KR101362989B1 - 지질 개선제 및 지질 개선제를 함유하는 조성물 - Google Patents

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Abstract

다가 불포화 지방산이 트리글리세리드의 2-위치에 결합된 트리글리세리드를 함유하는 지질 개선제.

Description

지질 개선제 및 지질 개선제를 함유하는 조성물{LIPID-IMPROVING AGENT AND COMPOSITION CONTAINING LIPID-IMPROVING AGENT}
본 발명은 다가 불포화 지방산을 함유하며 다가 불포화 지방산을 포함하는 구조화된 지질을 갖는 신규한 지질 개선제에 관한 것이다.
지방은 단백질, 당질과 함께 중요한 영양소로, 특히 고에너지원으로서 유용하다. 그러나, 지방은 칼로리가 높아 (9 kcal/g), 비만을 조장하여 생활습관병 등의 문제를 일으키는 원인이 된다. 실제로, 고지혈증 (고콜레스테롤혈증, 고트리글리세리드혈증)인 것으로 판정된 경우, 제일 치료법으로는 식사요법이 사용되며, 적절한 식사요법, 운동요법이 병용될 경우, 흔히 증세가 호전되어 정상화되는 경우도 있다. 그러나, 지방은 식욕을 증진시키고, 현대인은 지방을 다량 함유하는 식품을 자주 먹기 때문에, 섭식 상태가 좋은 선진국에서는 지방의 섭취 과다가 문제가 되고 있다.
고트리글리세리드 혈증의 다수는 과식, 운동 부족, 비만, 알코올 과음의 결과이므로, 동시에 고혈압이나 당뇨병을 합병시키는 경우가 많다. 따라서, 위험인자가 중복되는 경우나 일상의 생활관습의 개선이 곤란한 경우가 많고, 허혈성 심질환의 발병을 방지하기 위해서, 적극적인 약물 요법을 실시하는 경우가 증가하고 있다.
고트리글리세리드 혈증에 대한 약물로는 피브레이트계 약물 (일본에서는, 베자피브레이트) (Bezatol SR
Figure 112011071469610-pat00001
및 Bezalip
Figure 112011071469610-pat00002
)과 페노피브레이트 (Lipantil
Figure 112011071469610-pat00003
)가 2세대 피브레이트계 약물로서 알려져 있다. 피브레이트계 약물의 주된 작용 메카니즘은 핵내 수용체형 전사 인자 α (PRARα: peroxisome proliferator-activated receptor α)의 활성화를 매개하는 것이다.
따라서, 지방산의 β산화가 항진되어 간장 트리글리세리드 생성이 저하하고, 그 결과 VLDL-TG 생성이 억제된다. 또한, PRARα의 활성화는 LPL 활성을 높이고, 트리글리세리드가 풍부한 리포단백질의 이화(異化)가 항진된다. 또한, 아포 AI 및 AII의 생성 증가나 아포 CIII의 생성 억제가 야기된다. 그 외, 피브레이트계 약제에는 간장에서의 콜레스테롤의 합성 억제, 인슐린 감수성 항진, 이에 더해 담즙에의 콜레스테롤 분비 항진 작용도 있는 것으로 알려져 있다. 그 결과 피브레이트계 약제는 혈청 트리글리세리드값을 20-50% 저하시켜, HDL-콜레스테롤을 10-15% 상승시킨다.
그 외의 약제로서, 니코틴산 제제 (니세리트롤 (Perycit
Figure 112011071469610-pat00004
) 및 니코몰 (Cholexamin
Figure 112011071469610-pat00005
)이 고트리글리세리드혈증 및 혼합형 고지혈증 (고트리글리세리드혈증, 고콜레스테롤혈증, 및 저HDL콜레스테롤혈증을 수반함)에 대해 유용성이 인정되고 있다. 니코틴계 약제의 주된 작용 메카니즘은, 지방산 합성 저해, 지방산의 간장으로의 동원 억제, 그리고 간장 지방산의 에스테르화 억제에 의한 간장 트리글리세리드를 저하시키는 것이다. 현재, 피브레이트계 약물이 제일 선택약으로서 사용되고 있으나, 약물 요법은, 간장 기능 장해, 신장기능 장해, 근육병증(myopathy) 등의 부작용의 발현에 유의할 필요가 있다. 또한, 약물의 부작용의 대부분은 투여 개시후 6개월 이내에 발현하므로, 투여 개시 또는 증량 후의 6개월, 적어도 3-4개월간은 약물의 효과 검정과 함께 부작용의 발생에 주의할 필요가 있다. 따라서, 이러한 약물의 섭취에는 세심한 주의가 요구되고, 예방적으로 이들을 섭취하는 것은 불가능하였다.
현재, 예방적인 수단으로서, 유지 대체물, 비흡수성 유지의 개발이 수행되고 있고, 그 중에서도 대표적인 것으로, 수크로스 지방산 폴리에스테르 (미국특허 제3,600,186호)를 들 수 있다. 이것은 체내에서 흡수되지 않고 배설되므로 유지 유래의 칼로리는 0 kcal/g이다. 그러나, 지용성 비타민의 흡수가 저해되고, 필수 지방산의 공급원이 아니므로 상용하는 유지로 될 수는 없다. 따라서, 근년, 필수 지방산의 공급원으로서의 기능을 고려한 것으로서 디아실글리세리드가 개발되었다.
디아실글리세리드는, 트리글리세리드의 1,3-위치에 지방산이 주로 결합된 것으로, 흡수시 1,3-위치 특이적 췌장 리파제에 의해 지방산이 절단되어, 결과된 글리세리드와 지방산이 되어 장관 흡수된다. 그러나 이들은, 소장 상피 세포에서 트리글리세리로 재구축되지 않고 문맥흡수되어 직접 간으로 운반된다. 따라서, 지방 축적이 억제된다. (트리글리세리드의 경우는, 2-아실모노글리세리드와 지방산으로 장관 흡수되어, 소장 상피 세포에서 트리글리세리드로 재구축되어, 카일로마이크론에 흡수되어 림프로 분비되어 말초 조직을 순환한다).
그러나, 개발된 유지 대체물들 중 어떠한 것도, 약제의 효과와 같이 적극적으로 체내에서 지방을 연소 (β산화) 시키는 것은 없고, 효과도 한정적이었다. 또한, 흡수 억제를 목적으로 한 췌장 리파제의 저해제도 개발되어 있지만, 이들의 효과도 한정적이다.
발명의 개시
따라서, 지질개선 작용을 나타내면서도 식품에의 적응성이 우수한 부작용이 적은 화합물의 개발이 강력히 요망되고 있다.
따라서, 본 발명은 트리글리세리드의 2-위치에 다가 불포화 지방산이 결합된 트리글리세리드, 또는 트리글리세리드의 2-위치에 다가 불포화 지방산이 결합되고 1,3-위치에 포화 지방산 및/또는 모노 불포화 지방산이 결합된 트리글리세리드를 유효 성분으로 하는 지질 개선제, 지질 개선 작용을 갖는 음식물 및 그의 제조 방법을 제공하고자 하는 것이다.
더욱 상세하게는, 본 발명의 목적은 트리글리세리드의 2-위치에 오메가 6계, 오메가 3게 또는 오메가 9계 다가 불포화 지방산이 결합된 트리글리세리드 및, 트리글리세리드의 2-위치에 오메가 6계, 오메가 3계 또는 오메가 9계 다가 불포화 지방산이 결합되어 있고, 1,3-위치에 탄소수 8 이상의 포화 및/또는 모노 불포화 지방산이 결합된 트리글리세리드 중에서 선택된 적어도 1종을 유효 성분으로 하고, 지질 개선 작용, 구체적으로는 혈액 중의 중성 지방 (트리글리세리드) 및/또는 콜레스테롤을 저하, 혈액 중의 HDL-콜레스테롤을 증가, 축적 체지방을 연소 (β산화 항진), 식사성 지방을 연소 (β산화 항진), 핵내 수용체형 전사 인자인 간장의 PPARα 및/또는 관련 유전자 발현을 억제하는 지질 개선제, 음식물 및 그의 제조 방법을 제공하는데 있다.
본 발명자들은 고트리글리세리드혈증의 제일 선택약인 피브레이트계 약물의 작용 메카니즘이 되는 지질 대사에 관여하는 핵내 수용체형 전사 인자 (PPAR)을 활성화하는 성분의 스크리닝을 실시하였다. 유지는 그 섭취되면 소장 상피 세포에서는 PPARα mRNA의 발현을 증가시키고, 지방산 및 비타민 A의 흡수를 촉진하며, 간장에서는 PPARα mRNA의 발현을 증가시키고, 지방산의 β산화를 항진하는 것으로 알려져 있다. 또한, 이 PPAR의 리간드로는, 포화 지방산 및 모노 불포화 지방산 보다 다가 불포화 지방산이 더 효과적이라는 것도 알려져 있다. 따라서, 본 발명자들은 PPAR을 활성화시키는 안전한 천연 성분으로서 다가 불포화 지방산에 주목하였다.
유지는 흡수시, 1,3-위치 특이적 췌장 리파제에 의해 1,3-위치 결합된 지방산이 절단되므로, 트리글리세리드의 1,3-위치에 다가 불포화 지방산을 결합시킨 트리글리세리드가 이상적인 트리글리세리드 구조라는 가정에 기초하여 집중적으로 연구하였다. 그러자 놀랍게도 트리글리세리드의 2-위치에 다가 불포화 지방산이 결합된 트리글리세리드 및, 트리글리세리드의 2-위치에 다가 불포화 지방산이 결합하고, 1,3-위치에 포화 지방산 및/또는 모노 불포화 지방산이 결합된 트리글리세리드 쪽이, PPAR을 더욱 잘 활성화시킨다는 것을 발견하였다. 이러한 본 발명자들의 연구 결과는 2-위치에 결합한 다가 불포화 지방산은 1,3-위치 특이적 췌장 리파제로는 절단되지 않기 때문에, PPAR이 거의 활성화되지 않을 것으로 예상된 것과는 전혀 반대의 결과로서, 이에 기초하여 본 발명을 달성하기에 이르렀다.
따라서, 본 발명자들은 트리글리세리드의 2-위치에 다가 불포화 지방산이 결합된 트리글리세리드 또는, 트리글리세리드의 2-위치에 다가 불포화 지방산이 결합하고, 1,3-위치에 포화 지방산 및/또는 모노 불포화 지방산이 결합된 트리글리세리드를 유효 성분으로 하는 지질 개선제, 지질 개선 작용을 갖는 음식물 및 그의 제조 방법을 제공하는 것이다.
더욱 구체적으로, 본 발명은 트리글리세리드의 2-위치에 오메가 6계, 오메가 3계 또는 오메가 9계 다가 불포화 지방산이 결합한 트리글리세리드 및, 트리글리세리드의 2-위치에 오메가 6계, 오메가 3계 또는 오메가 9계 다가 불포화 지방산이 결합하고, 1,3-위치에 탄소수 8 이상의 포화 및/또는 모노 불포화 지방산이 결합된 트리글리세리드로부터 선택된 적어도 1종을 유효 성분으로 하고, 지질 개선 작용, 구체적으로는 혈액 중의 중성 지방 (트리글리세리드) 및/또는 콜레스테롤을 저하, 혈액 중의 HDL-콜레스테롤을 증가, 축적 체지방을 연소 (β산화 항진), 식사성 지방을 연소 (β산화 항진), 핵내 수용체형 전사 인자인 간장의 PPARα 및/또는 관련 유전자 (예컨대, 간장 β산화 효소 유전자) 발현을 증가시키고, 지방 조직의 PPARγ 및/또는 관련 유전자 발현을 억제하는 지질 개선제, 음식물 및 그의 제조 방법을 제공하는 것이다.
