JP5658034B2 - 油性真核生物中の多価不飽和脂肪酸および総脂質含量を変更するためのペルオキシソーム生合成因子（ｐｅｘ）タンパク質の中断 - Google Patents

油性真核生物中の多価不飽和脂肪酸および総脂質含量を変更するためのペルオキシソーム生合成因子（ｐｅｘ）タンパク質の中断 Download PDF

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Description

本明細書は、どちらも２００７年１０月３日に出願され、どちらもその全体を参照によって本明細書に援用する、米国仮特許出願第６０／９７７，１７４号明細書および米国仮特許出願第６０／９７７，１７７号明細書の優先権を主張する。
本発明は、生物工学分野にある。より具体的には本発明は、ペルオキシソーム生合成因子（Ｐｅｘ）タンパク質の中断に基づいて、真核生物の多価不飽和脂肪酸（ＰＵＦＡ）組成および脂質含量を操作するのに有用な方法に関する。
多価不飽和脂肪酸［「ＰＵＦＡ」］、特にω−３およびω−６ＰＵＦＡと関連付けられている健康上の利点は、文献で十分に立証されている。大量のω−３およびω−６ＰＵＦＡを製造する方法を見つけるために、研究者らは彼らの研究を遺伝子の発見、および脂質および脂肪酸をもたらすコードされた生合成経路の理解に向けている。
これらのＰＵＦＡを生成する１つの努力により、天然ではω−３／ω−６ＰＵＦＡを産生しない生物に、ω−３／ω−６ＰＵＦＡ生合成経路を導入した。大規模に操作されたこのような１つの生物が、非油性酵母サッカロミセス・セレヴィシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）である。しかし、リノール酸［「ＬＡ」］、γ−リノレン酸［「ＧＬＡ」］、α−リノレン酸［「ＡＬＡ」］、ステアリドン酸［「ＳＴＡ」］および／またはエイコサペンタエン酸［「ＥＰＡ」］の限定的生成を実証した予備段階の結果は、いずれも商業的開発に適さない。
大量のω−３／ω−６ＰＵＦＡを生成する別の努力では、例えば従属栄養珪藻キクロテラ（Ｃｙｃｌｏｔｅｌｌａ）種およびニッチア（Ｎｉｔｚｓｃｈｉａ）種、シュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）、アルテロモナス（Ａｌｔｅｒｏｍｏｎａｓ）またはシュワネラ（Ｓｈｅｗａｎｅｌｌａ）種、クサレカビ（Ｐｙｔｈｉｕｍ）、またはモルティエラ・エロンガータ（Ｍｏｒｔｉｅｒｅｌｌａ ｅｌｏｎｇａｔａ）、Ｍ．エクシグア（ｅｘｉｇｕａ）またはＭ．ハイグロフィラ（ｈｙｇｒｏｐｈｉｌａ）属の糸状菌などの選択された脂肪酸を天然に産生する微生物が培養された。
これらの努力は全て、発酵が微生物の天然の能力に依存するため、油の収率を実質的に改善できず、または生成する油組成の特徴を制御できないという欠点がある。
同一譲受人の特許文献１は、ＰＵＦＡ生成のための生産宿主としての油性酵母ヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）の使用について記載している。油性酵母は油を天然に合成して、典型的に細胞の乾燥重量の２５％を超える量を蓄積できる酵母と定義される。生産宿主の最適化については、当該技術分野において記載されている（例えば特許文献２〜５を参照されたい）。そこに記載されている組み換え株は、異種のデサチュラーゼ、エロンガーゼ、およびアシル基転移酵素の複数コピーを発現する様々なキメラ遺伝子を含んでなり、任意に様々な天然デサチュラーゼおよびアシル基転移酵素ノックアウトを含んでなり、ＰＵＦＡの合成および蓄積を可能にする。ＰＵＦＡの商業生産のために、宿主細胞のさらなる最適化が必要である。
Ｌｉｎ Ｙ．らは、ペルオキシソームが異化および同化脂質代謝の双方に必要であることを提案する（非特許文献１）。しかしこの仮説は、異常なペルオキシソーム生合成および脂肪酸合成（すなわちｓｓｅ１種子中では油が野性型のおよそ１０〜１６％に減少することが報告された）の双方を有する、アラビドプシス（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ）変異体中のＰｅｘ１６ｐの相同体に関する研究に基づいていた。非特許文献２もまた、サッカロミセス・セレヴィシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）中のペルオキシソームと脂質体の間の密接な協力を実証した。しかし以前のＰｅｘノックアウトの研究は、ＰＵＦＡ産生生物中では実施されていない。
出願人らは、Ｙ．リポリティカ（Ｙ．ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）組み換えＰＵＦＡ産生株中の総脂肪酸の％としてのＰＵＦＡ量の増大に予測不可能な結果をもたらす、ＰＵＦＡ産生生物中のペルオキシソーム生合成因子タンパク質中断の予測不可能な機序によって、ＰＵＦＡ商業生産のための宿主細胞最適化という表明された問題を解決した。ペルオキシソーム生合成因子タンパク質の中断を含有する、新しい株について本明細書に記載する。
米国特許第７，２３８，４８２号明細書 国際公開第２００６／０３３７２３号パンフレット 米国特許出願公開第２００６−００９４０９２号明細書 米国特許出願公開第２００６−０１１５８８１号明細書 米国特許出願公開第２００６−０１１０８０６号明細書
Ｐｌａｎｔ Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ，１３５：８１４〜８２７（２００４年） Ｂｉｎｎｓ，Ｄ．ら、Ｊ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．，１７３（５）：７１９〜７３１（２００６年）
発明の要約
本明細書に記載されているのは、総脂質含量、総脂質画分、および油画分を有する油性真核生物中の総脂肪酸［「ＴＦＡ」］重量％に対する少なくとも１つの多価不飽和脂肪酸［「ＰＵＦＡ」］の重量％を増大させる方法であり、
ａ）１）機能性多価不飽和脂肪酸生合成経路をコードする遺伝子と、
２）ペルオキシソーム生合成因子タンパク質をコードする天然遺伝子中の中断と
を含んでなる油性真核生物を提供することによって、ＰＥＸ中断生物を提供するステップと、
ｂ）ペルオキシソーム生合成因子タンパク質をコードする天然遺伝子がいずれも中断されていない油性真核生物における、総脂質画分中または油画分中の総脂肪酸の重量％に対する少なくとも１つの多価不飽和脂肪酸の重量％と比較して、総脂質画分または油画分中の総脂肪酸の重量％に対する少なくとも１つの多価不飽和脂肪酸の重量％を増大させる条件下で、ＰＥＸ中断生物を生育させるステップと、
を含んでなる。
この増大させる方法を使用して、（ａ）および（ｂ）と同一ステップを適用することで、乾燥細胞重量［「ＤＣＷ」］に対する少なくとも１つの多価不飽和脂肪酸［「ＰＵＦＡ」］の％を増大させてもよい。
本明細書に記載されているいくつかの方法では、ＴＦＡの重量％に対するＰＵＦＡの重量％は少なくとも１．３倍に増大する。
いくつかの記載されている方法では、ＰＥＸ中断生物中の総脂質含量は、天然ＰＥＸ遺伝子中に中断を有さない油性真核生物と比較して、増大または減少し得る。
これらの方法のいずれでも、増大するＰＵＦＡは、単一ＰＵＦＡまたはＰＵＦＡの組み合わせであってもよい。どちらの場合でも、増大するＰＵＦＡまたは増大するＰＵＦＡの組み合わせは、リノール酸、抱合型リノール酸、γ−リノレン酸、ジホモ−γ−リノレン酸、アラキドン酸、ドコサテトラエン酸、ω−６ドコサペンタエン酸、α−リノレン酸、ステアリドン酸、エイコサテトラエン酸、エイコサペンタエン酸、ω−３ドコサペンタエン酸、エイコサジエン酸、エイコサトリエン酸、ドコサヘキサエン酸、これらのヒドロキシル化またはエポキシ脂肪酸、Ｃ18多価不飽和脂肪酸またはそれらの組み合わせ、Ｃ20多価不飽和脂肪酸またはそれらの組み合わせ、Ｃ20〜22多価不飽和脂肪酸とＣ22多価不飽和脂肪酸との組み合わせ、またはこれらの組み合わせを含むことができる。
これらのいずれの方法でも、ＰＥＸ中断生物は次の一員であってもよい。油性特質を有するヤロウィア（Ｙａｒｒｏｗｉａ）、カンジダ（Ｃａｎｄｉｄａ）、ロドトルラ（Ｒｈｏｄｏｔｏｒｕｌａ）、ロドスポリジウム（Ｒｈｏｄｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ）、クリプトコッカス（Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）、トリコスポロン（Ｔｒｉｃｈｏｓｐｏｒｏｎ）、リポマイセス（Ｌｉｐｏｍｙｃｅｓ）、モルティエラ（Ｍｏｒｔｉｅｒｅｌｌａ）、スラウストキトリウム（Ｔｈｒａｕｓｔｏｃｈｙｔｒｉｕｍ）、シゾキトリウム（Ｓｃｈｉｚｏｃｈｙｔｒｉｕｍ）、およびサッカロミセス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）。そして記載されている方法のいずれにおいても、ＰＵＦＡ生合成経路は、次の酵素のいずれかまたは組み合わせをコードする遺伝子を含む。Δ９デサチュラーゼ、Δ１２デサチュラーゼ、Δ６デサチュラーゼ、Δ５デサチュラーゼ、Δ１７デサチュラーゼ、Δ８デサチュラーゼ、Δ１５デサチュラーゼ、Δ４デサチュラーゼ、Ｃ14/16エロンガーゼ、Ｃ16/18エロンガーゼ、Ｃ18/20エロンガーゼ、Ｃ20/22エロンガーゼ、およびΔ９エロンガーゼ。
中断は、以下をはじめとするペルオキシソーム生合成因子タンパク質をコードするＰＥＸ遺伝子に生じてもよい。Ｐｅｘ１ｐ、Ｐｅｘ２ｐ、Ｐｅｘ３ｐ、Ｐｅｘ３Ｂｐ、Ｐｅｘ４ｐ、Ｐｅｘ５ｐ、Ｐｅｘ５Ｂｐ、Ｐｅｘ５Ｃｐ、Ｐｅｘ５／２０ｐ、Ｐｅｘ６ｐ、Ｐｅｘ７ｐ、Ｐｅｘ８ｐ、Ｐｅｘ１０ｐ、Ｐｅｘ１２ｐ、Ｐｅｘ１３ｐ、Ｐｅｘ１４ｐ、Ｐｅｘ１５ｐ、Ｐｅｘ１６ｐ、Ｐｅｘ１７ｐ、Ｐｅｘ１４／１７ｐ、Ｐｅｘ１８ｐ、Ｐｅｘ１９ｐ、Ｐｅｘ２０ｐ、Ｐｅｘ２１ｐ、Ｐｅｘ２１Ｂｐ、Ｐｅｘ２２ｐ、Ｐｅｘ２２ｐ様、およびＰｅｘ２６ｐ。そしてこれらの方法のいずれにおいても、中断は、タンパク質のＣ末端部分をコードする遺伝子の一部における遺伝子ノックアウトまたは欠失であってもよい。これらのいくつかの方法では、欠失は、タンパク質のＣ3ＨＣ4亜鉛リングフィンガーモチーフのＣ末端部分をコードする遺伝子の部分にある。
請求項１に記載の方法によって達成される少なくとも１つのＰＵＦＡ重量％の増大を経験した、ＰＥＸ中断生物中の油画分または総脂質画分についてもまた、本明細書に記載されている。Ｐｅｘ３ｐまたはＰｅｘ１０ｐまたはＰｅｘ１６ｐをコードする天然遺伝子中に中断を有するＰＥＸ中断ヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）についてもまた、本明細書に記載されている。このＹ．リポリティカ（Ｙ．ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）は、ＡＴＣＣ称号ＡＴＣＣ ＰＴＡ−８６１４（Ｙ４１２８株）を有してもよい。
生物学的寄託
以下の生体物質が１０８０１ユニバーシティ・ブールヴァード、マナッサス、ＶＡ２０１１０−２２０９の米国微生物系統保存機関（ＡＴＣＣ）に寄託され、以下の命名、登録番号、および寄託日を有する。
Figure 0005658034
上に列挙した生体物質は、「特許手続上の微生物の寄託の国際的承認に関するブダペスト条約」の条項に従って寄託された。列挙した寄託物は、表示された国際受託機関に少なくとも３０年間保存され、それを開示する特許の付与時に一般に公開される。寄託株の利用可能性は、政府の行動によって付与された特許権を失墜させて主題発明を実施する認可とはみなされない。
図１Ｂと共にω−３／ω−６脂肪酸生合成経路を図示し、下のこの経路の説明を考察する際には合わせ見るべきである。 図１Ａと共にω−３／ω−６脂肪酸生合成経路を図示し、下のこの経路の説明を考察する際には合わせ見るべきである。 次のＣ3ＨＣ4亜鉛リングフィンガーモチーフのアラインメントを提供する。ヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）Ｐｅｘ１０ｐ（すなわち配列番号１０［ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＣＡＧ８１６０６］のアミノ酸３２７〜３６４）、ヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）Ｐｅｘ２ｐ（すなわち配列番号２［ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＣＡＧ７７６４７］のアミノ酸２６６〜３２３）、およびヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）Ｐｅｘ１２ｐ（すなわち配列番号１１［ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＣＡＧ８１５３２］のアミノ酸３４２〜３９１）。保存されたＣ3ＨＣ4亜鉛リングフィンガーモチーフのシステインおよびヒスチジン残基を星印によって示す。 Ｙ．リポリティカ（Ｙ．ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）Ｐｅｘ１０ｐ Ｃ3ＨＣ4フィンガーモチーフの様々なアミノ酸残基と、それらが結合する２個の亜鉛イオンとの間の提案される相互作用を模式的に図示する。 総脂質画分中に３７．６％のＥＰＡを産生するヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）Ｙ４１２８株の作成を図示する。 ｐＺＰ３−Ｐａ７７７Ｕのプラスミドマップを提供する。 ｐＹ１１７のプラスミドマップを提供する。 ｐＺＰ２−２９８８のプラスミドマップを提供する。 ｐＺＫＵＥ３Ｓのプラスミドマップを提供する。 ｐＦＢＡＩＮ−ＭＯＤ−１のプラスミドマップを提供する。 ｐＦＢＡＩＮ−ＰＥＸ１０のプラスミドマップを提供する。 ｐＥＸＰ−ＭＯＤ−１のプラスミドマップを提供する。 ｐＰＥＸ１０−１のプラスミドマップを提供する。 ヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）Ｙ４１８４Ｕ株の作成を図示する。 ｐＺＫＬ１−２ＳＰ９８Ｃのプラスミドマップを提供する。 ｐＺＫＬ２−５Ｕ８９ＧＣのプラスミドマップを提供する。 ｐＹＰＳ１６１のプラスミドマップを提供する。 ｐＹＲＨ１３のプラスミドマップを提供する。 ヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）Ｙ４３０５Ｕ３株の作成を図示する。 ｐＺＫＵＭのプラスミドマップを提供する。 ｐＺＫＤ２−５Ｕ８９Ａ２のプラスミドマップを提供する。 ｐＹ８７のプラスミドマップを提供する。 ｐＹ１５７のプラスミドマップを提供する。
本発明は、本明細書の一部をなす以下の詳細な説明および添付の配列説明から、より完全に理解できる。
次の配列は、３７Ｃ．Ｆ．Ｒ．１．§８２１〜１．８２５（「ヌクレオチド配列および／またはアミノ酸配列開示を含む特許出願の要件−配列規則」）を満たし、世界知的所有権機関（ＷＩＰＯ）標準ＳＴ．２５（１９９８年）、およびＥＰＯおよびＰＣＴの配列表要件（規則５．２および４９．５（ａの２）、および実施細則第２０８号および附属書Ｃ）に一致する。ヌクレオチドおよびアミノ酸配列データのために使用される記号および型式は、３７Ｃ．Ｆ．Ｒ．§１．８２２に記載の規則に従う。
配列番号１〜８６は、表１に示すような、プライマー、遺伝子またはタンパク質（またはそれらの部分）をコードするＯＲＦ、あるいはプラスミドである。
Figure 0005658034
Figure 0005658034
Figure 0005658034
Figure 0005658034
ＰＵＦＡ産生真核生物中の長鎖多価不飽和脂肪酸［「ＬＣ−ＰＵＦＡ」］の濃度（総脂肪酸の％として）、および含量（乾燥細胞重量の％として）を操作する一般的方法について本明細書に記載する。これらの方法は、宿主内の天然ペルオキシソーム生合成因子［「Ｐｅｘ」］タンパク質の中断に依存し、藻類、真菌、卵菌綱、酵母、ユーグレナ属、ストラメノパイル、植物、およびいくつかの哺乳類系をはじめとする、ＰＵＦＡを産生する天然または遺伝改変された能力を有する多様な真核生物に対して広範な適応性を有する。
ＰＵＦＡ、またはその誘導体は、食事代用物、または栄養補給剤、特に乳児用調製粉乳として、静脈内栄養補給を受ける患者のために、または栄養失調を予防しまたは治療するために使用できる。例えば、料理用油、脂肪またはマーガリン中にＰＵＦＡを組み込んで、消費者が日常の食事の一部として摂取することによって、消費者が所望の食事補給を得られるようにしてもよい。さらに、ＰＵＦＡはまた、乳児用調製粉乳、栄養補給剤またはその他の食品中に組み込んでもよく、抗炎症薬またはコレステロール低下剤としての用途があるかもしれない。場合により組成物は、ヒトまたは動物のいずれかのため製薬用途に使用してもよい。
定義
本開示では、いくつかの用語および略語を使用する。以下の定義が提供される。
「読み取り枠」はＯＲＦと略記される。
「ポリメラーゼ連鎖反応」はＰＣＲと略記される。
「米国微生物系統保存機関」はＡＴＣＣと略記される。
「多価不飽和脂肪酸」はＰＵＦＡと略記される。
「トリアシルグリセロール」はＴＡＧと略記される。
「総脂肪酸」は「ＴＦＡ」と略記される。
「脂肪酸メチルエステル」は「ＦＡＭＥ」と略記される。
「乾燥細胞重量」は「ＤＣＷ」と略記される。
「発明」または「本発明」という用語は、本明細書での用法では限定を意図せず、特許請求の範囲で定義されるかまたは本明細書に記載される本発明のいずれにも全般的に当てはまる。
「ペルオキシソーム」という用語は、全ての真核細胞に見られる遍在性細胞小器官を指す。それらは、内容物を細胞質ゾルから隔て、後述の機能に必須である様々な膜タンパク質を含む単一脂質二重層膜を有する。ペルオキシソームは、「拡張シャトル機構」を通じて選択的にタンパク質を取り込む。より具体的には、ペルオキシンとしてもまた知られている既知のペルオキシソームタンパク質が少なくとも３２個あり、ペルオキシソーム膜を通じたＡＴＰ加水分解の手段によるタンパク質取り込み過程に関与する。いくつかのペルオキシンは、Ｎ末端またはＣ末端のどちらかに特異的タンパク質シグナル、すなわちペルオキシソームを標的とするシグナルまたは「ＰＴＳ」を含んでなり、ペルオキシソーム膜を通じた取り込みが起こるべきことを伝達する。ひとたび細胞タンパク質がペルオキシソーム中に取り込まれると、それらは典型的に何らかの分解措置を受ける。例えば、ペルオキシソームは、細胞にとって有毒な物質を分解できるようにするカタラーゼ、Ｄ−アミノ酸オキシダーゼ、および尿酸オキシダーゼなどの酸化的酵素を含有する。あるいはペルオキシソームは、β−酸化と称される過程において脂肪酸分子を分解してアセチル−ＣｏＡの遊離分子を生成し、それは細胞質ゾル中に戻されて取り込まれる。
「ペルオキシソーム生合成因子タンパク質」、「ペルオキシン」、および「Ｐｅｘタンパク質」という用語は同義であり、ペルオキシソーム生合成に関与するタンパク質、および／またはＡＴＰ加水分解の手段によるペルオキシソーム膜を通じた細胞性のタンパク質取り込み過程に関与するタンパク質を指す。これらのタンパク質のいずれかをコードする遺伝子の頭字語が「Ｐｅｘ遺伝子」である。Ｐｅｘ遺伝子命名法の体系については、Ｄｉｓｔｅｌら、Ｊ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．，１３５：１〜３（１９９６年）に記載されている。これまでに少なくとも３２個の異なるＰｅｘ遺伝子が、様々な真核生物中で同定されている。異常なペルオキシソーム機能または構造を示す変異株の分析から、多数のＰｅｘ遺伝子が単離されている。１７の異なる真菌種のゲノム配列のコンピュータシミュレーションによる分析が実施された、Ｋｉｅｌ，Ｊ．Ａ．Ｋ．Ｗ．ら（Ｔｒａｆｆｉｃ，７：１２９１〜１３０３（２００６年））によるレビューに基づいて、次のＰｅｘタンパク質が同定された。Ｐｅｘ１ｐ、Ｐｅｘ２ｐ、Ｐｅｘ３ｐ、Ｐｅｘ３Ｂｐ、Ｐｅｘ４ｐ、Ｐｅｘ５ｐ、Ｐｅｘ５Ｂｐ、Ｐｅｘ５Ｃｐ、Ｐｅｘ５／２０ｐ、Ｐｅｘ６ｐ、Ｐｅｘ７ｐ、Ｐｅｘ８ｐ、Ｐｅｘ１０ｐ、Ｐｅｘ１２ｐ、Ｐｅｘ１３ｐ、Ｐｅｘ１４ｐ、Ｐｅｘ１５ｐ、Ｐｅｘ１６ｐ、Ｐｅｘ１７ｐ、Ｐｅｘ１４／１７ｐ、Ｐｅｘ１８ｐ、Ｐｅｘ１９ｐ、Ｐｅｘ２０ｐ、Ｐｅｘ２１ｐ、Ｐｅｘ２１Ｂｐ、Ｐｅｘ２２ｐ、Ｐｅｘ２２ｐ様、およびＰｅｘ２６ｐ。したがってこれらの各タンパク質は本明細書では「Ｐｅｘタンパク質」、「ペルオキシン」または「ペルオキシソーム生合成因子タンパク質」と称され、少なくとも１つの「Ｐｅｘ遺伝子」によってコードされる。
「保存ドメイン」または「モチーフ」という用語は、進化的に関連したタンパク質の整合配列に沿って特定の位置で保存されたアミノ酸のセットを指す。その他の位置のアミノ酸は、相同的なタンパク質間で変動できるが、特定の位置で高度に保存されたアミノ酸は、タンパク質の構造、安定性、または活性に必須であるアミノ酸であることを示唆する。それらはタンパク質相同体ファミリーの整合配列中のそれらの高度な保存によって同定されるので、それらを識別子または「シグネチャー」として使用して、新たに判定された配列のタンパク質が以前同定されたタンパク質ファミリーに属するかどうかを判定できる。それに関連してＰｅｘ２ｐ、Ｐｅｘ１０ｐ、およびＰｅｘ１２ｐは全て、それらのカルボキシル末端の近辺に、Ｃ3ＨＣ4亜鉛リングフィンガーモチーフとして知られているシステインに富むモチーフを共有する。このモチーフは、タンパク質のドッキングおよびペルオキシソーム内への転位に関与し、それらの活性に必要なようである（Ｋｉｅｌ，Ｊ．Ａ．Ｋ．Ｗ．ら、Ｔｒａｆｆｉｃ，７：１２９１〜１３０３（２００６年））。
「Ｃ3ＨＣ4亜鉛リングフィンガーモチーフ」または「Ｃ3ＨＣ4モチーフ」という用語は、総称的に、式Ｉに記載のアミノ酸配列存在によって同定される、２つの亜鉛イオンを結合する保存されたシステインに富むモチーフを指す。
式Ｉ：ＣＸ2ＣＸ9-27ＣＸ1-3ＨＸ2ＣＸ2ＣＸ4-48ＣＸ2Ｃ
ペルオキシソーム生合成因子１０タンパク質をコードするヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）遺伝子、すなわちＹｌＰｅｘ１０ｐ内のＣ3ＨＣ4亜鉛リングフィンガーモチーフは配列番号１０のアミノ酸３２７〜３６４の間に位置し、ＣＸ2ＣＸ11ＣＸ1ＨＸ2ＣＸ2ＣＸ10ＣＸ2Ｃモチーフ（配列番号２５）によって定義される。ペルオキシソーム生合成因子２タンパク質をコードするＹ．リポリティカ（Ｙ．ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）遺伝子、すなわちＹｌＰｅｘ２ｐ内のＣ3ＨＣ4亜鉛リングフィンガーモチーフは、配列番号２のアミノ酸２６６〜３２３の間に位置する。Ｙ．リポリティカ（Ｙ．ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）ペルオキシソーム生合成因子１２タンパク質、すなわちＹｌＰｅｘ１２ｐは、配列番号１１のアミノ酸３４２〜３９１の間に位置する不完全Ｃ3ＨＣ4リングフィンガーモチーフを含有する。ＹｌＰｅｘ１０、ＹｌＰｅｘ２、およびＹｌＰｅｘ１２のＣ3ＨＣ4亜鉛リングフィンガーモチーフに対応するタンパク質配列を全て図２Ａに整列させた。星印は、モチーフの保存されたシステインまたはヒスチジン残基を示す。
ＹｌＰｅｘ１０、ＹｌＰｅｘ２、およびＹｌＰｅｘ１２は、タンパク質−タンパク質相互作用によってリングフィンガー複合体を形成すると考えられる。２つの亜鉛残基があるＹｌＰｅｘ１０ｐのＣ3ＨＣ4フィンガーモチーフのシスチンとヒスチジン残基間の提案される相互作用を図２Ｂに模式的に図示する。
「Ｐｅｘ１０」という用語は、ペルオキシソーム生合成因子１０タンパク質またはペルオキシソームアセンブリータンパク質ペルオキシン１０をコードする遺伝子を指し、ペルオキシンタンパク質は下文において「Ｐｅｘ１０ｐ」と称される。Ｐｅｘ１０ｐの機能は明確に解明されていないが、その他の生物における研究は、Ｐｅｘ１０生成物がペルオキシソーム膜中に局在し、細胞小器官の正常な機能化に必須であることを明らかにした。Ｃ3ＨＣ4亜鉛リングフィンガーモチーフはＰｅｘ１０ｐのＣ末端領域中に保存されているようであり（Ｋａｌｉｓｈ，Ｊ．Ｅ．ら、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．，１５：６４０６〜６４１９（１９９５年）；Ｔａｎ，Ｘ．ら、Ｊ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．，１２８：３０７〜３１９（１９９５年）；Ｗａｒｒｅｎ，Ｄ．Ｓ．ら、Ａｍ．Ｊ．Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅｔ．，６３：３４７〜３５９（１９９８年））、酵素活性に必要とされる。
「ＹｌＰｅｘ１０」という用語は、ペルオキシソーム生合成因子１０タンパク質をコードするヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）遺伝子を指し、タンパク質は下文において「ＹｌＰｅｘ１０ｐ」と称される。この特定のペルオキシンは、最近Ｓｕｍｉｔａら（ＦＥＭＳ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｌｅｔｔ．，２１４：３１〜３８（２００２年））によって研究された。ＹｌＰｅｘ１０のヌクレオチド配列は、ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＣＡＧ８１６０６（配列番号１０）、ＡＢ０３６７７０（配列番号２０、２１、および２２）、およびＡＪ０１２０８４（配列番号２３および２４）をはじめとする複数の登録番号の下にＧｅｎＢａｎｋに登録された。配列番号２４に記載のＹｌＰｅｘ１０ｐ配列は、長さが３５４個のアミノ酸である。対照的に配列番号１０および配列番号２２に記載のＹｌＰｅｘ１０ｐ配列は、１００％同一の配列が追加的な２３個のアミノ酸をタンパク質のＮ末端に有するので、それぞれ長さが３７７個のアミノ酸である（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＡＪ０１２０８４（配列番号２４）で同定されるのとは異なる開始コドンに対応する）。
「Ｐｅｘ３」という用語はペルオキシソーム生合成因子３タンパク質またはペルオキシソームアセンブリータンパク質ペルオキシン３をコードする遺伝子を指し、ペルオキシンタンパク質は下文において「Ｐｅｘ３ｐ」と称される。Ｐｅｘ３ｐの機能に関する機構的詳細は明らかには解明されていないが、Ｐｅｘ３ｐが、ペルオキシソーム膜形成のためのペルオキシソーム生合成初期に必要とされるペルオキシソーム内在性膜タンパク質であることは明らかである（例えばＢａｅｒｅｎｄｓ，Ｒ．Ｊ．ら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２７１：８８８７〜８８９４（１９９６年）；Ｂａｓｃｏｍ，Ｒ．Ａ．ら、Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．Ｃｅｌｌ，１４：９３９〜９５７（２００３年）を参照されたい）。
「ＹｌＰｅｘ３」という用語は、ペルオキシソーム生合成因子３タンパク質をコードするヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）遺伝子を指し、タンパク質は下文において「ＹｌＰｅｘ３ｐ」と称される。ＹｌＰｅｘ３のヌクレオチド配列は、ＧｅｎＢａｎｋに登録番号ＣＡＧ７８５６５（配列番号３）として登録された。
「Ｐｅｘ１６」という用語は、ペルオキシソーム生合成因子１６タンパク質またはペルオキシソームアセンブリータンパク質ペルオキシン１６をコードする遺伝子を指し、ペルオキシンタンパク質は下文において「Ｐｅｘ１６ｐ」と称される。Ｐｅｘ１６ｐの機能は明らかには解明されていないが、その他の様々な生物における研究は、Ｐｅｘ１６生成物がペルオキシソーム膜形成およびペルオキシソーム増殖制御で役割を果たすことを明らかにした（Ｐｌａｔｔａ，Ｈ．Ｗ．およびＲ．Ｅｒｄｍａｎｎ，Ｔｒｅｎｄｓ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．，１７（１０）：４７４〜４８４（２００７年））。
「ＹｌＰｅｘ１６」という用語は、ペルオキシソーム生合成因子１６タンパク質をコードするヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）遺伝子を指し、タンパク質は下文において「ＹｌＰｅｘ１６ｐ」と称される。この特有のペルオキシンについては、Ｅｌｉｚｅｎ Ｇ．Ａ．ら（Ｊ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．，１３７：１２６５〜１２７８（１９９７年））およびＴｉｔｏｒｅｎｋｏ，Ｖ．Ｉ．ら（Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．，１７：５２１０〜５２２６（１９９７年））に記載されている。ＹｌＰｅｘ１６のヌクレオチド配列は、ＧｅｎＢａｎｋに登録番号ＣＡＧ７９６２２（配列番号１４）として登録された。
天然Ｐｅｘ遺伝子中のまたはそれと関連した「中断」という用語は、遺伝子がゲノムから欠失していかなるタンパク質も翻訳されないような完全な遺伝子ノックアウトか、または挿入、欠失、アミノ酸置換またはその他の標的を定めた変異を有する翻訳されたＰｅｘタンパク質のどちらかをもたらす、その遺伝子の一部内の挿入、欠失、または標的を定めた変異を指す。タンパク質中の中断の位置は、例えばタンパク質のＮ末端部分内またはタンパク質のＣ末端部分内であってもよい。中断されたＰｅｘタンパク質は、中断されていないＰｅｘタンパク質と比較して損なわれた活性を有し、非機能性であり得る。Ｐｅｘタンパク質をコードする天然遺伝子中の中断としては、制御配列、転写および翻訳因子および／または情報伝達経路の操作を通じて、またはセンス、アンチセンスまたはＲＮＡｉ技術の使用によってもたらされるものなどのＰｅｘタンパク質の低発現または発現欠如をもたらす別の手段が挙げられる。
本明細書での用法では、「ＰＥＸ中断生物」という用語は、機能性多価不飽和脂肪酸生合成経路をコードする遺伝子を含み、ペルオキシソーム生合成因子タンパク質をコードする天然遺伝子中に上で定義される中断を有する、あらゆる油性真核生物を指す。
「脂質」という用語は、あらゆる脂溶性（すなわち親油性）天然分子を指す。脂質は、細胞膜の構成成分、エネルギー保存源、およびシグナル伝達経路中間体などの多数の重要な生物学的機能を有する多様な化合物である。脂質はケトアシル基またはイソプレン基のどちらかから完全にまたは部分的に由来する疎水性または両親媒性の小型分子として広く定義されてもよい。Ｌｉｐｉｄ Ｍｅｔａｂｏｌｉｔｅｓ ａｎｄ Ｐａｔｈｗａｙｓ Ｓｔｒａｔｅｇｙ（ＬＩＰＩＤ ＭＡＰＳ）分類体系（Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｏｆ Ｇｅｎｅｒａｌ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，ＭＤ）に基づく脂質の一般的概要を下の表２に示す。
Figure 0005658034
細胞の「総脂質画分」という用語は、本明細書では細胞の全てのエステル化脂肪酸を指す。トリアシルグリセロール［「油」］画分、ホスファチジルコリン画分、およびホスファチジルエタノールアミン画分をはじめとする、総脂質画分内の様々な下位画分が単離できるが、これは決して全ての下位画分を包含するものではない。
「脂質体」は、リン脂質単層によって、および通常特定のタンパク質によって結合される脂質小滴を指す。これらの細胞小器官は、ほとんどの生物が中性脂質を輸送／保存する部位である。脂質体は、ＴＡＧ生合成酵素を含有する小胞体のミクロドメインから生じると考えられる。それらの合成およびサイズは、特定のタンパク質構成要素によって制御されるようである。
「中性脂質」とは、細胞中において脂質体内に貯蔵脂肪および油として一般に見られる脂質を指し、細胞のｐＨでは脂質は荷電群を有さないためこのように称される。一般にそれらは完全に非極性であり、水に対する親和性がない。中性脂質は一般にグリセロールと脂肪酸のモノ−、ジ−、および／またはトリエステルを指し、それぞれモノアシルグリセロール、ジアシルグリセロールまたはトリアシルグリセロールとも称され、または集合的にアシルグリセロールとも称される。遊離脂肪酸をアシルグリセロールから放出するには、加水分解反応が起きなくてはならない。
「トリアシルグリセロール」［「ＴＡＧ」］および「油」という用語は同義であり、グリセロール分子にエステル化された３つの脂肪酸アシル残基から構成される中性脂質を指す。ＴＡＧは、長鎖ＰＵＦＡ、ならびにより短い飽和および不飽和脂肪酸、およびより長鎖の飽和脂肪酸を含有できる。細胞のＴＡＧ画分はまた「油画分」とも称され、「油生合成」は総称的に細胞内のＴＡＧ合成を指す。油またはＴＡＧ画分は総脂質画分の下位画分であるが、それはまた油性生物中において、乾燥細胞重量の％としての細胞中の総脂肪酸の重量として測定される、総脂質含量の主要部分も構成する［下記参照］。油[「ＴＡＧ」]画分中の脂肪酸組成および総脂質画分の脂肪酸組成は、一般に類似している。したがって総脂質画分中のＰＵＦＡ濃度の増大または減少は、油［「ＴＡＧ」］画分中のＰＵＦＡ濃度の増大または減少に対応し、逆もまた然りである。
