CN106998742A - 用于水产养殖饲料中的饲料补充物质 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及通过在鱼类的饮食周期中向其饲喂水产养殖饲料组合物来可持续性生产水产养殖肉制品的方法，所述方法包括以下步骤：通过用二十碳五烯酸(“EPA”)和二十二碳六烯酸(“DHA”)的单一微生物来源代替组合物中的全部或部分鱼油来配制水产养殖饲料组合物。在一个优选的实施方式中，包含DHA和EPA的微生物来源源自Schizochytrium属或Thraustochytrium属的微生物。

Description

用于水产养殖饲料中的饲料补充物质
本发明涉及水产养殖领域。更具体地说，本发明涉及通过在鱼类的饮食周期中向其饲喂包含至少减少量的鱼油的水产养殖饲料组合物来可持续性生产水产养殖肉制品的方法。
水产养殖是农业的一种形式，其涉及在受控环境中繁殖、培养和销售水生动物和水生植物。水产养殖业目前是世界上发展最快的食品生产部门。世界水产养殖每年产生约6000万吨海产品，价值超过700亿美元。现今，养殖鱼类占全球消耗的所有鱼类的约50％。由于来自海洋和淡水环境中的捕捞渔业的捕捞量减少且海产品消费(即，总消费以及人均消费)增加，因此预期上述百分比将会增加。现今，水产养殖生产中的物种群包括例如：鲤鱼和其它鲤科鱼类；牡蛎；蛤蜊、鸟蛤和赤贝；小虾和对虾；鲑鱼、鳟鱼和胡瓜鱼；贻贝；罗非鱼和其它丽鱼科鱼；以及扇贝。
虽然一些水产养殖物种(例如罗非鱼)可以以完全素食饮食饲喂，但许多其它物种以肉食性饮食饲喂。通常，肉食性鱼的饲料包括源自野生捕获的小浮游鱼类物种(主要是鳀鱼、茄克竹荚鱼、蓝鳕、毛鳞鱼、玉筋鱼和鲱鱼(menhaden))的鱼粉和鱼油。这些浮游鱼类被加工成鱼粉和鱼油，取决于鱼的大小，终产品往往是粒状或薄片状饲料。根据需要，水产养殖饲料组合物的其它组分可以包括植物蛋白、维生素、矿物质和色素。
海洋鱼油传统上被用作商业鱼类饲料中唯一的膳食脂质来源，这是由于它们具有随时可用性、有竞争力的价格以及该产品中所含的丰富的必需脂肪酸。此外，鱼油容易提供鱼类的正常生长、健康、繁殖和身体功能所必需的必需脂肪酸。更具体而言，包括鱼类在内的所有脊椎动物物种均具有对ω-6和ω-3多不饱和脂肪酸[“PUFA”]的饮食需求。二十碳五烯酸[“EPA”；顺式-5,8,11,14,17-二十碳五烯酸；ω-3]和二十二碳六烯酸[“OHA”；顺式-4,7,10,13,16,19-二十二碳六烯酸；22:6ω-3]是鱼类生长和健康所必需的，其往往通过添加鱼油而掺入商业鱼类饲料中。
估计水产养殖饲料组合物目前使用约87％的全球鱼油供应作为脂质来源。由于年鱼油产量不超过150万吨/年，故迅速增长的水产养殖业不能继续依赖有限的海洋浮游鱼类库作为鱼油供给。因此，迫切需要找到和实现可持续性鱼油替代物，所述替代物能够适应日益增长的全球对鱼类产品的需求。
许多组织认识到了上述关于鱼油可用性和水产养殖可持续性的限制。例如，在美国，国家海洋和大气管理局正在与农业部合作开展替代饲料倡议以“……鉴定替代饮食成分，其将减少水产养殖饲料中含有的鱼粉和鱼油的量，同时保持养殖海产品的重要人体健康益处”。
美国专利号7,932,077提示，重组改造的Yarrowia lipolytica可以是大多数动物饲料(包括水产养殖饲料)的有用添加剂以提供必需的ω-3和/或ω-6PUFA，这基于其独特的蛋白质：脂质：碳水化合物组成，以及独特的复合碳水化合物谱(包含约1:4:4.6比率的甘露聚糖:β-葡聚糖:几丁质)。
美国专利申请公开号2007/0226814公开了含有至少一种获自发酵微生物的生物质的鱼食品，其中所述生物质含有相对于总脂肪酸含量至少20％的DHA。用作DHA来源的优选微生物是属于Stramenopiles属的生物。
如果不断发展的水产养殖业要继续为世界鱼类供应作出贡献并同时产生继续为人类消费提供健康益处的水产养殖肉制品，那么需要减少使用野生鱼类，同时采用更加生态健康的世界鱼类供应管理实践。
发明概述
在一种实施方式中，本发明涉及通过在鱼类的饮食周期(dietary cycles)中向其饲喂水产养殖饲料组合物来可持续性生产水产养殖肉制品的方法，所述方法包括以下步骤：通过用二十碳五烯酸(“EPA”)和二十二碳六烯酸(“DHA”)的单一微生物来源代替水产养殖饲料组合物中的全部或部分鱼油来配制所述组合物。
在一个优选的实例中，使用基于Schizochytrium种的天然微生物的自然能力的方法来生产包含DHA和EPA的微生物来源。
在第二种实施方式中，本发明涉及通过在鱼类的饮食周期中向其饲喂水产养殖饲料组合物来可持续性生产水产养殖肉制品的方法，其中所述水产养殖饲料组合物包含总量为至少约0.8％的源自所述微生物来源的EPA和DHA，所述量以所述水产养殖饲料组合物的重量百分比测量。
在第三种实施方式中，本发明涉及通过在鱼类的饮食周期中向其饲喂具有微生物油来源的EPA和DHA的水产养殖饲料组合物来可持续性生产水产养殖肉制品的方法，其中所述微生物油以选自以下的形式提供：生物质、经处理的生物质、部分纯化的油和纯化油，其中任何一种均获自一种微生物。
