CN101883843B - 破坏过氧化物酶体生物合成因子蛋白(pex)以改变含油真核生物中多不饱和脂肪酸和总脂质含量 - Google Patents

破坏过氧化物酶体生物合成因子蛋白(pex)以改变含油真核生物中多不饱和脂肪酸和总脂质含量 Download PDF

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Abstract

通过改变过氧化物酶体生物合成因子(Pex)蛋白的活性，已经成功地找到在生产PUFA的含油真核生物中的总脂质级分和油级分中提高多不饱和脂肪酸(PUFA)的量的方法。在与不破坏天然Pex蛋白的亲本菌株比较时，在生产PUFA的含油真核生物菌种中破坏染色体Pex3基因、Pex10p基因或Pex16p基因导致在菌株的总脂质级分和油级分中的PUFA量提高，所述PUFA的量以总脂肪酸百分比和干细胞重量百分比形式表示。

Description

破坏过氧化物酶体生物合成因子蛋白(PEX)以改变含油真核生物中多不饱和脂肪酸和总脂质含量
本专利申请要求美国临时申请60/977,174和60/977,177的优先权，所述临时申请均提交于2007年10月3日，并且全文以引用方式并入本文中。
发明领域
本发明属于生物技术领域。更具体地讲，本发明涉及基于破坏过氧化物酶体生物合成因子(PEX)蛋白的、用于操纵真核生物的多不饱和脂肪酸(PUFA)组成和脂质含量的方法。
发明背景
已经有大量文献证明了与多不饱和脂肪酸[“PUFA”]，尤其是ω-3和ω-6PUFA相关的健康有益效果。为了寻找大规模制备ω-3和ω-6
PUFA的方法，研究者已经将他们的工作转向发现基因以及了解产生脂质和脂肪酸的编码的生物合成途径。
一个用于生产这些PUFA的研究成果已经将ω-3/ω-6PUFA生物合成途径导入了不会天然产生ω-3/ω-6PUFA的生物体中。一种已经被广泛使用的所述生物是非含油酵母，啤酒糖酵母(Saccharomycescerevisiae)。然而，并无初步结果证明有限产量的亚油酸[“LA”]、γ-亚麻酸[“GLA”]、α-亚麻酸[“ALA”]、十八碳四烯酸[“STA”]和/或二十碳五烯酸[“EPA”]适于商业开发。
其它用于大规模生产ω-3/ω-6PUFA的研究成果已经培育出了天然生产选定脂肪酸的微生物，例如异养硅藻小环藻属(Cyclotellasp.)和菱形藻属(Nitzschiasp.)、假单胞菌属(Pseudomonas)、交替单胞菌属(Alteromonas)或希瓦氏菌(Shewanella)、腐霉属(Pythium)的丝状真菌、或长被孢霉属(Mortierellaelongata)、M.exigua或M.hygrophila。
然而所有这些研究成果都不能够充分地改善油产量或控制所生产的油的组成的特性，因为发酵依赖微生物本身的天然能力。
共有的美国专利7,238,482描述了使用含油酵母解脂耶氏酵母作为生产宿主用于生产PUFA的用途。含油酵母被定义为是那些天然能够合成并积聚油的酵母，其中细胞干重一般大于25％。本领域已经描述了生产宿主的优化(参见例如国际申请公开WO2006/033723、美国专利申请公开2006-0094092、美国专利申请公开2006-0115881、和美国专利申请公开2006-0110806)。本文所述的重组菌株包含多种嵌合基因，所述基因表达多拷贝的异源去饱和酶、延伸酶和酰基转移酶，并且任选地包含多个天然去饱和酶和酰基转移酶敲除以能够合成并积聚PUFA。商业生产PUFA需要对宿主细胞进行进一步优化。
LinY.等人提出过氧化物酶体是脂质的分解代谢和合成代谢所必需的(PlantPhysiology，135：814-827(2004))。然而，该假说是以对拟南芥属突变体中的Pex16p同源物的研究为基础的，该突变体具有异常的过氧化物酶体生物合成以及脂肪酸合成(即，据报道ssel种子中生产的油比野生型减少了大约10-16％)。Binns，D.等人(J.CellBiol.，173(5)：719-731(2006))也提供了证明过氧化物酶体和脂质体在啤酒糖酵母中的密切协作的文献。但是以前尚未在生产PUFA的生物中进行过对Pex敲除的研究。
申请人已经通过在生产PUFA的生物体中破坏过氧化物酶体生物合成因子蛋白的非预知机制，解决了优化宿主细胞以用于PUFA商业生产的所述问题，所述机制导致在解脂耶氏酵母的重组PUFA生产菌株中提高PUFA量(以总脂肪酸百分比形式表示)的非预知结果。本文描述了在过氧化物酶体生物合成因子蛋白中存在破坏的新型菌株。
发明概述
本文所述的是提高在具有总脂质含量、总脂质级分和油级分的含油真核生物中至少一种多不饱和脂肪酸[“PUFA”]的重量％相对于总脂肪酸[“TFA”]的重量％的方法，所述方法包括：
a)提供含油真核生物，所述含油真核生物包含：
1)编码功能性多不饱和脂肪酸生物合成途径的基因；和
2)在编码过氧化物酶体生物合成因子蛋白的天然基因中的破坏，由此提供PEX破坏的生物，以及
b)使所述PEX破坏的生物在以下条件下生长：即，使得当与编码过氧化物酶体生物合成因子蛋白的天然基因未被破坏的含油真核生物中的总脂质级分或油级分中相对于总脂肪酸的重量百分比的至少一种多不饱和脂肪酸的重量百分比进行比较时，所述总脂质级分或油级分中至少一种多不饱和脂肪酸的重量百分比相对于总脂肪酸的重量百分比提高。
该提高方法也可通过实施相同步骤(a)和(b)，用于提高至少一种多不饱和脂肪酸[“PUFA”]相对于干细胞重量[“DCW”]的百分比。
在本文所述的一些方法中，PUFA重量％相对于TFA重量％提高了至少1.3倍。
在一些所述方法中，PEX破坏的生物体中的总脂质含量与天然PEX基因中无破坏的含油真核生物的总脂质含量相比可能提高或降低。
在这些方法的任何一种中，提高的PUFA可以是单个PUFA或多个PUFA的组合。在任一种情况下，提高的PUFA或提高的PUFA组合可以包括亚油酸、共轭亚油酸、γ-亚麻酸、二高-γ-亚麻酸、花生四烯酸、二十二碳四烯酸、ω-6二十二碳五烯酸、α-亚麻酸、十八碳四烯酸、二十碳四烯酸、二十碳五烯酸、ω-3二十二碳五烯酸、二十碳二烯酸、二十碳三烯酸、二十二碳六烯酸、这些脂肪酸的羟基化或环氧脂肪酸、C18多不饱和脂肪酸或这些脂肪酸的组合、C20多不饱和脂肪酸或这些脂肪酸的组合、C20-22多不饱和脂肪酸的组合和C22多不饱和脂肪酸或这些脂肪酸的组合。
在这些方法的任何一种中，PEX破坏的生物可以是以下生物的一员：耶氏酵母属(Yarrowia)、假丝酵母属(Candida)、红酵母属(Rhodotorula)、红冬孢酵母属(Rhodosporidium)、隐球酵母属(Cryptococcus)、丝孢酵母属(Trichosporon)、油脂酵母属(Lipomyces)、被孢霉属(Mortierella)、破囊壶菌属(Thraustochytrium)、裂殖壶菌属(Schizochytrium)、和糖酵母属(Saccharomyces)，上述生物都具有含油特性。并且，在任何一种所述方法中，PUFA生物合成途径包括编码以下酶的任何一种或它们的组合的基因：Δ9去饱和酶、Δ12去饱和酶、Δ6去饱和酶、Δ5去饱和酶、Δ17去饱和酶、Δ8去饱和酶、Δ15去饱和酶、Δ4去饱和酶、C14/16延伸酶、C16/18延伸酶、C18/20延伸酶、C20/22延伸酶和Δ9延伸酶。
破坏可发生在编码以下过氧化物酶体生物合成因子蛋白的PEX基因中，所述蛋白包括：Pex1p、Pex2p、Pex3p、Pex3Bp、Pex4p、Pex5p、Pex5Bp、Pex5Cp、Pex5/20p、Pex6p、Pex7p、Pex8p、Pex10p、Pex12p、Pex13p、Pex14p、Pex15p、Pex16p、Pex17p、Pex14/17p、Pex18p、Pex19p、Pex20p、Pex21p、Pex21Bp、Pex22p、Pex22p样和Pex26p。并且在这些方法的任何一种中，破坏可以是编码蛋白的C-末端部分的基因的一部分中的基因敲除或缺失。在这些方法的任何一种中，缺失发生在编码蛋白的C3HC4环状锌指基序的C-末端部分的基因部分。
本文也描述了PEX破坏的生物中的油级分或总脂质级分，通过如权利要求1所述的方法，其已经提高了至少一种PUFA的重量％。本文也描述了一种PEX破坏的解脂耶氏酵母，该酵母在编码Pex3p或Pex10p或Pex16p的天然基因中存在破坏。该解脂耶氏酵母的ATCC命名为ATCCPTA-8614(菌株Y4128)。
生物保藏
下列生物材料保藏于美国典型培养物保藏中心(AmericanTypeCultureCollection)(ATCC)(10801UniversityBoulevard，Manassas，VA20110-2209)，并具有下列名称、保藏号和保藏日期。
生物材料 保藏号 保藏日期
解脂耶氏酵母(Yarrowia lipolytica)Y2047 ATCC PTA-7186 2005年10月26日
解脂耶氏酵母(Yarrowia lipolytica)Y2201 ATCC PTA-7185 2005年10月26日
解脂耶氏酵母(Yarrowia lipolytica)Y2096 ATCC PTA-7184 2005年10月26日
解脂耶氏酵母(Yarrowia lipolytica)Y3000 ATCC PTA-7187 2005年10月26日
解脂耶氏酵母(Yarrowia lipolytica)Y4128 ATCC PTA-8614 2007年8月23日
解脂耶氏酵母(Yarrowia lipolytica)Y4127 ATCC PTA-8802 2007年11月29日
上面列出的生物材料将按照国际承认的用于专利程序目的的微生物保藏的布达佩斯条约的有关条款来保存。所列出的保藏物将会被保持在指定的国际保藏机构中至少30年，并且一旦准予专利公开它就将会对公众开放。在由政府行为授予的专利权的部分废除中，保藏物的可用性不会构成实施主题发明的许可。
附图简述和序列表
图1由图1A和图1B组成，它们一起示出了ω-3/ω-6脂肪酸生物合成途径，并且当考虑下文对该途径的描述时应被视为一起。
图2A提供了解脂耶氏酵母Pex10p(即，SEQIDNO：10[GenBank保藏号CAG81606]的氨基酸327-364)、解脂耶氏酵母Pex2p(即，SEQIDNO：2[GenBank保藏号CAG77647]的氨基酸266-323)和解脂耶氏酵母Pex12p(即，SEQIDNO：11[GenBank保藏号CAG81532]的氨基酸342-391)的C3HC4环状锌指基序的比对，它们具有星号指示的保守C3HC4环状锌指基序的半胱氨酸和组氨酸残基。
图2B图示出了解脂耶氏酵母Pex10pC3HC4指状基序的不同氨基酸残基和它们结合的两个锌离子之间的本发明相互作用。
图3A图示了解脂耶氏酵母菌株Y4128的发育，该菌株在总脂质级分中生产37.6％的EPA。
图3B提供了pZP3-Pa777U的质粒图谱。
图4提供了下列质粒的质粒图谱：(A)pY117；和(B)pZP2-2988。
图5提供了下列质粒的质粒图谱：(A)pZKUE3S；和(B)pFBAIN-MOD-1。
图6提供了下列质粒的质粒图谱：(A)pFBAIN-PEX10；和(B)pEXP-MOD-1。
图7A提供了pPEX10-1的质粒图谱。图7B图示了解脂耶氏酵母菌株Y4184U的发育。
图8提供了如下质粒的质粒图谱：(A)pZKL1-2SP98C；和(B)pZKL2-5U89GC。
图9提供了下列质粒的质粒图谱：(A)pYPS161；和(B)pYRH13。
图10图示了解脂耶氏酵母菌株Y4305U3的发育。
图11提供了下列质粒的质粒图谱：(A)pZKUM；和(B)pZKD2-5U89A2。
图12提供了下列质粒的质粒图谱：(A)pY87；和(B)pY157。
根据下面的详细描述和附带的序列描述可以更充分地理解本发明，下面的详细描述和所附的序列描述形成了本申请的一部分。
下面的序列遵照37C.F.R.§1.821-1.825(“对包含核苷酸序列和/或氨基酸序列公开内容的专利申请的要求-序列规则”(“RequirementsforPatentApplicationsContainingNuceotideSequencesand/orAminoAcidSequenceDisclosures-theSequenceRules”))，并且符合世界知识产权组织(WorldIntellectualPropertyOrganization)(WIPO)ST.25标准(1998)以及EPO和PCT的序列表要求(细则5.2和49.5(a-bis)以及行政指令(AdministrativeInstructions)的208节和附录C)。用于核苷酸和氨基酸序列数据的符号和格式遵循在37C.F.R.§1.822中示出的规则。
SEQIDNO：1-86是引物、编码基因或蛋白(或它们的片段)的ORF、或质粒，如表1所述。
表1
核酸和蛋白质SEQID号总汇
描述和缩写 核酸SEQ ID NO 蛋白质SEQ ID NO
解脂耶氏酵母Pex1p(GenBank保藏号CAG82178) -- 1(1024AA)
解脂耶氏酵母Pex2p(GenBank保藏号CAG77647) -- 2(381AA)
解脂耶氏酵母Pex3p(GenBank保藏号CAG78565) -- 3(431AA)
解脂耶氏酵母Pex3Bp(GenBank保藏号CAG83356) -- 4(395AA)
解脂耶氏酵母Pex4p(GenBank保藏号CAG79130) -- 5(153AA)
解脂耶氏酵母Pex5p(GenBank保藏号CAG78803) -- 6(598AA)
解脂耶氏酵母Pex6p(GenBank保藏号CAG82306) -- 7(1024AA)
解脂耶氏酵母Pex7p(GenBank保藏号CAG78389) -- 8(356AA)
解脂耶氏酵母Pex8p(GenBank保藏号CAG80447) -- 9(671AA)
解脂耶氏酵母Pex10p(GenBank保藏号CAG81606) -- 10(377AA)
解脂耶氏酵母Pex12p(GenBank保藏号CAG81532) -- 11(408AA)
解脂耶氏酵母Pex13p(GenBank保藏号CAG81789) -- 12(412AA)
解脂耶氏酵母Pex14p(GenBank保藏号CAG79323) -- 13(380AA)
解脂耶氏酵母Pex16p(GenBank保藏号CAG79622) -- 14(391AA)
解脂耶氏酵母Pex17p(GenBank保藏号CAG84025) -- 15(225AA)
解脂耶氏酵母Pex19p(GenBank保藏号AAK84827) -- 16(324AA)
解脂耶氏酵母Pex20p(GenBank保藏号CAG79226) -- 17(417AA)
解脂耶氏酵母Pex22p(GenBank保藏号CAG77876) -- 18(195AA)
解脂耶氏酵母Pex26p(GenBank保藏号NC_006072，核苷酸117230-118387的反义翻译) -- 19(386AA)
包含解脂耶氏酵母Pex10基因的重叠群，该基因编码过氧化物酶体生物合成因子蛋白(Pex10p)(GenBank保藏号AB036770) 20(3387bp) --
解脂耶氏酵母Pex10(GenBank保藏号AB036770，核苷酸1038-2171)(蛋白序列与SEQ ID NO：10100％相同) 21(1134bp) 22(377AA)
解脂耶氏酵母Pex10(GenBank保藏号AJ012084，它对应于GenBank保藏号AB036770的核苷酸1107-2171)(相对于SEQID NO：10和22的蛋白序列截短了最初的23个氨基酸) 23(1065bp) 24(354AA)
解脂耶氏酵母Pex10p C3HC4环状锌指基序(即，SEQ ID NO：10的氨基酸327-364) -- 25(38AA)
解脂耶氏酵母截短Pex10p(GenBank保藏号CAG81606[SEQ IDNO：10]，缺失了C-末端的32个氨基酸) -- 26(345AA)
解脂耶氏酵母乙酰羟酸合酶(AHAS)突变基因，该基因包含W497L突变 27(2987bp) --
质粒pZP3-Pa777U 28(13,066bp) --
质粒pY117 29(9570bp) --
质粒pZP2-2988 30(15,743bp) --
质粒pZKUE3S 31(6303bp) --
引物pZP-GW-5-1 32 --
引物pZP-GW-5-2 33 --
引物pZP-GW-5-3 34 --
引物pZP-GW-5-4 35 --
引物pZP-GW-3-1 36 --
引物pZP-GW-3-2 37 --
引物pZP-GW-3-3 38 --
引物pZP-GW-3-4 39 --
Genome Walker衔接子[顶链] 40 --
Genome Walker衔接子[底链] 41 --
巢式衔接子引物 42 --
引物Per10F1 43 --
引物ZPGW-5-5 44 --
引物Per10R 45 --
质粒pFBAIN-MOD-1 46(7222bp) --
质粒pFBAIn-PEX10 47(8133bp) --
引物PEX10-R-BsiWI 48 --
引物PEX10-F1-SalI 49 --
引物PEX10-F2-SalI 50 --
质粒pEXP-MOD1 51(7277bp) --
质粒pPEX10-1 52(7559bp) --
质粒pPEX10-2 53(8051bp) --
质粒pZKL1-2SP98C 54(15,877bp) --
质粒pZKL2-5U89GC 55(15,812bp) --
质粒pYPS161 56(7966bp) --
引物Pex-10del1 3′.正向 57 --
引物Pex-10del2 5′.反向 58 --
质粒pYRH13 59(8673bp) --
引物PEX16Fii 60 --
引物PEX16Rii 61 --
引物3UTR-URA3 62 --
引物Pex16-conf 63 --
实时PCR引物ef-324F 64 --
实时PCR引物ef-392R 65 --
实时PCR引物Pex16-741F 66 --
实时PCR引物Pex16-802R 67 --
TaqMan探针ef-345T的核苷酸部分 68 --
TaqMan探针PEX16-760T的核苷酸部分 69 --
质粒pZKUM 70(4313bp) --
质粒pZKD2-5U89A2 71(15,966bp) --
解脂耶氏酵母二酰基甘油酰基转移酶(DGAT2)(美国专利公开7,267,976) 72(2119bp) 73(514AA)
合成Δ12去饱和酶，该酶来源于串珠镰刀菌，其密码子经优化以在解脂耶氏酵母(“FmD12S”)中表达 74(1434bp) 75(477AA)
合成突变型Δ8去饱和酶(“EgD8M”)，该酶来源于小眼虫(“EgD8S”；美国专利公开7,256,033) 76(1272bp) 77(422AA)
合成Δ9延伸酶，该酶来源于小型绿藻属CCMP389，其密码子经优化以在解脂耶氏酵母(“E389D9eS”)中表达 78(792bp) 79(263AA)
合成Δ5去饱和酶，该酶来源于小眼虫，其密码子经优化以在解脂耶氏酵母(“EgD5S”)中表达 80(1350bp) 81(449AA)
质粒pY157 82(6356bp) --
质粒pY87 83(5910bp) --
被Cre重组酶识别的大肠杆菌(Escherichia coli)LoxP重组位点 84(34bp) --
引物UP 768 85 --
引物LP 769 86 --
发明详述
本文所述的是用于操纵在生产PUFA的真核生物中的长链多不饱和脂肪酸[“LC-PUFA”]的浓度(以总脂肪酸百分比形式表示)和含量(以干细胞重量百分比形式表示)的通用方法。这些方法依赖于破坏在宿主中的天然过氧化物酶体生物合成因子[“Pex”]蛋白并将对具有天然的或遗传工程的PUFA生产能力的多种真核生物具有广泛适用性，所述真核生物包括藻类、真菌、卵菌、酵母、类眼虫、原生藻菌、植物和一些哺乳动物系统。
PUFA或其衍生物可用作膳食替代品或补充剂，尤其是婴儿代乳品(formula)，用于接受静脉内营养法的患者或用来预防或治疗营养不良。例如，PUFA可掺入烹饪油、脂肪或人造黄油并作为消费者的一般饮食部分被摄入，从而给予消费者所需的饮食补充剂。此外，PUFA还可以掺入婴儿代乳品、营养补充剂或其它食品中，并且可用作抗炎或降胆固醇剂。任选地，该组合物可以用于药用(人药或兽药)。
定义
在本公开中，使用了大量术语和缩写。给出了如下定义。
“开放阅读框”缩写为ORF。
“聚合酶链反应”缩写为PCR。
“美国典型培养物保藏中心”缩写为“ATCC”。
“多不饱和脂肪酸”缩写为“PUFA”。
“三酰基甘油”缩写为“TAG”。
“总脂肪酸”缩写为“TFA”。
“脂肪酸甲酯”缩写为“FAME”。
“干细胞重量”缩写为“DCW”。
如本文所用，术语“发明”或“本发明”不旨在限制而是通常适用于权利要求中的或本文所述的任何发明。
术语“过氧化物酶体”指普遍存在于所有真核细胞中的细胞器。它们具有单独的脂双层膜，该膜将它们的内容物与细胞溶质分离开来，并且包含多种下文所述功能必需的膜蛋白。过氧化物酶体经由“扩展的穿梭机制(extendedshuttlemechanism)”选择性输入蛋白。更具体地讲，存在至少32个已知的过氧化物酶体蛋白(也称为peroxin)，它们参与通过ATP水解穿过过氧化物酶体膜而输入蛋白的过程。一些过氧化物酶体蛋白在其N-末端或C-末端包含特异性蛋白信号，即，过氧化物酶体靶信号或“PTS”，它们引导蛋白通过过氧化物酶体膜。一旦细胞蛋白进入过氧化物酶体，它们通常通过一些方法降解。例如，过氧化物酶体包含氧化酶，例如过氧化氢酶、D-氨基酸氧化酶和尿酸氧化酶，这些酶能够降解对细胞有毒的物质。作为另外一种选择，过氧化物酶体降解脂肪酸分子以生成乙酰-CoA游离分子，它们被回输到细胞溶质中，该过程称为β-氧化。
术语“过氧化物酶体生物合成因子蛋白”、“过氧化物酶体蛋白”和“Pex蛋白”是可互换的，并且指涉及过氧化物酶体生物合成的和/或参与通过ATP水解使细胞蛋白穿过过氧化物酶体膜的过程的蛋白。编码任何这些蛋白的基因的首字母缩写是“Pex基因”。Pex基因的命名体系描述于Distel等人，J.CellBiol.，135：1-3(1996)。迄今已经在多种真核生物中鉴定了至少32个不同的Pex基因。已经从对突变体的分析中分离出了多种Pex基因，所述突变体显示具有异常的过氧化物酶体功能或结构。根据Kiel，J.A.K.W.等人的文献(Traffic，7：1291-1303(2006))，其中对17个不同真菌菌种中的基因组序列进行了电脑模拟的信息学分析(silicoanalysis)，鉴定了以下Pex蛋白：Pex1p、Pex2p、Pex3p、Pex3Bp、Pex4p、Pex5p、Pex5Bp、Pex5Cp、Pex5/20p、Pex6p、Pex7p、Pex8p、Pex10p、Pex12p、Pex13p、Pex14p、Pex15p、Pex16p、Pex17p、Pex14/17p、Pex18p、Pex19p、Pex20p、Pex21p、Pex21Bp、Pex22p、Pex22p样和Pex26p。因此，本文将这些蛋白中的每一个称为“Pex蛋白”、“过氧化物酶体蛋白”或“过氧化物酶体生物合成因子蛋白”，并且每个蛋白由至少一个“Pex基因”编码。
术语“保守结构域”或“基序”指进化上相关的蛋白质的比对序列中在特定位置处保守的一组氨基酸。虽然同源蛋白质之间在其它位置的氨基酸可以发生变化，但在特定位置高度保守的氨基酸表明为是对蛋白质的结构、稳定性或活性来说必需的氨基酸。因为它们可通过它们在蛋白质同系物家族的比对序列中的高度保守来鉴定，所以它们可用作识别标签或“签名”来确定具有新的测定序列的蛋白质是否属于以前鉴定的蛋白质家族。参考本文相关部分，Pex2p、Pex10p和Pex12p在它们的羧基末端都有一个富含半胱氨酸的基序，已知该基序是C3HC4环状锌指基序。该基序是它们的活性所必需的，涉及蛋白停靠并转移到过氧化物酶体中(Kiel，J.A.K.W.，等人，Traffic，7：1291-1303(2006))。
术语“C3HC4环状锌指基序”或“C3HC4基序”一般指结合两个锌离子的保守半胱氨酸富含基序，它们通过如式I所示的氨基酸序列进行鉴定：
式I：CX2CX9-27CX1-3HX2CX2CX4-48CX2C
在解脂耶氏酵母的编码过氧化物酶体生物合成因子10蛋白(即YlPex10p)的基因中的C3HC4环状锌指基序，位于SEQIDNO：10的氨基酸327-364之间，并且由CX2CX11CX1HX2CX2CX10CX2C基序(SEQIDNO：25)限定。在解脂耶氏酵母的编码过氧化物酶体生物合成因子2蛋白(即YlPex2p)的基因中的C3HC4环状锌指基序，位于SEQIDNO：2的氨基酸266-323之间。解脂耶氏酵母过氧化物酶体生物合成因子12蛋白，即YlPex12p，包含位于SEQIDNO：11的氨基酸342-391之间的不完全C3HC4环指基序。图2A列出了对应于YlPex10、YlPex2和YlPex12的C3HC4环状锌指基序的蛋白序列；星号表示基序的保守半胱氨酸或组氨酸残基。
认为YlPex10、YlPex2和YlPex12通过蛋白-蛋白相互作用形成环指复合物。本发明的YlPex10pC3HC4指状基序(具有两个锌残基)的胱氨酸和组氨酸残基间相互作用在图2B中用图表示出。
术语“Pex10”指编码过氧化物酶体生物合成因子10蛋白或过氧化物酶体装配蛋白Peroxin10的基因，其中所述peroxin蛋白在下文中称为“Pex10p”。Pex10p的功能尚未被清楚的阐明，虽然对其它生物的研究已经揭示Pex10产物位于过氧化物酶体膜内并且是细胞器正常功能所必需的。C3HC4环状锌指基序在Pex10p的C-末端区域是保守的(Kalish，J.E.等人，Mol.CellBiol.，15：6406-6419(1995)；Tan，X.等人，J.CellBiol.，128：307-319(1995)；Warren，D.S.，等人，Am.J.Hum.Genet.，63：347-359(1998))，并且是酶活性所必需的。
术语“YlPex10”指解脂耶氏酵母的编码过氧化物酶体生物合成因子10蛋白的基因，其中所述蛋白在下文中称为“YlPex10p”。该特定的peroxin近来由Sumita等人(FEMSMicrobiol.Lett.，214：31-38(2002))进行了研究。YlPex10的核苷酸序列在GenBank中注册了多个保藏号，包括GenBank保藏号CAG81606(SEQIDNO：10)、AB036770(SEQIDNOs：20、21和22)以及AJ012084(SEQIDNO：23和24)。如在SEQIDNO：24中所示的YlPex10p的序列长度为354个氨基酸。相比之下，如在SEQIDNO：10和SEQIDNO：22中所示的YlPex10p序列每个长度为377个氨基酸，它们100％相同的序列在蛋白N-末端具有附加地23个氨基酸(对应于与GenBank保藏号AJ012084(SEQIDNO：24)中鉴定的起始密码子不同的起始密码子)。
术语“Pex3”指编码过氧化物酶体生物合成因子3蛋白或过氧化物酶体装配蛋白Peroxin3的基因，其中peroxin蛋白在下文中称为“Pex3p”。虽然尚未清楚地了解关于Pex3p的机制细节，但是清楚的是Pex3p是在早期的过氧化物酶体生物合成中所需的过氧化物酶体整合膜蛋白，该蛋白用于形成过氧化物酶体膜(参见例如Baerends，R.J.等人，J.Biol.Chem.，271：8887-8894(1996)；Bascom，R.A.等人，Mol.Biol.Cell，14：939-957(2003))。
术语“YlPex3”指解脂耶氏酵母的编码过氧化物酶体生物合成因子3蛋白的基因，其中所述蛋白在下文中称为“YlPex3p”。YlPex3的核苷酸序列在GenBank中登记为保藏号CAG78565(SEQIDNO：3)。
