0.5 N.D. 90.1
РТА-10208 Конечное масло #5 0.3 86.3 ND 0.7 0.8 0.5 N.D. 88.6
РТА-10208 Конечное масло #6 0.36 100.76 ND 0.84 0.54 0.61 N.D. 103.11
ND=не определено.
Конечное масло PTA-10212.
ДГК представлены в конечном масле PTA-10212 как 41.63% и 366.9 мг/г, в то время как ЭПК представлен как 16.52%. Индивидуальные профили жирных кислот определены и суммированы в табл. 29.
- 54 031136
Таблица 29
Профили жирных кислот конечного масла PTA-10212 (% МЭЖК)
Пример 6.
Анализ триацилглицеридов (ТАГ) конечных масел PTA-10208, описанных в примере 5, выполняли, используя методику, описанную в примере 4. Идентификацию каждой жирной кислоты выполняли, как описано в табл. 30.
- 55 031136
Таблица 30
Идентификация видов ТАГ конечного масла PTA-10208
Идентификация РТА-10208 Конечное масло #1 Область % РТА-10208 Конечное масло #2 Область % РТА-10208 Конечное масло #3 Область % РТА-10208 Конечное масло #4 Область % РТА-10208 Конечное масло #5 Область %
эпк/эпк/эпк 1.3 1.0 1.9 1.7 1.4
эпк/эпк/дгк 8.2 6.0 7.3 6.8 6.4
дгк/дгк/эпк 14.2 11.1 10.6 9.5 8.7
дгк/дгк/дгк 10.2 8.3 7.6 6.1 5.7
дпк/эпк/эпк 1.2 0.9 1.0 1.1 1.1
дгк/дпк/эпк 3.0 2.4 2.5 2.3 2.9
ДГК/ЭПК/АРК дгк/дпк/дгк 3.8 3.0 3.0 3.0 2.3
дгк/дпк/эпк 2.3 1.9 1.5 1.6 1.7
дгк/дпк/дгк 1.7 1.2 1.1 1.2 1.2
ЭПК/14:0/ДГК 1.1 1.0 1.8 1.8 1.5
ДГК/ДГК/14:0 1.1 1.0 1.4 1.3 1.3
ЭПК/ЭПК/16:0 2.3 2.3 3.4 3.9 3.3
ДГК/16:0/ЭПК 12.1 12.5 12.9 14.0 13.4
ДГК/16:0/ДГК 16.1 16.8 17.5 14.8 17.2
ЭПК/ЭПК/18:0 2.1 2.0 1.7 2.1 2.7
ДГК/ДПК/16:0 3.0 3.3 2.3 2.9 2.7
ДГК/16:0/АРК 1.6 1.6 1.8 2.0 2.2
ДГК/16:0/ДПК 1.3 2.1 1.4 1.5 2.5
ДГК/18:0/ДГК 0.8 0.8 0.7 0.8 1.0
ДГК/14:0/16:0 0.6 1.0 1.3 1.4 1.3
ЭПК/16:0/16:0 0.9 1.1 1.5 1.7 2.0
ДГК/16:0/16:0 3.6 4.8 5.5 5.7 6.5
18:0/16:0/ДГК 0.4 0.8 0.7 0.8 1.2
18:1/18:1/18:1 0.6 4.0 1.0 1.4 1.6
Пример 7.
Двухдневный инокулюм изолированных микроорганизмов, депонированных в ATCC под номерами доступа PTA-10208 и 10212, приготавливали в виде культур с подпиткой углевода и азота в среде в соответствии с табл. 1 и 2.
Мутагенез был выполнен в соответствии со следующей процедурой.
Стерильную двухдневную (T=2 дня) колбу, примерно 50 мл, выливали в стерильный стакан гомогенизатора объемом 40 мл. Культура подвергали 50 колебаниям в гомогенизаторе. Культуру пипетировали и фильтровали через стерильный сетчатый фильтр в 50 мкм, который помещали в стерильную пробирку объемом 50 мл (сетку использовали для фильтрования больших комков колоний, в то время как небольшие кластеры и единичные клетки могли проходить через 50-микронную сетку). Весь концентрированный мацерат собирали в стерильную пробирку объемом 50 мл. Мацерированную культуру перемешивали на вортексе и разводили 1:100 раз. Разведенные мацерированные образцы перемешивали на вортексе перед добавлением 200 мкл инокулюма на чашку с агаризованной средой размером 100x15 мм, содержащей 4-5 стеклянных бусины (размером 3 мм). Каждую чашку осторожно трясли так, чтобы бусины распределяли инокулюм равномерно по чашке. Бусины удаляли из чашек и чашки оставляли без крышек примерно на 5 мин для подсушивания. Свет в обоих стерильных боксах и прилегающих к ним районах выключали, поскольку процедуру выполняли в тусклом свете. Использовали лишь минимальный свет, позволяющий начать процедуру, но он был ненаправленным и тусклым.
Пять реплик чашек помещали на поверхность сшивающего облучателя XL (Spectronic Corporation, New York) с открытыми крышками во время облучения образцов. Облучатель доставлял энергию в микроджоулях и уровень достигал 90-95% смертности. Пять реплик контрольных чашек инокулировали немутагенизированными клетками, используя тот же протокол. Эти клетки были использованы для подсчета % смертности. После завершения облучения чашки вынимали, крышки заменяли и чашки заматывали парафильмом и заворачивали в алюминиевую фольгу. Было необходимо, чтобы первую неделю чашки росли в темноте, чтобы они не были способны восстановить поврежденные гены.
Чашки помещали в комнату при 22.5°C на 10 дней перед подсчетом колоний. После конечного подсчета индивидуальные колонии были перенесены стерильной петлей на чашки с новой средой. Каждую колонию помещали на индивидуальную чашку. После того как чашка вырастала густую пробу брали с помощью петли и инокулировали стерильную колбу объемом 250 мл, содержащую 50 мл среды.
Эту колбу помещали на шейкер и инкубировали при 200 rpm 22.5°C. На T=7 день инкубирования
- 56 031136 культуру собирали в стерильную пробирку объемом 50 мл. Измеряли pH и пробу центрифугировали, чтобы собрать биомассу в осадок. Каждый образец промывали и ресуспендировали в смеси 50:50 изопропилового спирта и дистиллированной воды перед повторным центрифугированием. Собранный осадок замораживали, взвешивали и проводили МЭЖК анализ. Данные в табл. 31 и 32 представляют мутантов, полученных с помощью вышеописанного процесса из штаммов PTA-10208 и PTA-10212 соответственно.
Таблица 31
Мутанты PTA-10208
Жирные кислоты Контроль РТА-10208 Мутант 1 РТА-10209 Мутант 2 РТА-10210 Мутант 3 РТА-10211
% 08:0 0.00 0.00 0.00 0.00
% 09:0 0.00 0.00 0.00 0.00
% 10:0 0.00 0.00 0.00 0.00
% 11:0 0.00 0.00 0.00 0.00
% 11:1 0.00 0.00 0.00 0.00
% 12:0 0.11 0.10 0.22 0.19
% 12:1 0.00 0.00 0.00 0.00
% 13:0 0.19 0.19 0.15 0.16
% 13:1 0.00 0.00 0.00 0.00
% 14:0 1.94 1.82 2.98 2.59
% 14:1 0.00 0.00 0.00 0.00
% 15:1 2.66 2.22 1.76 1.66
% 16:0 24.87 24.97 23.71 25.01
% 16:1 0.20 0.25 0.07 0.07
% 16:2 0.00 0.00 0.00 0.00
% 16:3 0.00 0.00 0.00 0.00
% 17:0 1.49 1.21 0.62 0.66
% 18:0 1.13 1.14 0.91 1.01
% 18:1 п-9 0.07 0.07 0.06 0.06
% 18:1 п-7 0.00 0.00 0.00 0.00
% 18:2 0.00 0.00 0.00 0.00
% 18:3 п-6 0.00 0.00 0.05 0.04
% 18:3 п-3 0.09 0.08 0.17 0.14
% 18:4 п-3 0.00 0.00 0.00 0.00
% 20:0 0.31 0.33 0.24 0.30
% 20:1 п-9 0.00 0.04 0.00 0.00
% 20:2 0.00 0.00 0.05 0.00
% 20:3 п-9 0.00 0.00 0.00 0.00
% 20:3 п-6 0.12 0.13 0.08 0.04
% 20:3 п-3 0.42 0.42 0.08 0.06
% 20:4 АРК 0.68 0.67 1.44 1.11
% 20:5 п-3 ЭПК 6.56 6.47 11.99 9.87
% 22:0 0.07 0.07 0.06 0.07
% 22:1 0.00 0.00 0.00 0.00
% 22:2 0.11 0.09 0.10 0.08
% 22:3 0.00 0.00 0.00 0.00
% 22:4 п-6 0.00 0.00 0.00 0.00
% 22:5 п-6 2.32 2.36 2.36 2.36
% 22:5 п-3 0.48 0.66 0.66 0.52
% 22:6 п-3 ДГК 51.58 52.27 48.17 49.35
% 24:0 0.00 0.00 0.00 0.00
% 24:1 0.00 0.00 0.00 0.00
% Fat 47.87 49.41 66.00 63.12
% Неизвестн ый 4.61 4.45 4.07 4.64
- 57 031136
Мутанты PTA-10212
Таблица 32
Жирные кислоты Контроль РТА-10212 Мутант 1 РТА-10213 Мутант 2 РТА-10214 Мутант 3 РТА-10215
