KR20180100714A - 에이코사펜타엔산 생산 미생물, 지방산 조성물 및 이의 제조방법 및 용도 - Google Patents

에이코사펜타엔산 생산 미생물, 지방산 조성물 및 이의 제조방법 및 용도 Download PDF

Info

Publication number
KR20180100714A
KR20180100714A KR1020187025169A KR20187025169A KR20180100714A KR 20180100714 A KR20180100714 A KR 20180100714A KR 1020187025169 A KR1020187025169 A KR 1020187025169A KR 20187025169 A KR20187025169 A KR 20187025169A KR 20180100714 A KR20180100714 A KR 20180100714A
Authority
KR
South Korea
Prior art keywords
weight
pta
day
fraction
biomass
Prior art date
Application number
KR1020187025169A
Other languages
English (en)
Other versions
KR102447978B1 (ko
Inventor
컬크 이. 앱트
폴 워렌 베흐렌스
존 밀톤 한센
조세프 더블유 페이펄 3세
트레이시 린 스탈
로스 질클레
Original Assignee
디에스엠 아이피 어셋츠 비.브이.
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Family has litigation
First worldwide family litigation filed litigation Critical https://patents.darts-ip.com/?family=44277725&utm_source=google_patent&utm_medium=platform_link&utm_campaign=public_patent_search&patent=KR20180100714(A) "Global patent litigation dataset” by Darts-ip is licensed under a Creative Commons Attribution 4.0 International License.
Application filed by 디에스엠 아이피 어셋츠 비.브이. filed Critical 디에스엠 아이피 어셋츠 비.브이.
Publication of KR20180100714A publication Critical patent/KR20180100714A/ko
Application granted granted Critical
Publication of KR102447978B1 publication Critical patent/KR102447978B1/ko

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
    • C12N1/12—Unicellular algae; Culture media therefor
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A23—FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
    • A23C—DAIRY PRODUCTS, e.g. MILK, BUTTER OR CHEESE; MILK OR CHEESE SUBSTITUTES; MAKING THEREOF
    • A23C9/00—Milk preparations; Milk powder or milk powder preparations
    • A23C9/152—Milk preparations; Milk powder or milk powder preparations containing additives
    • A23C9/1528—Fatty acids; Mono- or diglycerides; Petroleum jelly; Paraffine; Phospholipids; Derivatives thereof
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A23—FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
    • A23D—EDIBLE OILS OR FATS, e.g. MARGARINES, SHORTENINGS, COOKING OILS
    • A23D9/00—Other edible oils or fats, e.g. shortenings, cooking oils
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A23—FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
    • A23D—EDIBLE OILS OR FATS, e.g. MARGARINES, SHORTENINGS, COOKING OILS
    • A23D9/00—Other edible oils or fats, e.g. shortenings, cooking oils
    • A23D9/007—Other edible oils or fats, e.g. shortenings, cooking oils characterised by ingredients other than fatty acid triglycerides
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A23—FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
    • A23K—FODDER
    • A23K10/00—Animal feeding-stuffs
    • A23K10/10—Animal feeding-stuffs obtained by microbiological or biochemical processes
    • A23K10/12—Animal feeding-stuffs obtained by microbiological or biochemical processes by fermentation of natural products, e.g. of vegetable material, animal waste material or biomass
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A23—FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
    • A23K—FODDER
    • A23K20/00—Accessory food factors for animal feeding-stuffs
    • A23K20/10—Organic substances
    • A23K20/158—Fatty acids; Fats; Products containing oils or fats
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A23—FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
    • A23K—FODDER
    • A23K50/00—Feeding-stuffs specially adapted for particular animals
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A23—FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
    • A23K—FODDER
    • A23K50/00—Feeding-stuffs specially adapted for particular animals
    • A23K50/40—Feeding-stuffs specially adapted for particular animals for carnivorous animals, e.g. cats or dogs
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A23—FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
    • A23K—FODDER
    • A23K50/00—Feeding-stuffs specially adapted for particular animals
    • A23K50/80—Feeding-stuffs specially adapted for particular animals for aquatic animals, e.g. fish, crustaceans or molluscs
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A23—FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
    • A23L—FOODS, FOODSTUFFS, OR NON-ALCOHOLIC BEVERAGES, NOT COVERED BY SUBCLASSES A21D OR A23B-A23J; THEIR PREPARATION OR TREATMENT, e.g. COOKING, MODIFICATION OF NUTRITIVE QUALITIES, PHYSICAL TREATMENT; PRESERVATION OF FOODS OR FOODSTUFFS, IN GENERAL
    • A23L2/00—Non-alcoholic beverages; Dry compositions or concentrates therefor; Their preparation
    • A23L2/52—Adding ingredients
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A23—FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
    • A23L—FOODS, FOODSTUFFS, OR NON-ALCOHOLIC BEVERAGES, NOT COVERED BY SUBCLASSES A21D OR A23B-A23J; THEIR PREPARATION OR TREATMENT, e.g. COOKING, MODIFICATION OF NUTRITIVE QUALITIES, PHYSICAL TREATMENT; PRESERVATION OF FOODS OR FOODSTUFFS, IN GENERAL
    • A23L33/00—Modifying nutritive qualities of foods; Dietetic products; Preparation or treatment thereof
    • A23L33/10—Modifying nutritive qualities of foods; Dietetic products; Preparation or treatment thereof using additives
    • A23L33/115—Fatty acids or derivatives thereof; Fats or oils
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A23—FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
    • A23L—FOODS, FOODSTUFFS, OR NON-ALCOHOLIC BEVERAGES, NOT COVERED BY SUBCLASSES A21D OR A23B-A23J; THEIR PREPARATION OR TREATMENT, e.g. COOKING, MODIFICATION OF NUTRITIVE QUALITIES, PHYSICAL TREATMENT; PRESERVATION OF FOODS OR FOODSTUFFS, IN GENERAL
    • A23L33/00—Modifying nutritive qualities of foods; Dietetic products; Preparation or treatment thereof
    • A23L33/40—Complete food formulations for specific consumer groups or specific purposes, e.g. infant formula
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/185—Acids; Anhydrides, halides or salts thereof, e.g. sulfur acids, imidic, hydrazonic or hydroximic acids
    • A61K31/19—Carboxylic acids, e.g. valproic acid
    • A61K31/20—Carboxylic acids, e.g. valproic acid having a carboxyl group bound to a chain of seven or more carbon atoms, e.g. stearic, palmitic, arachidic acids
    • A61K31/201—Carboxylic acids, e.g. valproic acid having a carboxyl group bound to a chain of seven or more carbon atoms, e.g. stearic, palmitic, arachidic acids having one or two double bonds, e.g. oleic, linoleic acids
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/185—Acids; Anhydrides, halides or salts thereof, e.g. sulfur acids, imidic, hydrazonic or hydroximic acids
    • A61K31/19—Carboxylic acids, e.g. valproic acid
    • A61K31/20—Carboxylic acids, e.g. valproic acid having a carboxyl group bound to a chain of seven or more carbon atoms, e.g. stearic, palmitic, arachidic acids
    • A61K31/202—Carboxylic acids, e.g. valproic acid having a carboxyl group bound to a chain of seven or more carbon atoms, e.g. stearic, palmitic, arachidic acids having three or more double bonds, e.g. linolenic
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K35/00—Medicinal preparations containing materials or reaction products thereof with undetermined constitution
    • A61K35/66—Microorganisms or materials therefrom
    • A61K35/68—Protozoa, e.g. flagella, amoebas, sporozoans, plasmodium or toxoplasma
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K8/00—Cosmetics or similar toiletry preparations
    • A61K8/18—Cosmetics or similar toiletry preparations characterised by the composition
    • A61K8/30—Cosmetics or similar toiletry preparations characterised by the composition containing organic compounds
    • A61K8/33—Cosmetics or similar toiletry preparations characterised by the composition containing organic compounds containing oxygen
    • A61K8/36—Carboxylic acids; Salts or anhydrides thereof
    • A61K8/361—Carboxylic acids having more than seven carbon atoms in an unbroken chain; Salts or anhydrides thereof
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P29/00—Non-central analgesic, antipyretic or antiinflammatory agents, e.g. antirheumatic agents; Non-steroidal antiinflammatory drugs [NSAID]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P3/00—Drugs for disorders of the metabolism
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P3/00—Drugs for disorders of the metabolism
    • A61P3/02—Nutrients, e.g. vitamins, minerals
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61Q—SPECIFIC USE OF COSMETICS OR SIMILAR TOILETRY PREPARATIONS
    • A61Q19/00—Preparations for care of the skin
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C11—ANIMAL OR VEGETABLE OILS, FATS, FATTY SUBSTANCES OR WAXES; FATTY ACIDS THEREFROM; DETERGENTS; CANDLES
    • C11B—PRODUCING, e.g. BY PRESSING RAW MATERIALS OR BY EXTRACTION FROM WASTE MATERIALS, REFINING OR PRESERVING FATS, FATTY SUBSTANCES, e.g. LANOLIN, FATTY OILS OR WAXES; ESSENTIAL OILS; PERFUMES
    • C11B1/00—Production of fats or fatty oils from raw materials
    • C11B1/10—Production of fats or fatty oils from raw materials by extracting
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C11—ANIMAL OR VEGETABLE OILS, FATS, FATTY SUBSTANCES OR WAXES; FATTY ACIDS THEREFROM; DETERGENTS; CANDLES
    • C11B—PRODUCING, e.g. BY PRESSING RAW MATERIALS OR BY EXTRACTION FROM WASTE MATERIALS, REFINING OR PRESERVING FATS, FATTY SUBSTANCES, e.g. LANOLIN, FATTY OILS OR WAXES; ESSENTIAL OILS; PERFUMES
    • C11B3/00—Refining fats or fatty oils
    • C11B3/02—Refining fats or fatty oils by chemical reaction
    • C11B3/04—Refining fats or fatty oils by chemical reaction with acids
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
    • C12N1/10—Protozoa; Culture media therefor
    • C12N1/105—Protozoal isolates
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
    • C12N1/12—Unicellular algae; Culture media therefor
    • C12N1/125—Unicellular algae isolates
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P7/00—Preparation of oxygen-containing organic compounds
    • C12P7/64—Fats; Fatty oils; Ester-type waxes; Higher fatty acids, i.e. having at least seven carbon atoms in an unbroken chain bound to a carboxyl group; Oxidised oils or fats
    • C12P7/6409—Fatty acids
    • C12P7/6427—Polyunsaturated fatty acids [PUFA], i.e. having two or more double bonds in their backbone
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P7/00—Preparation of oxygen-containing organic compounds
    • C12P7/64—Fats; Fatty oils; Ester-type waxes; Higher fatty acids, i.e. having at least seven carbon atoms in an unbroken chain bound to a carboxyl group; Oxidised oils or fats
    • C12P7/6409—Fatty acids
    • C12P7/6427—Polyunsaturated fatty acids [PUFA], i.e. having two or more double bonds in their backbone
    • C12P7/6432—Eicosapentaenoic acids [EPA]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P7/00—Preparation of oxygen-containing organic compounds
    • C12P7/64—Fats; Fatty oils; Ester-type waxes; Higher fatty acids, i.e. having at least seven carbon atoms in an unbroken chain bound to a carboxyl group; Oxidised oils or fats
    • C12P7/6409—Fatty acids
    • C12P7/6427—Polyunsaturated fatty acids [PUFA], i.e. having two or more double bonds in their backbone
    • C12P7/6434—Docosahexenoic acids [DHA]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P7/00—Preparation of oxygen-containing organic compounds
    • C12P7/64—Fats; Fatty oils; Ester-type waxes; Higher fatty acids, i.e. having at least seven carbon atoms in an unbroken chain bound to a carboxyl group; Oxidised oils or fats
    • C12P7/6436—Fatty acid esters
    • C12P7/6445—Glycerides
    • C12P7/6458—Glycerides by transesterification, e.g. interesterification, ester interchange, alcoholysis or acidolysis
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P7/00—Preparation of oxygen-containing organic compounds
    • C12P7/64—Fats; Fatty oils; Ester-type waxes; Higher fatty acids, i.e. having at least seven carbon atoms in an unbroken chain bound to a carboxyl group; Oxidised oils or fats
    • C12P7/6436—Fatty acid esters
    • C12P7/6445—Glycerides
    • C12P7/6472—Glycerides containing polyunsaturated fatty acid [PUFA] residues, i.e. having two or more double bonds in their backbone
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A23—FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
    • A23V—INDEXING SCHEME RELATING TO FOODS, FOODSTUFFS OR NON-ALCOHOLIC BEVERAGES AND LACTIC OR PROPIONIC ACID BACTERIA USED IN FOODSTUFFS OR FOOD PREPARATION
    • A23V2002/00—Food compositions, function of food ingredients or processes for food or foodstuffs
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K2800/00—Properties of cosmetic compositions or active ingredients thereof or formulation aids used therein and process related aspects
    • A61K2800/10—General cosmetic use
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12R—INDEXING SCHEME ASSOCIATED WITH SUBCLASSES C12C - C12Q, RELATING TO MICROORGANISMS
    • C12R2001/00—Microorganisms ; Processes using microorganisms
    • C12R2001/89—Algae ; Processes using algae
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12R—INDEXING SCHEME ASSOCIATED WITH SUBCLASSES C12C - C12Q, RELATING TO MICROORGANISMS
    • C12R2001/00—Microorganisms ; Processes using microorganisms
    • C12R2001/90—Protozoa ; Processes using protozoa
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
    • Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
    • Y02A40/00—Adaptation technologies in agriculture, forestry, livestock or agroalimentary production
    • Y02A40/80—Adaptation technologies in agriculture, forestry, livestock or agroalimentary production in fisheries management
    • Y02A40/81—Aquaculture, e.g. of fish
    • Y02A40/818—Alternative feeds for fish, e.g. in aquacultures
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
    • Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10S426/00—Food or edible material: processes, compositions, and products
    • Y10S426/805—Pet food for dog, cat, bird, or fish

Abstract

본 발명은 분리된 미생물 뿐만 아니라 이의 균주 및 돌연변이체, 바이오매스, 미생물 오일, 조성물 및 배양물; 상기 미생물 오일, 바이오매스 및 돌연변이체를 생산하는 방법; 및 분리된 미생물, 바이오매스 및 미생물 오일을 사용하는 방법에 관한 것이다.

