ES2466365T3 - Genes de Delta-8 desaturasa, enzimas codificadas por los mismos y usos de los mismos - Google Patents

Abstract

Un ácido nucleico aislado que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido que tiene actividad desaturasa, donde la secuencia de aminoácidos del polipéptido comprende la secuencia de aminoácidos SEC ID Nº 29.

Description

Genes de Delta-8 desaturasa, enzimas codificadas por los mismos y usos de los mismos

5 Campo de la invención

La presente invención se refiere a polinucleótidos aislados que codifican una delta-8 desaturasa, las delta-8 desaturasas codificadas por los polinucleótidos aislados, vectores de expresión que contienen los polinucleótidos aislados, células huésped que contienen los vectores de expresión y métodos para producir delta-8 desaturasas y ácidos grasos poliinsaturados.

Antecedentes

Los ácidos grasos poliinsaturados (PUFA) tienen muchos papeles en el funcionamiento apropiado de todas las

15 formas de vida. Por ejemplo los PUFA son componentes importantes de la membrana plasmática de las células, en donde se encuentran en forma de fosfolípidos. Los PUFA son necesarios para el desarrollo apropiado del cerebro infantil, así como para la formación y la reparación de tejidos en mamíferos maduros.

Varias enzimas, sobre todo desaturasas y elongasas, están implicadas en la biosíntesis de PUFA (Véase la Figura 1). Las desaturasas catalizan la introducción de insaturaciones (por ejemplo enlaces dobles) entre los átomos de carbono en la cadena alquil del ácido graso del sustrato. Las elongasas catalizan la adición de una unidad de 2 carbonos a un sustrato ácido graso. Por ejemplo, el ácido linoleico (LA, 18:2 n-6) se produce a partir del ácido oleico (OA, 18:1n-9) por la acción de una !12-desaturasa. El ácido eicosadienoico (EDA, 20: 2 n-6) se produce a partir del LA por la acción de una !9-elongasa. El ácido dihomo-∀-linolénico (DGLA, 20:3 n-6) se produce a partir del EDA por

25 acción de una !8-desaturasa (Véase la Figura 1). El ácido araquidónico (ARA, 20:4 n-6) se produce a partir de DGLA por acción de una !5-desaturasa (Véase la Figura 1).

Varios PUFA de cadena larga importantes se conocen en la técnica. Por ejemplo, uno de los más importantes PUFA de cadena larga es el ácido eicosapentaenoico (EPA). El EPA se encuentra en hongos y en aceites marinos. Un segundo PUFA de cadena larga importante es el ácido docosahexaenoico (DHA). El DHA se encuentra más a menudo en aceite de pescado y también se puede purificar del tejido cerebral de mamíferos. Un tercer PUFA de cadena larga importante es el ARA. El ARA se encuentra en hongos filamentosos y también se puede purificar a partir de tejidos de mamíferos incluyendo el hígado y las glándulas adrenales.

35 El ARA, EPA y/o DHA, se pueden producir tanto por medio de la ruta alternativa !8-desaturasa / !9-elongasa como por medio de la ruta convencional de la !6-desaturasa (Véase la Figura 1). Se habían identificado anteriormente elongasas activas sobre el sustrato de ácidos grasos en la ruta convencional !6-desaturasa para la producción de PUFA de cadena larga, particularmente ARA, EPA y DHA. La ruta convencional de la !6-desaturasa para convertir el LA en DGLA y el ácido alfa-linolénico (ALA) en ácido #3-eicosatetraenoico (#3-ETA) utiliza la enzima !6desaturasa para convertir el LA en ácido gamma-linolénico (GLA) y el ALA en ácido estearidónico (SDA); y la enzima C18-elongasa convierte el GLA en DGLA y el SDA en #3-ETA. Sin embargo en ciertas situaciones puede preferirse la ruta alternativa !8-desaturasa / !9-elongasa sobre la ruta convencional de la !6-desaturasa. Por ejemplo, si no se desea la presencia de ciertos ácidos grasos omega-6 u omega-3 residuales intermedios, tales como GLA o SDA, durante la producción del DGLA, ARA, #3-ETA, EPA, ácido #3-docosapentaenoico (DPA) y/o DHA, se puede utilizar

45 la ruta alternativa !8-desaturasa / !9-elongasa como alternativa a la ruta convencional de la !6-desaturasa para evitar la formación de GLA y SDA. Las !8-desaturasas son útiles en esta ruta porque desnaturalizan un ácido graso entre el octavo y noveno átomo de carbono (numerados a partir del extremo carboxilo de la molécula) y pueden, por ejemplo, catalizar la conversión del ácido #6-eicosadienoico (EDA) en DGLA y/o el ácido #3-eicosatrienoico (#3-ETrA) en #3-ETA. Por lo tanto, existe una necesidad en la técnica para nuevas fuentes de !8-desaturasas que puedan utilizarse en la producción de PUFA de cadena larga.

El documento WO 2007/127381 desvela fragmentos aislados de un ácido nucleico y construcciones recombinantes que comprenden tales fragmentos que codifican una !8-desaturasa y el uso de la desaturasa para la fabricación de ácidos grasos poliinsaturados de cadena larga. La !8-desaturasa se derivó de Pavlova lutheri CCMP 459. Zhou y 55 col. Phytochemistry, 2007, Vol. 68, p. 785-796 desvela el aislamiento y caracterización de tres desaturasas del extremo frontal de ácidos grasos poliinsaturados de cadena larga de Pavlova salina que tenían especificidad !4, !5 y !8. Zhou y col. informaron de que el grado máximo de identidad entre la desaturasa de P. salina y otras desaturasas clonadas con la !8-desaturasa de Acanthamoeba castellanii era del 29%. Además Zhou y col. investigaron la expresión de la !8-desaturasa de P. salina en Arabidopsis. La expresión demostró que la !8desaturasa de P. salina podía desaturar ácidos grasos !6 y !9. Bell y col., Phytochemistry, 1996, Vol. 41, Nº 2, p. 465-471 desvela un estudio en el que se cultivaron axénicamente tipos celulares flagelados y cocolitos de Emiliana huxleyi, y se examinaron la clase de lípido y la composición en ácidos grasos de las clases principales de lípidos polares a lo largo del ciclo de crecimiento. Singh y col., Current Opinion in Plant Biology, 2005, Vol. 8, Nº 2, p. 197203, plantea las dificultades implicadas en la manipulación metabólica de plantas para expresar altos niveles de

nuevos ácidos grasos que tengan importancia nutricional e industrial. Napier, Annual Review of Plant Biology, 2007, Vol. 58, p. 295-319 desvela la producción de varios ácidos grasos en plantas transgénicas, incluyendo los factores responsables de la variación de los resultados y el potencial para optimizar más la producción transgénica de ácidos grasos.