본 발명에 따라, 트리글리세리드의 2-위치에 다가 불포화 지방산이 결합된 트리글리세리드, 또는 트리글리세리드의 2-위치에 다가 불포화 지방산이 결합되고, 1,3-위치에 포화 지방산 및/또는 모노 불포화 지방산이 결합된 트리글리세리드를 유효 성분으로 하는 지질 개선제, 지질 개선작용을 갖는 음식물 및 그의 제조 방법을 제공하는 것이 가능하다. 본 발명은 현대 사회의 인류에 특히 유용하다.
발명 수행을 위한 구체예
본 발명은, 트리글리세리드의 2-위치에 다가 불포화 지방산이 결합된 트리글리세리드, 또는 트리글리세리드의 2-위치에 다가 불포화 지방산이 결합되고, 1,3-위치에 포화 지방산 및/또는 모노 불포화 지방산이 결합된 트리글리세리드를 유효 성분으로 하는 지질 개선제, 지질 개선작용을 갖는 음식물 및 그의 제조 방법에 관한 것이다.
본 발명의 화합물 및 이 화합물을 함유하여 되는 조성물은, 지질 개선 작용, 구체적으로는 중성 지방 (트리글리세리드) 및/또는 콜레스테롤을 저하, 혈액 중의 HDL-콜레스테롤을 증가, 축적 체지방을 연소 (β산화 항진), 식사성 지방을 연소 (β산화 항진), 및 메카니즘 적으로는, 간장에서는 핵내 수용체형 전사인자인 PPARα 및/또는 관련 유전자 (예컨대, 아실 CoA 옥시다제를 필두로 하는 β산화계효소, 탈공액 단백질 (UCP-2) 등)의 발현을 증가시키고, 지방산 합성효소 (FAS)유전자 발현을 억제하며, 지방 세포에서는 PPARγ 및/또는 관련 유전자 (예컨대, 지방세포 특이적 지방 결합 단백질 (aP2), 탈공액 단백질 (UCP-2)등)의 발현을 억제하며, 아실 CoA 옥시다제를 필두로 하는 β산화계효소 및/또는 탈공액 단백질 (UCP-2) 유전자의 발현을 증가시키고, 지방산 합성 효소 (FAS) 유전자 발현을 억제하는 예방 또는 개선을 목적으로 하는 음식물, 건강 식품, 기능성 식품, 특정 보건용 식품, 유아용 식품, 노인용 식품, 의약품, 의약외품 등으로서 유효하다.
본 발명의 화합물은, 트리글리세리드의 2-위치에 다가 불포화 지방산이 결합된 트리글리세리드, 및, 트리글리세리드의 2-위치에 다가 불포화 지방산이 결합되고, 1,3-위치에 포화 지방산 및/또는 모노 불포화 지방산이 결합된 트리글리세리드를 이용할 수 있다.
2-위치에 결합되는 다가 불포화 지방산의 특정예로는 오메가 6계 불포화 지방산(9,12-옥타데카디엔산 (리놀레산) 18:2ω6, 6,9,12-옥타데카트리엔산(γ-리놀렌산), 18:3ω6, 8,11,14-에이코사트리엔산 (디호모-γ-리놀렌산) 20:3ω6, 5,8,11,14-에이코사트리엔산 (아라키돈산), 20:4ω6, 7,10,13,16-도코사테트라엔산 22:4ω6 또는 4,7,10,13,16-도코사펜타엔산 22:5ω6), 오메가 3계 불포화 지방산 (9,12,15-옥타데카트리엔산 (α-리놀렌산) 18:3ω3, 6,9,12,15-옥타데카테트라엔산 (스테아리돈산) 18:4ω3, 11,14,17-에이코사트리엔산 (디호모-α-리놀렌산) 20:3ω3, 8,11,14,17-에이코사테트라엔산 20:4ω3, 5,8,11,14,17-에이코사펜타엔산 20:5ω3, 7,10,13,16,19-도코사펜타엔산 22:5ω3 또는 4,7,10,13,16,19-도코사헥사엔산 22:6ω3) 및 오메가 9계 불포화 지방산 (6,9-옥타데카디엔산 18:2ω9, 8,11-에이코사디엔산 20:2ω9 또는 5,8,11-에이코사트리엔산 (미드산) 20:3ω9)를 들 수 있으나 이에 한정되지 않으며, 탄소수 18 이상, 이중 결합을 2개 이상 갖는 다가 불포화 지방산이면 어느 것이든 사용할 수 있다. 또한, 1,3-위치에 결합하는 포화 지방산 및/또는 모노 불포화 지방산의 예로는, 옥탄산 (카프릴산) 8:0, 데칸산 (카프르산) 10:0, 도데칸산 (라우르산) 12:0, 테트라데칸산 (미리스트산) 14:0, 헥사데칸산 (팔미트산) 16:0, 옥타데칸산 (스테아르산) 18:0, 9-옥타데칸산 (올레산) 18:1ω9, 아라키드산 20:0 및 베헨산 22:0을 들 수 있으나 이에 한정되지 않으며, 탄소수 8 이상인 포화 지방산 또는 모노 불포화 지방산이면 어느 것이든 사용할 수 있다. 1위 및 3위에 결합하는 지방산은 동일하거나 또는 조합시켜 사용할 수 있음은 물론이다.
구체적인 화합물로는, 트리글리세리드: 1,3-디팔미토일-2-아라키도노일 글리세리드 (16:0-20:4ω6-16:0), 1,3-디팔미토일-2-5,8,11,14,17-에이코사펜타노일 글리세리드 (16:0-20:5ω3-16:0), 1,3-디팔미토일-2-4,7,10,13,16,19-도코사헥사노일 글리세리드 (16:0-22:6ω3-16:0), 1, 3-디팔미토일-2-디호모-γ-리놀레노일 글리세리드 (16:0-20:3ω6-16:0), 1,3-디팔미토일-2-미드노일 글리세리드 (16:0-20:3ω9-16:0), 1,3-디카프릴로일-2-아라키도노일 글리세리드(8:0-20:4ω6-8:0), 1,3-디카프릴로일-2-5,8,11,14,17-에이코사펜타노일 글리세리드(8:0-20:5ω3-8:0), 1,3-디카프릴로일-2-4,7,10,13,16,19-도코사헥사노일 글리세리드 (8:0-22:6ω3-8:0), 1,3-디카프릴로일-2-디호모-γ-리놀레노일 글리세리드(8:0-20:3ω6-8:0), 1,3-디카프릴로일-2-미드노일 글리세리드 (8:0-20:3ω9-8:0), 1,3-디올레오일-2-아라키도노일 글리세리드 (18:1ω9-20:4ω6-18:1ω9), 1,3-디올레오일-2-5,8,11,14,17-에이코사펜타노일 글리세리드(18:lω9-20:5ω3-18:1ω9), 1,3-올레오일-2-4,7,10,13, 16,19-도코사헥사노일 글리세리드 (18:lω9-22:6ω3-18:lω9), 1,3-디올레오일-2-디호모-γ-리놀레노일 글리세리드 (18:lω9-20:3ω6-18:1ω9) 및/또는 1,3-디올레오일-2-미드노일 글리세리드 (18:lω9-20:3ω9-18:lω9)를 들 수 있으나 이에 한정되지 않으며, 트리글리세리드의 2-위치에 다가 불포화 지방산이 결합된 트리글리세리드, 및 트리글리세리드의 2-위치에 다가 불포화 지방산이 결합되고, 1,3-위치에 포화 지방산 및/또는 모노 불포화 지방산이 결합된 트리글리세리드이면 어느 것이든 이용할 수 있다.
본 발명의 유효 성분의 한가지는, 트리글리세리드의 2-위치에 다가 불포화 지방산이 결합되고, 1,3-위치에 포화 지방산 및/또는 모노 불포화 지방산이 결합된 트리글리세리드로서, 예컨대 다음과 같은 방법에 의해 제조될 수 있다.
2-위치에 다가 불포화 지방산이 결합되고, 1,3-위치에 포화 지방산 및/또는 모노 불포화 지방산이 결합된 트리글리세리드의 구체적인 제조 방법의 한가지는, 다가 불포화 지방산을 구성 지방산으로서 함유하는 유지 (트리글리세리드) 및 포화 지방산 및/또는 모노 불포화 지방산의 존재 하에, 트리글리세리드의 1,3-위치의 에스테르 결합에만 작용하는 리파제를 작용시키는 것이다.
원료로서 사용하는 유지 (트리글리세리드)는, 오메가 6계 다가 불포화 지방산, 오메가 3계 다가 불포화 지방산 및/또는 오메가 3계 다가 불포화 지방산을 구성 지방산으로서 함유하는 트리글리세리드이다. 트리글리세리드를 구성하는 전지방산에 대한 다가 불포화 지방산의 비율이 높은 경우에는, 미반응 유지 (원료 트리글리세리드 및 1,3-위치의 지방산 중 한쪽이 포화 지방산 및/또는 모노 불포화 지방산으로 된 트리글리세리드)의 증가에 의한 반응 수율의 저하를 방지하기 위해, 효소 반응 온도를 통상의 효소 반응 온도인 20-30℃보다 높은 30-50℃, 바람직하게는 40-50℃로 한다.
트리글리세리드의 1,3-위치의 에스테르 결합에 특이적으로 작용하는 리파제로는, 예컨대 리조푸스 (Rhizopus)속, 리조뮤코 (Rhizomucor)속, 아스퍼질러스 (Aspergillus)속 등의 미생물이 생산하는 것, 및 돼지의 췌장 리파제 등을 들 수 있다. 이러한 리파제로는 시판되는 것을 이용할 수 있다. 예컨대, 리조푸스 델레마 (Rhizopus delemar)의 리파제 (탈리파제, 타나베 세이야쿠사 제품), 리조뮤코 미에헤이 (Rhizomucor miehei)의 리파제 (리보자임 IM, 노보 노르디스크사 제품), 아스퍼질러스 나이거 (Aspergillus niger)의 리파제 (리파제 A, 아마노 세이야쿠사 제품) 등을 들 수 있으나, 이들 효소로 한정되는 것은 아니며, 1,3-위치 특이적 리파제이면 어느 것이든 사용할 수 있다.
전술한 리파제의 사용 형태는, 반응 효율을 높일 목적으로 반응 온도를 30℃ 이상, 바람직하게는 40℃ 이상으로 하기 때문에, 효소의 내열성을 부가할 목적에서 고정화 담체에 고정화시킨 리파제를 사용하는 것이 바람직하다. 고정화 담체로서 Dowex Marathon WBA (상표; Dow Chemical)등과 같이 약 100Å 이상의 공경을 갖는 다공성 수지인 이온 교환 수지를 들 수 있다.
고정화 담체 1에 대해, 1,3-위치 특이적 리파제의 수용액 0.5-20배 중량으로 현탁하고, 현탁액에 대해 2-5배량의 차가운 아세톤 (예컨대, -80℃)를 교반하면서 서서히 가하여 침전을 형성시킨다. 이 침전물을 감압하에서 건조시켜 고정화 효소를 조제할 수 있다.