Description

에이코사펜타엔산 생산 미생물, 지방산 조성물 및 이의 제조방법 및 용도{EICOSAPENTAENOIC ACID-PRODUCING MICROORGANISMS, FATTY ACID COMPOSITIONS, AND METHODS OF MAKING AND USES THEREOF}
본 발명은 분리된 미생물 뿐만 아니라 이의 균주 및 돌연변이체, 바이오매스(biomass), 미생물 오일, 조성물 및 배양물; 상기 미생물 오일, 바이오매스 및 돌연변이체를 생산하는 방법; 및 상기 분리된 미생물, 바이오매스 및 미생물 오일을 사용하는 방법에 관한 것이다.
지방산은 탄소 쇄의 길이 및 포화 특성을 기초로 하여 분류된다. 지방산은 쇄에 존재하는 탄소수에 기초하여 단쇄, 중쇄 또는 장쇄 지방산으로 명명되고, 이중 결합이 탄소 원자들 사이에 존재하지 않는 경우에 포화 지방산으로 명명되며, 이중 결합이 존재하는 경우에 불포화 지방산으로 명명된다. 불포화 장쇄 지방산은, 단지 하나의 이중 결합이 존재하는 경우에 일불포화(monounsaturated)되고, 하나 이상의 이중 결합이 존재하는 경우에 다중불포화(polyunsaturated)된다.
다중불포화된 지방산(PUFA)은 지방산의 메틸 말단으로부터 첫번째 이중 결합의 위치를 기초로 하여 분류되며: 오메가-3(n-3) 지방산은 세번째 탄소에서 제1 이중 결합을 함유하는 반면, 오메가-6(n-6) 지방산은 6번째 탄소에서 제1 이중 결합을 함유한다. 예를 들면, 도코사헥사엔산("DHA")은, 쇄 길이가 22개 탄소이고 6개의 이중 결합을 갖는, 흔히 "22:6 n-3"로 지정되는 오메가-3 장쇄 다중불포화 지방산(LC-PUFA)이다. 다른 오메가-3 LC-PUFA는 "20:5 n-3"로 지정된 에이코사펜타엔산("EPA"), 및 "22:5 n-3"로 지정된 오메가-3 도코사펜타엔산("DPA n-3")을 포함한다. DHA 및 EPA는 "필수" 지방산으로 명명된다. 오메가-6 LC-PUFA는 "20:4 n-6"로 지정된 아라키돈산("ARA"), 및 "22:5 n-6"로 지정된 오메가-6 도코사펜타엔산 ("DPA n-6")을 포함한다.
오메가-3 지방산은 세포막내 이들의 존재로 인하여 세포 생리학에 영향을 미치며, 생물학적 활성 화합물의 생산 및 유전자 발현을 조절하고, 생합성 기질(substrate)로서 사용되는 생물학적으로 중요한 분자이다[참조: Roche, H. M., Proc. Nutr. Soc. 58: 397-401 (1999)]. 예를 들면, 인간 대뇌 피질 속 지질의 약 15% 내지 20%, 망막 속 지질의 30% 내지 60%를 차지하는 DHA는 고환 및 정자 속에서 농축되며, 모유의 중요한 성분이다[참조: Berge, J.P., and Barnathan, G.. Adv. Biochem. Eng. Biotechnol. 96 :49-125 (2005)]. DHA는 뇌 속 오메가-3 지방산의 97% 이하 및 망막내 오메가-3 지방산의 93% 이하를 차지한다. 또한, DHA는 태아 및 유아 발달 둘 다 뿐만 아니라, 성인에서 인지 기능의 유지에도 필수적이다(상기 문헌 참조). 오메가-3 지방산은 인간 체내에서 새로이 합성되지 않으므로, 이들 지방산은 영양원으로부터 유래되어야만 한다.
아마씨유(flaxseed oil) 및 어유(fish oil)는 오메가-3 지방산의 우수한 식이원으로 고려된다. 아마씨유는 EPA, DHA, DPA, 또는 ARA를 함유하지 않지만 오히려 체내에서 EPA를 제조할 수 있도록 하는 구성 요소(building block)인, 리놀렌산(C18:3 n-3)을 함유한다. 그러나, 대사 전환률은, 특히 건강이 악화된 인간들 중에서 느리고 가변적일 수 있다는 증거가 존재한다. 어유는 특수한 종 및 이들의 식이에 따라 지방산 조성의 유형 및 수준이 상당히 변한다. 예를 들면, 양식에 의해 길러낸 어류는 야생의 것보다 더 낮은 수준의 오메가-3 지방산을 갖는 경향이 있다. 더욱이, 어유는 환경 오염 물질을 함유할 위험성을 수반하며 안정성 문제 및 비린내 또는 맛과 관련될 수 있다.
트라우스토키트리드는 트라우스토키트리알레스(Thraustochytriales) 목의 미생물이다. 트라우스토키트리드는 스키조키트리움(Schizochytrium) 및 트라우스토키트리움(Thraustochytrium) 속의 구성원들을 포함하며 DHA 및 EPA를 포함하는 오메가-3 지방산의 대체 공급원으로서 인식되어 왔다(참조: 미국 특허 제5,130,242호). 이러한 해양 종속영양성 미생물로부터 생산된 오일은 흔히 상응하는 어유 또는 미세조류 오일보다 더 단순한 다중불포화 지방산 프로파일을 갖는다[참조: Lewis, T.E., Mar. Biotechnol. 1: 580-587 (1999)]. 트라우스토키트리드 종의 균주는 유기체에 의해 생산된 총 지방산의 높은 퍼센트로 오메가-3 지방산을 생산하는 것으로 보고되어 있다[참조: 미국 특허 제5,130,242호; Huang, J. et al., J. Am. Oil. Chem. Soc. 78: 605-610 (2001); Huang, J. et al., Mar. Biotechnol. 5: 450-457 (2003)]. 그러나, 분리된 트라우스토키트리드는 생산된 LC-PUFA의 동일성 및 양에 있어서 다양하여, 일부 앞서 기술된 균주는 바람직하지 않은 수준의 오메가-6 지방산을 가질 수 있고/있거나 배양시 낮은 생산성을 입증할 수 있다.
이에, 높은 생산성 및 바람직한 LC-PUFA 프로파일이 입증된 미생물의 분리가 지속적으로 요구되고 있다.
본 발명은 ATCC 수탁번호 PTA-10212로 기탁된 종의 분리된 미생물에 관한 것이다.
본 발명은 ATCC 수탁번호 PTA-10212로 기탁된 종의 특성을 갖는 분리된 미생물에 관한 것이다.
본 발명은 서열번호 1의 폴리뉴클레오티드 서열 또는 서열번호 1과의 동일성이 적어도 94%인 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하는 18s rRNA을 포함하는 분리된 미생물에 관한 것이다.
본 발명은 ATCC 수탁번호 PTA-10212로 기탁된 미생물의 18s rRNA 폴리뉴클레오티드 서열과의 동일성이 적어도 94%인 18s rRNA 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하는 분리된 미생물에 관한 것이다.
본 발명은 ATCC 수탁번호 PTA-10208로 기탁된 종의 분리된 미생물로서, 상기 미생물에 의해 생산된 총 지방산이 약 10중량% 이상의 에이코사펜타엔산을 포함하는, 분리된 미생물에 관한 것이다.
본 발명은 ATCC 수탁번호 PTA-10208로 기탁된 종의 특성을 갖는 분리된 미생물로서, 상기 미생물에 의해 생산된 총 지방산이 약 10중량% 이상의 에이코사펜타엔산을 포함하는, 분리된 미생물에 관한 것이다.
본 발명은 트리아실글리세롤 분획을 생산하는 분리된 미생물로서, 상기 트리아실글리세롤 분획의 에이코사펜타엔산 함량이 약 12중량% 이상인, 분리된 미생물에 관한 것이다.
일부 양태에서, 본 발명의 미생물은 돌연변이체 균주이다.
본 발명은 ATCC 수탁번호 PTA-10212, PTA-10213, PTA-10214, PTA-10215, PTA-10208, PTA-10209, PTA-10210, 또는 PTA-10211로 기탁된 분리된 미생물에 관한 것이다.
본 발명은 본 발명의 임의의 미생물 또는 이의 혼합물을 포함하는 바이오매스에 관한 것이다.
본 발명은, 분리된 바이오매스으로서, 상기 바이오매스의 건조 세포 중의 적어도 약 20중량%가 지방산이고, 상기 지방산의 약 10중량% 이상이 에이코사펜타엔산이고, 상기 지방산이 각각 약 5중량% 미만의 아라키돈산 및 도코사펜타엔산 n-6을 포함하는, 분리된 바이오매스에 관한 것이다. 일부 양태에서, 지방산의 적어도 약 25중량%는 도코사헥사엔산이다.
일부 양태에서, 본 발명은, 트리아실글리세롤을 포함하는 분리된 바이오매스으로서, 트리아실글리세롤의 적어도 약 12중량%가 에이코사펜타엔산인, 분리된 바이오매스에 관한 것이다.
일부 양태에서, 본 발명은, 지방산이 각각 약 5중량% 미만의 올레산(oleic acid), 리놀레산(linoleic acid), 리놀렌산(linolenic acid), 에이코센산(eicosenoic acid) 및 에루크산(erucic acid)을 포함하는, 본 발명의 분리된 바이오매스에 관한 것이다.
본 발명은 본 발명의 임의의 미생물 또는 이의 혼합물을 포함하는 분리된 배양물에 관한 것이다.
본 발명은, 본 발명의 미생물 또는 바이오매스 또는 이의 혼합물을 포함하는, 비-인간 동물 또는 인간용 식품, 화장품 또는 약제학적 조성물에 관한 것이다.
본 발명은 적어도 약 20중량%의 에이코사펜타엔산 및 각각 약 5중량% 미만의 아라키돈산, 도코사펜타엔산 n-6, 올레산, 리놀레산, 리놀렌산, 에이코센산, 에루크산 및 스테아리돈산을 포함하는, 미생물 오일에 관한 것이다. 일부 양태에서, 미생물 오일은 적어도 약 25중량%의 도코사헥사엔산을 추가로 포함한다.
본 발명은, 적어도 약 10중량%의 트리아실글리세롤 분획을 포함하는 미생물 오일로서, 상기 트리아실글리세롤 분획 중의 지방산의 적어도 약 12중량%가 에이코사펜타엔산이고, 상기 트리아실글리세롤 분획 중의 지방산의 적어도 약 25중량%가 도코사헥사엔산이고, 상기 트리아실글리세롤 분획 중의 지방산의 약 5중량% 미만이 아라키돈산인, 미생물 오일에 관한 것이다.
본 발명은, 본 발명의 임의의 미생물 오일을 포함하는, 비-인간 동물 또는 인간용 식품, 화장품 또는 약제학적 조성물에 관한 것이다. 일부 양태에서, 상기 식품은 영아용 조제식이다. 일부 양태에서, 상기 영아용 조제식은 조산아에 적합하다. 일부 양태에서, 상기 식품은 우유, 음료, 치료학적 음료, 영양 음료, 또는 이들의 배합물이다. 일부 양태에서, 상기 식품은 비-인간 동물 또는 인간 음식용 첨가제이다. 일부 양태에서, 상기 식품은 영양 보충물이다. 일부 양태에서, 상기 식품은 동물 사료이다. 일부 양태에서, 상기 동물 사료는 수산 양식 사료이다. 일부 양태에서, 상기 동물 사료는 애완 동물 사료, 동물원 동물 사료, 노동 동물(work animal) 사료, 가축 사료 또는 이들의 배합물이다.
본 발명은, 본 발명의 임의의 분리된 미생물 또는 이의 혼합물을 배양물에서 성장시켜 오메가-3 지방산을 포함하는 오일을 생산하는 단계를 포함하는, 오메가-3 지방산을 포함하는 미생물 오일의 생산 방법에 관한 것이다. 일부 양태에서, 상기 방법은 오일을 추출하는 단계를 추가로 포함한다.
본 발명은, 오메가-3 지방산을 포함하는 오일을 본 발명의 바이오매스으로부터 추출함을 포함하는, 오메가-3 지방산을 포함하는 미생물 오일의 생산 방법에 관한 것이다. 일부 양태에서, 상기 미생물 오일은 유기 용매 추출 방법, 예를 들면, 헥산 추출을 사용하여 추출한다. 일부 양태에서, 상기 미생물 오일은 무용매 추출 공정을 사용하여 추출한다.
본 발명은 본 발명의 방법으로 생산한 미생물 오일에 관한 것이다.
본 발명은, 본 발명의 임의의 분리된 미생물 또는 이의 배합물을 배양물에서 성장시켜 바이오매스을 생산하는 단계를 포함하는, 본 발명의 임의의 바이오매스의 생산 방법에 관한 것이다.
본 발명은 본 발명의 방법으로 생산한 바이오매스에 관한 것이다.
본 발명은, 본 발명의 임의의 미생물을 돌연변이시키는 단계 및 돌연변이체 균주를 분리하는 단계를 포함하는, 본 발명의 돌연변이체 균주의 생산 방법에 관한 것이다.
본 발명은, 염증 또는 이와 관련된 증상 치료용 의약을 제조하기 위한, 본 발명의 임의의 분리된 미생물, 바이오매스 또는 미생물 오일, 또는 이들의 혼합물의 용도에 관한 것이다.
본 발명은, 염증 또는 이와 관련된 증상을 치료하기 위한, 본 발명의 임의의 분리된 미생물, 바이오매스 또는 미생물 오일, 또는 이들의 혼합물의 용도에 관한 것이다.
본 발명은, 염증 또는 이와 관련된 증상의 치료에 사용하기 위한, 본 발명의 임의의 분리된 미생물, 바이오매스 또는 미생물 오일, 또는 이들의 혼합물의 용도에 관한 것이다.
본 발명은, 본 발명의 임의의 분리된 미생물, 바이오매스 또는 미생물 오일, 또는 이들의 혼합물, 및 약제학적으로 허용되는 담체를 대상체에게 투여함을 포함하는, 염증 또는 이와 관련된 증상의 치료가 필요한 대상체에서 염증 또는 이와 관련된 증상의 치료 방법에 관한 것이다.
본 발명은 분리된 미생물 뿐만 아니라 이의 균주 및 돌연변이체, 및 이의 바이오매스, 미생물 오일, 조성물 및 배양물에 관한 것이다. 본 발명은 본 발명의 미생물로부터 미생물 오일, 바이오매스 및 돌연변이체를 생산하는 방법 및 상기 미생물, 바이오매스 및 미생물 오일을 사용하는 방법에 관한 것이다. 본원에 기재된 미생물은 매우 생산적이며, 고도의 오메가-3 지방산, 특히 고도의 EPA를 부분적으로 특성으로 하는 독특한 지방산 프로파일을 생성한다.
미생물
본 발명은 분리된 미생물 및 이로부터 기원하는 균주에 관한 것이다. 본 발명의 분리된 미생물로부터 "기원하는" 균주는 천연 또는 합성 유도체, 예를 들면, 돌연변이체, 변이체 또는 재조합체 균주일 수 있다. 본원에 사용된 용어 "분리된"은 분리물이 정제된 정도를 반드시 반영하는 것이 아니라, 천연 형태 또는 천연 환경으로부터의 분리 또는 격리를 나타낸다. 분리물은, 이로써 한정되는 것은 아니지만, 분리된 미생물, 분리된 바이오매스, 분리된 배양물, 분리된 미생물 오일 및 분리된 서열(예를 들면, 본원에 개시된 분리된 폴리뉴클레오티드 서열)을 포함할 수 있다. 본원에 사용된 용어 "미생물"은, 이로써 한정되는 것은 아니지만, 용어 "미세조류", "트라우스토키트리드", 및 본원에 기재된 임의의 기탁된 미생물과 관련된 분류학상 분류를 포함한다. 본원에 기재된 기탁된 미생물을 포함하여 본원의 임의의 미생물과 관련하여 사용된 용어 "트라우스토키트리알레스", "트라우스토키트리드", "스키조키트리움", 및 "트라우스토키트리움"은 이용가능하는 계통발생학상 정보를 포함하는 현재의 분류학상 분류에 기초하며, 분류학상 분류가 본 출원의 출원일 이후에 재분류되는 경우에 한정되는 것으로 의도되지 않는다.
일부 양태에서, 본 발명은 ATCC 수탁번호 PTA-10212로 기탁된 종의 분리된 미생물에 관한 것이다. ATCC 수탁번호 PTA-10212와 관련된 분리된 미생물은 또한 트라우스토키트리움(Thraustochytrium) 종 ATCC PTA-10212로서 본원에 알려져 있다. ATCC 수탁번호 PTA-10212와 관련된 분리된 미생물은 2009년 7월 14일자로 부다페스트 조약하에 미국 버지니아 20110-2209, 마나사스, 유니버시티 불러바드 10801에 소재하는 아메리칸 타입 컬쳐 컬렉션(American Type Culture Collection)(Patent Depository)에 기탁되었다. 일부 양태에서, 본 발명은 ATCC 수탁번호 PTA-10212로 기탁된 분리된 균주에 관한 것이다.
일부 양태에서, 본 발명은 ATCC 수탁번호 PTA-10212로 기탁된 종의 특성을 갖는 분리된 미생물 또는 이로부터 기원하는 균주에 관한 것이다. ATCC 수탁번호 PTA-10212로 기탁된 종의 특성은 이의 성장 및 표현형 특성(표현형 특성의 예는 형태학적 및 생식 특성을 포함한다), 이의 물리적 및 화학적 특성(예: 건조 중량 및 지질 프로파일), 이의 유전자 서열 및 이들의 조합을 포함하고, 상기 특성은 이미 동정된 종과 비교하여 상기 종을 구별한다. 일부 양태에서, 본 발명은 ATCC 수탁번호 PTA-10212로 기탁된 종의 특성을 갖는 분리된 미생물로서, 상기 특성이 서열번호 1의 폴리뉴클레오티드 서열 또는 서열번호 1과의 동일성이 적어도 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99%인 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하는 18s rRNA, ATCC 수탁번호 PTA-10212로 기탁된 종의 형태학적 및 생식 특성, 및 ATCC 수탁번호 PTA-10212로 기탁된 종의 지방산 프로파일을 포함한다. 일부 양태에서, 본 발명의 분리된 미생물은 ATCC 수탁번호 PTA-10212로 기탁된 미생물과 실질적으로 동일한 표현형 특성을 갖는다. 일부 양태에서, 본 발명의 분리된 미생물은 ATCC 수탁번호 PTA-10212로 기탁된 미생물과 실질적으로 동일한 성장 특성을 갖는다. 일부 양태에서, 본 발명은 서열번호 1의 폴리뉴클레오티드 서열 또는 서열번호 1과의 동일성이 적어도 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99%인 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하는 18s rRNA를 포함하는 분리된 미생물에 관한 것이다. 일부 양태에서, 본 발명은 ATCC 수탁번호 PTA-10212로 기탁된 미생물의 18s rRNA 폴리뉴클레오티드 서열과의 동일성이 적어도 94%인 18s rRNA 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하는 분리된 미생물에 관한 것이다.
일부 양태에서, 본 발명은 ATCC 수탁번호 PTA-10212로 기탁된 미생물의 돌연변이체 균주에 관한 것이다. 추가의 양태에서, 돌연변이체 균주는 ATCC 수탁번호 PTA-10213, PTA-10214 또는 PTA-10215로 기탁된 균주이다. ATCC 수탁번호 PTA-10213, PTA-10214 또는 PTA-10215와 관련된 미생물은 2009년 7월 14일자로 부다페스트 조약하에 미국 버지니아 20110-2209, 마나사스, 유니버시티 불러바드 10801에 소재하는 아메리칸 타입 컬쳐 컬렉션(Patent Depository)에 기탁되었다.
일부 양태에서, 본 발명은 ATCC 수탁번호 PTA-10208로 기탁된 종의 분리된 미생물에 관한 것이다. ATCC 수탁번호 PTA-10208과 관련된 분리된 미생물은 본원에서 또한 스키조키트리움 종 ATCC PTA-10208로서 공지되어 있다. ATCC 수탁번호 PTA-10208과 관련된 미생물은 2009년 7월 14일자로 부다페스트 조약하에 미국 버지니아 20110-2209, 마나사스, 유니버시티 불러바드 10801에 소재하는 아메리칸 타입 컬쳐 컬렉션(Patent Depository)에 기탁되었다. 일부 양태에서, 본 발명은 ATCC 수탁번호 PTA-10208로 기탁된 분리된 균주에 관한 것이다.
일부 양태에서, 본 발명은, ATCC 수탁번호 PTA-10208로 기탁된 종의 분리된 미생물로서, 상기 미생물에 의해 생산된 총 지방산이 약 10중량% 이상, 약 11중량% 이상, 약 12중량% 이상, 약 13중량% 이상, 약 14중량% 이상, 약 15중량% 이상, 약 16중량% 이상, 약 17중량% 이상, 약 18중량% 이상, 약 19중량% 이상 또는 약 20중량% 이상의 EPA를 포함하는, 분리된 미생물에 관한 것이다. 일부 양태에서, 본 발명은, ATCC 수탁번호 PTA-10208로 기탁된 종의 분리된 미생물로서, 상기 미생물에 의해 생산된 총 지방산이 약 10 내지 약 55중량%, 약 10 내지 약 50중량%, 약 10 내지 약 45중량%, 약 10 내지 약 40중량%, 약 10 내지 약 35중량%, 약 10 내지 약 30중량%, 약 15 내지 약 55중량%, 약 15 내지 약 50중량%, 약 15 내지 약 45중량%, 약 15 내지 약 40중량%, 약 15 내지 약 35중량%, 약 15 내지 약 30중량%, 약 20 내지 약 55중량%, 약 20 내지 약 20중량%, 약 20 내지 약 45중량%, 약 20 내지 약 40중량%, 약 20 내지 약 35중량% 또는 약 20 내지 약 30중량%의 EPA를 포함하는, 분리된 미생물에 관한 것이다.
일부 양태에서, 본 발명은, ATCC 수탁번호 PTA-10208로 기탁된 종의 특성을 갖는 분리된 미생물로서, 상기 미생물에 의해 생산된 총 지방산이 약 10중량% 이상의 에이코사펜타엔산을 포함하는, 분리된 미생물에 관한 것이다. ATCC 수탁번호 PTA-10208로 기탁된 미생물의 특성은 이의 성장 및 표현형 특성(표현형 특성의 예는 형태학적 및 생식 특성을 포함한다), 이의 물리적 및 화학적 특성(예: 건조 중량 및 지질 프로파일), 이의 유전자 서열 및 이들의 조합을 포함하고, 상기 특성은 이미 동정된 종과 비교하여 상기 종을 구별한다. 일부 양태에서, 본 발명은, ATCC 수탁번호 PTA-10212로 기탁된 종의 특성을 갖는 분리된 미생물로서, 상기 특성이 서열번호 2의 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하는 18s rRNA, ATCC 수탁번호 PTA-10208로 기탁된 종의 형태학적 및 생식 특성 및 ATCC 수탁번호 PTA-10208로 기탁된 종의 지방산 프로파일을 포함한다. 일부 양태에서, 본 발명의 분리된 미생물은 ATCC 수탁번호 PTA-10208로 기탁된 미생물과 실질적으로 동일한 물리적 및 화학적 특성을 갖는다.
일부 양태에서, 본 발명은 ATCC 수탁번호 PTA-10208로 기탁된 미생물의 돌연변이체 균주에 관한 것이다. 추가의 양태에서, 돌연변이체 균주는 ATCC 수탁번호 PTA-10209, PTA-10210 또는 PTA-10211로 기탁된 균주이다. ATCC 수탁번호 PTA-10209, PTA-10210 및 PTA-10211로 기탁된 미생물은 2009년 9월 25일자로 부다페스트 조약하에 미국 버지니아 20110-2209, 마나사스, 유니버시티 불러바드 10801에 소재하는 아메리칸 타입 컬쳐 컬렉션(Patent Depository)에 기탁되었다.
일부 양태에서, 본 발명은, 트리아실글리세롤 분획을 생산하는 본 발명의 분리된 미생물로서, 상기 트리아실글리세롤 분획의 EPA 함량이 적어도 약 12중량%, 적어도 약 13중량%, 적어도 약 14중량%, 적어도 약 15중량%, 적어도 약 16중량%, 적어도 약 17중량%, 적어도 약 18중량%, 적어도 약 19중량% 또는 적어도 약 20중량%인 분리된 미생물에 관한 것이다. 일부 양태에서, 본 발명은, 트리아실글리세롤 분획을 생산하는 분리된 미생물로서, 상기 트리아실글리세롤 분획의 EPA 함량이 약 12 내지 약 55중량%, 약 12 내지 약 50중량%, 약 12 내지 약 45중량%, 약 12 내지 약 40중량%, 약 12 내지 약 35중량%, 약 12 내지 약 30중량%, 약 15 내지 약 45중량%, 약 15 내지 약 40중량%, 약 15 내지 약 35중량%, 약 15 내지 약 30중량% 또는 약 20 내지 약 30중량%인, 분리된 미생물에 관한 것이다.
일부 양태에서, 본 발명은, 트리아실글리세롤 분획을 생산하는 본 발명의 분리된 미생물의 돌연변이체, 변이체 또는 재조합체로서, 상기 트리아실글리세롤 분획의 EPA 함량이 적어도 약 10중량%, 적어도 약 11중량%, 적어도 약 12중량%, 적어도 약 13중량%, 적어도 약 14중량%, 적어도 약 15중량%, 적어도 약 16중량%, 적어도 약 17중량%, 적어도 약 18중량%, 적어도 약 19중량% 또는 적어도 약 20중량%인, 상기 돌연변이체, 변이체 또는 재조합체에 관한 것이다. 일부 양태에서, 본 발명은, 트리아실글리세롤 분획을 생산하는 본 발명의 분리된 미생물의 돌연변이체, 변이체 또는 재조합체로서, 상기 트리아실글리세롤 분획의 EPA 함량이 약 12 내지 약 55중량%, 약 12 내지 약 50중량%, 약 12 내지 약 45중량%, 약 12 내지 약 40중량%, 약 12 내지 약 35중량%, 약 12 내지 약 30중량%, 약 15 내지 약 55중량%, 약 15 내지 약 50중량%, 약 15 내지 약 45중량%, 약 15 내지 약 40중량%, 약 15 내지 약 35중량%, 약 15 내지 약 30중량%, 약 20 내지 약 55중량%, 약 20 내지 약 50중량%, 약 20 내지 약 45중량%, 약 20 내지 약 40중량%, 약 20 내지 약 35중량% 또는 약 20 내지 약 30중량%인, 상기 돌연변이체, 변이체 또는 재조합체에 관한 것이다. 돌연변이체 균주는 공지된 공정에 의해 생산할 수 있다. 통상의 공정은 방사선 조사, 고온에서의 처리 및 돌연변이유발원을 사용한 처리를 포함한다. 변이체 균주는 본원에 기재된 종의 다른 천연 존재하는 분리체 및/또는 아분리체일 수 있다. 재조합체 균주는 외인성 유전자의 발현 또는 외인성 유전자의 기능 또는 발현의 대안을 위해 분자생물학에서 공지된 어떠한 방법으로도 생산할 수 있다. 일부 양태에서, 돌연변이체, 변이체, 또는 재조합체 균주는 야생형 균주보다 더 많은 양의 오메가-3 지방산, 특히 EPA를 생산한다. 일부 양태에서, 돌연변이체, 변이체, 또는 재조합체 균주는 보다 적은 양의 DHA, ARA, DPA n-6 또는 이의 배합물과 같은 보다 적은 양의 하나 이상의 지방산을 생산한다. 일부 양태에서, 돌연변이체, 변이체, 또는 재조합체 균주는 야생형 균주보다 배양물 리터당 보다 많은 건조 세포 중량을 생산한다. 이러한 돌연변이체, 변이체, 또는 재조합체 균주는 본 발명의 분리된 미생물로부터 유래한 균주의 예이다.
일부 양태에서, 본 발명의 분리된 미생물(이의 돌연변이체, 변이체 및 재조합체 포함)은 상기 미생물로부터 분리된 하나 이상의 분획에 지방산 프로파일을 포함한다. 상기 미생물로부터 분리된 하나 이상의 분획은 총 지방산 분획, 스테롤 에스테르 분획, 트리아실글리세롤 분획, 유리 지방산 분획, 스테롤 분획, 디아실글리세롤 분획, 극성 분획(인지질 분획 포함) 및 이의 배합물을 포함한다. 특정한 분획에 대한 지방산 프로파일은 본원에 개시된 특정 분획과 관련된 임의의 지방산 프로파일을 포함할 수 있다.
본 발명은 본 발명의 임의의 미생물을 돌연변이유발시키는 단계 및 돌연변이체 균주를 분리하는 단계를 포함하는 돌연변이체를 생산하는 방법에 관한 것이다.
배양물 및 분리된 바이오매스
본 발명은 본 발명의 하나 이상의 분리된 미생물을 포함하는 배양물에 관한 것이다. 미소식물을 접종하고 성장시키며 회수하기 위한 다양한 발효 파라미터는 당해 기술분야에 공지되어 있다(참조: 본원에서 이의 전체가 참조로서 포함되는 미국 특허 제5,130,242호). 액체 또는 고체 배지는 천연 또는 인공 해수를 함유할 수 있다. 종속영양성 성장을 위한 탄소원은, 이로써 한정되는 것은 아니지만, 글루코즈, 프럭토즈, 크실로즈, 사카로즈, 말토즈, 가용성 전분, 몰라세스, 푸코즈, 글루코사민, 덱스트란, 지방, 오일, 글리세롤, 아세트산나트륨 및 만니톨을 포함한다. 질소원은, 이로써 한정되는 것은 아니지만, 펩톤, 효모 추출물, 폴리펩톤, 맥아 추출물, 고기 추출물, 카사미노산, 옥수수대 액, 유기 질소원, 글루탐산나트륨, 우레아, 무기 질소원, 아세트산암모늄, 황산암모늄, 염화암모늄 및 질산암모늄을 포함한다.
ATCC 수탁번호 PTA-10212로 기탁된 미생물을 성장시키기 위한 전형적인 배지는 표 1에 제시되어 있다.
[표 1] PTA-10212 용기 배지
Figure pat00001
대표적인 배양 조건은 다음을 포함할 수 있다:
pH: 약 6.5 - 약 9.5, 약 6.5 - 약 8.0 또는 약 4.8 - 약 7.8;
온도: 약 15 - 약 30℃, 약 18 - 약 28℃, 또는 약 21 내지 약 23℃
용존 산소: 약 0.1 - 약 100% 포화, 약 5 - 약 50% 포화, 또는 약 10 - 약 30% 포화 및/또는
조절된 글리세롤 @: 약 5 - 약 50g/L, 약 10 - 약 40g/L, 또는 약 15 - 약 35g/L
일부 양태에서, ATCC 수탁번호 PTA-10212로 기탁된 미생물 또는 이의 돌연변이체, 변이체 또는 재조합체는 탄소원으로서 글리세롤 상에서 종속영양적으로 성장하지만, 탄소원으로서 글루코즈 상에서 성장하지 않는다.
ATCC 수탁번호 PTA-10208로 기탁된 미생물을 성장시키기 위한 대표적인 배지는 표 2에 제시되어 있다.
[표 2] PTA-10208 용기 배지
Figure pat00002
대표적인 배양 조건은 다음을 포함할 수 있다:
pH: 약 6.5 - 약 8.5, 약 6.5 - 약 8.0 또는 약 7.0 - 약 8.0;
온도: 약 17 - 약 30℃, 약 20 - 약 28℃, 또는 약 22 내지 약 24℃
용존 산소: 약 2 - 약 100% 포화, 약 5 - 약 50% 포화, 또는 약 7 - 약 20% 포화 및/또는
조절된 글루코즈 @: 약 5 - 약 50g/L, 약 10 - 약 40g/L, 또는 약 20 - 약 35g/L
일부 양태에서, 배양 배지는 적어도 약 0.1%, 적어도 약 0.5%, 적어도 약 1%, 적어도 약 1.5%, 적어도 약 2%, 적어도 약 5%, 적어도 약 7%, 적어도 약 10%, 적어도 약 20%, 적어도 약 30%, 적어도 약 40%, 적어도 약 50%, 적어도 약 60%, 적어도 약 70%, 적어도 약 80% 또는 적어도 약 90%의 용존 산소를 포화 수준의 퍼센트로서 포함한다. 일부 양태에서, 배양 배지는 약 0.1% 내지 약 2%, 약 0.1% 내지 약 5%, 약 0.1% 내지 약 10%, 약 0.1% 내지 약 20%, 약 0.1% 내지 약 30%, 약 0.1% 내지 약 50%, 약 0.1% 내지 약 100%, 약 5% 내지 약 10%, 약 5% 내지 약 20%, 약 5% 내지 약 30%, 약 5% 내지 약 50%, 약 5% 내지 약 100%, 약 7% 내지 약 10%, 약 7% 내지 약 20%, 약 7% 내지 약 30%, 약 7% 내지 약 50%, 약 7% 내지 약 100%, 약 10% 내지 약 20%, 약 10% 내지 약 30%, 약 10% 내지 약 50%, 약 10% 내지 약 100%, 약 20% 내지 약 30%, 약 20% 내지 약 50% 또는 약 20% 내지 약 100%의 용존 산소를 포화 수준의 퍼센트로서 포함한다.
본 발명은 본 발명의 미생물의 분리된 바이오매스에 관한 것이다. 본 발명의 분리된 바이오매스는, 각각 이의 전체가 참조로서 포함되는 미국 특허 제5,130,242호 및 미국 출원 공개번호 제2002/0001833호에 기술된 바와 같은 바이오매스의 분리를 위한 임의의 통상의 방법에 의해 수득된 수거된 세포 바이오매스이다.
일부 양태에서, 배양물의 각 리터로부터 분리된 바이오매스의 건조 세포 중량은 탄소, 질소 및 영양물의 공급원을 포함하고 약 950ppm 내지 약 8500ppm의 클로라이드 이온을 포함하는 약 pH 6.5 내지 약 9.5의 배양 배지 속에서 약 15℃ 내지 약 30℃에서 약 6 내지 약 8일 동안 성장시킨 후 적어도 약 10g, 적어도 약 15g, 적어도 약 20g, 적어도 약 25g, 적어도 약 30g, 적어도 약 50g, 적어도 약 60g, 적어도 약 70g, 적어도 약 80g, 적어도 약 100g, 적어도 약 120g, 적어도 약 140g, 적어도 약 160g, 적어도 약 180g 또는 적어도 약 200g이다. 일부 양태에서, 배양물의 각 리터로부터 분리된 바이오매스의 건조 세포 중량은 탄소, 질소 및 영양물의 공급원을 포함하고 약 950ppm 내지 약 8500ppm의 클로라이드 이온을 포함하는 약 pH 6.5, 약 pH 7, 약 pH 7.5, 약 pH 8.0, 약 pH 8.5, 약 pH 9 또는 약 pH 9.5의 배양 배지 속에서 약 15℃, 약 16℃, 약 17℃, 약 18℃, 약 19℃, 약 20℃, 약 21℃, 약 22℃, 약 23℃, 약 24℃, 약 25℃, 약 26℃, 약 27℃, 약 28℃, 약 29℃ 또는 약 30℃에서 약 6일, 약 7일 또는 약 8일 동안 성장시킨 후 적어도 약 10g, 적어도 약 15g, 적어도 약 20g, 적어도 약 25g, 적어도 약 30g, 적어도 약 50g, 적어도 약 60g, 적어도 약 70g, 적어도 약 80g, 적어도 약 100g, 적어도 약 120g, 적어도 약 140g, 적어도 약 160g, 적어도 약 180g 또는 적어도 약 200g이다. 일부 양태에서, 배양물의 각 리터로부터 분리된 바이오매스의 건조 세포 중량은 탄소, 질소 및 영양물의 공급원을 포함하고 약 950ppm 내지 약 8500ppm의 클로라이드 이온을 포함하는 약 pH 6.5 내지 약 pH 9.5의 배양 배지에서 약 15℃ 내지 약 30℃로 약 6일 내지 약 8일 동안 성장시킨 후 약 10g 내지 약 200g이다. 일부 양태에서, 배양물의 각 리터로부터 분리된 바이오매스의 건조 세포 중량은 탄소, 질소 및 영양물의 공급원을 포함하고 약 950ppm 내지 약 8500ppm의 클로라이드 이온을 포함하는 약 pH 6.5, 약 pH 7, 약 pH 7.5, 약 pH 8.0, 약 pH 8.5, 약 pH 9 또는 약 pH 9.5의 배양 배지에서 약 15℃, 약 16℃, 약 17℃, 약 18℃, 약 19℃, 약 20℃, 약 21℃, 약 22℃, 약 23℃, 약 24℃, 약 25℃, 약 26℃, 약 27℃, 약 28℃, 약 29℃ 또는 약 30℃로 약 6일, 약 7일 또는 약 8일 동안 성장시킨 후 약 10g 내지 약 200g, 약 10g 내지 약 100g, 약 10g 내지 약 50g, 약 15g 내지 약 200g, 약 15g 내지 약 100g, 약 15g 내지 약 50g, 약 20g 내지 약 200g, 약 20g 내지 약 100g, 약 20g 내지 약 50g, 약 50g 내지 약 200g 또는 약 50g 내지 약 100g이다. 일부 양태에서, 분리된 배양물은 폴리비닐피롤리돈을 함유하지 않는다.
일부 양태에서, 분리된 배양물은, 탄소, 질소 및 영양물의 공급원을 포함하고 약 950ppm 내지 약 8500ppm의 클로라이드 이온을 포함하는 약 pH 6.5 내지 약 pH 8.5 또는 약 pH 6.5 내지 약 pH 9.5의 배양 배지에서 약 15℃ 내지 약 30℃로 약 6일, 약 7일 또는 약 8일 동안 성장시킨 후 오메가-3 지방산 생산성이 적어도 약 0.2g/L/일, 적어도 약 0.3g/L/일, 적어도 약 0.4g/L/일, 적어도 약 0.5g/L/일, 적어도 약 1g/L/일, 적어도 약 1.2g/L/일, 적어도 약 1.5g/L/일, 적어도 약 1.7g/L/일, 적어도 약 2g/L/일, 적어도 약 3g/L/일, 적어도 약 3.5g/L/일, 적어도 약 4g/L/일, 적어도 약 4.5g/L/일, 적어도 약 5g/L/일, 적어도 약 6g/L/일 또는 적어도 약 8g/L/일이다. 일부 양태에서, 분리된 배양물은, 탄소, 질소 및 영양물의 공급원을 포함하고 약 950ppm 내지 약 8500ppm의 클로라이드 이온을 포함하는 약 pH 6.5 내지 약 pH 9.5의 배양 배지에서 약 15℃ 내지 약 30℃로 약 6일, 약 7일 또는 약 8일 동안 성장시킨 후 오메가-3 지방산 생산성이 약 0.2g/L/일 내지 약 20g/L/일, 약 0.4g/L/일 내지 약 20g/L/일, 약 0.4g/L/일 내지 약 2g/L/일, 약 1g/L/일 내지 약 2g/L/일, 약 1g/L/일 내지 약 20g/L/일, 약 2g/L/일 내지 약 15g/L/일, 약 2g/L/일 내지 약 10g/L/일, 약 3g/L/일 내지 약 10g/L/일, 약 4g/L/일 내지 약 9g/L/일, 약 4g/L/일 내지 약 8g/L/일, 약 4g/L/일 내지 약 7g/L/일 또는 약 4g/L/일 내지 약 6g/L/일이다.
일부 양태에서, 분리된 배양물은, 탄소, 질소 및 영양물의 공급원을 포함하고 약 950ppm 내지 약 8500ppm의 클로라이드 이온을 포함하는 약 pH 6.5 내지 약 pH 8.5 또는 약 pH 6.5 내지 약 pH 9.5의 배양 배지에서 약 15℃ 내지 약 30℃로 약 6일, 약 7일 또는 약 8일 동안 성장시킨 후 EPA 생산성이 적어도 약 0.2g/L/일, 적어도 약 0.3g/L/일, 적어도 약 0.4g/L/일, 적어도 약 0.5g/L/일, 적어도 약 0.6g/L/일, 적어도 약 0.7g/L/일, 적어도 약 0.8g/L/일, 적어도 약 0.9g/L/일, 적어도 약 1g/L/일, 적어도 약 1.2g/L/일, 적어도 약 1.5g/L/일, 적어도 약 1.7g/L/일, 적어도 약 2g/L/일, 적어도 약 3g/L/일, 적어도 약 4g/L/일 또는 적어도 약 5g/L/일이다. 일부 양태에서, 탄소, 질소 및 영양물의 공급원을 포함하고 약 950ppm 내지 약 8500ppm의 클로라이드 이온을 포함하는 약 pH 6.5 내지 약 pH 8.5 또는 약 pH 6.5 내지 약 pH 9.5의 배양 배지에서 약 15℃ 내지 약 30℃로 약 6일, 약 7일 또는 약 8일 동안 성장시킨 후 EPA 생산성이 약 0.2g/L/일 내지 약 5g/L/일, 약 0.2g/L/일 내지 약 4g/L/일, 약 0.2g/L/일 내지 약 3g/L/일, 약 0.2g/L/일 내지 약 2g/L/일, 약 0.2g/L/일 내지 약 1g/L/일, 약 0.2g/L/일 내지 약 0.8g/L/일, 약 0.2g/L/일 내지 약 0.7g/L/일, 약 1g/L/일 내지 약 5g/L/일, 약 1g/L/일 내지 약 4g/L/일, 약 1g/L/일 내지 약 3g/L/일 또는 약 1g/L/일 내지 약 2g/L/일이다. 일부 양태에서, 상술한 임의의 EPA 생산성은 상술한 임의의 오메가-3 지방산 생산성과 관련된다. 일부 양태에서, 배양물은 약 0g/L/일 내지 약 5g/L/일, 약 0g/L/일 내지 약 4g/L/일, 약 0g/L/일 내지 약 3g/L/일, 약 0g/L/일 내지 약 2g/L/일, 약 0g/L/일 내지 약 1g/L/일, 약 0.2g/L/일 내지 약 5g/L/일, 약 0.2g/L/일 내지 약 4g/L/일, 약 0.2g/L/일 내지 약 3g/L/일, 약 0.2g/L/일 내지 약 2g/L/일, 약 0.2g/L/일 내지 약 1g/L/일, 약 1g/L/일 내지 약 5g/L/일, 약 2g/L/일 내지 약 5g/L/일, 약 2g/L/일 내지 약 4g/L/일 또는 약 2g/L/일 내지 약 3g/L/일의 DHA 생산성을 추가로 포함한다. 일부 양태에서, DHA 생산성은 약 5g/L/일 미만, 약 4g/L/일 미만, 약 3g/L/일 미만, 약 2g/L/일 미만, 약 1g/L/일 미만, 약 0.5g/L/일 미만, 약 0.2g/L/일 미만 또는 약 0g/L/일이다.
일부 양태에서, 발효 용적(배양 용적)은 적어도 약 2 리터, 적어도 약 10 리터, 적어도 약 50 리터, 적어도 약 100 리터, 적어도 약 200 리터, 적어도 약 500 리터, 적어도 약 1000 리터, 적어도 약 10,000 리터, 적어도 약 20,000 리터, 적어도 약 50,000 리터, 적어도 약 100,000 리터, 적어도 약 150,000 리터, 적어도 약 200,000 리터, 또는 적어도 약 250,000 리터이다. 일부 양태에서, 발효 용적은 약 2 리터 내지 약 300,000 리터, 약 2 리터, 약 10 리터, 약 50 리터, 약 100 리터, 약 200 리터, 약 500 리터, 약 1000 리터, 약 10,000 리터, 약 20,000 리터, 약 50,000 리터, 약 100,000 리터, 약 150,000 리터, 약 200,000 리터, 약 250,000 리터, 또는 약 300,000 리터이다.