在第四种实施方式中，本发明涉及用于鱼类饲料产品的饲料添加剂组合物，所述添加剂组合物包含单一微生物来源的二十碳五烯酸(“EPA”)和二十二碳六烯酸(“DHA”)。
在第五种实施方式中，本发明涉及具有含EPA和DHA的微生物添加剂组合物的水产养殖饲料，其中所述微生物添加剂获自单一微生物。
在第六种实施方式中，本发明涉及通过在鱼类的饮食周期中向其饲喂水产养殖饲料组合物来可持续性生产水产养殖肉制品的方法，所述方法包括以下步骤：通过用二十碳五烯酸(“EPA”)和二十二碳六烯酸(“DHA”)的单一微生物来源代替水产养殖饲料组合物中的全部或部分鱼油来配制所述组合物，其中所述微生物是经遗传工程改造以用于生产含多不饱和脂肪酸的微生物油的转基因微生物，所述微生物油包含EPA和DHA。
优选地，所述转基因微生物是Thraustochytriales目的微生物。
详细描述
本公开中使用了一些术语和缩写。提供以下定义：
“多不饱和脂肪酸”缩写为“PUFA”。
“三酰基甘油”缩写为“TAG”。
“总脂肪酸”缩写为“TFA”。
“脂肪酸甲酯”缩写为“FAME”。
“细胞干重”缩写为“DCW”。
在本文中使用时，术语“发明”或“本发明”旨在表示在本文的权利要求和说明书中描述的本发明的所有方面和实施方式，并且不应被理解为限于任何特定实施方式或方面。
术语鱼的“饮食周期”是指在水产养殖生产期间向鱼饲喂饮食或水产养殖饲料的生长期或阶段(即生长阶段)。下表1中列出了大西洋鲑鱼的饮食周期的实例，其中有六个阶段，对应于标注的起始重量和结束重量。对于不同类型的鱼和/或不同的水产养殖实践，饮食周期的阶段数以及每个阶段鱼的起始重量和结束重量可不同。
表1.鱼生长的示例性饮食周期或阶段
阶段
术语“水产养殖饲料组合物”、“水产养殖饲料制剂”、“水产养殖饲料”和“水产饲料”在本文中可互换使用。它们是指制造的饮食或人工饮食(即配制饲料)，以补充或替代水产养殖业中的天然饲料。这些制备的食品通常以薄片状(flake)、丸粒状或片状(table)形式生产。通常，水产养殖饲料组合物是指人工复合饲料，其可用于养殖的有鳍鱼类和甲壳类动物(即较低价值的主食鱼类物种[例如，淡水有鳍鱼类诸如鲤鱼、罗非鱼和鲶鱼]和用于奢侈市场或小众市场的较高价值的经济作物物种[例如，主要是海洋物种和洄游物种，诸如小虾、鲑鱼、鳟鱼、黄尾鱼、鲈鱼、海鲷和石斑鱼])。这些配制的饲料由多种比例、互相补充的成分组成，以形成用于水产养殖物种的营养全面的饮食。水产养殖饲料组合物被用于生产“水产养殖产品”，其中该产品是可收获的水产养殖物种(例如，有鳍鱼类、甲壳类动物)，其往往出售供人类消费。例如，鲑鱼在水产养殖中大量生产，因此是水产养殖产品。
术语“水产养殖肉制品”是指旨在用于人类消费的食品，其包含至少一部分来自如上所定义的水产养殖产品的肉类。水产养殖肉制品可以是例如整条鱼或从鱼上切下的鱼片，其中每一种都可以作为食物消费。
“二十碳五烯酸”[“EPA”]是顺式-5,8,11,14,17-二十碳五烯酸的通用名。这种脂肪酸是20:5ω-3脂肪酸。除非另有特别说明，本公开中使用的术语EPA是指酸或酸的衍生物(例如甘油酯、酯、磷脂、酰胺、内酯、盐等)。
“二十二碳六烯酸”[“DHA”]是顺式-4,7,10,13,16,19-二十二碳六烯酸的通用名。这种脂肪酸是22:6ω-3脂肪酸。除非另有特别说明，本公开中使用的术语DHA是指酸或酸的衍生物(例如甘油酯、酯、磷脂、酰胺、内酯、盐等)。
在本文中使用时，术语“添加剂组合物”是指源自微生物来源的物质，所述微生物来源以选自以下的形式提供：生物质、经处理的生物质、部分纯化的油和纯化油，其中任何一种均获自单一的微生物。
在本文中使用时，术语“生物质”是指微生物细胞物质。生物质可以自然产生，或者可以由天然宿主或突变菌株或重组生产宿主的发酵产生。生物质可以呈全细胞、全细胞裂解物、均化细胞、部分水解的细胞物质和/或部分纯化的细胞物质(例如微生物产生的油)的形式。术语“经处理的生物质”是指已进行额外处理的生物质，所述额外处理例如干燥、巴氏杀菌、破裂等，其中每种均在下文详细讨论。
术语“脂质”是指任何脂溶性(即亲脂性)的自然存在的分子。美国专利申请公开号2009-0093543-A1中提供了脂质的总体概述。术语“油”是指在25℃下为液体且通常为多不饱和的脂质物质。
术语“提取油”是指已经从细胞物质(例如，其中合成油的微生物)中分离的油。提取油通过多种方法获得，其中最简单的方法仅涉及物理手段。例如，使用多种压力配置(例如，螺杆，推进器，活塞，珠式搅拌器等)的机械破碎能够从细胞物质中分离油。或者，可以通过用多种有机溶剂(例如己烷)处理、通过酶促提取、通过渗压震扰、通过超声提取、通过超临界流体提取(例如，CO2提取)、通过皂化和通过这些方法的组合进行油提取。可以进一步纯化或浓缩提取油。
“鱼油”指源自油性鱼类组织的油。油性鱼类的实例包括但不限于：鲱鱼、鳀鱼、青鱼(herring)、毛鳞鱼、鳕鱼等。鱼油是水产养殖中所用饲料的典型组分。
“植物油”是指从植物获得的任何食用油。通常，从植物的种子或谷粒中提取植物油。术语“三酰基甘油”[“TAG”]是指由三个脂肪酰基残基酯化到甘油分子构成的中性脂质。