Sumario de la invención

En un aspecto, la presente invención se refiere a un ácido nucleico aislado que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido que tiene actividad desaturasa, en el que la secuencia de aminoácidos del polipéptido comprende la SEC ID Nº 29. El ácido nucleico aislado codifica una enzima !8-desaturasa funcionalmente activa que utiliza como sustrato el ácido #6-eicosadienoico o el ácido #3-eicosatrienoico. Esta secuencia de ácido nucleico aislado puede derivarse de Emiliana huxleyi, preferentemente de la Emiliana huxleyi CCMP 378.

En otro aspecto, la presente invención se refiere a una secuencia de nucleótidos aislada que comprende la

15 secuencia de nucleótidos SEC ID Nº 28 o que comprende al menos el 90% de la secuencia de nucleótidos SEC ID Nº 30, en el que la secuencia de nucleótidos codifica un polipéptido que tiene actividad desaturasa. La secuencia de nucleótidos aislada codifica una enzima !8-desaturasa funcionalmente activa que utiliza como sustrato el ácido #6eicosadienoico o el ácido #3-eicosatrienoico. La secuencia de nucleótidos aislada puede tener una secuencia SEC ID Nº 28. De manera alternativa, la secuencia de nucleótidos aislada puede tener una secuencia SEC ID Nº 30. La secuencia de nucleótidos aislada se puede derivar de Emiliana huxleyi, preferentemente de Emiliana huxleyi CCMP

378.

En otro aspecto, la presente invención se refiere a un vector de expresión. El vector de expresión de la presente invención comprende una secuencia de nucleótidos unida operativamente a una secuencia reguladora, en donde la

25 secuencia de nucleótidos comprende la secuencia de nucleótidos SEC ID Nº 28 o comprende al menos el 90% de la secuencia de nucleótidos SEC ID Nº 30, en donde la secuencia de nucleótidos codifica un polipéptido que tiene actividad desaturasa.

En otro aspecto más, la presente invención se refiere a una célula huésped que comprende el vector de expresión descrito anteriormente. La célula huésped puede ser una célula eucariota. Específicamente, la célula eucariota se selecciona de entre el grupo que consiste en una célula de mamífero, una célula de insecto, una célula vegetal, o una célula fúngica. Ejemplos de células fúngicas que se pueden utilizar son células fúngicas seleccionadas de entre el grupo que consiste en; Saccharomyces spp., Candida spp., Lipomyces spp., Yarrowia spp., Kluyveromyces spp., Hansenula spp., Aspergillus spp., Penicillium spp., Neurospora spp., Trichoderma spp., y Pichia spp. Los ejemplos

35 de células vegetales que se pueden utilizar se seleccionan de entre el grupo que consiste en: soja, especies de Brassica, cártamo, girasol, maíz, algodón y lino.

En otro aspecto más, la presente invención se refiere a una célula vegetal, una semilla vegetal, una planta o un tejido vegetal que comprende el vector de expresión descrito anteriormente, en donde la expresión de la secuencia de nucleótidos del vector da como resultado la producción de al menos un ácido graso poliinsaturado por la célula vegetal, la semilla vegetal, la planta o el tejido vegetal. El ácido graso poliinsaturado producido por tal vector de expresión se selecciona de entre el grupo que consiste en: ácido araquidónico (ARA), ácido eicosapentaenoico (EPA), ácido docosahexaenoico (DHA), ácido dihomo-gamma-linolénico (DGLA) o ácido #3-eicosatetraenoico (#3-ETA) y combinaciones de los mismos.

45 En otro aspecto más, la presente invención se refiere a un polipéptido purificado codificado por una secuencia de nucleótidos que comprende la secuencia de nucleótidos SEC ID Nº 28 o que comprende al menos el 90% de la SEC ID Nº 30, en donde el polipéptido purificado tiene actividad desaturasa.

En otro aspecto más, la presente invención se refiere a un polipéptido purificado que desatura un sustrato de ácido graso poliinsaturado de 20 carbonos de largo (C20-PUFA) entre el átomo de carbono 8 y el átomo de carbono 9 del sustrato y en el que el polipéptido comprende la secuencia de aminoácidos SEC ID Nº 29.

En otra realización más, la presente invención se refiere a un polipéptido purificado que tiene la secuencia de 55 aminoácidos SEC ID Nº 29.

En otra realización más, la presente invención se refiere a un método para producir una enzima !8-desaturasa. El método comprende las etapas de:

a) aislar una secuencia de nucleótidos que comprende la secuencia de nucleótidos SEC ID Nº 28 o que comprende al menos el 90% de la secuencia de nucleótidos SEC ID Nº 30, en donde la secuencia de nucleótidos codifica un polipéptido que tiene actividad !8-desaturasa; b) construir un vector de expresión que comprende la secuencia de nucleótidos aislada de la etapa a) ligada operativamente a una secuencia reguladora; e

65 c) introducir el vector de expresión en una célula huésped durante un tiempo y bajo las condiciones suficientes para la producción de la enzima !8-desaturasa.

En el método descrito anteriormente, la célula huésped puede ser una célula eucariota. Específicamente, la célula eucariota se selecciona de entre el grupo que consiste en: una célula de mamífero, una célula de insecto, una célula

5 vegetal y una célula fúngica. Ejemplos de células fúngicas que se pueden utilizar son células fúngicas seleccionadas de entre el grupo que consiste en; Saccharomyces spp., Candida spp., Lipomyces spp., Yarrowia spp., Kluyveromyces spp., Hansenula spp., Aspergillus spp., Penicillium spp., Neurospora spp., Trichoderma spp., y Pichia spp. Los ejemplos de células vegetales que se pueden utilizar se seleccionan de entre el grupo que consiste en: soja, especies de Brassica, cártamo, girasol, maíz, algodón y lino.

En otra realización más, la presente invención se refiere a un método para producir un ácido graso poliinsaturado que comprende las etapas de:

a) aislar una secuencia de nucleótidos que comprende la secuencia de nucleótidos SEC ID Nº 28 o que

15 comprende al menos el 90% de la secuencia de nucleótidos SEC ID Nº 30, en donde la secuencia de nucleótidos codifica un polipéptido que tiene actividad !8-desaturasa; b) construir un vector de expresión que comprende la secuencia de nucleótido aislada de la etapa a) unida operativamente a una secuencia reguladora; c) introducir un vector de expresión en una célula huésped durante un tiempo y bajo las condiciones suficientes para la producción de una enzima !8-desaturasa; y d) exponer la enzima !8-desaturasa expresada a un sustrato seleccionado de entre el grupo que consiste en: ácido #6-eicosadienoico, ácido #3-eicosatrienoico y combinaciones de los mismos con el fin de convertir el sustrato en un producto ácido graso poliinsaturado.