术术语“Pex16”指编码过氧化物酶体生物合成因子16蛋白或过氧化物酶体装配蛋白Peroxin16的基因，其中peroxin蛋白在下文中称为“Pex16p”。虽然对多种生物的研究已经揭示Pex16产物在形成过氧化物酶体膜和调节过氧化物酶体增殖中起到作用，但是Pex16p的功能仍未被清楚地阐明(Platta，H.W.和R.Erdmann，TrendsCellBiol.，17(10)：474-484(2007))。
术语“YlPex16”指解脂耶氏酵母的编码过氧化物酶体生物合成因子16蛋白的基因，其中所述蛋白在下文中称为“YlPex16p”。该特定peroxin描述于ElizenG.A.等人(J.CellBiol.，137：1265-1278(1997))和Titorenko，V.I.等人(Mol.CellBiol.，17：5210-5226(1997))。YlPex16的核苷酸序列在GenBank中登记为保藏号CAG79622(SEQIDNO：14)。
在天然Pex基因中的或与之相关的术语“破坏”指在一部分该基因中的插入、缺失、或定向突变，所述破坏导致全部基因敲除使得该基因从基因组中缺失并且不翻译蛋白，或者导致翻译的Pex蛋白具有插入、缺失、氨基酸取代或其它定向突变。蛋白中的破坏位置可以是在例如蛋白的N-末端部分中或在蛋白的C-末端部分中。破坏的Pex蛋白相对于未破坏的Pex蛋白将具有减弱的活性，并且可能是无功能的。在编码Pex蛋白的天然基因中的破坏也包括导致Pex蛋白低表达或缺乏表达的替代方法，例如能够经由操纵调控序列、转录和翻译因子和/或信号转导途径或使用有义、反义或RNAi技术等方法导致破坏。
如本文所用，术语“PEX破坏的生物”指包含以下基因的任何含油真核生物，所述基因编码功能性多不饱和脂肪酸生物合成途径并且在编码过氧化物酶体生物合成因子蛋白的天然基因中具有上述破坏。
术语“脂质”指任何脂溶性的(即，亲脂的)、天然存在的分子。脂质是具有多种关键生物学功能的化合物的不同组，所述功能例如细胞膜的结构组分、能量贮存来源和信号途径的中间体。可以将脂质广泛定义为疏水性或两亲性小分子，它们完全地或部分地起源于酮脂酰或异戊二烯基团。表2显示了对脂质的综述，它基于LipidMetabolitesandPathwaysStrategy(LIPIDMAPS)分类系统(NationalInstituteofGeneralMedicalSciences，Bethesda，MD)。
表2
脂质类别综述
本文术语细胞的“总脂质级分”指细胞的所有酯化脂肪酸。可分离在总脂质级分中的不同亚级分，包括三酰基甘油[“油”]级分、磷脂酰胆碱级分和磷脂酰乙醇胺级分，但是这并不包括所有亚级分。
“脂质体”指通过单层磷脂以及通常通过特异性蛋白结合的脂质小滴。这些细胞器是大多数生物运输/贮存中性脂类的位点。认为脂质体来源于包含TAG生物合成酶的内质网的微区。它们的合成及尺寸受特异性蛋白组分的控制。
“中性脂类”指那些一般以贮存脂肪和油形式存在于脂质体中的细胞中的脂质，它们的名称是因为在细胞pH下，所述脂质无带电基团。它们一般是完全非极性的，对水无亲和力。中性脂类一般指脂肪酸的甘油单酯、二酯、和/或三酯，也分别称为单酰基甘油、二酰基甘油或三酰基甘油，或统称为酰基甘油。为了从酰基甘油中释放游离脂肪酸，必须发生水解反应。
术语“三酰基甘油”[“TAG”]和“油”是可互换的，它们指由酰化甘油分子的三个脂肪酰残基组成的中性脂类。TAG能够包含长链PUFA，以及较短的饱和的和不饱和的脂肪酸以及较长链的饱和脂肪酸。细胞的TAG级分也称作“油级分”，并且“油的生物合成”一般指在细胞中合成TAG。油或TAG级分是总脂质级分的亚级分，虽然它也是构成总脂质含量的主要部分，总脂质含量以含油生物细胞中的总脂肪酸重量占干细胞重量[参见下文]的百分比表示。油[“TAG”]级分中的脂肪酸组成和总脂质级分的脂肪酸组成一般是相似的。因此，总脂质级分中的PUFA浓度的提高或降低将对应于油[“TAG”]级分中的PUFA浓度的升高或降低，反之亦然。
术语“总脂肪酸”[“TFA”]本文指所有细胞脂肪酸的总量，所述脂肪酸在给定实例中可通过碱酯交换方法(本领域已知的方法)被衍生化成脂肪酸甲酯[“FAME”]，例如它可以是总脂质级分或油级分。因此，总脂肪酸包括来自中性和极性脂质级分的脂肪酸，包括磷脂酰胆碱级分、磷脂酰乙醇胺级分(phosphatidyletanolaminefraction)和二酰基甘油、单酰基甘油和三酰基甘油[“TAG或油”]级分，但是不包括游离脂肪酸。
术语细胞的“总脂质含量”是TFA的量度，以干细胞重量[“DCW”]百分比的形式表示。因此，总脂质含量[“TFA％DCW”]等同于例如每100毫克DCW的总脂肪酸毫克数。
脂肪酸浓度本文一般表示为TFA的重量百分比[“％TFA”]，例如每100毫克TFA的给定脂肪酸毫克数。除非在本文公开内容中另作具体说明，给定脂肪酸相对于总脂质的百分比等同于以％TFA表示的脂肪酸浓度(例如总脂质的％EPA等同于EPA％TFA)。
在一些情况下，可使用细胞中给定脂肪酸占干细胞重量的百分比[“％DCW”]形式表达给定脂肪酸的含量。因此例如二十碳五烯酸％DCW将根据下式进行测定：(二十碳五烯酸％TFA)*(TFA％DCW)]/100。
术语“脂质分布”和“脂质组成”是可互换的，并且指在特定脂质级分(例如在总脂质级分或油[“TAG”]级分中)中包含的单个脂肪酸的量，其中所述量用TFA百分比形式表示。混合物中存在的各单个脂肪酸的总量应当是100。
如本文所用，术语“成倍增加”指通过乘以某数获得的增加。例如，通过乘以1.3的数量、量、浓度、重量百分比等，提供1.3倍的增加。
术语“脂肪酸”指不同链长的长链脂族酸(链烷酸)，链长为约C12至C22(尽管更长和更短链长的酸均是已知的)。主链长介于C16和C22之间。脂肪酸的结构可用简单的记号系统“X:Y”来表示，其中X表示具体脂肪酸中碳(“C”)原子的总数，而Y表示双键的数目。另外的关于“饱和脂肪酸”与“不饱和脂肪酸”、“单不饱和脂肪酸”与“多不饱和脂肪酸”(“PUFA”)以及“ω-6脂肪酸”(ω-6或n-6)与“ω-3脂肪酸”(ω-3或n-3)之间的区别的详细信息在美国专利7,238,482中有所提供。
表3提供了用于描述本文PUFA的命名。在标题为“简化符号”一栏中，ω-指代系统用于表明碳数目、双键的数目和最接近ω碳的双键位置，双键位置的计数从ω碳开始(为此ω碳的编号为1)。该表的其余部分汇总了ω-3和ω-6脂肪酸及其前体的俗名、在整个说明书中使用的缩写以及每种化合物的化学名称。
表3
多不饱和脂肪酸及其前体的命名
俗名 缩写 化学名称 简化符号
肉豆蔻酸 -- 十四酸 14:0
棕榈酸 棕榈酸 十六酸 16:0
棕榈油酸 -- 9-十六碳烯酸 16:1
硬脂酸 -- 十八酸 18:0
油酸 -- 顺式-9-十八碳烯酸 18:1
亚油酸 LA 顺式-9，12-十八碳二烯酸 18:2 ω-6
γ-亚麻酸 GLA 顺式-6，9，12-十八碳三烯酸 18:3 ω-6
附子脂酸 EDA 顺式-11，14-二十碳二烯酸 20:2 ω-6
二高-γ-亚麻酸 DGLA 顺式-8，11，14-二十碳三烯酸 20:3 ω-6
花生四烯酸 ARA 顺式-5，8，11，14-二十碳四烯酸 20:4 ω-6
α-亚麻酸 ALA 顺式-9，12，15-十八碳三烯酸 18:3 ω-3
硬脂艾杜糖酸 STA 顺式-6，9，12，15-十八碳四烯酸 18:4 ω-3
二十碳三烯酸 ETrA 顺式-11，14，17-二十碳三烯酸 20:3 ω-3
金松烯酸 SCI 顺式-5，11，14-二十碳三烯酸 20:3b ω-6
Juniperonic JUP 顺式-5，17，11，14-二十碳四烯酸 20:4b ω-3
二十碳四烯酸 ETA 顺式-8，11，14，17-二十碳四烯酸 20:4 ω-3
二十碳五烯酸 EPA 顺式-5，8，11，14，17-二十碳五烯酸 20:5 ω-3
二十二碳三烯酸 DRA 顺式-10，13，16-二十二碳三烯酸 22:3 ω-3
二十二碳四烯酸 DTA 顺式-7，10，13，16-二十二碳四烯酸 22:4 ω-3
二十二碳五烯酸 DPAn-6 顺式-4，7，10，13，16-二十二碳五烯酸 22:5 ω-6
二十二碳五烯酸 DPA 顺式-7，10，13，16，19-二十二碳五烯酸 22:5 ω-3
二十二碳六烯酸 DHA 顺式-4，7，10，13，16，19-二十二碳六烯酸 22:6 ω-3
虽然使用本文所述方法，表3列出的ω-3/ω-6PUFA最可能在含油酵母的油级分中积聚，但是该列表不应理解为限制性的或完全的。
如本文所用，术语“多不饱和脂肪酸的组合”或“多不饱和脂肪酸的任何组合”指上表3中列出的任何两种或更多种多不饱和脂肪酸的混合物。此类组合具有能相对于细胞中的多种浓度或重量百分比进行测量，包括相对于细胞中的总脂肪酸的重量百分比进行测量的浓度和重量百分比属性。
代谢途径或生物合成途径在生物化学意义上可以认为是发生于细胞内由酶催化的一系列化学反应，以实现细胞待使用的或待贮存的代谢产物的形成，或启动另一代谢途径(称作流量产生步骤)。很多此类途径均很精细，并涉及对起始物质的逐步修饰以使之形成具有期望的精确化学结构的产物。
术语“PUFA生物合成途径”指将油酸转化成诸如LA、EDA、GLA、DGLA、ARA、DRA、DTA和DPAn-6之类的ω-6脂肪酸和诸如ALA、STA、ETrA、ETA、EPA、DPA和DHA之类的ω-3脂肪酸的代谢过程。文献中详细描述了该过程。参见例如Int′.App.Pub.No.WO2006/052870。简而言之，该过程涉及通过添加碳原子来延长碳链和通过加入双键来使分子去饱和，这通过存在于内质网膜内的一系列特异性去饱和酶和延伸酶(称为“PUFA生物合成途径酶”)进行。更具体地讲，“PUFA生物合成途径酶”指如下与PUFA生物合成相关的任何酶(以及编码它们的基因)，所述酶包括：Δ4去饱和酶、Δ5去饱和酶、Δ6去饱和酶、Δ12去饱和酶、Δ15去饱和酶、Δ17去饱和酶、Δ9去饱和酶、Δ8去饱和酶、Δ9延伸酶、C14/16延伸酶、C16/18延伸酶、C18/20延伸酶和/或C20/22延伸酶。
术语“ω-3/ω-6脂肪酸生物合成途径”指在合适条件下表达时编码催化ω-3和ω-6脂肪酸二者之一或两者产生的酶的一组基因。通常，参与ω-3/ω-6脂肪酸生物合成途径的基因编码PUFA生物合成途径酶。图1示出了一条代表性途径，提供了从肉豆蔻酸经过多种中间产物向DHA的转化，演示了ω-3和ω-6脂肪酸两者是如何可以从共同来源产生。该途径自然分成两部分，使得一部分只生成ω-3脂肪酸而另一部分只生成ω-6脂肪酸。只产生ω-3脂肪酸的部分在本文中将称作ω-3脂肪酸生物合成途径，而只产生ω-6脂肪酸的部分在本文中称作ω-6脂肪酸生物合成途径。
如本文中关于ω-3/ω-6脂肪酸生物合成途径所用的，术语“功能性的”指该途径中的一些(或全部)基因表达活性酶，导致体内催化或底物转化。应当理解，“ω-3/ω-6脂肪酸生物合成途径”或“功能性ω-3/ω-6脂肪酸生物合成途径”并不意味着上面段落中列出的所有基因都是必需的，因为许多脂肪酸产物将仅需要表达该途径中的一亚组基因。
术语“Δ6去饱和酶/Δ6延伸酶途径”指最低程度包括至少一种Δ6去饱和酶和至少一种C18/20延伸酶的PUFA生物合成途径，从而使得能分别从LA和ALA开始，以GLA和/或STA作为脂肪酸中间产物来生物合成DGLA和/或ETA。通过其它去饱和酶和延伸酶的表达，还可以合成ARA、EPA、DPA和DHA。
术语“Δ9延伸酶/Δ8去饱和酶途径”指最低程度包括至少一种Δ9延伸酶和至少一种Δ8去饱和酶的PUFA生物合成途径，从而使得能分别从LA和ALA开始，以EDA和/或ETrA作为脂肪酸中间产物来生物合成DGLA和/或ETA。通过其它去饱和酶和延伸酶的表达，还可以合成ARA、EPA、DPA和DHA。
术语“去饱和酶”指能够通过从邻接碳原子中的一个上移除氢原子、并且从而在碳原子之间导入双键来去饱和脂肪酸中的邻接碳原子的多肽。去饱和产生了脂肪酸或受关注的前体。尽管在整个说明书中使用ω-指代系统来指代特定的脂肪酸，但使用Δ-系统从底物的羧基端计数来表示去饱和酶的活性更方便。本文特别关注的是：1)Δ5去饱和酶，它催化脂肪酸底物DGLA转化成ARA和/或催化脂肪酸底物ETA转化成EPA；2)Δ17去饱和酶，它在从分子羧基末端编号为第17和第18的碳原子之间去饱和脂肪酸，并且它例如催化底物脂肪酸ARA转化成EPA和/或催化底物脂肪酸DGLA转化成ETA；3)Δ6去饱和酶，它催化脂肪酸底物LA转化成GLA和/或催化脂肪酸底物ALA转化成STA；4)Δ12去饱和酶，它催化底物脂肪酸油酸转化成LA；5)Δ15去饱和酶，它催化脂肪酸底物LA转化成ALA和/或催化脂肪酸底物GLA转化成STA；6)Δ4去饱和酶，它催化底物脂肪酸DPA转化成DHA和/或催化底物脂肪酸DTA转化成DPAn-6；7)Δ8去饱和酶，它催化底物脂肪酸EDA转化成DGLA和/或催化底物脂肪酸ETrA转化成ETA；和，8)Δ9去饱和酶，它催化底物脂肪酸棕榈酸转化成棕榈油酸(16:1)和/或催化底物脂肪酸硬脂酸转化成油酸。基于Δ15和Δ17去饱和酶将ω-6脂肪酸转化成它们的ω-3对应物的能力(如分别将LA转化成ALA以及将ARA转化成EPA)，偶尔也将它们称作“ω-3去饱和酶”、“W-3去饱和酶”和/或“ω-3去饱和酶”。所期望的是通过用脂肪酸去饱和酶的基因来转化合适的宿主并测定它对该宿主脂肪酸分布的作用，从而经验性地测定特定脂肪酸去饱和酶的特异性。
术语“延伸酶”指能延长脂肪酸碳链从而产生比该延伸酶作用于其上的脂肪酸底物长2个碳原子的酸的多肽。该延长过程在与脂肪酸合酶相关的多步骤机制中发生，如美国专利公开2005/0132442和国际专利公开WO2005/047480所述。延伸酶体系催化反应的实例如GLA转化成DGLA、STA转化成ETA以及EPA转化成DPA。通常，延伸酶的底物选择性有些广泛，但由链长度和不饱和的程度及类型两者来区分。例如，C14/16延伸酶利用C14底物(如肉豆蔻酸)，C16/18延伸酶利用C16底物(如棕榈酸)，C18/20延伸酶(也称为Δ6延伸酶，两个术语可以互换使用)利用C18底物(如GLA、STA)，而C20/22延伸酶利用C20底物(如EPA)。以类似方式，Δ9延伸酶能够催化LA和ALA分别转化成EDA和ETrA。重要的是，须注意一些延伸酶具有广泛的特异性因而单个酶可能能够催化几种延伸酶反应。例如单个酶可因此作为C16/18延伸酶和C18/20延伸酶。
术语“转化效率”和“底物转化百分比”指特定酶(如去饱和酶)能够将底物转化成产物的效率。转化效率根据下面的公式测量：([产物]/[底物+产物])*100，其中‘产物’包括中间产物和该途径中来源于它的所有产物。
术语“含油的”指那些倾向于以油形式贮存它们的能源的生物(Weete，FungalLipidBiochemistry，第2版，Plenum，1980)。
术语“含油酵母”指那些能制造油(即TAG)的、分类为酵母的微生物。通常，含油微生物的细胞油或TAG含量符合S形曲线，其中脂质浓度增加直至在对数生长期晚期或稳定生长期早期它达到最高浓度，随后在稳定生长期晚期和死亡期期间逐渐下降(Yongrmanitchai和Ward，Appl.Environ.Microbiol.，57：419-25(1991))。本文所述的含油微生物通常积聚超过它们的干细胞重量约25％的油或TAG。含油酵母的实例包括但不限于如下属：耶氏酵母属(Yarrowia)、假丝酵母属(Candida)、红酵母属(Rhodotorula)、红冬孢酵母属(Rhodosporidium)、隐球酵母属(Cryptococcus)、丝孢酵母属(Trichosporon)和油脂酵母属(Lipomyces)。
如本文所用的，术语“分离的核酸片段”和“分离的核酸分子”可互换使用，并且是指单链或双链的，任选含有合成的、非天然的或改变了的核苷酸碱基的RNA或DNA聚合物。-DNA聚合物形式的分离的核酸片段可由cDNA、基因组DNA或合成DNA的一个或多个片段构成。
当在合适的温度和溶液离子强度条件下单链形式的核酸片段可以退火至另一核酸片段时，核酸片段“可杂交”至另一核酸片段，例如cDNA、基因组DNA或RNA分子。杂交条件和洗涤条件是众所周知的，并在Sambrook，J.，Fritsch，E.F.和Maniatis，T.MolecularCloning：A LaboratoryManual，第2版，ColdSpringHarborLaboratory：ColdSpringHarbor，NY(1989)中得到举例说明。
氨基酸或核苷酸序列的“基本部分”指这样的部分，该部分包括的多肽的氨基酸序列或基因的核苷酸序列足以推定鉴定所述多肽或基因，所述鉴定或者可以由本领域技术人员通过人工评价序列来完成，或者可以利用诸如BLAST(BasicLocalAlignmentSearchTool；Altschul，S.F.等人，J.Mol.Biol.，215：403-410(1993))之类的算法通过计算机自动化序列比较和鉴定来完成。一般来讲，为了推测鉴定多肽或核酸序列是否与已知的蛋白质或基因同源，需要有10个或更多邻接氨基酸或者30个或更多邻接核苷酸的序列。此外，对于核苷酸序列，包含20-30个邻接核苷酸的基因特异性寡核苷酸探针可用于序列依赖性的基因鉴定(如DNA杂交)和基因分离(如细菌菌落或噬斑的原位杂交)的方法中。此外，12至15个碱基的短寡核苷酸可在PCR中用作扩增引物，以便获得包含该引物的特定核酸片段。因此，核苷酸序列的“基本部分”所包含的序列应足以特异性地鉴定和/或分离包含该序列的核酸片段。
术语“互补的”用于描述核苷酸碱基之间能够彼此杂交的关系。例如，对于DNA，腺嘌呤与胸腺嘧啶互补，而胞嘧啶与鸟嘌呤互补。
术语“同源性”或“同源”本文互换使用。它们指这样的核酸片段，即其中一个或多个核苷酸碱基改变并不会影响该核酸片段介导基因表达或产生某种表型的能力。这些术语也指本文所述的Pex核酸片段的修饰(例如缺失或插入一个或多个核苷酸)，相对于初始的未经修饰的核酸片段，该修饰基本上不会改变所得核酸片段的功能特性。
此外，技术人员认识到，同源核酸序列也由它们在中等严格条件(如0.5×SSC，0.1％SDS，60℃)下，与本文所示例的序列杂交的能力，或杂交至本文公开的核苷酸序列的任何部分以及杂交至与其功能相当的序列的能力所限定。
“密码子简并性”指允许核苷酸序列在不影响所编码的多肽的氨基酸序列的情况下发生变化的遗传密码的性质。技术人员非常了解具体宿主细胞在使用核苷酸密码子确定给定氨基酸时所表现出的“密码子偏好性”。因此，当合成基因用以改善在宿主细胞中的表达时，希望对基因进行设计，使得其密码子使用频率接近该宿主细胞优选的密码子使用频率。
“合成的基因”可由使用本领域技术人员已知的方法化学合成的寡核苷酸构件装配而成。将这些寡核苷酸基本单位构件进行退火并随后连接以形成基因节段，该基因节段随后在酶促作用下装配而构建成完整的基因。因此，基于最优化核苷酸序列以反映宿主细胞的密码子偏好性，可以定制基因用以最优化基因表达。如果密码子使用偏向于宿主偏好的那些密码子，则技术人员能预期成功的基因表达的可能。优选的密码子的确定可基于对来源于宿主细胞的基因(其中序列信息可获得)的检测。
“基因”指表达特定蛋白的核酸片段，并且可以指单独的编码区或可以包含位于编码序列之前的调控序列(5′非编码区)和之后的调控序列(3′非编码区)。“天然基因”是指天然存在的具有其自己的调控序列的基因。“嵌合基因”是指不是天然基因的任何基因，包含在天然情况下不是一起存在的调控序列和编码序列。因此，嵌合基因可包括源于不同来源的调控序列和编码序列，或者包括源于同一来源但以不同于天然存在的方式排列的调控序列和编码序列。“内源性基因”指位于生物基因组内它的天然位置的天然基因。“外来”基因指通过基因转移导入到宿主生物内的基因。外来基因可包括插入到非天然生物内的天然基因、导入到天然宿主内的新位置的天然基因，或嵌合基因。“转基因”是已通过转化方法导入基因组内的基因。“密码子优化的基因”是其密码子使用频率经设计用以模仿宿主细胞优选的密码子使用频率的基因。
“编码序列”指编码特定氨基酸序列的DNA序列。“合适的调控序列”指位于编码序列的上游(5′非编码序列)、中间或下游(3′非编码序列)的核苷酸序列，其可影响相关编码序列的转录、RNA加工或稳定性或者翻译。调控序列可包括启动子、增强子、静默子、5′非翻译前导序列(例如在转录起始位点和翻译启动密码子之间的序列)、内含子、多腺苷酸化识别序列、RNA加工位点、效应子结合位点和茎-环结构。
“启动子”指能够控制编码序列或功能性RNA表达的DNA序列。一般来讲，编码序列位于启动子序列的3′端。启动子可整个源于天然基因，或者由源于不同的天然存在的启动子的不同元件组成，或者甚至包含合成的DNA片段。本领域内的技术人员应当理解，不同的启动子可以在不同的组织或细胞类型中，或者在不同的发育阶段，或者响应不同的环境条件或生理条件而引导基因的表达。导致基因在大部分时间内在大多数细胞类型中表达的启动子通常称为“组成型启动子”。还应当进一步认识到，由于在大多数情况下调控序列的确切边界尚未完全确定，因此不同长度的DNA片段可能具有相同的启动子活性。
术语“3′非编码序列”和“转录终止子”指位于编码序列下游的DNA序列。这包括多腺苷酸化识别序列和编码能影响mRNA加工或基因表达的调控信号的其它序列。多腺苷酸化信号通常特征在于影响多腺苷酸片添加到mRNA前体的3′末端。3′区可影响相关编码序列的转录、RNA加工或稳定性或翻译。
“RNA转录物”指由RNA聚合酶催化DNA序列的转录所产生的产物。当RNA转录物是DNA序列的完全互补的拷贝时，它被称为初级转录物，或者它可以是源自初级转录物的转录后加工的RNA序列并被称作成熟RNA。“信使RNA”或“mRNA”指无内含子并且可以由细胞翻译成蛋白质的RNA。“eDNA”指与mRNA互补并源于mRNA的双链DNA。“有义”RNA指包含mRNA并因而能由细胞翻译成蛋白质的RNA转录物。“反义RNA”指与全部或部分靶初级转录物或mRNA互补，并阻止靶基因表达的RNA转录物(美国专利5,107,065；国际申请公开WO99/28508)。反义RNA可以与特定基因转录物的任何部分，即5′非编码序列、3′非编码序列或编码序列互补。“功能性RNA”指反义RNA、核酶RNA或其它不被翻译但是对细胞过程有影响作用的RNA。
术语“可操作地连接”指单个核酸片段上的核酸序列的关联，使得其中一个核酸序列的功能受到另一个核酸序列的影响。例如，当启动子能够影响编码序列的表达时，它可操作地连接编码序列。即，编码序列处于启动子的转录控制下。编码序列可以以有义或反义的取向可操作地连接至调控序列。
如本文所用，术语“表达”指源于核酸片段的有义RNA(mRNA)或反义RNA的转录和稳定积聚。表达也可指将mRNA翻译成多肽。
“成熟”蛋白指经翻译后加工的多肽，即已经去除了存在于初始翻译产物中的任何前肽或肽原的多肽。“前体”蛋白质指mRNA的初级翻译产物，即前肽和肽原仍然存在。前肽和肽原可以是但不限于细胞内定位信号。
“转化”指将核酸分子转移至宿主生物中，导致在遗传上稳定遗传。例如，核酸分子可以是自主复制的质粒，或者它可以整合进宿主生物的基因组中。含有转化核酸片段的宿主生物被称为“转基因”或“重组”或“转化”生物体。
“稳定转化”指将核酸片段转移至宿主生物的基因组(包括核基因组和细胞器基因组)中，导致在遗传上稳定遗传。相反，“瞬时转化”指将核酸片段转移至宿主生物的核中或包含DNA的细胞器中，导致基因表达而不整合或不稳定遗传。含有转化核酸片段的宿主生物被称为“转基因”生物体。
术语“质粒”和“载体”指通常携带有不属于细胞中心代谢部分的基因的染色体外元件，并且常常是环状双链DNA片段的形式。这类元件可以是源自任何来源的自主复制序列、基因组整合序列、噬菌体或单链或双链DNA或RNA的核苷酸序列(线性或环状)，其中多个核苷酸序列已连接或重组为一种独特构建体，该独特构建体能够将表达盒引入细胞中。
术语“表达盒”指包含如下编码序列的DNA片段：所选基因的编码序列和所选基因产物表达所需的位于编码序列之前(5′非编码序列)和之后(3′非编码序列)的调控序列。因此，表达盒通常由如下序列构成：(1)启动子序列；2)编码序列，即，开放阅读框[“ORF”]和，3)3′非翻译区域，即，在真核细胞中通常包含聚腺苷酸位点的终止子。表达盒通常包含于载体中以有利于克隆和转化。可以将不同表达盒转化进包括细菌、酵母、植物和哺乳动物细胞在内的不同生物体中，只要能针对每种宿主使用正确的调控序列。
术语“同一性百分比”指两种或更多种多肽序列之间或两种或更多种多核苷酸序列之间的关系，该关系通过对序列进行比较而确定。“同一性”还表示多肽或多核苷酸序列之间的序列关联的程度，根据具体情况，它由比较序列的序列串之间的匹配百分比确定。“同一性百分比”和“相似性百分比”可容易地通过已知方法计算出来，所述的方法包括但不限于以下文献中所描述的那些：1.)ComputationalMolecularBiology(Lesk，A.M.编辑)OxfordUniversity：NY(1988)；2)Biocomputing： InformaticsandGenomeProjects(Smith，D.W.编辑)Academic：NY(1993)；3.)ComputerAnalysisofSequenceData，PartI(Griffin，A.M.和Griffin，H.G.编辑)Humania：NJ(1994)；4)SequenceAnalysisin MolecularBiology(vonHeinje，G.编辑)Academic(1987)；和5.)SequenceAnalysisPrimer(Gribskov，M.和Devereux，J.编辑)Stockton：NY(1991)。
设定确定同一性百分比的优选方法来用于给出待测试序列之间的最佳匹配。用于测定同一性百分比和相似性百分比的方法在公开可获得的计算机程序中进行编辑。序列比对和同一性百分比计算可以用LASERGENE生物信息学计算软件包(LASERGENEbioinformaticscomputingsuite(DNASTARInc.，Madison，WI))中的MegAlignTM程序进行。序列的多重比对采用包括几种改变形式的算法在内的“Clustal比对方法”进行，包括“ClustalV比对方法”和“ClustalW比对方法”(在Higgins和Sharp，CABIOS，5：151-153(1989)；Higgins，D.G.等人，Comput.Appl.Biosci.，8：189-191(1992)中有所描述)和可以在LASERGENE生物信息学计算软件包(DNASTARInc.)中的MegAlignTMv6.1程序中找到的比对方法。用Clustal程序比对序列后，可通过查看程序中的“序列距离”表来获得“同一性百分比”。
本领域的技术人员非常清楚，多种程度的序列同一性百分比可用于从其它物种中鉴定多肽，其中这类多肽具有相同或相似的功能或活性。同一性百分比的有用实例包括但不限于50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、或95％、或从50％至100％的任何整数百分比。实际上，从50％至100％的任何整数氨基酸同一性可用于描述在本文所述的方法和宿主细胞中编码多肽的合适核酸片段(分离的多核苷酸)，例如51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％、60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％。在一些情况下，合适的核酸片段(分离的多核苷酸)编码与本文报道的氨基酸序列至少约70％相同，优选地至少约75％相同，更优选地至少约80％相同的多肽。优选的核酸片段编码与本文所报道的氨基酸序列具有至少约85％同一性的氨基酸序列。更优选的核酸片段编码与本文所报道的氨基酸序列具有至少约90％同一性的氨基酸序列。最优选的是编码与本文所报道的氨基酸序列具有至少约95％同一性的氨基酸序列的核酸片段。
合适的核酸片段不但具有上述同源性，而且通常编码具有至少50个氨基酸，优选至少100个氨基酸，更优选至少150个氨基酸，更优选至少200个氨基酸，最优选至少250个氨基酸的多肽。
