KR102149116B1 - 지방산 조성물 - Google Patents

Abstract

본 발명은 도코사헥사엔산, 에이코사펜타엔산 및 선택적으로 도코사펜타엔산을 포함하는 오메가-3 다중불포화 지방산을 함유하는 미생물 오일 및 이러한 오일을 함유하는 투여 형태에 관한 것이다.

Description

지방산 조성물{FATTY ACID COMPOSITIONS}

본 발명은 단리된 미생물, 및 이의 균주 및 돌연변이체, 바이오매스(biomass), 미생물 오일, 조성물 및 배양물; 상기 미생물 오일, 바이오매스 및 돌연변이체를 생산하는 방법; 및 단리된 미생물, 바이오매스 및 미생물 오일을 사용하는 방법에 관한 것이다.

본원과 함께 온라인 제출된 서열 목록은 이의 전체내용이 본원에 참고로서 혼입되어 있다.

지방산은 탄소 쇄의 길이 및 포화 특성을 기초로 하여 분류된다. 지방산은 쇄에 존재하는 탄소수에 기초하여 단쇄, 중쇄 또는 장쇄 지방산으로 명명되고, 이중 결합이 탄소 원자들 사이에 존재하지 않는 경우에 포화 지방산으로 명명되며, 이중 결합이 존재하는 경우에 불포화 지방산으로 명명된다. 불포화 장쇄 지방산은, 단지 하나의 이중 결합이 존재하는 경우에 일불포화되고, 하나 초과의 이중 결합이 존재하는 경우에 다중불포화된다.

다중불포화된 지방산(PUFA)은 지방산의 메틸 말단으로부터 첫 번째 이중 결합의 위치를 기초로 하여 분류되며: 오메가-3(n-3) 지방산은 세 번째 탄소에서 제1 이중 결합을 함유하는 반면, 오메가-6(n-6) 지방산은 여섯 번째 탄소에서 제1 이중 결합을 함유한다. 예를 들면, 도코사헥사엔산("DHA")은, 쇄 길이가 22개 탄소이고 6개의 이중 결합을 갖는, 흔히 "22:6 n-3"으로 지정되는 오메가-3 장쇄 다중불포화 지방산(LC-PUFA)이다. 다른 오메가-3 LC-PUFA는 "20:5 n-3"으로 지정된 에이코사펜타엔산("EPA"), 및 "22:5 n-3"으로 지정된 오메가-3 도코사펜타엔산("DPA n-3")을 포함한다. DHA 및 EPA는 "필수" 지방산으로 명명된다. 오메가-6 LC-PUFA는 "20:4 n-6"으로 지정된 아라키돈산("ARA"), 및 "22:5 n-6"으로 지정된 오메가-6 도코사펜타엔산("DPA n-6")을 포함한다.

오메가-3 지방산은 세포막내 이들의 존재로 인하여 세포 생리학에 영향을 미치며, 생물학적 활성 화합물의 생산 및 유전자 발현을 조절하고, 생합성 기질(substrate)로서 사용되는 생물학적으로 중요한 분자이다(문헌[Roche, H. M., Proc. Nutr. Soc. 58: 397-401 (1999)]). 예를 들면, 인간 대뇌 피질속 지질의 약 15 내지 20%, 망막 속 지질의 30 내지 60%를 차지하는 DHA는 고환 및 정자속에서 농축되며, 모유의 중요한 성분이다(문헌[Berge, J.P., and Barnathan, G.. Adv. Biochem. Eng. Biotechnol. 96 :49-125 (2005)]). DHA는 뇌속 오메가-3 지방산의 97% 이하 및 망막내 오메가-3 지방산의 93% 이하를 차지한다. 또한, DHA는 태아 및 유아 발달 둘다뿐만 아니라, 성인에서 인지 기능의 유지에도 필수적이다(상기 문헌 참조). 오메가-3 지방산은 인간 체내에서 새로이 합성되지 않으므로, 이들 지방산은 영양원으로부터 유도되어야만 한다.

아마씨유(flaxseed oil) 및 어유(fish oil)는 오메가-3 지방산의 우수한 식이원으로 고려된다. 아마씨유는 EPA, DHA, DPA 또는 ARA를 함유하지 않지만 오히려 체내에서 EPA를 제조할 수 있도록 하는 구성 요소(building block)인 리놀렌산(C18:3 n-3)을 함유한다. 그러나, 대사 전환율은, 특히 건강이 악화된 인간들중에서 느리고 가변적일 수 있다는 증거가 존재한다. 어유는 특수한 종 및 이들의 식이에 따라 지방산 조성의 유형 및 수준이 상당히 변한다. 예를 들면, 양식에 의해 길러낸 어류는 야생의 것보다 더 낮은 수준의 오메가-3 지방산을 갖는 경향이 있다. 더욱이, 어유는 환경 오염 물질을 함유할 위험성을 수반하며 안정성 문제 및 비린내 또는 맛과 관련될 수 있다.

트라우스토키트리드(Thraustochytrid)는 트라우스토키트리알레스(Thraustochytriales) 목의 미생물이다. 트라우스토키트리드는 쉬조키트리움(Schizochytrium) 및 트라우스토키트리움(Thraustochytrium) 속의 구성원들을 포함하며 DHA 및 EPA를 포함하는 오메가-3 지방산의 대체 공급원으로서 인식되어 왔다(미국 특허 제5,130,242호 참고). 이러한 해양 종속영양성 미생물로부터 생산된 오일은 흔히 상응하는 어유 또는 미세조류 오일보다 더 단순한 다중불포화 지방산 프로파일을 갖는다(문헌[Lewis, T.E., Mar. Biotechnol. 1: 580-587 (1999)]). 트라우스토키트리드 종의 균주는 유기체에 의해 생산된 총 지방산의 높은 백분율로 오메가-3 지방산을 생산하는 것으로 보고되어 있다(미국 특허 제5,130,242호; 문헌[Huang, J. et al., J. Am. Oil. Chem. Soc. 78: 605-610 (2001)]; 문헌[Huang, J. et al., Mar. Biotechnol. 5: 450-457 (2003)]). 그러나, 단리된 트라우스토키트리드는 생산된 LC-PUFA의 동일성 및 양에 있어서 다양하여, 일부 앞서 기술된 균주는 바람직하지 않은 수준의 오메가-6 지방산을 가질 수 있고/있거나 배양 시 낮은 생산성을 입증할 수 있다. 이에, 높은 생산성 및 바람직한 LC-PUFA 프로파일이 입증된 미생물의 단리가 지속적으로 요구되고 있다.

본 발명은 ATCC 수탁번호 PTA-10212로 기탁된 종의 단리된 미생물에 관한 것이다.

본 발명은 ATCC 수탁번호 PTA-10212로 기탁된 종의 특성을 갖는 단리된 미생물에 관한 것이다.

본 발명은 서열번호 1의 폴리뉴클레오티드 서열 또는 서열번호 1과의 동일성이 94% 이상인 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하는 18s rRNA를 포함하는 단리된 미생물에 관한 것이다.

본 발명은 ATCC 수탁번호 PTA-10212로 기탁된 미생물의 18s rRNA 폴리뉴클레오티드 서열과의 동일성이 94% 이상인 18s rRNA 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하는 단리된 미생물에 관한 것이다.

본 발명은 ATCC 수탁번호 PTA-10208로 기탁된 종의 단리된 미생물로서, 상기 미생물에 의해 생산된 총 지방산이 약 10중량% 이상의 에이코사펜타엔산을 포함하는, 단리된 미생물에 관한 것이다.

본 발명은 ATCC 수탁번호 PTA-10208로 기탁된 종의 특성을 갖는 단리된 미생물로서, 상기 미생물에 의해 생산된 총 지방산이 약 10중량% 초과의 에이코사펜타엔산을 포함하는, 단리된 미생물에 관한 것이다.

본 발명은 트라이아실글리세롤 분획을 생산하는 단리된 미생물로서, 상기 트라이아실글리세롤 분획의 에이코사펜타엔산 함량이 약 12중량% 이상인, 단리된 미생물에 관한 것이다.

일부 양태에서, 본 발명의 단리된 미생물은 돌연변이체 균주이다.

본 발명은 ATCC 수탁번호 PTA-10212, PTA-10213, PTA-10214, PTA-10215, PTA-10208, PTA-10209, PTA-10210 또는 PTA-10211로 기탁된 단리된 미생물에 관한 것이다.

본 발명은 본 발명의 임의의 미생물 또는 이의 혼합물을 포함하는 바이오매스에 관한 것이다.

본 발명은 단리된 바이오매스로서, 상기 바이오매스의 건조 세포중의 약 20중량% 이상이 지방산이고, 상기 지방산의 약 10중량% 초과가 에이코사펜타엔산이고, 상기 지방산이 각각 약 5중량% 미만의 아라키돈산 및 도코사펜타엔산 n-6을 포함하는, 단리된 바이오매스에 관한 것이다. 일부 양태에서, 지방산의 약 25중량% 이상은 도코사헥사엔산이다.

일부 양태에서, 본 발명은 트라이아실글리세롤을 포함하는 단리된 바이오매스로서, 트라이아실글리세롤의 약 12중량% 이상이 에이코사펜타엔산인, 단리된 바이오매스에 관한 것이다.

일부 양태에서, 본 발명은 지방산이 각각 약 5중량% 미만의 올레산, 리놀레산, 리놀렌산, 에이코센산 및 에루크산을 포함하는, 본 발명의 임의의 단리된 바이오매스에 관한 것이다.

본 발명은 본 발명의 임의의 미생물 또는 이의 혼합물을 포함하는 단리된 배양물에 관한 것이다.

본 발명은 본 발명의 미생물 또는 바이오매스 또는 이의 혼합물을 포함하는, 비인간 동물 또는 인간용 식료품, 화장품 또는 약학 조성물에 관한 것이다.

본 발명은 약 20중량% 이상의 에이코사펜타엔산 및 각각 약 5중량% 미만의 아라키돈산, 도코사펜타엔산 n-6, 올레산, 리놀레산, 리놀렌산, 에이코센산, 에루크산 및 스테아리돈산을 포함하는, 미생물 오일에 관한 것이다. 일부 양태에서, 미생물 오일은 약 25중량% 이상의 도코사헥사엔산을 추가로 포함한다.

본 발명은 약 10중량% 이상의 트라이아실글리세롤 분획을 포함하는 미생물 오일로서, 상기 트라이아실글리세롤 분획중의 지방산의 약 12중량% 이상이 에이코사펜타엔산이고, 상기 트라이아실글리세롤 분획중의 지방산의 약 25중량% 이상이 도코사헥사엔산이고, 상기 트라이아실글리세롤 분획중의 지방산의 약 5중량% 미만이 아라키돈산인, 미생물 오일에 관한 것이다.

본 발명은 본 발명의 임의의 미생물 오일을 포함하는, 비인간 동물 또는 인간용 식료품, 화장품 또는 약학 조성물에 관한 것이다. 일부 양태에서, 상기 식료품은 영아용 조제식이다. 일부 양태에서, 상기 영아용 조제식은 조산아에 적합하다. 일부 양태에서, 상기 식료품은 우유, 음료, 치료 음료, 영양 음료, 또는 이들의 조합이다. 일부 양태에서, 상기 식료품은 비인간 동물 또는 인간 음식용 첨가제이다. 일부 양태에서, 상기 식료품은 영양 보충물이다. 일부 양태에서, 상기 식료품은 동물 사료이다. 일부 양태에서, 상기 동물 사료는 수산 양식 사료이다. 일부 양태에서, 상기 동물 사료는 애완 동물 사료, 동물원 동물 사료, 노동 동물(work animal) 사료, 가축 사료 또는 이들의 조합이다.

본 발명은 본 발명의 임의의 단리된 미생물 또는 이의 혼합물을 배양물에서 성장시켜 오메가-3 지방산을 포함하는 오일을 생산하는 단계를 포함하는, 오메가-3 지방산을 포함하는 미생물 오일의 생산 방법에 관한 것이다. 일부 양태에서, 상기 방법은 오일을 추출하는 단계를 추가로 포함한다.

본 발명은 오메가-3 지방산을 포함하는 오일을 본 발명의 바이오매스로부터 추출하는 단계를 포함하는, 오메가-3 지방산을 포함하는 미생물 오일의 생산 방법에 관한 것이다. 일부 양태에서, 상기 미생물 오일은 유기 용매 추출 공정, 예를 들면, 헥산 추출을 사용하여 추출한다. 일부 양태에서, 상기 미생물 오일은 무용매 추출 공정을 사용하여 추출한다.

본 발명은 본 발명의 방법으로 생산한 미생물 오일에 관한 것이다.

본 발명은 본 발명의 임의의 단리된 미생물 또는 이의 조합을 배양물에서 성장시켜 바이오매스를 생산하는 단계를 포함하는, 본 발명의 임의의 바이오매스의 생산 방법에 관한 것이다.

본 발명은 본 발명의 방법으로 생산한 바이오매스에 관한 것이다.

본 발명은 본 발명의 임의의 미생물을 돌연변이시키는 단계, 및 돌연변이체 균주를 단리하는 단계를 포함하는, 본 발명의 돌연변이체 균주의 생산 방법에 관한 것이다.

본 발명은 염증 또는 이와 관련된 증상 치료용 의약을 제조하기 위한, 본 발명의 임의의 단리된 미생물, 바이오매스 또는 미생물 오일, 또는 이들의 혼합물의 용도에 관한 것이다.

본 발명은 염증 또는 이와 관련된 증상을 치료하기 위한, 본 발명의 임의의 단리된 미생물, 바이오매스 또는 미생물 오일, 또는 이들의 혼합물의 용도에 관한 것이다.

본 발명은 염증 또는 이와 관련된 증상의 치료에 사용하기 위한, 본 발명의 임의의 단리된 미생물, 바이오매스 또는 미생물 오일, 또는 이들의 혼합물의 용도에 관한 것이다.

본 발명은 본 발명의 임의의 단리된 미생물, 바이오매스 또는 미생물 오일, 또는 이들의 혼합물, 및 약학적으로 허용되는 담체를 대상체에게 투여함을 포함하는, 염증 또는 이와 관련된 증상의 치료가 필요한 대상체에서 염증 또는 이와 관련된 증상의 치료 방법에 관한 것이다.

본 발명은 단리된 미생물, 및 이의 균주 및 돌연변이체, 및 이의 바이오매스, 미생물 오일, 조성물 및 배양물에 관한 것이다. 본 발명은 본 발명의 미생물로부터 미생물 오일, 바이오매스 및 돌연변이체를 생산하는 방법 및 상기 미생물, 바이오매스 및 미생물 오일을 사용하는 방법에 관한 것이다. 본원에 기재된 미생물은 매우 생산적이며, 높은 수준의 오메가-3 지방산, 특히 높은 수준의 EPA를 부분적인 특성으로 하는 독특한 지방산 프로파일을 생성한다.

본 발명은 단리된 미생물 및 이로부터 유도되는 균주에 관한 것이다. 본 발명의 단리된 미생물로부터 "유도되는" 균주는 천연 또는 인공 유도체, 예를 들면, 돌연변이체, 변이체 또는 재조합체 균주일 수 있다. 본원에 사용된 용어 "단리된"은 단리물이 정제된 정도를 반드시 반영하는 것이 아니라, 천연 형태 또는 천연 환경으로부터의 단리 또는 격리를 나타낸다. 단리물은, 비제한적으로, 단리된 미생물, 단리된 바이오매스, 단리된 배양물, 단리된 미생물 오일 및 단리된 서열(예를 들면, 본원에 개시된 단리된 폴리뉴클레오티드 서열)을 포함할 수 있다. 본원에 사용된 용어 "미생물"은, 비제한적으로, 용어 "미세조류", "트라우스토키트리드", 및 본원에 기재된 임의의 기탁된 미생물과 관련된 분류학상 분류를 포함한다. 본원에 기재된 기탁된 미생물을 포함하여 본원의 임의의 미생물과 관련하여 사용된 용어 "트라우스토키트리알레스", "트라우스토키트리드", "쉬조키트리움" 및 "트라우스토키트리움"은 이용가능한 계통발생학상 정보를 포함하는 현재의 분류학상 분류에 기초하며, 분류학상 분류가 본 출원의 출원일 이후에 재분류되는 경우에 한정되는 것으로 의도되지 않는다.

일부 양태에서, 본 발명은 ATCC 수탁번호 PTA-10212로 기탁된 종의 단리된 미생물에 관한 것이다. ATCC 수탁번호 PTA-10212와 관련된 단리된 미생물은 또한 트라우스토키트리움 종 ATCC PTA-10212로서 본원에 알려져 있다. ATCC 수탁번호 PTA-10212와 관련된 단리된 미생물은 2009년 7월 14일자로 부다페스트 조약하에 미국 버지니아주 20110-2209 마나사스 유니버시티 불러바드 10801에 소재하는 아메리칸 타입 컬쳐 컬렉션(American Type Culture Collection)(특허 기탁소)에 기탁되었다. 일부 양태에서, 본 발명은 ATCC 수탁번호 PTA-10212로 기탁된 단리된 균주에 관한 것이다.

일부 양태에서, 본 발명은 ATCC 수탁번호 PTA-10212로 기탁된 종의 특성을 갖는 단리된 미생물 또는 이로부터 유도되는 균주에 관한 것이다. ATCC 수탁번호 PTA-10212로 기탁된 종의 특성은 이의 성장 및 표현형 특성(표현형 특성의 예는 형태학적 및 생식 특성을 포함한다), 이의 물리적 및 화학적 특성(예: 건조 중량 및 지질 프로파일), 이의 유전자 서열 및 이들의 조합을 포함하고, 상기 특성은 이미 동정된 종과 비교하여 상기 종을 구별한다. 일부 양태에서, 본 발명은 ATCC 수탁번호 PTA-10212로 기탁된 종의 특성을 갖는 단리된 미생물로서, 상기 특성이 서열번호 1의 폴리뉴클레오티드 서열 또는 서열번호 1과의 동일성이 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 이상인 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하는 18s rRNA, ATCC 수탁번호 PTA-10212로 기탁된 종의 형태학적 및 생식 특성, 및 ATCC 수탁번호 PTA-10212로 기탁된 종의 지방산 프로파일을 포함한다. 일부 양태에서, 본 발명의 단리된 미생물은 ATCC 수탁번호 PTA-10212로 기탁된 미생물과 실질적으로 동일한 표현형 특성을 갖는다. 일부 양태에서, 본 발명의 단리된 미생물은 ATCC 수탁번호 PTA-10212로 기탁된 미생물과 실질적으로 동일한 성장 특성을 갖는다. 일부 양태에서, 본 발명은 서열번호 1의 폴리뉴클레오티드 서열 또는 서열번호 1과의 동일성이 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 이상인 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하는 18s rRNA를 포함하는 단리된 미생물에 관한 것이다. 일부 양태에서, 본 발명은 ATCC 수탁번호 PTA-10212로 기탁된 미생물의 18s rRNA 폴리뉴클레오티드 서열과의 동일성이 94% 이상인 18s rRNA 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하는 단리된 미생물에 관한 것이다.

일부 양태에서, 본 발명은 ATCC 수탁번호 PTA-10212로 기탁된 미생물의 돌연변이체 균주에 관한 것이다. 추가의 양태에서, 돌연변이체 균주는 ATCC 수탁번호 PTA-10213, PTA-10214 또는 PTA-10215로 기탁된 균주이다. ATCC 수탁번호 PTA-10213, PTA-10214 또는 PTA-10215와 관련된 미생물은 2009년 7월 14일자로 부다페스트 조약하에 미국 버지니아주 20110-2209 마나사스 유니버시티 불러바드 10801에 소재하는 아메리칸 타입 컬쳐 컬렉션(특허 기탁소)에 기탁되었다.

일부 양태에서, 본 발명은 ATCC 수탁번호 PTA-10208로 기탁된 종의 단리된 미생물에 관한 것이다. ATCC 수탁번호 PTA-10208과 관련된 단리된 미생물은 본원에서 또한 쉬조키트리움 종 ATCC PTA-10208로서 공지되어 있다. ATCC 수탁번호 PTA-10208과 관련된 미생물은 2009년 7월 14일자로 부다페스트 조약하에 미국 버지니아주 20110-2209 마나사스 유니버시티 불러바드 10801에 소재하는 아메리칸 타입 컬쳐 컬렉션(특허 기탁소)에 기탁되었다. 일부 양태에서, 본 발명은 ATCC 수탁번호 PTA-10208로 기탁된 단리된 균주에 관한 것이다.

일부 양태에서, 본 발명은 ATCC 수탁번호 PTA-10208로 기탁된 종의 단리된 미생물로서, 상기 미생물에 의해 생산된 총 지방산이 약 10중량% 초과, 약 11중량% 초과, 약 12중량% 초과, 약 13중량% 초과, 약 14중량% 초과, 약 15중량% 초과, 약 16중량% 초과, 약 17중량% 초과, 약 18중량% 초과, 약 19중량% 초과 또는 약 20중량% 초과의 EPA를 포함하는, 단리된 미생물에 관한 것이다. 일부 양태에서, 본 발명은 ATCC 수탁번호 PTA-10208로 기탁된 종의 단리된 미생물로서, 상기 미생물에 의해 생산된 총 지방산이 약 10 내지 약 55중량%, 약 10 내지 약 50중량%, 약 10 내지 약 45중량%, 약 10 내지 약 40중량%, 약 10 내지 약 35중량%, 약 10 내지 약 30중량%, 약 15 내지 약 55중량%, 약 15 내지 약 50중량%, 약 15 내지 약 45중량%, 약 15 내지 약 40중량%, 약 15 내지 약 35중량%, 약 15 내지 약 30중량%, 약 20 내지 약 55중량%, 약 20 내지 약 50중량%, 약 20 내지 약 45중량%, 약 20 내지 약 40중량%, 약 20 내지 약 35중량% 또는 약 20 내지 약 30중량%의 EPA를 포함하는, 단리된 미생물에 관한 것이다.

일부 양태에서, 본 발명은 ATCC 수탁번호 PTA-10208로 기탁된 종의 특성을 갖는 단리된 미생물로서, 상기 미생물에 의해 생산된 총 지방산이 약 10중량% 초과의 에이코사펜타엔산을 포함하는, 단리된 미생물에 관한 것이다. ATCC 수탁번호 PTA-10208로 기탁된 미생물의 특성은 이의 성장 및 표현형 특성(표현형 특성의 예는 형태학적 및 생식 특성을 포함한다), 이의 물리적 및 화학적 특성(예: 건조 중량 및 지질 프로파일), 이의 유전자 서열 및 이들의 조합을 포함하고, 상기 특성은 이미 동정된 종과 비교하여 상기 종을 구별한다. 일부 양태에서, 본 발명은 ATCC 수탁번호 PTA-10212로 기탁된 종의 특성을 갖는 단리된 미생물로서, 상기 특성이 서열번호 2의 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하는 18s rRNA, ATCC 수탁번호 PTA-10208로 기탁된 종의 형태학적 및 생식 특성 및 ATCC 수탁번호 PTA-10208로 기탁된 종의 지방산 프로파일을 포함한다. 일부 양태에서, 본 발명의 단리된 미생물은 ATCC 수탁번호 PTA-10208로 기탁된 미생물과 실질적으로 동일한 물리적 및 화학적 특성을 갖는다.

일부 양태에서, 본 발명은 ATCC 수탁번호 PTA-10208로 기탁된 미생물의 돌연변이체 균주에 관한 것이다. 추가의 양태에서, 돌연변이체 균주는 ATCC 수탁번호 PTA-10209, PTA-10210 또는 PTA-10211로 기탁된 균주이다. ATCC 수탁번호 PTA-10209, PTA-10210 및 PTA-10211로 기탁된 미생물은 2009년 9월 25일자로 부다페스트 조약하에 미국 버지니아주 20110-2209 마나사스 유니버시티 불러바드 10801에 소재하는 아메리칸 타입 컬쳐 컬렉션(특허 기탁소)에 기탁되었다.