일부 양태에서, 본 발명은 본 발명의 지방산 프로파일을 포함하는 분리된 바이오매스에 관한 것이다. 일부 양태에서, 상기 바이오매스의 건조 세포 중량의 적어도 약 20%, 적어도 약 25%, 적어도 약 30%, 적어도 약 35%, 적어도 약 40%, 적어도 약 45%, 적어도 약 50%, 적어도 약 55%, 적어도 약 60%, 적어도 약 65%, 적어도 약 70%, 적어도 약 75% 또는 적어도 약 80%는 지방산이다. 일부 양태에서, 상기 바이오매스의 건조 세포 중량의 약 20% 초과, 약 25% 초과, 약 30% 초과, 약 35% 초과, 약 40% 초과, 약 45% 초과, 약 50% 초과, 약 55% 초과 또는 약 60% 초과는 지방산이다. 일부 양태에서, 상기 바이오매스의 건조 세포 중량의 약 20중량% 내지 약 55중량%, 약 20중량% 내지 약 60중량%, 약 20중량% 내지 약 70중량%, 약 20중량% 내지 약 80중량%, 약 30중량% 내지 약 55중량%, 약 30중량% 내지 약 70중량%, 약 30중량% 내지 약 80중량%, 약 40중량% 내지 약 60중량%, 약 40중량% 내지 약 70중량%, 약 40중량% 내지 약 80중량%, 약 50중량% 내지 약 60중량%, 약 50중량% 내지 약 70중량%, 약 50중량% 내지 약 80중량%, 약 55중량% 내지 약 70중량%, 약 55중량% 내지 약 80중량%, 약 60중량% 내지 약 70중량% 또는 약 60중량% 내지 약 80중량%는 지방산이다. 일부 양태에서, 바이오매스는 약 10중량% 초과, 적어도 약 12중량%, 적어도 약 15중량%, 적어도 약 20중량%, 적어도 약 25중량%, 적어도 약 30중량%, 적어도 약 35중량%, 적어도 약 40중량% 또는 적어도 약 45중량%의 지방산을 EPA로서 포함한다. 일부 양태에서, 상기 바이오매스는 약 10중량% 내지 약 55중량%, 약 12중량% 내지 약 55중량%, 약 15중량% 내지 약 55중량%, 약 20중량% 내지 약 55중량%, 약 20중량% 내지 약 40중량% 또는 약 20중량% 내지 약 30중량%의 지방산을 EPA로서 포함한다. 일부 양태에서, 상기 바이오매스는 트리아실글리세롤 분획을 포함하고, 상기 트리아실글리세롤 분획의 적어도 약 12중량%, 적어도 약 13중량%, 적어도 약 14중량%, 적어도 약 15중량%, 적어도 약 16중량%, 적어도 약 17중량%, 적어도 약 18중량%, 적어도 약 19중량% 또는 적어도 약 20중량%는 EPA이다. 일부 양태에서, 상기 바이오매스는 트리아실글리세롤 분획을 포함하고, 상기 트리아실글리세롤 분획의 EPA 함량은 적어도 약 12중량% 내지 약 55중량%, 약 12중량% 내지 약 50중량%, 약 12중량% 내지 약 45중량%, 적어도 약 12중량% 내지 약 40중량%, 적어도 약 12중량% 내지 약 35중량% 또는 적어도 약 12중량% 내지 약 30중량%, 약 15중량% 내지 약 55중량%, 약 15중량% 내지 약 50중량%, 약 15중량% 내지 약 45중량%, 약 15중량% 내지 약 40중량%, 약 15중량% 내지 약 35중량%, 약 15중량% 내지 약 30중량%, 약 20중량% 내지 약 55중량%, 약 20중량% 내지 약 50중량%, 약 20중량% 내지 약 45중량%, 적어도 약 20중량% 내지 약 40중량%, 적어도 약 20중량% 내지 약 35중량% 또는 약 20중량% 내지 약 30중량%이다. 일부 양태에서, 상기 바이오매스의 건조 세포 중량의 적어도 약 20중량%, 적어도 약 25중량%, 적어도 약 30중량%, 적어도 약 35중량%, 적어도 약 40중량%, 적어도 약 50중량% 또는 적어도 약 60중량%는 DHA이다. 일부 양태에서, 상기 바이오매스의 건조 세포 중량의 약 20중량% 내지 약 60중량%, 약 25중량% 내지 약 60중량%, 약 25중량% 내지 약 50중량%, 약 25중량% 내지 약 45중량%, 약 30중량% 내지 약 50중량% 또는 약 35중량% 내지 약 50중량%는 DHA이다. 일부 양태에서, 상기 바이오매스는 약 10중량% 이하, 약 9중량% 이하, 약 8중량% 이하, 약 7중량% 이하, 약 6중량% 이하, 약 5중량% 이하, 약 4중량% 이하, 약 3중량% 이하, 약 2중량% 이하 또는 약 1중량% 이하의 지방산을 DHA로서 포함한다. 일부 양태에서, 상기 바이오매스는 약 1중량% 내지 약 10중량%, 약 1중량% 내지 약 5중량%, 약 2중량% 내지 약 5중량%, 약 3중량% 내지 약 5중량% 또는 약 3중량% 내지 약 10중량%의 지방산을 DHA로서 포함한다. 일부 양태에서, 상기 바이오매스는 DHA를 실질적으로 함유하지 않는다. 일부 양태에서, 상기 바이오매스는 약 0.1중량% 내지 약 5중량% 미만, 약 0.1중량% 내지 약 4중량%, 약 0.1중량% 내지 약 3중량%, 약 0.1중량% 내지 약 2중량%, 약 0.2중량% 내지 약 5중량% 미만, 약 0.2중량% 내지 약 4중량%, 약 0.2중량% 내지 약 3중량%, 약 0.2중량% 내지 약 2중량%, 약 0.3중량% 내지 약 2중량%, 약 0.1중량% 내지 약 0.5중량%, 약 0.2중량% 내지 약 0.5중량%, 약 0.1중량% 내지 약 0.4중량%, 약 0.2중량% 내지 약 0.4중량%, 약 0.5중량% 내지 약 2중량%, 약 1중량% 내지 약 2중량%, 약 0.5중량% 내지 약 1.5중량% 또는 약 1중량% 내지 약 1.5중량%의 지방산을 ARA로서 포함한다. 일부 양태에서, 상기 바이오매스는 약 5중량% 미만, 약 4중량% 이하, 약 3중량% 이하, 약 2중량% 이하, 약 1.5중량% 이하, 약 1중량% 이하, 약 0.5중량% 이하, 약 0.4중량% 이하, 약 0.3중량% 이하, 약 0.2중량% 이하 또는 약 0.1중량% 이하의 지방산을 ARA로서 포함한다. 일부 양태에서, 상기 바이오매스는 ARA를 실질적으로 포함하지 않는다. 일부 양태에서, 상기 바이오매스는 약 0.4중량% 내지 약 2중량%, 약 0.4중량% 내지 약 3중량%, 약 0.4중량% 내지 약 4중량%, 약 0.4중량% 내지 약 5중량%, 약 0.4중량% 내지 약 5중량% 미만, 약 0.5중량% 내지 약 1중량%, 약 0.5중량% 내지 약 2중량%, 약 0.5중량% 내지 약 3중량%, 약 0.5중량% 내지 약 4중량%, 약 0.5중량% 내지 약 5중량%, 약 0.5중량% 내지 약 5중량% 미만, 약 1중량% 내지 약 2중량%, 약 1중량% 내지 약 3중량%, 약 1중량% 내지 약 4중량%, 약 1중량% 내지 약 5중량% 또는 약 1중량% 내지 약 5중량% 미만의 지방산을 DPA n-6으로서 포함한다. 일부 양태에서, 상기 바이오매스는 약 5중량% 이하, 약 5중량% 미만, 약 4중량% 이하, 약 3중량% 이하, 약 2중량% 이하, 약 1중량% 이하, 약 0.75중량% 이하, 약 0.6중량% 이하 또는 약 0.5중량% 이하의 지방산을 DPA n-6으로서 포함한다. 일부 양태에서, 상기 바이오매스는 DPA n-6을 실질적으로 포함하지 않는다. 일부 양태에서, 상기 바이오매스는 올레산(18:1 n-9), 리놀레산(18:2 n-6), 리놀렌산(18:3 n-3), 에이코센산(20:1 n-9), 에루크산(22:1 n-9) 또는 이의 배합물을 약 5중량% 이하, 약 5중량% 미만, 약 4중량% 이하, 약 3중량% 이하 또는 약 2중량% 이하로 갖는 지방산을 포함한다.
본 발명의 분리된 바이오매스의 특성은 외인성으로 도입된 물질보다 분리된 바이오매스의 내인성 또는 천연 특성과 관련되어 있다. 일부 양태에서, 분리된 바이오매스는 폴리비닐피롤리돈을 함유하지 않거나, 폴리비닐피롤리돈을 함유하는 배양물로부터 분리되지 않는다.
본 발명은 바이오매스을 생산하는 방법에 관한 것이다. 일부 양태에서, 본 발명의 바이오매스을 생산하는 방법은 본 발명의 임의의 분리된 미생물 또는 이의 혼합물을 배양기에서 성장시켜 바이오매스을 생산하는 단계를 포함한다. 본 발명은 상기 방법으로 생산된 바이오매스에 관한 것이다.
미생물 오일
본 발명은 본 발명의 지방산 프로파일을 포함하는 미생물 오일에 관한 것이다. 본 발명의 미생물 오일은 적어도 약 35중량%의 트리아실글리세롤 분획을 포함하는 "미정제 오일" 또는 "정제 오일"이다. "미정제 오일"은 추가의 처리 없이 미생물의 바이오매스으로부터 추출되는 오일이다. "정제 오일"은 미정제 오일을 정제, 표백 및/또는 탈취의 표준 공정으로 처리함으로써 수득되는 오일이다(참조: 전체 내용이 본원에서 참조로서 포함되는 미국 특허 제5,130,242호). 미생물 오일은 또한 본원에 기재된 바와 같은 "최종 오일"을 포함하며, 이는 식물성 오일로 희석된 정제 오일이다. 일부 양태에서, 최종 오일은 고도 올레산 해바라기 오일로 희석된 정제 오일이다. 본원에 사용된 용어 "미생물"은, 이로써 한정되는 것은 아니지만, 용어 "미세조류", "트라우스토키트리드" 및 본원에 기재된 임의의 기탁된 미생물과 관련된 분류학상 분류를 포함한다. 본원에 기재된 기탁된 미생물을 포함하여 본원의 임의의 미생물과 관련하여 사용된 용어 "트라우스토키트리알레스", "트라우스토키트리드", "스키조키트리움" 및 "트라우스토키트리움"은 이용가능하는 계통발생학상 정보를 포함하는 현재의 분류학상 분류에 기초하며, 분류학상 분류가 본 출원의 출원일 이후에 재분류되는 경우에 한정되는 것으로 의도되지 않는다.
일부 양태에서, 본원에 기재된 지방산은 지방산 에스테르이다. 일부 양태에서, 지방산 에스테르는 오메가-3 지방산, 오메가-6 지방산 및 이의 배합물의 에스테르를 포함한다. 일부 양태에서, 지방산 에스테르는 DHA 에스테르, EPA 에스테르 또는 이의 배합물이다. 일부 양태에서, 본원에 기재된 오일 또는 이의 분획은 에스테르화되어, 지방산 에스테르를 포함하는 오일 또는 이의 분획을 생산한다. 용어 "에스테르"는 지방산 분자의 카복실산 그룹 중의 수소가 또 다른 치환체로 치환된 것을 지칭한다. 통상의 에스테르는 당해 기술분야에 공지되어 있고, 문헌[참조: Higuchi, T. and V. Stella in Pro-drugs as Novel Delivery Systems, Vol. 14, A.C.S. Symposium Series, Bioreversible Carriers in Drug Design, Ed. Edward B. Roche, American Pharmaceutical Association, Pergamon Press, 1987, and Protective Groups in Organic Chemistry, McOmie ed., Plenum Press, New York, 1973]에 언급되어 있다. 에스테르의 예는 메틸, 에틸, 프로필, 부틸, 펜틸, t-부틸, 벤질, 니트로벤질, 메톡시벤질, 벤즈하이드릴 및 트리클로로에틸을 포함한다. 일부 양태에서, 에스테르는 카복실산 보호 에스테르 그룹, 아르알킬(예: 벤질, 펜에틸)과의 에스테르, 저급 알케닐(예: 알릴, 2-부테닐)과의 에스테르, 저급-알콕시-저급-알킬(예: 메톡시메틸, 2-메톡시에틸, 2-에톡시에틸)과의 에스테르, 저급-알카노일옥시-저급-알킬(예: 아세톡시메틸, 피발로일옥시메틸, 1-피발로일옥시에틸)과의 에스테르, 저급-알콕시카보닐-저급-알킬(예: 메톡시카보닐메틸, 이소프로폭시카보닐메틸)과의 에스테르, 카복시-저급 알킬(예: 카복시메틸)과의 에스테르, 저급-알콕시카보닐옥시-저급-알킬(예: 1-(에톡시카보닐옥시)에틸, 1-(사이클로헥실옥시카보닐옥시)에틸)과의 에스테르, 카바모일옥시-저급 알킬(예: 카보모일옥시메틸)과의 에스테르 등이다. 일부 양태에서, 첨가된 치환체는 선형 또는 사이클릭 탄화수소 그룹, 예를 들면, C1-C6 알킬, C1-C6 사이클로알킬, C1-C6 알케닐 또는 C1-C6 아릴 에스테르이다. 일부 양태에서, 에스테르는 알킬 에스테르, 예를 들면, 메틸 에스테르, 에틸 에스테르 또는 프로필 에스테르이다. 일부 양태에서, 에스테르 치환체는 당해 지방산이 정제된 또는 반-정제된 상태로 존재하는 경우에 유리 지방산 분자에 부가된다. 또는, 지방산 에스테르는 트리아실글리세롤을 에스테르로 전환시에 형성된다.
본 발명은 미생물 오일을 생산하는 방법에 관한 것이다. 일부 양태에서, 상기 방법은 본 발명의 임의의 분리된 미생물 또는 이의 혼합물을 배양물에서 성장시켜 오메가-3 지방산을 포함하는 미생물 오일을 생산하는 것을 포함한다. 일부 양태에서, 상기 방법은 미생물 오일을 추출하는 것을 추가로 포함한다. 일부 양태에서, 상기 방법은 본 발명의 임의의 바이오매스 또는 이의 혼합물로부터 오메가-3 지방산을 포함하는 미생물 오일을 추출하는 것을 포함한다. 일부 양태에서, 상기 방법은 분리된 미생물을 종속영양적으로 성장시키는 것을 포함하며, 상기 배양물은 본원에 기재된 탄소원을 포함한다. 미생물 오일은 신선하게 수거된 바이오매스으로부터 추출하거나, 부패를 방지하는 조건하에 저장된 사전 수거된 바이오매스으로부터 추출할 수 있다. 공지된 방법을 사용하여 본 발명의 미생물을 배양하고, 상기 배양물로부터 바이오매스을 분리하며, 상기 바이오매스으로부터 미생물 오일을 추출하고, 상기 바이오매스으로부터 추출된 오일의 지방산 프로파일을 분석할 수 있다(참조: 전체 내용이 본원에서 참조로서 포함된 미국 특허 제5,130,242호). 본 발명은 본 발명의 임의의 방법으로 생산한 미생물 오일에 관한 것이다.
일부 양태에서, 미생물 오일은 효소 추출 방법에 의해 추출된다. 일부 양태에서, 미생물 오일은 기계적 추출 방법으로 추출된다. 일부 양태에서, 기계적 추출 방법은 (1) 균질화기를 통해 저온살균 발효조를 처리하여 세포 용해 및 세포로부터 오일의 방출을 보조하는 방법; (2) 균질화 후에 발효조에 이소프로필 알콜을 첨가하여 오일 및 물 에멀젼을 파쇄하는 방법; (3) 혼합물을 원심분리하여 오일 상을 회수하는 방법 및 (4) 항산화제를 첨가하면서 진공하에 건조시키는 방법 중의 하나 이상을 포함한다. 일부 양태에서, 미정제 오일은 정제된다. 일부 양태에서, 미정제 오일의 정제는 (1) 미정제 오일을 정제 탱크로 펌핑하고 오일을 가열한 다음, 혼합하면서 산 용액을 첨가하는 방법; (2) 산 처리 후에 가성 용액을 오일에 첨가하는 방법; (3) 미정제 오일을 재가열한 다음, 원심분리하여 정제 오일로부터 중질 상을 분리하는 방법; (4) 예를 들면, 트리실(TriSyl®), 점토 및/또는 여과를 사용하여 잔류 극성 화합물, 미량 금속 및 산화 생성물을 정제 오일로부터 제거하는 방법; (5) 표백된 오일을 냉각 여과하여 고융점 성분을 오일로부터 추가로 제거함으로써 목적하는 수준의 정화도를 수득하는 방법; (6) 오일을 가열하고, 이어서 오일을 냉각시킨 다음, 고융점 트리글리세라이드 및 왁스가 결정화되도록 하는 시간 동안 유지하는 방법; (7) 필터 보조제를 냉각된 오일에 첨가한 다음, 여과에 의해 결정화 고체를 제거하는 방법; (8) 냉각 여과 후, 고온 및 진공하에 작동되는 탈취기를 사용하여, 예를 들면, 악취 및 풍미를 유발할 수 있는 과산화물 및 임의의 잔류 저분자량 화합물을 제거하는 방법; 및 (9) 오일을 탈취된 공급물 탱크로 옮기고, 공기 제거하고, 예를 들면, 충전 컬럼 탈취기에서 탈취시키는 방법; 및 (10) 예를 들면, 탈취 사이클 말기에 질소 블랭킷하에 냉각시키고, 탈취된 오일에 적합한 항산화제를 첨가하여 산화 안정성을 제공하는 방법 중의 하나 이상을 포함한다.
일부 양태에서, 상기 미생물 오일은 약 0중량%, 적어도 약 0.1중량%, 적어도 약 0.2중량%, 적어도 약 0.5중량%, 적어도 약 1중량%, 적어도 약 1.5중량%, 적어도 약 2중량% 또는 적어도 약 5중량%의 스테롤 에스테르 분획을 포함한다. 일부 양태에서, 미생물 오일은 약 0중량% 내지 약 1.5중량%, 약 0중량% 내지 약 2중량%, 약 0중량% 내지 약 5중량%, 약 1중량% 내지 약 1.5중량%, 약 0.2중량% 내지 약 1.5중량%, 약 0.2중량% 내지 약 2중량% 또는 약 0.2중량% 내지 약 5중량%의 스테롤 에스테르 분획을 포함한다. 일부 양태에서, 미생물 오일은 약 5중량% 이하, 약 4중량% 이하, 약 3중량% 이하, 약 2중량% 이하, 약 1중량% 이하, 약 0.5중량% 이하, 약 0.3중량% 이하, 약 0.2중량% 이하, 약 0.5중량% 이하, 약 0.4중량% 이하, 약 0.3중량% 이하 또는 약 0.2중량% 이하의 스테롤 에스테르 분획을 포함한다.
일부 양태에서, 미생물 오일은 적어도 약 35중량%, 적어도 약 40중량%, 적어도 약 45중량%, 적어도 약 50중량%, 적어도 약 55중량%, 적어도 약 60중량%, 적어도 약 65중량%, 적어도 약 70중량%, 적어도 약 75중량%, 적어도 약 80중량%, 적어도 약 85중량% 또는 적어도 약 90중량%의 트리아실글리세롤 분획을 포함한다. 일부 양태에서, 미생물 오일은 약 35중량% 내지 약 98중량%, 약 35중량% 내지 약 90중량%, 약 35중량% 내지 약 80중량%, 약 35중량% 내지 약 70중량%, 약 35중량% 내지 약 70중량%, 약 35중량% 내지 약 65중량%, 약 40중량% 내지 약 70중량%, 약 40중량% 내지 약 65중량%, 약 40중량% 내지 약 55중량%, 약 40중량% 내지 약 50중량%, 약 65중량% 내지 약 95중량%, 약 75중량% 내지 약 95중량%, 약 75중량% 내지 약 98중량%, 약 80중량% 내지 약 95중량%, 약 80중량% 내지 약 98중량%, 약 90중량% 내지 약 96중량%, 약 90중량% 내지 약 97중량%, 약 90중량% 내지 약 98중량%, 약 90중량%, 약 95중량%, 약 97중량% 또는 약 98중량%의 트리아실글리세롤 분획을 포함한다.
일부 양태에서, 미생물 오일은 적어도 약 10중량%, 적어도 약 11중량%, 적어도 약 12중량%, 적어도 약 13중량%, 적어도 약 14중량%, 적어도 약 15중량%, 적어도 약 16중량%, 적어도 약 17중량%, 적어도 약 18중량%, 적어도 약 19중량% 또는 적어도 약 20중량%의 디아실글리세롤 분획을 포함한다. 일부 양태에서, 미생물 오일은 약 10중량% 내지 약 45중량%, 약 10중량% 내지 약 40중량%, 약 10중량% 내지 약 35중량%, 약 10중량% 내지 약 30중량%, 약 15중량% 내지 약 40중량%, 약 15중량% 내지 약 35중량% 또는 약 15중량% 내지 약 30중량%의 디아실글리세롤 분획을 포함한다. 일부 양태에서, 미생물 오일은 적어도 약 0.2중량%, 적어도 약 0.3중량%, 적어도 약 0.4중량%, 적어도 약 0.5중량%, 적어도 약 1중량%, 적어도 약 5중량%, 적어도 약 10중량%, 적어도 약 11중량%, 적어도 약 12중량%, 적어도 약 13중량%, 적어도 약 14중량%, 적어도 약 15중량%, 적어도 약 16중량%, 적어도 약 17중량%, 적어도 약 18중량%, 적어도 약 19중량% 또는 적어도 약 20중량%의 1,2-디아실글리세롤 분획을 포함한다. 일부 양태에서, 미생물 오일은 약 0.2중량% 내지 약 45중량%, 약 0.2중량% 내지 약 30중량%, 약 0.2중량% 내지 약 20중량%, 약 0.2중량% 내지 약 10중량%, 약 0.2중량% 내지 약 5중량%, 약 0.2중량% 내지 약 1중량%, 약 0.2중량% 내지 약 0.8중량%, 약 0.4중량% 내지 약 45중량%, 약 0.4중량% 내지 약 30중량%, 약 0.4중량% 내지 약 20중량%, 약 0.4중량% 내지 약 10중량%, 약 0.4중량% 내지 약 5중량%, 약 0.4중량% 내지 약 1중량%, 약 0.4중량% 내지 약 0.8중량%, 약 0.5중량% 내지 약 1중량%, 약 0.5중량% 내지 약 0.8중량%, 약 10중량% 내지 약 45중량%, 약 10중량% 내지 약 40중량%, 약 10중량% 내지 약 35중량%, 약 10중량% 내지 약 30중량%, 약 15중량% 내지 약 40중량%, 약 15중량% 내지 약 35중량%, 약 15중량% 내지 약 30중량% 또는 약 15중량% 내지 약 25중량%의 디아실글리세롤 분획을 포함한다. 일부 양태에서, 미생물 오일은 적어도 약 0.1중량%, 적어도 약 0.2중량%, 적어도 약 0.5중량%, 적어도 약 1중량%, 적어도 약 2중량%, 적어도 약 2.5중량% 또는 적어도 약 3중량%의 1,3-디아실글리세롤 분획을 포함한다. 일부 양태에서, 미생물 오일은 적어도 약 0.3중량%, 적어도 약 0.4중량%, 적어도 약 0.5중량%, 적어도 약 1중량%, 적어도 약 1.5중량%, 적어도 약 2중량% 또는 적어도 약 5중량%의 스테롤 분획을 포함한다.
일부 양태에서, 미생물 오일은 약 0.3중량% 내지 약 5중량%, 약 0.3중량% 내지 약 2중량%, 약 0.3중량% 내지 약 1.5중량%, 약 0.5중량% 내지 약 1.5중량%, 약 1중량% 내지 약 1.5중량%, 약 0.5중량% 내지 약 2중량%, 약 0.5중량% 내지 약 5중량%, 약 1중량% 내지 약 2중량% 또는 약 1중량% 내지 약 5중량%의 스테롤 분획을 포함한다. 일부 양태에서, 미생물 오일은 약 5중량% 이하, 약 4중량% 이하, 약 3중량% 이하, 약 2중량% 이하, 약 1.5중량% 이하 또는 약 1중량% 이하의 스테롤 분획을 포함한다.
일부 양태에서, 미생물 분획은 적어도 약 2중량%, 적어도 약 5중량% 또는 적어도 약 8중량%의 인지질 분획을 포함한다. 일부 양태에서, 미생물 오일은 약 2중량% 내지 약 25중량%, 약 2중량% 내지 약 20중량%, 약 2중량% 내지 약 15중량%, 약 2중량% 내지 약 10중량%, 약 5중량% 내지 약 25중량%, 약 5중량% 내지 약 20중량%, 약 5중량% 내지 약 20중량%, 약 5중량% 내지 약 10중량% 또는 약 7중량% 내지 약 9중량%의 인지질 분획을 포함한다. 일부 양태에서, 미생물 오일은 약 20중량% 미만, 약 15중량% 미만, 약 10중량% 미만, 약 9중량% 미만, 약 8중량% 미만의 인지질 분획을 포함한다. 일부 양태에서, 미생물 오일은 인지질을 실질적으로 포함하지 않는다. 일부 양태에서, 미생물 오일은 오일중 약 2중량% 미만, 약 1.5중량% 미만, 약 1중량% 미만, 약 0.5중량% 미만의 불검화물(unsaponifiable)을 포함한다. 트리아실글리세롤 분획 등의 미생물 오일에 존재하는 지질 등급은 플래쉬 크로마토그래피로 분리하여 박층 크로마토그래피(TLC)로 분석할 수 있거나, 당해 기술분야에 공지된 다른 방법으로 분리하여 분석할 수 있다.
일부 양태에서, 미생물 오일 및/또는 트리아실글리세롤 분획, 디아실글리세롤 분획, 스테롤 분석, 스테롤 에스테르 분석, 유리 지방산 분획, 인지질 분획 및 이의 배합물로부터 선택된 하나 이상의 이의 분획은 적어도 약 5중량%, 적어도 약 10중량%, 약 10중량% 초과, 적어도 약 12중량%, 적어도 약 13중량%, 적어도 약 14중량%, 적어도 약 15중량%, 적어도 약 16중량%, 적어도 약 17중량%, 적어도 약 18중량%, 적어도 약 19중량%, 적어도 약 20중량%, 적어도 약 25중량%, 적어도 약 30중량%, 적어도 약 35중량%, 적어도 약 40중량% 또는 적어도 약 45중량%의 EPA를 포함한다. 일부 양태에서, 미생물 오일 및/또는 트리아실글리세롤 분획, 디아실글리세롤 분획, 스테롤 분석, 스테롤 에스테르 분석, 유리 지방산 분획, 인지질 분획 및 이의 배합물로부터 선택된 하나 이상의 이의 분획은 약 5중량% 내지 약 55중량%, 약 5중량% 내지 약 50중량%, 약 5중량% 내지 약 45중량%, 약 5중량% 내지 약 40중량%, 약 5중량% 내지 약 35중량%, 약 5중량% 내지 약 30중량%, 약 10중량% 내지 약 55중량%, 약 10중량% 내지 약 50중량%, 약 10중량% 내지 약 45중량%, 약 10중량% 내지 약 40중량%, 약 10중량% 내지 약 35중량%, 약 10중량% 내지 약 30중량%, 적어도 약 12중량% 내지 약 55중량%, 적어도 약 12중량% 내지 약 50중량%, 적어도 약 12중량% 내지 약 45중량%, 적어도 약 12중량% 내지 약 40중량%, 적어도 약 12중량% 내지 약 35중량%, 또는 적어도 약 12중량% 내지 약 30중량%, 약 15중량% 내지 약 55중량%, 약 15중량% 내지 약 50중량%, 약 15중량% 내지 약 45중량%, 약 15중량% 내지 약 40중량%, 약 15중량% 내지 약 35중량%, 약 15중량% 내지 약 30중량%, 약 15중량% 내지 약 25중량%, 약 15중량% 내지 약 20중량%, 약 20중량% 내지 약 55중량%, 약 20중량% 내지 약 50중량%, 약 20중량% 내지 약 45중량%, 약 20중량% 내지 약 40중량% 또는 약 20중량% 내지 약 30중량%의 EPA를 포함한다. 일부 양태에서, 미생물 오일 및/또는 트리아실글리세롤 분획, 디아실글리세롤 분획, 스테롤 분석, 스테롤 에스테르 분석, 유리 지방산 분획, 인지질 분획 및 이의 배합물로부터 선택된 하나 이상의 이의 분획은 적어도 약 5중량%, 적어도 약 10중량%, 적어도 약 15중량%, 적어도 약 20중량%, 적어도 약 25중량%, 적어도 약 30중량%, 적어도 약 35중량%, 적어도 약 40중량%, 적어도 약 50중량% 또는 적어도 약 60중량%의 DHA를 포함한다. 일부 양태에서, 미생물 오일 및/또는 트리아실글리세롤 분획, 디아실글리세롤 분획, 스테롤 분석, 스테롤 에스테르 분석, 유리 지방산 분획, 인지질 분획 및 이의 배합물로부터 선택된 하나 이상의 이의 분획은 약 5중량% 내지 약 60중량%, 약 5중량% 내지 약 55중량%, 약 5중량% 내지 약 50중량%, 약 5중량% 내지 약 40중량%, 약 10중량% 내지 약 60중량%, 약 10중량% 내지 약 50중량%, 약 10중량% 내지 약 40중량%, 약 20중량% 내지 약 60중량%, 약 25중량% 내지 약 60중량%, 약 25중량% 내지 약 50중량%, 약 25중량% 내지 약 45중량%, 약 30중량% 내지 약 50중량%, 약 35중량% 내지 약 50중량% 또는 약 30중량% 내지 약 40중량%의 DHA를 포함한다. 일부 양태에서, 미생물 오일 및/또는 트리아실글리세롤 분획, 디아실글리세롤 분획, 스테롤 분석, 스테롤 에스테르 분석, 유리 지방산 분획, 인지질 분획 및 이의 배합물로부터 선택된 하나 이상의 이의 분획은 약 10중량% 이하, 약 9중량% 이하, 약 8중량% 이하, 약 7중량% 이하, 약 6중량% 이하, 약 5중량% 이하, 약 4중량% 이하, 약 3중량% 이하, 약 2중량% 이하 또는 약 1중량% 이하의 DHA를 포함한다. 일부 양태에서, 미생물 오일 및/또는 트리아실글리세롤 분획, 디아실글리세롤 분획, 스테롤 분획, 스테롤 에스테르 분획, 유리 지방산 분획, 인지질 분획 및 이의 배합물로부터 선택된 하나 이상의 이의 분획은 약 1중량% 내지 약 10중량%, 약 1중량% 내지 약 5중량%, 약 2중량% 내지 약 5중량%, 약 3중량% 내지 약 5중량% 또는 약 3중량% 내지 약 10중량%의 지방산을 DHA로서 포함한다. 일부 양태에서, 미생물 오일 및/또는 트리아실글리세롤 분획, 디아실글리세롤 분획, 스테롤 분획, 스테롤 에스테르 분획, 유리 지방산 분획, 인지질 분획 및 이의 배합물로부터 선택된 하나 이상의 이의 분획은 DHA를 실질적으로 포함하지 않는다. 일부 양태에서, 미생물 오일 및/또는 트리아실글리세롤 분획, 디아실글리세롤 분획, 스테롤 분획, 스테롤 에스테르 분획, 유리 지방산 분획, 인지질 분획 및 이의 배합물로부터 선택된 하나 이상의 이의 분획은 약 0.1중량% 내지 약 5중량%, 약 0.1중량% 내지 약 5중량% 미만, 약 0.1중량% 내지 약 4중량%, 약 0.1중량% 내지 약 3중량%, 약 0.1중량% 내지 약 2중량%, 약 0.2중량% 내지 약 5중량%, 약 0.2중량% 내지 약 5중량% 미만, 약 0.2중량% 내지 약 4중량%, 약 0.2중량% 내지 약 3중량%, 약 0.2중량% 내지 약 2중량%, 약 0.3중량% 내지 약 2중량%, 약 0.1중량% 내지 약 0.5중량%, 약 0.2중량% 내지 약 0.5중량%, 약 0.1중량% 내지 약 0.4중량%, 약 0.2중량% 내지 약 0.4중량%, 약 0.5중량% 내지 약 2중량%, 약 1중량% 내지 약 2중량%, 약 0.5중량% 내지 약 1.5중량% 또는 약 1중량% 내지 약 1.5중량%의 ARA를 포함한다. 일부 양태에서, 미생물 오일 및/또는 트리아실글리세롤 분획, 디아실글리세롤 분획, 스테롤 분획, 스테롤 에스테르 분획, 유리 지방산 분획, 인지질 분획 및 이의 배합물로부터 선택된 하나 이상의 이의 분획은 약 5중량% 이하, 약 5중량% 미만, 약 4중량% 이하, 약 3중량% 이하, 약 2중량% 이하, 약 1.5중량% 이하, 약 1중량% 이하, 약 0.5중량% 이하, 약 0.4중량% 이하, 약 0.3중량% 이하, 약 0.2중량% 이하 약 0.1중량% 이하의 ARA를 포함한다. 일부 양태에서, 미생물 오일 및/또는 트리아실글리세롤 분획, 디아실글리세롤 분획, 스테롤 분획, 스테롤 에스테르 분획, 유리 지방산 분획, 인지질 분획 및 이의 배합물로부터 선택된 하나 이상의 이의 분획은 ARA를 실질적으로 포함하지 않는다. 일부 양태에서, 미생물 오일 및/또는 트리아실글리세롤 분획, 디아실글리세롤 분획, 스테롤 분획, 스테롤 에스테르 분획, 유리 지방산 분획, 인지질 분획 및 이의 배합물로부터 선택된 하나 이상의 이의 분획은 약 0.4중량% 내지 약 2중량%, 약 0.4중량% 내지 약 3중량%, 약 0.4중량% 내지 약 4중량%, 약 0.4중량% 내지 약 5중량%, 약 0.4중량% 내지 약 5중량% 미만, 약 0.5중량% 내지 약 1중량%, 약 0.5중량% 내지 약 2중량%, 약 0.5중량% 내지 약 3중량%, 약 0.5중량% 내지 약 4중량%, 약 0.5중량% 내지 약 5중량%, 약 0.5중량% 내지 약 5중량% 미만, 약 1중량% 내지 약 2중량%, 약 1중량% 내지 약 3중량%, 약 1중량% 내지 약 4중량%, 약 1중량% 내지 약 5중량% 또는 약 1중량% 내지 약 5중량% 미만의 DPA n-6을 포함한다. 일부 양태에서, 미생물 오일 및/또는 트리아실글리세롤 분획, 디아실글리세롤 분획, 스테롤 분획, 스테롤 에스테르 분획, 유리 지방산 분획, 인지질 분획 및 이의 배합물로부터 선택된 하나 이상의 이의 분획은 약 5중량%, 약 5중량% 미만, 약 4중량% 이하, 약 3중량% 이하, 약 2중량% 이하, 약 1중량% 이하, 약 0.75중량% 이하, 약 0.6중량% 이하 또는 약 0.5중량% 이하의 DPA n-6을 포함한다. 일부 양태에서, 미생물 오일 및/또는 트리아실글리세롤 분획, 디아실글리세롤 분획, 스테롤 분획, 스테롤 에스테르 분획, 유리 지방산 분획, 인지질 분획 및 이의 배합물로부터 선택된 하나 이상의 이의 분획은 DPA n-6을 실질적으로 포함하지 않는다. 일부 양태에서, 미생물 오일 및/또는 트리아실글리세롤 분획, 디아실글리세롤 분획, 스테롤 분획, 스테롤 에스테르 분획, 유리 지방산 분획, 인지질 분획 및 이의 배합물로부터 선택된 하나 이상의 이의 분획은 약 5중량% 이하, 약 5중량% 미만, 약 4중량% 이하, 약 3중량% 이하 또는 약 2중량% 이하의 올레산(18:1 n-9), 리놀레산(18:2 n-6), 리놀렌산(18:3 n-3), 에이코센산(20:1 n-9), 에루크산(22:1 n-9), 스테아리돈산(18:4 n-3) 또는 이의 배합물을 갖는 지방산을 포함한다.
트리아실글리세롤 분자는 3개의 중심 탄소 원자(C(sn-1)H2R1-(sn-2)H2R2-C(sn-3)H2R3)를 함유함으로써 상이한 위치 이성체의 형성을 허용한다. 일부 양태에서, 미생물 오일은 트리아실글리세라이드 분획을 포함하며, 여기서 트리아실글리세롤 분획중 트리아실글리세롤의 적어도 약 2%, 적어도 약 3%, 적어도 약 5%, 적어도 약 10%, 적어도 약 15%, 적어도 약 20%, 적어도 약 30%, 적어도 약 35%, 또는 적어도 약 40%는, HPLC 크로마토그래피 상의 피크의 상대적인 면적 퍼센트를 기초로 하여, sn-1, sn-2, 또는 sn-3 위치 중의 어느 2개로부터 선택된 트리아실글리세롤(이치환된 DHA)내 2개 위치에서 DHA를 함유한다. 일부 양태에서, 미생물 오일은 트리아실글리세롤 분획을 포함하며, 여기서 트리아실글리세롤 분획중 트리아실글리세롤의 약 2% 내지 약 55%, 약 2% 내지 약 50%, 약 2% 내지 약 45%, 약 2% 내지 약 40%, 약 2% 내지 약 35%, 약 2% 내지 약 30%, 약 2% 내지 약 25%, 약 5% 내지 약 55%, 약 5% 내지 약 50%, 약 5% 내지 약 45%, 약 5% 내지 약 40%, 약 5% 내지 약 35%, 약 5% 내지 약 30%, 약 5% 내지 약 25%, 약 10% 내지 약 55%, 약 10% 내지 약 50%, 약 10% 내지 약 45%, 약 10% 내지 약 40%, 약 10% 내지 약 35%, 약 10% 내지 약 30%, 약 10% 내지 약 25%, 약 10% 내지 약 20%, 약 20% 내지 약 40%, 약 20% 내지 약 35%, 약 20% 내지 약 25%는, HPLC 크로마토그래피 상의 피크의 상대적인 면적 퍼센트를 기초로 하여, sn-1, sn-2, 또는 sn-3 위치 중의 어느 2개로부터 선택된 트리아실글리세롤내 2개 위치에서 EPA를 함유한다. 일부 양태에서, 미생물 오일은 트리아실글리세롤 분획을 포함하며, 여기서 트리아실글리세롤 분획중 트리아실글리세롤의 적어도 약 0.5%, 적어도 약 1%, 적어도 약 1.5% 또는 적어도 약 2%는, HPLC 크로마토그래피 상의 피크의 상대적인 면적 퍼센트를 기초로 하여, sn-1, sn-2, 또는 sn-3 위치(삼치환된 DHA) 중 모두에서 DHA를 포함한다. 일부 양태에서, 미생물 오일은 트리아실글리세롤 분획을 포함하며, 여기서 트리아실글리세롤 분획중 트리아실글리세롤의 약 0.5 내지 약 5%, 약 0.5 내지 약 3%, 약 0.5% 내지 약 2.5%, 약 0.5% 내지 약 2%, 약 1% 내지 약 5%, 약 1% 내지 약 3% 또는 1% 내지 약 2%는, HPLC 크로마토그래피 상의 피크의 상대적인 면적 퍼센트를 기초로 하여, sn-1, sn-2, 또는 sn-3 위치 중 모두에서 DHA를 포함한다. 일부 양태에서, 미생물 오일은 트리아실글리세롤 분획을 포함하며, 여기서 트리아실글리세롤 분획중 트리아실글리세롤의 적어도 약 10%, 적어도 약 15%, 적어도 약 20%, 적어도 약 25%, 적어도 약 30%, 적어도 약 35%, 적어도 약 40%, 적어도 약 45%, 적어도 약 50%, 적어도 약 55% 또는 적어도 약 60%는 HPLC 크로마토그래피 상의 피크의 상대적인 면적 퍼센트를 기초로 하여, sn-1, sn-2, 및 sn-3 위치 중 어느 하나로부터 선택된 트리아실글리세롤내 하나의 위치에서 DHA를 포함한다. 일부 양태에서, 미생물 오일은 트리아실글리세롤 분획을 포함하며, 여기서 트리아실글리세롤 분획중 트리아실글리세롤의 약 10% 내지 약 80%, 약 10% 내지 약 70%, 약 10% 내지 약 60%, 약 15 내지 약 80%, 약 15% 내지 약 75%, 약 15% 내지 약 70%, 약 15% 내지 약 65%, 약 15% 내지 약 60%, 약 35% 내지 약 80%, 약 35% 내지 약 75%, 약 35% 내지 약 65%, 약 35% 내지 약 60%, 약 40% 내지 약 80%, 약 40% 내지 약 75%, 약 40% 내지 약 70%, 약 40% 내지 약 65%, 약 40% 내지 약 60% 또는 약 40% 내지 약 55%는 HPLC 크로마토그래피 상의 피크의 상대적인 면적 퍼센트를 기초로 하여, sn-1, sn-2, 및 sn-3 위치 중 어느 하나로부터 선택된 트리아실글리세롤내 하나의 위치에서 DHA를 포함한다.
조성물
본 발명은 또한 본 발명의 미생물, 본 발명의 분리된 바이오매스, 본 발명의 미생물 오일 또는 이의 배합물을 포함하는 조성물에 관한 것이다.
본 발명의 미생물, 바이오매스 또는 미생물 오일은 또한 어떠한 공지된 기술에 의해서도 조성물의 요건을 기초로 하여 화학적으로 또는 물리적으로 개질되거나 또는 가공될 수 있다.
미생물 세포 또는 바이오매스는, 이로써 한정되는 것은 아니지만, 냉동 건조, 공기 건조, 분무 건조, 터널 건조(tunnel drying), 진공 건조(동결 건조: lyophilization) 또는 유사한 공정을 포함하는 방법에 의해 조성물에서 사용하기 전에 건조시킬 수 있다. 대안적으로, 수거하거나 세척한 바이오매스는 건조하지 않고 조성물에 직접 사용할 수 있다(참조: 본원에서 전체 내용이 참조로서 포함되는 미국 특허 제5,130,242호 및 제6,812,009호).
본 발명의 미생물 오일은 EPA 등의 지방산 속에 강화된 생성물을 더 효율적으로 생산하기 위한 출발 물질로서 사용될 수 있다. 예를 들면, 본 발명의 미생물 오일은 증류 또는 우레아 첨가 등과 같은, 당해 기술분야에 공지된 각종 정제 기술에 적용시켜 보다 높은 농도의 EPA 또는 다른 지방산을 갖는 보다 높은 효능의 생성물을 생산할 수 있다. 본 발명의 미생물 오일은 또한 EPA 또는 다른 지방산의 에스테르 및 염 등과 같이 오일내 지방산으로부터 기원한 화합물을 생산하기 위한 화학 반응에 사용될 수 있다.
본 발명의 조성물은 하나 이상의 부형제를 포함할 수 있다. 본원에 사용된 바와 같이, "부형제"는 식품 및 약제, 화장품 및 산업용 조성물을 포함하는 조성물에 바람직한 특성을 제공하기 위해 본 발명의 조성물에 사용된, 성분 또는 성분들의 혼합물을 지칭한다. 본 발명의 부형제는 약제학적 조성물에 첨가되는 경우에 "약제학적으로 허용되는" 부형제로 기재될 수 있으며, 이는, 온전한 의학적 판단 영역내에서, 부형제가 이상적인 이익/위험 비에 적합한 바람직한 접촉 기간에 걸쳐 과도한 독성, 자극, 알러지 반응 또는 다른 문제가 많은 합병증 없이 인간 및 비-인간 동물의 조직과 접촉하기에 적합한 화합물, 물질, 조성물, 염 및/또는 투여형태임을 의미한다. 일부 양태에서, 용어 "약제학적으로 허용되는"은 동물 및 보다 특히 인간에서 사용하기 위한 미국 약전 또는 다른 일반적으로 인지된 국제 약전에 수록되거나 연방 또는 주 정부의 감독 기관에 의해 승인됨을 의미한다. 각종 부형제가 사용될 수 있다. 일부 양태에서, 부형제는, 이로써 한정되는 것은 아니지만, 알칼리제, 안정화제, 항산화제, 부착제, 분리제, 피복제, 외부 상 성분, 방출 조절 성분, 용매, 계면활성제, 습윤제, 완충제, 충전제, 진정제 또는 이의 배합물일 수 있다. 본원에 기술된 것 외의 부형제는, 이로써 한정되는 것은 아니지만, 문헌[참조: Remington: The Science and Practice of Pharmacy, 21st ed. (2005)]에 수록되어 있다. 본원의 특정 등급(예를 들면, "용매")에서 부형제의 포함은 부형제의 역할을 제한하는 것이 아니라 설명하는 것으로 의도된다. 특정 부형제는 다중 등급내에 속할 수 있다.
본 발명의 조성물은, 이로써 한정되는 것은 아니지만, 식료품, 약제학적 조성물, 화장품 및 산업용 조성물을 포함한다.
일부 양태에서, 조성물은 식료품이다. 식료품은 비-인간 동물 또는 인간 소비용의 임의의 식품이며, 고체 및 액체 조성물을 포함한다. 식료품은 동물 또는 인간 식품에 대한 첨가제일 수 있다. 식료품은, 이로써 한정되는 것은 아니지만, 일반적인 식품; 우유, 음료(beverage), 치료학적 음료, 및 영양 음료를 포함하는 액체 제품; 기능성 식품; 보충물; 기능 식품; 조산아용 분유를 포함하는 영아용 조제식; 임신 또는 수유모용 식품; 성인용 식품; 노인용 식품; 및 동물 식품을 포함한다.
일부 양태에서, 본 발명의 미생물, 바이오매스 또는 미생물 오일은 직접 사용되거나 오일, 쇼트닝(shortening), 스프레드(spread), 다른 지방 성분, 음료, 소스, 낙농 또는 대두 식품(예를 들면, 우유, 요구르트, 치즈 및 아이스크림), 구운 제품, 영양 제품, 예를 들면, 영양 보충물(캅셀 또는 정제형)로서, 비타민 보충물, 식이 보충물, 분말 음료, 가공 또는 반-가공 분말 식료품 중의 하나 이상에 첨가제로서 포함될 수 있다. 일부 양태에서, 영양 보충물은 동물 공급원으로부터 형성되지 않고 동물 공급원의 어떠한 성분도 함유하지 않는 유제 캡슐 형태이다.
본 발명의 미생물 오일을 포함할 수 있는 조성물의 일부 목록은, 이로써 한정되는 것은 아니지만, 대두계 제품(우유, 아이스크림, 요구르트, 음료, 크림, 스프레드, 분말 크림(whitener); 수프 및 수프 혼합물; 도우(dough), 배터(batter) 및, 예를 들면, 빵 제품(bakery ware), 아침식사용 시리얼, 케익, 치즈케익, 파이, 컵케익, 쿠키, 바(bar), 빵, 롤, 비스킷, 머핀, 페스트리, 스콘(scone), 크루톤(crouton), 크래커, 감미 제품, 스낵 케익, 파이, 그래놀라(granola)/스낵 바 및 토우스트 페스트리를 포함하는 구운 식품 항목; 사탕; 단단한 과자류; 초콜렛 및 다른 과자류; 츄잉검; 액체 식료품, 예를 들면, 우유, 열량 음료, 영아용 조제식, 탄산음료, 차, 액상 식사(liquid meal), 과일 쥬스, 과일계 음료, 야채계 음료; 다중비타민 시럽, 식사 대용품, 의료용 식품 및 시럽; 분말 음료 혼합물; 파스타; 가공된 어류 제품; 가공된 고기 제품; 가공된 가금류 제품; 그래비(gravy) 및 소스; 조미료(케찹, 마요네스 등); 야채 오일계 스프레드; 유제품; 요구르트; 버터; 냉동 유제품; 아이스크림; 냉동 디저트; 냉동 요구르트; 유아 식품 등의 반고체 식료품; 푸딩 및 젤라틴 디저트; 가공된 및 가공되지 않는 치즈; 팬케익 믹스; 열량 바를 포함하는 식품 바; 와플 믹스; 샐러드 드레싱; 대체란 믹스(replacement egg mix); 견과 및 견과계 스프레드; 감자칩 및 기타 칩 또는 크리스프(crisp), 옥수수 칩, 토틸라 칩(tortilla chip), 압출된 스넥, 팝콘, 프레첼(pretzel), 감자 크리스프 및 견과 등의 소금가미 스낵; 딥(dips), 건조 과일 스낵, 고기 스낵, 돼지껍질 스낵(pork rinds), 건강 식품 바 및 쌀/옥수수 케익 등의 특수 스낵을 포함한다.
