BR112014001126A2 - óleo microbiano refinado e forma de dosagem oral - Google Patents

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Abstract

“óleo microbiano refinado e forma de dosagem oral” a presente invenção refere-se a óleos microbianos refinados contendo ácidos graxos poliinsaturados ômega-3 que compõem o ácido docosahexaenóico, ácido eicosapentaenóico e, opcionalmente, ácido docosapentaenóico e formas de dosagens orais contendo os referidos óleos.

Description

ÓLEO MICROBIANO REFINADO E FORMA DE DOSAGEM ORAL [001] O conteúdo da lista de sequência submetida eletronicamente (sequence listing.txt, 5.136 bytes, criado em 20 de julho de 2011) depositado com o pedido é aqui incorporado por referência na sua totalidade.
[002] A presente invenção é direcionada a microrganismos isolados, bem como estirpes e mutantes destes, biomassas, óleos microbianos, composições, e culturas; métodos de produzir os óleos microbianos, biomassas e mutantes; e métodos de utilização dos microrganismos isolados, biomassas, e óleos microbianos.
[003] Os ácidos graxos são classificados de acordo com as características de comprimento e saturação da cadeia de carbono. Os ácidos graxos são denominados ácidos graxos de cadeia curta, de cadeia média, ou de cadeia longa com base no número de átomos de carbono presentes na cadeia, são denominadas ácidos graxos saturados quando não há ligações duplas presentes entre os átomos de carbono, e são denominados ácidos graxos insaturados quando ligações duplas estão presentes. Os ácidos graxos insaturados de cadeia longa são monoinsaturados quando apenas uma ligação dupla está presente e são poliinsaturados quando mais do que uma ligação dupla está presente.
[004] Os ácidos graxos poliinsaturados (AGPIs) são classificados com base na posição da primeira ligação dupla a partir da extremidade metil do ácido graxo: ácidos graxos ômega-3 (n-3) contém uma primeira ligação dupla no terceiro carbono, enquanto ácidos graxos ômega-6 (n-6) contêm uma primeira ligação dupla no sexto carbono. Por exemplo, o
2/131 ácido docosahexaenóico (DHA) é um ácido graxo poliinsaturado de cadeia longa ômega-3 (AGPICL) com um comprimento de cadeia de 22 carbonos e 6 ligações duplas, muitas vezes designado como 22:6 n-3. Outros AGPIs ômega3 incluem o ácido eicosapentaenóico (EPA) designado como 20:5 n-3, e ácido docosapentaenóico ômega-3 (DPA n-3), designado como 22:5 n-3. DHA e EPA têm sido denominados ácidos graxos essenciais. AGPICL ômega-6 incluem o ácido araquidônico (ARA), designado por 20:4 n-6, e ácido docosapentaenóico ômega-6 (DPA n-6), designado por 22:5 n-6 .
[005] Ácidos graxos ômega-3 são moléculas biologicamente importantes que afetam a fisiologia celular devido à sua presença nas membranas das células, regulam a produção e expressão gênica de compostos biologicamente ativos, e servem como substratos biossintéticos. Roche, H.M., Proc. Nutr. Soc. 58: 397-401 (1999) . DHA, por exemplo corresponde a cerca de 15%-20% de lipidios no córtex cerebral humano, 30%-60% dos lipidios na retina, concentrase nos testículos e esperma, e é um componente importante do leite materno. Berge, J.P., e Barnathan, G.. Adv. Biochem. Eng. Biotechnol. 96:49-125 (2005) . O DHA é responsável por até 97% dos ácidos graxos ômega-3 no cérebro e até 93% dos ácidos graxos ômega-3 na retina. Além disso, o DHA é essencial para o desenvolvimento fetal e infantil, bem como a manutenção das funções cognitivas em adultos. Id. Devido ao fato de que ácidos graxos ômega-3 não são sintetizadas de novo no corpo humano, estes ácidos graxos devem ser derivados de fontes nutricionais.
[006] Óleo de linhaça e óleos de peixe são considerados
3/131 boas fontes alimentares de ácidos graxos ômega-3. 0 óleo de linhaça não contém EPA, DHA, DPA ou ARA, mas contém ácido linolênico (C18:3 n-3), um bloco de construção que permite ao organismo fabricar EPA. Há provas, no entanto, que a taxa de conversão metabólica pode ser lenta e variável, particularmente entre aqueles com saúde comprometida. Os óleos de peixe variam consideravelmente no tipo e nivel de composição de ácidos graxos dependendo das espécies particulares e suas dietas. Por exemplo, peixes criados por aquicultura tendem a ter um nivel mais baixo de ácidos graxos ômega-3 do que aqueles em estado selvagem. Além disso, os óleos de peixe têm o risco de conter contaminantes ambientais e podem ser associados com problemas de estabilidade e um cheiro ou gosto duvidoso.
[007] Thraustochytrids são microrganismos da ordem Thraustochytriales. Thraustochytrids inclui membros do gênero Schizochytrium e Thraustochytrium e foram reconhecidos como uma fonte alternativa de ácidos graxos ômega-3, incluindo DHA e EPA. Ver Patente dos EUA N£ 5.130.242. Os óleos produzidos a partir desses microrganismos heterotróficos marinhos muitas vezes têm perfil de ácidos graxos poliinsaturados mais simples do que os óleos de peixes ou microalgas correspondentes. Lewis, T.E., Mar. Biotechnol. 1:580-587 (1999). Estirpes de espécies Thraustochytrid têm sido relatadas produzir ácidos graxos ômega-3 como uma elevada porcentagem de ácidos graxos totais produzidos pelos organismos. Patente dos EUA N— 5.130.242; Huang, J. et al, J. Am. Chem. Oil. Chem. Soc. 78:605-610 (2001); Huang, J. et al., Mar. Biotechnol. 5:450-457 (2003). No entanto, thraustochytrids isolados
4/131 variam na identidade e valores de AGPICL produzidos, de tal forma que algumas estirpes descritas anteriormente podem ter níveis indesejáveis de ácidos graxos ômega-6 e/ou podem demonstrar baixa produtividade na cultura. Como tal, existe uma necessidade contínua para o isolamento de microrganismos que demonstrem uma elevada produtividade e perfis de AGPICL desejados.
[008] A presente invenção é direcionada a um microrganismo isolado da espécie depositada na instituição ATCC sob o N- de Acesso PTA-10212.
[009] A presente invenção é direcionada a um microrganismo isolado possuindo as características da espécie depositada na instituição ATCC sob o N£ de Acesso PTA-10212 .
[010] A presente invenção é direcionada a um microrganismo isolado, compreendendo uma RNAr 18s, compreendendo uma sequência polinucleotídica de SEQ ID NO:1 ou uma sequência polinucleotídica tendo pelo menos 94% de identidade com a SEQ ID NO:1.
[011] A presente invenção é direcionada a um microrganismo isolado compreendendo uma sequência polinucleot ídica RNAr 18s que tem, pelo menos, 94% de identidade com uma sequência polinucleotídica RNAr 18s do microrganismo depositado na instituição ATCC sob o N£ de Acesso PTA-10212.
[012] A presente invenção é direcionada a um microrganismo isolado da espécie depositada na instituição ATCC sob o N- de Acesso PTA-10208, em que os ácidos graxos totais produzidos pelo microrganismo compreendem mais do que cerca de 10% por peso de ácido eicosapentaenóico.
5/131
[013] A presente invenção é direcionada a um
microrganismo isolado possuindo as características da
espécie depositada na instituição ATCC sob o N— de Acesso
PTA-10208, em que os ácidos graxos totais produzidos pelo microrganismo compreendem mais do que cerca de 10% por peso de ácido eicosapentanóico.
[014] A presente invenção é direcionada a um microrganismo isolado que produz uma fração de triacilglicerol, em que o conteúdo de ácido eicosapentaenóico da fração de triacilglicerol é, pelo menos, cerca de 12% por peso.
[015] Em algumas formas de realização, o microrganismo isolado da presente invenção é uma estirpe mutante.
[016] A presente invenção é direcionada a um microrganismo isolado depositado na instituição ATCC sob os N— de Acesso PTA-10212, PTA-10213, PTA-10214, PTA-10215, PTA-10208, PTA-10209, PTA-10210 ou PTA-10211.
[017] A presente invenção é direcionada a uma biomassa
que inclui qualquer um dos microrganismos da presente
invenção ou as suas misturas.
[018] A presente invenção é direcionada a uma biomassa
isolada, em que, pelo menos, cerca de 20% por pe so de um
peso de células secas da biomassa são ácidos graxos, em que mais do que cerca de 10% por peso de ácidos graxos é o ácido eicosapentanóico, e em que os ácidos graxos compreendem menos do que cerca de 5% por peso de cada um de ácido araquidônico e ácido docosapentaenóico n-6. Em algumas formas de realização, pelo menos, cerca de 25% por peso dos ácidos graxos é o ácido docosahexaenóico.
[019] Em algumas formas de realização, a presente
6/131 invenção é direcionada a uma biomassa isolada compreendendo triacilglicerol, em que pelo menos cerca de 12% por peso de triacilgliceróis é ácido eicosapentanóico.
[020] Em algumas formas de realização, a presente invenção é direcionada a qualquer uma das biomassas isoladas da invenção, em que os ácidos graxos compreendem ainda menos do que cerca de 5% por peso de cada de ácido oleico, ácido linoleico, ácido linolênico, ácido eicosanóico, e ácido erúcico.
[021] A presente invenção é direcionada a uma cultura isolada compreendendo qualquer um dos microrganismos da presente invenção ou as suas misturas.
[022] A presente invenção é direcionada a um produto alimentar, cosmético, ou composição farmacêutica para um animal não-humano ou humano, que compreende qualquer um dos microrganismos ou biomassas do invento ou suas misturas.
[023] A presente invenção é direcionada a um óleo microbiano que compreende pelo menos, cerca de 20% por peso de ácido eicosapentaenóico e menos do que cerca de 5% por peso de cada um de ácido araquidônico, ácido docosapentaenóico n-6, ácido oleico, ácido linoleico, ácido linolênico, ácido eicosenoico, ácido erúcico e ácido estearidônico. Em algumas formas de realização, o óleo microbiano compreende ainda, pelo menos, cerca de 25% por peso de ácido docosahexaenóico.
[024] A presente invenção é direcionada a um óleo microbiano que compreende uma fração de triacilgliceróis de pelo menos, cerca de 10% por peso, em que, pelo menos, cerca de 12% por peso dos ácidos graxos na fração de triacilglicerol é ácido eicosapentanóico, em que, pelo
7/131 menos, cerca de 25% por peso, dos ácidos graxos na fração de triacilglicerol é ácido docosahexaenóico, e em que menos do que cerca de 5% por peso dos ácidos graxos na fração de triacilglicerol é ácido araquidônico.
[025] A presente invenção é direcionada a um produto alimentar, cosmético, ou composição farmacêutica para um animal não-humano ou humano, que compreende qualquer um dos óleos microbianos da presente invenção. Em algumas formas de realização, o produto alimentar é uma fórmula para lactentes. Em algumas formas de realização, a fórmula para lactentes é adequada para lactentes prematuros. Em algumas formas de realização, o produto alimentar é um leite, uma bebida, uma bebida terapêutica, uma bebida nutricional, ou uma combinação dos mesmos. Em algumas formas de realização, o produto alimentar é um aditivo para o alimento animal não-humano ou humano. Em algumas formas de realização, o produto alimentar é um suplemento nutricional. Em algumas formas de realização, o produto alimentar é um alimento para animais. Em algumas formas de realização, o alimento animal é um alimento de aquicultura. Em algumas formas de realização, o alimento animal é um alimento de animais domésticos, um alimento animal zoológico, um alimento animal de trabalho, um alimento de gado, ou uma combinação destes.
[026] A presente invenção é direcionada a um método para a produção de um óleo microbiano que compreende ácidos graxos ômega-3, o método compreendendo: crescimento de qualquer dos microrganismos isolados do invento ou as suas misturas em uma cultura para produzir um óleo compreendendo ácidos graxos ômega-3. Em algumas formas de realização, o
8/131 método compreende ainda extrair o óleo.
[027] A presente invenção é direcionada a um método para a produção de um óleo microbiano que compreende ácidos graxos ômega-3, o método compreendendo a extração de um óleo compreendendo ácidos graxos ômega-3 a partir de qualquer uma das biomassas de invenção. Em algumas formas de realização, o óleo microbiano é extraído usando um processo de extração com solventes orgânicos, por exemplo, extração em hexano. Em algumas formas de realização, o óleo microbiano é extraído utilizando um processo de extração com solvente.
[028] A presente invenção é direcionada a um óleo microbiano produzido por um método da invenção.
[029] A presente invenção é direcionada a um método para a produção de uma biomassa da invenção compreendendo: crescimento de qualquer dos microrganismos isolados da invenção ou as suas misturas em uma cultura para produzir uma biomassa.
[030] A presente invenção é direcionada a uma biomassa produzida através de um método da invenção.
[031] A presente invenção é direcionada a um método para a produção de uma estirpe mutante da presente invenção compreendendo: mutagênese de qualquer dos microrganismos da invenção, e isolamento da estirpe mutante.
[032] A presente invenção é direcionada à utilização de qualquer dos microrganismos isolados, biomassas, ou de óleos microbianos da presente invenção, ou suas misturas, para a fabricação de um fármaco para o tratamento de inflamação ou de uma condição relacionada a isto.
[033] A presente invenção é direcionada à utilização de
9/131 qualquer dos microrganismos isolados, biomassas, ou de óleos microbianos da presente invenção, ou misturas dos mesmos, para o tratamento de inflamação ou de uma condição relacionada a isto.
[034] A presente invenção é direcionada a qualquer um dos microrganismos isolados, biomassas, ou óleos microbianos da presente invenção, ou misturas dos mesmos, para uso no tratamento de inflamação ou de uma condição relacionada a este.
[035] A presente invenção é direcionada a um método para tratar a inflamação ou um estado relacionado a este em um sujeito em necessidade do mesmo, compreendendo administrar ao sujeito qualquer dos microrganismos isolados biomassas, ou óleos microbianos da presente invenção, ou suas misturas, e um veiculo farmaceuticamente aceitável.
[036] A presente invenção é direcionada a microrganismos isolados, bem como estirpes e mutantes dos mesmos, bem como as biomassas, óleos microbianos, composições, e as culturas dos mesmos. A presente invenção é direcionada a métodos de produção de óleos microbianos, biomassas e mutantes dos microrganismos da invenção, e métodos de utilização dos microrganismos, biomassas, e óleos microbianos. Os microrganismos aqui descritos são altamente produtivos e produzem perfis de ácidos graxos únicos, caracterizadas, em parte, pelos altos níveis de ácidos graxos ômega-3, especialmente altos níveis de EPA.
[037] A invenção é direcionada a microrganismos isolados e estirpes deles derivados. Uma estirpe que é derivada a partir de um microrganismo isolado da presente invenção pode ser um derivado natural ou artificial, tal
10/131 como, por exemplo, um mutante, variante, ou estirpe recombinante. O termo isolado como aqui utilizado não reflete necessariamente a extensão em que um isolado foi purificado, mas indica o isolamento ou separação de uma forma nativa ou ambiente nativo. Um isolado pode incluir, mas não está limitado a, um microrganismo isolado, uma biomassa isolada, uma cultura pura, um óleo microbiano isolado, e uma sequência isolada (tal como uma sequência polinucleotidica isolada aqui revelada). O termo microrganismo, tal como aqui utilizado inclui, mas não está limitado aos termos microalgas, Thraustochytrid e as classificações taxonômicas associadas com qualquer um dos microrganismos depositados aqui descritos. Os termos Thraustochytriales, Thraustochytrid, Schizochytrium e Thraustochytrium como utilizado em referência a qualquer um dos microrganismos da invenção, incluindo os microrganismos depositados aqui descritos, baseiam-se na presente classificação taxonômica incluindo informações filogenéticas disponíveis e não se destinam a ser limitativos no invento que as classificações taxonômicas são revistas após a data de apresentação do presente pedido [038] Em algumas formas de realização, a invenção é direcionada a um microrganismo isolado da espécie depositada na instituição ATCC sob o N£ de Acesso PTA-10212 O microrganismo isolado associado com número de acesso ATCC PTA-10212 é também conhecido aqui como Thraustochytrium sp. ATCC PTA-10212. O microrganismo isolado associado com ATCC N— acesso PTA-10212 foi depositado sob o Tratado de Budapeste em 14 de julho, 2009 na American Type Culture Collection (Coleção de Tipo de Cultura Americano),
11/131
Depository Patentes, 10801 University Boulevard, Manassas,
VA 20110-2209. Em algumas formas de realização, a invenção
é direcionada a uma estirpe isolada depositada na
instituição ATCC sob o N2 de Acesso PTA-10212 •
[039] Em algumas formas de realização, a invenção é
direcionada a um microrganismo isolado possuindo as
características da espécie depositada na instituição ATCC sob o N~ de Acesso PTA-10212 ou uma estirpe derivada deste. As características da espécie depositada na instituição ATCC sob o N— de Acesso PTA-10212 podem incluir o seu crescimento e propiredades fenotípicas (exemplos de propriedades fenotípicas incluem propriedades morfológicas e reprodutivas), suas propriedades físicas e químicas (tais como o peso seco e os perfis lipídicos), suas sequências de genes, e as suas combinações, em que as características distinguem as espécies sobre espécies identificadas anteriormente. Em algumas formas de realização, a invenção é direcionada a um microrganismo isolado possuindo as características da espécie depositada na instituição ATCC sob o N~ de Acesso PTA-10212, em que as características incluem um rRNA 18s que compreende uma sequência polinucleot ídica de SEQ ID NO:1 ou uma sequência polinucleotídica tendo pelo menos 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, ou 99% de identidade com a SEQ ID NO:1, as propriedades morfológicas e de reprodução das espécies depositadas na instituição ATCC sob o N2 de Acesso PTA-10212 , e os perfis de ácidos graxos da espécie depositada na instituição ATCC sob o N2 de Acesso PTA-10212. Em algumas formas de realização, os microrganismos isolados da invenção possuem propriedades fenotípicas substancialmente idênticas às do
12/131 microrganismo depositado na instituição ATCC sob o N2 de acesso PTA-10212. Em algumas formas de realização, os microrganismos isolados da invenção têm propriedades de crescimento substancialmente idênticas às do microrganismo depositado na instituição ATCC sob o N2 de acesso PTA-10212. Em algumas formas de realização, a invenção é direcionada a um microrganismo isolado, compreendendo um RNAr 18s que compreende a sequência de polinucleótidos de SEQ ID NO:1 ou uma sequência polinucleotidica tendo pelo menos 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, ou 99 % de identidade com a SEQ ID NO:1. Em algumas formas de realização, a invenção é direcionada a um microrganismo isolado compreendendo uma sequência polinucleotidica RNAr 18s que tem pelo menos 94% de identidade com a sequência de polinucleitidica RNAr 18S do microrganismo depositado na instituição ATCC sob o N2 de acesso PTA-10212.
[040] Em algumas formas de realização, a invenção é direcionada a uma estirpe mutante do microrganismo depositado na instituição ATCC sob o N2 de acesso PTA-10212. Em outras formas de realização, a estirpe mutante é uma estirpe depositada na instituição ATCC sob o N2 de acesso PTA-10213, PTA-10214 ou PTA-10215. Os microrganismos associados com ATCC N— PTA-10213, PTA-10214 e PTA-10215 foram depositados nos termos do Tratado de Budapeste em 14 de julho de 2009, no American Type Culture Collection (Coleção de Tipo de Cultura Americano), Depository Patentes, 10801 University Boulevard, Manassas, VA 20110-2209.
[041] Em algumas formas de realização, a invenção é direcionada a um microrganismo isolado da espécie depositada na instituição ATCC sob o N2 de Acesso PTA-10208.
13/131 microrganismo isolado associado com a ATCC N2 de acesso PTA-102 0 8 é também conhecido aqui como Schizochytrium sp. ATCC PTA-10208. 0 microrganismo associado com a ATCC N2 acesso PTA-10208 foi depositado sob o Tratado de Budapeste em 14 de julho de 2009, no American Type Culture Collection (Coleção de Tipo de Cultura Americano), Depository Patentes 10801 University Boulevard, Manassas, VA 20110-2209. Em algumas formas de realização, a invenção é direcionada a uma estirpe isolada depositada na instituição ATCC sob o N2 de Acesso PTA-10208.
[042] Em algumas formas de realização, a invenção é direcionada a um microrganismo isolado da espécie depositada na instituição ATCC sob o N2 de Acesso PTA-10208 em que os ácidos graxos totais produzidos pelo microrganismo compreendem mais do que cerca de 10%, mais do que cerca de 11%, mais do que cerca de 12%, mais do que cerca de 13%, mais do que cerca de 14%, mais do que cerca de 15%, mais do que cerca de 16%, mais do que cerca de 17%, mais do que cerca de 18%, mais do que cerca de 19%, ou mais do que cerca de 20% por peso de EPA. Em algumas formas de realização, a invenção é direcionada a um microrganismo isolado da espécie depositada na instituição ATCC sob o N2 de Acesso PTA-10208, em que os ácidos graxos totais produzidos pelo microrganismo compreendem cerca de 10% a
cerca de 55%, cerca de 10% a cerca de 50%, cerca de 10% a
cerca de 45%, cerca de 10% a cerca de 40%, cerca de 10% a
cerca de 35%, cerca de 10% a cerca de 30%, cerca de 15% a
cerca de 55%, cerca de 15 0, 0 a cerca de 5 0 %, cerca 15% a
cerca de 45%, cerca de 15% a cerca de 40%, cerca de 15% a
cerca de 35%, cerca de 15% a cerca de 30%, cerca de 20% a
14/131
cerca de 55%, cerca de 20% a cerca de 50%, cerca de 20% a
cerca de 45%, cerca de 20% a cerca de 40%, cerca de 20% a
cerca de 35%, ou cerca de 20% a cerca de 30% por peso de
EPA.
[043] Em algumas formas de realização, a invenção é direcionada a um microrganismo isolado possuindo as características da espécie depositada na instituição ATCC sob o N~ de Acesso PTA-10208, em que os ácidos graxos totais produzidos pelo microrganismo compreendem mais do que cerca de 10% por peso de ácido eicosapentaenóico. As características do microrganismo depositado na instituição ATCC sob o N— de acesso PTA-10208 incluem o seu crescimento e propriedades fenotípicas (exemplos de propriedades fenotípicas incluem propriedades morfológicas e reprodutivas), suas propriedades físicas e químicas (tais como o peso seco e perfis lipídicos) , suas sequências de genes, e suas combinações, em que as características distinguem as espécies sobre espécies identificadas anteriormente. Em algumas formas de realização, a invenção é direcionada a um microrganismo isolado possuindo as características da espécie depositada na instituição ATCC sob o N~ de Acesso PTA-10212, em que as características incluem uma RNAr 18s que compreende a sequência polinucleotídica de SEQ ID NO:2, as propriedades morfológicas e reprodutivas da espécie depositada na instituição ATCC sob o N£ de acesso PTA-10208, e os perfis de ácidos graxos da espécie depositada na instituição ATCC sob o N£ de acesso PTA-10208. Em algumas formas de realização, os microrganismos isolados da invenção têm propriedades físicas e químicas substancialmente idênticas
15/131 àquelas do microrganismo depositado na instituição ATCC sob o N— de acesso PTA-10208.
[044] Em algumas formas de realização, a invenção é direcionada a uma estirpe mutante do microrganismo depositado na instituição ATCC sob o N£ de acesso PTA-10208. Em outras formas de realização, a estirpe mutante é uma estirpe depositada na instituição ATCC sob o N£ de acesso PTA-10209, PTA-10210 ou PTA-10211. Os microrganismos associados com ATCC N— PTA-10209, PTA-10210 e PTA- 10211 foram depositados sob o Tratado de Budapeste em 25 de setembro de 2009, no American Type Culture Collection (Coleção de Tipo de Cultura Americano), Depository Patentes, 10801 University Boulevard, Manassas, VA 20110-2209.
[045] Em algumas formas de realização, a invenção é direcionada a um microrganismo isolado da invenção, que produz uma fração de triacilglicerol, em que o teor de EPA da fração de triacilglicerol é pelo menos, cerca de 12%, pelo menos, cerca de 13%, pelo menos, cerca de 14%, pelo menos, cerca de 15%, pelo menos, cerca de 16%, pelo menos, cerca de 17%, pelo menos, cerca de 18%, pelo menos, cerca de 19%, ou pelo menos, cerca de 20% por peso. Em algumas formas de realização, a invenção é direcionada a um microrganismo isolado que produz uma fração de
tr acilglicerol , em que o teor de EPA da fração de
tr acilglicerol é de cerca de 12% a cerca de 55%, cerca de
12 o 0 a cerca de 50%, cerca de 12% a cerca de 45%, cerca de
12 o 0 a cerca de 40%, cerca de 12% a cerca de 35%, cerca de
12 o 0 a cerca de 30%, cerca de 15% a cerca de 45%, cerca de
15 o 0 a cerca de 40%, cerca de 15% a cerca de 35%, cerca 15%
a cerca de 30%, ou cerca de 20% a cerca de 30% por peso.
16/131 [046] Em algumas formas de realização, a invenção é direcionada a um mutante, variante, ou recombinante de um microrganismo isolado da invenção, que produz uma fração de triacilglicerol, em que o teor de EPA da fração de triacilglicerol é de, pelo menos, cerca de 10%, pelo menos,
cerca de 11%, pelo menos, cerca de 12%, pelo menos, cerca
de 13%, pelo menos, cerca de 14%, pelo menos, cerca de 15%,
pelo menos, cerca de 16%, pelo menos, cerca de 17%, pelo
menos, cerca de 18%, pelo menos, cerca de 19%, ou pelo
menos, cerca de 20% por peso. Em algumas formas de realização, a invenção é direcionada a um mutante, variante ou recombinante de um microrganismo isolado da invenção, que produz uma fração de triacilglicerol, em que o teor de
EPA da fração de triacilglicerol é de cerca de 12% a cerca
de 55%, cerca de 12% de cerca de 50 )%, cerca de 12% a cerca
de 45%, cerca de 12% a cerca de 40 O 0 r cerca de 12% a cerca
de 35%, cerca de 12% a cerca de 30 o 0 r cerca de 15% a cerca
de 55%, cerca de 15% a cerca de 50 o 0 r cerca de 15% a cerca
de 45%, cerca de 15% a cerca de 40 o 0 r cerca de 15% a cerca
de 35%, cerca de 15% a cerca de 30 o 0 r cerca de 20% a cerca
de 55%, cerca de 20% a cerca de 50 o 0 r cerca de 20% a cerca
de 45%, cerca de 20% a cerca de 40 o 0 r cerca de 20% a cerca
de 35% ou cerca de 20% a cerca de 30 % por peso. Estirpes
mutantes podem ser produzidas por procedimentos bem conhecidos. Procedimentos comuns incluem irradiação, tratamento a altas temperaturas e tratamento com um agente mutagênico. Estirpes variantes podem ser outras que ocorrem naturalmente isoladas e/ou sub-isoladas das espécies aqui descritas. As estirpes recombinantes podem ser produzidas por qualquer dos métodos bem conhecidos da biologia
17/131 molecular para a expressão de genes exógenos ou alteração de função do gene endógeno ou expressão. Em algumas formas de realização, o mutante, variante, ou estirpe recombinante produz uma quantidade maior de ácidos graxos ômega-3, particularmente EPA, do que a estirpe do tipo selvagem. Em algumas formas de realização, o mutante, variante, ou estirpe recombinante produz uma quantidade menor de um ou mais ácidos graxos, tais como quantidades mais baixas de DHA, ARA, DPA n-6, ou combinações dos mesmos. Em algumas formas de realização, o mutante, variante, ou estirpe recombinante produz um peso maior de células secas por litro de cultura do que a estirpe do tipo selvagem. Tal mutante, variante, ou estirpes recombinantes são exemplos de estirpes derivadas de um microrganismo isolado da invenção.
[047] Em algumas formas de realização, um microrganismo isolado da invenção, incluindo os mutantes, variantes, e os seus recombinantes, compreende um perfil de ácido graxo em uma ou mais frações isoladas do microrganismo. As uma ou mais frações isoladas do microrganismo inclui a fração total de ácido graxo, a fração de ésteres de esteróis, a fração de triacilglicerol, a fração de ácidos graxos livres a fração de esterol, a fração de diacilglicerol, a fração polar (incluindo a fração de fosfolipidio), e combinações. O perfil de ácidos graxos para uma fração especifica pode incluir qualquer um dos perfis de ácidos graxos associados com a fração especifica tal como aqui divulgado.
[048] A invenção é direcionada a um método de produção de um mutante que compreende a mutagênese de qualquer dos microrganismos da presente invenção e isolamento da estirpe
18/131 mutante .
[049] A invenção é direcionada a uma cultura compreendendo um ou mais microrganismos isolados do invento Vários parâmetros de fermentação para inoculação, crescimento e recuperação da microflora, como microalgas e thraustochytrids, são conhecidos na técnica. Veja-se, por exemplo, Patente dos EUA N2 5.130.242, aqui incorporada por referência na sua totalidade. Meios líquidos ou sólidos podem conter água do mar natural ou artificial. As fontes de carbono para crescimento heterotrófico incluem, mas não estão limitadas a, glicose, frutose, xilose, sacarose, maltose, amido solúvel, melaço, fucose, glicosamina, dextrano, gorduras, óleos, glicerol, acetato de sódio, e manitol. As fontes de nitrogênio incluem, mas não estão limitadas a, peptona, extrato de levedura, polipeptona, extrato de malte, extrato de carne, casaminoácido, milhocina, fontes de nitrogênio orgânico, glutamato de sódio, ureia, fontes inorgânicas de nitrogênio, acetato de amônio, sulfato de amônio, cloreto de amônio e nitrato de amônio.