더욱 간편한 방법으로는, 고정화 담체 1에 대해, 0.05-0.4배량의 1,3-위치 특이적 리파제를 최소한의 물에 용해시켜, 교반하면서 고정화 담체를 혼합하면서, 감압하에서 건조시켜 고정화 효소를 조제할 수 있다. 이 조작에 의해 약 90%의 리파제가 담체에 고정화되지만, 이대로는 에스테르 교환활성이 전혀 나타나지 않는다. 따라서, 물 1-10% (w/v)를 가한 기질 (원료 유지와 중쇄 지방산) 중에서, 바람직하게는 물 1-3%를 가한 기질 중에서 전처리 함으로써 고정화 효소는 최고의 효율로 활성화될 수 있으며 제조에 사용될 수 있다.
효소의 종류에 따라서는, 본 반응계에 가해진 수분량이 극히 중요하다. 따라서, 물을 함유하지 않는 경우에는 에스테르 교환이 진행하기 어려워지고, 또, 수분량이 많은 경우에는 가수분해가 일어나, 글리세리드의 회수율이 저하한다 (가수분해가 일어나면 디글리세리드, 모노글리세리드가 생성된다). 그러나, 이 경우, 전처리에 의해 활성화된 고정화 효소를 사용함으로써, 본 반응계에 첨가된 수분량은 중요하지 않게 되어, 물을 전혀 함유하지 않은 계에서도 효율 좋게 에스테르 교환반응을 일으킬 수 있다. 또한, 효소제의 종류를 적절히 선택함으로써 전처리를 생략하는 것도 가능하다.
이와 같이, 내열성을 갖는 고정화 효소를 사용하고, 효소 반응 온도를 높이면, 1,3-위치 특이적 리파제에 반응 특이성이 낮은 다가 불포화 지방산을 구성 지방산으로 하는 유지 (트리글리세리드)에 있어서도, 반응 효율을 저하시킴이 없이, 2-위치에 다가 불포화 지방산이 결합하고, 1,3-위치에 포화 지방산 및/또는 모노 불포화 지방산이 결합된 트리글리세리드를 효율적으로 제조할 수 있다.
원료로 사용 되는 유지 (트리글리세리드)는, 오메가 6계 다가 불포화 지방산, 오메가 3계 다가 불포화 지방산 및/또는 오메가 3계 다가 불포화 지방산을 구성지방산으로 하는 트리글리세리드이고, 예컨대, 오메가 6계 다가 불포화 지방산을 구성 지방산으로 하는 트리글리세리드로는, 월견초유 (9,12-옥타데카디엔산 (리놀레산) 및 6,9,12-옥타데카트리엔산 (γ-리놀렌산)) 및 보라지유 (9,12-옥타데카디엔산 (리놀레산) 및 6,9,12-옥타데카트리엔산 (γ-리놀렌산))을 들 수 있다. 또한, 5,8,11,14-에이코사테트라엔산 (아라키돈산) 및 8,11,14-에이코사트리엔산 (디-호모-γ-리놀레산)의 효과적인 제조 공정이 본 발명자들에 의해 개발되었으며 (P86-0087; JP-A-5-91887) 이러한 유지 역시 효소 반응의 원료 유지로서 사용할 수 있다.
오메가 9계 다가 불포화 지방산을 구성 지방산으로 하는 트리글리세리드의 경우, 6,9-옥타데카디엔산 18:3ω9, 8,11-에이코사디엔산 20:2ω9 또는 5,8,11-에이코사트리엔산 (미드산) 20:3ω9을 구성 지방산으로 하는 트리글리세리드의 효과적인 제조 공정이 본 발명자들에 의해 개발되었으며 (JP-A-5-91888, 10-57085 및 5-91886) 이러한 유지 역시 효소 반응의 원료 유지로서 사용할 수 있다.
오메가 3계 다가 불포화 지방산을 구성 지방산으로 하는 트리글리세리드의 경우, 참치, 가다랭이, 정어리, 고등어, 꽁치, 대구, 오징어, 전갱이 등의 어유를 효소 반응의 원료 유지로서 사용할 수 있다. 또, 어유에는 트리글리세리드에 결합하는 전지방산이 오메가 3계 다가 불포화 지방산으로 한정되지 않고, 일부, 오메가 6계 다가 불포화 지방산도 구성 지방산으로서 결합되어 있다. 크릴 및 클로렐라, 스피룰리나와 같은 조류로부터 추출된 유지 역시 효소 반응의 원료 유지로서 사용할 수 있다.
나아가, 4,7,10,13,16,19-도코헥사엔산 22:6ω3을 구성 지방산으로 하는 트리글리세리드를 생산하는 미생물로서 알려져 있는, 크립테코데늄 (Crypthecodenium)속, 트라우스토키트리움 (Thraustochytrium)속, 쉬조키트리움 (Schizochytrium)속, 울케니아 (Ulkenia)속, 자포노키토리움 (Japonochytorium)속 또는 할리프토로스 (Haliphthoros)속의 미생물을 배양하여 얻은 유지도 효소 반응의 원료 유지로서 사용할 수 있다.
원료로서 포화 지방산 및/또는 모노 불포화 지방산으로서, 식물 유지로부터 추출된 포화 지방산 및/또는 모노 불포화 지방산, 탄소수 8-12의 중쇄지방산을 효소반응의 원료로서 사용할 수 있다. 또한, 원료는 지방산, 지방산염, 지방산의 알코올 에스테르 및/또는 트리글리세리드로서 반응시킬 수 있다.
본 발명의 활성 성분이, 트리글리세리드의 2-위치에 다가 불포화 지방산이 결합되고, 1,3-위치에 포화 지방산 및/또는 모노 불포화 지방산이 결합된 트리글리세리드이지만, 옥탄산 (카프릴산) 8:0 및 9-옥타데칸산 (올레산) 18:1ω9가 PPAR 유전자의 발현을 증진시킨다는 것이 알려져 있으므로, 이러한 지방산을 1,3-위치에 결합시킨 트리글리세리드는 보다 효과적인 지질 개선제로 될 수 있다.
효소법으로 얻어진 트리글리세리드는, 2-위치에 다가 불포화 지방산이 결합되고, 1,3-위치에 포화 지방산 및/또는 모노 불포화 지방산이 결합된 지질 개선 작용을 갖는 트리글리세리드를 100%로 제공하지 않지만, 발명의 요지 상, 해당 트리글리세리드를 5몰% 이상, 바람직하게는 10몰% 이상, 더욱 바람직하게는 20몰% 이상, 가장 바람직하게는 30몰% 이상 함유하는 유지 (트리글리세리드)도 지질 개선 작용을 갖는 트리글리세리드라는 것은 명백하다.
더우기, 2-위치에 다가 불포화 지방산이 결합되고, 1,3-위치에 포화 지방산 및/또는 모노 불포화 지방산이 결합된 트리글리세리드를 얻는 방법은, 효소 합성에 한정되지 않으며, 화학 합성을 포함하는 여하한 방법을 사용할 수 있음도 자명하다.
지질 개선 작용을 갖는 조성물의 제조법에서는, 트리글리세리드의 2-위치에 다가 불포화 지방산이 결합되고, 1,3-위치에 포화 지방산 및/또는 모노 불포화 지방산이 결합된 트리글리세리드를 단독으로, 또는 조합시켜, 트리글리세리드의 2-위치에 다가 불포화 지방산이 결합되고 1,3-위치에 포화 지방산 및/또는 모노 불포화 지방산이 결합된 트리글리세리드를 실질적으로 함유하지 않거나, 또는 함유하여도 근소한 양으로 함유하는 식품 원료와 함께 배합시킬 수 있다. 여기서, 근소한 양이란, 음식물 원료에 트리글리세리드의 2-위치에 다가 불포화 지방산이 결합되고 1,3-위치에 포화 지방산 및/또는 모노 불포화 지방산이 결합된 트리글리세리드가 함유되어 있다고 해도, 그것을 배합한 식품 조성물을 사람이 섭취하여도, 후술하는 1일 다가 불포화 지방산의 섭취량에는 미치지 않는 양을 의미한다.
본 발명의 화합물은 트리글리세리드이고, 그의 용도에 관해서는 무한한 가능성이 있다. 식품, 음료, 의약품, 의약부외품의 원료 및 첨가물로서 사용할 수 있다. 그리고, 그의 사용 목적, 사용량에 관해서는 어떠한 제한도 없다.
예컨대, 식품 조성물로서는, 일반식품 외에, 기능성 식품, 영양보조식품, 미숙아용 조제유, 유아용 조제유, 유아용 식품, 임산부 식품 또는 노인용 식품 등을 들 수 있다. 유지를 함유하는 식품의 예로는 고기, 생선, 또는 너트류 등 본래 유지를 함유하는 천연 식품, 국물 등 조리시에 유지를 가하는 식품, 도넛 등 가열 매체로서 유지를 사용하는 식품; 버터 등 유지 식품, 쿠키 등 가공시에 유지를 가하는 가공 식품, 또는 딱딱한 비스켓 등 가공 마무리시에 유지를 분무 또는 도포하는 식품 등을 들 수 있다. 또한, 유지를 함유하지 않는 농산 식품, 발효 식품, 축산 식품, 수산 식품, 또는 음료에 첨가할 수도 있다. 뿐만 아니라, 기능성 식품, 의약품, 의약부외품의 형태도 허용되며, 예컨대, 경장영양제, 분말, 과립, 트로키, 내복액, 현탁액, 에멀젼, 시럽 등의 가공형태도 좋다.
또한 본 발명의 조성물은, 본 발명의 유효 성분 이외에, 일반적으로 음식물, 의약품 또는 의약부외품에 사용되는 각종 담체나 첨가물을 함유할 수도 있다. 특히 본 발명의 유효 성분의 산화 방지를 방지하기 위한 목적으로 항산화제를 함유하는 것이 바람직하다. 항산화제로는 예컨대, 토코페롤, 플라본 유도체, 필로둘신, 코지산, 갈산 유도체, 카테킨, 푸키산, 고씨폴, 피라진 유도체, 세사몰, 과이아올, 과이아스산, p-쿠말산, 노르-디히드로과이아레트산, 스테롤, 테르펜, 핵산 염기, 카로티노이드 및 리그난과 같은 천연 항산화제 및 아스코르브산 팔미테이트, 아스코르브산 스테아레이트, 부틸히드록시아니솔 (BHA), 부틸히드록시톨루엔 (BHT), 모노-3차-부틸히드로퀴논 (TBHQ) 및 4-히드록시메틸-2,6-디-3차-부틸페놀 (HMBP)과 같은 합성 항산화제를 들 수 있다. 토코페롤의 예로는 α-토코페롤, β-토코페롤, γ-토코페롤, δ-토코페롤, ε-토코페롤, ζ-토코페롤, η-토코페롤 및 토코페롤 에스테르 (아세트산 토코페롤 등) 등을 들 수 있다. 또한, 카로티노이드로는 예컨대 β-카로틴, 칸타잔틴 및 아스타잔틴을 들 수 있다.