「総脂肪酸」［「ＴＦＡ」］という用語は、本明細書では所定のサンプル中において、（当該技術分野で知られているような）塩基エステル交換法によって脂肪酸メチルエステル［「ＦＡＭＥ」］に誘導体化できる全ての細胞脂肪酸の和を指し、それは例えば総脂質画分または油画分であってもよい。したがって総脂肪酸は、ホスファチジルコリン画分、ホスファチジルエタノールアミン画分、およびジアシルグリセロールとモノアシルグリセロールとトリアシルグリセロール［「ＴＡＧまたは油」］画分をはじめとする、中性および極性脂質画分からの脂肪酸を含むが、遊離脂肪酸は含まない。
細胞の「総脂質含量」という用語は、乾燥細胞重量［「ＤＣＷ」］の％としてのＴＦＡの測定値である。したがって総脂質含量［「ＴＦＡ％ＤＣＷ」］は、例えば１００ミリグラムのＤＣＷあたりの総脂肪酸のミリグラムに等しい。
一般に脂肪酸濃度は、本明細書では、例えば１００ミリグラムのＴＦＡあたりの所定の脂肪酸のミリグラムなどのＴＦＡ［「％ＴＦＡ」］の重量％として表される。本開示中で特に断りのない限り、総脂質に対する所定の脂肪酸の％への言及は、％ＴＦＡとしての脂肪酸濃度に等しい（例えば総脂質の％ＥＰＡは、ＥＰＡ％ＴＦＡに等しい）。
場合によっては、細胞中の所定の脂肪酸の含量をその乾燥細胞重量の％［「％ＤＣＷ」］として表すことが有用である。したがって例えばエイコサペンタエン酸％ＤＣＷは、次式に従って求められる。
（エイコサペンタエン酸％ＴＦＡ）*（ＴＦＡ％ＤＣＷ）]／１００
「脂質プロフィール」および「脂質組成」という用語は同義であり、総脂質画分中または油［「ＴＡＧ」］画分中などの特定の脂質画分に含有される個々の脂肪酸の量を指し、量はＴＦＡの％として表される。混合物中に存在する個々の各脂肪酸の和は、１００になるはずである。
本明細書での用法では、「倍の増大」という用語は、数値で乗じることで得られる増大を指す。例えば数量、量、濃度、重量％などを１．３で乗じることは、１．３倍の増大を提供する。
「脂肪酸」という用語は、（より長い、およびより短い鎖長の酸の双方も知られているが）約Ｃ12〜Ｃ22の様々な鎖長の長鎖脂肪族酸（アルカン酸）を指す。優勢な鎖長はＣ16〜Ｃ22の間である。脂肪酸の構造は単純な表記体系「Ｘ：Ｙ」で表され、式中、Ｘは特定の脂肪酸中の炭素［「Ｃ」］原子総数であり、Ｙは二重結合数である。「飽和脂肪酸」対「不飽和脂肪酸」、「一価不飽和脂肪酸」対「多価不飽和脂肪酸」［「ＰＵＦＡ」］、および「オメガ−６脂肪酸」［「ω−６」または「ｎ−６」］対「オメガ−３脂肪酸」［「ω−３」または「ｎ−３」］の違いについて、さらに詳しくは米国特許第７，２３８，４８２号明細書で規定される。
本明細書においてＰＵＦＡを既述するのに使用される命名法を表３に示す。「略記法」と題された欄では、オメガ−参照システムが使用されて炭素数、二重結合数、およびこの目的では番号１のオメガ炭素から数えて、オメガ炭素に最も近い二重結合の位置を示唆する。表の残りは、ω−３およびω−６脂肪酸およびそれらの前駆物質の一般名、本明細書全体で使用される略語、および各化合物を要約する。
Figure 0005658034
本明細書に記載されている方法を使用すると、油性酵母の油画分中には表３に列挙されるω−３／ω−６ＰＵＦＡが蓄積する可能性が最も高いが、この一覧は限定的または完全なものと解釈すべきではない。
本明細書での用法では、「多価不飽和脂肪酸の組み合わせ」または「多価不飽和脂肪酸のあらゆる組み合わせ」という用語は、上で表３に列挙した多価不飽和脂肪酸のいずれか２つ以上の混合物を指す。このような組み合わせは、細胞中の総脂肪酸の重量％をはじめとする、細胞中の多様な濃度または重量％に対して測定できる、濃度および重量％の属性を有する。
代謝経路または生合成経路は、生化学的意味において、細胞内で順番に起きて酵素によって触媒され、細胞によって使用されまたは保存される代謝産物の形成、または「流束発生ステップ」と呼ばれる別の代謝経路の開始のどちらかを達成する一連の化学反応と見なすことができる。これらの経路の多くは複雑であり、開始物質を所望の正確な化学構造を有する生成物に成形する段階を追った改変を伴う。
「ＰＵＦＡ生合成経路」という用語は、オレイン酸をＬＡ、ＥＤＡ、ＧＬＡ、ＤＧＬＡ、ＡＲＡ、ＤＲＡ、ＤＴＡ、およびＤＰＡｎ−６などのω−６脂肪酸に、そしてＡＬＡ、ＳＴＡ、ＥＴｒＡ、ＥＴＡ、ＥＰＡ、ＤＰＡ、およびＤＨＡなどのω−３脂肪酸に変換する代謝過程を指す。この過程については文献に詳細に記載されている。例えば国際公開第２００６／０５２８７０号パンフレットを参照されたい。簡単に述べるとこの過程は、小胞体膜中に存在する「ＰＵＦＡ生合成経路酵素」と称される一連の特別な延長および不飽和化酵素による、炭素原子の付加を通じた炭素鎖の延長、および二重結合の付加を通じた延長分子の不飽和化を伴う。より具体的には「ＰＵＦＡ生合成経路酵素」とは、ＰＵＦＡの生合成と関連付けられている次の酵素（およびそれらをコードする遺伝子）のいずれかを指す。Δ４デサチュラーゼ、Δ５デサチュラーゼ、Δ６デサチュラーゼ、Δ１２デサチュラーゼ、Δ１５デサチュラーゼ、Δ１７デサチュラーゼ、Δ９デサチュラーゼ、Δ８デサチュラーゼ、Δ９エロンガーゼ、Ｃ14/16エロンガーゼ、Ｃ16/18エロンガーゼ、Ｃ18/20エロンガーゼおよび／またはＣ20/22エロンガーゼ。
「ω−３／ω−６脂肪酸生合成経路」という用語は、適切な条件下で発現すると、ω−３およびω−６脂肪酸の片方または双方の生成を触媒する酵素をコードする一組の遺伝子を指す。典型的にω−３／ω−６脂肪酸生合成経路に関与する遺伝子は、ＰＵＦＡ生合成経路酵素をコードする。代表的な経路を図１に示し、様々な中間体を経由するミリスチン酸のＤＨＡへの変換を提供して、ω−３およびω−６脂肪酸の双方が共通の原料からどのように生成できるかを実証する。経路は自然に２つの部分に別れ、１つの部分はω−３脂肪酸、別の部分はω−６脂肪酸のみを発生させる。ω−３脂肪酸のみを発生させる部分を本明細書ではω−３脂肪酸生合成経路と称する一方、ω−６脂肪酸のみを発生させる部分は本明細書ではω−６脂肪酸生合成経路と称する。
「機能性」という用語は、本明細書ではω−３／ω−６脂肪酸生合成経路に関して、経路中の遺伝子のいくつか（または全て）が、活性酵素を発現し、生体内触媒作用または基質変換をもたらすことを意味する。いくつかの脂肪酸生成物は、この経路の遺伝子のサブセットの発現のみを必要とするので、「ω−３／ω−６脂肪酸生合成経路」または「機能性ω−３／ω−６脂肪酸生合成経路」は、上の段落に列挙される遺伝子の全てが必要とされることを暗示しないものとする。
「Δ６デサチュラーゼ／Δ６エロンガーゼ経路」という用語は、最低限少なくとも１つのΔ６デサチュラーゼおよび少なくとも１つのＣ18/20エロンガーゼを含み、それによってＧＬＡおよび／またはＳＴＡを中間体脂肪酸として、ＬＡおよびＡＬＡからそれぞれＤ
ＧＬＡおよび／またはＥＴＡを生合成できるようにするＰＵＦＡ生合成経路を指す。その他のデサチュラーゼおよびエロンガーゼが発現すれば、ＡＲＡ、ＥＰＡ、ＤＰＡ、およびＤＨＡもまた合成されるかもしれない。
「Δ９エロンガーゼ／Δ８デサチュラーゼ経路」という用語は、最低限少なくとも１つのΔ９エロンガーゼおよび少なくとも１つのΔ８デサチュラーゼを含み、それによってＥＤＡおよび／またはＥＴｒＡを中間体脂肪酸として、ＬＡおよびＡＬＡからのそれぞれＤＧＬＡおよび／またはＥＴＡの生合成を可能にするＰＵＦＡ生合成経路を指す。その他のデサチュラーゼおよびエロンガーゼが発現すれば、ＡＲＡ、ＥＰＡ、ＤＰＡ、およびＤＨＡもまた合成されるかもしれない。
「デサチュラーゼ」という用語は、隣接する炭素の１つから水素を取り去り、それによってそれらの間に二重結合を導入することによって、脂肪酸中の隣接する炭素を不飽和化できるポリペプチドを指す。不飽和化からは、対象の脂肪酸または前駆物質が生じる。特定の脂肪酸に言及するために明細書全体を通じてオメガ基準系を使用したにもかかわらず、デルタ系を使用して基質のカルボキシル末端から数えることによってデサチュラーゼ活性を示す方が、より都合がよい。ここで特に興味深いのは、１）基質脂肪酸ＤＧＬＡのＡＲＡへの、および／または基質脂肪酸ＥＴＡのＥＰＡへの変換を触媒するΔ５デサチュラーゼ、２）分子のカルボキシル末端から数えて１７番目と１８番目の炭素原子の間で脂肪酸を不飽和化し、例えば基質脂肪酸ＡＲＡのＥＰＡへの変換および／または基質脂肪酸ＤＧＬＡのＥＴＡへの変換を触媒するΔ１７デサチュラーゼ、３）基質脂肪酸ＬＡのＧＬＡへの変換、および／または基質脂肪酸ＡＬＡのＳＴＡへの変換を触媒するΔ６デサチュラーゼ、４）基質脂肪酸オレイン酸のＬＡへの変換を触媒するΔ１２デサチュラーゼ、５）基質脂肪酸ＬＡのＡＬＡへの変換および／または基質脂肪酸ＧＬＡのＳＴＡへの変換を触媒するΔ１５デサチュラーゼ、６）基質脂肪酸ＤＰＡのＤＨＡへの変換および／または基質脂肪酸ＤＴＡのＤＰＡｎ−６への変換を触媒するΔ４デサチュラーゼ、７）基質脂肪酸ＥＤＡのＤＧＬＡへの変換および／または基質脂肪酸ＥＴｒＡのＥＴＡへの変換を触媒するΔ８デサチュラーゼ、および８）基質脂肪酸パルミチン酸のパルミトレイン酸（１６：１）への変換および／または基質脂肪酸ステアリン酸のオレイン酸への変換を触媒するΔ９デサチュラーゼである。Δ１５およびΔ１７デサチュラーゼはまた、ω−６脂肪酸をそれらのω−３対応物に変換するそれらの能力に基づいて、（例えばＬＡをＡＬＡへの、およびＡＲＡをＥＰＡへのそれぞれの変換）「オメガ−３デサチュラーゼ」、「ｗ−３デサチュラーゼ」、および／または「ω−３デサチュラーゼ」と称されることもある。適切な宿主を脂肪酸デサチュラーゼ遺伝子で形質転換し、宿主の脂肪酸プロフィールに対するその影響を判定することによって、特定の脂肪酸デサチュラーゼの特異性を経験的に判定することが望ましいかもしれない。
「エロンガーゼ」という用語は、脂肪酸炭素鎖を延長して、エロンガーゼが作用する脂肪酸基質よりも炭素２個分長い酸を生成できるポリペプチドを指す。この延長過程は、米国特許出願公開第２００５／０１３２４４２号明細書および国際公開第２００５／０４７４８０号パンフレットに記載されているように、脂肪酸シンターゼと関連している多段階機序で起きる。エロンガーゼ系によって触媒される反応の例は、ＧＬＡからＤＧＬＡ、ＳＴＡからＥＴＡ、およびＥＰＡからＤＰＡへの変換である。一般にエロンガーゼの基質選択性はいくぶん広いが、鎖長および不飽和の程度とタイプの双方によって区別される。例えばＣ14/16エロンガーゼは例えばミリスチン酸などのＣ14基質を利用し、Ｃ16/18エロンガーゼは例えばパルミチン酸などのＣ16基質を利用し、Ｃ18/20エロンガーゼ［Δ６エロンガーゼとしてもまた知られており、用語は同義的に使用できる］は例えばＧＬＡまたはＳＴＡなどのＣ18基質を利用し、Ｃ20/22エロンガーゼは例えばＥＰＡなどのＣ20基質を利用する。同様にΔ９エロンガーゼは、ＬＡをＥＤＡへの、およびＡＬＡをＥＴｒＡへの、それぞれの変換を触媒できる。いくつかのエロンガーゼは幅広い特異性を有し、したがって単一酵素がいくつかのエロンガーゼ反応を触媒できるかもしれないことに留意することが重要である。例えば単一酵素が、Ｃ16/18エロンガーゼとＣ18/20エロンガーゼの双方として機能してもよい。
「変換効率」および「％基質変換」という用語は、それによってデサチュラーゼなどの特定の酵素が基質を生成物に変換できる効率を指す。変換効率は、次式に従って測定される。
（［生成物］／［基質＋生成物］）*１００
式中、「生成物」は即時生成物および経路中のそれから誘導される全生成物を含む。
「油性」という用語は、それらのエネルギー源を油の形態で保存する傾向がある生物を指す（Ｗｅｅｔｅ、「Ｆｕｎｇａｌ Ｌｉｐｉｄ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ」、第２版、Ｐｌｅｎｕｍ、１９８０年）。
「油性酵母菌」という用語は、ＴＡＧである油を生成できる酵母菌として分類される微生物を指す。一般に油性微生物の細胞油またはＴＡＧ含量はＳ字形曲線に従い、対数増殖後期または定常増殖初期において脂質濃度が最大に達するまで増大し、次に定常増殖後期および死滅期において徐々に減少する（ＹｏｎｇｍａｎｉｔｃｈａｉおよびＷａｒｄ、Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．５７：４１９〜２５（１９９１年））。本明細書に記載のとおり油性微生物は、典型的に約２５％を超えるその乾燥細胞重量を油またはＴＡＧとして蓄積する。油性酵母菌の例としては、ヤロウィア（Ｙａｒｒｏｗｉａ）、カンジダ（Ｃａｎｄｉｄａ）、ロドトルラ（Ｒｈｏｄｏｔｏｒｕｌａ）、ロドスポリジウム（Ｒｈｏｄｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ）、クリプトコッカス（Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）、トリコスポロン（Ｔｒｉｃｈｏｓｐｏｒｏｎ）、およびリポマイセス（Ｌｉｐｏｍｙｃｅｓ）属が挙げられるが、決してこれに限定されるものではない。
本明細書の用法では、「単離された核酸断片」および「単離された核酸分子」という用語は同義的に使用されて、一本鎖または二本鎖で、場合により合成、非天然または改変ヌクレオチド塩基を含有するＲＮＡまたはＤＮＡのポリマーを指す。ＤＮＡポリマーの形態の単離された核酸断片は、ｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡまたは合成ＤＮＡの１つ以上のセグメントを含んでなってもよい。
核酸断片は、適切な温度および溶液イオン強度条件下で、核酸断片の一本鎖形態がその他の核酸断片とアニールできる場合、ｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ、またはＲＮＡなどの別の核酸断片と「ハイブリダイズ可能」である。ハイブリダイゼーションおよび洗浄条件については良く知られており、Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ．、Ｆｒｉｔｓｃｈ，Ｅ．Ｆ．およびＭａｎｉａｔｉｓ，Ｔ．「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ」、第二版、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ、ＮＹ（１９８９年）で例証される。
アミノ酸またはヌクレオチド配列の「かなりの部分」とは、当業者による配列の手動評価によって、あるいはＢＬＡＳＴ（「基礎的局在性配列検索ツール（Ｂａｓｉｃ Ｌｏｃａｌ Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ Ｓｅａｒｃｈ Ｔｏｏｌ」、Ａｌｔｓｃｈｕｌ，Ｓ．Ｆ．ら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３〜４１０（１９９３年））などのアルゴリズムを使用したコンピュータ自動化アラインメントおよび同定によって、遺伝子またはポリペプチドの推定上の同定を得るのに十分なポリペプチドまたは遺伝子のヌクレオチド配列のアミノ酸配列を含んでなる部分である。一般に推定的にポリペプチドまたは核酸配列が既知のタンパク質または遺伝子に相同的であると同定するためには、１０個以上の隣接するアミノ酸または３０個以上の連続的なヌクレオチド配列が必要である。さらにヌクレオチド配列に関して、配列依存遺伝子同定法（例えばサザンハイブリダイゼーション）および微生物コロニーまたはバクテリオファージプラークの原位置ハイブリダイゼーションのような単離において、２０〜３０個の隣接するヌクレオチドを含んでなる遺伝子特異的オリゴヌクレオチドプローブを使用しても良い。さらにプライマーを含んでなる特定の核酸断片を得るために、塩基１２〜１５個の短いオリゴヌクレオチドを増幅プライマーとしてＰＣＲで使用しても良い。したがってヌクレオチド配列の「かなりの部分」は、配列を含んでなる核酸断片を特異的に同定、および／または単離できるようにする十分な配列を含んでなる。
「相補的」という用語は、互いにハイブリダイズできるヌクレオチド塩基間の関係について述べるために使用される。例えばＤＮＡについて、アデノシンはチミンに相補的であり、シトシンはグアニンに相補的である。
「相同性」、および「相同的」という用語は、本明細書では区別なく使用される。これらは、１個もしくはそれ以上のヌクレオチド塩基の変化が、遺伝子発現を仲介するまたは特定の表現型を生成する核酸断片の能力に影響しない核酸断片を指す。これらの用語はまた、最初の未変性断片と比べて、得られる核酸断片の機能特性を実質的に変化させない、１個もしくはそれ以上のヌクレオチドの欠失または挿入などの本明細書に記載されているＰｅｘ核酸断片の変更も指す。
さらに当業者は、相同的な核酸配列が、０．５×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ、６０℃のような中程度にストリンジェントな条件下において、本明細書に例示されている配列と、または機能的にそれらと同等物である本明細書に記載されている本ヌクレオチド配列のあらゆる部分とハイブリダイズする、それらの能力によってもまた定義されることを認識する。
「コドン縮重」とは、コードされるポリペプチドのアミノ酸配列に影響しないヌクレオチド配列の変動を可能にする遺伝子コードの性質を指す。当業者は、特定のアミノ酸を特定化するヌクレオチドコドンの使用における、特定の宿主細胞によって示される「コドンバイアス」についてよく知っている。したがって宿主細胞中の改善された発現のために遺伝子を合成する場合、そのコドン使用頻度が、宿主細胞の好むコドン使用頻度に近くなるように遺伝子をデザインすることが望ましい。
「合成遺伝子」は、当業者に公知の手順を使用して化学的に合成されるオリゴヌクレオチド構成単位からアセンブルできる。これらのオリゴヌクレオチド構成単位をアニールし次にライゲーションして遺伝子セグメントを形成し、次にそれを酵素的にアセンブルして遺伝子全体を構築する。したがって遺伝子をヌクレオチド配列の最適化に基づいて、最適な遺伝子発現のために個別に調整し、宿主細胞のコドンバイアスを反映させることができる。当業者は、コドン利用が宿主によって好まれるコドンに偏っている場合の遺伝子発現成功の可能性を理解する。好ましいコドンの判定は、配列情報が利用できる宿主細胞由来の遺伝子の調査に基づくことができる。
「遺伝子」とは特定のタンパク質を発現する核酸断片を指し、それはコード領域のみを指してもよく、またはコード配列に先行する（５’非コード配列）およびそれに続く（３’非コード配列）制御配列を含んでもよい。「天然遺伝子」とは、自然界にそれ自体の制御配列と共に見られる遺伝子を指す。「キメラ遺伝子」とは、自然界に共に見られない制御およびコード配列を含んでなる天然遺伝子でないあらゆる遺伝子を指す。したがってキメラ遺伝子は、異なる起源由来の制御配列およびコード配列、あるいは同一起源由来であるが、自然界に見られるのとは異なる様式で配列される制御配列およびコード配列を含んでなってもよい。「内在性遺伝子」とは、生物ゲノム中のその天然位置にある天然遺伝子を指す。「外来性」遺伝子とは、遺伝子移入によって宿主生物に導入された遺伝子を指す。外来性遺伝子は、非天然生物中に挿入された天然遺伝子、天然宿主内の新しい位置に導入された天然遺伝子、あるいはキメラ遺伝子を含んでなることができる。「導入遺伝子」とは、形質転換によってゲノム中に導入された遺伝子である。「コドン最適化遺伝子」とは、そのコドン使用頻度が宿主細胞の好むコドン使用頻度を模倣するようにデザインされた遺伝子である。
「コード配列」とは、特定のアミノ酸配列をコードするＤＮＡ配列を指す。「適した制御配列」とは、コード配列の上流（５’非コード配列）、配列内、または下流（３’非コード配列）に位置して、転写、ＲＮＡプロセシングまたは安定性、または関連コード配列の翻訳に影響を及ぼすヌクレオチド配列を指す。制御配列は、プロモータ、エンハンサー、サイレンサー、５’非翻訳リーダー配列（例えば転写開始部位と翻訳開始コドンの間）、イントロン、ポリアデニル化認識配列、ＲＮＡプロセシング部位、エフェクター結合部位、およびステムループ構造を含んでもよい。
「プロモーター」とは、コード配列または機能性ＲＮＡの発現を調節できるＤＮＡ配列を指す。一般にコード配列はプロモーター配列に対して３’に位置する。プロモーターはその全体が天然遺伝子に由来しても良く、あるいは自然界に見られる異なるプロモーター由来の異なる要素からなっても良く、あるいは合成ＤＮＡセグメントを含んでなってさえ良い。異なるプロモーターが、異なる組織または細胞タイプ中で、あるいは異なる発育段階で、あるいは異なる環境または生理学的条件に呼応して、遺伝子の発現を導いても良いことが当業者には理解される。ほとんどの場合にほとんどの細胞タイプ中で遺伝子の発現を引き起こすプロモーターは、一般に「構造プロモーター」と称される。ほとんどの場合、制御配列の正確な境界は完全に画定されていないので、異なる長さのＤＮＡ断片が、同一プロモーター活性を有してもよいこともさらに認識される。
「３’非翻訳配列」および「転写ターミネーター」という用語は、コード配列下流に位置するＤＮＡ配列を指す。これには、ｍＲＮＡプロセッシングまたは遺伝子発現に影響できる調節シグナルをコードするポリアデニル化認識配列、およびその他の配列が含まれる。ポリアデニル化シグナルは、通常、ｍＲＮＡ前駆物質の３’末端へのポリアデニル酸トラクトの付加に影響することで特徴づけられる。３’領域は、関連したコード配列の転写、ＲＮＡプロセシングまたは安定性、または翻訳に影響できる。
「ＲＮＡ転写物」とは、ＲＮＡポリメラーゼが触媒するＤＮＡ配列転写から得られる生成物を指す。ＲＮＡ転写物がＤＮＡ配列の完全な相補的コピーである場合、それは一次転写物と称され、あるいはそれは一次転写物の転写後プロセッシング由来のＲＮＡ配列であってもよく、成熟ＲＮＡと称される。「メッセンジャーＲＮＡ」または「ｍＲＮＡ」とは、イントロンがなく、細胞によってタンパク質に翻訳されることができるＲＮＡを指す。「ｃＤＮＡ」とは、ｍＲＮＡに対して相補的であり、それに由来する二重鎖ＤＮＡを指す。「センスＲＮＡ」とは、ｍＲＮＡを含み、細胞によってタンパク質に翻訳されることができるＲＮＡ転写物を指す。「アンチセンスＲＮＡ」とは、標的一次転写物またはｍＲＮＡの全部または一部に相補的であり、標的遺伝子の発現をブロックするＲＮＡ転写物を指す（米国特許第５０，１７０，０６５号明細書、国際公開第９９／２８５０８号パンフレット）。アンチセンスＲＮＡの相補性は、特定の遺伝子転写物のあらゆる部分、すなわち５’非コード配列、３’非コード配列、またはコード配列にあっても良い。「機能性ＲＮＡ」とは、翻訳されないがそれでもなお細胞プロセスに影響するアンチセンスＲＮＡ、リボザイムＲＮＡ、またはその他のＲＮＡを指す。
「作動的に結合した」という用語は、１つの機能が他方の機能による影響を受けるような、単一核酸断片上の核酸配列のつながりを指す。例えばプロモーターがコード配列の発現に影響を及ぼすことができる場合、それはそのコード配列と作動的に結合する。すなわちコード配列がプロモーターの転写調節下にある。コード配列は、センスまたはアンチセンス方向で制御配列に作動的に結合できる。
「発現」という用語は、本明細書での用法では、核酸断片由来のセンス（ｍＲＮＡ）またはアンチセンスＲＮＡの転写と安定した蓄積を指す。発現はまた、ｍＲＮＡのポリペプチドへの翻訳も指す。
「成熟」タンパク質とは、翻訳後処理されたポリペプチド、すなわち一次翻訳生成物中に存在するあらゆるプレペプチドまたはプロペプチドがそれから除去されたものを指す。「前駆」タンパク質とは、ｍＲＮＡの翻訳の一次生成物、すなわちプレまたはプロペプチドが依然として存在するものを指す。プレペプチドまたはプロペプチドは、細胞内局在化シグナルであってもよいが、これに限定されるものではない。
「形質転換」とは、遺伝的に安定した遺伝形質をもたらす核酸分子の宿主生物中への転移を指す。核酸分子は、例えば自律的に複製するプラスミドであってもよく、またはそれは宿主生物のゲノムに組み込まれてもよい。形質転換された核酸断片を含有する宿主生物は、「遺伝子導入」または「組み換え」または「形質転換」生物と称される。
「安定した形質転換」とは、遺伝的に安定した遺伝形質をもたらす、核および細胞小器官ゲノムの双方をはじめとする宿主生物ゲノム中への核酸断片の転移を指す。対照的に「一過性形質転換」とは、組み込みまたは安定した遺伝形質なしに遺伝子発現をもたらす、宿主生物の核、またはＤＮＡ含有細胞小器官中への核酸断片の転移を指す。形質転換された核酸断片を含有する宿主生物は、「遺伝子導入」生物と称される。
「プラスミド」および「ベクター」という用語は、細胞の中心的代謝の一部ではない遺伝子を運ぶことが多く、通常環状二本鎖ＤＮＡ断片の形態である染色体外要素を指す。このような要素は、あらゆる供給源に由来する一本鎖または二本鎖ＤＮＡまたはＲＮＡの配列、ゲノム一体化配列、直鎖または環状のファージまたはヌクレオチド配列を自律的に複製するかもしれず、そこではいくつかのヌクレオチド配列が独自の構成に結合または組み換えされ、それは選択された遺伝子産物のために、発現カセットを細胞中に導入することができる。
「発現カセット」という用語は、選択された遺伝子産物の発現に必要とされる、選択された遺伝子のコード配列、およびコード配列に先行する制御配列（５’非コード配列）およびコード配列に続く制御配列（３’非コード配列）を含んでなるＤＮＡ断片を指す。したがって発現カセットは、典型的に１）プロモータ配列、２）コード配列、すなわち読み取り枠［「ＯＲＦ」］、および３）３’非翻訳領域、すなわち真核生物中では通常ポリアデニル化部位を含有するターミネーターから構成される。発現カセットは通常ベクター内に含まれ、クローニングおよび形質転換を容易にする。各宿主に対する正しい制御配列が使用される限りは、異なる発現カセットを細菌、酵母、植物、および哺乳類細胞をはじめとする、異なる生物に形質転換することができる。
「％同一性」という用語は、配列を比較して判定される２つ以上のポリペプチド配列または２つ以上のポリヌクレオチド配列の関係であると言及される。「同一性」は、場合によってはこのような比較配列間の整合パーセンテージによって判定される、ポリペプチドまたはポリヌクレオチド配列間の配列関連性の程度も意味する。「％同一性」および「％類似性」は、１．）「計算分子生物学（Ｃｏｍｐｕｔａｔｉｏｎａｌ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ）Ｌｅｓｋ，Ａ．Ｍ．編）Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ、ＮＹ（１９８８年）、２．）「Ｂｉｏｃｏｍｐｕｔｉｎｇ：Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ ａｎｄ Ｇｅｎｏｍｅ Ｐｒｏｊｅｃｔｓ」（Ｓｍｉｔｈ，Ｄ．Ｗ．編）Ａｃａｄｅｍｉｃ、ＮＹ（１９９３年）、３．）「Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ｄａｔａ」、第一部、（Ｇｒｉｆｆｉｎ，Ａ．Ｍ．、およびＧｒｉｆｆｉｎ，Ｈ．Ｇ．編）Ｈｕｍａｎｉａ、ＮＪ（１９９４年）、４．）「Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ」ｖｏｎ Ｈｅｉｎｊｅ，Ｇ．編、Ａｃａｄｅｍｉｃ、ＮＹ（１９８７年）、５．）「Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ Ｐｒｉｍｅｒ」（Ｇｒｉｂｓｋｏｖ，Ｍ．およびＤｅｖｅｒｅｕｘ，Ｊ．編）Ｓｔｏｃｋｔｏｎ、ＮＹ（１９９１年）に記載されているものをはじめとするが、これに限定されるものではない公知の方法によって容易に計算できる。
％同一性を判定する好ましい方法は、試験された配列間に最良の一致を与えるようにデザインされている。％同一性および％類似性を判定する方法は、公的に入手可能なコンピュータプログラム中で体系化されている。配列アラインメントおよび％同一性の計算は、ＬＡＳＥＲＧＥＮＥバイオインフォマティクス演算スイート（ＤＮＡＳＴＡＲ Ｉｎｃ．（Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ））のＭｅｇＡｌｉｇｎTMプログラムを使用して実施されてもよい。配列の多重アラインメントは、「アラインメントのＣｌｕｓｔａｌ Ｖ法」および「アラインメントのＣｌｕｓｔａｌ Ｗ法」をはじめとするアルゴリズムのいくつかの変法を包含し、ＬＡＳＥＲＧＥＮＥバイオインフォマティクス演算スイート（ＤＮＡＳＴＡＲ Ｉｎｃ．）のＭｅｇＡｌｉｇｎTMｖ６．１プログラムにある、「Ｃｌｕｓｔａｌアラインメント法」（ＨｉｇｇｉｎｓおよびＳｈａｒｐ，ＣＡＢＩＯＳ，５：１５１〜１５３（１９８９年）；Ｈｉｇｇｉｎｓ，Ｄ．Ｇ．ら、Ｃｏｍｐｕｔ．Ａｐｐｌ．Ｂｉｏｓｃｉ．，８：１８９〜１９１（１９９２年）に記載されている）を使用して実施される。いずれかのＣｌｕｓｔａｌプログラムを使用した配列アラインメントの後、プログラムの「配列距離」表を見ることで「％同一性」を得ることができる。
同一のまたは類似した機能または活性を有するポリペプチドをその他の種から識別するのに、配列％同一性の様々な測定が有用であることは、当業者によって良く理解されている。％同一性の有用な例としては、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、または９５％、または５０％〜１００％の間のあらゆる整数百分率が挙げられるが、これに限定されるものではない。実際、５１％、５２％、５３％、５４％、５５％、５６％、５７％、５８％、５９％、６０％、６１％、６２％、６３％、６４％、６５％、６６％、６７％、６８％、６９％、７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％などの５０％〜１００％のあらゆる整数のアミノ酸同一性が、本明細書に記載されている方法および宿主細胞においてポリペプチドをコードする、適切な核酸断片（単離されたポリヌクレオチド）について述べるのに有用かもしれない。場合によっては適切な核酸断片（単離されたポリヌクレオチド）は、本明細書に記載のアミノ酸配列と少なくとも約７０％同一、好ましくは少なくとも約７５％同一、およびより好ましくは少なくとも約８０％同一のポリペプチドをコードする。好ましい核酸断片は、本明細書に記載のアミノ酸配列と少なくとも約８５％同一のアミノ酸配列をコードする。より好ましい核酸断片は、本明細書に記載のアミノ酸配列と少なくとも約９０％同一のアミノ酸配列をコードする。最も好ましいのは、本明細書に記載のアミノ酸配列と少なくとも約９５％同一のアミノ酸配列をコードする核酸断片である。
適切な核酸断片は上の相同性を有するだけでなく、典型的に少なくとも５０個のアミノ酸、好ましくは少なくとも１００個のアミノ酸、より好ましくは少なくとも１５０個のアミノ酸、なおもより好ましくは少なくとも２００個のアミノ酸、最も好ましくは少なくとも２５０個のアミノ酸を有するポリペプチドをコードする。
「配列分析ソフトウェア」という用語は、ヌクレオチドまたはアミノ酸配列の分析のために有用なあらゆるコンピュータアルゴリズムまたはソフトウェアプログラムを指す。「配列分析ソフトウェア」は、市販のものでも、あるいは独立して開発されても良い。典型的な配列分析ソフトウェアとしては、１．）Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ｇｒｏｕｐ（ＧＣＧ）（Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）からのＧＣＧプログラム一式（Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ Ｐａｃｋａｇｅ Ｖｅｒｓｉｏｎ ９．０）、２．）ＢＬＡＳＴＰ、ＢＬＡＳＴＮ、ＢＬＡＳＴＸ（Ａｌｔｓｃｈｕｌら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３〜４１０（１９９０年））、および３．）ＤＮＡＳＴＡＲ，Ｉｎｃ．（Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ）からのＤＮＡＳＴＡＲ、４．）Ｇｅｎｅ Ｃｏｄｅｓ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ（Ａｎｎ Ａｒｂｏｒ、ＭＩ）からのＳｅｑｕｅｎｃｈｅｒ、および５．）スミス−ウォーターマン・アルゴリズムを組み入れたＦＡＳＴＡプログラム（Ｗ．Ｒ．Ｐｅａｒｓｏｎ、Ｃｏｍｐｕｔ．Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｇｅｎｏｍｅ Ｒｅｓ．［Ｐｒｏｃ．Ｉｎｔ．Ｓｙｍｐ．］（１９９４年）、１９９２年会議、１１１〜２０、編集者：Ｓｕｈａｉ，Ｓａｎｄｏｒ、Ｐｌｅｎｕｍ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，ＮＹ）が挙げられるが、これに限定されるものではない。この説明では、配列分析ソフトウェアを分析のために使用する場合、分析結果は特に断りのない限り、言及されるプログラムの「デフォルト値」に基づく。本明細書での用法では、「デフォルト値」とは、最初に初期化されるときにソフトウェアに元からロードされる、あらゆる値またはパラメータの組を意味する。