% 08:0 0.00 0.00 0.00 0.00
% 09:0 0.00 0.00 0.00 0.00
% 10:0 0.00 0.00 0.00 0.00
% 11:0 0.00 0.00 0.00 0.00
% 11:1 0.00 0.00 0.00 0.00
% 12:0 0.00 0.00 0.00 0.00
% 12:1 0.00 0.00 0.00 0.00
% 13:0 0.00 0.00 0.21 0.20
% 13:1 0.00 0.00 0.00 0.00
% 14:0 0.68 0.77 0.62 0.97
% 14:1 0.00 0.00 0.00 0.00
% 15:1 0.00 0.00 0.00 0.00
% 16:0 17.36 19.94 15.27 23.61
% 16:1 1.45 2.33 1.40 2.57
% 16:2 0.00 0.00 0.00 0.00
% 16:3 0.00 0.00 0.00 0.00
% 17:0 0.20 0.21 0.18 0.27
% 18:0 0.78 0.82 0.79 0.81
% 18:1 п-9 0.00 0.00 0.00 0.00
% 18:1 п-7 0.18 0.27 0.20 0.19
% 18:2 0.00 0.00 0.00 0.00
% 18:3 п-6 0.00 0.00 0.00 0.00
% 18:3 п-3 0.00 0.00 0.00 0.00
% 18:4 п-3 0.00 0.00 0.00 0.00
% 20:0 0.00 0.00 0.00 0.00
% 20:1 п-9 0.00 0.00 0.00 0.00
% 20:2 0.00 0.00 0.00 0.00
% 20:3 п-9 0.00 0.00 0.00 0.00
% 20:3 п-6 0.00 0.00 0.00 0.00
% 20:3 п-3 0.90 0.77 0.99 0.66
% 20:4 АРК 1.43 1.32 1.65 0.72
% 20:5 п-3 ЭПК 13.33 14.93 14.14 8.54
% 22:0 0.00 0.00 0.00 0.00
% 22:1 0.00 0.00 0.00 0.00
% 22:2 0.00 0.00 0.00 0.00
% 22:3 0.00 0.00 0.00 0.00
% 22:4 п-6 0.00 0.00 0.00 0.00
% 22:5 п-6 2.39 1.95 2.59 2.18
% 22:5 п-3 0.73 0.79 0.80 0.68
% 22:6 п-3 ДГК 59.18 54.31 59.89 56.39
% 24:0 0.00 0.00 0.00 0.00
% 24:1 0.00 0.00 0.00 0.00
% Fat 45.69 38.08 42.88 48.48
% Неизвестн ый 1.38 1.58 1.27 2.19
Все аспекты, варианты реализаций и возможные варианты, описанные в настоящем изобретении, могут быть объединены в любых вариациях.
Все публикации, патенты и патентные заявки, упомянутые в настоящем описании, включены в качестве ссылки в той же степени, как если каждая отдельная публикация, патент или патентная заявка были включены специально и индивидуально в качестве ссылки.
- 58 031136
ПЕРЕЧЕНЬ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ <110>
Эпт, Кирк Е.
Бернес, Пол Варрен
Хансен, Джон Милтон Пфайфер III, Джозеф Б. Шталь, Трэйси Линн Зиркл, Росс <120> МИКРООРГАНИЗМЫ, ПРОДУЦИРУЮЩИЕ ЭЙКОЗАПЕНТАЕНОВУЮ КИСЛОТУ, КОМПОЗИЦИИ
ЖИРНЫХ КИСЛОТ И
СПОСОБЫ ИХ ПОЛУЧЕНИЯ И ПРИМЕНЕНИЯ
<130> 2715 .004PC01/JUK/SAS
<140> To be assigned
<141> 2010 -03-22
<150> 61/296,456
<151> 2010 -01-19
<160> 2
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 1705
<212> DNA
<213> Thraustochytrium sp.
<400> 1
aagatacctg gttgatcctg ccagtagtca tacgctcgtc tcaaagatta agccatgcat 60
gtgtcagtat aaatactttt actttgaaac tgcgaacggc tcattaaatc agtaattatc 120
tacatggtaa cgaaaattat atggataacc gtagtaattc tagggctaat acatgcgtaa 180
aatctgggta actggatgca tttattggat tgaagccaac attaaaaggt gattcacgat 240
aactaagcgg agcgttttag gacgctgaat cattcgagtt tctgccctat cagctgtcga 300
tggtaaggta ttggcttacc atggcgttaa cgggtaacgg agaattaggg ttcgattccg 360
gagagggagc ctgagagacg gctaccacat ccaaggaagg cagcaggcgc gtaaattgcc 420
caatgagaac ttctcgaggc agtgacaaga aatatcaaag tgatgccgtt aggtattgca 480
tttgaaatga gaacgatgta caacttctaa cgatgatcaa ttggagggca agtctggtgc 540
cagcagccgc ggtaattcca gctccaatag cgtatactaa cgttgctgca gttaaaacgc 600
ccgtagttga attagtatca tggtatttta accttattcg atgaatttga gttgaaagct 660
aggatatata ggaagcgatt cctcatttac tgtaaaaaaa ttagagtgtt tcacacagat 720
cgtaagatcg ggatatatta gtatggaata ataagatagg actttggtgc tattttgttg 780
gtttgcacac caaagtaatg attaataggg acagttgggg gtattcgtat ttaattgtca 840
gaggtgaaat tcttggattt atgaaagacg aactactgcg aaagcattta ccaaggatgt 900
tttcattaat caaggacgaa agttagggga tcgaagatga ttagatacca tcgtagtctt 960
- 59 031136
aaccataaac tatgccgact gaggattctt gaaatttgta aatgaattta agagcactcc 1020
atgagaaatc aaagtctttg ggttccgggg ggagtatggt cgcaagtctg aaacttaaag 1080
gaattgacgg aagggcacca ccaggagtgg agcctgcggc ttaatttgac tcaacacggg 1140
aaaacttacc aggtccagac atagtgagga ttgacagatt gatagctctt tcttgattct 1200
atgggtggtg gtgcatggcc gttcttagtt ggtggtttga actgtctgct taattgcgtt 1260
aacgaacgag acctcagcct actaaatagt atgttgttta gtaataaatg atatgacttc 1320
ttagagggac atttcgggtt taccggaagg aagtttgagg caataacagg tctgtgatgc 1380
ccttagatgt tctgggccgc acgcgcgcta cactgacgag ctcaacaagt aatatttggt 1440
tgtctggaag gattgcctaa tcttttaaat actcgtcgtg atggggctag attcttgtaa 1500
ttattaatct ccaacgagga attcctagta aacgcaagtc atcagcttgc attgattacg 1560
tccctgccct ttgtacacac cgcccgtcgc acctaccgat tggatggtcc ggtgaaatct 1620
tcggatgttt ttttacaata gtagagagac aaaagttgag taaaccttac catctagagg 1680
aaggtgaagt cgtaacaagg atctt 1705
<210> 2 <211> 1713
<212> DNA
<213> Schizochytrium sp.
<400> 2
acctggttga tcctgccagc tgtcatttgc tcgtctaaaa gattaagcca tgcatgtcta 60
agtataaaca aattatacgg tgaaactgcg aacggctcat tatatcagtt atagtttctt 120
tgatagtgta tttctatatc tatttggata actgtggcaa ttctagagct aacacatgct 180
ttcgagtggg actttttggt accactgcat ttattagatt ttgaagccaa cgtaaaattg 240
gtgattcatg ataactttgc gaatcgcagt agcgtcttgt acgcggcgat gaatcattca 300
agtttctgcc ccatcagctg tcgatggtac ggtattggcc taccatggct ttcacgggtg 360
acggagaatt agggtttgat tccggagagg acgcttgaga gacggcgacc acatccaagg 420
aaggcagcag gcgcgtaaat tacccaatgg ggactccccg aggtagtgac aagaaataaa 480
aatgaggagc gctttgcgtt tttcaatttg aatgagagaa tcgtacaatc ctcatcgagg 540
atcaattgga gggcaagtct ggtgccagca gccgcggtaa ctccagctcc aatagcaaat 600
attagagttg ttgcagttaa aaagctcgta gttgaatttc cgatagtctt tggccgtgtc 660
cttggtctcg tatcatgggt ttattgtgcc aagatgatcg tcctctatgg ttagtgatag 720
tcatagtcgt ttactgtaaa aaaactggag tgtttaaagc atttctttgg gaaaggtaca 780
tattagtata ggataattag ataggacctg tgattcttat ttggttggtt tgtgagtcat 840
ggtaatgatt aatagggaca atcgggggta ttcgaattta attgtcagag gtgaaattct 900
- 60 031136
tggatttaag aaagtcgaac tactgcgaag gcatttacca aggatgtttt cattaataaa 960
gaacgaaagt taggggatcg aagatgatta gataccatcg tagtcttaac tgtaaactat 1020
gccgacttgc gattgtccgt cgttgttttt tcaaaaaaga gacctgggca gcagcacatg 1080
agaaatcaaa gtttttgggt tccgggggga gtatggtcgc aaggctgaaa cttaaaggaa 1140
ttgacggaag ggcaccacca ggagtggagc ctgcggctta attcgactca acacgggaaa 1200
acttaccagg tccagacata gtaaggattg acagattgag agctctttct tgattctatg 1260
ggtggtggtg catggccgtt cttagttggt ggagtgattt gtctggttaa ttccgttaac 1320
gaacgagacc tcagcctact aaatagtggt gcatattgtg agatatgtga caaaaatcgc 1380
ttcttagagg gacatttcgg gtttaccgga aggaagtttg aggcaataac aggtctgtga 1440
tgcccctaga tgttctgggc cgcacgcgcg ctacaatgac agattcaaca agtccggtag 1500
tggagctttt gcttctctat tattactttt ccgagaggaa tggttaatct tctaaatgtc 1560
tgtcgtgatg gggctagatt tttgcaatta ttaatctcca acgaggaatt cctagtaaac 1620
gcaagtcatc agcttgcatt gattacgtcc ctgccctttg tacacaccgc ccgtcgcacc 1680
taccgattga acggtcctat gaaatcttcg gat 1713