[050] Um meio típico para o crescimento do microrganismo depositado na instituição ATCC sob o N2 de Acesso PTA-10212 é apresentado na Tabela 1:
Tabela 1: Meio de Recipiente de PTA-10212
Ingrediente Concentração Faixa
Na2SO4 g/L 31,0 0-50, 15-45 ou 25-35
NaCl g/L 0, 625 0-25, 0,1-10 ou 0,5-5
KC1 g/L 1,0 0-5, 0,25-3 ou 0,5-2
MgSO4.7H2O g/L 5, 0 0-10, 2-8 ou 3-6
(NH4)2SO4 g/L 0,44 0-10, 0,25-5 ou 0,05-3
19/131
MSG-1H2O g/L 6, 0 0-10, 4-8 ou 5-7
CaC12 g/L 0,29 0,1-5, 0,15-3 ou 0,2-1
T154 (extrato de levedura) g/L 6, 0 0-20, 0,1-10 ou 1-7
KH2PO4 g/L 0,8 0,1-10, 0,5-5 ou 0,6-1,8
Pós autoclave (Metais)
Ácido cítrico mg/L 3,5 0,1-5000, 10-3000 ou 3-2500
FeSO4.7H2O mg/L 10,30 0,1-100, 1-50 ou 5-25
MnCl2.4H2O mg/L 3, 10 0,1-100, 1-50 ou 2-25
ZnSO4.7H2O mg/L 3, 10 0,01-100, 1-50 ou 2-25
CoC12.6H2O mg/L 0,04 0-1, 0,001-0,1 ou 0,01-0,1
Na2Mo04.2H2O mg/L 0,04 0,001-1, 0,005-0,5 ou 0,01-0,1
CuSO4.5H2O mg/L 2,07 0,1-100, 0,5-50 ou 1-25
NíSO4.6H2O mg/L 2,07 0,1-100, 0,5-50 ou 1-25
Pós Autoclave (Vitaminas)
Tiamina mg/L 9, 75 0,1-100, 1-50 ou 5-25
Vitamina B12 mg/L 0,16 0,01-100, 0,05-5 ou 0,1-1
Ca^ pantotenato mg/L 2,06 0,1-100, 0,1-50 ou 1-10
Biotina mg/L 3,21 0,1-100, 0,1-50 ou 1-10
Pós Autoclave (Carbono)
Glicerol g/L 30,0 5-150, 10-100 ou 20-50
Alimenação de Nitrogênio
Ingrediente Concentração
MSG.1H2O g/L 17 0-150, 10-100 ou 15-50
Condições de cultura típicas incluem o seguinte:
pH: cerca de 6,5 - cerca de 9,5, cerca de 6,5 - cerca de 8,0, ou cerca de
6,8 cerca de 7,8;
20/131
temperatura: cerca de 15 - cerca de 30 graus
oxigênio dissolvido: Celsius, cerca de 18 - cerca de 28 graus Celsius, ou cerca de 21 a cerca de 23 graus Celsius; cerca de 0,1 - cerca de 100% de
glicerol controlado a: saturação, cerca de 5 - cerca de 50% de saturação, ou cerca de 10 cerca de 30% de saturação; e/ou cerca de 5 - cerca de 50 g/L, cerca
de 10 - cerca de 40 g/L, ou de 15 - cerca de 35 g/L. cerca
[051] Em algumas formas de realização, o microrganismo depositado na instituição ATCC sob o No de acesso PTA-10212, ou um mutante, variante, ou recombinante, cresce heterotroficamente em glicerol como fonte de carbono, mas não cresce em glicose como fonte de carbono.
[052] Um meio típico para o crescimento do microrganismo depositado na instituição ATCC sob o N£ de Acesso PTA-10208 é mostrado na Tabela 2:
Tabela 2: Meio de Recipiente de PTA-10208
Ingrediente Concentração Faixa
Na2SO4 g/L 8,8 0-25, 2-20 ou 3-10
NaCl g/L 0, 625 0-25, 0,1-10 ou 0,5-5
KC1 g/L 1,0 0-5, 0,25-3 ou 0,5-2
MgSO4.7H2O g/L 5, 0 0-10, 2-8 ou 3-6
(NH4) 2SO4 g/L 0,42 0-10, 0,25-5 ou 0,05-3
CaC12 g/L 0,29 0,1-5, 0,15-3 ou 0,2-1
T154 (extrato de levedura) g/L 1,0 0-20, 0,1-10 ou 0,5-5
KH2PO4 g/L 1,765 0,1-10, 0,5-5 ou 1-3
21/131
Pós autoclave (Metais)
Ácido cítrico mg/L 46, 82 0,1-5000, 10-3000 ou 40-2500
FeSO4.7H2O mg/L 10,30 0,1-100, 1-50 ou 5-25
MnCl2.4H2O mg/L 3, 10 0,1-100, 1-50 ou 2-25
ZnSO4.7H2O mg/L 9, 3 0,01-100, 1-50 ou 2-25
CoC12.6H2O mg/L 0,04 0-1, 0,001-0,1 ou 0,01-0,1
Na2Mo04.2H2O mg/L 0,04 0,001-1, 0,005-0,5 ou 0,01-0,1
CuSO4.5H2O mg/L 2,07 0,1-100, 0,5-50 ou 1-25
NíSO4.6H2O mg/L 2,07 0,1-100, 0,5-50 ou 1-25
Pós Autoclave (Vitaminas)
Tiamina mg/L 9, 75 0,1-100, 1-50 ou 5-25
Ca^ pantotenato mg/L 3,33 0,1-100, 0,1-50 ou 1-10
Biotina mg/L 3,58 0,1-100, 0,1-50 ou 1-10
Pós Autoclave (Carbono)
Glicose g/L 30,0 5-150, 10-100 ou 20-50
Alimenação de Nitrogênio
Ingrediente Concentração
MSG.1H2O g/L 17 0-150, 10-100 ou 15-50
Condições de cultura típicos incluem o seguinte:
PH cerca de 6,5 - cerca de 8 , 5, cerca
de 6,5 - 7,0 cerca cerca de 8,0, ou de 8,0; cerca de
temperatura: cerca de 17 - cerca de 30 graus
Celsius, cerca de 20 - cerca de 28
graus Celsius, ou cerca cerca de 24 graus Celsius; de 22 a
oxigênio dissolvido: cerca de 2 - cerca de 100% de
saturação , cerca de 5 - cerca de
50% de saturação, ou cerca de 7
22/131
cerca de 20% de saturação; e/ou
glicerol controlado a: cerca de 5 - cerca de 50 g/L, cerca
de 10 - cerca de 40 g/L, ou cerca
de 2 0 - cerca de 35 g/L.
[053] Em algumas formas de realização, o meio de
cultura é composto por, pelo menos, cerca de 0,1%, pelo menos, cerca de 0,5%, pelo menos, cerca de 1%, pelo menos, cerca de 1,5%, pelo menos, cerca de 2%, pelo menos, cerca de 5%, pelo menos, cerca de 7%, pelo menos, cerca de 10%, pelo menos, cerca de 20%, pelo menos, cerca de 30%, pelo menos, cerca de 40%, pelo menos, cerca de 50%, pelo menos, cerca de 60%, pelo menos, cerca de 70%, pelo menos, cerca de 80%, ou pelo menos, cerca de 90% de oxigênio dissolvido, como uma porcentagem do nivel de saturação. Em algumas formas de realização, o meio de cultura é composto por
cerca de 0,1% a cerca de 2%, cerca de 0,1% . a cerca de 5%,
cerca de 0,1% a cerca de 10%, cerca de 0, 1% a . cerca de 20%,
cerca de 0,1% a cerca de 30%, cerca de 0,1% a cerca de 50%
cerca de 0,1% a cerca de 100% , cerca de 5% a cerca de 10%,
cerca de 5% a cerca de 20%, cerca de 5% a cerca de 30%,
cerca de 5% a cerca de 50%, cerca de 5% a < cerca de 100%,
cerca de 7% a cerca de 10%, cerca de 7% a cerca de 20%,
cerca de 7% a cerca de 30%, cerca de 7% a cerca de 50%,
cerca de 7% a cerca de 100%, cerca de 10% a cerca de 20 %,
cerca de 10% e i cerca de 30%, cerca de 10% a cerca de 50%,
cerca de 10% a . cerca de 100%, cerca de 20% a cerca de 30%,
cerca de 20% a cerca de 50%, ( 2u cerca de 20% a cerca de 100
de oxigênio dissolvido, como uma porcentagem do nivel de saturação.
[054] A invenção é direcionada a uma biomassa isolada
23/131 de um microrganismo da invenção. Uma biomassa isolada da invenção é uma biomassa celular colhida obtida através de qualquer método convencional para o isolamento de uma biomassa, tal como descrito na Patente dos EUA N- 5.130.242 e Publicação de Pedido dos EUA N£ 2002/0001833, cada uma das quais são aqui incorporadas por referência na sua totalidade.
[055] Em algumas formas de realização, o peso celular seco da biomassa isolada a partir de cada litro de cultura é de pelo menos, cerca de 10 g, pelo menos, cerca de 15 g, pelo menos, cerca de 20 g, pelo menos, cerca de 25 g, pelo menos, cerca de 30 g, pelo menos, cerca de 50 g, pelo menos cerca de 60 g, pelo menos, cerca de 70 g, pelo menos, cerca de 80 g, pelo menos, cerca de 100 g, pelo menos, cerca de 120 g, pelo menos, cerca de 140 g, pelo menos, cerca de 160 g, pelo menos, cerca de 180 g, ou, pelo menos, cerca de 200 g após o crescimento durante cerca de 6 dias a cerca 8 dias a cerca de 15°C até cerca de 30°C em um meio de cultura de cerca de pH 6,5 a cerca de 9,5 compreendendo fontes de carbono, nitrogênio e nutrientes, e cerca de 950 ppm a cerca de 8500 ppm de ions cloreto. Em algumas formas de realização, o peso seco de células de biomassa isolada a partir de cada litro de cultura é de pelo menos, cerca de 10 g, pelo menos, cerca de 15 g, pelo menos, cerca de 20 g, pelo menos, cerca de 25 g, pelo menos, cerca de 30 g, pelo menos, cerca de 50 g, pelo menos, cerca de 60 g, pelo menos cerca de 70 g, pelo menos, cerca de 80 g, pelo menos, cerca
de 100 g, pelo menos, cerca de 120 g, pelo menos, cerca de
140 g< pelo menos, cerca de 160 g< pelo menos, cerca de 180
g< ou, pelo menos, cerca de 200 i g após o crescimento
24/131 durante cerca de 6 dias, cerca de 7 dias, ou cerca de 8 dias a cerca de 15°C, cerca de 16°C, cerca de 17°C, cerca
de 18 °C, cerca de 19°C r cerca de 20°C, cerca de 21 °C,
cerca de 22°C, cerca de 23 °C, cerca de 24°C, cerca de 25 °C,
cerca de 26°C, cerca de 27 °C, cerca de 28°C, cerca de 29 °C,
ou cerca de 30°C em um meio de cultura de cerca de pH 6,5, cerca de pH 7, cerca de pH 7,5, cerca de pH 8,0, cerca de pH 8,5, cerca de pH 9, ou cerca de pH 9,5 compreendendo fontes de carbono, nitrogênio e nutrientes, e cerca de 950 ppm a cerca de 8500 ppm de ions cloreto. Em algumas formas de realização, o peso seco de células de biomassa isolada a partir de cada litro de cultura é de cerca de 10 g a cerca de 200 g após o crescimento durante cerca de 6 dias a cerca de 8 dias a cerca de 15°C até cerca de 30°C em um meio de cultura de cerca de pH 6,5 a cerca de pH 9,5, compreendendo fontes de carbono, nitrogênio e nutrientes, e cerca de 950 ppm a cerca de 8500 ppm de ions cloreto. Em algumas formas de realização, o peso seco de células de biomassa isolada a partir de cada litro de cultura é de cerca de 10 g a cerca de 200 g, cerca de 10 g a cerca de 100 g, cerca de 10 g a cerca de 50 g, cerca de 15 g a cerca de 200 g, cerca de 15 g a cerca de 100 g, cerca de 15 g a cerca de 50 g, cerca de 20 g a cerca 200 g, cerca de 20 g a cerca de 100 g, cerca
de 2 0 g a cerca de 50 g< cerca de 5 0 g a cerca de 200 g< ou
cerca de 50 g a cerca de 100 g após o crescimento durante
cerca de 6 dias, cerca de 7 dias, ou í cerca de 8 dias a
cerca de 15°C, cerca de 16°C, cerca de 17 °C, cerca de 18° c,
cerca de 19°C, cerca de 20°C, cerca de 21 °C, cerca de 22° c,
cerca de 23°C, cerca de 24°C, cerca de 25 °C, cerca de 26° c,
cerca de 27°C, cerca de 28°C, cerca de 29°C, ou cerca de
25/131
30°C em um meio de cultura de cerca pH 6,5, cerca de pH 7, cerca de pH 7,5, cerca de pH 8,0, cerca de pH 8,5, cerca de pH 9, ou cerca de pH 9,5, compreendendo fontes de carbono, nitrogênio e nutrientes, e cerca de 950 ppm a cerca de 8500 ppm de ions cloreto. Em algumas formas de realização, a cultura isolada não contém polivinilpirrolidona.
[056] Em algumas formas de realização, a cultura isolada tem uma produtividade de ácido graxo ômega-3 de, pelo menos, cerca de 0,2 g/L/dia, pelo menos, cerca de 0,3 g/L/dia, pelo menos, cerca de 0,4 g/L/dia, pelo menos, cerca de 0,5 g/L/dia, pelo menos, cerca de 1 g/L/dia, pelo menos, cerca de 1,2 g/L/dia, pelo menos, cerca de 1,5 g/L/dia, pelo menos, cerca de 1,7 g/L/dia, pelo menos, cerca de 2 g/L/dia, pelo menos, cerca de 3 g/L/dia, pelo menos, cerca de 3,5 g/L/dia, pelo menos, cerca de 4 g/L/dia pelo menos, cerca de 4,5 g/L/dia, pelo menos, cerca de 5 g/L/dia, pelo menos, cerca de 6 g/L/dia, ou, pelo menos, cerca de 8 g de L/dia após o crescimento durante cerca de 6 dias, cerca de 7 dias, ou cerca de 8 dias a cerca de 15°C até cerca de 30°C em um meio de cultura de cerca de pH 6,5 a cerca de pH 8,5 ou cerca de pH 6,5 a cerca de pH 9,5, compreendendo fontes de carbono, nitrogênio e nutrientes, e cerca de 950 ppm a cerca de 8500 ppm de ions cloreto. Em algumas formas de realização, a cultura isolada tem uma produtividade de ácido graxo ômega-3 de cerca de 0,2 g/L/dia a cerca de 20 g/L/dia, cerca de 0,4 g/L/dia a cerca de 20 g/L/dia, cerca de 0,4 g/L/dia a cerca de 2 g/L/dia, cerca de 1 g/L/dia a cerca de 2 g/L/dia, cerca de 1 g/L/dia a cerca de 20 g/L/dia, cerca de 2 g/L/dia a cerca de 15 g/L/dia, cerca de 2 g/L/dia a cerca de 10 g de L/dia, cerca
26/131 de 3 g/L/dia até cerca de 10 g/L/dia, cerca de 4 g/L/dia a cerca de 9 g/L/dia, cerca de 4 g/L/dia a cerca de 8 g/L/dia cerca de 4 g/L/dia a cerca de 7 g/L/dia, ou cerca de 4 g/L/dia a cerca de 6 g/L/dia após o crescimento durante cerca de 6 dias, cerca de 7 dias, ou cerca de 8 dias a cerca de 15°C até cerca de 30°C em um meio de cultura de cerca de pH 6,5 a cerca de pH 9,5, compreendendo fontes de carbono, nitrogênio , e nutrientes, e cerca de 950 ppm até cerca de 8500 ppm de ions cloreto.
[057] Em algumas formas de realização, a cultura isolada compreende uma produtividade de EPA de pelo menos, cerca de 0,2 g/L/dia, pelo menos, cerca de 0,3 g/L/dia, pelo menos, cerca de 0,4 g/L/dia, pelo menos, cerca de 0,5 g/L/dia, pelo menos, cerca de 0,6 g/L/dia, pelo menos, cerca de 0,7 g/L/dia, pelo menos, cerca de 0,8 g/L/dia, pelo menos, cerca de 0,9 g de L/dia, pelo menos, cerca de 1 g/L/dia , pelo menos, cerca de 1,2 g/L/dia, pelo menos, cerca de 1,5 g/L/dia, pelo menos, cerca de 1,7 g/L/dia, pelo menos, cerca de 2 g/L/dia, pelo menos, cerca de 3 g/L/dia , pelo menos, cerca de 4 g de L/dia, ou, pelo menos cerca de 5 g/L/dia após o crescimento durante cerca de 6 dias, cerca de 7 dias, ou cerca de 8 dias a cerca de 15°C até cerca de 30°C em um meio de cultura de cerca de pH 6,5 a cerca de pH 8,5 ou cerca de pH 6,5 a cerca de pH 9,5, compreendendo fontes de carbono, nitrogênio e nutrientes, e cerca de 950 ppm a cerca de 8500 ppm de ions cloreto. Em algumas formas de realização, a produtividade de EPA é cerca de 0,2 g/L/dia a cerca de 5 g/L/dia, cerca de 0,2 g/L/dia a cerca de 4 g/L/dia, cerca de 0,2 g/L/dia a cerca de 3 g/L/dia, cerca de 0,2 g/L/dia a cerca de 2 g/L/dia,
27/131 cerca de 0,2 g/L/dia a cerca de 1 g/L/dia, cerca de 0,2 g/L/dia a cerca de 0,8 g/L/dia, cerca de 0,2 g/L/dia a cerca de 0,7 g/L/dia, cerca de 1 g/L/dia a cerca de 5 g/L/dia, cerca de I g/L/dia a cerca de 4 g/L/dia, cerca de g/L/dia a cerca de 3 g/L/dia, ou cerca de 1 g/L/dia a cerca de 2 g/L/dia após o crescimento durante cerca de 6 dias, cerca de 7 dias, ou cerca de 8 dias, a cerca de 15°C até cerca de 30°C em um meio de cultura de cerca de pH 6,5 a cerca de pH 8,5 ou cerca de pH 6,5 a cerca de pH 9,5, compreendendo fontes de carbono, nitrogênio e nutrientes, e cerca de 950 ppm a cerca de 8500 ppm de ions cloreto. Em algumas formas de realização, qualquer uma das produtividades de EPA acima mencionadas estão associadas com qualquer uma das produtividades de ácidos graxos ômega3 mencionados acima. Em algumas formas de realização, a cultura compreende ainda uma produtividade de DHA de cerca de 0 g/L/dia a cerca de 5 g/L/dia, cerca de 0 g/L/dia a cerca de 4 g/L/dia, cerca de 0 g/L/dia a cerca de 3 g/L/dia cerca de 0 g/L/dia a cerca de 2 g/L/dia, cerca de 0 g/L/dia a cerca de 1 g/L/dia, cerca de 0,2 g/L/dia a cerca de 5 g/L/dia, cerca de 0,2 g/L/dia a cerca de 4 g/L/dia, cerca de 0,2 g/L/dia a cerca de 3 g/L/dia, cerca de 0,2 g/L/dia a cerca de 2 g L/dia, cerca de 0,2 g/L/dia a cerca de 1 g/L/dia, cerca de 1 g/L/dia a cerca de 5 g/L/dia, cerca de g/L/dia a cerca de 5 g/L/dia, cerca de 2 g/L/dia a cerca de 4 g/L/dia, ou cerca de 2 g/L/dia a cerca de 3 g/L/dia. Em algumas formas de realização, a produtividade de DHA é menos de cerca de 5 g/L/dia, menos do que cerca de 4 g/L/dia, menos do que cerca de 3 g/L/dia, menos do que cerca de 2 g/L/dia, menos do que cerca de 1 g/L/dia, menos
28/131
do que cerca de 0,5 g/L/dia, menos do que cerca de 0,2
g/L/dia, ou cerca de 0 g/L/dia.
[058] Em algumas formas de realização, o volume de
fermentação (volume de cultura) é, pelo menos, cerca de 2 litros, pelo menos, cerca de 10 litros, pelo menos, cerca de 50 litros, pelo menos, cerca de 100 litros, pelo menos, cerca de 200 litros, pelo menos, cerca de 500 litros, em menos cerca de 1000 litros, pelo menos, cerca de 10.000 litros, pelo menos, cerca de 20.000 litros, pelo menos, cerca de 50.000 litros, pelo menos, cerca de 100.000 litros pelo menos, cerca de 150.000 litros, pelo menos, cerca de 200.000 litros, ou, pelo menos, cerca de 250.000 litros. Em algumas formas de realização, o volume de fermentação é de cerca de 2 litros a cerca de 300.000 litros, cerca de 2 litros, cerca de 10 litros, cerca de 50 litros, cerca de 100 litros, cerca de 200 litros, cerca de 500 litros, cerca de 1000 litros, cerca de 10.000 litros, cerca de 20.000 litros, cerca de 50.000 litros, cerca de 100.000 litros, cerca de 150.000 litros, cerca de 200.000 litros, cerca de 250.000 litros, ou cerca de 300.000 litros.
[059] Em algumas formas de realização, a invenção é direcionada a uma biomassa isolada compreendendo um perfil de ácidos graxos da invenção. Em algumas formas de realização, pelo menos, cerca de 20%, pelo menos, cerca de 25%, pelo menos, cerca de 30%, pelo menos, cerca de 35%, pelo menos, cerca de 40%, pelo menos, cerca de 45%, pelo menos, cerca de 50%, pelo menos, cerca de 55%, pelo menos, cerca de 60%, pelo menos, cerca de 65%, pelo menos, cerca de 70%, pelo menos, cerca de 75%, ou pelo menos, cerca de 80% do peso de células secas da biomassa são ácidos graxos.
29/131
Em algumas formas de realização, mais do que cerca de 20%, mais do que cerca de 25%, mais do que cerca de 30%, mais do que cerca de 35%, mais do que cerca de 40%, mais do que cerca de 45%, mais do que cerca de 50%, mais do que cerca de 55 %, ou mais do que cerca de 60% do peso de células secas da biomassa são ácidos graxos. Em algumas formas de
realização, cerca de ; 20% a cerca de 55%, cerca de 20% a
cerca de 60%, cerca de 2 0 o 0 a cerca de 70%, cerca de 20% a
cerca de 80%, cerca de 3 0 o 0 a cerca de 55%, cerca de 30% a
cerca 70%, cerca de 30% a cerca de 80%, cerca de 40% a
cerca de 60%, cerca de 4 0 o 0 a cerca de 70%, cerca de 40% a
cerca de 80%, cerca de 5 0 o 0 a cerca de 60%, cerca de 50% a
cerca de 70% , cerca de 50% a cerca de 80%, cerca de 55% a
cerca de 70%, cerca de 55 o 0 a cerca de 80%, cerca de 60% a
cerca de 70%, ou cerca de 60% a cerca de 8 0 %, por peso, do
peso seco da biomassa são ácidos graxos. Em algumas formas de realização, a biomassa compreende mais do que cerca de 10%, pelo menos, cerca de 12%, pelo menos, cerca de 15%, pelo menos, cerca de 20%, pelo menos, cerca de 25%, pelo menos, cerca de 30%, cerca de pelo menos, cerca de 35%, em menos cerca de 40%, ou pelo menos, cerca de 45%, por peso, dos ácidos graxos como EPA. Em algumas formas de realização
a biomassa compreende cerca . de 10% a cerca de 55%, cerca de
12 % a cerca de 55%, cerca de 15% a cerca de 55%, cerca de
20 % a cerca de 55%, cerca de 20% a cerca de 40%, ou cerca
de 20 % a cerca de 30%, por peso, dos ácidos graxos como EPA. Em algumas formas de realização, a biomassa compreende uma fração de triacilglicerol, em que pelo menos, cerca de 12%, pelo menos, cerca de 13%, pelo menos, cerca de 14%, pelo menos, cerca de 15%, pelo menos, cerca de 16%, pelo
30/131 menos, cerca de 17%, pelo menos, cerca de 18%, pelo menos,
cerca de 19%, ou pelo menos, cerca de 20%, por peso, da
fração de triad Iglicerol é EPA. Em algumas formas de
realização, a biomassa compreende uma fração de
triacilglicerol, em que o teor de EPA da fração de
triacilglicerol é de pelo menos, cerca de 12% a cerca de
55%, cerca de 12% a cerca de 50%, cerca de 12% a cerca de
45%, pelo menos, cerca de 12% a cerca de 40%, pelo menos,
cerca de 12% a cerca de 35%, ou pelo menos, cerca de 12% a
cerca de 30%, cerca de 15% a cerca de 55%, cerca de 15% a
cerca de 50%, cerca de 15% de cerca de 45%, cerca de 15% a
cerca de 40%, cerca de 15% a cerca de 35%, cerca de 15% a
cerca de 30%, cerca de 20% a cerca de 55%, cerca de 20% a
cerca de 50% , cerca de 2 0% a cerca de 45 %, pelo meno s,
cerca de 20% a cerca de 40%, pelo menos, cerca de 20% a
cerca de 35%, ou cerca de 2 0% : a cerca de 30% por pe so. Em
algumas formas de realização, pelo menos, cerca de 20%, pelo menos, cerca de 25%, pelo menos, cerca de 30%, pelo menos, cerca de 35%, pelo menos, cerca de 40%, pelo menos, cerca de 50%, ou pelo menos, cerca de 60% por peso da peso seco da biomassa é DHA. Em algumas formas de realização,
cerca de 20% a cerca de 60%, cerca de 25% a cerca de 60 O 0 r
cerca de 25% a cerca de 50%, cerca de 25% a cerca de 45 o 0 r
cerca de 30% a cerca de 50%, ou cerca de 35% a cerca 50 o 0 r
por peso, do peso de células secas da biomassa é DHA • Em
algumas formas de realização, a biomassa compreende cerca de 10% ou menos, cerca de 9% ou menos, cerca de 8% ou menos
cerca de 7% ou menos, cerca de 6% ou menos, cerca de 5% ou
menos, cerca de 4 % ou menos, em cerca 3% ou menos, cerca de
2% ou menos, ou cerca de 1% ou menos, por peso, dos ácidos
31/131 graxos como DHA. Em algumas formas de realização, a biomassa compreende cerca de 1% a cerca de 10%, cerca de 1% a cerca de 5%, cerca de 2% a cerca de 5%, cerca de 3% a cerca de 5%, ou cerca de 3% a cerca de 10%, por peso, dos ácidos graxos como DHA. Em algumas formas de realização, a biomassa é substancialmente livre de DHA. Em algumas formas de realização, a biomassa compreende cerca de 0,1% a menos
do que cerca de 5%, cerca de 0,1% a cerca de 4%, cerca de
0, 1% a cerca de 3%, cerca de 0,1% a cerca de 2%, cerca de
0,2% a menos do que cerca de 5% , cerca de 0,2% a cerca de
4%, cerca de 0, 2% a cerca de 3%, cerca de 0,2% a cerca de
2%, cerca de 0, 3% a cerca de 2%, cerca de 0,1% a cerca de
0,5%, cerca de 0,2% a cerca de 0,5%, cerca de 0,1% a cerca de 0,4%, cerca de 0,2% a cerca de 0,4%, cerca de 0,5% a cerca de 2%, cerca de 1% a cerca de 2%, cerca de 0,5% a cerca de 1,5%, ou cerca de 1% a cerca de 1,5%, por peso, dos ácidos graxos como ARA. Em algumas formas de realização a biomassa compreende menos do que cerca de 5%, cerca de 4% ou menos, cerca de 3% ou menos, cerca de 2% ou menos, cerca de 1,5% ou menos, cerca de 1% ou menos, cerca de 0,5% ou menos, cerca 0,4% ou menos, cerca de 0,3% ou menos, cerca de 0,2% ou menos, ou cerca de 0,1% ou menos, por peso, dos ácidos graxos como ARA. Em algumas formas de realização, a biomassa é substancialmente livre de ARA. Em algumas formas de realização, a biomassa compreende cerca de 0,4% a cerca
de 2%, cerca de 0,4 % a cerca de 3%, cerca de 0,4% a cerca
de 4%, cerca de 0,4 % a cerca de 5%, cerca de 0,4% a menos
do que cerca de 5%, cerca 0,5% a cerca de 1%, cerca de 0,5%
a cerca de 2%, cerca de 0,5% a cerca de 3%, cerca de 0,5% a cerca de 4%, cerca de 0,5% a cerca de 5%, cerca de 0,5% a
32/131 menos do que cerca de 5%, cerca 1% para cerca de 2%, cerca de 1% a cerca de 3%, cerca de 1% a cerca de 4%, cerca de 1% a cerca de 5%, ou cerca de 1% a menos do que cerca de 5%, por peso, dos ácidos graxos como DPA n-6. Em algumas formas de realização, a biomassa compreende cerca de 5% ou menos, menos do que cerca de 5%, cerca de 4% ou menos, cerca de 3% ou menos, cerca de 2% ou menos, cerca de 1% ou menos, cerca de 0,75% ou menos, em cerca 0,6% ou menos, ou cerca de 0,5% ou menos, por peso, dos ácidos graxos como DPA n-6. Em algumas formas de realização, a biomassa é substancialmente livre de DPA n-6. Em algumas formas de realização, a biomassa compreende ácidos graxos com cerca de 5% ou menos, menos do que cerca de 5%, cerca de 4% ou menos, cerca de 3% ou menos, ou cerca de 2% ou menos, por peso, de ácido oleico (18:1 n-9), ácido linoleico (18:2 n-6), ácido linolênico (18:3 n-3), ácido eicosanóico (20:1 n-9), ácido erúcico (22:1 n-9), ou combinações dos mesmos.
[060] As características de uma biomassa isolada da invenção estão associadas com propriedades endógenas ou nativas da biomassa isolada em vez de materiais introduzidos exogenamente. Em algumas formas de realização, a biomassa isolada não contém polivinilpirrolidona ou não é isolada a partir de uma cultura contendo polivinilpirrolidona.
[061] A presente invenção é direcionada a um método de produção de uma biomassa. Em algumas formas de realização, o método para a produção de uma biomassa da invenção compreende o crescimento de qualquer dos microrganismos isolados da invenção ou as suas misturas em uma cultura para produzir uma biomassa. A presente invenção é
33/131 direcionada a uma biomassa produzida pelo método.
[062] A invenção é direcionada a um óleo microbiano que compreende um perfil de ácidos graxos da invenção. Um óleo microbiano da invenção é um óleo bruto ou um óleo refinado que compreende uma fração de triacilgliceróis de, pelo menos, cerca de 35% por peso. Um óleo bruto é um óleo que é extraído a partir da biomassa do microrganismo, sem processamento adicional. Um óleo refinado é um óleo que é obtido por tratamento de um óleo bruto com o processamento padrão de refinação, branqueamento e/ou desodorização. Veja-se, por exemplo, Patente dos EUA N2 5.130.242, aqui incorporada por referência na sua totalidade. Um óleo microbiano inclui também um óleo final, tal como aqui descrito, que é um óleo refinado, que foi diluído com um óleo vegetal. Em algumas formas de realização, um óleo final é um óleo refinado que foi diluído com óleo de girassol altamente oleico. O termo microbiano tal como aqui utilizado inclui, mas não está limitado aos termos microalgas, Thraustochytrid e as classificações taxonômicas associadas com qualquer um dos microrganismos depositados aqui descritos. Os termos Thraustochytriales, Thraustochytrid , Schizochytrium, e Thraustochytrium como utilizado em referência a qualquer um dos óleos microbianos dos microrganismos depositados aqui descritos baseiam-se na presente classificações taxonômicas incluindo informação filogenética disponível e não pretendem ser um fator limitante no caso em que as classificações taxonômicas são revistas após a data do depósito do presente pedido.
