CN101627118B

CN101627118B - 由靶向诱变工程化的突变型△8去饱和酶基因及其在制备多不饱和脂肪酸中的用途

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Publication number: CN101627118B
Application number: CN2007800452327A
Authority: CN
Inventors: H·G·达穆德; H·贺; D·廖; Q·Q·朱
Original assignee: EI Du Pont de Nemours and Co
Current assignee: EIDP Inc
Priority date: 2006-12-07
Filing date: 2007-12-05
Publication date: 2013-07-17
Anticipated expiration: 2027-12-05
Also published as: JP2010512146A; DK2087106T3; CA2669217C; AU2007332918B2; CA2669217A1; WO2008073271A9; EP2087106A1; AU2007332918A1; US20080138868A1; EP2087106B1; WO2008073271A1; US8026089B2; US20100297713A1; CN101627118A; JP5769374B2; US7709239B2

Abstract

本发明涉及突变型Δ8去饱和酶基因，该基因具有将二十碳二烯酸[20:2ω-6，EDA]转化成二高-γ-亚麻酸[20:3，DGLA]和/或将二十碳三烯酸[20:3ω-3，ETrA]转化成二十碳四烯酸[20:3ω-3，ETA]的能力。编码Δ8去饱和酶的分离的核酸片段和包括此类片段的重组构建体，连同在植物和含油酵母中使用这些突变型Δ8去饱和酶制备长链多不饱和脂肪酸(PUFA)的方法一起被公开。

Description

由靶向诱变工程化的突变型△8去饱和酶基因及其在制备多不饱和脂肪酸中的用途

发明领域

本发明属于生物技术领域。更具体地讲，本发明涉及编码突变型Δ8脂肪酸去饱和酶的核酸片段的制造以及这些去饱和酶在制备长链多不饱和脂肪酸(PUFA)中的用途。

发明背景

PUFA的重要性无可争议。例如，某些PUFA是健康细胞的重要生物学组分，并且被认为是“必需”脂肪酸，即，不能在哺乳动物体内从头合成，而必须从饮食中获取或者通过亚油酸进一步去饱和及延伸而衍生得到的“必需”脂肪酸(LA；18:2 ω-6)或α-亚麻酸(ALA；18:3 ω-3)；此外PUFA是细胞质膜的组分，在细胞质膜中它们以磷脂或甘油三酯的形式存在。PUFA是正常发育(尤其在婴儿脑发育过程中)和组织形成及修复所必需的，并且是哺乳动物体内几种重要的生物活性类二十烷酸的前体(例如环前列腺素、类二十烷酸、白三烯、前列腺素)。已有研究表明摄入大量长链ω-3 PUFA产生心血管保护效果(Dyerberg，J.等人，Amer.J.Clin.Nutr.，28：958-966(1975)；Dyerberg，J.等人，Lancet，2(8081)：117-119(1978年7月15日)；Shimokawa，H.，World Rev.Nutr.Diet，88：100-108(2001)；vonSchacky，C.和Dyerberg，J.，World Rev.Nutr.Diet，88：90-99(2001))。据文献报道，针对多种症状和疾病(如哮喘、牛皮癣、湿疹、糖尿病、癌)施用ω-3和/或ω-6PUFA赋予了广泛的健康益处。

目前正在研究包括植物、藻类、真菌和酵母在内的多种不同宿主作为商业化PUFA生产的手段。基因工程已经证明可以显著改变一些宿主的天然能力以生产多种长链ω-3/ω-6PUFA。例如生产花生四烯酸(ARA；20:4 ω-6)、二十碳五烯酸(EPA；20:5 ω-3)和二十二碳六烯酸(DHA；22:6 ω-3)都需要Δ9延伸酶/Δ8去饱和酶途径或Δ6去饱和酶/Δ6延伸酶途径的表达。Δ9延伸酶/Δ8去饱和酶途径存在于如类眼虫物种中，其特征在于产生二十碳二烯酸[“EDA”；20:2 ω-6]和 /或二十碳三烯酸[“ETrA”；20:3 ω-3]。(图1)。Δ6去饱和酶/Δ6延伸酶途径主要存在于藻类、藓类、真菌、线虫动物和人类中，其特征在于产生γ-亚油酸[“GLA”；18:3 ω-6]和/或硬脂艾杜糖酸[“STA”；18:4 ω-3])(图1)。

对一些应用来说，Δ9延伸酶/Δ8去饱和酶途径更有利。然而Δ8去饱和酶不是本领域所熟知的，致使重组Δ9延伸酶/Δ8去饱和酶途径的构建选择受限。迄今为止少数鉴定的Δ8去饱和酶具有将EDA转化为二高-γ-亚麻酸[20:3，DGLA]的能力和将ETrA转化为二十碳四烯酸[20:4，ETA]的能力(其中ARA和EPA随后分别由DGLA和ETA与Δ5去饱和酶反应后合成，然而DHA合成需要另外的C_20/22延伸酶和Δ4去饱和酶的随后表达)。

几种Δ8去饱和酶是已知的，并且其部分功能已知(参见例如Δ8来自小眼虫的去饱和酶，Wallis等人，Arch.Biochem.and Biophys.，365(2)：307-316(1999年5月)；WO 2000/34439；美国专利6,825,017；WO 2004/057001；WO 2006/012325；WO 2006/012326)。此外WO2005/103253(公布于2005年4月22日)公开了来自盐生巴夫藻的Δ8去饱和酶的氨基酸和核苷酸序列(也参见美国专利2005/0273885)。Sayanova等人(FEBS Lett.，580：1946-1952(2006))描述了对来自非寄生土壤变形虫卡氏棘变形虫的cDNA的分离与鉴定，当其在鼠耳芥属中表达时，编码C₂₀Δ8去饱和酶。此外，共有的和共同未决的美国临时申请60/795810(提交于2006年4月28日)公开了来自路氏巴夫藻(CCMP459)的Δ8去饱和酶的氨基酸和核酸序列。

因此仍需要在重组途径中使用另外的Δ8去饱和酶以产生PUFA。申请人通过发展合成的工程化突变型小眼虫Δ8去饱和酶，已经解决了所述需要。

发明概述

本发明涉及编码具有Δ8去饱和酶活性的突变型多肽的新重组构建体以及它们在植物和酵母中用于产生PUFA并且尤其是ω-3和/或ω-6脂肪酸的用途。

因此，本发明提供分离的多核苷酸，它包括：(a)编码具有Δ8去饱和酶活性的突变型多肽的核苷酸序列，该多肽具有在SEQ ID NO：2 中列出的氨基酸序列，并且其中SEQ ID NO：2与SEQ ID NO：10不同；或，(b)核苷酸序列(a)的互补序列，其中互补序列和核苷酸序列由相同数量的核苷酸组成并且它们是100％互补的。

在另一个实施方案中，本发明提供分离的多核苷酸，它包括：(a)编码具有Δ8去饱和酶活性的突变型多肽的核苷酸序列，该多肽具有在SEQ ID NO：198中列出的氨基酸序列，并且其中SEQ ID NO：198与SEQ ID NO：10不同；或，(b)核苷酸序列(a)的互补序列，其中互补序列和核苷酸序列由相同数量的核苷酸组成并且它们是100％互补的。

提供由本发明的多核苷酸编码的多肽以及遗传嵌合体和转化过的并表达它的宿主细胞是本发明的一个方面。

在另一方面，本发明提供在酵母细胞中制备长链多不饱和脂肪酸的方法，该方法包括：(a)提供本发明的酵母细胞；和(b)在其中会产生长链多不饱和脂肪酸的条件下培养(a)中所述的酵母细胞。

在另一方面，本发明提供获自本发明酵母的微生物油。

在另一个实施方案中，本发明提供产油量为其干细胞重量的至少约25％的含油酵母，该含油酵母包括：

a)第一重组DNA构建体，该构建体包括分离的多核苷酸，它编码本发明的Δ8去饱和酶多肽并可操作地连接到至少一个调控序列上；和，

b)至少一个第二重组DNA构建体，该构建体包括可操作地连接到至少一个调控序列上的分离多核苷酸，该构建体编码的多肽选自：Δ4去饱和酶、Δ5去饱和酶、Δ6去饱和酶、Δ9去饱和酶、Δ12去饱和酶、Δ15去饱和酶、Δ17去饱和酶、Δ9延伸酶、C_14/16延伸酶、C_16/18延伸酶、C_18/20延伸酶和C_20/22延伸酶。

在另一方面，本发明提供了一种食物或饲料产品，该产品包括本发明的微生物油。

在另一个实施方案中，本发明提供了用于生产二高-γ-亚油酸的方法，该方法包括：

a)提供一种含油酵母，该含油酵母包括：

(i)编码Δ8去饱和酶多肽的重组构建体，所述多肽具有在SEQ ID NO：2中列出的氨基酸序列，其中SEQ ID NO：2与SEQ ID NO：10不同；和，

(ii)二十碳二烯酸源；

b)在其中能表达编码Δ8去饱和酶多肽的重组构建体以及能将二十碳二烯酸转化为二高-γ-亚油酸的条件下，培养步骤(a)中的酵母，和；

c)任选地回收步骤(b)的二高-γ-亚油酸。

在另一个实施方案中，本发明提供了用于产生二十碳四烯酸的方法，该方法包括：

a)提供一种含油酵母，该含油酵母包括：

(i)编码Δ8去饱和酶多肽的重组构建体，该多肽具有在SEQID NO：2中列出的氨基酸序列，其中SEQ ID NO：2与SEQ IDNO：10不同；和，

(ii)一种二十碳三烯酸源；

b)在其中能表达编码Δ8去饱和酶多肽的重组构建体以及能将二十碳三烯酸转化为二十碳四烯酸的条件下，培养步骤(a)中的酵母，和；

c)任选地回收步骤(b)的二十碳四烯酸。

在另一个实施方案中，本发明提供了用于产生二高-γ-亚油酸的方法，该方法包括：

a)提供酵母细胞，该酵母细胞包括：

i)第一重组DNA构建体，该构建体包括本发明的分离多核苷酸，它可操作地连接到至少一个调控序列上，和；

ii)至少一个第二重组DNA构建体，它包括编码Δ9延伸酶多肽的分离多核苷酸，该多核苷酸可操作地连接到至少一个调控序列上；

b)提供步骤(a)中的酵母细胞以及亚麻酸源，和；

c)在其中能形成二高-γ-亚油酸的条件下培养(b)中的酵母细胞。

生物保藏

下列质粒保藏于美国典型培养物保藏中心(American Type CultureCollection)(ATCC)(10801 University Boulevard，Manassas，VA20110-2209)，并具有下列名称、保藏号和保藏日期(表1)。

表1

ATCC保藏

附图简述和序列列表

图1是代表性的PUFA生物合成途径。

图2显示了EgD8S的拓扑模型。

图3显示了EgD8S(SEQ ID NO：10)、淀粉霉的Δ6去饱和酶(SEQID NO：13)、根霉菌属的Δ6去饱和酶(SEQ ID NO：14)、硕大利什曼原虫的Δ8脂肪酸去饱和酶样蛋白质L(GenBank登陆号CAJ09677；SEQ ID NO：15)、和深黄被孢霉的Δ6去饱和酶(GenBank登陆号AAG38104；SEQ ID NO：16)的比对结果。所用的比对方法符合“Clustal W比对方法”。

图4显示了EgD8S(SEQ ID NO：10)、酿酒酵母的细胞色素b₅(GenBank登陆号P40312；SEQ ID NO：178)和粟酒裂殖酵母的可能的细胞色素b₅1(GenBank登陆号O94391；SEQ ID NO：179)的比对结果。所用的比对方法符合“Clustal W比对方法”。

图5提供了下列质粒的质粒图谱：(A)pZKLeuN-29E3；和(B)pY116。

图6提供了下列质粒的质粒图谱：(A)pKUNFmkF2；(B)pDMW287F；(C)pDMW214；和(D)pFmD8S。

图7图示了通过连接突变型EgD8S-1和突变型EgD8S-2B的片段来合成突变型EgD8S-5B。

图8A图示了通过连接突变型EgD8S-001和突变型EgD8S-003的片段来合成突变型EgD8S-008。类似地，图8B图示了通过连接突变型EgD8S-001和突变型EgD8S-004的片段来合成突变型EgD8S-009。

图9A图示了通过连接突变型EgD8S-009和突变型EgD8S-23的片段来合成突变型EgD8S-013。类似地，图9B图示了通过连接突变型EgD8S-008和突变型EgD8S-28的片段来合成突变型EgD8S-015。

图10显示了EgD8S(SEQ ID NO：10)、突变型EgD8S-23(SEQ ID NO：4)、突变型EgD8S-013(SEQ ID NO：6)和突变型EgD8S-015(SEQID NO：8)的比对结果。所用的比对方法符合“Clustal W比对方法”。

图11提供了如下质粒的质粒图谱：(A)pKo2UFm8；和，(B)pKO2UF8289。

根据下面的详细描述和附带的序列描述可以更充分地理解本发明，下面的详细描述和附带的序列描述形成了本申请的一部分。

下面的序列遵照37C.F.R.1.821-1.825(“Requirements for PatentApplications Containing Nucleotide Sequences and/or Amino AcidSequence Disclosures-the Sequence Rules”(对含有核苷酸序列和/或氨基酸序列公开内容的专利申请的要求-序列规则))，并且符合WorldIntellectual Property Organization(世界知识产权组织，WIPO)ST.25标准(1998)以及EPO和PCT的序列表要求(规则5.2和49.5(abis)以及Administrative Instructions(行政指令)的第208节和附录C)。用于核苷酸和氨基酸序列数据的符号和格式均遵照37C.F.R.§1.822中列出的规则。

附带光盘上提供序列表。包含序列表的光盘的内容遵照37CFR1.52(e)，据此以引用方式并入本文。提交三张彼此相同的光盘。光盘上贴有标签“Copy 1-Sequence Listing”、“Copy 2-SequenceListing”、和CRF。光盘包含以下文件：CL3495 SeqListing 11.27.06 ST25，文件大小如下：293,000字节，创建于2006年12月6日。

SEQ ID NO：1-17、19-23、165和172-177为编码基因或蛋白质(或其片段)或质粒的ORF，如表2所述。

表2

核酸和蛋白质SEQ ID NO摘要

描述和缩写	核酸 SEQ ID NO	蛋白质 SEQ ID NO
			合成突变型Δ8去饱和酶来源于小眼虫(“EgD8S-共有序列”)，任选地包括M1、M2、M3、M8、M12、 M15、M16、M18、M21、M26、 M38、M45、M46、M51、M63、 M68、M69和M70突变位点	1 (1272bp)	2 (422AA)
合成突变型Δ8去饱和酶来源于小眼虫(“EgD8S-共有序列”)，任选地包括M1、M2、M3、M6、M8、 M12、M14、M15、M16、M18、 M19、M21、M22、M26、M38、 M39、M40、M41、M45、M46、 M49、M50、M51、M53、M54、 M58、M63、M68、M69和M70突变位点	197 (1272bp)	198 (422AA)
			合成突变型Δ8去饱和酶来源于小眼虫(“突变型EgD8S-23”)	3 (1272bp)	4 (422AA)
合成突变型Δ8去饱和酶来源于小眼虫(“突变型EgD8S-013”)	5 (1272bp)	6 (422AA)
			合成突变型Δ8去饱和酶来源于小眼虫(“突变型EgD8S-015”)	7 (1272bp)	8 (422AA)
合成Δ8去饱和酶来源于小眼虫，其密码子经最优化以在解脂耶氏酵母 (“EgD8S”)中表达	9 (1272bp)	10 (422AA)
			小眼虫Δ8去饱和酶(全长基因为核苷酸4至1269(终止))(“EgD8”)	11 (1271bp)	12 (421AA)
淀粉霉Δ6去饱和酶(GenBank登陆号 AAR27297)	--	13 (467AA)

[0061]

根霉菌属Δ6去饱和酶(GenBank登陆号AAS93682)	--	14 (458AA)
			硕大利什曼原虫Δ8脂肪酸去饱和酶样蛋白质(GenBank登陆号CAJ09677)	--	15 (400AA)
深黄被孢霉Δ6去饱和酶(GenBank登陆号AAG38104)	--	16 (457AA)
			酿酒酵母细胞色素b₅(GenBank登陆号 P40312)	--	178 (120AA)
粟酒裂殖酵母的可能的细胞色素b₅1 (GenBank登陆号O94391)	--	179 (124AA)
			质粒pZKLeuN-29E3	17 (14,655bp)	--
合成的C_16/18延伸酶基因来源于高山被孢霉ELO3，其密码子经优化以在解脂耶氏酵母中表达	19 (828bp)	--
			质粒pFmD8S	20 (8,910bp)	--
质粒pKUNFmkF2	21 (7,145bp)	--
			质粒pDMW287F	22 (5,473bp)	--
质粒pDMW214	23 (9,513bp)	--
			质粒pKO2UFkF2	165 (8,560bp)	--
绿光等鞭金藻Δ9延伸酶(GenBank登陆号AF390174)	172 (1064bp)	173 (263AA)
			合成Δ9延伸酶基因来源于绿光等鞭金藻，其密码子经最优化以在解脂耶氏酵母中表达	174 (792bp)	173 (263AA)

小眼虫Δ9延伸酶	175 (777bp)	176 (258AA)
			合成Δ9延伸酶基因来源于小眼虫，其密码子经最优化以在解脂耶氏酵母中表达	177 (777bp)	176 (258AA)
质粒pY116	180 (8739bp)	--
			质粒pKO2UF8289	181 (15,304bp)	--
合成突变型Δ8去饱和酶来源于小眼虫(“修饰突变型EgD8S-23”)，包括5′Not1位点	182 (1288bp)	--
			质粒pKR457	183 (5252bp)	--
质粒pKR1058	184 (6532bp)	--
			质粒pKR607	185 (7887bp)	--
质粒pKR1060	186 (11,766bp)	--
			质粒pKR906	189 (4311bp)	--
质粒pKR72	190 (7085bp)	--
			质粒pKR1010	191 (7873bp)	--
质粒pKR1059	192 (11752bp)	--
			小眼虫Δ9延伸酶--来自克隆 eeg1c.pk001.n5.f.的cDNA插入片段的 5′序列	194 (757bp)	--

[0063]

小眼虫Δ9延伸酶--来自克隆 eeg1c.pk001.n5.f.的cDNA插入片段3′ 序列	195 (774bp)	--
			小眼虫Δ9延伸酶--来自SEQ ID NO： 1和SEQ ID NO：2的比对序列(除多聚A尾之外的全长cDNA序列)	196 (1201bp)	--

SEQ ID NO：18对应于LoxP重组位点，该位点被Cre重组酶识别。

SEQ ID NO：24-164对应70对核苷酸引物(即分别为1A、1B、2A、2B、3A、3B等，最多达69A、69B、70A和70B)，该引物用以在突变位点引起特异性靶向突变，突变位点如M1、M2、M3等，最多达M70。

SEQ ID NO：166-171分别对应富含His的基序，该富含His的基序是属于双铁膜蛋白超家族的膜结合脂肪酸去饱和酶的特征。

SEQ ID NO：187和188分别对应引物oEugEL1-1和oEugEL1-2，该引物用以扩增小眼虫Δ9延伸酶。

SEQ ID NO：193为M13F通用引物。

发明详述

除非上下文中清楚地指明，如本文所用的并以及在附加的权利要求书中的单数形式“一个”、“一种”和“所述”包括复数涵义。因此，例如，“一个植株”的涵义包括多个此类植株，“一个细胞”的涵义包括一个或多个细胞及其本领域的技术人员已知的等同物，等等。

本文所引用的所有专利、专利申请和出版物均以引用的方式将其全文并入本文。这具体地讲包括以下共有的和共同未决的专利申请：美国专利申请10/840478、10/840579和10/840325(提交于2004年5月6日)、美国专利申请10/869630(提交于2004年6月16日)、美国专利申请10/882760(提交于2004年7月1日)、美国专利申请10/985254和10/985691(提交于2004年11月10日)、美国专利申请10/987548(提交于2004年11月12日)、美国专利申请11/024545和11/024544 (提交于2004年12月29日)、美国专利申请11/166993(提交于2005年6月24日)、美国专利申请11/183664(提交于2005年7月18日)、美国专利申请11/185301(提交于2005年7月20日)、美国专利申请11/190750(提交于2005年7月27日)、美国专利申请11/198975(提交于2005年8月8日)、美国专利申请11/225354(提交于2005年9月13日)、美国专利申请11/251466(提交于2005年10月14日)、美国专利申请11/254173和11/253882(提交于2005年10月19日)、美国专利申请11/264784和11/264737(提交于2005年11月1日)、美国专利申请11/265761(提交于2005年11月2日)、美国专利申请60/739989(提交于2005年11月23日)、美国专利申请60/793575(提交于2006年4月20日)、美国专利申请60/795810(提交于2006年4月28日)、美国专利申请60/796637(提交于2006年5月1日)、和美国专利申请60/801172及60/801119(提交于2006年5月17日)。

此外，共有的美国专利申请10/776311(公布于2004年8月26日)涉及在植物中产生PUFA，并且美国专利申请10/776889(公布于2004年8月26日)涉及膜联蛋白启动子及其在植物中转基因表达中的用途，它们全文以引用方式并入。

本发明提供了突变型Δ8去饱和酶和编码该去饱和酶的基因，该酶和编码该酶的基因可用于操纵产生有益于健康的PUFA的生化途径。

通过本文所公开的方法学制备的PUFA或其衍生物可用作膳食替代品或补充剂，尤其是婴儿代乳品(formula)，可用于接受静脉注射营养的病人或用来预防或治疗营养不良。作为另外一种选择，可以将纯化的PUFA(或其衍生物)掺入到食用油、脂肪或调配的人造黄油中，以便食用者在正常使用中可获得所需量的膳食补充。也可以将PUFA用作药用组合物或兽医用组合物的抗炎剂或降胆固醇剂组分。

定义

在本公开中，使用了大量术语和缩写。给出了如下定义。

“可读框”缩写为ORF。

“聚合酶链反应”缩写为PCR。

“美国典型培养物保藏中心”缩写为ATCC。

“多不饱和脂肪酸”缩写为PUFA。

“三酰基甘油”缩写为TAG。

术语“脂肪酸”是指不同链长的长链脂族酸(链烷酸)，链长为约C₁₂至C₂₂(尽管更长和更短链长的酸两者都是已知的)。主要的链长介于C₁₆和C₂₂之间。另外的关于“饱和脂肪酸”与“不饱和脂肪酸”、“单不饱和脂肪酸”与“多不饱和脂肪酸”(或“PUFA”)以及“ω-6脂肪酸”(ω-6或n-6)与“ω-3脂肪酸”(ω-3或n-3)之间的区别的详细信息在WO2004/101757中有提供。