25 En el método anterior, el ácido graso poliinsaturado producido puede ser el ácido dihomo-gamma-linolénico (DGLA), el ácido #3-eicosatetraenoico (#3-ETA) o cualquier combinación de los mismos.

Adicionalmente, el método descrito anteriormente puede además comprender la etapa de:

exponer el ácido graso poliinsaturado producido a al menos una desaturasa adicional o una elongasa con el fin de convertir el ácido graso poliinsaturado producido en otro o adicional ácido graso poliinsaturado. El ácido graso poliinsaturado producido puede ser ácido araquidónico (ARA), ácido eicosapentaenoico (EPA), ácido docosapentaenoico (DPA) o ácido docosahexaenoico (DHA) o cualquier combinación de los mismos.

35 En otro aspecto más, la presente invención se refiere a un método para producir un ácido graso poliinsaturado en una célula huésped que comprende las etapas de:

a) aislar una secuencia de nucleótidos que comprende una secuencia de nucleótidos SEC ID Nº 28 o que comprende al menos el 90% de la secuencia de nucleótidos SEC ID Nº 30, en donde la secuencia de nucleótidos codifica un polipéptido que tiene actividad !8-desaturasa; b) construir un vector de expresión que comprende la secuencia de nucleótidos aislada de la etapa a) unida operativamente a una secuencia reguladora; c) introducir el vector de expresión de b) y al menos una construcción de ADN recombinante adicional que comprende una secuencia de nucleótidos aislada unida operativamente a al menos una secuencia reguladora

45 que codifica una delta-9 elongasa en una célula huésped; d) exponer la enzima !8-desaturasa y la delta-9 elongasa expresadas a un sustrato seleccionado de entre el grupo que consiste en: ácido linoleico (LA), ácido alfa-linolénico (ALA) y combinaciones de los mismos con el fin de convertir el sustrato en un producto ácido graso poliinsaturado.

En el método anterior, el producto ácido graso poliinsaturado puede ser ácido dihomo-gamma-linolénico (DGLA) o ácido #3-eicosatetraenoico (#3-ETA) o cualquier combinación de los mismos.

El método anterior puede además comprender la etapa de:

55 exponer el producto ácido graso poliinsaturado a al menos una desaturasa adicional o a una elongasa con el fin de convertir el producto ácido graso poliinsaturado en otro o adicional ácido graso poliinsaturado. El producto ácido graso poliinsaturado producido puede ser el ácido araquidónico (ARA), ácido eicosapentaenoico (EPA), ácido docosapentaenoico (DPA), ácido docosahexaenoico (DHA) o cualquier combinación de los mismos.

En el método descrito anteriormente, la célula huésped puede ser una célula eucariota. Específicamente, la célula eucariota se selecciona de entre el grupo que consiste en: una célula de mamífero, una célula de insecto, una célula vegetal y una célula fúngica. Ejemplos de células fúngicas que se pueden utilizar son células fúngicas que se seleccionan de entre el grupo que consiste en: Saccharomyces spp., Candida spp., Lipomyces spp., Yarrowia spp., Kluyveromyces spp., Hansenula spp., Aspergillus spp., Penicillium spp., Neurospora spp., Trichoderma spp. y Pichia 65 spp. Los ejemplos de células vegetales que se pueden utilizar se seleccionan de entre el grupo que consiste en:

soja, especies de Brassica, cártamo, girasol, maíz, algodón y lino.

Breve descripción de las Figuras

5 La Figura 1 muestra la ruta biosintética de ácidos grasos y el papel de la !8-desaturasa en esta ruta. Las Figuras 2A y 2B muestran el alineamiento de la secuencia de aminoácidos codificada por ED3-8 (SEC ID Nº 29) con !8-desaturasas conocidas de Pavlova lutheri CCMP 459 (SEC ID Nº 2), Pavlova salina (SEC ID Nº 3), Euglena gracialis (SEC ID Nº 1), y Perkinsus (SEC ID Nº 4), los restos idénticos están resaltados, las cajas de histidina están subrayadas, la región conservada del citocromo b5 está subrayada (línea doble). La Figura 3A muestra la secuencia de aminoácidos de la !8-desaturasa de la Euglena gracialis (Nº de registro AF139720, SEC ID Nº 1). La Figura 3B muestra la secuencia de aminoácidos de la !8-desaturasa de la Pavlova lutheri CCMP 459 (SEC ID Nº 2). La Figura 4A muestra la secuencias de aminoácido de la !8-desaturasa de la Pavlova salina (Nº de registro

15 DQ995518, SEC ID Nº 3). La Figura 4B muestra la secuencia de aminoácidos de la !8-desaturasa de la Perkinsus marinus (Nº de registro DQ508730, SEC ID Nº 4). La Figura 4C muestra las secuencias de aminoácidos de la !8-desaturasa de la Acanthamoeba castellani (Nº de registro CS608483, SEC ID Nº 5). La Figura 5 muestra la secuencia de ADN (SEC ID Nº 11) del clon ED3-8 obtenido como se describe en el Ejemplo 2. La Figura 6 muestra la secuencia de aminoácidos deducida (SEC ID Nº 12) del clon ED3-8 obtenido como se describe en el Ejemplo 2. La Figura 7A muestra la secuencia de ADN (SEC ID Nº 15) del clon PK15 obtenido como se describe en el

25 Ejemplo 2. La Figura 7B muestra la secuencia de aminoácidos (SEC ID Nº 16) del clon PK15 obtenido como se describe en el Ejemplo 2. La Figura 8A muestra la secuencia de ADN (SEC ID Nº 24) de un supuesto extremo 3’ del clon ED3-8 obtenido como se describe en el Ejemplo 2. La Figura 8B muestra la secuencia de aminoácidos (SEC ID Nos 25 y 44-46, respectivamente, en orden de aparición) de un supuesto extremo 3’ del clon ED3-8 obtenido como se describe en el Ejemplo 2. La Figura 9 muestra la secuencia de 1.254 pares de bases del supuesto gen !8-desaturasa de Emiliana huxleyi CCMP 378 (SEC ID Nº 28). La Figura 10 muestra la proteína de 417 aminoácidos (SEC ID Nº 29) codificada por la secuencia de 1.254 pares

35 de bases (SEC ID Nº 28) del supuesto gen !8-desaturasa de Emiliana huxleyi CCMP 378. La Figura 11 muestra la secuencia del supuesto gen de la !8-desaturasa de Emiliana huxleyi CCMP 378 con el codón optimizado (SEC ID Nº 30), denominado ‘ED3-8-EP2-5-SC’. El ED3-8-EP2-5-SC comparte un 66,98% de identidad de secuencia con la secuencia del gen ED3-8 original (SEC ID Nº 28; Figura 9). Ninguna de las modificaciones del gen con el codón optimizado cambió la secuencia de aminoácidos de la proteína codificada (SEC ID Nº 29; Figura 10). La Figura 12 muestra la secuencia del gen de la !9-elongasa derivada de Isochrysis galbana (IsoD9) (Nº de registro CQ831422, SEC ID Nº 31).