[063] Em algumas formas de realização, um ácido graxo,
34/131 tal como aqui descrito pode ser um éster de ácido graxo. Em algumas formas de realização, um éster de ácido graxo inclui um éster de um ácido graxo ômega-3, ácido graxo ômega-6, e suas combinações. Em algumas formas de realização, o éster de ácido graxo é um éster de DHA, um éster de EPA, ou uma combinação dos mesmos. Em algumas formas de realização, um óleo ou uma fração do mesmo, tal como aqui descrito é esterificado para produzir um óleo ou uma fração do mesmo, compreendendo os ésteres de ácidos graxos. 0 termo éster refere-se à substituição do átomo de hidrogênio no grupo de ácido carboxilico da molécula de ácido graxo com um outro substituinte. Os ésteres típicos são conhecidos para os especialistas na técnica, uma discussão sobre a qual é fornecida por Higuchi, T. e V. Stella em Pro-drugs as Novel Delivery Systems (Pro-Fármacos como um Novo Sistema de Entrega), Vol. 14, ACS Symposium Series, Bioreversible Carriers in Drug Design (Carreiras Biorreversíveis em Concepção de Fármacos), Ed. Edward B. Roche, American Pharmaceutical (Association Associação Farmacêutica Americana), Pergamon Press, 1987, e Protective Groups in Organic Chemistry (Grupos de Porteção em Química Orgânica), McOmie ed., Plenum Press, Nova Iorque, 1973. Exemplos de ésteres incluem metil, etil, propil, butil, pentil, t-butil, benzil, nitrobenzil, metoxibenzil, benzidril, e tricloroetil. Em algumas formas de realização, o éster é um grupo éster de ácido carboxilico protetor, ésteres com aralquil (por exemplo, benzil, fenetil), ésteres de alcenil inferior (por exemplo, alil, 2-butenil), ésteres de alcoxi inferior-alquil inferior (por exemplo, metoximetil, 2-metoxietil, 2-etoxietil), ésteres de alquil
35/131 inferior-alcanoiloxi inferior (por exemplo, acetoximetil, pivaloiloximetil, 1-pivaloiloxietil), ésteres de alcoxi carbonil-inferior-alquil-inferior (por exemplo, metoxicarbonilmetil, isopropoxicarbonilmetil), ésteres de carboxi-inferior-alquil (por exemplo, carboximetil), ésteres de alcoxicarboniloxi-inferior-alquil-inferior (por exemplo, 1-(etoxicarboniloxi)etil, l-(ciclohexiloxicarboniloxi)etil), ésteres de alquil-inferiorcarbamoiloxi (por exemplo, carbamoiloximetil) , e semelhantes. Em algumas formas de realização, o substituinte adicional é uma cadeia linear ou grupo hidrocarboneto cíclico, por exemplo, um grupo éster de alquila Ci-C6, cicloalquila Ci-C6, alcenila Ci-C6 ou Ci-C6 arila. Em algumas formas de realização, o éster é um éster de alquila, por exemplo, um éster metílico, éster etílico ou éster propílico. Em algumas formas de realização, o substituinte éster é adicionado à molécula de ácido graxo livre, quando o ácido graxo é de um estado purificado ou semi-purifiçado. Alternativamente, o éster de ácido graxo é formado após a conversão de um triacilglicerol em um éster.
[064] A presente invenção é direcionada a métodos de produção de óleos microbianos. Em algumas formas de realização, o método compreende o crescimento de qualquer dos microrganismos isolados do invento ou as suas misturas em uma cultura para produzir um óleo microbiano que compreende ácidos graxos ômega-3. Em algumas formas de realização, o método compreende ainda extrair o óleo microbiano. Em algumas formas de realização, o método compreende a extração de um óleo microbiano que compreende ácidos graxos ômega-3 a partir de qualquer uma das
36/131 biomassas do invento ou suas misturas. Em algumas formas de realização, o método compreende o crescimento heterotroficamente do microrganismo isolado, em que a cultura compreende uma fonte de carbono, tal como aqui descrito. 0 óleo microbiano pode ser extraído a partir de uma biomassa recentemente colhida ou pode ser extraído a partir de uma biomassa colhida anteriormente que foi armazenada em condições que impeçam a deterioração. Métodos conhecidos podem ser utilizados para a cultura de um microrganismo da invenção, para isolar uma biomassa a partir da cultura, para extrair um óleo a partir da biomassa microbiana, e para analisar o perfil de ácidos graxos de óleos obtidos a partir da biomassa. Veja-se, por exemplo, Patente dos EUA N2 5.130.242, aqui incorporada por referência na sua totalidade. A invenção é direcionada a um óleo microbiano produzido por qualquer dos métodos da invenção.
[065] Em algumas formas de realização, o óleo microbiano é extraído por um método de extração de enzimas. Em algumas formas de realização, o óleo microbiano é extraído por um método de extração mecânica. Em algumas formas de realização, o método de extração mecânica compreende um ou mais de: (1) processamento de um caldo de fermentação pasteurizado por meio de um homogeneizador para auxiliar na lise celular e liberação de óleo das células; (2) adição de álcool isopropílico para o caldo de fermentação seguido de homogeneização para quebrar a emulsão de óleo e água; (3) centrifugação da mistura para se recuperar a fase de óleo; e (4) secagem sob vácuo com a adição de antioxidantes. Em algumas formas de realização, o
37/131 óleo bruto é purificado. Em algumas formas de realização, a purificação do óleo bruto compreende um ou mais de: (1) bombeamento do óleo bruto para um tanque de refinação e aquecimento do óleo seguido pela adição de uma solução ácida, com mistura; (2) adição de uma solução de soda cáustica ao óleo após o tratamento com ácido; (3) aquecimento do óleo bruto e, então, centrifugação para separar a fase pesada do óleo refinado; (4) remoção dos compostos polares remanescentes, traços de metais, e produtos de oxidação do óleo refinado, utilizando, por exemplo, ácido, TriSyl®, argila e/ou filtração; (5) filtração a frio do óleo branqueado para ainda remover componentes de alto ponto de fusão do óleo para alcançar o nivel de clareza desejado; (6) aquecimento do óleo, após o qual o óleo é, então, arrefecido e mantido durante um periodo de tempo fazendo com que os triglicerideos e ceras de elevado ponto de fusão cristalizem; (7) adição de um auxiliar de filtração ao óleoa arrefecido e, em seguida, remoção dos sólidos cristalizados por meio de filtração; (8) utilização de um desodorizador após filtração a frio, operado sob altas temperaturas e sob vácuo, para remover, por exemplo, peróxidos e todos os compostos de baixo peso molecular restantes que podem causar odor e aromas estranhos; (9) a transferência do óleo para o tanque de alimentação de desodorizador, eliminação de ar, e desodorização, por exemplo, em um desodorizador de coluna empacotada; e (10) arrefecimento, por exemplo, sob um manto de nitrogênio, no final do ciclo de desodorização e adição de antioxidantes adequados para o óleo desodorizado para proporcionar estabilidade oxidativa.
38/131 [066] Em algumas formas de realização, o óleo microbiano compreende uma fração de ésteres de esteróis de cerca de 0%, pelo menos, cerca de 0,1%, pelo menos, cerca de 0,2%, pelo menos, cerca de 0,5%, pelo menos, cerca de 1% pelo menos, cerca de 1,5%, pelo menos, cerca 2%, ou, pelo menos, cerca de 5% por peso. Em algumas formas de realização, o óleo microbiano compreende uma fração de ésteres de esteróis de cerca de 0% a cerca de 1,5%, cerca de 0% a cerca de 2%, cerca de 0% a cerca de 5%, cerca de 1% a cerca de 1,5%, cerca de 0,2% a cerca 1,5%, cerca de 0,2% a cerca de 2%, ou cerca de 0,2% a cerca de 5% por peso. Em algumas formas de realização, o óleo microbiano compreende uma fração de ésteres de esteróis de cerca de 5% ou menos, cerca de 4% ou menos, cerca de 3% ou menos, cerca de 2% ou menos, cerca de 1% ou menos, cerca de 0,5% ou menos, em cerca 0,3% ou menos, cerca de 0,2% ou menos, cerca de 0,5% ou menos, cerca de 0,4% ou menos, cerca de 0,3% ou menos, ou cerca de 0,2% ou menos por peso.
[067] Em algumas formas de realização, o óleo microbiano compreende uma fração de triacilgliceróis de pelo menos, cerca de 35%, pelo menos, cerca de 40%, pelo menos, cerca de 45%, pelo menos, cerca de 50%, pelo menos, cerca de 55%, pelo menos, cerca de 60%, pelo menos, cerca de 65%, pelo menos, cerca de 70%, pelo menos, cerca de 75%, pelo menos, cerca de 80%, pelo menos, cerca de 85%, ou pelo
menos, cerca de 9 0% por peso. Em algumas formas de
realização, o óleo microbiano compreende uma fração de
triacilgliceróis de cerca de 35% a cerca de 98 %, cerca de
35% a cerca de 90%, cerca de 35% a cerca de 80 %, cerca de
35% a cerca de 70%, cerca de 35% a cerca de 70 %, cerca de
39/131
35% a cerca de 65%, cerca de 40% a cerca de 70%, cerca de
40% a cerca de 65%, cerca de 40% a cerca de 55%, cerca de
40% a cerca de 50%, cerca de 65% a cerca de 95%, cerca de
75% a cerca de 95%, cerca de 75% a cerca de 98%, cerca de
80% a cerca de 95%, cerca de 80% a cerca de 98%, cerca de
90% a cerca de 96%, cerca de 90% a cerca de 97%, cerca de
90 0, 0 a cerca . de 98%, cerca de 90 0, 0 f cerca de 95%, cerca de
97%, ou cerca de 98% por peso.
[068] Em algumas formas de realização, o óleo microbiano compreende uma fração de diacilglicerol de pelo menos, cerca de 10%, pelo menos, cerca de 11%, pelo menos, cerca de 12%, pelo menos, cerca de 13%, pelo menos, cerca de 14%, pelo menos, cerca de 15%, pelo menos, cerca de 16%, pelo menos, cerca de 17%, pelo menos, cerca de 18%, pelo menos, cerca de 19%, ou pelo menos, cerca de 20% por peso. Em algumas formas de realização, o óleo microbiano compreende uma fração de diacilglicerol de cerca de 10% a
cerca de 45%, cerca de 10% a cerca de 40%, cerca de 10% a
cerca de 35%, cerca de 10% a cerca de 30%, cerca de 15% a
cerca de 40 %, cerca de 15% a cerca de 35%, ou cerca de 15%
a cerca de 30% por peso. Em algumas formas de realização, o óleo microbiano compreende uma fração de 1,2-diacilglicerol de, pelo menos, cerca de 0,2%, pelo menos, cerca de 0,3%, pelo menos, cerca de 0,4%, pelo menos, cerca de 0,5%, pelo menos, cerca de 1%, pelo menos, cerca de 5%, pelo menos, cerca de 10%, pelo menos, cerca de 11%, pelo menos, cerca de 12%, pelo menos, cerca de 13%, pelo menos, cerca de 14%, pelo menos, cerca de 15%, pelo menos, cerca de 16%, pelo menos, cerca de 17%, pelo menos, cerca de 18%, pelo menos, cerca de 19%, ou pelo menos, cerca de 20% por peso. Em
40/131 algumas formas de realização, o óleo microbiano compreende
uma fração de diacilglicer Ό1 de cerca de 0, 2% a cerca de
45%, cerca de 0,2% a cerca de 30% , cerca de 0 , 2% a cerca de
20%, cerca de 0,2% a cerca de 10% , cerca de 0 , 2% a cerca de
5 %, cerca de 0,2% a cerca de 1%, cerca de 0 , 2% a cerca de
0, 8%, cerca de 0, 4% a cerca de 45%, cerca < de 0,4% a cerca
de 30% , cerca de 0,4% a cerca de 20%, cerca de 0,4% a cerca
de 10% , cerca de 0,4% a cerca de 5%, cerca de 0,4% a cerca
de 1%, cerca de 0 ,4% a cerca de 0,8%, cerca de 0,5% a cerca
de 1%, cerca de 0 , 5% a cerca de 0,8%, cerca de 10% a cerca
de 45% , cerca de 10 % a cerca de 40%, cerca de 10% a cerca
de 35% , cerca de 10% a cerca de 30%, cerca de 15% a cerca
de 4 0% , cerca de 15% a cerca de 35%, cerca de 15% a cerca
de 30%, ou cerca de 15% a cerca de 25% por peso. Em algumas formas de realização, o óleo microbiano compreende uma fração de 1,3-diacilglicerol de, pelo menos, cerca de 0,1%, pelo menos, cerca de 0,2%, pelo menos, cerca de 0,5%, pelo menos, cerca de 1%, pelo menos, cerca de 2%, pelo menos, cerca de 2,5%, ou, pelo menos, cerca de 3% por peso. Em algumas formas de realização, o óleo microbiano compreende uma fração de esterol de, pelo menos, cerca de 0,3%, pelo menos, cerca de 0,4%, pelo menos, cerca de 0,5%, pelo menos, cerca de 1%, pelo menos, cerca de 1,5%, pelo menos, cerca de 2%, ou, pelo menos, cerca de 5% por peso.
[069] Em algumas formas de realização, o óleo microbiano compreende uma fração de esterol de cerca de 0,3% a cerca de 5%, cerca de 0,3% a cerca de 2%, cerca de 0,3% a
cerca de 1,5% , cerca de 0,5% a cerca de 1, 5%, cerca de 1% a
cerca de 1,5% , cerca de 0,5% a cerca de 2% , cerca de 0, 5% a
cerca de 5%, cerca de 1% a ce rca de 2% r ou cerca de 1% a
41/131 cerca de 5% por peso. Em algumas formas de realização, ο óleo microbiano compreende uma fração de esterol de cerca de 5% ou menos, cerca de 4% ou menos, cerca de 3% ou menos, cerca de 2% ou menos, cerca de 1,5% ou menos, ou cerca de 1% ou menos, em peso.
[070] Em algumas formas de realização, o óleo microbiano compreende uma fração de fosfolipidio de pelo menos, cerca de 2%, pelo menos, cerca de 5%, ou, pelo menos, cerca de 8% por peso. Em algumas formas de realização, o óleo microbiano compreende uma fração de fosfolipidio de
cerca de 2% a cerca de 25%, cerca de 2% a cerca de 20%,
cerca de 2% a cerca de 15%, cerca de 2% a cerca de 10%,
cerca de 5% a cerca de 25 %, cerca de 5% a cerca de 20%,
cerca de 5% a cerca de 20%, cerca de 5% a ce rca de 10%, ou
cerca de 7% a cerca de 9% por peso. Em algumas formas de
realização, o óleo microbiano compreende uma fração de f osf olipidios de menos do que cerca de 20%, menos do que cerca de 15%, menos do que cerca de 10%, menos do que cerca de 9%, ou menos do que cerca de 8% por peso. Em algumas formas de realização, o óleo microbiano é substancialmente livre de fosfolipidios. Em algumas formas de realização, o óleo microbiano compreende insaponificáveis de menos do que cerca de 2%, menos do que cerca de 1,5%, menos do que cerca de 1%, ou menos do que cerca de 0,5% por peso do óleo. As classes de lipídios presentes no óleo microbiano, tal como uma fração de triacilglicerol, podem ser separadas por cromatografia flash e analisadas por cromatografia em camada fina (CCF), ou separadas e analisadas por outros métodos conhecidos na técnica.
[071] Em algumas formas de realização, o óleo
42/131 microbiano e/ou uma ou mais frações deste selecionadas a partir da fração de triacilglicerol, fração de ácidos graxos livres, fração de esterol, fração de diacilglicerol, e suas combinações, compreende pelo menos, cerca de 5%, pelo menos, cerca de 10%, mais do que cerca de 10%, pelo menos, cerca de 12%, pelo menos, cerca de 13%, pelo menos, cerca de 14%, pelo menos, cerca de 15%, pelo menos, cerca de 16%, pelo menos, cerca de 17%, pelo menos, cerca de 18%, pelo menos, cerca de 19%, pelo menos, cerca de 20%, pelo menos, cerca de 25%, pelo menos, cerca de 30%, cerca de pelo menos, cerca de 35%, pelo menos, cerca de 40%, ou pelo menos, cerca de 45% por peso de EPA. Em algumas formas de realização, as frações de óleo microbiano e/ou uma ou mais deste selecionadas a partir da fração de triacilglicerol, fração de ácidos graxos livres, fração de esterol, fração de diacilglicerol, e suas combinações, compreende cerca de 5% a cerca de 55%, cerca de 5% a cerca de 50%, cerca de 5% a cerca de 45%, cerca de 5% a cerca de 40%, cerca de 5% a cerca de 35%, cerca de 5% a cerca de 30%, cerca de 10% a cerca de 55%, cerca de 10% de cerca de 50%, cerca de 10%a cerca de 45%, cerca de 10% a cerca de 40%, cerca de 10%a cerca de 35%, cerca de 10% a cerca de 30%, pelo menos, cerca de 12% a cerca de 55%, pelo menos, cerca de 12%a cerca de 50%, pelo menos, cerca de 12% a cerca de 45%, pelo menos, cerca de 12% a cerca de 40%, pelo menos, cerca de 12% a cerca de 35%, ou pelo menos, cerca de 12% a cerca de 30%, cerca de 15% a cerca de 55%, cerca de 15% a cerca de 50%, cerca de 15% a cerca de 45%, cerca de 15% a cerca de 40%, cerca de 15% a cerca de 35%, cerca de 15% a cerca de 30%, cerca de 15% a cerca 25%, cerca de 15% a cerca de 20%,
43/131
cerca de 20% a cerca de 55%, cerca de 2 0% a cerca de 50%,
cerca de 20% a cerca de 45%, cerca de 2 0% a cerca de 40%,
ou cerca de 2 0% a cerca de 30% por peso de EPA. Em algumas
formas de realização, as frações de óleo microbiano e/ou uma ou mais deste selecionadas a partir da fração de triacilglicerol, fração de diacilglicerol, fração de esterol, fração de ésteres de esteróis, fração de ácidos graxos livres, fração fosfolipidica, e suas combinações, compreende pelo menos, cerca de 5%, pelo menos, cerca de 10%, pelo menos, cerca de 15%, pelo menos, cerca de 20%, pelo menos, cerca de 25%, pelo menos, cerca de 30%, pelo menos, cerca de 35%, pelo menos, cerca de 40%, pelo menos, cerca 50%, ou pelo menos, cerca de 60% por peso de DHA. Em algumas formas de realização, as frações de óleo microbiano e/ou uma ou mais deste selecionadas a partir da fração de triacilglicerol, fração de diacilglicerol, fração de esterol, fração de ésteres de esteróis, fração de ácidos graxos livres, fração fosfolipidica, e suas combinações, compreende cerca 5% a cerca de 60%, cerca de 5% a cerca de
55%, cerca de 5% a cerca de 50%, cerca de 5% a cerca de 40%
cerca de 10% a cerca de 60%, cerca de 10% a cerca de 50%,
cerca de 10% a cerca de 40%, cerca de 20% a cerca de 60%,
cerca de 2 5% a cerca de 60%, cerca de 25% a cerca de 50%,
cerca de 2 5% a cerca de 45%, cerca de 30% a cerca de 50%,
cerca de 35% a cerca 50 %, ou cerca de 30% a cerca de 40%
por peso de DHA. Em algumas formas de realização, as
frações de óleo microbiano e/ou uma ou mais deste
selecionadas a partir da fração de triacilglicerol, fração de diacilglicerol, fração de esterol, fração de ésteres de esteróis, fração de ácidos graxos livres, fração
44/131 fosfolipídica, e suas combinações, compreende cerca 10% ou menos, cerca de 9% ou menos, cerca de 8% ou menos, cerca de 7% ou menos, cerca de 6% ou menos, cerca de 5% ou menos, cerca de 4% ou menos, cerca de 3% ou menos, cerca de 2% ou menos, ou cerca de 1% ou menos por peso de DHA. Em algumas formas de realização, as frações de óleo microbiano e/ou uma ou mais deste selecionadas a partir da fração de triacilglicerol, fração de diacilglicerol, fração de esterol, fração de ésteres de esteróis, fração de ácidos graxos livres, fração fosfolipídica e suas combinações, compreende cerca 1% a cerca de 10%, cerca de 1% a cerca de 5%, cerca de 2% a cerca de 5%, cerca de 3% a cerca de 5%, ou cerca de 3% a cerca de 10%, por peso, dos ácidos graxos como DHA. Em algumas formas de realização, o óleo microbiano e/ou uma ou mais frações selecionadas a partir da fração de triacilglicerol, fração de diacilglicerol, fração de esterol, fração de ésteres de esteróis, fração de ácidos graxos livres, fração fosfolipídica e suas combinações, é substancialmente livre de DHA. Em algumas formas de realização, as frações de óleo microbiano e/ou uma ou mais deste selecionadas a partir da fração de triacilglicerol, fração de diacilglicerol, fração de esterol, fração de ésteres de esteróis, fração de ácidos graxos livres, fração fosfolipídica e suas combinações, compreende cerca 0,1% a cerca de 5%, cerca de 0,1% a menos
do que cerca de 5%, cerca de 0,1% a cerca de 4%, cerca de
0, 1% a cerca de 3%, cerca de 0,1% a cerca de 2%, cerca de
0,2% a cerca de 5%, cerca 0,2 % a menos do que cerca de 5%,
cerca de 0,2% a cerca de 4%, cerca de 0,2% a cerca de 3%,
cerca de 0,2% a cerca de 2%, cerca de 0,3% a cerca de 2%,
45/131
cerca de 0,1% a cerca de 0,5%, cerca 0,2% a cerca de 0, 5%,
cerca de 0,1% a cerca de 0,4%, cerca de 0,2% a cerca de
0,4%, cerca de 0,5% a cerca de 2%, cerca de 1% a cerca de
2%, cerca de 0,5% a cerca de 1,5%, ou cerca de 1% a cerca de 1,5% por peso de ARA. Em algumas formas de realização, as frações de óleo microbiano e/ou uma ou mais destes selecionadas a partir da fração de triacilglicerol, fração de diacilglicerol, fração de esterol, fração de ésteres de esteróis, fração de ácidos graxos livres, fração fosfolipidica e suas combinações compreende cerca 5% ou menos, menos do que cerca de 5%, cerca de 4% ou menos, cerca de 3% ou menos, cerca de 2% ou menos, cerca de 1,5% ou menos, cerca de 1% ou menos, cerca de 0,5% ou menos, cerca de 0,4% ou menos, cerca de 0,3% ou menos, cerca de 0,2% ou menos, ou cerca de 0,1% ou menos por peso de ARA. Em algumas formas de realização, o óleo microbiano e/ou uma ou mais frações destes selecionadas a partir da fração de triacilglicerol, fração de diacilglicerol, fração de esterol, fração de ésteres de esteróis, fração de ácidos graxos livres, fração fosfolipidica e suas combinações é substancialmente livre de ARA. Em algumas formas de realização, as frações de óleo microbiano e/ou uma ou mais destes selecionadas a partir da fração de triacilglicerol, fração de diacilglicerol, fração de esterol, fração de ésteres de esteróis, fração de ácidos graxos livres, fração fosfolipidica e suas combinações compreende cerca 0,4% a
cerca de 2%, cerca de 0 , 4% a cerca de 3%, cerca de 0, 4% a
cerca de 4%, cerca de 0 , 4% a cerca de 5%, cerca de 0, 4% a
menos do que cerca de 5%, cerca de 0,5% a cerca de 1 O 0 r
cerca 0, 5% a cerca de 2%, cerca de 0,5% a cerca de 3 o 0 r
46/131
cerca de 0,5% a cerca de 4%, cerca de 0,5% a cerca de 5 O 0 r
cerca de 0,5% a menos do que cerca de 5%, cerca de 1% a
cerca de 2%, cerca 1% a cerca de 3%, cerca de 1% a cerca de
4%, cerca de 1% a cerca de 5%, ou cerca de 1% a menos do que cerca de 5% por peso de DPA n-6. Em algumas formas de realização, as frações de óleo microbiano e/ou uma ou mais destes selecionadas a partir da fração de triacilglicerol, fração de diacilglicerol, fração de esterol, fração de ésteres de esteróis, fração de ácidos graxos livres, fração
fosfolipidica e suas combinações compreende cerca 5%, menos
do que cerca de 5%, cerca de 4% ou menos, cerca de 3% ou
menos, cerca de 2% ou menos, cerca de 1% ou menos, cerca de
0,75% ou menos, cerca de 0,6% ou menos, ou cerca de 0,5% ou
menos por peso de DPA n-6. Em algumas formas de realização, o óleo microbiano e/ou uma ou mais frações destes selecionadas a partir da fração de triacilglicerol, fração de diacilglicerol, fração de esterol, fração de ésteres de esteróis, fração de ácidos graxos livres, fração fosfolipidica e suas combinações é substancialmente livre de DPA n-6. Em algumas formas de realização, as frações de óleo microbiano e/ou uma ou mais destes selecionadas a partir da fração de triacilglicerol, fração de diacilglicerol, fração de esterol, fração de ésteres de esteróis, fração de ácidos graxos livres, fração fosfolipidica e suas combinações compreende ácidos graxos com cerca de 5% ou menos, menos do que cerca de 5%, cerca de 4% ou menos, cerca de 3% ou menos, ou cerca de 2% ou menos, por peso de ácido oleico (18:1 n-9), ácido linoleico (18:2 n-6), ácido linolênico (18:3 n-3) , ácido eicosanóico (20:1 n-9), ácido erúcico (22:1 n-9), ácido estearidônico
47/131 (18:4 n-3) , ou suas combinações.
[072] A molécula de triacilglicerol contém 3 átomos de carbono central (C(sn-1)H2R1-(sn-2)H2R2-C(sn-3)H2R3) , permitindo a formação de diferentes isômeros posicionais. Em algumas formas de realização, o óleo microbiano compreende uma fração de triacilglicerol, em que, pelo menos, cerca de 2%, pelo menos, cerca de 3%, pelo menos, cerca de 5%, pelo menos, cerca de 10%, pelo menos, cerca de 15%, pelo menos, cerca de 20%, pelo menos, cerca 30%, pelo menos, cerca de 35%, ou pelo menos, cerca de 40% dos triacilgliceróis na fração de triacilglicerol contêm DHA em duas posições no triacilglicerol (DHA di-substituído) selecionadas a partir de qualquer duas das posições sn-1, sn-2, e sn-3, com base na porcentagem de área relativa de picos em um cromatógrafo de CLAE. Em algumas formas de realização, o óleo microbiano compreende uma fração de triacilglicerol em que cerca de 2% a cerca de 55%, cerca de 2% a cerca de 50%, cerca de 2% a cerca de 45%, cerca de 2% a cerca de 40%, cerca de 2% a cerca 35%, cerca de 2% a cerca de 30%, cerca de 2% a cerca de 25%, cerca de 5% a cerca de 55%, cerca de 5% a cerca de 50%, cerca de 5%a cerca de 45%, cerca de 5% a cerca de 40%, cerca de 5%a cerca de 35%, cerca de 5% a cerca de 30%, cerca de 5%a cerca de 25%, cerca de 10% a cerca de 55%, cerca de 10% a cerca de 50%, cerca de 10% a cerca de 45%, cerca 10% a cerca de 40%, cerca de 10% a cerca de 35%, cerca de 10%a cerca de 30%, cerca de 10% a cerca de 25%, cerca de 10%a cerca de 20%, cerca de 20% a cerca de 40%, cerca de 20%a cerca de 35%, ou cerca de 20% a cerca de 25% dos triacilgliceróis na fração de triacilglicerol contêm EPA em
48/131 duas posições no triacilglicerol selecionadas a partir de qualquer duas das posições sn-1, sn-2, ou sn-3, com base na porcentagem de área relativa de picos em um cromatógrafo de CLAE. Em algumas formas de realização, o óleo microbiano compreende uma fração de triacilgliceróis na qual, pelo menos, cerca de 0,5%, pelo menos, cerca de 1%, pelo menos, cerca de 1,5%, ou, pelo menos, cerca de 2% dos triacilgliceróis na fração de triacilglicerol contêm DHA em todas as posições sn-1, sn-2 e sn-3 (DHA tri-substituido) , com base na porcentagem de área relativa de picos em um cromatógrafo de CLAE. Em algumas formas de realização, o óleo microbiano compreende uma fração de triacilglicerol em
que cerca de 0,5% a cerca de 5%, cerca de 0,5% a cerca de
3%, cerca de 0,5% a cerca de 2,5%, cerca de 0,5% a cerca de
2%, cerca de 1% a cerca 5 O 0 r cerca de 1% a cerca de 3%, ou
cerca de 1% a cerca de 2% dos triacilgliceróis na fração de triacilglicerol contêm DHA em todas as posições sn-1, sn-2 e sn-3, com base na porcentagem de área relativa de picos em um cromatógrafo de CLAE. Em algumas formas de realização o óleo microbiano compreende uma fração de triacilglicerol, em que pelo menos, cerca de 10%, pelo menos, cerca de 15%, pelo menos, cerca de 20%, pelo menos, cerca de 25%, pelo menos, cerca de 30%, pelo menos, cerca de 35%, em menos cerca de 40%, pelo menos, cerca de 45%, pelo menos, cerca de 50%, pelo menos, cerca de 55%, ou pelo menos, cerca de 60% dos triacilgliceróis na fração de triacilglicerol contêm DHA em uma posição no triacilglicerol selecionada a partir de qualquer uma das posições sn-1, sn-2 ou sn-3, com base na porcentagem de área relativa de picos em um cromatógrafo de CLAE. Em algumas formas de realização, o
49/131 óleo microbiano compreende uma fração de triacilgliceróis
na qual cerca de 10% a cerca de 80%, cerca de 10% a cerca
de 70%, cerca de 10% a cerca de 60%, cerca de 15% a cerca
de 80%, cerca de 15% a cerca 75% , cerca de 15% a cerca de
70 %, cerca de 15% a cerca de 65% , cerca de 15% a cerca de
60 %, cerca de 35% a cerca de 80% , cerca de 35% a cerca de
75 %, cerca de 35% a i cerca de 65% , cerca de 35% a cerca de
60 %, cerca de 40% a cerca de 80% , cerca de 40% a cerca de
75 %, cerca de 40% a cerca de 70% , cerca de 40% a cerca de
65 %, cerca de 40% a cerca de 60% , ou cerca de 40% a cerca
de 55% dos triacilgliceróis na fração de triacilglicerol contêm DHA em uma posição no triacilglicerol selecionada a partir de qualquer uma das posições sn-1, sn-2 e sn-3, com base na porcentagem de área relativa de picos em um cromatógrafo de CLAE.
[073] Em algumas formas de realização o óleo microbiano compreende ácidos graxos em que os ácidos graxos ainda compreendem ácidos graxos poliinsaturados ômega-3, em que os ácidos graxos poliinsaturados ômega-3 compreendem EPA e DHA, em uma quantidade de cerca de > 90%, por peso, da quantidade total de ácidos graxos poliinsaturados ômega-3 e a quantidade de EPA, por peso, é de cerca de 28% a cerca de 36% da quantidade total de DHA e EPA, e a quantidade de DHA por peso, é de cerca de 54% para cerca de 62% da quantidade total de DHA e EPA.