本文通过简单的记数系统“X:Y”来描述脂肪酸，其中X表示特定脂肪酸中碳(C)原子的数目，而Y表示双键的数目。按照脂肪酸命名法，数字表示脂肪酸羧基末端的双键位置，“c”词缀表示双键为顺式构型[例如，棕榈酸(16:0)、硬脂酸(18:0)、油酸(18:1，9c)、岩芹酸(18:1，6c)、LA(18:2，9c，12c)、GLA(18:3，6c，9c，12c)和ALA(18:3，9c，12c，15c)]。除非另外指明，18:1、18:2和18:3是指油酸、LA和ALA脂肪酸。除非另外明确指明，均认为双键为顺式构型。例如，认为18:2(9，12)中的双键为顺式构型。

在本文公开内容中用于描述PUFA的命名在下面的表3中示出。在标题为“简化符号”一栏中，ω-指代系统用于表明碳数目、双键的数目和最接近ω碳的双键位置，双键位置的计数从ω碳开始(为此ω碳的编号为1)。该表的其余部分汇总了ω-3和ω-6脂肪酸及其前体的俗名、将在整个说明书中使用的缩写以及每种化合物的化学名称。

表3

多不饱和脂肪酸及其前体的命名

俗名	缩写	化学名称	简化符号
				肉豆蔻酸	--	十四酸	14:0
棕榈酸	棕榈酸酯	十六酸	16:0
				棕榈油酸	--	9-十六碳烯酸	16:1
硬脂酸	--	十八酸	18:0
				油酸	--	顺式-9-十八碳烯酸	18:1
亚油酸	LA	顺式-9，12-十八碳二烯酸	18:2ω-6
				γ-亚油酸	GLA	顺式-6，9，12-十八碳三烯酸	18:3ω-6

[0088]

附子脂酸	EDA	顺式-11，14-二十碳二烯酸	20:2ω-6
				二高-γ-亚油酸	DGLA	顺式-8，11，14-二十碳三烯酸	20:3ω-6
花生四烯酸	ARA	顺式-5，8，11，14-二十碳四烯酸	20:4ω-6
				-亚麻酸	ALA	顺式-9，12，15-十八碳三烯酸	18:3ω-3
十八碳四烯酸	STA	顺式-6，9，12，15-十八碳四烯酸	18:4ω-3
				二十碳三烯酸	ETrA	顺式-11，14，17-二十碳三烯酸	20:3ω-3
二十碳四烯酸	ETA	顺式-8，11，14，17-二十碳四烯酸	20:4ω-3
				二十碳五烯酸	EPA	顺式-5，8，11，14，17- 二十碳五烯酸	20:5ω-3
二十二碳五烯酸	DPA	顺式-7，10，13，16， 19-二十二碳五烯酸	22:5ω-3
				二十二碳六烯酸	DHA	顺式-4，7，10，13， 16，19-二十二碳六烯酸	22:6ω-3

术语“三酰基甘油”、“油”和“TAG”是指由与甘油分子酯化的三个脂肪酰残基组成的中性脂质(并且这些术语在本公开内容中可互换使用)。这些油可含有长链PUFA以及较短的饱和的和不饱和的脂肪酸以及较长链的饱和脂肪酸。因此，“油的生物合成”一般是指细胞中TAG的合成。

“总脂质和油组分中的PUFA百分比(％)”是指PUFA相对于在那些组分中的总脂肪酸的百分比。术语“总脂质组分”或“脂质组分”两者均指含油生物内所有脂质(即中性和极性脂质)的总和，因此包括位于磷脂酰胆碱(PC)组分、磷脂酰乙醇胺(PE)组分和三酰基甘油(TAG或油)组分中的那些脂质。然而，术语“脂质”和“油”将在整个说明书中互换使用。

术语“PUFA生物合成途径”是指将油酸转化成LA、EDA、GLA、DGLA、ARA、ALA、STA、ETrA、ETA、EPA、DPA和DHA的代谢过程。该过程在文献中已有很好的描述(如参见WO2006/052870)。简而言之，该过程涉及通过添加碳原子来延长碳链和通过加入双键来使分子去饱和，这通过存在于内质网膜内的一系列特异性去饱和酶和延伸酶(即“PUFA生物合成途径酶”)进行。更具体地讲，“PUFA生物合成途径酶”是指如下与PUFA生物合成相关的任何酶(以及编码该酶的基因)，包括：Δ4去饱和酶、Δ5去饱和酶、Δ6去饱和酶、Δ12去饱和酶、Δ15去饱和酶、Δ17去饱和酶、Δ9去饱和酶、Δ8去饱和酶、C_14/16延伸酶、Δ9延伸酶、C_16/18延伸酶、C_18/20延伸酶和/或C_20/22延伸酶。

术语ω-3/ω-6脂肪酸生物合成途径”是指在合适条件下表达时编码催化ω-3和ω-6脂肪酸二者之一或两者产生的酶的一组基因。通常，参与ω-3/ω-6脂肪酸生物合成途径的基因编码一些或所有以下酶：Δ12去饱和酶、Δ6去饱和酶、C_18/20延伸酶、C_20/22延伸酶、Δ5去饱和酶、Δ17去饱和酶、Δ15去饱和酶、Δ9去饱和酶、Δ8去饱和酶、Δ9延伸酶和Δ4去饱和酶。图1示出了一条代表性途径，提供了从油酸经过多种中间产物向DHA的转化，演示了ω-3和ω-6脂肪酸两者是如何可以从共同来源产生。该途径自然分成两部分，其中一部分将产生ω-3脂肪酸而另一部分只产生ω-6脂肪酸。只产生ω-3脂肪酸的部分在本文中将称作ω-3脂肪酸生物合成途径，而只产生ω-6脂肪酸的部分在本文中将称作ω-6脂肪酸生物合成途径。

如本文中关于ω-3/ω-6脂肪酸生物合成途径所用的，术语“功能性的”是指该途径中的一些(或全部)基因表达活性酶，导致体内催化或底物转化。应当了解，“ω-3/ω-6脂肪酸生物合成途径”或“功能性ω-3/ω-6脂肪酸生物合成途径”并不意味着上面段落中列出的所有基因都是必需的，因为许多脂肪酸产物将仅需要表达该途径中的一亚组基因。

术语“去饱和酶”是指可以在一种或多种脂肪酸中去饱和(即引入双键)而产生所需要的脂肪酸或前体的多肽。尽管在整个说明书中使用ω-指代系统来指代特定的脂肪酸，但使用Δ-系统从底物的羧基端计数来表示去饱和酶的活性更方便。本文尤其关注的是使脂肪酸介于从该分子的羧基末端计数的第8个和第9个碳原子之间去饱和并且能够例如催化EDA转化成DGLA和/或催化ETrA转化成ETA的Δ8去饱和酶。其它去饱和酶包括：1.)Δ5去饱和酶，它催化DGLA转化为ARA和/或催化ETA转化为EPA；2.)Δ6去饱和酶，它催化LA转化为GLA和/或催化ALA转化为STA；3.)Δ4去饱和酶，它催化DPA转化为DHA；4.)Δ12去饱和酶，它催化油酸转化为LA；5.)Δ15去饱和酶，它催化LA转化为ALA和/或催化GLA转化为STA；6.)Δ17去饱和酶，它催化ARA转化为EPA和/或催化DGLA转化为ETA；以及7.)Δ9去饱和酶，它催化棕榈酸转化成棕榈油酸(16:1)和/或催化硬脂酸转化成油酸(18:1)。在本领域中，基于Δ15和Δ17去饱和酶将ω-6脂肪酸转化成它们的ω-3对应物的能力(如分别将LA转化成ALA以及将ARA转化成EPA)，偶尔也将它们称作“ω-3去饱和酶”、“ω-3去饱和酶”和/或“ω-3去饱和酶”。在一些实施方案中，最期望通过用脂肪酸去饱和酶基因转化合适的宿主并测定其对宿主脂肪酸特征的影响来根据经验测定特定脂肪酸去饱和酶的特异性。

对于本文的目的，术语“EgD8”是指分离自小眼虫的由本文SEQID NO：11编码的Δ8去饱和酶(SEQ ID NO：12)。如WO 2006/012325和WO 2006/012326[US2005-0287652-A1]所述，EgD8与“Eg5”100％相同且功能上等同。

类似地，术语“EgD8S”是指来源于小眼虫的合成Δ8去饱和酶，其密码子经优化以在本文解脂耶氏酵母中表达(即SEQ ID NO：9和10)。如WO 2006/012325和WO 2006/012326所述，EgD8S与“D8SF”100％相同且功能上等同。

术语“突变型EgD8S”是指本发明的Δ8去饱和酶，它有至少一个对于合成Δ8去饱和酶的突变，该合成去饱和酶来源于经密码子最优化以在解脂耶氏酵母中表达的小眼虫(即，EgD8S)。虽然“突变”可包括任何删除、插入和点突变(或它们的组合)，但在优选的实施方案中，突变型EgD8S为在SEQ ID NO：2中列出的突变型，其中：(i)SEQ ID NO：2包括至少一个突变，该突变选自：4S突变成A、5K突变成S、12T突变成V、16T突变成K、17T突变成V、54A突变成G、55F突变成Y、66P突变成Q、67S突变成A、108S突变成L、117G突变成A、118Y突变成F、120L突变成M、121M突变成L、125Q突变成H、 126M突变成L、132V突变成L、133L突变成V、162L突变成V、163V突变成L、170G突变成A、171L突变成V、279T突变成L、280L突变成T、293L突变成M、346I突变成V、347I突变成L、348T突变成S、407A突变成S、408V突变成Q、418A突变成G、419G突变成A和422L突变成Q，其中将突变定义为对合成的经密码子最优化的EgD8S序列的突变(即，SEQ ID NO：10)；和(ii)SEQ ID NO：2与SEQ ID NO：10并非100％相同。在更优选的实施方案中，突变型EgD8S具有至少约10至18个对合成的经密码子最优化的EgD8S序列的突变，更优选的至少约19至25个突变，最优选的至少约26至33个对合成的经密码子最优化的EgD8S序列的突变(即，SEQ ID NO：10)。在另一个实施方案中，突变型EgD8S的Δ8去饱和酶活性与合成的经密码子优化的EgD8S(SEQ ID NO：10)的Δ8去饱和酶活性至少约功能上等同。

尽管突变型EgD8S与EgD8S的多肽序列不同，当比较它们的酶活性和特异选择性时，它们“至少约功能上等同”。因此当比较酶的“转化效率”时，功能上等同的突变型EgD8S序列将具有基本上不低于EgD8S的Δ8去饱和酶活性(即，突变型EgD8S将具有至少约50％，优选地至少约75％，更优选地至少约85％，最优选地至少约95％的EgD8S酶活性)。在更优选的实施方案中，突变型EgD8S当与EgD8S相比较时将具有更高的酶活性和特异选择性(即，至少约105％，更优选地至少约115％以及最优选地至少约125％的EgD8S酶活性)。

术语“转换转化效率”和“底物转换转化百分比”是指特定酶(如去饱和酶)能够将底物转化成产物的效率。转化效率根据下面的公式测量：([产物]/[底物+产物])×100，其中‘产物’包括源于它的途径中的中间产物和所有产物。

术语“延伸酶体系”是指负责延伸脂肪酸碳链以产生比延伸酶体系作用的脂肪酸底物增加2个碳原子的脂肪酸的四种酶的集合。更具体地讲，延伸过程与脂肪酸合酶协同作用，其中CoA是酰基载体(Lassner等人，The Plant Cell，8：281-292(1996))。在第一步中，已经发现该酶是底物特异性的和限速的，丙二酸单酰-CoA与长链酰基-CoA缩合以产生CO₂和β-酮脂酰-CoA(其中该酰基部分已经延长了两个碳原子)。继发反应包括还原β-羟脂酰-CoA，脱水烯酰-CoA和二次还原以产生延长的酰基-CoA。由延伸酶体系催化的反应实例为将GLA转化成 DGLA、将STA转化成ETA，以及将EPA转化成DPA。

对于本文的目的，催化第一次缩合反应(即将丙二酸单酰-CoA转化成β-酮脂酰-CoA)的酶一般称为“延伸酶”。一般来讲，延伸酶的底物选择性有点广泛，但是可以通过链长及不饱和程度区分。因此，延伸酶可能具有不同的特异性。例如，C_14/16延伸酶将利用C₁₄底物(例如肉豆蔻酸)，C_16/18延伸酶将利用C₁₆底物(例如棕榈酸酯)，C_18/20延伸酶将利用C₁₈底物(例如GLA、STA)，C_20/22延伸酶将利用C₂₀底物(例如EPA)。同样的，Δ9延伸酶能够分别催化LA和ALA转化成EDA和ETrA(例如WO 2002/077213)。重要的是，须注意一些延伸酶具有广泛的特异性并因而单个延伸酶可能能催化几种延伸酶反应(如，从而可作为C_16/18延伸酶和C_18/20延伸酶起作用)。

术语“Δ9延伸酶/Δ8去饱和酶途径”是指用于产生长链PUFA的生物合成途径，所述途径最低限度应包括Δ9延伸酶和Δ8去饱和酶，因此能够分别从LA和ALA生物合成DGLA和/或ETA。该途径在一些实施方案中可能是有利的，因为GLA和/或STA的生物合成被排除。

术语“氨基酸”将指蛋白质或多肽的基本化学结构单位。遵照在Nucleic Acids Research，13：3021-3030(1985)和Biochemical Journal，219(2)：345-373(1984)(将其以引用方式并入本文)中描述的IUPAC-IYUB标准，通过氨基酸的单字母密码或三字母密码来表示氨基酸。

术语“保守氨基酸置换”是指将给定蛋白质中的氨基酸残基用另一种氨基酸置换，而不改变该蛋白质的化学或功能性质。例如，本领域中熟知，导致在给定位点产生化学等价的氨基酸(但不影响所编码、折叠蛋白质的结构和功能特性)的基因改变是常见的。对于本发明的目的，将“保守氨基酸置换”定义为如下五组中的一组内的互换：

1.小的脂族非极性残基或稍微极性的残基：Ala[A]、Ser[S]、Thr[T](Pro[P]、Gly[G])；

2.极性的、带负电荷的残基和它们的酰胺：Asp[D]、Asn[N]、Glu[E]、Gln[Q]；

3.极性的、带正电荷的残基：His[H]、Arg[R]、Lys[K]；

4.大的脂族非极性残基：Met[M]、Leu[L]、Ile[I]、Val[V](Cys[C])；and

5.大的芳族残基：Phe[F]、Tyr[Y]、Trp[W]。

因此如Ala这样的弱疏水性氨基酸可以由另一种疏水性更弱的残基(例如Gly)取代。类似地，也期望由一种带负电的残基取代另一种带负电的残基(例如Asp取代Glu)或一种带正电的残基取代另一种带正电的残基(例如Lys取代Arg)所引发的改变能产生功能上等同的产物。因此，保守氨基酸取代一般保持：1.)置换区内多肽主链的结构；2.)分子在靶位点处的电荷或疏水性；或3.)侧链体积。此外，在许多情形中，改变蛋白质分子的N-末端和C-末端部分也将预计不会改变蛋白质的活性。

术语“非保守氨基酸置换”是指通常预期会使蛋白质性质发生最大变化的氨基酸置换。因此，例如非保守氨基酸置换应该是这样的置换，由此1.)亲水性残基置换疏水性残基/被疏水性残基置换(如Ser或Thr置换Leu、Ile、Val/被Leu、Ile、Val置换)2.)Cys或Pro置换任何其它残基/被任何其它残基置换；3.)具有带正电荷的侧链的残基置换带负电荷的残基/被带负电荷的残基置换(如Lys、Arg或His置换Asp或Glu/被Asp或Glu置换)；或4.)具有大侧链的残基置换无侧链的残基/被无侧链的残基置换(如Phe置换Gly/被Gly置换)。有时，这5组中的两组之间的非保守氨基酸置换将不会影响所编码的蛋白质的活性。

术语“多核苷酸”、“核苷酸序列”、“核酸序列”、“核酸片段”和“分离的核酸片段”在本文中可互换使用。多核苷酸可以是RNA或DNA的聚合物，它们可以是单链或双链，任选地包含合成的、非天然的或改性的核苷酸碱基。DNA聚合物形式的多核苷酸可由cDNA、基因组DNA、合成DNA、或它们的混合物的一个或多个片段构成。

当在合适的温度和溶液离子强度条件下单链形式的核酸片段可以退火至另一核酸片段时，核酸片段“可杂交”至另一核酸片段，例如cDNA、基因组DNA或RNA分子。杂交条件和洗涤条件是众所周知的，并在Sambrook，J.，Fritsch，E.F.和Maniatis，T.MolecularCloning：A Laboratory Manual，第二版，Cold Spring Harbor Laboratory：Cold Spring Harbor，NY(1989)中有举例说明，尤其是其中的第11章和表11.1(将其全部内容以引用的方式并入本文)。温度和离子强度条件确定了杂交的“严格性”。可以调节严格性条件以筛选中度相似的片段(例如来自远缘生物的同源序列)，到筛选高度相似的片段(例如从近缘生物复制功能性酶的基因)。杂交后的洗涤决定严格性条件。一组优选的条件采用一系列如下洗涤：开始采用6×SSC、0.5％SDS在室温下持续洗涤15分钟，然后再使用2×SSC、0.5％SDS在45℃下洗涤30分钟，最后使用0.2×SSC、0.5％SDS在50℃下重复洗涤30分钟两次。更优选的一组严格性条件采用更高的温度，其中洗涤与上述洗涤相同，不同的是最后两次在0.2×SSC、0.5％SDS中洗涤30分钟时的温度被增加到60℃。另一组优选的高严格性条件是最后两次洗涤是在65℃下用0.1×SSC、0.1％SDS进行。例如，另一组严格性条件包括在0.1×SSC、0.1％SDS中于65℃下杂交，并用2×SSC、0.1％SDS洗涤，随后用0.1×SSC、0.1％SDS洗涤。

杂交需要两种核酸含有互补序列，但是取决于杂交的严格性，碱基之间可能会发生错配。用于使核酸杂交的合适严格性取决于核酸的长度和互补的程度，所述长度和互补程度是本领域内所熟知的变量。两条核苷酸序列之间的相似性或同源性程度越高，具有那些序列的核酸的杂交体的Tm值就越大。核酸杂交的相对稳定性(对应较高的Tm)按以下顺序依次降低：RNA:RNA、DNA:RNA、DNA:DNA。对于长度超过100个核苷酸的杂交体，已经推导出了用于计算Tm的公式(请参见Sambrook等人，同上，9.50-9.51)。对于较短核酸(即寡核苷酸)的杂交，错配的位置变得更重要，而且寡核苷酸的长度决定了其特异性(参见Sambrook等人，同上，11.7-11.8)。在一个实施方案中，可杂交核酸的长度为至少约10个核苷酸。优选地，可杂交核酸的最小长度为至少约15个核苷酸；更优选至少约20个核苷酸；并且最优选地，长度为至少约30个核苷酸。此外，技术人员将认识到，可根据需要根据诸如探针长度之类的因素来调节温度和洗涤溶液盐浓度。

氨基酸或核苷酸序列的“基本部分”是指这样的部分，该部分包括的多肽的氨基酸序列或基因的核苷酸序列足以通过推定而鉴定所述多肽或基因，所述鉴定或者可以由本领域技术人员通过人工评价序列来完成，或者可以利用诸如BLAST(Basic Local Alignment SearchTool；Altschul，S.F.等人，J.Mol.Biol.，215：403-410(1993))Biol.215：403-410(1993))。一般来讲，为了推测鉴定多肽或核酸序列是否与已知的蛋白质或基因同源，需要有10个或更多邻接的氨基酸或者30 个或更多核苷酸的序列。此外，对于核苷酸序列，包含20-30个邻接核苷酸的基因特异性寡核苷酸探针可用于序列依赖性的基因鉴定(如DNA杂交)和基因分离(如细菌菌落或噬斑的原位杂交)的方法中。此外，12至15个碱基的短寡核苷酸可在PCR中用作扩增引物，以便获得包含该引物的特定核酸片段。因此，核苷酸序列的“基本部分”包含的序列足以特异性地鉴定和/或分离包含该序列的核酸片段。本说明书提出了编码一种或多种特定Δ8去饱和酶蛋白的完全氨基酸和核苷酸序列。利用本文所公开的序列，技术人员现在可以利用本发明所公开序列的全部或基本部分，以用于本领域技术人员已知的目的。因此，本发明包括如随附的序列表中所示的完整序列，以及如上文定义的这些序列的基本部分。

术语“互补的”用于描述核苷酸碱基之间能够彼此杂交的关系。例如，对于DNA，腺嘌呤与胸腺嘧啶互补，而胞嘧啶与鸟嘌呤互补。因此，本发明也包括与所附序列表中报道的完整序列互补的分离的核酸片段，以及那些基本相似的核酸序列。

术语“同源性”、“同源的”、“基本上类似的”和“基本上对应的”在本文中可互换使用。它们是指其中一个或多个核苷酸碱基的变化不会影响核酸片段介导基因表达或产生某种表型的能力的核酸片段。这些术语也指本发明的核酸片段的修饰(例如缺失或插入一个或多个核苷酸)，相对于初始的未经修饰的核酸片段，基本上不会改变所得核酸片段的功能特性。因此，正如本领域技术人员应当理解的，本发明不仅仅涵盖这些具体的示例性序列。

此外，技术人员认识到，本发明所涵盖的基本上类似的核苷酸序列也由它们在中等严格条件(如0.5×SSC，0.1％SDS，60℃)下，与本文所示例的序列杂交的能力，或杂交至本文所公开的核苷酸序列的任何部分以及杂交至与本文所公开的任何核苷酸序列功能相当的序列的能力所限定。

“密码子简并性”是指允许核苷酸序列在不影响所编码的多肽的氨基酸序列的情况下发生变化的遗传密码的性质。因此，本发明涉及任何编码以下氨基酸序列的全部或基本部分的核酸片段，该氨基酸序列编码在SEQ ID NO：2、10和12中列出的本发明Δ8去饱和酶多肽。技术人员非常了解在使用核苷酸密码子确定给定氨基酸时，特定宿主细胞显示出的“密码子偏好性”。因此，在合成基因以改善其在宿主细胞中的表达时，希望设计基因以使得其密码子使用频率接近宿主细胞中优选的密码子使用频率。

与DNA序列有关的“化学合成”是指在体外对组分核苷酸进行装配。可以采用完善建立的方法来完成DNA的手工化学合成，或者可使用许多种可商业获得的机器的其中一种来完成自动化学合成。“合成的基因”可由使用本领域技术人员已知的方法化学合成的寡核苷酸构件装配而成。将这些构件进行连接并退火以形成基因节段，该基因节段随后在酶促作用下装配而构建成完整的基因。因此，基于最优化核苷酸序列以反映宿主细胞的密码子偏好，可以定制基因用最优化基因表达。如果密码子使用偏向于宿主偏好的那些密码子，则技术人员会得到成功的基因表达的可能性。优选的密码子的确定可基于对来源于宿主细胞的基因(其中序列信息可获得)的检测。