术语“序列分析软件”指可用于分析核苷酸或氨基酸序列的任何计算机算法或软件程序。“序列分析软件”可商购获得或独立开发。典型的序列分析软件包括但不限于：1.)GCG程序包(WisconsinPackageVersion9.0，GeneticsComputerGroup(GCG)，Madison，WI)；2)BLASTP，BLASTN，BLASTX(Altschul等人，J.Mol.Biol.，215：403-410(1990))；3)DNASTAR(DNASTAR，Inc.Madison，WI)；4)Sequencher(GeneCodesCorporation，AnnArbor，MI)；和5.)整合了Smith-Waterman算法的FASTA程序(W.R.Pearson，Comput.MethodsGenomeRes.，[Proc.Int.Symp.](1994)，召开年份：1992，111-20.编辑：Suhai，Sandor.Plenum：NewYork，NY)。在这一描述中，除非另外指明，只要序列分析软件用于分析，分析结果都基于所用程序的“默认值”。在此所用的“默认值”指在首次初始化软件时软件最初加载的任何值或参数集。
本文使用的标准重组DNA和分子克隆技术是本领域熟知的并且已经在如下文献中有所描述：Sambrook，J.，Fritsch，E.F.和Maniatis，T.，MolecularCloning：ALaboratoryManual，第2版，ColdSpringHarborLaboratory：ColdSpringHarbor，NY(1989)(下文称为“Maniatis”)；Silhavy，T.J.、Bennan，M.L.和Enquist，L.W.，ExperimentswithGene Fusions，ColdSpringHarborLaboratory：ColdSpringHarbor，NY(1984)；以及Ausubel，F.M.等人，CurrentProtocolsinMolecularBiology，GreenePublishingAssoc.andWiley-Interscience出版，Hoboken，NJ(1987)。
综述：脂肪酸和三酰基甘油的生物合成
通常，含油微生物中的脂质蓄积是响应存在于生长培养基中的总的碳氮比而触发。该过程(导致含油微生物中游离棕榈酸(16:0)的从头合成)在美国专利7,238,482中有详细描述。棕榈酸是长链饱和和不饱和脂肪酸衍生物的前体，这些脂肪酸衍生物通过延伸酶和去饱和酶的作用形成(图1)。
TAG(脂肪酸的主要贮存单位)通过涉及如下反应的一系列反应形成：(1)一分子的酰基辅酶A和甘油-3-磷酸通过酰基转移酶酯化而生成溶血磷脂酸；(2)第二分子的酰基辅酶A通过酰基转移酶酯化而生成1，2-二酰基甘油磷酸(通常称为磷脂酸)；3)通过磷脂酸磷酸酶移除磷酸以生成1，2-二酰基甘油[“DAG”]；和4)通过酰基转移酶的作用加入第三脂肪酸以形成TAG。
广谱的脂肪酸可被引入TAG中，包括饱和的和不饱和的脂肪酸以及短链和长链的脂肪酸。一些能通过酰基转移酶被引入TAG的脂肪酸的非限制性实例包括：癸酸(10:0)、月桂酸(12:0)、肉豆蔻酸(14:0)、棕榈酸(16:0)、棕榈油酸(16:1)、硬脂酸(18:0)、油酸(18:1)、异油酸(18:1)、LA(18:2)、桐油酸(18:3)、GLA(18:3)、ALA(18:3)、STA(18:4)、花生酸(20:0)、EDA(20:2)、DGLA(20:3)、ETrA(20:3)、ARA(20:4)、ETA(20:4)、EPA(20:5)、二十二烷酸(22:0)、DPA(22:5)、DHA(22:6)、木蜡酸(24:0)、神经酸(24:1)、蜡酸(26:0)和褐煤酸(28:0)脂肪酸。在本文所述的方法和宿主细胞中，最期望将“长链”PUFA引入TAG中，其中长链PUFA包括来源于18:1底物的任何脂肪酸，所述底物具有至少18个碳原子，即，C18或更长。其也包括羟基化脂肪酸、环氧脂肪酸和共轭亚油酸。
虽然大多数PUFA以中性脂类的形式掺入TAG并贮存于脂质体中，但是重要的是认识到在含油生物中测量总PUFA应包括那些位于磷脂酰胆碱级分、磷脂酰乙醇胺级分、和三酰基甘油(也称为TAG或油)级分中的PUFA。
ω脂肪酸的生物合成
其中油酸转化成ω-3/ω-6脂肪酸的代谢过程包括通过添加碳原子使碳链延长和通过加入双键使分子去饱和。这需要存在于内质网膜内的一系列专门的去饱和酶和延伸酶。然而，如在图1中看到的和如下所述的，通常存在多个用于产生特定ω-3/ω-6脂肪酸的替代途径。
具体地讲，图1描述了下文所述的途径。所有途径都需要最初通过Δ12去饱和酶将油酸转化成亚油酸LA(第一个ω-6脂肪酸)。然后，利用“Δ6去饱和酶/Δ6延伸酶途径”并将LA用作底物来如下形成长链ω-6脂肪酸：1)通过Δ6去饱和酶将LA转化成γ-亚麻酸[“GLA”]；2)通过C18/20延伸酶将GLA转化成二高-γ-亚麻酸[“DGLA”]；3)通过Δ5去饱和酶将DGLA转化成花生四烯酸[“ARA”]；4)通过C20/22延伸酶将ARA转化成二十二碳四烯酸[“DTA”]；以及，5)通过Δ4去饱和酶将DTA转化成二十二碳五烯酸[“DPAn-6”]。
作为另外一种选择，“Δ6去饱和酶/Δ6延伸酶途径”能够如下使用α-亚麻酸[“ALA”]作底物生产长链ω-3脂肪酸：(1)通过Δ15去饱和酶将LA转化成ALA(第一个ω-3脂肪酸)；2)通过Δ6去饱和酶将ALA转化成十八碳四烯酸[“STA”]；3)通过C18/20延伸酶将STA转化成二十碳四烯酸[“ETA”]；4)通过Δ5去饱和酶将ETA转化成二十碳五烯酸[“EPA”]；5)通过C20/22延伸酶将EPA转化成二十二碳五烯酸[“DPA”]；以及，6)通过Δ4去饱和酶将DPA转化成二十二碳六烯酸[“DHA”]。任选地，ω-6脂肪酸可转化成ω-3脂肪酸；例如，ETA和EPA通过Δ17去饱和酶活性分别从DGLA和ARA生成。
ω-3/ω-6脂肪酸生物合成的替代途径利用Δ9延伸酶和Δ8去饱和酶，即，“Δ9延伸酶/Δ8去饱和酶途径”。更具体地讲，LA和ALA可通过Δ9延伸酶分别转化成EDA和ETrA；Δ8去饱和酶然后将EDA转化成DGLA和/或将ETrA转化成ETA。随后如上所述形成下游PUFA。
本文宿主生物必须天然或经由基因工程技术具有生产PUFA的能力。虽然多种微生物能够在常见的细胞代谢过程中合成PUFA(包括ω-3/ω-6脂肪酸)，并且它们中的一些能进行商业培养，但是这些生物很少生产或不生产具有期望的油含量的油和用于药物、膳食替代品、医疗食品、营养补充剂、其它食物产品、工业油脂化学制品或其它终端产品中的组合物。因此，越来越着重于工程化微生物以生产“设计”的脂质和油的能力，其中脂肪酸含量和组成通过基因工程进行详细指定。在此基础上，期望宿主可能包含编码功能性PUFA生物合成途径的异源基因，但这是非必需的。
如果宿主生物不天然生产期望的PUFA或具有期望的脂质分布，本领域的技术人员熟悉将编码用于PUFA生物合成的合适酶的一个或多个表达盒导入所选的宿主生物所必需的构思和技术。文献为技术人员提供了多个教导，用于将此类表达盒导入多个宿主生物。将使用宿主生物解脂耶氏酵母的一些文献提供如下：美国专利7,238,482、国际申请公布WO2006/033723、专利申请公布US-2006-0094092、专利申请公布US-2006-0115881-A1和专利申请公布US-2006-0110806-A1。上述列举并非穷尽性的因此不应理解为限制性的。
简而言之，多种ω-3/ω-6PUFA产品能在它们转化成TAG之前被生产出来，这取决于脂肪酸底物和存在于或被转化到宿主细胞中的ω-3/ω-6脂肪酸生物合成途径的特定基因。同样地，期望脂肪酸产品的生产可能直接发生或间接发生。当不经过任何中间步骤或中间途径将脂肪酸底物直接转化成期望的脂肪酸产品时，直接生产发生。当编码PUFA生物合成途径的多个基因可被组合使用，使得一系列反应发生以生产期望的PUFA时，间接生产发生。具体地讲，可期望用包含Δ12去饱和酶、Δ6去饱和酶、C18/20延伸酶、Δ5去饱和酶和Δ17去饱和酶的表达盒转化含油酵母以过剩生产EPA。参见美国专利7,238,482和国际申请公布WO2006/052870。为本领域的技术人员熟知的是可将编码PUFA生物合成途径酶的基因的多种其它组合用于在含油生物中表达(参见图1)。包含于具体表达盒中的具体基因取决于宿主生物、它的PFUA分布和/或去饱和酶/延伸酶分布、底物的可利用性和期望的终产物。
许多候选基因具有所需去饱和酶和/或延伸酶活性，它们能根据公开可获得的文献进行鉴定，如GenBank、专利文献、和对具有生产PUFA能力的生物进行的实验分析。可用的去饱和酶和延伸酶序列可源自任何来源，例如，分离自天然来源如细菌、藻类、真菌、卵菌、酵母、植物、动物等、经由半合成途径产生或从头合成。在鉴定这些候选基因后，选择具有去饱和酶或延伸酶活性的特定多肽时的考虑事项包括：1)多肽的底物特异性；2)多肽或其组件是否为限速酶；3)去饱和酶或延伸酶是否是合成期望的PUFA所必需的；4)多肽所需的辅因子；和/或5)多肽在其产生后是否被修饰，例如，通过激酶或异戊烯转移酶修饰。
表达的多肽优选具有与它在宿主细胞中的位置的生化环境相容的参数。参见美国专利7,238,482。考虑每种特定的去饱和酶和/或延伸酶的转化效率也可以是有用的。更具体地讲，由于每种酶极少能以100％的效率将底物转化成产物，宿主细胞内所产生的未纯化的油的最终脂质分布通常是由期望的ω-3/ω-6脂肪酸及多种上游PUFA中间产物组成的多种PUFA的混合物。因此，当使期望的脂肪酸的生物合成最优化时，每种酶的转换效率也是要考虑的变量。
过氧化物酶体生物合成和Pex基因
如前文所述，过氧化物酶体是普遍存在于所有真核细胞中的细胞器。它们的主要作用是降解细胞定位细胞器中的各种物质，例如毒性化合物、脂肪酸等。例如，在过氧化物酶体中能够发生β-氧化过程，其中脂肪酸分子发生降解，最后产生乙酰-CoA的游离分子(它被回输到细胞溶质中)。虽然线粒体中的β-氧化过程导致ATP合成，在过氧化物酶体中的β-氧化引起高电位电子转移到O2中并导致形成H2O2，H2O2随后被过氧化物酶体过氧化氢酶转化成水和O2。特长链(如C18至C22)脂肪酸在过氧化物酶体中经过初始β-氧化，然后经过线粒体β-氧化。
已知负责通过ATP水解使蛋白穿过过氧化物酶体膜的蛋白是过氧化物酶体生物合成因子蛋白，或“peroxins”。这些过氧化物酶体生物合成因子蛋白也包括那些涉及过氧化物酶体生物合成/装配的蛋白。过氧化物酶体生物合成因子蛋白的基因首字母缩写是Pex；并且命名体系描述于Distel等人，J.CellBiol.，135：1-3(1996)。迄今已经在多种真核生物中鉴定了至少32个不同的Pex基因。然而在真菌中，Kiel等人近来的文献(Traffic，7：1291-1303(2006))提出过氧化物酶体生物合成/基质蛋白输入所需的最小数目是17，因此仅需要Pex1p、Pex2p、Pex3p、Pex4p、Pex5p、Pex6p、Pex7p、Pex8p、Pex10p、Pex12p、Pex13p、Pex14p、Pex17p、Pex19p、Pex20p、Pex22p和Pe26p。这些蛋白以协同方式作用以增生(复制)过氧化物酶体并经由转移进入过氧化物酶体以输入蛋白(参见Waterham，H.R.和J.M.Cregg，BioEssays.19(1)：57-66(1996))。
最初从对突变体的分析中分离了多种Pex基因，所述突变体显示具有异常的过氧化物酶体功能或结构。然而，由于全部基因组序列是可获得的，所以通过基于同源性的计算机序列搜索来鉴定Pex基因变得更加容易。Kiel等人(Traffic，7：1291-1303(2006))引用过氧化物酶体生物合成机制的强保守性，尽管它偶尔会出现低序列相似性。更具体地讲，在酵母和丝状真菌中，它们的数据指示迄今鉴定的几乎所有Pex蛋白都是保守的。下表4显示Kiel等人鉴定的过氧化物酶体生物合成因子蛋白(同上)，它们来源于啤酒糖酵母(Saccharomycescerevisiae)、光滑假丝酵母(Candidaglabrata)、棉阿舒囊霉(Ashbyagossypii)、乳酸克鲁维酵母(Kluyveromyceslactis)、白假丝酵母(Candidaalbicans)、汉逊德巴利酵母(Debaryomyceshansenii)、巴斯德毕赤酵母(Pichiapastoris)、多形汉逊酵母(Hansenulapolymorpha)、解脂耶氏酵母(Yarrowialipolytica)、烟曲霉(Aspergillusfumigatus)、构巢曲霉(Aspergillusnidulans)、产黄青霉(Penicilliumchrysogenum)、稻瘟病菌(Magnaporthegrisea)、粗糙脉孢菌(Neurosporacrassa)、玉蜀黍赤霉(Gibberellazeae)、玉米黑粉菌(Ustilagomaydis)、新生隐球菌新生变种(Cryptococcusneoformansvar.neoformans)和粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomycespombe)。
导致过氧化物酶体生物合成减弱的Pex基因突变在酵母、人类和植物中引起严重的代谢和发育紊乱(Eckert，J.H.和R.Erdmann，Rev.Physiol.BiochemPharmacol.，147：75-121(2003)；Weller，S.等人，AnnualReviewofGenomicsandHumanGenetics，4：165-211(2003)；Wanders，R.J.，Am.J.Med.Genet.，126A：355-375(2004)；Mano，S.和M.Nishimura，VitamHorm.，72：111-154(2005)；Wanders，J.A.，和H.R.Waterham，Annu.Rev.Biochem.，75：295-332(2006)；Fujiki，Yukio.PeroxisomeBiogenesisDisorders.In，EncyclopediaofLifeSciences.JohnWiley&Sons，2006)。例如X-连锁肾上腺脑白质营养不良[“X-ALD”]和Zellweger综合征、以及若干个严重程度较低的疾病，它们可能由单个酶缺乏和/或过氧化物酶体生物合成失调引起。
在酵母、解脂耶氏酵母中，已经分离并鉴定了多种不同的Pex基因，如上表4中鉴定的那些Pex基因。更具体地讲，Bascom，R.A.等人(Mol.Biol.Cell，14：939-957(2003))描述了YlPex3p；Szilard，R.K.等人(J.CellBiol.，131：1453-1469(1995))描述了YlPex5p；Nuttley，W.M.等人(J.Biol.Chem.，269：556-566(1994))描述了YlPex6p；ElizenG.A.，等人(J.Biol.Chem.，270：1429-1436(1995))描述了YlPex9p；ElizenG.A.，等人(J.CellBiol.，137：1265-1278(1997))和Titorenko，V.I.等人(Mol.CellBiol.，17：5210-5226(1997))描述了YlPex16p；Lambkin，G.R.和R.A.Rachubinski(Mol.Biol.Cell.，12(11)：3353-3364(2001))描述了YlPex19；以及TitorenkoV.I.，等人(J.CellBiol.，142：403-420(1998))和SmithJ.J.以及R.A.Rachubinski(J.CellBiol.，276：1618-1625(2001))描述了YlPex20p。
本文最初关注的基因是YlPex10p(GenBank保藏号CAG81606、AB036770和AJ012084)。它由Sumita等人证明(FEMSMicrobiol.Lett.，214：31-38(2002))：1)YlPex10p用作过氧化物酶体的组分；并且2)YlPex10p的C3HC4环状锌指基序是蛋白功能必需的，如经由制造C341S、C346S和H343W点突变并随后进行生长分析来所测定的。
已经在其它生物中完成了对Pex10的C3HC4环状锌指基序的研究并具有类似结果。例如，发现改变在巴斯德毕赤酵
母(Pichiapastoris)的Pex10pC3HC4基序中的保守残基的点突变会使蛋白无功能(Kalish，J.E.等人，Mol.CellBiol.，15：6406-6419(1995))。同样地，在对纤维原细胞系进行功能互补分析后，WarrenD.S.等人(Hum.Mutat.，15(6)：509-521(2000))得出结论：C3HC4基序对Pex10p功能是至关重要的。若干个研究结果显示Pex10p在拟南芥属中丧失功能会引起胚芽在心期死亡(Hu，J.等人，Science，297：405-409(2002)；Schmumann，U.等人，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.，100：9626-9631(2003)；Sparkes，I.A.等人，PlantPhysiol.，133：1809-1819(2003)；Fan，J.等人，PlantPhysiol.，139：231-239(2005))。在后继研究中，Schemann，U.等人(Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A，104：1069-1074(2007))研究了Pex10p在非致命的功能部分丧失拟南芥属突变体中的功能。具体地讲，在拟南芥属野生型植株中制备具有功能异常的C3HC4基序的表达Pex10p的四个T-DNA插入序列。突变植物显示具有减少的叶片过氧化物酶体，并且作者提出Pex10p中环指基序的失活消除了连结过氧化物酶体与叶绿体以及在过氧化物酶体和叶绿体之间转移代谢物所需的蛋白相互作用。
虽然研究尚未鉴定其它Pex蛋白中必需的结构域，但是研究认识到了多种Pex突变体的效应，从而认识到各种不同的生物进化出的用于装配、保持、繁殖和遗传过氧化物酶体(一种已知在脂质代谢中起作用的细胞器)的方法和分子机制。例如，Bascom，R.A.等人已经进行了解脂耶氏酵母Pex3p的基因敲除和超表达(Mol.Biol.Cell，14：939-957(2003))。基因敲除细胞不包含野生型过氧化物酶体，相反具有多个小囊泡；超表达导致细胞具有较少、较大和聚集的过氧化物酶体。他们假定Pex3p涉及通过固定过氧化物酶体生物合成组件启动过氧化物酶体装配，即，过氧化物酶体靶信号(PTS)1和2输入机制。同样地，Guo，T.等人，敲除解脂耶氏酵母Pex16p导致过多地增殖不成熟的过氧化物酶体囊泡并显著地降低它们转化成成熟过氧化物酶体的速率和效率(J.CellBiol.，162：1255-1266(2003))，然而超表达导致产生很少但是增大的过氧化物酶体(Eitzen等人，J.CellBiol.，137：1265-1278(1997))。Guo等人得出结论：Pex16p负调节早期的过氧化物酶体前体分裂所需的膜分裂事件。
尽管已有上文概述的研究进展，关于不同Pex蛋白的作用、它们彼此相互作用和过氧化物酶体中的生物合成/装配机制的细节仍未被阐明。同样地，本专利申请所述的数据是在对其它植物或动物的研究中尚未验证的新观察数据，其中在YlPex10p的C3HC4基序中的突变或YlPex3p、YlPex10p或YlPex16p的敲除导致产生解脂耶氏酵母突变体，该突变体具有提高的PUFA掺入能力，尤其是掺入长链PUFA如C20至C22分子到细胞的总脂质级分和油级分中的能力。
已经提出过氧化物酶体是脂质的分解代谢和合成代谢所必需的(LinY.等人，PlantPhysiology，135：814-827(2004))；然而，该假说是基于对Pex16p的同源物的研究。更具体地讲，Lin，Y.等人(同上)报道拟南芥属Shrunken种子1(sse1)突变体具有异常的过氧化物酶体生物合成和脂肪酸合成，这基于sse1种子中的油与野生型相比减少了10-16％。Binns，D.等人(J.CellBiol.，173(5)：719-731(2006))检查了啤酒糖酵母中的过氧化物酶体-脂质体相互作用并测定两个细胞器之间的广泛物理接触促进脂质体内的结合脂解及过氧化物酶体脂肪酸氧化。更具体地讲，检查不同Pex基因敲除菌株的游离脂肪酸与TAG的比率，发现比率相对于野生型提高。很明显，为了了解过氧化物酶体，尤其是Pex3p、Pex10p和Pex16p蛋白的代谢作用，进一步的研究将是必须的。
不希望受任何具体说明或理论的限制，假定在含油酵母细胞中的Pex基因破坏或敲除影响过氧化物酶体中天然存在的脂质分解代谢和合成代谢，或受过氧化物酶体的影响。与尚未破坏其天然过氧化物酶体生物合成因子蛋白的含油酵母相比，破坏或敲除导致总脂质级分和油级分中的PUFA量增加，所述PUFA量以总脂肪酸百分比形式表示。在一些情况下，也观察到在总脂质级分和油级分中以干细胞重量百分比形式表示的PUFA量增加，和/或以干细胞重量百分比形式表示的总脂质含量增加。假定这种通用机制可应用于所有真核生物中，如藻类、真菌、卵菌、酵母、类眼虫、原生藻菌、植物和一些哺乳动物体系，因为所有这些生物都包含过氧化物酶体。
鉴定并分离Pex同源物
当在优选宿主生物中的特定Pex基因或蛋白的序列不是已知的时，本领域技术人员认识到在调控基因编码的蛋白活性之前鉴定和分离这些基因或它们的部分基因将是最期望的，所述调控继而促进掺入真核生物总脂质级分和油级分中的PUFA量的变化，所述量以总脂肪酸百分比形式表示。对优选的宿主Pex基因序列的认识将有利于通过定向破坏来破坏同源染色体基因。
表4中的Pex序列或它们的序列部分可用于在相同或其它藻类、真菌、卵菌、类眼虫、原生藻菌、酵母或植物物种中使用序列分析软件搜索Pex同源物。通常，这种计算机软件通过将同源程度赋予多种置换、缺失和其它修饰来匹配相似的序列。使用软件算法，如具有低复杂度滤波器和以下参数的BLASTP比对方法：Expectvalue＝10，matrix＝Blosum62(Altschul，等人，NucleicAcidsRes.25：3389-3402(1997))，该方法是用于将表4中的任何Pex蛋白对核酸或蛋白序列数据库进行比较并从而鉴定在优选宿主生物中的相似已知序列的熟知方法。
使用算法软件搜索已知序列数据库尤其适于分离对公开可获得的Pex序列具有相对低的同一性百分比的同源物，如那些表4中描述的序列。可预测的一点是：分离与公开可获得的Pex序列具有至少约70％-85％同一性的Pex同源物将是相对更容易的。此外，那些至少约85％-90％相同的序列将尤其适于分离，那些至少约90％-95％相同的序列将最容易分离。
通过使用Pex酶独有的基序已经分离了一些Pex同源物。例如，为人熟知的是Pex2p、Pex10p和Pex12p在它们的羧基末端都有一个富含半胱氨酸的基序，已知该基序是C3HC4环状锌指基序(图2A)。该“保守结构域”区域对应于一组在特定位点高度保守的氨基酸，并且可能提供对蛋白结构、稳定性或活性来说必需的Pex蛋白区域。基序通过它们在蛋白同源物家族的比对序列中的高度保守性进行鉴定。作为独有的“标记”，它们能决定具有新测定序列的蛋白是否属于以前鉴定过的蛋白家族。这些基序可用作诊断工具以分别迅速鉴定新的Pex2、Pex10和/或Pex12基因。
作为另外一种选择，公开可获得的Pex序列或它们的基序可以是用于鉴定同源物的杂交试剂。核酸杂交试验的基本组成包括探针、怀疑含有目的基因或基因片段的样本及特定的杂交方法。探针通常是与待检测核酸序列互补的单链核酸序列。探针与待检测的核酸序列是可杂交的。尽管探针的长度可在5个碱基到数万个碱基之间变化，但通常约15个碱基到约30个碱基的探针长度是合适的。只需要探针分子的部分与待检测的核酸序列互补。另外，探针和靶序列之间不需要完全互补。杂交确实可以在并不完全互补的分子之间发生，结果是杂交区内的一定比率的碱基未与适当的互补碱基配对。
杂交方法是已知的。通常探针和样品必须在允许核酸杂交的条件下混合。这涉及在适当浓度和温度条件下在存在无机或有机盐时使探针和样品接触。探针和样品核酸必须接触足够长的时间，使探针和样品核酸之间的任何可能的杂交均会发生。混合物中的探针或靶标的浓度决定杂交发生所需的时间。探针或靶标的浓度越高，所需的杂交孵育时间就越短。任选地，可以加入离液剂(如氯化胍、硫氰酸胍、硫氰酸钠、四氯乙酸锂、高氯酸钠、四氯乙酸铷、碘化钾或三氟乙酸铯)。如果需要，能将甲酰胺加入杂交混合物，通常为30-50％(v/v)[“按体积计”]。
可以采用多种杂交溶液。通常，这些杂交溶液包含约20％至60％体积，优选30％体积的极性有机溶剂。通常的杂交溶液采用约30-50％v/v甲酰胺、约0.15至1M氯化钠、约0.05至0.1M缓冲液(如柠檬酸钠、Tris-HCl、PIPES或HEPES(pH范围约6-9))、约0.05至0.2％的去污剂(如十二烷基硫酸钠)或0.5-20mM的EDTA、FICOLL(PharmaciaInc.)(约300-500千道尔顿)、聚乙烯吡咯烷酮(约250-500千道尔顿)和血清白蛋白。一般的杂交溶液还包含约0.1至5mg/mL未经标记的载体核酸、片段化的核酸DNA(如小牛胸腺或鲑精DNA或酵母RNA)，以及任选约0.5％至2％wt/vol[“重量体积比”]的甘氨酸。可以包含其它添加剂，例如包括极性水溶性或可膨胀试剂(如聚乙二醇)、阴离子聚合物(如聚丙烯酸酯或聚甲基丙烯酸酯)和阴离子糖类聚合物(如硫酸葡聚糖)在内的体积排阻剂。
核酸杂交可适用于多种测定形式。最合适的形式之一是夹心测定形式。夹心测定尤其适用于在非变性条件下杂交。夹心型测定的主要成分是固体支持体。固体支持体具有吸附或共价连接至其上的固定核酸探针，该探针未经标记并且与序列的一部分互补。
任何Pex核酸片段或任何鉴定的同源物可用于从相同或其它藻类、真菌、卵菌、类眼虫、原生藻菌、酵母或植物物种中分离编码同源蛋白的基因。使用序列依赖性规程分离同源基因是本领域熟知的。序列依赖性规程的实例包括但不限于：1)核酸杂交方法；2)DNA和RNA扩增方法，例如核酸扩增技术的多种应用，如聚合酶链反应[“PCR”](美国专利4,683,202)；连接酶链反应[“LCR”](Tabor，S.等人，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.，82：1074(1985))；或链置换扩增[“SDA”]，Walker等人，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.，89：392(1992))；和3.)文库构建和互补筛选方法。
例如，编码蛋白或多肽的基因类似于公开可获得的Pex基因或它们的基序，可使用所有或部分那些公开可获得的核酸片段作为DNA杂交探针，以使用熟知的方法筛选来自任何期望生物的文库而直接分离该基因。基于公开可获得核酸序列的特异性，寡核苷酸探针可通过本领域已知的方法(Maniatis，同上)设计并合成。而且，整个序列可直接用于通过熟练技术人员已知的方法，例如随机引物DNA标记、切口平移或末端标记技术，来合成DNA探针，或使用可获得的体外转录体系来合成RNA探针。此外，能设计特异性引物并用于扩增部分或全长公开可获得的序列或它们的基序。所得的扩增产物可在扩增反应过程中直接标记或在扩增反应后标记，并用作探针以在合适的严格条件下分离全长的DNA片段。
通常，在PCR类型的扩增技术中，引物具有不同的序列而且彼此之间不互补。取决于期望的检测条件，应当设计引物序列以提供既有效又可靠的靶核酸的复制。PCR引物设计方法是常见且熟知的(Thein和Wallace，“TheuseofoligonucleotidesasspecifichybridizationprobesintheDiagnosisofGeneticDisorders”，HumanGeneticDiseases：APracticalApproach，K.E.Davis编辑，(1986)第33-50页，IRL：Herndon，VA；Rychlik，W.，InMethodsinMolecularBiology，White，B.A.Ed.，(1993)第15卷，第31-39页，PCRProtocols：CurrentMethodsandApplications.Humania：Totowa，NJ)。