일부 양태에서, 본 발명은 트라이아실글리세롤 분획을 생산하는 본 발명의 단리된 미생물로서, 상기 트라이아실글리세롤 분획의 EPA 함량이 약 12중량% 이상, 약 13중량% 이상, 약 14중량% 이상, 약 15중량% 이상, 약 16중량% 이상, 약 17중량% 이상, 약 18중량% 이상, 약 19중량% 이상 또는 약 20중량% 이상인 단리된 미생물에 관한 것이다. 일부 양태에서, 본 발명은 트라이아실글리세롤 분획을 생산하는 단리된 미생물로서, 상기 트라이아실글리세롤 분획의 EPA 함량이 약 12 내지 약 55중량%, 약 12 내지 약 50중량%, 약 12 내지 약 45중량%, 약 12 내지 약 40중량%, 약 12 내지 약 35중량%, 약 12 내지 약 30중량%, 약 15 내지 약 45중량%, 약 15 내지 약 40중량%, 약 15 내지 약 35중량%, 약 15 내지 약 30중량% 또는 약 20 내지 약 30중량%인 단리된 미생물에 관한 것이다.

일부 양태에서, 본 발명은 트라이아실글리세롤 분획을 생산하는 본 발명의 단리된 미생물의 돌연변이체, 변이체 또는 재조합체로서, 상기 트라이아실글리세롤 분획의 EPA 함량이 약 10중량% 이상, 약 11중량% 이상, 약 12중량% 이상, 약 13중량% 이상, 약 14중량% 이상, 약 15중량% 이상, 약 16중량% 이상, 약 17중량% 이상, 약 18중량% 이상, 약 19중량% 이상 또는 약 20중량% 이상인 상기 돌연변이체, 변이체 또는 재조합체에 관한 것이다. 일부 양태에서, 본 발명은 트라이아실글리세롤 분획을 생산하는 본 발명의 단리된 미생물의 돌연변이체, 변이체 또는 재조합체로서, 상기 트라이아실글리세롤 분획의 EPA 함량이 약 12 내지 약 55중량%, 약 12 내지 약 50중량%, 약 12 내지 약 45중량%, 약 12 내지 약 40중량%, 약 12 내지 약 35중량%, 약 12 내지 약 30중량%, 약 15 내지 약 55중량%, 약 15 내지 약 50중량%, 약 15 내지 약 45중량%, 약 15 내지 약 40중량%, 약 15 내지 약 35중량%, 약 15 내지 약 30중량%, 약 20 내지 약 55중량%, 약 20 내지 약 50중량%, 약 20 내지 약 45중량%, 약 20 내지 약 40중량%, 약 20 내지 약 35중량% 또는 약 20 내지 약 30중량%인 상기 돌연변이체, 변이체 또는 재조합체에 관한 것이다. 돌연변이체 균주는 널리 공지된 공정에 의해 생산할 수 있다. 통상의 공정은 방사선 조사, 고온에서의 처리 및 돌연변이유발원을 사용한 처리를 포함한다. 변이체 균주는 본원에 기재된 종의 다른 천연 존재하는 단리물 및/또는 아단리물일 수 있다. 재조합체 균주는 외인성 유전자의 발현 또는 외인성 유전자의 기능 또는 발현의 변경을 위해 분자 생물학에서 공지된 임의의 방법으로 생산할 수 있다. 일부 양태에서, 돌연변이체, 변이체 또는 재조합체 균주는 야생형 균주보다 더 많은 양의 오메가-3 지방산, 특히 EPA를 생산한다. 일부 양태에서, 돌연변이체, 변이체 또는 재조합체 균주는 보다 적은 양의 DHA, ARA, DPA n-6 또는 이의 조합과 같은 보다 적은 양의 하나 이상의 지방산을 생산한다. 일부 양태에서, 돌연변이체, 변이체 또는 재조합체 균주는 야생형 균주보다 배양물 1L 당 보다 많은 건조 세포 중량을 생산한다. 이러한 돌연변이체, 변이체 또는 재조합체 균주는 본 발명의 단리된 미생물로부터 유도되는 균주의 예이다.

일부 양태에서, 본 발명의 단리된 미생물(이의 돌연변이체, 변이체 및 재조합체를 포함함)은 상기 미생물로부터 단리된 하나 이상의 분획에 지방산 프로파일을 포함한다. 상기 미생물로부터 단리된 하나 이상의 분획은 총 지방산 분획, 스테롤 에스터 분획, 트라이아실글리세롤 분획, 유리 지방산 분획, 스테롤 분획, 다이아실글리세롤 분획, 극성 분획(인지질 분획을 포함함) 및 이의 조합을 포함한다. 특정 분획에 대한 지방산 프로파일은 본원에 개시된 특정 분획과 관련된 임의의 지방산 프로파일을 포함할 수 있다.

본 발명은 본 발명의 임의의 미생물을 돌연변이유발시키는 단계, 및 돌연변이체 균주를 단리하는 단계를 포함하는 돌연변이체를 생산하는 방법에 관한 것이다.

본 발명은 본 발명의 하나 이상의 단리된 미생물을 포함하는 배양물에 관한 것이다. 마이크로플로라(microflora), 예컨대 미세조류 및 트라우스토키트리드를 접종하고 성장시키고 회수하기 위한 다양한 발효 변수는 당해 분야에 공지되어 있다(이의 전체내용이 본원에 참고로서 혼입되는 미국 특허 제5,130,242호 참고). 액체 또는 고체 배지는 천연 또는 인공 해수를 함유할 수 있다. 종속영양성 성장을 위한 탄소원은, 비제한적으로, 글루코스, 프럭토스, 크실로스, 사카로스, 말토스, 가용성 전분, 몰라세스, 푸코스, 글루코사민, 덱스트란, 지방, 오일, 글리세롤, 나트륨 아세테이트 및 만니톨을 포함한다. 질소원은, 비제한적으로, 펩톤, 효모 추출물, 폴리펩톤, 맥아 추출물, 고기 추출물, 카사미노산, 옥수수대 액, 유기 질소원, 나트륨 글루타메이트, 우레아, 무기 질소원, 암모늄 아세테이트, 암모늄 설페이트, 암모늄 클로라이드 및 암모늄 니트레이트를 포함한다.

ATCC 수탁번호 PTA-10212로 기탁된 미생물을 성장시키기 위한 전형적인 배지는 표 1에 제시되어 있다.

[표 1]

전형적인 배양 조건은 다음을 포함할 수 있다:

pH: 약 6.5 내지 약 9.5, 약 6.5 내지 약 8.0 또는 약 6.8 내지 약 7.8;

온도: 약 15 내지 약 30℃, 약 18 내지 약 28℃ 또는 약 21 내지 약 23℃;

용존 산소: 약 0.1 내지 약 100% 포화, 약 5 내지 약 50% 포화 또는 약 10 내지 약 30% 포화; 및/또는

다음과 같이 조절된 글리세롤: 약 5 내지 약 50g/L, 약 10 내지 약 40g/L 또는 약 15 내지 약 35g/L.

일부 양태에서, ATCC 수탁번호 PTA-10212로 기탁된 미생물 또는 이의 돌연변이체, 변이체 또는 재조합체는 탄소원으로서 글리세롤상에서 종속영양적으로 성장하지만, 탄소원으로서 글루코스상에서 성장하지는 않는다.

ATCC 수탁번호 PTA-10208로 기탁된 미생물을 성장시키기 위한 전형적인 배지는 표 2에 제시되어 있다.

[표 2]

전형적인 배양 조건은 다음을 포함할 수 있다:

pH: 약 6.5 내지 약 8.5, 약 6.5 내지 약 8.0 또는 약 7.0 내지 약 8.0;

온도: 약 17 내지 약 30℃, 약 20 내지 약 28℃ 또는 약 22 내지 약 24℃;

용존 산소: 약 2 내지 약 100% 포화, 약 5 내지 약 50% 포화 또는 약 7 내지 약 20% 포화; 및/또는

다음과 같이 조절된 글루코스: 약 5 내지 약 50g/L, 약 10 내지 약 40g/L 또는 약 20 내지 약 35g/L.

일부 양태에서, 배지는 약 0.1% 이상, 약 0.5% 이상, 약 1% 이상, 약 1.5% 이상, 약 2% 이상, 약 5% 이상, 약 7% 이상, 약 10% 이상, 약 20% 이상, 약 30% 이상, 약 40% 이상, 약 50% 이상, 약 60% 이상, 약 70% 이상, 약 80% 이상 또는 약 90% 이상의 용존 산소를 포화 수준의 백분율로서 포함한다. 일부 양태에서, 배지는 약 0.1% 내지 약 2%, 약 0.1% 내지 약 5%, 약 0.1% 내지 약 10%, 약 0.1% 내지 약 20%, 약 0.1% 내지 약 30%, 약 0.1% 내지 약 50%, 약 0.1% 내지 약 100%, 약 5% 내지 약 10%, 약 5% 내지 약 20%, 약 5% 내지 약 30%, 약 5% 내지 약 50%, 약 5% 내지 약 100%, 약 7% 내지 약 10%, 약 7% 내지 약 20%, 약 7% 내지 약 30%, 약 7% 내지 약 50%, 약 7% 내지 약 100%, 약 10% 내지 약 20%, 약 10% 내지 약 30%, 약 10% 내지 약 50%, 약 10% 내지 약 100%, 약 20% 내지 약 30%, 약 20% 내지 약 50% 또는 약 20% 내지 약 100%의 용존 산소를 포화 수준의 백분율로서 포함한다.

본 발명은 본 발명의 미생물의 단리된 바이오매스에 관한 것이다. 본 발명의 단리된 바이오매스는 각각 이의 전체내용이 참고로서 혼입되는 미국 특허 제5,130,242호 및 미국 특허출원공개 제2002/0001833호에 기술된 바와 같은 바이오매스의 단리를 위한 임의의 통상의 방법에 의해 수득된 수거된 세포 바이오매스이다.

일부 양태에서, 배양물 1L로부터 단리된 바이오매스의 건조 세포 중량은 탄소, 질소 및 영양분의 공급원을 포함하고 약 950 내지 약 8,500ppm의 클로라이드 이온을 포함하는 약 pH 6.5 내지 약 pH 9.5의 배지내에서 약 15 내지 약 30℃에서 약 6 내지 약 8일 동안 성장시킨 후 약 10g 이상, 약 15g 이상, 약 20g 이상, 약 25g 이상, 약 30g 이상, 약 50g 이상, 약 60g 이상, 약 70g 이상, 약 80g 이상, 약 100g 이상, 약 120g 이상, 약 140g 이상, 약 160g 이상, 약 180g 이상 또는 약 200g 이상이다. 일부 양태에서, 배양물 1L로부터 단리된 바이오매스의 건조 세포 중량은 탄소, 질소 및 영양분의 공급원을 포함하고 약 950 내지 약 8,500ppm의 클로라이드 이온을 포함하는 약 pH 6.5, 약 pH 7, 약 pH 7.5, 약 pH 8.0, 약 pH 8.5, 약 pH 9 또는 약 pH 9.5의 배지내에서 약 15℃, 약 16℃, 약 17℃, 약 18℃, 약 19℃, 약 20℃, 약 21℃, 약 22℃, 약 23℃, 약 24℃, 약 25℃, 약 26℃, 약 27℃, 약 28℃, 약 29℃ 또는 약 30℃에서 약 6일, 약 7일 또는 약 8일 동안 성장시킨 후 약 10g 이상, 약 15g 이상, 약 20g 이상, 약 25g 이상, 약 30g 이상, 약 50g 이상, 약 60g 이상, 약 70g 이상, 약 80g 이상, 약 100g 이상, 약 120g 이상, 약 140g 이상, 약 160g 이상, 약 180g 이상 또는 약 200g 이상이다. 일부 양태에서, 배양물 1L로부터 단리된 바이오매스의 건조 세포 중량은 탄소, 질소 및 영양분의 공급원을 포함하고 약 950 내지 약 8,500ppm의 클로라이드 이온을 포함하는 약 pH 6.5 내지 약 pH 9.5의 배지에서 약 15 내지 약 30℃로 약 6일 내지 약 8일 동안 성장시킨 후 약 10 내지 약 200g이다. 일부 양태에서, 배양물 1L로부터 단리된 바이오매스의 건조 세포 중량은 탄소, 질소 및 영양분의 공급원을 포함하고 약 950 내지 약 8,500ppm의 클로라이드 이온을 포함하는 약 pH 6.5, 약 pH 7, 약 pH 7.5, 약 pH 8.0, 약 pH 8.5, 약 pH 9 또는 약 pH 9.5의 배지에서 약 15℃, 약 16℃, 약 17℃, 약 18℃, 약 19℃, 약 20℃, 약 21℃, 약 22℃, 약 23℃, 약 24℃, 약 25℃, 약 26℃, 약 27℃, 약 28℃, 약 29℃ 또는 약 30℃로 약 6일, 약 7일 또는 약 8일 동안 성장시킨 후 약 10 내지 약 200g, 약 10 내지 약 100g, 약 10 내지 약 50g, 약 15 내지 약 200g, 약 15 내지 약 100g, 약 15 내지 약 50g, 약 20 내지 약 200g, 약 20 내지 약 100g, 약 20 내지 약 50g, 약 50 내지 약 200g 또는 약 50 내지 약 100g이다. 일부 양태에서, 단리된 배양물은 폴리비닐피롤리돈을 함유하지 않는다.

일부 양태에서, 단리된 배양물은 탄소, 질소 및 영양분의 공급원을 포함하고 약 950 내지 약 8,500ppm의 클로라이드 이온을 포함하는 약 pH 6.5 내지 약 pH 8.5 또는 약 pH 6.5 내지 약 pH 9.5의 배지에서 약 15 내지 약 30℃로 약 6일, 약 7일 또는 약 8일 동안 성장시킨 후 오메가-3 지방산 생산성이 약 0.2g/L/일 이상, 약 0.3g/L/일 이상, 약 0.4g/L/일 이상, 약 0.5g/L/일 이상, 약 1g/L/일 이상, 약 1.2g/L/일 이상, 약 1.5g/L/일 이상, 약 1.7g/L/일 이상, 약 2g/L/일 이상, 약 3g/L/일 이상, 약 3.5g/L/일 이상, 약 4g/L/일 이상, 약 4.5g/L/일 이상, 약 5g/L/일 이상, 약 6g/L/일 이상 또는 약 8g/L/일 이상이다. 일부 양태에서, 단리된 배양물은 탄소, 질소 및 영양분의 공급원을 포함하고 약 950 내지 약 8,500ppm의 클로라이드 이온을 포함하는 약 pH 6.5 내지 약 pH 9.5의 배지에서 약 15 내지 약 30℃로 약 6일, 약 7일 또는 약 8일 동안 성장시킨 후 오메가-3 지방산 생산성이 약 0.2g/L/일 내지 약 20g/L/일, 약 0.4g/L/일 내지 약 20g/L/일, 약 0.4g/L/일 내지 약 2g/L/일, 약 1g/L/일 내지 약 2g/L/일, 약 1g/L/일 내지 약 20g/L/일, 약 2g/L/일 내지 약 15g/L/일, 약 2g/L/일 내지 약 10g/L/일, 약 3g/L/일 내지 약 10g/L/일, 약 4g/L/일 내지 약 9g/L/일, 약 4g/L/일 내지 약 8g/L/일, 약 4g/L/일 내지 약 7g/L/일 또는 약 4g/L/일 내지 약 6g/L/일이다.

일부 양태에서, 단리된 배양물은 탄소, 질소 및 영양분의 공급원을 포함하고 약 950 내지 약 8,500ppm의 클로라이드 이온을 포함하는 약 pH 6.5 내지 약 pH 8.5 또는 약 pH 6.5 내지 약 pH 9.5의 배지에서 약 15 내지 약 30℃로 약 6일, 약 7일 또는 약 8일 동안 성장시킨 후 EPA 생산성이 약 0.2g/L/일 이상, 약 0.3g/L/일 이상, 약 0.4g/L/일 이상, 약 0.5g/L/일 이상, 약 0.6g/L/일 이상, 약 0.7g/L/일 이상, 약 0.8g/L/일 이상, 약 0.9g/L/일 이상, 약 1g/L/일 이상, 약 1.2g/L/일 이상, 약 1.5g/L/일 이상, 약 1.7g/L/일 이상, 약 2g/L/일 이상, 약 3g/L/일 이상, 약 4g/L/일 이상 또는 약 5g/L/일 이상이다. 일부 양태에서, 탄소, 질소 및 영양분의 공급원을 포함하고 약 950 내지 약 8,500ppm의 클로라이드 이온을 포함하는 약 pH 6.5 내지 약 pH 8.5 또는 약 pH 6.5 내지 약 pH 9.5의 배지에서 약 15 내지 약 30℃로 약 6일, 약 7일 또는 약 8일 동안 성장시킨 후 EPA 생산성이 약 0.2g/L/일 내지 약 5g/L/일, 약 0.2g/L/일 내지 약 4g/L/일, 약 0.2g/L/일 내지 약 3g/L/일, 약 0.2g/L/일 내지 약 2g/L/일, 약 0.2g/L/일 내지 약 1g/L/일, 약 0.2g/L/일 내지 약 0.8g/L/일, 약 0.2g/L/일 내지 약 0.7g/L/일, 약 1g/L/일 내지 약 5g/L/일, 약 1g/L/일 내지 약 4g/L/일, 약 1g/L/일 내지 약 3g/L/일 또는 약 1g/L/일 내지 약 2g/L/일이다. 일부 양태에서, 상술한 임의의 EPA 생산성은 상술한 임의의 오메가-3 지방산 생산성과 관련된다. 일부 양태에서, 배양물은 약 0g/L/일 내지 약 5g/L/일, 약 0g/L/일 내지 약 4g/L/일, 약 0g/L/일 내지 약 3g/L/일, 약 0g/L/일 내지 약 2g/L/일, 약 0g/L/일 내지 약 1g/L/일, 약 0.2g/L/일 내지 약 5g/L/일, 약 0.2g/L/일 내지 약 4g/L/일, 약 0.2g/L/일 내지 약 3g/L/일, 약 0.2g/L/일 내지 약 2g/L/일, 약 0.2g/L/일 내지 약 1g/L/일, 약 1g/L/일 내지 약 5g/L/일, 약 2g/L/일 내지 약 5g/L/일, 약 2g/L/일 내지 약 4g/L/일 또는 약 2g/L/일 내지 약 3g/L/일의 DHA 생산성을 추가로 포함한다. 일부 양태에서, DHA 생산성은 약 5g/L/일 미만, 약 4g/L/일 미만, 약 3g/L/일 미만, 약 2g/L/일 미만, 약 1g/L/일 미만, 약 0.5g/L/일 미만, 약 0.2g/L/일 미만 또는 약 0g/L/일이다.

일부 양태에서, 발효 부피(배양 부피)는 약 2L 이상, 약 10L 이상, 약 50L 이상, 약 100L 이상, 약 200L 이상, 약 500L 이상, 약 1,000L 이상, 약 10,000L 이상, 약 20,000L 이상, 약 50,000L 이상, 약 100,000L 이상, 약 150,000L 이상, 약 200,000L 이상 또는 약 250,000L 이상이다. 일부 양태에서, 발효 부피는 약 2L 내지 약 300,000L, 약 2L, 약 10L, 약 50L, 약 100L, 약 200L, 약 500L, 약 1,000L, 약 10,000L, 약 20,000L, 약 50,000L, 약 100,000L, 약 150,000L, 약 200,000L, 약 250,000L 또는 약 300,000L이다.

일부 양태에서, 본 발명은 본 발명의 지방산 프로파일을 포함하는 단리된 바이오매스에 관한 것이다. 일부 양태에서, 상기 바이오매스의 건조 세포 중량의 약 20% 이상, 약 25% 이상, 약 30% 이상, 약 35% 이상, 약 40% 이상, 약 45% 이상, 약 50% 이상, 약 55% 이상, 약 60% 이상, 약 65% 이상, 약 70% 이상, 약 75% 이상 또는 약 80% 이상은 지방산이다. 일부 양태에서, 상기 바이오매스의 건조 세포 중량의 약 20% 초과, 약 25% 초과, 약 30% 초과, 약 35% 초과, 약 40% 초과, 약 45% 초과, 약 50% 초과, 약 55% 초과 또는 약 60% 초과는 지방산이다. 일부 양태에서, 상기 바이오매스의 건조 세포 중량의 약 20 내지 약 55중량%, 약 20 내지 약 60중량%, 약 20 내지 약 70중량%, 약 20 내지 약 80중량%, 약 30 내지 약 55중량%, 약 30 내지 약 70중량%, 약 30 내지 약 80중량%, 약 40 내지 약 60중량%, 약 40 내지 약 70중량%, 약 40 내지 약 80중량%, 약 50 내지 약 60중량%, 약 50 내지 약 70중량%, 약 50 내지 약 80중량%, 약 55 내지 약 70중량%, 약 55 내지 약 80중량%, 약 60 내지 약 70중량% 또는 약 60 내지 약 80중량%는 지방산이다. 일부 양태에서, 바이오매스는 약 10중량% 초과, 약 12중량% 이상, 약 15중량% 이상, 약 20중량% 이상, 약 25중량% 이상, 약 30중량% 이상, 약 35중량% 이상, 약 40중량% 이상 또는 약 45중량% 이상의 지방산으로서 EPA를 포함한다. 일부 양태에서, 상기 바이오매스는 약 10 내지 약 55중량%, 약 12 내지 약 55중량%, 약 15 내지 약 55중량%, 약 20 내지 약 55중량%, 약 20 내지 약 40중량% 또는 약 20 내지 약 30중량%의 지방산으로서 EPA를 포함한다. 일부 양태에서, 상기 바이오매스는 트라이아실글리세롤 분획을 포함하고, 상기 트라이아실글리세롤 분획의 약 12중량% 이상, 약 13중량% 이상, 약 14중량% 이상, 약 15중량% 이상, 약 16중량% 이상, 약 17중량% 이상, 약 18중량% 이상, 약 19중량% 이상 또는 약 20중량% 이상은 EPA이다. 일부 양태에서, 상기 바이오매스는 트라이아실글리세롤 분획을 포함하고, 상기 트라이아실글리세롤 분획의 EPA 함량은 적어도 약 12 내지 약 55중량%, 약 12 내지 약 50중량%, 약 12 내지 약 45중량%, 적어도 약 12 내지 약 40중량%, 적어도 약 12 내지 약 35중량% 또는 적어도 약 12 내지 약 30중량%, 약 15 내지 약 55중량%, 약 15 내지 약 50중량%, 약 15 내지 약 45중량%, 약 15 내지 약 40중량%, 약 15 내지 약 35중량%, 약 15 내지 약 30중량%, 약 20 내지 약 55중량%, 약 20 내지 약 50중량%, 약 20 내지 약 45중량%, 적어도 약 20 내지 약 40중량%, 적어도 약 20 내지 약 35중량% 또는 약 20 내지 약 30중량%이다. 일부 양태에서, 상기 바이오매스의 건조 세포 중량의 약 20중량% 이상, 약 25중량% 이상, 약 30중량% 이상, 약 35중량% 이상, 약 40중량% 이상, 약 50중량% 이상 또는 약 60중량% 이상은 DHA이다. 일부 양태에서, 상기 바이오매스의 건조 세포 중량의 약 20 내지 약 60중량%, 약 25 내지 약 60중량%, 약 25 내지 약 50중량%, 약 25 내지 약 45중량%, 약 30 내지 약 50중량% 또는 약 35 내지 약 50중량%는 DHA이다. 일부 양태에서, 상기 바이오매스는 약 10중량% 이하, 약 9중량% 이하, 약 8중량% 이하, 약 7중량% 이하, 약 6중량% 이하, 약 5중량% 이하, 약 4중량% 이하, 약 3중량% 이하, 약 2중량% 이하 또는 약 1중량% 이하의 지방산으로서 DHA를 포함한다. 일부 양태에서, 상기 바이오매스는 약 1 내지 약 10중량%, 약 1 내지 약 5중량%, 약 2 내지 약 5중량%, 약 3 내지 약 5중량% 또는 약 3 내지 약 10중량%의 지방산으로서 DHA를 포함한다. 일부 양태에서, 상기 바이오매스는 DHA를 실질적으로 함유하지 않는다. 일부 양태에서, 상기 바이오매스는 약 0.1 내지 약 5중량% 미만, 약 0.1 내지 약 4중량%, 약 0.1 내지 약 3중량%, 약 0.1 내지 약 2중량%, 약 0.2 내지 약 5중량% 미만, 약 0.2 내지 약 4중량%, 약 0.2 내지 약 3중량%, 약 0.2 내지 약 2중량%, 약 0.3 내지 약 2중량%, 약 0.1 내지 약 0.5중량%, 약 0.2 내지 약 0.5중량%, 약 0.1 내지 약 0.4중량%, 약 0.2 내지 약 0.4중량%, 약 0.5 내지 약 2중량%, 약 1 내지 약 2중량%, 약 0.5 내지 약 1.5중량% 또는 약 1 내지 약 1.5중량%의 지방산으로서 ARA를 포함한다. 일부 양태에서, 상기 바이오매스는 약 5중량% 미만, 약 4중량% 이하, 약 3중량% 이하, 약 2중량% 이하, 약 1.5중량% 이하, 약 1중량% 이하, 약 0.5중량% 이하, 약 0.4중량% 이하, 약 0.3중량% 이하, 약 0.2중량% 이하 또는 약 0.1중량% 이하의 지방산으로서 ARA를 포함한다. 일부 양태에서, 상기 바이오매스는 ARA를 실질적으로 포함하지 않는다. 일부 양태에서, 상기 바이오매스는 약 0.4 내지 약 2중량%, 약 0.4 내지 약 3중량%, 약 0.4 내지 약 4중량%, 약 0.4 내지 약 5중량%, 약 0.4 내지 약 5중량% 미만, 약 0.5 내지 약 1중량%, 약 0.5 내지 약 2중량%, 약 0.5 내지 약 3중량%, 약 0.5 내지 약 4중량%, 약 0.5 내지 약 5중량%, 약 0.5 내지 약 5중량% 미만, 약 1 내지 약 2중량%, 약 1 내지 약 3중량%, 약 1 내지 약 4중량%, 약 1 내지 약 5중량% 또는 약 1 내지 약 5중량% 미만의 지방산으로서 DPA n-6을 포함한다. 일부 양태에서, 상기 바이오매스는 약 5중량% 이하, 약 5중량% 미만, 약 4중량% 이하, 약 3중량% 이하, 약 2중량% 이하, 약 1중량% 이하, 약 0.75중량% 이하, 약 0.6중량% 이하 또는 약 0.5중량% 이하의 지방산으로서 DPA n-6을 포함한다. 일부 양태에서, 상기 바이오매스는 DPA n-6을 실질적으로 포함하지 않는다. 일부 양태에서, 상기 바이오매스는 올레산(18:1 n-9), 리놀레산(18:2 n-6), 리놀렌산(18:3 n-3), 에이코센산(20:1 n-9), 에루크산(22:1 n-9) 또는 이들의 조합을 약 5중량% 이하, 약 5중량% 미만, 약 4중량% 이하, 약 3중량% 이하 또는 약 2중량% 이하로 갖는 지방산을 포함한다.