本明細書で使用される標準リコンビナントＤＮＡおよび分子クローニング技術については技術分野で良く知られており、Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ．、Ｆｒｉｔｓｃｈ，Ｅ．Ｆ．、およびＭａｎｉａｔｉｓ，Ｔ．、「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ」第二版、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ、ＮＹ（１９８９年）（下文においてＭａｎｉａｔｉｓ）；Ｓｉｌｈａｖｙ，Ｔ．Ｊ．、Ｂｅｎｎａｎ，Ｍ．Ｌ．およびＥｎｑｕｉｓｔ，Ｌ．Ｗ．、「Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔｓ ｗｉｔｈ Ｇｅｎｅ Ｆｕｓｉｏｎｓ」Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ：Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ、ＮＹ（１９８４年）；およびＡｕｓｕｂｅｌ，Ｆ．Ｍ．ら、「Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ」Ｇｒｅｅｎｅ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ａｓｓｏｃ．ａｎｄ Ｗｉｌｅｙ−Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ、Ｈｏｂｏｋｅｎ，ＮＪによる出版（１９８７年）に記載されている。
概説：脂肪酸およびトリアシルグリセロールの生合成
一般に、油性微生物中の脂質蓄積は、増殖培地中に存在する全体的な炭素対窒素比に応えて誘発される。油性微生物中に遊離パルミチン酸（１６：０）の新規（ｄｅ ｎｏｖｏ）合成をもたらすこのプロセスについては、米国特許第７，２３８，４８２号明細書に詳細に記載されている。パルミチン酸は、エロンガーゼおよびデサチュラーゼの作用を通じて形成される、より長鎖の飽和および不飽和脂肪酸誘導体の前駆物質である（図１）。
ＴＡＧ（脂肪酸の主要な貯蔵単位）は、以下が関与する一連の反応によって形成される。１．）アシルトランスフェラーゼによる１分子のアシル−ＣｏＡのグリセロール−３−リン酸塩へのエステル化がリゾホスファチジン酸を生じ、２．）アシルトランスフェラーゼによる第２のアシル−ＣｏＡ分子のエステル化が、一般にホスファチジン酸として同定される１，２−ジアシルグリセロールリン酸塩を生じ、３．）ホスファチジン酸ホスファターゼによるリン酸塩の除去が１，２−ジアシルグリセロール［「ＤＡＧ」］を生じ、４．）アシルトランスフェラーゼの作用による第３の脂肪酸の付加がＴＡＧを形成する。
飽和および不飽和脂肪酸および短鎖および長鎖脂肪酸をはじめとする、幅広い脂肪酸をＴＡＧに組み込むことができる。アシル基転移酵素によってＴＡＧに組み込むことができる脂肪酸のいくつかの非限定的例としては次が挙げられる。カプリン酸（１０：０）、ラウリン酸（１２：０）、ミリスチン酸（１４：０）、パルミチン酸（１６：０）、パルミトレイン酸（１６：１）、ステアリン酸（１８：０）、オレイン酸（１８：１）、バクセン酸（１８：１）、ＬＡ（１８：２）、エレオステアリン酸（１８：３）、ＧＬＡ（１８：３）、ＡＬＡ（１８：３）、ＳＴＡ（１８：４）、アラキジン酸（２０：０）、ＥＤＡ（２０：２）、ＤＧＬＡ（２０：３）、ＥＴｒＡ（２０：３）、ＡＲＡ（２０：４）、ＥＴＡ（２０：４）、ＥＰＡ（２０：５）、ベヘン酸（２２：０）、ＤＰＡ（２２：５）、ＤＨＡ（２２：６）、リグノセリン酸（２４：０）、ネルボン酸（２４：１）、セロチン酸（２６：０）、およびモンタン酸（２８：０）脂肪酸。本明細書に記載されている方法および宿主細胞では、「長鎖」ＰＵＦＡのＴＡＧへの組み込みが最も望ましいかもしれず、長鎖ＰＵＦＡとしては、長さが少なくとも炭素１８個である、すなわちＣ18以上である、１８：１基質から誘導されるあらゆる脂肪酸が挙げられる。これにはまたヒドロキシル化脂肪酸、エポキシ脂肪酸、および抱合型リノール酸も含まれる。
ほとんどのＰＵＦＡは中性脂質としてＴＡＧに組み込まれて脂質体中に保存されるが、油性生物中の総ＰＵＦＡの測定は、ホスファチジルコリン画分、ホスファチジルエタノールアミン画分、およびトリアシルグリセロール（ＴＡＧまたは油としてもまた知られている）画分中に位置するＰＵＦＡを含むべきであることに留意することが重要である。
オメガ脂肪酸の生合成
オレイン酸がω−３／ω−６脂肪酸に変換される代謝プロセスは、炭素原子付加を通じた炭素鎖の延長、および二重結合添加を通じた分子の不飽和化を伴う。これは、小胞体膜内に存在する一連の特別な不飽和化酵素および延長酵素を必要とする。しかし図１に示され下に記載されるように、特定ω−３／ω−６脂肪酸生成のための複数の代案の経路があることが多い。
具体的には図１は後述の経路を描写する。全ての経路は、オレイン酸がΔ１２デサチュラーゼによって、第１のω−６脂肪酸であるリノール酸［「ＬＡ」］に最初に変換されることを必要とする。次に「Δ６デサチュラーゼ／Δ６エロンガーゼ経路」および基質としてＬＡを使用して、長鎖ω−６脂肪酸が次のように形成される。１）ＬＡがΔ６デサチュラーゼによってγ−リノレン酸［「ＧＬＡ」］に変換され、２）ＧＬＡがＣ18/20エロンガーゼによってジホモ−γ−リノレン酸［「ＤＧＬＡ」］に変換され、３）ＤＧＬＡがΔ５デサチュラーゼによってアラキドン酸［「ＡＲＡ」］に変換され、４）ＡＲＡがＣ20/22エロンガーゼによってドコサテトラエン酸［「ＤＴＡ」］に変換され、５）ＤＴＡがΔ４デサチュラーゼによってドコサペンタエン酸［「ＤＰＡｎ−６」］に変換される。
代案としては、「Δ６デサチュラーゼ／Δ６エロンガーゼ経路」は基質としてα−リノレン酸［「ＡＬＡ」］を使用し、次のように長鎖ω−３脂肪酸を生成できる。１）ＬＡがΔ１５デサチュラーゼによって第１のω−３脂肪酸ＡＬＡに変換され、２）ＡＬＡがΔ６デサチュラーゼによってステアリドン酸［「ＳＴＡ」］に変換され、３）ＳＴＡがＣ18/20エロンガーゼによってエイコサテトラエン酸［「ＥＴＡ」］に変換され、４）ＥＴＡがΔ５デサチュラーゼによってエイコサペンタエン酸［「ＥＰＡ」］に変換され、５）ＥＰＡがＣ20/22エロンガーゼによってドコサペンタエン酸［「ＤＰＡ」］に変換され、６）ＤＰＡがΔ４デサチュラーゼによってドコサヘキサエン酸［「ＤＨＡ」］に変換される。任意にω−６脂肪酸がω−３脂肪酸に変換されてもよい。例えばΔ１７デサチュラーゼ活性によって、ＤＧＬＡからＥＴＡが、およびＡＲＡからＥＰＡが、それぞれ生成される。
ω−３／ω−６脂肪酸の生合成のための別の経路は、Δ９エロンガーゼおよびΔ８デサチュラーゼすなわち「Δ９エロンガーゼ／Δ８デサチュラーゼ経路」を利用する。より具体的にはΔ９エロンガーゼによって、ＬＡがＥＤＡに、およびＡＬＡがＥＴｒＡに、それぞれ変換されてもよい。次にΔ８デサチュラーゼは、ＥＤＡをＤＧＬＡに、および／またはＥＴｒＡをＥＴＡに変換する。下流ＰＵＦＡが、上述のように引き続いて形成される。
ここで宿主生物は、天然にまたは遺伝子操作技術を通じてのどちらかによって、ＰＵＦＡ産生能力を有さなくてはならない。多数の微生物が、通常の細胞代謝過程において（ω−３／ω−６脂肪酸をはじめとする）ＰＵＦＡを合成できるが、商業的に培養できるのはそのいくつかであり、医薬品、食餌代用物、メディカルフード、栄養補給剤、その他の食品、工業油脂化学またはその他の最終用途で使用するための所望の含油量および組成を有する油を産生する生物は、ほとんどない。したがって脂肪酸含量および組成が遺伝子操作によって注意深く規定されている「デザイナー」脂質および油の生産のために、微生物を操作する能力がさらに重要視されるようになってきている。これに基づき、宿主は恐らく機能性ＰＵＦＡ生合成経路をコードする異種遺伝子を含んでなることが予期されるが、必須ではない。
宿主生物が天然では所望のＰＵＦＡを産生せず、または所望の脂質プロフィールを有さない場合、当業者は、選択された宿主生物に、ＰＵＦＡ生合成のための適切な酵素をコードする１つ以上の発現カセットを導入するのに必要な考察事項および技術に精通している。文献において、このような発現カセットを様々な宿主生物に導入するための多数の教示が、当業者に提供される。宿主生物ヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）を使用した、次のようないくつかの参考文献が提供される。米国特許第７，２３８，４８２号明細書、国際公開第２００６／０３３７２３号パンフレット、米国特許出願公開第２００６−００９４０９２号明細書、米国特許出願公開第２００６−０１１５８８１−Ａ１号明細書、および米国特許出願公開第２００６−０１１０８０６−Ａ１号明細書。この一覧は網羅的でなく、限定的と見なすべきではない。
簡単に述べると、宿主細胞中に存在するまたはそれに形質転換される、ω−３／ω−６脂肪酸生合成経路の脂肪酸基質および特定遺伝子次第で、それらのＴＡＧへの転写に先だって多様なω−３／ω−６ＰＵＦＡ生成物が生成できる。したがって所望の脂肪酸生成物の生成は、直接または間接的に起こり得る。直接的生成は、脂肪酸基質が、いかなる中間体ステップまたは経路中間体もなしに所望の脂肪酸生成物に直接変換される場合に起きる。間接生成は、所望のＰＵＦＡを生成する一連の反応が起きるような組み合わせで、ＰＵＦＡ生合成経路をコードする複数の遺伝子が使用されてもよい場合に起きる。具体的にはＥＰＡの過剰生成のために、Δ１２デサチュラーゼ、Δ６デサチュラーゼ、Ｃ18/20エロンガーゼ、Δ５デサチュラーゼ、およびΔ１７デサチュラーゼを含んでなる発現カセットで油性酵母を形質転換することが望ましいかもしれない。米国特許第７，２３８，４８２号明細書および国際公開第２００６／０５２８７０号パンフレットを参照されたい。当業者に良く知られているように、ＰＵＦＡ生合成経路の酵素をコードする遺伝子のその他の様々な組み合わせが、油性生物中での発現に有用かもしれない（図１参照）。特定の発現カセット内に含まれる特定の遺伝子は宿主生物、そのＰＵＦＡプロフィールおよび／またはデサチュラーゼ／エロンガーゼプロフィール、基質可用性、および所望の最終産物に左右される。
ＧｅｎＢａｎｋ、特許文献、およびＰＵＦＡ産生能力を有する生物の実験解析などの公的に入手可能な文献に従って、所望のデサチュラーゼおよび／またはエロンガーゼ活性を有するいくつかの候補遺伝子が同定できる。有用なデサチュラーゼおよびエロンガーゼ配列は、例えば細菌、藻類、真菌、卵菌類、酵母、植物、動物などからの天然原料から単離される起源、半合成経路または新規合成によって生成される起源などのあらゆる起源に由来してもよい。これらの候補遺伝子の同定に続いて、デサチュラーゼまたはエロンガーゼ活性を有する特定のポリペプチドを選択する上での検討事項としては、次が挙げられる。１）ポリペプチドの基質特異性、２）ポリペプチドまたはその構成要素が律速酵素であるかどうか、３）デサチュラーゼまたはエロンガーゼが所望のＰＵＦＡの合成に必須であるかどうか、４）ポリペプチドに必要な補助因子、および／または５）ポリペプチドの生成後に、それがキナーゼまたはプレニル基転移酵素などによって修飾されるかどうか。
発現されるポリペプチドは、好ましくは宿主細胞中のその位置の生化学的環境に適したパラメーターを有する。米国特許第７，２３８，４８２号明細書を参照されたい。特定の各デサチュラーゼおよび／またはエロンガーゼの変換効率を考慮することもまた有用かもしれない。より具体的には各酵素は、基質を生成物に変換するのに１００％効率では滅多に機能しないので、宿主細胞中に生じる未精製油の最終脂質プロフィールは、典型的に所望のω−３／ω−６脂肪酸、ならびに様々な上流中間ＰＵＦＡからなる様々なＰＵＦＡの混合物である。したがって各酵素の変換効率もまた、所望の脂肪酸の生合成を最適化する際に考慮すべき変数である。
ペルオキシソーム生合成およびＰｅｘ遺伝子
前述したように、ペルオキシソームは全ての真核細胞に見られる遍在性細胞小器官である。それらの主な役割は、有毒化合物、脂肪酸など、細胞の局在性細胞小器官内の様々な物質の分解である。例えば脂肪酸分子が分解されて、（細胞質ゾル中に排出されて戻る）アセチル−ＣｏＡの遊離分子を究極的に生じるβ−酸化の過程は、ペルオキシソーム中で起きる。ミトコンドリア中のβ−酸化過程はＡＴＰ合成をもたらすが、ペルオキシソーム中のβ−酸化は高電位電子のＯ2への転移を引き起こして、Ｈ2Ｏ2の形成をもたらし、それは引き続いてペルオキシソームカタラーゼによって水とＯ2に変換される。Ｃ18〜Ｃ22などの超長鎖脂肪酸は、ペルオキシソーム中で最初にβ−酸化を被り、ミトコンドリアβ−酸化がそれに続く。
ペルオキシソーム膜を通じたＡＴＰ加水分解の手段によって、タンパク質を取り込む役割を担うタンパク質は、ペルオキシソーム生合成因子タンパク質、または「ペルオキシン」として知られている。これらのペルオキシソーム生合成因子タンパク質はまた、ペルオキシソーム生合成／アセンブリーに関与するタンパク質も含む。ペルオキシソーム生合成因子タンパク質の遺伝子頭字語はＰｅｘであり、命名システムはＤｉｓｔｅｌら、Ｊ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．，１３５：１〜３（１９９６年）に記載されている。これまでに様々な真核生物中で、少なくとも３２個の異なるＰｅｘ遺伝子が同定されている。しかし真菌では、Ｋｉｅｌら（Ｔｒａｆｆｉｃ，７：１２９１〜１３０３（２００６年））の最近のレビューが、ペルオキシソーム生合成／マトリックスタンパク質取り込みの最小要件が合計１７であり、したがってＰｅｘ１ｐ、Ｐｅｘ２ｐ、Ｐｅｘ３ｐ、Ｐｅｘ４ｐ、Ｐｅｘ５ｐ、Ｐｅｘ６ｐ、Ｐｅｘ７ｐ、Ｐｅｘ８ｐ、Ｐｅｘ１０ｐ、Ｐｅｘ１２ｐ、Ｐｅｘ１３ｐ、Ｐｅｘ１４ｐ、Ｐｅｘ１７ｐ、Ｐｅｘ１９ｐ、Ｐｅｘ２０ｐ、Ｐｅｘ２２ｐ、およびＰｅｘ２６ｐのみが必要であると提案している。これらのタンパク質は協調して作用し、ペルオキシソームを増殖（複製）して、ペルオキシソーム中への転移によってタンパク質を取り込む（Ｗａｔｅｒｈａｍ，Ｈ．Ｒ．およびＪ．Ｍ．Ｃｒｅｇｇ．ＢｉｏＥｓｓａｙｓ．１９（１）：５７〜６６（１９９６年）によるレビュー）。
多数のＰｅｘ遺伝子は、最初は、異常なペルオキシソーム機能または構造を示す変異型の分析から単離された。しかし完全なゲノム配列が利用できるようになって、相同性に基づくコンピュータ配列検索によってＰｅｘ遺伝子を同定することが次第に容易になった。Ｋｉｅｌら（Ｔｒａｆｆｉｃ，７：１２９１〜１３０３（２００６年））は、時折の低い配列類似性にもかかわらず、ペルオキシソーム生合成機構の強力な保存を主張した。より具体的には酵母および糸状菌の中では、彼らのデータは、これまでに同定されたほとんど全てのＰｅｘタンパク質が保存されていることを示唆する。下の表４は、Ｋｉｅｌら（前出）によって、サッカロミセス・セレヴィシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）、カンジダ・グラブラタ（Ｃａｎｄｉｄａ ｇｌａｂｒａｔａ）、アシュビア・ゴッシピイ（Ａｓｈｂｙａ ｇｏｓｓｙｐｉｉ）、クリヴェロミセス・ラクチス（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ ｌａｃｔｉｓ）、カンジダ・アルビカンス（Ｃａｎｄｉｄａ ａｌｂｉｃａｎｓ）、デバリオミセス・ハンセニ（Ｄｅｂａｒｙｏｍｙｃｅｓ ｈａｎｓｅｎｉｉ）、ピチア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ）、ハンゼヌラ・ポリモルファ（Ｈａｎｓｅｎｕｌａ ｐｏｌｙｍｏｒｐｈａ）、ヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）、アスペルギルス・フミガーツス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｆｕｍｉｇａｔｕｓ）、アスペルギルス・ニデュランス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｄｕｌａｎｓ）、ペニシリウム・クリソゲヌム（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ ｃｈｒｙｓｏｇｅｎｕｍ）、マグナポルテ・グリセア（Ｍａｇｎａｐｏｒｔｈｅ ｇｒｉｓｅａ）、ニューロスポラ・クラッサ（Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ ｃｒａｓｓａ）、ジベレラ・ゼアエ（Ｇｉｂｂｅｒｅｌｌａ ｚｅａｅ）、トウモロコシ黒穂菌（Ｕｓｔｉｌａｇｏ ｍａｙｄｉｓ）、クリプトコッカス・ネオフォルマンス（Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｎｅｏｆｏｒｍａｎｓ）ネオフォルマンス（ｎｅｏｆｏｒｍａｎｓ）変異株、およびシゾサッカロミセス・ポンベ（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｐｏｍｂｅ）中で同定されたペルオキシソーム生合成因子タンパク質を示す。
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損なわれたペルオキシソーム生合成につながるＰｅｘ遺伝子の変異は、酵母、ヒト、お
よび植物において、重篤な代謝および発達障害をもたらす（Ｅｃｋｅｒｔ，Ｊ．Ｈ．およびＲ．Ｅｒｄｍａｎｎ，Ｒｅｖ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．，１４７：７５〜１２１（２００３年）；Ｗｅｌｌｅｒ，Ｓ．ら、Ａｎｎｕａｌ Ｒｅｖｉｅｗ ｏｆ Ｇｅｎｏｍｉｃｓ ａｎｄ Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，４：１６５〜２１１（２００３年）；Ｗａｎｄｅｒｓ，Ｒ．Ｊ．，Ａｍ．Ｊ．Ｍｅｄ．Ｇｅｎｅｔ．，１２６Ａ：３５５〜３７５（２００４年）；Ｍａｎｏ，Ｓ．およびＭ．Ｎｉｓｈｉｍｕｒａ，Ｖｉｔａｍ Ｈｏｒｍ．，７２：１１１〜１５４（２００５年）；Ｗａｎｄｅｒｓ，Ｊ．Ａ．，およびＨ．Ｒ．Ｗａｔｅｒｈａｍ，Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，７５：２９５〜３３２（２００６年）；Ｆｕｊｉｋｉ，Ｙｕｋｉｏ．Ｐｅｒｏｘｉｓｏｍｅ Ｂｉｏｇｅｎｅｓｉｓ Ｄｉｓｏｒｄｅｒｓ．，Ｅｎｃｙｃｌｏｐｅｄｉａ ｏｆ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ．Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ，２００６年）。例えばＸ連鎖副腎白質萎縮症［「Ｘ−ＡＬＤ」］およびツェルヴェーガー症候群、ならびにいくつかの重篤性のより低い疾患形態は、単一酵素欠乏症および／またはペルオキシソーム生合成障害に起因し得る。
酵母ヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）中では、表４で同定されているように多様な異なるＰｅｘ遺伝子が単離され特性決定されている。より具体的にはＢａｓｃｏｍ，Ｒ．Ａ．ら（Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．Ｃｅｌｌ，１４：９３９〜９５７（２００３年））はＹｌＰｅｘ３ｐについて述べ、Ｓｚｉｌａｒｄ，Ｒ．Ｋ．ら（Ｊ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．，１３１：１４５３〜１４６９（１９９５年））はＹｌＰｅｘ５ｐについて述べ、Ｎｕｔｔｌｅｙ，Ｗ．Ｍ．ら（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２６９：５５６〜５６６（１９９４年））はＹｌＰｅｘ６ｐについて述べ、Ｅｌｉｚｅｎ Ｇ．Ａ．ら（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２７０：１４２９〜１４３６（１９９５年））はＹｌＰｅｘ９ｐについて述べ、Ｅｌｉｚｅｎ Ｇ．Ａ．ら（Ｊ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．，１３７：１２６５〜１２７８（１９９７年））およびＴｉｔｏｒｅｎｋｏ，Ｖ．Ｉ．ら（Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．，１７：５２１０〜５２２６（１９９７年））はＹｌＰｅｘ１６ｐについて述べ、Ｌａｍｂｋｉｎ，Ｇ．Ｒ．およびＲ．Ａ．Ｒａｃｈｕｂｉｎｓｋｉ（Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．Ｃｅｌｌ．，１２（１１）：３３５３〜３３６４（２００１年））はＹｌＰｅｘ１９について述べ、Ｔｉｔｏｒｅｎｋｏ Ｖ．Ｉ．ら（Ｊ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．，１４２：４０３〜４２０（１９９８年））およびＳｍｉｔｈ Ｊ．Ｊ．およびＲ．Ａ．Ｒａｃｈｕｂｉｎｓｋｉ（Ｊ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．，２７６：１６１８〜１６２５（２００１年））はＹｌＰｅｘ２０ｐについて述べている。
ここで最初に興味深かったのはＹｌＰｅｘ１０ｐ（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＣＡＧ８１６０６、ＡＢ０３６７７０、およびＡＪ０１２０８４）であった。Ｓｕｍｉｔａら（ＦＥＭＳ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｌｅｔｔ．，２１４：３１〜３８（２００２年）では、１）ＹｌＰｅｘ１０ｐがペルオキシソーム構成要素として機能すること、２）Ｃ３４１Ｓ、Ｃ３４６Ｓ、およびＨ３４３Ｗ点突然変異の創出とそれに続く成長分析による判定で、ＹｌＰｅｘ１０ｐのＣ3ＨＣ4亜鉛リングフィンガーモチーフがタンパク質の機能に必須であることが実証された。
Ｐｅｘ１０のＣ3ＨＣ4亜鉛リングフィンガーモチーフの研究はその他の生物で行われ、同様の結果であった。例えばピチア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ）のＰｅｘ１０ｐのＣ3ＨＣ4モチーフ中の保存された残基を変更する点突然変異は、タンパク質の機能を消滅させることが分かった（Ｋａｌｉｓｈ，Ｊ．Ｅ．ら、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．，１５：６４０６〜６４１９（１９９５年））。同様に線維芽細胞系中における機能的相補性アッセイの後、Ｗａｒｒｅｎ Ｄ．Ｓ．ら（Ｈｕｍ．Ｍｕｔａｔ．，１５（６）：５０９〜５２１（２０００年））は、Ｃ3ＨＣ4モチーフがＰｅｘ１０ｐ機能に重要であると結論した。いくつかの研究は、アラビドプシス（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ）におけるＰｅｘ１０ｐ機能の損失が、心形期における胚死亡を引き起こすことを示す（Ｈｕ，Ｊ．ら、Ｓｃｉｅｎｃｅ，２９７：４０５〜４０９（２００２年）；Ｓｃｈｍｕｍａｎｎ，Ｕ．ら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．，１００：９６２６〜９６３１（２００３年）；Ｓｐａｒｋｅｓ，Ｉ．Ａ．ら、Ｐｌａｎｔ Ｐｈｙｓｉｏｌ．，１３３：１８０９〜１８１９（２００３年）；Ｆａｎ，Ｊ．ら、Ｐｌａｎｔ Ｐｈｙｓｉｏｌ．，１３９：２３１〜２３９（２００５年））。経過観察研究で、Ｓｃｈｅｍａｎｎ，Ｕ．ら（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．，１０４：１０６９〜１０７４（２００７年））は、非致死性部分機能喪失型アラビドプシス（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ）変異株においてＰｅｘ１０ｐの機能を調査した。具体的にはアラビドプシス（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ）野生型バックグラウンドで、機能不全Ｃ3ＨＣ4モチーフがある、Ｐｅｘ１０ｐを発現する４つのＴ−ＤＮＡ挿入系統を作り出した。変異型植物は損なわれた緑葉ペルオキシソームを示し、著者らはＰｅｘ１０ｐ中のリングフィンガーモチーフの不活性化が、ペルオキシソームの葉緑体への付着と、ペルオキシソームおよび葉緑体間の代謝産物移動とに必要なタンパク質相互作用を排除したことを提案した。
研究はその他のＰｅｘタンパク質中の必須ドメインを同定していないが、研究は脂質代謝における役割が知られている細胞小器官であるペルオキシソームをアセンブルし、維持し、増殖させ、遺伝させるために、進化的に多様な生物が使用する戦略および分子機序を学ぶため、様々なＰｅｘ変異型の影響を検討している。例えばＢａｓｃｏｍ，Ｒ．Ａ．らは、ヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）Ｐｅｘ３ｐのノックアウトおよび過剰発現を実施した（Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．Ｃｅｌｌ，１４：９３９〜９５７（２００３年））。ノックアウト細胞は野生型ペルオキシソームを含有しなかったが、代わりに多数の小型小胞を有した。過剰発現は、より少数のより大型で密集するペルオキシソームがある細胞をもたらした。彼らは、ペルオキシソーム生合成の構成要素の隔離、すなわちペルオキシソーム標的シグナル（ＰＴＳ）１および２取り込み機序によって、Ｐｅｘ３ｐがペルオキシソームアセンブリーの開始に関与するという仮説を立てた。同様にＧｕｏ，Ｔ．らの研究では、ヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）Ｐｅｘ１６ｐのノックアウトが未熟ペルオキシソーム小胞の過剰な増殖をもたらし、それらの成熟ペルオキシソームへの変換の速度と効率を顕著に低下させたのに対し（Ｊ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．，１６２：１２５５〜１２６６（２００３年））、過剰発現は少数であるが肥大したペルオキシソームをもたらした（Ｅｉｔｚｅｎら、Ｊ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．，１３７：１２６５〜１２７８（１９９７年））。Ｇｕｏらは、Ｐｅｘ１６ｐが、初期ペルオキシソーム前駆物質の分裂に必要な膜切断事象を負に調節すると結論した。
上に要約した進歩にもかかわらず、様々なＰｅｘタンパク質の役割、それらの相互作用、およびペルオキシソーム中の生合成／アセンブリー機序に関わる多くの詳細は、未だに解明されていない。したがってＹｌＰｅｘ１０ｐのＣ3ＨＣ4モチーフ内の変異、またはＹｌＰｅｘ３ｐ、ＹｌＰｅｘ１０ｐまたはＹｌＰｅｘ１６ｐのノックアウトが、ＰＵＦＡ、特にＣ20〜Ｃ22分子などの長鎖ＰＵＦＡを細胞中の総脂質画分および油画分に組み込む能力が増大したヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）変異株の創出をもたらすという、本明細書に記載されているデータは、その他の植物または動物を用いた研究で未だ検証されていない新しい観察である。
ペルオキシソームは、異化および同化脂質代謝の双方に必要とされることが提案されている（Ｌｉｎ，Ｙ．ら、Ｐｌａｎｔ Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ，１３５：８１４〜８２７（２００４年））が、この仮説はＰｅｘ１６ｐ相同体の研究に基づく。より具体的にはＬｉｎ，Ｙ．ら（前出）は、ｓｓｅ１ ｓｅｅｄの野性型のおよそ１０〜１６％への油減少に基づいて、アラビドプシス（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ）Ｓｈｒｕｎｋｅｎ Ｓｅｅｄ １（ｓｓｅ１）変異型が、異常なペルオキシソーム生合成および脂肪酸合成の双方を有することを報告した。Ｂｉｎｎｓ，Ｄ．ら（Ｊ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．，１７３（５）：７１９〜７３１（２００６年））は、サッカロミセス・セレヴィシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）においてペルオキシソームと脂質体の相互作用を調べ、２つの細胞小器官の間の広範囲に及ぶ物理的接触が、ペルオキシソーム脂肪酸酸化による脂質体内の脂肪分解のカップリングを促進すると判定した。より具体的には様々なＰｅｘノックアウト中で遊離脂肪酸とＴＡＧとの比率を調べ、野生型に比べて増大することを見いだした。ペルオキシソームおよび特にＰｅｘ３ｐ、Ｐｅｘ１０ｐ、およびＰｅｘ１６ｐタンパク質の代謝的役割を理解するには、明らかにさらなる調査が必要であろう。
いかなる特定の説明または理論による拘束も望まないが、油性酵母細胞中のＰｅｘ遺伝子の中断またはノックアウトは、ペルオキシソーム中で自然に起きる、またはペルオキシソームによって影響される、異化および同化脂質代謝の双方に影響するという仮説が立てられる。中断またはノックアウトは、天然ペルオキシソーム生合成因子タンパク質が中断されていない油性酵母と比較して、総脂肪酸の％としての、総脂質画分中および油画分中のＰＵＦＡ量の増大をもたらす。場合によっては、乾燥細胞重量％としての総脂質画分中および油画分中のＰＵＦＡ量の増大、および／または乾燥細胞重量％としての総脂質含量の増大もまた観察された。藻類、真菌、卵菌綱、酵母、ユーグレナ属、ストラメノパイル（Ｓｔｒａｍｅｎｏｐｉｌｅｓ）、植物、およびいくつかの哺乳類系などの全ての真核生物は全てペルオキシソームを含んでなることから、この一般機序が適用できるという仮説が立てられる。
Ｐｅｘ相同体の同定および単離
好ましい宿主生物中の特定のＰｅｘ遺伝子またはタンパク質の配列が未知である場合、当業者は、コードされるタンパク質の活性を調節するのに先だって、これらの遺伝子またはその一部を同定および単離することが最も望ましいことを認識し、次に調節は、総脂肪酸の％としての、真核生物の総脂質画分中および油画分中に組み込まれるＰＵＦＡ量の変更を容易にする。好ましい宿主のＰｅｘ遺伝子の配列知識もまた、標的を定めた中断による相同染色体の遺伝子中断を容易にする。
配列分析ソフトウェアを使用して、表４中のＰｅｘ配列またはその一部を使用して、同一または別の藻類、真菌、卵菌類、ユーグレナ属、ストラメノパイル（Ｓｔｒａｍｅｎｏｐｉｌｅｓ）、酵母または植物種中のＰｅｘ相同体を検索してもよい。一般にこのようなコンピュータソフトウェアは、様々な置換、欠失、およびその他の修飾に相同性の程度を割り当てることで類似した配列をマッチさせる。低複雑性フィルターと、次のパラメーター：期待値＝１０、マトリックス＝Ｂｌｏｓｕｍ ６２（Ａｌｔｓｃｈｕｌ，ら、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２５：３３８９〜３４０２（１９９７年））でのＢＬＡＳＴＰアラインメント法などのソフトウェアアルゴリズムの使用は、表４中のいずれかのＰｅｘタンパク質を核またはタンパク質配列のデータベースと比較して、それによって好ましい宿主生物内の類似した既知の配列を同定するために良く知られている。
既知の配列のデータベースを綿密にチェックするためのソフトウェアアルゴリズムの使用は、特に表４に記載されているものなどの公的に入手可能なＰｅｘ配列と比較的低い％同一性を有する相同体の単離に適する。公的に入手可能なＰｅｘ配列と少なくとも約７０％〜８５％同一性のＰｅｘ相同体について、単離が比較的容易であろうことは予測可能である。さらに少なくとも約８５％〜９０％同一の配列は特に単離に適し、少なくとも約９０％〜９５％同一の配列は最も容易に単離されるであろう。
いくつかのＰｅｘ相同体はまた、Ｐｅｘ酵素にユニークなモチーフの使用によって単離されている。例えばＰｅｘ２ｐ、Ｐｅｘ１０ｐ、およびＰｅｘ１２ｐは、全てそれらのカルボキシル末端近辺に、Ｃ3ＨＣ4亜鉛リングフィンガーモチーフとして知られている、システインに富むモチーフを共有することが良く知られている（図２Ａ）。この「保存ドメイン」領域は特定の位置の高度に保存されたアミノ酸セットに対応し、タンパク質の構造、安定性または活性に必須であるＰｅｘタンパク質の領域を表す可能性が高い。モチーフは、それらがタンパク質相同体ファミリーの整合配列内に高度に保存されていることによって同定される。それらはユニークな「シグネチャー」として、新たに判定された配列を有するタンパク質が、以前同定されたタンパク質ファミリーに属するかどうかを判定できる。これらのモチーフは、それぞれ新しいＰｅｘ２、Ｐｅｘ１０および／またはＰｅｘ１２遺伝子の迅速な同定のための診断用ツールとして有用である。
代案としてはΔ１７デサチュラーゼ相同体の同定のために、公的に入手可能なＰｅｘ配列またはそのモチーフをハイブリダイゼーション試薬としてもよい。核酸ハイブリダイゼーション試験の基本的構成要素には、プローブ、対象とする遺伝子または遺伝子断片を含有することが疑われるサンプル、および特定のハイブリダイゼーション法が含まれる。プローブは、典型的に、検出される核酸配列に相補的な一本鎖核酸配列である。プローブは、検出される核酸配列とハイブリダイズ可能である。プローブの長さは、５個の塩基から数万個の塩基の間で変動してもよいが、典型的に約１５個の塩基から約３０個の塩基のプローブ長が適切である。プローブ分子の一部のみが、検出される核酸配列に相補的であればよい。さらにプローブと標的配列との間の相補性は完璧でなくてもよい。ハイブリダイゼーションは不完全に相補的な分子間でも生じ、その結果、ハイブリダイズした領域の特定塩基の一部は、適切な相補的塩基と対合形成しない。