通常，可以将可获得的Pex序列的两个短片段在PCR规程中用于从DNA或RNA扩增编码同源基因的更长的核酸片段。也可以对克隆的核酸片段文库进行PCR，其中一个引物的序列来源于可获得的核酸片段或它们的基序。其它引物序列利用mRNA前体编码基因3′末端存在的多腺苷酸片。
作为另一种选择，第二个引物序列可以基于来源于克隆载体的序列。例如，技术人员可以按照RACE规程(Frohman等人，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.，85：8998(1988))，通过用PCR扩增在转录物内单个位点与3′或5′端之间的区域的拷贝来产生cDNA。以3′和5′方向取向的引物可以从能利用可获得的序列设计。使用可商业获得的3′RACE或5′RACE体系(例如BRL，Gaithersburg，MD)，可以分离特异性的3′或5′cDNA片段(Ohara等人，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.，86：5673(1989)；Loh等人，Science，243：217(1989))。
基于所讨论的这些熟知方法中的任何一种，在选择的任何优选真核生物中鉴定和/或分离Pex基因同源物将是可能的。能通过定向破坏PUFA生产宿主生物中的内源基因容易地确认任何推定的Pex基因的活性，因为总脂质级分和油级分的脂质分布相对于它们在缺乏定向Pex基因破坏的生物中的那些脂质分布发生了改变。
经由破坏天然过氧化物酶体生物合成因子蛋白提高总脂质级分和油级 分中的PUFA量
如上所述，本发明的公开内容涉及下述提高含油真核生物中的一种PUFA或PUFA组合的重量百分比的方法，所述方法包括：
a)提供含油真核生物，所述生物在编码过氧化物酶体生物合成因子蛋白的天然基因中包含破坏，这产生PEX破坏生物；和编码功能性PUFA生物合成途径的基因；以及
b)在下述条件下培养(a)的真核生物：当与未破坏其天然过氧化物酶体生物合成因子蛋白的含油真核生物中的那些的重量％相比较时，(a)真核生物的总脂质级分和油级分中的一种PUFA或PUFA组合的重量％相对于总脂肪酸的重量％增加。
以总脂肪酸百分比形式提高的PUFA的量可能是：1)作为功能性PUFA生物合成途径期望终产品形式的PUFA，这与以中间体或副产品形式产生的PUFA相反；2)C20至C22的PUFA；和/或3)总PUFA。
除了相对于总脂肪酸重量％提高一种PUFA或PUFA组合的重量％之外，在一些情况下，还可以提高或降低细胞的总脂质含量(TFA％DCW)。这意味着无论PEX基因破坏是否引起PEX破坏细胞中的总脂质量提高或降低，该破坏总是引起一种PUFA或PUFA组合的重量％提高。
本文提供的另一种方法涉及在编码过氧化物酶体生物合成因子蛋白的天然基因中的破坏，其中当与亲本菌株中的该百分比进行比较时，所述破坏能够导致一种PUFA或PUFA组合相对于干细胞重量的百分比提高，所述亲本菌株的天然Pex蛋白未被破坏或其表达破坏天然Pex蛋白的“后备”拷贝。
在上述方法的优选方面，在编码过氧化物酶体生物合成因子蛋白的天然基因中的破坏导致PUFA的量提高，PUFA是功能性PUFA生物合成途径期望的终产品，而不是PUFA中间体或副产品，PUFA量以干细胞重量百分比相对于亲本菌株的重量百分比表示，所述亲本菌株的天然Pex蛋白未被破坏或其表达破坏天然Pex蛋白的“后备”拷贝。在一些情况下，组合PUFA相对于干细胞重量的百分比的提高是C20至C22PUFA的组合或总PUFA的提高。
上文也描述了通过这些方法产生的生物，所述生物包含至少一个过氧化物酶体生物合成因子蛋白的破坏。也描述了获取自这些生物的脂质和油、获取自脂质和油加工的产品、这些脂质和油用于食品、动物饲料、或工业应用的用途和/或副产品用于食品或动物饲料的用途。
上述方法中优选的真核生物包括藻类、真菌、卵菌、酵母、类眼虫、原生藻菌、植物和一些哺乳动物系统。
用于这些方法中任何一种的过氧化物酶体生物合成因子蛋白可选自：Pex1p、Pex2p、Pex3p、Pex3Bp、Pex4p、Pex5p、Pex5Bp、Pex5Cp、Pex5/20p、Pex6p、Pex7p、Pex8p、Pex10p、Pex12p、Pex13p、Pex14p、Pex15p、Pex16p、Pex17p、Pex14/17p、Pex18p、Pex19p、Pex20p、Pex21p、Pex21B、Pex22p、Pex22p样和Pex26p(以及它们的蛋白同源物)。在本文所述的一些优选方法中，被破坏的过氧化物酶体生物合成因子蛋白选自：Pex2p、Pex3p、Pex10p、Pex12p和/或Pex16p。然而在一些更优选的方法中，被破坏的过氧化物酶体生物合成因子蛋白选自：Pex3p、Pex10p和/或Pex16p。
在编码过氧化物酶体生物合成因子蛋白的天然基因中的破坏可能是在部分基因(例如在蛋白N-末端部分或在蛋白C-末端部分)中进行的插入、缺失、或定向突变。作为另外一种选择，该破坏能导致完全的基因敲除，使得基因从宿主细胞基因组中除去。或者该破坏可能是导致无功能蛋白的定向突变。
破坏方法
本发明包括在天然基因中的破坏，所述基因编码优选宿主细胞内的过氧化物酶体生物合成因子蛋白。虽然本领域的技术人员可使用多种技术获得破坏，但是特定基因的内源活性一般能通过以下技术减少或消除，例如：1)通过插入、取代和/或缺失所有或部分靶基因破坏所述基因；或2)操纵控制所述蛋白表达的调控序列。这些技术在下文中讨论。然而，本领域的技术人员认识到这些技术在现有文献中已有详细描述，并且不受本文所述的方法、宿主细胞、和产品的限制。本领域的技术人员也认识到大多数适用的技术使用任何特定的含油酵母。
经由插入、取代和/或缺失的破坏：就基因破坏而言，将外源DNA片段(通常是一个选择性标记基因)插入结构基因。这打断结构基因的编码序列并引起基因失活。将破坏盒转化到宿主细胞中导致非功能性破坏基因通过同源重组置换功能性天然基因。参见例如：Hamilton等人，J.Bacteriol.，171：4617-4622(1989)；Balbas等人，Gene，136：211-213(1993)；Gueldener等人，NucleicAcidsRes.，24：2519-2524(1996)；和Smith等人，MethodsMol.Cell.Biol.，5：270-277(1996)。本领域的技术人员了解基因定向常规方法的许多改良方法，所述方法容许有阳性选择和阴性选择、生成基因敲除、以及将外来DNA序列插入到哺乳动物系统、植物细胞、丝状真菌、藻类、卵菌、类眼虫、原生藻菌、酵母和/或微生物系统的特定基因组位点中。
相反地，基因破坏的非特异性方法是使用转座元件或转座子。转座子是随机插入DNA但随后能根据序列进行检索以测定插入位点的基因元件。体内和体外转座技术是已知的，并且涉及转座元件与转座酶的组合使用。当转座元件或转座子与核酸片段在存在转座酶的情况下接触时，转座元件随机插入核酸片段中。该技术用于随机诱变和基因分离，因为被破坏的基因可基于转座元件的序列进行鉴定。用于体外转座的试剂盒是可商购获得的并包括：PrimerIslandTranspositionKit，得自PerkinElmerAppliedBiosystems，Branchburg，NJ，基于酵母的Ty1元件；GenomePrimingSystem，得自NewEnglandBiolabs，Beverly，MA，基于细菌转座子Tn7；和EZ::TN转座子插入系统，得自EpicentreTechnologies，Madison，WI，基于Tn5细菌转座元件。
Pex调控序列的操纵：本领域熟知与编码序列附连的调控序列包括转录和翻译“控制”核苷酸序列，所述序列位于编码序列的上游(5′非编码序列)、内部、或下游(3′非编码序列)，并且影响附连的编码序列的转录、RNA加工或稳定性、或翻译。因此，操纵Pex基因调控序列可以指操纵特定Pex基因的启动子、静默子、5′非转录前导序列(介于转录起始位点好翻译启动密码子之间)、内含子、增强子、启动控制区、多腺苷酸化识别序列、RNA加工位点、效应子结合位点和茎-环结构。然而在所有情况下，操纵的结果是下调Pex基因的表达，这促使与天然过氧化物酶体生物合成因子蛋白未被破坏的含油酵母相比，总脂质级分和油级分中以总脂肪酸百分比形式表示的PUFA量增加。
例如，能缺失或破坏Pex10基因的启动子。作为另外一种选择，驱动Pex10基因表达的天然启动子可以用与天然启动子相比启动子活性减弱的异源启动子取代。用于操纵调控序列的方法是为人们熟知的。
技术人员能够使用这些技术和其它熟知技术破坏在本文所述的优选宿主细胞中的天然过氧化物酶体生物合成因子蛋白，所述优选宿主例如哺乳动物系统、植物细胞、丝状真菌、藻类、卵菌、类眼虫、原生藻菌和酵母。
本领域的技术人员能够识别破坏天然Pex基因的最佳方法，以使得与天然过氧化物酶体生物合成因子蛋白未被破坏的真核生物相比，在总脂质级分和油级分中积聚的PUFA量增加，所述PUFA量以总脂肪酸的百分比形式表示。
ω-3和/或ω-6脂肪酸生物合成的代谢工程
本文所述方法除了用于破坏天然过氧化物酶体生物合成因子蛋白之外，还可使用操纵ω-3和/或ω-6脂肪酸生物合成。这种操纵可能需要直接在PUFA生物合成途径中进行代谢工程改造或需要另外对为PUFA生物合成途径贡献碳的途径进行操纵。可用于上调期望的生化途径和下调不期望的生化途径的技术是本领域熟知的。例如，与ω-3和/或ω-6脂肪酸生物合成途径竞争能量或碳的生化途径或干扰特定PUFA终产物产生的天然PUFA生物合成途径中的酶可以通过基因破坏来去除或通过其它手段(如反义mRNA和锌指靶向技术(zinc-fingertargetingtechnologies))来下调。
以下讨论改变PUFA生物合成途径从而分别提高GLA、ARA、EPA或DHA含量的方法，以及在TAG生物合成途径和TAG降解途径中的所期望的操纵：分别是国际申请公布WO2006/033723，国际申请公布WO2006/055322[美国专利申请公布2006-0094092-A1]，国际申请公布WO2006/052870[美国专利申请公布2006-0115881-A1]和国际申请公布WO2006/052871[美国专利申请公布2006-0110806-A1]。
表达系统、表达盒、载体和宿主细胞转化
制备重组构建体并将其导入到优选真核宿主中以破坏天然过氧化物酶体生物合成因子蛋白和/或导入编码PUFA生物合成途径的基因可能是必需的，所述真核宿主例如哺乳动物系统、植物细胞、丝状真菌、藻类、卵菌、类眼虫、原生藻菌和酵母。本领域的技术人员了解的标准来源材料如下所述：1)构建、操纵和分离大分子(例如DNA分子、质粒等)的特定条件和程序；2)生成重组DNA片段和重组表达构建体；和3)克隆的筛选和分离。参见Sambrook等人，MolecularCloning：A LaboratoryManual，第2版，ColdSpringHarborLaboratory：ColdSpringHarbor，NY(1989)；Maliga等人，MethodsinPlantMolecularBiology，ColdSpringHarbor，NY(1995)；Birren等人，GenomeAnalysis：DetectingGenes，v.1，ColdSpringHarbor，NY(1998)；Birren等人，GenomeAnalysis：AnalyzingDNA，v.2，ColdSpringHarbor：NY(1998)；PlantMolecular Biology：ALaboratoryManual，Clark，ed.Springer：NY(1997)。
一般来讲，存在于构建体中的序列的具体选择取决于期望的表达产物、宿主细胞的性质以及提出的相对于未转化细胞分离转化细胞的手段。技术人员熟知基因元件必须存在于质粒载体上以成功地转化、选择并增殖包含嵌合基因的宿主细胞。然而，通常载体或盒含有引导相关基因的转录和翻译的序列、选择标记和允许自主复制或染色体整合的序列。合适的载体包括控制转录起始的基因5′区(即启动子)和控制转录终止的DNA片段3′区(即终止子)。最优选两个控制区都来源于来自转化宿主细胞的基因。
用于驱动在期望的宿主细胞中的异源基因或部分异源基因表达的启动控制区或启动子有多种，并且为人们所熟知。这些控制区可包含启动子、增强子、静默子、内含子序列、3′UTR和/或5′UTR区域、以及蛋白和/或RNA稳定元件。此类元件的长度和特异性可以不同。实际上能够引导这些基因在所选宿主细胞中的表达的任何启动子(即，天然的、合成的、或嵌合的启动子)都是适用的。在宿主细胞中的表达能够以诱导型或组成型的方式发生。诱导型表达通过诱导可操作地连接至受关注的Pex基因的可调控启动子的活性发生。组成型表达通过利用可操作地连接至受关注基因的组成型启动子发生。
当宿主细胞是例如酵母时，酵母细胞中的功能性转录和翻译区域尤其从宿主菌种中提供。用于在解脂耶氏酵母中使用的优选转录起始调节区参见国际申请公布WO2006/052870。可以使用许多调控序列的任意一种，这取决于是期望组成型转录还是诱导型转录、启动子在表达所关注的ORF中的效率、构建的容易性等。
必须在重组构建体中提供编码转录终止信号的3′非编码序列，即，“终止区”，该序列可以来自从中获取初始区的基因或不同基因的3′区域。大量的终止区是已知的并且当用于与它们源自的属和物种相同和不同的属和物种两者时，其在多种宿主中发挥的功能令人满意。选择终止区更多的是从方便的角度出发而不是为了任何特性。终止区也可以源于优选宿主的多种天然基因。
尤其有用的酵母终止区是那些来源于酵母基因，尤其是糖酵母属、裂殖糖酵母属、假丝酵母属、耶氏酵母属或克鲁维酵母属的终止区。编码γ-干扰素和α-2干扰素的哺乳动物基因的3′区域也已知能在酵母中起作用。3′-区也可以是合成的，因为本领域的技术人员可利用可获得的信息来设计和合成用作转录终止子的3′-区序列。终止区可以是非必需的，但是是高度优选的。
载体除了上述调控元件之外还可包含选择性的和/或可评分的标记。优选地，标记基因是抗生素抗性基因，使得用抗生素处理细胞引起未转化细胞的生长抑制或死亡，但不抑制转化细胞的生长。为了选择酵母转化体，可使用在酵母中发挥功能的任何标记，使之具有对卡那霉素、潮霉素、和氨基配醣物G418的抗性并能够在缺乏尿嘧啶、赖氨酸、组氨酸、或亮氨酸的培养基上生长的标记是尤其有用的。
仅仅将基因插入克隆载体不确保它能以期望的速率、浓度、量等表达。根据对高表达率的需要，通过操作许多控制转录、RNA稳定性、翻译、蛋白质稳定性和位置、氧限制和从宿主细胞分泌的不同遗传元件，已经建立了许多专用的表达载体。一些操纵特征包括：相关转录启动子和终止子序列的性质，所克隆基因的拷贝数目以及该基因是质粒携带的还是整合进了宿主细胞的基因组中，所合成的外来蛋白质的最终细胞定位，蛋白质在宿主生物内的翻译和正确折叠的效率，所克隆基因的mRNA和蛋白质在宿主细胞内的固有稳定性和所克隆基因中的密码子使用，以使得其频率与宿主细胞的优选密码子使用频率接近。这些特征的每一种可用于本文所述的方法和宿主细胞中，以进一步优化PUFA生物合成途径基因的表达并减少天然Pex基因的表达。
在制备适于破坏或敲除天然过氧化物酶体生物合成因子蛋白和/或表达编码PUFA生物合成途径活性的基因的重组构建体(例如包含具有启动子、ORF和终止子的嵌合基因的构建体)后，将其置于能够在宿主细胞中自主复制的质粒载体中，或直接整合进宿主细胞基因组中。表达盒的整合可以在宿主基因组中随机地发生或者可以通过使用下述构建体来靶向，所述构建体含有足以靶向宿主基因座中的重组的与宿主基因组同源的区。如果构建体靶向内源性基因座，则转录和翻译调控区的全部或某些可以由内源性基因座提供。
当两个或更多个基因从独立的复制载体表达时，每个载体可具有不同的选择手段并且应当缺乏与其它构建体的同源性以便维持稳定表达和防止元件在构建体之间重配(reassortment)。可用实验方法确定对调控区、选择手段和所引入的构建体的增殖方法的正确选择，以便所有导入的基因均以需要的水平表达从而提供期望的产品的合成。
包含目的基因的构建体可以通过任何标准技术导入到宿主细胞中。这些技术包括转化(如醋酸锂转化[MethodsinEnzymology，194：186-187(1991)])、原生质体融合、基因枪轰击(bolisticimpact)、电穿孔、显微注射、真空过滤或将所关注的基因引入宿主细胞中的任何其它方法。
为方便起见，已经通过任何方法被操纵以摄取DNA序列(如表达盒)的宿主细胞在本文中将称为“转化的”或“重组的”。转化的宿主将具有至少一个表达构建体的拷贝，而且可以具有两个或更多个拷贝，这取决于该基因是整合进基因组内、被扩增还是存在于具有多拷贝数的染色体外元件上。
转化宿主细胞能通过选择导入构建体上包含的标记进行鉴定。作为另外一种选择，分离的标记构建体可用期望的构建体进行共转化，该方法与多种将多个DNA分子导入宿主细胞的转化技术一样。通常转化宿主通过它们在选择培养基上生长的能力进行选择。选择培养基可掺入抗生素或缺乏未转化宿主必需的生长因子，如营养物质或生长因子。导入的标记基因可赋予抗生素抗性，或编码必需的生长因子或酶，从而当在转化宿主中表达时允许在选择培养基上生长。转化宿主的选择也能发生在表达标记蛋白能被直接地或间接地检测出来时。标记蛋白可单独表达或融合到另一种蛋白中进行表达。标记蛋白可通过其酶活性(例如β-半乳醣苷酶可将X-gal[“5-溴-4-氯-3-吲哚基-β-D-半乳糖苷”]底物转化成着色产物；荧光素酶能将荧光素转化成发光产物)或其产光或改性特性(例如维多利亚多管水母(Aequoreavictoria)的绿荧光蛋白，它当用蓝光照亮时发荧光)进行检测。作为另外一种选择，能使用抗体检测标记蛋白或在例如所关注蛋白上的分子标记。能对表达标记蛋白或标记物的细胞进行选择，例如通过视觉检测或通过例如使用抗体分选或批选荧光活化细胞的技术。
无论选择哪种宿主或表达构建体，必须筛选多个转化体以获取显示期望的表达水平、调节和模式的菌株或植物品系，因为不同的独立转化事件导致不同水平和模式的表达(Jones等人，EMBOJ.，4：2411-2418(1985)；DeAlmeida等人，Mol.Gen.Genetics，218：78-86(1989))。这种筛选可以通过DNA印迹的Southern分析(Southern，J.Mol.Biol.，98：503(1975))、mRNA表达的Northern分析(Kroczek，J.Chromatogr.Biomed.Appl.，618(1-2)：133-145(1993))、蛋白质表达的Western和/或Elisa分析、PUFA产物的表型分析或GC分析来完成。
优选的真核宿主生物
多种真核生物适合作为本文的宿主，因此产生在天然过氧化物酶体生物合成因子蛋白和编码PUFA生物合成途径的基因中的包含破坏的转化宿主生物，与尚未破坏其天然过氧化物酶体生物合成因子蛋白的真核生物相比，其中转化的真核宿主生物的PUFA含量提高，所述PUFA被掺入到总脂质级分和油级分中，以总脂肪酸百分比形式表示。可获得的宿主可以是不同的哺乳动物体系、植物细胞、真菌、藻类、卵菌、酵母、原生藻菌和/或类眼虫。虽然优选含油生物，但本文也可使用非含油生物，使得当它们的一种天然PEX基因被破坏时，在总脂质级分或油级分中至少一种多不饱和脂肪酸的重量％相对于总脂肪酸的重量％提高，并且可导致PUFA提高1.3倍。此外，PUFA百分比可相对于非含油生物的干细胞重量提高。在另一个实施方案中，能基因修饰非含油生物使之变成含油生物，例如酵母如啤酒糖酵母。
含油生物天然能够合成并积聚油，其中总油含量通常大于细胞干重的约25％。将多种藻类、藓、真菌、酵母、原生藻菌和植物被天然地归类为含油生物。
优选的含油微生物包括那些藻类、原生藻菌和真菌生物，它们天然生产ω-3/ω-6PUFA。例如，ARA、EPA和/或DHA经由小环藻属(Cyclotellasp.)、菱形藻属(Nitzschiasp.)、腐霉属(Pythium)、破囊壶菌属(Thraustochytriumsp.)、裂殖壶菌属(Schizochytriumsp.)和被孢霉属(Mortierella)生产。Mackenzie等人(Appl.Environ.Microbiol.，66：4655(2000))描述了转化高山被孢霉(M.alpina)的方法。类似地，用于转化破囊壶菌目(Thraustochytriales)微生物(例如破囊壶菌属(Thraustochytrium)、裂殖壶菌属(Schizochytrium))的方法在美国专利7,001,772中公开。
更优选含油酵母，包括那些天然生产和那些经遗传工程化以生产ω-3/ω-6PUFA的酵母。通常鉴定为含油酵母的属包括但不限于：耶氏酵母属(Yarrowia)、假丝酵母属(Candida)、红酵母属(Rhodotorula)、红冬孢酵母属(Rhodosporidium)、隐球酵母属(Cryptococcus)、丝孢酵母属(Trichosporon)和油脂酵母属(Lipomyces)。更具体地讲，示例性的油合成酵母包括：圆红冬孢酵母(Rhodosporidiumtoruloides)、斯达氏油脂酵母(Lipomycesstarkeyii)、产油油脂酵母(L.lipoferus)、拉可夫氏假丝酵母(Candidarevkaufi)、铁红假丝酵母(C.pulcherrima)、热带假丝酵母(C.tropicalis)、产朊假丝酵母(C.utilis)、茁芽丝孢酵母(Trichosporonpullans)、皮状丝孢酵母(T.cutaneum)、胶粘红酵母(Rhodotorulaglutinus)、禾木科红酵母(R.graminis)和解脂耶氏酵母(Yarrowialipolytica)(以前归类为解脂假丝酵母(Candidalipolytica))。
最优选的是含油酵母解脂耶氏酵母；而且，在其它实施方案中，最优选的是命名为ATCC#76982、ATCC#20362、ATCC#8862、ATCC#18944和/或LGAMS(7)1的解脂耶氏酵母菌株(PapanikolaouS.和AggelisG.，Bioresour.Technol.，82(1)：43-9(2002))。
涉及转化解脂耶氏酵母的具体教导内容包括美国专利4,880,741和美国专利5,071,764，以及Chen，D.C.等人(Appl.MicrobiolBiotechnol..，48(2)：232-235(1997))，而合适的选择技术描述于美国专利7,238,482和国际申请公布WO2005/003310和WO2006/052870。
在解脂耶氏酵母中表达基因的优选方法是通过将线性DNA整合进宿主基因组中。当期望基因高水平表达时，整合进基因组中的多个位置可能是尤其有用的，例如在Ura3基因座(GenBank保藏号AJ306421)、Leu2基因座(GenBank保藏号AF260230)、Lys5基因座(GenBank保藏号M34929)、Aco2基因座(GenBank保藏号AJ001300)、Pox3基因座(Pox3：GenBank保藏号XP_503244或Aco3：GenBank保藏号AJ001301)、Δ12去饱和酶基因座(美国专利7,214,491)、Lip1基因座(GenBank保藏号Z50020)、Lip2基因座(GenBank保藏号AJ012632)、SCP2基因座(GenBank保藏号AJ431362)、Pex3基因座(GenBank保藏号CAG78565)、Pex16基因座(GenBank保藏号CAG79622)和/或Pex10基因座(GenBank保藏号CAG81606)。
优选的用于解脂耶氏酵母的选择方法是对卡那霉素、潮霉素和氨基糖苷G418的抗性以及在缺乏尿嘧啶、亮氨酸、赖氨酸、色氨酸或组氨酸的培养基上生长的能力。5-氟乳清酸[5-氟尿嘧啶-6-羧酸一水合物或“5-FOA”]也可用于选择酵母Ura-突变体。该化合物对具有编码乳清酸苷5′-单磷酸脱羧酶[OMP脱羧酶]的功能性URA3基因的酵母细胞有毒性；因此，基于这种毒性，5-FOA特别可用于选择和鉴定Ura-突变型酵母菌株(Bartel，P.L.和Fields，S.，Yeast2-HybridSystem，OxfordUniversity：NewYork，第7卷，第109-147页，1997；也参见国际申请公开WO2006/052870，用于5-FOA在耶氏酵母属中的应用)。
用于耶氏酵母属的备选的优选选择方法依赖于用于解脂耶氏酵母的基于磺酰脲(氯嘧磺隆；E.I.duPontdeNemours&Co.，Inc.，Wilmington，DE)抗性的显性非抗生素标记。更具体地讲，该标记基因是具有单个氨基酸改变(即W497L)的天然乙酰羟酸合酶(“AHAS”或乙酰乳酸合酶；E.C.4.1.3.18)，从而赋予了磺酰脲除草剂抗性(国际申请公布WO2006/052870)。AHAS是用于生物合成支链氨基酸(即缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸)的途径中的第一常用酶，并且它是磺酰脲和咪唑啉酮除草剂的靶标。
用于多不饱和脂肪酸生产的发酵方法
使转化的宿主细胞在优化PUFA生物合成基因的表达并且产生最大并且最经济产量的期望PUFA的条件下生长。通常，可通过改变碳源的类型和量、氮源的类型和量、碳氮比、不同矿物离子的量、氧水平、生长温度、pH、生物质生产期的时长、油积聚期的时长以及细胞收获的时间和方法来优化培养基条件。通常使所关注的含油酵母例如解脂耶氏酵母在复合培养基(例如酵母提取物-蛋白胨-葡萄糖肉汤培养基(YPD))或缺乏生长所必需的成分并强迫选择期望表达盒的确定成分的极限培养基(如YeastNitrogenBase(DIFCOLaboratories，Detroit，MI))中生长。
用于本文所述方法和宿主细胞的发酵培养基必须包含合适的碳源如在美国专利7,238,482中提出的碳源。合适的碳源涵盖多种来源，优选糖、甘油和/或脂肪酸。最优选的碳源是葡萄糖和/或包含介于10-22个碳之间的脂肪酸。
氮可以由无机源(如(NH4)2SO4)或有机源(如尿素或谷氨酸)提供。除了合适的碳源和氮源之外，发酵培养基还必须含有合适的矿物质、盐、辅因子、缓冲液、维生素和本领域技术人员已知的适合含油酵母生长并促进PUFA产生的酶促途径的其它组分。要特别注意促进脂质和PUFA合成的几种金属离子(如Fe+2、Cu+2、Mn+2、Co+2、Zn+2和Mg+2)(Nakahara，T.等人，Ind.Appl.SingleCellOils，D.J.Kyle和R.Colin编辑，第61-97页(1992))。
用于本文所述方法和宿主细胞的优选生长培养基是常规的商业制备培养基，如酵母氮源培养基(YeastNitrogenBase，DIFCOLaboratories，Detroit，MI)。也可以使用其它确定成分的生长培养基或合成的生长培养基，适于转化宿主细胞生长的培养基对微生物学或发酵科学来说是已知的。适于发酵的pH范围通常介于约pH4.0至pH8.0之间，其中优选将pH5.5至pH7.5作为初始生长条件的范围。发酵可以在有氧或厌氧条件下进行，其中优选为微好氧条件。
通常，在含油酵母细胞中积聚高水平的PUFA和TAG需要一个两阶段过程，因为代谢状态必须在生长和脂肪的合成/贮存之间达到“平衡”。因此，最优选的是，两阶段的发酵过程是在含油酵母中产生油所必需的。这种方法在美国专利7,238,482中有所描述，其也描述了多种合适的发酵工艺设计(即分批式、补料分批式和连续式)和生长过程中的注意事项。
PUFA油的纯化和处理
包括PUFA在内的脂肪酸可以游离脂肪酸或酯化形式如酰基甘油、磷脂、硫脂或糖脂形式存在于宿主生物中。这些脂肪酸可通过本领域熟知的多种方法从宿主细胞中提取。关于酵母脂质的提取技术、质量分析和可接受标准的一篇综述是Z.Jacobs(CriticalReviewsinBiotechnology，12(5/6)：463-491(1992))的综述。有关下游加工的简述也可由A.Singh和O.Ward(Adv.Appl.Microbiol.，45：271-312(1997))提供。
一般来讲，用于纯化脂肪酸(包括PUFA)的手段可包括用有机溶剂萃取(例如，美国专利6,797,303和美国专利5,648,564)、超声处理、超临界流体萃取(如使用二氧化碳)、皂化和物理手段(例如挤压)、或它们的组合。参见美国专利7,238,482.