본 발명의 조성물은, 본 발명의 유효 성분 이외에, 담체로서, 각종 캐리어 담체, 익스텐더, 희석제, 증량제, 분산제, 부형제, 결합제 용매 (예컨대, 물, 에탄올, 식물유), 용해보조제, 완충제, 용해촉진제, 젤화제, 현탁화제, 소맥분, 쌀가루, 전분, 옥수수 전분, 다당류, 유단백질, 콜라겐, 쌀유, 레시틴 등을 함유할 수 있고, 첨가제로는, 예컨대, 비타민, 감미료, 유기산, 착색제, 향료, 습화방지제, 화이버, 전해질, 미네랄, 영양소, 항산화제, 보존제, 방향제, 습윤제, 천연의 음식물 추출물, 야채 추출물 등을 함유할 수 있으나 이에 한정되지 않는다.
본 발명의 화합물은 트리글리세리드의 형태를 하고 있으나, 활성 본체는 핵내 수용체형 전사 인자 (PPAR)의 리간드로 되는 트리글리세리드의 2-위치에 결합된 다가 불포화 지방산이다. 1일 당 식사로부터 얻는 아라키돈산의 섭취량은 관동 지구에서는 0.14 g, 관서 지구에서는 0.19-0.20 g으로 보고된 바 있고 (지질영양학 4, 73-82, 1995), 그에 상당하는 양 또는 그 이상을 아라키돈산의 섭취 목표량으로 할 수 있다.
따라서, 본 발명의 트리글리세리드의 2-위치에 아라키돈산이 결합된 트리글리세리드, 또는 트리글리세리드의 2-위치에 아라키돈산이 결합되고, 1,3-위치에 포화 지방산 및/또는 모노 불포화 지방산이 결합된 트리글리세리드의 성인 (예컨대, 체중 60 kg으로서) 1일 섭취량은, 아라키돈산량으로 환산해서, 0.001 g 내지 20 g, 바람직하게는 0.01 g 내지 10 g, 더욱 바람직하게는, 0.05 내지 5 g, 가장 바람직하게는 0.1 내지 2 g이다. 또한, 5,8,11,14,17-에이코사펜타엔산 20:5ω3, 7,10,13,16,19-도코사펜타엔산 22:5ω3 및 4,7,10,13,16,19-도코사헥사엔산 22:6ω3 도코사헥사엔산의 1일 섭취량은 관동 지구에서는 각각 0.15, 0.05 및 0.27-0.37, 관서 지구에서는 각각 0.35, 0.12-0.14 및 0.69-0.82로 보고되어 있고, 그에 상당하는 양 또는 그 이상을 아라키돈산의 섭취 목표량으로 할 수 있다.
본 발명의 트리글리세리드의 2-위치에 다가 불포화산이 결합된 트리글리세리드, 또는 트리글리세리드의 2-위치에 다가 불포화산이 결합되고, 1,3-위치에 포화 지방산 및/또는 모노 불포화 지방산이 결합된 트리글리세리드 및 전술한 트리글리세리드를 함유하는 유지 (트리글리세리드)를 실제로 음식물에 적용할 경우에는, 식품에 배합되는 다가 불포화 지방산의 절대량도 중요하다.
그러나, 음식물에 배합되는 절대량도, 배합되는 음식물의 섭취량에 의해 변화할 수 있기 때문에, 다가 불포화 지방산으로 환산해서 0.003 중량% 이상, 바람직하게는 0.03 중량% 이상, 더욱 바람직하게는 0.3 중량% 이상으로 배합한다. 이에 더하여, 트리글리세리드의 2-위치에 아라키돈산이 결합된 트리글리세리드, 또는 트리글리세리드의 2-위치에 아라키돈산이 결합되고, 1,3-위치에 포화 지방산 및/또는 모노 불포화 지방산이 결합된 트리글리세리드를 음식물에 배합하는 경우에는, 0.001 중량% 이상, 바람직하게는 0.01 중량% 이상, 더욱 바람직하게는 0.1 중량% 이상으로 한다.
본 발명의 조성물을 의약품으로서 사용하는 경우, 제약 기술 분야의 관용 방법, 예컨대, 일본약국방에 기재된 방법 또는 그에 준하는 방법에 따라 제조할 수 있다.
본 발명의 조성물을 의약품으로서 사용하는 경우, 조성물 중의 유효 성분의 배합량은, 본 발명의 목적이 달성되는 한, 특히 한정되지 않으며, 적절한 배합 비율로 사용할 수 있다.
본 발명의 조성물을 의약품으로서 사용하는 경우, 투여 단위 형태로 투여하는 것이 바람직하며, 특히, 경구 투여가 바람직하다. 본 발명의 조성물의 투여량은, 연령, 체중, 증상, 투여 횟수 등에 따라 달라지나, 예컨대, 성인 (약 60 kg으로서)의 경우 1일, 본 발명의 트리글리세리드의 2-위치에 다가 불포화 지방산이 결합된 트리글리세리드, 또는 트리글리세리드의 2-위치에 다가 불포화 지방산이 결합되고, 1,3-위치에 포화 지방산 및 또는 모노 불포화 지방산이 결합된 트리글리세리드를, 다가 불포화 지방산 환산량으로서, 통상 약 0.001 내지 20 g, 바람직하게는 약 0.01 내지 10 g, 더욱 바람직하게는 0.05 내지 5 g, 가장 바람직하게는 약 0.1 내지 2 g을 1일 1회 내지 3회로 나누어 투여하는 것이 좋다.
도 1은 래트 공장(空腸)의 PPAR 및 관련 유전자 발현에 미치는, 트리글리세리드의 2-위치에 아라키돈산이 결합된 유지의 영향을 조사한 결과를 나타낸 도면이다. 내부 표준 유전자 18SrRNA의 양으로 보정 후, 0% 아라키돈산 식품군을 1로 하여 상대치 (평균값±표준오차, n=5)로 표기하였다. a-c: 여러가지 알파벳들 간에 현저한 차이가 나타났다 (p < 0.05, Tukey). AOX: 아실 CoA 옥시다제, CRBP II: 세포성 레티놀 결합 단백질, II형, L-FABP:간형 지방산 결합 단백질, I-FABP: 소장형 지방산 결합 단백질.
도 2는 래트 간장의 PPAR 및 관련 유전자 발현에 미치는, 트리글리세리드의 2-위치에 아라키돈산이 결합된 유지의 영향을 조사한 결과를 나타낸 도면이다. 내부 표준 유전자 18SrRNA의 양으로 보정 후, 0% 아라키돈산 식품군을 1로 하여 상대치 (평균값±표준오차, n=5)로 표기하였다. a,b: 여러가지 알파벳들 간에 현저한 차이가 나타났다 (p < 0.05, Tukey). L-FABP:간형 지방산 결합 단백질, AOX: 아실 CoA 옥시다제, UCP-2: 탈공액 단백질, FAS: 지방산 합성효소.
도 3은 래트 부고환 백색 지방 조직의 PPAR 및 관련 유전자 발현에 미치는, 트리글리세리드의 2-위치에 아라키돈산이 결합된 유지의 영향을 조사한 결과를 나타낸 도면이다. 내부 표준 유전자 18SrRNA의 양으로 보정 후, 0% 아라키돈산 식품군을 1로 하여 상대치 (평균값±표준오차, n=5)로 표기하였다. a-c: 여러가지 알파벳들 간에 현저한 차이가 나타났다 (p < 0.05, Tukey). aP2: 지방셀 특이 지방산 결합 단백질, UCP-2: 탈공액 단백질, AOX: 아실 CoA 옥시다제, FAS: 지방산 합성효소.
도 4는 래트 간장의 PPAR 및 관련 유전자 발현에 미치는, 아라키돈산 함유 구조 지질의 영향을 조사한 결과를 나타낸 도면이다. 내부 표준 유전자 18SrRNA의 양으로 보정 후, 0% 아라키돈산 식품군을 1로 하여 상대치 (평균값±표준오차, n=5)로 표기하였다. a-c: 여러가지 알파벳들 간에 현저한 차이가 나타났다 (p < 0.05, Tukey). L-FABP: 간형 지방산 결합 단백질, I-FABP: 소장형 지방산 결합 단백질, UCP-2: 탈공액 단백질.
도 5는 래트 부고환 백색 지방 조직의 PPAR 및 관련 유전자 발현에 미치는, 아라키돈산 함유 구조 지질의 영향을 조사한 결과를 나타낸 도면이다. 내부 표준 유전자 18SrRNA의 양으로 보정 후, 0% 아라키돈산 식품군을 1로 하여 상대치 (평균값±표준오차, n=5)로 표기하였다. a,b: 여러가지 알파벳들 간에 현저한 차이가 나타났다 (p < 0.05, Tukey).
실시예
이하, 실시예를 들어 본 발명을 더욱 구체적으로 설명한다. 그러나, 본 발명은 하기의 실시예로 한정되지 않는다.
실시예 1. 트리글리세리드의 2-위치에 아라키돈산이 결합된 트리글리세리드의 제조 방법
아라키돈산 생산균으로서 모르티에렐라 알피나 (Mortierella alpina)를 이용하였다. 글루코스 1.8%, 탈지 대두분 3.1%, 대두유 0.1%, KH2PO4 0.3%, Na2SO4 0.1%, CaCl2·2H2O 0.05% 및 MgCl2·6H2O 0.05%를 함유하는 배지 6 kL를, 10 kL 배양조에서 조제하고, 출발 pH를 6.0으로 조정하였다. 예비 배양액 30L를 접종하고, 26℃ 온도, 통기량 360 m3/h, 배양조 압력 200 kPa의 조건으로 8일간 통기 교반 배양을 수행하였다. 교반 횟수는 용존산소 농도를 10-15 ppm으로 유지하도록 조정하였다.
글루코스 농도를 4일째까지는 유가법(流加法)에 의해 배지 중의 글루코스 농도가 1-2.5%의 범위 내가 되도록, 그 이후에는 0.5-1%로 유지시켰다 (상기의 %는 중량 (W/V)%를 의미한다). 배양 종료 후, 여과, 건조에 의해 아라키돈산을 구성 지방산으로 하는 트리글리세리드를 함유하는 균체를 회수하고 얻어진 균체로부터 헥산 추출에 의해 유지를 추출하고, 식용 유지의 정제 공정 (탈검, 탈산, 탈취, 탈색)을 거쳐, 아라키돈산 함유 트리글리세리드 (여기서 아라키돈산은 트리글리세리드의 임의의 위치에 결합한 것임) 150 kg을 얻었다. 얻어진 유지 (트리글리세리드)를 메틸에스테르화시켜, 얻어진 지방산 메틸에스테르를 가스 크로마토그래피로 분석하자, 전지방산 중 아라키돈산이 차지하는 비율은 40.84%였다.
또한, 팔미트산, 스테아르산, 올레산, 리놀레산, γ-리놀레산 및 디-호모-γ-리놀레산은 각각 11.63%, 7.45%, 7.73%, 9.14%, 2.23%, 3.27%였다. 또한, 상법의 분석에 의하면 트리글리세리드의 2-위치를 점하는 다가 불포화 지방산의 비율은 91.5%이고, 아라키돈산의 비율은 64.7%였다. 또한, 상기 아라키돈산 함유 유지 (트리글리세리드)를 에틸에스테르화시키고, 아라키돈산 에틸을 40% 함유하는 지방산 에틸에스테르 혼합물을 상법의 고속 액체 크로마토그래피로 처리하여, 99% 아라키돈산 에틸을 분리 및 정제하였다. 얻어진 아라키돈산 에틸을 상법의 비누화 반응으로 처리하여 유리 아라키돈산을 조제하였다.