ハイブリダイゼーション法については、良く知られている。典型的には、プローブおよびサンプルは、核酸ハイブリダイゼーションを可能にする条件下で混合されなくてはならない。これは適切な濃度および温度条件下において、無機または有機塩存在下で、プローブとサンプルを接触させることを伴う。プローブとサンプル核酸の間であらゆる可能なハイブリダイゼーションが起きるように、プローブおよびサンプル核酸は、十分長い時間接触しなくてはならない。混合物中のプローブまたは標的濃度が、ハイブリダイゼーションが生じるのに必要な時間を決定する。プローブまたは標的の濃度が高いほど、必要なハイブリダイゼーションインキュベーション時間は短くなる。場合により、塩化グアニジニウム、グアニジニウムチオシアネート、ナトリウムチオシアネート、テトラクロロ酢酸リチウム、過塩素酸ナトリウム、テトラクロロ酢酸ルビジウム、ヨウ化カリウム、またはトリフルオロ酢酸セシウムのようなカオトロピック剤を添加してもよい。所望するならば、ハイブリダイゼーション混合物にホルムアミドを典型的に３０〜５０％（ｖ／ｖ）[「容量で」]添加できる。
様々なハイブリダイゼーション溶液を用いることができる。それらは典型的に約２０〜６０容量％、好ましくは３０容量％の極性有機溶剤からなる。一般的なハイブリダイゼーション溶液は、約３０〜５０％ｖ／ｖのホルムアミドと、約０．１５〜１Ｍの塩化ナトリウムと、（例えばクエン酸ナトリウム、トリス−ＨＣｌ、ＰＩＰＥＳまたはＨＥＰＥＳ（ｐＨ範囲約６〜９）などの）約０．０５〜０．１Ｍの緩衝液と、（例えばドデシル硫酸ナトリウムなどの）約０．０５〜０．２％の洗剤、または０．５〜２０ｍＭのＥＤＴＡ、ファーマシア（Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｉｎｃ．）からのＦＩＣＯＬＬ（約３００〜５００ｋｄａｌ）、ポリビニルピロリドン（約２５０〜５００ｋｄａｌ）、および血清アルブミンを用いる。また典型的なハイブリダイゼーション溶液には、約０．１〜５ｍｇ／ｍＬの非標識の担体核酸、仔ウシ胸腺またはサケ精子ＤＮＡ、または酵母菌ＲＮＡのような核酸ＤＮＡ断片、および場合により約０．５〜２％ｗｔ／ｖｏｌ［重量／容量］のグリシンも含まれる。ポリエチレングリコールのような極性水溶性または水性膨張剤、（例えばポリアクリレートまたはポリメチルアクリレートなどの）陰イオンポリマー、硫酸デキストランのような陰イオン糖類ポリマーをはじめとする体積排除剤などのその他の添加剤を含めてもよい。
核酸ハイブリダイゼーションは多様なアッセイ型式に適合できる。最も適切なもの１つは、サンドイッチアッセイ型式である。サンドイッチアッセイは、特に非変性条件下でのハイブリダイゼーションに適合できる。サンドイッチタイプのアッセイの主要構成要素は、固体担体である。固体担体は、未標識で配列の一部と相補的である固定化核酸プローブをそれに吸着し、またはそれと共有結合する。
任意のＰｅｘ核酸断片または同定されたあらゆる相同体のいずれかを使用して、同一または別の藻類、真菌、卵菌綱、ユーグレナ属、ストラメノパイル（Ｓｔｒａｍｅｎｏｐｉｌｅｓ）、酵母または植物種から、相同的なタンパク質をコードする遺伝子を単離してもよい。配列依存プロトコルを使用した相同的遺伝子の単離は、当該技術分野で周知である。配列依存プロトコルの例としては以下が挙げられるが、これに限定されるものではない。１．）核酸ハイブリダイゼーション法、２．）ポリメラーゼ連鎖反応［「ＰＣＲ」］（米国特許第４，６８３，２０２号明細書）などの、核酸増幅技術の様々な使用で例示されるようなＤＮＡおよびＲＮＡ増幅法；リガーゼ連鎖反応［「ＬＣＲ」］（Ｔａｂｏｒ，Ｓ．ら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．、８２、１０７４（１９８５年））；または連鎖置換増幅［「ＳＤＡ」］（Ｗａｌｋｅｒら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．、８９、３９２（１９９２年））、および３．）相補性によるライブラリー構築およびスクリーニング法。
例えば公的に入手可能なＰｅｘ遺伝子またはそれらのモチーフと類似したタンパク質またはポリペプチドをコードする遺伝子は、周知の方法を使用して、ＤＮＡハイブリダイゼーションプローブとして公的に入手可能な核酸断片の全てまたは一部を使用して、あらゆる所望の生物からのライブラリーをスクリーンして直接単離できる。公的に入手可能な核酸配列に基づく特異的オリゴヌクレオチドプローブは、技術分野で既知の方法によってデザインおよび合成できる（Ｍａｎｉａｔｉｓ、前出）。さらにランダムプライマーＤＮＡ標識、ニック翻訳または末端標識技術のような当業者に既知の方法によって、配列全体を直接使用してＤＮＡプローブを合成でき、または利用できる生体外転写システムを使用してＲＮＡプローブを合成できる。さらに特異的プライマーをデザインして使用し、公的に入手可能な配列の一部（または全長）を増幅できる。得られた増幅生成物を増幅反応中に直接標識し、または増幅反応後に標識して、適切なストリンジェンシー条件下でプローブとして使用し、完全長ＤＮＡ断片を単離できる。
典型的にＰＣＲ−タイプ増幅技術では、プライマーは異なる配列を有し、互いに相補的でない。所望の試験条件次第で、プライマーの配列は、標的核酸の効率的かつ忠実な複製を提供するようにデザインされるべきである。ＰＣＲプライマーデザインの方法は一般的であり、よく知られている。（Ｋ．Ｅ．Ｄａｖｉｓ編、「Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅｔｉｃ Ｄｉｓｅａｓｅｓ：Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ」よりＴｈｅｉｎおよびＷａｌｌａｃｅ、「Ｔｈｅ ｕｓｅ ｏｆ ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ａｓ ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ ｐｒｏｂｅｓ ｉｎ ｔｈｅ Ｄｉａｇｎｏｓｉｓ ｏｆ Ｇｅｎｅｔｉｃ Ｄｉｓｏｒｄｅｒｓ」（１９８６年）３３〜５０、ＩＲＬ：Ｈｅｒｎｄｏｎ，ＶＡ；Ｗｈｉｔｅ，Ｂ．Ａ．編、「Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ」よりＲｙｃｈｌｉｋ，Ｗ．、「ＰＣＲ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ：Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｍｅｔｈｏｄｓ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ」（１９９３年）第１５巻、３１〜３９、Ｈｕｍａｎａ：Ｔｏｔｏｗａ，ＮＪ）。
一般に、入手可能なＰｅｘ配列の２本の短い断片をＰＣＲプロトコルで使用して、ＤＮＡまたはＲＮＡからの相同遺伝子をコードするより長い核酸断片を増幅してもよい。１つのプライマーの配列が入手可能な核酸断片またはそれらのモチーフに由来する、クローンされた核酸断片ライブラリーに対して、ＰＣＲを実施してもよい。別のプライマーの配列は遺伝子をコードするｍＲＮＡ前駆物質の３’末端のポリアデニル酸トラクトの存在を利用する。
代案としては第２のプライマー配列は、クローニングベクターに由来する配列に基づいてもよい。例えば当業者は、ＲＡＣＥプロトコル（Ｆｒｏｈｍａｎら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．、８５：８９９８（１９８８年））に従って、ＰＣＲを使用して転写物の一点と３’または５’末端との間の領域のコピーを増幅し、ｃＤＮＡを作り出すことができる。３’および５’方向を向いたプライマーは、入手可能な配列からデザインできる。市販される３’ＲＡＣＥまたは５’ＲＡＣＥシステム（例えば、ＢＲＬ（Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ，ＭＤ））からを使用して、特定の３’または５’ｃＤＮＡ断片を単離できる（Ｏｈａｒａら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．、８６：５６７３（１９８９年）；Ｌｏｈら、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４３：２１７（１９８９年））。
すぐ上で論議したこれらの周知の方法のいずれかに基づいて、あらゆる選択された好ましい真核生物中でＰｅｘ遺伝子相同体を同定および／または単離することが可能であろう。総脂質画分のおよび油画分の脂質プロフィールが、標的を定めたＰｅｘ遺伝子中断を欠く生物中のものと比較して変更されることから、ＰＵＦＡ産生宿主生物の内在性遺伝子の標的を定めた中断によって、あらゆる推定上のＰｅｘ遺伝子の活性が容易に確認できる。
天然ペルオキシソーム生合成因子タンパク質の中断による総脂質画分中および油画分中のＰＵＦＡ量の増大
上述のように、本開示は、
ａ）ペルオキシソーム生合成因子タンパク質をコードする天然遺伝子の中断と、機能性ＰＵＦＡ生合成経路をコードする遺伝子とを含んでなる油性真核生物を提供することで、ＰＥＸ−中断生物を作り出すステップと、
ｂ）天然ペルオキシソーム生合成因子タンパク質が中断されていない油性真核生物中の重量％と比較して、総脂肪酸重量％に対する総脂質画分中および油画分中の１つのＰＵＦＡまたはＰＵＦＡの組み合わせの重量％を増大させる条件下で、（ａ）の真核生物を成長させるステップを含む、油性真核生物中の１つのＰＵＦＡまたはＰＵＦＡの組み合わせの重量％を増大させるための方法に関する。
総脂肪酸の％としてのＰＵＦＡ量の増大は、１）ＰＵＦＡ中間体または副産物とは対照的に機能性ＰＵＦＡ生合成経路の所望の最終産物であるＰＵＦＡ、２）Ｃ20〜Ｃ22ＰＵＦＡ、および／または、３）総ＰＵＦＡであり得る。
総脂肪酸重量％に対する１つのまたは合わせたＰＵＦＡの重量％の増大に加えて、場合によっては細胞の総脂質含量（ＴＦＡ％ＤＣＷ）が増大または減少するかもしれない。これはＰＥＸ遺伝子中の中断が、ＰＥＸ中断細胞内の総脂質量の増大または減少を引き起こすかどうかにかかわらず、中断が、常にＰＵＦＡまたはＰＵＦＡの組み合わせの重量％の増大を引き起こすことを意味する。
本明細書で提供される別の方法は、ペルオキシソーム生合成因子タンパク質をコードする天然遺伝子中の中断に関し、前記中断は、天然Ｐｅｘタンパク質が中断されていない、または中断された天然Ｐｅｘタンパク質の「置換」コピーを発現する親株中の％と比較して、乾燥細胞重量に対する１つのＰＵＦＡまたはＰＵＦＡの組み合わせの％の増大をもたらすことができる。
上の方法の好ましい態様では、ペルオキシソーム生合成因子タンパク質をコードする天然遺伝子中の中断は、天然Ｐｅｘタンパク質が中断されていない親株、または中断された天然Ｐｅｘタンパク質の「置換」コピーを発現する親株と比較した、乾燥細胞重量の％として、ＰＵＦＡ中間体または副産物とは対照的に機能性ＰＵＦＡ生合成経路の所望の最終産物であるＰＵＦＡ量の増大をもたらす。場合によっては乾燥細胞重量に対するＰＵＦＡの組み合わせ％の増大は、Ｃ20〜Ｃ22ＰＵＦＡの組み合わせ、または総ＰＵＦＡである。
少なくとも１つのペルオキシソーム生合成因子タンパク質の中断を含んでなる方法によって生成される生物についてもまた、本明細書に記載されている。これらの生物から得られる脂質および油、脂質および油の加工から得られる製品、食品、動物飼料または産業上の利用におけるこれらの脂質および油の使用、および／または食品または動物飼料における副産物の使用についてもまた記載されている。
上述の方法における好ましい真核生物としては、藻類、真菌、卵菌綱、酵母、ユーグレナ属、ストラメノパイル（Ｓｔｒａｍｅｎｏｐｉｌｅｓ）、植物、およびいくつかの哺乳類系が挙げられる。
これらのいずれかの方法のためのペルオキシソーム生合成因子タンパク質は、Ｐｅｘ１ｐ、Ｐｅｘ２ｐ、Ｐｅｘ３ｐ、Ｐｅｘ３Ｂｐ、Ｐｅｘ４ｐ、Ｐｅｘ５ｐ、Ｐｅｘ５Ｂｐ、Ｐｅｘ５Ｃｐ、Ｐｅｘ５／２０ｐ、Ｐｅｘ６ｐ、Ｐｅｘ７ｐ、Ｐｅｘ８ｐ、Ｐｅｘ１０ｐ、Ｐｅｘ１２ｐ、Ｐｅｘ１３ｐ、Ｐｅｘ１４ｐ、Ｐｅｘ１５ｐ、Ｐｅｘ１６ｐ、Ｐｅｘ１７ｐ、Ｐｅｘ１４／１７ｐ、Ｐｅｘ１８ｐ、Ｐｅｘ１９ｐ、Ｐｅｘ２０ｐ、Ｐｅｘ２１ｐ、Ｐｅｘ２１Ｂ、Ｐｅｘ２２ｐ、Ｐｅｘ２２ｐ様、およびＰｅｘ２６ｐ（およびそのタンパク質相同体）からなる群から選択されてもよい。本明細書に記載されているいくつかの好ましい方法では、中断されたペルオキシソーム生合成因子タンパク質は、Ｐｅｘ２ｐ、Ｐｅｘ３ｐ、Ｐｅｘ１０ｐ、Ｐｅｘ１２ｐおよび／またはＰｅｘ１６ｐからなる群から選択される。しかしいくつかのより好ましい方法では、中断されたペルオキシソーム生合成因子タンパク質は、Ｐｅｘ３ｐ、Ｐｅｘ１０ｐおよび／またはＰｅｘ１６ｐからなる群から選択される。
ペルオキシソーム生合成因子タンパク質をコードする天然遺伝子中の中断は、タンパク質Ｎ末端部分内またはタンパク質Ｃ末端部分内などの遺伝子の一部内の挿入、欠失、または標的を定めた変異であり得る。代案としては中断は、遺伝子が宿主細胞ゲノムから除去されるような完全な遺伝子ノックアウトをもたらすことができる。あるいは中断は、非機能性タンパク質をもたらす標的を定めた変異であり得る。
中断方法
本発明は、好ましい宿主細胞内における、ペルオキシソーム生合成因子タンパク質をコードする天然遺伝子の中断を含む。当業者は中断を達成するのに多数の技術を利用できるが、一般に特定遺伝子の内在性活性は次の技術によって低下または排除できる。例えば１）標的遺伝子全部または一部の挿入、置換および／または欠失を通じた遺伝子の中断、または２）タンパク質発現を調節する制御配列の操作。これらの技術についてはどちらも下で論じられる。しかし当業者は、これらについて既存の文献に詳しく記載されており、本明細書に記載されている方法、宿主細胞、および生成物を限定するものではないことを理解する。当業者はまた、あらゆる特定の油性酵母と共に使用するための最も適切な技術を理解する。
挿入、置換および／または欠失を通じた中断：遺伝子中断のために、典型的に選択可能なマーカー遺伝子である外来性ＤＮＡ断片が構造遺伝子中に挿入される。これは構造遺伝子のコード配列を妨害して、その遺伝子の不活性化を引き起こす。中断カセットの宿主細胞への形質転換は，非機能性中断遺伝子との相同的組換えによる機能性天然遺伝子の置換をもたらす。例えばＨａｍｉｌｔｏｎら、Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．，１７１：４６１７〜４６２２（１９８９年）；Ｂａｌｂａｓら、Ｇｅｎｅ，１３６：２１１〜２１３（１９９３年）；Ｇｕｅｌｄｅｎｅｒら、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，２４：２５１９〜２５２４（１９９６年）；およびＳｍｉｔｈら、Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．，５：２７０〜２７７（１９９６年）を参照されたい。当業者は、正または負の選択と、遺伝子ノックアウト創出と、哺乳類系、植物細胞、糸状菌、藻類、卵菌綱、ユーグレナ属、ストラメノパイル（Ｓｔｒａｍｅｎｏｐｉｌｅｓ）、酵母および／または微生物系の特定ゲノム部位への外来性ＤＮＡ配列の挿入を可能にする、遺伝子標的技術の一般方法の多数のバリエーションを理解する。
対照的に遺伝子中断の非特異的方法は、転位因子またはトランスポゾンの使用である。トランスポゾンはＤＮＡに無作為に挿入される遺伝的要素であるが、後で配列に基づいて検索して挿入遺伝子座を判定できる。生体内および生体外双方における遺伝子転位技術が知られており、トランスポサーゼ酵素と組み合わされた転位因子の使用を伴う。転位因子またはトランスポゾンをトランスポサーゼ存在下で核酸断片に接触させると、転位因子は核酸断片中に無作為に挿入される。中断された遺伝子は転位因子の配列に基づいて同定されてもよいので、技術はランダム変異誘発のためおよび遺伝子単離のために有用である。生体外遺伝子転位のためのキットは市販され、Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ（Ｂｒａｎｃｈｂｕｒｇ，ＮＪ）から入手できる酵母Ｔｙ１要素に基づくＰｒｉｍｅｒ Ｉｓｌａｎｄ遺伝子転位キット、Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ（Ｂｅｖｅｒｌｙ，ＭＡ）から入手できる細菌トランスポゾンＴｎ７に基づくＧｅｎｏｍ Ｐｒｉｍｉｎｇ Ｓｙｓｔｅｍ、およびＥｐｉｃｅｎｔｒｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）から入手できるＴｎ５細菌転位因子に基づくＥＺ：：ＴＮ Ｔｒａｎｓｐｏｓｏｎ Ｉｎｓｅｒｔｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍｓが挙げられる。
Ｐｅｘ制御配列の操作：当該技術分野で良く知られているように、コード配列と関連付けられている制御配列としては、コード配列の上流（５’非コード配列）、コード配列内、または下流（３’非コード配列）に位置して、関連コード配列の転写、ＲＮＡプロセシングまたは安定性、または翻訳に影響する、転写および翻訳「制御」ヌクレオチド配列が挙げられる。したがってＰｅｘ遺伝子の制御配列の操作は、特定のＰｅｘ遺伝子のプロモータ、サイレンサー、５’非翻訳リーダー配列（転写開始部位および翻訳開始コドンの間）、イントロン、エンハンサー、開始制御領域、ポリアデニル化認識配列、ＲＮＡプロセシング部位、エフェクター結合部位、およびステムループ構造の操作を指してもよい。しかし全ての場合で、操作の結果は、天然ペルオキシソーム生合成因子タンパク質が中断されていない油性酵母と比較して、総脂肪酸％として、総脂質画分中および油画分中のＰＵＦＡ量の増大を促進するＰｅｘ遺伝子の発現のダウンレギュレートである。
例えばＰｅｘ１０遺伝子のプロモータは、欠失しまたは中断されてもよい。代案としてはＰｅｘ１０遺伝子発現を促進する天然プロモータは、天然プロモータと比較して低下したプロモータ活性を有する異種プロモータで置換されてもよい。制御配列を操作する有用な方法については、良く知られている。
当業者はこれらのおよびその他の良く知られている技術を使用して、哺乳類系、植物細胞、糸状菌、藻類、卵菌綱、ユーグレナ属、ストラメノパイル（Ｓｔｒａｍｅｎｏｐｉｌｅｓ）、および酵母などの本明細書に記載されている好ましい宿主細胞中の天然ペルオキシソーム生合成因子タンパク質を中断できる。
当業者は、天然Ｐｅｘ遺伝子を中断して、天然ペルオキシソーム生合成因子タンパク質が中断されていない真核生物と比較して、総脂肪酸の％として、総脂質画分中および油画分中に蓄積するＰＵＦＡ量の増大を達成する、最適手段を識別できる。
ω−３および／またはω−６脂肪酸生合成の代謝エンジニアリング
天然ペルオキシソーム生合成因子タンパク質の中断ための本明細書に記載されている方法に加えて、ω−３および／またはω−６脂肪酸生合成を操作することもまた有用であるかもしれない。これはＰＵＦＡ生合成経路中の直接代謝エンジニアリング、またはＰＵＦＡ生合成経路に炭素を提供する経路の追加的操作を必要とするかもしれない。
望ましい生化学的経路をアップレギュレートし、望ましくない生化学的経路をダウンレギュレートするのに有用な技術は、当該技術分野で良く知られている。例えばω−３および／またはω−６脂肪酸生合成経路とエネルギーまたは炭素について競合する生化学的経路、または特定のＰＵＦＡ最終産物の生成を妨げる天然ＰＵＦＡ生合成経路酵素は、遺伝子中断によって排除してもよく、またはアンチセンスｍＲＮＡおよび亜鉛フィンガー標的技術などのその他の手段によってダウンレギュレートしてもよい。
以下はＧＬＡ、ＡＲＡ、ＥＰＡまたはＤＨＡをそれぞれ増大させる手段としてのＰＵＦＡ生合成経路の改変、およびＴＡＧ生合成経路およびＴＡＧ分解経路における望ましい操作について論じている。国際公開第２００６／０３３７２３号パンフレット、国際公開第２００６／０５５３２２号パンフレット［米国特許出願公開第２００６−００９４０９２−Ａ１号明細書］、国際公開第２００６／０５２８７０号パンフレット［米国特許出願公開第２００６−０１１５８８１−Ａ１号明細書］、および国際公開第２００６／０５２８７１号パンフレット［米国特許出願公開第２００６−０１１０８０６−Ａ１号明細書］。
発現系、カセット、ベクター、および宿主細胞形質転換
組み換えコンストラクトを作り出して、例えば哺乳類系、植物細胞、糸状菌、藻類、卵菌綱、ユーグレナ属、ストラメノパイル（Ｓｔｒａｍｅｎｏｐｉｌｅｓ）、および酵母などの好ましい真核生物の宿主に導入し、天然ペルオキシソーム生合成因子タンパク質の中断、および／またはＰＵＦＡ生合成経路をコードする遺伝子の導入をもたらす必要があるかもしれない。当業者は、１）ＤＮＡ分子、プラスミドなどの高分子の構築操作、および単離のための特定の条件と手順、２）組み換えＤＮＡ断片および組み換え発現コンストラクトの作成、および３）クローンのスクリーニングおよび単離について記載している標準資料を理解する。Ｓａｍｂｒｏｏｋら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，第２版，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ：Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ（１９８９年）；Ｍａｌｉｇａら、Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ（１９９５年）；Ｂｉｒｒｅｎら、Ｇｅｎｏｍｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ：Ｄｅｔｅｃｔｉｎｇ Ｇｅｎｅｓ、第１巻、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ（１９９８年）；Ｂｉｒｒｅｎら、Ｇｅｎｏｍｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ：Ａｎａｌｙｚｉｎｇ ＤＮＡ、第２巻、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ：ＮＹ（１９９８）；Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｃｌａｒｋ，ｅｄ．Ｓｐｒｉｎｇｅｒ：ＮＹ（１９９７）を参照されたい。
一般にコンストラクトに含める配列の選択は、所望の発現産物、宿主細胞の性質、および非形質転換細胞に対して形質転換された細胞を分離するのに提案される手段に左右される。当業者は、キメラ遺伝子を含有する宿主細胞を成功裏に形質転換し、選択し、増殖させるのに、プラスミドベクター上に存在しなくてはならない遺伝的要素を十分承知している。しかし典型的にベクターまたはカセットは、関連遺伝子の転写および翻訳に向けた配列、選択可能なマーカー、および自律複製または染色体の組み込みを可能にする配列を含有する。適切なベクターは、転写開始を制御する遺伝子の領域５’、すなわちプロモータと、転写終結を制御するＤＮＡ断片の領域３’、すなわちターミネーターとを含んでなる。双方の制御領域が、形質転換宿主細胞からの遺伝子に由来することが最も好ましい。
所望の宿主細胞中において異種遺伝子またはその部分の発現を促進するのに有用な開始制御領域またはプロモータは多数あり、良く知られている。これらの制御領域は、プロモータ、エンハンサー、サイレンサー、イントロン配列、３’ＵＴＲおよび／または５’ＵＴＲ領域、およびタンパク質および／またはＲＮＡ安定化要素を含んでもよい。このような要素はそれらの強度および特異性が異なっていてもよい。実質的に、選択された宿主細胞中において、これらの遺伝子の発現を指示できるあらゆるプロモータ（すなわち天然、合成、またはキメラ）が適切である。宿主細胞中における発現は、誘発的または構成的に起きることができる。誘導的発現は、関心のあるＰｅｘ遺伝子と作動的に連結する調節可能なプロモータの活性を誘導することによって起きる。構成的発現は、関心のある遺伝子と作動的に連結する構成的プロモータを使用することによって起きる。
宿主細胞が例えば酵母である場合、酵細胞中で機能する転写および翻訳領域が、特に宿主種から提供される。ヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）中で使用するのに好ましい転写開始調節領域については、国際公開第２００６／０５２８７０号パンフレットを参照されたい。構成的または誘導的転写が所望されるかどうか、関心のあるＯＲＦを発現するプロモータの効率、構築の容易さなどに応じて、いくつかの制御配列のいずれを使用してもよい。
転写終結シグナルコードする３’非コード配列、すなわち「終結領域」が、組み換えコンストラクト中に提供されなくてはならず、それから開始領域が得られた遺伝子の３’領域からのもの、または異なる遺伝子からのものであってもよい。多数の終結領域が知られており、それらが由来するのと同一のおよび異なる属および種のどちらで利用しても、多様な宿主中で満足に機能する。終結領域は特定の特質についてでなく、より便宜的に選択される。終結領域はまた、好ましい宿主に天然の様々な遺伝子に由来してもよい。
酵母中で使用するのに特に有用な終結領域は、酵母遺伝子、特にサッカロミセス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）、分裂酵母（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）、カンジダ（Ｃａｎｄｉｄａ）、ヤロウィア（Ｙａｒｒｏｗｉａ）またはクリヴェロミセス（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ）に由来するものである。哺乳類のγ−インターフェロンおよびα−２インターフェロンをコードする遺伝子３’領域は、酵母中でもまた機能することが知られている。当業者は入手できる情報を利用して、転写ターミネーターとして機能する３’領域配列をデザインおよび合成できるので、３’領域はまた合成することもできる。終結領域は不要かもしれないが、高度に好ましい。
ベクターは、上述の制御要素に加えて、選択可能なおよび／またはスコア可能なマーカーを含んでなってもよい。好ましくはマーカー遺伝子は抗生物質耐性遺伝子であり、細胞を抗生物質で処置することは、非形質転換細胞の成長阻害または死亡、および形質転換細胞の阻害されない生育を引き起こす。酵母形質転換体の選択のためには、カナマイシン、ハイグロマイシン、およびアミノグリコシドＧ４１８に対する抵抗性がある、酵母中で機能するあらゆるマーカーが有用であり、ウラシル、リジン、ヒスチジンまたはロイシンを欠く培地上の生育能力が特に有用である。
遺伝子をクローニングベクターに単に挿入することは、所望の速度、濃度、量などでのその発現を保証しない。高発現率に対する必要に応えて、転写、ＲＮＡ安定性、翻訳、タンパク質安定性および位置、酸素制限、および宿主細胞からの分泌を制御する、いくつかの異なる遺伝的要素を操作することにより、多数の特殊発現ベクターが作り出されている。操作される特徴のいくつかとしては、次が挙げられる。関連する転写プロモータおよびターミネーター配列の性質、クローン遺伝子コピー数、および遺伝子がプラスミド由来であるかまたは宿主細胞のゲノム中に組み込まれているかどうか、合成外来性タンパク質の最終的細胞内所在、宿主生物中のタンパク質翻訳および正しい折りたたみの効率、宿主細胞中のクローン遺伝子のｍＲＮＡおよびタンパク質の固有の安定性、およびその使用頻度が宿主細胞の好ましいコドン使用頻度に近くなるようなクローン遺伝子中のコドン使用頻度。これらのそれぞれを本明細書に記載されている方法および宿主細胞中で使用して、ＰＵＦＡ生合成経路遺伝子の発現をさらに最適化し、天然Ｐｅｘ遺伝子の発現を減少させてもよい。
例えばプロモータ、ＯＲＦ、およびターミネーターを含んでなるキメラ遺伝子を含んでなり、天然ペルオキシソーム生合成因子タンパク質の中断またはノックアウト、および／またはＰＵＦＡ生合成経路活性をコードする遺伝子の発現に適した、組み換えコンストラクトを作り出した後、それを宿主細胞中で自律複製できるプラスミドベクターに入れ、または宿主細胞のゲノムに直接組み込む。発現カセットの組み込みは、宿主ゲノム中で無作為に起きることができ、または宿主遺伝子座での遺伝子組み換えを標的とするのに十分な宿主ゲノムとの相同性領域を含有するコンストラクトの使用を通じて、標的を定めることができる。コンストラクトが内在性遺伝子座に標的を定めれば、全てまたはいくつかの転写および翻訳調節領域を内在性遺伝子座によって提供できる。
別々の複製ベクターから２つ以上の遺伝子が発現する場合、各ベクターは異なる選択手段を有してもよく、他のコンストラクトに対する相同性を欠いて、安定した発現を維持し、コンストラクト中の要素の再集合を防止すべきである。調節領域、選択手段、および導入コンストラクト増殖方法の思慮深い選択は、全ての導入された遺伝子が必要なレベルで発現して、所望の生成物の合成を提供するように実験的に判定できる。
対象とする遺伝子を含んでなるコンストラクトは、あらゆる標準的技術によって宿主細胞に導入してもよい。これらの技術としては、形質転換、例えば酢酸リチウム形質転換（Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ、１９４：１８６〜１８７（１９９１年））、プロトプラスト融合、微粒子銃衝撃、電気穿孔、マイクロインジェクション、真空ろ過、または宿主細胞中に対象とする遺伝子を導入するその他のあらゆる方法が挙げられる。
便宜上、例えば発現カセット中のＤＮＡ配列を取り込むように、あらゆる方法によって操作されている宿主細胞を本明細書では「形質転換された」または「組み換え」と称する。形質転換された宿主は、遺伝子がゲノム中に組み込まれるか、増幅されるか、または複数のコピー数を有する染色体外要素上に存在するかどうか次第で、発現コンストラクトの少なくとも１つのコピーを有し、２つ以上を有してもよい。
形質転換宿主細胞は、導入されるコンストラクト上に含有されるマーカーを選択することで同定できる。代案としては、多数の形質転換技術は多数のＤＮＡ分子を宿主細胞に導入するので、別個のマーカーコンストラクトを所望のコンストラクトと共に同時形質転換してもよい。典型的に、形質転換された宿主は、選択培地上で生育するそれの能力について選択される。選択培地には抗生物質が組み込まれていてもよく、または栄養素または成長因子などの非形質転換宿主の生育に必要な要素を欠いていてもよい。導入されたマーカー遺伝子は抗生物質耐性を与え、または必須成長因子または酵素をコードしてもよく、それによって形質転換宿主中で発現されると選択培地上で生育できるようにする。形質転換宿主の選択は、発現されたマーカータンパク質が直接または間接的に検出できる場合にもまた起きることができる。マーカータンパク質は、単独で、または別のタンパク質との融合物として発現されてもよい。マーカータンパク質は、その酵素活性（例えばβ−ガラクトシダーゼは基質Ｘ−ｇａｌ［「５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリル−β−Ｄ−ガラクトピラノシド」]を着色産物に変換でき、ルシフェラーゼはルシフェリンを発光生成物に変換できる）、またはその発光または変光特徴（例えばオワンクラゲ（Ａｅｑｕｏｒｅａ ｖｉｃｔｏｒｉａ）の緑色蛍光タンパク質は青色光を照射すると蛍光を発する）によって検出できる。代案としては抗体を使用して、例えば関心のあるタンパク質上のマーカータンパク質または分子タグを検出できる。マーカータンパク質またはタグを発現する細胞は、例えば視覚的に、または蛍光活性化細胞選別または抗体を使用したパニングなどの技術によって選択できる。
異なる独立した形質転換事象が異なるレベルとパターンの発現をもたらすので、選択される宿主または発現コンストラクトに関係なく、複数の形質転換体をスクリーンして所望の発現レベル、制御、およびパターンを示す株または植物系統を得なくてはならない（Ｊｏｎｅｓら、ＥＭＢＯ Ｊ．，４：２４１１〜２４１８（１９８５年）；Ｄｅ Ａｌｍｅｉｄａら、Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，２１８：７８〜８６（１９８９年））。このようなスクリーニングは、ＤＮＡブロットのサザン分析（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，９８：５０３（１９７５年））、ｍＲＮＡ発現のノーザン分析（Ｋｒｏｃｚｅｋ，Ｊ．Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒ．Ｂｉｏｍｅｄ．Ａｐｐｌ．，６１８（１〜２）：１３３〜１４５（１９９３年））、タンパク質発現のウェスタンおよび／またはＥＬＩＳＡ分析、ＰＵＦＡ生成物の表現型分析またはＧＣ分析によって達成されてもよい。
好ましい真核生物の宿主生物
天然ペルオキシソーム生合成因子タンパク質の中断およびＰＵＦＡ生合成経路をコードする遺伝子を含んでなる形質転換体宿主生物を生じるために、多様な真核生物がここで宿主として適し、形質転換された真核生物の宿主生物は、天然ペルオキシソーム生合成因子タンパク質が中断されていない真核生物と比較して、総脂肪酸の％として、総脂質画分中および油画分中に組み込まれたＰＵＦＡ量の増大を有する。様々な哺乳類系、植物細胞、真菌、藻類、卵菌綱、酵母、ストラメノパイル（Ｓｔｒａｍｅｎｏｐｉｌｅｓ）および／またはユーグレナ属が、有用な宿主かもしれない。油性生物が好ましいが、非油性生物もまたここで有用性を有し、それらの天然ＰＥＸ遺伝子の１つが中断されると、総脂質画分中または油画分中の総脂肪酸の重量％に対する少なくとも１つの多価不飽和脂肪酸の重量％の増大が認められ、ＰＵＦＡの１．３倍の増大がもたらされるかもしれない。さらにＰＵＦＡの％は、非油性生物中の乾燥細胞重量に対して増大してもよい。代案の実施態様では、例えばサッカロミセス・セレヴィシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）などの酵母などの非油性生物を遺伝子改変して、油性にすることができる。