油在食物、保健食品、药物和动物饲料中的用途
市场包含许多种掺入了ω-3和/或ω-6脂肪酸(尤其是ALA、GLA、ARA、EPA、DPA和DHA)的食物和饲料产品。可以预期，通过本文所述方法和宿主细胞制备的包含长链PUFA的微生物生物质、包含PUFA的部分纯化微生物生物质、包含PUFA的纯化微生物油、和/或纯化的PUFA赋予健康有益效果，通过加入这些物质改善了对食物或饲料的摄取。举例来说，可将这些油加到食物类似物、饮料、肉产品、谷类产品、烘焙食品、小吃食品和乳制品中。参见美国专利公开2006/0094092。
这些组合物通过加入到医疗食品(包括医疗营养物质、饮食补充剂、婴儿代乳品和药品)中可赋予健康有益效果。技术人员将会知道加到食品、饲料、饮食补充剂、营养物质、药品、和其它可摄取的产品中以赋予健康有益效果的油的量。本领域描述了摄取这些油获得的健康有益效果，它是技术人员已知的并进行了持续的研究。本文所指的量是“有效”量，除了其它方面的原因，它取决于摄入的包含这些油的产品的性质以及它们旨在治疗的病症。
优选实施方案的描述
如实施例所证明并如表5所概述的(下文)，破坏YlPex10p的C3HC4环状锌指基序的C-末端部分、缺失整个染色体YlPex10基因或整个染色体YlPex16基因、缺失整个染色体YlPex10和YlPex16基因、和缺失整个染色体YlPex3基因都导致产生解脂耶氏酵母的工程化PUFA生产菌株，相对于不破坏天然Pex蛋白的亲本菌株，该菌株具有以总脂肪酸百分比形式表示的、提高的PUFA重量％。在解脂耶氏酵母的工程化EPA生产菌株中表达染色体外的YlPex10p逆转了该效应，所述菌株在基因组Pex10p中具有破坏和提高的总脂质级分和油级分中的PUFA的量。
表5汇编了来自实施例3、4、5、7、9、11和12的数据，使得关于总脂质含量[“TFA％DCW”]、以总脂肪酸重量％表示的给定脂肪酸浓度[“TFA％”]、和干细胞重量百分比形式表示的给定脂肪酸含量[“DCW％”]的趋势能基于存在/不存在Pex破坏或敲除被推论出来。“期望PUFA％TFA”和“期望PUFA％DCW”分别定量期望的PUFA产物(即DGLA或EPA)的特定浓度或含量，所述产物通过设计的工程化PUFA生物合成途径进行生产。“全部PUFA”包括LA、ALA、EDA、DGLA、ETrA、ETA和EPA、然而“C20PUFA”被限定为EDA、DGLA、ETrA、ETA和EPA。
虽然数据不能直接地在实施例之间进行比较，但作为不同的耶氏酵母属菌株和生长条件的结果，可得出以下结论(相对于其天然Pex蛋白未被破坏的亲本菌株或其表达破坏天然Pex蛋白的“后备”拷贝的亲本菌株)：
1)在生产PUFA的耶氏酵母属中的Pex破坏导致总脂质级分和油级分中的单个PUFA例如EPA或DLGA的重量％相对于总脂肪酸的重量％(％TFA)提高；
2)在生产PUFA的耶氏酵母属中的Pex破坏导致总脂质级分和油级分中的C20PUFA的重量％相对于总脂肪酸的重量％(％TFA)提高；
3)通过延伸点1)，在生产PUFA的耶氏酵母属中的Pex破坏导致总脂质级分和油级分中的任何PUFA和所有PUFA组合的量相对于总脂肪酸的重量％提高；和
4)在生产PUFA的耶氏酵母属中的Pex破坏导致单个PUFA例如EPA或DLGA相对于干细胞重量的百分比提高。
当比较在“所有PUFA％DCW”、“C20PUFA％DCW”和TFA％DCW中的Pex破坏的效应时，观察到不同的结果。具体地讲，在一些情况下，在生产PUFA的耶氏酵母属中的Pex破坏导致总脂质级分和油级分中的C20PUFA或所有PUFA的量(以干细胞重量百分比形式表示)提高(相对于天然Pex蛋白未被破坏的亲本菌株)。在其它情况下，在总脂质级分和油级分中存在以干细胞重量百分比形式表示的减少量的C20PUFA或所有PUFA(相对于天然Pex蛋白未被破坏的亲本菌株)。也观察到相对于总脂质含量(TFA％DCW)的类似结果，因此Pex破坏的效应可能导致总脂质含量提高或降低。
虽然上文概述的每项内容都是受关注的，尤其有用的是检查Pex破坏对期望的PUFA相对于总PUFA量的比率的效应，对生物进行工程化以生产期望的PUFA。
例如，在包含Pex10破坏的菌株Y4128中54％的PUFA(％TFA)是EPA，所述破坏导致截去C末端的最后32个氨基酸，然而在亲本菌株Y4086中仅有16.3％的PUFA(％TFA)是EPA。因此，所述破坏导致期望的PUFA(％TFA)量提高3.3倍(实施例3、4)。在类似情况下，在菌株Y4036(ΔPex16)中62.8％的PUFA(％TFA)是DGLA，然而在Y4036-中仅有38.1％的PUFA(％TFA)是DGLA，提高了1.65倍(实施例9)。并且在菌株Y4036(ΔPex3)中67.7％的PUFA(％TFA)是DGLA，然而在Y4036-中仅有33.3％的PUFA(％TFA)是DGLA，提高了2.0倍(实施例12)。这些结果证实这一假说：Pex破坏导致总脂质级分和油级分中的期望的PUFA的量(％TFA)选择性地提高，所述PUFA通过工程化生物进行生产。
当检查Pex破坏对C20PUFA相对于总PUFA量的比率的效应时，观察到较低的选择性。例如，在包含Pex10破坏的菌株Y4128中，73％的PUFA(％TFA)是C20PUFA，然而在菌株Y4086中，仅有42％的PUFA(％TFA)是C20PUFA。因此，破坏导致总脂质级分和油级分中积聚的C20PUFA相对于总PUFA的量提高1.7倍(实施例3、4)。在类似情况下，在菌株Y4036(ΔPex16)中71％的PUFA(％TFA)是C20PUFA，然而在Y4036-中仅有54.8％的PUFA(％TFA)是C20PUFA，提高了1.3倍(实施例9)。并且在菌株Y4036(ΔPex3)中82.4％的PUFA(％TFA)是C20PUFA，然而在Y4036-中仅有47.4％的PUFA(％TFA)是C20PUFA，提高了1.7倍(实施例12)。
基于教导和本文所述的结果，期望将实现以下方法的可行性和商业可用性：利用在编码过氧化物酶体生物合成因子蛋白的天然基因中的多个破坏作为提高在生产PUFA的真核生物中的PUFA量的方法。生产PUFA的真核生物能够合成多种ω-3和/或ω-6PUFA，该合成利用Δ9延伸酶/Δ8去饱和酶途径或Δ6去饱和酶/Δ6延伸酶途径。
实施例
在以下实施例中进一步描述本发明，所述实施例示出了实施本发明的简要方法，但不完全限定其所有可能变型。
一般方法
实施例中使用的标准重组DNA技术和分子克隆技术是本领域所熟知的并且在如下文献中有所描述：1)Sambrook，J.，Fritsch，E.F.和Maniatis，T.的MolecularCloning：ALaboratoryManual；ColdSpringHarborLaboratory：ColdSpringHarbor，NY(1989)(Maniatis)；2)T.J.Silhavy，M.L.Bennan和L.W.Enquist，ExperimentswithGeneFusions；ColdSpringHarborLaboratory：ColdSpringHarbor，NY(1984)；以及3.)Ausubel，F.M.等人，CurrentProtocolsinMolecularBiology，由GreenePublishingAssoc.和Wiley-Interscience出版，Hoboken，NJ(1987)。
适用于微生物培养物的维持和生长的材料和方法是本领域熟知的。适用于下面实施例的技术可在ManualofMethodsforGeneralBacteriology(PhillippGerhardt，R.G.E.Murray，RalphN.Costilow，EugeneW.Nester，WillisA.Wood，NoelR.Krieg和G.BriggsPhillips编辑)，AmericanSocietyforMicrobiology：Washington，D.C.(1994))；或ThomasD.BrockinBiotechnology：ATextbookofIndustrialMicrobiology，第2版，SinauerAssociates：Sunderland，MA(1989)的描述中找到。用于生长和维持微生物细胞的所有试剂、限制性酶和材料得自AldrichChemicals(Milwaukee，WI)、DIFCOLaboratories(Detroit，MI)、NewEnglandBiolabs，Inc.(Beverly，MA)、GIBCO/BRL(Gaithersburg，MD)、或SigmaChemicalCompany(St.Louis，MO)。通常于37℃下在LuriaBertani(LB)平板上培养大肠杆菌菌株。
一般的分子克隆根据标准方法(Sambrook等人，同上)来完成。DNA序列是在ABI自动测序仪上采用染料终止剂技术(美国专利5,366,860；EP272,007)使用载体和插入特异性引物的组合来产生的。序列编辑是在Sequencher(GeneCodesCorporation，AnnArbor，MI)中进行的。所有序列在两个方向上覆盖至少两次。除非另外指明，使用DNASTAR软件(DNASTARInc.，Madison，WI)比较本文的基因序列。
缩写的含义如下：“sec”表示秒，“min”表示分钟，“h”表示小时，“d”表示天，“μL”表示微升，“mL”表示毫升，“L”表示升，“μM”表示微摩尔浓度，“mM”表示毫摩尔浓度，“M”表示摩尔浓度，“mmol”表示毫摩尔，“μmole”表示微摩尔，“g”表示克，“μg”表示微克，“ng”表示纳克，“U”表示单位，“bp”表示碱基对，并且“kB”表示千碱基对。
表达盒的命名：
表达盒的结构通过简单的记号系统“X::Y::Z”表示，其中X描述启动子片段，Y描述基因片段而Z描述终止子片段，它们均彼此可操作地连接。
解脂耶氏酵母的转化和培养
解脂耶氏酵母菌株ATCC#20362购自美国典型培养物保藏中心(Rockville，MD)。解脂耶氏酵母菌株通常是在根据下面所示配方的数种培养基中于28-30℃下培育。根据标准方法，按需要通过将20g/L琼脂添加到每种液体培养基中来制备琼脂平板。
YPD琼脂培养基(每升)：10g酵母提取物[Difco]、20g细菌用蛋白胨[Difco]、以及20g葡萄糖。
基本培养基(MM)(每升)：20g葡萄糖、1.7g无氨基酸酵母氮源、1.0g脯氨酸，并且pH6.1(不需要调节)。
基本培养基+尿嘧啶(MM+尿嘧啶或MMU)(每升)：如上制备MM培养基并加入0.1g尿嘧啶和0.1g尿苷。
基本培养基+尿嘧啶+磺酰脲类(MMU+SU)(每升)：如上制备MMU培养基并加入280mg磺酰脲类。
基本培养基+亮氨酸+赖氨酸(MMLeuLys)(每升)：如上制备MM培养基并加入0.1g亮氨酸和0.1g赖氨酸。
基本培养基+5-氟乳清酸(MM+5-FOA)(每升)：20a葡萄糖、6.7g酵母氮源、75mg尿嘧啶、75mg尿苷，并且基于对一系列从100mg/L至1000mg/L的浓度的FOA活性试验(因为供应商提供的每批料中会发生改变)，选用适量的FOA(ZymoResearchCorp.，Orange，CA)。
高葡萄糖培养基(HGM)(每升)：80葡萄糖、2.58gKH2PO4和5.36gK2HPO4，pH7.5(不需要调节)。
无酵母提取物的发酵培养基(FM无YE)(每升)：6.70g酵母氮源、6.00gKH2PO4，2.00gK2HPO4、1.50gMgSO4*7H2O和20g葡萄糖。
发酵培养基(FM)(每升)：如上制备无YE培养基的FM并加入5.00g酵母提取物(BBL)。
合成右旋糖培养基(SD)(每升)：6.7g酵母氮源，具有硫酸铵并且无氨基酸；和20g葡萄糖。
CompleteMinimalGlucoseBrothMinusUracil(CSM-Ura)：目录号
C8140，Teknova，Hollister，CA(0.13％氨基酸缺陷型粉末，无尿嘧啶。0.17％酵母氮源，0.5％(NH4)2SO4，2.0％葡萄糖)。
解脂耶氏酵母的转化根据Chen，D.C.等人(Appl.MicrobiolBiotechnol.，48(2)：232-235(1997))的方法完成，除非另外说明。简而言之，将耶氏酵母划线到YPD平板上，并在30℃下生长大约18小时。从平板上刮掉几大环量的细胞并将其重悬浮于含有下面成分的lmL转化缓冲液中：2.25mL50％PEG，平均分子量为3350；0.125mL2M醋酸锂，pH6.0；以及0.125mL2MDTT。然后，将大约500ng线性化的质粒DNA在100μL重悬浮的细胞中孵育，并将其在39℃下维持1小时，每间隔15分钟进行涡旋混合。将细胞铺在选择培养基平板上并在30℃下维持2至3天。
解脂耶氏酵母的脂肪酸分析
为了进行脂肪酸分析，将细胞通过离心收集并如Bligh，E.G.&Dyer，W.J.(Can.J.Biochem.Physiol.，37：911-917(1959))中所述提取脂质。通过将脂质提取物与甲醇钠进行酯交换反应而制备脂肪酸甲酯[“FAME”(Roughan，G.和NishidaI.，ArchBiochemBiophys.，276(1)：38-46(1990))并随后将其用配有30m×0.25mm(内径)HP-INNOWAX(Hewlett-Packard)柱的Hewlett-Packard6890气相色谱仪(GC)进行分析。炉温以3.5℃/分钟从170℃(保持25分钟)升到185℃。
为了进行直接的碱催化酯交换反应，收获耶氏酵母培养物(3mL)，在蒸馏水中洗涤一次，并在Speed-Vac中在真空下干燥5-10分钟。将甲醇钠(100μL，浓度为1％)加入样本中，然后将样本涡旋振荡20分钟。在加入3滴1M氯化钠和400μL己烷后，涡旋并离心样本。移出上层并如上所述用GC进行分析。
实施例1
产生解脂耶氏酵母菌株Y4086以通过Δ9延伸酶/Δ8去饱和酶途径生产 占总脂质约14％的EPA
本实施例描述了来源于解脂耶氏酵母ATCC#20362的菌株Y4086的构建，该菌株能通过Δ9延伸酶/Δ8去饱和酶途径的表达生产相对于总脂质而言约14％的EPA(图3A)。
菌株Y4086的产生需要构建菌株Y2224(由野生型耶氏酵母菌株ATCC#20362的Ura3基因自主突变而产生的FOA抗性突变体)、菌株Y4001(产生17％EDA，具有Leu-表型)、菌株Y4001U(Leu-和Ura表型)、菌株Y4036(产生18％DGLA，具有Leu-表型)、菌株Y4036U(具有Leu-和Ura-表型)和菌株Y4070(产生12％ARA，具有Ura-表型)。关于构建菌株Y2224、Y4001、Y4001U、Y4036、Y4036U和Y4070的更多细节描述于实施例7，国际申请公布WO2008/073367。
相对于野生型解脂耶氏酵母ATCC#20362，菌株Y4070的最终基因型是Ura3-、unknown1-、unknown3-、Leu+、Lys+、GPD::FmD12::Pex20、YAT1::FmD12::OCT、YAT1::ME3S::Pex16、GPAT::EgD9e::Lip2、EXP1::EgD9eS::Lip1、FBAINm::EgD9eS::Lip2、FBAINm::EgD8M::Pex20、EXP1::EgD8M::Pex16、FBAIN::EgD5::Aco、EXP1::EgD5S::Pex20、YAT1::RD5S::OCT(其中FmD12是串珠镰刀菌Δ12去饱和酶基因[国际申请公布WO2005/047485]；ME3S是经密码子优化的C16/18延伸酶基因，来源于高山被孢霉[国际申请公布WO2007/046817]；EgD9e是小眼虫Δ9延伸酶基因[国际申请公布WO2007/061742]；EgD9eS是经密码子优化的Δ9延伸酶基因，来源于小眼虫[国际申请公布WO2007/061742]；EgD8M是合成突变型Δ8去饱和酶[国际申请公布WO2008/073271]，来源于小眼虫[美国专利7,256,033]；EgD5是小眼虫Δ5去饱和酶[美国专利申请公布US2007-0292924-A1]；EgD5S是经密码子优化的Δ5去饱和酶基因，来源于小眼虫[美国专利申请公布2007-0292924]；以及RD5S是经密码子优化的Δ5去饱和酶，来源于多甲藻属CCMP626[美国专利申请公布2007-0271632])。
产生菌株Y4086以生产占总脂质约14％的EPA
构建体pZP3-Pa777U(图3B；SEQIDNO：28)描述于表19，国际申请公布WO2008/07336，它被生成以将三个Δ17去饱和酶基因整合进菌株Y4070的Pox3位点中(GenBank保藏号AJ001301)，从而生成EPA。Δ17去饱和酶基因是PaD17，一种瓜果腐霉菌Δ17去饱和酶(国际申请公布WO2008/054565)，和PaD17S，一种经密码子优化的Δ17去饱和酶，来源于瓜果腐霉菌(国际申请公布WO2008/054565)。
将pZP3-Pa777U质粒用AscI/SphI消化，然后根据“一般方法”将其用于转化菌株Y4070。将转化细胞铺在MM平板上并在30℃下维持2至3天。将单菌落再次划线至MM平板上，随后将其在30℃下接种至液体MMLeuLys中并以250rpm/min摇动2天。离心收集细胞，提取脂质，通过酯交换反应来制备FAME，并随后用Hewlett-Packard6890GC进行分析。
GC分析显示，EPA存在于含有pZP3-Pa777U的3种嵌合基因的转化体中，但不存在于亲本Y4070菌株中。所选的96个菌株中大部分产生占总脂质约10-13％的EPA。有2个菌株(即#58和#79)产生了占总脂质约14.2％和13.8％的EPA。将这两个菌株分别命名为Y4085和Y4086。
相对于野生型解脂耶氏酵母ATCC#20362，菌株Y4086的最终基因型是Ura3+、Leu+、Lys+、unknown1-、unknown2-、YALI0F24167g-、GPD::FmD12::Pex20、YAT1::FmD12::OCT、YAT1::ME3S::Pex16、GPAT::EgD9e::Lip2、EXP1::EgD9eS::Lip1、FBAINm::EgD9eS::Lip2、FBAINm::EgD8M::Pex20、EXP1::EgD8M::Pex16、FBAIN::EgD5::Aco、EXP1::EgD5S::Pex20、YAT1::RD5S::OCT、YAT1::PaD17S::Lip1、EXP1::PaD17::Pex16、FBAINm::PaD17::Aco。
实施例2
产生解脂耶氏酵母菌株Y4128以通过Δ9延伸酶/Δ8去饱和酶途径生产 占总脂质约37％的EPA
本实施例描述来源于解脂耶氏酵母ATCC#20362的菌株Y4128的构建，该菌株能够产生相对于总脂质约37.6％的EPA(即，相对于Y4086以总脂肪酸的百分比表示的EPA浓度有大于2倍的提高；图3A)。
菌株Y4128的产生需要构建菌株Y2224、Y4001、Y4001U、Y4036、Y4036U、Y4070和Y4086(如实施例1所述)，以及构建菌株Y4086U1(Ura-)。
产生菌株Y4086U1(Ura-)
菌株Y4086U1经由在菌株Y4086的构建体pY117中暂时表达Cre重组酶(图4A；SEQIDNO：29；描述于国际申请公布WO2008/073367的表20中)制备Ura-表型。这从基因组释放出LoxP夹着的Ura3基因。突变的耶氏酵母属乙酰羟酸合酶[“AHAS”；E.C.4.1.3.18](即，GenBank保藏号XP501277，包含W497L突变，如SEQIDNO：27所示；参见国际申请公布WO2006/052870)在质粒pY117中，赋予其磺酰脲类抗除草剂性(SUR)，该抗性用作阳性筛选标记。
根据“一般方法”将质粒pY117用于转化菌株Y4086。在转化后，将细胞置于MMU+SU(280μg/mL磺酰脲类；也称作氯嘧磺隆，E.I.duPontdeNemours&Co.，Inc.，Wilmington，DE)平板上并在30℃下保持2至3天。挑取在MMU+SU平板上生长的SUR单菌落，将其在30℃下划线至YPD液体培养基中并以250rpm/min摇动1天以固化pY117质粒。将生长培养基划线接种在MMU平板上。在30℃下保持两天后，将单克隆再划线接种在MM和MMU平板上。选择可以在MMU平板上生长但不在MM平板上生长的那些菌落。将这些菌株中具有Ura-表型的两个菌株命名为Y4086U1和Y4086U2。
产生菌株Y4128以生产占总脂质约37％的EPA
制备构建体pZP2-2988(图4B；SEQIDNO：30；描述于表21，国际申请公布WO2008/073367)以将一个Δ12去饱和酶基因(即，FmD12S，一种经密码子优化的Δ12去饱和酶基因，来源于串珠镰刀菌[国际申请公布WO2005/047485])、两个Δ8去饱和酶基因(即，EgD8M)和一个Δ9延伸酶基因(即，EgD9eS)整合进菌株Y4086U1的Pox2位点(GenBank保藏号AJ001300)中，从而在较高水平上生产EPA。将pZP2-2988质粒用AscI/SphI消化，然后根据“一般方法”将其用于转化菌株Y4086U1。将转化细胞铺在MM平板上并在30℃下维持2至3天。将单菌落再次划线至MM平板上，随后将其在30℃下接种至液体MMLeuLys中并以250rpm/min摇动2天。通过离心收集细胞，将其重悬浮于HGM中，然后以250rpm/min摇动5天。离心收集细胞，提取脂质，通过酯交换反应来制备FAME，并随后用Hewlett-Packard6890GC进行分析。
GC分析显示所选择的96个菌株中的大多数生产了占总脂12-15.6％的EPA。有2个菌株(即，GroupI中的#37和GroupII中的#33)生产占总脂质约37.6％和16.3％的EPA。将这两个菌株分别命名为Y4128和Y4129。
相对于野生型解脂耶氏酵母ATCC#20362的菌株Y4128的最终基因型是：YALI0F24167g-、Pex10-、unknown1-、unknown2-、GPD::FmD12::Pex20、YAT1::FmD12::OCT、GPM/FBAIN::FmD12S::OCT、YAT1::ME3S::Pex16、GPAT::EgD9e::Lip2、EXP1::EgD9eS::Lip1、FBAINm::EgD9eS::Lip2、FBA::EgD9eS::Pex20、FBAINm::EgD8M::Pex20、EXP1::EgD8M::Pex16、GPDIN::EgD8M::Lip1、YAT1::EgD8M::Aco、FBAIN::EgD5::Aco、EXP1::EgD5S::Pex20、YAT1::RD5S::OCT、YAT1::PaD17S::Lip1、EXP1::PaD17::Pex16、FBAINm::PaD17::Aco。
在2007年8月23日将解脂耶氏酵母菌株Y4128保藏于美国典型培养物保藏中心，并且命名为ATCCPTA-8614。
产生具有Ura-表型的Y4128U菌株
为了破坏菌株Y4128中的Ura3基因，制备构建体pZKUE3S(图5ASEQIDNO：31；描述于表22，国际申请公布WO2008/073367)以将EXP1::ME3S::Pex20嵌合基因整合进菌株Y4128的Ura3基因中。将质粒pZKUE3S用SphI/PacI消化，然后根据“一般方法”将其用于转化菌株Y4128。转化后，将细胞铺至MM+5-FOA选择平板上并在30℃下维持2至3天。
挑取在MM+5-FOA选择平板上生长的总共24个转化体，并且再次划线接种到新MM+5-FOA平板上。从板上剥离细胞，提取脂质，通过酯交换反应来制备FAME，并随后用Hewlett-Packard6890GC进行分析。
GC分析显示来自平板的具有pZKUE3S的所有转化体中存在10-15％的EPA。鉴定为#3、#4、#10、#12、#19和#21的菌株分别生产占总脂质12.9％、14.4％、15.2％、15.4％、14％和10.9％的EPA，将它们分别命名为Y4128U1、Y4128U2、Y4128U3、Y4128U4、Y4128U5和Y4128U6(统称为Y4128U)。
Y4128(37.6％)对Y4128U(平均13.8％)％EPA定量差异是因为不同的生长条件而产生的。具体地讲，前者的培养基是在液体培养基中生长两天后进行分析的，而后者的培养基是在琼脂平板上生长后进行分析的。申请人已经观察到当比较琼脂平板与液体培养基中的结果时，％EPA提高了2-3倍。因此，虽然不能直接比较结果，但Y4128和Y4128U菌株都证明产生了EPA。
实施例3
测定解脂耶氏酵母菌株Y4128的总脂质含量
通过GC分析法测定菌株Y4128生产的脂质总量和脂质中的每种脂肪酸物质的百分比。具体地讲，如一般方法所述，提取总脂质，通过酯交换反应来制备FAME，并随后用Hewlett-Packard6890GC进行分析。
干细胞重量如下进行测定：从10mL培养物中经由离心收集细胞，用水洗涤细胞一次以除去残余培养基，在80℃真空炉中干燥细胞过夜，称量干细胞重量。样本中的FAME总量通过比较GC特征图中的所有峰面积与加入的已知量内部标准品C15:0脂肪酸的峰面积而进行测定。
基于上述分析，测定菌株Y4086和Y4128的以干细胞重量百分比形式表示的脂质含量(DCW)和脂质组成。菌株Y4128与菌株Y4086相比脂质含量降低(11.2TFA％DCW对28.6TFA％DCW)。相反地，菌株Y4128与菌株Y4086相比脂质中的EPA浓度提高，如下表6所示。脂肪酸被鉴定为18:0(硬脂酸)、18:1(油酸)、LA、ALA、EDA、DGLA、ETrA、ETA和EPA；脂肪酸组成表示为总脂肪酸的重量百分比(wt.％)(TFA)。
表6
在解脂耶氏酵母菌株Y4086和Y4128中的脂质组成
样本 18:0 18:1 18:2[LA] 18:3(n-3)[ALA] 20:2[EDA] 20:3(n-6)[DGLA] 20:3(n-3)[ETrA] 20:4(n-3)[ETA] 20:5(n-3)[EPA]
Y4086 4.6 26.8 28.0 6.9 7.6 0.9 4.9 2.0 9.8
Y4128 1.8 6.7 19.6 1.8 4.2 3.4 1.5 6.0 42.8
细胞中的EPA含量以mgEPA/g干细胞形式表示，并且按照下式计算：(％EPA/脂质)*(％脂质/干细胞重量)*0.1，其从菌株Y4086中的28mgEPA/gDCW提高到菌株Y4128中的47.9mgEPA/gDCW。
因此，表6中的结果显示与亲本菌株Y4086相比，菌株Y4128具有更低的总脂质含量(TFA％DCW)(11.2％对28.6％)，更高的EPA％TFA(42.8％对9.8％)，和更高的EPA％DCW(4.8％对2.8％)。此外，菌株Y4128的EPA相对于总PUFA的量提高了3.3倍(54％的PUFA[％TFA]对16.3％的PUFA[％TFA])，而C20PUFA相对于总PUFA的量提高了1.7倍(73％的PUFA[％TFA]对42％的PUFA[％TFA])。
实施例4
测定在解脂耶氏酵母菌株Y4128中的整合位点pZP2-2988发生Pex10整 合
菌株Y4128中的pZP2-2988基因组整合位点通过基因组步移法，使用来自Clontech(PaloAlto，CA)的UniversalGenomeWalkerTM试剂盒，按照制造商推荐的规程进行测定。基因质粒序列，设计以下引物用于基因组步移法：pZP-GW-5-1(SEQIDNO：32)、pZP-GW-5-2(SEQIDNO：33)、pZP-GW-5-3(SEQIDNO：34)、pZP-GW-5-4(SEQIDNO：35)、pZP-GW-3-1(SEQIDNO：36)、pZP-GW-3-2(SEQIDNO：37)、pZP-GW-3-3(SEQIDNO：38)和pZP-GW-3-4(SEQIDNO：39)。
使用QiagenMiniprep试剂盒用改进规程从菌株Y4128中制备基因组DNA。从YPD培养基平板上刮除细胞并置于1.5mL微管中。将细胞沉淀物(100μL)用250μL缓冲液P1重悬，该缓冲液P1包含0.125Mβ-巯基乙醇和1mg/mL酵母裂解酶20T(MPBiomedicals，Inc.，Solon，OH)。细胞悬浮液在37℃下培养30分钟。然后将缓冲液P2(250μL)加到管中。在将管颠倒几次进行混合后，加入350μL缓冲液N3。然后将微管中的混合物在14,000rpm下离心5分钟。将上清液注入Qiagen小量制备离心柱中，离心1分钟。加入0.75mL缓冲液PE洗涤一次柱子，然后在14,000rpm下离心1分钟。在14,000rpm下再离心1分钟干燥该柱。通过加入50μL的缓冲液EB到柱中洗脱基因组DNA，允许静置1分钟并在14,000rpm下离心1分钟。
使用纯化的基因组DNA进行基因组步移法。按照GenomeWalker试剂盒的规程，用限制性酶DraI、EcoRV、PvuII和StuI分别消化DNA。就每次消化而言，反应混合物包含10μL10X限制缓冲液、10μL适用的限制性酶和8μg基因组DNA，总体积为100μL。反应混合物在37℃下培养4小时。然后使用QiagenPCR纯化试剂盒，严格按照制造商规程纯化经消化的DNA样本。DNA样本用16μL水洗脱。然后将纯化的经消化基因组DNA样本连接到genomewalker衔接子上(下文)。每个连接混合物包含1.9μLgenomewalker衔接子、1.6μL10X连接缓冲液、0.5μLT4DNA连接酶和4μL消化过的DNA。反应混合物在16℃下培养过夜。然后将72μL的50mMTrisHCl、1mMEDTA，pH7.5加入到每个连接混合物中。
就5′末端基因组步移法而言，使用1μL的每个连接混合物作模板进行四个PCR反应。此外，每个反应混合物包含1μL的10μM引物pZP-GW-5-1(SEQIDNO：32)、1μL的10μM试剂盒配送的GenomeWalker衔接子、41μL水、5μL10XcDNAPCR反应缓冲液和1μL来自Clontech的AdvantagecDNA聚合酶混合物。GenomeWalker衔接子序列(SEQIDNOs：40[顶链]和41[底链])显示如下：
5′-GTAATACGACTCACTATAGGGCACGCGTGGTCGACGGCCCG
GGCTGGT-3′
3′-H2N-CCCGACCA-5′
PCR条件如下：95℃1分钟，随后是30个95℃20秒和68℃3分钟的循环，最后在68℃下延伸7分钟。将PCR产物每个进行1:100的稀释，并且将1μL稀释PCR产物用作模板进行第二轮PCR。条件是完全相同的，除了用pZP-GW-5-2(SEQIDNO：33)代替pZP-GW-5-1(SEQIDNO：32)。
就3′-末端基因组步移而言，如上文所述进行四个PCR反应，除了使用引物pZP-GW-3-1(SEQIDNO：36)和巢式衔接子引物(SEQIDNO：42)。PCR产物同样进行稀释并用作第二轮PCR的模板，使用pZP-GW-3-2(SEQIDNO：37)代替pZP-GW-3-1(SEQIDNO：36)。
通过凝胶电泳分析PCR产物。使用EcoRV消化的基因组DNA作为模板和引物pZP-GW-3-2以及巢式衔接子引物，一个反应产物生成～1.6kB的片段。分离该片段，用Qiagen凝胶纯化试剂盒纯化并克隆到pCR2.1-TOPO中。序列分析显示该片段包括两部分：质粒pZP2-2988和耶氏酵母属来自染色体C的基因组DNA。它们在染色体C的核苷酸位点139826上接合。这是位于Pex10基因的编码区内部(GenBank保藏号CAG81606；SEQIDNO：10)。
为了测定接合的5′末端，使用来自菌株Y4128的基因组DNA作为模板以及引物Per10F1(SEQIDNO：43)和ZPGW-5-5(SEQIDNO：44)进行PCR扩增。反应混合物包括1μL的每个均为20μM的引物、1μL基因组DNA、22μL水和25μLTaKaRaExTaq2X预混物(TaKaRaBioInc.，OtsuShiga，Japan)。热循环仪条件是：94℃1分钟，然后为30个94℃20秒、55℃20秒和72℃2分钟的循环，之后在72℃下进行7分钟最终延伸反应。扩增了1.6kB的DNA片段并将其克隆到pCR2.1-TOPO中。序列分析显示它是一个嵌合片段，该片段位于耶氏酵母属来自染色体C的基因组DNA和pZP2-2988之间。接合位于染色体C的核苷酸位点139817。因此，染色体C的10个核苷酸的片段被来自菌株Y4128中的pZP2-2988(图4B)AscI/SphI片段置换。因此，菌株Y4128中的Pex10缺少编码蛋白的最后32个氨基酸。
基于上述结论，实施例2中分离的Y4128U菌株2(同上)后来称为Δpex10菌株。为清楚起见，菌株Y4128U1等同于菌株Y4128U1(Δpex10)。
实施例5
在解脂耶氏酵母菌株Y4128U1(Δpex10)中的Pex10质粒表达
构建递送解脂耶氏酵母Pex10基因的三个质粒：1)pFBAIn-PEX10允许Pex10ORF在FBAINm启动子控制下表达；和2)pPEX10-1和pPEX10-2允许在天然Pex10启动子控制下表达Pex10，虽然pPEX10-1使用较短版本(～500bp)的启动子而pPEX10-2使用较长版本(～900bp)的启动子。在构建这些表达质粒并转化后，测定Pex10质粒表达对解脂耶氏酵母菌株Y4128U1(Δpex10)总油含量和EPA含量的效应。缺失Pex10导致细胞中以TFA百分比形式表示的EPA的量提高，但是以DCW百分比形式表示的总脂质的量降低。
构建pFBAIn-PEX10、pPEX10-1和pPEX10-2
为了构建pFBAIn-PEX10，使用引物Per10F1(SEQIDNO：43)和Per10R(SEQIDNO：45)，使用解脂耶氏酵母基因组DNA作为模板扩增Pex10基因的编码区。PCR反应混合物包含1μL每个均为20μM的引物、1μL解脂耶氏酵母基因组DNA(～100ng)、25μLExTaq2X预混物和22μL水。反应如下进行：94℃1分钟，然后为30个94℃20秒、55℃20秒和72℃90秒的循环，之后在72℃下进行7分钟最终延伸反应。PCR产物是一个1168bp的DNA片段，它用QiagenPCR纯化试剂盒进行纯化，用NcoI和NotI消化，并克隆到用相同的两个限制性酶消化的pFBAIn-MOD-1(SEQIDNO：46；图5B)中。
8个单克隆进行序列分析，2个具有无错的正确Pex10序列。pFBAIn-PEX10(SEQIDNO：47；图6A)组分在下表7中列出。
表7
质粒pFBAIn-PEX10(SEQIDNO：47)的组分
SEQ ID NO：47内的RE位点和核苷酸 片段和嵌合基因组分的描述
BglII-BsiWI(6040-318) FBAINm::Pex10::Pex20，它包含：●FBAINm：解脂耶氏酵母FBAINm启动子(美国专利7,202,356)；●Pex10：解脂耶氏酵母Pex10ORF(GenBank保藏号AB036770，核苷酸1038-2171；SEQ ID NO：21)；●Pex20：来自耶氏酵母属Pex20基因(GenBank保藏号AF054613)的Pex20终止子序列
PacI-BglII(4530-6040) 耶氏酵母属URA3(GenBank保藏号AJ306421)
(3123-4487) 耶氏酵母属自主复制序列18(ARS18；GenBank保藏号A17608)
(2464-2864) 大肠杆菌f1复制起点
(1424-2284) 用于在大肠杆菌中选择的氨苄青霉素抗性基因(AmpR)
(474-1354) ColE1质粒复制起点
为了构建pPEX10-1和pPEX10-2，设计并合成引物PEx10-R-BsiWI(SEQIDNO：48)、PEX10-F1-SalI(SEQIDNO：49)和PEX10-F2-SalI(SEQIDNO：50)。使用基因组解脂耶氏酵母DNA以及引物PEX10-R-BsiWI和PEX10-F1-SalI进行的PCR扩增生成1873bp的片段，该片段包含Pex10ORF，Pex10基因的500bp的5′上游区域和215bp的3′下游区域，该基因的两端侧接SalI和BsiWI限制性位点。该片段用QiagenPCR纯化试剂盒进行纯化，用SalI和BsiWI消化，并克隆到用相同的两个酶消化的pEXP-MOD-1(SEQIDNO：51；图6B)中以生成pPEX10-1(SEQIDNO：52；图7A)。质粒pEXP-MOD1类似于pFBAIn-MOD-1(SEQIDNO：46；图5B)，除了后者的FBAINm启动子被EXP1启动子置换。表8列出pPEX10-1的组分。
表8
质粒pPEX10-1(SEQIDNO：52)的组分
SEQ ID NO：52中的RE位点和核苷酸 片段和嵌合基因组分的描述
SalI-BsiWI(5705-1) Pex10-5′::Pex10::Pex10-3′，它包含：●Pex10-5′：解脂耶氏酵母Pex10基因的500bp的5′启动子区域；●Pex10：解脂耶氏酵母Pex10ORF(GenBank保藏号AB036770，核苷酸1038-2171；SEQ ID NO：21)；●Pex10-3′：来自耶氏酵母属Pex10基因的215bp的Pex10终止子序列(GenBank保藏号AB036770)[注意图中的整个Pex10-5′::Pex10::Pex10-3′表达盒统一标记成“PEX10”]
PacI-SalI(4216-5703) 耶氏酵母属URA3基因(GenBank保藏号AJ306421)
(2806-4170) 耶氏酵母属自主复制序列18(ARS18；GenBank保藏号A17608)
(2147-2547) 大肠杆菌f1复制起点
(1107-1967) 用于在大肠杆菌中选择的氨苄青霉素抗性基因(AmpR)
(157-1037) ColE1质粒复制起点
使用PEX10-R-BsiWI(SEQIDNO：48)和PEX10-F2-SalI(SEQIDNO：50)对解脂耶氏酵母基因组DNA进行PCR扩增生成2365bp的片段，该片段包含Pex10ORF，Pex10基因的991bp的5′上游区域和215bp的3′下游区域，该基因的两端侧接SalI和BsiWI限制性位点。用QiagenPCR纯化试剂盒纯化该片段，用SalI和BsiWI进行消化，然后将其克隆到进行了相似消化的pEXP-MOD-1中。这导致合成pPEX10-2(SEQIDNO：53)，其构建类似于质粒pPEX10-1的构建(表8，同上)，除了在嵌合Pex10-5′::Pex10::Pex10-3′基因中有更长的Pex10-5′启动子。