“基因”是指表达特定蛋白质的核酸片段，并且该核酸片段可以指单独的编码区或可以包括位于编码序列之前的调控序列(5′非编码区)和之后的调控序列(3′非编码区)。“天然基因”是指天然存在的具有其自己的调控序列的基因。“嵌合基因”是指不是天然基因的任何基因，包括在天然情况下不是一起存在的调控序列和编码序列。因此，嵌合基因可包括源于不同来源的调控序列和编码序列，或者包括源于同一来源但以不同于天然存在的方式排列的调控序列和编码序列。“内源性基因”是指位于生物的基因组内它的天然位置的天然基因。“外来基因”是指正常情况下不存在于宿主生物中的基因，它通过基因转移导入宿主生物。外来基因可包括插入到非天然生物内的天然基因、导入到天然宿主内的新位置的天然基因，或嵌合基因。“转基因”是通过转化方法导入基因组内的基因。“经密码子最优化的基因”是其密码子使用频率经设计用以模仿宿主细胞优选的密码子使用频率的基因。

“等位基因”是染色体上占据给定位点的基因的几种供选择替代形式的其中一种。当染色体上给定位点处存在的所有等位基因相同时，植物在该位点是纯合子。如果染色体上给定位点处存在的等位基因不同的话，植物在该位点是杂合子。

“编码序列”是指编码特定氨基酸序列的DNA序列。“合适的调控序列”是指位于编码序列的上游(5′非编码序列)、中间或下游(3′非编码序列)的核苷酸序列，其可影响相关编码序列的转录、RNA加工或稳定性或者翻译。调控序列可包括但不限于：启动子、翻译前导序列、内含子、多腺苷酸化识别序列、RNA加工位点、效应子结合位点和茎环结构。

“启动子”是指能够控制编码序列或功能性RNA表达的DNA序列。一般来讲，编码序列位于启动子序列的3′端。启动子序列可由近侧和较远端上游元件组成，后者经常指增强子。因此，“增强子”是能刺激启动子活性的DNA序列，它可以是启动子的天然元件，或插入以增强启动子水平或组织特异性的异源元件。启动子可以整个源于天然基因，或者由源于不同的天然存在的启动子的不同元件组成，或者甚至包括合成的DNA片段。本领域内的技术人员应当理解，不同的启动子可以在不同的组织或细胞类型中，或者在不同的发育阶段，或者响应不同的环境条件或生理条件而引导基因的表达。还应认识到，因为在大多数情况下还不能完全确定调控序列的确切范围，因此一些变型的DNA片段可能具有相同的启动子活性。多数情况下能引起基因在大多数细胞型中表达的启动子通常称为“组成型启动子”。在植物细胞中一直在发现可用的不同类型的新启动子；在以下文献中可以发现多个实例：Okamuro，J.K.和Goldberg，R.B.编辑的Biochemistry ofPlants，15：1-82(1989)。

“翻译前导序列”是指位于基因启动子序列和编码序列之间的多核苷酸序列。翻译前导序列存在于翻译起始序列的经充分加工后的mRNA上游。翻译前导序列可影响mRNA的初级转录过程、mRNA稳定性或翻译效率。已经描述了翻译前导序列的实例(Turner，R.和Foster，G.D.，Mol.Biotechnol.，3：225-236(1995))。

术语“3′非编码序列”、“转录终止子”和“终止序列”是指位于编码序列下游的DNA序列。这包括多腺苷酸化识别序列和编码能影响mRNA加工或基因表达的调节信号的其它序列。多腺苷酸化信号通常表征为影响多腺苷酸片段添加到mRNA前体的3′末端。3′区可影响相关编码序列的转录、RNA加工或稳定性或翻译。Ingelbrecht，I.L.等人例示了不同3′非编码序列的用途(Plant Cell，1：671-680(1989))。

“RNA转录物”是指由RNA聚合酶催化DNA序列的转录所产生的产物。当RNA转录物与DNA序列拷贝完全互补时，它是指初级转录物。当RNA转录物是来源于转录后加工的初级转录物的RNA序列时，它是指成熟的RNA。“信使RNA”或“mRNA”是指无内含子并且可以由细胞翻译成蛋白质的RNA。“cDNA”是指与mRNA模板互补并用反转录酶从mRNA模板合成的DNA。cDNA可以是单链，或使用DNA聚合酶I的Klenow片段转化成双链。“有意义”RNA是指包括mRNA和在细胞内或体外能被翻译成蛋白质的RNA在内的RNA转录物。“反义RNA”是指与全部或部分靶初级转录物或mRNA互补，并阻止靶基因表达的RNA(美国专利5,107,065；WO 99/28508)。反义RNA可以与特定基因转录物的任何部分，即5′非编码序列、3′非编码序列、内含子、或编码序列互补。“功能性RNA”是指反义RNA、核酶RNA或其它不能翻译但是对细胞过程有影响作用的RNA。术语“互补的”和“反向互补的”对mRNA转录来说可互换使用，并且用以定义信使反义RNA。

术语“可操作地连接”是指单个核酸片段上的核酸序列的关联，使得其中一个核酸序列的功能受到另一个核酸序列的调控。例如，当启动子能够影响编码序列的表达(即，该编码序列受到该启动子的转录控制)时，则该启动子与该编码序列可操作地连接。编码序列可以以有义或反义的取向可操作地连接至调控序列。

术语“质粒”、“载体”和“盒”是指通常携带有不属于细胞中心代谢的部分的基因的染色体外元件，并且常常是环状双链DNA片段的形式。这类元件可以是源自任何来源的自主复制序列、基因组整合序列、噬菌体或单链或双链DNA或RNA的核苷酸序列(线性或环状)，其中多个核苷酸序列已连接或重组进一种独特构建体中，该独特构建体能够将所选基因产物的启动子片段和DNA序列与相应的3′末端非翻译序列一起引入细胞中。“表达盒”是指包含外来基因并且除该外来基因以外还具有使得该基因在外来宿主中的表达增强的元件的特定载体。

术语“重组构建体”、“表达构建体”、“嵌合构建体”、“构建体”和“重组DNA构建体”在本文中可互换使用。重组构建体包括人造的核酸片段组合，例如天然条件下不一起存在的调控序列和编码序列。例如嵌合构造可包括源于不同来源的调控序列和编码序列，或者包括源于同一来源但以不同于天然存在的方式排列的调控序列和编码序列。此类构建体可独自使用或与载体组合使用。如果使用载体，则载体的选择取决于用以转化宿主细胞的方法，该宿主细胞是本领域的技术人员所熟知的。例如可以使用质粒载体。技术人员熟知为了成功地转化、筛选和繁殖包括本发明任何分离的核酸片段的宿主细胞，必须存在于载体上的遗传元件。技术人员也将认识到不同的独立转化事件将导致不同水平和不同模式的表达(Jones等人，EMBO J.4：2411-2418(1985)；De Almeida等人，Mol.Gen.Genetics 218：78-86(1989))，因此为了获得显示所需表达水平和模式的菌株或细胞系，必须对多个事件进行筛选。这种筛选可以通过DNA印迹的Southern分析(Southern，J.Mol.Biol.，98：503(1975))、mRNA表达的Northern分析(Kroczek，J.Chromatogr.Biomed.Appl.，618(1-2)：133-145(1993))、蛋白质表达的Western和/或Elisa分析、PUFA产物的表型分析或GC分析等来进行。

如本文所用，术语“表达”是指源于本发明的核酸片段的有义RNA(mRNA)或反义RNA的转录和稳定积聚。表达也可是指将mRNA翻译成多肽。

“成熟”蛋白质是指经翻译后加工的多肽(即已经去除了存在于初始翻译产物中的任何前肽或肽原的多肽)。“前体”蛋白质是指mRNA的初级翻译产物，即前肽和肽原仍然存在。前肽和肽原可以是但不限于细胞内定位信号。

“转化”是指将核酸片段转入宿主生物的基因组以产生稳定的遗传特性，该基因组包括核基因组和细胞器基因组。相反，“瞬时转化”是指将核酸片段转入宿主生物的核中或包含DNA的细胞器中，在无整合或无稳定的遗传特性的情况下引起基因表达。因此用于转化的核酸分子可以是例如质粒，它可以自主复制或整合到宿主生物的基因组中。含有转化核酸片段的宿主生物被称为“转基因”或“重组”或“转化”生物体。

“反义抑制”是指产生能够抑制靶蛋白表达的反义RNA转录物。“共抑制”是指产生能够抑制相同的或基本上类似的外源或内源性基因表达的正义RNA转录物(美国专利5,231,020)。以前已经通过集中正向超表达具有与内源mRNA同源性的核酸序列设计出了植物中的共抑制构建体，它导致所有与超表达序列具有同源性的RNA减少(Vaucheret等人，Plant J.，16：651-659(1998)；Gura，Nature，404：804-808(2000))。该现象的总体效率较低，并且RNA减少的程度变化较大。随后的工作已经描述了“发夹”结构的用途，它在互补方向结合全部或部分mRNA编码序列，导致已表达的RNA形成潜在的“茎-环”结构(WO 99/53050；WO 02/00904)。这在获得的转基因植物中提高了共抑制的频率。另一个变型描述了植物病毒序列的用途，该病毒序列用以引导近侧mRNA编码序列的抑制或“沉默”(WO98/36083)。这些共抑制现象均未从机制上得到阐明，但遗传证据已经开始揭示这种复杂的情况(Elmayan等人，Plant Cell，10：1747-1757(1998))。

术语“含油的”是指那些趋于以脂质形式贮存它们的能源的生物(Weete，Fungal Lipid Biochemistry，第二版，Plenum，1980)。FungalLipid Biochemistry，第二版，Plenum，1980)。通常，这些微生物的细胞油或TAG含量符合S形曲线，其中脂质浓度增加直至在晚对数培育生长期或早稳定培育生长期时它达到最高浓度，随后在晚稳定培育生长期和死亡期期间逐渐下降(Yongrmanitchai和Ward，Appl.Environ.Microbiol.，57：419-25(1991))。Environ.Microbiol.，57：419-25(1991))。

术语“含油酵母”是指那些能够产油并被归类为酵母的微生物。含油微生物积累油超过它们的干细胞重量的约25％的情形并不鲜见。含油酵母的实例包括但不限于如下属：耶氏酵母属(Yarrowia)、假丝酵母属(Candida)、红酵母属(Rhodotorula)、红冬孢酵母属(Rhodosporidium)、隐球酵母属(Cryptococcus)、丝孢酵母属(Trichosporon)和油脂酵母属(Lipomyces)。

如本领域所熟知，术语“百分比同一性”是两条或更多条多肽序列之间或两条或更多条多核苷酸序列之间的关系，该关系通过对序列进行比较确定。在本领域中，“同一性”还表示多肽或多核苷酸序列之间序列关联的程度。根据具体情况，它由这些序列的序列串之间的匹配程度确定。“同一性”和“相似性”可容易地通过已知方法计算出来，所述的方法包括但不限于以下文献中所描述的那些：1.)Computational Molecular Biology(Lesk，A.M.编辑)Oxford University： NY(1988)；2.)Biocomputing：Informatics and Genome Projects(Smith，D.W.编辑)Academic：NY(1993)；3.)Computer Analysis of SequenceData，Part I(Griffin，A.M.和Griffin，H.G.编辑)Humania：NJ(1994)；4.)Sequence Analysis in Molecular Biology(von Heinje，G.编辑)Academic(1987)；和5.)Sequence Analysis Primer(Gribskov，M.and Devereux，J.，Eds.)Stockton：NY(1991)。设定确定同一性的优选方法来用于给出待测试序列之间的最佳匹配。确定同一性和相似性的方法在可公开获得的计算机程序中编成了代码。

“Clustal V序列比对方法”对应于Clustal V标记的比对方法(描述于Higgins和Sharp，CABIOS.5：151-153(1989)；Higgins，D.G.等人(1992)Comput.Appl.Biosci.8：189-191)，存在于LASERGENE计算生物信息学程序包的MegAlign^TM程序中(DNASTAR Inc.，Madison，WI)。可以使用MegAlign^TM程序进行序列对比和百分比同一性计算。使用Clustal比对方法进行多重序列比对(Higgins和Sharp，CABIOS，5：151153(1989)；Higgins，D.G.等人，Comput.Appl.Biosci.，8：189-191(1992))，除非另外指明，使用预设参数(GAPPENALTY＝10，GAP LENGTH PENALTY＝10)。使用Clustal V方法时，用于双序列比对及蛋白质序列百分比同一性计算的预设参数是：KTUPLE 1，GAP PENALTY＝3，WINDOW＝5以及DIAGONALSSAVED＝5。用Clustal程序比对序列后，可通过查看同一程序中的“序列距离”表来获得“百分比同一性”。

“Clustal W序列比对方法”对应于Clustal W标记的比对方法(描述于Thompson等人，Nucleic Acids Res.22：4673-4680(1994))，存在于LASERGENE计算生物信息学程序包的MegAlign^TMv5.07程序中(DNASTAR Inc.，Madison，WI)。除非另外指明，用于多重序列比对和蛋白质序列百分比同一性计算的预设参数为GAP PENALTY＝10，GAP LENGTH PENALTY＝0.2，DELAY DIVERGENCE SEQS(％)＝30，DNA TRANSITION WEIGHT＝0.50，protein weight matrix＝Gonnet series以及DNA weight matrix＝IUB。除非另外指明，用于双序列比对和蛋白质序列百分比同一性计算的预设参数为GAP PENALTY＝10，GAPLENGTH PENALTY＝0.1，protein weight matrix＝Gonnet 250以及DNAweight matrix＝IUB。

“BLASTN比对方法”是由国家生物技术信息中心(National Centerfor Biotechnology Information，NCBI)提供的用以采用默认参数比较核苷酸序列的算法。

本领域的技术人员非常清楚，多种程度的序列同一性可用于从其它物种中鉴定多肽，其中这类多肽具有相同或相似的功能或活性。同一性百分比的可用的实例包括但不限于50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％或95％、或50％至100％之间的任何整数百分比。实际上，50％至100％之间的任何整数氨基酸同一性可用于描述本发明，诸如51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％、60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％。此分离核苷酸片段的任何全长或部分互补的序列也是有用的。

术语“序列分析软件”是指可用于分析核苷酸或氨基酸序列的任何计算机算法或软件程序。“序列分析软件”可商购获得或独立开发。典型的序列分析软件包括但不限于：1.)GCG程序包(WisconsinPackage Version 9.0，Genetics Computer Group(GCG)，Madison，WI)；(2)BLASTP，BLASTN，BLASTX(Altschul等人，J.Biol.，215：403-410(1990))；(3)DNASTAR(DNASTAR Inc.，Madison，WI)；(4)Sequencher(Gene Codes Corporation，Ann Arbor，MI)；和5.)整合了Smith-Waterman算法的FASTA程序(W.R.Pearson，Comput.Methods Genome Res.，[Proc.Int.Symp.](1994)，Meeting Date1992，111-20.编辑：Suhai，Sandor.Plenum：New York，NY)。在本专利申请案的上下文中应当理解，使用序列分析软件进行分析时，除非另外指明，否则分析结果将基于所参考程序的“默认值”。在此所用的“默认值”是指在首次初始化软件时软件最初加载的任何值或参数集。

合适的核酸片段(本发明的分离多核苷酸)编码与本文报导的氨基酸序列至少约85％相同的多肽。更优选的核酸片段编码与本文报导的氨基酸序列至少约90％相同的氨基酸序列，而最优选的核酸片段编码至少约95％相同的氨基酸序列。本领域的技术人员非常清楚，多种程度的序列同一性可用于从其它物种中鉴定多肽，其中这类多肽具有相同或相似的功能或活性。尽管上文描述了优选的范围，但85％至100％之间的任何整数百分比可用于本文目的。

合适的核酸片段不但具有上述同源性，而且通常编码具有至少50个氨基酸，优选至少100个氨基酸，更优选至少150个氨基酸，更优选至少200个氨基酸，最优选至少250个氨基酸的多肽。

本文使用的标准重组DNA和分子克隆技术是本领域熟知的并且已经在如下文献中有较充分地描述：Sambrook，J.，Fritsch，E.F.和Maniatis，T.，Molecular Cloning：A Laboratory Manual，第二版，ColdSpring Harbor Laboratory：Cold Spring Harbor，NY(1989)(下文称为“Maniatis”)；Silhavy，T.J.，Bennan，M.L.和Enquist，L.W.，Experiments with Gene Fusions，Cold Spring Harbor Laboratory：ColdSpring Harbor，NY(1984)；以及Ausubel，F.M.等人，CurrentProtocols in Molecular Biology(Greene Publishing Assoc.andWiley-Interscience(1987)。

综述：Ω脂肪酸和三酰基甘油的生物合成

其中油酸转化成ω-3/ω-6脂肪酸的代谢过程包括通过添加碳原子使碳链延长和通过加入双键使分子去饱和。这需要存在于内质网膜内的一系列特殊去饱和酶和延伸酶。然而，如在图1中看到的和如下所述的，通常存在多个用于产生特定ω-3/ω-6脂肪酸的替代途径。

具体地讲，所有途径都需要最初通过Δ12去饱和酶将油酸转化成LA(第一个ω-6脂肪酸)。然后，利用“Δ9延伸酶/Δ8去饱和酶途径”，如下形成ω-6脂肪酸：(1)通过Δ9延伸酶将LA转化成EDA；(2)通过Δ8去饱和酶将EDA转化成DGLA；和(3)通过Δ5去饱和酶将DGLA转化成ARA。作为另一种选择，“Δ9延伸酶/Δ8去饱和酶途径”可用于如下形成ω-3脂肪酸：(1)通过Δ15去饱和酶将LA转化成ALA(第一个ω-3脂肪酸)；(2)通过Δ9延伸酶将ALA转化成ETrA；(3)通过Δ8去饱和酶将ETrAA转化成ETA；(4)通过Δ5去饱和酶将ETA转化成EPA；(5)通过C_20/22延伸酶将EPA转化成DPA；和(6)通过Δ4去饱和酶将DPA转化成DHA。任选地，ω-6脂肪酸可转化成ω-3脂肪酸；例如，ETA和EPA通过Δ17去饱和酶活性分别从DGLA和ARA生成。

用于ω-3/ω-6脂肪酸生物合成的替代途径利用Δ6去饱和酶和C_18/20延伸酶(即“Δ6去饱和酶/Δ6延伸酶途径”)。更具体地讲，LA和ALA可通过Δ6去饱和酶分别转化成GLA和STA；然后，C_18/20延伸酶将GLA转化成DGLA和/或将STA转化成ETA。

预期需要在特定宿主生物中表达用以产生ω-3/ω-6脂肪酸的特定功能将取决于宿主细胞(及其天然的PFUA概况和/或去饱和酶/延伸酶概况)、底物的可利用性和所需的终产物。例如Δ9延伸酶/Δ8去饱和酶途径的表达在一些实施方案中是优选的，但它会抑制Δ6去饱和酶/Δ6延伸酶途径的表达，因为经由前者产生的PUFA缺乏GLA。

本领域技术人员将能够鉴定多种编码ω-3/ω-6脂肪酸生物合成所需的每种酶的候选基因。可用的去饱和酶和延伸酶序列可源自任何来源，例如，分离自天然来源(来自细菌、藻类、真菌、植物、动物等)、经由半合成途径产生或从头合成。尽管导入宿主的去饱和酶和延伸酶基因的具体来源不是关键的，但选择具有去饱和酶或延伸酶活性的特定多肽的考虑事项包括：1.))多肽的底物特异性；2.)多肽或其组分是否为限速酶；3.)去饱和酶或延伸酶是否是合成期望的PUFA所必需的；和/或4.)多肽所需的辅因子。表达的多肽优选具有与它在宿主细胞中的位置的生化环境相容的参数(参见WO 2004/101757)。

在另外的实施方案中，考虑每种特定的去饱和酶和/或延伸酶的转化效率也将是有用的。更具体地讲，由于每种酶极少能以100％的效率将底物转化成产物，宿主细胞所产生的未纯化的油的最终脂质概况将通常是由期望的ω-3/ω-6脂肪酸及多种上游PUFA中间产物组成的多种PUFA的混合物。因此，当优化所需脂肪酸的生物合成时，每种酶的转化效率也是一个重要的变量，必须按照产物的最终所需脂质特征进行考虑。

考虑到上述各个考虑事项，具有合适去饱和酶和延伸酶活性(如Δ6去饱和酶、C_18/20延伸酶、Δ5去饱和酶、Δ17去饱和酶、Δ15去饱和酶、Δ9去饱和酶、Δ12去饱和酶、C_14/16延伸酶、C_16/18延伸酶、Δ9延伸酶、Δ8去饱和酶、Δ4去饱和酶和C_20/22延伸酶)的候选基因可根据可公开获得的文献(如GenBank)、专利文献和对具有产生PUFA能力的生物的实验分析来鉴定。这些基因将适用于导入到特定的宿主生物中，以使该生物能合成PUFA或增强生物合成PUFA。

一旦脂肪酸在生物体内合成(包括饱和的和不饱和的脂肪酸以及短链和长链脂肪酸)，它们可能被掺入三酰甘油(TAG)。TAG(脂肪酸的初级储存单位，包括PUFA)通过一系列反应形成，涉及：1.)一分子的酰基辅酶A和甘油-3-磷酸通过酰基转移酶酯化而生成溶血磷脂酸；2.)第二分子的酰基辅酶A通过酰基转移酶酯化而生成1，2-二酰基甘油磷酸(通常称为磷脂酸)；3.)通过磷脂酸磷酸酶除去磷酸而生成1，2-二酰基甘油(DAG)；和4.)在酰基转移酶作用下加入第三个脂肪酸以形成TAG。

小眼虫Δ8去饱和酶的序列鉴定

共有的WO 2006/012325和WO 2006/012326公开了小眼虫的Δ8去饱和酶，该去饱和酶能使EDA和EtrA去饱和(此处称为“Eg5”并编为SEQ ID NO：2)。在本申请中，描述为“EgD8”的小眼虫Δ8去饱和酶(本文的SEQ ID NO：11和12)与Eg5的核苷酸和氨基酸序列100％相同及等效。

如本领域所熟知，密码子最优化可以是进一步优化该酶在替代宿主中表达的有用手段，因为使用宿主优选的密码子能够大幅增强编码该多肽的外来基因的表达。类似地，来源于小眼虫并经密码子最优化以在解脂耶氏酵母中表达的合成Δ8去饱和酶也在WO 2006/012325和WO 2006/012326中被公开为SEQ ID NO：112和113(此处称为“D8SF”)。具体地讲，1263bp的编码区中有207bp(16.4％)被修饰，对应于192个密码子的密码子优化。此外，“D8SF”另外有一个插入到野生型Eg5的氨基酸残基1和2之间的缬氨酸；因此，密码子最优化的去饱和酶的全长为422个氨基酸。解脂耶氏酵母中密码子最优化基因(即“D8SF”)的表达产物显示了比野生型基因(即Eg5)更有效的将EDA去饱和为DGLA和/或将ETrA去饱和为ETA的效果。在本申请中，来源于小眼虫并经密码子最优化以在解脂耶氏酵母中表达的合成Δ8去饱和酶称为“EgD8S”(本文的SEQ ID NO：9和10)，它与D8SF的核苷酸和氨基酸序列100％相同及等同。