일부 양태에서, 본 발명의 미생물 오일은 영아용 조제식을 보충하는데 사용될 수 있다. 영아용 조제식은 본 발명의 미생물 오일을 단독으로 또는 아라키돈산(ARA)-생산 미생물로부터 기원한 물리적으로 정제된 오일과 함께 보충시킬 수 있다. ARA-생산 미생물은, 예를 들면, 모르티에렐라 알피나(Mortierella alpina) 또는 모르티에렐라 종파 슈무크케리(Mortierella sect. schmuckeri)이다. 대안적으로, 영아용 조제식은 본 발명의 미생물 오일을, ARASCO®[제조원: 마르텍 바이오사이언시스(Martek Biosciences), 미들랜드 콜롬비아 소재]을 포함하는 ARA가 풍부한 오일과 함께 보충할 수 있다.
일부 양태에서, 조성물은 동물 사료이다. "동물"은 동물계에 속하는 특정의 비-인간 유기체를 의미하며, 이로써 한정되지 않지만, 수생 동물 및 육상 동물을 포함한다. 용어 "동물 사료" 또는 "동물 식품"은, 어류; 시판 어류; 관상 어류; 어류 유충; 쌍각류; 연체동물; 갑각류; 패류; 새우; 새우 유충; 아르테미아(artemia); 담륜충(rotifer); 브라인 새우(brine shrimp); 여과 섭식동물; 양서류; 파충류; 포유류; 사육동물; 농장 동물; 동물원 동물; 스포츠 동물; 종계(breeding stock); 경주용 동물; 쇼 동물(show animal); 보존 동물(heirloom animal); 희귀 동물 또는 멸종위기 동물; 애완동물, 예를 들면, 개, 고양이, 기니아 피크, 토끼, 랫트, 마우스 또는 말; 원숭이[예를 들면, 세부스(cebus), 레서스(rhesus), 아프리카 녹색(African green), 파타스(patas), 시노몰구스(cynomolgus), 및 세르코피테쿠스(cercopithecus)], 유인원, 우랑우탄, 개코원숭이, 긴팔원숭이, 및 침팬지 등의 영장류; 개 및 늑대 등의 개과 동물; 고양이, 사자 및 호랑이 등의 고양이과; 말, 당나귀 및 얼룩말 등의 말과; 암소, 소, 돼지 및 양 등의 식용 동물; 사슴 및 기린 등의 유제류; 마우스, 랫트, 햄스터 및 기니아 피그 등의 설치류 등에 상관없이, 비-인간 동물에 의도된 특정 식품을 말한다. 동물 식품은, 이로써 한정되는 것은 아니지만, 양식 사료, 애완동물 사료, 동물원 동물 사료, 노동 동물 사료, 가축 동물 사료 또는 이의 조합을 포함하는 사육 동물 사료를 포함한다.
일부 양태에서, 조성물은, 이의 고기 또는 생산물이 인간에 의해 소비되는 특정 동물, 예를 들면, 고기, 알 또는 우유가 이로부터 인간 소비용으로 유래되는 특정 동물용 사료 또는 사료 보충물이다. 이러한 동물에게 공급되는 경우, LC-PUFA 등의 영양물이 고기, 우유, 알 또는 이러한 동물의 다른 생산물에 혼입되어 이들 영양분들의 함량을 증가시킬 수 있다.
일부 양태에서, 조성물은 동물성 플랑크톤, 아르테미아(artemia), 담륜충, 및 여과 섭식 동물에 의한 소비용으로 적합한 크기의 입자를 형성하기 위해 부서질 수 있는 분무-건조시킨 물질이다. 일부 양태에서, 조성물에 의해 공급된 동물성 플랑크톤, 아르테미아 또는 담륜충은 순차로 어류 유충, 어류, 조개류, 쌍각류 또는 갑각류에게 공급된다.
일부 양태에서, 조성물은 약제학적 조성물이다. 적합한 약제학적 조성물은, 이로써 한정되는 것은 아니지만, 항염 조성물, 관상동맥심질환의 치료용 약물, 동맥경화증의 치료용 약물, 화학치료제, 활성 부형제, 골다공증 약물, 항-우울증제, 항경련제, 항-헬리코박터 필로리 약물, 신경변성 질환의 치료용 약물, 변성 간 질환의 치료용 약물, 항생제, 콜레스테롤 저하 조성물, 및 트리글아실리세롤 저하 조성물을 포함한다. 일부 양태에서, 조성물은 의학 식품이다. 의학 식품은 주치의의 감독하에 외부적으로 소모되거나 투여되는 조성물로 존재하고 인지된 과학 원리를 기초로 하여, 명백한 영양 요건이 의학적 평가에 의해 확립되는 조건의 특수한 식이 조절을 위해 의도된 식품을 포함한다.
일부 양태에서, 미생물 오일은 투약 형태로 제형화될 수 있다. 투약 형태는, 이로써 한정되는 것은 아니지만, 유효량의 미생물 오일을 포함하는 액제, 현탁제, 유제 및 건조 분말을 포함하는, 이에 제한되지 않는 정제, 캅셀제, 카세제(cachet), 펠렛, 환제, 산제 및 과립제 및 비경구적 투약 형태를 포함할 수 있다. 이러한 제형이 또한 약제학적으로 허용되는 희석제, 충전제, 붕해제, 결합제, 윤활제, 표면활성제, 소수성 비히클, 수용성 비히클, 유화제, 완충제, 습윤제, 습윤화제, 가용화제, 방부제 등을 함유할 수 있음은 당해 분야에 또한 공지되어 있다. 투여 형태는, 이로써 한정되는 것은 아니지만, 미생물 오일 및 하나 이상의 적합한 약제학적으로 허용되는 담체를 함유하는 정제, 당의제(dragee), 캅셀제, 캐플렛(caplet), 및 환제를 포함할 수 있다.
경구 투여를 위해, 미생물 오일은 당해 기술분야에 공지된 약제학적으로 허용되는 담체와 혼합할 수 있다. 이러한 담체는, 본 발명의 치료할 대상체가 경구 섭취하기 위해 미생물 오일이 정제, 환제, 당의제, 캅셀제, 액제, 겔제, 시럽제, 슬러리제, 현탁제 등과 같이 제형되되도록 할 수 있다. 일부 양태에서, 투약 형태은 정제, 환제 또는 카플렛이다. 경구용의 약제학적 제제는 고체 부형제를 가하고, 수득되는 혼합물을 임의로 분쇄하고, 경우에 따라, 적합한 보조제를 첨가한 후, 과립의 혼합물을 가공하여 정제 또는 당의제 코어를 수득함으로써 수득할 수 있다. 적합한 부형제는, 이로써 한정되는 것은 아니지만, 락토즈, 슈크로즈, 만니톨 및 소르비톨을 포함하는, 이에 제한되지 않는 당류 등의 충전제; 이로써 한정되는 것은 아니지만, 옥수수 전분, 밀 전분, 쌀 전분, 감자 전분, 젤라틴, 검 트라가칸트, 메틸 셀룰로즈, 하이드록시프로필메틸 셀룰로즈, 나트륨 카복시메틸 셀룰로즈, 및 폴리비닐피롤리돈(PVP) 등의 셀룰로즈 제제를 포함한다. 필요에 따라, 이로써 한정되는 것은 아니지만, 가교결합된 폴리비닐 피롤리돈, 아가(agar), 또는 알긴산 또는 알긴산나트륨 등의 이의 염과 같은 붕해제를 가할 수 있다. 경구적으로 사용될 수 있는 약제학적 제제는, 이로써 한정되는 것은 아니지만, 젤라틴으로 제조된 푸쉬-핏 캅셀(push-fit capsule), 및 또한 젤라틴 및 글리세롤 또는 소르비톨 등의 가소제로 제조된 연질의 밀봉된 젤라틴 캅셀을 포함한다.
일부 양태에서, 조성물은 화장품이다. 화장품은, 이로써 한정되는 것은 아니지만, 유제, 크림제, 로션제, 차폐제, 비누, 샴푸, 세척액, 화장 크림(facial cream), 컨디셔너(conditioner), 메이크업(make-up), 목욕 제제, 및 분산 액체를 포함한다. 화장 제제는 의약이거나 의약이 아닐 수 있다.
일부 양태에서, 조성물은 산업용 조성물이다. 일부 양태에서, 조성물은 하나 이상의 제제(manufacture)용 출발 물질이다. 제제는, 이로써 한정되는 것은 아니지만, 중합체; 사진 감광성 물질; 세제; 산업용 오일; 또는 산업용 세제를 포함한다. 예를 들면, 미국 특허 제7,259,006호는 베헨산의 생산 및 베헨산을 사용한 사진 민감성 물질의 생산을 위한 DHA-함유 지방 및 오일의 용도를 기술하고 있다.
조성물의 사용 방법
일부 양태에서, 조성물은 인간 또는 비-인간 동물에서의 증상 치료에 사용될 수 있다. 일부 양태에서, 조성물은 인간 또는 비-인간 동물에서 영양섭취(nutrition)에 사용될 수 있다.
용어 "치료하다" 및 "치료"는 치료학적 치료 및 예방학적 또는 예방적 조치(measure) 둘 다를 지칭하며, 여기서 이의 목적은 바람직하지 않는 생리학적 증상, 질병 또는 질환을 방지하거나 서서히 강하(경감)시키거나, 또는 유리하거나 바람직한 임상 결과를 수득하기 위한 것이다. 본 발명의 목적을 위해, 유리하거나 바람직한 임상 결과는, 이로써 한정되는 것은 아니지만, 증상, 질병 또는 질환과 관련된 징후 또는 전조의 완화; 증상, 질병 또는 질환의 정도의 감소; 증상, 질병 또는 질환의 안정화(즉, 증상, 질병 또는 질환이 악화되지 않는 경우); 증상, 질병 또는 질환의 발병 또는 진행의 지연; 증상, 질병 또는 질환의 개량; 증상, 질병 또는 질환의 완화(부분적이거나 전체적인 것에 상관없이 및 검출가능하거나 검출가능하지 않는 것에 상관없이); 또는 증상, 질병 또는 질환의 향상 또는 개선을 포함한다. 치료는 과도한 부작용 없이 임상적으로 상당한 반응을 유도하는 것을 포함한다. 치료는 또한 치료를 받지 않는 경우에 예측 수명과 비교하여 연장된 생존을 포함한다.
일부 양태에서, 조성물은 여드름, 급성 염증, 나이 관련 황반병, 알러지, 알츠하이머병(Alzheimer's disease), 관절염, 천식, 죽상경화증, 자가면역 질환, 혈중 지질 질환, 유방 낭종(breast cyst), 악액질, 암, 심장 재협착, 심혈관병, 만성 염증, 관상심질환, 낭성섬유증, 간의 변성 질환, 당뇨병, 습진, 위장 질환, 심장병, 고 트리아실글리세롤 수준, 고혈압, 과다활동, 면역질환, 억제성 종양 성장, 염증 증상, 장 질환, 신장 기능장애, 백혈병, 주요 우울증, 다발성 경화증, 신경변성 질환, 골관절염, 골다공증, 페르옥시솜병(peroxisomal disorder), 자간전증, 조기분만, 건선, 폐질환, 류마티스 관절염, 심장병의 위험 또는 혈전증 등의 증상, 질병 또는 질환을 치료하는데 사용된다.
일부 양태에서, 본 발명의 조성물을 사용하여 임신 3개월(trimester)에서 임신 기간을 증가시킨다.
일부 양태에서, 조성물은 혈압을 조절하는데 사용된다.
일부 양태에서, 조성물은 인지 기능을 개선시키거나 유지하는데 사용된다.
일부 양태에서, 조성물은 기억을 개선시키거나 유지하는데 사용된다.
조성물 또는 투약 형태는 대상체의 체내에 조성물 또는 투약 형태와 혼화성인 임의의 경로로도 투여할 수 있다. 물질이 대상체에 의해 대상체의 신체내로 도입되는 경우, 또는 다른 인간, 기계 또는 장치가 물질을 대상체의 체내로 도입하는 경우에 당해 물질은 "투여"되는 것으로 고려된다. 따라서, "투여하는"은, 예를 들면, 자가-투여, 다른 것에 의한 투여 및 간접 투여를 포함한다. "투여"와 관련하여 본원에 사용된 용어 "연속" 또는 "연이은"은, 투여 회수가 매일 적어도 1회임을 의미한다. 그러나, 투여 회수는 매일 1회보다 많을 수 있으며, 여전히 '연속" 또는 "연이은", 예를 들면, 본원에 규정된 투약 수준을 초과하지 않는 한, 매일 2회 또는 심지어 3회 이상일 수 있다. 투여 수단 및 방법은 당해 기술분야에 공지되어 있으며, 숙련가들은 각종 안내용 약리학적 문헌을 참조할 수 있다. 예를 들면, 문헌[참조: "Modern Pharmaceutics," Banker & Rhodes, Informa Healthcare, USA, 4th ed. (2002); and "Goodman & Gilman's The Pharmaceutical Basis of Therapeutics," McGraw-Hill Companies, Inc., New York, 10th ed. (2001)]을 참고할 수 있다.
"대상체", "개인" 또는 "환자'는, 진단, 예후 또는 치료 또는 조성물 또는 투약 형태의 투여가 요구되는 인간 또는 비-인간에 상관없는 임의의 대상체를 의미한다. 포유동물 대상체는, 이로써 한정되는 것은 아니지만, 인간; 사육 동물; 농장 동물; 동물원 동물; 스포츠 동물; 애완 동물, 예를 들면, 개, 고양이, 기니아 피그, 토끼, 랫트, 마우스 또는 말; 영장류, 예를 들면, 원숭이(예를 들면, 세부스, 레서스(rhesus), 아프리카 녹색, 파타스, 시노몰구스 및 세르코피테쿠스), 유인원, 우랑우탄, 개코원숭이, 긴팔원숭이, 및 침팬지 등의 영장류; 개 및 늑대 등의 개과 동물; 고양이, 사자 및 호랑이 등의 고양이과; 말, 당나귀 및 얼룩말 등의 말과; 암소, 소, 돼지 및 양 등의 식용 동물; 사슴 및 기린 등의 유제류; 마우스, 랫트, 햄스터 및 기니아 피그 등의 설치류 등을 포함한다. 용어 대상체는 또한 모델 동물, 예를 들면, 질병 모델 동물을 포함한다. 일부 양태에서, 용어 대상체는 경제적으로 또는 이와는 달리, 예를 들면, 경제적으로 중요한 육종 가축, 경주용 동물, 쇼 동물, 국보 동물, 희귀 또는 멸종위기 동물 또는 반려동물을 포함한다. 특정 양태에서, 대상체는 인간 대상체이다. 특정 양태에서, 대상체는 비인간 대상체이다.
조성물은 "영양학적 양", "치료학적 유효량", "예방학적 유효량", "치료학적 투약량" 또는 "예방학적 투약량"으로서 투여될 수 있다. "영양학적 양"은 필요한 투약량 및 기간 동안 목적하는 영양 결과를 달성하는데 효과적인 양을 지칭한다. 영양학적 결과는, 예를 들면, 대상체에서 바람직한 지방산 성분의 증가된 수준일 수 있다. "치료학적 유효량" 또는 "치료학적 투약량"은 필요한 투약량 및 기간 동안 바람직한 치료 효과를 달성하기에 효과적인 양을 지칭한다. 치료학적 결과는, 예를 들면, 징후의 감소, 연장된 생존, 개선된 이동성 등일 수 있다. 치료학적 결과는 "치유"일 필요는 없다. "예방학적 유효량" 또는 "예방학적 투약량"은 필요한 투약량 및 기간 동안 바람직한 예방학적 결과를 달성하기에 효과적인 양을 지칭한다. 통상적으로, 예방학적 투약량은 질병의 조기 단계 이전에 또는 조기 단계에 대상체에서 사용되므로, 예방학적 유효량은 질병의 진전된 단계의 치료를 위한 치료학적 유효량보다 적을 것이다.
약제학적 조성물의 각종 투약량, 투약 형태 또는 약제학적 조성물은 대상체에게 투여될 미생물, 바이오매스 또는 미생물 오일의 EPA 또는 다른 지방산 성분의 양을 기초로 하여, 대상체에게 투여될 수 있다. 용어 "1일 투약량(dosage)", "1일 투약량 수준" 및 "1일 투약량(dosage amount)"은 본원에서 1일당(24시간 기간당) 투여된 EPA 또는 다른 지방산 성분의 총량을 지칭한다. 따라서, 예를 들면, 2mg의 1일 용량에서 대상체에게 EPA를 투여하는 것은, EPA가 2mg의 EPA를 포함하는 단일 투약 형태로서, 또는 달리는 0.5　mg의 EPA 각각을 포함하는 4회 투약 형태(총 2mg의 EPA)로서 투여되는 것에 상관없이, 대상체가 1일 기준으로 총 2mg의 EPA를 제공받음을 의미한다. 일부 양태에서, EPA의 1일 양은 단일 투약 형태, 또는 2회 투약 형태로 투여된다. 본 발명의 투약 형태는 단일 적용 또는 다중 적용으로 취해질 수 있다. 예를 들면, 4개의 정제를 매일 섭취하는 경우, 0.5mg의 EPA를 포함하는 각각의 정제, 이어서 모두 4개의 정제를 1일 1회 섭취할 수 있거나, 2개의 정제를 1일 2회 섭취할 수 있거나, 1개의 정제를 6시간마다 섭취할 수 있다. 일부 양태에서, 1일 투약량은 약 0.5mg 내지 약 250mg, 약 100mg 내지 약 250mg, 약 100mg 내지 약 500mg, 약 100mg 내지 약 1g, 약 1g 내지 약 2.5g, 약 1g 내지 약 5g, 약 1g 내지 약 10g, 약 1g 내지 약 15g, 약 5g 내지 약 10g, 약 5g 내지 약 15g, 약 10g 내지 약 15g, 약 100mg 내지 약 10g, 약 100mg 내지 약 5g 또는 약 100mg 내지 약 2.5g의 EPA, DHA 또는 이의 배합물이다. 일부 양태에서, 조성물은 투약 형태당 약 0.5mg 내지 약 250mg, 100mg 내지 약 250mg, 약 0.5mg 내지 약 500mg, 약 100mg 내지 약 500mg, 약 0.5mg 내지 약 1g 또는 약 100mg 내지 약 1g의 EPA, DHA 또는 이의 배합물이다.
본 발명의 조성물 또는 투약 형태의 투여는 각종 섭생을 사용하여 달성할 수 있다. 예를 들면, 일부 양태에서, 투여는 매일 연속일로, 또는 대안적으로 격일마다(2일마다) 수행한다. 투여는 1일 이상의 일로 수행할 수 있다.
조성물 및 투약 형태의 투여는 증상의 치료를 위해 사용된 다른 섭생과 조합시킬 수 있다. 예를 들면, 본 발명의 방법은 식이 섭생(예를 들면, 저탄수화물 식이, 고단백질 식이, 고섬유 식이 등), 운동 섭생, 체중 감소 섭생, 금연 섭생 또는 이의 조합과 결합시킬 수 있다. 본 발명의 방법은 또한 증상의 치료시 다른 약제학적 제품과 함께 사용할 수 있다. 본 발명의 조성물 또는 투약 형태는 다른 섭생 또는 약제학적 제품의 투여 전 또는 후에 투여할 수 있다.
조성물을 포함하는 키트
본 발명은 또한 본 발명의 조성물의 하나 이상의 단위를 함유하는 키트 또는 포장에 관한 것이다. 키트 또는 포장은 본 발명의 미생물, 바이오매스 또는 미생물 오일, 또는 이의 배합물을 포함하는 식품, 약제학적 조성물, 화장품 또는 산업용 조성물의 단위를 포함할 수 있다. 키트 또는 포장은 또한 식품, 화장품, 약제학적 조성물 또는 산업용 조성물의 제조를 위한 본 발명의 미생물, 바이오매스 또는 미생물 오일, 또는 이의 배합물을 포함하는 첨가물을 포함할 수 있다.
일부 양태에서, 키트 또는 포장은 본 발명의 방법에 따라 투여될 약제학적 조성물의 하나 이상의 단위를 함유한다. 키트 또는 포장은 하나의 투약량 단위 또는 하나 이상의 투약량 단위(즉, 다중 투약량 단위)를 함유할 수 있다. 다중 투약량 단위가 키트 또는 포장 속에 존재하는 경우, 다중 투약량 단위는 순차적인 투여를 위해 임의로 정렬될 수 있다.
본 발명의 키트는 임의로 키트의 단위 또는 투약 형태와 관련된 지시사항을 함유할 수 있다. 이러한 지시사항은 약제학적 제품의 제조, 사용 또는 판매를 감독하는 정부 기관에 의해 규정된 형태일 수 있으며, 이러한 주의사항은 증상 또는 질환을 치료하기 위해 인간 투여용으로 제조, 사용 또는 판매 대리인에 의한 승인을 반영한다. 지시사항은 본 발명의 방법에 따른 키트내 단위 또는 투약 형태의 사용에 대한 정보를 전달하는 임의의 형태일 수 있다. 예를 들면, 지시사항은 인쇄물의 형태 또는 앞서 기록된 의학 장치의 형태일 수 있다.
환자의 시험 과정 중에, 의학 전문의는 본 발명의 방법 중 하나의 투여가 환자에게 적절한지를 결정할 수 있거나, 주치의는, 환자의 증상이 본 발명의 방법 중 하나의 투여에 의해 개선될 수 있는지를 결정할 수 있다. 특정 섭생을 기재하기 전에, 주치의는 환자와, 예를 들면, 섭생과 관련된 각종 위험 및 이점에 대해 조언할 수 있다. 환자는 섭생과 관련된 모든 공지되고 예측된 위험의 완전한 기술내용을 제공받을 수 있다. 이러한 조언과정은 구두로 및 인쇄물로 제공될 수 있다. 일부 양태에서, 주치의는 환자에게 제품 정보, 교육 자료 등의 섭생에 대한 문헌 자료를 제공할 수 있다.
본 발명은 또한 치료 방법에 대해 소비자를 교육시키는 방법에 관한 것이며, 당해 방법은 투약 형태를 판매 시점에 소비자 정보로 분배함을 포함한다. 일부 양태에서, 이러한 분배는 약사 또는 건강관리 제공자의 판매 시점에 수행할 것이다.
용어 "소비자 정보"는, 이로써 한정되는 것은 아니지만, 영문 교재, 비영문 교재, 시각적 정보, 도표, 전화 기록물, 웹사이트 및 실시간 소비자 서비스 대표자에 대한 접근을 포함한다. 일부 양태에서, 소비자 정보는 본 발명의 방법에 따른 투약 형태의 사용, 적절한 연령 사용, 지표, 부작용, 적절한 투약량, 경고문, 웹사이트 주소의 전화번호에 대한 지시사항을 제공할 것이다. 일부 양태에서, 당해 방법은 본 발명의 방법에 따라 기재된 섭생의 사용에 관한 소비자 질문에 답하는 위치에 있는 관계자에 대한 전문 정보를 제공함을 추가로 포함한다. 용어 "전문 정보"는, 이로써 한정되는 것은 아니지만, 의학적으로 전문적이어서 소비자 질문에 답할 수 있도록 설계된 본 발명의 방법에 따라 투여된 경우에 섭생에 관한 정보를 포함한다.
"의학적 전문(의)"은, 예를 들면, 의사, 의사 보조자, 간호원, 약사 및 소비자 서비스 대표자를 포함한다.
본 발명을 일반적으로 기술하였지만, 본원에 제공된 실시예를 참조로 하여 추가의 이해가 수득될 수 있다. 이들 실시예는 단지 설명할 목적이며 제한하는 것으로 의도되지 않는다.
실시예 1
미생물의 분리
시료은 북아메리카의 서부 연안(캘리포니아, 오레곤 및 워싱턴) 및 하와이를 따르는 만 및 강어귀를 포함하는 낮은 조수 동안 서식지로부터 수집했다. 물, 퇴적물, 살아있는 식물 및 부패 식물/동물 파편을 멸균 50ml 튜브에 넣었다. 각 시료의 일부를 물과 함께 분리 배지의 고체 한천 플레이트에 펼쳤다. 분리 배지는 500ml의 인공 해수, 500ml의 멸균수, 1g의 글루코즈, 1g의 글리세롤, 13g의 한천, 1g의 글루타메이트, 0.5g의 효모 추출물, 0.5g의 카제인 가수분해물, 1ml의 비타민 용액(100mg/L 티아민, 0.5mg/L 바이오틴, 0.5mg B12), 1ml의 미량 광물 용액(PII 금속, 리터당 함유량: 6.0g의 FeCl36H2O, 6.84g의 H3BO3, 0.86g의 MnCl24H2O, 0.06g의 ZnCl2, 0.026g의 CoCl26H20, 0.052g의 NiSO4H2O, 0.002g의 CuSO45H2O 및 0.005g의 Na2MoO42H2O), 및 500mg의 페니실린 G 및 스트렙토마이신 설페이트 각각으로 이루어졌다. 한천 플레이트를 암실에서 20 내지 25℃로 항온처리하였다. 2 내지 4일 후, 한천 플레이트를 확대하여 시험하고, 세포의 콜로니를 멸균 이쑤시개로 집어서 새로운 배지 플레이트 위에 재스트리킹(restreaking)하였다. 오염된 유기체가 제거될 때까지 세포를 반복적으로 새로운 배지 위해 스트리킹하였다. 분리된 미생물 중의 2개는 ATCC 수탁번호 PTA-10212 및 PTA-10208로 기탁되었다.
ATCC 수탁번호 PTA-10212로 기탁된 분리된 미생물의 분류학상 특성
ATCC 수탁번호 PTA-10212("PTA-10212")로 기탁된 분리된 미생물의 배양물은 가시적으로 분리된 포자낭군 없이 백색의 습윤 얼룩 콜로니로서 나타났다.
PTA-10212를 고체 및 액체 FFM, 고체 KMV, KMV 슬러쉬(1%), KMV 브로쓰 및 MH 브로쓰에서 성장시켜 성장 특성을 추가로 검사했다. PTA-10212는 KMV 및 MH에서 신속하게 성장하는 것으로 관찰되었다[참조: Porter D., 1989. Phylum Labyrinthulomycota. In Margulis, L., Corliss, J.O., Melkonian, M., Chapman, D.J. (Eds.) Handbook of Protoctista, Jones and Bartlett, Boston, pp. 388-398 (KMV); Honda et al., Mycol. Res. 102:439-448 (1998) (MH); 및 미국 특허 제5,130,242호(FFM), 이들 각각은 전체 내용이 본원에서 참조로서 포함된다].
하기 관찰은 고체 FFM 배지 상에서 수일에 걸쳐 PTA-10212의 성장 후, KMV 배지 및 MH 브로쓰에서 72시간 성장 후에 이루어졌다. 포자낭은 어느 배지 속/상에서 응집되지 않았고, 매우 작았다(5 내지 10㎛). PTA-10212는 스키조키트리움(Schizochytrium) 개열 패턴의 풍부한 4분자 특성을 입증하지 않았다. 아메바상 세포는 신선한 고체 배지로 옮긴 후 약 24시간에서 나타났다. 이들 아메바상 세포는 수일 후에 사라졌고, 액체 또는 슬러쉬 배지에서 증명되지 않았다. 액체 배지에서 성장시킬 때에 "플라스크 하부에 작은 모래입자"의 외관을 갖는 것으로 문헌[참조: Yokoyama, R. et al., Mycoscience 48(6): 329-341 (2007)]에 기재된 오란티오키트리움(Aurantiochytrium)과 달리, PTA-10212는 플라스크 하부에 침강되지 않았지만, KMV 및 MH 액체 배지 둘 다에서 현탁되었다. 포자낭은, PTA-10212로부터 부재하는 확실한 외부원형질 네트워크를 또한 갖는, 전형적인 스키조키트리움 또는 올리고키트리움과 같이 조밀하지 않았다. 대부분의 종은 수시간에 걸쳐 보다 큰 포자낭의 분열에 의해 작은 포자낭 또는 동화 세포의 영양 개열을 받지만, PTA-10212는 덤벨형의 신장된 동화 세포를 형성했고, 이는 이어서 덤벨의 말단이 분리됨에 따라 떨어져 끌어당기는 얇은 협부를 형성했다. 생성되는 세포는 작은 동화 세포인 것으로 나타났다. 아메바상 세포의 덤벨형 동화 세포의 직접적인 형질전환은 관찰되지 않았다. 전형적인 쌍편모 유주자는 수영하는 것으로 관찰되었지만, 비교적 드물었다. PTA-10212는 비증식성이므로, 영양 개열에 의해 분할한다. 유주자는 수영하는 것으로 관찰되었으나, 유주자의 직접 방출은 관찰되지 않았다. 영양 세포는 매우 작았다(2㎛ 내지 5㎛).
PTA-10212는 현미경 슬라이드가 작은 부분의 한천 성장 콜로니를 반-강도 해수 한 방울에 현탁시켜 제조된 유동 기술을 사용하여 추가로 시험했다. 이 기술을 사용하여, 제1 포자낭은 구형이고 직경이 약 10㎛인 것으로 관찰되었다. 원형동물의 이분열이 개시될 경우 벽은 매우 얇았고, 나머지는 관찰되지 않았다. 반복된 이분열은 8 내지 16개의 소형(직경 4 내지 5㎛) 2차 포자낭을 생산했다. 2차 포자낭은 무조직 원생 동물을 방출시키기 전에 수 시간 동안 조용하게 잔류했다. 무조직 원생동물은 꼬집고 당겨서 분할해 최초로 전형적인 덤벨형 중간 단계를 생성하고, 최종적으로 직경 2.5-2.8㎛의 4 내지 8개의 소형의 구형 본체를 유도한다. 후자를 수분 내지 1-2시간 동안 휴지시킨 다음, 형태를 변화시키고(신장시키고), 쌍편모 유주자, 2.3-2.5 x 3.7-3.9㎛로 변화시켰다. 유주자는 풍부했고, 이들이 휴지될 때까지 정확하게 측정될 수 있었다. 이어서, 유주자를 둥글게 하고, 새로운 발달 주기를 개시했다. 유주자는 씨사이요이도키트리움 미누툼(Sicyoidochytrium minutum)보다 크고 울케니아 비수르겐시스(Ulkenia visurgensis)보다 작았다.
PTA-10212는 공지된 종의 그것에 대한 이의 18s rRNA 유전자의 유사성에 기초하여 추가로 특성화되었다. 게놈 DNA는 표준 절차로 PTA-10212로부터 제조했다[참조: Sambrook J. and Russell D. 2001. Molecular cloning: A laboratory manual, 3rd edition. Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York]. 요약하면, (1) 500㎕의 세포를 중-로그 배양액으로부터 원심분리했다. 세포를 재원심분리시키고, 모든 미량의 액체는 작은 구경 선단을 갖는 세포 펠릿으로부터 제거했고; (2) 펠릿을 200㎕ 용해 완충제(20mM 트리스 pH 8.0, 125μg/mL 프로테이나제 K, 50mM NaCl, 10mM EDTA pH 8.0, 0.5% SDS)로 재현탁시켰고; (3) 세포를 50℃에서 1시간 동안 용해시켰고; (4) 용해 혼합물을 페이스-락(phase-lock) 겔(PLG-에펜도르프) 2mL 튜브에 피펫팅했고; (5) 동일 용적으로 P:C:I를 첨가하고, 1.5시간 동안 혼합했고; (6) 튜브를 12,000 x g에서 5분 동안 원심분리했고; (7) 수성 상을 PLG 튜브 내에서 상기 겔로부터 제거하고, 동일 용적의 클로로포름을 수성 상에 첨가하고, 30분 동안 혼합했고; (8) 튜브를 14,000 x g에서 약 5분 동안 원심분리했고; (9) 상부 층(수성 상)을 클로로포름으로부터 피펫팅하고, 새로운 튜브에 넣었고; (10) 0.1용적의 3M NaOAC를 첨가하고, 혼합했고(수회 역전시켰고); (11) 2용적의 100% EtOH를 첨가하고, 이 단계에서 형성하는 게놈 DMA 침전제와 혼합했고(수회 역전시켰고); (12) 튜브를 14,000 x g에서 약 5분 동안 4℃에서 미량원심기에서 원심분리했고; (13) 액체를 튜브의 기저부에 잔류하는 게놈 DNA와 함께 완만하게 부었고; (14) 펠릿을 0.5mL 70% EtOH로 세척했고; (15) 튜브를 14,000 x g에서 약 15분 동안 4℃에서 미량원심기에서 원심분리했고; (16) EtOH를 완만하에 붓고, 게놈 DNA 펠릿을 건조시켰고; (17) 적합한 용적의 H2O 및 RNase를 게놈 DNA 펠릿에 직접 첨가했다. 18s rRNA 유전자의 PCR 증폭은 이미 기술된 프라이머로 수행했다[참조: Honda et. al., J. Euk. Micro. 46(6): 637-647 (1999)]. 염색체 DNA 주형에 의한 PCR 조건은 다음과 같다: 0.2μM dNTPs, 0.1μM 각 프라이머, 8% DMSO, 200ng 염색체 DNA, 2.5U Herculase® II 융합 DNA 폴리머라제(Stratagene), 및 Herculase® 완충제(Stratagene), 50μL 총 용적. PCR 프로토콜은 다음 단계를 포함한다: (1) 2분 동안 95℃; (2) 35초 동안 95℃; (3) 35초 동안 55℃; (4) 1분 30초 동안 72℃; (5) 30주기 동안 단계 2-4 반복; (6) 5분 동안 72℃; 및 (7) 4℃에서 유지.
PCR 증폭은 상기한 염색체 주형을 사용하여 기대된 크기를 갖는 명확한 DNA 생성물을 수득했다. PCR 생성물을 제조업자의 지침에 따라 벡터 pJET1.2/블런트(Fermentas)로 클로닝하고, 삽입 서열을 공급된 표준 프라이머를 사용하여 측정했다.
계통발생 분석은 적절한 지지체로 트라우스토키트리움 파키데루뭄(Thraustochytrium pachydermum) 및 트라우스토키트리움 아그레가툼(Thraustochytrium aggregatum)을 포함하는 계통 내의 PTA-10212에 적용한다. 티. 파키데르뭄의 포자낭은 매우 두꺼운 세포벽을 갖는다. 티. 아그레가툼은 명백하게 불투명한 포장낭군의 가시성 집단을 형성한다. PTA-10212는 이들 특성의 어떤 것도 나타내지 않는다. 다수의 아메바형 세포의 존재가 기타 분류군, 예를 들면, 울케니아(Ulkenia), 티. 가에르트네리움(T. gaertnerium), 에이. 리미아시눔(A. limiacinum) 및 에스. 만그로베이(S. mangrovei)에서 기술되지만; 이러한 분류군과 관련된 설명은 관찰된 격리 집단의 특성과 상이하다. 또한, PTA-10212는 임의의 이들 분류군을 향한 계통발생 친화도를 나타내지 않았다.
표 3은 국립 생물공학 정보 센터(NCBI)에 DNA 서열에 대한 ATCC 수탁번호 PTA-10212로 기탁된 미생물로부터 18s rRNA 서열의 비교를 나타낸다. 퍼센트 동일성은 두 개의 상이한 계산을 사용하여 측정했다. "계산 #1"은 비-상동성 영역 또는 부분적 서열(AlignX-VectorNTI 디폴트 셋팅)로부터 서열 중에 발생하는 임의의 "갭"을 고려한다. "계산 #2"는 갭(AlignX-VectorNTI "동일성" 매트릭스 세팅)에 대한 계산된 벌점을 포함하지 않는다.
[표 3] 18s rRNA 서열의 비교
Figure pat00003
표 3에서 제시된 바와 같이, % 동일성과 관련하여, ATCC 수탁번호 PTA-10212로 기탁된 미생물로부터 18s rRNA 서열(서열번호 l)은, 동일하지 않지만, NCBI 데이터베이스에서 이용가능한 18s rRNA 유전자 서열과 관련된다는 것이 밝혀졌다. 유기체가 상이한 속 또는 종에 속하는 18s rRNA 유전자 서열과 밀접하게 관련될 수 있음이 일반적으로 인지된다.
상기한 특성화에 기초하여, ATCC 수탁번호 PTA-10212로 기탁된 분리된 미생물은 새로운 트라우스토키트리움(Thraustochytrium) 종을 나타내는 것으로 간주되고, 따라서 또한 트라우스토키트리움 종(Thraustochytrium sp.), ATCC PTA-10212로서 지정된다.
ATCC 수탁번호 PTA-10208로 기탁된 분리된 미생물의 분류 특성
ATCC 수탁번호 PTA-10208로 기탁된 분리된 미생물("PTA-10208")은, 각각 전문이 본원에 참조로 인용된 미국 특허원 제12/407,687호 및 제PCT/US2009/001720호에 기술된 ATCC 수탁번호 PTA-9695로 기탁된 미생물("PTA-9695")의 서브-분리물(배양물로부터 분리되고 신규한 별도의 명백한 배양물로서 유지된 개별적 세포)로서 동정되었다.
PTA-10208은 PTA-9695와 분류 특성을 공유한다. PTA-9695는 성숙 포자낭으로부터 떨어져 활동적으로 수영 방출시 쌍편모 유주자를 갖는 것으로 밝혀졌고, 이의 벽 잔류물은 포자 방출 후 명백하게 가시적이었다(상 대조). PTA-9695 포자낭은 직경이 12.5㎛ 내지 25㎛로 측정되었고, 유주자는 크기가 2.5㎛ 내지 2.8㎛ x 4.5㎛ 내지 4.8㎛였다. 개별적인 PTA-9695 포자낭당 8 내지 24개의 포자가 존재한다. 고정된 PTA-9695 유주자를 확대시키고, 신속하게 이분열을 경험시켜 테트라드, 옥타드 및 최종적으로 포자낭의 집단을 유도한다. 이들 특성은 속 스키조키트루움(Schizochytrium)과 일치한다. % 동일성과 관련하여, PTA-10208로 공유되는 PTA-9695 18s rRNA 유전자 서열(서열번호 2)은 동일하지는 않지만, 문헌[참조: Honda, D. et al., J. Euk. Micro. 46(6): 637-647 (1999)]에 제공된 티. 아그레가툼(T. aggregatum)의 18s rRNA 유전자 서열에 밀접하게 관련되는 것으로 밝혀졌다. 트라우스토키트리움 아그레가툼을 위해 공개된 18s rRNA 서열은 서열의 중간에서 약 71 DNA 뉴클레오티드 갭을 갖는 부분적 서열이다. PTA-9695는 새로운 스키조키트리움 종을 나타내는 것으로 간주된다. 그 자체로, 서브-분리물 PTA-10208은 또한 스키조키트리움종 ATCC PTA-10208로서 지정된다.
실시예 2
ATCC 수탁번호 PTA-10212로 기탁된 분리된 미생물의 성장 특성
ATCC 수탁번호 PTA-10212로 기탁된 분리된 미생물을 이하 기술된 바와 같이 개별적인 발효 작동으로 성장 특성에 대해 시험했다. 전형적인 매질 및 배양 조건은 표 1에 제시한다.
pH 7.3에서 20% 용해된 산소와 함께 22.5℃에서 1000ppm Cl-를 갖는 탄소(글리세롤) 및 질소 공급 배양물에서, PTA-10212는 10L 발효조 용적에서 138시간 배양 후 건조 세포 중량 26.2g/L를 생성했다. 지질 수율은 7.9g/L였고; 오메가-3 수율은 5.3g/L였고; EPA 수율은 3.3g/L였고; DHA 수율은 1.8g/L였다. 지방산 함량은 30.3중량%였고; EPA 함량은 지방산 메틸 에스테르(FAME)의 41.4%였고; DHA 함량은 FAME의 26.2%였다. 0.57g/L/일 EPA 생산성 및 0.31g/L/일 DHA 생산성과 함께, 이러한 조건하에 지질 생산성은 1.38g/L/일이었고, 오메가-3 생산성은 0.92g/L/일이었다.
pH 7.3에서 20% 용해된 산소와 함께 22.5℃에서 1000ppm Cl-를 갖는 탄소(글리세롤) 및 질소 공급 배양물에서, PTA-10212는 10L 발효조 용적에서 189시간 배양 후 건조 세포 중량 38.4g/L를 생성했다. 지질 수율은 18g/L였고; 오메가-3 수율은 12g/L였고; EPA 수율은 5g/L였고; DHA 수율은 6.8g/L였다. 지방산 함량은 45중량%였고; EPA 함량은 FAME의 27.8%였고; DHA 함량은 FAME의 37.9%였다. 0.63g/L/일 EPA 생산성 및 0.86g/L/일 DHA 생산성과 함께, 이러한 조건하에 지질 생산성은 2.3g/L/일이었고, 오메가-3 생산성은 1.5g/L/일이었다.
pH 6.8-7.7에서 20% 용해된 산소와 함께 22.5℃에서 1000ppm Cl-를 갖는 탄소(글리세롤) 및 질소 공급 배양물에서, PTA-10212는 10L 발효조 용적에서 189시간 배양 후 건조 세포 중량 13g/L를 생성했다. 지질 수율은 5.6g/L였고; 오메가-3 수율은 3.5g/L였고; EPA 수율은 1.55g/L였고; DHA 수율은 1.9g/L였다. 지방산 함량은 38중량%였고; EPA 함량은 FAME의 29.5%였고; DHA 함량은 FAME의 36%였다. 0.20g/L/일 EPA 생산성 및 0.24g/L/일 DHA 생산성과 함께, 이러한 조건하에 지질 생산성은 0.67g/L/일이었고, 오메가-3 생산성은 0.4g/L/일이었다.
pH 6.6-7.2에서 20% 용해된 산소와 함께 22.5-28.5℃에서 1000ppm Cl-를 갖는 탄소(글리세롤) 및 질소 공급 배양물에서, PTA-10212는 10L 발효조 용적에서 191시간 배양 후 건조 세포 중량 36.7g/L-48.7g/L를 생성했다. 지질 수율은 15.2g/L-25.3g/L였고; 오메가-3 수율은 9.3g/L-13.8g/L였고; EPA 수율은 2.5g/L-3.3g/L였고; DHA 수율은 5.8g/L-11g/L였다. 지방산 함량은 42.4-53중량%였고; EPA 함량은 FAME의 9.8%-22%였고; DHA 함량은 FAME의 38.1%-43.6%였다. 0.31g/L/일-0.41g/L/일 EPA 생산성 및 0.72g/L/일-1.4g/L/일 DHA 생산성과 함께, 이러한 조건하에 지질 생산성은 1.9g/L/일-3.2g/L/일이었고, 오메가-3 생산성은 1.2g/L/일-1.7g/L/일이었다.
ATCC 수탁번호 PTA-10208로 기탁된 분리된 미생물의 성장 특성
ATCC 수탁번호 PTA-10208로 기탁된 분리된 미생물을 이하 기술된 바와 같이 개별적인 발효 작동으로 성장 특성에 대해 시험했다. 전형적인 매질 및 배양 조건은 표 2에 제시한다.
질소 공급 동안 20% 용해된 산소 및 이후 10% 용해된 산소와 함께 pH 7.0에서 22.5℃에서 1000ppm Cl-를 갖는 탄소(글루코스) 및 질소 공급 배양물에서, PTA-10208은 10L 발효조 용적에서 200시간 배양 후 건조 세포 중량 95g/L를 생성했다. 지질 수율은 53.7g/L였고; 오메가-3 수율은 37g/L였고; EPA 수율은 14.3g/L였고; DHA 수율은 21g/L였다. 지방산 함량은 57중량%였고; EPA 함량은 FAME의 27.7%였고; DHA 함량은 FAME의 39.1%였다. 1.7g/L/일 EPA 생산성 및 2.5g/L/일 DHA 생산성과 함께, 이러한 조건하에 지질 생산성은 6.4g/L/일이었고, 오메가-3 생산성은 4.4g/L/일이었다.
질소 공급 동안 20% 용해된 산소 및 이후 10% 용해된 산소와 함께 pH 7.5에서 22.5℃에서 1000ppm Cl-를 갖는 탄소(글루코스) 및 질소 공급 배양물에서, PTA-10208은 10L 발효조 용적에서 139시간 배양 후 건조 세포 중량 56g/L를 생성했다. 지질 수율은 53g/L였고; 오메가-3 수율은 34g/L였고; EPA 수율은 11.5g/L였고; DHA 수율은 22g/L였다. 지방산 함량은 58중량%였고; EPA 함량은 FAME의 21.7%였고; DHA 함량은 FAME의 41.7%였다. 2g/L/일 EPA 생산성 및 3.8g/L/일 DHA 생산성과 함께, 이러한 조건하에 지질 생산성은 9.2g/L/일이었고, 오메가-3 생산성은 5.9g/L/일이었다.
질소 공급 동안 20% 용해된 산소 및 이후 10% 용해된 산소와 함께 pH 7.0에서 22.5℃에서 1000ppm Cl-를 갖는 탄소(글루코스) 및 질소 공급 배양물에서, PTA-10208은 2000L 발효조 용적에서 167시간 배양 후 건조 세포 중량 93.8g/L를 생성했다. 지질 수율은 47.2g/L였고; 오메가-3 수율은 33.1g/L였고; EPA 수율은 10.5g/L였고; DHA 수율은 20.4g/L였다. 지방산 함량은 50.6중량%였고; EPA 함량은 FAME의 23%였고; DHA 함량은 FAME의 42.6%였다. 1.5g/L/일 EPA 생산성 및 2.9g/L/일 DHA 생산성과 함께, 이러한 조건하에 지질 생산성은 6.8g/L/일이었고, 오메가-3 생산성은 4.7g/L/일이었다.