[074] Em uma outra forma de realização, o óleo microbiano compreende ácidos graxos poliinsaturados ômega-3 compreendendo EPA e DHA, em uma quantidade de cerca de > 90%, por peso, da quantidade total de ácidos graxos poliinsaturados ômega-3, em que a quantidade de EPA, por
50/131 peso, é de cerca de 19% a cerca de 55% da quantidade total de DHA e EPA, e a quantidade de DHA, por peso, é de cerca de 35% a cerca de 71% da quantidade total de DHA e EPA.
[075] Em outras formas de realização, o óleo microbiano compreende ácidos graxos poliinsaturados ômega-3, compreendendo EPA e DHA, em uma quantidade de cerca de > 90%, por peso, da quantidade total de ácidos graxos poliinsaturados ômega-3, em que a quantidade de EPA, por peso, é de cerca de 19% a cerca de 43% da quantidade total de DHA e EPA, e a quantidade de DHA, por peso, é de cerca de 35% a cerca de 47% da quantidade total de DHA e EPA.
[076] Em uma outra forma de realização, o óleo microbiano compreende ácidos graxos poliinsaturados ômega-3 compreendendo EPA e DHA, em uma quantidade de cerca de > 90%, por peso, da quantidade total de ácidos graxos poliinsaturados ômega-3, em que a quantidade de EPA, por peso, é de cerca de 27% a cerca de 54% da quantidade total de DHA e EPA, e a quantidade de DHA, por peso, é de cerca de 36% a cerca de 63% da quantidade total de DHA e EPA.
[077] Em ainda uma outra forma de realização, o óleo microbiano compreende ácidos graxos poliinsaturados ômega-3 compreendendo EPA e DHA, em uma quantidade de cerca de > 90%, por peso, da quantidade total de ácidos graxos poliinsaturados ômega-3, em que a quantidade de EPA, por peso, é de cerca de 26% a cerca de 38% da quantidade total de DHA e EPA, e a quantidade de DHA, por peso, é de cerca de 52% a cerca de 64% da quantidade total de DHA e EPA.
[078] Em ainda outra forma de realização, o óleo microbiano compreende ácidos graxos poliinsaturados ômega-3 compreendendo EPA e DHA, em uma quantidade de cerca de >
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90%, por peso, da quantidade total de ácidos graxos poliinsaturados ômega-3, e DPA n-3 em uma quantidade de desde cerca de 0% a cerca de 10%, por peso, da quantidade total de ácidos graxos poliinsaturados ômega-3, em que a quantidade de EPA, por peso, é de cerca de 19% a cerca de 55% da quantidade total de EPA e DHA, e a quantidade de DHA por peso, é de cerca de 35% a cerca de 71% da quantidade total de DHA e EPA.
[079] Em ainda outra forma de realização, o óleo microbiano compreende ácidos graxos poliinsaturados ômega-3 que compreende DHA e EPA em uma quantidade de cerca de > 90%, por peso, da quantidade total de ácidos graxos poliinsaturados ômega-3 e DPA n-3 em uma quantidade de cerca de 0% a cerca de 10%, por peso, da quantidade total de ácidos graxos poliinsaturados ômega-3, em que a quantidade de EPA, por peso, é de cerca de 19% a cerca de 43% da quantidade total de DHA e EPA, e a quantidade de DHA por peso, é de cerca de 35% a cerca de 47% da quantidade total de DHA e EPA.
[080] Em ainda outra forma de realização, o óleo microbiano compreende ácidos graxos poliinsaturados ômega-3 compreendendo DHA e EPA em uma quantidade de cerca de > 90% por peso, da quantidade total de ácidos graxos poliinsaturados ômega-3 e DPA n-3 em uma quantidade de cerca de 0% a cerca de 10%, por peso, da quantidade total de ácidos graxos poliinsaturados ômega-3, em que a quantidade de EPA, por peso, é de cerca de 27% a cerca de 54% da quantidade total de DHA e EPA, e a quantidade de DHA por peso, é de cerca de 36% a cerca de 63% da quantidade total de DHA e EPA.
52/131 [081] Em uma outra forma de realização, o óleo microbiano compreende ácidos graxos poliinsaturados ômega-3 compreendendo EPA e DHA, em uma quantidade de cerca de > 90%, por peso, da quantidade total de ácidos graxos poliinsaturados ômega-3, e DPA n-3 em uma quantidade compreendida entre cerca de 0% a cerca de 10%, por peso, da quantidade total de ácidos graxos poliinsaturados ômega-3, em que a quantidade de EPA, por peso, é de cerca de 26% a cerca de 38% da quantidade total de DHA e EPA, e a quantidade de DHA, por peso, é de cerca de 52% a cerca de 64% da quantidade total de DHA e EPA.
[082] Em uma outra forma de realização, o óleo microbiano compreende ácidos graxos poliinsaturados ômega-3 compreendendo EPA e DHA, em uma quantidade de cerca de > 90%, por peso, da quantidade total de ácidos graxos poliinsaturados ômega-3, e DPA n-3 em uma quantidade compreendida entre cerca de 0% a cerca de 10%, por peso, da quantidade total de ácidos graxos poliinsaturados ômega-3, em que a quantidade de EPA, por peso, é de cerca de 28% a cerca de 36% da quantidade total de DHA e EPA e a quantidade de DHA, por peso, é de cerca de 54% a cerca de 62% da quantidade total de DHA e EPA.
[083] Em ainda outra forma de realização, o óleo microbiano compreende ácidos graxos poliinsaturados ômega-3 compreendendo EPA e DHA, em uma quantidade de cerca de > 90%, por peso, da quantidade total de ácidos graxos poliinsaturados ômega-3, e DPA n-3 em uma quantidade de desde cerca de 0% a cerca de 2%, por peso, da quantidade total de ácidos graxos poliinsaturados ômega-3, em que a quantidade de EPA, por peso, é de cerca de 10% a cerca de
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25% do total quantidade de EPA e DHA e a quantidade de DHA, por peso, é de cerca de 75% a cerca de 90% da quantidade total de DHA e EPA.
[084] Em algumas formas de realização, a quantidade total de ácidos graxos poliinsaturados ômega-3 no óleo microbiano é, pelo menos, cerca de 400 mg por um grama de óleo.
[085] Em outras formas de realização, a quantidade total de ácidos graxos poliinsaturados ômega-3 no óleo microbiano é, pelo menos, cerca de 500 mg por um grama de óleo.
[086] Em ainda outras formas de realização, a quantidade total de ácidos graxos polinsaturados ômega-3 no óleo microbiano é de cerca de 400 mg a cerca de 750 mg por um grama de óleo.
[087] Em algumas formas de realização, o óleo microbiano compreende de cerca de 120 mg a cerca 220 mg de EPA por um grama de óleo e de cerca de 240 mg a cerca de 450 mg de DHA por um grama de óleo.
[088] Em algumas formas de realização, o óleo microbiano compreende de cerca de 120 mg a cerca 220 mg de EPA por um grama de óleo e de cerca de 240 mg a cerca de 450 mg de DHA por um grama de óleo.
[089] Em outras formas de realização, o óleo microbiano compreende de cerca de 130 mg a cerca 195 mg de EPA por um grama de óleo e de cerca de 320 mg a cerca de 480 mg de DHA por um grama de óleo.
[090] Em uma outra forma de realização, o óleo microbiano compreende de cerca de 150 mg a cerca 300 mg de EPA por um grama de óleo; a partir de cerca de 200 mg a
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cerca de 400 mg de DHA por um grama de um óleo; e de cerca
de 0 a cerca de 55 mg de DPA n-3 por um grama de óleo.
[091] Em ainda uma outra forma de realização, o óleo
microbiano compreende de cerca de 50 mg a cerca de 150 mg de EPA por urn grama de óleo; a partir de cerca de 410 mg a
cerca de 540 mg de DHA por um grama de um óleo; e de cerca
de 0 a cerca de 12 mg de DPA n-3 por um grama de óleo
[092] Em algumas formas de realização, o óleo
microbiano compreende uma proporção de EPA:DHA de 1:1 a
1:30 ou 1:1 a 1:3 por peso de ácidos ômega-3 totais. graxos polinsaturados
[093] Em algumas formas de realização, o óleo
microbiano compreende uma proporção de EPA:DHA de 1:1 a
1:2,5 por peso de ácidos graxos poliinsaturados ômega-3 totais .
[094] Em uma outra forma de realização, o óleo microbiano compreende uma proporção de EPA:DHA de 1:4 a 1:7 por peso de ácidos graxos polinsaturados ômega-3 totais.
[095] Em algumas formas de realização, o óleo microbiano compreende uma proporção de EPA:DHA de pelo menos 1:1, pelo menos, 1:1,5, pelo menos, 1:2, pelo menos, 1:2,5, pelo menos 1:3, ou, pelo menos, 1:4 por peso de ácidos graxos poliinsaturados ômega-3 totais. Faixas úteis podem ser selecionadas entre qualquer um destes valores, por exemplo, uma proporção de EPA:DHA de 1:1 a 1:1,5, 1:1 a 1:2, 1:1,5 a 1:2, 1:1 a 1:2,5, 1:2 a 1:2,5 e 1:4 a 1:7 por peso de ácidos graxos polinsaturados ômega-3 totais.
[096] Em ainda uma outra forma de realização, o óleo microbiano é produzido por Schizochytrium sp.
[097] A invenção é direcionada a composições
55/131 compreendendo um microrganismo da invenção, uma biomassa isolada da invenção, um óleo microbiano da invenção, ou suas combinações.
[098] Um microrganismo, biomassa ou óleo microbiano da invenção pode ser ainda quimicamente ou fisicamente modificado ou processado com base nos requisitos da composição através de qualquer técnica conhecida.
[099] As células de microrganismos ou de biomassas podem ser secas antes da sua utilização em uma composição por métodos, incluindo, mas não limitados a, secagem por congelamento; secagem ao ar, secagem por pulverização, túnel de secagem, secagem por vácuo (liofilização), e um processo similar. Alternativamente, uma biomassa recolhida e lavada pode ser utilizada diretamente em uma composição sem secagem. Veja-se, por exemplo, Patente dos EUA N— 5.130.242 e 6.812.009, cada uma das quais é aqui incorporada por referência na sua totalidade.
[100] Os óleos microbianos da presente invenção podem ser utilizados como material de partida para produzir de forma mais eficiente um produto enriquecido em um ácido graxo, tal como EPA. Por exemplo, os óleos microbianos da presente invenção podem ser submetidos a várias técnicas de purificação conhecidas na técnica, tais como destilação ou adução de ureia, para produzir um produto de maior potência, com concentrações mais elevadas de EPA ou outro ácido graxo. Os óleos microbianos da presente invenção também podem ser utilizados em reações químicas para produzir compostos derivados de ácidos graxos nos óleos, tais como os ésteres e sais de EPA ou outro ácido graxo.
[101] A composição da invenção pode incluir um ou mais
56/131 excipientes. Tal como aqui utilizado, excipiente referese a um componente, ou uma mistura de componentes, que é utilizado em uma composição da presente invenção para se obter as características desejadas para a composição, incluindo alimentos bem como produtos farmacêuticos, cosméticos, e composições industriais. Um excipiente da presente invenção pode ser descrito como um excipiente farmaceuticamente aceitável quando adicionado a uma composição farmacêutica, o que significa que o excipiente é emm forma de composto, material, composição, sal, e/ou dosagem, que é, no âmbito de julgamento de parecer médico, adequado para contato com os tecidos de seres humanos e animais não-humanos, sem excessiva toxicidade, irritação, resposta alérgica, e outras complicações mais problemáticas sobre a duração desejada do contato comensurável com uma relação risco/benefício razoável. Em algumas formas de realização, o termo farmaceuticamente aceitável significa aprovado por uma agência reguladora do governo federal ou de um governo estadual ou inscrito na Farmacopeia dos EUA ou outras farmacopeias internacionais geralmente reconhecidas para uso em animais, e mais particularmente em seres humanos. Vários excipientes podem ser utilizados. Em algumas formas de realização, o excipiente pode ser, mas não está limitado a, um agente alcalino, um estabilizador, um antioxidante, um agente de aderência, um agente de separação, um agente de revestimento, um componente da fase exterior, um componente de liberação controlada, um solvente, um surfactante, um agente humectante, um agente tampão, um agente de enchimento, um emoliente, ou suas combinações. Excipientes, além dos aqui discutidos podem
57/131 incluir excipientes listados em, embora não se limitando a, Remington: The Science and Practice of Pharmacy (Remigton: A Ciência e a Prática de Farmácia) , 21- ed. (2005) . A inclusão de um excipiente em uma classificação particular aqui (por exemplo, solvente) destina-se a ilustrar em vez de limitar o papel do excipiente. Um excipiente particular pode cair dentro de várias classificações.
[102] As composições da invenção incluem, mas não estão limitadas a, produtos alimentares, composições farmacêuticas, cosméticos e composições industriais.
[103] Em algumas formas de realização, a composição é um produto alimentar. Um produto alimentar é qualquer alimento de animal não humano ou consumo humano, e inclui ambas as composições sólida e liquida. Um produto alimentar pode ser um aditivo para alimentos de animais ou humanos. Alimentos incluem, mas não estão limitadas a, alimentos comuns; produtos líquidos, incluindo leite, bebidas, bebidas terapêuticas e bebidas nutricionais; alimentos funcionais; suplementos; nutracêuticos; fórmulas infantis, incluindo fórmulas para lactentes prematuros; alimentos para mulheres grávidas ou lactantes; alimentos para adultos; alimentos geriátricos; e alimentos de origem animal.
[104] Em algumas formas de realização, um microrganismo, biomassa ou óleo microbiano da invenção pode ser utilizado diretamente como ou incluído como um aditivo dentro de um ou mais dos seguintes: um óleo, gordura, pasta, outro ingrediente oleoso, bebida, molho, alimentos à base de lacticínios ou à base de soja (tal como leite, iogurte, queijo e sorvetes), um assado comum, um produto nutricional, por exemplo, como um suplemento nutricional (em forma de
58/131 cápsula ou comprimido), um suplemento vitaminico, um suplemento de dieta, uma bebida em pó, e um produto alimentar em pó acabado ou semi-acabado. Em algumas formas de realização, o suplemento nutricional é na forma de uma cápsula vegetal que não é formado a partir de e não contém quaisquer componentes de uma fonte animal.
[105] Uma lista parcial das composições alimentares que podem incluir um óleo microbiano da invenção inclui, mas não está limitado a, produtos à base de soja (leite, sorvetes, iogurtes, bebidas, cremes, pastas, branqueadores); sopas e misturas de sopa; massas, batidas, e itens de alimentos assados, incluindo, por exemplo, produtos de confeitaria fina, cereais matinais, bolos, cheesecakes, tortas, cupcakes, bolachas, barras, pães, biscoitos, muffins, doces, bolinhos, croutons, biscoitos torrados, produtos doces, bolos de lanche, tortas, barras de granola/lanche e doces de torradeira; doces; confeitaria rígida; chocolate e outras guloseimas; goma de mascar; produtos alimentares líquidos, por exemplo, leites, bebidas energéticas, fórmula infantil, refrigerantes, chás, refeições líquidas, sucos de frutas, bebidas à base de frutas, bebidas à base de vegetais; xaropes multivitamínicos, substitutos de refeição, alimentos medicinais, e xaropes; misturas de bebidas em pó; massas; produtos de pesca processados; produtos à base de carne processados; produtos de aves processados; caldos e molhos; condimentos (ketchup, maionese, etc.); pastas à base de óleos vegetais; produtos lácteos; iogurte; manteigas; produtos lácteos congelados; sorvetes; sobremesas geladas; iogurtes congelados; alimentos semi-sólidos como comida
59/131 para bebé; pudins e gelatinas; queijo processado e não processado; misturas para panqueca; barras de alimentos, incluindo barras energéticas; misturas para waffle; molhos para saladas; misturas de substituição de ovos; pastas de nozes ou à base de nozes; salgadinhos fritos como batatas fritas e outros fritos ou crocantes, salgadinhos de milho, batatas fritas de pacote, lanches extrutilizados, pipoca, pretzels, batatas fritas e nozes; e lanches especiais, como molhos, petiscos de frutas secas, petiscos de carne, torresmo, bares de alimentos saudáveis e bolos de arroz/milho.
[106] Em algumas formas de realização, um óleo microbiano da invenção pode ser utilizado para complementar a fórmula infantil. A fórmula infantil pode ser suplementada com um óleo microbiano da invenção sozinho ou em combinação com um óleo refinado fisicamente derivado de um microrganismo produtor ácido araquidônico (ARA). Um microrganismo produtor de ARA, por exemplo, é Mortierella alpina ou Mortierella sect., schmuckeri. Alternativamente, as fórmulas infantis podem ser suplementadas com um óleo microbiano da invenção em combinação com um óleo rico em ARA, incluindo ARASCO® (Martek Biosciences, Columbia, MD).
[107] Em algumas formas de realização, a composição é uma ração para animais. Um animal inclui os organismos não-humano pertencente ao reino Animalia e inclui, sem limitação, animais aquáticos e animais terrestres. O termo ração animal ou alimento animal se refere a qualquer alimento para animais não-humanos, quer para peixes; peixe comercial; peixe ornamental; larvas de peixes; bivalves; moluscos; crustáceos; mariscos; camarão; camarão larval;
60/131 artemia; rotíferos; camarão de água salgada; alimentadores de filtros; anfíbios; répteis; mamíferos; animais domésticos; animais de fazenda; animais de jardim zoológico; animais de esporte; plantéis; animais de corrida; animais de exposição; animais de herança; animais raros ou ameaçados de extinção; animais de companhia; animais domésticos, como cães, gatos, porcos da índia, coelhos, ratos, camundongos, ou cavalos; primatas tal como macacos (por exemplo, Cebus, rhesus, verde Africano, patas, cinomólogo e Cercopithecus), macacos, orangotangos, babuínos, gibões, e chimpanzés; canídeos, como cães e lobos; felinos, como gatos, leões e tigres; equídeos, como cavalos, burros e zebras; animais alimentares, tais como vacas, bois, porcos e ovelhas; ungulados tal como veados e girafas; ou roedores, tais como ratos, ratazanas, hamsters e cobaias; e assim por diante. Uma ração animal inclui, mas não está limitada a, um alimento de aquacultura, um alimento de animais domésticos, incluindo alimentos para animais de estimação, um alimento de animais de zoológicos, um alimento de animais de trabalho, um alimento para o gado, e suas combinações.
[108] Em algumas formas de realização, a composição é um alimento ou suplemento alimentar para qualquer animal cuja carne ou produtos são consumidos pelos seres humanos, tais como qualquer animal a partir do qual a carne, ovos, ou leite é derivado para consumo humano. Quando alimentado a tais animais, nutrientes, tais como AGPICL podem ser incorporados na carne, leite, ovos ou outros produtos desses animais para aumentar o seu teor destes nutrientes.
[109] Em algumas formas de realização, a composição é
61/131 um material obtido por secagem por pulverização que pode ser desintegrado para formar partículas de um tamanho apropriado para consumo por zooplâncton, artemia, rotíferos e alimentadores de filtro. Em algumas formas de realizaçãos zooplâncton, artemia, ou rotíferos alimentados pela composição são por sua vez alimentados a larvas de peixe, peixes, crustáceos, bivalves ou crustáceos.
[110] Em algumas formas de realização, a composição é uma composição farmacêutica. As composições farmacêuticas adequadas incluem, mas não estão limitadas a, uma composição anti-inflamatória, um fármaco para o tratamento de doença cardíaca coronária, um fármaco para o tratamento de arteriosclerose, um agente quimioterapêutico, um excipiente ativo, um fármaco para a osteoporose, um agente anti-depressivo, um anti-convulsivo, um fármaco antiHelicobacter pylori, um fármaco para o tratamento de doenças neurodegenerativas, um fármaco para o tratamento de doença degenerativa do fígado, um antibiótico, uma composição de redução do colesterol, e uma composição de abaixamento de triglicerídeos. Em algumas formas de realização, a composição é um alimento médico. Um alimento médico inclui um alimento que está em uma composição para ser consumido ou administrado externamente, sob a supervisão de um médico, e que se destina a satisfazer as necessidades nutricionais específicas de uma condição, para quais necessidades nutricionais distintas, com base em princípios científicos reconhecidos, são estabelecidos por avaliação médica.
[111] Em algumas formas de realização, o óleo microbiano pode ser formulado em uma forma de dosagem. As
62/131 formas de dosagem podem incluir, mas não estão limitadas a, comprimidos, cápsulas, hóstias, peletes, pílulas, pós e grânulos, e formas de dosagem parenterais que incluem, mas não estão limitadas a, soluções, suspensões, emulsões, e pós secos compreendendo uma quantidade eficaz do óleo microbiano. É também conhecido na técnica que tais formulações podem também conter diluentes, cargas, desintegrantes, ligantes, lubrificantes, surfactantes, veículos hidrofóbicos, veículos solúveis em água, emulsionantes, tampões, humectantes, hidratantes, solubilizantes, conservantes e outros semelhantes farmaceuticamente aceitáveis. As formas de administração podem incluir, mas não estão limitadas a, comprimidos, drageias, cápsulas, hóstias, e pílulas, que contêm o óleo microbiano e um ou mais veículos adequados farmaceuticamente aceitáveis. Para a administração oral, o óleo microbiano pode ser combinado com veículos farmaceuticamente aceitáveis bem conhecidos na técnica. Tais veículos permitem que os óleos microbianos da presente invenção sejam formulados como comprimidos, pílulas, drageias, cápsulas, líquidos, géis, xaropes, pastas, suspensões e semelhantes, para ingestão oral por um paciente a ser tratado. Em algumas formas de realização, a forma de dosagem é um comprimido, pílula ou cápsula. As preparações farmacêuticas para uso oral podem ser obtidas através da adição de um excipiente sólido, opcionalmente moendo a mistura resultante, e processando a mistura de grânulos, após adição de auxiliares adequados, se desejado, para obter comprimidos ou núcleos de drageias. Os excipientes adequados incluem, mas não estão limitados a,
63/131 agentes de enchimento, tais como açúcares, incluindo, mas não limitados a, lactose, sacarose, manitol e sorbitol; preparações de celulose, tais como, mas não limitados a, amido de milho, amido de trigo, amido de arroz, amido de batata, gelatina, goma de tragacanto, metilcelulose, hidroxipropilmetilcelulose, carboximetilcelulose de sódio, e polivinilpirrolidona (PVP). Se desejado, agentes desintegrantes podem ser adicionados, tais como, mas não limitado a, polivinilpirrolidona reticulada, agar, ou ácido alginico ou um seu sal, tal como alginato de sódio. As preparações farmacêuticas que podem ser utilizadas por via oral incluem, mas não estão limitadas a, cápsulas de engate rápido feitas de gelatina, bem como cápsulas seladas moles feitas de gelatina e um plastificante, tal como glicerol ou sorbitol. Em algumas formas de realização, a forma de dosagem é uma forma de dosagem de vegetarianos, em que a forma de dosagem não é formada a partir de e não contém quaisquer componentes de uma fonte animal. Em algumas formas de realização, a forma de dosagem vegetariana é uma cápsula vegetariana.
[112] Em algumas formas de realização a forma de dosagem oral, é uma cápsula em gel vegetariana que compreende amido de milho modificado, carragenina, glicerina, sorbitol, água purificada, beta-caroteno e caramelo em pó.
[113] Em algumas formas de realização a forma de dosagem oral é formulada com um óleo constituído por cerca de 100 mg, cerca de 200 mg, cerca de 300 mg, cerca de 400 mg, cerca de 500 mg, cerca de 550 mg ou cerca de 600 mg de teor de DHA e EPA por um grama de óleo.
64/131 [114] Em algumas formas de realização a forma de dosagem oral é formulada com um óleo compreendido entre cerca de 300 mg a cerca de 700 mg de teor de DHA e EPA por um grama de óleo.
[115] Em uma outra forma de realização, a forma de dosagem oral é formulada com um óleo compreendido entre cerca de 360 mg a cerca de 670 mg de teor de DHA e EPA por um grama de óleo.
[116] Em algumas formas de realização, a cápsula em gel pode ser formulada com um óleo constituído por cerca de 100 mg, cerca de 200 mg, cerca de 300 mg, cerca de 400 mg, cerca de 500 mg, cerca de 550 mg, ou cerca de 600 mg da quantidade total de teor de DHA e EPA por um grama de óleo.
[117] Em algumas formas de realização da cápsula em gel pode ser formulada com um óleo compreendido entre cerca de 300 mg a cerca de 700 mg de teor de DHA e EPA por um grama de óleo.
[118] Em uma outra forma de realização, a cápsula em gel pode ser formulada com um óleo compreendido entre cerca de 360 mg a cerca de 670 mg de teor de DHA e EPA por um grama de óleo.
[119] Em ainda uma outra forma de realização, a quantidade total de DHA e EPA é, pelo menos, cerca 400 mg por um grama de óleo.
[120] Em ainda uma forma de realização adicional, a quantidade total de ácidos graxos poliinsaturados ômega-3 é pelo menos, cerca de 400 mg por um grama de óleo.
[121] Em ainda uma outra forma de realização, a quantidade total de DHA e EPA é cerca de 400 mg por um grama de óleo.
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[122] Em uma ainda outra forma de realização, a
quantidade total de DHA e EPA é, pelo menos, cerca de 500
mg por um grama de óleo.
[123] Em uma ainda outra forma de realização, a
quantidade total de ácidos graxos polii nsaturados ômega-3 é
pelo menos, cerca de 500 mg por um grama de óleo.
[124] Em uma outra forma de realização, a quantidade total de DHA e EDA é cerca de 500 mg por um grama de óleo.
[125] Em algumas formas de realização, a composição é um produto cosmético. Cosméticos incluem, mas não estão limitados a, emulsões, cremes, loções, máscaras, sabonetes, xampus, lavagens, cremes faciais, condicionadores, maquiagens, agentes de banho, e líquidos de dispersão. Os agentes cosméticos podem ser medicinais ou não-medicinais.
[126] Em algumas formas de realização, a composição é uma composição industrial. Em algumas formas de realização, a composição é um material de partida para um ou mais fabricantes. Uma fabricação inclui, mas não está limitada a, um polímero; um material fotossensível fotográfico; um detergente; um óleo industrial; ou um detergente industrial. Por exemplo, a Patente dos EUA N2 7.259.006 descreve a utilização de DHA contendo gordura e óleo para a produção de ácido beénico e produção de materiais sensíveis fotográficos utilizando ácido beénico.
[127] Em algumas formas de realização, as composições podem ser utilizadas no tratamento de uma doença em seres humanos ou animais não-humanos. Em algumas formas de realização, as composições podem ser utilizadas para nutrição em seres humanos ou animais não-humanos.
[128] Os termos tratar tratamento referem-se
66/131 tanto a tratamento terapêutico como a medidas profiláticas ou preventivas, em que o objetivo é prevenir ou desacelerar (diminuir) a condição, doença, distúrbio ou fisiológico indesejado, ou para obter resultados clínicos benéficos ou desejados. Para os fins desta invenção, resultados clínicos benéficos ou desejados incluem, mas não estão limitados a, alívio ou eliminação de sintomas ou sinais associados com um estado, doença ou desordem; diminuição da extensão de um estado, doença ou desordem; estabilização de um estado, doença ou desordem, (isto é, onde a condição, doença ou distúrbio não está piorando); atraso no início ou progressão da condição, doença ou desordem; melhoramento da condição, doença ou desordem; remissão (quer parcial ou total e quer detectável ou indetectável) do estado, doença ou desordem; ou aperfeiçoamento ou melhoria de uma condição doença ou desordem. 0 tratamento inclui desencadear uma resposta clinicamente significativa sem efeitos secundários excessivos. 0 tratamento inclui também prolongar a sobrevivência em comparação com a sobrevivência esperada se não receber o tratamento.
[129] Em algumas formas de realização, a composição é utilizada para tratar um estado, doença ou desordem, tal como acne, inflamação aguda, maculopatia relacionada com a idade, alergia, doença de Alzheimer, artrite, asma, aterosclerose, doenças auto-imunes, distúrbios de lipidios no sangue, quistos mamários, caquexia, cancro, reestenose cardíaca, doenças cardiovasculares, inflamação crônica, doença cardíaca coronária, fibrose cística, doença degenerativa do fígado, diabetes, eczema, doenças gastrointestinais, doenças do coração, elevados níveis de
67/131 triacilgliceróis, hipertensão, hiperatividade, doenças imunológicas, inibição de crescimento tumoral, condições inflamatórias, doenças intestinais, disfunção renal, leucemia, depressão, esclerose múltipla, doença neurodegenerativa, osteoartrite, osteoporose, distúrbio peroxissomal, pré-eclampsia, parto prematuro, psoriase, doença pulmonar, artrite reumatóide, risco de doenças cardíacas ou trombose.
[130] Em algumas formas de realização, a composição é utilizada para aumentar o comprimento de gestação de um feto no terceiro trimestre.
[131] Em algumas formas de realização, a composição é utilizada para controlar a pressão arterial.
[132] Em algumas formas de realização, a composição é utilizada para melhorar ou manter a função cognitiva.
[133] Em algumas formas de realização, a composição é utilizada para melhorar ou manter a memória.
[134] Em algumas formas de realização, a composição é utilizada para manter um coração saudável.
[135] A composição ou forma de dosagem pode ser administrada no corpo de um sujeito por qualquer via compatível com a composição ou forma de dosagem. Uma substância é considerada como sendo administrada se a substância é introduzida no corpo do indivíduo por objeto, ou se outra pessoa, uma máquina, ou um dispositivo introduz a substância dentro do corpo do indivíduo. Administração, portanto, inclui, por exemplo, auto-administração, administração por outros e administração indireta. O termo contínuo ou consecutivo tal como aqui utilizado em referência a administração significa que a frequência de
68/131 administração é de, pelo menos, uma vez por dia. Note-se, contudo, que a frequência de administração pode ser superior a uma vez por dia e ainda ser continua ou consecutiva, por exemplo, duas vezes ou mesmo três vezes por dia, enquanto os níveis de dosagem, tal como aqui especificado, não são excedidos. Os meios e os métodos para administração são conhecidos na técnica e um especialista na técnica pode referir-se a várias referências farmacológicas para orientação. Por exemplo, Modern Pharmaceutics, Banker & Rhodes, Informa Healthcare, EUA, 4- ed. (2002); e Goodman & Gilman's The Pharmaceutical Base of Therapeutics, McGraw-Hill Companies, Inc., New York, 10- ed. (2001) podem ser consultados.