在来源于小眼虫并经密码子最优化以在解脂耶氏酵母中表达的合成Δ8去饱和酶中的工程学靶向突变

现有文献中已经建立了用于合成序列并将序列组合到一起的方法。文献中普遍采用多种技术以获得天然存在的去饱和酶基因的突变型(其中此类突变可包括删除、插入和点突变、或它们的组合)。这将使得能分别在体内产生具有去饱和酶活性的多肽，该多肽在宿主细胞内具有更佳的物理参数和动力参数，例如更长的半衰期或更高的所需PUFA的生产速率。或者如果需要的话，可以通过常规诱变、所得突变多肽表达及其活性测定来测定所需多肽(即去饱和酶)对酶活性重要的区域。所有此类突变蛋白质和编码它们的核苷酸序列，无论是来源于野生型的(即SEQ ID NO：11和12)还是同上所述的合成的经密码子最优化的(SEQ ID NO：9和10)Δ8去饱和酶，均属于本发明的范围内。

更具体地讲，在本文的发明中，通过在已知的、功能化的小眼虫Δ8去饱和酶中制备靶向突变来工程化地合成编码Δ8去饱和酶的突变序列，该Δ8去饱和酶经密码子最优化以在解脂耶氏酵母中表达(即在SEQ ID NO：9和10中列出的“EgD8S”)。对每种突变在所得突变型EgD8S的Δ8去饱和酶活性上的效果进行筛选。尽管不应被理解为对本文本发明的限制，使用下述方法最后制造的突变型EgD8S酶(SEQ IDNO：2)包括至少一个对合成的经密码子最优化的EgD8S的氨基酸突变(以及最多33个氨基酸突变)，并具有功能上等同的Δ8去饱和酶活性。

制造拓扑模型并鉴定合适的氨基酸突变位点

基于去饱和酶的进化，P.Sperling等人详述了Δ8去饱和酶的一般特性(Prostaglandins Leukot.Essent.Fatty Acids，68：73-95(2003))。连同Δ6、Δ5和Δ4去饱和酶一起，已知Δ8去饱和酶是长链PUFA“前端”去饱和酶(其中去饱和发生在先前存在的双键和脂肪酸酰基的羧基末端之间，与甲基定向的去饱和相反)。这些去饱和酶的特征在于三个组氨酸框[H(X)_3-4H(SEQ ID NO：166和167)、H(X)_2-3HH(SEQ ID NO：168和169)和H/Q(X)_2-3HH(SEQ ID NO：170和171)]，以及是细胞色素b₅融合超家族的成员，因为它们在N末端具有融合细胞色素b₅结构域，该结构域起到电子供体的作用。细胞色素b₅结构域还包含完全保守的血红素结合基序(即“HPGG”)，它显示对酶活性是必需的(J.A.Napier等人，Prostaglandins Leukot.Essent.FattyAcids，68：135-143(2003)；P.Sperling等人，同上)。最后，尽管“前端”去饱和酶的晶体结构仍未获得，亲水性分析揭示4-6个跨膜螺旋区占这些蛋白质几乎30％的氨基酸序列。

基于上文综述，将EgD8S(SEQ ID NO：10)的蛋白质序列进行特定分析以制造拓扑模型(图2)。正如我们预期，EgD8S包含两个结构域：N末端细胞色素b₅结构域(位于SEQ ID NO：10的氨基酸残基5至71之间)和C末端去饱和酶结构域(位于SEQ ID NO：10的氨基酸残基79至406之间)。在SEQ ID NO：10的88-109、113-132、266-283和287-309氨基酸残基处鉴定了四个跨膜螺旋区(图2上标记为区域I、II、III和IV)，其N末端和C末端均位于膜的细胞质侧。另外两个疏水区域位于氨基酸残基157-172和223-245处。最后，三个组氨酸框位于氨基酸残基146-150、183-187和358-362之间，而保守血红素结合基序(“HPGG”)位于氨基酸残基27-30之间。

使用拓扑模型、比对EgD8S和其它前端去饱和酶以及比对EgD8S的细胞色素b₅结构域和其它细胞色素b₅基因，随后选择了EgD8S内的70个位点作为可能适合诱变的位点(实施例2中详细描述了选择标准)。这些位点对应于126个单独的氨基酸突变(即57.9％的保守氨基酸取代和42.1％的非保守氨基酸取代)，如实施例2的表7所详述。

定点诱变以制造EgD8S突变型

尽管可使用多种方法诱变Δ8去饱和酶，基于本文的策略，期望在EgD8S中使用低聚核苷酸介导的定点诱变制造特异性点突变。此外，尽管存在多种定点诱变方案(例如Ishii，T.M.等人，MethodsEnzymol.，293：53-71(1998)；Ling M.M.和B.H.Robinson，Anal.Biochem.，254：157-178(1997)；Braman J.(ed.)In Vitro MutagenesisProtocols.第2版，Humania：Totowa，NJ(2002)；Kunkel T.A.等人，Methods Enzymol.，154：367-382(1987)；Sawano A.和Miyawaki，A.Nucleic Acids Res.，28：e78(2000))，选择

定点诱变试剂盒(Stratagene，La Jolla，CA)使用，这是基于该试剂盒的易操作和高效率。具体地讲，该试剂盒不需要专门的载体、单一限制性位点或多重转化，并且实际上允许在任何双链质粒中的位点特异性突变。基本程序利用了超螺旋双链DNA载体以及所需的插入序列和两个包含所需突变的合成低聚核苷酸引物。每个低聚核苷酸引物与载体的反链互补，在温度循环过程中被DNA聚合酶延伸。结合低聚核苷酸引物产生包含交错切口的突变质粒。在温度循环后用Dpn I核酸内切酶(甲基化和半甲基化DNA特异性的)处理产物，以此作为消化亲本DNA模板并选择新合成的突变DNA的方法。然后用包含所需突变的切口载体DNA转化大肠杆菌宿主并培养宿主。

使用上述技术，然后测试工程化合成EgD8S(具有多个对EgD8S的突变位点，但是保持了与酶的Δ8去饱和酶活性功能等同)的可行性。具体地讲，通过定点诱变将选择的单个点突变引入EgD8S(在包括嵌合FBAINm::EgD8S::XPR基因的质粒构建体内)、转化大肠杆菌、然后基于GC分析筛选Δ8去饱和酶活性。

技术人员将可以设想另外的筛选以选择编码具有Δ8去饱和酶活性的蛋白质的基因。例如可以通过检测分析法检测去饱和酶活性，其中将包含一种酶的制备物与合适形式的脂肪酸底物一起培养并分析此底物向预想的脂肪酸产物的化情况。作为另外一种选择，可以将提出的用于编码去饱和酶蛋白质的DNA序列导入合适的载体构建体，并通过该构建体在正常情况下不能去饱和特定脂肪酸底物的细胞中表达。该DNA序列编码的去饱和酶的活性然后可以通过提供合适形式的脂肪酸底物给用包含编码去饱和酶的DNA序列的载体转化的细胞和合适的对照细胞(例如单独用空载体转化的细胞)的方法进行检测。在此类实验中，在包含编码去饱和酶的DNA序列的细胞中检测到预想的脂肪酸产物，而在对照细胞中检测不到该脂肪酸产物，由此确定去饱和酶的活性。

上述实验的结果鉴别了一些产生完全无功能的突变型Δ8去饱和酶的突变，该突变具有0％的Δ8去饱和酶活性(例如同时发生的48V到F的突变和49M到L的突变，或同时发生的304G到F的突变和305F到G的突变)。尽管如此，与EgD8S的Δ8去饱和酶活性相比，测试的约75％的单个突变不能显著地降低突变酶的Δ8去饱和酶活性。更具体地讲，将以下突变确认为优选的突变，其中Δ8去饱和酶活性功能上等同于(即100％)或功能上大于EgD8S的Δ8去饱和酶活性(即SEQ IDNO：10)：

表4

EgD8S中最初优选的突变

突变位点	EgD8S序列突变 (SEQ ID NO：10)	％活性^*
			M3	16T突变成K，17T突变成V	100％
M8	66P突变成Q，67S突变成A	100％
			M12	407A突变成S，408V突变成Q	100％
M14	416Q突变成V，417P突变成Y	100％
			M16	108S突变成L	100％
M19	122V突变成S	100％
			M38	54A突变成G，55F突变成Y	100％
M39	64I突变成L，65N突变成D	100％
			M40	69E突变成D，70L突变成V	100％
M41	75A突变成G，76V突变成L	100％
			M45	117G突变成A，118Y突变成F	100％
M46	132V突变成L，133L突变成V	100％
			M49	297F突变成V，298V突变成L	100％
M50	309I突变成V，310V突变成I	100％
			M51	347I突变成L，348T突变成S	100％
M51B	346I突变成V，347I突变成L，348T突变成S	100％
			M53	9L突变成V	100％
M54	19D突变成E，20V突变成I	100％
			M58	65N突变成Q	100％
M63	279T突变成L，280L突变成T	100％
			M68	162L突变成V，163V突变成L	100％
M69	170G突变成A，171L突变成V	100％
			M70	418A突变成G，419G突变成A	100％
M2	12T突变成V	110％

[0173]

M22	127Y突变成Q	110％
			M26	293L突变成M	110％
M6	59K突变成L	110％
			M1	4S突变成A，5K突变成S	115％
M21	125Q突变成H，126M突变成L	120％
			M15	422L突变成Q	125％

^*“％活性”是指每个突变型EgD8S的Δ8去饱和酶活性

对在SEQ ID NO：10中列出的EgD8S的Δ8去饱和酶活性的百分比。

本领域的技术人员应当理解，本发明的可用突变型Δ8去饱和酶不限于上文所述的30个突变组合。例如，尽管所述的突变位点M3包括两个特定的氨基酸突变(即16T突变成K和17T突变成V)，本领域的技术人员将期望单个突变，如16T突变成K或17T突变成V，在突变型Δ8去饱和酶的设计中有用，其Δ8去饱和酶活性与合成的经密码子最优化的EgD8S的Δ8去饱和酶活性至少约功能上等同。因此，实际上表4给出了52个可用于本文目的的单个氨基酸突变。在具有Δ8去饱和酶活性的突变型Δ8去饱和酶的设计中，它与SEQ ID NO：10的Δ8去饱和酶活性至少约功能上等同。

基于以上结果，继续实验工作以致力于在合成的经密码子最优化的EgD8S序列中“累积”合适的单个氨基酸突变。这导致制造出在SEQ ID NO：2中列出的突变型Δ8去饱和酶，SEQ ID NO：2具有“n”个氨基酸突变，其中“n”为1至33之间的任何整数(即1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33)，并且与EgD8S相比该酶具有Δ8去饱和酶活性。具体地讲，SEQ ID NO：2包括至少一个突变，该突变选自：4S突变成A、5K突变成S、12T突变成V、16T突变成K、17T突变成V、54A突变成G、55F突变成Y、66P突变成Q、67S突变成A、108S突变成L、117G突变成A、118Y突变成F、120L突变成M、121M突变成L、125Q突变成H、126M突变成L、132V突变成L、133L突变成V、162L突变成V、163V突变成L、170G突变成A、171L突变成V、279T突变成L、280L突变成T、293L突变成M、346I突变成V、347I突变成L、348T突变成S、407A突变成S、408V突变成Q、418A突变成G、419G突变成A和422L突变成Q，其中将突变定义为对合成的经密码子最优化的EgD8S序列的突变(即，SEQ ID NO：10)；其中SEQ ID NO：2并非100％与SEQ IDNO：10相同；并且其中突变型EgD8S与EgD8S(SEQ ID NO：10)至少约功能上等同。技术人员应当理解，每个上述突变可以彼此任意组合使用。并且本文所述的来源于EgD8和/或EgD8S的所有此类突变蛋白质和编码它们的核苷酸序列属于本发明的范围内。在更优选的实施方案中，突变型EgD8S具有对合成的经密码子最优化的EgD8S序列至少约10-18个保守的和非保守的氨基酸取代(即突变)，更优选地至少约19-25个保守的和非保守的氨基酸取代，最优选地对合成的经密码子最优化的EgD8S(即SEQ ID NO：10)序列至少约26-33个保守的和非保守的氨基酸取代。因此，例如在一个优选的实施方案中，突变型EgD8S-23(SEQ ID NO：4)包括对在SEQ ID NO：10中列出的合成的经密码子最优化的EgD8S序列的以下24个氨基酸突变：4S突变成A、5K突变成S、12T突变成V、16T突变成K、17T突变成V、66P突变成Q、67S突变成A、108S突变成L、117G突变成A、118Y突变成F、120L突变成M、121M突变成L、125Q突变成H、126M突变成L、132V突变成L、133L突变成V、162L突变成V、163V突变成L、293L突变成M、407A突变成S、408V突变成Q、418A突变成G、419G突变成A和422L突变成Q。突变型EgD8S-23氨基酸序列对合成的经密码子最优化的SEQ ID NO：10序列的双序列比对使用预设参数的Vector

AlignX程序(Invitrogen Corporation，Carlsbad，CA)，结果揭示在两种蛋白质间422个氨基酸的长度上有94.3％的序列同一性和97.9％的共有序列。

在另一个优选的实施方案中，突变型EgD8S-013(SEQ ID NO：6)包括对在SEQ ID NO：10中列出的合成的经密码子最优化的EgD8S序列的以下28个氨基酸突变：4S突变成A、5K突变成S、12T突变成V、16T突变成K、17T突变成V、54A突变成G、55F突变成Y、66P突变成Q、67S突变成A、108S突变成L、117G突变成A、118Y突变成F、120L突变成M、121M突变成L、125Q突变成H、126M突变成L、132V突变成L、133L突变成V、162L突变成V、163V突变成L、170G突变成A、171L突变成V、293L突变成M、407A突变成S、408V突变 v成Q、418A突变成G、419G突变成A和422L突变成Q。突变型EgD8S-013氨基酸序列对合成的经密码子最优化的SEQ ID NO：10序列的双序列比对使用预设参数的Vector

的AlignX程序，结果揭示在两种蛋白质间422个氨基酸的长度上有93.4％的序列同一性和97.9％的共有序列。

在另一个优选的实施方案中，突变型EgD8S-015(SEQ ID NO：8)包括对在SEQ ID NO：10中列出的合成的经密码子最优化的EgD8S序列的以下31个氨基酸突变：4S突变成A、5K突变成S、12T突变成V、16T突变成K、17T突变成V、54A突变成G、55F突变成Y、66P突变成Q、67S突变成A、108S突变成L、117G突变成A、118Y突变成F、120L突变成M、121M突变成L、125Q突变成H、126M突变成L、162L突变成V、163V突变成L、170G突变成A、171L突变成V、293L突变成M、279T突变成L、280L突变成T、346I突变成V、347I突变成L、348T突变成S、407A突变成S、408V突变成Q、418A突变成G、419G突变成A和422L突变成Q。突变型EgD8S-015氨基酸序列对合成的经密码子最优化的SEQ ID NO：10序列的双序列比对使用预设参数的Vector

的AlignX程序，结果揭示在两种蛋白质间422个氨基酸的长度上有92.7％的序列同一性和97.4％的共有序列。

因此，在一个实施方案中，本发明涉及分离的多核苷酸，该多核苷酸包括：

(a)编码突变型多肽的核苷酸序列，该突变型多肽具有Δ8去饱和酶活性，其中突变型多肽具有在SEQ ID NO：2中列出的氨基酸序列，其中：

(i)SEQ ID NO：2包括至少一个突变，该突变选自：4S突变成A、5K突变成S、12T突变成V、16T突变成K、17T突变成V、54A突变成G、55F突变成Y、66P突变成Q、67S突变成A、108S突变成L、117G突变成A、118Y突变成F、120L突变成M、121M突变成L、125Q突变成H、126M突变成L、132V突变成L、133L突变成V、162L突变成V、163V突变成L、170G突变成A、171L突变成V、279T突变成L、280L突变成T、293L突变成M、346I突变成V、347I突变成L、348T突变成S、407A突变成S、408V突变成Q、418A突变成G、419G突变成A和422L突变成Q，其中将突变定义为对合成的经密码子最优化的EgD8S序列的突变(即SEQ ID NO：10)；和

(ii)SEQ ID NO：2与SEQ ID NO：10不同；或，

(b)该核苷酸序列的互补序列，其中互补序列和核苷酸序列由相同数量的核苷酸组成并且它们是100％互补的。

在更优选的实施方案中，如上所述的SEQ ID NO：2的Δ8去饱和酶活性与SEQ ID NO：10的Δ8去饱和酶活性至少约功能上等同。

预期具有Δ8去饱和酶活性、至少约功能上等同于EgD8(SEQ IDNO：12)或EgD8S(SEQ ID NO：10)的Δ8去饱和酶活性的突变型Δ8去饱和酶可在SEQ ID NO：2中列出，其中：(i)SEQ ID NO：2包括至少一个突变，该突变选自：4S突变成A、5K突变成S、12T突变成V、16T突变成K、17T突变成V、54A突变成G、55F突变成Y、66P突变成Q、67S突变成A、108S突变成L、117G突变成A、118Y突变成F、120L突变成M、121M突变成L、125Q突变成H、126M突变成L、132V突变成L、133L突变成V、162L突变成V、163V突变成L、170G突变成A、171L突变成V、279T突变成L、280L突变成T、293L突变成M、346I突变成V、347I突变成L、348T突变成S、407A突变成S、408V突变成Q、418A突变成G、419G突变成A和422L突变成Q，其中将突变定义为对合成的经密码子最优化的EgD8S序列的突变(即，SEQ ID NO：10)；和，(ii)SEQ ID NO：2并非与SEQ ID NO：10100％相同。此外，应当理解本发明不但包括上述特定突变，而且包括那些化学上等同的氨基酸取代。因此例如在某一位点发生脂肪族的、非极性的丙氨酸的取代，那么在相同位点也可用化学上等同的丝氨酸取代。

在其它实施方案中，可以通过结构域交换，使用任何本文所述的Δ8去饱和酶核酸片段以制造新的和改善的脂肪酸去饱和酶，其中来自任何Δ8去饱和酶核酸片段的功能结构域与替代去饱和酶基因中的功能结构域发生交换并由此产生新的蛋白质。

用于产生多种ω-3和/或ω-6脂肪酸的方法

期望在合适的启动子控制下导入编码本文所述的Δ8去饱和酶的嵌合基因能分别引起转化过的宿主生物中产生的DGLA和/或ETA增加。同样的，本发明包括直接产生PUFA的方法，该方法包括使脂肪酸底物(即EDA或ETrA)受到本文所述的去饱和酶的作用(即那些来源于EgD8或EgD8S，或它们的同源物的去饱和酶)，使得底物被转化为所需的脂肪酸产物(即DGLA和/或ETA)。

更具体地讲，本发明的目的是提供用于在宿主细胞(例如含油酵母、大豆)中产生DGLA的方法，其中宿主细胞包括：

a.)编码Δ8去饱和酶多肽的重组构建体，该构建体在SEQ IDNO：2中提出，其中SEQ ID NO：2并非与SEQ ID NO：10100％相同；和，

b.)EDA源；

其中宿主细胞在使得Δ8去饱和酶被表达并且EDA被转化为DGLA的条件下培养，并且其中DGLA被任选地回收。

本领域中的技术人员将认识到，Δ8去饱和酶的宽的底物范围可另外允许利用该酶将ETrA转化成ETA。因此，本发明提供用于产生ETA的方法，其中宿主细胞包括：

b.)ETrA源；

其中宿主细胞在使得Δ8去饱和酶被表达并且ETrA被转化为ETA的条件下增殖，并且其中ETA被任选地回收。

作为另外一种选择，可以间接使用本文所述的每个Δ8去饱和酶基因及其对应的酶产物以产生ω-3脂肪酸(参见WO 2004/101757)。发生了间接产生ω-3/ω-6 PUFA，其中脂肪酸底物经由中间步骤或途径中间产物间接转化成期望的脂肪酸产物。因此，预期可以将本文描述的Δ8去饱和酶(即那些来源于EgD8或EgD8S，或它们的同源物的突变型)与另外的编码PUFA生物合成途径的酶(如Δ6去饱和酶、C_18/20延伸酶、Δ17去饱和酶、Δ15去饱和酶、Δ9去饱和酶、Δ12去饱和酶、C_14/16延伸酶、C_16/18延伸酶、Δ9延伸酶、Δ5去饱和酶、Δ4去饱和酶、C_20/22延伸酶)的基因结合表达以导致更高水平地产生长链ω-3ω-6脂肪酸(如ARA、EPA、DPA和DHA)。在优选的实施方案中，本发明的Δ8去饱和酶将最低限度地与Δ9延伸酶结合表达(例如在SEQ ID NO：173或SEQ ID NO：176中列出的Δ9延伸酶)。然而，包含于特定表达盒中的具体基因将取决于宿主细胞(和它的PFUA概况和/或去饱和酶/延伸酶概况)、底物的可利用性和期望的终产物。

微生物表达系统、表达盒和载体、以及转化

本文所述的Δ8去饱和酶基因和基因产物(即那些来源于EgD8或EgD8S，或它们的同源物的突变型)在可以在异源微生物宿主细胞中生产，尤其是可以在含油酵母细胞中生产(例如解脂耶氏酵母)。

含有引导外来蛋白质高水平表达的调控序列的微生物表达系统和表达载体是本领域技术人员熟知的。这些表达系统和表达载体的任一种均可用于构建用于产生本发明序列的任何基因产物的嵌合基因。然后可以将这些嵌合基因通过转化导入合适的微生物中以提供所编码的酶的高水平表达。

可用于转化合适的微生物宿主细胞的载体或DNA盒是本领域熟知的。存在于构建体中的序列的具体选择取决于期望的表达产物(同上)、宿主细胞的性质以及建议的相对于未转化株分离转化株的手段。然而，通常载体或盒含有引导相关基因的转录和翻译的序列、选择标记和允许自主复制或染色体整合的序列。合适的载体包括控制转录起始的基因5′区(如启动子)和控制转录终止的DNA片段3′区(即终止子)。最优选的是，这两个控制区都来源于来自转化的微生物宿主细胞的基因，尽管应该了解这种控制区不必源自选作生产宿主的特定物种的天然基因。