질소 공급 동안 20% 용해된 산소 및 이후 10% 용해된 산소와 함께 pH 7.0에서 22.5℃에서 1000ppm Cl-를 갖는 탄소(글루코스) 및 질소 공급 배양물에서, PTA-10208은 2000L 발효조 용적에서 168시간 배양 후 건조 세포 중량 105g/L를 생성했다. 지질 수율은 46.4g/L였고; 오메가-3 수율은 33g/L였고; EPA 수율은 10.7g/L였고; DHA 수율은 20.3g/L였다. 지방산 함량은 43.9중량%였고; EPA 함량은 FAME의 24%였고; DHA 함량은 FAME의 43.7%였다. 1.5g/L/일 EPA 생산성 및 2.9g/L/일 DHA 생산성과 함께, 이러한 조건하에 지질 생산성은 6.6g/L/일이었고, 오메가-3 생산성은 4.7g/L/일이었다.
질소 공급 동안 20% 용해된 산소 및 이후 10% 용해된 산소와 함께 pH 7.0에서 22.5℃에서 1000ppm Cl-를 갖는 탄소(글루코스) 및 질소 공급 배양물에서, PTA-10208은 2000L 발효조 용적에서 168시간 배양 후 건조 세포 중량 64.8g/L를 생성했다. 지질 수율은 38.7g/L였고; 오메가-3 수율은 29.9g/L였고; EPA 수율은 8.5g/L였고; DHA 수율은 16.7g/L였다. 지방산 함량은 59.6중량%였고; EPA 함량은 FAME의 23%였고; DHA 함량은 FAME의 42.3%였다. 1.2g/L/일 EPA 생산성 및 2.3g/L/일 DHA 생산성과 함께, 이러한 조건하에 지질 생산성은 5.53g/L/일이었고, 오메가-3 생산성은 3.8g/L/일이었다.
실시예 3
미생물 균주 ATCC PTA-10208 및 PTA-10212의 지방산 프로파일
바이오매스의 4개의 시료(PTA-10208 시료 #1; PTA-10208 시료 #2; PTA-10212 시료 #1; 및 PTA-10212 시료 #2)을 용매 추출에 의해 총 미정제 오일 함량에 대해 분석했고, 지질 등급은 고성능 액체 크로마토그래피/증발성 광 산란 검출(HPLC/ELSD)에 의해 측정하였고, 트리아실글리세롤(TAG)은 HPLC/질량 분석법(HPLC/MS)으로 분석했고, 지방산(FA) 프로파일은 불꽃 이온화 검출과 함께 기체 크로마토그래피(GC-FID)로 측정했다. 각 냉동 건조된 바이오매스의 조 지질 함량은 헥산을 사용하는 용매 분쇄를 사용하여 측정하고, 직접 에스테르교환 반응에 의해 생성된 FAME(mg/g)의 합계와 비교하고, 생성되는 지방산 메틸 에스테르(FAME)는 GC/FID 분석으로 정량화했다. 추출된 조 지질 중의 지방산은 또한 에스테르교환 반응으로 정량화하고, 생성되는 FAME의 GC/FID 분석을 사용하여 정량화했다. 모든 중성 지질(NL) 및 유리 지방산(FFA)의 중량%는 ELSD 및 대기압 화학적 이온화-MS(APCI-MS) 동정과 함께 정상 상 HPLC를 사용하여 추출된 조 지질 중에서 측정했다. 방법은 스테롤 에스테르(SE), TAG, 유리 지방산(FFA), 1,3-디아실글리세롤(1,3-DAG), 스테롤, 1,2-디아실글리세롤(1,2-DAG) 및 모노아실글리세롤(MAG)을 분리하고 정량화한다. 결과는 이하 표 4 및 5에 제시한다.
TAG 및 인지질(PL)을 바이오매스의 4개의 시료(PTA-10208 시료 #1; PTA-10208 시료 #2; PTA-10212 시료 #1; 및 PTA-10212 시료 #2)로부터 추출된 미정제 오일로부터 분리했다. TAG를 저압 플래쉬 크로마토그래피를 사용하여 분리했고, PL은 고체 상 추출(SPE)을 사용하여 분리했다. 각각 분리된 분획의 동일성은 박층 크로마토그래피(TLC)로 확인했다. 분리된 TAG 및 PL 분획이 지방산 프로파일은 FAME로서 GC-FID를 사용하여 후속되는 직접 에스테르교환 반응을 측정했다. 결과는 이하 표 6 및 7에 제시된다.
분리된 지질 등급의 총 미정제 오일 함량 및 지방산 프로파일은 또한 미생물 균주 ATCC PTA-10212(PTA-10212 시료 #3 및 PTA-10212 시료 #4)로부터의 바이오매스의 두 추가 시료에 대해 측정했다. 미정제 오일은 헥산 추출에 의해 각각의 시료로부터 수득했고, 개별적 지질 등급을 저압 플래쉬 크로마토그래피로 분리했다. 바이오매스, 미정제 오일 및 분리된 분획의 지방산 프로파일은 FAME로서 GC-FID를 사용하여 측정했다. 결과는 이하 표 8 내지 11에 제시한다.
개별적인 지질 등급은 사전에 FRIOLEX® 방법을 사용하여 추출된 미생물 균주 ATCC PTA-10212로부터의 미정제 오일의 시료(PTA-10212 시료 #5)로부터 분리하고, 각각의 등급의 지방산 프로파일은 FAME로서 GC-FID를 사용하여 측정했다. 결과는 이하 표 12 및 13에 제시한다.
개별적인 지질 등급은 ELSD 및 APCI-MS 동정과 함께 통상의 HPLC를 사용하여 미생물 균주 ATCC PTA-10208로부터의 미정제 오일의 시료(PTA-10208 시료 #3)로부터 분리했다.
실험 절차
미정제 오일 추출 - 미정제 오일을 동결 건조된 바이오매스의 시료로부터 용매 분쇄를 사용하여 추출했다. 예를 들면, 약 3g의 바이오매스을 스웨덴 튜브 속에서 칭량했다. 3개의 볼 베어링 및 30mL의 헥산을 스웨덴 튜브에 첨가하고, 이를 네오프렌 마개로 밀폐시키고, 진탕기에 2시간 동안 위치시켰다. 생성되는 슬러리를 부흐너 깔때기 및 와트만 필터지를 사용하여 여과시켰다. 여과된 액체를 수집하고, 용매를 진공하에 제거하고, 잔류하는 조 지질의 양을 중량 측정으로 측정했다.
지방산 분석 - 바이오매스의 시료, 추출된 조 지질 및 분리된 지질 등급을 FAME로서 지방산 조성물에 대해 분석했다. 간단하게, 동결 건조된 바이오매스 및 분리된 지질 등급을 스크류 캡 시험 튜브 속에서 직접 칭량하고, 미정제 오일 시료을 헥산에 용해시켜 약 2mg/mL의 농도를 수득했다. 내부 표준을 포함하는 톨루엔, 및 메탄올 중의 1.5N HCl을 각 튜브에 첨가했다. 튜브를 와동시킨 다음, 뚜껑을 덮고, 2시간 동안 100℃로 가열했다. 튜브를 냉각시키고, 물 중의 포화된 NaCl을 첨가했다. 튜브를 다시 와동시키고, 원심분리시켜 층이 분리되도록 했다. 이어서, 유기 층 부분을 GC 바이알에 위치시키고, GC-FID에 의해 분석했다. FAME는 Nu-Check-Prep GLC 참조 표준(NuCheck, Elysian, MN)을 사용하여 생성된 3점 교정 곡선을 사용하여 정량화했다. 추출물에 존재하는 지방산은 mg/g 및 중량%로서 나타냈다. 시료 중의 지방 함량을 추산하여 GC-FID로 분석될 경우 내부 표준에 대한 동일 반응을 가정했다.
Figure pat00004
고체 상 추출 - PL 분획을 Vac 용출 장치(Varian Inc, Palo Alto, USA)에 위치된 2g 아미노프로필 카트리지(Biotage, Uppsala, Sweden)를 사용하여 고체 상 추출(SPE)에 의해 조 지질로부터 분리했다. 카트리지는 15mL의 헥산으로 컨디셔닝하고, 약 60mg의 각 시료을 1mL의 CHCl3에 용해시키고, 카트리지에 적용했다. 컬럼을 15mL의 2:1 CHCl3:이소프로필 알콜로 세척하여 중성 지질 모두를 용출시키고, 이를 처리한다. 이어서, 지방산을 에테르 중의 2% 아세트산(HOAc) 15mL로 용출시키고, 이를 처리한다. PL 부분은 15mL의 6:1 메탄올:클로로포름으로 용출시키고, 이를 수집하고, 질소하에 건조시키고, 칭량했다.
플래쉬 크로마토그래피 - 플래쉬 크로마토그래피를 사용하여 미정제 오일 중에 존재하는 지질 등급을 분류했다. 헥산에 용해된 약 200mg의 미정제 오일을 컬럼의 정상에 주입했다. 크로마토그래피 시스템은 5mL/분(표 6 및 7) 또는 3mL/분(표 8 내지 13)에서 석유 에테르 및 에틸 아세테이트로 구성된 이동 상과 함께 실리카 겔 60(EMD Chemical, Gibbstown, NJ)을 사용했다. 단계 구배를 사용하여 컬럼으로부터 각 지질 등급을 선택적으로 용출시켰다. 이동 상 구배는 100% 석유 에테르로 출발하고 50% 에틸 아세테이트로 완성했다. 분획을 10mL 시험 튜브에서 길슨(Gilson) FC 204 넓은 상 분획 수집기(Gilson, Inc., Middleton, WI)를 사용하여 수집했다. 각 튜브를 박층 크로마토그래피(TLC)로 분석하고, 개별적인 지질 등급(기대되는 체류 인자(Rf)와 함께 TLC 플레이트 상에서 단일 반점에 의해 판단된 바와 같이)을 함유하는 튜브를 풀링하고, 농축 건조시키고 칭량했다. 이어서, 총 분획 함량을 중량 측정으로 측정했다.
TLC 분석 - 박층 크로마토그래피를 실리카 겔 플레이트 상에서 수행했다. 플레이트를 석유 에테르:에틸 에테르:아세트산(80:20:1)으로 이루어진 용매 시스템을 사용하여 용출시키고, 요오드 증기를 사용하여 가시화했다. 이어서, 각 반점의 Rf 값을 각 지질 등급에 대한 기록된 문헌 값과 비교했다.
TAG 및 PL 분획의 분석 - 분리된 TAG 및 PL 분획을 지방산 메틸 에스테르(FAME)로서 지방산 조성에 대해 분석했다. TAG 분획을 헥산에 용해시켜 약 1-2mg/mL의 농도를 수득했다. 용액의 1mL 분액을 질소하에 농축 건조시켰다. 내부 표준을 함유하는 톨루엔, 및 메탄올 중의 1.5N HC1을 각 튜브에 첨가했다. 튜브를 와동시킨 다음, 뚜껑을 덮고, 2시간 동안 100℃로 가열했다. 내부 표준 및 HCl 메탄올을 PL 분획을 함유하는 튜브에 직접 첨가하고, 가열했다. 튜브를 냉각시키고, 물 중의 포화된 NaCl을 첨가했다. 튜브를 다시 와동시키고, 원심분리시켜 층이 분리되도록 했다. 이어서, 유기 층 부분을 GC 바이알에 위치시키고, GC-FID에 의해 분석했다. FAME는 Nu-Check-Prep GLC 502B 참조 표준(NuCheck, Elysian, MN)을 사용하여 생성된 3점 교정 곡선을 사용하여 정량화했다. 추출물에 존재하는 지방산은 mg/g 및 FAME의 %로서 나타냈다.
결과
PTA-10208 시료 #1
PTA-10208 시료 #1에 대한 바이오매스 및 추출된 조 지질의 지방산 프로파일은 GC/FID를 사용하여 측정했다. 바이오매스 중의 지방산은 FAME 튜브 속에서 직접 28.6mg의 바이오매스을 칭량함으로써 동일 반응계에서 에스테르교환반응되고, 추출된 조 지질의 시료은 55.0mg의 조 지질을 50mL 용량 플라스크에서 칭량하여 1ml를 별도의 FAME 튜브로 옮겨 제조했다. 바이오매스의 추산된 조 지질 함량은 FID 검출과 함께 GC를 사용하여 53.2%(FAME의 합계로써)인 것으로 측정된 반면, 52.0%(wt/wt) 지질을 건조 바이오매스으로부터 추출하여 총 지질의 97.8% 회수를 수득했다. 조 지질은 GC/FID를 사용하여 91.9% 지방산(FAME의 합계)인 것으로 측정되었다. 조 지질에 함유된 주요 지방산은 C16:0(182.5mg/g), C20:5 n-3(186.8mg/g), 및 C22:6 n-3(423.1mg/g)이었다.
추출된 조 지질의 지질 등급 프로파일은 50mL 용적 플라스크 속에서 55.0mg의 조 지질을 칭량하고, 분액을 HPLC/ELSD/MS 분석을 위해 HPLC 바이알에 옮겨 측정했다. HPLC/ELSD/MS 분석에 따라서, 조 지질은 0.2% 스테롤 에스테르(SE), 95.1% TAG, 0.4% 스테롤 및 0.5% 1,2-디아실글리세롤(DAG)을 함유한다. TAG 분획의 5%가 TAG 피크 후 직접 용출된 피크를 포함하지만, 인지가능한 질량 스펙트럼을 제공하지 않았다.
플래쉬 크로마토그래피로 측정된 바와 같이 이 시료로부터 분리된 TAG는 미정제 오일의 약 92.4%를 구성한다. PL은 SPE 분리 후 중량 또는 TLC로 검출되지 않았다. TAG에 함유된 주요 지방산(>50mg/g)은 C16:0(189mg/g), C20:5 n-3(197mg/g), 및 C22:6 n-3(441mg/g)이었다.
PTA-10208 시료 #2
PTA-10208 시료 #2에 대한 바이오매스 및 추출된 조 지질의 지방산 프로파일은 GC/FID를 사용하여 측정했다. 바이오매스 중의 지방산은 FAME 튜브 속에서 직접 32.0mg의 바이오매스을 칭량함으로써 동일 반응계에서 에스테르교환반응되고, 추출된 조 지질의 시료은 60.1mg의 조 지질을 50mL 용량 플라스크에서 칭량하여 1ml를 별도의 FAME 튜브로 옮겨 제조했다. 바이오매스의 추산된 조 지질 함량은 FID 검출과 함께 GC를 사용하여 52.4%(FAME의 합계)인 것으로 측정된 반면, 48.0%(wt/wt) 지질을 건조 바이오매스으로부터 추출하여 총 지질의 91.7% 회수를 수득했다. 조 지질은 GC/FID를 사용하여 95.3% 지방산(FAME의 합계)인 것으로 측정되었다. 조 지질에 함유된 주요 지방산은 C16:0(217.5mg/g), C20:5 n-3(169.3mg/g), 및 C22:6 n-3(444.1mg/g)이었다.
추출된 조 지질의 지질 등급 프로파일은 50mL 용적 플라스크 속에서 60.1mg의 조 지질을 칭량하고, 분액을 HPLC/ELSD/MS 분석을 위해 HPLC 바이알에 옮겨 측정했다. HPLC/ELSD/MS 분석에 따라서, 조 지질은 0.2% SE, 95.7% TAG, 0.3% 스테롤 및 0.7% 1,2-DAG을 함유한다. TAG 분획의 5.1%가 TAG 피크 후 직접 용출된 피크를 포함하지만, 인지가능한 질량 스펙트럼을 제공하지 않았다.
이 시료로부터 분리된 TAG는 미정제 오일의 약 93.9%를 구성한다. PL은 SPE 분리 후 중량 또는 TLC로 검출되지 않았다. TAG에 함유된 주요 지방산(>50mg/g)은 C16:0(218mg/g), C20:5 n-3(167mg/g) 및 C22:6 n-3(430mg/g)이었다.
PTA-10208 시료 #3
ATCC 수탁번호 PTA-10208로 기탁된 미생물로부터의 미정제 오일의 시료(시료 PTA-10208 #3)을 HPLC/ELSD/MS를 사용하여 분석했다. 총 98.38%의 지질이 회수되었고, 스테롤 에스테르(SE) 분획은 0.32%를 차지하고, TAG 분획은 96.13%를 차지하고, 1,3-디아실글리세롤(DAG) 분획은 0.22%를 차지하고, 1,2-DAG 분획은 0.78%를 차지하고, 스테롤 분획은 0.93%를 차지한다.
PTA-10212 시료 #1
PTA-10212 시료 #1에 대한 바이오매스 및 추출된 조 지질의 지방산 프로파일은 GC/FID를 사용하여 측정했다. 바이오매스 중의 지방산은 FAME 튜브 속에서 직접 27.0mg의 바이오매스을 칭량함으로써 동일 반응계에서 에스테르교환반응되고, 추출된 조 지질의 시료은 52.5mg의 조 지질을 50mL 용량 플라스크에서 칭량하여 1ml를 별도의 FAME 튜브로 옮겨 제조했다. 바이오매스의 추산된 조 지질 함량은 FID 검출과 함께 GC를 사용하여 38.3%(FAME의 합계)인 것으로 측정된 반면, 36.3%(wt/wt) 지질을 건조 바이오매스으로부터 추출하여 총 지질의 94.6% 회수를 수득했다. 조 지질은 GC/FID를 사용하여 83.2% 지방산(FAME의 합계)인 것으로 측정되었다. 조 지질에 함유된 주요 지방산은 C16:0(328.5mg/g), C20:5 n-3(90.08mg/g) 및 C22:6 n-3(289.3mg/g)이었다.
추출된 조 지질의 지질 등급 프로파일은 50mL 용적 플라스크 속에서 52.5mg의 조 지질을 칭량하고, 분액을 HPLC/ELSD/MS 분석을 위해 HPLC 바이알에 옮겨 측정했다. HPLC/ELSD/MS 분석에 따라서, 조 지질은 0.2% SE, 64.2% TAG, 1.9% FFA, 2.8% 1,3-DAG, 1.4% 스테롤 및 18.8% 1,2-DAG 및 0.5% MAG를 함유한다. TAG 분획의 3.4%가 TAG 피크 후 직접 용출된 피크를 포함하지만, 인지가능한 질량 스펙트럼을 제공하지 않았다.
이 시료로부터 분리된 TAG는 미정제 오일의 약 49.8%를 구성한다. 분리된 PL은 미정제 오일의 약 8.1%를 구성한다. TAG에 함유된 주요 지방산(>50mg/g)은 C16:0(400mg/g), C20:5 n-3(91mg/g) 및 C22:6 n-3(273mg/g)이었다. PL에 함유된 주요 지방산(>50mg/g)은 C16:0(98mg/g), C20:5 n-3(33mg/g) 및 C22:6 n-3(227mg/g)이었다.
PTA-10212 시료 #2
PTA-10212 시료 #2에 대한 바이오매스 및 추출된 조 지질의 지방산 프로파일은 GC/FID를 사용하여 측정했다. 바이오매스 중의 지방산은 FAME 튜브 속에서 직접 29.5mg의 바이오매스을 칭량함으로써 동일 반응계에서 에스테르교환반응되고, 추출된 조 지질의 시료은 56.5mg의 조 지질을 50mL 용량 플라스크에서 칭량하여 1ml를 별도의 FAME 튜브로 옮겨 제조했다. 바이오매스의 추산된 조 지질 함량은 FID 검출과 함께 GC를 사용하여 40.0%(FAME의 합계)인 것으로 측정된 반면, 41.3%(wt/wt) 지질을 건조 바이오매스으로부터 추출하여 총 지질의 106.1% 회수를 수득했다. 조 지질은 GC/FID를 사용하여 82.8% 지방산(FAME의 합계)인 것으로 측정되었다. 조 지질에 함유된 주요 지방산은 C16:0(327.3mg/g), C20:5 n-3(92.5mg/g) 및 C22:6 n-3(277.6mg/g)이었다.
추출된 조 지질의 지질 등급 프로파일은 50mL 용적 플라스크 속에서 56.5mg의 조 지질을 칭량하고, 분액을 HPLC/ELSD/MS 분석을 위해 HPLC 바이알에 옮겨 측정했다. HPLC/ELSD/MS 분석에 따라서, 조 지질은 0.2% SE, 58.2% TAG, 2.3% FFA, 3.4% 1,3-DAG, 1.7% 스테롤, 23.4% 1,2-DAG 및 0.6% MAG를 함유한다. TAG 분획의 3.3%가 TAG 피크 후 직접 용출된 피크를 포함하지만, 인지가능한 질량 스펙트럼을 제공하지 않았다.
이 시료로부터 분리된 TAG는 미정제 오일의 약 51.9%를 구성한다. 분리된 PL은 미정제 오일의 약 8.8%를 구성한다. TAG에 함유된 주요 지방산(>50mg/g)은 C16:0(402mg/g), C20:5 n-3(92mg/g) 및 C22:6 n-3(245mg/g)이었다. PL에 함유된 주요 지방산(>50mg/g)은 C16:0(121mg/g), C20:5 n-3(48mg/g) 및 C22:6 n-3(246mg/g)이었다.
[표 4] PTA-10208 및 PTA-10212 바이오매스 및 추출된 조 지질의 지방산 프로파일(mg/g)
Figure pat00005
[표 5] PTA-10208 및 PTA-10212 바이오매스 및 추출된 조 지질의 지방산 프로파일(%)
Figure pat00006
[표 6] PTA-10208 및 PTA-10212 분리된 TAG의 지방산 프로파일
Figure pat00007
[표 7] PTA-10212 분리된 PL의 지방산 프로파일
Figure pat00008
PTA-10212 시료 #3
PTA-10212 시료 #3에 대한 바이오매스의 지질 함량은 FAME의 합계로서 34%인 것으로 평가되었고, 용매 추출후 수득된 미정제 오일의 양은 37중량%로서, 바이오매스에 존재하는 지방의 109% 회수를 제공했다. 플래쉬 크로마토그래피를 사용한 분획화 후, 미정제 오일의 대략 46%는 TAG로서 분리되었고, 28%는 DAG로서 분리되었다. 미정제 오일은 309mg/g DHA 및 264mg/g EPA를 함유했다. 분리된 TAG는 341mg/g DHA 및 274mg/g EPA를 함유했다. 분리된 DAG 분획은 262mg/g DHA 및 237mg/g EPA를 함유했다. 바이오매스, 추출된 미정제 오일 및 분리된 분획의 총 지방산 프로파일은 각각 mg/g 및 % FAME로서 계산된 하기 표 8 및 9에 제시되어 있다.
[표 8] PTA-10212 시료 #3 바이오매스 및 추출된 조 지질의 지방산 프로파일(mg/g)
Figure pat00009
[표 9] PTA-10212 시료 #3 바이오매스 및 추출된 조 지질의 지방산 프로파일(%)
Figure pat00010
PTA-10212 시료 #4
PTA-10212 시료 #4는 FAME의 합계로서 측정된 대략 23% 지질을 함유했고, 이중 107%는 헥산 추출을 사용하여 회수했다. 플래쉬 크로마토그래피를 사용한 분획화 후, 미정제 오일의 대략 42%는 TAG로서 분리되었고, 18%는 DAG로서 분리되었다. 미정제 오일은 275mg/g DHA 및 209mg/g EPA를 함유했다. 분리된 TAG는 296mg/g DHA 및 205mg/g EPA를 함유했다. 분리된 DAG 분획은 245mg/g DHA 및 219mg/g EPA를 함유했다. 바이오매스, 추출된 미정제 오일 및 분리된 분획의 총 지방산 프로파일은 하기 표 10(mg/g) 및 표 11(% FAME)에 제시되어 있다.
[표 10] PTA-10212 시료 #4 바이오매스 및 추출된 조 지질의 지방산 프로파일(mg/g)
Figure pat00011
[표 11] PTA-10212 시료 #4 바이오매스 및 추출된 조 지질의 지방산 프로파일(%)
Figure pat00012
PTA-10212 시료 #5
미정제 오일의 시료은 FRIOLEX® 공정(GEA Westfalia Separator UK Ltd., Milton Keynes, England)을 사용하여 PTA-10212의 바이오매스으로부터 추출하여 미생물 오일 PTA-10212 시료 #5를 수득했다. 개개 지질 등급은 저압 플래쉬 크로마토그래피를 사용하여 PTA-10212 시료 #5로부터 분리했고, 각 등급의 중량%를 측정했다. 각 등급의 지방산 프로파일은 GC-FID를 사용하여 측정했다.
요약하면, 시료은 600μL의 헥산에 240mg의 미정제 오일을 용해시고 컬럼의 헤드에 적용하여 제조했다. 플래쉬 크로마토그래피를 사용한 분획화 후, 모든 분획의 합한 중량은 240mg으로서 100% 회수를 제공했다. 스테롤 에스테르 분획은 0.9%를 차지하고, TAG 분획은 42.6%를 차지하고, 유리 지방산(FFA)는 1.3%를 차지하고, 스테롤 분획은 2.2%를 차지하고, DAG 분획은 41.6%를 차지했다. FRIOLEX® 미정제 오일 및 분리된 분획의 총 지방산 프로파일은 각각 mg/g 및 % FAME로서 계산된 하기 표 12 및 13에 제시되어 있다.
[표 12] PTA-10212 시료 #5 미정제 오일의 지방산 프로파일(mg/g)
Figure pat00013
[표 13] PTA-10212 시료 #5 미정제 오일의 지방산 프로파일(%)
Figure pat00014
실시예 4
추출된 조 지질에 존재하는 각 TAG 이성체의 상대량 및 지방산 조성은 비수성 역상 HPLC 분리 및 APCI-MS 검출을 사용하여 실시예 3의 시료 PTA-10208 시료 #1, PTA-10208 시료 #2, PTA-10212 시료 #1, PTA-10212 시료 #2, PTA-10212 시료 #3, PTA-10212 시료 #4 및 PTA-10212 시료 #5의 각각에 대해 측정했다.
Figure pat00015
PTA-10208 시료 #1
PTA-10208 시료 #1로부터 분리된 조 지질은 5.5mg의 오일을 HPLC 바이알로 칭량하고 1mL 헥산으로 희석하여 TAG 분석용으로 제조했다.
[표 14] PTA-10208 시료 #1에서 TAG 종의 확인
Figure pat00016
PTA-10208 시료 #2
PTA-10208 시료 #2로부터 분리된 조 지질은 5.3mg의 오일을 HPLC 바이알로 칭량하고 1mL 헥산으로 희석하여 TAG 분석용으로 제조했다.
[표 15] PTA-10208 시료 #2에서 TAG 종의 확인
Figure pat00017
PTA-10212 시료 #1
PTA-10212 시료 #1로부터 분리된 조 지질은 5.3mg의 오일을 HPLC 바이알로 칭량하고 1mL 헥산으로 희석하여 TAG 분석용으로 제조했다.
[표 16] PTA-10212 시료 #1에서 TAG 종의 확인
Figure pat00018
PTA-10212 시료 #2
PTA-10212 시료 #2로부터 분리된 조 지질은 3.6mg의 오일을 HPLC 바이알로 칭량하고 1mL 헥산으로 희석하여 TAG 분석용으로 제조했다.
[표 17] PTA-10212 시료 #2에서 TAG 종의 확인
Figure pat00019
PTA-10212 시료 #3
PTA-10212 시료 #3의 TAG 분획의 시료은 헥산에서 제조하고, HPLC/APCI/MS로 분석하여 개개 TAG 이성체의 확인을 측정했다.
[표 18] PTA-10212 시료 #3에서 TAG 종의 확인
Figure pat00020
PTA-10212 시료 #4
PTA-10212 시료 #4의 TAG 분획의 시료은 헥산에서 제조하고, HPLC/APCI/MS로 분석하여 개개 TAG 이성체의 확인을 측정했다.
[표 19] PTA-10212 시료 #4에서 TAG 종의 확인
Figure pat00021
PTA-10212 시료 #5
PTA-10212 시료 #5의 TAG 분획의 시료은 헥산에서 제조하고, HPLC/APCI/MS로 분석하여 개개 TAG 이성체의 확인을 측정했다.
[표 20] PTA-10212 시료 #5에서 TAG 종의 확인
Figure pat00022
실시예 5
미정제 오일은 정제, 표백 및 탈취에 의해 추가로 처리하여 정제 오일을 수득했다. 정제된 오일을 고도 올레산 해바라기 오일로 희석하여 DHA 함량이 대략 400mg/g인 최종 오일을 수득했다. 개개 지질 등급을 분리하고, 각 등급의 지방산 프로파일은 FAME로서 GC-FID를 사용하여 측정했다.
PTA-10208 최종 오일
PTA-10208 최종 오일 #1-5에 대한 지방산 프로파일은, 분리된 TAG 분획(표 23-24) 분리된 스테롤/DAG 분획(표 24-26)과 관련된 프로파일을 포함하여, 표 21-22에 요약되어 있다.
[표 21] PTA-10208 최종 오일의 지방산 프로파일(mg/g)
Figure pat00023
[표 22] PTA-10208 최종 오일의 지방산 프로파일(%)
Figure pat00024
[표 23] 분리된 TAG 지방산 프로파일: PTA-10208 최종 오일(mg/g)
Figure pat00025
[표 24] 분리된 TAG 지방산 프로파일: PTA-10208 최종 오일(%)
Figure pat00026
[표 25] 분리된 스테롤/DAG 지방산 프로파일: PTA-10208 최종 오일(mg/g)
Figure pat00027
[표 26] 분리된 스테롤/DAG 지방산 프로파일: PTA-10208 최종 오일(%)
Figure pat00028
[표 27] 플래쉬 크로마토그래피에 의한 지질 등급 분리(중량%)
Figure pat00029
[표 28] HPLC-ELSD에 의한 지질 등급 분리(중량%)
Figure pat00030
PTA-10212 최종 오일
DHA는 PTA-10212 최종 오일에 41.63% 및 366.9mg/g으로 존재하고, EPA는 16.52%로 존재한다. 개개 지방산 프로파일이 측정되었고, 표 29에 요약되어 있다.
[표 29] PTA-10212 최종 오일의 지방산 프로파일(% FAME)
Figure pat00031
실시예 6
실시예 5에 기재된 PTA-10208 최종 오일의 트리아실글리세라이드(TAG)의 분석은 실시예 4에 기재된 기술을 사용하여 수행했다. 각각의 지방산 잔기의 확인을 하기 표 30에 요약된 바와 같이 수행했다.
[표 30] PTA-10208 최종 오일에서 TAG 종의 확인
Figure pat00032
실시예 7
ATCC 수탁번호 PTA-10208 및 10212로 기탁된 분리된 미생물의 2일된 접종 플라스크를 표 1 및 2에 따르는 배지에서 탄소 및 질소-공급 배양물로서 제조하였다.
돌연변이유발은 다음 공정에 따라 수행하였다:
대략 50ml의 멸균 T=2일된 플라스크를 멸균 40ml 유리 균질화기에 부었다. 배양물에 균질화기 속에서 50 플런지(plunge)를 제공하였다. 배양물을 피펫팅하고 멸균 50 마이크론 메쉬 여과기(mesh filter)를 통해 여과하고, 이를 50ml 멸균 튜브 속에 두었다(메쉬는 50 마이크론 메쉬를 통해 보다 작은 집단 및 단일 세포가 통과하도록 하면서 보다 큰 콜로니 집단을 잔류시키는 수단으로서 사용하였다). 전체의 농축 침연(macerate)을 멸균 50ml 튜브 속에 수집하였다. 침연된 배양물을 와동시키고 1:100배 이하 수준에서의 희석물을 제조했다. 희석된 침연 시료은 200μl의 접종물을, 4 내지 5개 유리 비드(3mm 유리 비드)를 함유하는, 배지 한천 플레이트, 100 × 15mm에 가하기 전에 와동시켰다. 플레이트 주변 접종물에 비드가 균일하게 확산되도록 하기 위한 노력으로 각각의 플레이트를 온화하게 교반하였다. 비드를 플레이트로부터 버리고, 플레이트를 커버와 함께 대략 5분 동안 두어 건조시켰다. 공정이 어두운 광 속에서 수행하기 때문에 멸균 후드 및 인접한 지역에서의 광을 껐다. 공정을 수행할 수 있도록 이용가능한 광은 최소였으나, 간접 및 어두움만 존재하였다.
5개의 복제 플레이트를 XL 가교결합제[제조원: 스펙트로닉스 코포레이션(Spectronics Corporation), 뉴욕 소재]의 바닥 위에 뚜겅 없이 두고, 시료을 조사(irradiating)하였다. 마이크로주울 및 수준과 관련하여 가교결합제 전달된 힘은 90% 내지 95% 사멸을 달성한 것으로 나타났다. 5개의 복제 대조군 플레이트는 동일한 프로토콜을 사용하여 돌연변이유발되지 않은 세포와 함께 접종하였다. 이들 세포 수를 사용하여 사멸%를 계산하였다. 조사가 완료되면, 플레이트를 제거하고, 뚜껑을 교체하고, 플레이트를 파라핀으로 싼 다음, 알루미늄 호일로 쌌다. 플레이트를 암실 속에서 1주 동안 성장시켜 이들이 손상된 유전자를 복구할 수 없도록 하는 것이 필수적이었다.
플레이트를 22.5℃ 방에 약 10일 동안 둔 다음, 콜로니를 계수하였다. 최종 계수를 수행하는 경우, 개개 콜로니를 멸균 접종 루프로 집어올려 새로운 배지 플레이트 위에 재-스트리킹(re-streaking)하였다. 각각의 콜로니를 개개의 플레이트 위에 두었다. 플레이트가 조밀해지면, 시료은 접종 루프를 사용하여 취하고, 50ml의 배지를 함유하는 멸균 250ml 진탕 플라스크내로 접종하였다. 당해 플라스크를 22.5℃ 방 속에 200rpm에서 진탕기 위에 두었다. T=7일 째에, 진탕 플라스크 배양물을 50ml 멸균 튜브내로 수거하였다. pH를 취하고, 시료을 원심분리하여 바이오매스 펠렛을 수집하였다. 각각의 시료을 세정하고 이소프로필 알콜 및 증류수의 50:50 혼합물에 재현탁시킨 다음, 재원심분리했다. 수집된 펠렛을 동결 건조시키고, 칭량하고, FAME 분석을 수행하였다. 표 31 및 32에서의 데이타는 각각 균주 PTA-10208 및 PTA-10212로부터 상기 과정으로 생산된 돌연변이체를 나타낸다.
[표 31] PTA-10208 돌연변이체
Figure pat00033
[표 32] PTA-10212 돌연변이체
Figure pat00034
Figure pat00035
본원에 기재된 모든 다양한 측면, 양태 및 선택권은 임의의 및 모든 변형태로 조합될 수 있다.
본 명세서에서 언급된 모든 공보, 특허 및 특허출원은, 각각의 개개 공보, 특허 또는 특허출원이 구체적으로 및 개별적으로 참고로서 포함되는 것으로 나타낸 바와 동일한 정도로 본원에 참고로서 포함된다.
아메리칸 타입 컬쳐 컬렉션 PTA10208 20090714 아메리칸 타입 컬쳐 컬렉션 PTA10212 20090714 아메리칸 타입 컬쳐 컬렉션 PTA10213 20090714 아메리칸 타입 컬쳐 컬렉션 PTA10214 20090714 아메리칸 타입 컬쳐 컬렉션 PTA10215 20090714 아메리칸 타입 컬쳐 컬렉션 PTA10209 20090925 아메리칸 타입 컬쳐 컬렉션 PTA10210 20090925 아메리칸 타입 컬쳐 컬렉션 PTA10211 20090925
SEQUENCE LISTING <110> Apt, Kirk E. Behrens, Paul Warren Hansen, Jon Milton Pfeifer III, Joseph W. Stahl, Tracey Lynn Zirkle, Ross <120> Eicosapentaenoic Acid-Producing Microorganisms, Fatty Acid Compositions, and Methods of Making and Uses Thereof <130> 2715.004PC01/JUK/SAS <140> To be assigned <141> 2010-03-22 <150> 61/296,456 <151> 2010-01-19 <160> 2 <170> PatentIn version 3.3 <210> 1 <211> 1705 <212> DNA <213> Thraustochytrium sp. <400> 1 aagatacctg gttgatcctg ccagtagtca tacgctcgtc tcaaagatta agccatgcat 60 gtgtcagtat aaatactttt actttgaaac tgcgaacggc tcattaaatc agtaattatc 120 tacatggtaa cgaaaattat atggataacc gtagtaattc tagggctaat acatgcgtaa 180 aatctgggta actggatgca tttattggat tgaagccaac attaaaaggt gattcacgat 240 aactaagcgg agcgttttag gacgctgaat cattcgagtt tctgccctat cagctgtcga 300 tggtaaggta ttggcttacc atggcgttaa cgggtaacgg agaattaggg ttcgattccg 360 gagagggagc ctgagagacg gctaccacat ccaaggaagg cagcaggcgc gtaaattgcc 420 caatgagaac ttctcgaggc agtgacaaga aatatcaaag tgatgccgtt aggtattgca 480 tttgaaatga gaacgatgta caacttctaa cgatgatcaa ttggagggca agtctggtgc 540 cagcagccgc ggtaattcca gctccaatag cgtatactaa cgttgctgca gttaaaacgc 600 ccgtagttga attagtatca tggtatttta accttattcg atgaatttga gttgaaagct 660 aggatatata ggaagcgatt cctcatttac tgtaaaaaaa ttagagtgtt tcacacagat 720 cgtaagatcg ggatatatta gtatggaata ataagatagg actttggtgc tattttgttg 780 gtttgcacac caaagtaatg attaataggg acagttgggg gtattcgtat ttaattgtca 840 gaggtgaaat tcttggattt atgaaagacg aactactgcg aaagcattta ccaaggatgt 900 tttcattaat caaggacgaa agttagggga tcgaagatga ttagatacca tcgtagtctt 960 aaccataaac tatgccgact gaggattctt gaaatttgta aatgaattta agagcactcc 1020 atgagaaatc aaagtctttg ggttccgggg ggagtatggt cgcaagtctg aaacttaaag 1080 gaattgacgg aagggcacca ccaggagtgg agcctgcggc ttaatttgac tcaacacggg 1140 aaaacttacc aggtccagac atagtgagga ttgacagatt gatagctctt tcttgattct 1200 atgggtggtg gtgcatggcc gttcttagtt ggtggtttga actgtctgct taattgcgtt 1260 aacgaacgag acctcagcct actaaatagt atgttgttta gtaataaatg atatgacttc 1320 ttagagggac atttcgggtt taccggaagg aagtttgagg caataacagg tctgtgatgc 1380 ccttagatgt tctgggccgc acgcgcgcta cactgacgag ctcaacaagt aatatttggt 1440 tgtctggaag gattgcctaa tcttttaaat actcgtcgtg atggggctag attcttgtaa 1500 ttattaatct ccaacgagga attcctagta aacgcaagtc atcagcttgc attgattacg 1560 tccctgccct ttgtacacac cgcccgtcgc acctaccgat tggatggtcc ggtgaaatct 1620 tcggatgttt ttttacaata gtagagagac aaaagttgag taaaccttac catctagagg 1680 aaggtgaagt cgtaacaagg atctt 1705 <210> 2 <211> 1713 <212> DNA <213> Schizochytrium sp. <400> 2 acctggttga tcctgccagc tgtcatttgc tcgtctaaaa gattaagcca tgcatgtcta 60 agtataaaca aattatacgg tgaaactgcg aacggctcat tatatcagtt atagtttctt 120 tgatagtgta tttctatatc tatttggata actgtggcaa ttctagagct aacacatgct 180 ttcgagtggg actttttggt accactgcat ttattagatt ttgaagccaa cgtaaaattg 240 gtgattcatg ataactttgc gaatcgcagt agcgtcttgt acgcggcgat gaatcattca 300 agtttctgcc ccatcagctg tcgatggtac ggtattggcc taccatggct ttcacgggtg 360 acggagaatt agggtttgat tccggagagg acgcttgaga gacggcgacc acatccaagg 420 aaggcagcag gcgcgtaaat tacccaatgg ggactccccg aggtagtgac aagaaataaa 480 aatgaggagc gctttgcgtt tttcaatttg aatgagagaa tcgtacaatc ctcatcgagg 540 atcaattgga gggcaagtct ggtgccagca gccgcggtaa ctccagctcc aatagcaaat 600 attagagttg ttgcagttaa aaagctcgta gttgaatttc cgatagtctt tggccgtgtc 660 cttggtctcg tatcatgggt ttattgtgcc aagatgatcg tcctctatgg ttagtgatag 720 tcatagtcgt ttactgtaaa aaaactggag tgtttaaagc atttctttgg gaaaggtaca 780 tattagtata ggataattag ataggacctg tgattcttat ttggttggtt tgtgagtcat 840 ggtaatgatt aatagggaca atcgggggta ttcgaattta attgtcagag gtgaaattct 900 tggatttaag aaagtcgaac tactgcgaag gcatttacca aggatgtttt cattaataaa 960 gaacgaaagt taggggatcg aagatgatta gataccatcg tagtcttaac tgtaaactat 1020 gccgacttgc gattgtccgt cgttgttttt tcaaaaaaga gacctgggca gcagcacatg 1080 agaaatcaaa gtttttgggt tccgggggga gtatggtcgc aaggctgaaa cttaaaggaa 1140 ttgacggaag ggcaccacca ggagtggagc ctgcggctta attcgactca acacgggaaa 1200 acttaccagg tccagacata gtaaggattg acagattgag agctctttct tgattctatg 1260 ggtggtggtg catggccgtt cttagttggt ggagtgattt gtctggttaa ttccgttaac 1320 gaacgagacc tcagcctact aaatagtggt gcatattgtg agatatgtga caaaaatcgc 1380 ttcttagagg gacatttcgg gtttaccgga aggaagtttg aggcaataac aggtctgtga 1440 tgcccctaga tgttctgggc cgcacgcgcg ctacaatgac agattcaaca agtccggtag 1500 tggagctttt gcttctctat tattactttt ccgagaggaa tggttaatct tctaaatgtc 1560 tgtcgtgatg gggctagatt tttgcaatta ttaatctcca acgaggaatt cctagtaaac 1620 gcaagtcatc agcttgcatt gattacgtcc ctgccctttg tacacaccgc ccgtcgcacc 1680 taccgattga acggtcctat gaaatcttcg gat 1713