Descripción detallada de la invención

45 La presente invención se refiere a las secuencias de nucleótidos (por ejemplo, un gen) y las secuencias de aminoácidos traducidas de un gen de la !8-desaturasa de Emiliana spp., por ejemplo, Emiliana huxleyi, específicamente Emiliana huxleyi CCMP 378. Además, la presente invención incluye usos del gen y de la enzima codificada por este gen. Por ejemplo, el nucleótido y la enzima correspondiente se pueden utilizar en la producción de ácidos grasos poliinsaturados tales como, por ejemplo, DGLA, ARA, EPA, #3-ETA DPA y DHA o cualquier combinación de los mismos, los cuales se pueden añadir a composiciones farmacéuticas, composiciones nutricionales y a otros productos valiosos.

A. Definiciones

55 Como se utiliza en el presente documento, las formas singulares “uno”, “una” y “el/la” incluyen los referentes plurales a menos que el contexto dicte claramente otra cosa. Para la enumeración de intervalos numéricos, cada número que interviene en ellos se contempla de manera explícita con el mismo grado de precisión. Por ejemplo para el intervalo 6-9, se contemplan los números 7 y 8 además del 6 y el 9, y para el intervalo 6,0-7,0, se contemplan explícitamente los números 6,0, 6,1, 6,2, 6,3, 6,4, 6,5, 6,6, 6,7, 6,8, 6,9 y 7,0.

a) Especies de Brassica

Como se utiliza en el presente documento “especies de Brassica” se refiere a cualquier planta de entre Brassica 65 juncea, Brassica napus, Brasicca carinata, Brassica oleracea, Brassica nigra y Brassica campestris.

b) Construcción quimérica

Como se utiliza en el presente documento, la frase “construcción quimérica” se refiere a una combinación de moléculas de ácido nucleico que no se encuentran juntas en la naturaleza en condiciones normales. En

5 consecuencia, una construcción quimérica puede comprender secuencias reguladoras y secuencias codificantes que se derivan de fuentes diferentes, o secuencias reguladoras y secuencias codificantes derivadas de la misma fuente, pero dispuestas en una manera diferente a la que se encuentra normalmente en la naturaleza.

c) Secuencia codificante

Como se utiliza en el presente documento, la expresión “secuencia codificante” se refiere a una secuencia de ADN que codifica una secuencia de aminoácidos específica. “Secuencias reguladoras” se refiere a secuencias de nucleótidos que se localizan corriente arriba de (secuencias no codificantes 5’), en, o corriente abajo de (secuencias no codificantes 3’) una secuencia codificante, y que tienen influencia en la transcripción, procesamiento o estabilidad

15 del ARN, o en la traducción de la secuencia codificante asociada. Las secuencias reguladoras pueden incluir, pero sin limitarse a estos, promotores, secuencias directoras de la traducción, intrones, y secuencias de reconocimiento de poliadenilación.

d) Codón optimizado

Cuando se utiliza “con el codón optimizado” en conexión con un gen o una molécula de ácido nucleico se refiere a un gen o molécula de ácido nucleico que tiene su frecuencia de uso del codón diseñada para imitar la frecuencia de uso del codón preferido de la célula huésped.

25 e) Complementariedad

Como se utiliza en el presente documento, el término “complementariedad” se refiere al grado de relación entre dos segmentos de ADN. Se determina midiendo la capacidad de la cadena en sentido de un segmento de ADN para hibridarse con la cadena antisentido del otro segmento de ADN, para formar bajo las condiciones apropiadas, una doble hélice. En la doble hélice, la adenina está presente en una cadena, la timina está presente en la otra cadena. De manera similar, si se encuentra guanina en una cadena, la citosina se encuentra en la otra. Cuanto mayor es la relación entre las secuencias de nucleótidos de los dos segmentos de ADN, mayor es la capacidad para formar dúplex híbridos entre las cadenas de los dos segmentos de ADN.

35 f) Codificado por, Hibridación y condiciones rigurosas

Como se utiliza en el presente documento, la frase “codificado por” se refiere a una secuencia de ácido nucleico que codifica una secuencia de polipéptidos, en el que la secuencia de polipéptidos o una porción de la misma contiene una secuencia de aminoácidos de al menos 3 aminoácidos consecutivos, más preferentemente 8 aminoácidos consecutivos, e incluso más preferentemente al menos 15 aminoácidos consecutivos de un polipéptidos codificado por la secuencia de ácidos nucleicos.

Una molécula de ácido nucleico es “hibridable” con otra molécula de ácido nucleico cuando una forma de cadena sencilla de la molécula de ácido nucleico se puede hibridar con otra molécula de ácido nucleico bajo condiciones 45 apropiadas de temperatura y fuerza iónica (Véase, Sambrook y col., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Segunda Edición (1989), Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, Nueva York). Las condiciones de temperatura y fuerza iónica determinan la “rigurosidad” de la hibridación. La “hibridación” necesita que los dos ácidos nucleicos contengan secuencias complementarias. Sin embargo, dependiendo de la rigurosidad de la hibridación, pueden ocurrir complementariedades erróneas entre las bases. La rigurosidad adecuada para hibridar ácidos nucleicos depende de la longitud de los ácidos nucleicos y el grado de complementariedad. Tales variables son conocidas por los expertos en la técnica. Más específicamente, cuanto mayor es el grado de similitud u homología entre dos secuencias de nucleótidos, mayor es el valor de Tm para los híbridos de ácidos nucleicos que tienen esas secuencias. Para los híbridos de más de 100 nucleótidos de longitud, se han derivado ecuaciones para calcular el Tm (Véase, Sambrook y col., anteriormente). Para la hibridación con ácidos nucleicos más cortos, la

55 posición de las complementariedades erróneas es menos importante, y la longitud de los oligonucleótidos determinan su especificidad (Véase, Sambrook y col., anteriormente).