在菌株Y4128U1(Δpex10)中表达Pex10
按照一般方法中的规程将质粒pFBAIN-MOD-1(对照物；SEQIDNO：46)、pFBAIn-PEX10(SEQIDNO：47)、pPEX10-1(SEQIDNO：52)和pPEX10-2(SEQIDNO：53)转化到Y4128U1(Δpex10)中。将转化体置于MM平板上。递送上述质粒的转化体总脂质含量和脂肪酸组成按照实施例3所述进行分析。
下表9显示以干细胞重量(DCW)百分比表示的脂质含量和脂质组成。具体地讲，将脂肪酸鉴定为18:0(硬脂酸)、18:1(油酸)、LA、ALA、EDA、DGLA、ETrA、ETA和EPA；脂肪酸组成表示为总脂肪酸的重量百分比(wt.％)。
表9中的结果显示在Y4128U1(Δpex10)中从天然解脂耶氏酵母Pex10启动子或从解脂耶氏酵母FBAINm启动子表达Pex10，将EPA百分比降低回Y4086的水平，同时将总脂质含量(TFA％DCW)提高到Y4086的水平(参见表6数据用于比较)。每克干细胞的EPA含量从对照样本中(即，递送pFBAIn-MOD-1的细胞)的63.2mg变成递送pFBAIn-PEX10的细胞中的31.5mg、递送pPEX10-1的细胞中的29mg以及递送pPEX10-2的细胞中的30.8mg。这些结果证明破坏Pex10的环指结构域提高了细胞中的EPA的量但降低细胞中的总脂质含量。
因此，表9的结果显示与具有对照质粒的Y4128U1(Δpex10)转化体相比，所有具有Pex10表达质粒的转化体显示更高的脂质含量(TFA％DCW)(＞27％对22.8％)、更低的EPA％TFA(大约10.8％对27.7％)、和更低的EPA％DCW(＜3.1％对6.3％)。此外，具有对照质粒的菌株Y4128U1(Δpex10)转化体与那些具有Pex10表达质粒的转化体相比，EPA相对于总PUFA的量提高了2.5倍(44％的PUFA[％TFA]对17.5％(平均值)的PUFA[％TFA])，C20PUFA相对于总PUFA的量提高了1.5倍(67％的PUFA[％TFA]对44％(平均值)的PUFA[％TFA])。
实施例6
生成Y4184U菌株用于生产EPA
解脂耶氏酵母菌株Y4184U用作实施例7中的宿主，下文菌株Y4184U来源于解脂耶氏酵母ATCC#20362，并且能够经由Δ9延伸酶/Δ8去饱和酶途径的表达生产EPA。该菌株具有Ura-表型并且其构建如实施例7所述，国际申请公布WO2008/073367。
然而概括地说，菌株Y4184U的产生需要构建菌株Y2224、菌株Y4001、菌株Y4001U、菌株Y4036、菌株Y4036U和菌株Y4069(如上文实施例1所述)。进一步产生菌株Y4184U(在图7B用图表表示)需要生成菌株Y4084、菌株Y4084U1、菌株Y4127(在2007年11月29日保藏于美国典型培养物保藏中心，保藏号ATCCPTA-8802)、菌株Y4127U2、菌株Y4158、菌株Y4158U1和菌株Y4184。质粒构建体pZKL1-2SP98C用于转化菌株Y4127U2，在图8A中用图表表示(SEQIDNO：54；描述于表23，国际申请公布WO2008/073367)。质粒pZKL2-5U89GC用于转化菌株Y4158U1，在图8B中显示(SEQIDNO：55；描述于表24，国际申请公布WO2008/073367)。
相对于野生型解脂耶氏酵母ATCC#20362的菌株Y4184(生产占总脂质31％的EPA)的最终基因型是unknown1-、unknown2-、unknown4-、unknown5-、unknown6-、unknown7-、YAT1::ME3S::Pex16、EXP1::ME3S::Pex20(2拷贝)、GPAT::EgD9e::Lip2、FBAINm::EgD9eS::Lip2、EXP1::EgD9eS::Lip1、FBA::EgD9eS::Pex20、YAT1::EgD9eS::Lip2、GPD::EgD9eS::Lip2、GPDIN::EgD8M::Lip1、YAT1::EgD8M::Aco、EXP1::EgD8M::Pex16、FBAINm::EgD8M::Pex20、FBAIN::EgD8M::Lip1(2拷贝)、GPM/FBAIN::FmD12S::Oct、EXP1::FmD12S::Aco、YAT1::FmD12::Oct、GPD::FmD12::Pex20、EXP1::EgD5S::Pex20、YAT1::EgD5S::Aco、YAT1::Rd5S::Oct、FBAIN::EgD5::Aco、FBAINm::PaD17::Aco、EXP1::PaD17::Pex16、YAT1::PaD17S::Lip1、YAT1::Y1CPT1::Aco、GPD::YlCPT1::Aco(其中FmD12是串珠镰刀菌Δ12去饱和酶基因[国际申请公布WO2005/047485]；FmD12S是经密码子优化的Δ12去饱和酶基因，来源于串珠镰刀菌[国际申请公布WO2005/047485]；ME3S是经密码子优化的C16/18延伸酶基因，来源于高山被孢霉[国际申请公布WO2007/046817]；EgD9e是小眼虫Δ9延伸酶基因[国际申请公布WO2007/061742]；EgD9eS是经密码子优化的Δ9延伸酶基因，来源于小眼虫[国际申请公布WO2007/061742]；EgD8M是合成突变型Δ8去饱和酶[国际申请公布WO2008/073271]，来源于小眼虫[美国专利7,256,033]；EgD5是小眼虫Δ5去饱和酶[美国专利申请公布US2007-0292924-A1]；EgD5S是经密码子优化的Δ5去饱和酶基因，来源于小眼虫[美国专利申请公布2007-0292924]；RD5S是经密码子优化的Δ5去饱和酶，来源于多甲藻属CCMP626[美国专利申请公布2007-0271632]；PaD17是瓜果腐霉菌Δ17去饱和酶[国际申请公布WO2008/054565]；PaD17S是一种经密码子优化的Δ17去饱和酶，来源于瓜果腐霉菌[国际申请公布WO2008/054565]；和YlCPT1是一种解脂耶氏酵母二酰基甘油胆碱磷酸转移酶基因[国际申请公布WO2006/052870])。
为了破坏菌株Y4184中的Ura3基因，构建体pZKUE3S(图5ASEQIDNO：31；描述于表22，国际申请公布WO2008/073367)用于将EXP1::ME3S::Pex20嵌合基因整合进菌株Y4184的Ura3基因中以分别产生菌株Y4184U1(占总脂质11.2％的EPA)、Y4184U2(占总脂质10.6％的EPA)和Y4184U4(占总脂质15.5％的EPA)(统称为Y4184U)。
实施例7
解脂耶氏酵母菌株Y4184U4中的Pex10染色体缺失提高了EPA的积聚 和总脂质含量
构建体pYPS161(图9A，SEQIDNO：56)用于从生产EPA的耶氏酵母属菌株Y4184U4中敲除染色体Pex10基因(实施例6)。用Pex10敲除构建体转化解脂耶氏酵母菌株Y4184U4导致生成菌株Y4184(Δpex10)。测定并比较Pex10敲除对总油量和EPA含量的效应。具体地讲，敲除Pex10导致细胞中EPA(％TFA和％DCW)百分比提高以及总脂质含量提高。
构建体pYSP161
构建体pYPS161包含以下组分：
表10
质粒pYPS161(SEQIDNO：56)的描述
SEQ ID NO：56中的RE位点和核苷酸 片段和嵌合基因组分的描述
AscI/BsiW I(1521-157) 耶氏酵母属Pex10基因的1364bp的Pex10敲除片段#1(GenBank保藏号AB036770)
PacI/SphI(5519-4229) 耶氏酵母属Pex10基因的1290bp的Pex10敲除片段#2(GenBank保藏号AB036770)
SalI/EcoRI(7170-5551) 耶氏酵母属URA3基因(GenBank保藏号AJ306421)
2451-1571 ColE1质粒复制起点
3369-2509 用于在大肠杆菌中选择的氨苄青霉素抗性基因(AmpR)
3977-3577 大肠杆菌f1复制起点
生成解脂耶氏酵母基因敲除菌株Y4184(ΔPex10)
用于转化解脂耶氏酵母菌株Y4184U4(实施例6)的标准规程使用Pex10敲除构建体pYPS161的纯化5.3kBAscI/SphI片段(同上)，并且还制备了细胞单独对照。在每个转化实验中有大约200至250个菌落存在，然而在细胞单独平板上无菌落存在(每期望值)。
菌落PCR用于筛选具有Pex10缺失的细胞。具体地讲，PCR反应使用MasterAmpTaq聚合酶(EpicentreTechnologies，Madison，WI)，使用PCR引物Pex-10del13′.正向(SEQIDNO：57)和Pex-10del25′.反向(SEQIDNO：58)，按照标准规程进行。PCR反应条件为94℃5分钟，然后30个94℃30秒、60℃30秒和72℃2分钟的循环，之后在72℃下进行6分钟的最终延伸反应。然后将该反应保持在4℃下。如果Pex10基因敲除构建体在Pex10区域整合，期望生成长度为2.8KB的单一PCR产物。相反地，如果该菌株在除Pex10区域之外的染色体区域内整合Pex10基因敲除构建体，则将生成两个PCR片段，即2.8kB和1.1kB的片段。在288个筛选的菌落中，大部分菌落具有在随机位点整合的Pex10基因敲除构建体。288个菌落中仅有一个菌落包含Pex10敲除。将该菌株命名为Y4184(Δpex10)。
评估解脂耶氏酵母菌株Y4184和Y4184(ΔPex10)的总油和EPA产量
为了评估Pex10基因敲除对总脂质级分中的PUFA百分比和细胞中的总脂质含量的效应，菌株Y4184和Y4184(Δpex10)在可比较的含油条件下生长。具体地讲，培养物在初始OD600为～0.1的情况下开始生长，在含有25mL发酵培养基(FM)或无酵母提取物(FM无YE)的FM培养基的250mL烧瓶中生长48小时。在50mL圆锥管中，以8000rpm离心10分钟收获细胞。弃去上清液，将细胞重悬于25mLHGM中并转移到新的250mL烧瓶中。细胞在30℃下透气培养另外120小时。
为了测定干细胞重量(DCW)，处理来自5mLFM生长培养基和10mL无YE生长培养物的FM的细胞。培养的细胞在4300rpm下离心10分钟。使用10mL生理盐水重悬沉淀物并在相同条件下二次离心。然后用1mL无菌H2O(第三次)重悬沉淀物，将其转移到预先称重的铝盘中。细胞在80℃真空炉中干燥过夜。测量细胞重量。
递送上述质粒的转化体的总脂质含量和脂肪酸组成如实施例3所述分析。DCW、总脂质含量(TFA％DCW)、总EPA％TFA、和EPA％DCW在下表11中显示。
表11
在解脂耶氏酵母菌株Y4184和Y4184中的脂质组成(ΔPex10)
表11中的结果显示敲除Y4184(ΔPex10)中的染色体Pex10基因与菌株Y4184中的EPA百分比和总油含量相比提高EPA百分比(％TFA和％DCW)并提高总油含量，菌株Y4184的天然Pex10p未被敲除。更具体地讲，在FM培养基中，EPA(％TFA)有约109％的提高，EPA产量(％DCW)有约216％的提高，总油量(TFA％DCW)有约49％的提高。在无YE的FM培养基中，EPA(％TFA)有约100％的提高，EPA产量(％DCW)有约205％的提高，总油量(TFA％DCW)有约50％的提高。
因此，表11中的结果显示与亲本菌株Y4184相比，Y4184(ΔPex10)菌株在FM培养基中具有更高的脂质含量(TFA％DCW)(17.6％对11.8％)，更高的EPA％TFA(43.2％对20.6％)，和更高的EPA％DCW(7.6％对2.4％)。同样的，与亲本菌株Y4184相比，Y4184(ΔPex10)菌株在无YE的FM培养基中具有更高的脂质含量(TFA％DCW)(13.2％对8.8％)，更高的EPA％TFA(46.1％对23.2％)，和更高的EPA％DCW(6.1％对2.0％)。
实施例8(预测的)
在解脂耶氏酵母的PUFA生产菌株中的替代Pex基因的染色体敲除
本实施例描述了已经进行了工程化以生产ω-3/ω-6PUFA的解脂耶氏酵母的多个菌株。如果使用实施例7的方法同上破坏编码Pex1p、Pex2p、Pex3p、Pex3Bp、Pex4p、Pex5p、Pex6p、Pex7p、Pex8p、Pex12p、Pex13p、Pex14p、Pex16p、Pex17p、Pex19p、Pex20p、Pex22p或Pex26p的染色体基因，预期这些解脂耶氏酵母宿主菌株中的任何一种都能进行工程化以生产在总脂质级分和油级分中含量提高的ω-3/ω-6PUFA。
更具体地讲，申请人的受让人已经工程化了多种解脂耶氏酵母菌株，经由表达异源Δ6去饱和酶/Δ6延伸酶PUFA途径或异源Δ9延伸酶/Δ8去饱和酶PUFA途径来生产高浓度的多种ω-3/.ω-6PUFA。
生产ω-3/ω-6PUFA的代表性解脂耶氏酵母菌株概述
虽然在下表中概述了一些代表性菌株，但公开的生产ω-3/ω-6PUFA的解脂耶氏酵母菌株不受本文菌株的任何方式的限制。相反地，除了以下共有的和共同未决的专利申请之外，在本专利申请中提供的所有教导对于开发合适的工程化解脂耶氏酵母菌株以生产ω-3/ω-6PUFA也是有用的。这些教导具体地讲包括以下申请人的受让人的共同未决的专利和专利申请：美国专利7,125,672、美国专利7,189,559、美国专利7,192,762、美国专利7,198,937、美国专利7,202,356、美国专利7,214,491、美国专利7,238,482、美国专利7,256,033、美国专利7,259,255、美国专利7,264,949、美国专利7,267,976、美国专利7,273,746、美国专利申请10/985254和10/985691(提交于2004年11月10日)、美国专利申请11/183664(提交于2005年7月18日)、美国专利申请11/185301(提交于2005年7月20日)、美国专利申请11/190750(提交于2005年7月27日)、美国专利申请11/198975(提交于2005年8月8日)、美国专利申请11/253882(提交于2005年10月19日)、美国专利申请11/264784和11/264737(提交于2005年11月1日)、美国专利申请11/265761(提交于2005年11月2日)、美国专利申请11/601563和11/601564(提交于2006年11月16日)、美国专利申请11/635258(提交于2006年12月7日)、美国专利申请11/613420(提交于2006年12月20日)、美国专利申请11/787772(提交于2007年4月18日)、美国专利申请11/737772(提交于2007年4月20日)、美国专利申请11/740298(提交于2007年4月26日)、美国专利申请12/111237(提交于2008年4月29日)、美国专利申请11/748629和11/748637(提交于2007年5月15日)、美国专利申请11/779915(提交于2007年7月19日)、美国专利申请60/991266(提交于2007年11月30日)、美国专利申请11/952243(提交于2007年12月7日)、美国专利申请61/041716(提交于2008年4月2日)、美国专利申请12/061738(提交于2008年4月3日)、美国专利申请12/099811(提交于2008年4月9日)、美国专利申请12/102879(提交于2008年4月15日)、美国专利申请12/111237(提交于2008年4月29日)、美国专利申请61/055511(提交于2008年5月23日)和美国专利申请61/093007(提交于2008年8月29日)。
Pex基因的染色体敲除
在选择优选解脂耶氏酵母菌株生产期望的ω-3/ω-6PUFA(或它们的PUFA组合)后，本领域的技术人员能够容易地工程化合适的基因敲除构建体(类似于在实施例7中的pYPS161)以使得染色体Pex敲除基因通过转化进入解脂耶氏酵母菌株。优选的Pex基因将包括：YlPex1p(GenBank保藏号CAG82178；SEQIDNO：1)、YlPex2p(GenBank保藏号CAG77647；SEQIDNO：2)、YlPex3p(GenBank保藏号CAG78565；SEQIDNO：3)、YlPex3Bp(GenBank保藏号CAG83356；SEQIDNO：4)、YlPex4p(GenBank保藏号CAG79130；SEQIDNO：5)、YlPex5p(GenBank保藏号CAG78803；SEQIDNO：6)、YlPex6p(GenBank保藏号CAG82306；SEQIDNO：7)、YlPex7p(GenBank保藏号CAG78389；SEQIDNO：8)、YlPex8p(GenBank保藏号CAG80447；SEQIDNO：9)、YlPex12p(GenBank保藏号CAG81532；SEQIDNO：11)、YlPex13p(GenBank保藏号CAG81789；SEQIDNO：12)、YlPex14p(GenBank保藏号CAG79323；SEQIDNO：13)、YlPex16p(GenBank保藏号CAG79622；SEQIDNO：14)、YlPex17p(GenBank保藏号CAG84025；SEQIDNO：15)、YlPex19p(GenBank保藏号AAK84827；SEQIDNO：16)、YlPex20p(GenBank保藏号CAG79226；SEQIDNO：17)、YlPex22p(GenBank保藏号CAG77876；SEQIDNO：18)和YlPex26p(GenBank保藏号NC_006072，反义翻译核苷酸117230-118387；SEQIDNO：19)。
期望的是染色体破坏Pex基因将导致与天然过氧化物酶体生物合成因子蛋白未被破坏的真核生物相比，在总脂质级分和油级分中积聚的以总脂肪酸百分比形式表示的PUFA量增加，其中所述PUFA量可能是：1)以功能性PUFA生物合成途径期望的终产品形式产生的PUFA，与以中间体或副产品形式产生的PUFA相反，2)C20和C22PUFA，和/或3)总PUFA。优选的结果是与天然过氧化物酶体生物合成因子蛋白未被破坏的真核生物相比，不但以总脂肪酸百分比表示的PUFA量提高，而且以干细胞重量百分比形式表示的PUFA量也提高。此外，PUFA量可能是：1)以功能性PUFA生物合成途径期望的终产品形式产生的PUFA，与以中间体或副产品形式产生的PUFA相反，2)C20和C22PUFA，和/或3)总PUFA。在一些情况下，相对于未破坏天然过氧化物酶体生物合成因子蛋白的真核生物，总脂质含量也提高。
实施例9
在解脂耶氏酵母菌株Y4036U中的Pex16染色体缺失提高了积聚的 DGLA百分比
本实施例描述使用构建体pYRH13(图9B；SEQIDNO：59)敲除DGLA生产耶氏酵母属菌株Y4036U(实施例1)中的染色体Pex16基因。用Pex16敲除构建体转化解脂耶氏酵母菌株Y4036U导致生成菌株Y4036U(Dpex16)。测定并比较Pex16敲除对DGLA含量的效应。具体地讲，敲除Pex16导致细胞中以总脂肪酸百分比形式存在的DGLA百分比提高。
构建体pYRH13
质粒pYRH13来源于质粒pYPS161(图9A，SEQIDNO：56；实施例7)。具体地讲，解脂耶氏酵母Pex16基因(GenBank保藏号CAG79622)的1982bp的5′启动子区域置换pYPS161的AscI/BsiWI片段，解脂耶氏酵母Pex16基因(GenBank保藏号CAG79622)的448bp的3′终止子区域置换pYPS161的PacI/SphI片段以生成pYRH13(SEQIDNO：59；图9B)。
生成解脂耶氏酵母基因敲除菌株Y4036(ΔPex16)
使用标准规程，用Pex16敲除构建体pYRH13的纯化6.0kBAscI/SphI片段转化解脂耶氏酵母的菌株Y4036U(实施例1)。
为了筛选具有Pex16缺失的细胞，使用Taq聚合酶(Invitrogen；Carlsbad，CA)、PCR引物PEX16Fii(SEQIDNO：60)和PEX16Rii(SEQIDNO：61)进行菌落PCR。设计这组引物以扩增完整Pex16基因的1.1kB区域，因此Pex16缺失突变体(即，Δpex16)将不生成该条带。设计第二组引物生成仅当Pex16基因被缺失时出现的条带。具体地讲，一个引物(即3UTR-URA3；SEQIDNO：62)结合到导入的6.0kBAscI/SphI破坏片段的载体序列区域上，而另一个引物(即，PEX16-conf；SEQIDNO：63)结合到在破坏片段的同源序列之外染色体Pex16终止子序列上。
更具体地讲，使用反应混合物进行菌落PCR，所述混合物包含：20mMTris-HCl(pH8.4)、50mMKCl、1.5mMMgCl2、400μM各种dGTP、dCTP、dATP、和dTTP、2μM的各个引物、20μL的水和2UTaq聚合酶。扩增如下进行：94℃120秒进行初始变性，随后在94℃60秒进行35个循环的变性，在55℃下退火60秒，在72℃下延伸120秒。最后在72℃下进行5分钟的最终延伸循环，然后在4℃下终止反应。
在205个筛选的菌落中，195个菌落具有在染色体随机位点整合的Pex16敲除片段，因此不是Δpex16突变体(然而，由于存在pYRH13，细胞能够在ura-平板上生长)。这些随机整合的菌株中的三个，命名为Y4036U-17、Y4036U-19和Y4036U-33，用作脂质生产实验中的对照物(下文)。
筛选的剩余10个菌落(即，总计205个菌落中的剩余菌落)包含Pex16基因敲除。将在Y4036U菌株背景中的这十个Δpex16突变体命名为RHY25至RHY34。
通过定量实时PCR确认解脂耶氏酵母基因敲除菌株Y4036U(ΔPex16)
通过定量实时PCR在菌株RHY25至RHY34中对Pex16基因敲除进行进一步确认，使用耶氏酵母属翻译延伸因子(tef-1)基因(GenBank保藏号AF054510)作为对照物。
首先，设计分别靶向于Pex16基因和tef-1基因的实时PCR引物和TaqMan探针，该设计使用PrimerExpress软件v2.0(AppliedBiosystems，FosterCity，CA)。具体地讲，设计实时PCR引物ef-324F(SEQIDNO：64)、ef-392R(SEQIDNO：65)、PEX16-741F(SEQIDNO：66)和PEX16-802R(SEQIDNO：67)以及TaqMan探针ef-345T(即，5′6-FAMTM-TGCTGGTGGTGTTGGTGAGTT-TAMRATM，其中核苷酸序列如SEQIDNO：68所示)和PEX16-760T(即，5′-6FAMTM-CTGTCCATTCTGCGACCCCTC-TAMRATM，其中核苷酸序列如EQIDNO：69所示)。TaqMan荧光探针5′末端具有结合的6FAMTM荧光报告基因染料，而3′末端包含TAMRATM淬灭剂。所有引物和探针获取自Sigma-Genosys(Woodlands，TX)。
敲除候选DNA通过在50μL水中悬浮1个菌落进行制备。tef-1和PEX16的反应分别进行，每个样本重复三次。实时PCR反应包括20pmoles各个正向和反向引物(即，ef-324F、ef-392R、PEX16-741F和PEX16-802R5′，同上)、5pmolesTaqMan探针(即，ef-345T和PEX16-760T)、10μLTaqManUniversalPCRMasterMix--NoAmpEraseUracil-N-Glycosylase(UNG)(目录号PN4326614，AppliedBiosystems)、1μL菌落悬浮液和8.5μL去RNase/DNase水，每个反应总体积为20μL。反应在ABIPRISM7900SequenceDetectionSystem上进行，使用以下条件：初始在95℃变性10分钟，随后进行95℃变性15秒、60℃退火1分钟的循环40次。在每个循环期间通过监控6-FAMTM荧光自动收集实时数据。使用用于数据归一化的tef-1基因阈值循环(CT)值，按照ABIPRISM7900SequenceDetectionSystem使用说明书进行数据分析。
基于这一分析，得出结论：所有十个Y4036U(Δpex16)菌落(即，RHY25至RHY34)是有效的Pex16基因敲除菌落，其中pYRH13构建体已经整合进染色体YlPex16中。
评估用于DGLA生产的解脂耶氏酵母菌株Y4036U和Y4036U(δPex16)
为了评估Pex16基因敲除对总脂质级分中的PUFA百分比和细胞中的总脂质含量的效应，使Y4036U和Y4036U(Δpex16)菌株在可比较的含油条件下生长。更具体地讲，菌株Y4036U-17、Y4036U-19和Y4036U-33具有在染色体随机位点整合的Pex16基因敲除片段，上述菌株被认为是Pex16野生型(即，Y4036U)，而菌株RHY25至RHY34是Pex16突变型菌株(即，Y4036U(Δpex16))。每个菌株在起始OD600为～0.1的情况下，在包含90mg/LL-亮氨酸的25mLMM中，置于125mL烧瓶中培养48小时。在50mL圆锥管中，以4300rpm离心5分钟收获细胞。弃去上清液，将细胞重悬于25mLHGM中并转移到新的125mL烧瓶中。细胞在30℃下透气培养另外120小时。
下表13中显示了每个菌株的脂肪酸组成(即，LA(18:2)，ALA，EDA和DGLA)；脂肪酸组成以占总脂肪酸的重量百分比(wt.％)的形式表示。菌株Y4036U和Y4036U(Δpex16)的平均脂肪酸组成用灰色突出显示并且用“Ave”指示。在MM+L-亮氨酸培养基中无受试菌株提供足够的细胞群，因此不能分析总脂质含量。
表13
解脂耶氏酵母菌株Y4036U和Y4036U(Δpex16)中的脂质组成
表13中的结果显示敲除Y4036U(Δpex16)中的染色体Pex16基因与天然Pex16p未被敲除的菌株Y4036U中的DGLA％TFA相比较，DGLA％TFA提高了大约85％。然而，Y4036U(Δpex16)积聚的LA(18:2)也降低了～40％。
因此，表13中的结果显示与亲本菌株Y4036相比，Y4036(ΔPex16)菌株具有更高的平均DGLA％TFA(43.4％对23.4％)。此外，菌株Y4036U(Δpex16)的DGLA相对于总PUFA的量提高了1.65倍(62.8％的PUFA[％TFA]对38.1％的PUFA[％TFA])，而C20PUFA相对于总PUFA的量提高了1.3倍(71％的PUFA[％TFA]对54.8％的PUFA[％TFA])。
实施例10
产生菌株Y4305以生产占总脂质约53.2％的EPA
解脂耶氏酵母菌株Y4305U具有Ura-表型，它在下文的实施例11中被用作宿主。菌株Y4305(Ura+菌株，它是Y4305U的亲本)来源于解脂耶氏酵母ATCC#20362，该菌株能通过Δ9延伸酶/Δ8去饱和酶途径的表达生产相对于总脂质而言约53.2％的EPA。
菌株Y4305U的产生需要构建菌株Y2224、菌株Y4001、菌株Y4001U、菌株Y4036、菌株Y4036U、菌株Y4070和菌株Y4086(如上文实施例1所述)。进一步开发菌株Y4305U需要构建菌株Y4086U1、菌株Y4128和菌株Y4128U3(如上文实施例2所述)。随后产生菌株Y4305U(如图10所示)需要构建菌株Y4217(生产42％的EPA)、菌株Y4217U2(Ura-)、菌株Y4259(生产46.5％的EPA)、菌株Y4259U2(Ura-)和菌株Y4305(生产53.2％的EPA)。
虽然本文未详细阐述关于转化和选择EPA生产菌株(在菌株Y4128U3后开发的菌株)的细节，但是在实施例1和2中描述了分离菌株Y4217、菌株Y4217U2、菌株Y4259、菌株Y4259U2、菌株Y4305和菌株Y4305U的方法。
简而言之，生成构建体pZKL2-5U89GC(图8B；SEQIDNO：55；描述于表24，国际申请公布WO2008/073367)以将一个Δ9延伸酶基因(即，EgD9eS)、一个Δ8去饱和酶基因(即，EgD8M)、一个Δ5去饱和酶基因(即，EgD5S)、和一个解脂耶氏酵母二酰基甘油胆碱磷酸转移酶(CPT1)基因整合进菌株Y4128U3的Lip2位点(GenBank保藏号AJ012632)中，从而产生较高含量的EPA。六个分别命名为Y4215、Y4216、Y4217、Y4218、Y4219和Y4220的菌株分别生产占总脂质约41.1％、41.8％、41.7％、41.1％、41％和41.1％的EPA。
菌株Y4217U1和Y4217U2经由构建体pZKUE3S破坏菌株Y4217中的Ura3基因进行制备(图5ASEQIDNO：31；描述于表22，国际申请公布WO2008/073367)，它包含定向于Ura3基因的嵌合EXP1::ME3S::Pex20基因。利用构建体pZKL1-2SP98C(图8ASEQIDNO：54；描述于表23，国际申请公布WO2008/073367)将一个Δ9延伸酶基因(即，EgD9eS)、一个Δ8去饱和酶基因(即，EgD8M)、一个Δ12去饱和酶基因(即，FmD12S)、和一个解脂耶氏酵母CPT1基因整合进菌株Y4217U2的Lip1位点(GenBank保藏号Z50020)中，从而产生分离菌株Y4259、Y4260、Y4261、Y4262、Y4263和Y4264，分别生产占总脂质约46.5％、44.5％、44.5％、44.8％、44.5％和44.3％的EPA。
然后经由用构建体pZKUM进行转化制备Ura-衍生物(即，菌株Y4259U2)(图11A；SEQIDNO：70；描述于表33，国际申请公布WO2008/073367)，该构建体将Ura3突变基因整合进菌株Y4259的Ura3基因中，从而分别产生分离的菌株Y4259U1、Y4259U2和Y4259U3(统称为Y4259U)(分别生产占总脂质31.4％、31％和31.3％的EPA)。
最后，生成构建体pZKD2-5U89A2(图11B；SEQIDNO：71)以将一个Δ9延伸酶基因、一个Δ5去饱和酶基因、一个Δ8去饱和酶基因、和一个Δ12去饱和酶基因整合进菌株Y4259U2的二酰基甘油酰基转移酶(DGAT2)位点中，从而使EPA产量提高。pZKD2-5U89A2质粒含有如下组分：
表14
描述质粒pZKD2-5U89A2(SEQIDNO：71)
SEQ ID NO：71中的RE位点和核苷酸 片段和嵌合基因组分的描述
AscI/BsiWI(1-736) 耶氏酵母属DGAT2基因的728bp的5′部分(SEQ IDNO：72)(图中标记为“YLDGAT5”；美国专利7,267,976)
PacI/SphI(4164-3444) 耶氏酵母属DGAT2基因的714bp的3′部分(SEQ IDNO：72)(图中标记为“YLDGAT3”；美国专利7,267,976)
SwaI/BsiWI(13377-1) YAT1::FmD12S::Lip2，它包含：●YAT1：解脂耶氏酵母YAT1启动子(在图中标记为“YAT”；专利申请公布US 2006/0094102-A1)；●FmD12S：经密码子优化的Δ12延伸酶(SEQ IDNO：74)，来源于串珠镰刀菌(图中标记为“F.D12S”；国际申请公布WO 2005/047485)；●Lip2：来自耶氏酵母属Lip2基因(GenBank保藏号AJ012632)的Lip2终止子序列
PmeI/SwaI(10740-13377) FBAIN::EgD8M::Lip1，它包含：●FBAIN：解脂耶氏酵母FBAIN启动子(美国专利7,202,356)；●EgD8M：合成突变型Δ8去饱和酶(SEQ ID NO：76；专利申请公布US 2008-0138868A1)，来源于小眼虫(“EgD8S”；美国专利7,256,033)；●Lip1：来自耶氏酵母属Lip1基因(GenBank保藏号Z50020)的Lip1终止子序列
ClaI/PmeI(8846-10740) YAT1::E389D9eS::OCT，它包含：●YAT1：解脂耶氏酵母YAT1启动子(在图中标记为“YAT”；专利申请公布US 2006/0094102-A1)；●E389D9eS：经密码子优化的Δ9延伸酶(SEQ IDNO：78)，来源于小型绿藻属CCMP389(图中标记为“D9ES-389”；国际申请公布WO 2007/061742)；●OCT：耶氏酵母属OCT基因(GenBank保藏号X69988)的OCT终止子序列
ClaI/EcoRI(8846-6777) 耶氏酵母属Ura3基因(GenBank保藏号AJ306421)
EcoRI/PacI(6777-4164) EXP1::EgD5S::ACO，它包含：●EXP1：解脂耶氏酵母输出蛋白(EXP1)启动子(在图中标记为“Exp”；国际申请公布WO 2006/052870)。●EgD5S：经密码子优化的Δ5去饱和酶(SEQ IDNO：80)，来源于小眼虫(专利申请公布US2007-0292924-A1)；●Aco：耶氏酵母属Aco基因(GenBank保藏号AJ001300)的Aco终止子序列
将pZKD2-5U89A2质粒用AscI/SphI消化，然后根据“一般方法”将其用于转化菌株Y4259U2。将转化细胞铺在MM平板上并在30℃下维持3至4天。将单菌落再划线接种到MM平板上，所得菌落用于接种液体MM。液体培养物以250rpm/min，在30℃下摇动2天。通过离心收集细胞，将其重悬浮于HGM中，然后以250rpm/min摇动5天。通过离心收集细胞，并提取脂质。通过酯交换制备FAME并随后用Hewlett-Packard6890GC进行分析。
GC分析显示大多数选择的96个菌株生产占总脂质40-46％的EPA。命名为Y4305、Y4306、Y4307和Y4308的四个菌株分别生产占总脂质约53.2％、46.4％、46.8％和47.8％的EPA。Y4305的全部脂质分布如下：16:0(2.8％)、16:1(0.7％)、18:0(1.3％)、18:1(4.9％)、18:2(17.6％)、ALA(2.3％)、EDA(3.4％)、DGLA(2.0％)、ARA(0.6％)、ETA(1.7％)和EPA(53.2％)。总脂质％干细胞重量是27.5。
相对于野生型解脂耶氏酵母ATCC#20362的菌株Y4305的最终基因型是SCP2-(YALI0E01298g)、YALI0C18711g-、Pex10-、YALI0F24167g-，unknown1-、unknown3-、unknown8-、GPD::FmD12::Pex20、YAT1::FmD12::OCT、GPM/FBAIN::FmD12S::OCT、EXP1::FmD12S::Aco、YAT1::FmD12S::Lip2、YAT1::ME3S::Pex16、EXP1::ME3S::Pex20(3copies)、GPAT::EgD9e::Lip2、EXP1::EgD9eS::Lip1、FBAINm::EgD9eS::Lip2、FBA::EgD9eS::Pex20、GPD::EgD9eS::Lip2、YAT1::EgD9eS::Lip2、YAT1::E389D9eS::OCT、FBAINm::EgD8M::Pex20、FBAIN::EgD8M::Lip1(2个拷贝)、EXP1::EgD8M::Pex16、GPDIN::EgD8M::Lip1、YAT1::EgD8M::Aco、FBAIN::EgD5::Aco、EXP1::EgD5S::Pex20、YAT1::EgD5S::Aco、EXP1::EgD5S::ACO、YAT1::RD5S::OCT、YAT1::PaD17S::Lip1、EXP1::PaD17::Pex16、FBAINm::PaD17::Aco、YAT1::Y1CPT1::ACO、GPD::YlCPT1::ACO。
为了破坏菌株Y4305中的Ura3基因，使用构建体pZKUM(图11A；SEQIDNO：70；描述于表33，国际申请公布WO2008/073367)以将Ura3突变基因整合进菌株Y4305的Ura3基因中。挑取在MM+5-FOA平板上生长的总共8个转化体，并且再次分别划线接种到MM平板和MM+5-FOA平板上。所有8个菌株具有Ura-表型(即，细胞能在MM+5-FOA平板上生长，但是不能在MM平板上生长)。从MM+5-FOA平板上刮除细胞并提取脂质。通过酯交换制备FAME并随后用Hewlett-Packard6890GC进行分析。
GC分析显示在MM+5-FOA平板上生长的pZKUM转化体#1、#6和#7中存在占总脂质37.6％，37.3％和36.5％的EPA。这三个菌株分别命名为菌株Y4305U1、Y4305U2和Y4305U3(统称为Y4305U)。为清楚起见，在实施例11中菌株Y4305U被称为菌株Y4305U(Δpex10)。
实施例11
在解脂耶氏酵母菌株Y4305U(Δpex10)中的Pex16染色体缺失进一步 提高了积聚的EPA百分比(Pex10-Pex16双敲除)
本实施例描述使用构建体pYRH13(图9B；SEQIDNO：59)敲除在耶氏酵母属菌株Y4305U中的染色体Pex16(Δpex10)(实施例10)，从而导致生成Pex10-Pex16双突变体。测定并比较Pex10-Pex16双敲除对总油量和EPA含量的效应。具体地讲，在菌株Y4305U(Δpex10)(Δpex16)中的Pex10-Pex16双突变体的效应导致细胞中EPA的量与单突变体相比(即，菌株Y4305U(Δpex10))有所提高(EPA％TFA和EPA％DCW)。
生成解脂耶氏酵母基因敲除菌株Y4305U(Δpex10)(Δpex16)
采用Pex16敲除构建体pYRH13(实施例9；SEQIDNO：59)的纯化6.0kBAscI/SphI片段，使用标准规程来转化解脂耶氏酵母菌株Y4305U(Δpex10)(实施例10)。如实施例9所述，通过菌落PCR筛选并鉴定具有Pex16缺失的细胞。
在93个筛选的菌落中，88个菌落具有在染色体随机位点整合的Pex16敲除片段，因此不是Δpex16突变体(然而，由于存在pYRH13，细胞能够在ura-平板上生长)。这些随机整合的菌株中的两个，命名为Y4305U-22和Y4305U-25，用作脂质生产实验中的对照物(下文)。