Claims (16)

  1. ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ
    1. Микробное масло, содержащее по меньшей мере 20 мас.% эйкозапентаеновой кислоты и менее чем 5 мас.% каждой из следующих кислот: арахидоновой кислоты, докозапентаеновой кислоты n-6, олеиновой кислоты, линолевой кислоты, линоленовой кислоты, эйкозеноевой кислоты, эруковой кислоты и стеаридоновой кислоты, где указанное микробное масло получено из траустохитрид.
  2. 2. Микробное масло по п.1, дополнительно содержащее по меньшей мере примерно 25 мас.% докозагексаеновой кислоты.
  3. 3. Микробное масло, которое содержит по меньшей мере 10 мас.% фракции триацилглицеринов, при этом по меньшей мере 12 мас.% жирных кислот в указанной фракции триацилглицеринов составляет эйкозапентаеновая кислота, при этом по меньшей мере 20 мас.% жирных кислот в указанной фракции триацилглицеринов составляет докозагексаеновая кислота и при этом менее чем 5 мас.% жирных кислот в указанной фракции триацилглицеринов составляет арахидоновая кислота, где указанное микробное масло получают из траустохитрид.
  4. 4. Микробное масло по п.3, в котором содержание фракции триацилглицеринов составляет по меньшей мере 40 мас.%.
  5. 5. Микробное масло по п.4, в котором содержание фракции триацилглицеринов составляет по меньшей мере 70 мас.%.
  6. 6. Микробное масло по п.5, в котором содержание фракции триацилглицеринов составляет по меньшей мере 90 мас.%.
  7. 7. Микробное масло по любому из пп.3-6, где по меньшей мере 15 мас.% жирных кислот во фракции триацилглицеринов составляет эйкозапентаеновая кислота.
  8. 8. Микробное масло по п.7, где по меньшей мере 20 мас.% жирных кислот во фракции триацилглицеринов составляет эйкозапентаеновая кислота.
  9. 9. Микробное масло по любому из пп.3-8, где по меньшей мере 25 мас.% жирных кислот во фракции триацилглицеринов составляет докозагексаеновая кислота.
  10. 10. Микробное масло по п.9, где по меньшей мере 30 мас.% жирных кислот во фракции триацилглицеринов составляет докозагексаеновая кислота.
  11. 11. Микробное масло по п.10, где по меньшей мере 35 мас.% жирных кислот во фракции триацилглицеринов составляет докозагексаеновая кислота.
  12. 12. Микробное масло по любому из пп.3-11, где 3 мас.% или менее жирных кислот во фракции триацилглицеринов составляет арахидоновая кислота.
  13. 13. Микробное масло по п.12, где 2 мас.% или менее жирных кислот во фракции триацилглицеринов составляет арахидоновая кислота.
    - 61 031136
  14. 14. Микробное масло по любому из пп.1-13, где указанное масло является неочищенным маслом.
  15. 15. Микробное масло по любому из пп.1-13, где указанное масло является очищенным маслом.
  16. 16. Микробное масло по любому из пп.1-13, дополнительно содержащее растительное масло.
EA201290656A 2010-01-19 2010-03-22 Микроорганизмы, продуцирующие эйкозапентаеновую кислоту, композиции жирных кислот и способы их получения и применения EA031136B1 (ru)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US29645610P 2010-01-19 2010-01-19
PCT/US2010/028175 WO2011090493A1 (en) 2010-01-19 2010-03-22 Eicosapentaenoic acid-producing microorganisms, fatty acid compositions, and methods of making and uses thereof