Claims (11)

  1. 스키조키트리움(Schizochytrium) 속 또는 트라우스토키트리움(Thraustochytrium) 속의 미생물로부터 분리된 바이오매스로서,
    상기 바이오매스의 건조 세포 중량의 20중량% 이상이 지방산이고, 상기 지방산의 10중량% 초과가 에이코사펜타엔산이고, 상기 지방산이 각각 5중량% 미만의 아라키돈산 및 도코사펜타엔산 n-6을 포함하는, 분리된 바이오매스.
  2. 제1항에 있어서,
    상기 지방산의 25중량% 이상이 도코사헥사엔산인, 분리된 바이오매스.
  3. 스키조키트리움(Schizochytrium) 속 또는 트라우스토키트리움(Thraustochytrium) 속의 미생물로부터 분리된, 트리아실글리세롤을 포함하는 분리된 바이오매스로서,
    상기 트리아실글리세롤의 12중량% 이상이 에이코사펜타엔산인, 분리된 바이오매스.
  4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 지방산이 각각 5중량% 미만의 올레산, 리놀레산, 리놀렌산, 에이코센산 및 에루크산을 포함하는, 분리된 바이오매스.
  5. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항의 분리된 바이오매스를 포함하는, 비-인간 동물 또는 인간용 식품.
  6. 제5항에 있어서,
    상기 식품이 비-인간 동물 또는 인간 음식용 첨가물인, 식품.
  7. 제5항에 있어서,
    상기 식품이 영양 보충물인, 식품.
  8. 제5항에 있어서,
    상기 식품이 동물 사료인, 식품.
  9. 제8항에 있어서,
    상기 동물 사료가 수산 양식 사료인, 식품.
  10. 제8항에 있어서,
    상기 동물 사료가 애완 동물 사료, 동물원 동물 사료, 노동 동물(work animal) 사료, 가축 사료 또는 이들의 배합물인, 식품.
  11. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서,
    염증의 치료에 사용하기 위한, 분리된 바이오매스.
KR1020187025169A 2010-01-19 2010-03-22 에이코사펜타엔산 생산 미생물, 지방산 조성물 및 이의 제조방법 및 용도 KR102447978B1 (ko)