筛选的剩余5个菌落(即，总计93个菌落中的剩余菌落)包含Pex16基因敲除。将在Y4305U菌株中的这五个Δpex16突变体命名为RHY20、RHY21、RHY22、RHY23和RHY24。如实施例9所述，通过如实施例9所述的定量实时PCR进行对YlPex16基因敲除的进一步确认。
评估用于EPA生产的解脂耶氏酵母菌株Y4305U(ΔPex10)和Y4305U (ΔPex10)(Δpex16)
为了评估多个Pex基因突变对总脂质级分中的PUFA百分比和细胞中的总脂质含量的效应，将Y4305U(Δpex10)和Y4305U(Δpex10)(Δpex16)菌株在可比较的含油条件下生长。更具体地讲，菌株Y4305U-22和Y4305U-25具有在染色体随机位点整合的Pex16基因敲除片段，它们被认为是Pex16野生型，Pex10基因敲除型(即，Y4305U(Δpex10))。菌株RHY22、RHY23和RHY24是双敲除突变型菌株(即，Y4305U(Δpex10)(Δpex16))。在可比较的含油条件下平行培养每个菌株。
具体地讲，在25mL合成右旋糖培养基(SD)中在起始OD600为～0.1的情况下，在125mL烧瓶中培养48小时。在50mL圆锥管中，以4300rpm离心5分钟收获细胞。弃去上清液，将细胞重悬于25mLHGM中并转移到新的125mL烧瓶中。细胞在30℃下透气培养另外120小时。
为了测定干细胞重量(DCW)，对来自5mLHGM生长培养物的细胞进行处理。培养的细胞在4300rpm下离心5分钟。使用10mL无菌水重悬沉淀物并在相同条件下二次离心。然后用1mL无菌H2O(第三次)重悬沉淀物，将其转移到预先称重的铝盘中。细胞悬浮液在80℃真空炉中干燥过夜。测量细胞重量。
为了测定总脂质含量，1mL的HGM培养细胞通过在13,000rpm下离心1分钟进行收集，提取总脂质并通过酯交换制备FAME，随后用Hewlett-Packard6890GC(一般方法)进行分析。
表15显示了每个菌株的脂肪酸组成(即，16:0(棕榈酸))、16:1(棕榈油酸)、18:0、18:1(油酸)、18:2(LA)、18:3(ALA)、EDA、DGLA、ARA、ETrA、ETA和EPA)(以总脂肪酸(TFA)的重量百分比(wt.％)形式表示)，以及DCW(g/L)和总脂质含量(TFA％DCW)。菌株Y4305U(Δpex10)和Y4305U(Δpex10)(Δpex16)的平均脂肪酸组成用灰色突出显示并用“Ave”指示。
表15中的结果显示敲除Y4305U(Δpex10)(Δpex16)中的染色体Pex16基因与天然Pex16p未被敲除的菌株Y4305U(Δpex10)中的EPA％TFA相比较，EPA％TFA提高了大约8％。此外，与单突变菌株相比，EPA％DCW也在双突变体中提高，而TFA％DCW保持不变。
因此，表15中的结果显示与对照Y4305(ΔPex10)菌株相比，Y4305(ΔPex10，ΔPex16)菌株平均具有更高的EPA％TFA(48.3％对44.7％)和更高的EPA％DCW(14.57％对13.23％)。菌株Y4305(ΔPex10，ΔPex16)相对于菌株Y4305(ΔPex10)的EPA相对于总PUFA的量(61％的PUFA[％TFA]对58.3％的PUFA[％TFA])仅提高了1.05倍，而C20PUFA相对于总PUFA的量的提高二者基本上相同(73％的PUFA[％TFA]对72％的PUFA[％TFA])。
实施例12
在解脂耶氏酵母菌株Y4036U中的Pex3染色体缺失提高了积聚的DGLA 百分比
本实施例描述了使用构建体pY157(图12B；SEQIDNO：82)敲除在Ura-、DGLA-生产耶氏酵母属菌株Y4036U(实施例1)中的染色体Pex3基因(SEQIDNO：3)。用Pex3敲除构建体转化解脂耶氏酵母菌株Y4036U导致生成菌株Y4036(Dpex3)。测量Pex3敲除对DGLA含量的效应并与对照菌株Y4036(Ura+菌株，它是菌株Y4036U的亲本)比较。具体地讲，敲除Pex3提高DGLA占总脂肪酸的百分比并且与对照相比改善了大约3倍的DGLA％DCW。
构建体pY157
质粒pY87(图12A)包含表达盒以敲除解脂耶氏酵母二酰基甘油酰基转移酶(DGAT2)基因，如下表16所述：
表16
质粒pY87(SEQIDNO：83)的描述
SEQ ID NO：83中的RE位点和核苷酸 片段和嵌合基因组分的描述
SphI/PacI(1-721) 耶氏酵母属DGAT2基因的5′部分(SEQ ID NO：72的碱基1-720)(美国专利公开7,267,976)
PacI/BglII(721-2459) LoxP::Ura3::LoxP，它包含：●LoxP序列(SEQ ID NO：84)；●耶氏酵母属Ura3基因(GenBank保藏号AJ306421)；●LoxP序列(SEQ ID NO：84)
BglII/AscI(2459-3203) 耶氏酵母属DGAT2基因的3′部分(SEQ ID NO：72的碱基2468-3202)(美国专利公开7,267,976)
AscI/SphI(3203-5910) 载体主链包括：●ColE1质粒复制起点●用于在大肠杆菌中选择的氨苄青霉素抗性基因(AmpR)(4191-5051)；●大肠杆菌f1复制起点
质粒pY157来源于质粒pY87。具体地讲，解脂耶氏酵母Pex3基因的704bp的5′启动子区域置换pY87的SphI/PacI片段，解脂耶氏酵母Pex3基因的448bp的3′终止子区域置换pY87的BglII/AscI片段以生成pYR157(SEQIDNO：82；图12B)。
生成解脂耶氏酵母基因敲除菌株Y4036(ΔPex3)
使用标准规程，用Pex3敲除构建体pY157的纯化3648bp的AscI/SphI片段来转化解脂耶氏酵母的菌株Y4036U(实施例1)(同上)。
为了筛选具有Pex3缺失的细胞，使用Taq聚合酶(Invitrogen；Carlsbad，CA)和PCR引物UP768(SEQIDNO：85)以及LP769(SEQIDNO：86)进行菌落PCR。设计这组引物用于扩增完整Pex3基因的2039bp的野生型条带，以及当Pex3基因被定向敲除破坏时，3719bp的敲除特异性条带。
更具体地讲，菌落PCR使用MasterAmpTaq试剂盒(EpicentreTechnologies，Madison，WI；目录号82250)，并且按照制造商说明书进行，在25μL的反应中包含：2.5μL10XMasterAmpTaq缓冲液、2.0μL25mMMgCl2、7.5μL10XMasterAmpEnhancer、2.5μL2.5mMdNTP(TaKaRaBioInc.，OtsuShiga，Japan)、1.0μL10μM上游引物、1.0μL10μM下游引物、0.25μLMasterAmpTaqDNA聚合酶和19.75μL水。扩增如下进行：95℃5分钟进行初始变性，随后在95℃30秒进行40个循环的变性，在56℃下退火60秒，在72℃下延伸4分钟。最后在72℃下进行10分钟的最终延伸循环，然后在4℃下终止反应。
筛选的48个菌落中，46个菌落具有2039bp的预期条带，该条带来自野生型(即，未破坏的)Pex3基因，因此不是Δpex3突变体。剩余的2个菌落只显示2039bp的弱条带，说明它们是在背景中存在一些污染的非转化细胞的Δpex3突变体。通过划线接种2个推定敲除菌落到选择性平板上分离单菌落，这一点得到了证实。然后从每个推定基因敲除菌株的3个单菌落中来分离基因组DNA并用相同引物对来进行筛选。即，UP768和LP769(SEQIDNO：85和86)。该方法被认为是比菌落PCR更灵敏的方法。来自主要转化体的所有三个单菌落都缺少2039bp的野生型条带，相反地具有3719bp的基因敲除特异性条带。将在Y4036U菌株中的Δpex3突变体命名为L134和L135。
评估用于DGLA生产的解脂耶氏酵母菌株YY4036和Y4036(ΔPex3)
为了评估Pex3基因敲除对总脂质级分中的PUFA百分比和细胞中的总脂质含量的效应，Y4036和Y4036(Δpex3)菌株6在可比较的含油条件下生长。将菌株Y4036、L134(即，Y4036(Δpex3))和L135(即，Y4036(Δpex3))接种到25mL的CSM-Ura并在振荡器中在30℃下培养过夜。将预培养物等分到新的25mLCSM-Ura烧瓶中，最终OD600为0.4。培养物在30℃下在振荡器中生长。在48小时后，离心细胞(它几乎不生长)并重悬在新的25mLCSM-Ura中并继续生长72小时。将细胞离心、重悬于25mLHGM中，并继续如上文所述生长72小时。离心收获细胞，用蒸馏水洗涤一次并重悬于25mL水中，终体积为20.5mL。使用等分试样(1.5mL)测量脂质含量，提取总脂质，通过酯交换制备FAME并通过Hewlett-Packard6890GC进行分析(一般方法)。如实施例11所述干燥剩余的等分试样以测量干细胞重量(DCW)。
表17显示了每个菌株的脂肪酸组成(即，16:0(棕榈酸)、16:1(棕榈油酸)、18:0、18:1(油酸)、18:2(LA)、EDA和DGLA)(以占总脂肪酸(TFA)的重量百分比(wt.％)形式表示)，以及总脂质含量(TFA％DCW)。转化效率(“CE”)根据下面的公式测量：([产物]/[底物+产物])*100，其中‘产物’包括中间产物和该途径中来源于它的所有产物。因此，Δ12去饱和酶转化效率(Δ12％CE)计算如下：([LA+EDA+DGLA]/[18:1+LA+EDA+DGLA])*100；Δ9延伸酶转化效率(Δ9elo％CE)计算如下：([EDA+DGLA]/[LA+EDA+DGLA])*100；并且Δ8去饱和酶转化效率(Δ8％CE)计算如下：([DGLA]/[EDA+DGLA])*100。菌株Y4036、L134和L135的平均脂肪酸组成用灰色突出显示并用“Ave”表示，而“S.D.”指示标准偏差。正如预期的那样，Δpex3菌株不在用油酸盐作唯一碳源的平板上生长。
表17中的结果显示敲除Y4036(Δpex3)中的染色体Pex3基因与天然Pex3p未被敲除的菌株Y4036中的DGLA％TFA相比较，DGLA％TFA提高了大约142％。具体地讲，Pex3敲除提高了DGLA含量，从在Y4036中的大约19％提高到在Y4036(Δpex3)菌株L134和L135中的46％。此外，Δ9延伸酶转化效率百分比从Y4036中的大约48％提高到Y4036(Δpex3)菌株L134和L135中的83％；并且菌株L134和L135中的TFA％DCW从4.7％提高到6％。LA％TFA从30％下降到12％。Pex3缺失实际上提高了脂肪酸的通量并从而提高了用于Δ9延伸的底物可利用性。
因此，表17中的结果显示与亲本菌株Y4036相比，Y4036(ΔPex3)菌株具有平均更高的脂质含量(TFA％DCW)(大约6.0％对4.7％)，更高的DGLA％TFA(46％对19％)，以及更高的DGLA％DCW(大约2.8％对0.9％)。此外，菌株Y4036(ΔPex3)的DGLA相对于总PUFA的量提高了2倍(67.7％的PUFA[％TFA]对33.3％的PUFA[％TFA])，而C20PUFA相对于总PUFA的量提高了1.7倍(82％的PUFA[％TFA]对47％的PUFA[％TFA])。
预测改善的DGLA产量也将导致在经基因工程化用于EPA生产的解脂耶氏酵母菌株中的EPA产量的改善(例如实施例10所述并从中衍生出的解脂耶氏酵母菌株Y4305U)。
序列表
<110>E.I.duPontdeNemours&Co.，Inc.
Zhu，Quinn
Xue，Zhixiong
<120)破坏过氧化物酶体生物合成因子蛋白(PEX)以改变含油真核生物中多不饱和脂肪酸和总脂质含量
<130>CL3847
<160>89
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TyrPheThrAlaSerThrLeu
385390
<210>15
<211>225
<212>PRT
<213>解脂耶氏酵母CLIB122(GenBank保藏号CAG84025)
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(1)..(225)
<223>YlPex17p
<400>15
MetSerAlaPheProGluProSerSerPheGluIleGluPheAlaLys
151015
GlnMetAsnArgProArgThrValGlnPheLysGlnLeuValAlaVal
202530
LeuTyrIlePheGlyGlyThrSerAlaLeuIleTyrIleIleSerLys
354045
ThrIleLeuAsnProLeuPheGluGluLeuThrPheAlaArgSerGlu
505560
TyrAlaIleHisAlaArgArgLeuMetGluGlnLeuAsnAlaLysLeu
65707580
SerSerMetAlaSerTyrIleProProValArgAlaLeuGlnGlyGln
859095
ArgPheValAspAlaGlnThrGlnThrGluAspGluGluGlyGluAsp
100105110
IleProAsnProSerLeuGlyLysSerSerHisValSerPheGlyGlu
115120125
SerProMetGlnLeuLysLeuAlaGluLysGluLysGlnGlnLysLeu
130135140
IleAspAspSerValAspAsnLeuGluArgLeuAlaAspSerLeuLys
145150155160
HisAlaGlyGluValSerAspLeuSerAlaLeuSerGlyPheLysTyr
165170175
GlnValGluGluLeuThrAsnTyrSerAspGlnLeuAlaMetSerGly
180185190
TyrSerMetMetLysSerGlyLeuProGlyHisGluThrAlaMetSer
195200205
GluThrLysLysGluIleArgSerLeuLysGlySerValLeuSerVal
210215220
Arg
225
<210>16
<211>324
<212>PRT
<213>解脂耶氏酵母(GenBank保藏号AAK84827)
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(1)..(324)
<223>YlPex19p
<400>16
MetSerHisGluGluAspLeuAspAspLeuAspAspPheLeuAspGlu
151015
PheAspGluGlnValLeuSerLysProProGlyAlaGlnLysAspAla
202530
ThrProThrThrSerThrAlaProThrThrAlaGluAlaLysProAsp
354045
AlaThrLysLysSerThrGluThrSerGlyThrAspSerLysThrGlu
505560
GlyAlaAspThrAlaAspLysAsnAlaAlaThrAspSerAlaGluAla
65707580
GlyAlaGluLysValSerLeuProAsnLeuGluAspGlnLeuAlaGly
859095
LeuLysMetAspAspPheLeuLysAspIleGluAlaAspProGluSer
100105110
LysAlaGlnPheGluSerLeuLeuLysGluIleAsnAsnValThrSer
115120125
AlaThrAlaSerGluLysAlaGlnGlnProLysSerPheLysGluThr
130135140
IleSerAlaThrAlaAspArgLeuAsnGlnSerAsnGlnGluMetGly
145150155160
AspMetProLeuGlyAspAspMetLeuAlaGlyLeuMetGluGlnLeu
165170175
SerGlyAlaGlyGlyPheGlyGluGlyGlyGluGlyAspPheGlyAsp
180185190
MetLeuGlyGlyIleMetArgGlnLeuAlaSerLysGluValLeuTyr
195200205
GlnProLeuLysGluMetHisAspAsnTyrProLysTrpTrpAspGlu
210215220
HisGlySerLysValThrGluGluLysGluArgAspArgLeuLysLeu
225230235240
GlnGlnAspIleValGlyLysIleCysAlaLysPheGluAspProSer
245250255
TyrSerAspAspSerGluAlaAspArgAlaValIleThrGlnLeuMet
260265270
AspGluMetGlnGluThrGlyAlaProProAspGluIleMetSerAsn
275280285
ValAlaAspGlySerIleProGlyGlyLeuAspGlyLeuGlyLeuGly
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GlyLeuGlyGlyGlyLysMetProGluMetProGluAsnMetProGlu
305310315320
CysAsnGlnGln
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<211>417
<212>PRT
<213>解脂耶氏酵母CLIB122(GenBank保藏号CAG79226)
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(1)..(417)
<223>YlPex20p
<400>17
MetAlaSerCysGlyProSerAsnAlaLeuGlnAsnLeuSerLysHis
151015
AlaSerAlaAspArgSerLeuGlnHisAspArgMetAlaProGlyGly
202530
AlaProGlyAlaGlnArgGlnGlnPheArgSerGlnThrGlnGlyGly
354045
GlnLeuAsnAsnGluPheGlnGlnPheAlaGlnAlaGlyProAlaHis
505560
AsnSerPheGluGlnSerGlnMetGlyProHisPheGlyGlnGlnHis
65707580
PheGlyGlnProHisGlnProGlnMetGlyGlnHisAlaProMetAla
859095
HisGlyGlnGlnSerAspTrpAlaGlnSerPheSerGlnLeuAsnLeu
100105110
GlyProGlnThrGlyProGlnHisThrGlnGlnSerAsnTrpGlyGln
115120125
AspPheMetArgGlnSerProGlnSerHisGlnValGlnProGlnMet
130135140
AlaAsnGlyValMetGlySerMetSerGlyMetSerSerPheGlyPro
145150155160
MetTyrSerAsnSerGlnLeuMetAsnSerThrTyrGlyLeuGlnThr
165170175
GluHisGlnGlnThrHisLysThrGluThrLysSerSerGlnAspAla
180185190
AlaPheGluAlaAlaPheGlyAlaValGluGluSerIleThrLysThr
195200205
SerAspLysGlyLysGluValGluLysAspProMetGluGlnThrTyr
210215220
ArgTyrAspGlnAlaAspAlaLeuAsnArgGlnAlaGluHisIleSer
225230235240
AspAsnIleSerArgGluGluValAspIleLysThrAspGluAsnGly
245250255
GluPheAlaSerIleAlaArgGlnIleAlaSerSerLeuGluGluAla
260265270
AspLysSerLysPheGluLysSerThrPheMetAsnLeuMetArgArg
275280285
IleGlyAsnHisGluValThrLeuAspGlyAspLysLeuValAsnLys
290295300
GluGlyGluAspIleArgGluGluValArgAspGluLeuLeuArgGlu
305310315320
GlyAlaSerGlnGluAsnGlyPheGlnSerGluAlaGlnGlnThrAla
325330335
ProLeuProValHisHisGluAlaProProProGluGlnIleHisPro
340345350
HisThrGluThrGlyAspLysGlnLeuGluAspProMetValTyrIle
355360365
GluGlnGluAlaAlaArgArgAlaAlaGluSerGlyArgThrValGlu
370375380
GluGluLysLeuAsnPheTyrSerProPheGluTyrAlaGlnLysLeu
385390395400
GlyProGlnGlyValAlaLysGlnSerAsnTrpGluGluAspTyrAsp
405410415
Phe
<210>18
<211>195
<212>PRT
<213>解脂耶氏酵母CLIB122(GenBank保藏号CAG77876)
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(1)..(195)
<223>YlPex22p
<400>18
ValProArgCysThrSerHisProCysAsnLeuThrLeuHisLeuPro
151015
ValThrThrMetAlaProArgLysThrArgLeuProAlaValIleGly
202530
AlaAlaAlaAlaAlaAlaAlaValAlaTyrLeuValTyrSerPheVal
354045
AlaLysSerAsnSerAspGlnAspThrPheAspSerSerValGlnSer
505560
SerSerLysSerSerThrLysSerProLysSerThrAlaThrAsnSer
65707580
LysIleThrValValValSerGlnGluLeuValGlnSerGlnLeuVal
859095
AspPheLysHisLeuMetSerValHisProAsnLeuValValIleVal
100105110
ProProMetValAlaAsnLysPheHisArgAlaLeuLysSerSerVal
115120125
GlyHisAspHisGlyValLysValIleArgCysAspThrAspValGly
130135140
ValIleHisValIleLysHisIleArgProAspLeuAlaLeuIleAla
145150155160
AspGlyValGlyAspAsnIleGlnGlyGluIleLysArgPheValGly
165170175
SerSerGluAlaLeuSerGlyAspValAsnLeuAlaAlaGluArgLeu
180185190
ThrGlyLeu
195
<210>19
<211>386
<212>PRT
<213>解脂耶氏酵母CLIB122(GenBank保藏号NC_006072，核苷酸117230至118387的
反义翻译)
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(1)..(386)
<223>YlPex26p
<400>19
MetProProAlaMetProGlnMetThrThrSerThrLeuLeuThrAsp
151015
SerValThrSerAlaValAsnGlnAlaAlaThrProLysValAspGln
202530
MetTyrGlnThrPheGlyGluSerAlaArgGluPheValAsnLysAsn
354045
PheTyrAsnSerTyrGluLeuIleArgProPhePheAspGluIleThr
505560
AlaLysGlyAlaGlnGlnAsnGlySerThrValLeuAspAlaGluAsn
65707580
ProHisAsnIleProLeuSerLeuTrpIleLysValTrpSerLeuTyr
859095
LeuAlaIleLeuAspAlaSerCysLysGlnAlaGlyGluAlaLeuLeu
100105110
AsnSerThrGlyAspLeuSerGlySerAspSerGlyGluTrpAsnGln
115120125
ThrArgLysLeuLeuAlaArgLysLeuThrSerGlySerValTrpAsp
130135140
GluLeuValThrAlaSerGlyGlyThrGlyAsnIleHisProThrIle
145150155160
LeuAlaLeuLeuAlaSerLeuSerIleArgHisAspThrAspAlaLys
165170175
LeuMetAlaAspAsnLeuGluLysPheIleValThrTyrAsnAspAsn
180185190
GlySerAspAspValLysThrLysThrAlaPheTyrLysValLeuAsp
195200205
LeuTyrLeuLeuArgValLeuProAspLeuGlyGlnTrpAspValAla
210215220
HisSerPheValAsnAsnThrAsnLeuPheSerHisGluGlnLysLys
225230235240
GluMetThrHisLysLeuAspGlnSerGlnLysHisAlaGluGlnGlu
245250255
HisLysArgLeuLeuGluGluAlaGlnGluLysGluLysSerAspAla
260265270
LysGluLysGluArgGluGluArgValSerArgAspThrGlnSerArg
275280285
GluIleLysSerProIleValAspSerSerThrSerSerArgAspVal
290295300
ThrArgAspThrThrArgGluLeuSerLysSerSerArgGlnProArg
305310315320
ThrLeuSerGlnIleIleSerThrSerLeuLysSerGlnPheAspGly
325330335
AsnAlaIlePheArgThrLeuAlaLeuIleValIleValSerLeuSer
340345350
AlaAlaAsnProLeuIleArgLysArgValValAspThrLeuLysMet
355360365
LeuTrpIleLysIleLeuGlnThrLeuSerMetGlyPheLysValSer
370375380
TyrLeu
385
<210>20
<211>3387
<212>DNA
<213>解脂耶氏酵母(GenBank保藏号AB036770)
<400>20
ggtaccatcaagggtaaaatcaaggctatcatcaagggccatatatcgcaagtttggggg60
aagataatatgttcatagtgaatcgggttgtggatttcctcatctaacggcattataact120
agtcctggagggtcttttttatggataacctccatgtacgatgtatccaagatctccacg180
tactgtgttctgtttcctaagtaatacccaacaacctctccaacaaacacttgggaagat240
gcacttgtgctgagatgtcaagatgttagagagtagagacagtagcaagcgtaaaaggcg300
gccgaggccaccgagagaacagcgtagcagggcgcgtagtcaccacaggggacgcagaac360
caaacaaatgacgaagaagaaccacaaggagacgttttcaaaggcaatgcaaacgaagag420
ggcaatggaaggattgagattagagaactggagactggagtggcgttttcccgatgaacg480
aacaaacacgcgaagctatgtggaccaacatacaacacggactgaaccaggtttttttat540
gatttttttactggaaataggtacgtgccaagttggaccatgacactaaacgtgtttaat600
tagtaatattcgtgtaagcgtacattcatttcaaaggttattctttcacggcaaagttat660
aattaaatgaatgtatatgcagaaaaaaaaaaaaaaagtactgtactggatggagagaat720
attaataaataattgttacccaactacatcttgtcgattgaaagagacccctaagacaga780
taggatatctgcaacccgaggaatgaaccccccagcaccggcaccctttctattaacaaa840
atgccaactgaaatttgaaaagttcaactaaacttatttgacccacaaaaactcgtcaaa900
agtggcggcgaaagctggcaaatgatgacatccccttggaaccatgatatcctctcggaa960
tcttcgtccccatttgccacatctacttgcaacgccacatctgcttactaagcaacccaa1020
atctgcctcggctcaaaatgtggggaagttcacatgcattcgctggtgaatctgatctga1080
cactacaactacacaccaggtccaacatgagcgacaatacgacaatcaaaaagccgatcc1140
gacccaaaccgatccggacggaacgcctgccttacgctggggccgcagaaatcatccgag1200
ccaaccagaaagaccactactttgagtccgtgcttgaacagcatctcgtcacgtttctgc1260
agaaatggaagggagtacgatttatccaccagtacaaggaggagctggagacggcgtcca1320
agtttgcatatctcggtttgtgtacgcttgtgggctccaagactctcggagaagagtaca1380
ccaatctcatgtacactatcagagaccgaacagctctaccgggggtggtgagacggtttg1440
gctacgtgctttccaacactctgtttccatacctgtttgtgcgctacatgggcaagttgc1500
gcgccaaactgatgcgcgagtatccccatctggtggagtacgacgaagatgagcctgtgc1560
ccagcccggaaacatggaaggagcgggtcatcaagacgtttgtgaacaagtttgacaagt1620
tcacggcgctggaggggtttaccgcgatccacttggcgattttctacgtctacggctcgt1680
actaccagctcagtaagcggatctggggcatgcgttatgtatttggacaccgactggaca1740
agaatgagcctcgaatcggttacgagatgctcggtctgctgattttcgcccggtttgcca1800
cgtcatttgtgcagacgggaagagagtacctcggagcgctgctggaaaagagcgtggaga1860
aagaggcaggggagaaggaagatgaaaaggaagcggttgtgccgaaaaagaagtcgtcaa1920
ttccgttcattgaggatacagaaggggagacggaagacaagatcgatctggaggaccctc1980
gacagctcaagttcattcctgaggcgtccagagcgtgcactctgtgtctgtcatacatta2040
gtgcgccggcatgtacgccatgtggacactttttctgttgggactgtatttccgaatggg2100
tgagagagaagcccgagtgtcccttgtgtcggcagggtgtgagagagcagaacttgttgc2160
ctatcagataatgacgaggtctggatggaaggactagtcagcgagacacagagcatcagg2220
gaccagacacgaccaattcaatcgacaacactgtgctgcatagcagtgcacagaggtcct2280
gggcatgaatatattttagcattggagatatgagtggtagagcgtatacagtattaattg2340
tggaggtatctcgtcgcattgatagagcaatacagttactgctgaagggaatgataccga2400
gtatttcggcccgattcagttcttgatatcgtcattttgtctctattgtctacttttcag2460
ataacctcaacaaatcttcaacaaatctcccagtaaacagtcagagatcatatccgagat2520
catatcagatatgtcacgatccgagtacaataatggatattaatctgcttgattttgaat2580
tctgttgcgattatgatttctttgatttcgatatgaacacatacggcgactcccagacct2640
ttagaagctccagtttggattcttagcaatggttacactcaactatatcccaagtaatac2700
ttggtaacaatatgccaagttagtcattcattcgttataggagttagcaagtgtttgtca2760
gctaaaaatggttagtcggtcgattaccacttagatcttttcagcgtggaacttgatggt2820
acgcttgaaccgacacttggagtagtcggggctgttgatgacgtagatgacgtttcgctc2880
agggtgaggagtgcaatagtagtactccttggggccgtctctcagctcaaaggttccatc2940
ggcggcaatgtcaaagaccgagccctggagcttgtagccgtagtcgccggtccagaacaa3000
agcctgcagctccagataggcgatgggcatgtcgttaacagagaaggtgttgccctcgcc3060
ctcggtgatggtgatgggttcgccgtcggtggaggcggtgatcaggtcatcttggtaggt3120
gacgggcagagattcgaccgattgggcgtctgatctggtataggtcagcttgtacttgtc3180
tccgacagccgccagagcggtggtagcgacggtgatgagggagatgagtttcatattggc3240
ggcaagtttagcaaaagatggcagtgggattgagggacaagagtgtttatatagatatag3300
atacaacacaacgagtctgaatgagacaaccgagacaaccactcccgaagcctcactaat3360
agttactaacggcatatttcaggtacc3387
<210>21
<211>1134
<212>DNA
<213>解脂耶氏酵母(GenBank保藏号AB036770，核苷酸1038-2171)
<220>
<221>CDS
<222>(1)..(1134)
<223>Pex10
<400>21
atgtggggaagttcacatgcattcgctggtgaatctgatctgacacta48
MetTrpGlySerSerHisAlaPheAlaGlyGluSerAspLeuThrLeu
151015
caactacacaccaggtccaacatgagcgacaatacgacaatcaaaaag96
GlnLeuHisThrArgSerAsnMetSerAspAsnThrThrIleLysLys
202530
ccgatccgacccaaaccgatccggacggaacgcctgccttacgctggg144
ProIleArgProLysProIleArgThrGluArgLeuProTyrAlaGly
354045
gccgcagaaatcatccgagccaaccagaaagaccactactttgagtcc192
AlaAlaGluIleIleArgAlaAsnGlnLysAspHisTyrPheGluSer
505560
gtgcttgaacagcatctcgtcacgtttctgcagaaatggaagggagta240
ValLeuGluGlnHisLeuValThrPheLeuGlnLysTrpLysGlyVal
65707580
cgatttatccaccagtacaaggaggagctggagacggcgtccaagttt288
ArgPheIleHisGlnTyrLysGluGluLeuGluThrAlaSerLysPhe
859095
gcatatctcggtttgtgtacgcttgtgggctccaagactctcggagaa336
AlaTyrLeuGlyLeuCysThrLeuValGlySerLysThrLeuGlyGlu
100105110
gagtacaccaatctcatgtacactatcagagaccgaacagctctaccg384
GluTyrThrAsnLeuMetTyrThrIleArgAspArgThrAlaLeuPro
115120125