[136] Por sujeito, indivíduo ou paciente significa qualquer objeto, seja humano ou não humano, para os quais o diagnóstico, prognóstico, terapêutica, ou administração da composição ou forma de dosageme é desejada Indivíduos mamíferos incluem, mas não estão limitados a, seres humanos; animais domésticos; animais de fazenda; animais de jardim zoológico; animais de esporte; animais de companhia, como cães, gatos, porcos da índia, coelhos, ratos, camundongos, ou cavalos; primatas, como macacos (por exemplo, Cebus, rhesus, verde Africano, patas, cinomólogo e Cercopithecus), macacos, orangotangos, babuínos, gibões, e os chimpanzés; Canídeos, como cães e lobos; felinos, como gatos, leões e tigres; equídeos, como cavalos, burros e zebras; animais alimentares, tais como vacas, bois, porcos e ovelhas; ungulados como veados e girafas; roedores, tais como ratos, ratazanas, hamsters e cobaias; e assim por diante. O termo sujeito também abrange animais modelos, por
69/131 exemplo, animais de modelo da doença. Em algumas forma de realizaçãos, o termo sujeito inclui animais valiosos, seja economicamente ou não, por exemplo, plantéis economicamente importante, animais de corrida, animais de exposição, animais da herança, animais raras ou ameaçados ou animais
de companhia . Em certas formas de realização, o sujeito é
um sujeito sujeito é um humano. Em sujeito não certas humano. formas de real ização, o
[137] A composição pode s er administrada como uma
quantidade nutricional, quantidade terapeuticamente eficaz, quantidade profilaticamente eficaz, dose terapêutica ou dose profilática. Uma quantidade nutricional refere-se a uma quantidade eficaz, em dosagens e por períodos de tempo necessários, para alcançar um resultado nutricional desejado. Um resultado nutricional pode ser, por exemplo, aumento dos níveis de um componente de ácido graxo desejável em um sujeito. Uma quantidade terapeuticamente eficaz ou dose terapêutica refere-se a uma quantidade eficaz, em dosagens e por períodos de tempo necessários, para alcançar um resultado terapêutico desejado. Um resultado terapêutico pode ser, por exemplo, diminuição de sintomas, sobrevivência prolongada, maior mobilidade, e assim por diante. Um resultado terapêutico não precisa ser uma cura. Uma quantidade profilaticamente eficaz ou dose profilática refere-se a uma quantidade eficaz, em dosagens e por períodos de tempo necessários, para alcançar o resultado profilático desejado Tipicamente, uma vez que uma dose profilática é utilizada em indivíduos antes ou em uma fase precoce da doença, a quantidade profilaticamente eficaz será inferior a uma
70/131 quantidade terapeuticamente eficaz para o tratamento de um estado avançado da doença.
[138] Várias quantidades de dosagem da composição, forma de dosagem, ou composição farmacêutica podem ser administradas a um indivíduo, com base na quantidade de EPA ou outro componente de ácido graxo do microrganismo, biomassa ou óleo microbiano para ser administrada ao sujeito. Os termos dose diária, nível de dosagem diária e quantidade diária de dosagem referem-se aqui à quantidade total de EPA ou outro componente de ácido graxo administrado por dia (por período de 24 horas). Assim, por exemplo, a administração de EPA para um indivíduo a uma dose diária de 2 mg significa que o indivúdo recebe um total de 2 mg de EPA em uma base diária, se o EPA é administrado como uma forma de dosagem única compreendendo 2 mg de EPA, ou, alternativamente, quatro formas de dosagem compreendendo 0,5 mg de EPA cada (para um total de 2 mg de EPA). Em algumas formas de realização, a dose diária de EPA é administrada em uma forma de dosagem única, ou em duas formas de dosagem. As formas de dosagem da presente invenção podem ser feitas em uma única aplicação ou múltiplas aplicações. Por exemplo, se quatro comprimidos são tomados diariamente, cada comprimido contendo 0,5 mg de EPA, em seguida, todos os quatro comprimidos podem ser tomados uma vez por dia, ou dois comprimidos podem ser tomados duas vezes por dia, ou um comprimido pode tomado a cada 6 horas. Em algumas formas de realização, a dosagem diária é de cerca de 100 mg a cerca de 15 g de EPA. Em algumas formas de realização, a dosagem diária é de cerca de 0,5 mg a cerca de 250 mg, cerca de 100 mg a cerca de 250
71/131 mg, cerca de 100 mg a cerca de 500 mg, cerca de 100 mg a cerca de 1 g, cerca de 1 g a cerca de 2,5 g, cerca de 1 g a cerca de 5 g, cerca de 1 g a cerca de 10 g, cerca de 1 g a cerca de 15 g, cerca de 5 g a cerca de 10 g, cerca de 5 g a cerca de 15 g, cerca de 10 g a cerca de 15 g, cerca de 100 mg a cerca de 10 g, cerca de 100 mg a cerca de 5 g, ou cerca de 100 mg a cerca de 2,5 g de EPA, DHA, ou uma combinação dos mesmos. Em algumas formas de realização, a composição é uma forma de dosagem que compreende cerca de 0,5 mg a cerca de 250 mg, 100 mg e cerca de 250 mg, cerca de 0,5 mg a cerca de 500 mg, cerca de 100 mg a cerca de 500 mg, cerca de 0,5 mg a cerca de 1 g, ou cerca de 100 mg a cerca de 1 g de EPA, DHA, ou uma combinação dos mesmos por forma de dosagem.
[139] A administração das composições ou formas de dosagem da presente invenção pode ser conseguida utilizando vários regimes. Por exemplo, em algumas formas de realização, a administração ocorre diariamente em dias consecutivos, ou em alternativa, ocorre em dias alternados (bi-diária) . A administração pode ocorrer em um ou mais dias.
[140] A administração das composições e formas de dosagem pode ser combinada com outros regimes utilizados para o tratamento da condição. Por exemplo, o método da presente invenção pode ser combinado com regimes de dieta (por exemplo, as dietas baixas em carboidratos, dietas ricas em proteínas, dietas ricas em fibra, etc.), regimes de exercício, regimes de perda de peso, regimes de cessação do tabagismo ou suas combinações. O método da presente invenção também pode ser utilizado em combinação com outros
72/131 produtos farmacêuticos para o tratamento da condição. As composições ou formas de dosagem da presente invenção podem ser administradas antes ou depois de outros regimes ou produtos farmacêuticos.
[141] A invenção é direcionada a kits ou embalagens contendo uma ou mais unidades de uma composição da invenção. Kits ou pacotes podem incluir unidades de um produto alimentar, composição farmacêutica, cosmética, ou composição industrial que compreende o microrganismo, biomassa ou óleo microbiano da invenção ou suas combinações. Kits ou embalagens também podem incluir um aditivo que compreende o microrganismo, biomassa ou óleo microbiano da invenção, ou combinações dos mesmos para a preparação de um alimento, cosmético, composição farmacêutica ou composição industrial.
[142] Em algumas formas de realização, o kit ou pacote contém uma ou mais unidades de uma composição farmacêutica a ser administrada de acordo com os métodos da presente invenção. 0 kit ou pacote pode conter uma unidade de dosagem, ou mais do que uma unidade de dosagem (isto é, múltiplas unidades de dosagem). Se várias unidades de dosagem estão presentes no kit ou pacote, as várias unidades de dosagem podem, opcionalmente, ser adaptadas para administração sequencial.
[143] Os kits da presente invenção podem, opcionalmente, conter instruções associadas com as unidades ou formas de dosagem dos kits. Tais instruções podem estar em uma forma prescrita por uma agência governamental que regulamenta a fabricação, uso ou venda de produtos farmacêuticos, qual aviso reflete aprovação pela agência de fabricação, uso ou
73/131 venda para administração a seres humanos no tratamento de uma doença ou disordem. As instruções podem ser em qualquer forma que transmita informação sobre a utilização das unidades de formas de dosagem ou do kit de acordo com os métodos da invenção. Por exemplo, as instruções podem estar na forma de produtos impressos ou sob a forma de um dispositivo de suporte pré-gravado.
[144] No decurso da análise de um paciente, um profissional médico pode determinar que a administração de um dos métodos da presente invenção é apropriada para o paciente, ou o médico pode determinar que o estado do doente pode ser melhorado pela administração de um dos métodos da presente invenção. Antes de prescrever qualquer regime, o médico pode aconselhar o paciente, por exemplo, sobre os vários riscos e benefícios associados com o regime 0 paciente pode ser fornecido de divulgação completa de todos os riscos conhecidos e suspeitos associados com o regime. Tal orientação pode ser fornecida oralmente, bem como na forma escrita. Em algumas formas de realização, o médico pode fornecer ao paciente materiais de literatura sobre o regime, tal como informação de produto, materiais didáticos, e outros semelhantes.
[145] A presente invenção é direcionada a métodos para a educação do consumidor sobre os métodos de tratamento, compreendendo o método a distribuição das formas de dosagem com informação ao consumidor no ponto de venda. Em algumas formas de realização, a distribuição irá ocorrer em um ponto de venda com um farmacêutico ou prestador de cuidados de saúde.
[146] 0 termo informação do consumidor pode incluir,
74/131 mas não está limitado a, um texto no idioma Inglês, texto no idioma não-Inglês, imagem visual, gráfico, gravação de telefone, website, e acesso a um representante de serviço ao cliente ao vivo. Em algumas forma de realizaçãos, a informação do consumidor irá fornecer instruções de utilização das formas de dosagem de acordo com os métodos da presente invenção, uso apropriado para a idade, indicação, contra-indicações, dosagem adequada, avisos, número de telefone ou endereço do website. Em algumas formas de realização, o método compreende ainda fornecer informação profissional para as pessoas competentes em condições de responder a perguntas do consumidor em relação ao uso dos esquemas descritos de acordo com os métodos da presente invenção. 0 termo informação profissional inclui mas não está limitado a, informações relativas ao regime quando administrada de acordo com os métodos da presente invenção que está concebido para permitir que um profissional de saúde responda a perguntas do cliente.
[147] A profissional médico, inclui, por exemplo, um médico, assistente médico, enfermeira, auxiliar de enfermagem, farmacêutico e representante de atendimento ao cliente.
[148] Tendo descrito geralmente este invento, uma compreensão adicional pode ser obtida por referência aos exemplos aqui fornecidos. Estes exemplos são para fins de ilustração apenas e não se destinam a ser limitantes.
EXEMPLO 1
ISOLAMENTO DE MICRORGANISMOS [149] As amostras foram coletadas a partir de habitats intertidais durante a maré baixa, incluindo baias e
75/131 estuários ao longo da costa oeste da América do Norte (Califórnia, Oregon e Washington) e Havai. Água, sedimentos material vegetal vivo e restos de plantas/animais em decomposição foram colocados em tubos estéreis de 50 mL. Porções de cada uma das amostras, juntamente com a água, foram espalhadas em placas de agar sólidos de meios de isolamento. Meio de isolamento consistiu de: 500 mL de água do mar artificial, 500 mL de água destilada, 1 g de glicose 1 g de glicerol, 13 g de agar, 1 g de glutamato, 0,5 g de extrato de levedura, 0,5 g de hidrolisado de caseina, 1 mL de uma solução de vitaminas (100 mg/L de tiamina, 0,5 mg/L de biotina, 0,5 mg de B12), 1 mL de uma solução mineral (metais PII, contendo por litro: 6,0 g de FeC136H2O, 6,84 g de H3BO3, 0,86 g de MnCl24H2O, 0,06 g de ZnCl2, 0,026 g de CoC126H20, 0,052 g de NiSO4H2O, 0,002 g de CuSO45H2O e 0,005 g de Na2Mo042H20) , e 500 mg de cada um de penicilina G e sulfato de estreptomicina. As placas de Agar foram incubadas no escuro a 20-25°C. Após 2-4 dias, as placas de Agar foram examinadas sob ampliação, e colônias de células foram escolhidas com um palito estéril e novamente riscadas para uma nova placa de meio. As células foram semeadas em meio fresco repetidamente até que os organismos contaminados foram removidos. Dois dos microrganismos isolados foram depositados na instituição ATCC sob os N— PTA-10212 e PTA-10208.
CARACTERÍSTICAS TAXONÔMICAS DO MICRORGANISMO ISOLADO DEPOSITADO NA INSTITUIÇÃO ATCC SOB O N° PTA-10212 [150] A cultura do microrganismo isolado depositado na instituição ATCC sob o N£ de acesso PTA-10212 (PTA-10212) apareceu como colônias brancas, molhadas, manchadas sem
76/131 sori visível isolado.
[151] PTA-10212 foi cultivado em FFM sólido e líquido, MV sólido, KMV suspensão (1%), caldo de MV, e caldo de MH para ainda analisar as características de crescimento. PTA10212 foi observada crescer rapidamente em KMV e MH. Vejase, por exemplo, Porter D., 1989. Phylum Labyrinthulomycota Em Margulis, L., Corliss, J.O., Melkonian, M., Chapman, D.J (Eds.) Handbook of Protoctista, Jones e Bartlett, Boston, páginas 388-398 (KMV); Honda et al. , Mycol. Res. 702:439448 (1998) (MH); e Patente dos EUA N2 5.130.242 (FFM), cada uma das quais é aqui incorporada por referência na sua totalidade.
[152] As seguintes observações foram feitas após o crescimento de PTA-10212 ao longo de vários dias em meio de FFM sólido, após 72 horas de crescimento em meio de KMV e caldo de MH. Esporângios não foram aglutinados em/sobre quaisquer meios e eram muito pequenos (5-10 pm) . PTA-10212 não demonstrou as tétrades copiosas características de padrões de divagem de Schizochytrium. Células amebóides apareceram cerca de 24 horas após a transferência para meios sólidos frescos. Estas células amebóides se foram depois de alguns dias e não foram evidentes em meio líquido ou suspensão. Ao contrário de, Aurantiochytrium, descrito por Yokoyama, R. et al. , Mycoscience 4 8(6):329-341 (2007), como tendo a aparência de pequenos grãos de areia no fundo do balão, quando cultivada em meio líquido, PTA- 10212 não se deposita no fundo do frasco, mas é suspensa em ambos meios líquidos de KMV e MH. Os esporos não foram tão densos como típico de Schizochytrium ou Oligochytrium, que também têm redes robustas ectoplásmicas que foram ausentes no PTA
77/131
10212. Enquanto a maioria das espécies sofrem divagem vegetativa da esporângios pequenos ou células de assimilação pela divisão de um esporângio maior ao longo de várias horas, PTA-10212 formaram células assimilativas alongadas em forma de halteres, que então formaram um istmo fino que se separaram como as extremidades de halteres separados. As células resultantes parecem ser pequenas células de assimilação. Transformação direta de uma célula amebóide em uma célula de assimilação em forma de haltere não foi observada. Zoósporos biflagelados típicos foram observados nadando, mas foram relativamente raros. PTA10212 foi não-prolífico, dividindo-se por divagem vegetativa. Liberação direta de zoósporos não foi observada embora zoósporos foram observados nadando. Células vegetativas foram muito pequenas (2 pm a 5 pm) .
[153] PTA-10212 foi ainda examinada por meio da técnica de fluxo contínuo, em que as lâminas microscópicas foram preparadas pela suspensão de uma pequena porção de uma colônia de Agar crescida em uma gota de metade da concentração de água do mar. Com esta técnica, esporângios primários foram observados como sendo globosos e de aproximadamente 10 pm de diâmetro. As paredes eram muito finas e restos não foram observados quando a divisão binária de protoplasto foi iniciada. Divisão binária repetida produziu 8-16 esporângios secundários menores (4-5 pm de diâmetro). Os esporângios secundários permaneceram em repouso por várias horas antes de voltar a lançar um protoplasto amorfo. O protoplastos amorfos divididos por aperto e puxão, inicialmente produz fases intermediárias típicas em forma de haltere e, finalmente resulta em 4-8
78/131 pequenos corpos globosos de 2,5-2,8 pm de diâmetro. 0 último descansou por alguns minutos até 1-2 horas, em seguida, mudou de forma (alongadas) e se transformou em zoósporos biflageladas, 2,3-2,5 x 3,7-3,9 pm. Os zoósporos eram abundantes e puderam ser medidos com precisão quando eles vieram a descansar. Os zoósporos então se arredondaram e começaram um novo ciclo de desenvolvimento. Os zoósporos eram maiores do que Sicyoidochytrium minutum e menores do que Ulkenia visurgensis.
[154] PTA-10212 foi adicionalmente caracterizado com base na similaridade do seu gene RNAr 18s para o de espécies conhecidas. 0 ADN genômico foi preparado a partir de PTA-10212 por processos normalizados. Veja-se, por exemplo, Sambrook, J. e Russell D. 2001 Molecular cloning: A Laboratory Manual, 3- edition. Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, em Nova York. Resumidamente: (1) 500 pL de células foram centrifugados a partir de cultura semi-log. As células foram novamente centrifugadas e todos os vestígios de líquido foram removidos do pélete de células com uma ponta de pequeno calibre; (2) péletes foram ressuspensos com 200 pL tampão de lise (20 mM Tris pH 8,0, 125 pg/mL de Proteinase, 50 mM de NaCl, 10 mM EDTA pH 8,0, 0,5% de SDS) ; (3) as células foram lisadas a 50°C durante 1 hora; (4) a mistura de lise foi pipetada em tubos gel de bloqueio de fase (Eppendorf PLG) de 2 mL; (5) volume igual de P:C:I foi adicionado e deixado misturar durante 1,5 horas; (6) os tubos foram centrifugados a 12.000 x g durante 5 minutos; (7) a fase aquosa foi removida de cima do gel dentro do tubo de PLG e um volume igual de clorofórmio foi adicionado à fase aquosa
79/131 e misturada durante 30 minutos; (8) os tubos foram centrifugados a 14.000 x g durante cerca de 5 minutos; (9) a camada superior (fase aquosa) foi pipetada para longe do clorofórmio e colocada em um novo tubo; (10) 0,1 volumes de NaOAc 3M foram adicionados e misturados (invertidos várias vezes); (11) 2 volumes de EtOH a 100% foram adicionados e misturados (invertidos várias vezes) com precipitante ADN genômico formando nesta fase; (12) os tubos foram centrifugados a 4°C em uma microcentrifuga a 14000 x g durante cerca de 15 minutos; (13) o líquido foi vertido suavemente com o ADN genômico permanecendo no fundo do tubo; (14) o sedimento foi lavado com 0,5 mL de EtOH a 70%; (15) os tubos foram centrifugados a 4 °C em uma microcentrifuga a 14000 x g durante cerca de 5 minutos; (16) o EtOH foi vertido com cuidado e o sedimento de DNA genômico foi seco; e (17) um volume apropriado de H2O e RNase foi adicionado diretamente ao sedimento de ADN genômico. A amplificação por POR do gene RNAr 18s foi realizada com iniciadores previamente descritos (Honda et al., J. Euk. Micro. 46(6) :637-647 (1999) . As condições de POR com molde de DNA cromossômico foram como se segue: 0,2 μΜ de dNTP, 0,1 μΜ de cada iniciador, 8% de DMSO, 200 ng de ADN cromossômico, 2,5 U de Herculase® II de fusão de ADN Polimerase (Stratagene), e tampão Herculase® (Stratagene) em um volume total de 50 pm. O protocolo de PCR incluiu os seguintes passos: (1) 95°C durante 2 minutos, (2) 95°C durante 35 segundos, (3) 55°C durante 35 segundos, (4) 72°C durante 1 minuto e 30 segundos; (5) repita os passos 2-4 por 30 ciclos; (6) 72°C durante 5 minutos; e (7) manter a 4°C.
[155] A amplificação por PCR produziu um produto de ADN
80/131 distinto com o tamanho esperado utilizando o modelo cromossômico descrito acima. O produto de PCR foi clonado no vetor pJET1,2/blunt (Fermentas) de acordo com as instruções do fabricante, e a sequência de inserção foi determinada utilizando padrão primário fornecido.
[156] A análise filogenética coloca PTA-10212 dentro da linhagem que inclui Thraustochytrium pachydermum e Thraustochytrium aggregation com apoio moderado. Os esporângios de T. pachydermum têm paredes celulares muito espessas. T. aggregatum formam aglomerados de sori claramente visíveis que são opacos. PTA-10212 não mostra nenhuma destas características. A presença de várias células amebóides foi descrito em outros táxons, tais como Ulkenia, T. gaertnerium, A. limiacinum, e S. mangrove!; no entanto, as descrições associadas com esses táxons diferem das características observadas do isolado. Além disso, PTA10212 não mostrou afinidade filogenética para qualquer um destes táxons.
[157] A Tabela 3 mostra uma comparação da sequência de ARNr 18s do microrganismo depositado na instituição ATCC sob o N— de acesso PTA-10212 para as sequências de ADN na base de dados electrónica do National Center for Biotechnology Information (Centro Nacional para Informação de Biotecnologia) (NCBI). A porcentagem de identidade foi determinada usando dois cálculos diferentes. Cálculo #1 leva em consideração todas as lacunas que ocorrem nas sequências, quer a partir de regiões não-homólogas ou da sequência parcial (configurações padrão AlignX-VectorNTI). Cálculo #2 não inclui penalidades calculadas para lacunas (AlignX-VectorNTI identidade de ajuste da matriz).
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Table 3: Comparação da Sequência de RNAr 18s
dhraustüchytridíi % Identidade % Identidade
Cálculo #1 Calcule #2
85% 93%
| nraosííwAyírfw»» (p) | 83% . 92%...............
82% 92% '“j
1 1 82% ™92% Ί
80% 92%
a «wwl | 80%· 91%J
I sp. ^TCC 20ÍSÍ | 80% * 90%............ |
1 JftreMtíocÀytfríww _____________ | 79% 90% 1
(p): indica sequencia parcial.
[158] Como mostrado na Tabela 3, verificou-se que, em termos de % de identidade, a sequência de genes RNAr 18s (SEQ ID NO:1) do microrganismo depositado na instituição ATCC sob ο N° de acesso PTA-10212 está relacionada, embora não idêntica, a sequências de genes RNAr 18s disponível no banco de dados do NCBI. É geralmente reconhecido que os organismos podem ter sequências de genes RNAr 18s estreitamente relacionadas enquanto pertencente a um diferente gênero ou espécie.
[159] Com base na caracterização acima, o microrganismo isolado depositado na instituição ATCC sob N2 de acesso PTA-10212 é considerado representar uma nova espécie de Thraustochytrium e, por conseguinte, é também designado como Thraustochytrium sp. ATCC PTA-10212.
CARACTERÍSTICAS TAXONÔMICAS DO MICRORGANISMO ISOLADO DEPOSITADO NA INSTITUIÇÃO ATCC SOB N° DE ACESSO PTA-10208 [160] O microrganismo depositado na instituição ATCC sob o N2 de acesso PTA-10208 (PTA-10208) foi identificado como sendo um sub-isolado (uma célula individual isolada a partir de uma cultura e mantida como uma nova cultura separada e distinta) do microrganismo depositado na
82/131 instituição ATCC sob o N2 de acesso PTA-9695 (PTA-9695), descritos no Pedido dos EUA N2 12/407.687 e PCT/US2009/001720, cada uma das quais é aqui incorporado por referência na sua totalidade.
[161] PTA-10208 divide partes características taxonômicas com PTA-9695. PTA-9695 foi encontrado ter zoósporos biflagelados na descarga que nadam ativamente longe do esporângio maduro, restos de parede que eram claramente visíveis (em contraste de fase) após a liberação de esporos. Os esporângios PTA-9695 mediram de 12,5 pm a 25 pm de diâmetro, e os zoósporos eram de 2,5 pm a 2,8 pm x 4,5 pm a 4,8 pm em tamanho. Haviam de 8 a 24 esporos por esporângio PTA-9695 individual. Os zoósporos PTA-9695 estabelecidos ampliaram e rapidamente submeteram-se a divisões binárias levando a tétrades, octades e, finalmente para os conjuntos de esporângios. Formação de tétrades começou em um estágio muito precoce antes da maturidade do esporângio. Estas características estão de acordo com o gênero Schizochytrium. Em termos de % de identidade, a sequência de genes de RNAr 18s de PTA-9695 (SEQ ID NO:2), que é partilhada por PTA-10208, foi encontrada ser estreitamente relacionada, embora não idêntica, à sequência de gene ARNr 18s de T. aggregation fornecida em Honda, D. et al. , J. Euk. Micro. 46(6) : 637-647 (1999) . A sequência de ARNr 18s publicada para Thraustochytrium aggregatum é uma sequência parcial, com uma diferença de aproximadamente 71 nucleótidos de ADN no meio da sequência. PTA-9695 é acreditado representar uma nova espécie de Schizochytrium. Como tal, o PTA-10208 sub-isolado também é designado como Schizochytrium sp. ATCC PTA-10208.
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EXEMPLO 2
CARACTERÍSTICAS DE CRESCIMENTO DO MICRORGANISMO ISOLADO DEPOSITADO NA INSTITUIÇÃO ATCC SOB O N° DE ACESSO PTA-10212 [162] O microrganismo isolado depositado na instituição ATCC sob o N— de acesso PTA-10212 foi examinado para características de crescimento em corridas individuais de fermentação, como descrito abaixo. Meios típicos e as condições de cultura são mostrados na Tabela 1.
[163] Em culturas de carbono (glicerol) e alimentadas com nitrogênio com 1.000 ppm Cl~ a 22,5°C, com 20% de oxigênio dissolvido, pH 7,3, PTA-10212 produziu um peso seco de 26,2 g/L após 138 horas de cultura em um volume de 10 L de fermentador. O rendimento de lipidios foi de 7,9 g L; o rendimento de ômega-3 foi de 5,3 g/L; o rendimento de EPA foi de 3,3 g/L; e o rendimento de DHA foi de 1,8 g/L. O teor de ácidos graxos foi de 30,3% por peso; o teor de EPA foi de 41,4% de ésteres metílicos de ácidos graxos (FAME); e o teor de DHA foi de 26,2% de FAME. A produtividade de lipidios foi 1,38 g/L/dia, e a produtividade de ômega-3 foi de 0,92 g/L/dia, sob estas condições, com 0,57 g/L/dia de produtividade de EPA e 0,31 g/L/dia de produtividade de DHA [164] Em culturas de carbono (glicerol) e alimentadas com nitrogênio com 1.000 ppm de Cl~ a 22,5°C, com 20% de oxigênio dissolvido, pH 7,3, PTA-10212 produziu um peso seco de 38,4 g/L após 189 horas de cultura em um volume de 10 L de fermentador. O rendimento de lipídio foi de 18 g/L; o rendimento de ômega-3 foi de 12 g/L; o rendimento da EPA foi de 5 g/L; e o rendimento de DHA foi de 6,8 g/L. O teor de ácidos graxos foi de 45%, em peso; o teor de EPA foi de 2 7,8% de FAME; e o teor de DHA foi de 37,9% de FAME. A
84/131 produtividade de lipidios foi de 2,3 g/L/dia, e a produtividade de ômega-3 foi de 1,5 g/L/dia, sob estas condições, com 0,63 g/L/dia de produtividade de EPA e 0,86 g/L/dia de produtividade de DHA.
[165] Em culturas de carbono (glicerol) e alimentadas com nitrogênio com 1.000 ppm de Cl~ a 22,5°C, com 20% de oxigênio dissolvido, pH 6,8-7,7, PTA-10212 produziu um peso seco de 13 g/L após 189 horas de cultura em um volume de 10 L de fermentador. O rendimento de lipidios foi de 5,6 g/L; o rendimento de ômega-3 foi de 3,5 g/L; o rendimento da EPA foi de 1,55 g/L; e o rendimento de DHA foi de 1,9 g/L. O teor e ácidos graxos foi de 38%, em peso; o teor de EPA foi de 2 9,5% de FAME; e o teor de DHA foi de 36% de FAME. A produtividade de lipidios foi de 0,67 g/L/dia, e a produtividade de ômega-3 foi de 0,4 g/L/dia, sob estas condições, com 0,20 g/L/dia de produtividade de EPA e 0,24 g/L/dia de produtividade de DHA.
[166] Em culturas de carbono (glicerol) e alimentadas com nitrogênio com 1.000 ppm de Cl~ a 22,5-28,5°C com 20% de oxigênio dissolvido, pH 6,6-7,2, PTA-10212 produziu um peso seco de 36,7 g/L - 48,7 g/L após 191 horas de cultura em um volume de 10 L de fermentador. O rendimento de lipidios foi de 15,2 g/L - 25,3 g/L, o rendimento de ômega3 foi de 9,3 g/L - 13,8 g/L, o rendimento de EPA foi de 2,5 g/L - 3,3 g/L, e o rendimento de DHA foi de 5,8 g/L - 11 g/L. O teor de ácidos graxos foi de 42,4% - 53% por peso, o teor de EPA foi de 9, 8% - 22% de FAME e o teor de DHA foi de 38,1% - 43,6% de FAME. A produtividade de lipidios foi de 1 0,9 g/L/dia - 3,2 g/L/dia, e a produtividade de ômega3 foi de 1,2 g/L/dia - 1,7 g/L/dia, sob estas condições,
85/131 com 0,31 g/L/dia - 0,41 g/L/dia de produtividade de EPA e 0,72 g/L/dia - 1,4 g de L/dia de produtividade de DHA.
CARACTERÍSTICAS DE CRESCIMENTO DO MICRORGANISMO ISOLADO DEPOSITADO NA INSTITUIÇÃO ATCC SOB O N° DE ACESSO PTA-10208 [167] 0 microrganismo isolado depositado na instituição ATCC sob o N2 de acesso PTA-10208 foi examinado para características de crescimento em corridas individuais de fermentação, como descrito abaixo. Meios típicos e as condições de cultura são mostrados na Tabela 2.
[168] Em culturas de carbono (glicose) e alimentados com nitrogênio com 1.000 ppm de Cl~ a 22,5°C em pH 7,0 com 20% de oxigênio dissolvido durante a alimentação de nitrogênio e 10% de oxigênio dissolvido subsequentemente, PTA-10208 produziu um peso seco de 95 g/L após 200 horas de cultura em um volume de 10 L de fermentador. O rendimento de lipídios foi de 53,7 g/L; o rendimento de ômega-3 foi de 37 g/L; o rendimento da EPA foi de 14,3 g/L; e o rendimento de DHA foi de 21 g/L. O teor de ácidos graxos foi de 57% por peso; o teor de EPA foi de 27,7% de FAME; e o teor de DHA foi de 39,1% de FAME. A produtividade de lipídio foi de 6,4 g/L/dia, e a produtividade de ômega-3 foi de 4,4 g/L/dia, sob estas condições, com 1,7 g/L/dia de produtividade de EPA e 2,5 g/L/dia de produtividade de DHA.