TAG可以含有长链PUFA和饱和脂肪酸，以及较短链的饱和脂肪酸和不饱和脂肪酸。“中性脂质”是指那些通常作为贮存脂肪存在于细胞中的脂质体中的脂质，它们之所以被称为“中性脂质”是因为在细胞PH下，所述脂质无带电基团。它们一般是完全非极性的，对水无亲和力。中性脂质一般是指甘油与脂肪酸的单酯、二酯和/或三酯，也分别称为单酰基甘油、二酰基甘油或三酰基甘油，或统称为酰基甘油。为了从酰基甘油中释放游离脂肪酸，必须发生水解反应。
术语“总脂肪酸”[“TFA”]在本文指给定样品中能通过碱酯交换方法(本领域已知的方法)被衍生化成脂肪酸甲酯[“FAME”]的所有细胞脂肪酸的总和，所述样品可以是例如生物质或油。因此，总脂肪酸包括来自中性脂质级分(包括二酰基甘油、单酰基甘油和TAG)的脂肪酸和来自极性脂质级分(包括，例如磷脂酰胆碱和磷脂酰乙醇胺级分)的脂肪酸，但是不包括游离脂肪酸。
术语细胞的“总脂质含量”是TFA的量度，以细胞干重[“DeW”]百分比的形式表示，但总脂质含量可以近似为FAME的量度，以DeW的百分比[“FAME％DeW”]的形式表示。因此，总脂质含量[“TFA％DeW”]等同于例如每100毫克DeW的总脂肪酸的毫克数。
总脂质中脂肪酸的浓度在本文中表示为TFA的重量百分比(％TFA)，例如每100毫克TFA中给定脂肪酸的毫克数。除非在本文的公开内容中另有特别说明，否则提及给定脂肪酸相对于总脂质的百分比等同于以％TFA计的脂肪酸浓度(例如，总脂质的％EPA等同于EPA％TFA)。
在某些情况下，将细胞中给定脂肪酸的含量表示为其在细胞干重中的重量百分比(％DCW)是有用的。因此，例如，根据下式来确定二十碳五烯酸％DCW：(二十碳五烯酸％TFA)*(TFA％DCW)]/100。然而，可以将细胞中给定脂肪酸的含量(以其在细胞干重中的重量百分比(％DCW)计)近似为：(二十碳五烯酸％TFA)*(FAME％DCW)]/100。
术语“脂质谱”和“脂质组成”是可互换的，其是指特定脂质级分中(例如总脂质或油中)所含的各种脂肪酸的量，其中所述量表示为TFA的重量百分比。混合物中存在的各种脂肪酸的总和应为100。
术语“混合油”是指通过以下获得的油：将本文所述的提取油与任意组合的油或单独的油混合或共混以获得期望的组合物。因此，例如，可以将来自不同微生物的各种类型的油混合在一起以获得期望的PUFA组合物。或者或另外，可以将本文公开的含PUFA的油与鱼油、植物油或两者的混合物混合以获得期望的组合物。
术语“脂肪酸”是指不同链长(约C12至C22)的长链脂族酸(链烷酸)，但更长和更短链长的酸都是已知的。主要链长介于C16和C22之间。脂肪酸的结构由简单的符号系统“X:Y”表示，其中X是特定脂肪酸中碳[“C”]原子的总数，Y是双键数。美国专利7,238,482中提供了关于“饱和脂肪酸”与“不饱和脂肪酸”、“单不饱和脂肪酸”与“多不饱和脂肪酸”["PUFAs"]以及“ω-6脂肪酸”[“00-6”或“n-6”]与“ω-3脂肪酸”[“00-3”或“n-3”]之间区别的额外详细信息，该专利通过引用并入本文。
“鱼粉”是指水产养殖饲料组合物的蛋白质来源。鱼粉通常由与用于人类消费的鱼(例如鲑鱼、金枪鱼)的加工相关的渔业废物产生，或者由专门为了生产鱼粉而收集的特定鱼类(即青鱼、鲱鱼)产生。
水产养殖是养殖水生动物和水生植物的做法。其涉及在受控条件下培养水产品(例如淡水动物和咸水动物)。其涉及使鱼类、贝类和水生植物在淡水、半咸水或咸水中生长并收获。
水产养殖中生长的生物体可包括鱼类和甲壳类动物。甲壳类动物有例如龙虾、螃蟹、小虾、对虾和小龙虾。有鳍鱼类养殖是水产养殖的最常见形式。
其涉及在贮水池、池塘或海洋围场中商业化饲养鱼类，通常用于食物。将幼鱼释放到野外用于休闲渔业或补充物种的自然数量的设施通常被称为鱼类孵化场。特别感兴趣的是鲑科群组的鱼，例如樱花鲑(Oncorhynchus rnasou)、努克鲑鱼(O.tshawytscha)、狗鲑(O.keta)、银鲑(O.kisutch)、粉鲑(O.gorbuscha)、红鲑(O.nerka)和大西洋鲑鱼(Salmosalar)。水产养殖感兴趣的其它有鳍鱼类包括但不限于各种鳟鱼，以及白鱼属诸如罗非鱼(包括Oreochromis、Sarotherodon和Tilapia的各种物种)、海鲈、鲶鱼(Siluriformes目)、大眼金枪鱼(Thunnus obesus)、鲤鱼(Cyprinidae科)和鳕鱼(Gadus)。
水产养殖通常需要制备的水产养殖饲料组合物以满足培养动物的饮食需求。不同水产养殖物种的饮食需求不同，一种物种在不同生长阶段的饮食需求也不同。因此，投入了巨大的研究以优化用于培养生物体每个生长阶段的每种水产养殖饲料组合物。
水产养殖饲料组成由微量组分和大组分(micro and macro components)组成。一般来说，以超过1％的水平使用的所有组分都被视为大组分。以低于1％的水平使用的饲料成分是微量组分。将它们预混合以实现微量组分在完整饲料中均匀分布。大组分和微量组分均被细分成具有营养功能和技术功能的成分。
具有技术功能的成分改善水产养殖饲料组合物的物理品质或其外观。