본 발명의 단리된 바이오매스의 특성은 외인성으로 도입된 물질보다 단리된 바이오매스의 내인성 또는 천연 특성과 관련되어 있다. 일부 양태에서, 단리된 바이오매스는 폴리비닐피롤리돈을 함유하지 않거나, 폴리비닐피롤리돈을 함유하는 배양물로부터 단리되지 않는다.

본 발명은 바이오매스를 생산하는 방법에 관한 것이다. 일부 양태에서, 본 발명의 바이오매스를 생산하는 방법은 본 발명의 임의의 단리된 미생물 또는 이의 혼합물을 배양물에서 성장시켜 바이오매스를 생산하는 단계를 포함한다. 본 발명은 상기 방법으로 생산된 바이오매스에 관한 것이다.

본 발명은 본 발명의 지방산 프로파일을 포함하는 미생물 오일에 관한 것이다. 본 발명의 미생물 오일은 약 35중량% 이상의 트라이아실글리세롤 분획을 포함하는 "미정제 오일" 또는 "정제 오일"이다. "미정제 오일"은 추가의 처리 없이 미생물의 바이오매스로부터 추출되는 오일이다. "정제 오일"은 미정제 오일을 정제, 표백 및/또는 탈취의 표준 공정으로 처리함으로써 수득되는 오일이다(전체내용이 본원에 참고로서 혼입되는 미국 특허 제5,130,242호 참고). 미생물 오일은 또한 본원에 기재된 바와 같은 "최종 오일"을 포함하며, 이는 식물성 오일로 희석된 정제 오일이다. 일부 양태에서, 최종 오일은 고도 올레산 해바라기 오일로 희석된 정제 오일이다. 본원에 사용된 용어 "미생물"은, 비제한적으로, 용어 "미세조류", "트라우스토키트리드" 및 본원에 기재된 임의의 기탁된 미생물과 관련된 분류학상 분류를 포함한다. 본원에 기재된 기탁된 미생물을 포함하여 본원의 임의의 미생물과 관련하여 사용된 용어 "트라우스토키트리알레스", "트라우스토키트리드", "쉬조키트리움" 및 "트라우스토키트리움"은 이용가능한 계통발생학상 정보를 포함하는 현재의 분류학상 분류에 기초하며, 분류학상 분류가 본 출원의 출원일 이후에 재분류되는 경우에 한정되는 것으로 의도되지 않는다.

일부 양태에서, 본원에 기재된 지방산은 지방산 에스터이다. 일부 양태에서, 지방산 에스터는 오메가-3 지방산, 오메가-6 지방산 및 이의 조합의 에스터를 포함한다. 일부 양태에서, 지방산 에스터는 DHA 에스터, EPA 에스터 또는 이의 조합이다. 일부 양태에서, 본원에 기재된 오일 또는 이의 분획은 에스터화되어, 지방산 에스터를 포함하는 오일 또는 이의 분획을 생산한다. 용어 "에스터"는 지방산 분자의 카복실산 기중의 수소가 또 다른 치환기로 치환된 것을 지칭한다. 통상의 에스터는 당해 분야에 공지되어 있고, 문헌[Higuchi, T. and V. Stella in Pro-drugs as Novel Delivery Systems, Vol. 14, A.C.S. Symposium Series, Bioreversible Carriers in Drug Design, Ed. Edward B. Roche, American Pharmaceutical Association, Pergamon Press, 1987, and Protective Groups in Organic Chemistry, McOmie ed., Plenum Press, New York, 1973]에 언급되어 있다. 에스터의 예는 메틸, 에틸, 프로필, 부틸, 펜틸, t-부틸, 벤질, 니트로벤질, 메톡시벤질, 벤즈하이드릴 및 트라이클로로에틸을 포함한다. 일부 양태에서, 에스터는 카복실산 보호 에스터 기, 아르알킬(예: 벤질, 펜에틸)과의 에스터, 저급-알케닐(예: 알릴, 2-부테닐)과의 에스터, 저급-알콕시-저급-알킬(예: 메톡시메틸, 2-메톡시에틸, 2-에톡시에틸)과의 에스터, 저급-알카노일옥시-저급-알킬(예: 아세톡시메틸, 피발로일옥시메틸, 1-피발로일옥시에틸)과의 에스터, 저급-알콕시카보닐-저급-알킬(예: 메톡시카보닐메틸, 이소프로폭시카보닐메틸)과의 에스터, 카복시-저급-알킬(예: 카복시메틸)과의 에스터, 저급-알콕시카보닐옥시-저급-알킬(예: 1-(에톡시카보닐옥시)에틸, 1-(사이클로헥실옥시카보닐옥시)에틸)과의 에스터, 카바모일옥시-저급-알킬(예: 카바모일옥시메틸)과의 에스터 등이다. 일부 양태에서, 첨가된 치환기는 선형 또는 사이클릭 탄화수소 기, 예를 들면, C1-C6 알킬, C1-C6 사이클로알킬, C1-C6 알케닐 또는 C1-C6 아릴 에스터이다. 일부 양태에서, 에스터는 알킬 에스터, 예를 들면, 메틸 에스터, 에틸 에스터 또는 프로필 에스터이다. 일부 양태에서, 에스터 치환기는 당해 지방산이 정제된 또는 반-정제된 상태로 존재하는 경우에 유리 지방산 분자에 부가된다. 다르게는, 지방산 에스터는 트라이아실글리세롤을 에스터로 전환 시에 형성된다.

본 발명은 미생물 오일을 생산하는 방법에 관한 것이다. 일부 양태에서, 상기 방법은 본 발명의 임의의 단리된 미생물 또는 이의 혼합물을 배양물에서 성장시켜 오메가-3 지방산을 포함하는 미생물 오일을 생산하는 단계를 포함한다. 일부 양태에서, 상기 방법은 미생물 오일을 추출하는 단계를 추가로 포함한다. 일부 양태에서, 상기 방법은 본 발명의 임의의 바이오매스 또는 이의 혼합물로부터 오메가-3 지방산을 포함하는 미생물 오일을 추출하는 단계를 포함한다. 일부 양태에서, 상기 방법은 단리된 미생물을 종속영양적으로 성장시키는 단계를 포함하며, 상기 배양물은 본원에 기재된 탄소원을 포함한다. 미생물 오일은 신선하게 수거된 바이오매스로부터 추출하거나, 부패를 방지하는 조건하에 저장된 사전 수거된 바이오매스로부터 추출할 수 있다. 공지된 방법을 사용하여 본 발명의 미생물을 배양하고, 상기 배양물로부터 바이오매스를 단리하며, 상기 바이오매스로부터 미생물 오일을 추출하고, 상기 바이오매스로부터 추출된 오일의 지방산 프로파일을 분석할 수 있다(전체내용이 본원에 참고로서 혼입되는 미국 특허 제5,130,242호 참고). 본 발명은 본 발명의 임의의 방법으로 생산한 미생물 오일에 관한 것이다.

일부 양태에서, 미생물 오일은 효소 추출 방법에 의해 추출된다. 일부 양태에서, 미생물 오일은 기계적 추출 방법으로 추출된다. 일부 양태에서, 기계적 추출 방법은 (1) 균질화기를 통해 저온살균 발효 부용을 처리하여 세포 용해 및 세포로부터 오일의 방출을 보조하는 단계; (2) 균질화 후에 발효 부용에 이소프로필 알콜을 첨가하여 오일 및 물 에멀젼을 파쇄하는 단계; (3) 혼합물을 원심분리하여 오일 상을 회수하는 단계; 및 (4) 산화방지제를 첨가하면서 진공하에 건조시키는 단계중 하나 이상을 포함한다. 일부 양태에서, 미정제 오일은 정제된다. 일부 양태에서, 미정제 오일의 정제는 (1) 미정제 오일을 정제 탱크로 펌핑하고 오일을 가열한 다음, 혼합하면서 산 용액을 첨가하는 단계; (2) 산 처리 후에 가성 용액을 오일에 첨가하는 단계; (3) 미정제 오일을 재가열한 다음, 원심분리하여 정제 오일로부터 중질 상을 단리하는 단계; (4) 예를 들면, 트라이실(TriSyl: 등록상표), 점토 및/또는 여과를 사용하여 잔류 극성 화합물, 미량 금속 및 산화 생성물을 정제 오일로부터 제거하는 단계; (5) 표백된 오일을 냉각 여과하여 고융점 성분을 오일로부터 추가로 제거함으로써 목적하는 수준의 정화도를 수득하는 단계; (6) 오일을 가열하고, 이어서 오일을 냉각시킨 다음, 고융점 트라이글리세라이드 및 왁스가 결정화되도록 하는 시간 동안 유지하는 단계; (7) 필터 보조제를 냉각된 오일에 첨가한 다음, 여과에 의해 결정화 고체를 제거하는 단계; (8) 냉각 여과 후, 고온 및 진공하에 작동되는 탈취기를 사용하여, 예를 들면, 악취 및 풍미를 유발할 수 있는 과산화물 및 임의의 잔류 저분자량 화합물을 제거하는 단계; (9) 오일을 탈취된 공급물 탱크로 옮기고, 공기 제거하고, 예를 들면, 충전 컬럼 탈취기에서 탈취시키는 단계; 및 (10) 예를 들면, 탈취 사이클 말기에 질소 블랭킷하에 냉각시키고, 탈취된 오일에 적합한 산화방지제를 첨가하여 산화 안정성을 제공하는 단계중 하나 이상을 포함한다.

일부 양태에서, 상기 미생물 오일은 약 0중량%, 약 0.1중량% 이상, 약 0.2중량% 이상, 약 0.5중량% 이상, 약 1중량% 이상, 약 1.5중량% 이상, 약 2중량% 이상 또는 약 5중량% 이상의 스테롤 에스터 분획을 포함한다. 일부 양태에서, 미생물 오일은 약 0 내지 약 1.5중량%, 약 0 내지 약 2중량%, 약 0 내지 약 5중량%, 약 1 내지 약 1.5중량%, 약 0.2 내지 약 1.5중량%, 약 0.2 내지 약 2중량% 또는 약 0.2 내지 약 5중량%의 스테롤 에스터 분획을 포함한다. 일부 양태에서, 미생물 오일은 약 5중량% 이하, 약 4중량% 이하, 약 3중량% 이하, 약 2중량% 이하, 약 1중량% 이하, 약 0.5중량% 이하, 약 0.3중량% 이하, 약 0.2중량% 이하, 약 0.5중량% 이하, 약 0.4중량% 이하, 약 0.3중량% 이하 또는 약 0.2중량% 이하의 스테롤 에스터 분획을 포함한다.

일부 양태에서, 미생물 오일은 약 35중량% 이상, 약 40중량% 이상, 약 45중량% 이상, 약 50중량% 이상, 약 55중량% 이상, 약 60중량% 이상, 약 65중량% 이상, 약 70중량% 이상, 약 75중량% 이상, 약 80중량% 이상, 약 85중량% 이상 또는 약 90중량% 이상의 트라이아실글리세롤 분획을 포함한다. 일부 양태에서, 미생물 오일은 약 35 내지 약 98중량%, 약 35 내지 약 90중량%, 약 35 내지 약 80중량%, 약 35 내지 약 70중량%, 약 35 내지 약 70중량%, 약 35 내지 약 65중량%, 약 40 내지 약 70중량%, 약 40 내지 약 65중량%, 약 40 내지 약 55중량%, 약 40 내지 약 50중량%, 약 65 내지 약 95중량%, 약 75 내지 약 95중량%, 약 75 내지 약 98중량%, 약 80 내지 약 95중량%, 약 80 내지 약 98중량%, 약 90 내지 약 96중량%, 약 90 내지 약 97중량%, 약 90 내지 약 98중량%, 약 90중량%, 약 95중량%, 약 97중량% 또는 약 98중량%의 트라이아실글리세롤 분획을 포함한다.

일부 양태에서, 미생물 오일은 약 10중량% 이상, 약 11중량% 이상, 약 12중량% 이상, 약 13중량% 이상, 약 14중량% 이상, 약 15중량% 이상, 약 16중량% 이상, 약 17중량% 이상, 약 18중량% 이상, 약 19중량% 이상 또는 약 20중량% 이상의 다이아실글리세롤 분획을 포함한다. 일부 양태에서, 미생물 오일은 약 10 내지 약 45중량%, 약 10 내지 약 40중량%, 약 10 내지 약 35중량%, 약 10 내지 약 30중량%, 약 15 내지 약 40중량%, 약 15 내지 약 35중량% 또는 약 15 내지 약 30중량%의 다이아실글리세롤 분획을 포함한다. 일부 양태에서, 미생물 오일은 약 0.2중량% 이상, 약 0.3중량% 이상, 약 0.4중량% 이상, 약 0.5중량% 이상, 약 1중량% 이상, 약 5중량% 이상, 약 10중량% 이상, 약 11중량% 이상, 약 12중량% 이상, 약 13중량% 이상, 약 14중량% 이상, 약 15중량% 이상, 약 16중량% 이상, 약 17중량% 이상, 약 18중량% 이상, 약 19중량% 이상 또는 약 20중량% 이상의 1,2-다이아실글리세롤 분획을 포함한다. 일부 양태에서, 미생물 오일은 약 0.2 내지 약 45중량%, 약 0.2 내지 약 30중량%, 약 0.2 내지 약 20중량%, 약 0.2 내지 약 10중량%, 약 0.2 내지 약 5중량%, 약 0.2 내지 약 1중량%, 약 0.2 내지 약 0.8중량%, 약 0.4 내지 약 45중량%, 약 0.4 내지 약 30중량%, 약 0.4 내지 약 20중량%, 약 0.4 내지 약 10중량%, 약 0.4 내지 약 5중량%, 약 0.4 내지 약 1중량%, 약 0.4 내지 약 0.8중량%, 약 0.5 내지 약 1중량%, 약 0.5 내지 약 0.8중량%, 약 10 내지 약 45중량%, 약 10 내지 약 40중량%, 약 10 내지 약 35중량%, 약 10 내지 약 30중량%, 약 15 내지 약 40중량%, 약 15 내지 약 35중량%, 약 15 내지 약 30중량% 또는 약 15 내지 약 25중량%의 다이아실글리세롤 분획을 포함한다. 일부 양태에서, 미생물 오일은 약 0.1중량% 이상, 약 0.2중량% 이상, 약 0.5중량% 이상, 약 1중량% 이상, 약 2중량% 이상, 약 2.5중량% 이상 또는 약 3중량% 이상의 1,3-다이아실글리세롤 분획을 포함한다. 일부 양태에서, 미생물 오일은 약 0.3중량% 이상, 약 0.4중량% 이상, 약 0.5중량% 이상, 약 1중량% 이상, 약 1.5중량% 이상, 약 2중량% 이상 또는 약 5중량% 이상의 스테롤 분획을 포함한다.

일부 양태에서, 미생물 오일은 약 0.3 내지 약 5중량%, 약 0.3 내지 약 2중량%, 약 0.3 내지 약 1.5중량%, 약 0.5 내지 약 1.5중량%, 약 1 내지 약 1.5중량%, 약 0.5 내지 약 2중량%, 약 0.5 내지 약 5중량%, 약 1 내지 약 2중량% 또는 약 1 내지 약 5중량%의 스테롤 분획을 포함한다. 일부 양태에서, 미생물 오일은 약 5중량% 이하, 약 4중량% 이하, 약 3중량% 이하, 약 2중량% 이하, 약 1.5중량% 이하 또는 약 1중량% 이하의 스테롤 분획을 포함한다.

일부 양태에서, 미생물 분획은 약 2중량% 이상, 약 5중량% 이상 또는 약 8중량% 이상의 인지질 분획을 포함한다. 일부 양태에서, 미생물 오일은 약 2 내지 약 25중량%, 약 2 내지 약 20중량%, 약 2 내지 약 15중량%, 약 2 내지 약 10중량%, 약 5 내지 약 25중량%, 약 5 내지 약 20중량%, 약 5 내지 약 20중량%, 약 5 내지 약 10중량% 또는 약 7 내지 약 9중량%의 인지질 분획을 포함한다. 일부 양태에서, 미생물 오일은 약 20중량% 미만, 약 15중량% 미만, 약 10중량% 미만, 약 9중량% 미만, 약 8중량% 미만의 인지질 분획을 포함한다. 일부 양태에서, 미생물 오일은 인지질을 실질적으로 포함하지 않는다. 일부 양태에서, 미생물 오일은 오일중 약 2중량% 미만, 약 1.5중량% 미만, 약 1중량% 미만, 약 0.5중량% 미만의 불검화물(unsaponifiable)을 포함한다. 트라이아실글리세롤 분획 등의 미생물 오일에 존재하는 지질 등급은 플래쉬 크로마토그래피로 단리하고 박층 크로마토그래피(TLC)로 분석할 수 있거나, 당해 분야에 공지된 다른 방법으로 단리하고 분석할 수 있다.