[169] Em culturas de carbono (glicose) e alimentadas com nitrogênio com 1.000 ppm de Cl~ a 22,5°C em pH 7,5 com 20% de oxigênio dissolvido durante a alimentação de nitrogênio e 10% de oxigênio dissolvido subsequentemente, PTA-10208 produziu um peso seco de 56 g/L após 139 horas de cultura em um volume de 10 L de fermentador. O rendimento de lipídios foi de 53 g/L; o rendimento de ômega-3 foi de
86/131 g de L; o rendimento da EPA foi de 1 1,5 g/L; e o rendimento de DHA foi de 22 g/L. 0 teor de ácidos graxos foi de 58% por peso; o teor de EPA foi de 21,7% de FAME; e o teor de DHA foi de 41,7% de FAME. A produtividade de lipidio foi de 9,2 g/L/dia, e a produtividade de ômega-3 foi de 5,9 g/L/dia, sob estas condições, com 2 g/L/dia de produtividade de EPA e 3,8 g/L/dia de produtividade de DHA.
[170] Em culturas de carbono (glicose) e alimentadas com nitrogênio com 1.000 ppm de Cl~ a 22,5°C em pH 7,0 com 20% de oxigênio dissolvido durante a alimentação de nitrogênio e 10% de oxigênio dissolvido subsequentemente, PTA-10208 produziu urn peso seco de 93,8 g/L após 167 horas de cultura em um volume de 2000 L de fermentador. O rendimento de lipidios foi de 47,2 g/L; o rendimento de ômega-3 foi de 33,1 g/L; o rendimento da EPA foi de 10,5 g/L; e o rendimento de DHA foi de 20,4 g/L. O teor de ácidos graxos foi de 50,6% por peso; o teor de EPA foi de 23% de FAME; e o teor de DHA foi de 42,6% de FAME. A produtividade de lipidio foi de 6,8 g/L/dia, e a produtividade de ômega-3 foi de 4,7 g/L/dia, sob estas condições, com 1,5 g/L/dia de produtividade de EPA e 2,9 g/L/dia de produtividade de DHA.
[171] Em culturas de carbono (glicose) e alimentadas com nitrogênio com 1.000 ppm de Cl~ a 22,5°C em pH 7,0 com 20% de oxigênio dissolvido durante a alimentação de nitrogênio e 10% de oxigênio dissolvido subsequentemente, PTA-10208 produziu um peso seco de 105 g/L após 168 horas de cultura em um volume de 2000 L de fermentador. O rendimento de lipidios foi de 46,4 g/L; o rendimento de ômega-3 foi de 33 g/L; o rendimento da EPA foi de 10,7 g/L;
87/131 e o rendimento de DHA foi de 20,3 g/L. O teor de ácidos graxos foi de 43,9% por peso; o teor de EPA foi de 24% de FAME; e o teor de DHA foi de 43,7% de FAME. A produtividade de lipidio foi de 6,6 g/L/dia, e a produtividade de ômega-3 foi de 4,7 g/L/dia, sob estas condições, com 1 0,5 g/L/dia de produtividade de EPA e 2,9 g/L/dia de produtividade de DHA.
[172] Em culturas de carbono (glicose) e alimentadas com nitrogênio com 1.000 ppm de Cl~ a 22,5°C em pH 7,0 com 20% de oxigênio dissolvido durante a alimentação de nitrogênio e 10% de oxigênio dissolvido subsequentemente, PTA-10208 produziu urn peso seco de 64,8 g/L após 168 horas de cultura em um volume de 2000 L de fermentador. O rendimento de lipidios foi de 38,7 g/L; o rendimento de ômega-3 foi de 29,9 g/L; o rendimento da EPA foi de 8,5 g/L; e o rendimento de DHA foi de 16,7 g/L. O teor de ácidos graxos foi de 59, 6% por peso; o teor de EPA foi de 23% de FAME; e o teor de DHA foi de 42,3% de FAME. A produtividade de lipidios foi de 5,53 g/L/dia, e a produtividade de ômega-3 foi de 3,8 g/L/dia, sob estas condições, com 1,2 g/L/dia de produtividade de EPA e 2,3 g/L/dia de produtividade de DHA.
EXEMPLO 3
PERFIL DE ÁCIDOS GRAXOS DE ESTIRPES DE MICRORGANISMO ATCC PTA-10208 E PTA-10212 [173] Quatro amostras de biomassa (Amostra PTA-10208 n£ 1; Amostra PTA-10208 n£ 2; Amostra PTA-10212 n£ 1, e Amostra PTA-10212 n£ 2) foram analisadas quanto ao teor total de óleo bruto por meio de solventes, as classes de lipidios foram determinados por cromatografia liquida de
88/131 alta eficiência/detecção por espalhamento de luz evaporative (CLAE/ELSD) , triacilglicerol (TAG) foram analisados por CLAE/espectrometria de massa (CLAE/EM), e os perfis de ácido graxo (FA) foram determinados por cromatografia em fase gasosa com detecção de ionização de chama (CG-DIC). 0 teor de lipidios em bruto de cada biomassa seca por congelamento foi determinada através de trituração com solvente hexano e comparado com a soma dos FAME (mg/g) gerada por transesterificação direta, e os ésteres metilicos de ácidos graxos resultantes (FAME) foram quantificados por análise de CG/DIC. Ácidos graxos no lipidio bruto extraído também foram quantificados por transesterificação e quantificados usando análise de CG/DIC do FAME resultante. A porcentagem em peso de todos os lipidios neutros (NL) e de ácidos graxos livres (FFA) foram determinadas no lipidio bruto extraído utilizando CLAE de fase normal com ELSD e identificação de ionização química a pressão atmosférica em EM (APCI-MS). 0 método separa e quantifica ésteres de esteróis (SE), TAG, ácidos graxos livres (AGL), 1,3-diacilgliceróis (1,3-DAG), esteróis, 1,2diacilgliceróis (1,2-DAG) e monoacilgliceróis (MAG). Os resultados são apresentados nas Tabelas 4 e 5, abaixo.
[174] TAG e fosfolipídios (PL) foram isolados dos óleos brutos extraídos das quatro amostras de biomassa (Amostra PTA-10208 n£ 1; Amostra PTA-10208 n£ 2; Amostra PTA-10212 n£ 1, e Amostra PTA-10212 n£ 2) . TAG foi isolado por cromatografia flash a baixa pressão e o PL foi isolado utilizando extração em fase sólida (EFS). A identidade de cada fração isolada foi confirmada por cromatografia em camada fina (CCF) . Os perfis de ácidos graxos de TAG
89/131 isolados e frações de PL foram determinados após a transesterificação direta utilizando CG-DIC como FAME. Os resultados são apresentados nas Tabelas 6 e 7 a seguir.
[175] Os perfis de teor de óleo bruto e de ácidos graxos totais de classes de lipidios isoladas também foram determinados para duas amostras de biomassa de microrganismos ATCC PTA-10212 (Amostra PTA-10212 n£ 3 e Amostra PTA-10212 n£ 4) . 0 óleo bruto foi obtido a partir de cada amostra por extração com hexano, e as classes de lipidios individuais foram isoladas utilizando cromatografia flash de baixa pressão. Os perfis de ácidos graxos da biomassa, o óleo bruto e as frações isoladas foram determinadas utilizando CG-DIC como FAME. Os resultados são apresentados nas Tabelas 8-11 abaixo.
[176] As classes de lipidios individuais foram isoladas a partir de uma amostra de óleo bruto de microrganismos ATCC PTA-10212 (Amostra PTA-10212 n£ 5) previamente extraído utilizando o processo FRIOLEX®, e os perfis de ácidos graxos de cada classe foram determinados por CG-DIC como FAME. Os resultados são apresentados nas Tabelas 12 e 13 abaixo.
[177] As classes lipídicas individuais foram isoladas a partir de uma amostra de óleo bruto de microrganismo ATCC PTA-10208 (Amostra PTA-10208 n£ 3) utlizando CLAE normal com ELSD e identificação de APCI-MS.
PROCEDIMENTOS EXPERIMENTAIS [178] Extração de óleo bruto - óleo bruto foi extraído a partir de amostras de biomassa liofilizada utilizando moagem de solvente. Por exemplo, cerca de 3 gramas de biomassa foram pesados dentro de um tubo Sueco. Três
90/131 rolamentos de esferas e 30 mL de hexano foram adicionados ao tubo Sueco, que foi selado com uma rolha de neoprene e colocado em um agitador durante 2 horas. A suspensão resultante foi filtrada utilizando um funil de Buchner e papel de filtro Whatman. O líquido filtrado foi recolhido, o solvente foi removido sob vácuo, e a quantidade de lipídios em bruto restante determinada por gravimetria.
[179] Análise de ácidos graxos - As amostras de biomassa, lipídio bruto extraído e classes de lipídios isoladas foram analisadas quanto à composição de ácidos graxos como FAME. Resumidamente, biomassa liofilizada e as classes lipídicas isoladas foram pesadas diretamente em tubos de ensaio de tampa de rosca, enquanto que as amostras de óleo bruto foram dissolvidas em hexano para dar uma concentração de cerca de 2 mg/mL. Tolueno, contendo padrão interno, e 1,5 N de HC1 em metanol, foram adicionados a cada tubo. Os tubos foram agitados e, em seguida tapados e aquecidos a 100°C durante 2 horas. Os tubos foram deixados arrefecer, e NaCl saturado em água foi adicionado. Os tubos foram novamente agitados e centrifugados para permitir que as camadas se separem. Uma porção da camada orgânica foi em seguida colocada em um frasco de CG e analisado por CG-DIC. FAME foi quantificada utilizando uma curva de calibração de 3 pontos gerados utilizando padrão de referência Nu-CheckPrep GLC (NuCheck, Elysian, MN). Os ácidos graxos presentes no extrato foram expressos em mg/g e como uma porcentagem em peso. O teor de gordura das amostras foi estimado assumindo resposta igual ao padrão interno, quando analisadas por CG-DIC.
Método CLAE/ELSD/EM 91/131
Instrumento
Coluna
Fase móvel
CLAE Agilent 1100, ELSD Alltech 3300, EM
Agilent 1100
Phenomenex Luna Silica, 250 x 4,6 mm, 5 pm tamanho de partícula c/ pré-coluna
A - 99,5% de Hexano (Omnisolv)
0,4% de álcool isopropílico (OmniSolv)
0,1% de ácido acético
B - 99,9% de etanol (OmniSolv, 95:5 etanol: IPA)
0,1% de ácido acético.
Gradiente
Temps, íkííi. % A 1
0 tõô G
5 iõõ 6' 1
Í5 20 , ........ 0 ZJiQ íüô 1
25 0 ' ÍÕG.....1
26 o õ
35 100 G |
Temp, da Coluna 302C
Taxa de fluxo 1,5 mL/min
Volume de Injeção 5 pL
Detecção ELSD Temperatura de 35°C, fluxo de gás de 1,2 L/min
EM Faixa de Massa 200 - 1200, Fragmentador a 225 V Temperatura de secagem de gás de 350 °C Temperature do Vaporizer 325°C Tensão Capilar 3500 V Corrente de Corona 10 μΑ [180] Extração em Fase Sólida - frações PL foram separadas do lipídio em bruto por extração em fase sólida (EFS) com 2 g de aminopropil (cartuchos Biotage, Uppsala,
92/131
Suécia) colocados em um aparelho de Vac Elut (Varian Inc., Paio Alto, EUA) . 0 cartucho foi condicionado com 15 mL de hexano, e ~ 60 mg de cada amostra foram dissolvidos em 1 mL de CHC13 e aplicado ao cartucho. A coluna foi lavada com 15 mL de 2:1 de CHClszálcool isosopropil para eluir todos os lipidios neutros, que foram descartados. Os ácidos graxos foram então eluidos com 15 mL de ácido acético 2% (HOAc) em éter, que foram descartados. A porção de PL foi eluida com 15 mL de 6:1 de metanol:clorofórmio, o qual foi recolhido, seco sob nitrogênio, e pesado.
[181] Cromatografia flash - cromatografia flash foi utilizada para separar as classes de lipidios presentes no óleo bruto. Aproximadamente 200 mg de óleo bruto dissolvido em hexano foram injetados na cabeça da coluna. O sistema de cromatografia utilizou Silica gel 60 (Merck Chemical, Gibbstown, NJ) com uma fase móvel composta de éter de petróleo e acetato de etila a 5 mL/min (Tabelas 6-7) ou 3 mL/min (Tabelas 8-13). Um gradiente por passos foi utilizado para eluir seletivamente cada classe de lipidios da coluna. O gradiente de fase móvel iniciou a partir de 100% de éter de petróleo e terminou com 50% de acetato de etila. As frações foram recolhidas em tubos de ensaio de 10 mL, utilizando uma grande fração de leito coletor Gilson FC 204 (Gilson, Inc., Middleton, WI). Cada tubo foi analisado por cromatografia em camada fina (CCF) e os tubos que contêm as classes de lipidios individuais (como julgado por pontos individuais na placa de CCF com o fator de retenção esperado (Rf)) foram reunidos, concentrados até à secura e pesados. O teor total de fração foi então determinado por gravimetria.
93/131 [182] Análise de CCF - cromatografia de camada fina foi realizado sobre placas de gel de silica. As placas foram eluidas utilizando um sistema de solvente constituído por éter de petróleo:éter etílico:ácido acético (80:20:1) e foram visualizadas com vapor de iodo. Os valores de Rf de cada local foram então comparados com os valores da literatura reportados para cada classe de lipídios.
[183] Análise de TAG e frações PL - As frações de TAG e PL isoladas foram analisadas para a composição de ácidos graxos como ésteres metílicos de ácidos graxos (FAME). As frações TAG foram dissolvidas em hexano para dar uma concentração de aproximadamente 1-2 mg/mL. 1 mL de alíquotas das soluções foram concentradas até à secura sob nitrogênio. Tolueno, contendo padrão interno, e 1,5 N de HC1 em metanol, foram adicionados a cada tubo. Os tubos foram agitados e, em seguida tapados e aquecidos a 100°C durante 2 horas, padrão interno e HC1 metanol foram adicionados diretamente aos tubos contendo a fração de PL e aquecidos. Os tubos foram deixados arrefecer, e NaCl saturado em água foi adicionado. Os tubos foram novamente agitados e centrifugados para permitir que as camadas se separem. Uma porção da camada orgânica foi em seguida colocada em um frasco de CG e analisada por CG-DIC. FAMEs foram quantificadas utilizando uma curva de calibração de 3 pontos geradas utilizando Padrão de Referência Nu-CheckPrep GLC 502B (NuCheck, Elysian, MN) . Os ácidos graxos presentes no extrato foram expressos em mg/g e como % de FAME .
RESULTADOS
Amostra PTA-10208 n° 1
94/131 [184] 0 perfil de ácidos graxos da biomassa e lipidios bruto extraídos de Amostra PTA-10208 n£ 1 foi determinado utilizando CG-DIC. Os ácidos graxos na biomassa foram transesterif icados in situ pela pesagem de 28,6 mg de biomassa diretamente para um tubo de FAME, enquanto uma amostra de lipídio bruto extraído foi preparada pesando 55,0 mg de lipidios em bruto para um balão volumétrico de 50 mL e transferência de 1 mL para um tubo de FAME separado. O teor de lipidios em bruto estimado da biomassa foi determinado como sendo de 53,2% (como soma de FAME) utilizando CG com detecção DIC, enquanto que 52,0% (peso em peso) de lipídio foi extraído da biomassa seca, dando uma recuperação de 97,8% de lipídio total. O lipídio em bruto foi determinado como sendo de 91,9% de ácidos graxos (como soma de FAME) utilizando CG/DIC. Os principais ácidos graxos contidos no lipídio bruto foram C16:0 (182,5 mg/g), C20:5 n-3 (186,8 mg/g), e C22:6 n-3 (423,1 mg/g).
[185] O perfil de classe de lipidios do lipídio extraído em bruto foi determinado por pesagem de 55,0 mg de lipidios em bruto para um balão volumétrico de 50 mL e transferência de uma alíquota para um frasco de CLAE para análise por CLAE/ELSD/EM. De acordo com a análise de CLAE/ELSD/EM, o lipídio em bruto continha 0,2% de ésteres de esteróis (SE), 95,1% de TAG, 0,4% de esteróis, e 0,5% de 1,2-diacilglicerol (DAG). 5% da fração TAG incluiu um pico que eluiu imediatamente após o pico de TAG, mas não dá um espectro de massa reconhecível.
[186] TAG isolado a partir desta amostra, conforme determinado por cromatografia flash compôs, aproximadamente, 92,4% do óleo bruto. PL não foi detectada, por peso, ou TLC
95/131 após isolamento EFS. Os principais ácidos graxos (> 50 mg/g) contidos no TAG foram C16:0 (189 mg/g), C20:5 n-3 (197 mg/g), e C22:6 n-3 (441 mg/g).
Amostra PTA-10208 N° 2 [187] O perfil de ácidos graxos da biomassa e lipidios bruto extraído de Amostra PTA-10208 N£ 2 foi determinado por CG/DIC. Os ácidos graxos na biomassa foram transesterif içados in situ pela pesagem de 32,0 mg de biomassa diretamente para um tubo de FAME, enquanto uma amostra de lipídio bruto extraído foi preparada pesando 60,1 mg de lipidios em bruto para um balão volumétrico de 50 mL e transferência de 1 mL para um tubo de FAME separado. O teor de lipidios em bruto estimado da biomassa foi determinado como sendo de 52,4% (como soma de FAME) utilizando GC com detecção FID, enquanto que 48,0% (p/p) de lipídio foi extraído a partir da biomassa seca, dando uma recuperação de 91,7% do total de lipídio. O lipídio em bruto foi determinado como sendo de 95,3% de ácidos graxos (como soma de FAME) utilizando CG/DIC. Os principais ácidos graxos contidos no lipídio bruto foram C16:0 (217,5 mg/g), C20:5 n-3 (169,3 mg/g), e C22:6 n-3 (444,1 mg/g).
[188] O perfil de classe de lipidios do lipídio extraído em bruto foi determinado pela pesagem de 60,1 mg de lipídio bruto para um balão volumétrico de 50 mL e transferindo uma alíquota para um frasco de CLAE para análise por CLAE/ELSD/EM. De acordo com a análise de CLAE/ELSD/EM, o lipídio bruto continha 0,2% de SE, 95,7% de TAG, 0,3% de esteróis, e 0,7% de 1,2-DAG. 5,1% da fração de TAG incluiu um pico que eluição diretamente após o pico de TAG, mas não deu um espectro de massa reconhecível.
96/131 [189] TAG isolado desta amostra compôs, aproximadamente 93,9% do óleo bruto. PL não foi detectada por peso, ou TLC após isolamento por EFS. Os principais ácidos graxos (> 50 mg/g) contidos no TAG foram C16:0 (218 mg/g), C20:5 n-3 (167 mg g) e C22:6 n-3 (430 mg/g).
Amostra PTA-10208 n° 3 [190] Uma amostra de óleo bruto a partir do microrganismo depositado na instituição ATCC sob o N2 de Acesso NPTA-10208 (Amostra PTA-10208 N2 3) foi analisada utilizando CLAE/ELSD/EM. Um total de 98,38% de lipídios foram recuperados, com a fração de éster de esterol (SE) representando 0,32%, a fração de TAG representando 96,13%, a fração de 1,3-diacilglicerol (DAG) representando 0,22%, a fração de 1,2-DAG representando 0,78%, e a fração de esteróis representando 0,93%.
Amostra PTA-10212 n° 1 [191] O perfil de ácidos graxos da biomassa e lipídios bruto extraído de Amostra PTA-10212 η2 1 foi determinado utilizando CG/DIC. Os ácidos graxos na biomassa foram transesterif içados in situ pela pesagem de 27,0 mg de biomassa diretamente para um tubo de FAME, enquanto uma amostra de lipídio bruto extraído foi preparada pesando 52,5 mg de lipídios em bruto em um balão volumétrico de 50 mL e transferindo 1 mL para um tubo de FAME separado. O teor de lipídios em bruto estimado da biomassa foi determinado como sendo de 38,3% (como soma de FAME) utilizando GC com detecção FID, enquanto que 36,3% (p/p) de lipídio foi extraído a partir da biomassa seca, dando uma recuperação de 94,6% do total de lipídio. O lipídio em bruto foi determinado como sendo de 83,2% de ácidos graxos
97/131 (como soma de FAME) utilizando CG/DIC. Os principais ácidos graxos contidos no lipidio bruto foram C16:0 (328,5 mg/g), C20:5 n-3 (90,08 mg/g), e C22:6 n-3 (289,3 mg/g).
[192] O perfil de classe de lipídios do lipidio extraído em bruto foi determinado pela pesagem de 52,5 mg de lipídios em bruto para um balão volumétrico de 50 mL e transferindo uma alíquota para um frasco de CLAE para a análise de CLAE ELSD/EM. De acordo com a análise de CLAE/ELSD/EM, o lipidio em bruto continha 0,2% de SE, 64,2% de TAG, 1,9% de FFA, 2,8% de 1,3-D AG, 1,4% de esteróis, 18,8% de 1,2-DAG, e 0,5% de MAG. 3,4% da fração de TAG incluiu um pico que eluiu diretamente após o pico de TAG, mas não deu um espectro de massa reconhecível.
[193] TAG isolada a partir desta amostra constituiu, aproximadamente, 49,8% do petróleo bruto. PL isolada constituiu, aproximadamente, 8,1% do petróleo bruto. Os principais ácidos graxos (> 50 mg/g) contidos na fração de TAG são C16:0 (400 mg/g), C20:5 n-3 (91 mg/g), e C22:6 n-3 (273 mg/g). Os principais ácidos graxos (> 50 mg/g) contidos na fração de PL são C16:0 (98 mg/g), C20:5 n-3 (33 mg/g), e C22:6 n-3 (227 mg/g).
Amostra PTA-10212 # 2 [194] O perfil de ácidos graxos da biomassa e lipidio bruto extraído Amostra PTA-10212 n£ 2 foi determinado utilizando CG/DIC. Os ácidos graxos na biomassa foram transesterif içados in situ pela pesagem de 29,5 mg de biomassa diretamente para um tubo de FAME, enquanto uma amostra de lipidio bruto extraído foi preparada pesando 56,5 mg de lipídios em bruto em um balão volumétrico de 50 mL e transferindo 1 mL para um tubo de FAME separado. O
98/131 teor de lipidios em bruto estimado da biomassa foi determinado como sendo de 40,0% (como soma de FAME) utilizando CG com detecção de DIG, enquanto que 41,3% (p/p) de lipidio foi extraído a partir da biomassa seca, dando uma recuperação de 106,1% de lipidio total. 0 lipidio em bruto foi determinado como sendo de 82,8% de ácidos graxos (como soma de FAME) utilizando CG/DIC. Os principais ácidos graxos contidos no lipidio bruto foram C16:0 (327,3 mg/g), C20:5 n-3 (92,5 mg/g), e C22:6 n-3 (277,6 mg/g).
[195] O perfil de classe de lipidios do lipidio extraído em bruto foi determinado pela pesagem de 56,5 mg de lipidios em bruto em um balão volumétrico de 50 mL e transferindo uma alíquota para um frasco de CLAE para análise por CLAE/ELSD/EM. De acordo com a análise de CLAE/ELSD/EM, o lipidio em bruto continha 0,2% de SE, 58,2% de TAG, 2,3% de FFA, 3,4% de 1,3-DAG, 1,7% de esteróis, 23,4% de 1,2-DAG, e 0,6% de MAG. 3,3% da fração de TAG incluiu um pico que eluiu imediatamente após o pico de TAG, mas não deu um espectro de massa reconhecível.
[196] TAG isolada desta amostra constituiu, aproximadamente, 51,9% do óleo bruto. PL isolada compôs, aproximadamente, 8,8% do petróleo bruto. Os principais ácidos graxos (> 50 mg/g) contidos na fração de TAG são C16:0 (402 mg/g), C20:5 n-3 (92 mg/g), e C22:6 n-3 (245 mg/g) . Os principais ácidos graxos (> 50 mg/g) contidos na fração de PL são C16:0 (121 mg/g), C20:5 n-3 (48 mg/g), e C22:6 n-3 (246 mg/g).
99/131
Tabela 4: Perfis de Ácidos Graxos de Biomassas e Lipídios
Brutos Extraídos de PTA-10208 e PTA-10212
Aaao-stra ; Bicssiassa ptaíw Às&ostra ii± I Lipídio FTAH0PX Asiosira BS 2- Si&masis ΗΆ· 10208 Asiitstra ai 2 LÍ0dÍ£s .....Esrsít®-.... PTA-102Í2 ÀaiEstra íU 3 Hifimassa m-rniz | Àsssasíra i aí 1 Ligilío . Brssto ! FT A-10212 Amestra 111 ΐ Sisssasss PTÁ* W2J2 [ Aiss.e^tra ysi 7 : Lipídfe
FAME FAME FAME FAME FAME FAME | FAME FAME
Asidti ürsxo tas/.eí <m#g} (m.&W Sfttó) («âZtí..... .....f«W—· _£^ÍL·. O«g/g) ....
Cl 2:0 1.47 3.43 1.80 3.14 0.99 1.® 0.87 L§1
11.62 20.12 16,72 31 03 3.51 1'2.91 .5.97 1W
C14.1 0.00 W 0.® 0,® O.ôü i a® 0.® 0.90
Cl 5:0 2,43 3.75 3.60 6.22 $.13 20.4-2 939 201
Cl 6:0 195,04 18247 117.72 21W í 145.87 328.4$ 147.87 327.27 J
Clfcl 3,W w 0.06 0.01 6.26 M.53 7.46 109
C18:;Ü í s p 8.96 4.77 8.37 6.77 15.39 6.77 i5 15
Cl 8:1 M O.W 3.26 Õ.® W 0.03 4.04 O.&g 5.87
CÍS:1 nd ί ο.ω 0,00 0.00 0.00 0.00 0.00 0.00 0.00
C Ul'n-6 : 00« 0,® a.w 0.00 0.® a.® 0.00 0,00
C20.O 1.4® 1.79 L4B 1.85 w .3.09 1.6? .3,20
asjn-j ; O.Oô Ô-W 0.00 0.00 a® 0.® 0,00 0,00
C21W Μ : o.oo 0.® 0.00 0.00 0.00 0.® o.aa 0.00
ClLAn-J 0.91 161 LIO 2.00 2,28 2.56 121 2..64
GUWn-E 0.00 0.® íW 0.® a.w 0.® 0.® 0.00
C2O:3 nf . W 0.00 0.00 0.® 4.00 0.00 0,® 9G)
C220 ; O.K? O.,ü® 0.08 0.® ' 0,30 <‘J2 0,35 0,24
C20:4m7 0.81 ' 0.4$ ÜM7 0,4! 0.60 0.® 0.® aoô
C2Ô:4n4 7.22 12.23 6.84 12.ÍS LIO 2.36 1.31 2.32
CXM ilOO Ô.W 0.00 D.íXt 0.® 0.® . Q.M 0,00
cwms O.ffl 0.52 0.00 0.46 Oft 0.00 0.00 0.00
C3O:4 m3 3.45 $.45 3.13 5.58 0,00 2.40 Ü.00 2.34
020 J m3 : 0.09 0.® S.H 0.00 ......0.® 0.® 0,® 0.00
00:5 m3 : J&7.J5 18 6.83 ' 93.9$ 169.32 40,32. w:n 43.15 92,54
C23:4m9 : ü CO 0.® :.t 0.00 O.OÔ 0.® 0.® 0,00 0.00
C24.O 0.® o.® 0.52 w 2,81 W 3.74 6.53
C24:i 1.55 3.36 0.85 2.04 0,43 1.34 G..42 1.24
022:5 0-6 0.66 1ÍH 1W 2.42 4.6« 2.33 4,21
02:5 m3 ; 20.44 35.13 W Í7.5Ô 2.41 4.94 2.69 5.23
C2M m3 2408 423.14 245.96 444,08 139.58 289.34 ' 13735 377.57
StaaateFAiiE 327.15 90118 5ÍS.73 $42.75 36?.89 S&5.29 372,63 m68
100/131
Tabela 5: Perfis de Ácidos Graxos de Biomassas e Lipidios
Brutos Extraídos de PTA-10208 e PTA-10212
pfÀ-iâm Ãmoatra. Bil SÍ&1S3;S53 F*T-A-4âm Amostra Sra.tfí ^TÁ-W2Ü& Amostra Siemassa Riviímf Amestra FTÃ-WÍ2 Aissíi-siTa iií I. Bi©üS3.ssa PTÂ-Iffih Am^trs FTÃ-W212! Amostra Si&^iasaa ÍPTÀ4Í&Í2 Amostra .Bute.......
s4 FAME %FAM£ %FAMC % FAME ÃFAME %FAME %FAMÈ HFÂME
€12^ 3,28 0.27 035 ft33 02’ 024 &.Z3 . 0.24..........
2.23 2.32 3.22 3.29 i.50 1.00 L6Ó 1.71
Cl 41 ft.M '3,® 0.® 0.» 0.60 ” 0.® 0.00 0.00
015.« ft46 0.41 ft® 0.66 148 2.54 3,S2 2:.60
CIO IW 20.il 32.70 23,07 39,6j «0.79 3M8 40.93
Cl 63 O.Òft 0.® 001 Õ,W J.70 L.®S 2.80 xn
CIO LOS Q.99 0.93 as? L84 L91 1.82 L89
0.® 0,36 _ ft® 0.33 0.61 0.50 0.02 0.73
i ci&l ft® 000 0.00 0,00 ο,ω MO a.® 0,00
Cl«.an*Õ 0.08 0.00 0,06 w o.oó W 0.® Cl.®
Í>Ô 3.28 0.2Õ 0.27 0.20 0,43 0.38 0.45 0.40
ClOn»3 0,® 000 0,06 tw 0.1» O..O0 . 0,00 6,00
C20:l η-9 0® 0.00 ftOO 0.00 0.00 0,00 0.00 ft®
€18:4 n-3 3.17 0,1« 0..21 ÍUl 0,62 ft.32 0.59 &.3J __
C20'2n-6 ο.ω 0.00 0.00 0.00 O.O0 0,00 0.00 ft®
C203 '1-6 ft® 0,00 0.00 0.00 O.OÍJ O.0Ô 0jO© ft®
C22r0 W : 0.00 ft® 0'30 0,08 0.02 0.09 Ο.Οϊ
díH 0.16 i W ftí3 0.04 0.00 0.00 0.00 ft®
CZ0;4si“0 1.37 1.35 uz 1 39 0,32 0,28 0.35 X29
C333 0,® i Ò.® ft® 0.00 aso 0,00 0.00 ft®
C2O:4 fs»5 0.12 0,06 0.® '105 0,00 0,00 0,00 ft®
C20;4 sí-3 0,65 0.60 0,64 0.59 o.w Õ.3& 9.® 0.29
<20:3 '1-3 0.02 0.00 0.02 0,00 0.00 0,00 0.00 ft®
020:5 20.36 30.59 17.® 17,96 5Ô.96 Π.19 tL58 n.57
02:4 '1*9 aoô 0.® ft® 0.60 0,00 0,00 W ft®
C2.« 0..Π 0.00 0,10 aso 0.76 0.85 0,74 0.82
024:1 a-9 0,29 0,36 ft se ft23 0,12 0.Ϊ7 0.J 1 ft 16
C32;5 L83 1.73 L98 1.91 0,66 0,58 0.62 0.55
022:5 r-3 3.88 3,»7 L91 1,86 0.65 0,61 0.72 ft6S
C22;&»*3 46,85 46.64 47.42 47.10 37.94 33.93 36.86 34.75
Soma de FAME % 130 100 ISO 100 RXS 1« 100 1®
101/131
Tabela 6: Perfis de Ácidos Graxos de TAG Isolada de PTA10208 e PTA-10212
Figure BR112014001126A2_D0001
102/131
Tabela 7: Perfis de Ácidos Graxos PL isolada de PTA-10212
——Ί Ãcidb AmiSj.tr; es 1 'γαΪΙΕ (mp/sy...... PT A 4 02 J 2. Am&Stf8 L« 1 FAME PTA-:lO2i2: ,ta®s.taB=3 ΡΤΑ·102ί2 ÀEiSStfãüsS % ΓΑΜΕ
Cl2s0 0.® tí.ÓÒ tw áoo
CÍ4S 0,93 0.22 LÔ 0.39
C544 0,® ü.oa G.SO 0.00
C3M 3.44 0.82 5,07 L05
C!6:0 98.29 23..50 120.98 28.00
CMM M5 07 3.07 M3
ClíM- 3.-33 0.78 3,72 0.77
Clil íi-9 1.1:2 &27 0.95 0.20
CIS-ι ft-7 <U *0.1 Ç.02 )003
Cl 8:3 «4 ........MO 0.00 MÜ MO
CMS <S,1 <04 «li <0J
m3 •m iW 0.00 OJS©
C2O.I d.® õ.ds 0.40 «í
Cl8:4 m3 3J1 0.89 324 0.67
C2M ss4 d® d® s ido.....