可用于驱动本发明Δ8去饱和酶ORF在期望微生物宿主细胞中表达的起始控制区或启动子有许多并且是本领域技术人员所熟悉的。实际上任何能引导这些基因在所选择的宿主细胞中表达的启动子都适用于本发明。在微生物宿主细胞中的表达可以瞬时或稳定的方式完成。瞬时表达可通过诱导可操作地连接至目的基因的可调控启动子的活性完成。稳定表达可通过利用可操作地连接至目的基因的组成型启动子实现。举例来说，当宿主细胞为酵母时，提供在酵母细胞中起作用的转录和翻译区，尤其是来自宿主物种的转录和翻译区(例如，对于在解脂耶氏酵母中使用的优选的转录起始调控区，参见WO 2004/101757和WO 2006/052870)。可以使用许多调控序列的任意一种，这取决于是期望组成型转录还是诱导型转录、启动子在表达所关注的ORF中的效率、构建容易性等。

已经发现，围绕翻译起始密码子‘ATG’的核苷酸序列影响酵母细胞的表达。如果所需多肽在酵母中表达差，可以修饰外源基因的核苷酸序列以包括有效的酵母翻译起始序列来获得最佳的基因表达。对酵母中的表达来说，这可以可通过定点诱变不表达基因来完成，即通过将其融合到外源酵母基因的框架区中，优选高表达的基因。作为另外一种选择，可以测定宿主中的共有翻译起始序列并将其导入异源基因中，用于它们在所关注宿主中的最优化表达。

终止区可源于起始区从其获得的基因的3′区或来自不同的基因。大量的终止区是已知的并且(在用于与它们源自的属和物种相同和不同的属和物种两者时)在多种宿主中发挥的功能令人满意。终止区的选择通常更多是为了方便而不是因为任何特殊的性质。优选地，当微生物宿主是酵母细胞时，终止区来源于酵母基因(尤其是糖酵母属、裂殖糖酵母属、假丝酵母属、耶氏酵母属或克鲁维氏酵母属)。编码γ-干扰素和α-2干扰素的哺乳动物基因的3′区域也是酵母中功能已知的区域。终止控制区也可以源于优选宿主天然的多种基因。任选地，终止位点可以是非必需的；然而，如果包括则是最优选的。不受理论的约束，本文公开中可用的终止区包括：解脂耶氏酵母细胞外蛋白酶的100bp的3′区域(XPR；GenBank登陆号M17741)；酰基-coA氧化酶(Aco3：GenBank登陆号AJ001301和CAA04661；Pox3：GenBank登陆号XP_503244)终止子；Pex20(GenBank登陆号AF054613)终止子；Pex16(GenBank登陆号U75433)终止子；Lip1(GenBank登陆号Z50020)终止子；Lip2(GenBank登陆号AJ012632)终止子；以及3-氧酰基-coA硫解酶(OCT；GenBank登陆号X69988)终止子。

如本领域技术人员所意识到的，仅仅将基因插入到克隆载体中不能保证它将被成功地以所需要的水平表达。响应于对高表达率的需要，通过操作许多控制转录、翻译、蛋白质稳定性、氧限制和从微生物宿主细胞分泌方面的不同遗传元件，已经建立了许多专用的表达载体。更具体地讲，已经进行操作来控制基因表达的一些分子特征包括：1.)相关转录启动子和终止子序列的性质；2.)所克隆基因的拷贝数目以及该基因是质粒携带的还是整合到了宿主细胞的基因组中；3.) 所合成的外来蛋白质的最终细胞定位；4.)蛋白质在宿主生物内的翻译和正确折叠的效率；5.)所克隆基因的mRNA和蛋白质在宿主细胞内的固有稳定性；和6.)所克隆基因中的密码子使用，以使得其频率与宿主细胞的优选密码子使用频率接近。这些类型的修饰的每一种都包含于本发明中，作为进一步优化本文所描述的突变型Δ8去饱和酶的表达的手段。

一旦获得编码适于在合适的宿主细胞(例如含油酵母)中表达的多肽的DNA(例如包括启动子、ORF和终止子的嵌合基因)，将其导入能够在酵母细胞中自主复制的质粒载体中，或将其直接整合到宿主细胞基因组中。表达盒的整合可以在宿主基因组中随机地发生或者可以通过使用这样的构建体来靶向，即该构建体含有足够靶向宿主基因座中的重组的与宿主基因组同源的区。如果构建体靶向内源性基因座，则转录和翻译调控区的全部或某些可以由内源性基因座提供。

在本发明中，在解脂耶氏酵母中表达基因的优选方法是通过将线性DNA整合到宿主基因组中；而且，当期望基因高水平表达时，整合到基因组中的多个位置可以是尤其有用的[如在Ura3基因座(GenBank登陆号AJ306421)、Leu2基因座(GenBank登陆号AF260230)、Lys5基因座(GenBank登陆号M34929)、Aco2基因座(GenBank登陆号AJ001300)、Pox3基因座(Pox3：GenBank登陆号XP_503244或Aco3：GenBank登陆号AJ001301)、Δ12去饱和酶基因座(WO2004/104167)、Lip1基因座(GenBank登陆号Z50020)和/或Lip2基因座(GenBank登陆号AJ012632)]。

有利的是，Ura3基因可与5-氟乳清酸(5-氟尿嘧啶-6-一水合羧酸；“5-FOA”)组合重复使用，(下文)，以使得将基因变型较容易的整合进入耶氏酵母属基因组。

如果两个或更多个基因从独立的复制载体表达，则希望每个载体具有不同的选择手段并且应该缺乏与其它构建体的同源性以便维持稳定表达和防止元件在构建体之间重配(reassortment)。可用实验方法确定调控区、选择手段和导入的构建体的增殖方法的选择，以便所有导入的基因都以需要的水平表达从而提供所需产品的合成。

包括目的基因的构建体可以通过任何标准技术导入到微生物宿主细胞中。这些技术包括转化(如醋酸锂转化[Methods in Enzymology， 194：186-187(1991)])、原生质体融合、基因枪轰击(bolistic impact)、电穿孔、显微注射或任何将目的基因导入宿主细胞中的其它方法。可用于含油酵母(即解脂耶氏酵母)的更具体的文献包括美国专利4,880,741和美国专利5,071,764，以及Chen，D.C.等人(Appl.Microbiol.Biotechnol.，48(2)：232-235(1997))。

为了方便起见，已经通过任何方法操纵来摄取DNA序列(如表达盒)的宿主细胞在本文中将称为“转化的”或“重组的”。转化的宿主将具有至少一个拷贝的表达构建体，而且可以具有两个或更多个拷贝，这取决于该基因是整合到基因组内、被扩增还是存在于具有多拷贝数的染色体外元件上。

可通过多种选择技术鉴别转化过的宿主细胞，如WO2004/101757和WO 2006/052870所述。可用于本文的优选的选择方法为卡那霉素抗性、潮霉素和氨基配醣G418、以及在缺乏尿嘧啶、亮氨酸、赖氨酸、色氨酸或组氨酸的培养基上生长的能力。在另一个实施方案中，使用5-FOA选择酵母Ura-突变株。该化合物对具有编码乳清苷5′-单磷酸脱羧酶(OMP脱羧酶)的功能性URA3基因的酵母细胞有毒性；因此，基于这种毒性，5-FOA特别可用于选择和鉴定Ura^-突变酵母菌株(Bartel，P.L.和Fields，S.，Yeast 2-Hybrid System，Oxford University：New York，第7卷，第109-147页，1997)。更具体地讲，技术人员可以首先敲除天然Ura3基因以产生具有Ura-显型的菌株，其中基于5-FOA抗性进行选择。然后，可将多个嵌合基因和新的Ura3基因整合到耶氏酵母属基因组的不同位点以产生具有Ura+显型的新菌株。当敲除导入的Ura3基因时，随后的整合产生新的Ura3-菌株(再次使用5-FOA选择进行鉴别)。因此，在多轮转化过程中，可以将Ura3基因(与5-FOA选择组合使用)用作选择标记。

转化后，适合于本发明Δ8去饱和酶(以及任选在宿主细胞中共表达的其它PUFA酶)的底物可以由宿主自然产生或转基因产生，或者它们可以从外源提供。

用于表达本发明基因和核酸片段的微生物宿主细胞可以包括在多种原料(包括简单或复杂的碳水化合物、脂肪酸、有机酸、油和醇类和/或碳氢化合物)上于广泛的温度和pH值范围内生长的宿主。已经分离了本发明的基因用于在含油酵母中表达(以及具体地讲在解脂耶氏酵母中表达)。预期由于转录、翻译和蛋白质生物合成装置是高度保守的，任何细菌、酵母、藻类、卵菌和/或真菌都将是用于表达本发明的核酸片段的合适微生物宿主。

优选的微生物宿主为含油酵母。这些生物天然能够合成并积聚油，其中油可占细胞干重超过约25％，更优选占细胞干重超过约30％，而最优选占细胞干重超过约40％。通常鉴定为含油酵母的属包括但不限于：耶氏酵母属(Yarrowia)、假丝酵母属(Candida)、红酵母属(Rhodotorula)、红冬孢酵母属(Rhodosporidium)、隐球酵母属(Cryptococcus)、丝孢酵母属(Trichosporon)和油脂酵母属(Lipomyces)。更具体地讲，例证性的油合成酵母包括：类酵母红冬孢(Rhodosporidium toruloides)、斯达氏油脂酵母(Lipomycesstarkeyii)、产油油脂酵母(L.lipoferus)、拉可夫氏假丝酵母(Candidarevkaufi)、铁红假丝酵母(C.pulcherrima)、热带假丝酵母(C.tropicalis)、产朊假丝酵母(C.utilis)、茁芽丝孢酵母(Trichosporonpullans)、皮状丝孢酵母(T.cutaneum)、胶粘红酵母(Rhodotorulaglutinus)、禾木科红酵母(R.graminis)和解脂耶氏酵母(以前归类为解脂假丝酵母(Candida lipolytica))。

最优选的是含油酵母解脂耶氏酵母；而且，在其它实施方案中，最优选的是命名为ATCC#76982、ATCC#20362、ATCC#8862、ATCC#18944和/或LGAM S(7)1的解脂耶氏酵母菌株(PapanikolaouS.和Aggelis G.，Bioresour.Technol.82(1)：43-9(2002))。

从以往来看，多个解脂耶氏酵母菌株已经被用于制作和生产以下产品：异柠檬酸裂合酶；脂肪酶；聚羟基链烷酸酯；柠檬酸；赤藓醇；2-酮戊二酸；γ-癸内酯；γ-十二内酯；和丙酮酸。可用于解脂耶氏酵母中工程化ARA、EPA和DHA生产的具体文献分别在美国专利公开申请11/264784(WO 2006/055322)、11/265761(WO 2006/052870)和11/264737(WO 2006/052871)中提供。

其它优选的微生物宿主包括含油细菌、藻类、卵菌和其它真菌；而且，在该广的微生物宿主的组中，特别关注的是合成ω-3/ω-6脂肪酸的微生物(或那些能被基因工程化而达到该目的的微生物[如其它酵母例如酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)])。因此，例如，用处于诱导型或调控型启动子控制下的任何本发明的Δ8去饱和酶基因转化高山被孢霉(在商业上用于生产ARA)可以产生能合成增量EDA的转化体生物。Mackenzie等人(Appl.Environ.Microbiol.，66：4655(2000))描述了转化高山被孢霉的方法。类似地，美国专利7,001,772公开了转化破囊壶菌目(Thraustochytriales)微生物的方法。

基于上述文献，在本发明的一个实施方案中分别提出了生产DGLA或ETA的方法，该方法包括：

a)提供含油酵母，该含油酵母包括：

(i)编码突变型多肽的核苷酸序列，该突变型多肽具有Δ8去饱和酶活性，其中该突变型多肽具有在SEQ ID NO：2中列出的氨基酸序列，并且其中SEQ ID NO：2与SEQ ID NO：10不同；和，

(ii)分别由EDA或ETrA组成的去饱和酶底物源；和

b)在存在合适的可发酵碳源的情况下培养步骤(a)的酵母，其中编码Δ8去饱和酶多肽的基因被表达而且分别将EDA转化成DGLA或将ETrA转化成ETA；和

c)任选地分别回收步骤(b)中的DGLA或ETA。

可能需要给料底物。

当然，因为含油酵母中天然产生的PUFA仅限于18:2脂肪酸(即LA)和通常较少的18:3脂肪酸(即ALA)，除了本文所述的Δ8去饱和酶之外，本文所述的在本发明的更优选的实施方案中将对含油酵母进行遗传工程化，以表达多个对长链PUFA生物合成必需的酶(因此产生例如ARA、EPA、DPA和DHA)。

具体地讲，在本发明的一个实施方案中涉及的含油酵母包括：

a)第一重组DNA构建体，该构建体包括分离的多核苷酸，它编码突变型Δ8去饱和酶多肽，并可操作地连接到至少一个调控序列上；和

b)至少一个附加的重组DNA构建体，该构建体包括可操作地连接到至少一个调控序列上的分离多核苷酸，该构建体编码的多肽选自：Δ4去饱和酶、Δ5去饱和酶、Δ6去饱和酶、Δ9去饱和酶、Δ12去饱和酶、Δ15去饱和酶、Δ17去饱和酶、Δ9延伸酶、C_14/16延伸酶、C_16/18延伸酶、C_18/20延伸酶和C_20/22延伸酶。

在尤其优选的实施方案中，所述至少一个附加的重组DNA构建体编码具有Δ9延伸酶活性的多肽，例如分离的和/或来源于绿光等鞭金藻的Δ9延伸酶(GenBank登陆号AF390174)以及在SEQ ID NO： 172-174中列出的序列，或分离的和/或来源于小眼虫的Δ9延伸酶以及在SEQ ID NO：175至177中列出的序列。

微生物中的ω-3和/或ω-6脂肪酸生物合成代谢工程学

操纵生物化学途径的方法是本领域的技术人员所熟知的；并且，期望可能进行多个操纵以最大化在含油酵母尤其是解脂耶氏酵母中的ω-3和/或ω-6脂肪酸生物合成。这可能直接需要在PUFA生物合成途径中的或在另外的协同操纵的多种其它代谢途径中的代谢工程学。

在操纵PUFA生物合成途径中的情况下，可能期望增加LA的生产以增加ω-6和/或ω-3脂肪酸的生产。可通过导入和/或扩增编码Δ9和/或Δ12去饱和酶的基因达到此目的。为了最大化ω-6不饱和脂肪酸的生产，本领域的技术人员熟知在基本上不含ALA的宿主微生物中进行生产更有利；因此优选地通过移除或抑制Δ15或ω-3型去饱和酶活性(它使得LA转化成ALA)选择或获取宿主。作为另外一种选择，可能期望最大化ω-3脂肪酸的生产(并且最小化ω-6脂肪酸的合成)。在此实例中，技术人员可利用宿主微生物，其中移除或抑制了使油酸转化成LA的Δ12去饱和酶活性；随后，可将合适的表达盒与合适的底物(例如ALA)一起导入宿主以将ALA转化成其ω-3脂肪酸衍生物(例如STA、ETrA、ETA、EPA、DPA、DHA)。

在另一个实施方案中，与ω-3和/或ω-6脂肪酸生物合成途径竞争能量或碳的生化途径或干扰特定PUFA终产物产生的天然PUFA生物合成途径中的酶可以通过基因破坏来去除或通过其它手段(如反义mRNA)来下调。

对于操纵PUFA生物合成途径作为增加ARA、EPA或DHA(以及它们的相关技术)的方法的详细讨论分别在WO 2006/055322、WO2006/052870和WO 2006/052871中提出，它们是在TAG生物合成途径和TAG降解途径中所需的操纵(以及它们的相关技术)。

在本发明的上下文中，通过任何一种上述策略调节脂肪酸生物合成途径的表达都可能是有用的。例如本发明提供将编码Δ9延伸酶/Δ8去饱和酶生物合成途径中的关键酶的基因导入含油酵母以产生ω-3和/或ω-6脂肪酸的方法。在含油酵母中表达本Δ8去饱和酶基因将是尤其有用的，该含油酵母天然不具有ω-3和/或ω-6脂肪酸生物合成途径，它使用用于宿主生物代谢工程学的多种方法协调这些基因的表达以最大化优选的PUFA产物的生产。

用于PUFA生产的微生物发酵过程

转化过的微生物宿主细胞在能最优化嵌合去饱和酶和延伸酶基因表达的条件下培养，产生最大的和最经济的PUFA产量。通常，可以被优化的培养基条件包括碳源的类型和量、氮源的类型和量、碳氮比、氧水平、生长温度、pH、生物量生产期的时长、油积聚期的时长以及细胞收获的时间和方法。所关注的微生物(即解脂耶氏酵母)一般在复合培养基(例如酵母提取物-蛋白胨-葡萄糖肉汤培养基(YPD))或确定成分的基本培养基中生长，基本培养基缺乏增长必需的组分，因此能对所需表达盒加以选择(例如Yeast Nitrogen Base(DIFCOLaboratories，Detroit，MI))。

本发明的发酵培养基必须含有合适的碳源。在WO 2004/101757中提出了合适的碳源。尽管预期本发明中利用的碳源可以涵盖许多种含碳源，但优选的碳源是糖类、甘油和/或脂肪酸。最优选的碳源是葡萄糖和/或包含介于10-22个碳之间的脂肪酸。

氮可以由无机来源(如(NH₄)₂SO₄)或有机来源(如尿素或谷氨酸)提供。除了合适的碳源和氮源之外，发酵培养基还必须含有合适的矿物质、盐、辅因子、缓冲液、维生素和本领域技术人员已知的适合微生物生长并促进PUFA产生所必需的酶促途径的其它组分。要特别注意促进脂质和PUFA合成的几种金属离子(如Mn⁺²、Co⁺²、Zn⁺²、Mg⁺²)(Nakahara，T.等人，Ind.Appl.Single Cell Oils，D.J.Kyle和R.Colin(编辑)，第61-97页(1992))。

本发明中优选的生长培养基是普通的商业制备的培养基，例如Yeast Nitrogen Base(DIFCO Laboratories，Detroit，MI)。也可以使用其它确定成分的生长培养基或合成的生长培养基，并且适于转化宿主细胞生长的培养基对微生物学或发酵科学领域的技术人员来说将是已知的。适于发酵的pH范围通常介于约pH 4.0至pH 8.0之间，其中优选将pH 5.5至pH 7.5作为初始生长条件的范围。发酵可以在有氧或厌氧条件下进行，其中优选为微好氧条件。

通常，在含油酵母细胞中积聚高水平的PUFA需要两个阶段的过程，因为代谢状态必须在生长和脂肪的合成/贮存之间达到“平衡”。因此，最优选的是，两个阶段的发酵过程是在解脂耶氏酵母中产生PUFA所必需的。这种方法在WO 2004/101757中有所描述，其也描述了多种合适的发酵工艺设计(即分批式、补料分批式和连续式)和生长过程中的注意事项。

PUFA油的纯化和处理

PUFA可以以游离脂肪酸或酯化形式(如甘油酯、磷脂、硫脂或糖脂)存在于宿主微生物和植物中，并且可以通过多种本领域熟知的方法从宿主细胞中提取出来。一个关于酵母脂质的提取技术、质量分析和可接受标准的回顾参见Z.Jacobs(Critical Reviews in Biotechnology，12(5/6)：463-491(1992))。关于下游处理的简要回顾也可参见A.Singh和O.Ward(Adv.Appl.Microbiol.，45：271-312(1997))。

一般来讲，用于纯化PUFA的方法可包括有机溶剂提取、超声波降解、超临界流体提取(例如使用二氧化碳)、皂化和物理方法如压榨，或它们的组合。技术人员可参考文献WO 2004/101757以获得更详细的资料。

优选实施方案的描述

本发明的一个目标是合成合适的Δ8去饱和酶，它将使得植物和含油酵母中的Δ9延伸酶/Δ8去饱和酶途径得到表达。

在共有的WO 2006/012325和WO 2006/012326[US2005-0287652]中申请人描述了从小眼虫(“Eg5”)中分离Δ8去饱和酶，以及酶在酿酒酵母中表达时的功能特征。还可以对野生型Eg5序列进行密码子最优化以在解脂耶氏酵母中表达，从而合成合成的、功能密码子最优化的Δ8去饱和酶，称为“D8SF”。D8SF与密码子最优化的Δ9延伸酶(来源于绿光等鞭金藻(GenBank登陆号390174)在解脂耶氏酵母中的共表达显示6.4％的DGLA(无共表达的GLA)(在WO 2006/012325和WO2006/012326[US2005-0287652-A1]中的实施例12)。

在本申请中，称为“D8SF”(本文称为“EgD8S”)的合成的经密码子最优化的Δ8去饱和酶发生了靶向突变。最后制造了突变型EgD8S酶(SEQ ID NO：2)，该酶包括至少一个对合成的经密码子最优化的 EgD8S的氨基酸突变(最多约33个氨基酸突变)，其中：(i)至少一个突变选自：4S突变成A、5K突变成S、12T突变成V、16T突变成K、17T突变成V、54A突变成G、55F突变成Y、66P突变成Q、67S突变成A、108S突变成L、117G突变成A、118Y突变成F、120L突变成M、121M突变成L、125Q突变成H、126M突变成L、132V突变成L、133L突变成V、162L突变成V、163V突变成L、170G突变成A、171L突变成V、279T突变成L、280L突变成T、293L突变成M、346I突变成V、347I突变成L、348T突变成S、407A突变成S、408V突变成Q、418A突变成G、419G突变成A和422L突变成Q，其中将突变定义为对合成的经密码子最优化的在SEQ ID NO：10中列出的序列的突变；(ii)SEQ ID NO：2与SEQ ID NO：10不同；并且，(iii)SEQID NO：2与SEQ ID NO：10至少约功能上等同。

根据本申请所述的内容，技术人员将认识到本发明编码Δ8去饱和酶的重组基因的商业用途，能够经由异源Δ9延伸酶/Δ8去饱和酶途径的表达产生多种w-3和/或w-6PUFA。

实施例

本发明将在下面的实施例中进一步限定。应该理解，这些实施例尽管说明了本发明的优选实施方案，但仅是以例证的方式给出的。根据上面的论述和这些实施例，本领域的技术人员能确定本发明的基本特征，并在不脱离本发明的精神和范围的情况下，能够对本发明做出多种改变和修饰，以使其适用于多种用法和条件。因此，除了那些本文所示和描述的实例之外，根据前文所述，本发明的不同变型对本领域的技术人员来说将显而易见。此类变型也旨在属于附加的权利要求书的范围内。

一般方法

实施例中使用的标准的重组DNA技术和分子克隆技术是本领域所熟知的并且在如下文献中有描述：1.)Sambrook，J.，Fritsch，E.F.和Maniatis，T.Molecular Cloning：A Laboratory Manual；Cold SpringHarbor Laboratory：Cold Spring Harbor，NY(1989)(Maniatis)；2.)T.J.Silhavy，M.L.Bennan和L.W.Enquist，Experiments with Gene Fusions；Cold Spring Harbor Laboratory：Cold Spring Harbor，NY(1984)；and 3.)Ausubel，F.M.等人，Current Protocols in MolecularBiology，由Greene Publishing Assoc.和Wiley-Interscience公布(1987)。