Publications (2)

Publication Number Publication Date
EA201290656A1 EA201290656A1 (ru) 2013-02-28
EA031136B1 true EA031136B1 (ru) 2018-11-30

Family

ID=44277725

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
EA201290656A EA031136B1 (ru) 2010-01-19 2010-03-22 Микроорганизмы, продуцирующие эйкозапентаеновую кислоту, композиции жирных кислот и способы их получения и применения

Country Status (19)

Country Link
US (6) US9924733B2 (ru)
EP (3) EP2526197B1 (ru)
JP (4) JP5920890B2 (ru)
KR (4) KR20150013667A (ru)
CN (2) CN105360351A (ru)
AR (1) AR077916A1 (ru)
AU (1) AU2010343305B2 (ru)
BR (2) BR122015020119B8 (ru)
CA (3) CA2896012C (ru)
CL (2) CL2012002013A1 (ru)
DK (1) DK2526197T3 (ru)
EA (1) EA031136B1 (ru)
HK (1) HK1221873A1 (ru)
MX (1) MX343403B (ru)
MY (1) MY160121A (ru)
NZ (2) NZ626633A (ru)
PH (1) PH12016501930B1 (ru)
TW (2) TWI653336B (ru)
WO (1) WO2011090493A1 (ru)

Families Citing this family (26)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US8207363B2 (en) 2009-03-19 2012-06-26 Martek Biosciences Corporation Thraustochytrids, fatty acid compositions, and methods of making and uses thereof
EP2408797B1 (en) * 2009-03-19 2017-03-15 DSM IP Assets B.V. Polyunsaturated fatty acid synthase nucleic acid molecules and polypeptides, compositions, and methods of making and uses thereof
KR20150013667A (ko) 2010-01-19 2015-02-05 디에스엠 아이피 어셋츠 비.브이. 에이코사펜타엔산 생산 미생물, 지방산 조성물 및 이의 제조방법 및 용도
EP2576801B1 (en) 2010-06-01 2019-10-02 DSM IP Assets B.V. Extraction of lipid from cells and products therefrom
ES2857173T3 (es) * 2011-07-21 2021-09-28 Dsm Ip Assets Bv Aceites microbianos enriquecidos en ácidos grasos poliinsaturados
KR102149068B1 (ko) 2011-07-21 2020-08-31 디에스엠 아이피 어셋츠 비.브이. 지방산 조성물
SG10201605966TA (en) * 2011-07-21 2016-09-29 Dsm Ip Assets Bv Eicosapentaenoic acid-producing microorganisms, fatty acid compositions, and methods of making and uses thereof
EP2826384A1 (de) 2013-07-16 2015-01-21 Evonik Industries AG Verfahren zur Trocknung von Biomasse
SG11201605033UA (en) 2013-12-20 2016-07-28 Dsm Ip Assets Bv Processes for obtaining microbial oil from microbial cells
EP4223861A3 (en) 2013-12-20 2023-11-01 Mara Renewables Corporation Methods of recovering oil from microorganisms
KR102426987B1 (ko) 2013-12-20 2022-07-28 디에스엠 아이피 어셋츠 비.브이. 미생물 세포로부터의 미생물 오일의 수득 방법
TWI698520B (zh) 2013-12-20 2020-07-11 荷蘭商Ｄｓｍ智慧財產有限公司 用於從微生物細胞獲得微生物油之方法（三）
AU2014369040B2 (en) 2013-12-20 2019-12-05 Dsm Ip Assets B.V. Processes for obtaining microbial oil from microbial cells
US11464244B2 (en) 2014-10-02 2022-10-11 Evonik Operations Gmbh Feedstuff of high abrasion resistance and good stability in water, containing PUFAs
US20170295824A1 (en) 2014-10-02 2017-10-19 Evonik Degussa Gmbh Process for producing a pufa-containing biomass which has high cell stability
WO2016050559A1 (de) 2014-10-02 2016-04-07 Evonik Degussa Gmbh VERFAHREN ZUR HERSTELLUNG EINES PUFAs ENTHALTENDEN FUTTERMITTELS DURCH EXTRUSION EINER PUFAs ENTHALTENDEN BIOMASSE
CN106793799B (zh) 2014-10-02 2021-05-14 赢创运营有限公司 用于养殖动物的方法
CN106998742A (zh) * 2014-12-12 2017-08-01 帝斯曼知识产权资产管理有限公司 用于水产养殖饲料中的饲料补充物质
EP3318640A4 (en) * 2015-07-03 2019-03-06 Kuysyu University, National University Corporation MICROORGANISM OIL-PRODUCING LABYRINTHULIDS, MICROORGANISM OIL, PREPARATION METHOD AND USES THEREOF
WO2017055169A1 (en) * 2015-10-01 2017-04-06 Dsm Ip Assets B.V. Supplement material for use in pet food
EP3455351B1 (en) * 2016-05-12 2022-08-24 DSM IP Assets B.V. Method of increasing omega-3 polyunsaturated fatty acids production in microalgae
ES2952868T3 (es) * 2016-12-15 2023-11-06 Nestle Sa Composiciones y métodos que modulan la digestibilidad en un animal de compañía
CN111032878B (zh) * 2017-08-10 2024-03-08 帝斯曼知识产权资产管理有限公司 用于营养油纯化的双重离心过程
US20210401731A1 (en) * 2020-06-24 2021-12-30 Marco Ruggiero Anti-Aging Formula
SE2151489A1 (en) * 2021-12-07 2023-06-08 Mycorena Ab A food product or food ingredient comprising fungi biomass with an increased intracellular fat content
WO2023144707A1 (en) 2022-01-25 2023-08-03 Dsm Ip Assets B.V. Media refinement and nutrient feeding approaches to increase polyunsaturated fatty acid production

Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2007068997A2 (en) * 2005-12-16 2007-06-21 Avestha Gengraine Technologies Pvt.Ltd. Docosahexaenoic acid (dha) producing thraustochytrid strain - sc1
US20080076164A1 (en) * 2004-07-16 2008-03-27 Petra Cirpus Method for Increasing the Content of Polyunsaturated Long-Chained Fatty Acids in Transgenic Organisms
US20080199923A1 (en) * 1992-10-16 2008-08-21 Martek Biosciences Corporation Process for the Heterotrophic Production of Microbial Products with High Concentrations of Omega-3 Highly Unsaturated Fatty Acids
US20090004219A1 (en) * 2005-12-29 2009-01-01 Abl Biotechnologies Ltd. Novel Strain of Schizochytrium limacinum useful in the production of lipids and Extracellular Polysaccharides and process thereof
US20090192304A1 (en) * 2001-04-16 2009-07-30 Martek Biosciences Corporation Product and Process for Transformation of Thraustochytriales Microorganisms

Family Cites Families (107)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4485173A (en) 1981-01-19 1984-11-27 Cpc International Inc. Preparation of fats and oils
ES2052564T3 (es) 1986-07-08 1994-07-16 Suntory Ltd Procedimiento para la produccion de acido bishomo-gamma-linolenico y acido eicosapanteonico.
ES2061519T3 (es) 1986-12-26 1994-12-16 Sagami Chem Res Procedimiento para la produccion de acido eicosapentaenoico.
US5246841A (en) 1986-12-26 1993-09-21 Sagami Chemical Research Center Microbial process for production of eicosapentaenoic acid
JP2746371B2 (ja) 1987-12-21 1998-05-06 サントリー株式会社 ビスホモ−γ−リノレン酸及びこれを含有する脂質の製造方法
JP2710344B2 (ja) 1988-07-13 1998-02-10 サントリー株式会社 高度不飽和脂肪酸及びこれを含有する脂質の製造方法
US5340594A (en) 1988-09-07 1994-08-23 Omegatech Inc. Food product having high concentrations of omega-3 highly unsaturated fatty acids
US6451567B1 (en) * 1988-09-07 2002-09-17 Omegatech, Inc. Fermentation process for producing long chain omega-3 fatty acids with euryhaline microorganisms
US5130242A (en) 1988-09-07 1992-07-14 Phycotech, Inc. Process for the heterotrophic production of microbial products with high concentrations of omega-3 highly unsaturated fatty acids
US5698244A (en) 1988-09-07 1997-12-16 Omegatech Inc. Method for raising animals having high concentrations of omega-3 highly unsaturated fatty acids
US5244921A (en) 1990-03-21 1993-09-14 Martek Corporation Eicosapentaenoic acids and methods for their production
EP1092352A3 (en) * 1991-01-24 2003-08-27 Martek Corporation Microbial oil mixtures and uses thereof
JPH078215A (ja) 1993-04-30 1995-01-13 Kawasaki Steel Corp ドコサヘキサエン酸含有海洋性微細藻類食品素材およびその製造方法
US6582941B1 (en) * 1995-04-17 2003-06-24 Japan As Represented By Director-General Of Agency Of Industrial Science And Technology Microorganisms capable of producing highly unsaturated fatty acids and process for producing highly unsaturated fatty acids by using the microorganisms
GB9514649D0 (en) 1995-07-18 1995-09-13 Zeneca Ltd Extraction of triglycerides from microorganisms
US6255505B1 (en) 1996-03-28 2001-07-03 Gist-Brocades, B.V. Microbial polyunsaturated fatty acid containing oil from pasteurised biomass
CN1217029A (zh) 1996-03-28 1999-05-19 吉斯特-布罗卡迪斯股份有限公司 从用巴氏法灭菌的生物量中制备含有微生物多不饱和脂肪酸的油的方法
US20030143659A1 (en) 1996-03-28 2003-07-31 Hendrik Louis Bijl Process for the preparation of a granular microbial biomass and isolation of a compound thereform
WO1998003671A1 (en) * 1996-07-23 1998-01-29 Nagase Biochemicals, Ltd. Process for preparing docosahexaenoic acid and docosapentaenoic acid
EP0960943B1 (en) 1996-12-27 2014-02-12 Suntory Holdings Limited Media for culturing microorganisms and process for producing unsaturated fatty acids or lipids containing the same
ATE305048T1 (de) 1997-08-01 2005-10-15 Martek Biosciences Corp Dha-enthaltende naehrzusammensetzungen und verfahren zu deren herstellung
EP1025842B1 (en) 1997-10-30 2004-07-21 Morishita Jintan Co., Ltd. Double-leyered capsule of unsaturated fatty acid or derivative thereof and process for producing the same
JP4079494B2 (ja) * 1998-03-04 2008-04-23 サントリー株式会社 アラキドン酸及び／又はエイコサペンタエン酸含有油脂の製造方法
JP4175698B2 (ja) 1998-06-19 2008-11-05 サントリー株式会社 新規なトリグリセリド及びそれを含む組成物
US8003772B2 (en) * 1999-01-14 2011-08-23 Martek Biosciences Corporation Chimeric PUFA polyketide synthase systems and uses thereof
KR100423013B1 (ko) 1999-03-04 2004-03-12 산토리 가부시키가이샤 도코사펜타엔산 함유물질의 이용
IL143421A0 (en) 1999-09-29 2002-04-21 Micro Gaia Co Ltd Method for culturing algae
US6395778B1 (en) 2000-01-11 2002-05-28 Omegatech, Inc. Process for making an enriched mixture of polyunsaturated fatty acid esters
CN100460513C (zh) * 2000-01-19 2009-02-11 马泰克生物科学公司 无溶剂的提取方法
DE60130737T3 (de) 2000-01-28 2016-01-14 Dsm Ip Assets B.V. Verstärkte Produktion von Lipiden enthaltend mehrfachungesättigte Fettsäuren durch hochdichte Kulturen von eukariotischen Mikroben in Gärvorrichtungen
EP1261733A4 (en) 2000-02-24 2005-11-23 Thomas Veach Ii Long PROCESS FOR THE PREPARATION OF CAROTENOIDS, XANTHOPHYLLENE AND APO-CAROTENOIDES USING EUKARYOTIC MICROORGANISMS
DE60020271T2 (de) 2000-03-29 2006-03-23 Council Of Scientific And Industrial Research Verfahren zur erhöhung von mehrfachungesättigten fettsäuren in thraustochytriden