油性生物は天然に油を合成および蓄積でき、総含油量は典型的に細胞乾燥重量の約２５％以上を構成する。様々な藻類、コケ、真菌、酵母、ストラメノパイル（Ｓｔｒａｍｅｎｏｐｉｌｅｓ）および植物が、自然に油性として分類される。
好ましい油性微生物としては、ω−３／ω−６ＰＵＦＡを天然に産生する、藻類、ストラメノパイル（Ｓｔｒａｍｅｎｏｐｉｌｅｓ）、および真菌生物が挙げられる。例えばキクロテラ（Ｃｙｃｌｏｔｅｌｌａ）種、ニッチア（Ｎｉｔｚｓｃｈｉａ）種、クサレカビ（Ｐｙｔｈｉｕｍ）、スラウストキトリウム（Ｔｈｒａｕｓｔｏｃｈｙｔｒｉｕｍ）種、シゾキトリウム（Ｓｃｈｉｚｏｃｈｙｔｒｉｕｍ）種、およびモルティエラ（Ｍｏｒｔｉｅｒｅｌｌａ）によってＡＲＡ、ＥＰＡおよび／またはＤＨＡが生じる。Ｍ．アルピナ（Ｍ．ａｌｐｉｎａ）の形質転換法については、Ｍａｃｋｅｎｚｉｅら（Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，６６：４６５５（２０００年））に記載されている。同様に、ヤブレツボカビ目（Ｔｈｒａｕｓｔｏｃｈｙｔｒｉａｌｅｓ）微生物（例えばスラウストキトリウム（Ｔｈｒａｕｓｔｏｃｈｙｔｒｉｕｍ）、シゾキトリウム（Ｓｃｈｉｚｏｃｈｙｔｒｉｕｍ））の形質転換法は、米国特許第７，００１，７７２号明細書で開示されている。
より好ましいのは、ω−３／ω−６ＰＵＦＡを天然に産生するもの、およびそれらを産生するように遺伝子改変されたものをはじめとする油性酵母である。油性酵母菌として典型的に同定されている属としては、ヤロウィア（Ｙａｒｒｏｗｉａ）、カンジダ（Ｃａｎｄｉｄａ）、ロドトルラ（Ｒｈｏｄｏｔｏｒｕｌａ）、ロドスポリジウム（Ｒｈｏｄｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ）、クリプトコッカス（Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）、トリコスポロン（Ｔｒｉｃｈｏｓｐｏｒｏｎ）、およびリポマイセス（Ｌｉｐｏｍｙｃｅｓ）が挙げられるが、これに限定されるものではない。より具体的には、例示的な油合成酵母菌としては、ロドスポリジウム・トルイデス（Ｒｈｏｄｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ ｔｏｒｕｌｏｉｄｅｓ）、リポマイセス・スターケイ（Ｌｉｐｏｍｙｃｅｓ ｓｔａｒｋｅｙｉｉ）、Ｌ．リポフェラス（Ｌ．ｌｉｐｏｆｅｒｕｓ）、カンジダ・レブカウフィ（Ｃａｎｄｉｄａ ｒｅｖｋａｕｆｉ）、Ｃ．プルケリマ（Ｃ．ｐｕｌｃｈｅｒｒｉｍａ）、Ｃ．トロピカリス（Ｃ．ｔｒｏｐｉｃａｌｉｓ）、Ｃ．ユチリス（Ｃ．ｕｔｉｌｉｓ）、トリコスポロン・プランス（Ｔｒｉｃｈｏｓｐｏｒｏｎ ｐｕｌｌａｎｓ）、Ｔ．クタネウム（Ｔ．ｃｕｔａｎｅｕｍ）、ロドトルラ・グルティナス（Ｒｈｏｄｏｔｏｒｕｌａ ｇｌｕｔｉｎｕｓ）、Ｒ．グラミニス（Ｒ．ｇｒａｍｉｎｉｓ）、およびヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）（以前はカンジダ・リポリティカ（Ｃａｎｄｉｄａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）として分類されていた）が挙げられる。
最も好ましいのは油性酵母菌ヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）であり、さらなる実施態様で最も好ましいのは、ＡＴＣＣ＃７６９８２、ＡＴＣＣ＃２０３６２、ＡＴＣＣ＃８８６２、ＡＴＣＣ＃１８９４４、および／またはＬＧＡＭＳ（７）１と称されるＹ．リポリティカ（Ｙ．ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）株である（Ｐａｐａｎｉｋｏｌａｏｕ Ｓ．、およびＡｇｇｅｌｉｓ Ｇ．、Ｂｉｏｒｅｓｏｕｒ．Ｔｅｃｈｎｏｌ．８２（１）：４３〜９（２００２年））。
ヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）の形質転換に関する特定の教示は米国特許第４，８８０，７４１号明細書および米国特許第５，０７１，７６４号明細書およびＣｈｅｎ，Ｄ．Ｃ．ら（Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，４８（２）：２３２〜２３５（１９９７年））に含まれている一方、適切な選択技術については米国特許第７，２３８，４８２号明細書および国際公開第２００５／００３３１０号パンフレットおよび国際公開第２００６／０５２８７０号パンフレットに記載されている。
ヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）中で遺伝子を発現する好ましい方法は宿主の線状ＤＮＡのゲノムへの組み込みによる。Ｕｒａ３遺伝子座（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＡＪ３０６４２１）、Ｌｅｕ２遺伝子遺伝子座（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＡＦ２６０２３０）、Ｌｙｓ５遺伝子遺伝子座（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号Ｍ３４９２９）、Ａｃｏ２遺伝子遺伝子座（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＡＪ００１３００）、Ｐｏｘ３遺伝子遺伝子座（Ｐｏｘ３：ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＸＰ＃５０３２４４またはＡｃｏ３：ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＡＪ００１３０１）、Δ１２デサチュラーゼ遺伝子遺伝子座（米国特許第７，２１４，４９１号明細書）、Ｌｉｐ１遺伝子遺伝子座（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号Ｚ５００２０）、Ｌｉｐ２遺伝子遺伝子座（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＡＪ０１２６３２）、ＳＣＰ２遺伝子遺伝子座（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＡＪ４３１３６２）、Ｐｅｘ３遺伝子遺伝子座（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＣＡＧ７８５６５）、Ｐｅｘ１６遺伝子遺伝子座（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＣＡＧ７９６２２）および／またはＰｅｘ１０遺伝子遺伝子座（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＣＡＧ８１６０６）中などのゲノム内の複数位置への組み込みは、遺伝子の高レベル発現が所望される場合に特に有用であり得る。
ヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）において使用される好ましい選択方法は、カナマイシン、ハイグロマイシン、およびアミノグリコシドＧ４１８に対する抵抗性、ならびにウラシル、ロイシン、リジン、トリプトファンまたはヒスチジンを欠く培地に生育する能力である。５−フルオロオロト酸［５−フルオロウラシル−６−カルボン酸一水和物または「５−ＦＯＡ」］もまた、酵母Ｕｒａ-突然変異体の選択のために使用され得る。この化合物はオロチジン５’−一リン酸デカルボキシラーゼ［ＯＭＰデカルボキシラーゼ］をコードする機能性ＵＲＡ３遺伝子を有する酵母細胞に対して有毒である。したがってこの毒性に基づいて、５−ＦＯＡはＵｒａ-突然変異酵母株の選択および同定のために特に有用である（Ｂａｒｔｅｌ，Ｐ．Ｌ．およびＦｉｅｌｄｓ，Ｓ．、「Ｙｅａｓｔ ２−Ｈｙｂｒｉｄ Ｓｙｓｔｅｍ」、Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ：Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、第７巻、１０９〜１４７、１９９７年；ヤロウィア（Ｙａｒｒｏｗｉａ）における５−ＦＯＡについての国際公開第２００６／０５２８７０号パンフレットも参照）。
ヤロウィア（Ｙａｒｒｏｗｉａ）で使用される代案の好ましい選択方法は、スルホニル尿素（クロリムロンエチル；Ｅ．Ｉ．ｄｕＰｏｎｔ ｄｅ Ｎｅｍｏｕｒｓ ＆ Ｃｏ．，Ｉｎｃ．（Ｗｉｌｍｉｎｇｔｏｎ，ＤＥ））抵抗性に基づいた、ヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）のための優性非抗生物質マーカーに依存する。より具体的にはマーカー遺伝子は、スルホニル尿素除草剤抵抗性を与える単一アミノ酸変化、すなわちＷ４９７Ｌを有する天然アセトヒドロキシ酸シンターゼ（「ＡＨＡＳ」またはアセト乳酸シンターゼ、Ｅ．Ｃ．４．１．３．１８）である（国際公開第２００６／０５２８７０号パンフレット）。ＡＨＡＳは、分枝鎖アミノ酸、すなわちバリン、ロイシン、イソロイシンの生合成経路中の最初の共通酵素であり、それはスルホニル尿素およびイミダゾリノン除草剤の標的である。
多価不飽和脂肪酸生成のための発酵過程
形質転換された宿主細胞は、ＰＵＦＡ生合成遺伝子の発現を最適化する条件下で生育させて、最大かつ最も経済的な所望のＰＵＦＡ収率を生じさせる。一般に、修正により最適化されてもよい培地条件としては、炭素源のタイプおよび量、窒素源のタイプおよび量、炭素−対−窒素比、異なる無機イオンの量、酸素レベル、生育温度、ｐＨ、バイオマス生成相の長さ、油蓄積相の長さ、および細胞収穫時間および方法が挙げられる。ヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）のような対象の油性酵母は、一般に酵母菌抽出物−ペプトン−デキストロース液体培地（ＹＰＤ）のような複合培地で、または生育に必要な構成要素が欠如して所望の発現カセットの選択を強要する合成最少培地（例えばＤＩＦＣＯ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ（Ｄｅｔｒｏｉｔ，ＭＩ）からの酵母菌窒素ベース）上で生育させる。
本明細書に記載されている方法および宿主細胞のための発酵培地は、米国特許第７，２３８，４８２号明細書で教示されているものなどの適切な炭素源を含有しなくてはならない。適切な炭素源としては多種多様な原料が挙げられ、糖、グリセロールおよび／または脂肪酸が好ましい。最も好ましいのはグルコースおよび／または１０〜２２個の間の炭素を含有する脂肪酸である。
窒素は、無機（例えば（ＮＨ4）2ＳＯ4）または有機（例えば尿素またはグルタミン酸）源から供給されてもよい。適切な炭素および窒素源に加えて、発酵培地はまた、適切なミネラル、塩、補助因子、緩衝液、ビタミン、および油性酵母の生育と、ＰＵＦＡ生成の酵素的経路の促進とに適した、当業者に既知であるその他の構成要素を含有しなくてはならない。脂質およびＰＵＦＡの合成を促進する、Ｆｅ+2、Ｃｕ+2、Ｍｎ+2、Ｃｏ+2、Ｚｎ+2およびＭｇ+2のようないくつかの金属イオンが注目されている（Ｄ．Ｊ．ＫｙｌｅおよびＲ．Ｃｏｌｉｎ編、「Ｉｎｄ．Ａｐｐｌ．Ｓｉｎｇｌｅ Ｃｅｌｌ Ｏｉｌ」より、Ｎａｋａｈａｒａ，Ｔ．ら、６１〜９７（１９９２年）。
本明細書に記載されている方法および宿主細胞のための好ましい増殖培地は、ＤＩＦＣＯ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ（Ｄｅｔｒｏｉｔ，ＭＩ）からの酵母菌窒素ベースなどの一般的な市販の調製培地である。その他の合成または人工増殖培地もまた使用されてもよく、形質転換宿主細胞の生育に適する培地は、微生物学または発酵科学の当業者に知られている。発酵に適したｐＨ範囲は、典型的に約ｐＨ４．０〜ｐＨ８．０の間であり、ｐＨ５．５〜ｐＨ７．５が初期生育条件の範囲として好ましい。発酵は好気性または好気性条件下で実施されてもよく、微好気条件が好ましい。
典型的に油性酵母菌細胞中のＰＵＦＡおよびＴＡＧの高レベルの蓄積は、代謝状態が生育と脂肪合成／貯蔵との間で「平衡状態」でなくてはならないので、二段階過程を必要とする。したがって最も好ましくは、油性酵母中の油の生成には、二段階発酵過程が必要である。このアプローチについては米国特許第７，２３８，４８２号明細書に記載され、様々な適切な発酵過程デザイン（すなわちバッチ、供給バッチ、および連続）および成育中の考察事項についても同様に述べられる。
ＰＵＦＡ油の精製および加工
ＰＵＦＡをはじめとする脂肪酸は、遊離脂肪酸として、またはアシルグリセロール、リン脂質、スルホ脂質または糖脂質などのエステル化形態体で、宿主生物中にあってもよい。これらの脂肪酸は、当該技術分野で良く知られている多様な手段を通じて、宿主細胞から抽出されてもよい。酵母脂質の抽出技術、品質分析、および許容基準の１つのレビューは、Ｚ．Ｊａｃｏｂｓ（Ｃｒｉｔｉｃａｌ Ｒｅｖｉｅｗｓ ｉｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，１２（５／６）：４６３〜４９１（１９９２年））である。Ａ．ＳｉｎｇｈおよびＯ．Ｗａｒｄ（Ａｄｖ．Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，４５：２７１〜３１２（１９９７年））による後処理プロセスの簡潔なレビューもまた入手できる。
一般に（ＰＵＦＡをはじめとする）脂肪酸を精製する手段としては、有機溶剤を用いた抽出（例えば米国特許第６．７９７，３０３号明細書および米国特許第５，６４８，５６４号明細書）、超音波処理、（例えば二酸化炭素を使用した）超臨界流体抽出、鹸化、および加圧などの物理的手段、またはそれらの組み合わせが挙げられる。米国特許第７，２３８，４８２号明細書を参照されたい。
食材、健康食品、医薬品、および動物飼料で使用される油
市場は、ω−３および／またはω−６脂肪酸、特にＡＬＡ、ＧＬＡ、ＡＲＡ、ＥＰＡ、ＤＰＡ、およびＤＨＡを組み込んだ多数の食品および飼料製品を包含する。長鎖ＰＵＦＡ、ＰＵＦＡを含んでなる部分的に精製された微生物由来資源、ＰＵＦＡを含んでなる精製微生物油、および／または本明細書に記載されている方法および宿主細胞によって作成された精製ＰＵＦＡを含んでなる生物由来資源は、それらの添加によって改善された食品または飼料の摂取に際し、健康上の利点を与えることが考察される。これらの油は２、３例を挙げると類似食品、飲料、肉製品、穀物製品、ベークド食品、スナック食品。および酪農製品に添加できる。米国特許出願公開第２００６／００９４０９２号明細書を参照されたい。
これらの組成物は、医療栄養物、栄養補助食品、乳児用調製粉乳、および医薬品をはじめとするメディカルフードに添加されることで、健康上の利点を与えてもよい。当業者は、健康上の利点を与えるために、食品、飼料、栄養補助食品、栄養補給食品、医薬品、およびその他の摂取可能な製品に添加されるべき油の量を認識するであろう。これらの油を摂取することの健康上の利点は、当該技術分野において記載されており、継続的に研究されている。このような量は本明細書では「効果的」量と称され、とりわけこれらの油を含有する摂取される製品の性質、およびそれらが対処することが意図される健康状態に左右される。
好ましい実施態様の説明
実施例で実証され下の表５で要約されるように、ＹｌＰｅｘ１０ｐのＣ3ＨＣ4亜鉛リングフィンガーモチーフのＣ末端部分中の中断、染色体ＹｌＰｅｘ１０遺伝子全体または染色体ＹｌＰｅｘ１６遺伝子全体の欠失、染色体ＹｌＰｅｘ１０遺伝子全体および染色体ＹｌＰｅｘ１６遺伝子全体の双方の欠失、および染色体ＹｌＰｅｘ３遺伝子全体の欠失は全て、天然Ｐｅｘタンパク質が中断されていない親株と比較して、総脂肪酸の％としてＰＵＦＡの重量％が増大している改変されたヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）ＰＵＦＡ産生株をもたらす。ゲノムＰｅｘ１０ｐに中断を有し、総脂質画分中および油画分中のＰＵＦＡ量が増大している改変されたＥＰＡ産生ヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）株中における染色体外ＹｌＰｅｘ１０ｐの発現は、影響を逆転した。
表５は、実施例３、４、５、７、９、１１、および１２からのデータを集計し、総脂質含量［「ＴＦＡ％ＤＣＷ」］に関する傾向、総脂肪酸の重量％［「％ＴＦＡ」］として発現される特定の脂肪酸濃度、および乾燥細胞重量％［「％ＤＣＷ」］としての特定の脂肪酸含量は、Ｐｅｘ中断またはノックアウトの存在／不在に基づいて推定できる。「所望のＰＵＦＡ％ＴＦＡ」および「所望のＰＵＦＡ％ＤＣＷ」は、それぞれ、改変されたＰＵＦＡ生合成経路が生成するようにデザインされた、所望のＰＵＦＡ生成物（すなわちＤＧＬＡまたはＥＰＡ）の特定の濃度または含量を定量化する。「全てのＰＵＦＡ」がＬＡ、ＡＬＡ、ＥＤＡ、ＤＧＬＡ、ＥＴｒＡ、ＥＴＡ、およびＥＰＡ含むのに対し、「Ｃ２０ ＰＵＦＡ」はＥＤＡ、ＤＧＬＡ、ＥＴｒＡ、ＥＴＡ、およびＥＰＡに限定される。
Figure 0005658034
Figure 0005658034
データは実施例間で直接比較できないが、異なるヤロウィア（Ｙａｒｒｏｗｉａ）株および生育条件の結果として、（天然Ｐｅｘタンパク質が中断されていない親株、または中断された天然Ｐｅｘタンパク質の「置換」コピーを発現する親株と比較して）次の結論を導くことができる。
１）ＰＵＦＡ産生ヤロウィア（Ｙａｒｒｏｗｉａ）中のＰｅｘ中断は、総脂質画分中および油画分中の総脂肪酸の重量％（％ＴＦＡ）に対する例えばＥＰＡまたはＤＬＧＡなどの単一ＰＵＦＡの重量％の増大をもたらす。
２）ＰＵＦＡ産生ヤロウィア（Ｙａｒｒｏｗｉａ）中のＰｅｘ中断は、総脂質画分中および油画分中の総脂肪酸の重量％に対するＣ20 ＰＵＦＡの重量％増大をもたらす。
３）１）の延長線上で考えると、ＰＵＦＡ産生ヤロウィア（Ｙａｒｒｏｗｉａ）中のＰｅｘ中断は、総脂質画分中および油画分中の総脂肪酸の重量％に対するあらゆるそして全てのＰＵＦＡ組み合わせの量の増大をもたらす。
４）ＰＵＦＡ産生ヤロウィア（Ｙａｒｒｏｗｉａ）中のＰｅｘ中断は、乾燥細胞重量に対する例えばＥＰＡまたはＤＬＧＡなどの単一ＰＵＦＡの％増大をもたらす。
「全ＰＵＦＡ％ＤＣＷ」、「Ｃ２０ ＰＵＦＡ％ＤＣＷ」、およびＴＦＡ％ＤＣＷ中におけるＰｅｘ中断の影響を比較すると、変動する結果が観察される。具体的にはＰＵＦＡ産生ヤロウィア（Ｙａｒｒｏｗｉａ）中のＰｅｘ中断は、総脂質画分中および油画分中の乾燥細胞重量％としてのＣ20 ＰＵＦＡまたは全ＰＵＦＡ量の増大をもたらす（天然Ｐｅｘタンパク質が中断されていない親株と比較して）場合もある。他の事例では、総脂質画分中および油画分中の乾燥細胞重量％としてのＣ20 ＰＵＦＡまたは全ＰＵＦＡ量が減少する（天然Ｐｅｘタンパク質が中断されていない親株と比較して）。総脂質含量（ＴＦＡ％ＤＣＷ）に関しても同様の結果が観察され、そこではＰｅｘ中断の影響は、総脂質含量の増大または減少のどちらかをもたらすことができる。
上の一般化はそれぞれ興味深いが、生物がそれを生成するように改変された所望のＰＵＦＡの総ＰＵＦＡ量に対する比率に対する、Ｐｅｘ中断の影響を調べることが特に有用である。
例えばＣ末端の最後の３２個のアミノ酸のトランケーションをもたらすＰｅｘ１０中断を含有するＹ４１２８株中では、ＰＵＦＡの５４％（％ＴＦＡとして）がＥＰＡであったのに対し、親株Ｙ４０８６中ではＰＵＦＡの１６．３％（％ＴＦＡとして）のみがＥＰＡであった。したがって中断は、所望のＰＵＦＡ量の３．３倍（％ＴＦＡとして）の増大の原因であった（実施例３、４）。同様にＹ４０３６（ΔＰｅｘ１６）株中ではＰＵＦＡの６２．８％（％ＴＦＡとして）がＤＧＬＡであったのに対し、Ｙ４０３６中ではＰＵＦＡの３８．１％（％ＴＦＡとして）のみがＤＧＬＡであり、１．６５倍の増大であった（実施例９）。そしてＹ４０３６（ΔＰｅｘ３）株中ではＰＵＦＡの６７．７％（％ＴＦＡとして）がＤＧＬＡであったのに対し、Ｙ４０３６中ではＰＵＦＡの３３．３％（％ＴＦＡとして）のみがＤＧＬＡであり、２．０倍の増大であった（実施例１２）。これらの結果は、Ｐｅｘ中断が、総脂質および油画分中において、生物が産生するように改変された所望のＰＵＦＡ量の％ＴＦＡとしての選択的増大をもたらすという仮説を支持する。
総ＰＵＦＡ量に対するＣ２０ ＰＵＦＡの比率に対するＰｅｘ中断の影響を調べると、著しさにより劣る選択性が観察される。例えばＰｅｘ１０中断を含有するＹ４１２８株中ではＰＵＦＡの７３％（％ＴＦＡとして）がＣ２０ ＰＵＦＡであったのに対し、Ｙ４０８６株中ではＰＵＦＡの４２％（％ＴＦＡとして）のみがＣ２０ ＰＵＦＡであった。したがって中断は、総ＰＵＦＡに対する総脂質および油画分中に蓄積するＣ２０ ＰＵＦＡ量の１．７倍の増大の原因であった（実施例３、４）。同様にＹ４０３６（ΔＰｅｘ１６）株中では、ＰＵＦＡの７１％（％ＴＦＡとして）がＣ２０ ＰＵＦＡであったのに対し、Ｙ４０３６中ではＰＵＦＡの５４．８％（％ＴＦＡとして）のみがＣ２０ ＰＵＦＡであり、１．３倍の増大であった（実施例９）。そしてＹ４０３６（ΔＰｅｘ３）株中ではＰＵＦＡの８２．４％（％ＴＦＡとして）がＣ２０ ＰＵＦＡであったのに対し、Ｙ４０３６中ではＰＵＦＡの４７．４％（％ＴＦＡとして）のみがＣ２０ ＰＵＦＡであり、１．７倍の増大であった（実施例１２）。
本明細書に記載されている教示および結果に基づいて、ＰＵＦＡ産生真核生物中で生成するＰＵＦＡ量を増大させる手段として、ペルオキシソーム生合成因子タンパク質をコードする天然遺伝子中の様々な中断を用いることの実現可能性および商業的可用性が評価されることが予期される。ＰＵＦＡ産生真核生物は、Δ９エロンガーゼ／Δ８デサチュラーゼ経路またはΔ６デサチュラーゼ／Δ６エロンガーゼ経路のどちらかを使用して、多様なω−３および／またはω−６ＰＵＦＡを合成できる。
本発明の具体化を例示するが、その可能なバリエーション全てを完全に定義するものではない以下の実施例において、本発明をさらに説明する。
一般方法
実施例で使用する標準組み換えＤＮＡおよび分子クローニング技術は、当該技術分野でよく知られており、１．）Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ．、Ｆｒｉｔｓｃｈ，Ｅ．Ｆ．およびＭａｎｉａｔｉｓ，Ｔ．、「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ」、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ：Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ（１９８９年）（Ｍａｎｉａｔｉｓ）；２．）Ｔ．Ｊ．Ｓｉｌｈａｖｙ、Ｍ．Ｌ．Ｂｅｎｎａｎ、およびＬ．Ｗ．Ｅｎｑｕｉｓｔ、「Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔｓ ｗｉｔｈ Ｇｅｎｅ Ｆｕｓｉｏｎｓ」、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ：Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ（１９８４年）；および３．）Ａｕｓｕｂｅｌ，Ｆ．Ｍ．ら、「Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ」、Ｇｒｅｅｎｅ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ａｓｓｏｃ．ａｎｄ Ｗｉｌｅｙ−Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅによる出版、Ｈｏｂｏｋｅｎ，ＮＪ（１９８７年）に記載されている。
微生物培養の維持および生育に適した材料および方法は、技術分野でよく知られている。以下の実施例で使用するのに適した技術については、以下に記載されている。Ｐｈｉｌｌｉｐｐ Ｇｅｒｈａｒｄｔ、Ｒ．Ｇ．Ｅ．Ｍｕｒｒａｙ、Ｒａｌｐｈ Ｎ．Ｃｏｓｔｉｌｏｗ、Ｅｕｇｅｎｅ Ｗ．Ｎｅｓｔｅｒ、Ｗｉｌｌｉｓ Ａ．Ｗｏｏｄ、Ｎｏｅｌ Ｒ．Ｋｒｉｅｇ、およびＧ．Ｂｒｉｇｇｓ Ｐｈｉｌｌｉｐｓ編、「Ｍａｎｕａｌ ｏｆ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｆｏｒ Ｇｅｎｅｒａｌ Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ」、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｓｏｃｉｅｔｙ ｆｏｒ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ、Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ，Ｄ．Ｃ．（１９９４年）、またはＴｈｏｍａｓ，Ｄ．Ｂｒｏｃｋ、「Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ：Ａ Ｔｅｘｔｂｏｏｋ ｏｆ Ｉｎｄｕｓｔｒｉａｌ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ」、第２版、Ｓｉｎａｕｅｒ Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ：Ｓｕｎｄｅｒｌａｎｄ，ＭＡ（１９８９年）。微生物細胞の生育および維持のために使用される全ての試薬制限酵素および材料は、特に断りのない限り、Ａｌｄｒｉｃｈ Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ（Ｍｉｌｗａｕｋｅｅ，ＷＩ）、ＤＩＦＣＯ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ（Ｄｅｔｒｏｉｔ，ＭＩ）、Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ，Ｉｎｃ．（Ｂｅｖｅｒｌｙ，ＭＡ）、ＧＩＢＣＯ／ＢＲＬ（Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ，ＭＤ）、またはＳｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏｍｐａｎｙ（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）から得た。大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）（ＸＬ１−Ｂｌｕｅ）コンピテント細胞は、Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ Ｃｏｍｐａｎｙ（Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）から購入した。大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）株は、典型的にルリア・ベルターニ（Ｌｕｒｉａ Ｂｅｒｔａｎｉ）（ＬＢ）プレート上で３７℃で生育させた。
一般分子クローニングは、標準法に従って実施された（Ｓａｍｂｒｏｏｋら、前出）。ＤＮＡ配列は、染料ターミネーター技術（米国特許第５，３６６，８６０号明細書、欧州特許第２７２，００７号明細書）を使用し、ベクターおよび挿入断片特異的プライマーの組み合わせを使用して、ＡＢＩ Ａｕｔｏｍａｔｉｃ配列決定装置上で作成した。配列編集はＳｅｑｕｅｎｃｈｅｒ（Ｇｅｎｅ Ｃｏｄｅｓ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ（Ａｎｎ Ａｒｂｏｒ，ＭＩ））内で実施した。全ての配列は、両方向に少なくとも２回のカバレッジに相当する。本明細書で特に断りのない限り、遺伝子配列の比較はＤＮＡＳＴＡＲソフトウェア（ＤＮＡＳＴＡＲ Ｉｎｃ．（Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ））を使用して達成した。
略語の意味は以下の通り。「ｓｅｃ」は秒を意味し、「ｍｉｎ」は分を意味し、「ｈ」は時間を意味し、「ｄ」は日を意味し、「μＬ」はマイクロリットルを意味し、「ｍＬ」はミリリットルを意味し、「Ｌ」はリットルを意味し、「μＭ」はマイクロモル濃度を意味し、「ｍＭ」はミリモル濃度を意味し、「Ｍ」はモル濃度を意味し、「ｍｍｏｌ」はミリモルを意味し、「μｍｏｌｅ」はマイクロモルを意味し、「ｇ」はグラムを意味し、「μｇ」はマイクログラムを意味し、「ｎｇ」はナノグラムを意味し、「Ｕ」は単位を意味し、「ｂｐ」は塩基対を意味し、「ｋＢ」はキロベースを意味する。
発現カセットの命名法：
発現カセットの構造は単純な表記体系「Ｘ：：Ｙ：：Ｚ」によって表され、Ｘはプロモータ断片を記述し、Ｙは遺伝子断片を記述し、Ｚはターミネーター断片を記述し、それらは全て互いに作動的に連結する。
ヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）の形質転換および培養
ヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）ＡＴＣＣ＃２０３６２株はＡｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，ＭＤ）から購入した。ヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）株は、下に示す処方に従った数種の培地中で、慣例的に２８〜３０℃で生育させた。寒天プレートは、標準法に従って各液体培地に２０ｇ／Ｌ寒天を添加することによって、必要に応じて調製した。
ＹＰＤ寒天培地（１Ｌあたり）：１０ｇ酵母抽出物［Ｄｉｆｃｏ］、２０ｇのＢａｃｔｏペプトン［Ｄｉｆｃｏ］、および２０ｇグルコース。
基礎最少培地（ＭＭ）（１Ｌあたり）：２０ｇグルコース、１．７ｇアミノ酸非含有酵母窒素ベース、１．０ｇプロリン、およびｐＨ６．１（未調節）。
最少培地＋ウラシル（ＭＭ＋ウラシルまたはＭＭＵ）（１Ｌあたり）：ＭＭ培地を上のように調製して、０．１ｇウラシルおよび０．１ｇウリジンを添加する。
最少培地＋ウラシル＋スルホニル尿素（ＭＭＵ＋ＳＵ）（１Ｌあたり）：ＭＭＵ培地を上のように調製して、２８０ｍｇスルホニル尿素を添加する。
最少培地＋ロイシン＋リジン（ＭＭＬｅｕＬｙｓ）（１Ｌあたり）：ＭＭ培地を上のように調製して、０．１ｇロイシンおよび０．１ｇリジンを添加する。
最少培地＋５−フルオロオロト酸（ＭＭ＋５−ＦＯＡ）（１Ｌあたり）：２０ｇグルコース、６．７ｇ酵母窒素ベース、７５ｍｇウラシル、７５ｍｇウリジン、および１００ｍｇ／Ｌ〜１０００ｍｇ／Ｌの一連の濃度に対するＦＯＡ活性試験に基づく適量のＦＯＡ（Ｚｙｍｏ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｃｏｒｐ．（Ｏｒａｎｇｅ，ＣＡ））（供給元から受け取った各バッチ内で変動があるため）。
高グルコース培地（ＨＧＭ）（１Ｌあたり）：８０グルコース、２．５８ｇのＫＨ2ＰＯ4および５．３６ｇのＫ2ＨＰＯ4、ｐＨ７．５（調節の必要なし）。
酵母抽出物を含まない発酵培地（ＹＥ非含有ＦＭ）（１Ｌあたり）：６．７０ｇ酵母窒素ベース、６．００ｇのＫＨ2ＰＯ4、２．００ｇのＫ2ＨＰＯ4、１．５０ｇのＭｇＳＯ4・
７Ｈ2Ｏおよび２０ｇグルコース。
発酵培地（ＦＭ）（１Ｌあたり）：上のようにＹＥ非含有ＦＭ培地を調製して、５．００ｇ酵母抽出物（ＢＢＬ）を添加する。
合成デキストロース培地（ＳＤ）（１Ｌあたり）：硫酸アンモニウムを添加したアミノ酸非含有６．７ｇ酵母窒素ベース、および２０ｇグルコース。
ウラシル非含有完全最小グルコースブロス（ＣＳＭ−Ｕｒａ）：カタログ番号Ｃ８１４０（Ｔｅｋｎｏｖａ（Ｈｏｌｌｉｓｔｅｒ，ＣＡ））（０．１３％ウラシル非含有アミノ酸ドロップアウト粉末。０．１７％酵母窒素ベース、０．５％（ＮＨ4）2ＳＯ4、２．０％グルコース）。
Ｙ．リポリティカ（Ｙ．ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）の形質転換は、特に断りのない限りＣｈｅｎ，Ｄ．Ｃ．ら、Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．４８（２）：２３２〜２３５（１９９７年）の方法に従って実施した。簡単に述べると、ヤロウィア（Ｙａｒｒｏｗｉａ）をＹＰＤプレート上に画線培養し、３０℃でおよそ１８時間生育させた。いくつかの大型白金耳を満たす細胞をプレートからこすり取り、平均分子量３３５０の２．２５ｍＬの５０％ＰＥＧ、ｐＨ６．０の０．１２５ｍＬの２Ｍ酢酸Ｌｉ、および０．１２５ｍＬの２Ｍ ＤＴＴを含有する１ｍＬの形質転換緩衝液に再懸濁した。次に約５００ｎｇの直線化プラスミドＤＮＡを１００μＬの再懸濁細胞内でインキュベートし、１５分間隔でボルテックス混合しながら３９℃に１時間保った。細胞を選択培地プレートに蒔いて、３０℃に２〜３日間保った。
ヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）の脂肪酸分析