适用于微生物培养物的维持和生长的材料和方法是本领域熟知的。适用于下面实施例的技术可在Manual of Methods for GeneralBacteriology(Phillipp Gerhardt，R.G.E.Murray，Ralph N.Costilow，Eugene W.Nester，Willis A.Wood，Noel R.Krieg和G.Briggs Phillips编辑)，American Society for Microbiology：Washington，D.C.(1994))；或Thomas D.Brock in Biotechnology：A Textbook of IndustrialMicrobiology，第2版，Sinauer Associates：Sunderland，MA(1989)的描述中找到。除非另外说明，否则用于微生物细胞的生长和维持的所有试剂、限制性内切酶和材料均获自Aldrich Chemicals(Milwaukee，WI)、DIFCO Laboratories(Detroit，MI)、GIBCO/BRL(Gaithersburg，MD)或Sigma Chemical Company(St.Louis，MO)。

一般的分子克隆根据标准方法(Sambrook等人，同上)来完成。通过Sigma-Genosys(Spring，TX)合成低聚核苷酸。DNA序列是在ABI自动测序仪上采用染料终止剂技术(美国专利5,366,860；EP 272,007)使用载体和插入片段特异性引物的组合来产生的。在Sequencher(GeneCodes Corporation，Ann Arbor，MI)中进行序列编辑。所有序列在两个方向上覆盖至少两次。基因序列的比较是使用DNASTAR软件(DNAStar，Inc.，Madison，WI)完成。作为另外一种选择，使用得自Genetics Computer Group Inc.(Wisconsin Package Version 9.0，GeneticsComputer Group(GCG)，Madison，WI)的程序包完成对遗传序列的操纵。GCG程序“Pileup”使用的空位形成预设值为12，而空位延伸预设值为4。GCG“Gap”或“Bestfit”程序使用的预设空位形成罚分为50，而预设空位延伸罚分为3。除非另外指明，在所有其他情况下使用GCG程序的预设参数。

缩写的含义如下：“sec”表示秒，“min”表示分钟，“hr”表示小时，“d”表示天，“μL”表示微升，“mL”表示毫升，“L”表示升，“μM”表示微摩尔浓度，“mM”表示毫摩尔浓度，“M”表示摩尔浓度，“mmol”表示毫摩尔，“μmole”表示微摩尔，“g”表示克，“μg”表示微克，“ng”表示纳克，“U”表示单位，“bp”表示碱基对而“kB”表示千碱基对。份数和百分比为按重量计，温度度数为摄氏度。

解脂耶氏酵母的转化和培养

解脂耶氏酵母菌株ATCC #20362、解脂耶氏酵母菌株ATC#76982和#90812购自American Type Culture Collection(Rockville，MD)。解脂耶氏酵母菌株通常在28℃下于YPD琼脂(1％酵母提取物、2％细菌用蛋白胨、2％葡萄糖、2％琼脂)上生长。

除非另外说明，否则解脂耶氏酵母的转化根据Chen，D.C.等人(Appl.Microbiol.Biotechnol.，48(2)：232-235(1997))。简而言之，将耶氏酵母划线到YPD平板上，并在30℃下生长大约18小时。从平板上刮掉几大环量的细胞并将其重悬浮于含有下面成分的1mL转化缓冲液中：2.25mL 50％PEG，平均分子量为3350；0.125mL 2M醋酸锂，pH6.0；0.125mL 2M DTT。以及50μg经剪切的鲑精DNA。然后，将大约500ng线性化的质粒DNA在100μl重悬浮的细胞中孵育，并将其在39℃下维持1小时，每间隔15分钟进行涡旋混合。将细胞铺在选择培养基平板上并在30℃下维持2至3天。

为了选择转化体，一般使用基本培养基(“MM”)；MM的组分如下：不含硫酸铵或氨基酸的0.17％酵母氮基质(DIFCOLaboratories，Detroit，MI)、2％葡萄糖、0.1％脯氨酸，pH 6.1。视需要加入尿嘧啶或亮氨酸补充剂至终浓度0.01％(由此产生分别用20g/L琼脂制备的“MMU”或“MMLeU”选择培养基)。

备选地，将转化体在5-氟乳清酸(“FOA”；也称为5-氟尿嘧啶-6-羧酸一水合物)选择培养基上进行选择，该培养基包括：无硫酸铵或氨基酸的0.17％酵母氮源(DIFCO Laboratories，Detroit，MI)、2％葡萄糖、0.1％脯氨酸、75mg/L尿嘧啶、75mg/L尿苷、900mg/L FOA(Zymo Research Corp.，Orange，CA)和20g/L琼脂。

解脂耶氏酵母的脂肪酸分析

为了进行脂肪酸分析，将细胞通过离心收集并如Bligh，E.G.&Dyer，W.J.(Can.J.Biochem.Physiol.，37：911-917(1959))中所述提取脂质。脂肪酸甲酯通过脂质提取物和甲醇钠之间的酯交换反应进行制备(Roughan，G.，和Nishida I.，Arch.Biochem.Biophys.，276(1)：38-46(1990))，然后用配备30-m X 0.25mm(内径)HP-INNOWAX(Hewlett-Packard)柱的Hewlett-Packard 6890GC进行分析。烘箱温度以3.5℃/分钟从170℃(保持25分钟)升到185℃。

为了进行直接的碱酯交换反应，收获耶氏酵母培养物(3mL)，在蒸馏水中洗涤一次，并在Speed-Vac中在真空下干燥5至10分钟。将甲醇钠(100μL，浓度为1％)加入样本中，然后将样本涡旋振荡20分钟。在加入3滴1M氯化钠和400μL己烷后，涡旋并离心样本。移出上层并如上所述的用GC进行分析。

实施例1

开发EgD8S拓扑模型

BLASTP分析显示EgD8S包含两个结构域：N末端细胞色素b₅结构域(位于SEQ ID NO：10的氨基酸残基5至71之间)和C末端去饱和酶结构域(位于SEQ ID NO：10的氨基酸残基79至406之间)。为了在不降低Δ8去饱和酶活性的情况下突变EgD8S氨基酸序列，基于以下的逻辑和分析开发拓扑模型(图2)。

首先，TMHMM程序(“预测蛋白质中的跨膜超螺旋区域”；TMHMM Server v.2.0，Center for Biological Sequence Analysis，BioCentrum-DTU，Technical University of Denmark，DK-2800 Lyngby，Denmark)预测EgD8S具有四个跨膜超螺旋区(氨基酸残基113-132、223-245、266-283和287-309)，它们的N末端和C末端均位于膜的细胞质侧。

膜结合脂肪酸去饱和酶属于膜双铁蛋白超家族，它特征在于三个富含组氨酸的基序：HX_(3-4)H(SEQ ID NO：166和167)、HX_(2-3)HH(SEQ ID NO：168和169)以及(H/Q)X_(2-3)HH(SEQ ID NO：170和171)。已经预测这些富含组氨酸残基的基序位于膜的细胞质侧，并且已经证实它们对酶活性很重要(Shanklin，J.等人，Biochemistry，33：12787-12794(1994)；Shanklin，J.，和Cahoon，E.B.，Annu.Rev.Plant Physiol.Plant Mol.Biol.，49：611-641(1998))。在SEQ ID NO：10中，这三个组氨酸框位于氨基酸残基146-150、183-187和358-362之间；另外两个组氨酸残基位于氨基酸残基27和50位。每个组氨酸残基在图2中用小圆圈示出。

如果TMHMM(同上)预测的模型被无改变的接受，则前两个富含组氨酸的区域(即在氨基酸残基146-150和183-187之间的跨膜区域)将位于细胞周质中，因此阻止它们进入铁活化位点。

当使用亲水性分析图(Kyte，J.和Doolittle，R.，J.Mol.Biol.，157：105-132(1982))预测疏水性更强的区域时，解决了上述矛盾，该疏水性更强区域位于氨基酸残基88-109之间，紧邻第一个预测的跨膜片段(即残基113-132)。因为细胞色素b₅结构域的N末端位于细胞质中，预测疏水性区域(即残基88-109)应是第一个跨膜片段(即如图2所示的区域I)，然而预测的对应于残基113-132的跨膜片段被称为第二个跨膜片段(即如图2所示的区域II)。因此，TMHMM最初预测介于残基223-245之间的跨膜片段跨越膜，后来预测它位于细胞质侧，使得前两个富含组氨酸的基序(即介于氨基酸残基146-150之间和183-187之间的跨膜区域)可被调节到在细胞质侧。

最后，亲水性分析图还预测了介于前两个富含组氨酸的基序之间的另一个疏水性区域(即残基157-172)。因为去饱和酶的底物是高度疏水性的，预期它最可能位于细胞质膜的脂双层中。这提示装配自富含组氨酸的基序的去饱和酶活性位点可能在(或非常接近)膜表面。因此，假定两个疏水区域(即残基157-172和残基223-245)位于靠近膜表面的位置以确保活性位点靠近膜。

TMHMM预测后两个跨膜超螺旋区(即残基266-283和287-309)被包在最终的拓扑模型内部，在图2中显示为区域III和区域IV。

因此，图2描绘的拓扑模型包括四个跨膜区域，标记为区域I、II、III和IV，它们分别对应于氨基酸残基88-109、113-132、266-283和287-309。另外两个疏水区域位于氨基酸残基157-172和223-245处。最后，“IN”表示在细胞质内，而“OUT”表示在细胞周质间隙中。

实施例2

选择突变氨基酸残基的策略

通过BLAST测定EgD8S序列的近同源物(Basic Local AlignmentSearch Tool；Altschul，S.F.，等人，J.Mol.Biol.，215：403-410 (1993))，在BLAST“nr”数据库中寻找包含的相似序列(包括所有非冗余GenBank CDS翻译、来源于三维结构的Brookhaven ProteinData Bank的序列、SWISS-PROT蛋白质序列数据库、EMBL和DDBJ数据库)。具体地讲，EgD8S(SEQ ID NO：10)与“nr”数据库中包含的所有公开可用的蛋白质序列进行相似性比较，这通过使用NCBI提供的BLASTP算法进行(Altschul等人，J.Biol.215：403-410(1990))。

不计任何分离自小眼虫的Δ8去饱和酶，BLASTP搜索显示EgD8S与以下蛋白质同源性最高：

表6

基于BLASTP分析得到的EgD8S同源蛋白

GenBank 登陆号	蛋白质	生物	％同一性	％相似性	E-值
						CAE65324	假定蛋白 CBG10258	桅杆线虫	38	56	1E-65
AAR27297	Δ6去饱和酶	淀粉霉	35	52	3E-65
						AAS93682	Δ6去饱和酶	根霉菌属	32	53	4E-64

^*“百分比同一性”定义为两种蛋白质之间相同的氨基酸的百分比。

^**“百分比相似性”定义为两种蛋白质之间相同的或保守的氨基酸的百分比。

^***“期望值”用给定分值估计限定匹配数的匹配的统计显著性，该匹配数是在完全偶然地搜索数据库中这种大小片段时所预期的。

为了选择能在EgD8S中发生突变但又不影响Δ8去饱和酶活性的氨基酸残基，开发了一套标准以鉴别优选的突变靶，列举如下。

1.EgD8S去饱和酶结构域的优选的氨基酸残基靶(位于SEQ IDNO：10的氨基酸残基79至406之间)当与以下去饱和酶相比时是不保守的：淀粉霉的Δ6去饱和酶(同上；“ArD6”；SEQ ID NO：13)、根霉菌属的Δ6去饱和酶(同上；“RoD6”；SEQ ID NO：14)以及其它有代表性的去饱和酶如硕大利什曼原虫的Δ8脂肪酸去饱和酶样蛋白质(GenBank登陆号CAJ09677；“LmD8L”；SEQ ID NO：15)和深黄被孢霉的Δ6去饱和酶(GenBank登陆号AAG38104；“MiD6”； SEQ ID NO：16)。图3显示了这些蛋白质使用DNASTAR^TM软件的MegAlign^TM程序的Clustal W方法的比对结果(慢速、精确、Gonnet项；Thompson等人，Nucleic Acids Res.，22：4673-4680(1994))。假定这5个不同的去饱和酶的非保守区域的改变不会影响EgD8S的Δ8去饱和酶活性。

2.EgD8S的细胞色素b5结构域的优选氨基酸残基靶(位于SEQ IDNO：10的氨基酸5至71之间)当与酿酒酵母(GenBank登陆号P40312；“SCb5”；SEQ ID NO：178)和粟酒裂殖酵母(GenBank登陆号O94391；SPb5；SEQ ID NO：179)的细胞色素b₅基因相比时是不保守的。图4显示了使用DNASTAR^TM软件的MegAlign^TM程序的Clustal W方法(同上)，EgD8S(即SEQ ID NO：10的氨基酸残基1-136)的N末端部分与SCb5和SPb5的比对结果假定这3个不同蛋白质在非保守区域的改变不会影响EgD8S的细胞色素b5结构域的电子传送功能，因此不会影响Δ8去饱和酶的活性。

3.优选的氨基酸残基靶在靠近膜的内质网(ER)侧或暴露于ER内腔的跨膜超螺旋区域上。

4.优选的氨基酸残基靶靠近EgD8S酶的N末端或C末端，因为这些区域中的非保守残基可经受更多的突变。

基于以上标准，已经选择了EgD8S(即SEQ ID NO：10)中的一套70个靶向突变位点用于突变，如下表7所述。126个单个氨基酸残基突变中，已经确认53个(即42.1％)为“非保守的氨基酸取代”，而73个(即57.9％)为“保守的氨基酸取代”。

表7

经选择的适于靶向突变的氨基酸残基

突变位点	SEQ ID NO：10中的序列突变	突变位点	SEQ ID NO：10中的序列突变
				M1	4S突变成A，5K突变成S	M36	37Y突变成F，38Q突变成N
M2	12T突变成V	M37	51S突变成T，52Q突变成N
				M3	16T突变成K，17T突变成V	M38	54A突变成G，55F突变成Y
M4	25N突变成D，26F突变成E	M39	64I突变成L，65N突变成D
				M5	31A突变成D，32E突变成S	M40	69E突变成D，70L突变成V
M6	59K突变成L	M41	75A突变成G，76V突变成L

[0296]

M7	61M突变成A，62P突变成V	M42	89E突变成D，90L突变成I
				M8	66P突变成Q，67S突变成A	M43	97D突变成E，98A突变成V
M9	72P突变成Q，73Q突变成P	M44	110T突变成S，111L突变成V
				M10	79A突变成Q，80Q突变成A	M45	117G突变成A，118Y突变成F
M11	87R突变成A，88E突变成I	M46	132V突变成L，133L突变成V
				M12	407A突变成S，408V突变成Q	M47	198D突变成E，199I突变成L
M13	412M突变成S，413A突变成Q	M48	231L突变成V，232V突变成L
				M14	416Q突变成V，417P突变成Y	M49	297F突变成V，298V突变成L
M15	422L突变成Q	M50	309I突变成V，310V突变成I
				M16	108S突变成L	M51A	347I突变成L，348T突变成S
M17	110T突变成A	M51B	346I突变成V，347I突变成 L，348T突变成S
				M18	120L突变成M，121M突变成L	M52	400V突变成I，401I突变成V
M19	122V突变成S	M53	9L突变成V
				M20	123Q突变成Y，124Y突变成Q	M54	19D突变成E，20V突变成I
M21	125Q突变成H，126M突变成L	M55	33I突变成L
				M22	127Y突变成Q	M56	45A突变成G，46F突变成Y
M23	288S突变成N	M57	57K突变成R，58L突变成I
				M24	289I突变成P，290L突变成M	M58	65N突变成Q
M25	291T突变成V，292S突变成V	M59	73Q突变成N，74A突变成G
				M26	293L突变成M	M60	96F突变成Y
M27	296F突变成T	M61	239F突变成I，240I突变成F
				M28	298V突变成S	M62	271L突变成M，272A突变成S
M29	392N突变成T，393P突变成T	M63	279T突变成L，280L突变成T
				M30	394L突变成G，395P突变成M	M64	130G突变成A，131A突变成G
M31	7Q突变成L，8A突变成S	M65	304G突变成F，305F突变成G
				M32	10P突变成W，11L突变成Q	M66	229F突变成Y，230Y突变成F
M33	21S突变成F，22A突变成S	M67	291T突变成S，292S突变成L
				M34	46F突变成S，47M突变成L	M68	162L突变成V，163V突变成L
M35	48V突变成F，49M突变成L	M69	170G突变成A，171L突变成V
						M70	418A突变成G，419G突变成A

[0297] 实施例3

产生占总脂约17％的EDA的

解脂耶氏酵母菌株Y4001和Y4001U的产生

本实施例描述来源于解脂耶氏酵母ATCC#20362的菌株Y4001和Y4001U的构建，并且每种菌株能够产生占总脂约17％的EDA(C20:2)。工程化两种菌株以测量EgD8S及其突变型的功能化表达。因此，必须构建能够产生Δ8去饱和酶底物EDA的宿主菌株。

开发具有Leu-和Ura-显型的Y4001U菌株，需要构建Y2224菌株(从自发突变的野生型耶氏酵母属菌株ATCC#20362的Ura3基因获得的FOA抗性突变)和Y4001菌株。

菌株Y2224的产生

以如下方式分离菌株Y2224：将来自YPD琼脂平板(1％酵母提取物、2％细菌用蛋白胨、2％葡萄糖、2％琼脂)的解脂耶氏酵母ATCC#20362细胞划线至含有250mg/L 5-FOA(Zymo Research)的MM平板(75mg/L的尿嘧啶和75mg/L的尿苷、6.7g/L具有硫酸铵且无氨基酸的YNB，以及20g/L葡萄糖)上。将平板在28℃下孵育并将四个得到的菌落分别贴在含有200mg/mL 5-FOA的MM平板上和无尿嘧啶和尿苷的MM平板上以确定尿嘧啶Ura3营养缺陷型。

产生菌株Y4001以生产占总脂质17％的EDA

通过整合构建体pZKLeuN-29E3(图5A；包括四个嵌合基因[Δ12去饱和酶、C_16/18延伸酶和两个Δ9延伸酶])进入Y2224菌株的Leu2基因座来制造Y4001菌株，并由此产生EDA。

构建体pZKLeuN-29E3包含如下组分：

表8

质粒pZKLeuN-29E3(SEQ ID NO：17)的描述

SEQ ID NO：17 中的RE位点和核苷酸	片段和嵌合基因组分的描述
		BsiW I/Asc I (7797-7002)	795bp耶氏酵母属Leu2基因的3′部分(GenBank登陆号AF260230)
Sph I/Pac I (4302-3591)	703bp耶氏酵母属Leu2基因的5′部分(GenBank登陆号AF260230)
		Swa I/BsiW I (10500-7797)	GPD::F.D12::Pex20，包括： ·GPD：解耶氏酵母GPD启动子(WO 2005/003310) ·F.D12：串珠镰刀菌Δ12去饱和酶基因(WO 2005/047485) ·Pex20：来自耶氏酵母Pex20基因(GenBank登陆号 AF054613)的Pex20终止子序列
BglII/Swa I (12526-10500)	Exp pro::EgD9E::Lip1，包括： ·Exp pro：解脂耶氏酵母输出蛋白(EXP1)启动子 (WO 2006/052870和美国专利申请11/265761) ·EgD9E：经密码子最优化的Δ9延伸酶基因(SEQ ID NO：177)，来源于小眼虫(SEQ ID NOs：175和 176；美国专利公开申请60/739989；也参见本文实施例12) ·Lip1：来自耶氏酵母Lip1基因(GenBank登陆号 Z50020)的Lip1终止子序列
		Pme I/Cla I (12544-1)	FBAINm::EgD9S::Lip2，包括： ·FBAINm：解脂耶氏酵母FBAINm启动子(WO 2005/049805) ·EgD9S：经密码子优化的Δ9延伸酶基因(SEQ ID NO：177；同上) ·Lip2：来自耶氏酵母Lip2基因(GenBank登陆号 AJ012632)的Lip2终止子序列

[0310]

Cla I/EcoR I (1-1736)	LoxP::Ura3::LoxP，包括： ·LoxP序列(SEQ ID NO：18) ·耶氏酵母Ura3基因(GenBank登陆号AJ306421) ·LoxP序列(SEQ ID NO：18)
		EcoR I/Pac I (1736-3591)	NT::ME3S::Pex16，包括： ·NT：解脂耶氏酵母YAT1启动子(专利公开US 2006/0094102-A1) ·ME3S：来源于高山被孢霉的经密码子最优化的 C16/18延伸酶基因(SEQ ID NO：19)(参见美国专利申请11/253882以及WO 2006/052870) ·Pex16：耶氏酵母Pex 16基因(GenBank登陆号 U75433)的Pex16终止子序列

将质粒pZKLeuN-29E3用Asc I/Sph I消化，然后根据“一般方法”将其用于转化解脂耶氏酵母菌株Y2224(即ATCC#20362Ura3-)。将转化株铺在MMLeu培养基平板上并在30℃下维持2至3天。挑取菌落并划线到MM和MMLeu选择平板上。将在MMLeu平板上生长但不在MM平板上生长的菌落选作Leu-菌株。然后将Leu-菌株的单菌落在30℃下接种到液体MMLeu中并以250rpm/min摇动2天。离心收集细胞，提取脂质，通过酯交换反应制备脂肪酸甲酯，并随后用Hewlett-Packard6890GC分析。

GC分析显示，EDA存在于含有pZKLeuN-29E3的4种嵌合基因的转化体中，但不存在于耶氏酵母Y2224对照株中。所选的36个Leu-菌株中大部分产生占总脂质约12％至16.9％的EDA。有3个菌株(即菌株#11、#30和#34)产生占总脂质约17.4％、17％和17.5％的EDA；这三个菌株分别称为菌株Y4001、Y4002和Y4003。

产生菌株Y4001U(Leu-、Ura-)以产生占总脂质17％的EDA

通过在菌株Y4001中的质粒pY116(图5B)中暂时表达Cre重组酶以产生Leu-和Ura-表型来产生菌株Y4001U。构建体pY116含有如下组分：

表9

质粒pY116(SEQ ID NO：180)的描述

SEQ ID NO：180 中的RE位点和核苷酸	片段和嵌合基因组分的描述
		1328-448	ColE1质粒复制起点
2258-1398	抗氨苄青霉素基因(Amp^R)
		3157-4461	耶氏酵母自主复制序列(ARS18；GenBank登陆号 A17608)
PacI/SawI 6667-4504	耶氏酵母Leu2基因(GenBank登陆号AF260230)
		6667-180	GPAT::Cre::XPR2，包括： ·GPAT：解脂耶氏酵母GPAT启动子(WO 2006/031937) ·Cre：重组酶蛋白的肠杆菌噬菌体P1Cre基因 (GenBank登陆号X03453)； ·XPR2：耶氏酵母Xpr基因(GenBank登陆号 M17741)的约100bp的3′部分