Típicamente, las condiciones de rigurosidad serán aquellas en las que la concentración de sal es menor de aproximadamente 1,5 M de ion Na, típicamente aproximadamente de 0,01 a 1,0 M de concentración de ion Na (u otras sales) a un pH 7,0 a 8,3 y la temperatura es al menos de aproximadamente 30 ºC para las sondas cortas (por ejemplo, 10 a 50 nucleótidos) y al menos aproximadamente de 60 ºC para sondas largas (por ejemplo, mayores de 50 nucleótidos). Las condiciones de rigurosidad se pueden conseguir también con la adición de agentes desestabilizantes tales como la formamida. Un ejemplo de condiciones de baja rigurosidad incluye la hibridación con una solución tampón del 30 al 35% de formamida, NaCl 1 M, 1% de SDS (dodecil sulfato sódico) a 37 ºC, y un 65 lavado en 1 x a 2 x SSC (20 x SSC = NaCl 3 M / citrato trisódico 0,3 M) a 50 a 55 ºC. Un ejemplo de condiciones de rigurosidad moderada incluye la hibridación en un 40 a 45% de formamida, NaCl 1 M, 1% SDS a 37 ºC, y un lavado

en 0,5 x a 1 x de SSC a 55 a 60 ºC. Un ejemplo de condiciones de alta rigurosidad incluye la hibridación en formamida al 50%, NaCl 1 M, 1% SDS a 37 ºC, y un lavado en 0,1 x SSC a una temperatura de 60 a 65 ºC.

g) Exón

5 Como se utiliza en el presente documento, el término “exón” se refiere a una parte de la secuencia de un gen que se transcribe y se encuentra en el ARN mensajero maduro derivado del gen, pero que no es necesariamente una parte de la secuencia que codifica el producto génico final.

10 h) Expresión, inhibición antisentido y Co-supresión

Como se utiliza en el presente documento, el término “expresión”, se refiere a la producción de un producto final funcional. La expresión de un gen implica la transcripción del gen y la traducción del ARNm en una proteína precursora o madura.

15 Como se utiliza en el presente documento, la frase “inhibición antisentido” se refiere a la producción de transcripciones de ARN antisentido capaces de suprimir la expresión de la proteína diana.

Como se utiliza en el presente documento, el término “co-supresión” se refiere a la producción de transcripciones de

20 ARN en sentido capaces de suprimir la expresión de genes idénticos o sustancialmente similares ajenos o endógenos. (Véase la Patente de EE. UU Nº 5.231.020).

i) Fragmento o subfragmento que es funcionalmente equivalente

25 Las expresiones “fragmento o subfragmento que es funcionalmente equivalente” y “fragmento o subfragmento funcionalmente equivalente”, se utilizan en el presente documento de manera intercambiable y se refieren a una porción o subsecuencia de una molécula de ácido nucleico aislada en la que la capacidad de alterar la expresión génica o producir un cierto fenotipo se mantiene si el fragmento o el subfragmento codifica una enzima activa o no. Por ejemplo, el fragmento o subfragmento se puede utilizar en el diseño de construcciones quiméricas para producir

30 el fenotipo deseado en una planta transformada. Las construcciones quiméricas se pueden diseñar para utilizarlas en la co-supresión o inhibición antisentido, uniéndose a un fragmento o subfragmento de ácido nucleico de las mismas en la orientación apropiada con respecto a una secuencia promotora vegetal, si codifica una enzima activa o no.

35 j) Gen, Gen nativo y Transgén

Como se utiliza en el presente documento, el término “gen” se refiere a una molécula de ácido nucleico que expresa una proteína específica, que incluye las secuencias reguladoras precedentes (secuencias no codificantes 5’) y las siguientes (secuencias no codificantes 3’) de la secuencia codificante.

40 Como se utiliza en el presente documento, la frase “gen nativo” se refiere a un gen como se encuentra en la naturaleza con sus propias secuencias reguladoras.

Como se utiliza en el presente documento, el término “transgén” se refiere a un gen que se ha introducido en el 45 genoma por un procedimiento de transformación.

k) Especies de Gossypium

Como se utiliza en el presente documento, la frase “especies de Gossypium” se refiere a cualquier planta de entre

50 Gossypium arboreum, Gossypium barbadense, Gossypium herbaceum, Gossypium hirsutum, Gossypium hirsutum var hirsutum, Gossypium hirsutum var marie-galante, Gossypium lapideum, Gossypium sturtianum, Gossypium thuberi, Gossypium thurberi, Gossypium tomentosum o Gossypium tormentosum.

l) Homología

55 Los términos “homología”, “homólogo”, “sustancialmente similar” y “sustancialmente correspondiente” se utiliza de manera intercambiable en el presente documento y se refiere a moléculas de ácidos nucleicos en las que cambios en una o más bases de nucleótidos no afectan a la capacidad de la molécula de ácido nucleico para mediar en la expresión génica para producir un cierto fenotipo. Estos términos también se refieren a modificaciones en las

60 moléculas de ácido nucleico de la presente invención tal como una eliminación o inserción de uno o más nucleótidos que no altera sustancialmente las propiedades funcionales de la molécula de ácido nucleico con respecto a la molécula inicial, no modificada. Por lo tanto se entiende que los expertos en la técnica apreciarán que la invención engloba más que las secuencias ejemplares específicas.

m) Célula huésped

Como se utiliza en el presente documento, la frase “célula huésped” significa una célula, que comprende una secuencia de ácido nucleico aislada o un fragmento de la misma de la presente invención. Las células huésped 5 pueden ser células procariotas (por ejemplo, tales como Escherichia coli, cianobacterias y Bacillus subtilis), o células eucariotas (por ejemplo, tales como células fúngicas, de insecto, vegetales o de mamífero).

Ejemplos de células fúngicas que pueden utilizarse son Saccharomyces spp., Candida spp., Lipomyces spp., Yarrowia spp., Kluyveromyces spp., Hansenula spp., Aspergillus spp., Penicillium spp., Neurospora spp., Trichoderma spp. y Pichia spp. Una célula fúngica preferida es Saccharomyces cerevisiae.