일부 양태에서, 미생물 오일, 및/또는 트라이아실글리세롤 분획, 유리 지방산 분획, 스테롤 분획, 다이아실글리세롤 분획 및 이의 조합으로부터 선택된 하나 이상의 이의 분획은 약 5중량% 이상, 약 10중량% 이상, 약 10중량% 초과, 약 12중량% 이상, 약 13중량% 이상, 약 14중량% 이상, 약 15중량% 이상, 약 16중량% 이상, 약 17중량% 이상, 약 18중량% 이상, 약 19중량% 이상, 약 20중량% 이상, 약 25중량% 이상, 약 30중량% 이상, 약 35중량% 이상, 약 40중량% 이상 또는 약 45중량% 이상의 EPA를 포함한다. 일부 양태에서, 미생물 오일, 및/또는 트라이아실글리세롤 분획, 유리 지방산 분획, 스테롤 분획, 다이아실글리세롤 분획 및 이의 조합으로부터 선택된 하나 이상의 이의 분획은 약 5 내지 약 55중량%, 약 5 내지 약 50중량%, 약 5 내지 약 45중량%, 약 5 내지 약 40중량%, 약 5 내지 약 35중량%, 약 5 내지 약 30중량%, 약 10 내지 약 55중량%, 약 10 내지 약 50중량%, 약 10 내지 약 45중량%, 약 10 내지 약 40중량%, 약 10 내지 약 35중량%, 약 10 내지 약 30중량%, 적어도 약 12 내지 약 55중량%, 적어도 약 12 내지 약 50중량%, 적어도 약 12 내지 약 45중량%, 적어도 약 12 내지 약 40중량%, 적어도 약 12 내지 약 35중량%, 또는 적어도 약 12 내지 약 30중량%, 약 15 내지 약 55중량%, 약 15 내지 약 50중량%, 약 15 내지 약 45중량%, 약 15 내지 약 40중량%, 약 15 내지 약 35중량%, 약 15 내지 약 30중량%, 약 15 내지 약 25중량%, 약 15 내지 약 20중량%, 약 20 내지 약 55중량%, 약 20 내지 약 50중량%, 약 20 내지 약 45중량%, 약 20 내지 약 40중량% 또는 약 20 내지 약 30중량%의 EPA를 포함한다. 일부 양태에서, 미생물 오일, 및/또는 트라이아실글리세롤 분획, 다이아실글리세롤 분획, 스테롤 분획, 스테롤 에스터 분획, 유리 지방산 분획, 인지질 분획 및 이의 조합으로부터 선택된 하나 이상의 이의 분획은 약 5중량% 이상, 약 10중량% 이상, 약 15중량% 이상, 약 20중량% 이상, 약 25중량% 이상, 약 30중량% 이상, 약 35중량% 이상, 약 40중량% 이상, 약 50중량% 이상 또는 약 60중량% 이상의 DHA를 포함한다. 일부 양태에서, 미생물 오일, 및/또는 트라이아실글리세롤 분획, 다이아실글리세롤 분획, 스테롤 분획, 스테롤 에스터 분획, 유리 지방산 분획, 인지질 분획 및 이의 조합으로부터 선택된 하나 이상의 이의 분획은 약 5 내지 약 60중량%, 약 5 내지 약 55중량%, 약 5 내지 약 50중량%, 약 5 내지 약 40중량%, 약 10 내지 약 60중량%, 약 10 내지 약 50중량%, 약 10 내지 약 40중량%, 약 20 내지 약 60중량%, 약 25 내지 약 60중량%, 약 25 내지 약 50중량%, 약 25 내지 약 45중량%, 약 30 내지 약 50중량%, 약 35 내지 약 50중량% 또는 약 30 내지 약 40중량%의 DHA를 포함한다. 일부 양태에서, 미생물 오일, 및/또는 트라이아실글리세롤 분획, 다이아실글리세롤 분획, 스테롤 분획, 스테롤 에스터 분획, 유리 지방산 분획, 인지질 분획 및 이의 조합으로부터 선택된 하나 이상의 이의 분획은 약 10중량% 이하, 약 9중량% 이하, 약 8중량% 이하, 약 7중량% 이하, 약 6중량% 이하, 약 5중량% 이하, 약 4중량% 이하, 약 3중량% 이하, 약 2중량% 이하 또는 약 1중량% 이하의 DHA를 포함한다. 일부 양태에서, 미생물 오일, 및/또는 트라이아실글리세롤 분획, 다이아실글리세롤 분획, 스테롤 분획, 스테롤 에스터 분획, 유리 지방산 분획, 인지질 분획 및 이의 조합으로부터 선택된 하나 이상의 이의 분획은 약 1 내지 약 10중량%, 약 1 내지 약 5중량%, 약 2 내지 약 5중량%, 약 3 내지 약 5중량% 또는 약 3 내지 약 10중량%의 지방산으로서 DHA를 포함한다. 일부 양태에서, 미생물 오일, 및/또는 트라이아실글리세롤 분획, 다이아실글리세롤 분획, 스테롤 분획, 스테롤 에스터 분획, 유리 지방산 분획, 인지질 분획 및 이의 조합으로부터 선택된 하나 이상의 이의 분획은 DHA를 실질적으로 포함하지 않는다. 일부 양태에서, 미생물 오일, 및/또는 트라이아실글리세롤 분획, 다이아실글리세롤 분획, 스테롤 분획, 스테롤 에스터 분획, 유리 지방산 분획, 인지질 분획 및 이의 조합으로부터 선택된 하나 이상의 이의 분획은 약 0.1 내지 약 5중량%, 약 0.1 내지 약 5중량% 미만, 약 0.1 내지 약 4중량%, 약 0.1 내지 약 3중량%, 약 0.1 내지 약 2중량%, 약 0.2 내지 약 5중량%, 약 0.2 내지 약 5중량% 미만, 약 0.2 내지 약 4중량%, 약 0.2 내지 약 3중량%, 약 0.2 내지 약 2중량%, 약 0.3 내지 약 2중량%, 약 0.1 내지 약 0.5중량%, 약 0.2 내지 약 0.5중량%, 약 0.1 내지 약 0.4중량%, 약 0.2 내지 약 0.4중량%, 약 0.5 내지 약 2중량%, 약 1 내지 약 2중량%, 약 0.5 내지 약 1.5중량% 또는 약 1 내지 약 1.5중량%의 ARA를 포함한다. 일부 양태에서, 미생물 오일, 및/또는 트라이아실글리세롤 분획, 다이아실글리세롤 분획, 스테롤 분획, 스테롤 에스터 분획, 유리 지방산 분획, 인지질 분획 및 이의 조합으로부터 선택된 하나 이상의 이의 분획은 약 5중량% 이하, 약 5중량% 미만, 약 4중량% 이하, 약 3중량% 이하, 약 2중량% 이하, 약 1.5중량% 이하, 약 1중량% 이하, 약 0.5중량% 이하, 약 0.4중량% 이하, 약 0.3중량% 이하, 약 0.2중량% 이하 또는 약 0.1중량% 이하의 ARA를 포함한다. 일부 양태에서, 미생물 오일, 및/또는 트라이아실글리세롤 분획, 다이아실글리세롤 분획, 스테롤 분획, 스테롤 에스터 분획, 유리 지방산 분획, 인지질 분획 및 이의 조합으로부터 선택된 하나 이상의 이의 분획은 ARA를 실질적으로 포함하지 않는다. 일부 양태에서, 미생물 오일, 및/또는 트라이아실글리세롤 분획, 다이아실글리세롤 분획, 스테롤 분획, 스테롤 에스터 분획, 유리 지방산 분획, 인지질 분획 및 이의 조합으로부터 선택된 하나 이상의 이의 분획은 약 0.4 내지 약 2중량%, 약 0.4 내지 약 3중량%, 약 0.4 내지 약 4중량%, 약 0.4 내지 약 5중량%, 약 0.4 내지 약 5중량% 미만, 약 0.5 내지 약 1중량%, 약 0.5 내지 약 2중량%, 약 0.5 내지 약 3중량%, 약 0.5 내지 약 4중량%, 약 0.5 내지 약 5중량%, 약 0.5 내지 약 5중량% 미만, 약 1 내지 약 2중량%, 약 1 내지 약 3중량%, 약 1 내지 약 4중량%, 약 1 내지 약 5중량% 또는 약 1 내지 약 5중량% 미만의 DPA n-6을 포함한다. 일부 양태에서, 미생물 오일, 및/또는 트라이아실글리세롤 분획, 다이아실글리세롤 분획, 스테롤 분획, 스테롤 에스터 분획, 유리 지방산 분획, 인지질 분획 및 이의 조합으로부터 선택된 하나 이상의 이의 분획은 약 5중량%, 약 5중량% 미만, 약 4중량% 이하, 약 3중량% 이하, 약 2중량% 이하, 약 1중량% 이하, 약 0.75중량% 이하, 약 0.6중량% 이하 또는 약 0.5중량% 이하의 DPA n-6을 포함한다. 일부 양태에서, 미생물 오일, 및/또는 트라이아실글리세롤 분획, 다이아실글리세롤 분획, 스테롤 분획, 스테롤 에스터 분획, 유리 지방산 분획, 인지질 분획 및 이의 조합으로부터 선택된 하나 이상의 이의 분획은 DPA n-6을 실질적으로 포함하지 않는다. 일부 양태에서, 미생물 오일, 및/또는 트라이아실글리세롤 분획, 다이아실글리세롤 분획, 스테롤 분획, 스테롤 에스터 분획, 유리 지방산 분획, 인지질 분획 및 이의 조합으로부터 선택된 하나 이상의 이의 분획은 약 5중량% 이하, 약 5중량% 미만, 약 4중량% 이하, 약 3중량% 이하 또는 약 2중량% 이하의 올레산(18:1 n-9), 리놀레산(18:2 n-6), 리놀렌산(18:3 n-3), 에이코센산(20:1 n-9), 에루크산(22:1 n-9), 스테아리돈산(18:4 n-3) 또는 이의 조합을 갖는 지방산을 포함한다.

트라이아실글리세롤 분자는 3개의 중심 탄소 원자(C(sn-1)H₂R1-(sn-2)H₂R2-C(sn-3)H₂R3)를 함유함으로써 상이한 위치 이성질체의 형성을 허용한다. 일부 양태에서, 미생물 오일은 트라이아실글리세롤 분획을 포함하고, 이때 트라이아실글리세롤 분획중 트라이아실글리세롤의 약 2% 이상, 약 3% 이상, 약 5% 이상, 약 10% 이상, 약 15% 이상, 약 20% 이상, 약 30% 이상, 약 35% 이상 또는 약 40% 이상은 HPLC 크로마토그래피상의 피크의 상대적인 면적 백분율을 기초로 하여, sn-1, sn-2 또는 sn-3 위치중의 어느 2개로부터 선택된 트라이아실글리세롤내 2개 위치(이치환된 DHA)에서 DHA를 함유한다. 일부 양태에서, 미생물 오일은 트라이아실글리세롤 분획을 포함하고, 이때 트라이아실글리세롤 분획중 트라이아실글리세롤의 약 2% 내지 약 55%, 약 2% 내지 약 50%, 약 2% 내지 약 45%, 약 2% 내지 약 40%, 약 2% 내지 약 35%, 약 2% 내지 약 30%, 약 2% 내지 약 25%, 약 5% 내지 약 55%, 약 5% 내지 약 50%, 약 5% 내지 약 45%, 약 5% 내지 약 40%, 약 5% 내지 약 35%, 약 5% 내지 약 30%, 약 5% 내지 약 25%, 약 10% 내지 약 55%, 약 10% 내지 약 50%, 약 10% 내지 약 45%, 약 10% 내지 약 40%, 약 10% 내지 약 35%, 약 10% 내지 약 30%, 약 10% 내지 약 25%, 약 10% 내지 약 20%, 약 20% 내지 약 40%, 약 20% 내지 약 35% 또는 약 20% 내지 약 25%는 HPLC 크로마토그래피상의 피크의 상대적인 면적 백분율을 기초로 하여, sn-1, sn-2 또는 sn-3 위치중의 어느 2개로부터 선택된 트라이아실글리세롤내 2개 위치에서 EPA를 함유한다. 일부 양태에서, 미생물 오일은 트라이아실글리세롤 분획을 포함하고, 이때 트라이아실글리세롤 분획중 트라이아실글리세롤의 약 0.5% 이상, 약 1% 이상, 약 1.5% 이상 또는 약 2% 이상은 HPLC 크로마토그래피상의 피크의 상대적인 면적 백분율을 기초로 하여, sn-1, sn-2 및 sn-3 위치 모두(삼치환된 DHA)에서 DHA를 함유한다. 일부 양태에서, 미생물 오일은 트라이아실글리세롤 분획을 포함하고, 이때 트라이아실글리세롤 분획중 트라이아실글리세롤의 약 0.5 내지 약 5%, 약 0.5 내지 약 3%, 약 0.5% 내지 약 2.5%, 약 0.5% 내지 약 2%, 약 1% 내지 약 5%, 약 1% 내지 약 3% 또는 1% 내지 약 2%는 HPLC 크로마토그래피상의 피크의 상대적인 면적 백분율을 기초로 하여, sn-1, sn-2 및 sn-3 위치 모두에서 DHA를 함유한다. 일부 양태에서, 미생물 오일은 트라이아실글리세롤 분획을 포함하고, 이때 트라이아실글리세롤 분획중 트라이아실글리세롤의 약 10% 이상, 약 15% 이상, 약 20% 이상, 약 25% 이상, 약 30% 이상, 약 35% 이상, 약 40% 이상, 약 45% 이상, 약 50% 이상, 약 55% 이상 또는 약 60% 이상은 HPLC 크로마토그래피상의 피크의 상대적인 면적 백분율을 기초로 하여, sn-1, sn-2 및 sn-3 위치중 어느 하나로부터 선택된 트라이아실글리세롤내 하나의 위치에서 DHA를 포함한다. 일부 양태에서, 미생물 오일은 트라이아실글리세롤 분획을 포함하고, 이때 트라이아실글리세롤 분획중 트라이아실글리세롤의 약 10% 내지 약 80%, 약 10% 내지 약 70%, 약 10% 내지 약 60%, 약 15 내지 약 80%, 약 15% 내지 약 75%, 약 15% 내지 약 70%, 약 15% 내지 약 65%, 약 15% 내지 약 60%, 약 35% 내지 약 80%, 약 35% 내지 약 75%, 약 35% 내지 약 65%, 약 35% 내지 약 60%, 약 40% 내지 약 80%, 약 40% 내지 약 75%, 약 40% 내지 약 70%, 약 40% 내지 약 65%, 약 40% 내지 약 60% 또는 약 40% 내지 약 55%는 HPLC 크로마토그래피상의 피크의 상대적인 면적 백분율을 기초로 하여, sn-1, sn-2 및 sn-3 위치중 어느 하나로부터 선택된 트라이아실글리세롤내 하나의 위치에서 DHA를 포함한다.

일부 양태에서, 미생물 오일은 지방산을 포함하고, 이때 지방산은 오메가-3 다중불포화 지방산을 추가로 포함하고, 오메가-3 다중불포화 지방산은 DHA 및 EPA를 오메가-3 다중불포화 지방산의 총량의 약 90중량% 이상의 양으로 포함하고, EPA의 양은 DHA 및 EPA의 총량의 약 28 내지 약 36중량%이고, DHA의 양은 DHA 및 EPA의 총량의 약 54 내지 약 62중량%이다.

다른 양태에서, 미생물 오일은 DHA 및 EPA를 오메가-3 다중불포화 지방산의 총량의 약 90중량% 이상의 양으로 포함하는 오메가-3 다중불포화 지방산을 포함하고, 이때 EPA의 양은 DHA 및 EPA의 총량의 약 19 내지 약 55중량%이고, DHA의 양은 DHA 및 EPA의 총량의 약 35 내지 약 71중량%이다.

다른 양태에서, 미생물 오일은 DHA 및 EPA를 오메가-3 다중불포화 지방산의 총량의 약 90중량% 이상의 양으로 포함하는 오메가-3 다중불포화 지방산을 포함하고, 이때 EPA의 양은 DHA 및 EPA의 총량의 약 19 내지 약 43중량%이고, DHA의 양은 DHA 및 EPA의 총량의 약 35 내지 약 47중량%이다.

추가 양태에서, 미생물 오일은 DHA 및 EPA를 오메가-3 다중불포화 지방산의 총량의 약 90중량% 이상의 양으로 포함하는 오메가-3 다중불포화 지방산을 포함하고, EPA의 양은 DHA 및 EPA의 총량의 약 27 내지 약 54중량%이고, DHA의 양은 DHA 및 EPA의 총량의 약 36 내지 약 63중량%이다.

다른 추가 양태에서, 미생물 오일은 DHA 및 EPA를 오메가-3 다중불포화 지방산의 총량의 약 90중량% 이상의 양으로 포함하는 오메가-3 다중불포화 지방산을 포함하고, 이때 EPA의 양은 DHA 및 EPA의 총량의 약 26 내지 약 38중량%이고, DHA의 양은 DHA 및 EPA의 총량의 약 52 내지 약 64중량%이다.

또 다른 양태에서, 미생물 오일은 DHA 및 EPA를 오메가-3 다중불포화 지방산의 총량의 약 90중량% 이상의 양으로, DPA n-3을 오메가-3 다중불포화 지방산의 총량의 약 0 내지 약 10중량%의 양으로 포함하는 오메가-3 다중불포화 지방산을 포함하고, 이때 EPA의 양은 DHA 및 EPA의 총량의 약 19 내지 약 55중량%이고, DHA의 양은 DHA 및 EPA의 총량의 약 35 내지 약 71중량%이다.

다른 추가 양태에서, 미생물 오일은 DHA 및 EPA를 오메가-3 다중불포화 지방산의 총량의 약 90중량% 이상의 양으로, DPA n-3을 오메가-3 다중불포화 지방산의 총량의 약 0 내지 약 10중량%의 양으로 포함하는 오메가-3 다중불포화 지방산을 포함하고, 이때 EPA의 양은 DHA 및 EPA의 총량의 약 19 내지 약 43중량%이고, DHA의 양은 DHA 및 EPA의 총량의 약 35 내지 약 47중량%이다.

또 다른 추가 양태에서, 미생물 오일은 DHA 및 EPA를 오메가-3 다중불포화 지방산의 총량의 약 90중량% 이상의 양으로, DPA n-3을 오메가-3 다중불포화 지방산의 총량의 약 0 내지 약 10중량%의 양으로 포함하는 오메가-3 다중불포화 지방산을 포함하고, 이때 EPA의 양은 DHA 및 EPA의 총량의 약 27% 내지 약 54%이고, DHA의 양은 DHA 및 EPA의 총량의 약 36% 내지 약 63%이다.

다른 양태에서, 미생물 오일은 DHA 및 EPA를 오메가-3 다중불포화 지방산의 총량의 약 90중량% 이상의 양으로, DPA n-3을 오메가-3 다중불포화 지방산의 총량의 약 0 내지 약 10중량%의 양으로 포함하는 오메가-3 다중불포화 지방산을 포함하고, 이때 EPA의 양은 DHA 및 EPA의 총량의 약 26 내지 약 38중량%이고, DHA의 양은 DHA 및 EPA의 총량의 약 52 내지 약 64중량%이다.

다른 양태에서, 미생물 오일은 DHA 및 EPA를 오메가-3 다중불포화 지방산의 총량의 약 90중량% 이상의 양으로, DPA n-3을 오메가-3 다중불포화 지방산의 총량의 약 0 내지 약 10중량%의 양으로 포함하는 오메가-3 다중불포화 지방산을 포함하고, 이때 EPA의 양은 DHA 및 EPA의 총량의 약 28 내지 약 36중량%이고, DHA의 양은 DHA 및 EPA의 총량의 약 54 내지 약 62중량%이다.

또 다른 양태에서, 미생물 오일은 DHA 및 EPA를 오메가-3 다중불포화 지방산의 총량의 약 90중량% 이상의 양으로, DPA n-3을 오메가-3 다중불포화 지방산의 총량의 약 0 내지 약 2중량%의 양으로 포함하는 오메가-3 다중불포화 지방산을 포함하고, 이때 EPA의 양은 DHA 및 EPA의 총량의 약 10 내지 약 25중량%이고, DHA의 양은 DHA 및 EPA의 총량의 약 75% 내지 약 90중량%이다.

일부 양태에서, 미생물 오일중 오메가-3 다중불포화 지방산의 총량은 오일 1g 당 약 400mg 이상이다.

다른 양태에서, 미생물 오일중 오메가-3 다중불포화 지방산의 총량은 오일 1g 당 약 500mg 이상이다.

다른 추가 양태에서, 미생물 오일중 오메가-3 다중불포화 지방산의 총량은 오일 1g 당 약 400 내지 약 750mg이다.

일부 양태에서, 미생물 오일은 오일 1g 당 약 120 내지 약 220mg의 EPA 및 오일 1g 당 약 240 내지 약 450mg의 DHA를 포함한다.

일부 양태에서, 미생물 오일은 오일 1g 당 약 120 내지 약 220mg의 EPA 및 오일 1g 당 약 240 내지 약 450mg의 DHA를 포함한다.

다른 양태에서, 미생물 오일은 오일 1g 당 약 130 내지 약 195mg의 EPA 및 오일 1g 당 약 320 내지 약 480mg의 DHA를 포함한다.

추가 양태에서, 미생물 오일은 오일 1g 당 약 150 내지 약 300mg의 EPA; 오일 1g 당 약 200 내지 약 400mg의 DHA; 및 오일 1g 당 약 0 내지 약 55mg의 DPA n-3을 포함한다.

다른 추가 양태에서, 미생물 오일은 오일 1g 당 약 50 내지 약 150mg의 EPA; 오일 1g 당 약 410 내지 약 540mg의 DHA; 및 오일 1g 당 약 0 내지 약 12mg의 DPA n-3을 포함한다.

일부 양태에서, 미생물 오일은 오메가-3 다중불포화 지방산의 총 중량을 기준으로 1:1 내지 1:30 또는 1:1 내지 1:3의 EPA:DHA의 비를 포함한다.

일부 양태에서, 미생물 오일은 오메가-3 다중불포화 지방산의 총 중량을 기준으로 1:1 내지 1:2.5의 EPA:DHA의 비를 포함한다.

다른 양태에서, 미생물 오일은 오메가-3 다중불포화 지방산의 총 중량을 기준으로 1:4 내지 1:7의 EPA:DHA의 비를 포함한다.

일부 양태에서, 미생물 오일은 오메가-3 다중불포화 지방산의 총 중량을 기준으로 1:1 이상, 1:1.5 이상, 1:2 이상, 1:2.5 이상, 1:3 이상 또는 1:4 이상의 EPA:DHA의 비를 포함한다. 유용한 범위는 임의의 상기 값, 예를 들어 오메가-3 다중불포화 지방산의 총 중량을 기준으로 1:1 내지 1:1.5, 1:1 내지 1:2, 1:1.5 내지 1:2, 1:1 내지 1:2.5, 1:2 내지 1:2.5 및 1:4 내지 1:7의 EPA:DHA의 비에서 선택될 수 있다.

다른 추가 양태에서, 미생물 오일은 쉬조키트리움 종에 의해 생산된다.

본 발명은 또한 본 발명의 미생물, 본 발명의 단리된 바이오매스, 본 발명의 미생물 오일 또는 이의 조합을 포함하는 조성물에 관한 것이다.

본 발명의 미생물, 바이오매스 또는 미생물 오일은 또한 임의의 공지된 기술에 의해서 조성물의 요건을 기초로 하여 화학적으로 또는 물리적으로 개질되거나 가공될 수 있다.

미생물 세포 또는 바이오매스는, 비제한적으로, 냉동 건조, 공기 건조, 분무 건조, 터널 건조(tunnel drying), 진공 건조(동결 건조: lyophilization) 또는 유사한 공정을 포함하는 방법에 의해 조성물에서 사용하기 전에 건조될 수 있다. 다르게는, 수거하거나 세척한 바이오매스는 건조하지 않고 조성물에 직접 사용할 수 있다(전체내용이 본원에 참고로서 혼입되는 미국 특허 제5,130,242호 및 제6,812,009호 참고).

본 발명의 미생물 오일은 EPA 등의 지방산내에 강화된 생성물을 더 효율적으로 생산하기 위한 출발 물질로서 사용될 수 있다. 예를 들면, 본 발명의 미생물 오일은 증류 또는 우레아 첨가와 같은, 당해 분야에 공지된 각종 정제 기술에 적용시켜 보다 높은 농도의 EPA 또는 다른 지방산을 갖는 보다 높은 효능의 생성물을 생산할 수 있다. 본 발명의 미생물 오일은 또한 EPA 또는 다른 지방산의 에스터 및 염과 같이 오일내 지방산으로부터 기원한 화합물을 생산하기 위한 화학 반응에 사용될 수 있다.

본 발명의 조성물은 하나 이상의 부형제를 포함할 수 있다. 본원에 사용된 바와 같이, "부형제"는 식품 및 약제, 화장품 및 산업용 조성물을 비롯한 조성물에 바람직한 특성을 제공하기 위해 본 발명의 조성물에 사용된 성분의 혼합물을 지칭한다. 본 발명의 부형제는 약학 조성물에 첨가되는 경우에 "약학적으로 허용되는" 부형제로 기재될 수 있으며, 이는, 온전한 의학적 판단 영역내에서, 부형제가 이상적인 이익/위험 비에 적합한 바람직한 접촉 기간에 걸쳐 과도한 독성, 자극, 알러지 반응 또는 다른 문제가 많은 합병증 없이 인간 및 비인간 동물의 조직과 접촉하기에 적합한 화합물, 물질, 조성물, 염 및/또는 투여 형태임을 의미한다. 일부 양태에서, 용어 "약학적으로 허용되는"은 동물 및 보다 특히 인간에서 사용하기 위한 미국 약전 또는 다른 일반적으로 인지된 국제 약전에 수록되거나 미국 연방 또는 주 정부의 감독 기관에 의해 승인됨을 의미한다. 각종 부형제가 사용될 수 있다. 일부 양태에서, 부형제는, 비제한적으로, 알칼리제, 안정화제, 산화방지제, 부착제, 분리제, 피복제, 외부 상 성분, 방출 조절 성분, 용매, 계면활성제, 습윤제, 완충제, 충전제, 진정제 또는 이의 조합일 수 있다. 본원에 기술된 것 외의 부형제는, 비제한적으로, 문헌[Remington: The Science and Practice of Pharmacy, 21^st ed. (2005)]에 수록되어 있다. 본원의 특정 등급의 부형제(예를 들면, "용매")의 포함은 부형제의 역할을 제한하는 것이 아니라 설명하는 것으로 의도된다. 특정 부형제는 다중 등급내에 속할 수 있다.

본 발명의 조성물은, 비제한적으로, 식료품, 약학 조성물, 화장품 및 산업용 조성물을 포함한다.

일부 양태에서, 조성물은 식료품이다. 식료품은 비인간 동물 또는 인간 소비용의 임의의 식품이며, 고체 및 액체 조성물 둘다를 포함한다. 식료품은 동물 또는 인간 식품에 대한 첨가제일 수 있다. 식료품은, 비제한적으로, 일반적인 식품; 우유, 음료, 치료학적 음료 및 영양 음료를 비롯한 액체 제품; 기능성 식품; 보충물; 기능 식품; 조산아용 분유를 비롯한 영아용 조제식; 임신 또는 수유모용 식품; 성인용 식품; 노인용 식품; 및 동물 식품을 포함한다.

일부 양태에서, 본 발명의 미생물, 바이오매스 또는 미생물 오일은 직접 사용되거나 오일, 쇼트닝(shortening), 스프레드(spread), 다른 지방 성분, 음료, 소스, 낙농 또는 대두 식품(예를 들면, 우유, 요구르트, 치즈 및 아이스크림), 제과 제빵류, 영양 제품, 예를 들면, 영양 보충물(캡슐 또는 정제형)로서, 비타민 보충물, 식이 보충물, 분말 음료, 가공 또는 반-가공 분말 식료품중 하나 이상에 첨가제로서 포함될 수 있다. 일부 양태에서, 영양 보충물은 동물 공급원으로부터 형성되지 않고 동물 공급원으로부터의 어떠한 성분도 함유하지 않는 채식주의자 캡슐 형태이다.