具有营养功能的大组分为水生动物提供生长和行为所需的蛋白质和能量。对于鱼类而言，水产养殖饲料组合物理想地应该为鱼类提供：1)脂肪，其充当脂肪酸来源用于能量(特别是用于心脏和骨骼肌)；和2)氨基酸，其充当蛋白质的结构单元。脂肪还有助于维生素吸收；例如，维生素A、D、E和K是脂溶性的，或者只能与脂肪一起被消化、吸收和运输。虽然碳水化合物相较于蛋白质和脂肪不是更优的鱼类能量来源，但它们(通常为植物来源(例如小麦、向日葵粉、玉米麸质、豆粉))往往也包含在饲料组合物中。
通常通过将鱼粉(其含有少量鱼油)和鱼油掺入水产养殖饲料组合物中来提供脂肪。可用于水产养殖饲料组合物中的提取油包括鱼油(例如，来自油性鱼类鲱鱼、鳀鱼、青鱼、毛鳞鱼和鳕鱼肝)和植物油(例如，来自大豆、油菜籽、向日葵种子和亚麻籽)。通常，鱼油是优选的油，这是因为其含有长链ω-3多不饱和脂肪酸[“PUFA”](EPA和DHA)；相比之下，植物油不提供EPA和/或DHA来源。这些PUFA是大多数水产养殖产品的生长和健康所需的。典型的水产养殖饲料组合物包含约15-30％的油(例如鱼、植物等)，以水产养殖饲料组合物的重量百分比测量。
典型鱼油中提供的EPA(总脂肪酸的百分比[“％TFA”])和DHA％TFA的量不同，EPA与DHA的比率也不同。基于Turchini、Torstensen和Ng的工作(Reviews in Aquaculture 1:10-57(2009))的工作，在表2中总结了典型值：
表2.多种鱼油中典型的EPA含量和DHA含量
水产养殖饲料组合物中提供的蛋白质可以是植物来源或动物来源的。例如，动物来源的蛋白质可以来自海洋动物(例如鱼粉、鱼油、鱼类蛋白质、磷虾粉、贻贝粉、虾皮、鱿鱼粉、鱿鱼油等)或陆栖动物(例如，血粉、蛋粉、肝粉、肉粉、肉骨粉、蚕、蛹粉、乳清粉等)。植物来源的蛋白质可以包括豆粕、玉米麸质粉、小麦麸质、棉籽粕、油菜籽粕、向日葵粉、稻等。
大组分的技术功能可以重叠，例如，小麦麸质可以用作造粒助剂，并且由于其蛋白质含量而被使用，其具有相对高的营养价值。还可以提及瓜尔胶和小麦粉。
微量组分包括饲料添加剂，例如维生素、微量元素、饲料抗生素和其他生物制品。以低于100mg/kg(100ppm)的水平使用的矿物质被视为微量矿物质或微量元素。
具有营养功能的微量组分都是生物制品和微量元素。它们参与生物过程，并且为良好健康状态和高效能表现所需。可以提及维生素，例如维生素A、E、K3、D3、B1、B3、B6、B12、C，生物素，叶酸，泛酸，烟酸，氯化胆碱，肌醇和对氨基苯甲酸。可以提及矿物质，例如钙盐、钴盐、铜盐、铁盐、镁盐、磷盐、钾盐、硒盐和锌盐。其它组分可包括但不限于抗氧化剂、β-葡聚糖、胆汁盐、胆固醇、酶、谷氨酸钠、类胡萝卜素等。
微量组分的技术功能主要与造粒、解毒、防霉、抗氧化等有关。
在水产养殖中，通常在鱼类生长时，在不同的饮食周期饲喂它们。例如，如上表1所示，在大西洋鲑鱼从100克生长到4千克期间，可以在六个不同的饮食周期饲喂它们。不同饮食周期的鱼的重量可因鱼的类型和/或所用的水产养殖实践而异。
在第二方面，水产养殖饲料组合物可以包含总量为至少约0.8％的源自单一微生物来源的EPA和DHA，所述量以所述水产养殖饲料组合物的重量百分比测量。该量(即，0.8％)通常是适合于支持在水产养殖中生长的各种动物生长的恰当的最低浓度，并且特别适合于包含在鲑科鱼的饮食中。
如前所述，鱼油(即鳀鱼油)中最高的EPA:DHA比率为1.93:1(Turchini、Torstensen和Ng，如上所述)，鱼油中最低的EPA:DHA比率为1.21:1。因此，认为尚未生产出EPA:DHA比率高于1.93:1或低于1.21:1的市售水产养殖饲料组合物。
为了达到如本文所述的高于2:1或低于1.2:1的EPA:DHA比率，需要EPA和DHA的替代来源。
在一个实例中，本发明的水产养殖饲料组合物包含一种来源的DHA和EPA，其中基于EPA和DHA各自的浓度，EPA:DHA的比率高于2:1，EPA和DHA各自以微生物来源或水产养殖饲料组合物中总脂肪酸的重量百分比测量。
在另一个实例中，本发明的水产养殖饲料组合物包含一种来源的DHA和EPA，其中基于EPA和DHA各自的浓度，EPA:DHA的比率低于1:1，优选地介于0.2:1和1:1之间，EPA和DHA各自以微生物来源或水产养殖饲料组合物中总脂肪酸的重量百分比测量。
制造本发明的水产养殖饲料组合物的大多数方法开始于微生物发酵，其中在允许生长并产生包含EPA和DHA的微生物油的条件下培养特定微生物。在适当的时间，从发酵容器收获微生物细胞。可以使用多种方法机械处理这种微生物生物质，例如脱水、干燥、机械破碎、造粒等。然后，将生物质(或从其中提取的油)用作水产养殖饲料中的成分(优选地用作标准水产养殖饲料组合物中使用的至少部分鱼油的的替代物)。然后在水生动物的一部分寿命期间向其饲喂水产养殖饲料，以使来自水产养殖饲料中的EPA和DHA在水生动物体内积累。收获之后，所得的水产养殖肉制品因此包含等于或大于2:1或等于或低于1:1的EPA/DHA比率。以下将更详细地讨论这些方面中的每一个。