脂肪酸分析のために、Ｂｌｉｇｈ，Ｅ．Ｇ．およびＤｙｅｒ，Ｗ．Ｊ．、Ｃａｎ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．３７：９１１〜９１７（１９５９年）に記載されているように、細胞を遠心分離して収集し、脂質を抽出した。ナトリウムメトキシドでの脂質抽出物のエステル交換反応によって、脂肪酸メチルエステル［「ＦＡＭＥ」］を調製し（Ｒｏｕｇｈａｎ，Ｇ．およびＮｉｓｈｉｄａ，Ｉ．、Ａｒｃｈ Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ．２７６（１）：３８〜４６（１９９０年））、引き続きＨｅｗｌｅｔｔ−Ｐａｃｋａｒｄからの３０ｍ×０．２５ｍｍ（内径）ＨＰ−ＩＮＮＯＷＡＸカラムを装着したＨｅｗｌｅｔｔ−Ｐａｃｋａｒｄ ６８９０ ＧＣで分析した。オーブン温度は３．５℃／分で、１７０℃（２５分間保持）から１８５℃であった。
直接塩基エステル交換のために、ヤロウィア（Ｙａｒｒｏｗｉａ）培養物（３ｍＬ）を収集し、蒸留水で１回洗浄し、スピードバック（Ｓｐｅｅｄ−Ｖａｃ）内で真空下において５〜１０分乾燥させた。ナトリウムメトキシド（１００μＬの１％）をサンプルに添加して、次にサンプルをボルテックスし２０分間振盪した。３滴の１Ｍ ＮａＣｌおよび４００μＬのヘキサンを添加した後、サンプルをボルテックスして遠心分離した。上層を除去して上述のようにＧＣで分析した。
実施例１
Δ９エロンガーゼ／Δ８デサチュラーゼ経路を通じて総脂質の約１４％のＥＰＡを生成するためのヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）Ｙ４０８６株の作成
本例は、Δ９エロンガーゼ／Δ８デサチュラーゼ経路（図３Ａ）を通じて、総脂質に対して約１４％のＥＰＡを産生できるヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）ＡＴＣＣ＃２０３６２に由来するＹ４０８６株の構築について述べる。
Ｙ４０８６株の開発は、Ｙ２２２４株（野生型ヤロウィア（Ｙａｒｒｏｗｉａ）ＡＴＣＣ＃２０３６２株のＵｒａ３遺伝子の自律突然変異からのＦＯＡ抵抗性変異体）、Ｙ４００１株（Ｌｅｕ−表現型で１７％のＥＤＡを産生する）、Ｙ４００１Ｕ株（Ｌｅｕ−およびＵｒａ−表現型）、Ｙ４０３６株（Ｌｅｕ−表現型で１８％のＤＧＬＡを産生する）、Ｙ４０３６Ｕ株（Ｌｅｕ−およびＵｒａ−表現型）、およびＹ４０７０株（Ｕｒａ−表現型で１２％のＡＲＡを産生する）の構築を必要とした。Ｙ２２２４、Ｙ４００１、Ｙ４００１Ｕ、Ｙ４０３６、Ｙ４０３６Ｕ、およびＹ４０７０株の構築に関するさらなる詳細については、国際公開第２００８／０７３３６７号パンフレットの実施例７に記載されている。
野生型ヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）ＡＴＣＣ＃２０３６２に対してＹ４０７０株の最終遺伝子型は、Ｕｒａ３−、ｕｎｋｎｏｗｎ １−、ｕｎｋｎｏｗｎ ３−、Ｌｅｕ＋、Ｌｙｓ＋、ＧＰＤ：：ＦｍＤ１２：：Ｐｅｘ２０、ＹＡＴ１：：ＦｍＤ１２：：ＯＣＴ、ＹＡＴ１：：ＭＥ３Ｓ：：Ｐｅｘ１６、ＧＰＡＴ：：ＥｇＤ９ｅ：：Ｌｉｐ２、ＥＸＰ１：：ＥｇＤ９ｅＳ：：Ｌｉｐ１、ＦＢＡＩＮｍ：：ＥｇＤ９ｅＳ：：Ｌｉｐ２、ＦＢＡＩＮｍ：：ＥｇＤ８Ｍ：：Ｐｅｘ２０、ＥＸＰ１：：ＥｇＤ８Ｍ：：Ｐｅｘ１６、ＦＢＡＩＮ：：ＥｇＤ５：：Ａｃｏ、ＥＸＰ１：：ＥｇＤ５Ｓ：：Ｐｅｘ２０、ＹＡＴ１：：ＲＤ５Ｓ：：ＯＣＴ（ＦｍＤ１２はフザリウム・モニリフォルメ（Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｍｏｎｉｌｉｆｏｒｍｅ）Δ１２デサチュラーゼ遺伝子［国際公開第２００５／０４７４８５号パンフレット］であり、ＭＥ３Ｓはモルティエラ・アルピナ（Ｍｏｒｔｉｅｒｅｌｌａ ａｌｐｉｎａ）に由来するコドン最適化Ｃ16/18エロンガーゼ遺伝子［国際公開第２００７／０４６８１７号パンフレット］であり、ＥｇＤ９ｅはミドリムシ（Ｅｕｇｌｅｎａ ｇｒａｃｉｌｉｓ）Δ９エロンガーゼ遺伝子［国際公開第２００７／０６１７４２号パンフレット］であり、ＥｇＤ９ｅＳはミドリムシ（Ｅｕｇｌｅｎａ ｇｒａｃｉｌｉｓ）に由来するコドン最適化Δ９エロンガーゼ遺伝子［国際公開第２００７／０６１７４２号パンフレット］であり、ＥｇＤ８Ｍはミドリムシ（Ｅｕｇｌｅｎａ ｇｒａｃｉｌｉｓ）［米国特許第７，２５６，０３３号明細書］に由来する合成変異Δ８デサチュラーゼ［国際公開第２００８／０７３２７１号パンフレット］であり、ＥｇＤ５はミドリムシ（Ｅｕｇｌｅｎａ ｇｒａｃｉｌｉｓ）Δ５デサチュラーゼ［米国特許出願公開第２００７−０２９２９２４−Ａ１号明細書］であり、ＥｇＤ５Ｓはミドリムシ（Ｅｕｇｌｅｎａ ｇｒａｃｉｌｉｓ）に由来するコドン最適化Δ５デサチュラーゼ遺伝子［米国特許出願公開第２００７−０２９２９２４号明細書］であり、ＲＤ５Ｓはペリディニウム（Ｐｅｒｉｄｉｎｉｕｍ）種ＣＣＭＰ６２６に由来するコドン最適化Δ５デサチュラーゼ［米国特許出願公開第２００７−０２７１６３２号明細書］である）であった。
総脂質の約１４％のＥＰＡを生成するためのＹ４０８６株の作成
国際公開第２００８／０７３３６号パンフレットの表１９に記載されているコンストラクトｐＺＰ３−Ｐａ７７７Ｕ（図３Ｂ、配列番号２８）を作成し、３つのΔ１７デサチュラーゼ遺伝子をＹ４０７０株のＰｏｘ３遺伝子座（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＡＪ００１３０１）に組み込み、それによってＥＰＡ産生を可能にした。Δ１７デサチュラーゼ遺伝子は、ピシウム・アファニデルマタム（Ｐｙｔｈｉｕｍ ａｐｈａｎｉｄｅｒｍａｔｕｍ）Δ１７デサチュラーゼであるＰａＤ１７（国際公開第２００８／０５４５６５号パンフレット）、およびピシウム・アファニデルマタム（Ｐｙｔｈｉｕｍ ａｐｈａｎｉｄｅｒｍａｔｕｍ）に由来するコドン最適化Δ１７デサチュラーゼであるＰａＤ１７Ｓであった（国際公開第２００８／０５４５６５号パンフレット）。
ｐＺＰ３−Ｐａ７７７ＵプラスミドをＡｓｃＩ／ＳｐｈＩで消化し、次に一般方法に従ってＹ４０７０株の形質転換のために使用した。形質転換体細胞をＭＭプレート上に播種して、２〜３日間３０℃に保った。単一コロニーをＭＭプレート上に再度画線塗抹し、次に３０℃の液体ＭＭＬｅｕＬｙｓ中に接種して、２５０ｒｐｍ／分で２日間振盪した。細胞を遠心分離によって収集し、脂質を抽出してエステル交換によってＦＡＭＥを調製し、引き続いてＨｅｗｌｅｔｔ−Ｐａｃｋａｒｄ ６８９０ ＧＣで分析した。
ＧＣ分析からは、ｐＺＰ３−Ｐａ７７７Ｕの３つのキメラ遺伝子を含有する形質転換体中にＥＰＡの存在が示されたが、Ｙ４０７０親株では示されなかった。選択された９６株の大部分は、総脂質の１０〜１３％のＥＰＡを産生した。総脂質の約１４．２％および１３．８％のＥＰＡを産生した２株（すなわち＃５８および＃７９）があった。これらの２つの株をそれぞれＹ４０８５およびＹ４０８６と称する。
野生型ヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）ＡＴＣＣ＃２０３６２に対してＹ４０８６株の最終遺伝子型は、Ｕｒａ３＋、Ｌｅｕ＋、Ｌｙｓ＋、ｕｎｋｎｏｗｎ １−、ｕｎｋｎｏｗｎ ２−、ＹＡＬＩ０Ｆ２４１６７ｇ−、ＧＰＤ：：ＦｍＤ１２：：Ｐｅｘ２０、ＹＡＴ１：：ＦｍＤ１２：：ＯＣＴ、ＹＡＴ１：：ＭＥ３Ｓ：：Ｐｅｘ１６、ＧＰＡＴ：：ＥｇＤ９ｅ：：Ｌｉｐ２、ＥＸＰ１：：ＥｇＤ９ｅＳ：：Ｌｉｐ１、ＦＢＡＩＮｍ：：ＥｇＤ９ｅＳ：：Ｌｉｐ２、ＦＢＡＩＮｍ：：ＥｇＤ８Ｍ：：Ｐｅｘ２０、ＥＸＰ１：：ＥｇＤ８Ｍ：：Ｐｅｘ１６、ＦＢＡＩＮ：：ＥｇＤ５：：Ａｃｏ、ＥＸＰ１：：ＥｇＤ５Ｓ：：Ｐｅｘ２０、ＹＡＴ１：：ＲＤ５Ｓ：：ＯＣＴ、ＹＡＴ１：：ＰａＤ１７Ｓ：：Ｌｉｐ１、ＥＸＰ１：：ＰａＤ１７：：Ｐｅｘ１６、ＦＢＡＩＮｍ：：ＰａＤ１７：：Ａｃｏであった。
実施例２
Δ９エロンガーゼ／Δ８デサチュラーゼ経路を通じて総脂質の約３７％のＥＰＡを生成するためのヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）Ｙ４１２８株の作成
本実施例は、ヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）ＡＴＣＣ＃２０３６２に由来し、総脂質に対して約３７．６％のＥＰＡを産生できるＹ４１２８株の構築について述べる（すなわちＹ４０８６と比較して総脂肪酸の％として２倍を超えるＥＰＡ濃度の増大、図３Ａ）。
Ｙ４１２８株の開発は、Ｙ２２２４、Ｙ４００１、Ｙ４００１Ｕ、Ｙ４０３６、Ｙ４０３６Ｕ、Ｙ４０７０、およびＹ４０８６株の構築（実施例１に記載されている）、ならびにＹ４０８６Ｕ１株（Ｕｒａ−）の構築を必要とした。
Ｙ４０８６Ｕ１株（Ｕｒａ−）の作成
Ｙ４０８６株中において、コンストラクトｐＹ１１７中のＣｒｅリコンビナーゼ酵素の一時的な発現によってＵｒａ−表現型を作り出し、Ｙ４０８６Ｕ１株を創出した（図４Ａ、配列番号２９、国際公開第２００８／０７３３６７号パンフレットの表２０に記載されている）。これによってゲノムから、ＬｏｘＰで挟まれたＵｒａ３遺伝子が放出された。プラスミドｐＹ１１７中の変異ヤロウィア（Ｙａｒｒｏｗｉａ）アセトヒドロキシ酸シンターゼ［「ＡＨＡＳ」、Ｅ．Ｃ．４．１．３．１８］酵素（すなわちＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＸＰ＃５０１２７７、配列番号２７に記載のＷ４９７Ｌ変異を含んでなる、国際公開第２００６／０５２８７０号パンフレットを参照されたい）は、スルホニル尿素除草剤抵抗性（ＳＵR）を与え、それを陽性スクリーニングマーカーとして使用した。
一般方法に従って、プラスミドｐＹ１１７を使用してＹ４０８６株を形質転換した。形質転換に続いて、細胞をＭＭＵ＋ＳＵ（２８０μｇ／ｍＬスルホニル尿素、クロリムロンエチルとしてもまた知られている、Ｅ．Ｉ．ｄｕＰｏｎｔ ｄｅ Ｎｅｍｏｕｒｓ ＆ Ｃｏ．，Ｉｎｃ．（Ｗｉｌｍｉｎｇｔｏｎ，ＤＥ））プレート上に播種し、２〜３日間３０℃に保った。ＭＭＵ＋ＳＵプレート上で生育した個々のＳＵRコロニーを拾って３０℃のＹＰＤ液体培地中に画線塗抹し、２５０ｒｐｍ／分で１日間振盪してｐＹ１１７プラスミドをキュアした。生育した培養をＭＭＵプレート上に画線塗抹した。３０℃で２日間の後、個々のコロニーをＭＭおよびＭＭＵプレート上に再度画線塗抹した。ＭＭＵ上で生育できたが、ＭＭプレート上では生育できなかったコロニーを選択した。Ｕｒａ−表現型であるこれらの株の２つをＹ４０８６Ｕ１およびＹ４０８６Ｕ２と称する。
総脂質の約３７％のＥＰＡを生成するＹ４１２８株の作成
コンストラクトｐＺＰ２−２９８８（図４Ｂ、配列番号３０、国際公開第２００８／０７３３６７号パンフレットの表２１に記載されている）を作成して、１つのΔ１２デサチュラーゼ遺伝子（すなわちＦｍＤ１２Ｓ、フザリウム・モニリフォルメ（Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｍｏｎｉｌｉｆｏｒｍｅ）に由来するコドン最適化Δ１２デサチュラーゼ遺伝子［国際公開第２００５／０４７４８５号パンフレット］）、２つのΔ８デサチュラーゼ遺伝子（すなわちＥｇＤ８Ｍ）、および１つのΔ９エロンガーゼ遺伝子（すなわちＥｇＤ９ｅＳ）をＹ４０８６Ｕ１株のＰｏｘ２遺伝子座（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＡＪ００１３００）に組み込み、それによってより高レベルのＥＰＡ産生を可能にした。ｐＺＰ２−２９８８プラスミドをＡｓｃＩ／ＳｐｈＩで消化し、次に一般方法に従ってＹ４０８６Ｕ１株の形質転換のために使用した。形質転換体細胞をＭＭプレート上に播種して、および２〜３日間３０℃に保った。単一コロニーをＭＭプレート上に再度画線塗抹し、次に３０℃の液体ＭＭＬｅｕＬｙｓ中に接種して、２５０ｒｐｍ／分で２日間振盪した。細胞を遠心分離によって収集しＨＧＭに再懸濁して、次に２５０ｒｐｍ／分で５日間振盪した。細胞を遠心分離によって収集し、脂質を抽出してエステル交換によってＦＡＭＥを調製し、引き続いてＨｅｗｌｅｔｔ−Ｐａｃｋａｒｄ ６８９０ ＧＣで分析した。
ＧＣ分析は、選択された９６株の大部分が総脂質の１２〜１５．６％のＥＰＡを産生することを示した。総脂質の約３７．６％および１６．３％のＥＰＡを産生する２株（すなわちＩ群中の＃３７およびＩＩ群中の＃３３）があった。これらの２株をそれぞれＹ４１２８およびＹ４１２９と称する。
野生型ヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）ＡＴＣＣ＃２０３６２に対してＹ４１２８株の最終遺伝子型は、ＹＡＬＩ０Ｆ２４１６７ｇ−、Ｐｅｘ１０−、ｕｎｋｎｏｗｎ １−、ｕｎｋｎｏｗｎ ２−、ＧＰＤ：：ＦｍＤ１２：：Ｐｅｘ２０、ＹＡＴ１：：ＦｍＤ１２：：ＯＣＴ、ＧＰＭ／ＦＢＡＩＮ：：ＦｍＤ１２Ｓ：：ＯＣＴ、ＹＡＴ１：：ＭＥ３Ｓ：：Ｐｅｘ１６、ＧＰＡＴ：：ＥｇＤ９ｅ：：Ｌｉｐ２、ＥＸＰ１：：ＥｇＤ９ｅＳ：：Ｌｉｐ１、ＦＢＡＩＮｍ：：ＥｇＤ９ｅＳ：：Ｌｉｐ２、ＦＢＡ：：ＥｇＤ９ｅＳ：：Ｐｅｘ２０、ＦＢＡＩＮｍ：：ＥｇＤ８Ｍ：：Ｐｅｘ２０、ＥＸＰ１：：ＥｇＤ８Ｍ：：Ｐｅｘ１６、ＧＰＤＩＮ：：ＥｇＤ８Ｍ：：Ｌｉｐ１、ＹＡＴ１：：ＥｇＤ８Ｍ：：Ａｃｏ、ＦＢＡＩＮ：：ＥｇＤ５：：Ａｃｏ、ＥＸＰ１：：ＥｇＤ５Ｓ：：Ｐｅｘ２０、ＹＡＴ１：：ＲＤ５Ｓ：：ＯＣＴ、ＹＡＴ１：：ＰａＤ１７Ｓ：：Ｌｉｐ１、ＥＸＰ１：：ＰａＤ１７：：Ｐｅｘ１６、ＦＢＡＩＮｍ：：ＰａＤ１７：：Ａｃｏであった。
ヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）Ｙ４１２８株は２００７年８月２３日にＡｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎに寄託され、ＡＴＣＣ ＰＴＡ−８６１４と命名された。
Ｕｒａ−表現型を用いたＹ４１２８Ｕ株の作成
Ｙ４１２８株中のＵｒａ３遺伝子を中断するために、コンストラクトｐＺＫＵＥ３Ｓ（図５Ａ、配列番号３１、国際公開第２００８／０７３３６７号パンフレットの表２２に記載されている）を作成し、ＥＸＰ１：：ＭＥ３Ｓ：：Ｐｅｘ２０キメラ遺伝子をＹ４１２８株のＵｒａ３遺伝子に組み込んだ。プラスミドｐＺＫＵＥ３ＳをＳｐｈＩ／ＰａｃＩで消化し、次に一般方法に従って使用してＹ４１２８株を形質転換した。形質転換に続いて、細胞をＭＭ＋５−ＦＯＡ選択プレート上に播種し、２〜３日間３０℃に保った。
ＭＭ＋５−ＦＯＡ選択プレート上に生育した合計２４個の形質転換体を拾って、新鮮なＭＭ＋５−ＦＯＡプレート上に再度画線塗抹した。細胞をプレートからはぎ取って脂質を抽出し、エステル交換によってＦＡＭＥを調製し、引き続いてＨｅｗｌｅｔｔ−Ｐａｃｋａｒｄ ６８９０ ＧＣで分析した。
ＧＣ分析はプレートからのｐＺＫＵＥ３Ｓがある全ての形質転換体中に、１０〜１５％のＥＰＡの存在を示した。総脂質の１２．９％、１４．４％、１５．２％、１５．４％、１４％、および１０．９％のＥＰＡを産生した、＃３、＃４、＃１０、＃１２、＃１９、および＃２１と同定された株をそれぞれＹ４１２８Ｕ１、Ｙ４１２８Ｕ２、Ｙ４１２８Ｕ３、Ｙ４１２８Ｕ４、Ｙ４１２８Ｕ５、およびＹ４１２８Ｕ６（集合的にＹ４１２８Ｕ）と称した。
％ＥＰＡのＹ４１２８Ｕ中での定量化（平均１３．８％）とＹ４１２８中での定量化（３７．６％）との食い違いは、異なる生育条件に根ざしている。具体的にはＹ４１２８の培養が液体培養中で２日間の生育に続いて分析されたのに対し、Ｙ４１２８Ｕの培養は、寒天プレート上での生育後に分析された。出願人らは、寒天プレートからの結果を液体培養と比較した際に、％ＥＰＡの２〜３倍の増大を観察した。したがって結果を直接比較することはできないが、Ｙ４１２８およびＹ４１２８Ｕ株のどちらもＥＰＡの産生を実証する。
実施例３
ヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）Ｙ４１２８株の総脂質含量の定量
Ｙ４１２８株によって生成される脂質総量および脂質中の各脂肪酸種の百分率は、ＧＣ分析によって測定された。具体的には一般方法において記載されているようにして総脂質を抽出し、エステル交換によってＦＡＭＥを調製し、引き続いてＨｅｗｌｅｔｔ−Ｐａｃｋａｒｄ ６８９０ ＧＣで分析した。
乾燥細胞重量は、１０ｍＬの培養から遠心分離によって細胞を収集し、細胞を１回水洗して残留培地を除去し、細胞を真空オーブン内で８０℃で一晩乾燥させ、乾燥細胞を秤量することで測定された。サンプル中のＦＡＭＥの総量は、ＧＣプロフィール中の全てのピーク面積と、添加された既知量の内部基準Ｃ１５：０脂肪酸のピーク面積とを比較することで判定された
上の分析に基づき、Ｙ４０８６およびＹ４１２８株について、乾燥細胞重量（ＤＣＷ）の百分率としての脂質含量および脂質組成を判定した。Ｙ４１２８株は、Ｙ４０８６株と比較して脂質含量が減少していた（１１．２のＴＦＡ％ＤＣＷ対２８．６のＴＦＡ％ＤＣＷ）。対照的にＹ４１２８株は、下の表６で示されるようにＹ４０８６株と比較して脂質中のＥＰＡ濃度が増大していた。脂肪酸は１８：０（ステアリン酸）、１８：１（オレイン酸）、ＬＡ、ＡＬＡ、ＥＤＡ、ＤＧＬＡ、ＥＴｒＡ、ＥＴＡ、およびＥＰＡと同定された。脂肪酸組成は総脂肪酸（ＴＦＡ）の重量％として表される。
Figure 0005658034
細胞中のＥＰＡ含量はｍｇ ＥＰＡ／ｇ乾燥細胞として表され、式、
（％ＥＰＡ／脂質）*（％脂質／乾燥細胞重量）*０．１
に従って計算されるが、値はＹ４０８６株中の２８ｍｇ ＥＰＡ／ｇ ＤＣＷからＹ４１２８株中の４７．９ｍｇ ＥＰＡ／ｇ ＤＣＷに増大した。
したがって表６中の結果は、Ｙ４１２８株が、Ｙ４０８６親株と比較してより低い総脂質含量（ＴＦＡ％ＤＣＷ）（１１．２％対２８．６％）、より高いＥＰＡ％ＴＦＡ（４２．８％対９．８％）、およびより高いＥＰＡ％ＤＣＷ（４．８％対２．８％）を有したことをを示す。さらにＹ４１２８株は、総ＰＵＦＡに対するＥＰＡ量の３．３倍の増大（５４％のＰＵＦＡ［％ＴＦＡとして］対１６．３％のＰＵＦＡ［％ＴＦＡとして］）、および総ＰＵＦＡに対するＣ２０ ＰＵＦＡ量の１．７倍の増大（７３％のＰＵＦＡ［％ＴＦＡとして］対４２％のＰＵＦＡ［％ＴＦＡとして］）を有した。
実施例４
Ｐｅｘ１０組み込みとしてのヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）Ｙ４１２８株中のｐＺＰ２−２９８８組み込み部位の判定
Ｙ４１２８株中のｐＺＰ２−２９８８のゲノム組み込み部位をＣｌｏｎｔｅｃｈ（Ｐａｌｏ Ａｌｔｏ，ＣＡ）からのＵｎｉｖｅｒｓａｌ ＧｅｎｏｍｅＷａｌｋｅｒTMキットを使用して製造業者の推奨プロトコルに従って、ゲノム歩行により判定した。プラスミド配列に基づいて、次のプライマーをゲノム歩行のためにデザインした。ｐＺＰ−ＧＷ−５−１（配列番号３２）、ｐＺＰ−ＧＷ−５−２（配列番号３３）、ｐＺＰ−ＧＷ−５−３（配列番号３４）、ｐＺＰ−ＧＷ−５−４（配列番号３５）、ｐＺＰ−ＧＷ−３−１（配列番号３６）、ｐＺＰ−ＧＷ−３−２（配列番号３７）、ｐＺＰ−ＧＷ−３−３（配列番号３８）、およびｐＺＰ−ＧＷ−３−４（配列番号３９）。
Ｑｉａｇｅｎ Ｍｉｎｉｐｒｅｐキットを使用し、修正プロトコルを用いてＹ４１２８株からゲノムＤＮＡを調製した。細胞をＹＰＤ培地プレートからはぎ取り、１．５ｍＬ微量遠心管内に入れた。０．１２５Ｍのβ−メルカプトエタノールおよび１ｍｇ／ｍＬのｚｙｍｏｌｙａｓｅ ２０Ｔ（ＭＰ Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌｓ，Ｉｎｃ．（Ｓｏｌｏｎ，ＯＨ））を含有する２５０μｌの緩衝液Ｐ１に、細胞ペレット（１００μｌ）を再懸濁した。細胞懸濁液を３７℃で３０分間インキュベートした。次に緩衝液Ｐ２（２５０μｌ）を遠心管に添加した。遠心管を数回反転して混合した後、３５０μｌの緩衝液Ｎ３を添加した。次に微量遠心管内で、混合物を１４，０００ｒｐｍで５分間遠心分離した、上清をＱｉａｇｅｎ ｍｉｎｉｐｒｅｐスピンカラム内に注いで、１分間遠心分離した。０．７５ｍＬの緩衝液ＰＥを添加してカラムを１回洗浄し、１４，０００ｒｐｍで１分間の遠心分離がそれに続た。カラムを１４，０００ｒｐｍで１分間のさらなる遠心分離によって乾燥させた。５０μｌの緩衝液ＥＢをカラムに添加してゲノムＤＮＡを溶出し、１分間静置して１４，０００ｒｐｍで１分間遠心分離した。
精製されたゲノムＤＮＡをゲノム歩行のために使用した。ＧｅｎｏｍｅＷａｌｋｅｒキットプロトコルに従って、ＤＮＡを制限酵素ＤｒａＩ、ＥｃｏＲＶ、ＰｖｕＩＩ、およびＳｔｕＩで別々に消化した。各消化では、反応混合物は総容積１００μｌ中に、１０μｌの１０×制限酵素緩衝液、１０μｌの適切な制限酵素、および８μｇのゲノムＤＮＡを含有した。反応混合物を３７℃で４時間インキュベートした。次にＱｉａｇｅｎ ＰＣＲ精製キットを使用して製造業者のプロトコルに正確に従って、消化ＤＮＡサンプルを精製した。ＤＮＡサンプルを１６μｌの水中で溶出した。次に精製された消化ゲノムＤＮＡサンプルをＧｅｎｏｍｅ Ｗａｌｋｅｒアダプター（下記）にライゲートした。各ライゲーション混合物は、１．９μｌのＧｅｎｏｍｅ Ｗａｌｋｅｒアダプター、１．６μｌの１０×ライゲーション緩衝液、０．５μｌのＴ４ＤＮＡリガーゼ、および４μｌの消化ＤＮＡを含有した。反応混合物を１６℃で一晩インキュベートした。次に７２μｌの５０ｍＭ Ｔｒｉｓ ＨＣｌ、１ｍＭ ＥＤＴＡ、ｐＨ７．５を各ライゲーション混合物に添加した。
５’末端ゲノム歩行では、テンプレートとして個々に１μｌの各ライゲーション混合物を使用して、４回のＰＣＲ反応を実施した。さらに各反応混合物は、１μｌの１０μＭプライマーｐＺＰ−ＧＷ−５−１（配列番号３２）、１μｌの１０μＭキット提供Ｇｅｎｏｍｅ Ｗａｌｋｅｒアダプター、４１μｌの水、５μｌの１０×ｃＤＮＡ ＰＣＲ反応緩衝液、およびＣｌｏｎｔｅｃｈからの１μｌのＡｄｖａｎｔａｇｅ ｃＤＮＡポリメラーゼ混合物を含有した。Ｇｅｎｏｍｅ Ｗａｌｋｅｒアダプターの配列（配列番号４０［上のストランド］および４１［下のストランド］）を下に示す。
Figure 0005658034
 ＰＣＲ条件は次のとおり。９５℃で１分間、次に９５℃で２０秒間および６８℃で３分間を３０サイクルと、それに続く６８℃で７分間の最終延長。ＰＣＲ産物をそれぞれ１：１００に希釈し、１μｌの希釈ＰＣＲ産物を第２ラウンドのＰＣＲのためのテンプレートとして使用した。ｐＺＰ−ＧＷ−５−１（配列番号３２）をｐＺＰ−ＧＷ−５−２（配列番号３３）で置き換えたこと以外は、条件は全く同じであった。
３’末端ゲノム歩行では、プライマーｐＺＰ−ＧＷ−３−１（配列番号３６）およびネステッドアダプタープライマー（配列番号４２）を使用したこと以外は、上記のように４回のＰＣＲ反応を実施した。ＰＣＲ産物を同様に希釈し、ｐＺＰ−ＧＷ−３−２（配列番号３７）を使用してｐＺＰ−ＧＷ−３−１（配列番号３６）を置き換えて、第２ラウンドのＰＣＲのためのテンプレートとして使用した。
ＰＣＲ産物をゲル電気泳動法によって分析した。テンプレートとしてＥｃｏＲＶ消化ゲノムＤＮＡ、およびプライマーｐＺＰ−ＧＷ−３−２およびネステッドアダプタープライマーを使用して、１つの反応生成物から、約１．６ｋＢの断片が作成された。この断片を単離してＱｉａｇｅｎゲル精製キットを用いて精製し、ｐＣＲ２．１−ＴＯＰＯ中にクローンした。配列分析は、断片がプラスミドｐＺＰ２−２９８８の部分および染色体Ｃからのヤロウィア（Ｙａｒｒｏｗｉａ）ゲノムＤＮＡの双方を含むことを示した。それらの間の接合部は、染色体Ｃのヌクレオチド位置１３９８２６にあった。これはＰｅｘ１０遺伝子のコード領域の内側であった（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＣＡＧ８１６０６、配列番号１０）。
接合部の５’末端を判定するために、Ｙ４１２８株からのゲノムＤＮＡをテンプレートとして、プライマーＰｅｒ１０Ｆ１（配列番号４３）およびＺＰＧＷ−５−５（配列番号４４）を使用して、ＰＣＲ増幅を実施した。反応混合物は１μｌの各２０μＭプライマー、１μｌのゲノムＤＮＡ、２２μｌの水、および２５μｌのＴａＫａＲａ ＥｘＴａｑ ２×プレミックス（タカラバイオ株式会社（滋賀県大津市））を含んだ。サーモサイクラー条件は、９４℃で１分間、次に９４℃で２０秒間、５５℃で２０秒間、および７２℃で２分間を３０サイクルと、それに続く７２℃で７分間の最終延長であった。１．６ｋＢのＤＮＡ断片が増幅され、ｐＣＲ２．１−ＴＯＰＯ中にクローンされた。配列分析は、それが染色体Ｃからのヤロウィア（Ｙａｒｒｏｗｉａ）ゲノムＤＮＡと、ｐＺＰ２−２９８８とのキメラ断片であることを示した。接合部は染色体Ｃのヌクレオチド位置１３９８１７にあった。したがってＹ４１２８株中では、染色体Ｃのヌクレオチド１０個のセグメントが、ｐＺＰ２−２９８８からのＡｓｃＩ／ＳｐｈＩ断片によって置換された（図４Ｂ）。その結果、Ｙ４１２８株中のＰｅｘ１０は、コードされるタンパク質の最後の３２個のアミノ酸を欠いていた。
上の結論に基づいて、実施例２（前出）で単離されたＹ４１２８Ｕ株を引き続いてΔｐｅｘ１０株と称する。明確さのために述べると、Ｙ４１２８Ｕ１株は、Ｙ４１２８Ｕ１（Δｐｅｘ１０）株の同等物である。
実施例５
ヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）Ｙ４１２８Ｕ１（Δｐｅｘ１０）株中のＰｅｘ１０のプラスミド発現
Ｙ．リポリティカ（Ｙ．ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）Ｐｅｘ１０遺伝子を保持する３つのプラスミドを構築した。１）ｐＦＢＡＩｎ−ＰＥＸ１０は、ＦＢＡＩＮｍプロモータ制御下にあるＰｅｘ１０ ＯＲＦの発現を可能にし、２）ｐＰＥＸ１０−１およびｐＰＥＸ１０−２は、天然Ｐｅｘ１０プロモータ制御下のＰｅｘ１０の発現を可能にしたが、ｐＰＥＸ１０−１がより短いバージョン（約５００ｂｐ）のプロモータを使用したのに対し、ｐＰＥＸ１０−２はより長いバージョン（約９００ｂｐ）を使用した。これらの発現プラスミドの構築および形質転換に続き、Ｙ．リポリティカ（Ｙ．ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）Ｙ４１２８Ｕ１（Δｐｅｘ１０）株中の総油およびＥＰＡレベルに対するＰｅｘ１０プラスミド発現の影響を判定した。Ｐｅｘ１０の欠失は細胞中で、ＴＦＡの％としてのＥＰＡ量の増大をもたらしたが、ＤＣＷの％としての総脂質量を低下させた。
ｐＦＢＡＩｎ−ＰＥＸ１０、ｐＰＥＸ１０−１、およびｐＰＥＸ１０−２の構築
ｐＦＢＡＩｎ−ＰＥＸ１０を構築するために、テンプレートとしてＹ．リポリティカ（Ｙ．ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）ゲノムＤＮＡを使用して、プライマーＰｅｒ１０ Ｆ１（配列番号４３）およびＰｅｒ１０ Ｒ（配列番号４５）を使用して、Ｐｅｘ１０遺伝子のコード領域を増幅した。ＰＣＲ反応混合物は、１μｌの各２０μＭプライマー、１μｌのＹ．リポリティカ（Ｙ．ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）ゲノムＤＮＡ（約１００ｎｇ）、２５μｌのＥｘＴａｑ２×プレミックス、および２２μｌの水を含有した。反応を次のように実施した。９４℃で１分間、次に９４℃で２０秒間、５５℃で２０秒間、および７２℃で９０秒間を３０サイクルと、それに続く７２℃で７分間の最終延長。ＰＣＲ産物である１１６８ｂｐのＤＮＡ断片をＱｉａｇｅｎ ＰＣＲ精製キットを用いて精製し、ＮｃｏＩおよびＮｏｔＩで消化してｐＦＢＡＩｎ−ＭＯＤ−１中にクローンし（配列番号４６、図５Ｂ）、同じ２種の制限酵素で消化した。
配列分析した８つの個々のクローンの内、２つは誤りなしにＰｅｘ１０の正しい配列を有した。ｐＦＢＡＩｎ−ＰＥＸ１０（配列番号４７、図６Ａ）の構成要素を下の表７に列挙する。
Figure 0005658034
ｐＰＥＸ１０−１およびｐＰＥＸ１０−２を構築するために、プライマーＰＥＸ１０−Ｒ−ＢｓｉＷＩ（配列番号４８）、ＰＥＸ１０−Ｆ１−ＳａｌＩ（配列番号４９）、およびＰＥＸ１０−Ｆ２−ＳａｌＩ（配列番号５０）をデザインして合成した。ヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）ゲノムＤＮＡおよびプライマーＰＥＸ１０−Ｒ−ＢｓｉＷＩおよびＰＥＸ１０−Ｆ１−ＳａｌＩを使用したＰＣＲ増幅からは、両端をＳａｌＩおよびＢｓｉＷＩ制限部位で挟まれた、Ｐｅｘ１０ ＯＲＦ、Ｐｅｘ１０遺伝子の５００ｂｐの５’上流領域、および２１５ｂｐの３’下流領域を含有する１８７３ｂｐの断片が生じた。この断片をＱｉａｇｅｎ ＰＣＲ精製キットを用いて精製し、ＳａｌＩおよびＢｓｉＷＩで消化してｐＥＸＰ−ＭＯＤ−１（配列番号５１、図６Ｂ）にクローンし、同じ２種の酵素で消化してｐＰＥＸ１０−１（配列番号５２、図７Ａ）を作成した。プラスミドｐＥＸＰ−ＭＯＤ１は、ＦＢＡＩＮｍプロモータがＥＸＰ１プロモータで置換されていることを除いて、ｐＦＢＡＩｎ−ＭＯＤ−１（配列番号４６、図５Ｂ）と類似する。表８はｐＰＥＸ１０−１の構成要素を列挙する。
Figure 0005658034
ＰＥＸ１０−Ｒ−ＢｓｉＷＩ（配列番号４８）およびＰＥＸ１０−Ｆ２−ＳａｌＩ（配列番号５０）を使用したヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）ゲノムＤＮＡのＰＣＲ増幅からは、両端をＳａｌＩおよびＢｓｉＷＩ制限部位で挟まれた、ＰＥＸ１０ ＯＲＦ、Ｐｅｘ１０遺伝子の９９１ｂｐの５’上流領域、および２１５ｂｐの３’下流領域を含有する２３６５ｂｐの断片が生じた。この断片をＱｉａｇｅｎ ＰＣＲ精製キットを用いて精製し、ＳａｌＩおよびＢｓｉＷＩで消化して同様に消化されたｐＥＸＰ−ＭＯＤ−１にクローンした。これはキメラＰｅｘ１０−５’：：Ｐｅｘ１０：：Ｐｅｘ１０−３’遺伝子中のより長いＰｅｘ１０−５’プロモータを別として、その構造がプラスミドｐＰＥＸ１０−１（表８、前出）と類似するｐＰＥＸ１０−２（配列番号５３）の合成をもたらした。
Ｙ４１２８Ｕ１（Δｐｅｘ１０）株中におけるＰｅｘ１０の発現
一般方法のプロトコルに従って、プラスミドｐＦＢＡＩＮ−ＭＯＤ−１（対照、配列番号４６）、ｐＦＢＡＩｎ−ＰＥＸ１０（配列番号４７）、ｐＰＥＸ１０−１（配列番号５２）、およびｐＰＥＸ１０−２（配列番号５３）をＹ４１２８Ｕ１（Δｐｅｘ１０）に形質転換した。形質転換体をＭＭプレート上に播種した。上のプラスミドを保持する形質転換体の総脂質含量および脂肪酸組成を実施例３に記載されているように分析した。
乾燥細胞重量（ＤＣＷ）百分率としての脂質含量、および脂質組成を下の表９に示す。具体的には脂肪酸は１８：０（ステアリン酸）、１８：１（オレイン酸）、ＬＡ、ＡＬＡ、ＥＤＡ、ＤＧＬＡ、ＥＴｒＡ、ＥＴＡ、およびＥＰＡとして同定された。脂肪酸組成は総脂肪酸の重量％として表される。
Figure 0005658034
表９中の結果は、Ｙ４１２８Ｕ１（Δｐｅｘ１０）中における、天然Ｙ．リポリティカ（Ｙ．ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）Ｐｅｘ１０プロモータまたはＹ．リポリティカ（Ｙ．ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）ＦＢＡＩＮｍプロモータどちらかからのＰｅｘ１０の発現が、ＥＰＡ％を低下させてＹ４０８６のレベルに戻す一方、総脂質含量（ＴＦＡ％ＤＣＷ）をＹ４０８６のレベルにまで増大させることを示した（比較するのには表６のデータを参照されたい）。乾燥細胞１グラムあたりのＥＰＡ含量は、対照サンプル（すなわちｐＦＢＡＩｎ−ＭＯＤ−１を保持する細胞）の６３．２ｍｇから、ｐＦＢＡＩｎ−ＰＥＸ１０を保持する細胞中では３１．５ｍｇ、ｐＰＥＸ１０−１を保持する細胞中では２９ｍｇ、およびｐＰ
ＥＸ１０−２を保持する細胞中では３０．８ｍｇに変化した。これらの結果は、Ｐｅｘ１０のリングフィンガードメインの中断が、細胞中のＥＰＡの量を増大させるが総脂質含量は低下させることを実証した。
したがって表９の結果は、対照プラスミドがあるＹ４１２８Ｕ１（Δｐｅｘ１０）形質転換体との比較で、Ｐｅｘ１０発現プラスミドがある全ての形質転換体は、より高い脂質含量（ＴＦＡ％ＤＣＷ）（＞２７％対２２．８％）、より低いＥＰＡ％ＴＦＡ（約１０．８％対２７．７％）、およびより低いＥＰＡ％ＤＣＷ（＜３．１％対６．３％）を示すことを明らかにした。さらに対照プラスミドがあるＹ４１２８Ｕ１（Δｐｅｘ１０）株形質転換体は、Ｐｅｘ１０発現プラスミドがある形質転換体と比較して、総ＰＵＦＡに対するＥＰＡ量に２．５倍の増大を有し（４４％ＰＵＦＡ［％ＴＦＡとして］対１７．５％（平均）ＰＵＦＡ［％ＴＦＡとして］）、総ＰＵＦＡに対するＣ２０ ＰＵＦＡ量に１．５倍の増大を有した（６７％ＰＵＦＡ［％ＴＦＡとして］対４４％（平均）ＰＵＦＡ［％ＴＦＡとして］）。
実施例６
ＥＰＡを生成するためのＹ４１８４Ｕ株の作成
Ｙ．リポリティカ（Ｙ．ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）Ｙ４１８４Ｕ株を下の実施例７における宿主として使用した。Ｙ４１８４Ｕ株はＹ．リポリティカ（Ｙ．ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）ＡＴＣＣ＃２０３６２に由来し、Δ９エロンガーゼ／Δ８デサチュラーゼ経路の発現を通じてＥＰＡを産生できる。株はＵｒａ−表現型を有し、その構築については国際公開第２００８／０７３３６７号パンフレットの実施例７に記載されている。