본 발명의 미생물 오일을 포함할 수 있는 식품 조성물의 일부 목록은, 비제한적으로, 대두계 제품(우유, 아이스크림, 요구르트, 음료, 크림, 스프레드, 분말 크림(whitener); 수프 및 수프 혼합물; 도우(dough), 배터(batter) 및, 예를 들면, 제빵 제품(bakery ware), 아침식사용 시리얼, 케익, 치즈케익, 파이, 컵케익, 쿠키, 바(bar), 빵, 롤, 비스킷, 머핀, 페스트리, 스콘(scone), 크루톤(crouton), 크래커, 감미 제품, 스낵 케익, 파이, 그래놀라(granola)/스낵 바 및 토스터 페스트리를 비롯한 제과 제빵류 품목; 사탕; 단단한 과자류; 초콜렛 및 다른 과자류; 츄잉검; 액체 식료품, 예를 들면, 우유, 열량 음료, 영아용 조제식, 탄산음료, 차, 액상 식사(liquid meal), 과일 쥬스, 과일계 음료, 야채계 음료; 다중비타민 시럽, 식사 대용품, 의료용 식품 및 시럽; 분말 음료 혼합물; 파스타; 가공된 어류 제품; 가공된 고기 제품; 가공된 가금류 제품; 그래비(gravy) 및 소스; 조미료(케찹, 마요네스 등); 야채 오일계 스프레드; 유제품; 요구르트; 버터; 냉동 유제품; 아이스크림; 냉동 디저트; 냉동 요구르트; 유아 식품 등의 반고체 식료품; 푸딩 및 젤라틴 디저트; 가공 및 비가공 치즈; 팬케익 믹스; 열량 바를 비롯한 식품 바; 와플 믹스; 샐러드 드레싱; 대체란 믹스(replacement egg mix); 견과 및 견과계 스프레드; 감자칩 및 기타 칩 또는 크리스프(crisp), 옥수수 칩, 토틸라 칩(tortilla chip), 압출된 스낵, 팝콘, 프레첼(pretzel), 감자 크리스프 및 견과 등의 소금가미 스낵; 딥(dip), 건조 과일 스낵, 고기 스낵, 돼지껍질 스낵(pork rind), 건강 식품 바 및 쌀/옥수수 케익 등의 특수 스낵을 포함한다.

일부 양태에서, 본 발명의 미생물 오일은 영아용 조제식을 보충하는데 사용될 수 있다. 영아용 조제식은 본 발명의 미생물 오일을 단독으로 또는 아라키돈산(ARA)-생산 미생물로부터 기원한 물리적으로 정제된 오일과 함께 보충시킬 수 있다. ARA-생산 미생물은, 예를 들면, 모르티에렐라 알피나(Mortierella alpina) 또는 모르티에렐라 종파 슈무크케리(Mortierella sect. schmuckeri)이다. 다르게는, 영아용 조제식은 본 발명의 미생물 오일을, 아라스코(ARASCO: 등록상표)(마르텍 바이오사이언시스(Martek Biosciences), 미국 미들랜드주 콜롬비아)를 비롯한 ARA가 풍부한 오일과 함께 보충할 수 있다.

일부 양태에서, 조성물은 동물 사료이다. "동물"은 동물계에 속하는 비인간 유기체를 의미하며, 비제한적으로, 수생 동물 및 육상 동물을 포함한다. 용어 "동물 사료" 또는 "동물 식품"은, 어류; 시판 어류; 관상 어류; 어류 유충; 쌍각류; 연체동물; 갑각류; 패류; 새우; 새우 유충; 아르테미아(artemia); 담륜충(rotifer); 브라인 새우(brine shrimp); 여과 섭식동물; 양서류; 파충류; 포유류; 사육 동물; 농장 동물; 동물원 동물; 스포츠 동물; 종계(breeding stock); 경주용 동물; 쇼 동물(show animal); 보존 동물(heirloom animal); 희귀 동물 또는 멸종위기 동물; 애완동물, 예를 들면, 개, 고양이, 기니아 피크, 토끼, 래트, 마우스 또는 말; 원숭이(예를 들면, 세부스(cebus), 레서스(rhesus), 아프리카 녹색(African green), 파타스(patas), 시노몰구스(cynomolgus) 및 세르코피테쿠스(cercopithecus)), 유인원, 오랑우탄, 개코원숭이, 긴팔원숭이 및 침팬지 등의 영장류; 개 및 늑대 등의 개과 동물; 고양이, 사자 및 호랑이 등의 고양이과; 말, 당나귀 및 얼룩말 등의 말과; 암소, 소, 돼지 및 양 등의 식용 동물; 사슴 및 기린 등의 유제류; 마우스, 래트, 햄스터 및 기니아 피그 등의 설치류 등에 상관 없이, 비인간 동물에 의도된 임의의 식품을 말한다. 동물 식품은, 비제한적으로, 양식 사료, 애완동물 사료, 동물원 동물 사료, 노동 동물 사료, 가축 동물 사료 또는 이의 조합을 포함하는 사육 동물 사료를 포함한다.

일부 양태에서, 조성물은, 이의 고기 또는 생산물이 인간에 의해 소비되는 임의의 동물, 예를 들면, 고기, 알 또는 우유가 이로부터 인간 소비용으로 유래되는 임의의 동물용 사료 또는 사료 보충물이다. 이러한 동물에게 공급되는 경우, LC-PUFA 등의 영양분이 고기, 우유, 알 또는 이러한 동물의 다른 생산물에 혼입되어 이들 영양분들의 함량을 증가시킬 수 있다.

일부 양태에서, 조성물은 동물성 플랑크톤, 아르테미아, 담륜충, 및 여과 섭식 동물에 의한 소비용으로 적합한 크기의 입자를 형성하기 위해 부서질 수 있는 분무-건조시킨 물질이다. 일부 양태에서, 조성물에 의해 공급된 동물성 플랑크톤, 아르테미아 또는 담륜충은 순차로 어류 유충, 어류, 조개류, 쌍각류 또는 갑각류에게 공급된다.

일부 양태에서, 조성물은 약학 조성물이다. 적합한 약학 조성물은, 비제한적으로, 항염 조성물, 관상동맥심질환의 치료용 약물, 동맥경화증의 치료용 약물, 화학치료제, 활성 부형제, 골다공증 약물, 항우울증제, 항경련제, 항헬리코박터 필로리 약물, 신경변성 질환의 치료용 약물, 변성 간 질환의 치료용 약물, 항생제, 콜레스테롤 저하 조성물 및 트라이아실글리세롤 저하 조성물을 포함한다. 일부 양태에서, 조성물은 의학 식품이다. 의학 식품은 주치의의 감독하에 외부적으로 소모되거나 투여되는 조성물로 존재하고 인지된 과학 원리를 기초로 하여, 명백한 영양 요건이 의학적 평가에 의해 확립되는 조건의 특수한 식이 조절을 위해 의도된 식품을 포함한다.

일부 양태에서, 미생물 오일은 투약 형태로 제형화될 수 있다. 투약 형태는, 비제한적으로, 효과량의 미생물 오일을 포함하는, 비제한적으로 액제, 현탁제, 유제 및 건조 분말을 포함하는, 비제한적으로 정제, 캡슐제, 카세제(cachet), 펠렛, 환제, 산제 및 과립제 및 비경구적 투약 형태를 포함할 수 있다. 이러한 제형이 또한 약학적으로 허용되는 희석제, 충전제, 붕해제, 결합제, 윤활제, 계면활성제, 소수성 비히클, 수용성 비히클, 유화제, 완충제, 습윤제, 습윤화제, 가용화제, 방부제 등을 함유할 수 있음은 당해 분야에 또한 공지되어 있다. 투여 형태는, 비제한적으로, 미생물 오일 및 하나 이상의 적합한 약학적으로 허용되는 담체를 함유하는 정제, 당의제(dragee), 캡슐제, 카플렛(caplet) 및 환제를 포함할 수 있다. 경구 투여를 위해, 미생물 오일은 당해 분야에 공지된 약학적으로 허용되는 담체와 혼합할 수 있다. 이러한 담체는, 치료할 대상체가 경구 섭취하기 위해 본 발명의 미생물 오일이 정제, 환제, 당의제, 캡슐제, 액제, 겔제, 시럽제, 슬러리제, 현탁제 등으로서 제형화되도록 할 수 있다. 일부 양태에서, 투약 형태는 정제, 환제 또는 카플렛이다. 경구용의 약학 제제는 고체 부형제를 가하고, 수득되는 혼합물을 선택적으로 분쇄하고, 경우에 따라, 적합한 보조제를 첨가한 후, 과립의 혼합물을 가공하여 정제 또는 당의제 코어를 수득함으로써 수득할 수 있다. 적합한 부형제는, 비제한적으로, 락토스, 수크로스, 만니톨 및 소르비톨을 비롯한 당류 등의 충전제; 비제한적으로, 옥수수 전분, 밀 전분, 쌀 전분, 감자 전분, 젤라틴, 검 트라가칸트, 메틸 셀룰로스, 하이드록시프로필메틸 셀룰로스, 나트륨 카복시메틸 셀룰로스 및 폴리비닐피롤리돈(PVP) 등의 셀룰로스 제제를 포함한다. 필요에 따라, 비제한적으로, 가교결합된 폴리비닐 피롤리돈, 아가(agar), 또는 알긴산 또는 나트륨 알긴에이트 등의 이의 염과 같은 붕해제를 가할 수 있다. 경구적으로 사용될 수 있는 약학 제제는, 비제한적으로, 젤라틴으로 제조된 푸쉬-핏 캡슐(push-fit capsule), 및 또한 젤라틴 및 글리세롤 또는 소르비톨 등의 가소제로 제조된 연질의 밀봉된 젤라틴 캡슐을 포함한다. 일부 양태에서, 투약 형태는 채식주의자 투약 형태이고, 이때 투여 형태는 동물 공급원으로부터 형성되지 않고 동물 공급원으로부터의 어떠한 성분도 함유하지 않는다. 일부 양태에서, 채식주의자 투약 형태는 채식주의자 캡슐이다.

일부 양태에서, 경구 투약 형태는 개질된 옥수수 전분, 카라기난, 글리세린, 소르비톨, 정제수, 베타-카로틴 및 카라멜 분말을 포함하는 식물성 겔 캡슐이다.

일부 양태에서, 경구 투약 형태는 오일 1g 당 약 100mg, 약 200mg, 약 300mg, 약 400mg, 약 500mg, 약 550mg 또는 약 600mg의 DHA 및 EPA 함량으로 이루어진 오일에 의해 제형화된다.

일부 양태에서, 경구 투약 형태는 오일 1g 당 약 300 내지 약 700mg의 DHA 및 EPA 함량으로 이루어진 오일에 의해 제형화된다.

추가 양태에서, 경구 투약 형태는 오일 1g 당 약 360 내지 약 670mg의 DHA 및 EPA 함량으로 이루어진 오일에 의해 제형화된다.

일부 양태에서, 겔 캡슐은 오일 1g 당 약 100mg, 약 200mg, 약 300mg 약 400mg, 약 500mg, 약 550mg 또는 약 600mg의 총량의 DHA 및 EPA의 함량으로 이루어진 오일에 의해 제형화될 수 있다.

일부 양태에서, 겔 캡슐은 오일 1g 당 약 300 내지 약 700mg의 DHA 및 EPA 함량으로 이루어진 오일에 의해 제형화될 수 있다.

추가 양태에서, 겔 캡슐은 오일 1g 당 약 360 내지 약 670mg의 DHA 및 EPA 함량으로 이루어진 오일에 의해 제형화될 수 있다.

다른 추가 양태에서, DHA 및 EPA의 총량은 오일 1g 당 약 400mg 이상이다.

또 다른 추가 양태에서, 오메가-3 다중불포화 지방산의 총량은 오일 1g 당 약 400mg 이상이다.

다른 추가 양태에서, DHA 및 EPA의 총량은 오일 1g 당 약 400mg이다.

다른 추가 양태에서, DHA 및 EPA의 총량은 오일 1g 당 약 500mg 이상이다.

다른 추가 양태에서, 오메가-3 다중불포화 지방산의 총량은 오일 1g 당 약 500mg 이상이다.

다른 양태에서, DHA 및 EPA의 총량은 오일 1g 당 약 500mg이다.

일부 양태에서, 조성물은 화장품이다. 화장품은, 비제한적으로, 유제, 크림제, 로션제, 차폐제, 비누, 샴푸, 세척액, 화장 크림(facial cream), 컨디셔너(conditioner), 메이크업(make-up), 목욕 제제, 및 분산 액체를 포함한다. 화장 제제는 의약이거나 의약이 아닐 수 있다.

일부 양태에서, 조성물은 산업용 조성물이다. 일부 양태에서, 조성물은 하나 이상의 제제(manufacture)용 출발 물질이다. 제제는, 비제한적으로, 중합체; 사진 감광성 물질; 세제; 산업용 오일; 또는 산업용 세제를 포함한다. 예를 들면, 미국 특허 제7,259,006호는 베헨산의 생산 및 베헨산을 사용한 사진 민감성 물질의 생산을 위한 DHA-함유 지방 및 오일의 용도를 기술하고 있다.

일부 양태에서, 조성물은 인간 또는 비인간 동물에서의 증상 치료에 사용될 수 있다. 일부 양태에서, 조성물은 인간 또는 비인간 동물에서 영양섭취(nutrition)에 사용될 수 있다.

용어 "치료하다" 및 "치료"는 치료학적 처치 및 예방학적 또는 예방적 조치(measure) 둘다를 지칭하고, 이때 이의 목적은 바람직하지 않는 생리학적 증상, 질병 또는 질환을 방지하거나 서서히 강하(경감)시키거나, 유리하거나 바람직한 임상 결과를 수득하기 위한 것이다. 본 발명의 목적을 위해, 유리하거나 바람직한 임상 결과는, 비제한적으로, 증상, 질병 또는 질환과 관련된 징후 또는 전조의 경감 또는 완화; 증상, 질병 또는 질환의 정도의 감소; 증상, 질병 또는 질환의 안정화(즉, 증상, 질병 또는 질환이 악화되지 않는 경우); 증상, 질병 또는 질환의 발병 또는 진행의 지연; 증상, 질병 또는 질환의 개량; 증상, 질병 또는 질환의 완화(부분적이거나 전체적인 것에 상관 없이 및 검출가능하거나 검출가능하지 않는 것에 상관 없이); 또는 증상, 질병 또는 질환의 향상 또는 개선을 포함한다. 치료는 과도한 부작용 없이 임상적으로 유의한 반응을 유도하는 것을 포함한다. 치료는 또한 치료를 받지 않는 경우의 예측 수명과 비교하여 연장된 생존을 포함한다.

일부 양태에서, 조성물은 여드름, 급성 염증, 나이 관련 황반병, 알러지, 알츠하이머병, 관절염, 천식, 죽상경화증, 자가면역 질환, 혈중 지질 질환, 유방 낭종, 악액질, 암, 심장 재협착, 심혈관병, 만성 염증, 관상심질환, 낭성섬유증, 간의 변성 질환, 당뇨병, 습진, 위장 질환, 심장병, 고 트라이아실글리세롤 수준, 고혈압, 과다활동, 면역질환, 억제성 종양 성장, 염증 증상, 장 질환, 신장 기능장애, 백혈병, 주요 우울증, 다발성 경화증, 신경변성 질환, 골관절염, 골다공증, 페르옥시솜병(peroxisomal disorder), 자간전증, 조기분만, 건선, 폐질환, 류마티스 관절염, 심장병의 위험 또는 혈전증 등의 증상, 질병 또는 질환을 치료하는데 사용된다.

일부 양태에서, 본 발명의 조성물을 사용하여 임신 3개월(trimester)에서 임신 기간을 증가시킨다.

일부 양태에서, 조성물은 혈압을 조절하는데 사용된다.

일부 양태에서, 조성물은 인지 기능을 개선시키거나 유지하는데 사용된다.

일부 양태에서, 조성물은 기억을 개선시키거나 유지하는데 사용된다.

일부 양태에서, 조성물은 건강한 심장을 유지하는데 사용된다.

조성물 또는 투약 형태는 대상체의 신체내에 조성물 또는 투약 형태와 혼화성인 임의의 경로에 의해 투여할 수 있다. 물질이 대상체에 의해 대상체의 신체내로 도입되는 경우, 또는 다른 인간, 기계 또는 장치가 물질을 대상체의 신체내로 도입하는 경우에 당해 물질은 "투여"되는 것으로 고려된다. 따라서, "투여하는"은, 예를 들면, 자가-투여, 다른 것에 의한 투여 및 간접 투여를 포함한다. "투여"와 관련하여 본원에 사용된 용어 "연속" 또는 "연이은"은, 투여 횟수가 매일 1회 이상임을 의미한다. 그러나, 투여 횟수는 매일 1회보다 많을 수 있으며, 여전히 "연속" 또는 "연이은", 예를 들면, 본원에 규정된 투약 수준을 초과하지 않는 한, 매일 2회 또는 심지어 3회일 수 있다. 투여 수단 및 방법은 당해 분야에 공지되어 있으며, 숙련가들은 각종 안내용 약리학적 문헌을 참조할 수 있다. 예를 들면, 문헌["Modern Pharmaceutics," Banker & Rhodes, Informa Healthcare, USA, 4th ed. (2002); and "Goodman & Gilman's The Pharmaceutical Basis of Therapeutics," McGraw-Hill Companies, Inc., New York, 10th ed. (2001)]을 참고할 수 있다.

"대상체", "개인" 또는 "환자"는, 진단, 예후 또는 치료 또는 조성물 또는 투약 형태의 투여가 요구되는 인간 또는 비인간에 상관없는 임의의 대상체를 의미한다. 포유동물 대상체는, 비제한적으로, 인간; 사육 동물; 농장 동물; 동물원 동물; 스포츠 동물; 애완 동물, 예를 들면, 개, 고양이, 기니아 피그, 토끼, 래트, 마우스 또는 말; 영장류, 예를 들면, 원숭이(예를 들면, 세부스, 레서스, 아프리카 녹색, 파타스, 시노몰구스 및 세르코피테쿠스), 유인원, 오랑우탄, 개코원숭이, 긴팔원숭이 및 침팬지 등의 영장류; 개 및 늑대 등의 개과 동물; 고양이, 사자 및 호랑이 등의 고양이과; 말, 당나귀 및 얼룩말 등의 말과; 암소, 소, 돼지 및 양 등의 식용 동물; 사슴 및 기린 등의 유제류; 마우스, 래트, 햄스터 및 기니아 피그 등의 설치류 등을 포함한다. 용어 "대상체"는 또한 모델 동물, 예를 들면, 질병 모델 동물을 포함한다. 일부 양태에서, 용어 "대상체"는 경제적으로 또는 달리 귀중한 동물, 예를 들면, 경제적으로 중요한 육종 가축, 경주용 동물, 쇼 동물, 국보 동물, 희귀 또는 멸종위기 동물 또는 반려 동물을 포함한다. 특정 양태에서, 대상체는 인간 대상체이다. 특정 양태에서, 대상체는 비인간 대상체이다.

조성물은 "영양학적 양", "치료학적 효과량", "예방학적 효과량", "치료학적 투약량" 또는 "예방학적 투약량"으로서 투여될 수 있다. "영양학적 양"은 필요한 투약량 및 기간 동안 목적하는 영양 결과를 달성하는데 효과적인 양을 지칭한다. 영양학적 결과는, 예를 들면, 대상체에서 바람직한 지방산 성분의 증가된 수준일 수 있다. "치료학적 효과량" 또는 "치료학적 투약량"은 필요한 투약량 및 기간 동안 바람직한 치료 효과를 달성하기에 효과적인 양을 지칭한다. 치료학적 결과는, 예를 들면, 징후의 감소, 연장된 생존, 개선된 이동성 등일 수 있다. 치료학적 결과는 "치유"일 필요는 없다. "예방학적 효과량" 또는 "예방학적 투약량"은 필요한 투약량 및 기간 동안 바람직한 예방학적 결과를 달성하기에 효과적인 양을 지칭한다. 전형적으로, 예방학적 투약량은 질병의 조기 단계 이전에 또는 조기 단계에 대상체에서 사용되므로, 예방학적 효과량은 질병의 진전된 단계의 치료를 위한 치료학적 효과량보다 적을 것이다.

약학 조성물의 각종 투약량, 투약 형태 또는 약학 조성물은 대상체에게 투여될 미생물, 바이오매스 또는 미생물 오일의 EPA 또는 다른 지방산 성분의 양을 기초로 하여, 대상체에게 투여될 수 있다. 용어 "1일 투약량", "1일 투약량 수준" 및 "1일 투약량"은 본원에서 1일 당(24시간 기간 당) 투여된 EPA 또는 다른 지방산 성분의 총량을 지칭한다. 따라서, 예를 들면, 2mg의 1일 투약량에서 대상체에게 EPA를 투여하는 것은, EPA가 2mg의 EPA를 포함하는 단일 투약 형태로서, 또는 다르게는 0.5mg의 EPA 각각을 포함하는 4회 투약 형태(총 2mg의 EPA)로서 투여되는 것에 상관 없이, 대상체가 1일 기준으로 총 2mg의 EPA를 제공받음을 의미한다. 일부 양태에서, EPA의 1일 양은 단일 투약 형태, 또는 2회 투약 형태로 투여된다. 본 발명의 투약 형태는 단일 적용 또는 다중 적용으로 취해질 수 있다. 예를 들면, 4개의 정제를 매일 섭취하는 경우, 0.5mg의 EPA를 포함하는 각각의 정제, 이어서 모두 4개의 정제를 1일 1회 섭취할 수 있거나, 2개의 정제를 1일 2회 섭취할 수 있거나, 1개의 정제를 6시간마다 섭취할 수 있다. 일부 양태에서, 1일 투약량은 약 100mg 내지 약 15g의 EPA이다. 일부 양태에서, 1일 투약량은 약 0.5 내지 약 250mg, 약 100 내지 약 250mg, 약 100 내지 약 500mg, 약 100mg 내지 약 1g, 약 1 내지 약 2.5g, 약 1 내지 약 5g, 약 1 내지 약 10g, 약 1 내지 약 15g, 약 5 내지 약 10g, 약 5 내지 약 15g, 약 10 내지 약 15g, 약 100mg 내지 약 10g, 약 100mg 내지 약 5g 또는 약 100mg 내지 약 2.5g의 EPA, DHA 또는 이의 조합이다. 일부 양태에서, 조성물은 투약 형태 당 약 0.5 내지 약 250mg, 100 내지 약 250mg, 약 0.5 내지 약 500mg, 약 100 내지 약 500mg, 약 0.5mg 내지 약 1g 또는 약 100mg 내지 약 1g의 EPA, DHA 또는 이의 조합을 포함하는 투약 형태이다.

본 발명의 조성물 또는 투약 형태의 투여는 각종 섭생을 사용하여 달성할 수 있다. 예를 들면, 일부 양태에서, 투여는 매일 연속일로, 또는 다르게는 격일마다(2일마다) 수행한다. 투여는 1일 이상의 일로 수행할 수 있다.

조성물 및 투약 형태의 투여는 증상의 치료를 위해 사용된 다른 섭생과 조합시킬 수 있다. 예를 들면, 본 발명의 방법은 식이 섭생(예를 들면, 저탄수화물 식이, 고단백질 식이, 고섬유 식이 등), 운동 섭생, 체중 감소 섭생, 금연 섭생 또는 이의 조합과 결합시킬 수 있다. 본 발명의 방법은 또한 증상의 치료 시 다른 약학 제품과 함께 사용할 수 있다. 본 발명의 조성물 또는 투약 형태는 다른 섭생 또는 약학 제품의 투여 전 또는 후에 투여할 수 있다.