根据本发明的包含EPA和DHA的微生物油可以以适用于本文的水产养殖饲料组合物中的多种形式提供，其中所述油通常包含在微生物生物质或经处理的生物质内，或所述油是部分纯化的油或纯化油。在大多数情况下，与微生物油(部分纯化形式或纯化形式)不同，将微生物生物质或经处理的生物质掺入水产养殖饲料组合物中是最具成本效益的；然而，这些经济因素在本文中不应被视为限制。
根据本发明的微生物是藻类、真菌或酵母。优选的微生物是破囊壶菌(Thraustochytrids)，它们是Thraustochytriales目的微生物。破囊壶菌包括Schizochytrium属和Thraustochytrium属的成员，并被认为是ω-3脂肪酸(包括DHA和EPA)的替代来源。参见美国专利号5,130,242。
在一个优选的实施方式中，微生物是Schizochytrium种的突变菌株。Schizochytrium菌株是PUFA(例如DHA)的自然来源，并且可以通过诱变进行优化，以用作根据本发明的微生物来源。
可以通过下述方法获得产DHA和EPA的Schizochytrium菌株：连续诱变，然后适当地选择显示优异的EPA和DHA生产和特定的EPA:DHA比率的突变菌株。起始野生型菌株包括保藏在世界各地的各种培养物保藏中心的那些，例如ATCC和荷兰真菌菌种保藏中心(CBS)。通常需要进行两次或更多次连续的诱变循环以获得期望的突变菌株。
可以使用能够诱导酵母细胞遗传变化的任何化学试剂或非化学(例如紫外线(UV)辐射)试剂作为诱变剂。这些试剂可以单独使用或者彼此组合使用，并且化学试剂可以纯粹地(neat)使用或与溶剂一起使用。
例如，可以诱变和选择菌株，以使得其产生的EPA和DHA的量具有商业利益以及具有等于或高于2:1的EPA:DHA比率，以及可以具有至少约2.2:1、2.5:1、3:1、3.5:1、4:1、4.5:1、5:1、5.5:1、6:1、6.5:1、7:1、7.5:1、8:1、8.5:1、9:1、9.5:1或10:1或更高的比率。或者，可以诱变和选择菌株，以使得其产生的EPA和DHA的量具有商业利益以及具有等于或低于1:1的EPA:DHA比率，以及可以具有约0.9:1、0.8:1、0.7:1、0.6:1、0.5:1、0.4:1、0.3:1、0:2:1或更低的比率。
或者，可以通过被遗传转化以生产PUFA的微生物来生产根据本发明的微生物来源。任选地，可以通过下述方法对微生物进行工程改造以生产DHA和EPA：在宿主生物体中表达编码例如δ-6去饱和酶/δ-6延伸酶通路或δ-9延伸酶/δ-8去饱和酶通路的延伸酶和去饱和酶的合适的异源基因。
表达盒中的异源基因通常整合到宿主细胞基因组中。包含在特定表达盒内的特定基因取决于宿主生物体、其PUFA谱和/或去饱和酶/延伸酶谱、底物的可用性和期望的终产物。产生EPA的PUFA聚酮合成酶[“PKS”]体系，例如如Shewanella putrefaciens(美国专利6,140,486)、Shewanella olleyana(美国专利7,217,856)、Shewanella japonica(美国专利7,217,856)和Vibrio marinus(美国专利6,140,486)中所述的那些，也可以引入合适的产DHA的微生物中以使得能够产生EPA和DHA。也可以对具有天然产生DHA的其它PKS体系的宿主生物体进行工程改造，以使得能够生产PUFA的合适组合，从而产生高于2:1或低于1:1的EPA:DHA比率。
本领域技术人员熟悉将一种或多种编码用于EPA和DHA生物合成的合适酶的表达盒引入所选择的微生物宿主生物体中所必需的注意事项和技术，并且文献对技术人员提供了许多教导。包含来自这些遗传改造生物体的EPA和DHA的微生物油也可适用于本文的水产养殖饲料组合物中，其中油可以包含在微生物生物质或经处理的生物质中，或者油可以是部分纯化的油或纯化的油。
可用于本发明的典型的微生物种以ATCC登记号PTA-10208、PTA-10209、PTA-10210或PTA-10211、PTA-10212、PTA-10213、PTA-10214、PTA--10215保藏。
在一些实施方式中，本发明涉及分离的微生物，其具有以ATCC登记号PTA-10212保藏的种或源自其的菌株的特征。以ATCC登记号PTA-10212保藏的种的特征可以包括其生长和表型性质(表型性质的实例包括形态学性质和繁殖性质)、其物理性质和化学性质(例如干重和脂质谱)、其基因序列，以及它们的组合，其中所述特征将所述种与以前鉴定的种区分开。在一些实施方式中，本发明涉及分离的微生物，其具有以ATCC登记号PTA-10212保藏的种的特征，其中所述特征包括：包含SEQ ID NO1的多核苷酸序列或者与SEQ ID NO1具有至少94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的多核苷酸序列的18s rRNA，以ATCC登记号PTA-10212保藏的种的形态学性质和繁殖性质，以及以ATCC登记号PTA-10212保藏的种的脂肪酸谱。