실시예 2. 1,3-위치에 포화 지방산 및/또는 모노 불포화 지방산 (X)가 결합되고, 2-위치에 다가 불포화 지방산 (P)가 결합된 트리글리세리드 (XPX) 및 1-위치에 다가 불포화 지방산 (P)가, 2,3-위치에 포화 지방산 및/또는 모노 불포화 지방산 (X)가 결합된 트리글리세리드 (PXX) 또는 3-위치에 다가 불포화 지방산 (P)가, 1,2-위치에 포화 지방산 및/또는 모노 불포화 지방산 (X)가 결합된 트리글리세리드 (XXP)의 화학적 합성
8A8 (1,3- 디옥타노일 -2- 아라키도노일 글리세리드 )의 합성
디히드록시아세톤 이량체 (1 g, 0.55 mmol)를 염화메틸렌 20 ml에 용해시킨 다음 n-옥탄산 3.5 ml (2.2 mmol)와 디메틸아미노벤젠 70 mg을 가하고, 빙냉 하 WS-DDC 4.6 g (1.2 mmol)을 첨가하였다. 2시간 후, 혼합물을 농축하고, 에틸 아세테이트로 추출한 다음, 물, 1N HCl, 포화식염수로 순차 세정하였다. 무수황산마그네슘으로 건조시킨 후, 진공 농축하고, 얻어진 잔사를 차가운 헥산으로 결정화시켜, 3 g (8.7 mmol)의 1,3-디옥타노일옥시아세톤을 얻었다 (수율 79%).
*이 옥타노에이트 (10.8 g, 31.5 mmol)을 THF 120 ml에 용해시키고, 8 ml의 물을 첨가하고 혼합물을 빙냉 하에 강하게 교반하고, 소듐 보로하이드라이드 1.2 g (31.7 mmol)을 조금씩, pH를 아세트산으로 중성화시키면서 첨가하였다. 첨가 종료 후, 1N HCl로 약산성화시킨 물을 가하고, 에틸 아세테이트로 상기 혼합물을 추출하고, 물, 포화식염수로 추출물을 세정한 다음 무수황산 마그네슘으로 건조시킨 후, 진공 농축시켰다. 얻어진 유상 물질을 염화메틸렌 100 ml에 용해시키고, 디메틸아미노벤젠 300 mg, 아라키돈산 8 g (26.4 mmol)을 가하고, 혼합물을 빙냉하였다. WS-DCC (6.5 g, 34.4 mol)를 추가로 첨가하고 1시간 교반하였다.
반응액을 농축하고, 에틸 아세테이트로 추출한 다음, 물, 1N HCl, 포화식염수로 추출물을 순차 세정하였다. 무수 황산 마그네슘으로 건조시킨 후, 진공 농축하고, 얻어진 잔사를 헥산-에틸 아세테이트 (9:1)로 실리카겔 크로마토그래피 처리하여 유상 물질인 8A8 13.5 g을 얻었다 (수율 68%). PMR (CDCl3) δ : 0.8-1.0 (9H, m), 1.2-1.4 (22H, m), 1.6-1.8 (6H, m), 2.0-2.2 (4H, m), 2.3-2.4 (6H, m), 2.7-2.9 (6H, m), 4.14 (2H,q), 4.29 (2H, q), 5.2-5.5 (9H, m).
88A (1(3), 2- 디옥타노일 -3(1)- 아라키도노일 - 글리세리드 )의 합성
(RS)-2,2-디메틸-1,3-디옥솔란-4-메탄올 (5 g, 37.8 mmol)을 DMF 50 ml에 용해시키고, 빙냉 하에, 60% 소듐 하이드라이드 오일 분산액 1.6 g (39.7 mmol)을 소량씩 첨가하였다. 종료 후, 혼합물을 10분간 교반하고, 벤질 브로마이드 4.5 ml (37.8 mmol)을 적가하였다. 그 후, 혼합물을 5시간 교반하였다. 반응 종료 후, 물을 첨가하고, 혼합물을 에틸 아세테이트로 추출한 다음 추출물을 물 및 포화식염수로 세정하였다. 무수 황산 마그네슘으로 건조한 후, 진공 농축하고, 얻어진 유상 물질을 헥산-에틸 아세테이트 (9:1)을 이용하여 실리카 겔 크로마토그래피 처리하여 유상 물질인 1(3),2-이소프로필리덴-3(1)-헨질옥시글리세리드 6.5 g (수율: 77%)을 얻었다. 이 물질 (5.6 g, 25.2 mmol)을 아세트산 30 ml에 용해시키고, 물 30 ml를 첨가하여 혼합물을 60℃에서 1시간 반응시켰다.
반응액을 진공 농축하고, 잔사를 에틸 아세테이트로 추출한 다음 추출물을 포화 중탄산나트륨 수용액 및 포화식염수로 세정하였다. 이것을 무수 황산 마그네슘으로 건조시킨 후, 진공 농축하여, 유상 생성물 3.9 g을 얻었다 (수율: 85%). 이 생성물 (3.8 g, 20.9 mmol)을 염화메틸렌 40 ml에 용해시키고, n-옥탄산 6.9 ml (43.9 mmol)과 디메틸아미노벤젠 150 mg을 첨가하고, 빙냉 하, WS-DCC 8.7 g (46 mmol)을 첨가하였다. 2시간 후, 혼합물을 농축하고 에틸 아세테이트로 추출한 다음 추출물을 물, 0.5N NaOH 및 포화식염수로 순차 세정하였다. 이것을 무수 황산 마그네슘으로 건조시키고 진공 농축하여 유상 생성물 9.9 g을 얻었다. 이것을 THF 100 ml - 아세트산 25 ml에 용해시킨 다음, 10% 팔라듐-탄소 1.3 g을 첨가하고 수소 존재 하에 밤새도록 반응시켰다. 촉매를 여과한 후, 진공 농축하고 에틸 아세테이트로 추출하고, 추출물을 중탄산나트륨 포화수용액 및 포화식염수로 세정하였다.
무수 황산 마그네슘으로 건조시킨 후, 진공 농축시키고 얻어진 잔사를 헥산-에틸 아세테이트 (9:1)을 이용하여 실리카 겔 크로마토그래피 처리함으로써 탈벤질화된 생성물 6 g을 얻었다 (수율: 83%). 이 탈벤질화 생성물 (136 mg, 0.39 mmol)을 염화메틸렌 3 ml에 용해시키고, 아라키돈산 100 mg (0.33 mmol)과 디메틸아미노벤젠 3 mg을 첨가하고 빙냉 하에, WS-DCC 90 mg (0.48 mmol)을 첨가하였다. 2시간 후, 혼합물을 농축하고, 에틸 아세테이트로 추출한 다음 추출물을 물, 1N HCl 및 포화식염수로 순차 세정하였다. 무수 황산 마그네슘으로 건조시킨 후, 진공 농축시켜, 얻어진 잔사를 헥산-에틸 아세테이트 (9:1)을 이용하여 실리카 겔 크로마토그래피 처리하여 유상 생성물 180 mg을 얻었다 (수율: 74%).
PMR(CDCl3)δ: 0.8-1.0 (9H, m), 1.2-1.4 (22H, m), 1.5-1.8 (6H, m), 2.0-2.2 (4H, m), 2.3-2.4 (6H, m), 2.7-2.9 (6H, m), 4.1-4.2 (2H, m), 4.28 (2H, q), 5.3-5.5 (9H,m).
PAP (1,3-디팔미토일-2-아라키도노일 글리세리드), PPA (1(3),2-디팔미토일-3(1)-아라키도노일 글리세리드) 및 8P8(1,3-디옥타노일-2-아라키도노일 글리세리드) 역시도 8A8 및 88A의 합성법의 경우와 동일한 방법으로 제조할 수 있었다.
실시예 3. 1,3-위치에 중쇄지방산이 결합되고 , 2-위치에 아라키돈산이 결합된 트리글리세리드 (8A8)를 5% 이상 함유하는 트리글리세리드의 제조
이온 교환 수지 담체 (Dowex MARATHON WBA: 다우케미칼; 상표) (100 g)을, 리조푸스 델레마 (Rhizopus delemar) 리파제 12.5% 수용액 (탈리파제 분말; 다나베 세이야쿠사) 80 ml에 현탁시키고, 진공 건조시켜 고정화 리파제를 얻었다.
이어서, 실시예 1에서 얻은 아라키돈산을 40 중량% 함유하는 트리글리세리드 (TGA 40S) 80 g, 카프릴산 160 g, 상기 고정화 리파제 12 g, 물 4.8 ml을 30℃에서 48시간 동안 교반 (130 rpm)시키면서 반응시켰다. 반응 종료 후, 반응액을 제거하여 활성화된 고정화 리파제를 얻었다.
다음으로, 고정화 리파제 (Rhizopus delemar 리파제; 담체: Dowex Marathon WBA, 상표) (10 g)을 쟈켓이 구비된 유리 컬럼 (1.8 x 12.5 cm; 용량 31.8 ml)에 충전하고, 실시예 1에서 얻은 TGA 40S와 카프릴산을 1:2로 혼합한 혼합 유지를 소정 속도 (4 ml/시간)으로 컬럼에 흘려 보내서, 연속 반응을 실시하여, 반응 유지 400 g을 얻었다. 한편, 컬럼 온도는 40-41℃로 유지시켰다. 얻어진 반응 유지로부터, 미반응 카프릴산과 유리 지방산을 분자 증류에 의해 제거하고, 식용 유지의 제조 공정 (탈검, 탈산, 탈취, 탈색)을 경유하여, 8A8을 함유하는 유지 (트리글리세리드)를 얻었다.
가스 크로마토그래피 및 고속 액체 크로마토그래피에 의해, 얻어진 8A8 함유 유지 (트리글리세리드) 중의 8A8의 비율을 조사하자, 31.6%였다 (여기서, 8P8, 808, 8L8, 8G8 및 8D8의 비율은 각각 0.6, 7.9, 15.1, 5.2 및 4.8% 였다).
트리글리세리드의 2-위치에 결합하는 지방산 P, O, L, G 및 D는 각각 팔미트산, 올레산, 리놀레산, γ-리놀렌산 및 디호모-γ-리놀렌산을 나타내고, 8P8은 1,3-카프릴로일-2-팔미토일-글리세리드, 8O8은 1,3-카프릴로일-2-올레오일-글리세리드, 8L8은 1,3-카프롤로일-2-리놀레오일-글리세리드, 8G8은 1,3-카프릴로일-2-γ-리놀레노일-글리세리드, 그리고 8D8은 1,3-카프릴로일-2-디호모-γ-리놀레노닐-글리세리드였다. 얻어진 8A8-함유 유지 (트리글리세리드)를 통상적인 고속 액체 크로마토그래피로 처리하여 96 mol%의 8A8을 분리 및 정제하였다.
실시예 4. 트리글리세리드의 2-위치에 아라키돈산이 결합된 유지에 의한 지질 대사 유전자의 발현 조절
실시예 1에서 제조된 트리글리세리드의 2-위치에 아라키돈산이 결합된 유지 (아라키돈산 함유 유지)의 지질 대사 관련 유전자의 발현에 미치는 영향을 래트에서 조사하였다. 6주령 SD계 수컷 마우스를 표 1에 나타낸 바와 같이 4군으로 나누었다. 실시예 1에서 조제된 아라키돈산 함유 유지를 우지, 올리브유, 및 옥수수유와 적절히 배합하여, 표 1에 나타낸 바와 같이 아라키돈산 함유량을 달리하는 4종의 유지 (0% AA, 14.6% AA, 26.8% AA 및 37.7% AA)를 조제한, 다음 표 2에 나타낸 바와 같은 실험식 (0% AA, 1% AA, 2.5% AA 및 5% AA)을 2 주일간 섭취시켰다. 본 실험식(實驗食)은, 실험식 중의 아라키돈산의 비율이 0, 1, 2.5 및 5%가 되도록 하는 한편, 아라키돈산 이외의 주요한 지방산이 실험식에서 차지하는 비율이 거의 동일하도록 조제하였다 (표 3).