根据“一般方法”将质粒pY116用于转化新鲜生长的Y4001细胞。将转化体细胞铺在含有280μg/mL磺酰脲的MMU平板上并在30℃下维持3至4天。挑取四个菌落，将其在30℃下接种至3mL液体YPD培养基中并以250rpm/min摇动1天。将培养物用液体MMU培养基稀释至1∶50,000，将100μL铺至新的YPD平板上并在30℃下维持2天。挑取菌落并划线至MMLeu和MMLeu+Ura选择平板上。选择在MMLeu+Ura平板上生长但不在MMLeu平板上生长的菌落并通过GC分析来确定C20:2(EDA)的存在。一种具有Leu-和Ura-表型的菌株产生了占总脂质约17％的EDA并被称为Y4001U。

实施例4

自主复制质粒pFmD8S的产生

本实施例描述了包括嵌合FBAINm::EgD8S::XPR基因的质粒 pFmD8S的构建。用来自质粒pKUNFmkF2、pDMW287F和pDMW214的片段通过三合一连接构建质粒pFmD8S(SEQ ID NO：20；图6D)。质粒pFmD8S是一种自主复制的质粒，它在耶氏酵母属中存在1至3个拷贝，利用它来测试EgD8S(及其突变型)的功能性表达，如下文实施例5至10所述。

质粒pKUNFmkF2

pKUNFmkF2(SEQ ID NO：21；图6A；WO 2006/012326)是包括嵌合FBAINm::F.D12::Lip2基因的构建体(其中“FBAINmK”是解脂耶氏酵母FBAINm启动子[WO 2005/049805]，“F.D12”是串珠镰刀菌的Δ12去饱和酶[WO 2005/047485]，而“Lip2”是解脂耶氏酵母Lip2终止子序列(GenBank登陆号AJ012632))。

质粒pDMW287F

pDMW287F(SEQ ID NO：22；图6B；WO 2006/012326)是包括合成的Δ8去饱和酶的构建体(其中EgD8S在图中标定为“D8SF”)，该合成的去饱和酶来源于野生型小眼虫，并且经密码子最优化以用于在解脂耶氏酵母中表达。去饱和酶基因的旁侧为解脂耶氏酵母FBAIN启动子(WO 2005/049805；在图中标定为“FBA1+内含子”)和耶氏酵母Pex16基因(GenBank登陆号U75433)的Pex16终止子序列。

质粒pDMW214

pDMW214(SEQ ID NO：23；图6C；WO 2005/049805)是能在大肠杆菌和解脂耶氏酵母中复制的穿梭质粒。它含有如下组分：

表10

质粒pDMW214(SEQ ID NO：23)的描述

SEQ ID NO：23中的RE位点和核苷酸	片段和嵌合基因组分的描述
		1150-270	ColE1质粒复制起点
2080-1220	抗氨苄青霉素基因(Amp^R)
		2979-4256	耶氏酵母自主复制序列(ARS18；GenBank登陆号A17608)
PmeI/SphI 6501-4256	耶氏酵母Leu2基因(GenBank登陆号AF260230)
		6501-1	FBA1+内含子::GUS::XPR2，包括： ·FBA1+内含子：解脂耶氏酵母FBAIN启动子 (WO 2005/049805) ·GUS：编码β-葡糖苷酸酶的大肠杆菌基因 (Jefferson，R.A.，Nature.342：837-838(1989) ·XPR2：耶氏酵母Xpr基因(GenBank登陆号 M17741)的约100bp的3′部分

pFmD8S质粒的最终构造

质粒pKUNFmkF2的PmeI/NcoI片段(图6A；包括FBAINm启动子)和质粒pDMW287F的NcoI/NotI片段(图6B；包括合成的Δ8去饱和酶基因EgD8S)用于定向地置换pDMW214(图6C)的PmeI/Not I片段。这导致产生了pFmD8S(SEQ ID NO：20；图6D)，其包括FBAINm::EgD8S::XPR2嵌合基因。因此，pFmD8S的组分是如下面的表11中所述的。

表11

质粒pFmD8S(SEQ ID NO：20)的组分

SEQ ID NO：20中的 RE位点和核苷酸	片段和嵌合基因组分的描述
		Swa I/Sac II (7988-1461)	FBAINm::EgD8S::XPR2，包括： ·FBAINm：解脂耶氏酵母FBAINm启动子 (WO 2005/049805) ·EgD8S：经密码子优化的Δ8去饱和酶基因 (SEQ ID NO：9，在图6D中标定为“校正的 D8”)，来源于小眼虫(SEQ ID NO：11) ·XPR2：耶氏酵母Xpr基因(GenBank登陆号 M17741)的约100bp的3’区
2601-1721	ColE1质粒复制起点
		3531-2671	用于在大肠杆菌中选择的氨苄青霉素抗性基因 (Amp^R)coli
4430-5734	耶氏酵母自主复制序列(ARS 18；GenBank登陆号A17608)
		7942-5741	耶氏酵母Leu2基因(GenBank登陆号 AF260230)

实施例5

开发快速筛选方法以从功能上分析解脂耶氏酵母的Δ8去饱和酶活性

使用pFmD8S(实施例4)作模板和40对低聚核苷酸引物，通过定点诱变( Kit，Stratagene，La Jolla，CA)来个别变异EgD8S(SEQ ID NO：10)中的靶向氨基酸残基，制造了一套40个突变。特异性突变选自在实施例2的表7中列出的那些突变，引物选自在SEQ ID NO：24至164中列出的低聚核苷酸，使得M1突变(即在SEQID NO：10中4S突变成A、5K突变成S)的产生需要引物1A和1B(分别来自SEQ ID NO：24和25)，等等。将每个突变的质粒转化到大肠杆菌XL2Blue细胞中(Stratagene)。从每40个转化株中接种4个菌落并在液体培养基中37℃过夜生长。从这些培养物中分离质粒(即共160个)并逐个测序以确认突变。

如“一般方法”所述，将质粒pFmD8S和分离的突变质粒分别转化到菌株Y4001中(实施例3)。在MM平板上进行转化株的筛选。在30℃生长2天后，从各个平板上刮除转化株、提取脂质并通过转酯化制备脂肪酸甲酯，随后用Hewlett-Packard 6890GC进行分析。

GC分析显示通过转化质粒pFmD8S有占总脂约7％的DGLA和12％的EDA产生；转化过程中EgD8S转化EDA成DGLA的平均转化效率是36.8％。按照以下公式测量转化效率：([产物]/[底物+产物])×100，其中‘产物’包括源于它的途径中的中间产物和所有产物。

对在EgD8S中携带突变的转化株的GC分析显示40个突变中的30个不会影响Δ8去饱和酶的活性(当与在携带质粒pFmD8S的转化株中合成的经密码子最优化的EgD8SΔ8去饱和酶活性相比时)。这些结果提示可以使用本文所述的筛选程序(即pFmD8S作为亲本质粒而菌株Y4001作为宿主)来快速筛选EgD8S突变型并鉴别哪一种突变型降低Δ8去饱和酶活性。

基于这些结果，使用上述方法合成了实施例2的表7中列出的剩余的30个突变(尽管组合导入了一些突变以提高效率)。表12以每个突变EgD8S中所得Δ8去饱和酶活性对合成的经密码子最优化的EgD8S(SEQ ID NO：10)的Δ8去饱和酶活性的百分比形式，描述了每个突变位点的Δ8去饱和酶活性(即M1至M70)。8如下表所示，Δ8去饱和酶活性在0％至最多125％的范围内。

实施例6

通过定点诱变构建体pFmD8S中的EgD8S来产生pFmD8S-1、pFmD8S-001、pFmD8S-2A、pFmD8S-2B、pFmD8S-3A、pFmD8S-3B、pFmD8S-003、pFmD8S-4、pFmD8S-004、pFmD8S-005和pFmD8S-006

构建体

通过连续多轮的定点诱变将多个选择突变导入EgD8S(SEQ IDNO：9和10)来产生一系列质粒。包括合成的经密码子最优化的EgD8S的pFmD8S(实施例4)被用作表13、14、16和17中的起始模板，而它们制造的突变型(即pFmD8S-M45，它包括对SEQ ID NO：10的117G到A和118Y到F的突变)被用作表15中的起始模板。所得包括突变型EgD8S序列的质粒，以及关于用以产生这些突变的引物的详细资料，描述于下表13、14、15、16和17。

命名为“导入突变位点”的列是指选择用于突变的特定氨基酸位点，在实施例2的表7中列出。在命名为“所得质粒中对EgD8S(SEQID NO：10)的总突变”的列中，那些用粗体文字突出显示的氨基酸突变对应于新导入的突变，该突变不存在于定点诱变的起始轮中的模板中。圆括号中显示的数字对应于在所得质粒中对EgD8S(SEQ ID NO：10)的总突变的数目。

在每轮诱变后，通过DNA测序确认每个所得质粒的突变。此外，在每个突变质粒中的每个突变EgD8S的Δ8去饱和酶活性与在pFmD8S中的合成的经密码子最优化的EgD8S的Δ8去饱和酶活性相比较，比较通过将质粒转化到菌株Y4001(实施例3)中并用实施例5中所述的方法分析其活性来进行。基于这些功能上的分析，已经证明在所得质粒(表11、12、13、14和15中产生的质粒)的所有24个突变EgD8S基因中的突变不影响Δ8去饱和酶活性(即pFmD8S-M3；pFmD8S-M3，1；pFmD8S-M3，1，2；pFmD8S-1；pFmD8S-001；pFmD8S-M45；pFmD8S-M45，21；pFmD8S-M45，21，16；pFmD8S-2A；pFmD8S-003；pFmD8S-M45，46；pFmD8S-M45，46，16，21；pFmD8S-2B；pFmD8S-004；pFmD8S-M49；pFmD8S-M49，26；pFmD8S-3A；pFmD8S-3B；pFmD8S-005；pFmD8S-M51；pFmD8S-M51，15；pFmD8S-M51，15，14；pFmD8S-4；和pFmD8S-006)。

实施例7

通过消化和连接多个亲本质粒产生复合构建体pFmD8S-5B

质粒pFmD8S-5B在上半部分EgD8S中包含16个突变氨基酸。此质粒可通过3-途径连接产生，其中使用来自pFmD8S-1(包含7个氨基酸突变，对应于M1、M2，M3和M8)的318bp Nco I/Bgl II片段和来自pFmD8S-2B(包含9个氨基酸突变，对应于M16、M18、M21、M45和M46)的954bp Bgl II/Not I片段以置换pFmD8S(实施例4；图6D)的Nco I/Not I片段。DNA测序证实pFmD8S-5B在EgD8S中包含所期望的16个氨基酸突变。

图7示意质粒pFmD8S-5B的合成(图8和9中使用了类似的格式)。在此声明图中不包括包含每个突变型EgD8S的pFmD8S载体主链；而是仅仅显示了对应于突变型EgD8S的1272个碱基对(其中Δ8去饱和酶的编码序列对应于核苷酸碱基对2至1270)。因此，图7中标记为“突变型EgD8S-1”的突变型EgD8S片段对应于在质粒pFmD8S-1中发现的突变型EgD8S，并且图7中标记为“突变型EgD8S-2B”的突变型EgD8S片段对应于在质粒pFmD8S-2B中发现的突变型EgD8S。

同样的，图中不包括每个突变型EgD8S基因侧面的Nco I和Not I限制性酶切位点。Nco I核苷酸识别序列(“CCATGG”)对应于突变型EgD8S的-2至+4区域，其中‘ATG’翻译起始密码子的‘A’位点称为+1；Not I核苷酸识别序列部分第一个被识别的核苷酸是突变型EgD8S的核苷酸+1271，其中突变型EgD8S的‘TAA终止密码子’位于+1269至+1270。

在每个突变型EgD8S上标记了突变位点。那些用星号显示的突变位点对应于单个氨基酸突变(即M2^*对应于12T至V的突变)，而那些无星号的突变位点对应于两个氨基酸突变(即M1对应于4S至A和5K至S的突变)；那些用2个星号显示的突变位点对应于三个氨基酸突变(即M51^**对应于346I至V、347I至L和348T至S的突变)。

通过将每个质粒转化到菌株Y4001中(实施例3)并基于实施例5中所述的方法分析其活性，在pFmD8S-5B中的突变型EgD8S-5B的Δ8去饱和酶活性被与在pFmD8S中的合成的和经密码子最优化的EgD8S的Δ8去饱和酶活性相比较。基于此分析，测定了在突变型EgD8S-5B中的16个氨基酸突变型(即4S突变成A、5K突变成S、12T突变成V、16T突变成K、17T突变成V、66P突变成Q、67S突变成A、108S突变成L、120L突变成M、121M突变成L、125Q突变成H、126M突变成L、117G突变成A、118Y突变成F、132V突变成L和133L突变成V，对应的突变位点是M1、M2、M3、M8、M16、M18、M21、M45和M46)，在pFmD8S-5B中不影响Δ8去饱和酶活性。

实施例8

通过在构建体pFmD8S-5B中的突变型EgD8S-5B的附加定点诱变产生pFmD8S-12、pFmD8S-13、pFmD8S-23和pFmD8S-28

通过连续多轮的定点诱变以在突变型EgD8S-5B中导入多个选择性突变来产生附加的一系列质粒，该过程使用pFmD8S-5B(实施例7)作起始模板。所得包括突变型EgD8S序列的质粒，以及关于用以产生这些突变的引物的详细资料，描述于下表18中。表18的格式和列名称与上文实施例6中规定的相同。

在每轮诱变后，通过DNA测序确认所得质粒的突变。此外，在每个突变质粒中的每个突变EgD8S的Δ8去饱和酶活性与在pFmD8S中的合成的经密码子最优化的EgD8S的Δ8去饱和酶活性相比较，比较通过将质粒转化到菌株Y4001(实施例3)中并用实施例5中所述的方法分析其活性来进行。基于功能上的分析，已经证实在pFmD8S-12的突变型EgD8S-12中的20个突变、在pFmD8S-13的突变型EgD8S-13中的23个突变、在pFmD8S-23的突变型EgD8S-23中的24个突变和在pFmD8S-28的突变型EgD8S-28中的33个突变不影响Δ8去饱和酶的活性。

实施例9

通过消化和连接多个亲本质粒产生复合构建体pFmD8S-008、FmD8S-009、FmD8S-013和FmD8S-015

质粒pFmD8S-008和pFmD8S-009在EgD8S的上半部分中分别包含20个和22个突变氨基酸。这些质粒通过3-途径连接产生，分别如图8A和8B所示(图格式与实施例7中图7描述的格式相同)。具体地讲，来自pFmD8S-001(在突变型EgD8S-001中包含9个氨基酸突变，对应于M1、M2、M3、M8和M38)的318bp Nco I/Bgl II片段和来自pFmD8S-003(在突变型EgD8S-003中包含11个氨基酸突变，对应于M16、M18、M21、M45、M68和M69)或pFmD8S-004(在突变型EgD8S-004中包含13个氨基酸突变，对应于M16、M18、M21、M45、M46、M68和M69)的954bp Bgl II/Not I片段被用于置换pFmD8S(实施例4；图6D)的Nco I/Not I片段以分别在pFmD8S-008中产生突变型EgD8S-008和在pFmD8S-009中产生突变型EgD8S-009。DNA测序证实正如预期的那样，突变型EgD8S-008包含20个氨基酸突变，突变型EgD8S-009包含22个氨基酸突变。

使用3-途径连接法制造了分别在突变型EgD8S-013和突变型EgD8S-015中包含28个和31个氨基酸突变的质粒pFmD8S-013和pFmD8S-015，如图9A和9B所示(图的格式与在实施例7中描述的图7格式相同)。使用来自pFmD8S-009(在突变型EgD8S-009中包含22个氨基酸突变)或pFmD8S-008(在突变型EgD8S-008中包含20个氨基酸突变)的639bp Nco I/Xho I片段和来自pFmD8S-23(实施例8，在突变型EgD8S-23中包含6个氨基酸突变，对应于M12、M15、M26和M70)或pFmD8S-28(实施例8，在突变型EgD8S-28中包含11个氨基酸突变，对应于M12、M15、M26、M51B、M63和M70)的633bp XhoI/Not I片段来置换pFmD8S(实施例4；图6D)的Nco I/Not I片段以分别产生pFmD8S-013和pFmD8S-015。DNA测序证实突变型EgD8S-013和突变型EgD8S-015分别包含28个氨基酸突变和31个氨基酸突变。

在pFmD8S-008中的突变型EgD8S-008的Δ8去饱和酶活性、在pFmD8S-009中的突变型EgD8S-009的Δ8去饱和酶活性、在pFmD8S-013中的突变型EgD8S-013的Δ8去饱和酶活性和在pFmD8S-015中的突变型EgD8S-015的Δ8去饱和酶活性被与在pFmD8S中的合成的经密码子最优化的EgD8S的Δ8去饱和酶活性比较，所述比较通过将这些质粒转化到菌株Y4001(实施例3)中并基于实施例5中所述的方法分析活性。基于这些功能上的分析，证实Δ8去饱和酶的活性不受在pFmD8S-008中的突变型EgD8S-008中的20个突变的影响(即4S突变成A、5K突变成S、12T突变成V、16T突变成K、17T突变成V、66P突变成Q、67S突变成A、108S突变成L、120L突变成M、121M突变成L、125Q突变成H、126M突变成L、54A突变成G、55F突变成Y、117G突变成A、118Y突变成F、162L突变成V、163V突变成L、170G突变成A和171L突变成V，对应的突变位点是M1、M2、M3、M8、M16、M18、M21、M38、M45、M68and M69)，不受在pFmD8S-009中的突变型EgD8S-009的22个突变的影响(即4S突变成A、5K突变成S、12T突变成V、16T突变成K、17T突变成V、66P突变成Q、67S突变成A、108S突变成L、120L突变成M、121M突变成L、125Q突变成H、126M突变成L、54A突变成G、55F突变成Y、117G突变成A、118Y突变成F、132V突变成L、133L突变成V、162L突变成V、163V突变成L、170G突变成A和171L突变成V，对应的突变位点是M1、M2、M3、M8、M16、M18、M21、M38、M45、M46、M68and M69)，不受在pFmD8S-013中的突变型EgD8S-013的28个突变的影响(即4S突变成A、5K突变成S、12T突变成V、16T突变成K、17T突变成V、66P突变成Q、67S突变成A、407A突变成S、408V突变成Q、422L突变成Q、108S突变成L、120L突变成M、121M突变成L、125Q突变成H、126M突变成L、293L突变成M、54A突变成G、 55F突变成Y、117G突变成A、118Y突变成F、132V突变成L、133L突变成V、162L突变成V、163V突变成L、170G突变成A、171L突变成V、418A突变成G和419G突变成A，对应的突变位点是M1、M2、M3、M8、M12、M15、M16、M18、M21、M26、M38、M45、M46、M68、M69、M70)，或不受在pFmD8S-015中的突变型EgD8S-015中的31个突变的影响(即4S突变成A、5K突变成S、12T突变成V、16T突变成K、17T突变成V、66P突变成Q、67S突变成A、407A突变成S、408V突变成Q、422L突变成Q、108S突变成L、120L突变成M、121M突变成L、125Q突变成H、16M突变成L、293L突变成M、54A突变成G、55F突变成Y、117G突变成A、118Y突变成F、346I突变成V、347I突变成L、348T突变成S、279T突变成L、280L突变成T、162L突变成V、163V突变成L、170G突变成A、171L突变成V、418A突变成G和419G突变成A，对应的突变位点是M1、M2、M3、M8、M12、M15、M16、M18、M21、M26、M38、M45、M51B、M63、M68、M69、M70)。

图10图示了EgD8S(SEQ ID NO：10)、突变型EgD8S-23(SEQ IDNO：4；实施例8)、突变型EgD8S-013(SEQ ID NO：6；实施例9)和突变型EgD8S-015(SEQ ID NO：8；实施例9)的比对结果。所用的比对方法对应于“Clustal W比对方法”。

实施例10

将合成的经密码子最优化的EgD8S及其突变型整合到解脂耶氏酵母基因组中并比较它们的Δ8去饱和酶活性

本实施例描述了对pFmD8S-23、pFmD8S-013和pFmD8S-015中包含的EgD8S及其突变型的Δ8去饱和酶活性的定量分析。该比较要求每个包括EgD8S(或其突变型)的嵌合基因被插入到pKO2UFkF2载体主链中。具体地讲，pKO2UFkF2包括解脂耶氏酵母Δ12去饱和酶基因的5′和3′部分，该基因被设计靶向整合到此位点(尽管质粒整合也能经由随机整合进入基因组的其他位点)。因此，耶氏酵母属基因组(即1个拷贝)中包含的合成的经密码子最优化的EgD8S、突变型EgD8S-023、突变型EgD8S-013和突变型EgD8S-015当整合到耶氏酵母属基因组中后可进行较公正的比较，但会抑制质粒表达时获得的Δ8去饱和酶活性水平(即经由在pFmD8S中的表达成1至3个拷贝)，并且已经在前述实施例中被报导。

pKO2UFkF2的组分如下表19所述。

表19

质粒pKO2UFkF2(SEQ ID NO：165)的组分

SEQ ID NO： 165中的RE位点和核苷酸	片段和嵌合基因组分的描述
		SwaI/BsiWI 7638-1722	FBAINm::F.D12::Pex20，包括： ·FBAINm：解脂耶氏酵母FBAINm启动子(WO 2005/049805) ·F.D12：串珠镰刀菌Δ12去饱和酶基因(WO 2005/047485) ·Pex20：耶氏酵母Pex20基因(GenBank登陆号 AF054613)的Pex20终止子序列
AscI/BsiWI 2459-1722	解脂耶氏酵母Δ12去饱和酶基因的5′部分(WO 2004/104167)
		EcoRI/SphI 5723-5167	解脂耶氏酵母Δ12去饱和酶基因的3′部分(WO 2004/104167)
EcoRI/PacI 5723-7240	耶氏酵母Ura3基因(GenBank登陆号AJ306421)

首先，使用来自pFmD8S(包括嵌合FBAINm::EgD8S基因，其中图6D中的EgD8S被确认为“Δ8校正的”)的Swa I/Not I片段来置换pKO2UFkF2(包括嵌合FBAINm::F.D12基因)的SwaI/NotI片段以产生构建体pKO2UFm8(图11A)。使用相同方法，分别以pFmD8S-23、pFmD8S-013和pFmD8S-015的SwaI/NotI片段置换pKO2UFkF2的SwaI/Not I片段，从而分别制造构建体pKO2UFm8-23、pKO2UFm8-013和pKO2UFm8-015。同样的，合成的经密码子最优化的EgD8S、突变型EgD8S-023、突变型EgD8S-013和突变型EgD8S-015均在FBAINm启动子和Pex20终止子的控制下。