在另一些实施方式中，突变菌株是以ATCC登记号PTA-10213、PTA-10214或PTA-10215保藏的菌株。与ATCC登记号PTA-10213、PTA-10214和PTA-10215相关的微生物于2009年7月14日根据布达佩斯条约保藏在美国典型培养物保藏中心专利保藏库(American TypeCulture Collection,Patent Depository),10801University Boulevard,马纳萨斯,VA201 10-2209。
在一些实施方式中，本发明涉及以ATCC登记号PTA-10208保藏的种的分离的微生物。与ATCC登记号PTA-10208相关的分离的微生物在本文中也称为Schizochytriumsp.ATCC PTA-10208。与ATCC登记号PTA-10208相关的微生物于2009年7月14日根据布达佩斯条约保藏在美国典型培养物保藏中心专利保藏库,10801University Boulevard,马纳萨斯,VA 201 10-2209。
在一些实施方式中，本发明涉及以ATCC保藏号PTA-10208保藏的微生物的突变菌株。在另一些实施方式中，突变菌株是以ATCC登记号PTA-10209、PTA-10210或PTA-10211保藏的菌株。与ATCC登记号PTA-10209、PTA-10210和PTA-10211相关的微生物于2009年9月25日根据布达佩斯条约保藏在美国典型培养物保藏中心专利保藏库,10801UniversityBoulevard,马纳萨斯,VA 201 10-2209。
根据本发明的微生物可以在发酵培养基中并在微生物产生PUFA的条件下培养和生长。通常，向微生物供应碳源和氮源，以及一些允许微生物生长和/或产生EPA和DHA的额外化学品或物质。发酵条件取决于所用微生物，并且可以针对所得生物质中高含量的期望PUFA进行优化。
通常，可以通过改变碳源的类型和量、氮源的类型和量、碳氮比、不同矿物离子的量、氧水平、生长温度、pH、生物质生产期的长度、油积累期的长度以及细胞收获的时间和方法来优化培养基条件。
当微生物已产生期望量的EPA和DHA时，可以处理发酵培养基以获得包含PUFA的微生物生物质。例如，可以过滤或以其它方式处理发酵培养基以除去至少部分水性组分。可以进一步处理发酵培养基和/或微生物生物质，例如可以对微生物生物质进行巴氏杀菌或通过其它方式处理，以降低可损害微生物油和/或PUFA的内源性微生物酶的活性。可以使微生物生物质经受干燥(例如，达到期望的水含量)或机械破碎方法(例如，通过物理方法，例如珠磨器、螺杆挤出等，以提供对细胞内容物更多的接近)，或这些的组合。可以对微生物生物质进行粒化或造粒以便于处理。因此，由任何上述方法获得的微生物生物质可用作包含EPA和DHA的微生物油的来源。然后可将这种微生物油来源用作水产养殖饲料组合物中的成分。
在本发明的第一个实例中，可持续性生产包含比率等于或高于2:1的EPA和DHA的水产养殖肉制品，所述比率基于水产养殖肉制品中EPA和DHA各自的浓度。EPA与DHA各自的浓度比率可以等于或高于2:1、2.1:1、2.2:1、2.3:1、2.4:1、2.5:1、2.6:1、2.7:1、2.8:1、2.9:1、3:1、3.5:1、4:1、4.5:1、5:1、5.5:1、6:1、6.5:1、7:1、7.5:1、8:1、8.5:1、9:1、9.5:1或10:1或更高。
在本发明的第二个实例中，可持续性生产包含比率等于或低于1:1的EPA和DHA的水产养殖肉制品，所述比率基于水产养殖肉制品中EPA和DHA各自的浓度。EPA与DHA各自的浓度之比可以等于或低于1:1、0.9:1、0.8:1、0.7:1、0.6:1、0.5:1、0.4:1、0.3:1、0:2:1或更低。
根据本发明的微生物油的一个优选实例是来自Schizochytrium的油，其含有：
-至少40％w/w的DHA和EPA、优选地约50％w/w的DHA和EPA，
-约0.2:1至1:1、优选地0.4:1至0.8:1的EPA:DHA比率；和
-至少一种抗氧化剂，加入其是为了提供稳定性。
所述的以及由任何上述方法获得的微生物油可被用作用于向水产养殖动物饲喂的水产养殖饲料组合物中的EPA和DHA的单一来源，以生产EPA:DHA比率等于或大于2:1或者等于或小于1:1的水产养殖肉制品。
使用本发明方法获得的水产养殖肉制品可以进一步包含总量为至少约0.5％的EPA和DHA，所述量以所述水产养殖肉制品的重量百分比计。该量是水产养殖肉制品中通常存在的量。
可以通过以下方式获得总量为至少约0.5％的EPA和DHA(以水产养殖肉制品的重量百分比计)：向水产养殖动物饲喂EPA加DHA的总和通常为按重量计水产养殖饲料组合物的至少约1.6％的水产养殖饲料组合物。
基于本文的公开内容，清楚的是可以利用鱼油的可再生替代物，作为持续性生产鱼类饮食周期中的水产养殖饲料组合物的方法。
已经一般性地描述了本发明，通过参考本文提供的实施例能够获得进一步的理解。这些实施例仅仅是为了说明的目的，而不是限制性的。
实施例1：以ATCC登记号PTA-10212保藏的分离的微生物的生长特征
如下文所述，在单独发酵运行中检测以ATCC登记号PTA-10212保藏的分离的微生物的生长特征。典型的培养基和培养条件如表3所示。