식사의 섭취는 페어-급식 (pair-feeding)을 행하고 체중은 매일 측정하였다. 각 실험식 그룹 간의 1일 섭취 에너지량이 동일하도록 한천을 이용하여 실험식을 조제하였다. 실험식 섭취 2주일 후에 래트를 단두 도살하고, 채취한 공장을, 빙냉한 디에틸 피로카보네이트로 처리한 생리식염수로 관류하여 내용물을 제거하고, 수분을 제거한 후 중량을 측정하였다. 또, 간장 및 부고환 백색 지방 조직에 있어서는 조직 전체의 중량을 측정하였다. 또한, 코메진스키 등 (Chomezynski, et al)의 방법에 따라, 공장 중앙부, 간장, 부고환 백식 지방 조직 각각 100 mg으로부터 총RNA를 추출 및 정제하여, 유전자 발현 측정에 이용하였다. 또한, 단두 도살한 혈액을 채혈하여, 혈청 분획의 트리글리세리드 농도 및 총콜레스테롤 농도를 측정 키트 (각각 트리글리세리드 E-테스트 와코 및 총콜레스테롤 E-테스트 와코를 이용하였다)를 이용하여 정량하였다.
각 조직으로부터 추출된 총RNA (10 ㎍ 또는 30 ㎍)을 2.2M 포름알데히드 젤을 함유하는 1% 아가로스 젤을 이용하여 전기영동을 수행한 후, 나일론 멤브레인 (Hybond N+, Amersham)으로 하룻밤 20xSSC 완충액에 의해 트랜스퍼시켰다. 총RNA가 트랜스퍼된 멤브레인을 Ultrahyb 하이브리다이제이션 용액 (Ambion)을 이용하여 42℃에서 2시간 예비 하이브리다이즈시킨 후, 랜덤 프라이머법으로 32P 표지시킨 각 cDNA 프로브를 사용하여, 다시 42℃에서 16시간 이상 하이브리다이제이션을 수행하였다.
하이브리다이제이션 종료 후, 멤브레인을 세정액 I (2 x SSPE, 0.5% SDS)을 이용하여 42℃에서 10분간 (2회) 인큐베이션시키고, 이어서 42℃에서 세정액 III (0.1 x SSPE, 0.5% SDS)을 이용하여 15분간 (1회) 인큐베이션시켜서, 멤브레인을 세정하였다. 세정된 멤브레인 표면을 조영 플레이트 (푸지 포토 필름)에 1일 내지 2일간 감광시켜, 멤브레인 상의 mRNA의 시그널 강도를 바이오이미지 애널라이저 BAS200 (후지 포토 필름)으로 해석하였다.
각각의 측정 결과는 평균값 ± 표준 오차로 표시하고, 얻어진 데이터에 관한 분산 분석법을 이용하여 검정을 행하여, 이에 관하여 유의차가 인식된 결과에 관해서는, Tukey에 의한 다군검정을 행하였다. 위험률 5% 이하의 것은 유의적인 것으로 간주하였다.
아라키돈산 함유량을 달리하는 4종의 유지의 지방산 조성
유지 0% AA 14.6% AA 26.8% AA 37.7% AA
우지 52.0 34.7 19.4 0
올리브유 0 2.9 4.3 10.6
아라키돈산 함유 유지 0 32.9 60.2 84.8
옥수수유 48.0 29.4 16.1 4.5
합계 (g) 100.0 100.0 100.0 100.0
미리스트산 (14:0) 1.0 0.8 0.6 0.4
팔미트산 (16:0) 15.4 13.9 12.6 10.7
팔미톨레산 (16:1) 1.6 1.1 0.7 0.1
스테아르산 (18:0) 11.8 10.2 8.7 6.4
올레산 (18:1ω9) 37.0 28.1 20.1 14.7
리놀레산 (18:2ω2) 26.0 18.8 13.9 9.8
α-리놀렌산 (18:3ω3) 1.1 0.7 0.4 0.2
γ-리놀렌산 (18:3ω6) 0 0.1 0.2 0.3
DGLA (20:3ω6) 0 1.1 2.0 2.8
아라키드산 (20:0) 0.2 1.1 1.9 2.6
아라키돈산 (10:4ω6) 0 14.6 26.8 37.7
기타 5.8 9.2 12.1 14.3
DGLA: 디-호모-γ-리놀렌산
DGLA : 디-호모-γ-리놀렌산
실험식의 성분 조성
g/kg 0% AA 1% AA 2.5% AA 5% AA
카제인 (비타민 없음) 159 159 159 159
β-옥수수 전분 479 439 383 295
0% AA 혼합 유지 50
14.6% AA 혼합 유지 68
26.8% AA 혼합 유지 93
37.7% AA 혼합 유지 132
미네랄 AIN-76 28 28 28 28
비타민 AIN-76 8 8 8 8
DL-메티오닌 2 2 2 2
콜린 바이타르트레이트 2 2 2 2
2% 한천 272 294 325 374
실험식 중의 각 지방산의 비율 (%)
0% AA 1% AA 2.5% AA 5% AA
미리스트산 (14:0) 0 0.1 0.1 0
팔미트산 (16:0) 0.8 0.9 1.2 1.4
팔미톨레산 (16:1) 0.1 0.1 0.1 0
스테아르산 (18:0) 0.6 0.7 0.8 0.8
올레산(18:1ω9) 1.9 1.9 1.9 1.9
리놀레산 (18:2ω2) 1.3 1.3 1.3 1.3
α-리놀렌산 (18:3ω3) 0.1 0 0 0
γ-리놀렌산 (18:3ω6) 0 0 0 0
DGLA (20:3ω6) 0 0.1 0.2 0.4
아라키드산 (20:0) 0 0.1 0.2 0.3
아라키돈산 (10:4ω6) 0 1.0 2.5 5.0
기타 0.3 0.6 1.1 1.9
DGLA: 디-호모-γ-리놀렌산
DGLA : 디-호모-γ-리놀렌산
실험식 섭취 2주일 후의 조직 중량 및 혈청 지질 농도에 미치는 영향을 표 4에 나타내었다. 내장 지방에 상당하는 부고환 백색 지방 조직 중량은 실험식 중의 아라키돈산 함유량에 의존하여 저하하고, 5% AA 실험식에서는 유의적으로 감소하였다. 또한, 혈청 총콜레스테롤 및 트리글리세리드 농도도 실험식 중의 아라키돈산 함유량에 의존하여 유의적으로 저하하였다. 특히, 혈청 트리글리세리드 농도의 저하는 현저하였고, 1% AA 식군에서는 0% AA 식군의 53% 까지 저하하였다. 그런데, 아라키돈산 부하에 의한 본 실험 사육 조건하에서는, 과잉의 에이코노사이드 생산에 수반되는 염증과 같은 비정상적 증상은 관찰되지 않았고, 트리글리세리드의 구성 지방산으로서 아라키돈산을 섭취하는 한 어떠한 문제도 없다는 것이 확인되었다.
실험식 섭취에 의한 래트 체중 증가량, 상대 조직량 및 혈청 지질 농도에 미치는 영향
0% AA 1% AA 2.5% AA 5% AA
체중증가량 (g/14일) 91±3 90±7 89±10 80±5
섭취량 (g/일) 27.5±0.3 26.2±0.7 27.4±0.6 26.2±0.6
간장중량 (g/100g 체중) 4.0±0.1 3.7±0.3 4.0±0.4 4.2±0.1
부고환 지방 조직 중량
(g/100g 체중)		 1.7±0.1a 1.4±0.1ab 1.4±0.1ab 1.2±0.1b
혈청 트리글리세리드 농도
(μmol/dl)		 242±19.7a 128±20.3b 112±12.8b 87.0±12.3b
혈청 총콜레스테롤 농도
(μmol/dl)		 257±6.25a 239±19.2a 209±16.5b 144±14.2b
a,b: 다른 알파벳 간에서 유의차 있음 (p < 0.05)
쥐의 공장에서는, PPARα mRNA 발현량은 아라키돈산 함유량이 2.5% 및 5% AA 식군에서 약 1.5배 내지 1.7배로 증대하였다 (도 1). 한편, 공장 PPARδ mRNA 발현량은 실험식 중의 아라키돈산 함량에 의존적으로 저하하였다. 더우기, PPARα의 표적 유전자인 CRBPII, L-FABP, I-FABP 및 AOX mRNA 발현량은 섭취되는 아라키돈산 함량에 의존하여 증가하였다. 공정으로부터 흡수된 레티놀은 소수성 영양소이므로, 세포질에서는 거의가 결합 단백질과 결합되어 존재한다. 세포성 레티놀 결합 단백질 타입 II(CRBPII)은 레티놀의 세포내 전달 및 에스테르화에 중요한 역할을 한다.
따라서, 아라키돈산이 PPARαmRNA 발현량의 증가, 및 공장 CRBPII mRNA 발현량의 증가를 통하여, 지용성 비타민을 효율적으로 흡수 및 대사한다는 것이 명백하다. 이상의 결과로부터, 소장에 있어서 섭취된 아라키돈산은 직접적으로 또는 에이코사노이드류 등의 전구체로서 주로 PPARα의 리간드로서 기능한다는 것이 명백해졌다.
간장에서는, PPARαmRNA 발현량은 1% AA 식군 및 2.5% 식군에서는 증가하였으나, 5% AA 식군에서는 감소하였다. 그러나, PPARα 표적 유전자인 L-FABP, AOX 및 UCP-2 mRNA 발현량은 아라키돈산 함량에 의존적으로 상승하였고, 5% AA 식군에서 가장 높은 값을 보였다. 이것은, PPARα mRNA의 변동 패턴과 다르나, 결과적으로 아라키돈산 함량은 2.5% 까지는 안전하고 효과적으로 PPARα를 활성화시켜, 유전자 발현을 조절한다고 말할 수 있다. 이상의 결과로부터, 지방산 합성계의 억제 (PPAR 비개재) 및 PPARα의 발현량의 증가를 수반하는 지방산 분해계의 항진 (PPAR 개재)이 유전자 레벨로 제어되고, 혈중 트리글리세리드 농도가 저하된다는 것이 자명해졌다.
부고환 백색 지방 조직에서는, PPARα 및 PPARδ mRNA 발현량은 아라키돈산 함량에 의존하여 유의적으로 저하하였다. 또한, 지방 세포 특이적 지방산 결합 단백질 (aP2) mRNA 발현량도 농도의존적으로 저하하였다. PPARδ는 지방 세포의 분화 및 유도에 관여하고, 백색 지방 조직에서의 지방 축적을 촉진한다는 것이 알려져 있고, 아라키돈산 섭취에 의한 부고환 지방 조직 중량의 감소는 (표 4), PPARδ mRNA 발현량의 감소를 매개로, 백색 지방 세포의 수 및 그의 크기 증대를 억제하거나, 달리 말하면 지방 세포의 분화 및 숙성화를 억제하였다. 한편, 백색 지방 조직 AOX mRNA 발현량은 아라키돈산 함량 증가에 따라 증가하였으므로, 지방산 분해계의 항진도 관찰되었다.