US6410282B1 (en) * 2000-03-30 2002-06-25 Council Of Scientific And Industrial Research Method for enhancing levels of polyunsaturated fatty acids in thraustochytrid fungi
JP3425622B2 (ja) 2000-03-30 2003-07-14 独立行政法人産業技術総合研究所 ラビリンチュラ属菌を用いた高度不飽和脂肪酸含有培養物および高度不飽和脂肪酸含有油脂の製造方法
EP1178118A1 (en) 2000-08-02 2002-02-06 Dsm N.V. Isolation of microbial oils
ATE430794T1 (de) * 2001-03-09 2009-05-15 Nestle Sa Öl, das langkettige, mehrfach ungesättigte fettsäuren aus biomassen enthält, verfahren zur herstellung, lebensmittel, nahrungsmittelzusammensetzung, kosmetische oder pharmazeutische zusammensetzung, die dieses enthält
JP4995377B2 (ja) 2001-04-26 2012-08-08 花王株式会社 油脂組成物
US20050129739A1 (en) * 2001-05-14 2005-06-16 Gerhard Kohn Production and use of a polar lipid-rich fraction containing omega-3 and/or omega-6 highly unsaturated fatty acids from microbes, genetically modified plant seeds and marine organisms
ATE457357T1 (de) 2001-07-02 2010-02-15 Suntory Holdings Ltd Verfahren zur herstellung von fett mit triglyceridhaltiger hochungesättigter fettsäure
AU2002323409A1 (en) * 2001-08-24 2003-03-10 Martek Biosciences Boulder Corporation Products containing highly unsaturated fatty acids for use by women and their children during stages of preconception, pregnancy and lactation/post-partum
DE10151155A1 (de) 2001-10-19 2003-05-08 Nutrinova Gmbh Native PUFA-Triglyceridmischungen mit einem hohen Gehalt an mehrfach ungesättigten Fettsäuren sowie Verfahren zu deren Herstellung und deren Verwendung
US6677470B2 (en) 2001-11-20 2004-01-13 Natural Asa Functional acylglycerides
CN1267174C (zh) * 2001-12-12 2006-08-02 马泰克生物科学博尔德公司 从含油种子和微生物来源提取和冬化脂类的方法
US20040203120A1 (en) 2002-03-22 2004-10-14 Council Of Scientific And Industrial Research Method for enhancing levels of polyunsaturated fatty acids in thraustochytrid protists
EP1503715A4 (en) 2002-05-03 2005-07-06 Martek Biosciences Corp HIGH QUALITY LIPIDS AND METHODS FOR THE PRODUCTION THEREOF BY ENZYMATIC RELEASE FROM BIOMASS
EA013051B1 (ru) * 2002-06-19 2010-02-26 ДСМ Ай Пи ЭССЕТС Б.В. Масло из микробных клеток, композиция, содержащая масло, и способ получения масла
ES2312513T3 (es) * 2002-09-04 2009-03-01 Nestec S.A. Procedimiento para la preparacion de un aceite conteniendo uno o unos acidos grasos poliinsaturados de cadena larga proviniendo de biomasa, alimento, composicion nutricional, cosmetica o farmaceutica conteniendo dicho aceite.
CA2498569C (en) 2002-09-13 2016-11-29 Suntory Limited Process for production of transesterified oils/fats or triglycerides
DK1549753T3 (da) 2002-10-11 2010-10-18 Nippon Suisan Kaisha Ltd Fremgangsmåde til fremstilling af mikrobielt fedt eller olie med nedsat uforsæbeligt stofindhold
RU2235481C2 (ru) 2002-11-20 2004-09-10 Общество с ограниченной ответственностью "Гелла-Фарма" Способ получения биологически активной добавки к пище (варианты)
JP4280158B2 (ja) * 2002-12-27 2009-06-17 富士フイルム株式会社 ドコサヘキサエン酸生産能を有する微生物及びその利用
KR101362989B1 (ko) 2003-03-27 2014-02-17 산토리 홀딩스 가부시키가이샤 지질 개선제 및 지질 개선제를 함유하는 조성물
US20050019880A1 (en) 2003-03-31 2005-01-27 Council Of Scientific And Industrial Research Method of enhancing levels of polyunsaturated fatty acids in thraustochytrid protists
US6846942B2 (en) 2003-05-20 2005-01-25 David Rubin Method for preparing pure EPA and pure DHA
JP2007503802A (ja) 2003-09-01 2007-03-01 ノボザイムス アクティーゼルスカブ 海洋微生物のバイオマス及び／又はそのバイオマスの成分の収量を高める方法
CA2801065C (en) 2003-10-02 2020-04-28 Dsm Ip Assets B.V. Production of high levels of dha in microalgae using modified amounts of chloride and potassium
DE10352838A1 (de) 2003-11-10 2005-07-07 Nutrinova Nutrition Specialties & Food Ingredients Gmbh Verfahren zur Kultivierung von Mikroorganismen der Gattung Thraustochytriales unter Verwendung eines optimierten Niedrigsalzmediums
TWI365716B (en) 2003-12-02 2012-06-11 Suntory Holdings Ltd Oil or fat and oil compositions containing phospholipids and a long-chain polyunsaturated fatty acid supply compound, and food using same
SE0303513D0 (sv) 2003-12-19 2003-12-19 Pronova Biocare As Use of a fatty acid composition comprising at least one of epa and dha or any combinations thereof
DE602004029090D1 (de) 2003-12-30 2010-10-21 Dsm Ip Assets Bv Entlüftungsverfahren
GB0403247D0 (en) 2004-02-13 2004-03-17 Tillotts Pharma Ag A pharmaceutical composition
ATE469207T1 (de) 2004-08-12 2010-06-15 Nippon Suisan Kaisha Ltd Verfahren zur herstellung mehrfach ungesättigter fettsäuren unter verwendung einer neuen zellkonservierungstechnik
WO2006022356A1 (ja) * 2004-08-24 2006-03-02 Suntory Limited ジアシルグリセロールの含量を任意に含んだ微生物油脂の製造法並びに該油脂
JP4624040B2 (ja) 2004-09-06 2011-02-02 日本水産株式会社 菌体培養方法
US7588931B2 (en) * 2004-11-04 2009-09-15 E. I. Du Pont De Nemours And Company High arachidonic acid producing strains of Yarrowia lipolytica
CA2586310C (en) 2004-11-04 2013-09-24 Monsanto Technology Llc Seed oil compositions
US8241868B2 (en) 2005-02-08 2012-08-14 Nippon Suisan Kaisha, Ltd. Production of polyunsaturated fatty acids using cell treatment method