Las células vegetales pueden ser células de plantas monocotiledóneas y dicotiledóneas. Las células vegetales particularmente preferidas son de Glycine max (por ejemplo, soja), especies de Brassica, Carthamus tinctorius L. (por ejemplo, cártamo), Helianthus annuus (por ejemplo, girasol), Zea mays (por ejemplo, maíz), especies de

15 Gossypium y Linum usitatissimium (por ejemplo, lino).

Como se utiliza en el presente documento, las expresiones “identidad” e “identidad de secuencia” como se utilizan de manera intercambiable en el presente documento, cuando se utilizan en el contexto de secuencias de nucleótidos

o polipéptidos se refiere a las bases de ácidos nucleicos o restos de aminoácidos de dos secuencias que son la misma cuando se alinean para máxima correspondiente sobre una ventana de comparación determinada. Por lo tanto, la identidad se define como el grado de igualdad, correspondencia o equivalencia entre las mismas cadenas (sea en sentido o contrasentido) de dos segmentos de ADN o polipeptídicos.

El “porcentaje de identidad de secuencia” o “% de identidad” se calcula comparando dos secuencias alineadas

25 óptimamente sobre una región en particular, determinando el número de posiciones en las que hay bases idénticas en ambas secuencias con el fin de obtener el número de posiciones con correspondencia, dividiendo el número de tales posiciones por el número total de posiciones en el segmento que se compara, y multiplicando el resultado por

100. El alineamiento óptimo de secuencias se puede llevar a cabo por el algoritmo de Simth y Waterman, Appl. Math. 2: 482 (1981), por el algoritmo de Needleman y Wunsch, J. Mol. Biol. 48: 443 (1970), por el método de Pearson y Lipman, Proc. Natl. Acad. Sci (EE. UU) 85; 2444 (1988) y por programas de ordenador que aplican los algoritmos relevantes (por ejemplo, Higgins y col., CABIOS. 5LA51-153 (1989), FASTDB (intelligenetics), BLAST (National Center for Biomedical Information; Altschul y col., Nucleic Acids Research 25: 3389-3402 (1997)), PILEUP (Genetics Computer Group, Madison, WI) o GAP, BESTFIT, FASTA y TFASTA (Wisconsin Genetics Software Package Release 7.0. Genetics Computer Group, Madison, WI). (Véase la Patente de EE. UU Nº 5.912.120).

35 Ejemplos útiles de porcentaje de identidades de secuencia incluyen, pero sin limitarse a estos, el 50%, 51%, 52%, 53%, 54%, 55%, 56%, 57%, 58%, 59%, 60%, 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% o 99%. Estas identidades se pueden determinar utilizando cualquiera de los programas descritos en el presente documento.

o) Indirectamente o Directamente

Como se utiliza en el presente documento, el término “indirectamente” cuando se utiliza en conexión con el uso de un gen y su enzima correspondiente en la producción de ácidos grasos poliinsaturados, engloba la situación en la

45 que un primer ácido se convierte en un segundo ácido (es decir, una ruta intermedia) por acción de una primera enzima (por ejemplo, LA en EDA, por ejemplo, por la !9-elongasa) y luego un segundo ácido se convierte en un tercer ácido por el uso de una segunda enzima (por ejemplo, EDA en DGLA por ejemplo, por la !8-desaturasa).

Como se utiliza en el presente documento, el término “directamente” cuando se utiliza en conexión con el uso de un gen y su correspondiente enzima en la producción de ácidos grasos poliinsaturados engloba la situación en la que la enzima convierte directamente un primer ácido en un segundo ácido, en el que el segundo ácido se utiliza luego en una composición (por ejemplo, la conversión de LA en EDA por ejemplo, por la !9-elongasa o #3-EtrA en #3-ETA por ejemplo, por una !8-desaturasa).

55 p) Intrón

Como se utiliza en el presente documento, el término “intrón” se refiere a una secuencia que interviene en un gen que no codifica una parte de la secuencia proteica. Por tanto, tales secuencias se transcriben en un ARN pero luego se escinden y no se traducen. El término también se utiliza para secuencias de ARN escindidas.

q) Aislado

Como se utiliza en el presente documento, el término “aislado” se refiere a una molécula de ácido nucleico (ADN o ARN) o una proteína o una parte biológicamente activa de la misma que se elimina de su entorno o fuente donde se 65 encuentra naturalmente utilizando técnicas de rutina conocidas en la técnica (por ejemplo, de bacterias, algas, hongos, plantas, vertebrados, mamíferos, etc.). Las moléculas de ácido nucleico aislado o las proteínas están

sustancialmente o esencialmente libres de componentes que acompañan normalmente o interactúan con las moléculas de ácido nucleico o proteínas en el entorno donde se encuentran naturalmente.

r) Fragmento de ácido nucleico aislado o secuencia de ácido nucleico aislada

5 Como se utiliza en el presente documento, la frase “fragmento de ácido nucleico aislado” o “secuencia de ácido nucleico aislada” se refiere a un polímero de ARN o ADN que tiene una cadena sencilla o doble, que opcionalmente contiene bases de nucleótidos sintéticas, no naturales o alteradas. Un fragmento de ácido nucleico aislado en forma de un polímero de ADN puede estar comprendido por uno o más segmentos de ADNc, ADN genómico o ADN sintético. (Un “fragmento” de un polinucleótido específico se refiere a una secuencia de polinucleótido que comprende una secuencia contigua de aproximadamente, al menos 10 nucleótidos consecutivos, al menos aproximadamente 15 nucleótidos consecutivos, al menos aproximadamente 20 nucleótidos consecutivos, etc., idénticos o complementarios a una región de la secuencia de nucleótidos especificada). Los nucleótidos (que se encuentran normalmente en su forma de 5’-monofosfato) se nombran por su designación abreviada por una letra

15 como sigue: “A” para adenilato o desoxiadenilato (para ARN y ADN respectivamente), “C” para citidilato o desoxicitidilato, “G” por guanilato o desoxiguanilato, “U” para uridilato, “T” para desoxitimidilato, “R” para las purinas (A o G), “Y” para pirimidinas (C o T), “K” para G o T, “H” para A o C o T, “I” para inosina, y “N” para cualquier nucleótido.

s) Madura o Precursora

Como se utiliza en el presente documento, el término “madura” cuando se utiliza en conexión con el término “proteína” se refiere a un polipéptido procesado post-traduccionalmente; es decir, uno del que cualquier pre o propéptido presente en el primer producto de la traducción se ha eliminado.