실시예 5. 아라키돈산 함유 구조 지질에 의한 지질 대사 유전자 발현의 조절
실시예 2에서 화학 합성된 아라키돈산을 구조 지방산으로 하는 구조 지질의 지질 대사 관련 유전자의 발현에 미치는 영향을 래트에서 조사하였다. 구조 지질의 일례로서, 트리글리세리드의 1,2,3-위치에 팔미트산 (P)가 결합된 PPP, 트리글리세리드의 2-위치에 팔미트산이, 3-위치에 아라키돈산이 결합된 PPA와 트리글리세리드의 2,3(1)-위치에 팔미트산이, 1(3)-위치에 아라키돈산이 결합된 APP의 등량 혼합물 (화학합성에서는 PPA와 APP의 등량 혼합물로 되어, 편의상, 이하에서는 등량 혼합물을 PPA로서 표기함), 및 트리글리세리드의 1,3-위치에 팔미트산이, 2-위치에 아라키돈산이 결합된 PAP에서의 효과를 비교하였다.
5주령 SD계 수컷 래트를 1군 5마리로 하여 4군으로 나누어서, 1주일간 표준 고형 사료에 순응시킨 후 아라키돈산 함유 구조 지질 (PPA 또는 PAP)를 10% 배합한 실험식 (10% PPA 및 10% PAP; 표 5)를 2주일간 섭취시켰다. 또, 대조군은 PPP를 10% 배합한 실험식 (10% PPP)를 이용하였다. 식사의 섭취는 페어-급식을 행하고, 체중은 매일 측정하였다. 또, 각 실험식 군 간의 1일 섭취 에너지량이 동일하도록 한천을 이용하여 실험식을 조제하였다.
실험식 섭취 2주일 후에 래트를 단두 도살하고, 실시예 4와 동일한 방법에 의해, 각 조직의 채취 및 총RNA의 추출을 수행하고, 노던 블롯법에 의해 유전자 발현 분석을 실시하였다.
실험식의 성분 조성

저지방 10% PPP 10% PPA 10% PAP
g/kg 사료
카제인 (비타민 없음) 157 157 157 157
β-옥수수 전분 526 301 301 301
옥수수유 23 24 24 24
PPP 100
PPA 100
PAP 100
미네랄 AIN-G93 28 28 28 28
비타민 AIN-93 8 8 8 8
DL-메티오닌 2.4 2.4 2.4 2.4
콜린 바이타르트레이트 1.6 1.6 1.6 1.6
2% 한천 253 378 378 378
각 사료에 α-토코페롤을 0.25 g/kg 다이어트 첨가.
실험식 섭취 2주일 후의 조직 중량 및 혈청 지질 농도에 미치는 영향을 표 6에 나타내었다. 혈청 트리글리세리드 농도는 10% PPP식군에서 현저하게 높은 값을 나타내었으나, 10% PPA 및 10% PAP식군에서는 저지방식군과 유의적인 차이는 없었다. 저지방식 (2.4% 옥수수유)에 대해 동일하게 10% 유지를 부가하였으나, 트리글리세리드에 결합하는 지방산의 하나를 아라키돈산으로 치환시키자, 혈청 트리글리세리드가 유의적으로 저하하여, 저지방식군과 동등한 값으로 되었다. 또한, 혈청 총콜레스테롤 농도는 10% PPP식군에 비해 10% PPA 및 10% PAP식에서 낮은 값을 나타내었다.
실험식 섭취에 의한 래트 체중 증가량, 상대 조직 중량 및 혈청 지질 농도에 대한 영향
저지방 10% PPP 10% PPA 10% PAP
체중 증가량 (g/14일) 71±5ab 61±5ab 80±4ab 67±5ab
간장 중량 (g/100g 체중) 4.4±0.3 4.3±0.3 4.2±0.1 3.4±0.8
혈청 트리글리세리드 농도
(μmol/dl)		 191±32.3a 316±64.3b 173±6.6b 174±7.5b
혈청 총콜레스테롤 농도
(μmol/dl)		 235±7.8a 201±9.2a 150±16.6b 178±15.3ab
a,b: 다른 알파벳 간에서 유의차 있음 (p < 0.05)
공장의 PPAR의 표적 유전자 발현에 미치는 구조 지질의 영향을 나타내었다 (도 4). PPA로부터는 1,3-위치 특이적 췌장 리파제의 작용에 의해 팔미트산과 아라키돈산이 1분자씩 해리되어 흡수되고, 특히 PPAR 리간드 활성이 강한 아라키돈산이 소장에서 PPARα 리간드로서 작용하므로, 대조군인 PPP식군과 비교해서 10% PPA식군에서는 PPAR의 표적유전자의 발현량이 증대되었다. 한편, PAP로부터는 해리된 팔미트산 2분자와, 1분자의 2-아라키도노일 모노글리세리드 (2-AG)가 생성되어, 소장 상피 세포에 흡수 통합되는 것을 고려할 때, 팔미트산은 PPAR 리간드로서의 작용이 약하기 때문에, 대조군인 PPP식군에 비해 10% PAP식군에서는 PPAR의 표적 유전자의 발현에 미치는 영향이 거의 없을 것이라고 예상되었었다. 그러나, 결과는 완전히 반대로, 10% PPA식군과 동등 또는 그 이상으로 증대되었다.
간장의 PPARα mRNA의 발현량은 PAP식군에서 유의적으로 증대되었다 (도 5). 공장에서는 1,3-위치 특이적 리파제의 작용에 의해, 아라키돈산이 결합된 모노글리세리드 (2-AG)의 유의적인 작용을 발견되고, 간에서도 비슷한 효과를 나타냄이 실증되었다. 소장 상피 세포에 흡수 통합된 2 분자의 팔미트산과 1 분자의 2-AG가 트리글리세리드로 재구축되고 (이 경우, 소장 상피 세포에 존재하는 내재적인 다른 지방산이 1,3-위치에 결합할 가능성도 있으나, 2-위치에 결합하는 아라키돈산은 보존된다), 카이로미크론에 흡수 통합되어, 림프 분비 및, 혈류에 의해 말초조직으로 이행하여, 최후에 간장에 흡수 통합된다.
PAP가 유의적으로 간장 중에 PPARα의 발현량을 증가시킨 결과는, 2-위치에 아라키돈산이 결합한 트리글리세리드 구조가 간장까지 보존되어 기능을 발휘한 것을 나타내는 것으로서, 2-위치에 아라키돈산, 즉, 다가 불포화 지방산이 결합하는 의의가 실증되었다. 즉, 유지 부하 2.4%의 저지방식에 대해, 구조 지질 부하 10%의 PPP, PPA 및 PAP식 (전유지 부하는 12.4%로 됨)은 극단적인 지방 부하는 아니므로, 혈청 트리글리세리드 농도 및 혈청 총콜레스테롤 농도에서는 PPA와 PAP와의 차이가 인식되지 않았으나, 유전자 발현 레벨에서는 명확한 차이가 있으며, 이로부터, 극단적인 지질 부하에 있어서는 PAP (2-위치에 다가 불포화 지방산이 결합된 트리글리세리드)가 혈청 지질 농도를 유의적으로 저하시킨다는 것이 명백하다.
실시예 6. 아라키돈산 함유 구조 지질에 의한 혈청 지질 저하 작용
구성 지방산의 혈청 지질 저하작용에 미치는, 실시예 2에서 화학 합성된 아라키돈산의 영향을 고지방식에서 조사하였다. 구조 지질로는 실시예 5와 마찬가지로 PPP, PPA, PAP와, 트리글리세리드의 1,3-위치에 카프릴산 (8)이 결합하고, 2-위치에 팔미트산이 결합된 8P8, 트리글리세리드의 1,2-위치에 카프릴산이, 3-위치에 아라키돈산이 결합된 88A와 트리글리세리드의 2,3-위치에 카프릴산이, 1-위치에 아라키돈산이 결합된 A88의 등량 혼합물 (화학 합성에서는 88A와 A88의 등량 혼합물로 되어, 편의상, 등량 혼합물을 88A로 이하에서 표기한다), 및, 트리글리세리드의 1,3-위치에 카프릴산이, 2-위치에 아라키돈산이 결합된 8A8을 이용하여 효과를 비교하였다.
5주령 SD계 수컷 마우스를 1군에 5마리로 하여 8군으로 나누고, 1주일간 표준 고형 사료에 순응시킨 후, 표 7 및 표 8에 나타난 실험식 (보통, 고TG, 7.5% PPP, 7.5% PAP 7.5% PPA, 7.5% 8P8, 7.5% 8A8 및 7.5% 88A)를 2주일간 섭취시켰다. 한편, 고지질식의 조건으로서 사료 중에 차지하는 지질의 비율을 20%로 하고, 포화 지방산이 풍부한 우지를 베이스로 하며, 필수 지방산 결핍을 피하기 위해, 옥수수유를 2% 배합하였다. 또, 대조군은 8P8을 18% 배합 (옥수수유 2%를 가하여 20%)한 실험식 (고TG식 유지 20%식)을 이용하였다.
실험식 섭취 2주일 후에 래트를 단두 도살하여 혈액을 채취하고, 혈청 분획의 트리글리세리드 농도 및 총콜레스테롤 농도에 관해서는 측정 키트 (각각 트리글리세리드 E-테스트 와코 및 총콜레스테롤 E-테스트 와코)를 이용하여 정량하였다.
실험식의 성분 조성

보통식 고TG식
(20% 지방)		 고TG식
(7.5% PPP)		 고TG식
(7.5% PAP)		 고TG식
(7.5% PPA)
g/kg 사료
카제인 200 200 200 200 200
DL-메티오닌 3 3 3 3 3
옥수수 전분 150 150 150 150 150
수크로스 500 350 350 350 350
셀룰로스 분말 50 50 50 50 50
미네랄 AIN-76 35 35 35 35 35
비타민 AIN-76 10 10 10 10 10
콜린 바이타르트레이트 2 2 2 2 2
옥수수유 20 20 20 20 20
우지 30 180 105 105 105
PPP 75
PAP 75
PPA 76
8P8
8A8
88A
실험식의 성분 조성

고TG식 (7.5% 8P8) 고TG식 (7.5% 8A8) 고TG식 (7.5% 88A)
g/kg 사료
카제인 200 200 200
DL-메티오닌 3 3 3
옥수수 전분 150 150 150
수크로스 350 350 350
셀룰로스 분말 50 50 50
미네랄 AIN-76 35 35 35
비타민 AIN-76 10 10 10
콜린 바이타르트레이트 2 2 2
옥수수유 20 20 20
우지 105 105 105
PPP
PAP
PPA
8P8 75
8A8 75
88A 75
실험식 섭취 2주일 후의 조직 중량 및 혈청 지질 농도에 대한 영향을 표 9에 나타내었다. 혈청 트리글리세리드 농도는 고트리글리세리드식군에서 현저히 높은 값을 나타내었다. 비록 대조군인 7.5% PPP식군에서는 아무런 변화도 나타나지 않았으나, 7.5% PPA식군 및 7.5% PAP식군에서는 혈청 트리글리세리드가 유의적으로 저하되었다. 그리고, PAP와 PPA와의 효과는 7.5% PAP식군의 쪽이 유의적으로 낮은 값을 나타내었다. 마찬가지의 결과가 카프릴산을 구성 지방산으로 하는 구성 지질군 (7.5% 8P8, 7.5% 8A8, 7.5% 88A)에서도 나타났다. 그리고, 중쇄 지방산을 구성 지방산으로 하는 경우, 혈청 트리글리세리드의 저하 효과를 유의적으로 높일 수 있는 것으로 확인되었다. 유사한 결과가 혈청 총콜레스테롤 농도에서도 관찰되었다.