用AscI/SphI消化质粒pKO2UFm8、pKO2UFm8-23、pKO2UFm8-013和pKO2UFm8-015，然后分别按照“一般方法”用于转化菌株Y4001。转化后，将细胞接种于MM平板上并在30℃下保持2至3天。

从每个转化中采集总共6个转化株，并将其再转导在新MM平板上。一旦开始生长，将这些菌株分别接种到液体MM中，在30℃下，250rpm/min振荡生长1天。离心收集细胞，提取脂质，通过酯交换反应制备脂肪酸甲酯，并随后用Hewlett-Packard 6890GC分析。每个Δ8去饱和酶的Δ8去饱和酶活性如下表20所示；如实施例5所述计算转化效率。

表20

EgD8S及其突变型的Δ8去饱和酶活性

质粒	对EgD8S(SEQ ID NO：10)的突变	转化效率
			pKO2UFm8(包括野生型EgD8S[SEQ ID NO：10])	无	37.9％ (平均值)
pKO2UFm8S-23 (包括突变型 EgD8S-23[SEQ ID NO：4])	4S突变成A，5K突变成S，12T突变成V， 16T突变成K，17T突变成V，66P突变成Q， 67S突变成A，108S突变成L，120L突变成 M，121M突变成L，125Q突变成H，126M突变成L，117G突变成A，118Y突变成F， 132V突变成L，133L突变成V，407A突变成 S，408V突变成Q，422L突变成Q，293L突变成M，162L突变成V，163V突变成L， 418A突变成G，419G突变成A(24)	35％， 35％， 36.1％， 36.2％， 39.8％， 40％

[0390]

pKO2UFm8S-013 (包括突变型 EgD8S-013[SEQ ID NO：6])	4S突变成A，5K突变成S，12T突变成V，16T 突变成K，17T突变成V，66P突变成Q，67S 突变成A，407A突变成S，408V突变成Q， 422L突变成Q，108S突变成L，120L突变成 M，121M突变成L，125Q突变成H，126M突变成L，293L突变成M，54A突变成G，55F突变成Y，117G突变成A，118Y突变成F，132V突变成L，133L突变成V，162L突变成V，163V 突变成L，170G突变成A，171L突变成V， 418A突变成G和419G突变成A(28)	17.8％ 18.4％. 18.6％， 24.4％， 34.4％ 39.1％ 70.8％
			pKO2UFm8S-015 (包括突变型 EgD8S-015[SEQ ID NO：8])	4S突变成A，5K突变成S，12T突变成V，16T 突变成K，17T突变成V，66P突变成Q，67S 突变成A，407A突变成S，408V突变成Q， 422L突变成Q，108S突变成L，120L突变成 M，121M突变成L，125Q突变成H，126M突变成L，293L突变成M，54A突变成G，55F突变成Y，117G突变成A，118Y突变成F，346I突变成V，347I突变成L，348T突变成S，279T 突变成L，280L突变成T，162L突变成V， 163V突变成L，170G突变成A，171L突变成 V，418A突变成G and 419G突变成A(31)	17.3％， 19.8％， 20％， 20.1％ 29.2％， 33.5％ 38.5％

可将观察到的每个特异性突变型EgD8S的不同的转化效率归因于基于每个基因分别整合到耶氏酵母属基因组中的不同位置所引起的“位置效应”。在任何情况下，此结果证明几个包括突变型EgD8S-23(SEQ ID NO：4)、突变型EgD8S-013(SEQ ID NO：6)和突变型EgD8S-015(SEQ ID NO：8)的转化体具有Δ8去饱和酶活性，该酶活性至少功能上等同于(或增强了)合成的经密码子最优化的EgD8S(SEQID NO：10)的酶活性。

实施例11

产生解脂耶氏酵母菌株Y4031、Y4032和Y4033以产生占总脂约10％至13.6％的DGLA

本实施例描述构建来源于解脂耶氏酵母的Y4001U(实施例3)的菌株Y4031、Y4032和Y4033，它们能够产生总脂约10％至13.6％的DGLA(C20：3)。工程化这些菌株以表达Δ9延伸酶/Δ8去饱和酶途径，该途径经由表达本发明的突变型Δ8去饱和酶和Δ9延伸酶来实现。.

更具体地讲，制造构建体pKO2UF8289(图11B；SEQ ID NO：181)以将四个嵌合基因(包括Δ12去饱和酶、两拷贝的突变型EgD8-23和一个Δ9延伸酶)整合到Y4001U菌株的耶氏酵母属基因组的Δ12基因座中。构建体pKO2UF8289含有如下组分：

表21

质粒pKO2UF8289(SEQ ID NO：181)的描述

SEQ ID NO：181 中的RE位点和核苷酸	片段和嵌合基因组分的描述
		AscI/BsiW I (10304-9567)	解脂耶氏酵母Δ12去饱和酶基因的5′部分(WO 2004/104167)
EcoRI/SphI (13568-13012)	解脂耶氏酵母Δ12去饱和酶基因的3′部分(WO 2004/104167)
		Cla I/EcoR I (1-13568)	LoxP::Ura3::LoxP，包括： ·LoxP序列(SEQ ID NO：18) ·耶氏酵母Ura3基因(GenBank登陆号AJ306421) ·LoxP序列(SEQ ID NO：18)
PmeI/ClaI (2038-1)	GPAT::EgD9E::Lip2，包括： ·GPAT：解脂耶氏酵母GPAT启动子(WO 2006/031937) ·EgD9E：经密码子最优化的Δ9延伸酶基因(SEQ ID NO：177)，来源于小眼虫(SEQ ID NOs：175和 176；美国专利公开申请60/739989；也参见本文实施例12) ·Lip2：来自耶氏酵母Lip1基因(GenBank登陆号 AJ012632)的Lip2终止子序列

[0399]

PmeI/PacI (4581-2124)	Exp::D8至23::Pex16，包括： ·Exp：解脂耶氏酵母输出蛋白(EXP1)启动子(WO 2006/052870和美国专利申请11/265761) ·D8-23：突变型EgD8S-23(实施例8；SEQ ID NO： 4) ·Pex16：耶氏酵母Pex 16基因(GenBank登陆号 U75433)的Pex16终止子序列
		SwaI/PmeI (7055-4581)	YAT::F.D12::Oct，包括： ·YAT：解脂耶氏酵母YAT1启动子(专利公开US 2006/0094102-A1) ·F.D12：串珠镰刀菌Δ12去饱和酶基因(WO 2005/047485) ·OCT：耶氏酵母OCT基因(GenBank登陆号 X69988)的OCT终止子序列
Swa I/BsiW I (7055-9567)	FBAINm::D8S-23::Pex20，包括： ·FBAINm：解脂耶氏酵母FBAINm启动子(WO 2005/049805) ·D8S-23：突变型EgD8S-23(实施例8；SEQ ID NO：4) ·Pex20：耶氏酵母Pex20基因(GenBank登陆号 AF054613)的Pex20终止子序列

将质粒pKO2UF8289用Asc I/Sph I消化，然后根据“一般方法”将其用于解脂菌株Y4001U(实施例3)的转化。将转化株铺在MMLeu培养基平板上并在30℃下维持2至3天。挑取菌落并将其在30℃下划线至MMLeu选择平板上2天。然后将这些细胞在30℃下接种至液体MMLeu中并以250rpm/min摇动2天。离心收集细胞，提取脂质，通过酯交换反应制备脂肪酸甲酯，并随后用Hewlett-Packard 6890GC分析。

GC分析显示，DGLA存在于含有pKO2UF8289的4种嵌合基因的转化体中，但不存在于耶氏酵母Y4001U对照株中。所选的12个菌株大多数产生占总脂约4％至8％的DGLA。有3个菌株(即菌株#7、#8和#12)产生占总脂质约11.3％、10％和13.6％的DGLA；这三个菌株分别称为菌株Y4031、Y4031和Y4033。

实施例12

鉴别来自小眼虫的Δ9延伸酶

本实施例公开于美国专利申请60/739989，描述了从小眼虫中分离Δ9延伸酶(SEQ ID NO：175和176)。

小眼虫生长条件、脂质特征和mRNA分离

小眼虫获取自Dr.Richard Triemer的实验室，Michigan StateUniversity(East Lansing，MI)。在500mL玻璃瓶中将10mL活性生长培养基，1mL等分试样转入250mL的小眼虫(Eg)培养基中。通过在970mL水中组合使用1g醋酸钠，1g牛肉膏(U126-01，DifcoLaboratories，Detroit，MI)，2g

胰蛋白胨(0123-17-3，DifcoLaboratories)，2g

酵母提取物(0127-17-9，Difco Laboratories)来制备Eg培养基。过滤除菌后，将30mL土壤水上清液(15-3790，Carolina Biological Supply Company，Burlington，NC)无菌加入到最终的Eg培养基中。小眼虫培养物在23℃，16小时光照，8小时黑暗的循环条件下静置生长2个星期。

2个星期后，移除10mL培养物用于液体分析，在1,800x g下离心5分钟。用水洗涤沉淀一次并再次离心。所得沉淀真空干燥5分钟，重悬浮于100μL三甲基硫氢氧化物(TMSH)中，室温下震荡培养15分钟。此后加入0.5mL己烷并将小瓶室温下震荡培养15分钟。分离脂肪酸甲酯(从己烷层注入5μL)并进行定量，定量方法使用配有Omegawax320熔融石英毛细柱的Hewlett-Packard 6890 Gas Chromatograph(SupelcoInc.，Cat.No.24152)。设定烘箱温度程序如下：220℃保持2.7分钟，然后以20℃/分钟的速度升温至240℃并再保持2.3分钟。载气通过Whatman氢气发生器供应。保留时间与那些可商购获得的标准甲酯比较(Nu-Chek Prep，Inc.Cat.No.U-99-A)。

保持2星期的培养物(240mL)通过在1,800x g离心10分钟、水洗一次并再离心制成粒状。使用RNA STAT-60^TM试剂(TEL-TEST，Inc.，Friendswood，TX)，按照制造商提供的规程(使用5mL试剂，将RNA溶解于0.5mL水中)从所得颗粒状沉淀中提取总RNA。这样从颗粒状沉淀中获得了1mg总RNA(2mg/mL)。使用mRNA Purification Kit(Amersham Biosciences，Piscataway，NJ)，按照制造商提供的规程从1mg总RNA中分离mRNA。这样就获得了85μg的mRNA。

小眼虫cDNA合成、文库建立和测序

使用Cloneminer^TM cDNA Library Construction Kit(Cat.No.18249-029，Invitrogen Corporation，Carlsbad，CA)，按照制造商提供的规程(Version B，25-0608)建立cDNA文库。使用非放射标记方法，从3.2μg的mRNA(上文所述的mRNA)中使用Biotin-attB2-Oligo(dT)引物合成cDNA。在合成第一和第二链后，加入attB1衔接子并进行连接，然后用柱层析对cDNA按照大小进行分离。浓缩来自片段7和8的DNA(大小介于800至1500bp之间)，将其重组进入pDONR^TM222并转化到大肠杆菌ElectroMAX^TM DH10B^TM T1Phage-Resistant细胞中(Invitrogen Corporation)。将小眼虫文库命名为eeg1c。

为了测序，首先从生长/冻存于384-孔冷冻培养板的存档的甘油培养物中回收克隆，并在包含LB+75μg/mL卡那霉素(复制平板)的384-孔微板中与无菌384 pin replicator(Genetix，Boston，MA)一起复制。然后使用Templiphi DNA序列模板扩增试剂盒方法(AmershamBiosciences)，按照制造商提供的规程分离质粒。简而言之，Templiphi方法使用噬菌体φ29DNA聚合酶，通过等温滚环扩增环状单链或双链DNA(Dean等人，Genome Res.，11：1095-1099(2001)；Nelson等人，Biotechniques，32：S44-S47(2002))。在37℃生长20小时后，在复制平板中的细胞中加入5μL稀释缓冲液并在95℃变性3分钟以部分溶解细胞和释放变性模板。然后将Templiphi预混物(5μL)加入到各个样本，并且所得反应混合物在30℃培养16小时，然后在65℃放置10分钟以失活φ29DNA聚合酶。在将扩增样本用1∶3的比例稀释于蒸馏水中后，用

dsDNA Quantitation Reagent(Molecular Probes)进行DNA定量。

然后将扩增产物在95℃变性10分钟并在384-孔板中进行末端测序，测序使用M13F通用引物(SEQ ID NO：193)和ABI BigDye version3.1 Prism Sequencing Kit。100至200ng模板和6.4pmol引物被用于测序反应，重复以下反应条件25次：96℃10秒，50℃5秒，60℃4分钟。用乙醇清洁后，将循环序列反应产物溶解并用Perkin-Elmer ABI3730xl自动测序仪进行检查。

鉴别来自小眼虫cDNA文库eeg1c的长链多不饱和脂肪酸延伸酶同源物

编码长链多不饱和脂肪酸延伸酶同源物(LC-PUFA ELO同源物或D9延伸酶)的cDNA克隆通过BLAST(Basic Local Alignment SearchTool；Altschul等人，J.Biol.215：403-410(1993))搜索BLAST“nr”数据库中包含的相似序列进行鉴别(包括所有非冗余GenBank CDS翻译物、来源于3-维结构Brookhaven Protein Data Bank的序列、SWISS-PROT蛋白质序列数据库、EMBL和DDBJ数据库的最终主要释放物)。使用National Center for Biotechnology Information(NCBI)提供的BLASTN算法分析上文获得的小眼虫cDNA序列与“nr”数据库中包含的所有公开可用的DNA序列的相似度。在所有的阅读框中翻译DNA并使用NCBI提供的BLASTX算法比较“nr”数据库中包含的所有公开可用的蛋白质序列的相似性(Gish and States，Nat.Genet.，3：266-272(1993))。为了方便使用，观察到的BLAST计算的cDNA序列与所搜索的数据库中包含序列的随机匹配的P-值(概率)在本文报导为“pLog”值，它代表所报导的P-值的负对数。因此，pLog值越大，cDNA序列和BLAST的“匹配”代表同源蛋白的可能性就越大。

使用来自克隆eeg1c.pk001.n5.f的核苷酸序列进行的BLASTX搜索揭示了由绿光等鞭金藻的长链PUFA延伸酶(SEQ ID NO：173)的cDNA编码的蛋白相似性(GenBank登陆号AAL37626(GI 17226123)，位点AAL37626，CDS AF390174；Qi等人，FEBS Lett.510(3)：159-165(2002))。来自克隆eeg1c.pk001.n5.f的cDNA插入的部分序列显示于SEQ ID NO：194(cDNA插入的5′末端)中。另外的序列获取自如上所述的eeg1c.pk001.n5.1的cDNA插入的3′末端，但是使用poly(A)尾导的WobbleT低聚核苷酸。简而言之，WobbleT引物是21mer poly(T)A、poly(T)C、和poly(T)G的克分子数相等的混合物，用于对cDNA克隆的3′末端测序。

3′末端序列显示于SEQ ID NO：195。5′和3′序列均使用Sequencher^TM(Version 4.2，Gene Codes Corporation，Ann Arbor，MI) 进行比对，并且所得cDNA序列显示于SEQ ID NO：196(1201bp)中。来自eeg1c.pk001.n5.f的cDNA的编码序列和对应的推断氨基酸序列分别显示于SEQ ID NO：175(777bp)和SEQ ID NO：176(258个氨基酸)中。

在SEQ ID NO：176中列出的氨基酸序列通过BLASTP进行评估，产生的对绿光等鞭金藻序列(SEQ ID NO：173)的pLog值为38.70(E值为2e-39)。使用Jotun Hein方法得出小眼虫D9延伸酶与绿光等鞭金藻D9延伸酶有39.4％相同。使用Jotun Hein方法进行的序列百分比同一性计算(Hein，J.J.，Meth.Enz.，183：626-645(1990))通过LASERGENETM计算生物信息学程序包(DNASTAR^TM Inc.，Madison，WI)的MegAlign^TM v6.1程序完成，该程序使用双序列比对的预设参数(KTUPLE＝2)。使用Clustal V方法得出小眼虫D9延伸酶与绿光等鞭金藻D9延伸酶有31.8％相同。通过Clustal V方法进行的序列百分比同一性计算(Higgins，D.G.and Sharp，P.M.，Comput.Appl.Biosci.，5：151-153(1989)；Higgins等人，Comput.Appl.Biosci.，8：189-191(1992))通过LASERGENE^TM计算生物信息学程序包(DNASTAR^TMInc.，Madison，WI)的MegAlign^TM v6.1程序完成，该程序使用双序列比对的预设参数(KTUPLE＝1，GAP PENALTY＝3，WINDOW＝5，DIAGONALS SAVED＝5，GAP LENGTH PENALTY＝10)。BLAST分数值和概率说明本文所述的核酸片段SEQ ID NO：175编码整个小眼虫的Δ9延伸酶。

Claims

1.分离的多核苷酸，所述多核苷酸包括：

(a)编码具有Δ8去饱和酶活性的突变型多肽的核苷酸序列，所述多肽具有在SEQ ID NO：2中列出的氨基酸序列，并且其中SEQ IDNO：2与SEQ ID NO：10不同；或，

(b)部分(a)的所述核苷酸序列的互补序列，其中所述互补序列和所述核苷酸序列由相同数量的核苷酸组成并且是100％互补的。

2.权利要求1的分离的多核苷酸，其中所述核苷酸序列包括SEQID NO：1并且其中SEQ ID NO：1与SEQ ID NO：9不同。

3.分离的多核苷酸，所述多核苷酸包括：

(a)编码具有Δ8去饱和酶活性的突变型多肽的核苷酸序列，所述多肽具有在SEQ ID NO：198中列出的氨基酸序列，并且其中SEQ IDNO：198与SEQ ID NO：10不同；或，

4.权利要求3的分离的多核苷酸，其中所述核苷酸序列包括SEQID NO：197，并且其中SEQ ID NO：197与SEQ ID NO：9不同。

5.由权利要求1的分离的多核苷酸编码的多肽，所述多肽具有Δ8去饱和酶活性。

6.由权利要求3的分离的多核苷酸编码的多肽，所述多肽具有Δ8去饱和酶活性。

7.权利要求5的多肽，其中所述Δ8去饱和酶活性至少约功能上等同于在SEQ ID NO：10中列出的多肽的Δ8去饱和酶活性。

8.权利要求6的多肽，其中所述Δ8去饱和酶活性至少约功能上等同于在SEQ ID NO：10中列出的多肽的Δ8去饱和酶活性。

9.重组构建体，所述重组构建体包含权利要求1或3中任一项的分离的多核苷酸，所述多核苷酸可操作地连接到至少一个调控序列上。

10.细胞，所述细胞包括权利要求1或权利要求3的分离的多核苷酸。

11.权利要求10的细胞，其中所述细胞是酵母。

12.权利要求11的细胞，其中所述酵母是产油量为其干细胞重量的至少约25％的含油酵母。

13.权利要求12的细胞，其中所述含油酵母选自：耶氏酵母属、假丝酵母属、红酵母属、红冬孢酵母属、隐球酵母属、丝孢酵母属和油脂酵母属。

14.用于在酵母细胞中制备长链多不饱和脂肪酸的方法，所述方法包括：

(a)提供根据权利要求10的酵母细胞；和

(b)在能够产生长链多不饱和脂肪酸的条件下培养(a)中所述的酵母细胞。

15.权利要求14的方法，其中所述酵母是产油量为其干细胞重量的至少约25％的含油酵母。

16.权利要求15的方法，其中所述酵母是耶氏酵母属物种。

17.微生物油，所述微生物油获取自权利要求12的酵母。

18.产油量为其干细胞重量的至少约25％的含油酵母，所述含油酵母包括：

a)第一重组DNA构建体，所述重组构建体包括根据权利要求1或权利要求3的编码Δ8去饱和酶多肽的分离的多核苷酸，所述多核苷酸可操作地连接到至少一个调控序列上；和，

b)至少一个第二重组DNA构建体，所述重组DNA构建体包括可操作地连接到至少一个调控序列上的分离的多核苷酸，所述构建体编码选自下列的多肽：Δ4去饱和酶、Δ5去饱和酶、Δ6去饱和酶、Δ9去饱和酶、Δ12去饱和酶、Δ15去饱和酶、Δ17去饱和酶、Δ9延伸酶、C_14/16延伸酶、C_16/18延伸酶、C_18/20延伸酶和C_20/22延伸酶。

19.权利要求18的酵母，所述酵母选自：耶氏酵母属、假丝酵母属、红酵母属、红冬孢酵母属、隐球酵母属、丝孢酵母属和油脂酵母属。

20.权利要求19的酵母，其中所述酵母细胞是耶氏酵母属物种，并且所述油包括长链多不饱和脂肪酸，所述长链多不饱和脂肪酸选自：花生四烯酸、二十碳二烯酸、二十碳五烯酸、二十碳四烯酸、二十碳三烯酸、二高-γ-亚麻酸、二十二碳五烯酸和二十二碳六烯酸。

21.权利要求18的含油酵母，其中所述第一重组DNA构建体包括编码Δ8去饱和酶多肽的多核苷酸，所述多肽具有选自SEQ ID NO：2和SEQ ID NO：198的氨基酸序列。

22.用于产生二高-γ-亚油酸的方法，所述方法包括：

a)提供含油酵母，所述含油酵母包括：

(i)编码Δ8去饱和酶多肽的重组构建体，所述多肽具有在SEQ ID NO：2中列出的氨基酸序列，其中SEQ ID NO：2与SEQID NO：10不同；和，

(ii)二十碳二烯酸源；

b)在其中所述编码Δ8去饱和酶多肽的重组构建体能够被表达以及二十碳二烯酸能够被转化成二高-γ-亚油酸的条件下，培养步骤(a)中所述的酵母，和；

c)任选地回收步骤(b)的所述二高-γ-亚油酸。

23.用于产生二十碳四烯酸的方法，所述方法包括：

a)提供含油酵母，所述含油酵母包括：

(ii)二十碳三烯酸源；

b)在其中所述编码Δ8去饱和酶多肽的重组构建体能够被表达以及二十碳三烯酸能够被转化成二十碳四烯酸的条件下，培养步骤(a)中所述的酵母，和；

c)任选地回收步骤(b)的所述二十碳四烯酸。

24.用于产生二高-γ-亚油酸的方法，所述方法包括：

a)提供一种酵母细胞，所述酵母细胞包括：

i)第一重组DNA构建体，所述构建体包括权利要求1或权利要求3的分离的多核苷酸，所述多核苷酸可操作地连接到至少一个调控序列上，和；

ii)至少一个第二重组DNA构建体，所述构建体包括编码Δ9延伸酶多肽的分离的多核苷酸，所述多核苷酸可操作地连接到至少一个调控序列上；

b)给(a)所述的酵母细胞提供亚麻酸源，和；

c)在其中能够形成二高-γ-亚油酸的条件下，培养(b)中所述的酵母细胞。