C2&3 ss4 aoo O.ÓO 0,® 0.®
C22t0 õ.® w Ô.® O.A:
D-sscsabecído 4X33 10.12 44.71 9.24
C2ü:4 m? MG aso 000 0.90
1» «4 δ.δΟ a® M(! 0,00
C3OU 04 0.2-0 1.54 032
0.® aso 0.® 0.00
C20:4 »4 03 0,® 0.® ΰ.α>
C2O.4 ss-3 <Ô.Í <».): 0.27
C20:5 n-3 33.39 7.S8 47.91 9.9Í)
€24:0 «fr. 1 <0,1 0.01 0.*®!
C22:4 s·# 0.00 MO aso αώ
04:3 ss-« 0.00 O.íb MC! a®
C22:5 mS 0.74 3.82 0.70
02:5 K’3 ^0,1 0<»6 044
03:6 m3 226.68 54.2-0 24fi,09 505
SsmsdeFAME 418 21 - 483.94 -
%Tsíal FAME 300 *
[197] O teor de lipidios da 10212 n£ 3 foi estimado em 34% quantidade de óleo bruto obtido biomassa para Amostra PTAcomo a soma de FAME, e a após a extração do solvente foi de 37% por peso, dando uma recuperação de 109% de gordura presente na biomassa. Após fracionamento utilizando cromatografia flash, aproximadamente 46% do óleo bruto foi
103/131 isolado como TAG, 28% foi isolado como DAG, o óleo bruto continha 309 mg/g de DHA e 264 mg/g de EPA. O TAG isolado continha 341 mg/g de DHA e 274 mg/g de EPA. A fração de DAG isolada continha 262 mg/g de DHA e 237 mg/g de EPA. Os perfis de ácidos graxos totais da biomassa, óleo bruto extraído e frações isoladas são mostrados abaixo na Tabela 8 e na Tabela 9, calculada como mg/g e % de FAME, respectivamente.
Tabela 8: Perfis de ácidos graxos da Biomassa e Lipídio
Bruto Extraído de Amostra PTA-10212 N° 3 (mg/g)
......................... A-cids C-raxO· ΟΙβΦ Srato ΤΛ0 £>AÜ
ΝΑ —___________ FAMK (mgíg) 37.2% 2X9%
FWEÍinglg) FAME (síigíg) FAME
CJ2.G [ 0.6 < , 0.0 M o.í)
3.6 10.3 11.3 9,4
Γ Ô.Ô o,o ..... 0,0 0.0
Cl 5:9 1,1 10.6 9.8 0.6
C1&0 70 181.8 231,7 111.3
C16:t 6. 19,1 18.7 !7,1
Cl 8:0 2.4 10,2 tu 0.0
C!»;í 0.0 6.0 0.0
Ç: 8: 1 a-7 0.S !,2 0.0 Eo
0.0 1,8 6.0 0.0
CW o,o 3.4 &0 0.0
Clfcí n-3 Ü.3 0.0 6.0 0.0
CKU M 0,0 0.3 6.0 1.7
Cl 3:4 n-3 1.9 3.4 3.3 4,4
C30:2 0.0 S.S 6.0 0.8
CÍ0:3 a-6 0.0 0.0 6,0 0.0
C22sÔ w 0.0 8.0 0,0
«0.4 n-7 6.0 3.1 1.5 0.0
o.s O 6.0 0.0
C&W n-â 6,8 17,9 21.4 13.3
Cj.2:l n-9 0.0 0,0 6.0 ÍHJ
C2V4 i>5 0.0 1.3 1.3 0.0
C2$:4 3.0 8.5 Ϊ6.9 6.4
C20;5 :r>-3 02 0 263 Λ 274.2 237.4
C24;0 0.0 1.7 3.9 0.0·
C22:4 ís-9 0.0 0Λ é.ò 0,0
C24:l B‘9 0.0 0,8 u Õ.Õ
C2.2;5 rA. 3.2 8,3 ÍG.7 6.1
C22.-5 n-J 38 i W.4 15.1 6.6
131.2 309.4 341.1 261.9
SjfMKia de FAME 342.4 871.1 973.2
104/131
Tabela 9: Perfis de ácidos graxos da Biomassa e Lipídio bruto extraído de Amostra PTA-10212 N° 3 (%)
Bioysisssa Ctes Brota TAG DAü |
NA 372% 46.6% 27.9%
Ácido Gsaxa FÀMEWâ) PAMBWg) FAME (αι<5.) |
Cl. 2:0 00 ao 0,i) ao___
C1W M L.3 1.2 ),4
CH:1 00 S.O 0.0 ao
cw 1.2 1.2 1,0 1.0 ]
cí&o 20.6 30.9 23.8 16,3
ci&i 2.0 2,2 E9 2.5
cis-o 0-7 Í.2 L$ 0.0 1
0.0 0.8· 0.6 0.0 j
33-7 0.Õ o.t 6.0 ο.β 1
CH:2 n-é ao 0.2 ao Í5.G
0.0 03 0,0 0.0 ]
C18:3 83-S 0.0 0,0 0,0 0.0 __ _
CM. l n-4 ao 0.6 0.0 0,:2 1
CG. 4 -.A 0.6 0.4 0.3 0.6
CMiíHÍ ao 0.0 0.0 ao I
CM3n-6 0,0 G.tí 0.0 0.0
C22;& to 6,0 0.0 0,0
CM4 n-7 ao 0.3 03 ao
CM3 0.0 G.O 0.0 0.0 ~~J
CM4 éH 2.0 2d 2.3 3.0 1
C22.1 n-9 0.0 0.0 00 0.0 J
C2Ú4 n-5 0.0 6.1 0.1 0.0
CM4 n-3 0.9 1.0 Li 0.9
C2&5 πύ 29;8 M3 38,2 34.8
G24;6 0.0 6,2 0.4 0.0 1
C22:4 0.0 0.6 9.0 6,0
024:1 n-9 0.9 0.0 0.4 0.0 j
0.9 1.0 1,1 a® ]
CMS n-3 Li 12 I.& 1.0 |
C22:6 tl-3 M3 35J 35.1 ........ 38.4
% Teial de FAME : ico.o mo___ —~ too.o mo .....j
PTA Amostra N2 4 [198] Amostra PTA-10212 n£ 4 continha aproximadamente 23% de lipidios determinados como a soma de FAME, dos quais 107% foram recuperados utilizando extração em hexano. Após fracionamento utilizando cromatografia flash, aproximadamente 42% do óleo bruto foi isolado como TAG, 18%
105/131 foi isolado como DAG. O óleo bruto continha 275 mg/g de DHA e 209 mg/g de EPA. A TAG isolado continha 296 mg/g DHA e 205 mg/g EPA. A fração de DAG isolada continha 245 mg/g de DHA e 219 mg/g de EPA. Os perfis de ácidos graxos totais da biomassa, óleo bruto extraído e frações isoladas são mostrados abaixo na Tabela 10 (mg/g) e na Tabela 11 (% FAME).
Tabela 10: Perfis de Ácido Graxo de Biomassa e Lipídio
Bruto Extraído da Amostra PTA-10212 n° 4 (mg/g)
£ Òleo Brsitis TAO t:>AG :
% pese NA | 24.7% 42.2% 18,4%
Ácldc Graxc·: FAMÈ(*W | FAMEWg) FAME (ttsgi'g) FAME(«W i
Cl 2:0 00 | 0-Q 2.1 14
2.0 1 9.8 9,6
CHh 0.0 1 0,0 ao 0,0 J
C15.O 4.8 1 to 0,4 0.9
tl6:0 63,3. | 210.6 283.7 m.íi
C16U 7.4 7.5 '
CISO .2.8 1 122 É9.9 4.6
C18;l OO | 17 0.7 1J
i Cl 8:1 n-7 0.0 | 0.3 1.2
Ϊ C5 8:2 »4 0.0 1 0íí ao 0-0
i C20:o 0 0 | 3.3 6.0 L5
1 .01.8:1 nh 0 0 | 0.0 0.0 0.0
i C20:l n-9 0,0 | 0.0 0.7 12
Cl>4ftP 14 | 3 8 ' 3 6 5.0
C2S;2 ti-ò 0,0 0.0 0.0 0.0
cm «h 0.0 ; 0.0 0.4 0.0
C22:0 1.3 ao f.9 0.0
C®:4 tsd 0.0 ] 0.0 (><9 0,6
C2lM tsd 0.0 0.0 0.0 0,0
C20:4 »4 2.3 | 50... 5 53.0 10.3 ______
C2&1 SS-9 o.o | ao ao 0,0
004 s-3 00 T eü 0.8 0,7
0:4 n-3 1.4 6.3 8.6 6,Ü
cm m-3 57.6 1 209,1 205.4 219.0
C24:O 0.0 2.6 0,8 i 0.0
C22:4 si-9 0.5 J 0.0 0.0 0.0 i
C?.4:tr>A 0.0 0.0 L! 0.5
C‘22.5 Si 6 1.4 I 7,9 4.5 ]
C22:3 ss»3 4.-0 tS.8 20.8 S2,9
Qíí a-3 87.7 275.0 3M4 244.4
S-iasa a de FAME 232,2 1 790. S 8M8 672.4
106/131
Tabela 11: Perfis de Ácido Graxo de Biomassa e Lipídio
Bruto Extraído da Amostra PTA-10212 n° 4 (%)
Bíosssssa Óes Bruto TAG DACi
ft pese NA 24.?% Í8,4%
FAME FAMB(bW
csw O 0.0 oj 0.4
C14.0 o 1.0 J.í 1.4
Cí 4:1 ao o.» 0.0 O.Q
CM ............2.1 2d 0.0 &í
CM 27,3 26.? 31.9 3-0.5
C1&! 0.7 0.8 O 1.1 ____
1.2 Í.5 2.2 Ü..7
CJ8:t a-9 ao as 0.1 0.2
Ç18:í h-7 5.0 o 00 ã2
08:2 Ô.O ao 0.0 0.0
OW 0.0 0.4 0..7 a.2_____
Ct8:3 ís-3 0.0 ao 0.0 0.0
C2»:t a-9 0.0 0.0 0.1 0.2
0.6 05 0.4 0,7
S.O 0,0 00 ao
0.0 0.0 ao C.Ô__
0.6 0..Q· 0.2 ao
C3W n-7 0.0 ao 0.1 0.1
¢20:3 «'3 0.0 0,0 ae ao
M U 15 ' . 1.3
C22:l a-9 0.0 0.0 O.ô ao
0:4 ao 0.0 0.1 0.1
00:4 fl-3 0.6 o 10 0.9
00.5 ml 24.8 26.5 23.» 32.6
C24;0 aü 0.3 0 1 0.0
C22:4 m9 0.0 fl.O ao ao
C24:í a-9 ao ao 0J 0,1
C22;5 sHí 0,6 as ao Ò..7
C22.5 m3 ..........G........ « 2.3 u
€22:6 #’3 37,8 .34.8 33.1 38.4
ft Tefal de FAME 1000 Η.Ό0 loa» 100.0
Amostra PTA-10212 n2 5 [199] Uma amostra de óleo bruto foi extraída a partir de uma biomassa de PTA-10212 usando o processo FRIOLEX® (GEA Westfalia Separator UK Ltd., Milton Keynes, Inglaterra) para produzir óleo microbiano a Amostra PTA-10212 n£ 5. Classes lipídicas individuais foram isoladas a partir da
107/131
Amostra PTA-10212 n£ 5, utilizando cromatografia flash de baixa pressão, e a porcentagem em peso de cada classe foi determinada. O perfil de ácidos graxos de cada classe foi determinado utilizando CG-DIC.
[200] Em resumo, a amostra foi preparada pela dissolução de 240 mg do óleo bruto em 600 pL de hexano e aplicando à cabeça da coluna. Após o fracionamento da amostra, utilizando cromatografia flash, os pesos combinados de todas as frações foi de 240 mg dando uma recuperação de 100%. A fração de éster de esterol representou 0,9%, a fração de TAG representou 42,6%, a fração de ácidos graxos livres (FFA) representou 1,3%, a fração de esteróis representou 2,2%, a fração de DAG representou 41,6%. Os perfis de ácidos graxos totais das frações de óleo bruto FRIOLEX® e isolados são mostradas a seguir na Tabela 12 e na Tabela 13 calculados em mg/g e % de FAME, respectivamente.
Tabela 12: Perfis de Ácido Graxo de Biomassa e Lipídio Bruto Extraído da Amostra PTA-10212 n° 5 (mg/g)
Figure BR112014001126A2_D0002
108/131
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Stans, d e FAME. ?%.6 905.3 837,4
Tabela 13: Perfis de Ácido Graxo de Biomassa e Lipídio
Bruto Extraído da Amostra PTA-10212 n° 5 (%)
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C22:0 0 J 0.2 0,0
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109/131
Figure BR112014001126A2_D0003
EXEMPLO 4 [201] A quantidade relativa e composição de ácidos graxos de cada isômero de TAG presente no lipidio bruto extraído foi determinada para cada uma das amostras da Amostra PTA-10208 N£ 1, Amostra PTA-10208 N£ 2, Amostra PTA-10212 N£ 1, Amostra PTA-10212 N£ 2 e Amostra PTA-10212 N£ 3, Amostra PTA-10212 N£ 4, e Amostra PTA-10212 N£ 5 do
Exemplo 3 utilizando separação de CLAE de fase reversa não aquosa e detecção APCI-EM.
Método TAG Instrumento Agilent 1 100 CLAE
Agilent 1 100 MSD
Coluna (s) Oito Phenomenex Luna C 18 (2), 150 x 4,6 mm, do tamanho de partícula pm ligados em série
Fase móvel A - Acetonitrila
B - IPA w/0,1% de acetato de amônio
Gradiente
| Tempts» mm
0 80 20
120 20 | 80 i
Π5 20 ’1......80 1
126 ο·: O O#
140 80 | 20
Temp, da Coluna 20 °C
Vazão 0,5 mL/min
Volume de Injeção 5 pL
MSD Faixa de Massa 350 - 1150
Fragmentor 225 V
110/131
Temperatura de secagem de gás 350 °C,
Temperatura do Vaporizer 325°C
Tensão Capilar 3500 V
Corrente da Corona 10 μΑ
Amostra PTA-10208 n£ 1 [202] Os lipidios brutos isolados da Amostra PTA-10208 N£ 1 foram preparados para análise de TAG pela pesagem de 5,5 mg de óleo em um frasco de CLAE e diluição com 1 mL de hexano.
Tabela 14: Identificação das Espécies de TAG na Amostra
PTA-10208 n° 1
Tempe de
Resessçâa
41.76
CN
Figure BR112014001126A2_D0004
PerceaiuslE
42.97
4139
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W.9 1 «k« 1 5?9.4.651,5
Amostra PTA-10208 n£ 2
111/131 [203] O lipídio em bruto isolado da Amostra PTA-10212 n£ 1 foi preparado para análise de TAG pela pesagem de 5,3 mg de óleo em um frasco de CLAE e diluição com 1 mL de hexano.
Tabela 15: Identificação das Espécies TAG na Amostra PTA
10208 n° 2
“WE CN Percessual 4e.Ãr.èa_ [Μ + ΝΗ4Γ (DAG)jtrímàçoJs
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54.37 34 MHíGOTA 2.0 S97..7 914.7 5Ê9.5,595.4
55.7S 34 &HA/ÜHA/M;Ô 25 923.6 940,8 395.3,6951
60.74 36 EPAfêPÀ/lO 3.1 S99.6 9ÍO 397.3,643.5
61 94 36 OHA/UtOOA 13,08 925.7 942.8 597.162X5,669.3
63.10 36 ÍTO/Í6WHÂ 20-0 93 LS 968.8 623.3,693.1
65.60 38 i^MEPÀfio LS 927.7 9-40 _________6751 ;
3® O 953.7 970.8 6234,625.4,697.6
67.46 3® ^AÍAW!6:0 1.3 823.5 90L.S 840.7 918.8 495A 39.13 : 397.«, WA «45.4
O 38 DHA/I6:WÂRA 10 927.8 944.8 $W,W3.3.«?U
69.69 38 DHÂftWDFÁ 17 553.7 9MS 623.5, 625.5
70.39 38 DHWHATO ».7 979.8 996.8 «51,3
75.88 46 ' EPA7Í5:»Í4:0 LI §25.7 842.8 3231.,369.3,597.3
74,94 40 DHAWÍW 19 851.8 8M.7 523 Ja €23,5
........81.17....... 42 !,9 8518 870.8 33IS, 597.6
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85 72 44 DÍWl 6:07 S&9 0.6 8SL? 890 351.4, 623.5
ims 44 ' IWSMU !,2 WJ 920 579.4, 651.5
Amostra PTA-10212 η- 1 [204] O lipidio bruto isolado da Amostra PTA-10212 n£ 1 foi preparado para análise de TAG pela pesagem de 5,3 mg de óleo em um frasco de CLAE e diluição com 1 mL de hexano.
112/131
Tabela 16: Identificação das Espécies TAG na Amostra PTA
10212 n° 1
Terspo de Retenção i ÇN Mentifisação Peress.tsisi d& Μ’' [Μ+^ίΜΓ á e AO)
43 m 30 ; ^A/EPÁ/BHA 12 971.7 988,7 . 643,3.669.5 j
44.24 30 í DHAÍDKA/EPA 2.6 997.7 1914.8 669,5,095,4
45.41 30 dha/dhâoía 3.4 1X118 10401 693..5 ]
—— ÜHA/EFAK4:Ô 0.7 897.7 949.7 9118 .........; .569.3,395,4 | ..............61U.Í21L·____
59.53 35 DWV15.WHA 0.9 937.8 . 954.8 609.6.695,5
36 i EPA/I6«®FA 1.5 899,7 916.7 397.,5,643.2 |
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KM .26 49 HkOT6;W:0 0.7 ND m? 531 -4, 565J
.50 1,7 ND ms 5515, 579 5 j
30 DHA/tòÓfitt 0.7 9918 KCS.2 623.5,663.7.7.15.5
io 52 0.6 _ 88-0.9 5515. 607,4
124.24 56 16:^16:071410 0.6 Np BO 3313,6635 {
ND = Não detectado
Amostra PTA-10212 N- 2 [205] O lipídio bruto isolado da Amostra PTA-10212 n£ 2 foi preparado para análise de TAG pela pesagem de 3,6 mg de óleo em um frasco de CLAE e diluição com 1 mL de hexano.
113/131
Tabela 17: Identificação das Espécies TAG na Amostra PTA
10212 n° 2
Temped® ReííiiçSc· ] CN Perceiitsial L.dRÁEea.··. ÍM-s-ΚΓ [M+w»r Fragmentas de (DAG)
42.99 30 EWK8WDHA 1.4 9? L7 : m.7 6Í3..4 ,689.5
4-4.22 30 DHA/DHA?£PA 3.3 W.8 : 3014 7 6(,9.5,695.5
414 ] 30 DHAZÒHAO4A 2.4 1023.7 i 1040.8
54,$ü 34 »HA«PA/14:.O DHAOW16:i 0.6 897.7 ΐ W i 714,7 5695 62: 3
59.45 3S D.HÂ/15:Q/D14A 6.5 ND 954,8 «99.4
36 EWÍWEPA 1,6 . 899.7 . 916.6 59?Λ 643,3
82.02 36 EÍEW16Í1WA 9.9 935.8 942.7 597.5,623,5
6.116 36 btWU-WHA 13.0 951.8 968,8 623..6, 693.S
60 3S BSWI&Ô/EPA 0.7 953,7 ; 979.6 625.5
68.65 38 DHA/ARA/I&Ô (1.4 ND 944.X 5996,623.4
69.76 38 C.4 ' 953.6 9W AU
70.44 38 03 »70 9M.7 ND ____
40 H>Ârt Wl 63 0.4 ND 868.6 _________S49.5__________
[ 73.77 40 1,6 877.6 894.8 549.5,.621.9
14.97 ί 40 DHA/16:0/14:0 1,4 85 L8 868.7 521X623.7
77.73 i 41 gWiWHiO Ô.3 ND 856.,7 537.5
78.53 i 41 Diwui&m 2d mi 883.7 537,5
8132 42 Ê1W16:M6d) 6.3 853.8 87Ó..8 531A 397.5
82.13 42 DlWUiíW:» 32.8 396,7 5515,623,5
85,67 43 ÒÍLvi7Ã'16:0 1,6 W 910 565.5
ÍW - 44 DlA/DrO/lSA DHÀ/ié:WlW 2.6 ND 907.8 mi 934,.8 551.5 /..................S79;5___________
93,® 46 lWlO>0fcl 0.9 ND 822.8 549.6,551.3
94.« 46 16(1/16.0/14:0 LI ND W.7 523.5,551.5
§5.78 46 DKA/l 2:0/24 :ft 0.5 ND 952,8 607,5
97.8 47 Í&C/íÜíSÍ 1,6 ND 850,7 537-3,5515
48 1W1W16:O 9.5 ND .834.7 551.4
' mu 49 0,6 ND 838.7 551,7,565.5
167.23 5» 16:^16:0/18:0 2.1 ND 852Í $513,570
108.45 50 DHAA&Ôím 9.7 ND 1069.0 6615
113.11 52 16:&'1 6:0/2.0:0 65 ND 880 $513.607.7_________
Γ üw 56 16:9.-16:0,7.4:.0 0.8 ND 937.0 531.5,6633
ND = Não detectado
Amostra PTA-10212 N- 3 [206] Uma amostra da fração da Amostra PTA10212 n£ 3 foi preparada em hexano e analisda por CLAE/APCI/EM para determinar as identidades dos isômeros de TAG individuais.
114/131
Tabela 18: Identificação das Espécies de TAG na Amostra
PTA-10212 n° 3
Tempü de Reies-çâ®
20.016
20,471
26.970
31,441 t < ,-j· , |P«reenioal| f
Idesanficsça® | 4rea i * -1 gPA^PÂ/EPA | ] 1>1Α.ΦΗΑ®·’Α I &$
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24.306 j
24.509
24.783
25.571
26.020
26.376
2fi.832
27.272
37.543
28.048
28,271
28.5«
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595/3
933.7 ¢21.3
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L0 J 9H.7 921.7 | 583.4, t-U.4
0.7 | 93? 954,7 | MM
7.2 J 899.7 936.,7 1 597.5
ÍO 925.7 942.7 | 397,3,633.4
6215 $51.7
112
0.5 ίο
SOLS
918.7
599.4,623.4
623.4
944.7
5SSL5,623.5
944.7
9.27.7
2.3 Γ 953.7 1 1 WL8 970.6 918.6 623 5 597.4..................
j 26 Γ 927.7 | 944,7 599.3,625.5.
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í 1.0 §51,8 | 970.8 .............623.4,623.4 ...........
I Ϊ·4 ] 877.8 | S94/7 549,5,623.3_______
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Figure BR112014001126A2_D0008
924.·
NO
S24.8
579.4,651,3
53LS
ND = Não detectado
Amostra PTA-10212 N- 4 [207] Uma amostra da fração de TAG da Amostra PTA-10212
N2 4 foi preparada em hexano e analisada por CLAE/APCI/EM para determinar as identidades dos isômeros de TAG
115/131 individuais .
Tabela 19: Identificação das Espécies de TAG na Amostra
PTA-10212 n° 4
Te^de' Ketesçào • Picc i Ni i ideaiiftcaçàc. PeTC.esii.aa3 4« Âw&.... (M + ?iTmr Eragssseskios de (SAG)
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206 2. EPA/ EFA/DHA 4.4 971.6 m.7 64XS,&59.5
2M 3 i ΟΗΑΦΗΑ’ΡΤΑ 4.7 997,7 WM.7 695.5,669.5
216 * Dl-iA/UHWHA EFáZêPA^PA 4.1 1023.7 . 9'73.7 104«? . . 990.7 frUi
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22.3 6 DHÀ/ÊWDPA EPA/ EPA /ARA 1.4 999.3 947.3 íÕiàf 697Λ 671.4
22.7 7 í EPÁ/ARAOIÂ 1.5 973,7 990,7 6715,054
23.2 8 DWVEPWPA 05 ím.?.. 1016,7 696.5.6714
23,7 9 DHA/DPAOU 0.2 1O23.S 1043.8 697.7____________
34.6 se : DHA/Ifcl/OHA 0.3 949.6 96&.7 62 í..3
W.,9 H DHAA4:a®PA 0.4 . 9H.5 940.7 593.4
25.3 ;2 i EPA/15;WPA 0.4 8S5.5 902.5 583.3
35.7 53 êpa/jwdha 1.0 911.7 928.7 583.4, 60^,4
26.2 DHÃ/B:&?tíHÂ 0.6 9377 934,7 609.3
M6 §5 : EFA/ÍO/EPA 4,9 916.7 597,5
2X0 16 EWl«:WDHÀ 12.8 9257 942.7 397.3,623.4
27.5 17 i DHA7Í&WHÂ 15.2 951,7 9Õ..7 623.5
28.3 16 efa/ioepa 3.0 937.6 944.7 6234
2SJ 19 DFÀ/I&Í/ÜPÀ ARAh&VÁRA 2J 933,7 901.8 . 970,6 .........»11«_____i 623.3 597.4
29,3 20 DHA/MXaRA 1.4 927.7 944.7 5Λ.Μ23.4
29.6 21 DHAOiWFA fj 953.8 970.1 625,4,631,5
.10.(1 32 i DHAASrftOlA íl,7 979.7 9M.7 651.5
30.9 23 DHÀ/16»«d EPA/i&O/l&l i 0,7 877,6 825.6 894.7 842.6 549.5. ND ...............549.3. ND .........,:
31:..5 34 DHA/l4;em:Q Ô.6 851.7 323.3,595.3.............
32.5 25 ©HA/tWI^O i 1.5 865.8 882.7 537.5.623,4
33,4 26 BWS&OdS® i 4.4 833,5 W7 S515,8915.............
33.8 27 DHA/tfeQd&â i M..5 879.7 m? 551.5,623.5
35.0 28 DPA/16;0?'I6;0 2,3 881.6 898.7 551.5,625 3
MA/ÍWíiÕ ' .......893ΪΒ 910.7 545.5, NÕ
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4Ü.0 31 I6;^W',OÍ6;O 3,4 NO 834.» [ 551$ ___
422 33 lé.et 5:0/1 ΚΛ 0,7 ND 852.S $31X379,5
41Q B DU.-VRl.0/34:0 M 99Í.7 IODO 62.3,.3f 663.5
ND = Não detectado
Amostra PTA-10212 N- 5 [208] Uma amostra da fração da Amostra PTA-10212 N£ 5
116/131 foi preparada em hexano e analisada por CLAE/APCI/EM para determinar as identidades dos isômeros de TAG individuais.
Tabela 20: Identificação das Espécies de TAG na Amostra
PTA-10212 n° 5
Tesapo· àe pico
Reteseâs j
21Λ |:
213
EPÃ/EPA/DHA.
DHWHAÍÉPÀ
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27.8
28.2
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29.5
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£66.7
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599.5,6231,669.3 625 A 6$ 1,5 6315,6951 595.5. 6115 S49..5, 395,5 laws 337,3. .5831 653.3,679.6 5315,g3J 3513,5971 5315,623.3
5513,673..5
5515,623.5
579,4 “07.5, 733.6
735.7
117/131 [209] Os óleos brutos foram ainda processados através de refino, branqueamento e desodorização para obter óleos refinados. Os óleos refinados foram diluídos com óleo de girassol altamente oleico para obter óleos finais com um teor de DHA de cerca de 400 mg/g. Classes lipídicas individuais foram isoladas e os perfis de ácidos graxos de cada classe foi determinado por CG-DIC como FAME.
Óleos finais PTA-10208 [210] Os perfis de ácidos graxos para os óleos finais PTA-10208 N— 1-5 estão resumidos nas Tabelas 21-22, incluindo perfis associados dentro da fração de TAG isolada (Tabelas 23-24) e os esteróis isolados da fração de DAG (Tabelas 24-26).