ES2576986T3 (es) 2005-06-07 2016-07-12 Dsm Nutritional Products Ag Microorganismos eucariotas para la producción de lípidos y antioxidantes
EP2630869B1 (en) 2005-07-01 2016-12-14 DSM IP Assets B.V. Polyunsaturated fatty acid-containing oil product and uses and production thereof
CN101252844A (zh) * 2005-07-01 2008-08-27 马泰克生物科学公司 包含多不饱和脂肪酸的油产品及其用途和制备方法
BRPI0613453B1 (pt) 2005-07-12 2017-04-04 Adelaide Res And Innovation Pty Ltd composição fertilizante e método para fornecer micronutrientes para plantas
AU2006322990A1 (en) 2005-10-07 2007-06-14 Ocean Nutrition Canada Ltd. Salts of fatty acids and methods of making and using thereof
US9265745B2 (en) 2005-12-21 2016-02-23 Brudy Technology S.L. Use of DHA, EPA or DHA-derived EPA for treating a pathology associated with cellular oxidative damage
CN101466270A (zh) * 2006-04-11 2009-06-24 马泰克生物科学公司 包含长链多不饱和脂肪酸的食品及其制备方法
WO2007149577A2 (en) 2006-06-23 2007-12-27 The Procter & Gamble Company Concentrated and odorless omega 3 fatty acids
CA2656311C (en) 2006-07-05 2016-06-21 Photonz Corporation Limited Ultra pure epa and polar lipids produced in largely heterotrophic culture
US20090304784A1 (en) 2006-07-28 2009-12-10 V. Mane Fils Seamless capsules containing high amounts of polyunsaturated fatty acids and a flavouring component
JP5531324B2 (ja) * 2006-08-01 2014-06-25 ディーエスエム ニュートリショナル プロダクツ アーゲー 油生産微生物およびその改変方法
CN101528067A (zh) * 2006-08-29 2009-09-09 马泰克生物科学公司 二十二碳五烯酸（n-6）油在婴儿配方中的用途
AU2007314481B2 (en) 2006-10-30 2012-11-29 E. I. Du Pont De Nemours And Company Delta17 desaturase and its use in making polyunsaturated fatty acids
US8936923B2 (en) 2006-12-05 2015-01-20 Biomass Research & Refining Pty Ltd Production of biodiesel
JP5101894B2 (ja) 2007-01-15 2012-12-19 サントリーホールディングス株式会社 高度不飽和脂肪酸及びこれを含有する脂質の製造方法
US20080234377A1 (en) 2007-03-23 2008-09-25 Martek Biosciences Corporation Polyunsaturated fatty acids for treatment of dementia and pre-dementia-related conditions
EP1992233A1 (en) 2007-05-11 2008-11-19 DSMIP Assets B.V. Stabilized marine oils and process of making them
WO2009002145A1 (en) 2007-06-26 2008-12-31 N.V. Nutricia Lipid composition for improving function of brain functioning
CA2692394A1 (en) 2007-07-06 2009-01-15 Seth J. Baum Fatty acid compositions and methods of use
US20090064567A1 (en) * 2007-09-12 2009-03-12 Martek Biosciences Corporation Biological oils and production and uses Thereof
US20090099261A1 (en) 2007-09-25 2009-04-16 Isi Brands Inc. Omega-3 mixtures
CN101970638B (zh) * 2007-10-03 2015-02-11 纳幕尔杜邦公司 用于高水平生产二十碳五烯酸的优化解脂耶氏酵母菌株
US8343753B2 (en) 2007-11-01 2013-01-01 Wake Forest University School Of Medicine Compositions, methods, and kits for polyunsaturated fatty acids from microalgae
DE102008042932A1 (de) 2008-10-17 2010-04-22 Evonik Degussa Gmbh Herstellung und Verwendung von Methionylmethionin als Futtermitteladditiv für Fische und Krustentiere
BRPI0921539A2 (pt) * 2008-11-28 2020-08-04 Solazyme, Inc. célula, composição de óleo de trigligerídeos, mistura de óleo, método para preparar um combustível por processamento do óleo, e, combustível
US20100178369A1 (en) 2009-01-15 2010-07-15 Nicole Lee Arledge Antioxidant-stabilized concentrated fish oil
EP2401386A4 (en) 2009-02-25 2013-03-13 Vb Medicare Pvt Ltd IMPROVED METHODS FOR THE FERMENTATIVE MANUFACTURE OF DOCOSAHEXAENIC ACID
WO2010103402A1 (en) 2009-03-09 2010-09-16 Pronova Biopharma Norge As Compositions comprising a fatty acid oil mixture comprising epa and dha in free acid form and a surfactant, and methods and uses thereof
ES2895261T3 (es) 2009-03-19 2022-02-18 Dsm Ip Assets Bv Composiciones de ácidos grasos de traustoquítridos y métodos de fabricación y usos de las mismas
US8207363B2 (en) 2009-03-19 2012-06-26 Martek Biosciences Corporation Thraustochytrids, fatty acid compositions, and methods of making and uses thereof
EP2408797B1 (en) 2009-03-19 2017-03-15 DSM IP Assets B.V. Polyunsaturated fatty acid synthase nucleic acid molecules and polypeptides, compositions, and methods of making and uses thereof
EP2488022B1 (en) 2009-10-16 2018-01-10 Mochida Pharmaceutical Co., Ltd. Compositions
CN103068965A (zh) 2009-12-28 2013-04-24 Dsmip资产公司 在蔗糖上生长的重组破囊壶菌和其组合物、制备方法及用途
WO2011082189A1 (en) 2009-12-28 2011-07-07 Martek Biosciences Corporation Production of hemagglutinin-neuraminidase protein in microalgae
KR20150013667A (ko) 2010-01-19 2015-02-05 디에스엠 아이피 어셋츠 비.브이. 에이코사펜타엔산 생산 미생물, 지방산 조성물 및 이의 제조방법 및 용도
EP2576801B1 (en) 2010-06-01 2019-10-02 DSM IP Assets B.V. Extraction of lipid from cells and products therefrom
KR102149068B1 (ko) 2011-07-21 2020-08-31 디에스엠 아이피 어셋츠 비.브이. 지방산 조성물
ES2857173T3 (es) * 2011-07-21 2021-09-28 Dsm Ip Assets Bv Aceites microbianos enriquecidos en ácidos grasos poliinsaturados
SG10201605966TA (en) * 2011-07-21 2016-09-29 Dsm Ip Assets Bv Eicosapentaenoic acid-producing microorganisms, fatty acid compositions, and methods of making and uses thereof
WO2016130504A1 (en) * 2015-02-09 2016-08-18 Archer Daniels Midland Company Renewable source-derived polymer oil macroinitiators and thermoplastic block copolymers derived therefrom