ggggtggtgagacggtttggctacgtgctttccaacactctgtttcca432
GlyValValArgArgPheGlyTyrValLeuSerAsnThrLeuPhePro
130135140
tacctgtttgtgcgctacatgggcaagttgcgcgccaaactgatgcgc480
TyrLeuPheValArgTyrMetGlyLysLeuArgAlaLysLeuMetArg
145150155160
gagtatccccatctggtggagtacgacgaagatgagcctgtgcccagc528
GluTyrProHisLeuValGluTyrAspGluAspGluProValProSer
165170175
ccggaaacatggaaggagcgggtcatcaagacgtttgtgaacaagttt576
ProGluThrTrpLysGluArgValIleLysThrPheValAsnLysPhe
180185190
gacaagttcacggcgctggaggggtttaccgcgatccacttggcgatt624
AspLysPheThrAlaLeuGluGlyPheThrAlaIleHisLeuAlaIle
195200205
ttctacgtctacggctcgtactaccagctcagtaagcggatctggggc672
PheTyrValTyrGlySerTyrTyrGlnLeuSerLysArgIleTrpGly
210215220
atgcgttatgtatttggacaccgactggacaagaatgagcctcgaatc720
MetArgTyrValPheGlyHisArgLeuAspLysAsnGluProArgIle
225230235240
ggttacgagatgctcggtctgctgattttcgcccggtttgccacgtca768
GlyTyrGluMetLeuGlyLeuLeuIlePheAlaArgPheAlaThrSer
245250255
tttgtgcagacgggaagagagtacctcggagcgctgctggaaaagagc816
PheValGlnThrGlyArgGluTyrLeuGlyAlaLeuLeuGluLysSer
260265270
gtggagaaagaggcaggggagaaggaagatgaaaaggaagcggttgtg864
ValGluLysGluAlaGlyGluLysGluAspGluLysGluAlaValVal
275280285
ccgaaaaagaagtcgtcaattccgttcattgaggatacagaaggggag912
ProLysLysLysSerSerIleProPheIleGluAspThrGluGlyGlu
290295300
acggaagacaagatcgatctggaggaccctcgacagctcaagttcatt960
ThrGluAspLysIleAspLeuGluAspProArgGlnLeuLysPheIle
305310315320
cctgaggcgtccagagcgtgcactctgtgtctgtcatacattagtgcg1008
ProGluAlaSerArgAlaCysThrLeuCysLeuSerTyrIleSerAla
325330335
ccggcatgtacgccatgtggacactttttctgttgggactgtatttcc1056
ProAlaCysThrProCysGlyHisPhePheCysTrpAspCysIleSer
340345350
gaatgggtgagagagaagcccgagtgtcccttgtgtcggcagggtgtg1104
GluTrpValArgGluLysProGluCysProLeuCysArgGlnGlyVal
355360365
agagagcagaacttgttgcctatcagataa1134
ArgGluGlnAsnLeuLeuProIleArg
370375
<210>22
<211>377
<212>PRT
<213>解脂耶氏酵母(GenBank保藏号AB036770，核苷酸1038-2171)
<400>22
MetTrpGlySerSerHisAlaPheAlaGlyGluSerAspLeuThrLeu
151015
GlnLeuHisThrArgSerAsnMetSerAspAsnThrThrIleLysLys
202530
ProIleArgProLysProIleArgThrGluArgLeuProTyrAlaGly
354045
AlaAlaGluIleIleArgAlaAsnGlnLysAspHisTyrPheGluSer
505560
ValLeuGluGlnHisLeuValThrPheLeuGlnLysTrpLysGlyVal
65707580
ArgPheIleHisGlnTyrLysGluGluLeuGluThrAlaSerLysPhe
859095
AlaTyrLeuGlyLeuCysThrLeuValGlySerLysThrLeuGlyGlu
100105110
GluTyrThrAsnLeuMetTyrThrIleArgAspArgThrAlaLeuPro
115120125
GlyValValArgArgPheGlyTyrValLeuSerAsnThrLeuPhePro
130135140
TyrLeuPheValArgTyrMetGlyLysLeuArgAlaLysLeuMetArg
145150155160
GluTyrProHisLeuValGluTyrAspGluAspGluProValProSer
165170175
ProGluThrTrpLysGluArgValIleLysThrPheValAsnLysPhe
180185190
AspLysPheThrAlaLeuGluGlyPheThrAlaIleHisLeuAlaIle
195200205
PheTyrValTyrGlySerTyrTyrGlnLeuSerLysArgIleTrpGly
210215220
MetArgTyrValPheGlyHisArgLeuAspLysAsnGluProArgIle
225230235240
GlyTyrGluMetLeuGlyLeuLeuIlePheAlaArgPheAlaThrSer
245250255
PheValGlnThrGlyArgGluTyrLeuGlyAlaLeuLeuGluLysSer
260265270
ValGluLysGluAlaGlyGluLysGluAspGluLysGluAlaValVal
275280285
ProLysLysLysSerSerIleProPheIleGluAspThrGluGlyGlu
290295300
ThrGluAspLysIleAspLeuGluAspProArgGlnLeuLysPheIle
305310315320
ProGluAlaSerArgAlaCysThrLeuCysLeuSerTyrIleSerAla
325330335
ProAlaCysThrProCysGlyHisPhePheCysTrpAspCysIleSer
340345350
GluTrpValArgGluLysProGluCysProLeuCysArgGlnGlyVal
355360365
ArgGluGlnAsnLeuLeuProIleArg
370375
<210>23
<211>1065
<212>DNA
<213>解脂耶氏酵母(GenBank保藏号AJ012084，对应于GenBank保藏号AB036770的核
苷酸1107-2171)
<220>
<221>CDS
<222>(1)..(1065)
<223>YlPEX10
<400>23
atgagcgacaatacgacaatcaaaaagccgatccgacccaaaccgatc48
MetSerAspAsnThrThrIleLysLysProIleArgProLysProIle
151015
cggacggaacgcctgccttacgctggggccgcagaaatcatccgagcc96
ArgThrGluArgLeuProTyrAlaGlyAlaAlaGluIleIleArgAla
202530
aaccagaaagaccactactttgagtccgtgcttgaacagcatctcgtc144
AsnGlnLysAspHisTyrPheGluSerValLeuGluGlnHisLeuVal
354045
acgtttctgcagaaatggaagggagtacgatttatccaccagtacaag192
ThrPheLeuGlnLysTrpLysGlyValArgPheIleHisGlnTyrLys
505560
gaggagctggagacggcgtccaagtttgcatatctcggtttgtgtacg240
GluGluLeuGluThrAlaSerLysPheAlaTyrLeuGlyLeuCysThr
65707580
cttgtgggctccaagactctcggagaagagtacaccaatctcatgtac288
LeuValGlySerLysThrLeuGlyGluGluTyrThrAsnLeuMetTyr
859095
actatcagagaccgaacagctctaccgggggtggtgagacggtttggc336
ThrIleArgAspArgThrAlaLeuProGlyValValArgArgPheGly
100105110
tacgtgctttccaacactctgtttccatacctgtttgtgcgctacatg384
TyrValLeuSerAsnThrLeuPheProTyrLeuPheValArgTyrMet
115120125
ggcaagttgcgcgccaaactgatgcgcgagtatccccatctggtggag432
GlyLysLeuArgAlaLysLeuMetArgGluTyrProHisLeuValGlu
130135140
tacgacgaagatgagcctgtgcccagcccggaaacatggaaggagcgg480
TyrAspGluAspGluProValProSerProGluThrTrpLysGluArg
145150155160
gtcatcaagacgtttgtgaacaagtttgacaagttcacggcgctggag528
ValIleLysThrPheValAsnLysPheAspLysPheThrAlaLeuGlu
165170175
gggtttaccgcgatccacttggcgattttctacgtctacggctcgtac576
GlyPheThrAlaIleHisLeuAlaIlePheTyrValTyrGlySerTyr
180185190
taccagctcagtaagcggatctggggcatgcgttatgtatttggacac624
TyrGlnLeuSerLysArgIleTrpGlyMetArgTyrValPheGlyHis
195200205
cgactggacaagaatgagcctcgaatcggttacgagatgctcggtctg672
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210215220
ctgattttcgcccggtttgccacgtcatttgtgcagacgggaagagag720
LeuIlePheAlaArgPheAlaThrSerPheValGlnThrGlyArgGlu
225230235240
tacctcggagcgctgctggaaaagagcgtggagaaagaggcaggggag768
TyrLeuGlyAlaLeuLeuGluLysSerValGluLysGluAlaGlyGlu
245250255
aaggaagatgaaaaggaagcggttgtgccgaaaaagaagtcgtcaatt816
LysGluAspGluLysGluAlaValValProLysLysLysSerSerIle
260265270
ccgttcattgaggatacagaaggggagacggaagacaagatcgatctg864
ProPheIleGluAspThrGluGlyGluThrGluAspLysIleAspLeu
275280285
gaggaccctcgacagctcaagttcattcctgaggcgtccagagcgtgc912
GluAspProArgGlnLeuLysPheIleProGluAlaSerArgAlaCys
290295300
actctgtgtctgtcatacattagtgcgccggcatgtacgccatgtgga960
ThrLeuCysLeuSerTyrIleSerAlaProAlaCysThrProCysGly
305310315320
cactttttctgttgggactgtatttccgaatgggtgagagagaagccc1008
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gagtgtcccttgtgtcggcagggtgtgagagagcagaacttgttgcct1056
GluCysProLeuCysArgGlnGlyValArgGluGlnAsnLeuLeuPro
340345350
atcagataa1065
IleArg
<210>24
<211>354
<212>PRT
<213>解脂耶氏酵母(GenBank保藏号AJ012084，对应于GenBank保藏号AB036770的核
苷酸1107-2171)
<400>24
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202530
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100105110
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115120125
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130135140
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145150155160
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180185190
TyrGlnLeuSerLysArgIleTrpGlyMetArgTyrValPheGlyHis
195200205
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210215220
LeuIlePheAlaArgPheAlaThrSerPheValGlnThrGlyArgGlu
225230235240
TyrLeuGlyAlaLeuLeuGluLysSerValGluLysGluAlaGlyGlu
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ProPheIleGluAspThrGluGlyGluThrGluAspLysIleAspLeu
275280285
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290295300
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305310315320
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IleArg
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<211>38
<212>PRT
<213>解脂耶氏酵母
<220>
<221>misc_feature
<222>(2)..(3)
<223>Xaa可以是任何天然存在的氨基酸
<220>
<221>misc_feature
<222>(5)..(15)
<223>Xaa可以是任何天然存在的氨基酸
<220>
<221>misc_feature
<222>(17)..(17)
<223>Xaa可以是任何天然存在的氨基酸
<220>
<221>misc_feature
<222>(19)..(20)
<223>Xaa可以是任何天然存在的氨基酸
<220>
<221>misc_feature
<222>(22)..(23)
<223>Xaa可以是任何天然存在的氨基酸
<220>
<221>misc_feature
<222>(25)..(34)
<223>Xaa可以是任何天然存在的氨基酸
<220>
<221>misc_feature
<222>(36)..(37)
<223>Xaa可以是任何天然存在的氨基酸
<400>25
CysXaaXaaCysXaaXaaXaaXaaXaaXaaXaaXaaXaaXaaXaaCys
151015
XaaHisXaaXaaCysXaaXaaCysXaaXaaXaaXaaXaaXaaXaaXaa
202530
XaaXaaCysXaaXaaCys
35
<210>26
<211>345
<212>PRT
<213>解脂耶氏酵母
<400>26
MetTrpGlySerSerHisAlaPheAlaGlyGluSerAspLeuThrLeu
151015
GlnLeuHisThrArgSerAsnMetSerAspAsnThrThrIleLysLys
202530
ProIleArgProLysProIleArgThrGluArgLeuProTyrAlaGly
354045
AlaAlaGluIleIleArgAlaAsnGlnLysAspHisTyrPheGluSer
505560
ValLeuGluGlnHisLeuValThrPheLeuGlnLysTrpLysGlyVal
65707580
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100105110
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115120125
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130135140
TyrLeuPheValArgTyrMetGlyLysLeuArgAlaLysLeuMetArg
145150155160
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195200205
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MetArgTyrValPheGlyHisArgLeuAspLysAsnGluProArgIle
225230235240
GlyTyrGluMetLeuGlyLeuLeuIlePheAlaArgPheAlaThrSer
245250255
PheValGlnThrGlyArgGluTyrLeuGlyAlaLeuLeuGluLysSer
260265270
ValGluLysGluAlaGlyGluLysGluAspGluLysGluAlaValVal
275280285
ProLysLysLysSerSerIleProPheIleGluAspThrGluGlyGlu
290295300
ThrGluAspLysIleAspLeuGluAspProArgGlnLeuLysPheIle
305310315320
ProGluAlaSerArgAlaCysThrLeuCysLeuSerTyrIleSerAla
325330335
ProAlaCysThrProCysGlyHisPhe
340345
<210>27
<211>2987
<212>DNA
<213>解脂耶氏酵母
<220>
<221>misc_feature
<223>具有W497L突变的突变型乙酰羟酸合酶(AHAS)
<300>
<302>解脂耶氏酵母的高二十碳五烯酸生产菌株
<310>US2006-0115881-A1
<311>2005-11-02
<312>2006-06-01
<313>(1)..(2987)
<300>
<302>解脂耶氏酵母的高二十碳五烯酸生产菌株
<310>WO2006/052870
<311>2005-11-03
<312>2006-05-18
<313>(1)..(2987)
<400>27
ttccctagtcccagtgtacacccgccgatatcgcttaccctgcagccggattaaggttgg60
caatttttcacgtccttgtctccgcaattactcaccgggtggtttataagattgcaagcg120
tcttgatttgtctctgtatactaacatgcaatcgcgactcgcccgacgggccactaacct180
ggccagaatctccagatccaagtattctcttggtctgcgatatgtttccaacacaaaagc240
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actgtatagtgtttggaagcactagtcagaagaccagcgaaaacaggtggaaaaaactga360
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agaggtgacaaataacgacaaatgaaatatcagtatcttcccacaatcactacctctcag480
ctgtctgaaggtgcggctgatatatccatcccacgtctaacgtatggagtgtgatagaat540
atgacgacacaagcatgagaactcgctctctatccaaccaccgaaacactgtcactacag600
ccgttcttgttgctccattcgcttttgtgattccatgccttctctggtgactgacaacat660
tccttccttttctccagccctgttgttatctgctcatgacctacggccactctctatcgc720
atactaacatagacgatcccagcccgctccccacttccagggcaccgttggcaagcctcc780
tatcctcaagaaggctgaggctgccaacgctgacatggacgagtccttcatcggaatgtc840
tggaggagagatcttccacgagatgatgctgcgacacaacgtcgacactgtcttcggtta900
ccccggtggagccattctccccgtctttgacgccattcacaactctgagtacttcaactt960
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tggtaagcccggtgtcgttctcgtcacctctggccccggtgccaccaacgtcatcacccc1080
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gctcatccccctcatcaacaaggtctctgccgctgagcgagctccctggactgagactat1920
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caagccccagtccgtcattgctctgctctctgacctgacagagaacaacaaggacaagac2040
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ttctttcaacatgactctgaccgagctgtccaccgccgttcagttcaacattggcgtcaa2280
ggctattgtcctcaacaacgaggaacagggtatggtcacccagctgcagtctctcttcta2340
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catgggcatgaagggtatccgaatcactcacattgaccagctggaggccggtctcaagga2460
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cgaggctgcttctcgacccgatcgactgaagaatgcccccgcccctcacgtccaccagac2640
cacctttgagaactaagtggaaaggaacacaagcaatccgaaccaaaaataattggggtc2700
ccgtgcccacagagtctagtgcagacctaaaatgaccacagtaaattatagctgttatta2760
aacatgagattttgaccaacaagagcgtaggaatgttattagctactacttgtacataca2820
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gccagctctctgacttcagaccgcttgtacttaagcagctcgcaacactgttgtcgagga2940
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<210>28
<211>14688
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>质粒pZKLeuN-29E3
<400>28
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tgcttctctggatgttaccaccaccaaggagctcattgagcttgccgataaggtcggacc600
ttatgtgtgcatgatcaaaacccatatcgacatcattgacgacttcacctacgccggcac660
tgtgctccccctcaaggaacttgctcttaagcacggtttcttcctgttcgaggacagaaa720
gttcgcagatattggcaacactgtcaagcaccagtaccggtgtcaccgaatcgccgagtg780
gtccgatatcaccaacgcccacggtgtacccggaaccggaatcattgctggcctgcgagc840
tggtgccgaggaaactgtctctgaacagaagaaggaggacgtctctgactacgagaactc900
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gatcaaaccacccatggacttcctggaggcagaagaacttgttatggaaaagctcaagag1680
agagatcataacttcgtatagcatacattatacgaagttatcctgcaggtaaaggaattc1740
tggagtttctgagagaaaaaggcaagatacgtatgtaacaaagcgacgcatggtacaata1800
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gactttatacggctgactacatatttgtcctcagacatacaattacagtcaagcacttac1920
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aatgacatgatgtgattgggtctacactttcatatcagagataaggagtagcacagttgc2160
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cgaaatctggaagcttagttggccctaaaaaaatcaaaaaaagcaaaaaacgaaaaacga2280
aaaaccacagttttgagaacagggaggtaacgaaggatcgtatatatatatatatatata2340
tatacccacggatcccgagaccggcctttgattcttccctacaaccaaccattctcacca2400
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<300>
<302>适于改变含油酵母中多不饱和脂肪酸含量的Δ-12去饱和酶
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<313>(1)..(1434)
<300>
<302>适于改变含油酵母中多不饱和脂肪酸含量的Δ-12去饱和酶
<310>US2005-0216975-A1
<311>2004-11-10
<312>2005-09-29
<313>(1)..(1434)
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<213>串珠镰孢菌
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ThrValThrSerThrThrValThrAspSerGluSerAlaAlaValSer
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<212>DNA
<213>小眼虫
<220>
<221>CDS
<222>(1)..(777)
<223>合成Δ-9延伸酶(经密码子优化用于解脂耶氏酵母)
<300>
<302>Δ-9延伸酶及其在制备多不饱和脂肪酸中的应用
<310>WO2007/061742
<311>2006-11-16
<312>2007-05-31
<313>(1)..(777)
<300>
<302>Δ-9延伸酶及其在制备多不饱和脂肪酸中的应用
<310>US-2007-0117190-A1
<311>2006-11-16
<312>2007-05-24
<313>(1)..(777)
<400>31
atggaggtcgtgaacgaaatcgtctccattggccaggaggttcttccc48
MetGluValValAsnGluIleValSerIleGlyGlnGluValLeuPro
151015
aaggtcgactatgctcagctctggtctgatgcctcgcactgcgaggtg96
LysValAspTyrAlaGlnLeuTrpSerAspAlaSerHisCysGluVal
202530
ctgtacctctccatcgccttcgtcatcctgaagttcacccttggtcct144
LeuTyrLeuSerIleAlaPheValIleLeuLysPheThrLeuGlyPro
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ctcggacccaagggtcagtctcgaatgaagtttgtgttcaccaactac192
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<220>
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<222>(2)..(1270)
<400>38
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202530
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<300>
<302>Δ-9延伸酶及其在制备多不饱和脂肪酸中的应用
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gcgtttctgggtgagcaaaaacaggaaggcaaaatgccgcaaaaaagggaataagggcga3060
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<211>21
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<213>人工序列
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<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物pZP-GW-3-2
<400>64
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<210>65
<211>22
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
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<213>人工序列
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<220>
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ggttcacgtagtgggccatcgccctgatagacggtttttcgccctttgacgttggagtcc2940
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gaacttatttttattacttagtattattagacaacttacttgctttatgaaaaacacttc3720
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<300>
<302>高二十碳五烯酸生产菌株
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<220>
<223>引物Pex-10del25’.反向
<400>89
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Claims (12)

1.使含油耶氏酵母属的总脂肪酸中的至少一种多不饱和脂肪酸的重量百分比提高的方法，所述方法包括：
a)提供含油耶氏酵母属，所述含油耶氏酵母属包含：
1)编码功能性多不饱和脂肪酸生物合成途径的基因，所述基因包含编码选自Δ15去饱和酶、Δ6去饱和酶和Δ9延伸酶的酶的至少一种基因；和
2)编码过氧化物酶体生物合成因子蛋白的天然基因的敲除，以及
b)使所述耶氏酵母属在以下条件下生长：即，使得所述耶氏酵母属的总脂肪酸中的至少一种多不饱和脂肪酸的重量百分比提高，其中所述提高是相对于其中编码过氧化物酶体生物合成因子蛋白的天然基因未被敲除的耶氏酵母属的总脂肪酸中的所述至少一种多不饱和脂肪酸的重量百分比。
2.提高含油耶氏酵母属的至少一种多不饱和脂肪酸相对于干细胞重量的重量百分比的方法，所述方法包括：
a)提供含油耶氏酵母属，所述含油耶氏酵母属包含：
1)编码功能性多不饱和脂肪酸生物合成途径的基因，所述基因包含编码选自Δ15去饱和酶、Δ6去饱和酶和Δ9延伸酶的酶的至少一种基因；和
2)编码过氧化物酶体生物合成因子蛋白的天然基因的敲除，以及
b)使所述耶氏酵母属在以下条件下生长：即，使得耶氏酵母属的至少一种多不饱和脂肪酸相对于干细胞重量的重量百分比提高，其中所述提高是相对于其中编码过氧化物酶体生物合成因子蛋白的天然基因未被敲除的耶氏酵母属的所述至少一种多不饱和脂肪酸相对于干细胞重量的重量百分比。
3.权利要求1的方法，其中所述总脂肪酸中的所述至少一种多不饱和脂肪酸的重量百分比的提高为提高至至少1.3倍。
4.权利要求1或2的方法，其中所述至少一种多不饱和脂肪酸选自：
γ-亚麻酸、二高-γ-亚麻酸、花生四烯酸、二十二碳四烯酸、ω-6二十二碳五烯酸、α-亚麻酸、十八碳四烯酸、二十碳四烯酸、二十碳五烯酸、ω-3二十二碳五烯酸、二十碳二烯酸、二十碳三烯酸、二十二碳六烯酸、这些脂肪酸的羟基化或环氧脂肪酸、C18多不饱和脂肪酸、C20多不饱和脂肪酸、和C22多不饱和脂肪酸。
5.权利要求4的方法，其中耶氏酵母属的总脂肪酸中的多不饱和脂肪酸的组合的重量百分比被提高。
6.权利要求1或2的方法，其中所述耶氏酵母属中的总脂质含量被改变，其中所述改变是相对于其中编码过氧化物酶体生物合成因子蛋白的天然基因未被敲除的耶氏酵母属中的总脂质含量。
7.权利要求1或2的方法，其中所述编码多不饱和脂肪酸生物合成途径的基因还包含编码选自下组的酶的基因：
Δ9去饱和酶、Δ12去饱和酶、Δ5去饱和酶、Δ17去饱和酶、Δ8去饱和酶、Δ4去饱和酶、C14/16延伸酶、C16/18延伸酶、C18/20延伸酶和C20/22延伸酶。
8.权利要求1或2的方法，其中所述过氧化物酶体生物合成因子蛋白选自：
Pex1p、Pex2p、Pex3p、Pex3Bp、Pex4p、Pex5p、Pex5Bp、Pex5Cp、Pex5/20p、Pex6p、Pex7p、Pex8p、Pex10p、Pex12p、Pex13p、Pex14p、Pex15p、Pex16p、Pex17p、Pex14/17p、Pex18p、Pex19p、Pex20p、Pex21p、Pex21Bp、Pex22p、Pex22p样和Pex26p。
9.权利要求8的方法，其中所述过氧化物酶体生物合成因子蛋白是Pex3p。
10.解脂耶氏酵母，其具有ATCC命名ATCCPTA-8614。
11.权利要求1的方法，其中所述多不饱和脂肪酸选自γ-亚麻酸、二高-γ-亚麻酸、二十碳四烯酸和二十碳五烯酸。
12.权利要求8的方法，其中所述过氧化物酶体生物合成因子是Pex10p或Pex16p。
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