Applications Claiming Priority (4)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US29645610P 2010-01-19 2010-01-19
US61/296,456 2010-01-19
PCT/US2010/028175 WO2011090493A1 (en) 2010-01-19 2010-03-22 Eicosapentaenoic acid-producing microorganisms, fatty acid compositions, and methods of making and uses thereof
KR1020177024272A KR102155409B1 (ko) 2010-01-19 2010-03-22 에이코사펜타엔산 생산 미생물, 지방산 조성물 및 이의 제조방법 및 용도

Related Parent Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
KR1020177024272A Division KR102155409B1 (ko) 2010-01-19 2010-03-22 에이코사펜타엔산 생산 미생물, 지방산 조성물 및 이의 제조방법 및 용도

Publications (2)

Publication Number Publication Date
KR20180100714A true KR20180100714A (ko) 2018-09-11
KR102447978B1 KR102447978B1 (ko) 2022-09-27

Family

ID=44277725

Family Applications (4)

Application Number Title Priority Date Filing Date
KR1020147033815A KR20150013667A (ko) 2010-01-19 2010-03-22 에이코사펜타엔산 생산 미생물, 지방산 조성물 및 이의 제조방법 및 용도
KR1020177024272A KR102155409B1 (ko) 2010-01-19 2010-03-22 에이코사펜타엔산 생산 미생물, 지방산 조성물 및 이의 제조방법 및 용도
KR1020127021791A KR20120133381A (ko) 2010-01-19 2010-03-22 에이코사펜타엔산 생산 미생물, 지방산 조성물 및 이의 제조방법 및 용도
KR1020187025169A KR102447978B1 (ko) 2010-01-19 2010-03-22 에이코사펜타엔산 생산 미생물, 지방산 조성물 및 이의 제조방법 및 용도

Family Applications Before (3)

Application Number Title Priority Date Filing Date
KR1020147033815A KR20150013667A (ko) 2010-01-19 2010-03-22 에이코사펜타엔산 생산 미생물, 지방산 조성물 및 이의 제조방법 및 용도
KR1020177024272A KR102155409B1 (ko) 2010-01-19 2010-03-22 에이코사펜타엔산 생산 미생물, 지방산 조성물 및 이의 제조방법 및 용도
KR1020127021791A KR20120133381A (ko) 2010-01-19 2010-03-22 에이코사펜타엔산 생산 미생물, 지방산 조성물 및 이의 제조방법 및 용도

Country Status (19)

Country Link
US (6) US9924733B2 (ko)
EP (3) EP2526197B1 (ko)
JP (4) JP5920890B2 (ko)
KR (4) KR20150013667A (ko)
CN (2) CN105360351A (ko)
AR (1) AR077916A1 (ko)
AU (1) AU2010343305B2 (ko)
BR (2) BR122015020119B8 (ko)
CA (3) CA2896012C (ko)
CL (2) CL2012002013A1 (ko)
DK (1) DK2526197T3 (ko)
EA (1) EA031136B1 (ko)
HK (1) HK1221873A1 (ko)
MX (1) MX343403B (ko)
MY (1) MY160121A (ko)
NZ (2) NZ626633A (ko)
PH (1) PH12016501930B1 (ko)
TW (2) TWI653336B (ko)
WO (1) WO2011090493A1 (ko)