しかし要約すれば、Ｙ４１８４Ｕ株の開発はＹ２２２４株、Ｙ４００１株、Ｙ４００１Ｕ株、Ｙ４０３６株、Ｙ４０３６Ｕ株、およびＹ４０６９株の構築を必要とした（前出、実施例１）。Ｙ４１８４Ｕ株のさらなる開発（図７Ｂに略図で示す）は、株Ｙ４０８４、株Ｙ４０８４Ｕ１、株Ｙ４１２７（Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ ＣｏｌｌｅｃｔｉｏｎにＡＴＣＣ ＰＴＡ−８８０２の登録番号の下に２００７年１１月２９日に寄託された）、Ｙ４１２７Ｕ２株、Ｙ４１５８株、Ｙ４１５８Ｕ１株、およびＹ４１８４株の作成を必要とした。Ｙ４１２７Ｕ２株の形質転換のために使用されるプラスミドコンストラクトｐＺＫＬ１−２ＳＰ９８Ｃを図８Ａに略図で示す（配列番号５４、国際公開第２００８／０７３３６７号パンフレットの表２３に記載されている）。Ｙ４１５８Ｕ１株の形質転換のために使用されるプラスミドｐＺＫＬ２−５Ｕ８９ＧＣを図８Ｂに示す（配列番号５５、国際公開第２００８／０７３３６７号パンフレットの表２４に記載されている）。
野生型ヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）ＡＴＣＣ＃２０３６２に対してＹ４１８４株（総脂質の３１％のＥＰＡを産生する）の最終遺伝子型は、ｕｎｋｎｏｗｎ １−、ｕｎｋｎｏｗｎ ２−、ｕｎｋｎｏｗｎ ４−、ｕｎｋｎｏｗｎ ５−、ｕｎｋｎｏｗｎ ６−、ｕｎｋｎｏｗｎ ７−、ＹＡＴ１：：ＭＥ３Ｓ：：Ｐｅｘ１６、ＥＸＰ１：：ＭＥ３Ｓ：：Ｐｅｘ２０（２コピー）、ＧＰＡＴ：：ＥｇＤ９ｅ：：Ｌｉｐ２、ＦＢＡＩＮｍ：：ＥｇＤ９ｅＳ：：Ｌｉｐ２、ＥＸＰ１：：ＥｇＤ９ｅＳ：：Ｌｉｐ１、ＦＢＡ：：ＥｇＤ９ｅＳ：：Ｐｅｘ２０、ＹＡＴ１：：ＥｇＤ９ｅＳ：：Ｌｉｐ２、ＧＰＤ：：ＥｇＤ９ｅＳ：：Ｌｉｐ２、ＧＰＤＩＮ：：ＥｇＤ８Ｍ：：Ｌｉｐ１、ＹＡＴ１：：ＥｇＤ８Ｍ：：Ａｃｏ、ＥＸＰ１：：ＥｇＤ８Ｍ：：Ｐｅｘ１６、ＦＢＡＩＮｍ：：ＥｇＤ８Ｍ：：Ｐｅｘ２０、ＦＢＡＩＮ：：ＥｇＤ８Ｍ：：Ｌｉｐ１（２コピー）、ＧＰＭ／ＦＢＡＩＮ：：ＦｍＤ１２Ｓ：：Ｏｃｔ、ＥＸＰ１：：ＦｍＤ１２Ｓ：：Ａｃｏ、ＹＡＴ１：：ＦｍＤ１２：：Ｏｃｔ、ＧＰＤ：：ＦｍＤ１２：：Ｐｅｘ２０、ＥＸＰ１：：ＥｇＤ５Ｓ：：Ｐｅｘ２０、ＹＡＴ１：：ＥｇＤ５Ｓ：：Ａｃｏ、ＹＡＴ１：：Ｒｄ５Ｓ：：Ｏｃｔ、ＦＢＡＩＮ：：ＥｇＤ５：：Ａｃｏ、ＦＢＡＩＮｍ：：ＰａＤ１７：：Ａｃｏ、ＥＸＰ１：：ＰａＤ１７：：Ｐｅｘ１６、ＹＡＴ１：：ＰａＤ１７Ｓ：：Ｌｉｐ１、ＹＡＴ１：：ＹｌＣＰＴ１：：Ａｃｏ、ＧＰＤ：：ＹｌＣＰＴ１：：Ａｃｏ（ＦｍＤ１２はフザリウム・モニリフォルメ（Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｍｏｎｉｌｉｆｏｒｍｅ）Δ１２デサチュラーゼ遺伝子［国際公開第２００５／０４７４８５号パンフレット］であり、ＦｍＤ１２Ｓはフザリウム・モニリフォルメ（Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｍｏｎｉｌｉｆｏｒｍｅ）に由来するコドン最適化Δ１２デサチュラーゼ遺伝子［国際公開第２００５／０４７４８５号パンフレット］であり、ＭＥ３Ｓはモルティエラ・アルピナ（Ｍｏｒｔｉｅｒｅｌｌａ ａｌｐｉｎａ）に由来するコドン最適化Ｃ16/18エロンガーゼ遺伝子［国際公開第２００７／０４６８１７号パンフレット］であり、ＥｇＤ９ｅはミドリムシ（Ｅｕｇｌｅｎａ ｇｒａｃｉｌｉｓ）Δ９エロンガーゼ遺伝子［国際公開第２００７／０６１７４２号パンフレット］であり、ＥｇＤ９ｅＳはミドリムシ（Ｅｕｇｌｅｎａ ｇｒａｃｉｌｉｓ）に由来するコドン最適化Δ９エロンガーゼ遺伝子［国際公開第２００７／０６１７４２号パンフレット］であり、ＥｇＤ８Ｍはミドリムシ（Ｅｕｇｌｅｎａ ｇｒａｃｉｌｉｓ）[米国特許第７，２５６，０３３号明細書]に由来する合成Δ８デサチュラーゼ変異体［国際公開第２００８／０７３２７１号パンフレット］であり、ＥｇＤ５はミドリムシ（Ｅｕｇｌｅｎａ ｇｒａｃｉｌｉｓ）Δ５デサチュラーゼ［米国特許出願公開第２００７−０２９２９２４−Ａ１号明細書］であり、ＥｇＤ５Ｓはミドリムシ（Ｅｕｇｌｅｎａ ｇｒａｃｉｌｉｓ）に由来するコドン最適化Δ５デサチュラーゼ遺伝子［米国特許出願公開第２００７−０２９２９２４号明細書］であり、ＲＤ５Ｓはペリディニウム（Ｐｅｒｉｄｉｎｉｕｍ）種ＣＣＭＰ６２６に由来するコドン最適化Δ５デサチュラーゼ［米国特許出願公開第２００７−０２７１６３２号明細書］であり、ＰａＤ１７はピシウム・アファニデルマタム（Ｐｙｔｈｉｕｍ ａｐｈａｎｉｄｅｒｍａｔｕｍ）Δ１７デサチュラーゼ［国際公開第２００８／０５４５６５号パンフレット］であり、ＰａＤ１７Ｓはピシウム・アファニデルマタム（Ｐｙｔｈｉｕｍ ａｐｈａｎｉｄｅｒｍａｔｕｍ）に由来するコドン最適化Δ１７デサチュラーゼ［国際公開第２００８／０５４５６５号パンフレット］であり、ＹｌＣＰＴ１はヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）ジアシルグリセロールコリンリン酸転移酵素遺伝子［国際公開第２００６／０５２８７０号パンフレット］である）であった。
Ｙ４１８４株中でＵｒａ３遺伝子を中断するために、コンストラクトｐＺＫＵＥ３Ｓ（図５Ａ、配列番号３１、国際公開第２００８／０７３３６７号パンフレットの表２２に記載されている）を使用して、ＥＸＰ１：：ＭＥ３Ｓ：：Ｐｅｘ２０キメラ遺伝子をＹ４１８４株のＵｒａ３遺伝子に組み込み、それぞれＹ４１８４Ｕ１株（総脂質の１１．２％のＥＰＡ）、Ｙ４１８４Ｕ２株（総脂質の１０．６％のＥＰＡ）、およびＹ４１８４Ｕ４株（総脂質の１５．５％のＥＰＡ）、（集合的にＹ４１８４Ｕ株）を得た。
実施例７
ヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）Ｙ４１８４Ｕ４株中のＰｅｘ１０の染色体欠失はＥＰＡ蓄積および総脂質含量を増大させる
コンストラクトｐＹＰＳ１６１（図９Ａ、配列番号５６）を使用して、ＥＰＡ産生ヤロウィア（Ｙａｒｒｏｗｉａ）Ｙ４１８４Ｕ４株（実施例６）から染色体Ｐｅｘ１０遺伝子をノックアウトした。Ｐｅｘ１０ノックアウトコンストラクトによるＹ．リポリティカ（Ｙ．ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）Ｙ４１８４Ｕ４株の形質転換は、Ｙ４１８４（Δｐｅｘ１０）株の創出をもたらした。総油およびＥＰＡレベルに対するＰｅｘ１０ノックアウトの影響を判定して比較した。具体的にはＰｅｘ１０のノックアウトは、ＥＰＡ百分率（％ＴＦＡおよび％ＤＣＷとして）の増大および細胞中の総脂質含量の増大をもたらした。
コンストラクトｐＹＳＰ１６１
コンストラクトｐＹＰＳ１６１は、次の構成要素を含有した。
Figure 0005658034
ヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）ノックアウトＹ４１８４（ΔＰｅｘ１０）株の作成
標準プロトコルを使用して、ヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）Ｙ４１８４Ｕ４株（実施例６）をＰｅｘ１０ノックアウトコンストラクトｐＹＰＳ１６１の精製された５．３ｋＢのＡｓｃＩ／ＳｐｈＩ断片（前出）で形質転換し、細胞単独対照もまた調製した。実験的形質転換のそれぞれで約２００〜２５０個のコロニーが存在したのに対し、細胞単独プレート上にはコロニーは存在しなかった（予想通り）。
コロニーＰＣＲを使用して、Ｐｅｘ１０欠失を有する細胞についてスクリーンした。具体的にはＭａｓｔｅｒＡｍｐＴａｑポリメラーゼ（Ｅｐｉｃｅｎｔｒｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ））を使用して、標準プロトコルに従って、ＰＣＲプライマーＰｅｘ−１０ｄｅｌ１３’．Ｆｏｒｗａｒｄ（配列番号５７）およびＰｅｘ−１０ｄｅｌ２５’．Ｒｅｖｅｒｓｅ（配列番号５８）を使用してＰＣＲ反応を実施した。ＰＣＲ反応条件は、９４℃で５分間、次に９４℃で３０秒間、６０℃で３０秒間、および７２℃で２分間を３０サイクルと、それに続く７２℃で６分間の最終延長であった。次に反応を４℃に保った。Ｐｅｘ１０ノックアウトコンストラクトがＰｅｘ１０領域中に組み込まれれば、サイズ２．８ｋＢの単一ＰＣＲ産物が生じることが予期される。対照的に株がＰｅｘ１０領域以外の染色体領域にＰｅｘ１０ノックアウトコンストラクトを組みめば、２つのＰＣＲ断片、すなわち２．８ｋＢおよび１．１ｋＢが生じる。スクリーンした２８８個のコロニーの内、大多数はランダム部位に組み込まれたＰｅｘ１０ノックアウトコンストラクトを有した。２８８個のコロニーの内１個だけが、Ｐｅｘ１０ノックアウトを含有した。この株をＹ４１８４（Δｐｅｘ１０）と称した。
総油およびＥＰＡ産生に関するヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）Ｙ４１８４株およびＹ４１８４（ΔＰｅｘ１０）株の評価
総脂質画分中のＰＵＦＡ％、および細胞中の総脂質含量に対するＰｅｘ１０ノックアウトの影響を評価するために、比較できる油性条件下でＹ４１８４株およびＹ４１８４（Δｐｅｘ１０）株を生育させた。具体的には２５０ｍＬフラスコ内で、２５ｍＬの発酵培地（ＦＭ）または２５ｍＬの酵母抽出物を含まないＦＭ培地（ＹＥ非含有ＦＭ）どちらかの中で、培養を開始ＯＤ600約０．１で４８時間生育させた。５０ｍＬの円錐管内で８０００ｒｐｍで１０分間遠心分離して、細胞を収集した。上清を廃棄して細胞を２５ｍＬのＨＧＭに再懸濁し、新しい２５０ｍＬフラスコに移した。細胞を３０℃でさらに１２０時間通気培養した。
乾燥細胞重量（ＤＣＷ）を測定するために、５ｍＬのＦＭ生育培養、および１０ｍＬのＹＥ非含有ＦＭ生育培養からの細胞を処理した。培養細胞を４３００ｒｐｍで１０分間遠心分離した。ペレットを１０ｍＬの食塩水を使用して再懸濁し、同一条件下で２回目の遠心分離をした。次にペレットを１ｍＬの無菌Ｈ2０（３倍）を使用して再懸濁し、あらかじめ秤量したアルミ皿に移した。細胞を真空オーブン内において８０℃で一晩乾燥させた。細胞重量を測定した。
上記プラスミドを保持する形質転換体の総脂質含量および脂肪酸組成を実施例３に記載されているようにして分析した。ＤＣＷ、総脂質含量（ＴＦＡ％ＤＣＷ）、総ＥＰＡ％ＴＦＡ、およびＥＰＡ％ＤＣＷを下の表１１に示す。
Figure 0005658034
表１１中の結果は、Ｙ４１８４（ΔＰｅｘ１０）中の染色体Ｐｅｘ１０遺伝子のノックアウトが、天然Ｐｅｘ１０ｐがノックアウトされていないＹ４１８４株中のＥＰＡ％および総含油量と比較して、ＥＰＡ％（％ＴＦＡおよび％ＤＣＷとして）を増大し、および総含油量を増大することを示した。より具体的にはＦＭ培地中では、ＥＰＡ（％ＴＦＡ）の約１０９％の増大、ＥＰＡ生産性（％ＤＣＷ）の約２１６％の増大、および総油（ＴＦＡ％ＤＣＷ）の約４９％の増大があった。ＹＥ非含有ＦＭ培地中では、ＥＰＡ（％ＴＦＡ）の約１００％の増大、ＥＰＡ生産性（％ＤＣＷ）の約２０５％の増大、および総油（ＴＦＡ％ＤＣＷ）の約５０％の増大があった。
したがって表１１の結果は、ＦＭ培地中では、Ｙ４１８４親株と比較してＹ４１８４（ΔＰｅｘ１０）株が、より高い脂質含量（ＴＦＡ％ＤＣＷ）（１７．６％対１１．８％）、より高いＥＰＡ％ＴＦＡ（４３．２％対２０．６％）、およびより高いＥＰＡ％ＤＣＷ（７．６％対２．４％）を有することを示した。同様にＹＥ非含有ＦＭ培地中では、Ｙ４１８４親株と比較してＹ４１８４（ΔＰｅｘ１０）株は、より高い脂質含量（ＴＦＡ％ＤＣＷ）（１３．２％対８．８％）、より高いＥＰＡ％ＴＦＡ（４６．１％対２３．２％）、およびより高いＥＰＡ％ＤＣＷ（６．１％対２．０％）を有した。
実施例８（予測的）
ヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）ＰＵＦＡ産生株中における代案のＰｅｘ遺伝子の染色体ノックアウト
本例は、改変されてω−３／ω−６ＰＵＦＡを産生するヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）の様々な株について述べる。前出の実施例７の方法を使用して遺伝子Ｐｅｘ１ｐ、Ｐｅｘ２ｐ、Ｐｅｘ３ｐ、Ｐｅｘ３Ｂｐ、Ｐｅｘ４ｐ、Ｐｅｘ５ｐ、Ｐｅｘ６ｐ、Ｐｅｘ７ｐ、Ｐｅｘ８ｐ、Ｐｅｘ１２ｐ、Ｐｅｘ１３ｐ、Ｐｅｘ１４ｐ、Ｐｅｘ１６ｐ、Ｐｅｘ１７ｐ、Ｐｅｘ１９ｐ、Ｐｅｘ２０ｐ、Ｐｅｘ２２ｐまたはＰｅｘ２６ｐをコードする染色体が中断されれば、これらのＹ．リポリティカ（Ｙ．ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）宿主株のいずれかを改変して、総脂質画分中および油画分中に増大する量のω−３／ω−６ ＰＵＦＡを産生できることが考察される。
より具体的には出願人の譲受人によって多様なヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）株が改変されて、異種のΔ６デサチュラーゼ／Δ６エロンガーゼＰＵＦＡ経路または異種のΔ９エロンガーゼ／Δ８デサチュラーゼＰＵＦＡ経路の発現を通じて、高濃度の様々なω−３／ω−６ＰＵＦＡが生成されている。
ω−３／ω−６ＰＵＦＡを産生する代表的なヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）株の要約
いくつかの代表的な株を下の表に要約するが、ω−３／ω−６ＰＵＦＡを産生するヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）株の開示は、その中の株にどのようにも限定されない。それよりもむしろ本明細書で提供される全ての教示は、以下の同一譲受人のおよび同時係属出願に加えて、改変されてω−３／ω−６ＰＵＦＡを産生する適切なヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）株を開発するのに有用である。これらとしては、具体的には以下の出願人らの譲受人の同時係属特許および出願が挙げられる。米国特許第７，１２５，６７２号明細書、米国特許第７，１８９，５５９号明細書、米国特許第７，１９２，７６２号明細書、米国特許第７，１９８，９３７号明細書、米国特許第７，２０２，３５６号明細書、米国特許第７，２１４，４９１号明細書、米国特許第７，２３８，４８２号明細書、米国特許第７，２５６，０３３号明細書、米国特許第７，２５９，２５５号明細書、米国特許第７，２６４，９４９号明細書、米国特許第７，２６７，９７６号明細書、米国特許第７，２７３，７４６号明細書、米国特許出願公開第１０／９８５２５４号明細書および米国特許出願公開第１０／９８５６９１号明細書（２００４年１１月１０日出願）、米国特許出願公開第１１／１８３６６４号明細書（２００５年７月１８日出願）、米国特許出願公開第１１／１８５３０１号明細書（２００５年７月２０日出願）、米国特許出願公開第１１／１９０７５０号明細書（２００５年７月２７日出願）、米国特許出願公開第１１／１９８９７５号明細書（２００５年８月８日出願）、米国特許出願公開第１１／２５３８８２号明細書（２００５年１０月１９日出願）、米国特許出願公開第１１／２６４７８４号明細書および米国特許出願公開第１１／２６４７３７号明細書（２００５年１１月１日出願）、米国特許出願公開第１１／２６５７６１号明細書（２００５年１１月２日出願）、米国特許出願公開第１１／６０１５６３号明細書および米国特許出願公開第１１／６０１５６４号明細書（２００６年１１月１６日出願）、米国特許出願公開第１１／６３５２５８号明細書（２００６年１２月７日出願）、米国特許出願公開公開第１１／６１３４２０号明細書（２００６年１２月２０日出願）、米国特許出願第１１／７８７７７２号明細書（２００７年４月１８日出願）、米国特許出願公開第１１／７３７７７２号明細書（２００７年４月２０日出願）、米国特許出願公開第１１／７４０２９８号明細書（２００７年４月２６日出願）、米国特許出願公開第１２／１１１２３７号明細書（２００８年４月２９日出願）、米国特許出願公開第１１／７４８６２９号明細書および米国特許出願公開第１１／７４８６３７号明細書（２００７年５月１５日出願）、米国特許出願公開第１１／７７９９１５号明細書（２００７年７月１９日出願）、米国仮特許出願第６０／９９１２６６号明細書（２００７年１１月３０日出願）、米国特許出願公開第１１／９５２２４３号明細書（２００７年１２月７日出願）、米国仮特許出願第６１／０４１７１６号明細書（２００８年４月２日出願）、米国特許出願公開第１２／０６１７３８号明細書（２００８年４月３日出願）、米国特許出願公開第１２／０９９８１１号明細書（２００８年４月９日出願）、米国特許出願公開第１２／１０２８７９号明細書（２００８年４月１５日出願）、米国特許出願公開第１２／１１１２３７号明細書（２００８年４月２９日出願）、米国仮特許出願第６１／０５５５１１号明細書（２００８年５月２３日出願）、および米国仮特許出願第６１／０９３００７号明細書（２００８年８月２９日出願）。
Figure 0005658034
Ｐｅｘ遺伝子の染色体ノックアウト
望ましいω−３／ω−６ＰＵＦＡ（またはそのＰＵＦＡの組み合わせ）を産生する好ましいヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）株の選択に続いて、当業者は実施例７のｐＹＰＳ１６１に類似した適切なノックアウトコンストラクトを容易に操作でき、Ｙ．リポリティカ（Ｙ．ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）親株への形質転換に際して、染色体Ｐｅｘ遺伝子のノックアウトがもたらされる。好ましいＰｅｘ遺伝子としては、ＹｌＰｅｘ１ｐ（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＣＡＧ８２１７８、配列番号１）、ＹｌＰｅｘ２ｐ（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＣＡＧ７７６４７、配列番号２）、ＹｌＰｅｘ３ｐ（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＣＡＧ７８５６５、配列番号３）、ＹｌＰｅｘ３Ｂｐ（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＣＡＧ８３３５６、配列番号４）、ＹｌＰｅｘ４ｐ（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＣＡＧ７９１３０、配列番号５）、ＹｌＰｅｘ５ｐ（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＣＡＧ７８８０３、配列番号６）、ＹｌＰｅｘ６ｐ（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＣＡＧ８２３０６、配列番号７）、ＹｌＰｅｘ７ｐ（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＣＡＧ７８３８９、配列番号８）、ＹｌＰｅｘ８ｐ（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＣＡＧ８０４４７、配列番号９）、ＹｌＰｅｘ１２ｐ（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＣＡＧ８１５３２、配列番号１１）、ＹｌＰｅｘ１３ｐ（ＧｅＢｂａｎｋ登録番号ＣＡＧ８１７８９、配列番号１２）、ＹｌＰｅｘ１４ｐ（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＣＡＧ７９３２３、配列番号１３）、ＹｌＰｅｘ１６ｐ（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＣＡＧ７９６２２、配列番号１４）、ＹｌＰｅｘ１７ｐ（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＣＡＧ８４０２５、配列番号１５）、ＹｌＰｅｘ１９ｐ（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＡＡＫ８４８２７、配列番号１６）、ＹｌＰｅｘ２０ｐ（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＣＡＧ７９２２６、配列番号１７）、ＹｌＰｅｘ２２ｐ（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＣＡＧ７７８７６、配列番号１８）、およびＹｌＰｅｘ２６ｐ（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＮＣ＃００６０７２、ヌクレオチド１１７２３０〜１１８３８７のアンチセンス翻訳、配列番号１９）が挙げられる。
Ｐｅｘの染色体中断は、天然ペルオキシソーム生合成因子タンパク質が中断されていない真核生物と比較して、総脂肪酸の％として総脂質画分中および油画分中のＰＵＦＡ量の増大をもたらすことが予期され、ＰＵＦＡの量は、１）ＰＵＦＡ中間体または副産物とは対照的に、機能性ＰＵＦＡ生合成経路の所望の最終産物であるＰＵＦＡ、２）Ｃ20およびＣ22ＰＵＦＡ、および／または３）総ＰＵＦＡであり得る。好ましい結果は、天然ペルオキシソーム生合成因子タンパク質が中断されていない真核生物と比較して、総脂肪酸の％としてのＰＵＦＡ量の増大を達成するだけでなく、乾燥細胞重量の％としてのＰＵＦＡ量の増大ももたらす。この場合もＰＵＦＡの量は、１）ＰＵＦＡ中間体または副産物とは対照的に、機能性ＰＵＦＡ生合成経路の所望の最終産物であるＰＵＦＡ、２）Ｃ20およびＣ22ＰＵＦＡ、および／または３）総ＰＵＦＡであり得る。場合によっては、天然ペルオキシソーム生合成因子タンパク質が中断されていない真核生物と比較して、総脂質含量もまた増大する。
実施例９
ヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）Ｙ４０３６Ｕ株中におけるＰｅｘ１６の染色体欠失は蓄積ＤＧＬＡ％を増大させる
本実施例はＤＧＬＡ産生ヤロウィア（Ｙａｒｒｏｗｉａ）Ｙ４０３６Ｕ株（実施例１）中において、染色体のＰｅｘ１６遺伝子をノックアウトするためのコンストラクトｐＹＲＨ１３（図９Ｂ、配列番号５９）の使用について述べる。Ｐｅｘ１６ノックアウトコンストラクトによるＹ．リポリティカ（Ｙ．ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）Ｙ４０３６Ｕ株の形質転換はＹ４０３６Ｕ（Δｐｅｘ１６）株の創出をもたらした。ＤＧＬＡレベルに対するＰｅｘ１６ノックアウトの影響を判定して比較した。具体的にはＰｅｘ１６のノックアウトは、細胞中の総脂肪酸の％としてのＤＧＬＡ百分率の増大をもたらした。
コンストラクトｐＹＲＨ１３
プラスミドｐＹＲＨ１３は、プラスミドｐＹＰＳ１６１（図９Ａ、配列番号５６、実施例７）から誘導された。具体的にはヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）Ｐｅｘ１６遺伝子（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＣＡＧ７９６２２）の１９８２ｂｐの５’プロモータ領域がｐＹＰＳ１６１のＡｓｃＩ／ＢｓｉＷＩ断片を置換し、ヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）Ｐｅｘ１６遺伝子（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＣＡＧ７９６２２）の４４８ｂｐの３’ターミネーター領域がｐＹＰＳ１６１のＰａｃＩ／ＳｐｈＩ断片を置換して、ｐＹＲＨ１３（配列番号５９、図９Ｂ）を生成した。
ヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）ノックアウト株Ｙ４０３６（ΔＰｅｘ１６）の作成
標準プロトコルを使用して、Ｐｅｘ１６ノックアウトコンストラクトｐＹＲＨ１３の精製された６．０ｋＢのＡｓｃＩ／ＳｐｈＩ断片で、ヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）Ｙ４０３６Ｕ株（実施例１）を形質転換した。
Ｐｅｘ１６欠失を有する細胞についてスクリーンするために、Ｔａｑポリメラーゼ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ（Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ））およびＰＣＲプライマーＰＥＸ１６Ｆｉｉ（配列番号６０）およびＰＥＸ１６Ｒｉｉ（配列番号６１）を使用して、コロニーＰＣＲを実施した。このプライマーセットは、未変性Ｐｅｘ１６遺伝子の１．１ｋＢ領域を増幅するようにデザインされ、したがってＰｅｘ１６欠失変異体（すなわちΔｐｅｘ１６）はバンドを形成しない。プライマーの第２のセットは、Ｐｅｘ１６遺伝子が欠失している場合にのみバンドを生成するようにデザインされた。具体的には１つのプライマー（すなわち３ＵＴＲ−ＵＲＡ３、配列番号６２）が導入された６．０ｋＢのＡｓｃＩ／ＳｐｈＩ中断断片のベクター配列中の領域に結合し、別のプライマー（すなわちＰＥＸ１６−ｃｏｎｆ、配列番号６３）は中断断片の相同的な領域外の染色体のＰｅｘ１６ターミネーター配列に結合する。
より具体的には以下を含有する反応混合物を使用して、コロニーＰＣＲを実施した。２０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．４）、５０ｍＭのＫＣｌ、１．５ｍＭのＭｇＣｌ2、各４００μＭのｄＧＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＡＴＰ、およびｄＴＴＰ、各２μＭのプライマー、２０μｌの水、および２ＵのＴａｑポリメラーゼ。増幅を次のように実施した。９４℃で１２０秒間の最初の変性、次に９４℃で６０秒間の変性、５５℃で６０秒間のアニーリング、および７２℃で１２０秒間の延長を３５サイクル。７２℃で５分間の最終延長サイクルを実施し、４℃での反応終結がそれに続いた。
スクリーンされた２０５個のコロニーの内、１９５個は染色体中のランダム部位に組み込まれたＰｅｘ１６ノックアウト断片を有し、したがってΔｐｅｘ１６変異体ではなかった（しかしｐＹＲＨ１３の存在のために、細胞はｕｒａ−プレート上に生育できた）。Ｙ４０３６Ｕ−１７、Ｙ４０３６Ｕ−１９、およびＹ４０３６Ｕ−３３と称されるこれらのランダム組み込み体の３つを脂質生成実験（後述）における対照として使用した。
スクリーンされた残りの１０個のコロニー（すなわち合計は２０５個）は、Ｐｅｘ１６ノックアウトを含有した。Ｙ４０３６Ｕ株バックグラウンド内のこれら１０個のΔｐｅｘ１６変異体をＲＨＹ２５〜ＲＨＹ３４と称した。
定量的リアルタイムＰＣＲによるヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）ノックアウトＹ４０３６Ｕ（ΔＰｅｘ１６）株の確認
ＲＨＹ２５〜ＲＨＹ３４株中のＰｅｘ１６ノックアウトのさらなる確認は、ヤロウィア（Ｙａｒｒｏｗｉａ）翻訳延長因子（ｔｅｆ−１）遺伝子（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＡＦ０５４５１０）を対照として使用して、定量的リアルタイムＰＣＲによって実施された。
最初にそれぞれＰｅｘ１６遺伝子およびｔｅｆ−１遺伝子を標的とする、リアルタイムＰＣＲプライマーおよびＴａｑＭａｎプローブをＰｒｉｍｅｒ Ｅｘｐｒｅｓｓソフトウェアｖ２．０（ＡｐｐｌｉｅｄＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓ（Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ，ＣＡ））を用いてデザインした。具体的にはリアルタイムＰＣＲプライマーｅｆ−３２４Ｆ（配列番号６４）、ｅｆ−３９２Ｒ（配列番号６５）、ＰＥＸ１６−７４１Ｆ（配列番号６６）、およびＰＥＸ１６−８０２Ｒ（配列番号６７）、ならびにＴａｑＭａｎプローブｅｆ−３４５Ｔ（すなわち５’６−ＦＡＭTM−ＴＧＣＴＧＧＴＧＧＴＧＴＴＧＧＴＧＡＧＴＴ−ＴＡＭＲＡTM、ヌクレオチド配列は配列番号６８で記載される）およびＰＥＸ１６−７６０Ｔ（すなわち５’−６ＦＡＭTM−ＣＴＧＴＣＣＡＴＴＣＴＧＣＧＡＣＣＣＣＴＣ−ＴＡＭＲＡTM、ヌクレオチド配列は配列番号６９で記載される）をデザインした。ＴａｑＭａｎ蛍光発生的プローブの５’末端が６ＦＡＭTM蛍光性レポーター染料結合を有するのに対し、３’末端はＴＡＭＲＡTM失活剤を含んでなる。全てのプライマーおよびプローブは、Ｓｉｇｍａ−Ｇｅｎｏｓｙｓ（Ｗｏｏｄｌａｎｄｓ，ＴＸ）から得られた。
１個のコロニーを５０μｌの水に懸濁することにより、ノックアウト候補ＤＮＡを調製した。各サンプルについて三連で、ｔｅｆ−１およびＰＥＸ１６のための反応を別個に実施した。リアルタイムＰＣＲ反応は、各２０ｐｍｏｌｅの順方向および逆方向プライマー（すなわちｅｆ−３２４Ｆ、ｅｆ−３９２Ｒ、ＰＥＸ１６−７４１Ｆ、およびＰＥＸ１６−８０２Ｒ ５’、前出）、各５ｐｍｏｌｅのＴａｑＭａｎプローブ（すなわちｅｆ−３４５ＴおよびＰＥＸ１６−７６０Ｔ）、１０μｌのＴａｑＭａｎ Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ ＰＣＲ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ−−Ｎｏ ＡｍｐＥｒａｓｅ（登録商標）Ｕｒａｃｉｌ−Ｎ−Ｇｌｙｃｏｓｙｌａｓｅ（ＵＮＧ）（カタログ番号ＰＮ ４３２６６１４、ＡｐｐｌｉｅｄＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）、１μｌのコロニー懸濁液、および８．５μｌのＲＮＡ分解酵素／デオキシリボヌクレアーゼ非含有水を反応あたりの総容積２０μｌに含んだ。反応をＡＢＩ ＰＲＩＳＭ（登録商標）７９００ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ上で次の条件下で実施した。９５℃で１０分間の最初の変性、次に９５℃で１５秒間の変性および６０℃で１分間のアニーリングを４０サイクル。各サイクル中に６−ＦＡＭTM蛍光をモニターして、リアルタイムデータを自動的に収集した。ＡＢＩ ＰＲＩＳＭ（登録商標）７９００ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍの取扱説明書の通り、データ正規化のためにｔｅｆ−１遺伝子閾値サイクル（ＣT）値を使用してデータ分析を実施した。
この分析に基づいて、１０個のＹ４０３６Ｕ（Δｐｅｘ１６）コロニー（すなわちＲＨＹ２５〜ＲＨＹ３４）は全て、ｐＹＲＨ１３コンストラクトが染色体ＹｌＰｅｘ１６中に組み込まれた有効なＰｅｘ１６ノックアウトであると結論された。
ＤＧＬＡ産生に関するヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）Ｙ４０３６Ｕ株およびＹ４０３６Ｕ（ΔＰｅｘ１６）株の評価
総脂質画分中および総脂質含量細胞中のＰＵＦＡ％に対するＰｅｘ１６ノックアウトの影響を評価するために、比較できる油性条件下でＹ４０３６ＵおよびＹ４０３６Ｕ（Δｐｅｘ１６）株を生育させた。より具体的には染色体中のランダム部位に組み込まれたＰｅｘ１６ノックアウト断片を有するＹ４０３６Ｕ−１７、Ｙ４０３６Ｕ−１９、およびＹ４０３６Ｕ−３３株はＰｅｘ１６野性型（すなわちＹ４０３６Ｕ）と見なされ、ＲＨＹ２５〜ＲＨＹ３４株はＰｅｘ１６変異株（すなわちＹ４０３６Ｕ（Δｐｅｘ１６））であった。１２５ｍＬフラスコ内で、９０ｍｇ／ＬＬ−ロイシンを含有する２５ｍＬのＭＭ中で各株の培養を開始ＯＤ600約０．１で４８時間生育させた。５０ｍＬの円錐管内で４３００ｒｐｍで５分間遠心分離して、細胞を収集した。上清を廃棄して細胞を２５ｍＬのＨＧＭに再懸濁し、新しい１２５ｍＬフラスコに移した。細胞を３０℃でさらに１２０時間通気培養した。
各株の脂肪酸組成（すなわちＬＡ（１８：２）、ＡＬＡ、ＥＤＡ、およびＤＧＬＡ）を下の表１３に示す。脂肪酸組成は総脂肪酸の重量％として表される。Ｙ４０３６ＵおよびＹ４０３６Ｕ（Δｐｅｘ１６）株の平均脂肪酸組成は、灰色で強調表示され「Ａｖｅ．」で示される。試験されたいずれの株もＭＭ＋Ｌ−ロイシン培地中には十分な細胞集団を提供せず、したがって総脂質含量は分析しなかった。
Figure 0005658034
表１３の結果は、Ｙ４０３６Ｕ（Δｐｅｘ１６）中の染色体のＰｅｘ１６遺伝子ノックアウトが、天然Ｐｅｘ１６ｐがノックアウトされていないＹ４０３６Ｕ株中のＤＧＬＡ％ＴＦＡと比較して、ＤＧＬＡ％ＴＦＡをおよそ８５％増大することを示した。しかしＹ４０３６Ｕ（Δｐｅｘ１６）はまた、ＬＡ（１８：２）蓄積に約４０％の減少も有した。
したがって表１３中の結果は、親株Ｙ４０３６と比較して、Ｙ４０３６（ΔＰｅｘ１６）株がより高い平均ＤＧＬＡ％ＴＦＡ（４３．４％対２３．４％）を有したことを示した。さらにＹ４０３６Ｕ（Δｐｅｘ１６）株は、総ＰＵＦＡに対してＤＧＬＡの量に１．６５倍の増大（６２．８％のＰＵＦＡ［％ＴＦＡとして］対３８．１％のＰＵＦＡ［％ＴＦＡとして］）を有し、総ＰＵＦＡに対してＣ２０ ＰＵＦＡ量に１．３倍の増大（７１％のＰＵＦＡ［％ＴＦＡとして］対５４．８％のＰＵＦＡ［％ＴＦＡとして］）を有した。
実施例１０
総脂質の約５３．２％のＥＰＡを生成するためのＹ４３０５株の作成