表3：PTA-10212容器培养基
高压灭菌后(金属)
高压灭菌后(维生素)
高压灭菌后(碳)
甘油 g/L 30.0 5-150、10-100或20-50
氮饲料：
MSG*1H2O g/L 17 0-150、10-100或15-50
典型的培养条件包括以下：
在22.5℃的pH 7.3下的含有20％溶解氧、含有1000ppm Cl的补充有碳(甘油)和氮的培养物中，PTA-10212在于10L发酵罐体积中培养138小时后产生26.2g/L的细胞干重。脂质产量为7.9g/L；ω-3产量为5.3g/L；EPA产量为3.3g/L，DHA产量为1.8g/L。脂肪酸含量为30.3重量％；EPA含量为脂肪酸甲酯(FAME)的41.4％；且DHA含量为FAME的26.2％。在这些条件下，脂质生产率为1.38g/L/天，ω-3生产率为0.92g/L/天，EPA生产率为0.57g/L/天，DHA生产率为0.31g/L/天。
在含有1000ppm Cl的补充有碳(甘油)和氮的培养物中，所述培养物在22.5℃和pH7.3下且含有20％溶解氧，PTA-10212在于10L发酵罐体积中培养189小时后产生38.4g/L的细胞干重。脂质产量为18g/L；ω-3产量为12g/L；EPA产量为5g/L，DHA产量为6.8g/L。脂肪酸含量为45重量％；EPA含量为FAME的27.8％；且DHA含量为FAME的37.9％。在这些条件下，脂质生产率为2.3g/L/天，ω-3生产率为1.5g/L/天，EPA生产率为0.63g/L/天，DHA生产率为0.86g/L/天。
在含有1000ppm Cl的补充有碳(甘油)和氮的培养物中，所述培养物在22.5℃和pH6.8-7.7下并含有20％溶解氧，PTA-10212在于10L发酵罐体积中培养189小时后产生13g/L的细胞干重。脂质产量为5.6g/L；ω-3产量为3.5g/L；EPA产量为1.55g/L，DHA产量为1.9g/L。脂肪酸含量为38重量％；EPA含量为FAME的29.5％；且DHA含量为FAME的36％。在这些条件下，脂质生产率为0.67g/L/天，ω-3生产率为0.4g/L/天，EPA生产率为0.20g/L/天，DHA生产率为0.24g/L/天。
在含有1000ppm Cl的补充有碳(甘油)和氮的培养物中，所述培养物在22.5-28.5℃和pH 6.6-7.2下且含有20％溶解氧，PTA-10212在于10L发酵罐体积中培养191小时后产生36.7g/L-48.7g/L的细胞干重。脂质产量为15.2g/L-25.3g/L；ω-3产量为9.3g/L-13.8g/L；EPA产量为2.5g/L-3.3g/L，DHA产量为5.8g/L-11g/L。脂肪酸含量为42.4重量％-53重量％；EPA含量为FAME的9.8％-22％；且DHA含量为FAME的38.1％-43.6％。在这些条件下，脂质生产率为1.9g/L/天-3.2g/L/天，ω-3生产率为1.2g/L/天-1.7g/L/天，EPA生产率为0.31g/L/天-0.41g/L/天，DHA生产率为0.72g/L/天-1.4g/L/天。
实施例2DHA和EPA作为微生物生物质在大西洋鲑鱼中的表观消化率
将初始体重约200g的大西洋鲑鱼随机分配到1.5m贮水池中，每个贮水池50条鱼。水温在10℃范围内。在开始饲喂实验饮食之前，使鱼适应对照饮食持续2周。
根据表4中所述的配方，在卑尔根的Nofima通过挤出产生3-mm的饮食。仅向饮食中加入菜籽油，对照饮食中基础水平的DHA和EPA来自以约23％的水平包含在饮食中鱼粉。不向饮食中加入鱼油。
使用Schizochytrium sp.种ATCC PTA-10208(又名OvegaGoldTM)的生物质作为DHA和EPA的微生物来源。生物质包含物为饮食的0％、0.9％、3.5％和6.2％，这对应于0％、0.5％、1.0％、1.5％的DHA水平。
饲喂鱼至少4周，每种饮食处理一式三份地进行。实验饲喂4周后，通过剥开来自每个贮水池的每条鱼来收集粪便。从每个贮水池中的五条鱼取出肌肉样品。
测定ω-3脂肪酸和营养物(例如，干物质、脂质和蛋白质)的表观消化系数(apparent digestibility coefficient)。
使用Statbox Pro(单因素方差分析)进行统计学分析。
表4：饮食配方
DHA和EPA的饲料内回收率(in-feed recovery)结果示于表5。结果显示：非常好的通过挤出加工饲料之后的DHA和EPA回收率以及明显的剂量响应。
表5：饲料内回收率
测定DHA、EPA、DHA+EPA和ω-3脂肪酸的表观消化系数。图1、2和3分别展示了DHA+EPA、EPA和DHA的消化性。结果显示：通过藻源提供的EPA和DHA具有高的消化性。
图1：补充有分级量OvegaGold的饮食中DHA的表观消化率。统计分析结果示于表6。
图2：补充有分级量OvegaGold的饮食中EPA的表观消化率。统计分析结果示于表6。
图3：补充有分级量OvegaGold的饮食中DHA的表观消化率。统计分析结果示于表6。