Families Citing this family (26)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US8207363B2 (en) 2009-03-19 2012-06-26 Martek Biosciences Corporation Thraustochytrids, fatty acid compositions, and methods of making and uses thereof
EP2408797B1 (en) * 2009-03-19 2017-03-15 DSM IP Assets B.V. Polyunsaturated fatty acid synthase nucleic acid molecules and polypeptides, compositions, and methods of making and uses thereof
KR20150013667A (ko) 2010-01-19 2015-02-05 디에스엠 아이피 어셋츠 비.브이. 에이코사펜타엔산 생산 미생물, 지방산 조성물 및 이의 제조방법 및 용도
EP2576801B1 (en) 2010-06-01 2019-10-02 DSM IP Assets B.V. Extraction of lipid from cells and products therefrom
ES2857173T3 (es) * 2011-07-21 2021-09-28 Dsm Ip Assets Bv Aceites microbianos enriquecidos en ácidos grasos poliinsaturados
KR102149068B1 (ko) 2011-07-21 2020-08-31 디에스엠 아이피 어셋츠 비.브이. 지방산 조성물
SG10201605966TA (en) * 2011-07-21 2016-09-29 Dsm Ip Assets Bv Eicosapentaenoic acid-producing microorganisms, fatty acid compositions, and methods of making and uses thereof
EP2826384A1 (de) 2013-07-16 2015-01-21 Evonik Industries AG Verfahren zur Trocknung von Biomasse
SG11201605033UA (en) 2013-12-20 2016-07-28 Dsm Ip Assets Bv Processes for obtaining microbial oil from microbial cells
EP4223861A3 (en) 2013-12-20 2023-11-01 Mara Renewables Corporation Methods of recovering oil from microorganisms
KR102426987B1 (ko) 2013-12-20 2022-07-28 디에스엠 아이피 어셋츠 비.브이. 미생물 세포로부터의 미생물 오일의 수득 방법
TWI698520B (zh) 2013-12-20 2020-07-11 荷蘭商Ｄｓｍ智慧財產有限公司 用於從微生物細胞獲得微生物油之方法（三）
AU2014369040B2 (en) 2013-12-20 2019-12-05 Dsm Ip Assets B.V. Processes for obtaining microbial oil from microbial cells
US11464244B2 (en) 2014-10-02 2022-10-11 Evonik Operations Gmbh Feedstuff of high abrasion resistance and good stability in water, containing PUFAs
US20170295824A1 (en) 2014-10-02 2017-10-19 Evonik Degussa Gmbh Process for producing a pufa-containing biomass which has high cell stability
WO2016050559A1 (de) 2014-10-02 2016-04-07 Evonik Degussa Gmbh VERFAHREN ZUR HERSTELLUNG EINES PUFAs ENTHALTENDEN FUTTERMITTELS DURCH EXTRUSION EINER PUFAs ENTHALTENDEN BIOMASSE
CN106793799B (zh) 2014-10-02 2021-05-14 赢创运营有限公司 用于养殖动物的方法
CN106998742A (zh) * 2014-12-12 2017-08-01 帝斯曼知识产权资产管理有限公司 用于水产养殖饲料中的饲料补充物质
EP3318640A4 (en) * 2015-07-03 2019-03-06 Kuysyu University, National University Corporation MICROORGANISM OIL-PRODUCING LABYRINTHULIDS, MICROORGANISM OIL, PREPARATION METHOD AND USES THEREOF
WO2017055169A1 (en) * 2015-10-01 2017-04-06 Dsm Ip Assets B.V. Supplement material for use in pet food
EP3455351B1 (en) * 2016-05-12 2022-08-24 DSM IP Assets B.V. Method of increasing omega-3 polyunsaturated fatty acids production in microalgae
ES2952868T3 (es) * 2016-12-15 2023-11-06 Nestle Sa Composiciones y métodos que modulan la digestibilidad en un animal de compañía
CN111032878B (zh) * 2017-08-10 2024-03-08 帝斯曼知识产权资产管理有限公司 用于营养油纯化的双重离心过程
US20210401731A1 (en) * 2020-06-24 2021-12-30 Marco Ruggiero Anti-Aging Formula
SE2151489A1 (en) * 2021-12-07 2023-06-08 Mycorena Ab A food product or food ingredient comprising fungi biomass with an increased intracellular fat content
WO2023144707A1 (en) 2022-01-25 2023-08-03 Dsm Ip Assets B.V. Media refinement and nutrient feeding approaches to increase polyunsaturated fatty acid production

Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5130242A (en) * 1988-09-07 1992-07-14 Phycotech, Inc. Process for the heterotrophic production of microbial products with high concentrations of omega-3 highly unsaturated fatty acids
US20040161831A1 (en) * 2002-12-27 2004-08-19 Fuji Photo Film Co., Ltd. Microorganism having an ability of producing docosahexaenoic acid and use thereof
KR20090007407A (ko) * 2006-04-11 2009-01-16 마텍 바이오싸이언스스 코포레이션 장쇄 다중불포화 지방산을 포함하는 식품 제품 및 그의 제조 방법

Family Cites Families (109)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4485173A (en) 1981-01-19 1984-11-27 Cpc International Inc. Preparation of fats and oils
ES2052564T3 (es) 1986-07-08 1994-07-16 Suntory Ltd Procedimiento para la produccion de acido bishomo-gamma-linolenico y acido eicosapanteonico.
ES2061519T3 (es) 1986-12-26 1994-12-16 Sagami Chem Res Procedimiento para la produccion de acido eicosapentaenoico.
US5246841A (en) 1986-12-26 1993-09-21 Sagami Chemical Research Center Microbial process for production of eicosapentaenoic acid
JP2746371B2 (ja) 1987-12-21 1998-05-06 サントリー株式会社 ビスホモ−γ−リノレン酸及びこれを含有する脂質の製造方法
JP2710344B2 (ja) 1988-07-13 1998-02-10 サントリー株式会社 高度不飽和脂肪酸及びこれを含有する脂質の製造方法
US5340594A (en) 1988-09-07 1994-08-23 Omegatech Inc. Food product having high concentrations of omega-3 highly unsaturated fatty acids
US6451567B1 (en) * 1988-09-07 2002-09-17 Omegatech, Inc. Fermentation process for producing long chain omega-3 fatty acids with euryhaline microorganisms
US5698244A (en) 1988-09-07 1997-12-16 Omegatech Inc. Method for raising animals having high concentrations of omega-3 highly unsaturated fatty acids
US5340742A (en) * 1988-09-07 1994-08-23 Omegatech Inc. Process for growing thraustochytrium and schizochytrium using non-chloride salts to produce a microfloral biomass having omega-3-highly unsaturated fatty acids
US5244921A (en) 1990-03-21 1993-09-14 Martek Corporation Eicosapentaenoic acids and methods for their production
EP1092352A3 (en) * 1991-01-24 2003-08-27 Martek Corporation Microbial oil mixtures and uses thereof
JPH078215A (ja) 1993-04-30 1995-01-13 Kawasaki Steel Corp ドコサヘキサエン酸含有海洋性微細藻類食品素材およびその製造方法
US6582941B1 (en) * 1995-04-17 2003-06-24 Japan As Represented By Director-General Of Agency Of Industrial Science And Technology Microorganisms capable of producing highly unsaturated fatty acids and process for producing highly unsaturated fatty acids by using the microorganisms
GB9514649D0 (en) 1995-07-18 1995-09-13 Zeneca Ltd Extraction of triglycerides from microorganisms
US6255505B1 (en) 1996-03-28 2001-07-03 Gist-Brocades, B.V. Microbial polyunsaturated fatty acid containing oil from pasteurised biomass
CN1217029A (zh) 1996-03-28 1999-05-19 吉斯特-布罗卡迪斯股份有限公司 从用巴氏法灭菌的生物量中制备含有微生物多不饱和脂肪酸的油的方法
US20030143659A1 (en) 1996-03-28 2003-07-31 Hendrik Louis Bijl Process for the preparation of a granular microbial biomass and isolation of a compound thereform
WO1998003671A1 (en) * 1996-07-23 1998-01-29 Nagase Biochemicals, Ltd. Process for preparing docosahexaenoic acid and docosapentaenoic acid
EP0960943B1 (en) 1996-12-27 2014-02-12 Suntory Holdings Limited Media for culturing microorganisms and process for producing unsaturated fatty acids or lipids containing the same
ATE305048T1 (de) 1997-08-01 2005-10-15 Martek Biosciences Corp Dha-enthaltende naehrzusammensetzungen und verfahren zu deren herstellung
EP1025842B1 (en) 1997-10-30 2004-07-21 Morishita Jintan Co., Ltd. Double-leyered capsule of unsaturated fatty acid or derivative thereof and process for producing the same
JP4079494B2 (ja) * 1998-03-04 2008-04-23 サントリー株式会社 アラキドン酸及び／又はエイコサペンタエン酸含有油脂の製造方法
JP4175698B2 (ja) 1998-06-19 2008-11-05 サントリー株式会社 新規なトリグリセリド及びそれを含む組成物
US8003772B2 (en) * 1999-01-14 2011-08-23 Martek Biosciences Corporation Chimeric PUFA polyketide synthase systems and uses thereof
KR100423013B1 (ko) 1999-03-04 2004-03-12 산토리 가부시키가이샤 도코사펜타엔산 함유물질의 이용
IL143421A0 (en) 1999-09-29 2002-04-21 Micro Gaia Co Ltd Method for culturing algae
US6395778B1 (en) 2000-01-11 2002-05-28 Omegatech, Inc. Process for making an enriched mixture of polyunsaturated fatty acid esters
CN100460513C (zh) * 2000-01-19 2009-02-11 马泰克生物科学公司 无溶剂的提取方法
DE60130737T3 (de) 2000-01-28 2016-01-14 Dsm Ip Assets B.V. Verstärkte Produktion von Lipiden enthaltend mehrfachungesättigte Fettsäuren durch hochdichte Kulturen von eukariotischen Mikroben in Gärvorrichtungen
EP1261733A4 (en) 2000-02-24 2005-11-23 Thomas Veach Ii Long PROCESS FOR THE PREPARATION OF CAROTENOIDS, XANTHOPHYLLENE AND APO-CAROTENOIDES USING EUKARYOTIC MICROORGANISMS
DE60020271T2 (de) 2000-03-29 2006-03-23 Council Of Scientific And Industrial Research Verfahren zur erhöhung von mehrfachungesättigten fettsäuren in thraustochytriden
US6410282B1 (en) * 2000-03-30 2002-06-25 Council Of Scientific And Industrial Research Method for enhancing levels of polyunsaturated fatty acids in thraustochytrid fungi
JP3425622B2 (ja) 2000-03-30 2003-07-14 独立行政法人産業技術総合研究所 ラビリンチュラ属菌を用いた高度不飽和脂肪酸含有培養物および高度不飽和脂肪酸含有油脂の製造方法
EP1178118A1 (en) 2000-08-02 2002-02-06 Dsm N.V. Isolation of microbial oils
ATE430794T1 (de) * 2001-03-09 2009-05-15 Nestle Sa Öl, das langkettige, mehrfach ungesättigte fettsäuren aus biomassen enthält, verfahren zur herstellung, lebensmittel, nahrungsmittelzusammensetzung, kosmetische oder pharmazeutische zusammensetzung, die dieses enthält
TWI324181B (en) * 2001-04-16 2010-05-01 Martek Biosciences Corp Product and process for transformation of thraustochytriales microorganisms
JP4995377B2 (ja) 2001-04-26 2012-08-08 花王株式会社 油脂組成物
US20050129739A1 (en) * 2001-05-14 2005-06-16 Gerhard Kohn Production and use of a polar lipid-rich fraction containing omega-3 and/or omega-6 highly unsaturated fatty acids from microbes, genetically modified plant seeds and marine organisms
ATE457357T1 (de) 2001-07-02 2010-02-15 Suntory Holdings Ltd Verfahren zur herstellung von fett mit triglyceridhaltiger hochungesättigter fettsäure
AU2002323409A1 (en) * 2001-08-24 2003-03-10 Martek Biosciences Boulder Corporation Products containing highly unsaturated fatty acids for use by women and their children during stages of preconception, pregnancy and lactation/post-partum
DE10151155A1 (de) 2001-10-19 2003-05-08 Nutrinova Gmbh Native PUFA-Triglyceridmischungen mit einem hohen Gehalt an mehrfach ungesättigten Fettsäuren sowie Verfahren zu deren Herstellung und deren Verwendung
US6677470B2 (en) 2001-11-20 2004-01-13 Natural Asa Functional acylglycerides
CN1267174C (zh) * 2001-12-12 2006-08-02 马泰克生物科学博尔德公司 从含油种子和微生物来源提取和冬化脂类的方法
US20040203120A1 (en) 2002-03-22 2004-10-14 Council Of Scientific And Industrial Research Method for enhancing levels of polyunsaturated fatty acids in thraustochytrid protists
EP1503715A4 (en) 2002-05-03 2005-07-06 Martek Biosciences Corp HIGH QUALITY LIPIDS AND METHODS FOR THE PRODUCTION THEREOF BY ENZYMATIC RELEASE FROM BIOMASS
EA013051B1 (ru) * 2002-06-19 2010-02-26 ДСМ Ай Пи ЭССЕТС Б.В. Масло из микробных клеток, композиция, содержащая масло, и способ получения масла
ES2312513T3 (es) * 2002-09-04 2009-03-01 Nestec S.A. Procedimiento para la preparacion de un aceite conteniendo uno o unos acidos grasos poliinsaturados de cadena larga proviniendo de biomasa, alimento, composicion nutricional, cosmetica o farmaceutica conteniendo dicho aceite.
CA2498569C (en) 2002-09-13 2016-11-29 Suntory Limited Process for production of transesterified oils/fats or triglycerides
DK1549753T3 (da) 2002-10-11 2010-10-18 Nippon Suisan Kaisha Ltd Fremgangsmåde til fremstilling af mikrobielt fedt eller olie med nedsat uforsæbeligt stofindhold
RU2235481C2 (ru) 2002-11-20 2004-09-10 Общество с ограниченной ответственностью "Гелла-Фарма" Способ получения биологически активной добавки к пище (варианты)
KR101362989B1 (ko) 2003-03-27 2014-02-17 산토리 홀딩스 가부시키가이샤 지질 개선제 및 지질 개선제를 함유하는 조성물
US20050019880A1 (en) 2003-03-31 2005-01-27 Council Of Scientific And Industrial Research Method of enhancing levels of polyunsaturated fatty acids in thraustochytrid protists
US6846942B2 (en) 2003-05-20 2005-01-25 David Rubin Method for preparing pure EPA and pure DHA
JP2007503802A (ja) 2003-09-01 2007-03-01 ノボザイムス アクティーゼルスカブ 海洋微生物のバイオマス及び／又はそのバイオマスの成分の収量を高める方法
CA2801065C (en) 2003-10-02 2020-04-28 Dsm Ip Assets B.V. Production of high levels of dha in microalgae using modified amounts of chloride and potassium
DE10352838A1 (de) 2003-11-10 2005-07-07 Nutrinova Nutrition Specialties & Food Ingredients Gmbh Verfahren zur Kultivierung von Mikroorganismen der Gattung Thraustochytriales unter Verwendung eines optimierten Niedrigsalzmediums
TWI365716B (en) 2003-12-02 2012-06-11 Suntory Holdings Ltd Oil or fat and oil compositions containing phospholipids and a long-chain polyunsaturated fatty acid supply compound, and food using same
SE0303513D0 (sv) 2003-12-19 2003-12-19 Pronova Biocare As Use of a fatty acid composition comprising at least one of epa and dha or any combinations thereof
DE602004029090D1 (de) 2003-12-30 2010-10-21 Dsm Ip Assets Bv Entlüftungsverfahren
GB0403247D0 (en) 2004-02-13 2004-03-17 Tillotts Pharma Ag A pharmaceutical composition
DE102004060340A1 (de) * 2004-07-16 2006-02-09 Basf Plant Science Gmbh Verfahren zur Erhöhung des Gehalts an mehrfach ungesättigten langkettigen Fettsäuren in transgenen Organismen
ATE469207T1 (de) 2004-08-12 2010-06-15 Nippon Suisan Kaisha Ltd Verfahren zur herstellung mehrfach ungesättigter fettsäuren unter verwendung einer neuen zellkonservierungstechnik
WO2006022356A1 (ja) * 2004-08-24 2006-03-02 Suntory Limited ジアシルグリセロールの含量を任意に含んだ微生物油脂の製造法並びに該油脂
JP4624040B2 (ja) 2004-09-06 2011-02-02 日本水産株式会社 菌体培養方法
US7588931B2 (en) * 2004-11-04 2009-09-15 E. I. Du Pont De Nemours And Company High arachidonic acid producing strains of Yarrowia lipolytica
CA2586310C (en) 2004-11-04 2013-09-24 Monsanto Technology Llc Seed oil compositions
US8241868B2 (en) 2005-02-08 2012-08-14 Nippon Suisan Kaisha, Ltd. Production of polyunsaturated fatty acids using cell treatment method
ES2576986T3 (es) 2005-06-07 2016-07-12 Dsm Nutritional Products Ag Microorganismos eucariotas para la producción de lípidos y antioxidantes
EP2630869B1 (en) 2005-07-01 2016-12-14 DSM IP Assets B.V. Polyunsaturated fatty acid-containing oil product and uses and production thereof
CN101252844A (zh) * 2005-07-01 2008-08-27 马泰克生物科学公司 包含多不饱和脂肪酸的油产品及其用途和制备方法
BRPI0613453B1 (pt) 2005-07-12 2017-04-04 Adelaide Res And Innovation Pty Ltd composição fertilizante e método para fornecer micronutrientes para plantas
AU2006322990A1 (en) 2005-10-07 2007-06-14 Ocean Nutrition Canada Ltd. Salts of fatty acids and methods of making and using thereof
CN101370929A (zh) 2005-12-16 2009-02-18 阿维沙基因有限公司 生产二十二碳六烯酸(dha)的破囊壶菌菌株-sc1
US9265745B2 (en) 2005-12-21 2016-02-23 Brudy Technology S.L. Use of DHA, EPA or DHA-derived EPA for treating a pathology associated with cellular oxidative damage
EP1976973B1 (en) * 2005-12-29 2010-07-21 ABL Biotechnologies Ltd. Novel strain of schizochytrium limacinum useful in the production of lipids and extracellular polysaccharides and process thereof
WO2007149577A2 (en) 2006-06-23 2007-12-27 The Procter & Gamble Company Concentrated and odorless omega 3 fatty acids
CA2656311C (en) 2006-07-05 2016-06-21 Photonz Corporation Limited Ultra pure epa and polar lipids produced in largely heterotrophic culture
US20090304784A1 (en) 2006-07-28 2009-12-10 V. Mane Fils Seamless capsules containing high amounts of polyunsaturated fatty acids and a flavouring component
JP5531324B2 (ja) * 2006-08-01 2014-06-25 ディーエスエム ニュートリショナル プロダクツ アーゲー 油生産微生物およびその改変方法
CN101528067A (zh) * 2006-08-29 2009-09-09 马泰克生物科学公司 二十二碳五烯酸（n-6）油在婴儿配方中的用途
AU2007314481B2 (en) 2006-10-30 2012-11-29 E. I. Du Pont De Nemours And Company Delta17 desaturase and its use in making polyunsaturated fatty acids
US8936923B2 (en) 2006-12-05 2015-01-20 Biomass Research & Refining Pty Ltd Production of biodiesel
JP5101894B2 (ja) 2007-01-15 2012-12-19 サントリーホールディングス株式会社 高度不飽和脂肪酸及びこれを含有する脂質の製造方法
US20080234377A1 (en) 2007-03-23 2008-09-25 Martek Biosciences Corporation Polyunsaturated fatty acids for treatment of dementia and pre-dementia-related conditions
EP1992233A1 (en) 2007-05-11 2008-11-19 DSMIP Assets B.V. Stabilized marine oils and process of making them
WO2009002145A1 (en) 2007-06-26 2008-12-31 N.V. Nutricia Lipid composition for improving function of brain functioning
CA2692394A1 (en) 2007-07-06 2009-01-15 Seth J. Baum Fatty acid compositions and methods of use
US20090064567A1 (en) * 2007-09-12 2009-03-12 Martek Biosciences Corporation Biological oils and production and uses Thereof
US20090099261A1 (en) 2007-09-25 2009-04-16 Isi Brands Inc. Omega-3 mixtures
CN101970638B (zh) * 2007-10-03 2015-02-11 纳幕尔杜邦公司 用于高水平生产二十碳五烯酸的优化解脂耶氏酵母菌株
US8343753B2 (en) 2007-11-01 2013-01-01 Wake Forest University School Of Medicine Compositions, methods, and kits for polyunsaturated fatty acids from microalgae
DE102008042932A1 (de) 2008-10-17 2010-04-22 Evonik Degussa Gmbh Herstellung und Verwendung von Methionylmethionin als Futtermitteladditiv für Fische und Krustentiere
BRPI0921539A2 (pt) * 2008-11-28 2020-08-04 Solazyme, Inc. célula, composição de óleo de trigligerídeos, mistura de óleo, método para preparar um combustível por processamento do óleo, e, combustível
US20100178369A1 (en) 2009-01-15 2010-07-15 Nicole Lee Arledge Antioxidant-stabilized concentrated fish oil
EP2401386A4 (en) 2009-02-25 2013-03-13 Vb Medicare Pvt Ltd IMPROVED METHODS FOR THE FERMENTATIVE MANUFACTURE OF DOCOSAHEXAENIC ACID
WO2010103402A1 (en) 2009-03-09 2010-09-16 Pronova Biopharma Norge As Compositions comprising a fatty acid oil mixture comprising epa and dha in free acid form and a surfactant, and methods and uses thereof
ES2895261T3 (es) 2009-03-19 2022-02-18 Dsm Ip Assets Bv Composiciones de ácidos grasos de traustoquítridos y métodos de fabricación y usos de las mismas
US8207363B2 (en) 2009-03-19 2012-06-26 Martek Biosciences Corporation Thraustochytrids, fatty acid compositions, and methods of making and uses thereof
EP2408797B1 (en) 2009-03-19 2017-03-15 DSM IP Assets B.V. Polyunsaturated fatty acid synthase nucleic acid molecules and polypeptides, compositions, and methods of making and uses thereof
EP2488022B1 (en) 2009-10-16 2018-01-10 Mochida Pharmaceutical Co., Ltd. Compositions
CN103068965A (zh) 2009-12-28 2013-04-24 Dsmip资产公司 在蔗糖上生长的重组破囊壶菌和其组合物、制备方法及用途
WO2011082189A1 (en) 2009-12-28 2011-07-07 Martek Biosciences Corporation Production of hemagglutinin-neuraminidase protein in microalgae
KR20150013667A (ko) 2010-01-19 2015-02-05 디에스엠 아이피 어셋츠 비.브이. 에이코사펜타엔산 생산 미생물, 지방산 조성물 및 이의 제조방법 및 용도
EP2576801B1 (en) 2010-06-01 2019-10-02 DSM IP Assets B.V. Extraction of lipid from cells and products therefrom
KR102149068B1 (ko) 2011-07-21 2020-08-31 디에스엠 아이피 어셋츠 비.브이. 지방산 조성물
ES2857173T3 (es) * 2011-07-21 2021-09-28 Dsm Ip Assets Bv Aceites microbianos enriquecidos en ácidos grasos poliinsaturados
SG10201605966TA (en) * 2011-07-21 2016-09-29 Dsm Ip Assets Bv Eicosapentaenoic acid-producing microorganisms, fatty acid compositions, and methods of making and uses thereof
WO2016130504A1 (en) * 2015-02-09 2016-08-18 Archer Daniels Midland Company Renewable source-derived polymer oil macroinitiators and thermoplastic block copolymers derived therefrom

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5130242A (en) * 1988-09-07 1992-07-14 Phycotech, Inc. Process for the heterotrophic production of microbial products with high concentrations of omega-3 highly unsaturated fatty acids
US20040161831A1 (en) * 2002-12-27 2004-08-19 Fuji Photo Film Co., Ltd. Microorganism having an ability of producing docosahexaenoic acid and use thereof
KR20090007407A (ko) * 2006-04-11 2009-01-16 마텍 바이오싸이언스스 코포레이션 장쇄 다중불포화 지방산을 포함하는 식품 제품 및 그의 제조 방법

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
Owen P. Ward et al, ‘Omega-3/6 fatty acids: Alternative sources of production’ Process Biochemistry, Vol. 40, pp. 3627-3652, (2005) *

Also Published As

Publication number Publication date
CL2012002013A1 (es) 2013-03-22
MY160121A (en) 2017-02-28
BR112012017831B1 (pt) 2021-03-09
JP2016052311A (ja) 2016-04-14
BR122015020119A2 (pt) 2015-12-29
TWI653336B (zh) 2019-03-11
CN102884201A (zh) 2013-01-16
HK1221873A1 (zh) 2017-06-16
KR20150013667A (ko) 2015-02-05
WO2011090493A1 (en) 2011-07-28
BR122015020119B8 (pt) 2021-05-04
EP2526197A1 (en) 2012-11-28
JP2020072676A (ja) 2020-05-14
KR20170104628A (ko) 2017-09-15
US9924733B2 (en) 2018-03-27
DK2526197T3 (en) 2018-10-01
CN105360351A (zh) 2016-03-02
US9668499B2 (en) 2017-06-06
EP3054016A2 (en) 2016-08-10
JP5920890B2 (ja) 2016-05-18
BR112012017831A8 (pt) 2018-06-26
US20180295860A1 (en) 2018-10-18
US11154076B2 (en) 2021-10-26
US10798952B2 (en) 2020-10-13
EA201290656A1 (ru) 2013-02-28
US20220000147A1 (en) 2022-01-06
TWI649424B (zh) 2019-02-01
JP6705599B2 (ja) 2020-06-03
KR20120133381A (ko) 2012-12-10
US20150313861A1 (en) 2015-11-05
MX343403B (es) 2016-11-03
AU2010343305A1 (en) 2012-09-06
JP2013516997A (ja) 2013-05-16
CA2993690A1 (en) 2011-07-28
EP2526197B1 (en) 2018-06-20
CN102884201B (zh) 2016-04-13
CA2787344C (en) 2018-03-20
NZ601757A (en) 2015-01-30
KR102447978B1 (ko) 2022-09-27
JP2018078900A (ja) 2018-05-24
CA2896012A1 (en) 2011-07-28
CL2015001281A1 (es) 2015-08-07
EP2526197A4 (en) 2014-05-21
BR122015020119B1 (pt) 2021-04-13
PH12016501930A1 (en) 2019-02-11
US20110177031A1 (en) 2011-07-21
EP3054016A3 (en) 2016-11-30
CA2787344A1 (en) 2011-07-28
PH12016501930B1 (en) 2019-02-11
EA031136B1 (ru) 2018-11-30
EP4056708A1 (en) 2022-09-14
MX2012008388A (es) 2012-08-15
US20150237888A1 (en) 2015-08-27
TW201730343A (zh) 2017-09-01
CA2896012C (en) 2017-08-01
BR112012017831B8 (pt) 2021-05-25
AU2010343305B2 (en) 2015-06-11
BR112012017831A2 (pt) 2015-10-06
KR102155409B1 (ko) 2020-09-11
AR077916A1 (es) 2011-10-05
TW201125986A (en) 2011-08-01
CA2993690C (en) 2022-03-22
NZ626633A (en) 2015-10-30
US20170164639A1 (en) 2017-06-15

Similar Documents

Publication Publication Date Title
KR102155409B1 (ko) 에이코사펜타엔산 생산 미생물, 지방산 조성물 및 이의 제조방법 및 용도
KR102149116B1 (ko) 지방산 조성물
JP2018113973A (ja) 多価不飽和脂肪酸が高濃度化された微生物油
KR20110128944A (ko) 트라우스토키트리드, 지방산 조성물, 및 이의 제조방법 및 용도
AU2017202422A1 (en) Eicosapentaenoic acid-producing microorganisms, fatty acid compositions, and methods of making and uses thereof

Legal Events

Date Code Title Description
A107 Divisional application of patent
A201 Request for examination
E902 Notification of reason for refusal
E902 Notification of reason for refusal
E902 Notification of reason for refusal
E90F Notification of reason for final refusal
E701 Decision to grant or registration of patent right
GRNT Written decision to grant