본 발명은 또한 본 발명의 조성물의 하나 이상의 단위를 함유하는 키트 또는 포장에 관한 것이다. 키트 또는 포장은 본 발명의 미생물, 바이오매스 또는 미생물 오일, 또는 이의 조합을 포함하는 식료품, 약학 조성물, 화장품 또는 산업용 조성물의 단위를 포함할 수 있다. 키트 또는 포장은 또한 식품, 화장품, 약학 조성물 또는 산업용 조성물의 제조를 위한 본 발명의 미생물, 바이오매스 또는 미생물 오일, 또는 이의 조합을 포함하는 첨가물을 포함할 수 있다.

일부 양태에서, 키트 또는 포장은 본 발명의 방법에 따라 투여될 약학 조성물의 하나 이상의 단위를 함유한다. 키트 또는 포장은 하나의 투약량 단위 또는 하나 이상의 투약량 단위(즉, 다중 투약량 단위)를 함유할 수 있다. 다중 투약량 단위가 키트 또는 포장속에 존재하는 경우, 다중 투약량 단위는 순차적인 투여를 위해 선택적으로 정렬될 수 있다.

본 발명의 키트는 선택적으로 키트의 단위 또는 투약 형태와 관련된 지시사항을 함유할 수 있다. 이러한 지시사항은 약학 제품의 제조, 사용 또는 판매를 감독하는 정부 기관에 의해 규정된 형태일 수 있으며, 이러한 주의사항은 증상 또는 질환을 치료하기 위해 인간 투여용으로의 제조, 사용 또는 판매의 대리인에 의한 승인을 반영한다. 지시사항은 본 발명의 방법에 따른 키트내 단위 또는 투약 형태의 사용에 대한 정보를 전달하는 임의의 형태일 수 있다. 예를 들면, 지시사항은 인쇄물의 형태 또는 앞서 기록된 의학 장치의 형태일 수 있다.

환자의 시험 과정중에, 의학적 전문가는 본 발명의 방법중 하나의 투여가 환자에게 적절한지를 결정할 수 있거나, 주치의는, 환자의 증상이 본 발명의 방법중 하나의 투여에 의해 개선될 수 있는지를 결정할 수 있다. 임의의 섭생을 기재하기 전에, 주치의는 환자에게, 예를 들면, 섭생과 관련된 각종 위험 및 이점에 대해 조언할 수 있다. 환자는 섭생과 관련된 모든 공지되고 예측된 위험의 완전한 기술내용을 제공받을 수 있다. 이러한 조언과정은 구두로 및 인쇄물로 제공될 수 있다. 일부 양태에서, 주치의는 환자에게 제품 정보, 교육 자료 등의 섭생에 대한 문헌 자료를 제공할 수 있다.

본 발명은 또한 치료 방법에 대해 소비자를 교육시키는 방법에 관한 것이며, 당해 방법은 투약 형태를 판매 시점의 소비자 정보와 함께 분배함을 포함한다. 일부 양태에서, 이러한 분배는 약사 또는 건강관리 제공자의 판매 시점에 수행할 것이다.

용어 "소비자 정보"는, 비제한적으로, 영문 교재, 비영문 교재, 시각적 정보, 도표, 전화 기록물, 웹사이트 및 실시간 소비자 서비스 대표자에 대한 접근을 포함한다. 일부 양태에서, 소비자 정보는 본 발명의 방법에 따른 투약 형태의 사용, 적절한 연령 사용, 지표, 부작용, 적절한 투약량, 경고문, 전화번호 또는 웹사이트 주소에 대한 지시사항을 제공할 것이다. 일부 양태에서, 당해 방법은 본 발명의 방법에 따라 기재된 섭생의 사용에 관한 소비자 질문에 답하는 위치에 있는 관계자에 대한 전문 정보를 제공함을 추가로 포함한다. 용어 "전문 정보"는, 비제한적으로, 의학적으로 전문적이어서 소비자 질문에 답할 수 있도록 설계된 본 발명의 방법에 따라 투여된 경우에 섭생에 관한 정보를 포함한다.

"의학 전문가"은, 예를 들면, 의사, 의사 보조자, 간호원, 전문 간호사, 약사 및 소비자 서비스 대표자를 포함한다.

본 발명을 일반적으로 기술하였지만, 본원에 제공된 실시예를 참조로 하여 추가의 이해가 수득될 수 있다. 이들 실시예는 단지 설명할 목적이며 제한하는 것으로 의도되지 않는다.

실시예 1

미생물의 단리

샘플은 북아메리카의 서부 연안(미국 캘리포니아주, 오레곤주 및 워싱턴주) 및 하와이주를 따르는 만 및 강어귀를 포함하는 낮은 조수 동안 서식지로부터 수집했다. 물, 퇴적물, 살아있는 식물 및 부패 식물/동물 파편을 멸균 50mL 튜브에 넣었다. 각 샘플의 일부를 물과 함께 단리 배지의 고체 한천 플레이트에 펼쳤다. 단리 배지는 500mL의 인공 해수, 500mL의 멸균수, 1g의 글루코스, 1g의 글리세롤, 13g의 한천, 1g의 글루타메이트, 0.5g의 효모 추출물, 0.5g의 카제인 가수분해물, 1mL의 비타민 용액(100mg/L 티아민, 0.5mg/L 바이오틴, 0.5mg B₁₂), 1mL의 미량 광물 용액(PII 금속, 1L 당 함유량: 6.0g의 FeCl₃·6H₂O, 6.84g의 H₃BO₃, 0.86g의 MnCl₂·4H₂O, 0.06g의 ZnCl₂, 0.026g의 CoCl₂·6H₂0, 0.052g의 NiSO₄·H₂O, 0.002g의 CuSO₄·5H₂O 및 0.005g의 Na₂MoO₄·2H₂O), 및 500mg의 페니실린 G 및 스트렙토마이신 설페이트 각각으로 이루어졌다. 한천 플레이트를 암실에서 20 내지 25℃로 항온처리하였다. 2 내지 4일 후, 한천 플레이트를 확대하여 시험하고, 세포의 콜로니를 멸균 이쑤시개로 집어서 새로운 배지 플레이트위에 재스트리킹(restreaking)하였다. 오염된 유기체가 제거될 때까지 세포를 반복적으로 새로운 배지위에 스트리킹하였다. 단리된 미생물중의 2개는 ATCC 수탁번호 PTA-10212 및 PTA-10208로 기탁되었다.

ATCC 수탁번호 PTA-10212로 기탁된 단리된 미생물의 분류학상 특성

ATCC 수탁번호 PTA-10212("PTA-10212")로 기탁된 단리된 미생물의 배양물은 가시적으로 단리된 포자낭군 없이 백색의 습윤 얼룩 콜로니로서 나타났다.

PTA-10212를 고체 및 액체 FFM, 고체 KMV, KMV 슬러쉬(1%), KMV 부용 및 MH 부용에서 성장시켜 성장 특성을 추가로 검사했다. PTA-10212는 KMV 및 MH에서 신속하게 성장하는 것으로 관찰되었다(문헌[Porter D., 1989. Phylum Labyrinthulomycota. In Margulis, L., Corliss, J.O., Melkonian, M., Chapman, D.J. (Eds.) Handbook of Protoctista, Jones and Bartlett, Boston, pp. 388-398 (KMV); Honda et al., Mycol . Res. 102:439-448 (1998) (MH); 및 미국 특허 제5,130,242호(FFM) 참고, 이들 각각은 전체내용이 본원에 참고로서 혼입됨].

하기 관찰은 고체 FFM 배지상에서 수일에 걸쳐 PTA-10212의 성장 후, KMV 배지 및 MH 부용에서 72시간 성장 후에 이루어졌다. 포자낭은 어느 배지속/상에서 응집되지 않았고, 매우 작았다(5 내지 10㎛). PTA-10212는 쉬조키트리움 개열 패턴의 풍부한 4분자 특성을 입증하지 않았다. 아메바상 세포는 신선한 고체 배지로 옮긴 후 약 24시간에서 나타났다. 이들 아메바상 세포는 수일 후에 사라졌고, 액체 또는 슬러쉬 배지에서 증명되지 않았다. 액체 배지에서 성장시킬 때에 "플라스크 하부에 작은 모래입자"의 외관을 갖는 것으로 문헌[Yokoyama, R. et al., Mycoscience 48(6): 329-341 (2007)]에 기재된 오란티오키트리움(Aurantiochytrium)과 달리, PTA-10212는 플라스크 하부에 침강되지 않았지만, KMV 및 MH 액체 배지 둘다에서 현탁되었다. 포자낭은, PTA-10212로부터 부재하는 확실한 외부원형질 네트워크를 또한 갖는, 전형적인 쉬조키트리움 또는 올리고키트리움과 같이 조밀하지 않았다. 대부분의 종은 수시간에 걸쳐 보다 큰 포자낭의 분열에 의해 작은 포자낭 또는 동화 세포의 영양 개열을 받지만, PTA-10212는 덤벨형의 신장된 동화 세포를 형성했고, 이는 이어서 덤벨의 말단이 단리됨에 따라 떨어져 끌어당기는 얇은 협부를 형성했다. 생성되는 세포는 작은 동화 세포인 것으로 나타났다. 아메바상 세포의 덤벨형 동화 세포의 직접적인 형질전환은 관찰되지 않았다. 전형적인 쌍편모 유주자는 수영하는 것으로 관찰되었지만, 비교적 드물었다. PTA-10212는 비증식성이므로, 영양 개열에 의해 분할한다. 유주자는 수영하는 것으로 관찰되었으나, 유주자의 직접 방출은 관찰되지 않았다. 영양 세포는 매우 작았다(2 내지 5㎛).

PTA-10212는 현미경 슬라이드가 작은 부분의 한천 성장 콜로니를 반-강도 해수 한 방울에 현탁시켜 제조된 유동 기술을 사용하여 추가로 시험했다. 이 기술을 사용하여, 제1 포자낭은 구형이고 직경이 약 10㎛인 것으로 관찰되었다. 원형동물의 이분열이 개시될 경우 벽은 매우 얇았고, 나머지는 관찰되지 않았다. 반복된 이분열은 8 내지 16개의 소형(직경 4 내지 5㎛) 2차 포자낭을 생산했다. 2차 포자낭은 무조직 원생 동물을 방출시키기 전에 수 시간 동안 조용하게 잔류했다. 무조직 원생동물은 꼬집고 당겨서 분할해 최초로 전형적인 덤벨형 중간 단계를 생성하고, 최종적으로 직경 2.5 내지 2.8㎛의 4 내지 8개의 소형의 구형 본체를 유도한다. 후자를 수분 내지 1-2시간 동안 휴지시킨 다음, 형태를 변화시키고(신장시키고), 쌍편모 유주자, 2.3 내지 2.5 x 3.7 내지 3.9㎛로 변화시켰다. 유주자는 풍부했고, 이들이 휴지될 때까지 정확하게 측정될 수 있었다. 이어서, 유주자를 둥글게 하고, 새로운 발달 주기를 개시했다. 유주자는 씨사이요이도키트리움 미누툼(Sicyoidochytrium minutum)보다 크고 울케니아 비수르겐시스(Ulkenia visurgensis)보다 작았다.

PTA-10212는 공지된 종의 그것에 대한 이의 18s rRNA 유전자의 유사성에 기초하여 추가로 특성화되었다. 게놈 DNA는 표준 절차로 PTA-10212로부터 제조했다(문헌[Sambrook J. and Russell D. 2001. Molecular cloning: A laboratory manual, 3rd edition. Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York] 참고). 요약하면, (1) 500μL의 세포를 중-로그 배양물로부터 원심분리했다. 세포를 재원심분리시키고, 모든 미량의 액체는 작은 구경 선단을 갖는 세포 펠릿으로부터 제거했고; (2) 펠릿을 200μL 용해 완충제(20mM 트리스 pH 8.0, 125μg/mL 프로테이나제 K, 50mM NaCl, 10mM EDTA pH 8.0, 0.5% SDS)로 재현탁시켰고; (3) 세포를 50℃에서 1시간 동안 용해시켰고; (4) 용해 혼합물을 페이스-락(phase-lock) 겔(PLG-에펜도르프) 2mL 튜브에 피펫팅했고; (5) 동일 부피로 P:C:I를 첨가하고, 1.5시간 동안 혼합했고; (6) 튜브를 12,000 x g에서 5분 동안 원심분리했고; (7) 수성 상을 PLG 튜브 내에서 상기 겔로부터 제거하고, 동일 부피의 클로로포름을 수성 상에 첨가하고, 30분 동안 혼합했고; (8) 튜브를 14,000 x g에서 약 5분 동안 원심분리했고; (9) 상부 층(수성 상)을 클로로포름으로부터 피펫팅하고, 새로운 튜브에 넣었고; (10) 0.1부피의 3M NaOAC를 첨가하고, 혼합했고(수회 역전시켰고); (11) 2부피의 100% EtOH를 첨가하고, 이 단계에서 형성하는 게놈 DNA 침전제와 혼합했고(수회 역전시켰고); (12) 튜브를 14,000 x g에서 약 15분 동안 4℃에서 미량원심기에서 원심분리했고; (13) 액체를 튜브의 기저부에 잔류하는 게놈 DNA와 함께 완만하게 부었고; (14) 펠릿을 0.5mL 70% EtOH로 세척했고; (15) 튜브를 14,000 x g에서 약 5분 동안 4℃에서 미량원심기에서 원심분리했고; (16) EtOH를 완만하에 붓고, 게놈 DNA 펠릿을 건조시켰고; (17) 적합한 부피의 H₂O 및 RNase를 게놈 DNA 펠릿에 직접 첨가했다. 18s rRNA 유전자의 PCR 증폭은 이미 기술된 프라이머로 수행했다(문헌[Honda et. al., J. Euk. Micro. 46(6): 637-647 (1999)] 참고). 염색체 DNA 주형에 의한 PCR 조건은 다음과 같다: 0.2μM dNTP, 0.1μM 각 프라이머, 8% DMSO, 200ng 염색체 DNA, 2.5U 헤르쿨라제(Herculase: 등록상표) II 융합 DNA 폴리머라제(스트라타젠(Stratagene)), 및 헤르쿨라제(등록상표) 완충제(스트라타젠), 50μL 총 부피. PCR 프로토콜은 다음 단계를 포함한다: (1) 2분 동안 95℃; (2) 35초 동안 95℃; (3) 35초 동안 55℃; (4) 1분 30초 동안 72℃; (5) 30주기 동안 단계 2 내지 4 반복; (6) 5분 동안 72℃; 및 (7) 4℃에서 유지.

PCR 증폭은 상기한 염색체 주형을 사용하여 기대된 크기를 갖는 명확한 DNA 생성물을 수득했다. PCR 생성물을 제조업자의 지침에 따라 벡터 pJET1.2/블런트(페르멘타스(Fermentas))로 클로닝하고, 삽입 서열을 공급된 표준 프라이머를 사용하여 측정했다.

계통발생 분석은 적절한 지지체로 트라우스토키트리움 파키데르뭄(Thraustochytrium pachydermum) 및 트라우스토키트리움 아그레가툼(Thraustochytrium aggregatum)을 포함하는 계통내의 PTA-10212에 적용한다. 트라우스토키트리움 파키데르뭄의 포자낭은 매우 두꺼운 세포벽을 갖는다. 트라우스토키트리움 아그레가툼은 명백하게 불투명한 포장낭군의 가시성 집단을 형성한다. PTA-10212는 이들 특성의 어떤 것도 나타내지 않는다. 다수의 아메바형 세포의 존재가 기타 분류군, 예를 들면, 울케니아(Ulkenia), 트라우스토키트리움 가에르트네리움(Thraustochytrium gaertnerium), 오란티오키트리움 리미아시눔(Aurantiochytrium limiacinum) 및 쉬조키트리움 만그로베이(Schizochytrium mangrovei)에서 기술되지만; 이러한 분류군과 관련된 설명은 관찰된 격리 집단의 특성과 상이하다. 또한, PTA-10212는 임의의 이들 분류군을 향한 계통발생 친화도를 나타내지 않았다.

표 3은 미국 국립 생물공학 정보 센터(NCBI)에 DNA 서열에 대한 ATCC 수탁번호 PTA-10212로 기탁된 미생물로부터 18s rRNA 서열의 비교를 나타낸다. 백분율 동일성은 2개의 상이한 계산을 사용하여 측정했다. "계산 1"은 비-상동성 영역 또는 부분적 서열(AlignX-VectorNTI 디폴트 셋팅)로부터 서열중에 발생하는 임의의 "갭"을 고려한다. "계산 2"는 갭(AlignX-VectorNTI "동일성" 매트릭스 세팅)에 대한 계산된 벌점을 포함하지 않는다.

[표 3]

18s rRNA 서열의 비교

(p): 부분적 서열을 나타냄

표 3에서 제시된 바와 같이, % 동일성과 관련하여, ATCC 수탁번호 PTA-10212로 기탁된 미생물로부터 18s rRNA 서열(서열번호 l)은, 동일하지 않지만, NCBI 데이터베이스에서 이용가능한 18s rRNA 유전자 서열과 관련된다는 것이 밝혀졌다. 유기체가 상이한 속 또는 종에 속하는 18s rRNA 유전자 서열과 밀접하게 관련될 수 있음이 일반적으로 인지된다.

상기한 특성화에 기초하여, ATCC 수탁번호 PTA-10212로 기탁된 단리된 미생물은 새로운 트라우스토키트리움 종을 나타내는 것으로 간주되고, 따라서 또한 트라우스토키트리움 종 ATCC PTA-10212로서 지정된다.

ATCC 수탁번호 PTA-10208로 기탁된 단리된 미생물의 분류 특성

ATCC 수탁번호 PTA-10208로 기탁된 단리된 미생물("PTA-10208")은, 각각 전체내용이 본원에 참고로서 혼입되는 미국 특허출원 제12/407,687호 및 국제 특허출원 제PCT/US2009/001720호에 기술된 ATCC 수탁번호 PTA-9695로 기탁된 미생물("PTA-9695")의 서브-단리물(배양물로부터 단리되고 신규한 별도의 명백한 배양물로서 유지된 개별적 세포)로서 동정되었다.

PTA-10208은 PTA-9695와 분류 특성을 공유한다. PTA-9695는 성숙 포자낭으로부터 떨어져 활동적으로 수영하고 방출 시 쌍편모 유주자를 갖는 것으로 밝혀졌고, 이의 벽 잔류물은 포자 방출 후 명백하게 가시적이었다(상 대조). PTA-9695 포자낭은 직경이 12.5 내지 25㎛로 측정되었고, 유주자는 크기가 2.5 내지 2.8㎛ x 4.5 내지 4.8㎛였다. 개별적인 PTA-9695 포자낭 당 8 내지 24개의 포자가 존재한다. 고정된 PTA-9695 유주자를 확대시키고, 신속하게 이분열을 경험시켜 테트라드, 옥타드 및 최종적으로 포자낭의 집단을 유도한다. 이들 특성은 속 쉬조키트리움과 일치한다. % 동일성과 관련하여, PTA-10208로 공유되는 PTA-9695 18s rRNA 유전자 서열(서열번호 2)은 동일하지는 않지만, 문헌[Honda, D. et al., J. Euk. Micro. 46(6): 637-647 (1999)]에 제공된 트라우스토키트리움 아그레가툼의 18s rRNA 유전자 서열에 밀접하게 관련되는 것으로 밝혀졌다. 트라우스토키트리움 아그레가툼을 위해 공개된 18s rRNA 서열은 서열의 중간에서 약 71 DNA 뉴클레오티드 갭을 갖는 부분적 서열이다. PTA-9695는 새로운 쉬조키트리움 종을 나타내는 것으로 간주된다. 그 자체로, 서브-단리물 PTA-10208은 또한 쉬조키트리움 종 ATCC PTA-10208로서 지정된다.

실시예 2

ATCC 수탁번호 PTA-10212로 기탁된 단리된 미생물의 성장 특성

ATCC 수탁번호 PTA-10212로 기탁된 단리된 미생물을 이하 기술된 바와 같이 개별적인 발효 작동으로 성장 특성에 대해 시험했다. 전형적인 배지 및 배양 조건은 표 1에 제시한다.

pH 7.3에서 20% 용존 산소와 함께 22.5℃에서 1,000ppm Cl^-를 갖는 탄소(글리세롤) 및 질소 공급 배양물에서, PTA-10212는 10L 발효조 부피에서 138시간 배양 후 건조 세포 중량 26.2g/L를 생성했다. 지질 수율은 7.9g/L였고; 오메가-3 수율은 5.3g/L였고; EPA 수율은 3.3g/L였고; DHA 수율은 1.8g/L였다. 지방산 함량은 30.3중량%였고; EPA 함량은 지방산 메틸 에스터(FAME)의 41.4%였고; DHA 함량은 FAME의 26.2%였다. 0.57g/L/일 EPA 생산성 및 0.31g/L/일 DHA 생산성과 함께, 이러한 조건하에 지질 생산성은 1.38g/L/일이었고, 오메가-3 생산성은 0.92g/L/일이었다.

pH 7.3에서 20% 용존 산소와 함께 22.5℃에서 1,000ppm Cl^-를 갖는 탄소(글리세롤) 및 질소 공급 배양물에서, PTA-10212는 10L 발효조 부피에서 189시간 배양 후 건조 세포 중량 38.4g/L를 생성했다. 지질 수율은 18g/L였고; 오메가-3 수율은 12g/L였고; EPA 수율은 5g/L였고; DHA 수율은 6.8g/L였다. 지방산 함량은 45중량%였고; EPA 함량은 FAME의 27.8%였고; DHA 함량은 FAME의 37.9%였다. 0.63g/L/일 EPA 생산성 및 0.86g/L/일 DHA 생산성과 함께, 이러한 조건하에 지질 생산성은 2.3g/L/일이었고, 오메가-3 생산성은 1.5g/L/일이었다.

pH 6.8 내지 7.7에서 20% 용존 산소와 함께 22.5℃에서 1,000ppm Cl^-를 갖는 탄소(글리세롤) 및 질소 공급 배양물에서, PTA-10212는 10L 발효조 부피에서 189시간 배양 후 건조 세포 중량 13g/L를 생성했다. 지질 수율은 5.6g/L였고; 오메가-3 수율은 3.5g/L였고; EPA 수율은 1.55g/L였고; DHA 수율은 1.9g/L였다. 지방산 함량은 38중량%였고; EPA 함량은 FAME의 29.5%였고; DHA 함량은 FAME의 36%였다. 0.20g/L/일 EPA 생산성 및 0.24g/L/일 DHA 생산성과 함께, 이러한 조건하에 지질 생산성은 0.67g/L/일이었고, 오메가-3 생산성은 0.4g/L/일이었다.

pH 6.6 내지 7.2에서 20% 용존 산소와 함께 22.5 내지 28.5℃에서 1,000ppm Cl^-를 갖는 탄소(글리세롤) 및 질소 공급 배양물에서, PTA-10212는 10L 발효조 부피에서 191시간 배양 후 건조 세포 중량 36.7 내지 48.7g/L를 생성했다. 지질 수율은 15.2 내지 25.3g/L였고; 오메가-3 수율은 9.3 내지 13.8g/L였고; EPA 수율은 2.5 내지 3.3g/L였고; DHA 수율은 5.8 내지 11g/L였다. 지방산 함량은 42.4 내지 53중량%였고; EPA 함량은 FAME의 9.8 내지 22%였고; DHA 함량은 FAME의 38.1 내지 43.6%였다. 0.31 내지 0.41g/L/일 EPA 생산성 및 0.72 내지 1.4g/L/일 DHA 생산성과 함께, 이러한 조건하에 지질 생산성은 1.9 내지 3.2g/L/일이었고, 오메가-3 생산성은 1.2 내지 1.7g/L/일이었다.

ATCC 수탁번호 PTA-10208로 기탁된 단리된 미생물의 성장 특성

ATCC 수탁번호 PTA-10208로 기탁된 단리된 미생물을 이하 기술된 바와 같이 개별적인 발효 작동으로 성장 특성에 대해 시험했다. 전형적인 배지 및 배양 조건은 표 2에 제시한다.