图4：饲喂实验饮食约4周后，ω-3脂肪酸的肌肉沉积。肌肉含量证实了来自微藻(microalgal)来源的ω-3脂肪酸的高生物利用度。
表6：表观消化系数(平均值±Sd)
作为结论，当以补充到鲑鱼饮食的微藻生物质的形式提供时，DHA和EPA具有高生物可利用性。

Claims (26)

1.通过在鱼类的饮食周期中向其饲喂水产养殖饲料组合物来可持续性生产水产养殖肉制品的方法，所述方法包括以下步骤：通过用二十碳五烯酸(“EPA”)和二十二碳六烯酸(“DHA”)的单一微生物来源代替水产养殖饲料组合物中的全部或部分鱼油来配制所述组合物。
2.权利要求1所述的方法，其中所述水产养殖饲料组合物包含总量为至少约0.8％的EPA和DHA，所述量以所述水产养殖饲料组合物的重量百分比测量。
3.权利要求1或2所述的方法，其中基于所述微生物来源或所述水产养殖饲料组合物中EPA和DHA各自的浓度，EPA的浓度与DHA的浓度之比为至少2:1。
4.权利要求1或2所述的方法，其中基于所述微生物来源或所述水产养殖饲料组合物中EPA和DHA各自的浓度，EPA的浓度与DHA的浓度之比为1:1或更低。
5.权利要求1-4中任一项所述的方法，其中所述微生物来源是微生物油，且其中所述微生物油以选自以下的形式提供：生物质、经处理的生物质、部分纯化的油和纯化油，其中任何一种均获自所述微生物来源。
6.权利要求1-5中任一项所述的方法，其中所述微生物来源所源自的微生物是藻类、真菌或酵母。
7.权利要求6所述的方法，其中所述微生物是Schizochytrium属或Thraustochytrium属的成员。
8.权利要求7所述的方法，其中所述微生物具有以ATCC登记号PTA-10208或PTA-10209或PTA-10210或PTA-10211或PTA-10212或PTA-10213或PTA-10214或PTA-10215保藏的种的特征。
9.权利要求6-8中任一项所述的方法，其中所述微生物是突变菌株。
10.权利要求6-8中任一项所述的方法，其中所述微生物是经遗传工程改造用于生产含多不饱和脂肪酸的微生物油的转基因微生物，所述微生物油含有EPA和DHA。
11.权利要求1-10中任一项所述的方法，其中基于所述水产养殖肉制品中EPA和DHA各自的浓度，所述水产养殖肉制品中EPA的浓度与DHA的浓度之比等于或高于2:1。
12.权利要求1-10中任一项所述的方法，其中基于所述水产养殖肉制品中EPA和DHA各自的浓度，所述水产养殖肉制品中EPA的浓度与DHA的浓度之比等于或低于1:1。
13.用于水产养殖饲料的饲料添加剂组合物，其包含源自单一微生物来源的二十碳五烯酸(“EPA”)和二十二碳六烯酸(“DHA”)。
14.权利要求13所述的添加剂组合物，其以选自以下的形式提供：生物质、经处理的生物质、部分纯化的油和纯化油，其中任何一种均获自所述微生物来源。
15.权利要求13或14所述的添加剂组合物，其中所述微生物来源所源自的微生物是藻类、真菌或酵母。
16.权利要求15所述的添加剂组合物，其中所述微生物是Schizochytrium属或Thraustochytrium属的成员。
17.权利要求16所述的添加剂组合物，其中所述微生物具有以ATCC登记号PTA-10208或PTA-10209或PTA-10210或PTA-10211或PTA-10212或PTA-10213或PTA-10214或PTA-10215保藏的种的特征。
18.权利要求13-17中任一项所述的添加剂组合物，其是含有至少40％w/w的DHA和EPA、优选地约50％w/w的DHA和EPA的纯化微生物油形式。
19.水产养殖饲料，其包含二十碳五烯酸(“EPA”)和二十二碳六烯酸(“DHA”)的单一微生物来源。
20.权利要求19所述的水产养殖饲料，其包含总量为至少约0.08％的EPA和DHA，所述量以所述饲料的重量百分比测量。
21.权利要求19或20所述的水产养殖饲料，其中基于所述微生物来源或所述饲料中EPA和DHA各自的浓度，EPA的浓度与DHA的浓度之比等于或小于1:1。
22.权利要求19或20所述的水产养殖饲料，其中基于所述微生物来源或所述饲料中EPA和DHA各自的浓度，EPA的浓度与DHA的浓度之比等于或大于2:1。
23.权利要求19-22中任一项所述的水产养殖饲料，其中所述微生物来源是微生物油，并且其中所述微生物油以选自以下的形式提供：生物质、经处理的生物质、部分纯化的油和纯化油，其中任何一种均获自所述微生物来源。
24.权利要求19-23中任一项所述的水产养殖饲料，其中所述微生物来源所源自的微生物是藻类、真菌或酵母。
25.权利要求24所述的水产养殖饲料，其中所述微生物是Schizochytrium属或Thraustochytrium属的成员。
26.权利要求25所述的水产养殖饲料，其中所述微生物具有以ATCC登记号PTA-10208或PTA-10209或PTA-10210或PTA-10211或PTA-10212或PTA-10213或PTA-10214或PTA-10215保藏的种的特征。
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