Patent Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20080199923A1 (en) * 1992-10-16 2008-08-21 Martek Biosciences Corporation Process for the Heterotrophic Production of Microbial Products with High Concentrations of Omega-3 Highly Unsaturated Fatty Acids
US20090192304A1 (en) * 2001-04-16 2009-07-30 Martek Biosciences Corporation Product and Process for Transformation of Thraustochytriales Microorganisms
US20080076164A1 (en) * 2004-07-16 2008-03-27 Petra Cirpus Method for Increasing the Content of Polyunsaturated Long-Chained Fatty Acids in Transgenic Organisms
WO2007068997A2 (en) * 2005-12-16 2007-06-21 Avestha Gengraine Technologies Pvt.Ltd. Docosahexaenoic acid (dha) producing thraustochytrid strain - sc1
US20090004219A1 (en) * 2005-12-29 2009-01-01 Abl Biotechnologies Ltd. Novel Strain of Schizochytrium limacinum useful in the production of lipids and Extracellular Polysaccharides and process thereof

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
RAGAN et al. Labyrinthulid quahog parasite QPX small subunit ribosomal RNA gene, complete sequence. GenBank Accession No. AF261664. 31 July 2001 (31.07.2001) *

Also Published As

Publication number Publication date
CL2012002013A1 (es) 2013-03-22
MY160121A (en) 2017-02-28
BR112012017831B1 (pt) 2021-03-09
JP2016052311A (ja) 2016-04-14
BR122015020119A2 (pt) 2015-12-29
TWI653336B (zh) 2019-03-11
CN102884201A (zh) 2013-01-16
HK1221873A1 (zh) 2017-06-16
KR20150013667A (ko) 2015-02-05
WO2011090493A1 (en) 2011-07-28
BR122015020119B8 (pt) 2021-05-04
EP2526197A1 (en) 2012-11-28
JP2020072676A (ja) 2020-05-14
KR20170104628A (ko) 2017-09-15
US9924733B2 (en) 2018-03-27
DK2526197T3 (en) 2018-10-01
CN105360351A (zh) 2016-03-02
US9668499B2 (en) 2017-06-06
KR20180100714A (ko) 2018-09-11
EP3054016A2 (en) 2016-08-10
JP5920890B2 (ja) 2016-05-18
BR112012017831A8 (pt) 2018-06-26
US20180295860A1 (en) 2018-10-18
US11154076B2 (en) 2021-10-26
US10798952B2 (en) 2020-10-13
EA201290656A1 (ru) 2013-02-28
US20220000147A1 (en) 2022-01-06
TWI649424B (zh) 2019-02-01
JP6705599B2 (ja) 2020-06-03
KR20120133381A (ko) 2012-12-10
US20150313861A1 (en) 2015-11-05
MX343403B (es) 2016-11-03
AU2010343305A1 (en) 2012-09-06
JP2013516997A (ja) 2013-05-16
CA2993690A1 (en) 2011-07-28
EP2526197B1 (en) 2018-06-20
CN102884201B (zh) 2016-04-13
CA2787344C (en) 2018-03-20
NZ601757A (en) 2015-01-30
KR102447978B1 (ko) 2022-09-27
JP2018078900A (ja) 2018-05-24
CA2896012A1 (en) 2011-07-28
CL2015001281A1 (es) 2015-08-07
EP2526197A4 (en) 2014-05-21
BR122015020119B1 (pt) 2021-04-13
PH12016501930A1 (en) 2019-02-11
US20110177031A1 (en) 2011-07-21
EP3054016A3 (en) 2016-11-30
CA2787344A1 (en) 2011-07-28
PH12016501930B1 (en) 2019-02-11
EP4056708A1 (en) 2022-09-14
MX2012008388A (es) 2012-08-15
US20150237888A1 (en) 2015-08-27
TW201730343A (zh) 2017-09-01
CA2896012C (en) 2017-08-01
BR112012017831B8 (pt) 2021-05-25
AU2010343305B2 (en) 2015-06-11
BR112012017831A2 (pt) 2015-10-06
KR102155409B1 (ko) 2020-09-11
AR077916A1 (es) 2011-10-05
TW201125986A (en) 2011-08-01
CA2993690C (en) 2022-03-22
NZ626633A (en) 2015-10-30
US20170164639A1 (en) 2017-06-15

Similar Documents

Publication Publication Date Title
JP6705599B2 (ja) エイコサペンタエン酸生成微生物、脂肪酸組成物、ならびにそれらを作る方法およびそれらの使用
US10925850B2 (en) Eicosapentaenoic acid-producing microorganisms, fatty acid compositions, and methods of making and uses thereof
AU2016203427A1 (en) Thraustochytrids, fatty acid compositions, and methods of making and uses thereof
AU2017202422B2 (en) Eicosapentaenoic acid-producing microorganisms, fatty acid compositions, and methods of making and uses thereof

Legal Events

Date Code Title Description
MM4A Lapse of a eurasian patent due to non-payment of renewal fees within the time limit in the following designated state(s)

Designated state(s): AM AZ BY KZ KG MD TJ TM