질소 공급 동안 20% 용존 산소 및 이후 10% 용존 산소와 함께 pH 7.0에서 22.5℃에서 1,000ppm Cl^-를 갖는 탄소(글루코스) 및 질소 공급 배양물에서, PTA-10208은 10L 발효조 부피에서 200시간 배양 후 건조 세포 중량 95g/L를 생성했다. 지질 수율은 53.7g/L였고; 오메가-3 수율은 37g/L였고; EPA 수율은 14.3g/L였고; DHA 수율은 21g/L였다. 지방산 함량은 57중량%였고; EPA 함량은 FAME의 27.7%였고; DHA 함량은 FAME의 39.1%였다. 1.7g/L/일 EPA 생산성 및 2.5g/L/일 DHA 생산성과 함께, 이러한 조건하에 지질 생산성은 6.4g/L/일이었고, 오메가-3 생산성은 4.4g/L/일이었다.

질소 공급 동안 20% 용존 산소 및 이후 10% 용존 산소와 함께 pH 7.5에서 22.5℃에서 1,000ppm Cl^-를 갖는 탄소(글루코스) 및 질소 공급 배양물에서, PTA-10208은 10L 발효조 부피에서 139시간 배양 후 건조 세포 중량 56g/L를 생성했다. 지질 수율은 53g/L였고; 오메가-3 수율은 34g/L였고; EPA 수율은 11.5g/L였고; DHA 수율은 22g/L였다. 지방산 함량은 58중량%였고; EPA 함량은 FAME의 21.7%였고; DHA 함량은 FAME의 41.7%였다. 2g/L/일 EPA 생산성 및 3.8g/L/일 DHA 생산성과 함께, 이러한 조건하에 지질 생산성은 9.2g/L/일이었고, 오메가-3 생산성은 5.9g/L/일이었다.

질소 공급 동안 20% 용존 산소 및 이후 10% 용존 산소와 함께 pH 7.0에서 22.5℃에서 1,000ppm Cl^-를 갖는 탄소(글루코스) 및 질소 공급 배양물에서, PTA-10208은 2,000L 발효조 부피에서 167시간 배양 후 건조 세포 중량 93.8g/L를 생성했다. 지질 수율은 47.2g/L였고; 오메가-3 수율은 33.1g/L였고; EPA 수율은 10.5g/L였고; DHA 수율은 20.4g/L였다. 지방산 함량은 50.6중량%였고; EPA 함량은 FAME의 23%였고; DHA 함량은 FAME의 42.6%였다. 1.5g/L/일 EPA 생산성 및 2.9g/L/일 DHA 생산성과 함께, 이러한 조건하에 지질 생산성은 6.8g/L/일이었고, 오메가-3 생산성은 4.7g/L/일이었다.

질소 공급 동안 20% 용존 산소 및 이후 10% 용존 산소와 함께 pH 7.0에서 22.5℃에서 1,000ppm Cl^-를 갖는 탄소(글루코스) 및 질소 공급 배양물에서, PTA-10208은 2,000L 발효조 부피에서 168시간 배양 후 건조 세포 중량 105g/L를 생성했다. 지질 수율은 46.4g/L였고; 오메가-3 수율은 33g/L였고; EPA 수율은 10.7g/L였고; DHA 수율은 20.3g/L였다. 지방산 함량은 43.9중량%였고; EPA 함량은 FAME의 24%였고; DHA 함량은 FAME의 43.7%였다. 1.5g/L/일 EPA 생산성 및 2.9g/L/일 DHA 생산성과 함께, 이러한 조건하에 지질 생산성은 6.6g/L/일이었고, 오메가-3 생산성은 4.7g/L/일이었다.

질소 공급 동안 20% 용존 산소 및 이후 10% 용존 산소와 함께 pH 7.0에서 22.5℃에서 1,000ppm Cl^-를 갖는 탄소(글루코스) 및 질소 공급 배양물에서, PTA-10208은 2,000L 발효조 부피에서 168시간 배양 후 건조 세포 중량 64.8g/L를 생성했다. 지질 수율은 38.7g/L였고; 오메가-3 수율은 29.9g/L였고; EPA 수율은 8.5g/L였고; DHA 수율은 16.7g/L였다. 지방산 함량은 59.6중량%였고; EPA 함량은 FAME의 23%였고; DHA 함량은 FAME의 42.3%였다. 1.2g/L/일 EPA 생산성 및 2.3g/L/일 DHA 생산성과 함께, 이러한 조건하에 지질 생산성은 5.53g/L/일이었고, 오메가-3 생산성은 3.8g/L/일이었다.

실시예 3

미생물 균주 ATCC PTA-10208 및 PTA-10212의 지방산 프로파일

바이오매스의 4개의 샘플(PTA-10208 샘플 1; PTA-10208 샘플 2; PTA-10212 샘플 1; 및 PTA-10212 샘플 2)을 용매 추출에 의해 총 미정제 오일 함량에 대해 분석했고, 지질 등급은 고성능 액체 크로마토그래피/증발성 광 산란 검출(HPLC/ELSD)에 의해 측정하였고, 트라이아실글리세롤(TAG)은 HPLC/질량 분석법(HPLC/MS)으로 분석했고, 지방산(FA) 프로파일은 불꽃 이온화 검출과 함께 기체 크로마토그래피(GC-FID)로 측정했다. 각 냉동 건조된 바이오매스의 조 지질 함량은 헥산을 사용하는 용매 분쇄를 사용하여 측정하고, 직접 에스터교환 반응에 의해 생성된 FAME(mg/g)의 합계와 비교하고, 생성되는 지방산 메틸 에스터(FAME)는 GC/FID 분석으로 정량화했다. 추출된 조 지질중의 지방산은 또한 에스터교환 반응으로 정량화하고, 생성되는 FAME의 GC/FID 분석을 사용하여 정량화했다. 모든 중성 지질(NL) 및 유리 지방산(FFA)의 중량%는 ELSD 및 대기압 화학적 이온화-MS(APCI-MS) 동정과 함께 정상 상 HPLC를 사용하여 추출된 조 지질중에서 측정했다. 방법은 스테롤 에스터(SE), TAG, 유리 지방산(FFA), 1,3-다이아실글리세롤(1,3-DAG), 스테롤, 1,2-다이아실글리세롤(1,2-DAG) 및 모노아실글리세롤(MAG)을 단리하고 정량화한다. 결과는 이하 표 4 및 5에 제시한다.

TAG 및 인지질(PL)을 바이오매스의 4개의 샘플(PTA-10208 샘플 1; PTA-10208 샘플 2; PTA-10212 샘플 1; 및 PTA-10212 샘플 2)로부터 추출된 미정제 오일로부터 단리했다. TAG를 저압 플래쉬 크로마토그래피를 사용하여 단리했고, PL은 고체 상 추출(SPE)을 사용하여 단리했다. 각각 단리된 분획의 동일성은 박층 크로마토그래피(TLC)로 확인했다. 단리된 TAG 및 PL 분획의 지방산 프로파일은 FAME로서 GC-FID를 사용하여 후속되는 직접 에스터교환 반응을 측정했다. 결과는 이하 표 6 및 7에 제시된다.

단리된 지질 등급의 총 미정제 오일 함량 및 지방산 프로파일은 또한 미생물 균주 ATCC PTA-10212(PTA-10212 샘플 3 및 PTA-10212 샘플 4)로부터의 바이오매스의 두 추가 샘플에 대해 측정했다. 미정제 오일은 헥산 추출에 의해 각각의 샘플로부터 수득했고, 개별적 지질 등급을 저압 플래쉬 크로마토그래피로 단리했다. 바이오매스, 미정제 오일 및 단리된 분획의 지방산 프로파일은 FAME로서 GC-FID를 사용하여 측정했다. 결과는 이하 표 8 내지 11에 제시한다.

개별적인 지질 등급은 사전에 프리오렉스(FRIOLEX: 등록상표) 방법을 사용하여 추출된 미생물 균주 ATCC PTA-10212로부터의 미정제 오일의 샘플(PTA-10212 샘플 5)로부터 단리하고, 각각의 등급의 지방산 프로파일은 FAME로서 GC-FID를 사용하여 측정했다. 결과는 이하 표 12 및 13에 제시한다.

개별적인 지질 등급은 ELSD 및 APCI-MS 동정과 함께 통상의 HPLC를 사용하여 미생물 균주 ATCC PTA-10208로부터의 미정제 오일의 샘플(PTA-10208 샘플 3)로부터 단리했다.

실험 절차

미정제 오일 추출 - 미정제 오일을 동결 건조된 바이오매스의 샘플로부터 용매 분쇄를 사용하여 추출했다. 예를 들면, 약 3g의 바이오매스를 스웨덴 튜브속에서 칭량했다. 3개의 볼 베어링 및 30mL의 헥산을 스웨덴 튜브에 첨가하고, 이를 네오프렌 마개로 밀폐시키고, 진탕기에 2시간 동안 위치시켰다. 생성되는 슬러리를 부흐너 깔때기 및 와트만 필터지를 사용하여 여과시켰다. 여과된 액체를 수집하고, 용매를 진공하에 제거하고, 잔류하는 조 지질의 양을 중량 측정으로 측정했다.

지방산 분석 - 바이오매스의 샘플, 추출된 조 지질 및 단리된 지질 등급을 FAME로서 지방산 조성물에 대해 분석했다. 간단하게, 동결 건조된 바이오매스 및 단리된 지질 등급을 스크류 캡 시험 튜브속에서 직접 칭량하고, 미정제 오일 샘플을 헥산에 용해시켜 약 2mg/mL의 농도를 수득했다. 내부 표준을 포함하는 톨루엔, 및 메탄올중의 1.5N HCl을 각 튜브에 첨가했다. 튜브를 와동시킨 다음, 뚜껑을 덮고, 2시간 동안 100℃로 가열했다. 튜브를 냉각시키고, 물중의 포화된 NaCl을 첨가했다. 튜브를 다시 와동시키고, 원심분리시켜 층이 단리되도록 했다. 이어서, 유기 층 부분을 GC 바이알에 위치시키고, GC-FID에 의해 분석했다. FAME는 누-체크-프렙(Nu-Check-Prep) GLC 참조 표준(누체크, 미국 미네소타주 엘리시안)을 사용하여 생성된 3점 교정 곡선을 사용하여 정량화했다. 추출물에 존재하는 지방산은 mg/g 및 중량%로서 나타냈다. 샘플중의 지방 함량을 추산하여 GC-FID로 분석될 경우 내부 표준에 대한 동일 반응을 가정했다.

HPLC / ELSD /MS 방법 -

장치: 아길런트(Agilent) 1100 HPLC, 올텍(Alltech) 3300 ELSD, 아길런트 1100 MSD

컬럼: 페노메넥스 루나 실리카(Phenomenex Luna Silica), 250 x 4.6mm, 5㎛ 입자 크기 w/가드 컬럼(Guard Column)

이동 상: A - 99.5% 헥산(옴니솔브(Omnisolv)), 0.4% 이소프로필 알콜(옴니솔브), 0.1% 아세트산; B - 99.9% 에탄올(옴니솔브, 95:5 에탄올:IPA), 0.1% 아세트산

구배:

컬럼 온도: 30℃

유량: 1.5mL/분

주입 부피: 5μL

ELSD 검출: 온도 35℃, 기체 흐름 1.2L/분

MSD: 질량 범위 200 - 1200, 프레그멘터(Fragmentor) 225V, 건조 기체 온도 350℃, 증발기 온도 325℃, 모세관 전압 3,500V, 코로나 전류 10μA

고체 상 추출 - PL 분획을 Vac 용출 장치(바리안 인코포레이티드(Varian Inc), 미국 팔로 알토)에 위치된 2g 아미노프로필 카트리지(바이오티지(Biotage), 스웨덴 웁살라)를 사용하여 고체 상 추출(SPE)에 의해 조 지질로부터 단리했다. 카트리지는 15mL의 헥산으로 컨디셔닝하고, 약 60mg의 각 샘플을 1mL의 CHCl₃에 용해시키고, 카트리지에 적용했다. 컬럼을 15mL의 2:1 CHCl₃:이소프로필 알콜로 세척하여 중성 지질 모두를 용출시키고, 이를 처리한다. 이어서, 지방산을 에터중의 2% 아세트산(HOAc) 15mL로 용출시키고, 이를 처리한다. PL 부분은 15mL의 6:1 메탄올:클로로포름으로 용출시키고, 이를 수집하고, 질소하에 건조시키고, 칭량했다.

플래쉬 크로마토그래피 - 플래쉬 크로마토그래피를 사용하여 미정제 오일중에 존재하는 지질 등급을 분류했다. 헥산에 용해된 약 200mg의 미정제 오일을 컬럼의 정상에 주입했다. 크로마토그래피 시스템은 5mL/분(표 6 및 7) 또는 3mL/분(표 8 내지 13)에서 석유 에터 및 에틸 아세테이트로 구성된 이동 상과 함께 실리카 겔 60(이엠디 케미칼(EMD Chemical), 미국 뉴저지주 깁스타운)을 사용했다. 단계 구배를 사용하여 컬럼으로부터 각 지질 등급을 선택적으로 용출시켰다. 이동 상 구배는 100% 석유 에터로 출발하고 50% 에틸 아세테이트로 완성했다. 분획을 10mL 시험 튜브에서 길슨(Gilson) FC 204 넓은 상 분획 수집기(길슨 인코포레이티드, 미국 위스콘신주 미들톤)를 사용하여 수집했다. 각 튜브를 박층 크로마토그래피(TLC)로 분석하고, 개별적인 지질 등급(기대되는 체류 인자(Rf)와 함께 TLC 플레이트상에서 단일 반점에 의해 판단된 바와 같이)을 함유하는 튜브를 풀링하고, 농축 건조시키고 칭량했다. 이어서, 총 분획 함량을 중량 측정으로 측정했다.

TLC 분석 - 박층 크로마토그래피를 실리카 겔 플레이트상에서 수행했다. 플레이트를 석유 에터:에틸 에터:아세트산(80:20:1)으로 이루어진 용매 시스템을 사용하여 용출시키고, 요오드 증기를 사용하여 가시화했다. 이어서, 각 반점의 Rf 값을 각 지질 등급에 대한 기록된 문헌 값과 비교했다.

TAG 및 PL 분획의 분석 - 단리된 TAG 및 PL 분획을 지방산 메틸 에스터(FAME)로서 지방산 조성에 대해 분석했다. TAG 분획을 헥산에 용해시켜 약 1 내지 2mg/mL의 농도를 수득했다. 용액의 1mL 분액을 질소하에 농축 건조시켰다. 내부 표준을 함유하는 톨루엔, 및 메탄올중의 1.5N HCl을 각 튜브에 첨가했다. 튜브를 와동시킨 다음, 뚜껑을 덮고, 2시간 동안 100℃로 가열했다. 내부 표준 및 HCl 메탄올을 PL 분획을 함유하는 튜브에 직접 첨가하고, 가열했다. 튜브를 냉각시키고, 물중의 포화된 NaCl을 첨가했다. 튜브를 다시 와동시키고, 원심분리시켜 층이 분리되도록 했다. 이어서, 유기 층 부분을 GC 바이알에 위치시키고, GC-FID에 의해 분석했다. FAME는 누-체크-프렙 GLC 502B 참조 표준(누체크, 미국 미네소타주 엘리시안)을 사용하여 생성된 3점 교정 곡선을 사용하여 정량화했다. 추출물에 존재하는 지방산은 mg/g 및 FAME의 %로서 나타냈다.

결과

PTA-10208 샘플 1

PTA-10208 샘플 1에 대한 바이오매스 및 추출된 조 지질의 지방산 프로파일은 GC/FID를 사용하여 측정했다. 바이오매스중의 지방산은 FAME 튜브속에서 직접 28.6mg의 바이오매스를 칭량함으로써 동일 반응계에서 에스터교환반응되고, 추출된 조 지질의 샘플은 55.0mg의 조 지질을 50mL 부피 플라스크에서 칭량하여 1mL를 별도의 FAME 튜브로 옮겨 제조했다. 바이오매스의 추산된 조 지질 함량은 FID 검출과 함께 GC를 사용하여 53.2%(FAME의 합계)인 것으로 측정된 반면, 52.0%(wt/wt) 지질을 건조 바이오매스로부터 추출하여 총 지질의 97.8% 회수를 수득했다. 조 지질은 GC/FID를 사용하여 91.9% 지방산(FAME의 합계)인 것으로 측정되었다. 조 지질에 함유된 주요 지방산은 C16:0(182.5mg/g), C20:5 n-3(186.8mg/g) 및 C22:6 n-3(423.1mg/g)이었다.

추출된 조 지질의 지질 등급 프로파일은 50mL 부피 플라스크속에서 55.0mg의 조 지질을 칭량하고, 분액을 HPLC/ELSD/MS 분석을 위해 HPLC 바이알에 옮겨 측정했다. HPLC/ELSD/MS 분석에 따라서, 조 지질은 0.2% 스테롤 에스터(SE), 95.1% TAG, 0.4% 스테롤 및 0.5% 1,2-다이아실글리세롤(DAG)을 함유한다. TAG 분획의 5%가 TAG 피크 후 직접 용출된 피크를 포함하지만, 인지가능한 질량 스펙트럼을 제공하지 않았다.

플래쉬 크로마토그래피로 측정된 바와 같이 이 샘플로부터 단리된 TAG는 미정제 오일의 약 92.4%를 구성한다. PL은 SPE 단리 후 중량 또는 TLC로 검출되지 않았다. TAG에 함유된 주요 지방산(50mg/g 초과)은 C16:0(189mg/g), C20:5 n-3(197mg/g) 및 C22:6 n-3(441mg/g)이었다.

PTA-10208 샘플 2

PTA-10208 샘플 2에 대한 바이오매스 및 추출된 조 지질의 지방산 프로파일은 GC/FID를 사용하여 측정했다. 바이오매스중의 지방산은 FAME 튜브속에서 직접 32.0mg의 바이오매스를 칭량함으로써 동일 반응계에서 에스터교환반응되고, 추출된 조 지질의 샘플은 60.1mg의 조 지질을 50mL 부피 플라스크에서 칭량하여 1mL를 별도의 FAME 튜브로 옮겨 제조했다. 바이오매스의 추산된 조 지질 함량은 FID 검출과 함께 GC를 사용하여 52.4%(FAME의 합계)인 것으로 측정된 반면, 48.0%(wt/wt) 지질을 건조 바이오매스로부터 추출하여 총 지질의 91.7% 회수를 수득했다. 조 지질은 GC/FID를 사용하여 95.3% 지방산(FAME의 합계)인 것으로 측정되었다. 조 지질에 함유된 주요 지방산은 C16:0(217.5mg/g), C20:5 n-3(169.3mg/g) 및 C22:6 n-3(444.1mg/g)이었다.

추출된 조 지질의 지질 등급 프로파일은 50mL 부피 플라스크속에서 60.1mg의 조 지질을 칭량하고, 분액을 HPLC/ELSD/MS 분석을 위해 HPLC 바이알에 옮겨 측정했다. HPLC/ELSD/MS 분석에 따라서, 조 지질은 0.2% SE, 95.7% TAG, 0.3% 스테롤 및 0.7% 1,2-DAG를 함유한다. TAG 분획의 5.1%가 TAG 피크 후 직접 용출된 피크를 포함하지만, 인지가능한 질량 스펙트럼을 제공하지 않았다.

이 샘플로부터 단리된 TAG는 미정제 오일의 약 93.9%를 구성한다. PL은 SPE 단리 후 중량 또는 TLC로 검출되지 않았다. TAG에 함유된 주요 지방산(50mg/g 초과)은 C16:0(218mg/g), C20:5 n-3(167mg/g) 및 C22:6 n-3(430mg/g)이었다.

PTA-10208 샘플 3

ATCC 수탁번호 PTA-10208로 기탁된 미생물로부터의 미정제 오일의 샘플(샘플 PTA-10208 3)을 HPLC/ELSD/MS를 사용하여 분석했다. 총 98.38%의 지질이 회수되었고, 스테롤 에스터(SE) 분획은 0.32%를 차지하고, TAG 분획은 96.13%를 차지하고, 1,3-다이아실글리세롤(DAG) 분획은 0.22%를 차지하고, 1,2-DAG 분획은 0.78%를 차지하고, 스테롤 분획은 0.93%를 차지한다.

PTA-10212 샘플 1

PTA-10212 샘플 1에 대한 바이오매스 및 추출된 조 지질의 지방산 프로파일은 GC/FID를 사용하여 측정했다. 바이오매스중의 지방산은 FAME 튜브속에서 직접 27.0mg의 바이오매스를 칭량함으로써 동일 반응계에서 에스터교환반응되고, 추출된 조 지질의 샘플은 52.5mg의 조 지질을 50mL 부피 플라스크에서 칭량하여 1mL를 별도의 FAME 튜브로 옮겨 제조했다. 바이오매스의 추산된 조 지질 함량은 FID 검출과 함께 GC를 사용하여 38.3%(FAME의 합계)인 것으로 측정된 반면, 36.3%(wt/wt) 지질을 건조 바이오매스로부터 추출하여 총 지질의 94.6% 회수를 수득했다. 조 지질은 GC/FID를 사용하여 83.2% 지방산(FAME의 합계)인 것으로 측정되었다. 조 지질에 함유된 주요 지방산은 C16:0(328.5mg/g), C20:5 n-3(90.08mg/g) 및 C22:6 n-3(289.3mg/g)이었다.

추출된 조 지질의 지질 등급 프로파일은 50mL 부피 플라스크속에서 52.5mg의 조 지질을 칭량하고, 분액을 HPLC/ELSD/MS 분석을 위해 HPLC 바이알에 옮겨 측정했다. HPLC/ELSD/MS 분석에 따라서, 조 지질은 0.2% SE, 64.2% TAG, 1.9% FFA, 2.8% 1,3-DAG, 1.4% 스테롤 및 18.8% 1,2-DAG 및 0.5% MAG를 함유한다. TAG 분획의 3.4%가 TAG 피크 후 직접 용출된 피크를 포함하지만, 인지가능한 질량 스펙트럼을 제공하지 않았다.

이 샘플로부터 단리된 TAG는 미정제 오일의 약 49.8%를 구성한다. 단리된 PL은 미정제 오일의 약 8.1%를 구성한다. TAG 분획에 함유된 주요 지방산(50mg/g 초과)은 C16:0(400mg/g), C20:5 n-3(91mg/g) 및 C22:6 n-3(273mg/g)이었다. PL 분획에 함유된 주요 지방산(50mg/g 초과)은 C16:0(98mg/g), C20:5 n-3(33mg/g) 및 C22:6 n-3(227mg/g)이었다.

PTA-10212 샘플 2

PTA-10212 샘플 2에 대한 바이오매스 및 추출된 조 지질의 지방산 프로파일은 GC/FID를 사용하여 측정했다. 바이오매스중의 지방산은 FAME 튜브속에서 직접 29.5mg의 바이오매스를 칭량함으로써 동일 반응계에서 에스터교환반응되고, 추출된 조 지질의 샘플은 56.5mg의 조 지질을 50mL 부피 플라스크에서 칭량하여 1mL를 별도의 FAME 튜브로 옮겨 제조했다. 바이오매스의 추산된 조 지질 함량은 FID 검출과 함께 GC를 사용하여 40.0%(FAME의 합계)인 것으로 측정된 반면, 41.3%(wt/wt) 지질을 건조 바이오매스로부터 추출하여 총 지질의 106.1% 회수를 수득했다. 조 지질은 GC/FID를 사용하여 82.8% 지방산(FAME의 합계)인 것으로 측정되었다. 조 지질에 함유된 주요 지방산은 C16:0(327.3mg/g), C20:5 n-3(92.5mg/g) 및 C22:6 n-3(277.6mg/g)이었다.