[211] Classes individuais de lipídios nos óleos finais foram também determinadas utilizando cromatografia flash (Tabela 27) e CLAE normal com ELSD e confirmação em APCI-EM
Tabela 21: Perfis de ácidos graxos dos Óleos Finais PTA10208 (mg/g)
Figure BR112014001126A2_D0011
118/131
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C24.1 s-9 3,4 3.2 2.3 •2.6 2.3
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€22:5 8’3 4X9 41,3 30 40,3 M9
C22:6 M 394.9 373.7 373.3 374.3 3m
Sem»*FAME 918,1 932.2 914.? 925.1 914.1
Tabela 22: Perfis de ácidos graxos de Óleos finais PTA
10208 (%)
H/Óiosas ÓfeoràisiSsi H1VIG2® «TÁ-iOZOS âta» Final Ssâ PTÃ-im Òlts Final N»4 pTA-iom ÕteBFSa»I?Íí5
Ácido Graxo 74F AME % fame % FAME ^FAMÊ
C12& 0,3 0.3 0.3 0,3 0.3
cu$ 1,8 1,6 2.3 2.8 1.9
C14-1 0.0 M 0Λ 0.9 0.0
Cl 5:0 0.4 a.4 0.5 0.4 0.4
C16;D 20,9 19,2 21.1 19.9 lí ,3
Clô:i <0.! <υ <0,1 <0.1 0,1
Cl 7.0 ai 0,1 0.1 0.1 0.2
CU:0 1.4 L3 15 1.3 1.4
Cl 8:1 n-9 2,6 S.S 2.8 2.8 3.2
CUM a-7 OJ 0.1 <0,1 <0.1
0.4 H9 0.4 04 0,5
C2QU 0.5 0.4 0.4 0.4 C.4 i
CU:3 Ϊ1-3 0,0 0.0 0.0 0.0 0.0 i
C204 a-9 OJ <0.1 4M <6,1 <0.1
C184 ft-3 0,3 0.3 0.3 0.3
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C20.3 n-6 «9.1 <0.1 <0.1 <0,1 <0.1
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119/131
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0.7 ' 0.6 0.7 0.7 0.7
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¢.734:1 iv9 0.4 0.3 02 Ó.l 0.3
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02:5 ft-J 4.8 4,4 16 4.4 4,0
€23:6 nd 43.0 40.1 40.8 40.5
Tabela 23: Perfis de ácidos graxos de TAG Isolado: Óleos finais PTA-10208 (mg/g)
PTA302S8 àkoFàsIS·!! PTÃ-ÍÕ2S8 Òte Filial N* 2 ?TA- lOXOS QíasFiaaíJ!f:3 FTA-10208 Óte Finals 4 PTÁ-10208 ÔfeoEÍKilNs£ i
Àódo Síaxs : FAM.E Ws)· FAMEçmgfêj FAME Wg) (ΛΜ-μτημμ
<.:1.G i 2.5 2.3 2.7 2.3 2.6
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C17;S 8.6 0.5 9.9 0,8 0.8
Cl 8:1.· 13.9 M.2 n.7 12.5 13,2
€18:. tid 24.3 84,0 26.8 26,1 34.Ü
€18:’ u-7 0.1 11,7 i.m 0,1 0.3
€!S·? n-f> 3.2 7.7 14 3,5 4.0
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C 1.8:3 í>3 β.Ο 0.0 0.0 0,0 0.0
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C2O;4 6-7 Í.7 1.6 1.8 1.8 L7........J
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C22.J nd 0.8 e,o &.a 0.0 0.0
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C2&4 n-3 6,1 5,7 6.1 5.9 6.2
Cjfdn-S 176.0......... [ ' ' 1.36.1 mo 311.2 304,2
€24:0 €2 1.3 1.0 1.1 12
C22:4 nd 0.0 0.0 0.0 0.Θ 06
C24H n-9 3.3 12 2.2 2.5 2.4
C22s5 nd •5.0 14 2 14.7 132 13.3
C2b5n-3 444 42.Ô 33.3 40.5 38.3
CSd:n4 3^7,9 ,378.4 .176.4 375,5 375.5
&>U' FAME 92&9 945.7 923,5 929,6 944. í
120/131
Tabela 24: Perfis de ácidos graxos de TAG Isolado: Óleos
Finais PTA-10208 (%)
PTA-10208 ] PTA-10208 PTA-10208 | PTA-10208 PTA-10208
Ófes.Fiaai.N<l / QlsaFiaa£&3· Ôlws ?fe 4
Figure BR112014001126A2_D0012
Tabela 25: Perfis de Ácidos Graxos de Esteróis/DAG Isolados:
Óleos Finais PTA-10208 (mg/g)
................... PTA-10208 Ó.es Fiaal Ni j ...........................' ί ..... . ι·ΙΙ1·»··»·»!ΙΜΜΙΙΙΙΙΒ fATOTOWAWMlÍ ί ί ί ί ί ί ί ί ί ί ί ί ί ί ί PTA-10208 PTA-10208 ΡΤΑ-10208 Óle® Final 2 Final ^-3 PTA-10208 JSe® Fisaí Ns 5
Arid® FAME FAME (mg/g) FAM^Wg) FAMEfnig/g)
Cl2:0 íi 2d 2,9 2.1 L9
C14:0 9.9 9.5 9.7 iãi 8.0
121/131
CH:l o.o 0,0 0.0 0.0 0.0
CIS:& 2,4 23 ~' 2.2 2.3 . ÁO
CIO 132.6 128.6 110.1 116.8 . 106.4
C16:1 0.2 03 <0.1 03 0,4
Cl 7:0 Ü3 0.2 03 03 03
08:0 7.3 8J 6.4 O 6.1
CÍ8Í n-9 15,0 55 J 47,4 19.0 303
C Ϊ 8:1 n-7 0.4 0,7 OJ <Q.l 0.2
aotuí Π.Ι 16.7 21.6 Π5 18.4
C2O 2.0 2d 1,2 1.8 1.4
08:3 n-3 0,0 0.0 0.0 0,0 iõ
020: l n-9 <0.1 <0.1 <0.1 <0.1 <0,1
08:4 íi3 23 2.4 2.4 2,4 2.0
C20:2 n-6 8.0 0.0 0,0 0.0 0.0
C20:3 sí4 <0.1 <0.1 <0.1 <0.1 <0.1
C22:0 Ό.6 1,0 0.5 0.6 0.5
02(5:4 n-7 O J- 0.9 2,1 0.9 0.7
C20:3n-3 0.0 0.0 0.0 o 0.0
C2&4 sU 5,7 S3 4.8.......„ 6,1 4.5
022:1 só 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0
C2Õ:4 n-5 <0.1 <0.1 <0.1 0.6 <03
00:4 n-3 2.7 2.7 2,1 2,7 2.0
020:5 nd 92.9 94.5 91.9 iTu 84,8
024:0 1.2 13 1.1 1,1 13
022:4 n-9 0.0 0.0 0.0' 0.0 0,0
C24:1 n-9 1.9 2,0 1.2 1.5 1,2
022:5 .....7.8........ 8.0 6,7 7.0 5.5
022:5 n-3 22.2 22.9 13.9 20,7 14.2
022:6 nd 2463 252.7 22,1$ 2403 1963 J
Sesssa de FAME 569.3 619,8 552.1 568.7 488.2
Tabela 26: Perfis de Ácidos Graxos de Esteróis/DAG Isolados:
Óleos Finais PTA-10208 (%)
PTA-10208 □les Fisal SM ' PTA40208 Dies Final 1 PTA-10208 ZMeü Final ?O , PTA-10208 3iec Final NM PfAdOáGS Dies Final NsJ
| Àrids Graxa % FAMB %FÃMB %FÃMÉ % FAME %FAMB
| 02:0 0,3 0.3 . °·5 0,4 Õ_
| Cl 4:0 1,7 1,5 1.8 1.8 1.6
Γ Cl 4:1 0,0 oi 0.(1 0.0 0.0
05:0 0.4 0,4 0.4 0.4 0.4
| Ç16:0 233 2Õ.8 19,9 20,5 21,8
i 06:1 <Õ,I <0.1 <03 <0:1 0.1
07:0.........í 0.0 0,0 0,1 0,1 O.l
Cl 8:0 1.3 13 1.2 1,2 1.2
122/131
CÍ«:1 2.6 8.9 8.6 33 6.2
Cl83 o·? OJ 0.1 <Õ.Í <0.1 <Sd
C iSJn-fj 2.3· 2-7. 3.9 2.4 3.S
C26:0 0.4 03 0.2 .......03 03
CÜ3 n-3 0.0 0.0 , 0.0 0.0 0.0 :
€20:1 n-9 <0,1 <0.1 <0.1 <0 <0.1
Cl 8:4 π·3 0.4 0.4 0.4 0.4 0.4
€20:2 ni 0.0 ' 00 0.0 0.0 0 0
€203 mi <Õ'.l <0.1 <0.1 <0.1 <0.1
C22:Õ 0.1 0.2 0.1 0.1 0.1
€20:4 n-7 o.í 0,1 0.4 0.2 0.1.
C20:3 Π“3 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 i
€20:4 M) LÕ oi 0,9 1J 0.9
C22H n-9 o 0.0 0.0 0.0 0.0
C20::4 n-5 <0.1 <0.1 <Í.U 0.1 <u
C2Q;4 n-3 0.5 0.4 0.4 0.5 0.4
€20:5 nd 163 16.6 19.6 17,4
C24:0 0.2 0,2 0,2 0.2 “' 03 J
€22:4 oi 0.0 0.0 0.0 oi 0.0 i
C24:l oi 0.3 Õ.3 0.2 03 03
€22:5 O-6 1.4 1.3 1.2 L2 1.1 i
€22:5 ó»3 3.9 3.7 2.5 3.6 ?.9
€22:6 n»3 43.3 40.8 40.5 42.3 403
Tabela 27: Separação em classes lipídicas por cromatografia flash (% por peso)
Separação de Classe Lipidica PTA- 10208 Óleo Final N£ 1 PTA- 10208 Óleo Final N£ 2 PTA- 10208 Óleo Final N£ 3 PTA- 10208 Óleo Final N£ 4 PTA- 10208 Óleo Final N£ 5
TAG 93,4 95,4 94, 0 95,7 95, 1
Esteróis/DAG 3,1 2, 9 2, 6 3, 0 2, 9
Recuperação (%) 96, 5 98,3 9 6,6 98,7 98,0
123/131
Tabela 28: Separação em classes lipidicas por CLAE-ELSD (% por peso)
Estares .ásEstená TAG FfA Esteróis U-DÀG |Í>DÀG mãg fatal i
PTA-10208 SfesfisaÍJkl 0.4 90.8 MD 0,8 0.5 0.5 N..D. 93.0 j
PTA-10208 0.4 88.5 MD 0.6 06 1 0.6 N.D. 90,7
PT/V10208 0.3 89.4 ND Ο 0.6 I 0.5 N.D, 91.6 í
PTÃ-ÍO2Õ8 0.3 80 ND 0.8 § 0.5 s 0.5. N.D, 90.1
PT A- ¢020 8 Ófes.FitLaS.Ns5 0.3 80 ND 0.7 0.8 | 0.5 N.D. 88.6
PTA-10208 óte-s íiaU ÍÍ2 í- 0.36 100.76 ND 0.84 0.S4 [ 0.61 j N.D. 103.11 j
ND = não detectado
Óleo Final PTA-10212 [212] DHA estava presente em um óleo final PTA-10212 a 41,63% e 366,9 mg, enquanto EPA estava presente em 16,52%. Perfis de ácidos graxos individuais foram determinados e estão resumidos na Tabela 29.
Tabela 29: Perfis de ácidos graxos de Oil final PTA-10212 (% FAME)
Atiáo €vsxt> % fame
c&e ND
Ç7:0 w
C8:0 ND
C9:0 ND
Cl 0:0 ND
Cl 1:0 ND
CU:0 ND
Cl 3:0 ND
CÍ4:Õ 0.84
C14: s ND
C15:0 1.33
Ci6:C 27.09
C16:l LÔ3
Cl 7:0 0.34
Cs?:l ND
124/131
1.26
Cl8:í íi-9 234
C l8:i n-? 0.18 .....
09:0 ND
0.58
C20.0 0.32
Cl8:3 I>3 ND
CÍÍ4 ND
Cl8:3 ND
C2&2 06
C20:3 n-6 ND
C22:Ô β.Μ
C20:3 n-3 ND
C20:4 n-6 1.34
C22:l rs-9 ND'
C23:C ND
C2O;5 «-3 16.53...............
C24::i) 0.S3
C2O n-9 ND
C22:5n-6 L5G
C22:5 rc,3 1..30
C22:6 n-3 41.63
0.87
ND = não detectado
EXEMPLO 6 [213] Uma análise dos triacilgliceróis (TAG) dos óleos finais PTA-10208 descritas no exemplo 5 foi realizada utilizando técnicas descritas no Exemplo 4. A identificação de cada fragmento de ácido graxo foi feita, como resumido na Tabela 30 abaixo.
Tabela 30: Identificação das Espécies de TAG em Óleo final
PTA-10208
Ares % FfA-10208 Areu.,%........ pdUow ÔUs .Xí 3 Arsa % FÍÃ-4Õ2Õ8 Pisa S'tesl X* 4 FTAdiW s Am %
U Ü) 1.9 L7 D4
8.2 6,0 73 6.8 6.4
fi.2 U 1 10.6 9.5 8.7
DHA/OHA/OIU 8J 36 6 J 5.7
125/131
DFÁ/ÊFA/ÊPA 1.2 69 ............L9 Li LI
DIWDIWWA 3.0 2.4 2.5 2.3 XÔ
bhaoámía DHAA>PA'OHA XÔ X.Ô 33 23
□H.VDWEPA '23 LÔ L.S 13 L?
ΠΒΑΖΟΡΛ/ΡΗΑ L7 L2 „P ..... L2 L2
EPA34:M)HA Id LO 1.8 ÍJ 1.5
D1WWN.0 id i à L4 L3 13
23 2.3 X4 3J 13
124 123 123 L« 13,4
õú f i’o Í33 IO 17,2
EPÂ/HPÀ/Uáj' 3 1 -- w xi 3,7
3Í i 33 2.3 23 2.Ϊ
i U ti 2.0 2.2
DHAA63/OPA 1 3 i 3 1 L4 1.5 S '
DÍWMW O ôi O O LÔ
O LÔ M Í.4 L3
03 14 13 L7 2,0
36 43 S3 5.7 O
0.4 oi 0.7 Ό h
O 4,0 O L6
EXEMP LO 7 [214] Um frasco inóculo de dois dias de idade dos microrganismos isolados depositados na instituição ATCC sob os N— de Acesso PTA-10208 e 10212 foi preparado como uma cultura de carbono e alimentada de nitrogênio em meios de acordo com as Tabelas 1 e 2.
[215] A mutagênese foi realizada de acordo com o seguinte procedimento:
[216] Um frasco estéril de t = 2 dias de idade, cerca de 50 ml, foi vertido para um homogeneizador de vidro estéril de 40 mL. A cultura recebeu 50 mergulhos no homogeneizador. A cultura foi pipetada para fora e filtrada através de um filtro de malha de 50 micra (pm) estéril, o qual foi colocado em um tubo de 50 mL estéril (a malha foi utilizada como um meio de reter os aglomerados maiores de colônias enquanto deixa os aglomerados menores e as células individuais passarem através da malha de 50 micra (pm) .
126/131
Todo o macerado concentrado foi coletado em um tubo de 50 mL estéril. A cultura macerada foi submetida a vórtice e diluições em níveis até 1:100 vezes foram feitas. As amostras diluídas maceradas foram agitadas antes da adição de 200 pL de inóculo para uma placa de meio de agar, 100 x 15 mm, contendo 4-5 esferas de vidro (esferas de vidro 3 mm) . Cada placa foi agitada suavemente em um esforço para que as esferas espalhassem o inoculo uniformemente em torno da placa. As contas foram tirads das placas e as placas foram deixadas para assentar com tampas por aproximadamente 5 minutos para secar. Luzes, tanto no capô estéril e áreas adjacentes foram desligadas uma vez que o procedimento foi realizado com pouca luz. Havia luz mínima disponível para ser capaz de executar o procedimento, mas apenas indireta e fraca.
[217] Cinco placas replicadas foram colocadas no chão da reticulador XL (Spectronics Corporation, Nova Iorque) com as tampas de fora, enquanto as amostras foram irradiadas. O reticulador exerceu uma carga em termos de microjoules e um nível que foi procurado alcançou uma matança de 90%-95%. Cinco placas replicadas de controle foram inoculadas com células não-mutagenizadas, utilizando o mesmo protocolo. Estas contagens de células foram utilizadas para calcular o % de morte. Uma vez que a irradiação foi terminada, as placas foram retiradas, as tampas foram substituídas, e as placas foram envoltas em parafilme seguido por um envoltório em folha de alumínio. Era imperativo que as placas cercecem na primeira semana no escuro, para que não fossem capazes de reparar os genes danificados.
127/131 [218] As placas foram colocadas em uma sala a 22,5°C durante cerca de 10 dias antes da contagem das colônias. Quando as contagens finais foram feitas, as colônias individuais foram escolhidas com um loop de inoculação estéril e ressemeadas em novas placas de meio. Cada colônia foi banhada em um prato individual. Conforme as placas cresciam densas foi retirada uma amostra, utilizando um loop de inoculação, e inoculados em um frasco de agitação de 250 mL estéril contendo 50 mL de meio. Este frasco foi colocado em um agitador a 200 rpm (3,33 Hz) em uma sala a 22,5°C. Em T = 7 dias, a cultura em frasco de agitação foi colhida em um tubo estéril de 50 mL. O pH foi feito e a amostra foi centrifugada para recolher o sedimento de biomassa. Cada amostra foi lavada e re-suspensa em uma mistura de álcool isopropilico 50:50 e água destilada antes de serem re-centrifugados. O sedimento colhido foi liofilizao, pesado, e uma análise de FAME foi realizada. Os dados das Tabelas 31 e 32 representam os mutantes produzidos com o processo acima a partir de estirpes de PTA-10208 e PTA-10212, respectivamente.
Tabela 31: PTA-10208 Mutantes
Figure BR112014001126A2_D0013
128/131
% 1.6:0 24.87 24.07 2.5.01
% 16:1 OJÒ 0,25 0.07 0.07
% 16:2 0 00 0.00 0,00 O-.00
% 16:3 0.00 0,00 0,00
.17:0 ... αι 1.49 í^l. 0,62 0.66
% 18:0 1,13 1.14 0.91 1.01
% l|:ín-9 0.07 0.07 0.06 0,06
% 18:1 n-7 0.00 0,00 0.00 0.ÔÕ
H 18:2 0.00 o.w 0.00 0,00
% 18:3 n4 0.00 0.00 0.05 0.04
% 18;3n-3 0..09 ........m..... 0.17 ÕJ4
% 18:4 n-3 0.00 0.00 O.ÕÕ 0.00
% 20:0 ............oi............. 033 0.24 .................
% 20; l 0.00 0,04 0.00 0,00
% 20:2 íj.OO Ί 0.00· Õ.Ô5 .. Í).(M)
% 20:3 n-9 0,00 0.00 0.00 Ü.OÒ
% 20:3 n-6 032 0.13 0.08 0,04
% 20-:3 n3 0.42 0.42 0.08 0.06........
% 20:4 ARA 0.68 0.67 1.44 1,H
% 20:5 K’3 EPA 6,56 6.47 11.99 J/87
'% 22:0 0.07 Ô.07 . ,.w......... 0.07
% 22:1 0.00 0.00 0.00 0.®
H22:2 0.Π 0.09 010.......... 08
%22:3 0.00 0,00 0.00 0.00
% 22:4 n-6 0.00 0.00 0.00 0.00
% 22:5 n-6 2,32 2.36 2.36 236
% 22:3 n-3 0.48 0.66 0.65
% 22:6^3 DHA 51,58 52.27 48,17 49.35
% 24:0 0.00 0.00 0.00 ooo
% 24:1 0.00 0.00 0.00 ________0.00..........
| - % Gerismt 47.87 49,41 66.00 ^63.12
Dessosiliecsd» : 4.61 : 4.45 4.07......... 4,64
Tabela 32: PTA-10208 Mutantes
Acids·?. Urss® CWs^lS PTA4Ô212 àíutâst? 1 ΡΤΑ-Κ1213 àísíMsftf 2 PTÂ-10214 Matssaa 3 rr.-vi02i5
(58x0 0.00 o.B iJ.OO 0.00
% 09.0 ó.oõ 0.00 0.00 0.00
% 10:0 õ.oò 0.00 oo O.00
% U:0 aiw 0.00 ... 0.00 . 0,00
% 11:1 0.00 ó.m 0.00 Õ.0Õ
% 12 0 o.txi 0.00 0.00 0.90
..... % 12:1 0.00 0.00 0.00 0.00
% 13:0 ó.oo 0.00 0.21 0.2Õ
% 13:1 0.00 . ....... Õ.00
129/131
13:0 Õ.ÕÕ ....... 0-00 .... 0.21
% Í3d .......... ...........w............ ...........0.-00...... tW_^
% 14:0 0.68 a?? 9.62 i
% Md. 0.00 o.m 0-00 aao:
% Md am ãw aw am
% M-Ó 17.36 19.94 ÍW —ML—
% 16:1 U5 2.37
% 16:2 0.00 0.00
% 16:3 ...........am............ 0.06 ........ 0 00 aoo
% 17:0 0.20 0,21 6.18 0.27
% 18:0 ........078...... aE Í79 aii
% I8d n-9 aw JMLJ am . w
% lt:l n-d 0.Í8 9.2.0 a io
% 18:2 (US o.ai ... ..........tw _ . J» _
% IS:3 0.00 aw 0.06 _ ««_
% 18:.1 nd 0.00 ...........0-W. o.oo 6.09..........
% íSdnd too o.oo 0.00 0,.00
% 20:0 0.00 909 am 6.99
20:1 n-Í 0.00 0.06 ...........Õ.0Ú ...... .---- t»™ H
20:2 aw am 0.ÕÕ aw
% 30:3 0.60 aw .................. .. m_|
% » n-6 L ..too _ 0.00 aw tw
% 20:3 nd 0.90 0.77 ............ aw
% ARA § 43 1.3'2 1.65 a-72
% 20:5 nd EFA Π/Ά 14,93 14.14 &54 [
% 22.9 aw ÕB 0.00 am
% 22:1 0.00 0.06 960 0.00
% 22:2 0.00 ..........0.W........... Γ 0.Õ9 ___0M___·
% 1'2:3 0.00 aoo Cjm_. o.w
% 22:4 n-6 0.00 ...........»___________ 0.90 aw
% 22.5 n*4 2.39 1.95 X5Õ 2.18
% 22:3 nd 0.73 Õ.79 0.80 0.68· ......i
% 22:6 nd DHA 59.1 B 54.31 /.59.89 56.39
% 24:G 0.00 aw O.W olid
% 24:1 0.00 am Ü.O0 9.00
ft (líSJf&S FS 45.69 38.98 42.88 48.48
IdB L58 1.27 2.19
EXEMPLO 8 [219] Um óleo foi preparado de acordo com o método descrito no Exemplo 5, em que o óleo foi diluído com óleo de girassol altamente oleico para atingir um teor de, pelo menos, cerca de 500 mg de óleo/g de DHA + EPA combinados. A análise do produto e especificação típica de um óleo feito
130/131 de acordo com este Exemplo são apresentados na Tabela 33.
Tabela 33
Características Químicas Especificação Resultado
Teor de DHA mg/g de óleo Min. 320 382
Teor de EPA mg/g de óleo Min. 130 179
Teor de DHA + EPA mg/g de óleo Min. 500 561
Valor de Peróxido meq/Kg Max. 5, 0 0,1
Valor de Ansidina - Max . 20 4,8
Ácidos Graxos Livres % Max . 0,25 0,1
Umidade e Voláteis % Max . 0,02 < 0,01
Ácidos Graxos Trans % Max . 1 < 1
COMPOSIÇÃO ELEMENTAR
Arsênico ppm Max . 0,1 <0,1
Cádmio ppm Max . 0,1 <0,1
Cobre ppm Max . 0,05 < 0,02
Ferro ppm Max . 0,2 < 0,02
Chumbo ppm Max . 0,1 <0,1
Mercúrio ppm Max . 0,04 < 0,01
[220] Outros ingredientes contidos no óleo incluem menos de 2% de lecitina de girassol; Extrato de alecrim; Tocoferóis e Palmitato de Ascorbil (como antioxidantes).
EXEMPLO 9 [221] Um óleo foi preparado de acordo com o método descrito no Exemplo 5, em que o óleo foi diluído com óleo de girassol altamente oleico para atingir um teor de, pelo menos, cerca de 400 mg de óleo/g de DHA + EPA combinados. A análise do produto e especificação típica de um óleo feito de acordo com este Exemplo são apresentados na Tabela 34.
Tabela 34
Características Químicas Especificação Resultado
131/131
Teor de DHA mg/g de óleo Min. 240 255
Teor de EPA mg/g de óleo Min. 120 155
Teor de DHA + EPA mg/g de óleo Min. 400 411
Valor de Peróxido meq/Kg Max. 5, 0 0,4
Valor de Ansidina - Max . 20 < 1
Ácidos Graxos Livres % Max . 0,25 0,1
Umidade e Voláteis % Max . 0,02 < 0,01
Ácidos Graxos Trans % Max . 1 < 1
COMPOSIÇÃO ELEMENTAR
Arsênico ppm Max . 0,1 <0,1
Cádmio ppm Max . 0,1 <0,1
Cobre ppm Max . 0,05 < 0,02
Ferro ppm Max . 0,2 0,0
Chumbo ppm Max . 0,1 <0,1
Mercúrio ppm Max . 0,04 < 0,01
[222] Outros ingredientes contidos no óleo incluem menos de 2% de lecitina de girassol; Extrato de alecrim; Tocoferóis e Palmitato de Ascorbil (como antioxidantes).
[223] Em algumas formas de realização, os Exemplos 8 e 9 acima são fornecidos em uma cápsula de gel vegetariano de tamanho 20 em um peso de enchimento de cerca de 999 mg a cerca de 1.105 mg de óleo com o peso total da cápsula sendo cerca de 1.463 mg a cerca de 1.789 mg, em que a cápsula tem um tempo de ruptura de não mais do que 15 minutos e tem uma vida útil de cerca de 24 meses.
[224] Todas as várias formas de realização, aspectos e opções aqui descritos podem ser combinados em quaisquer e todas as variações.

Claims (14)

  1. REIVINDICAÇÕES
    1. Óleo microbiano refinado caracterizado pelo fato de que compreende ácidos graxos poliinsaturados ômega-3 que compõem ácido docosahexaenóico e ácido eicosapentaenóico em uma quantidade de cerca de > 90%, por peso, da quantidade total de ácidos graxos poliinsaturados ômega-3, em que a quantidade de ácido eicosapentanóico, por peso, é de cerca de 19% a cerca de 55% da quantidade total de ácido docosahexaenóico e ácido eicosapentanóico, e a quantidade de ácido docosahexaenóico, por peso, é de cerca de 35% a cerca de 71% da quantidade total de ácido docosahexaenóico e ácido eicosapentanóico, em que a quantidade total de ácidos graxos poli-insaturados de ômega-3 é de pelo menos 400 mg por um grama de óleo.
  2. 2. Óleo, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a quantidade de ácido eicosapentanóico, por peso, é de 19% a 43% da quantidade total de ácido docosahexaenóico e ácido eicosapentanóico, e a quantidade de ácido docosahexaenóico, por peso, é de 35% a 47% da quantidade total de ácido docosahexaenóico e ácido eicosapentanóico.
  3. 3. Óleo, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a quantidade de ácido eicosapentanóico, por peso, é de 27% a 54% da quantidade total de ácido docosahexaenóico e ácido eicosapentanóico, e a quantidade de ácido docosahexaenóico, por peso, é de 36% a 63% da quantidade total de ácido docosahexaenóico e ácido eicosapentanóico.
  4. 4. Óleo, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a quantidade de ácido
    2/4 eicosapentanóico, por peso, é de 26% a 38% da quantidade total de ácido docosahexaenóico e ácido eicosapentanóico, e a quantidade de ácido docosahexaenóico, por peso, é de 52% a 64% da quantidade total de ácido docosahexaenóico e ácido eicosapentanóico.
  5. 5. Óleo, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a quantidade de ácido eicosapentanóico, por peso, é de 28% a 36% da quantidade total de ácido docosahexaenóico e ácido eicosapentanóico, e a quantidade de ácido docosahexaenóico, por peso, é de 54% a 62% da quantidade total de ácido docosahexaenóico e ácido eicosapentanóico.
  6. 6. Óleo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 5, caracterizado pelo fato de que os ácidos graxos poliinsaturados ômega-3 ainda compreendem o ácido docosapentaenóico em uma quantidade de 0% a 10%, por peso, da quantidade total de ácidos graxos poliinsaturados ômega3.
    7. Óleo , de acordo com qualquer uma das reivindicações referido óleo 1 a 6, caracterizado pelo fato é produzido por Schizochytrium sp. de que o 8. Óleo , de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 7, caracterizado pelo fato de que o referido óleo compreende menos que 5% por peso de cada um
    de ácido araquidônico, ácido docosapentaenóico n-6, ácido oleico, ácido linoleico, ácido linolênico, ácido eicosanóico, ácido erúcico e ácido estearidônico.
  7. 9. Óleo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 8, caracterizado pelo fato de que o referido óleo é composto por uma fração de triacilgliceróis
    3/4 de 10% por peso, em que pelo menos, 12% por peso, dos ácidos graxos na fração de triacilglicerol é o ácido eicosapentanóico, em que 25%, por peso, dos ácidos graxos na fração de triacilglicerol é o ácido docosahexaenóico e em que menos que 5%, por peso, dos ácidos graxos na fração de triacilglicerol é o ácido araquidônico.
  8. 10. Óleo microbiano refinado caracterizado pelo fato de que compreende ácidos graxos poliinsaturados ômega-3 que compõem ácido docosahexaenóico e ácido eicosapentaenóico no valor de > 90%, por peso, da quantidade total de ácidos graxos poliinsaturados ômega-3; e docosapentaenóico ácido em uma quantidade de 0% a 2%, por peso, da quantidade total de ácidos graxos poliinsaturados ômega-3, em que a quantidade de ácido eicosapentanóico, por peso, é de 10% a 25% da quantidade total de ácido docosahexaenóico e ácido eicosapentanóico, a quantidade de ácido docosahexaenóico, por peso, é de 75% a 90% da quantidade total de ácido docosahexaenóico e ácido eicosapentanóico, em que a quantidade total de ácidos graxos poli-insaturados de ômega-3 é de pelo menos 400 mg por um grama de óleo.
  9. 11. Óleo, de acordo com a reivindicação 10, caracterizado pelo fato de que o referido óleo compreende de 55 mg a 150 mg de ácido eicosapentaenóico por um grama de óleo; a partir de 410 mg a 540 mg de ácido docosahexaenóico por um grama de óleo; e de 0 a 12 mg de ácido docosapentaenóico por um grama de óleo.
  10. 12. Óleo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 11, caracterizado pelo fato de que a quantidade total de ácidos graxos poliinsaturados ômega-3 é de 400 mg a 750 mg por um grama de óleo.
    4/4
  11. 13. Óleo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 11, caracterizado pelo fato de que a quantidade total de ácidos graxos poliinsaturados ômega-3 é de 500 mg por um grama de óleo.
  12. 14. Óleo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 11, caracterizado pelo fato de que a quantidade total de ácido docosahexaenóico e ácido eicosapentaenóico é de 500 mg por um grama de óleo.
  13. 15. Óleo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 14, caracterizado pelo fato de que o referido óleo compreende uma proporção de EPA:DHA selecionada a partir de (1:1) a (1:1,5), (1:1) a (1:2), (1:1,5) a (1:2), (1:1) a (1:2,5), (1:2) a (1:2,5) e (1:4) a (1:7) em peso de ácidos graxos polinsaturados ômega-3 totais.
  14. 16. Forma de dosagem oral, caracterizado pelo fato de que compreende o óleo como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 15.
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