Ｕｒａ−表現型を有するＹ．リポリティカ（Ｙ．ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）Ｙ４３０５Ｕ株を後述の実施例１１において宿主として使用した。Ｙ４３０５株（Ｙ４３０５Ｕの親株であるＵｒａ＋株）はＹ．リポリティカ（Ｙ．ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）ＡＴＣＣ＃２０３６２から誘導され、Δ９エロンガーゼ／Δ８デサチュラーゼ経路の発現を通じて総脂質に対して約５３．２％のＥＰＡを産生できる。
Ｙ４３０５Ｕ株の開発は、Ｙ２２２４株、Ｙ４００１株、Ｙ４００１Ｕ株、Ｙ４０３６株、Ｙ４０３６Ｕ株、Ｙ４０７０株、およびＹ４０８６株（前出、実施例１）の構築を必要とした。Ｙ４３０５Ｕ株のさらなる開発は、Ｙ４０８６Ｕ１株、Ｙ４１２８株、およびＹ４１２８Ｕ３株（前出、実施例２）の構築を必要とした。引き続いてＹ４３０５Ｕ株の開発（図１０に略図で示す）は、Ｙ４２１７株（４２％のＥＰＡを産生する）、Ｙ４２１７Ｕ２株（Ｕｒａ−）、Ｙ４２５９株（４６．５％のＥＰＡを産生する）、Ｙ４２５９Ｕ２株（Ｕｒａ−）、およびＹ４３０５株（５３．２％のＥＰＡを産生する）の構築を必要とした。
Ｙ４１２８Ｕ３株の後に開発されたＥＰＡ産生株の形質転換および選択に関する詳細についてはここに詳しく記載しないが、Ｙ４２１７株、Ｙ４２１７Ｕ２株、Ｙ４２５９株、Ｙ４２５９Ｕ２株、Ｙ４３０５株、およびＹ４３０５Ｕ株の単離のために使用される方法は、実施例１および２に記載されている通りである。
簡単に述べると、コンストラクトｐＺＫＬ２−５Ｕ８９ＧＣ（図８Ｂ、配列番号５５、国際公開第２００８／０７３３６７号パンフレットの表２４に記載されている）を作成し、１つのΔ９エロンガーゼ遺伝子（すなわちＥｇＤ９ｅＳ）、１つのΔ８デサチュラーゼ遺伝子（すなわちＥｇＤ８Ｍ）、１つのΔ５デサチュラーゼ遺伝子（すなわちＥｇＤ５Ｓ）、および１つのヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）ジアシルグリセロールコリンリン酸転移酵素（ＣＰＴ１）遺伝子をＹ４１２８Ｕ３株のＬｉｐ２遺伝子座（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＡＪ０１２６３２）に組み込み、それによってより高レベルのＥＰＡ産生を可能にした。Ｙ４２１５、Ｙ４２１６、Ｙ４２１７、Ｙ４２１８、Ｙ４２１９、およびＹ４２２０と称される６つの株は、それぞれ総脂質の約４１．１％、４１．８％、４１．７％、４１．１％、４１％、および４１．１％のＥＰＡを産生した。
Ｕｒａ３遺伝子を標的とするキメラＥＸＰ１：：ＭＥ３Ｓ：：Ｐｅｘ２０遺伝子を含んでなるコンストラクトｐＺＫＵＥ３Ｓ（図５Ａ、配列番号３１、国際公開第２００８／０７３３６７号パンフレットの表２２に記載されている）を通じて、Ｙ４２１７株中のＵｒａ３遺伝子を中断することで、Ｙ４２１７Ｕ１株およびＹ４２１７Ｕ２を作り出した。コンストラクトｐＺＫＬ１−２ＳＰ９８Ｃ（図８Ａ、配列番号５４、国際公開第２００８／０７３３６７号パンフレットの表２３に記載されている）を利用して、１つのΔ９エロンガーゼ遺伝子（すなわちＥｇＤ９ｅＳ）、１つのΔ８デサチュラーゼ遺伝子（すなわちＥｇＤ８Ｍ）、１つのΔ１２デサチュラーゼ遺伝子（すなわちＦｍＤ１２Ｓ）、および１つのヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）ＣＰＴ１遺伝子をＹ４２１７Ｕ２株のＬｉｐ１遺伝子座（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号Ｚ５００２０）に組み込み、それによってそれぞれ総脂質の約４６．５％、４４．５％、４４．５％、４４．８％、４４．５％、および４４．３％のＥＰＡを産生する、Ｙ４２５９、Ｙ４２６０、Ｙ４２６１、Ｙ４２６２、Ｙ４２６３、およびＹ４２６４株の単離をもたらした。
次にＵｒａ３変異体遺伝子をＹ４２５９株のＵｒａ３遺伝子に組み込むコンストラクトｐＺＫＵＭ（図１１Ａ、配列番号７０、国際公開第２００８／０７３３６７号パンフレットの表３３に記載されている）での形質転換を通じて、Ｕｒａ−誘導体（すなわちＹ４２５９Ｕ２株）を作り出し、それによってＹ４２５９Ｕ１、Ｙ４２５９Ｕ２、およびＹ４２５９Ｕ３株（集合的にＹ４２５９Ｕ）の単離をそれぞれもたらした（それぞれ総脂質の３１．４％、３１％および３１．３％のＥＰＡを産生する）。
最後にコンストラクトｐＺＫＤ２−５Ｕ８９Ａ２（図１１Ｂ、配列番号７１）を作成して、１つのΔ９エロンガーゼ遺伝子、１つのΔ５デサチュラーゼ遺伝子、１つのΔ８デサチュラーゼ遺伝子、および１つのΔ１２デサチュラーゼ遺伝子をＹ４２５９Ｕ２株のジアシルグリセロールアシル基転移酵素（ＤＧＡＴ２）遺伝子座に組み込み、それによってＥＰＡ産生を増大できるようにした。ｐＺＫＤ２−５Ｕ８９Ａ２プラスミドは、次の構成要素を含有した。
Figure 0005658034
ｐＺＫＤ２−５Ｕ８９Ａ２プラスミドをＡｓｃＩ／ＳｐｈＩで消化し、次に一般方法に従ってＹ４２５９Ｕ２株の形質転換のために使用した。形質転換された細胞をＭＭプレート上に播種し、プレートを３０℃で３〜４日間保った。単一コロニーをＭＭプレート上に再度画線塗抹して、得られたコロニーを使用して液体ＭＭに接種した。液体培養を２５０ｒｐｍ／分で２日間３０℃で振盪した。細胞を遠心分離によって収集し、ＨＧＭに再懸濁して次に２５０ｒｐｍ／分で５日間振盪した。細胞を遠心分離によって収集し、脂質を抽出した。ＦＡＭＥをエステル交換によって調製し、引き続いてＨｅｗｌｅｔｔ−Ｐａｃｋａｒｄ ６８９０ ＧＣで分析した。
ＧＣ分析は、選択された９６株のほとんどが、総脂質の４０〜４６％のＥＰＡを産生したことを示した。Ｙ４３０５、Ｙ４３０６、Ｙ４３０７、およびＹ４３０８と称される４株はそれぞれ総脂質の約５３．２％、４６．４％、４６．８％、および４７．８％のＥＰＡを産生した。Ｙ４３０５の完全な脂質プロフィールは次のとおりである。１６：０（２．８％）、１６：１（０．７％）、１８：０（１．３％）、１８：１（４．９％）、１８：２（１７．６％）、ＡＬＡ（２．３％）、ＥＤＡ（３．４％）、ＤＧＬＡ（２．０％）、ＡＲＡ（０．６％）、ＥＴＡ（１．７％）、およびＥＰＡ（５３．２％）。乾燥細胞重量総脂質％は２７．５であった。
野性型ヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）ＡＴＣＣ＃２０３６２に対してＹ４３０５株の最終遺伝子型は、ＳＣＰ２−（ＹＡＬＩ０Ｅ０１２９８ｇ）、ＹＡＬＩ０Ｃ１８７１１ｇ−、Ｐｅｘ１０−、ＹＡＬＩ０Ｆ２４１６７ｇ−、ｕｎｋｎｏｗｎ １−、ｕｎｋｎｏｗｎ ３−、ｕｎｋｎｏｗｎ ８−、ＧＰＤ：：ＦｍＤ１２：：Ｐｅｘ２０、ＹＡＴ１：：ＦｍＤ１２：：ＯＣＴ、ＧＰＭ／ＦＢＡＩＮ：：ＦｍＤ１２Ｓ：：ＯＣＴ、ＥＸＰ１：：ＦｍＤ１２Ｓ：：Ａｃｏ、ＹＡＴ１：：ＦｍＤ１２Ｓ：：Ｌｉｐ２、ＹＡＴ１：：ＭＥ３Ｓ：：Ｐｅｘ１６、ＥＸＰ１：：ＭＥ３Ｓ：：Ｐｅｘ２０（３コピー）、ＧＰＡＴ：：ＥｇＤ９ｅ：：Ｌｉｐ２、ＥＸＰ１：：ＥｇＤ９ｅＳ：：Ｌｉｐ１、ＦＢＡＩＮｍ：：ＥｇＤ９ｅＳ：：Ｌｉｐ２、ＦＢＡ：：ＥｇＤ９ｅＳ：：Ｐｅｘ２０、ＧＰＤ：：ＥｇＤ９ｅＳ：：Ｌｉｐ２、ＹＡＴ１：：ＥｇＤ９ｅＳ：：Ｌｉｐ２、ＹＡＴ１：：Ｅ３８９Ｄ９ｅＳ：：ＯＣＴ、ＦＢＡＩＮｍ：：ＥｇＤ８Ｍ：：Ｐｅｘ２０、ＦＢＡＩＮ：：ＥｇＤ８Ｍ：：Ｌｉｐ１（２コピー）、ＥＸＰ１：：ＥｇＤ８Ｍ：：Ｐｅｘ１６、ＧＰＤＩＮ：：ＥｇＤ８Ｍ：：Ｌｉｐ１、ＹＡＴ１：：ＥｇＤ８Ｍ：：Ａｃｏ、ＦＢＡＩＮ：：ＥｇＤ５：：Ａｃｏ、ＥＸＰ１：：ＥｇＤ５Ｓ：：Ｐｅｘ２０、ＹＡＴ１：：ＥｇＤ５Ｓ：：Ａｃｏ、ＥＸＰ１：：ＥｇＤ５Ｓ：：ＡＣＯ、ＹＡＴ１：：ＲＤ５Ｓ：：ＯＣＴ、ＹＡＴ１：：ＰａＤ１７Ｓ：：Ｌｉｐ１、ＥＸＰ１：：ＰａＤ１７：：Ｐｅｘ１６、ＦＢＡＩＮｍ：：ＰａＤ１７：：Ａｃｏ、ＹＡＴ１：：ＹｌＣＰＴ１：：ＡＣＯ、ＧＰＤ：：ＹｌＣＰＴ１：：ＡＣＯであった。
Ｙ４３０５株中のＵｒａ３遺伝子を中断するために、コンストラクトｐＺＫＵＭ（図１１Ａ、配列番号７０、国際公開第２００８／０７３３６７号パンフレットの表３３に記載されている）を使用して、Ｕｒａ３変異体遺伝子をＹ４３０５株のＵｒａ３遺伝子に組み込んだ。ＭＭ＋５−ＦＯＡプレート上に生育した合計８つの形質転換体を拾って、ＭＭプレートおよびＭＭ＋５−ＦＯＡプレート上に別々に再度画線塗抹した。８株の全てがＵｒａ−表現型を有した（すなわち細胞はＭＭ＋５−ＦＯＡプレート上で生育できたが、ＭＭプレート上では生育できなかった）。細胞をＭＭ＋５−ＦＯＡプレートからはぎ取って、脂質を抽出した。ＦＡＭＥをエステル交換によって調製し、引き続いてＨｅｗｌｅｔｔ−Ｐａｃｋａｒｄ ６８９０ ＧＣで分析した。
ＧＣ分析は、ＭＭ＋５−ＦＯＡプレート上に生育したｐＺＫＵＭ形質転換体＃１、＃６、および＃７の中に、総脂質の３７．６％、３７．３％、および３６．５％のＥＰＡの存在を示した。これらの３つの株をそれぞれＹ４３０５Ｕ１、Ｙ４３０５Ｕ２、およびＹ４３０５Ｕ３株（集合的にＹ４３０５Ｕ）と称する。実施例１１中における明確さのために述べると、Ｙ４３０５Ｕ株はＹ４３０５Ｕ（Δｐｅｘ１０）株と称される。
実施例１１
ヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）Ｙ４３０５Ｕ（Δｐｅｘ１０）株中のＰｅｘ１６の染色体欠失は蓄積ＥＰＡ％をさらに増大させる（二重Ｐｅｘ１０−Ｐｅｘ１６ノックアウト）
本実施例は、ヤロウィア（Ｙａｒｒｏｗｉａ）Ｙ４３０５Ｕ（Δｐｅｘ１０）株（実施例１０）中の染色体Ｐｅｘ１６をノックアウトし、それによってＰｅｘ１０−Ｐｅｘ１６二重変異体をもたらすためのコンストラクトｐＹＲＨ１３（図９Ｂ、配列番号５９）の使用について述べる。総油およびＥＰＡレベルに対するＰｅｘ１０−Ｐｅｘ１６二重ノックアウトの影響を判定して比較した。具体的にはＹ４３０５Ｕ（Δｐｅｘ１０）（Δｐｅｘ１６）株中のＰｅｘ１０−Ｐｅｘ１６二重変異の影響は、単一変異体（すなわちＹ４３０５Ｕ（Δｐｅｘ１０）株）と比較して、細胞中のＥＰＡ量（ＥＰＡ％ＴＦＡおよびＥＰＡ％ＤＣＷ）の増大をもたらした。
ヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）ノックアウトＹ４３０５Ｕ（Δｐｅｘ１０）（Δｐｅｘ１６）株の作成
標準プロトコルを使用して、ヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）Ｙ４３０５Ｕ（Δｐｅｘ１０）株（実施例１０）をＰｅｘ１６ノックアウトコンストラクトｐＹＲＨ１３（実施例９、配列番号５９）の精製された６．０ｋＢのＡｓｃＩ／ＳｐｈＩ断片で形質転換した。Ｐｅｘ１６欠失を有する細胞のスクリーニングおよび同定は、実施例９に記載されているようにコロニーＰＣＲによって実施した。
スクリーンした９３個のコロニーの内、８８個は染色体中のランダム部位に組み込まれたＰｅｘ１６ノックアウト断片を有し、したがってΔｐｅｘ１６変異体ではなかった（しかしｐＹＲＨ１３の存在のために細胞はＵｒａ−プレート上で生育できる）。Ｙ４３０５Ｕ−２２およびＹ４３０５Ｕ−２５と称するこれらのランダム組み込み体の２つを脂質生成実験（後述）において対照として使用した。
スクリーンした残りの５個のコロニー（すなわち合計は９３個）は、Ｐｅｘ１６ノックアウトを含有した。Ｙ４３０５Ｕ株バックグラウンド内のこれらの５つのΔｐｅｘ１６変異体をＲＨＹ２０、ＲＨＹ２１、ＲＨＹ２２、ＲＨＹ２３、およびＲＨＹ２４と称した。ＹｌＰｅｘ１６ノックアウトのさらなる確認は、実施例９に記載されているように定量的リアルタイムＰＣＲによって実施した。
ＥＰＡ産生に関するヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）Ｙ４３０５Ｕ（ΔＰｅｘ１０）株およびＹ４３０５Ｕ（ΔＰｅｘ１０）（Δｐｅｘ１６）株の評価
総脂質画分中および総脂質含量細胞の中のＰＵＦＡ％に対する複数Ｐｅｘ遺伝子中の変異の影響を評価するために、Ｙ４３０５Ｕ（Δｐｅｘ１０）株およびＹ４３０５Ｕ（Δｐｅｘ１０）（Δｐｅｘ１６）株を比較できる油性条件下で生育させた。より具体的には染色体中のランダム部位に組み込まれたＰｅｘ１６ノックアウト断片を有するＹ４３０５Ｕ−２２およびＹ４３０５Ｕ−２５株はＰｅｘ１６野性型、Ｐｅｘ１０ノックアウト（すなわちＹ４３０５Ｕ（Δｐｅｘ１０））と見なされ、ＲＨＹ２２、ＲＨＹ２３、およびＲＨＹ２４株は二重ノックアウト変異体（すなわちＹ４３０５Ｕ（Δｐｅｘ１０）（Δｐｅｘ１６））株であった。各株の培養は、比較できる油性条件下で二連で生育させた。
具体的には１２５ｍＬフラスコ内で、２５ｍＬの合成デキストロース培地（ＳＤ）中で培養を開始ＯＤ600約０．１で４８時間生育させた。５０ｍＬの円錐管内で４３００ｒｐｍで５分間遠心分離して、細胞を収集した。上清を廃棄して細胞を２５ｍＬのＨＧＭに再懸濁し、新しい１２５ｍＬフラスコに移した。細胞を３０℃でさらに１２０時間通気培養した。
乾燥細胞重量（ＤＣＷ）を測定するために、５ｍＬのＨＧＭ生育培養からの細胞を処理した。培養細胞を４３００ｒｐｍで５分間遠心分離した。ペレットを１０ｍＬの滅菌水を使用して再懸濁し、同一条件下で２回目の遠心分離をした。次にペレットを１ｍＬの無菌Ｈ2０（３倍）を使用して再懸濁し、あらかじめ秤量したアルミ皿に移した。細胞懸濁液を真空オーブン内において８０℃で一晩乾燥させた。細胞重量を測定した。
総脂質含量を測定するために、１ｍＬのＨＧＭ培養細胞を１３，０００ｒｐｍで１分間の遠心分離によって収集して総脂質を抽出し、エステル交換によってＦＡＭＥを調製し、び引き続いてＨｅｗｌｅｔｔ−Ｐａｃｋａｒｄ ６８９０ ＧＣで分析した（一般方法）。
各株の脂肪酸組成（すなわち１６：０（パルミチン酸）、１６：１（パルミトレイン酸）、１８：０、１８：１（オレイン酸）、１８：２（ＬＡ）、１８：３（ＡＬＡ）、ＥＤＡ、ＤＧＬＡ、ＡＲＡ、ＥＴｒＡ、ＥＴＡ、およびＥＰＡ）（総脂肪酸（ＴＦＡ）の重量％として表される）、ならびにＤＣＷ（ｇ／Ｌ）および総脂質含量（ＴＦＡ％ＤＣＷ）を下の表１５に示す。Ｙ４３０５Ｕ（Δｐｅｘ１０）株およびＹ４３０５Ｕ（Δｐｅｘ１０）（Δｐｅｘ１６）株の平均脂肪酸組成は灰色で強調表示され、「Ａｖｅ」で示される。
Figure 0005658034
表１５の結果は、Ｙ４３０５Ｕ（Δｐｅｘ１０）（Δｐｅｘ１６）中の染色体Ｐｅｘ１６遺伝子のノックアウトが、天然Ｐｅｘ１６ｐがノックアウトされていないＹ４３０５Ｕ（Δｐｅｘ１０）株中のＥＰＡ％ＴＦＡと比較して、ＥＰＡ％ＴＦＡをおよそ８％増大することを示した。さらに単一変異株と比較して、二重変異体中ではＥＰＡ％ＤＣＷもまた増大した一方で、ＴＦＡ％ＤＣＷは変化なしであった。
したがって表１５の結果は、対照Ｙ４３０５（ΔＰｅｘ１０）株と比較して、Ｙ４３０５（ΔＰｅｘ１０、ΔＰｅｘ１６）株が平均してより高いＥＰＡ％ＴＦＡ（４８．３％対４４．７％）およびより高いＥＰＡ％ＤＣＷ（１４．５７％対１３．２３％）を有したことを示す。Ｙ４３０５（ΔＰｅｘ１０、ΔＰｅｘ１６）株は、Ｙ４３０５（ΔＰｅｘ１０）株と比較して、総ＰＵＦＡに対してＥＰＡ量に１．０５倍のみの増大を有した（６１％のＰＵＦＡ［％ＴＦＡとして］対５８．３％のＰＵＦＡ［％ＴＦＡとして］）一方、総ＰＵＦＡに対するＣ２０ ＰＵＦＡ量の増大は事実上同一であった（７３％のＰＵＦＡ［％ＴＦＡとして］対７２％のＰＵＦＡ［％ＴＦＡとして］）。
実施例１２
ヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）Ｙ４０３６Ｕ株中のＰｅｘ３の染色体欠失は蓄積ＤＧＬＡ％を増大させる
本例は、Ｕｒａ−、ＤＧＬＡ産生ヤロウィア（Ｙａｒｒｏｗｉａ）Ｙ４０３６Ｕ株（実施例１）中の染色体Ｐｅｘ３遺伝子（配列番号３）をノックアウトするためのコンストラクトｐＹ１５７（図１２Ｂ、配列番号８２）の使用について述べる。Ｐｅｘ３ノックアウトコンストラクトによるＹ．リポリティカ（Ｙ．ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）Ｙ４０３６Ｕ株の形質転換は、Ｙ４０３６（Δｐｅｘ３）株の創出をもたらした。ＤＧＬＡレベルに対するＰｅｘ３ノックアウトの影響を判定して、対照Ｙ４０３６株（Ｙ４０３６Ｕ株の親株であるＵｒａ＋株）と比較した。具体的にはＰｅｘ３のノックアウトは、対照と比較して総脂肪酸の百分率としてのＤＧＬＡを増大し、ＤＧＬＡ％ＤＣＷをほぼ３倍改善した。
コンストラクトｐＹ１５７
プラスミドｐＹ８７（図１２Ａ）は、表１６で後述するように、ヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）ジアシルグリセロールアシル基転移酵素（ＤＧＡＴ２）遺伝子をノックアウトするためのカセットを含有した。
Figure 0005658034
プラスミドｐＹ１５７はプラスミドｐＹ８７から誘導された。具体的にはヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）Ｐｅｘ３遺伝子の７０４ｂｐの５’プロモータ領域がｐＹ８７のＳｐｈＩ／ＰａｃＩ断片を置換し、ヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）Ｐｅｘ３遺伝子の４４８ｂｐの３’ターミネーター領域がｐＹ８７のＢｇｌＩＩ／ＡｓｃＩ断片を置換して、ｐＹ１５７（配列番号８２、図１２Ｂ）を生成した。
ヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）ノックアウトＹ４０３６（ΔＰｅｘ３）株の作成
標準プロトコルを使用して、ヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）Ｙ４０３６Ｕ株（実施例１）をＰｅｘ３ノックアウトコンストラクトｐＹ１５７の精製された３６４８ｂｐのＡｓｃＩ／ＳｐｈＩ断片（前出）で形質転換した。
Ｐｅｘ３欠失を有する細胞についてスクリーンするために、Ｔａｑポリメラーゼ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ（Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ））およびＰＣＲプライマーＵＰ７６８（配列番号８５）およびＬＰ７６９（配列番号８６）を使用してコロニーＰＣＲを実施した。このプライマーのセットは未変性Ｐｅｘ３遺伝子の２０３９ｂｐの野性型バンドを増幅するよう、およびＰｅｘ３遺伝子が標的ノックアウトによって中断された場合は３７１９ｂｐのノックアウト特異的バンドを増幅するようにデザインされた。
より具体的には、ＭａｓｔｅｒＡｍｐ Ｔａｑ ｋｉｔ（Ｅｐｉｃｅｎｔｒｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）、カタログ番号８２２５０）および製造業者の使用説明書を使用して、以下を含んでなる２５μｌの反応液中でコロニーＰＣＲを実施した。２．５μｌの１０×ＭａｓｔｅｒＡｍｐ Ｔａｑ緩衝液、２．０μｌの２５ｍＭ ＭｇＣｌ2、７．５μｌの１０×ＭａｓｔｅｒＡｍｐ Ｅｎｈａｎｃｅｒ、２．５μｌの２．５ｍＭ ｄＮＴＰ（タカラバイオ株式会社（滋賀県大津市））、１．０μｌの１０μＭアッパープライマー、１．０μｌの１０μＭロウアープライマー、０．２５μｌのＭａｓｔｅｒＡｍｐ Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼ、および１９．７５μｌの水。増幅は次のように実施した。９５℃で５分間の最初の変性、次に９５℃で３０秒間の変性、５６℃で６０秒間のアニーリング、および７２℃で４分間の延長を４０サイクル。最終延長サイクルは７２℃で１０分間実施して、４℃での反応終結がそれに続いた。
スクリーンされた４８個のコロニーの内４６個は、野性型（すなわち非中断）Ｐｅｘ３遺伝子から予期される２０３９ｂｐのバンドを有し、したがってΔｐｅｘ３変異体ではなかった。残りの２つのコロニーは、２０３９ｂｐの淡いバンドのみを示し、それらがバックグラウンド中にいくらかの汚染非形質転換細胞が存在するΔｐｅｘ３変異体であることが示唆された。これは２つの推定上のノックアウトコロニーを選択プレート上に画線塗抹して、単一コロニーを単離することによって確認された。次に推定上の各ノックアウト株からの３個の単一コロニーからゲノムＤＮＡを単離して、同一プライマーペア、すなわちＵＰ ７６８およびＬＰ ７６９（配列番号８５および８６）によってスクリーニングした。この方法はコロニーＰＣＲより高感度であると見なされた。双方の一次形質転換体からの３つの単一コロニーは全て２０３９ｂｐの野性型バンドを欠いており、代わりに３７１９ｂｐのノックアウト特異的バンドを有した。Ｙ４０３６Ｕ株バックグラウンド内の２つのΔｐｅｘ３変異体をＬ１３４およびＬ１３５と称した。
ＤＧＬＡ産生に関するヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）Ｙ４０３６株およびＹ４０３６（ΔＰｅｘ３）株の評価
細胞中の総脂質画分中および総脂質含量のＰＵＦＡ％に対するＰｅｘ３ノックアウトの影響を評価するために、Ｙ４０３６株およびＹ４０３６（Δｐｅｘ３）株を比較できる油性条件下で生育させた。Ｙ４０３６、Ｌ１３４（すなわちＹ４０３６（Δｐｅｘ３））、およびＬ１３５（すなわちＹ４０３６（Δｐｅｘ３））株を２５ｍＬのＣＳＭ−Ｕｒａ中に接種して、振盪機内で３０℃で一晩生育させた。前培養を０．４の最終ＯＤ600で、新鮮な２５ｍＬのＣＳＭ−Ｕｒａフラスコ内へ等分した。培養を振盪機内で３０℃で生育させた。４８時間後、細胞（ほとんど生育しなかった）を遠沈して新鮮な２５ｍＬのＣＳＭ−Ｕｒａに再懸濁し、生育を７２時間継続させた。細胞を遠沈して２５ｍＬのＨＧＭに再懸濁し、上記のように生育を７２時間継続させた。細胞を遠心分離により収集して蒸留水で１回洗浄し、２５ｍＬの水に再懸濁して２０．５ｍＬの最終容積を得た。脂質含量のためにアリコート（１．５ｍＬ）を使用し、総脂質の抽出、塩基性エステル交換によるＦＡＭＥの調製、およびＨｅｗｌｅｔｔ−Ｐａｃｋａｒｄ ６８９０ ＧＣによる分析（一般方法）がそれに続いた。残りのアリコートを乾燥させ、実施例１１に記載されているようにして乾燥細胞重量（ＤＣＷ）を測定した。
各株の脂肪酸組成（すなわち１６：０（パルミチン酸）、１６：１（パルミトレイン酸）、１８：０、１８：１（オレイン酸）、１８：２（ＬＡ）、ＥＤＡ、およびＤＧＬＡ）（総脂肪酸（ＴＦＡ）の重量％として表される）ならびに総脂質含量（ＴＦＡ％ＤＣＷ）を下の表１７に示す。変換効率（「ＣＥ」）は、次式に従って測定される。
（［生成物］／［基質＋生成物］）*１００
式中、「生成物」は、即時生成物および経路中のそれから誘導される全生成物を含む。したがってΔ１２デサチュラーゼ変換効率（Δ１２％ＣＥ）は、次のように計算される。
（［ＬＡ＋ＥＤＡ＋ＤＧＬＡ］／［１８：１＋ＬＡ＋ＥＤＡ＋ＤＧＬＡ］）*１００
Δ９エロンガーゼ変換効率（Δ９ｅｌｏ％ＣＥ）は、次のように計算される。
（［ＥＤＡ＋ＤＧＬＡ］／［ＬＡ＋ＥＤＡ＋ＤＧＬＡ］）*１００
Δ８デサチュラーゼ変換効率（Δ８％ＣＥ）は、次のように計算される。
（［ＤＧＬＡ］／［ＥＤＡ＋ＤＧＬＡ］）*１００
Ｙ４０３６、Ｌ１３４、およびＬ１３５株の平均脂肪酸組成が灰色で強調表示されて「Ａｖｅ」で示される一方、「Ｓ．Ｄ．」は標準偏差を示す。予期されたようにΔｐｅｘ３株は、オレイン酸を唯一の炭素源とするプレート上では生育しなかった。
Figure 0005658034
表１７の結果は、Ｙ４０３６（Δｐｅｘ３）中の染色体Ｐｅｘ３遺伝子のノックアウトが、天然Ｐｅｘ３ｐがノックアウトされていないＹ４０３６株中のＤＧＬＡ％ＴＦＡと比較して、ＤＧＬＡ％ＴＦＡをおよそ１４２％増大させることを示した。具体的にはＰｅｘ３ノックアウトはＤＧＬＡレベルをＹ４０３６中の約１９％から、Ｙ４０３６（Δｐｅｘ３）株、Ｌ１３４株およびＬ１３５株中の４６％に増大させた。さらにΔ９エロンガーゼ％変換効率は、Ｙ４０３６株中の約４８％からＹ４０３６（Δｐｅｘ３）株、Ｌ１３４株およびＬ１３５株中では８３％に増大し、ＴＦＡ％ＤＣＷは４．７％からＬ１３４株およびＬ１３５株中では６％に増大した。ＬＡ％ＴＦＡは３０％から１２％に減少した。Ｐｅｘ３欠失は脂肪酸の流入を実際増大させ、したがってΔ９延長のための基質利用性を増大させた。
したがって表１７の結果は、Ｙ４０３６親株と比較して、Ｙ４０３６（ΔＰｅｘ３）株が、平均してより高い脂質含量（ＴＦＡ％ＤＣＷ）（約６．０％対４．７％）、より高いＤＧＬＡ％ＴＦＡ（４６％対１９％）、およびより高いＤＧＬＡ％ＤＣＷ（約２．８％対０．９％）を有したことを示す。さらにＹ４０３６（ΔＰｅｘ３）株は、総ＰＵＦＡに対するＤＧＬＡの量に２倍の増大（６７．７％のＰＵＦＡ［％ＴＦＡとして］対３３．３％のＰＵＦＡ［％ＴＦＡとして］）を有し、総ＰＵＦＡに対するＣ２０ ＰＵＦＡ量に１．７倍の増大（８２％のＰＵＦＡ［％ＴＦＡとして］対４７％のＰＵＦＡ［％ＴＦＡとして］）を有した。
改善されたＤＧＬＡ生産性は、ＥＰＡ産生について改変されたヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）株（例えば実施例１０に記載されているようなＹ．リポリティカ（Ｙ．ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）Ｙ４３０５Ｕ株、およびその誘導体）中において、改善されたＥＰＡ生産性をもまたもたらすという仮説が立てられる。
以上、本発明を要約すると下記のとおりである。
１．総脂質含量、総脂質画分、および油画分を有する油性真核生物における総脂肪酸質量％に対して少なくとも１つの多価不飽和脂肪酸の質量％を増大させる方法であって、
ａ）１）機能性多価不飽和脂肪酸生合成経路をコードする遺伝子；および
２）ペルオキシソーム生合成因子タンパク質をコードする天然遺伝子の破壊；
を含む油性真核生物を備え、それによりＰＥＸ破壊生物を備えること：および
ｂ）ペルオキシソーム生合成因子タンパク質をコードする天然遺伝子が破壊されていない油性真核生物における総脂質画分中または油画分中の総脂肪酸の質量％に対して少なくとも１つの多価不飽和脂肪酸の質量％を比較した場合、総脂質画分中または油画分中の総脂肪酸の質量％に対して少なくとも１つの多価不飽和脂肪酸の質量％を増大させる条件下で、ＰＥＸ破壊生物を生育させること
を含む、上記方法。
２．油性真核生物の乾燥細胞質量に対して少なくとも１つの多価不飽和脂肪酸のパーセントを増大させる方法であって、
ａ）１）機能性多価不飽和脂肪酸生合成経路をコードする遺伝子；および
２）ペルオキシソーム生合成因子タンパク質をコードする天然遺伝子の破壊；
を含む油性真核生物を備え、それによりＰＥＸ破壊生物を備えること：および
ｂ）ペルオキシソーム生合成因子タンパク質をコードする天然遺伝子が破壊されていない油性真核生物における乾燥細胞質量に対して少なくとも１つの多価不飽和脂肪酸のパーセントと比較した場合、乾燥細胞質量に対して少なくとも１つの多価不飽和脂肪酸のパーセントを増大させる条件下で、ＰＥＸ破壊生物を生育させること
を含む、上記方法。
３．ペルオキシソーム生合成因子タンパク質をコードする天然遺伝子が破壊されていない油性真核生物における総脂質画分中または油画分中の総脂肪酸の質量％に対して多価不飽和脂肪酸の質量％を比較した場合、総脂肪酸の質量％に対して少なくとも１つの多価不飽和脂肪酸質量％の増大が少なくとも１．３である、上記１または２に記載の方法。
４．少なくとも１つの多価不飽和脂肪酸が、リノール酸、共役リノール酸、γ−リノレン酸、ジホモ−γ−リノレン酸、アラキドン酸、ドコサテトラエン酸、ω−６ドコサペンタエン酸、α−リノレン酸、ステアリドン酸、エイコサテトラエン酸、エイコサペンタエン酸、ω−３ドコサペンタエン酸、エイコサジエン酸、エイコサトリエン酸、ドコサヘキサエン酸、これらの水酸化またはエポキシ脂肪酸、Ｃ18多価不飽和脂肪酸、Ｃ20多価不飽和脂肪酸、およびＣ22多価不飽和脂肪酸からなる群から選択される、上記１または２に記載の方法。
５．少なくとも１つの多価不飽和脂肪酸が多価不飽和脂肪酸の組み合わせからなり、組み合わせの質量％が総脂肪酸の質量％に対して増大する、上記１に記載の方法。
６．多価不飽和脂肪酸の組み合わせが、リノール酸、共役リノール酸、γ−リノレン酸、ジホモ−γ−リノレン酸、アラキドン酸、ドコサテトラエン酸、ω−６ドコサペンタエン酸、α−リノレン酸、ステアリドン酸、エイコサテトラエン酸、エイコサペンタエン酸、ω−３ドコサペンタエン酸、エイコサジエン酸、エイコサトリエン酸、ドコサヘキサエン酸、これらの水酸化またはエポキシ脂肪酸、Ｃ20多価不飽和脂肪酸の組み合わせ、Ｃ20〜22多価不飽和脂肪酸の組み合わせ、およびＣ22多価不飽和脂肪酸の組み合わせからなる群から選択される、２つまたはそれ以上の多価不飽和脂肪酸の任意の組み合わせからなる、上記４に記載の方法。
７．ＰＥＸ破壊生物における総脂質含量が、ペルオキシソーム生合成因子タンパク質をコードする天然遺伝子が破壊されていない油性真核生物における総脂質含量と比較した場合、変化させられる、上記１または２に記載の方法。
８．ＰＥＸ破壊生物が、油性性質を有するヤロウィア属、カンジダ属、ロドトルラ属、ロドスポリジウム属、クリプトコッカス属、トリコスポロン属、リポミセス属、クサレケカビ属、スラウストキトリウム属、シゾキトリウム属、およびサッカロミセス属からなる群から選択される、上記１または２に記載の方法。
９．多価不飽和脂肪酸生合成経路が、Δ９デサチュラーゼ、Δ１２デサチュラーゼ、Δ６デサチュラーゼ、Δ５デサチュラーゼ、Δ１７デサチュラーゼ、Δ８デサチュラーゼ、Δ１５デサチュラーゼ、Δ４デサチュラーゼ、Ｃ14/16エロンガーゼ、Ｃ16/18エロンガーゼ、Ｃ18/20エロンガーゼ、Ｃ20/22エロンガーゼ、およびΔ９エロンガーゼからなる群から選択される酵素をコードする遺伝子を含む、上記１または２に記載の方法。
１０．ペルオキシソーム生合成因子タンパク質をコードする天然遺伝子の破壊が、タンパク質のＣ末端部分をコードする遺伝子の一部の欠失および遺伝子ノックアウトからなる群から選択される欠失を含んでなる、上記１または２に記載の方法。
１１．ペルオキシソーム生合成因子タンパク質が、Ｐｅｘ１ｐ、Ｐｅｘ２ｐ、Ｐｅｘ３ｐ、Ｐｅｘ３Ｂｐ、Ｐｅｘ４ｐ、Ｐｅｘ５ｐ、Ｐｅｘ５Ｂｐ、Ｐｅｘ５Ｃｐ、Ｐｅｘ５／２０ｐ、Ｐｅｘ６ｐ、Ｐｅｘ７ｐ、Ｐｅｘ８ｐ、Ｐｅｘ１０ｐ、Ｐｅｘ１２ｐ、Ｐｅｘ１３ｐ、Ｐｅｘ１４ｐ、Ｐｅｘ１５ｐ、Ｐｅｘ１６ｐ、Ｐｅｘ１７ｐ、Ｐｅｘ１４／１７ｐ、Ｐｅｘ１８ｐ、Ｐｅｘ１９ｐ、Ｐｅｘ２０ｐ、Ｐｅｘ２１ｐ、Ｐｅｘ２１Ｂｐ、Ｐｅｘ２２ｐ、Ｐｅｘ２２ｐ様、およびＰｅｘ２６ｐからなる群から選択される、上記１または２に記載の方法。
１２．ペルオキシソーム生合成因子は、破壊が遺伝子ノックアウト、またはタンパク質のＣ3ＨＣ4亜鉛リングフィンガーモチーフのＣ末端部分をコードする遺伝子の一部の欠失である、上記１１に記載の方法。
１３．総脂肪酸の質量％に対して少なくとも１つの多価不飽和脂肪酸の質量％の増大を有し、増大が上記１に記載の方法によって得られる、ＰＥＸ破壊生物における油画分または総脂質画分。
１４．上記１に記載の方法によって、総脂肪酸の質量％に対して質量％が増大している、ＰＥＸ破壊生物の少なくとも１つの多価不飽和脂肪酸の食品、飼料としての、または産業上の利用における使用。
１５．破壊が、Ｐｅｘ３ｐ、Ｐｅｘ１０ｐ、およびＰｅｘ１６ｐからなる群から選択される、ペルオキシソーム生合成因子タンパク質をコードする天然遺伝子中で起きる、ＰＥＸ破壊ヤロウィア・リポリティカ。

Claims (6)

  1. 油性ヤロウィアの総脂質含量を増大させる方法であって、
    ａ）１）デルタ−１５デサチュラーゼ、デルタ−６デサチュラーゼおよびデルタ−９エロンガーゼからなる群より選択される酵素をコードする少なくとも１つの遺伝子を含む、機能性多価不飽和脂肪酸生合成経路をコードする遺伝子；および
    ２）Ｐｅｘ３ｐであるペルオキシソーム生合成因子（ＰＥＸ）タンパク質をコードする天然遺伝子のダウンレギュレートまたは中断；
    を含む油性ヤロウィアを備え：および
    ｂ）ＰＥＸタンパク質をコードする天然遺伝子がダウンレギュレートまたは中断されていないヤロウィアの総脂質含量との比較で上記ヤロウィアの総脂質含量を増大させる条件下で上記ヤロウィアを生育させること
    を含む、上記方法。
  2. さらに、上記ヤロウィアの総脂肪酸において、少なくとも１つの多価不飽和脂肪酸の質量パーセントが増大し、多価不飽和脂肪酸が、ガンマ−リノレン酸、ジホモ−ガンマ−リノレン酸、アラキドン酸、ドコサテトラエン酸、オメガ−６ドコサペンタエン酸、アルファ−リノレン酸、ステアリドン酸、エイコサテトラエン酸、エイコサペンタエン酸、オメガ−３ドコサペンタエン酸、エイコサジエン酸、エイコサトリエン酸、ドコサヘキサエン酸、これらのヒドロキシル化またはエポキシ脂肪酸、Ｃ18多価不飽和脂肪酸、Ｃ20多価不飽和脂肪酸、およびＣ22多価不飽和脂肪酸、からなる群より選択される、請求項１に記載の方法。
  3. 上記ヤロウィアの総脂肪酸において、多価不飽和脂肪酸の組み合わせの質量パーセントが増大する、請求項２に記載の方法。
  4. 多価不飽和脂肪酸生合成経路をコードする遺伝子が、デルタ−９デサチュラーゼ、デルタ−１２デサチュラーゼ、デルタ−５デサチュラーゼ、デルタ−１７デサチュラーゼ、デルタ−８デサチュラーゼ、デルタ−４デサチュラーゼ、C14/16エロンガーゼ、C16/18エロンガーゼ、C18/20エロンガーゼおよびC20/22エロンガーゼからなる群より選択される酵素をコードする遺伝子をさらに含む、請求項１に記載の方法。
  5. 上記ヤロウィアがＰｅｘ３ｐをコードする遺伝子の中断を含み、中断がＰｅｘ３ｐをコードする遺伝子の遺伝子ノックアウトである、請求項１に記載の方法。
  6. 多価不飽和脂肪酸がエイコサペンタエン酸である、請求項２に記載の方法。
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