추출된 조 지질의 지질 등급 프로파일은 50mL 부피 플라스크속에서 56.5mg의 조 지질을 칭량하고, 분액을 HPLC/ELSD/MS 분석을 위해 HPLC 바이알에 옮겨 측정했다. HPLC/ELSD/MS 분석에 따라서, 조 지질은 0.2% SE, 58.2% TAG, 2.3% FFA, 3.4% 1,3-DAG, 1.7% 스테롤, 23.4% 1,2-DAG 및 0.6% MAG를 함유한다. TAG 분획의 3.3%가 TAG 피크 후 직접 용출된 피크를 포함하지만, 인지가능한 질량 스펙트럼을 제공하지 않았다.

이 샘플로부터 단리된 TAG는 미정제 오일의 약 51.9%를 구성한다. 단리된 PL은 미정제 오일의 약 8.8%를 구성한다. TAG 분획에 함유된 주요 지방산(50mg/g 초과)은 C16:0(402mg/g), C20:5 n-3(92mg/g) 및 C22:6 n-3(245mg/g)이었다. PL 분획에 함유된 주요 지방산(50mg/g 초과)은 C16:0(121mg/g), C20:5 n-3(48mg/g) 및 C22:6 n-3(246mg/g)이었다.

[표 4]

[표 5]

[표 6]

[표 7]

PTA-10212 샘플 3

PTA-10212 샘플 3에 대한 바이오매스의 지질 함량은 FAME의 합계로서 34%인 것으로 평가되었고, 용매 추출 후 수득된 미정제 오일의 양은 37중량%로서, 바이오매스에 존재하는 지방의 109% 회수를 제공했다. 플래쉬 크로마토그래피를 사용한 분획화 후, 미정제 오일의 약 46%는 TAG로서 단리되었고, 28%는 DAG로서 단리되었다. 미정제 오일은 309mg/g DHA 및 264mg/g EPA를 함유했다. 단리된 TAG는 341mg/g DHA 및 274mg/g EPA를 함유했다. 단리된 DAG 분획은 262mg/g DHA 및 237mg/g EPA를 함유했다. 바이오매스, 추출된 미정제 오일 및 단리된 분획의 총 지방산 프로파일은 각각 mg/g 및 % FAME로서 계산된 하기 표 8 및 9에 제시되어 있다.

[표 8]

[표 9]

PTA-10212 샘플 4

PTA-10212 샘플 4는 FAME의 합계로서 측정된 약 23% 지질을 함유했고, 이중 107%는 헥산 추출을 사용하여 회수했다. 플래쉬 크로마토그래피를 사용한 분획화 후, 미정제 오일의 약 42%는 TAG로서 단리되었고, 18%는 DAG로서 단리되었다. 미정제 오일은 275mg/g DHA 및 209mg/g EPA를 함유했다. 단리된 TAG는 296mg/g DHA 및 205mg/g EPA를 함유했다. 단리된 DAG 분획은 245mg/g DHA 및 219mg/g EPA를 함유했다. 바이오매스, 추출된 미정제 오일 및 단리된 분획의 총 지방산 프로파일은 하기 표 10(mg/g) 및 표 11(% FAME)에 제시된다.

[표 10]

[표 11]

PTA-10212 샘플 5

미정제 오일의 샘플은 프리오렉스(등록상표) 공정(쥐이에이 웨스트팔리아 세퍼레이터 유케이 리미티드(GEA Westfalia Separator UK Ltd.), 영국 밀톤 케인즈)을 사용하여 PTA-10212의 바이오매스로부터 추출하여 미생물 오일 PTA-10212 샘플 5를 수득했다. 개개 지질 등급은 저압 플래쉬 크로마토그래피를 사용하여 PTA-10212 샘플 5로부터 단리했고, 각 등급의 중량%를 측정했다. 각 등급의 지방산 프로파일은 GC-FID를 사용하여 측정했다.

요약하면, 샘플은 600μL의 헥산에 240mg의 미정제 오일을 용해시키고 컬럼의 헤드에 적용하여 제조했다. 플래쉬 크로마토그래피를 사용한 분획화 후, 모든 분획의 합한 중량은 240mg으로서 100% 회수를 제공했다. 스테롤 에스터 분획은 0.9%를 차지하고, TAG 분획은 42.6%를 차지하고, 유리 지방산(FFA)은 1.3%를 차지하고, 스테롤 분획은 2.2%를 차지하고, DAG 분획은 41.6%를 차지했다. 프리오렉스(등록상표) 미정제 오일 및 단리된 분획의 총 지방산 프로파일은 각각 mg/g 및 % FAME로서 계산된 하기 표 12 및 13에 제시되어 있다.

[표 12] PTA-10212 샘플 5 미정제 오일의 지방산 프로파일(mg/g)

[표 13]

실시예 4

추출된 조 지질에 존재하는 각 TAG 이성질체의 상대량 및 지방산 조성은 비수성 역상 HPLC 분리 및 APCI-MS 검출을 사용하여 실시예 3의 샘플 PTA-10208 샘플 1, PTA-10208 샘플 2, PTA-10212 샘플 1, PTA-10212 샘플 2, PTA-10212 샘플 3, PTA-10212 샘플 4 및 PTA-10212 샘플 5 각각에 대해 측정했다.

TAG 방법 -

장치: 아길런트 1100 HPLC, 아길런트 1100 MSD

컬럼: 2개의 페노메넥스 루나 C18(2), 150 x 4.6mm, 직렬로 연결된 3㎛ 입자 크기

이동 상: A - 아세토니트릴; B - IPA w/0.1% 암모늄 아세테이트

구배:

컬럼 온도: 20℃

유량: 0.5mL/분

주입 부피: 5μL

MSD: 질량 범위 350 - 1150, 프레그멘터 225V, 건조 기체 온도 350℃, 증발기 온도 325℃, 모세관 전압 3,500V, 코로나 전류 10μA

PTA-10208 샘플 1

PTA-10208 샘플 1로부터 단리된 조 지질은 5.5mg의 오일을 HPLC 바이알로 칭량하고 1mL 헥산으로 희석하여 TAG 분석용으로 제조했다.

[표 14]

PTA-10208 샘플 2

PTA-10208 샘플 2로부터 단리된 조 지질은 5.3mg의 오일을 HPLC 바이알로 칭량하고 1mL 헥산으로 희석하여 TAG 분석용으로 제조했다.

[표 15]

PTA-10212 샘플 1

PTA-10212 샘플 1로부터 단리된 조 지질은 5.3mg의 오일을 HPLC 바이알로 칭량하고 1mL 헥산으로 희석하여 TAG 분석용으로 제조했다.

[표 16]

PTA-10212 샘플 2

PTA-10212 샘플 2로부터 단리된 조 지질은 3.6mg의 오일을 HPLC 바이알로 칭량하고 1mL 헥산으로 희석하여 TAG 분석용으로 제조했다.

[표 17]

PTA-10212 샘플 3

PTA-10212 샘플 3의 TAG 분획의 샘플은 헥산에서 제조하고, HPLC/APCI/MS로 분석하여 개개 TAG 이성질체의 본질을 측정했다.

[표 18]

PTA-10212 샘플 4

PTA-10212 샘플 4의 TAG 분획의 샘플은 헥산에서 제조하고, HPLC/APCI/MS로 분석하여 개개 TAG 이성질체의 본질을 측정했다.

[표 19]

PTA-10212 샘플 5

PTA-10212 샘플 5의 TAG 분획의 샘플은 헥산에서 제조하고, HPLC/APCI/MS로 분석하여 개개 TAG 이성질체의 본질을 측정했다.

[표 20]

실시예 5

미정제 오일을 정제, 표백 및 탈취에 의해 추가로 처리하여 정제 오일을 수득했다. 정제된 오일을 고도 올레산 해바라기 오일로 희석하여 DHA 함량이 약 400mg/g인 최종 오일을 수득했다. 개개 지질 등급을 단리하고, 각 등급의 지방산 프로파일은 FAME로서 GC-FID를 사용하여 측정했다.

PTA-10208 최종 오일

PTA-10208 최종 오일 1 내지 5에 대한 지방산 프로파일은, 단리된 TAG 분획(표 23 및 24) 및 단리된 스테롤/DAG 분획(표 24 내지 26)과 관련된 프로파일을 포함하여, 표 21 및 22에 요약되어 있다.

최종 오일의 개별적인 지질 등급은 또한 플래쉬 크로마토그래피(표 27) 및 ELSD 및 APCI-MS 동정과 함께 통상의 HPLC를 사용하여 측정했다(표 28).

[표 21]

[표 22]

[표 23]

[표 24]

[표 25]

[표 26]

[표 27]

[표 28]

PTA-10212 최종 오일

DHA는 PTA-10212 최종 오일에 41.63% 및 366.9mg/g으로 존재하고, EPA는 16.52%로 존재한다. 개개 지방산 프로파일이 측정되었고, 표 29에 요약되어 있다.

[표 29]

실시예 6

실시예 5에 기재된 PTA-10208 최종 오일의 트라이아실글리세라이드(TAG)의 분석은 실시예 4에 기재된 기술을 사용하여 수행했다. 각각의 지방산 잔기의 확인을 하기 표 30에 요약된 바와 같이 수행했다.

[표 30]

실시예 7

ATCC 수탁번호 PTA-10208 및 10212로 기탁된 단리된 미생물의 2일된 접종원 플라스크를 표 1 및 2에 따르는 배지에서 탄소 및 질소-공급 배양물로서 제조하였다.

돌연변이유발은 다음 공정에 따라 수행하였다:

약 50mL의 멸균 T=2일된 플라스크를 멸균 40mL 유리 균질화기에 부었다. 배양물에 균질화기속에서 50 플런지(plunge)를 제공하였다. 배양물을 피펫팅하고 멸균 50㎛ 메쉬 필터(mesh filter)를 통해 여과하고, 이를 50mL 멸균 튜브속에 두었다(메쉬는 50㎛ 메쉬를 통해 보다 작은 집단 및 단일 세포가 통과하도록 하면서 보다 큰 콜로니 집단을 잔류시키는 수단으로서 사용하였다). 전체의 농축 침연(macerate)을 멸균 50mL 튜브속에 수집하였다. 침연된 배양물을 와동시키고 1:100배 이하 수준에서의 희석물을 제조했다. 희석된 침연 샘플은 200μL의 접종원을, 4 또는 5개 유리 비드(3mm 유리 비드)를 함유하는, 배지 한천 플레이트, 100 x 15mm에 가하기 전에 와동시켰다. 플레이트 주변 접종원에 비드가 균일하게 확산되도록 하기 위한 노력으로 각각의 플레이트를 온화하게 교반하였다. 비드를 플레이트로부터 버리고, 플레이트를 커버와 함께 약 5분 동안 두어 건조시켰다. 공정이 희미한 광속에서 수행하기 때문에 멸균 후드 및 인접한 지역에서의 광을 껐다. 공정을 수행할 수 있도록 이용가능한 광은 최소였으나, 간접 및 어두움만 존재하였다.

5개의 복제 플레이트를 XL 가교결합제(스펙트로닉스 코포레이션(Spectronics Corporation), 미국 뉴욕주)의 바닥위에 뚜껑 없이 두고, 샘플을 조사(irradiating)하였다. 마이크로주울 및 수준과 관련하여 가교결합제 전달된 힘은 90% 내지 95% 사멸을 달성한 것으로 나타났다. 5개의 복제 대조군 플레이트는 동일한 프로토콜을 사용하여 돌연변이유발되지 않은 세포와 함께 접종하였다. 이들 세포 수를 사용하여 사멸 %를 계산하였다. 조사가 완료되면, 플레이트를 제거하고, 뚜껑을 교체하고, 플레이트를 파라핀으로 싼 다음, 알루미늄 호일로 쌌다. 플레이트를 암실속에서 1주 동안 성장시켜 이들이 손상된 유전자를 복구할 수 없도록 하는 것이 필수적이었다.

플레이트를 22.5℃ 방에 약 10일 동안 둔 다음, 콜로니를 계수하였다. 최종 계수를 수행하는 경우, 개개 콜로니를 멸균 접종 루프로 집어올려 새로운 배지 플레이트위에 재스트리킹하였다. 각각의 콜로니를 개개의 플레이트위에 두었다. 플레이트가 조밀해지면, 샘플은 접종 루프를 사용하여 취하고, 50mL의 배지를 함유하는 멸균 250mL 진탕 플라스크내로 접종하였다. 당해 플라스크를 22.5℃ 방속에 200rpm에서 진탕기위에 두었다. T=7일 째에, 진탕 플라스크 배양물을 50mL 멸균 튜브내로 수거하였다. pH를 취하고, 샘플을 원심분리하여 바이오매스 펠렛을 수집하였다. 각각의 샘플을 세정하고 이소프로필 알콜 및 증류수의 50:50 혼합물에 재현탁시킨 다음, 재원심분리했다. 수집된 펠렛을 동결 건조시키고, 칭량하고, FAME 분석을 수행하였다. 표 31 및 32에서의 데이터는 각각 균주 PTA-10208 및 PTA-10212로부터 상기 과정으로 생산된 돌연변이체를 나타낸다.

[표 31]

[표 32]

실시예 8

오일을 실시예 5에 기술된 방법에 따라 제조하였고, 이때 오일을 고도 올레산 해바라기 오일로 희석하여 약 500mg/g 오일 이상의 합한 DHA + EPA 함량을 달성하였다. 본 실시예에 따라 제조된 오일의 전형적인 분석 및 생성물 명세가 하기 표 33에 제시된다.

[표 33]

오일에 함유된 다른 성분은 2% 미만의 해바라기 레시틴; 로즈마리 추출물; 토코페롤 및 아스코르빌 팔미테이트(산화방지제)를 포함한다.

실시예 9

오일을 실시예 5에 기술된 방법에 따라 제조하였고, 이때 오일을 고도 올레산 해바라기 오일로 희석하여 약 400mg/g 오일 이상의 합한 DHA + EPA 함량을 달성하였다. 본 실시예에 따라 제조된 오일의 전형적인 분석 및 생성물 명세가 하기 표 34에 제시된다.

[표 34]

오일에 함유된 다른 성분은 2% 미만의 해바라기 레시틴; 로즈마리 추출물; 토코페롤 및 아스코르빌 팔미테이트(산화방지제)를 포함한다.

일부 양태에서, 상기 실시예 8 또는 9는 약 999 내지 약 1,105mg 오일의 충전 중량의 사이즈 20 채식주의자 겔 캡슐로 제공되고, 캡슐의 총 중량은 약 1,463 내지 약 1,789mg이고, 이때 캡슐은 15분 이하의 파단 시간을 갖고, 약 24개월의 유통 기한을 갖는다.

본원에 기재된 모든 다양한 측면, 양태 및 선택사항은 임의의 모든 변형으로 조합될 수 있다.

SEQUENCE LISTING <110> DSM IP ASSETS B.V. <120> FATTY ACID COMPOSITIONS <130> 2715.270PC01 <140> PCT/US2012/047731 <141> 2012-07-20 <150> US61/510,441 <151> 2011-07-21 <160> 2 <170> PatentIn version 3.3 <210> 1 <211> 1705 <212> DNA <213> Thraustochytrium sp. <400> 1 aagatacctg gttgatcctg ccagtagtca tacgctcgtc tcaaagatta agccatgcat 60 gtgtcagtat aaatactttt actttgaaac tgcgaacggc tcattaaatc agtaattatc 120 tacatggtaa cgaaaattat atggataacc gtagtaattc tagggctaat acatgcgtaa 180 aatctgggta actggatgca tttattggat tgaagccaac attaaaaggt gattcacgat 240 aactaagcgg agcgttttag gacgctgaat cattcgagtt tctgccctat cagctgtcga 300 tggtaaggta ttggcttacc atggcgttaa cgggtaacgg agaattaggg ttcgattccg 360 gagagggagc ctgagagacg gctaccacat ccaaggaagg cagcaggcgc gtaaattgcc 420 caatgagaac ttctcgaggc agtgacaaga aatatcaaag tgatgccgtt aggtattgca 480 tttgaaatga gaacgatgta caacttctaa cgatgatcaa ttggagggca agtctggtgc 540 cagcagccgc ggtaattcca gctccaatag cgtatactaa cgttgctgca gttaaaacgc 600 ccgtagttga attagtatca tggtatttta accttattcg atgaatttga gttgaaagct 660 aggatatata ggaagcgatt cctcatttac tgtaaaaaaa ttagagtgtt tcacacagat 720 cgtaagatcg ggatatatta gtatggaata ataagatagg actttggtgc tattttgttg 780 gtttgcacac caaagtaatg attaataggg acagttgggg gtattcgtat ttaattgtca 840 gaggtgaaat tcttggattt atgaaagacg aactactgcg aaagcattta ccaaggatgt 900 tttcattaat caaggacgaa agttagggga tcgaagatga ttagatacca tcgtagtctt 960 aaccataaac tatgccgact gaggattctt gaaatttgta aatgaattta agagcactcc 1020 atgagaaatc aaagtctttg ggttccgggg ggagtatggt cgcaagtctg aaacttaaag 1080 gaattgacgg aagggcacca ccaggagtgg agcctgcggc ttaatttgac tcaacacggg 1140 aaaacttacc aggtccagac atagtgagga ttgacagatt gatagctctt tcttgattct 1200 atgggtggtg gtgcatggcc gttcttagtt ggtggtttga actgtctgct taattgcgtt 1260 aacgaacgag acctcagcct actaaatagt atgttgttta gtaataaatg atatgacttc 1320 ttagagggac atttcgggtt taccggaagg aagtttgagg caataacagg tctgtgatgc 1380 ccttagatgt tctgggccgc acgcgcgcta cactgacgag ctcaacaagt aatatttggt 1440 tgtctggaag gattgcctaa tcttttaaat actcgtcgtg atggggctag attcttgtaa 1500 ttattaatct ccaacgagga attcctagta aacgcaagtc atcagcttgc attgattacg 1560 tccctgccct ttgtacacac cgcccgtcgc acctaccgat tggatggtcc ggtgaaatct 1620 tcggatgttt ttttacaata gtagagagac aaaagttgag taaaccttac catctagagg 1680 aaggtgaagt cgtaacaagg atctt 1705 <210> 2 <211> 1713 <212> DNA <213> Schizochytrium sp. <400> 2 acctggttga tcctgccagc tgtcatttgc tcgtctaaaa gattaagcca tgcatgtcta 60 agtataaaca aattatacgg tgaaactgcg aacggctcat tatatcagtt atagtttctt 120 tgatagtgta tttctatatc tatttggata actgtggcaa ttctagagct aacacatgct 180 ttcgagtggg actttttggt accactgcat ttattagatt ttgaagccaa cgtaaaattg 240 gtgattcatg ataactttgc gaatcgcagt agcgtcttgt acgcggcgat gaatcattca 300 agtttctgcc ccatcagctg tcgatggtac ggtattggcc taccatggct ttcacgggtg 360 acggagaatt agggtttgat tccggagagg acgcttgaga gacggcgacc acatccaagg 420 aaggcagcag gcgcgtaaat tacccaatgg ggactccccg aggtagtgac aagaaataaa 480 aatgaggagc gctttgcgtt tttcaatttg aatgagagaa tcgtacaatc ctcatcgagg 540 atcaattgga gggcaagtct ggtgccagca gccgcggtaa ctccagctcc aatagcaaat 600 attagagttg ttgcagttaa aaagctcgta gttgaatttc cgatagtctt tggccgtgtc 660 cttggtctcg tatcatgggt ttattgtgcc aagatgatcg tcctctatgg ttagtgatag 720 tcatagtcgt ttactgtaaa aaaactggag tgtttaaagc atttctttgg gaaaggtaca 780 tattagtata ggataattag ataggacctg tgattcttat ttggttggtt tgtgagtcat 840 ggtaatgatt aatagggaca atcgggggta ttcgaattta attgtcagag gtgaaattct 900 tggatttaag aaagtcgaac tactgcgaag gcatttacca aggatgtttt cattaataaa 960 gaacgaaagt taggggatcg aagatgatta gataccatcg tagtcttaac tgtaaactat 1020 gccgacttgc gattgtccgt cgttgttttt tcaaaaaaga gacctgggca gcagcacatg 1080 agaaatcaaa gtttttgggt tccgggggga gtatggtcgc aaggctgaaa cttaaaggaa 1140 ttgacggaag ggcaccacca ggagtggagc ctgcggctta attcgactca acacgggaaa 1200 acttaccagg tccagacata gtaaggattg acagattgag agctctttct tgattctatg 1260 ggtggtggtg catggccgtt cttagttggt ggagtgattt gtctggttaa ttccgttaac 1320 gaacgagacc tcagcctact aaatagtggt gcatattgtg agatatgtga caaaaatcgc 1380 ttcttagagg gacatttcgg gtttaccgga aggaagtttg aggcaataac aggtctgtga 1440 tgcccctaga tgttctgggc cgcacgcgcg ctacaatgac agattcaaca agtccggtag 1500 tggagctttt gcttctctat tattactttt ccgagaggaa tggttaatct tctaaatgtc 1560 tgtcgtgatg gggctagatt tttgcaatta ttaatctcca acgaggaatt cctagtaaac 1620 gcaagtcatc agcttgcatt gattacgtcc ctgccctttg tacacaccgc ccgtcgcacc 1680 taccgattga acggtcctat gaaatcttcg gat 1713

Claims (6)

1. 오메가-3 다중불포화 지방산의 총 중량을 기준으로 90중량% 초과의 양의 도코사헥사엔산(DHA) 및 에이코사펜타엔산(EPA), 및 오메가-3 다중불포화 지방산의 총 중량을 기준으로 0 내지 2중량%의 양의 도코사펜타엔산(DPA)을 포함하는 오메가-3 다중불포화 지방산을 포함하는 미생물 오일로서,
   에이코사펜타엔산의 중량이 도코사헥사엔산 및 에이코사펜타엔산의 총 중량의 10 내지 25%이고, 도코사헥사엔산의 중량이 도코사헥사엔산 및 에이코사펜타엔산의 총 중량의 75 내지 90%이며,
   상기 미생물 오일이, 미생물 오일 1g 당 55 내지 150mg의 에이코사펜타엔산, 미생물 오일 1g 당 410 내지 540mg의 도코사헥사엔산, 및 미생물 오일 1g 당 0 내지 12mg의 도코사펜타엔산을 포함하고,
   상기 미생물 오일이 쉬조키트리움(Schizochytrium) 종의 단일 균주에 의해 생산되고,
   오메가-3 다중불포화 지방산의 총량은 오일 1g 당 400mg 이상인, 미생물 오일.
2. 제 1 항에 있어서,
   오메가-3 다중불포화 지방산의 총량은 오일 1g 당 400 내지 750mg인, 미생물 오일.
3. 제 1 항에 있어서,
   오메가-3 다중불포화 지방산의 총량은 오일 1g 당 500mg 이상인, 미생물 오일.
4. 오메가-3 다중불포화 지방산의 총 중량을 기준으로 90중량% 초과의 양의 도코사헥사엔산(DHA) 및 에이코사펜타엔산(EPA), 및 오메가-3 다중불포화 지방산의 총 중량을 기준으로 0 내지 2중량%의 양의 도코사펜타엔산(DPA)을 포함하는 오메가-3 다중불포화 지방산을 포함하는 미생물 오일로서,
   에이코사펜타엔산의 중량이 도코사헥사엔산 및 에이코사펜타엔산의 총 중량의 10 내지 25%이고, 도코사헥사엔산의 중량이 도코사헥사엔산 및 에이코사펜타엔산의 총 중량의 75 내지 90%이며,
   상기 미생물 오일이, 미생물 오일 1g 당 55 내지 150mg의 에이코사펜타엔산, 미생물 오일 1g 당 410 내지 540mg의 도코사헥사엔산, 및 미생물 오일 1g 당 0 내지 12mg의 도코사펜타엔산을 포함하고,
   상기 미생물 오일이 쉬조키트리움(Schizochytrium) 종의 단일 균주에 의해 생산되고,
   오메가-3 다중불포화 지방산의 총 중량을 기준으로 1:4 내지 1:7의 EPA:DHA의 비를 포함하는, 미생물 오일.
5. 제 1 항 내지 제 4 항 중 어느 한 항의 미생물 오일을 포함하는 경구 투약 조성물.
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