25 Como se utiliza en el presente documento, el término “precursora” cuando se utiliza en conexión con el término “proteína” se refiere al producto primario de la traducción de ARNm; es decir, con los pre y propéptidos aún presentes. Los pre y propéptidos pueden ser, pero sin limitarse a estas, señales de localización intracelular.

t) Secuencias 3’ no codificantes

Como se utiliza en el presente documento, la frase “secuencias 3’ no codificantes” se refiere a secuencias de ADN localizadas corriente abajo de una secuencia codificante e incluyen secuencias de reconocimiento de poliadenilación y otras secuencias que codifican señales reguladoras capaces de afectar el procesamiento del ARNm o la expresión

35 génica. La señal de poliadenilación se caracteriza normalmente por afectar la adición de tramos de ácido poliadenílico al extremo 3’ del precursor de ARNm. El uso de diferentes secuencias no codificantes se ejemplifica por Ingelbrecht y col., (1989) Plant Cell 1: 671-680.

u) Que no se produce naturalmente

Como se utiliza en el presente documento, la frase, “que no se produce naturalmente” se refiere a algo que es artificial, no consistente con lo que se encuentra normalmente en la naturaleza.

v) Unido operativamente

45 Como se utiliza en el presente documento, la frase “unido operativamente” se refiere a la asociación de secuencias de ácido nucleico en una molécula única de ácido nucleico de forma que la función de una está regulada por la otra. Por ejemplo, un promotor está unido operativamente con una secuencia codificante cuando es capaz de regular la expresión de esa secuencia codificante (es decir, que la secuencia codificante está bajo el control transcripcional del promotor). Las secuencias codificantes pueden estar unidas operativamente a secuencias reguladoras en una orientación en sentido o antisentido. En otro ejemplo, las regiones complementarias de ARN de la invención pueden estar unidas operativamente, sea directa o indirectamente, en 5’ del ARNm diana, o en 3’ del ARNm diana, o en el ARNm, o una región complementaria está 5’ y su complemento está 3’ de la ARNm diana.

55 w) Planta

Como se utiliza en el presente documento, el término “planta” se refiere a plantas completas, órganos de plantas, tejidos vegetales, semillas, células vegetales, semillas y descendencia de la misma. Las células vegetales incluyen, sin limitación, células de las semillas, suspensiones de cultivos, embriones, regiones meristemáticas, tejido leñoso, hojas, raíces, brotes, gametofitos, esporofitos, polen y microesporas.

x) Reacción en cadena de la Polimerasa o PCR

Como se utiliza en el presente documento, la frase “Reacción en Cadena de la Polimerasa” o “PCR” se refiere a una

65 técnica para la síntesis de grandes cantidades de segmentos de ADN específicos, que consiste en una serie de ciclos repetitivos (Perkin Elmer Cetus Instruments, Norwalk, CT). Típicamente, la doble cadena de ADN se desnaturaliza por calor, los dos cebadores complementarios de los finales 3’ se hibridan con el segmento diana a baja temperatura y luego se extiende a temperatura intermedia. Un grupo de estas tres etapas consecutivas se designa como un ciclo.

5 La PCR es una técnica poderosa que se utiliza para amplificar el ADN millones de veces, por la replicación repetida de una matriz, en un corto periodo de tiempo (Mullis y col, Cold Spring Garbor Symp. Quant. Biol. 51: 263-273 (1986); Erlich y col., Solicitud de Patente Europea 50.424; Solicitud de Patente Europea 84.796; Solicitud de Patente Europea 258.017, Solicitud de Patente Europea 237.362; Mullis, Solicitud de Patente Europea 201.184, Mullis y col., Patente de EE. UU Nº 4.683.202; Erlich, Patente de EE. UU Nº 4.582.788; y Saiki y col., Patente de EE. UU Nº

10 4.683.194). El proceso utiliza grupos de oligonucleótidos específicos sintetizados in vitro para cebar la síntesis de ADN. El diseño de los cebadores depende de las secuencias de ADN que se desea analizar. La técnica se lleva a cabo por medio de muchos ciclos (normalmente de 20-50) o fundiendo la matriz a alta temperatura, permitiendo a los cebadores hibridarse con las secuencias complementarias de la matriz y luego replicando la matriz con una ADN polimerasa. Los productos de las reacciones PCR se analizan por separación en geles de agarosa y a continuación

15 por tinción con bromuro de etidio y visualización por transiluminación UV. De manera alternativa se pueden añadir dNTP radioactivos a la PCR con el fin de incorporar un marcador en los productos. En este caso los productos de la PCR se visualizan por exposición del gel en una película de rayos x. La ventaja añadida del radiomarcado de los productos PCR es que los niveles de los productos de cada amplificación individual se pueden cuantificar.

20 y) Promotor y potenciador

Como se utiliza en el presente documento, el término “promotor” se refiere a una secuencia de ADN capaz de controlar la expresión de una secuencia codificante o ARN funcional. La secuencia promotora consiste en elementos proximales y más distales corriente arriba, a los últimos elementos se les designa a menudo como potenciadores.

25 Como se utiliza en el presente documento, el término “potenciador” se refiere a una secuencia de ADN que puede estimular la actividad promotora y puede ser un elemento innato del promotor o un elemento heterólogo insertado para aumentar el nivel o la especificidad tisular de un promotor. Las secuencias promotoras pueden localizarse también en las porciones transcritas de genes, y/o corriente abajo de las secuencias transcritas. Los promotores

30 pueden derivarse completamente de un gen nativo, o estar compuestos de diferentes elementos derivados de diferentes promotores que se encuentran en la naturaleza, o incluso comprender segmentos de ADN sintéticos. Se entiende por los expertos en la técnica que los diferentes promotores pueden dirigir la expresión de un gen en diferentes tejidos o tipos celulares o en diferentes estadios de desarrollo, o en respuesta a diferentes condiciones ambientales. Los promotores que producen que un gen se exprese en la mayoría de los tipos celulares en la

35 mayoría de las veces se designan comúnmente como “promotores constitutivos”. Se están descubriendo continuamente nuevos promotores de varios tipos, útiles en células vegetales; se pueden encontrar numerosos ejemplos en la recopilación de Okamuro y Goldgerg, (1989) Biochemistry of Plants 15: 1-82. Además se reconoce que aunque en la mayoría de los casos los límites exactos de las secuencias reguladoras no se han definido completamente, las moléculas de ADN con alguna variación pueden tener una actividad promotora idéntica.

z) Recombinante

Como se utiliza en el presente documento, el término “recombinante” se refiere a una combinación artificial de dos segmentos de una secuencia que de otra manera estarían separados, por ejemplo, por síntesis química o por

45 manipulación de segmentos aislados de ácidos nucleicos por técnicas de manipulación genética.