또한, 아라키돈산 뿐만 아니라, 다가 불포화 지방산은 PPAR를 매개로 하여 혈청 트리글리세리드 농도 및 혈청 콜레스테롤 농도를 조절한다는 것이 알려져 있고, 2-위치에 아라키돈산이 결합된 경우와 마찬가지로, 2-위치에 다가 불포화 지방산이 결합된 구조 지질에서도 유사한 효과가 달성됨이 명백하다.
실험식 섭취에 의한 혈청 지질 농도에 미치는 영향
보통식 고TG식
(20% 지방)		 고TG식
(7.5% PPP		 고TG식
(7.5% PAP)
혈청 트리글리세리드 농도
(μmol/dl)		 45.0±5.9a 103.0±5.6b 109.2±6.8b 80.4±3.9a
혈청 총콜레스테롤 농도
(μmol/dl)		 80.2±2.8a 102.4±4.9b 104.3±5.9b 91.7±3.3a
보통식 고TG식
(7.5% PPA)		 고TG식
(7.5% 8P8)		 고TG식
(7.5% 8A8)		 고TG식
(7.5% 88A)
혈청 트리글리세리드 농도
(μmol/dl)		 93.1±1.3a 101.8±5.3b 63.3±4.1a 83.1±3.6a
혈청 총콜레스테롤 농도
(μmol/dl)		 92.4±4.9a 99.7±4.2b 85.6±2.6b 92.9±2.9a
a,b: 다른 알파벳 간에서 유의차 있음 (p < 0.05)
실시예 7. 트리글리세리드의 2-위치에 아라키돈산이 결합된 유지 ( 트리글리세리드) 배합 캡슐의 제조예
젤라틴 (100 중량부)와 식품 첨가용 글리세리드 35 중량부를 물에 가하여 50 내지 60℃에서 용해시키고, 점도 2000 cp의 젤라틴 피막을 제조하였다. 이어서, 실시예 1에서 얻은 트리글리세리드의 2-위치에 아라키돈산이 결합된 유지 (트리글리세리드)와 비타민E유 0.05 중량%를 혼합하여 내용물 1을 조제하였다. 실시예 3에서 얻은 8A8을 32 mol% 함유하는 유지 (트리글리세리드)에 비타민 E유 (0.05 중량%)를 배합하여, 내용물 2를 조제하였다. 이들 내용물 1과 2를 이용하여, 상법에 따라 캡슐 형성 및 건조를 행하여, 캡슐 하나에 200 mg의 내용물을 함유하는 연질 캡슐을 제조하였다.
실시예 8. 트리글리세리드의 2-위치에 아라키돈산이 결합된 유지 ( 트리글리세리드) 섭취 후의 사람의 혈청 지질 개선 작용
본 발명의 사람 시험은, 헬싱키 선언의 정신에 따라 충분한 배려 하에 실시하였다. 시험 참가 동의의 설명을 행하고, 동의를 얻은 피험자 8명에게 실시예 7에서 조제한 트리글리세리드의 2-위치에 아라키돈산이 결합된 유지 캡슐 (아라키돈산으로서 80 mg/캡슐) 6 캡슐을 1개월간 복용시켰다. 캡슐 섭취 전후에 채혈하여 혈액 생화학 마커를 분석하였다.
측정 결과를 표 10에 나타내었다. 혈청 트리글리세리드 농도는 캡슐 섭취에 의해 유의적으로 저하하였다. 혈청 콜레스테롤 농도는 유의적으로 증가하였으나, 이는 나쁜 콜레스테롤인 LDL-콜레스테롤 농도의 증가에 의한 것이 아니라, 좋은 콜레스테롤인 HDL-콜레스테롤 농도의 유의적 증가에 의한 것이었다. 이상으로부터, 트리글리세리드의 2-위치에 아라키돈산이 결합된 유지에 의해 혈청 지질이 개선된 것을 확인할 수 있었다.
트리글리세리드의 2-위치에 아라키돈산이 결합된 유지 캡슐 섭취 전후의 건강 검진 결과
개시전 개시후
신장 (cm) 169.8±5.9 169.8±5.9
체중 (kg) 65.1±6.5 65.0±5.9
중성 지방 (트리글리세리드) 99.4±28.0a 74.1±17.5b
총콜레스테롤 175.9±17.6a 184.9±18.6b
HDL-콜레스테롤 58.5±10.2a 63.1±10.0b
LDL-콜레스테롤 106.9±19.4 108.3±17.6
a,b: 다른 알파벳 간에서 유의차 있음 (p < 0.05)
실시예 9. 8A8 함유 식용 유지 캡슐 섭취 후의 사람의 혈청 트리글리세리드 저하 작용
실시예 8과 마찬가지로, 시험 참가 동의의 설명을 행하고, 동의를 얻은 피험자 8명에게 실시예 7에서 조제한 8A8 함유 식용 유지 캡슐 (아라키돈산으로서 72 mg/캡슐) 3캡슐을 1개월간 복용시켜, 캡슐 섭취 전후의 혈청 트리글리세리드 농도를 분석하자, 162±29.3에서 83.3±14.9로 유의적으로 저하하였다.
실시예 10. 지방 수액제에의 사용
실시예 3에서 얻은 8A8을 96% 함유하는 유지 (트리글리세리드) (400 g), 정제 난황 레시틴 48 g, 올레산 20 g, 글리세리드 100 g 및 0.1N 수산화나트륨 40 ml를 가하여, 호모지나이저로 분산시킨 후, 주사용 증류수를 가하여 4리터로 만들었다. 이것을 고압 분무식 유화기로 유화시켜, 지질 유액을 조제하였다. 이 지질 유액을 200 ml 씩 플라스틱제 백에 분주한 후, 121℃, 20분간 고압 증기 멸균 처리하여 지방 수액제로 만들었다.
실시예 11. 쥬스에의 사용
β-시클로덱스트린 (2 g)을 20% 에탄올 수용액 20 ml에 첨가하고, 여기에 스터러로 교반하면서, 실시예 1에서 얻은 트리글리세리드의 2-위치에 아라키돈산이 결합된 유지 (비타민 E를 0.05% 배합) 100 mg을 첨가하고, 50℃에서 2시간 인큐베이션시켰다. 실온 냉각 (약 1시간) 후, 더욱 교반을 계속하면서 4℃에서 10시간 인큐베이션시켰다. 생성된 침전을, 원심분리에 의해 회수하고, n-헥산으로 세정 후, 동결건조를 행하여, 트리글리세리드의 2-위치에 아라키돈산이 결합된 유지를 함유하는 시클로덱스트린 포접 화합물 1.8 g을 얻었다. 이 분말 (1 g)을 쥬스 10 L에 균일하게 혼합시켜, 트리글리세리드의 2-위치에 아라키돈산이 결합된 유지를 함유하는 쥬스를 조제하였다.

Claims (6)

  1. 트리글리세리드의 2-위치에 다가 불포화 지방산이 결합된 트리글리세리드의 성인 1일 섭취량이, 다가 불포화 지방산량으로 환산하여 0.001 내지 20 g으로 되도록, 트리글리세리드의 2-위치에 다가 불포화 지방산이 결합된 트리글리세리드를 함유하는, 혈액 중의 HDL-콜레스테롤을 증가시키기 위한 식품 조성물.
  2. 제1항에 있어서, 상기 트리글리세리드는 2-위치에 다가 불포화 지방산이 결합되고, 1,3-위치에 포화 지방산 및 모노 불포화 지방산 중 1종 이상이 결합된 트리글리세리드이며, 성인 1일 섭취량이, 다가 불포화 지방산량으로 환산하여 0.001 내지 20 g으로 되도록, 트리글리세리드의 2-위치에 다가 불포화 지방산이 결합되고, 1,3-위치에 포화 지방산 및 모노 불포화 지방산 중 1종 이상이 결합된 트리글리세리드를 함유하는 식품 조성물.
  3. 제1항에 있어서, 상기 트리글리세리드는 2-위치에 아라키돈산이 결합되고, 1,3-위치에 포화 지방산 및 모노 불포화 지방산 중 1종 이상이 결합된 트리글리세리드이며, 성인 1일 섭취량이, 아라키돈산량으로 환산하여 0.001 내지 20 g으로 되도록, 트리글리세리드의 2-위치에 아라키돈산이 결합되고, 1,3-위치에 포화 지방산 및 모노 불포화 지방산 중 1종 이상이 결합된 트리글리세리드를 함유하는 식품 조성물.
  4. 제2항에 있어서, 상기 트리글리세리드가, 1,3-디팔미토일-2-아라키도노일 글리세리드 (16:0-20:4ω6-16:0), 1,3-디팔미토일-2-5,8,11,14,17-에이코사펜타노일 글리세리드 (16:0-20:5ω3-16:0), 1,3-디팔미토일-2-4,7,10,13,16,19-도코사헥사노일 글리세리드 (16:0-22:6ω3-16:0), 1, 3-디팔미토일-2-디호모-γ-리놀레노일 글리세리드 (16:0-20:3ω6-16:0), 1,3-디팔미토일-2-미드노일 글리세리드 (16:0-20:3ω9-16:0), 1,3-디카프릴로일-2-아라키도노일 글리세리드(8:0-20:4ω6-8:0), 1,3-디카프릴로일-2-디호모-γ-리놀레노일 글리세리드(8:0-20:3ω6-8:0), 1,3-디카프릴로일-2-미드노일 글리세리드 (8:0-20:3ω9-8:0), 1,3-디올레오일-2-아라키도노일 글리세리드 (18:1ω9-20:4ω6-18:1ω9), 1,3-디올레오일-2-5,8,11,14,17-에이코사펜타노일 글리세리드(18:lω9-20:5ω3-18:1ω9), 1,3-올레오일-2-4,7,10,13,16,19-도코사헥사노일 글리세리드 (18:lω9-22:6ω3-18:lω9), 1,3-디올레오일-2-디호모-γ-리놀레노일 글리세리드 (18:lω9-20:3ω6-18:1ω9) 또는 1,3-디올레오일-2-미드노일 글리세리드 (18:lω9-20:3ω9-18:lω9) 중에서 선택된 것인 트리글리세리드를 0.001 중량% 이상 함유하는 식품 조성물.
  5. 제1항 또는 제3항에 있어서, 식품 조성물이 기능성 식품, 영양 보조 식품, 특정 보건용 식품 또는 노인용 식품인 것인 조성물.
  6. 트리글리세리드의 2-위치에 다가 불포화 지방산이 결합되고, 1,3-위치에 포화 지방산 및 모노 불포화 지방산 중 1종 이상이 결합된 트리글리세리드를 단독으로 또는 조합시켜, 트리글리세리드의 2-위치에 다가 불포화 지방산이 결합되고, 1,3-위치에 포화 지방산 및 모노 불포화 지방산 중 1종 이상이 결합된 트리글리세리드를 함유하지 않는 식품 원료와 함께 배합시킴을 특징으로 하는 제2항에 기재된 식품 조성물의 제조 방법.
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