aa) Construcción recombinante, Construcción de Expresión y Construcción de expresión recombinante

Las frases “construcción recombinante”, “construcción de expresión” y “construcción de expresión recombinante” se

50 utilizan de manera intercambiable en el presente documento y se refiere a una unidad funcional de material genético que se puede insertar en el genoma de una célula utilizando la metodología estándar bien conocida por un experto en la técnica. Tal construcción se puede usar tal cual o en conjunción con un vector. Si se utiliza un vector, entonces la elección del vector depende del método que se utilizará para transformar las plantas huésped como es bien conocido por los expertos en la técnica. Por ejemplo, se puede utilizar un vector plásmido. El experto en la técnica

55 es bien consciente de los elementos genéticos que deben estar presentes en el vector con el fin de transformar, seleccionar y propagar con éxito las células huésped que comprenden cualquiera de las moléculas de ácido nucleico de la invención. El experto en la técnica también reconocerá qué acontecimientos de transformación independientes diferentes resultarán en diferentes niveles y patrones de expresión (Jones y col., (1985) EMBO J. 4: 2411-2418; De Almeida y col., (1989) Mol. Gen. Genetics 218: 78-86), y por tanto que los múltiples casos se deben valorar con el

60 fin de obtener líneas que muestren el nivel y patrón de expresión deseados. Tal valoración se puede conseguir por el análisis Southern de ADN, análisis Northern de expresión de ARNm, análisis de Western de la expresión proteica, o análisis fenotípico.

bb) ARN Transcrito, ARN mensajero, ADNc, ARN funcional y ARN endógeno

Como se utiliza en el presente documento, “ARN transcrito” se refiere al producto resultante de la transcripción de una secuencia de ADN catalizada por una ARN polimerasa. Cuando la transcripción de ARN es una copia

5 complementariamente perfecta de la secuencia de ADN, se designa como transcripción primaria o puede ser una secuencia derivada de un procesamiento post-transcripcional de la transcripción primaria y se designa como ARN maduro.

Como se utiliza en el presente documento, la frase “ARN mensajero (ARNm)” se refiere al ARN que está sin intrones y que puede traducirse en proteínas por la célula.

Como se utiliza en el presente documento, el término “ADNc” se refiere a un ADN que es complementario con y se sintetiza a partir de una matriz de ARNm utilizando la enzima transcriptasa inversa. El ADNc puede ser monocatenario o se puede convertir en forma de doble cadena utilizando la molécula Klenow de la ADN polimerasa

15 I. ARN en “sentido” se refiere a la transcripción de ARN que incluye el ARNm y que se puede traducir en una proteína en una célula o in vitro. “ARN antisentido” se refiere a un ARN transcrito que es complementario a toda o a parte de una transcripción primaria de ARNm diana y que bloquea la expresión de un gen diana (Patente de EE. UU Nº 5.107.065). La complementariedad de un ARN antisentido puede ser con cualquier parte de la transcripción génica específica, es decir, con la secuencia no codificante 5’, la secuencia no codificante 3’, intrones, o la secuencia codificante.

Como se utiliza en el presente documento, la frase “ARN funcional” se refiere a un ARN antisentido, ARN ribozima, u otro ARN que puede no traducirse pero que aún tiene un efecto sobre los procesos celulares.

25 Las expresiones “complemento” y “complemento inverso” se utilizan de manera intercambiable en el presente documento con respecto a transcripciones de ARNm, y se supone que define el ARN antisentido del mensaje.

Como se utiliza en el presente documento, la frase “ARN endógeno” se refiere a cualquier ARN que está codificado por cualquier secuencia de ácido nucleico presente en el genoma del huésped antes de la transformación con la construcción recombinante de la presente invención, tanto si se encuentra naturalmente o no naturalmente, es decir, introducido por medios recombinantes, mutagénesis, etc.

cc) Similitud

35 Como se utiliza en el presente documento, el término “similitud” cuando se utiliza en referencia a la “similitud” entre dos secuencias de aminoácidos, proteínas, o polipéptidos se refiere a la presencia de una serie de restos de aminoácidos idénticos así como a que se han conservado en ambas secuencias. Cuanto mayor es el grado de similitud entre las dos secuencias de aminoácidos, mayor es la correspondencia, igualdad o equivalencia de las dos secuencias.

dd) Transformación estable, Transformación transitoria y Transformación

Como se utiliza en el presente documento, la frase “transformación estable” se refiere a la transferencia de una molécula de ácido nucleico en el genoma de un organismo huésped, incluyendo tanto los genomas nuclear y

45 orgánulos, que da como resultado una herencia genéticamente estable.

Por el contrario, como se utiliza en el presente documento, la frase “transformación transitoria” se refiere a la transferencia de una molécula de ácido nucleico en el núcleo, o en un orgánulo que contiene ADN, de un organismo huésped que da como resultado la expresión génica sin integración o herencia estable. Los organismos huésped que contienen las moléculas de ácido nucleico transformadas se designan como organismos “transgénicos”. El método preferido de transformación celular del arroz, maíz y otras monocotiledóneas es el uso de tecnología de transformación con partículas aceleradas o “pistola génica” (Klein y col., (1987) Nature (Londres) 327: 70-73; Patente de EE. UU Nº 4.945.050), o un método mediado por Agrobacterium utilizando un plásmido Ti apropiado que contenga el transgén (Ishida Y. y col., (1996) Nature Biotech. 14: 745-750).

55 Como se utiliza en el presente documento, el término “transformación” se refiere tanto a la transformación estable como a la transformación transitoria.

ee) Secuencia directora de la traducción

Como se utiliza en el presente documento, la frase “secuencia directora de la traducción” se refiere a una secuencia de ADN localizada entre la secuencia promotora de un gen y la secuencia codificante. La secuencia directora de traducción está presente en el ARNm procesado completamente corriente arriba de la secuencia de inicio de la traducción. La secuencia directora de traducción puede afectar el procesamiento de la transcripción primaria a

65 ARNm, la estabilidad del ARNm o la eficacia de la traducción. Se han descrito ejemplos de secuencias directoras de traducción (Turner, R. y Foster, G. D. (1995) Molecular Biotechnology 3: 225).

Todas las patentes, patentes publicadas y documentos prioritarios citados en el presente documento se incorporan por la presente en su integridad por referencia.

B. El gen de la 8-desaturasa y la enzima codificada por el mismo

5 La enzima codificada por el gen de !8-desaturasa de la presente invención es esencial para la producción de ácidos grasos poliinsaturados (PUFA) que tienen al menos dos insaturaciones (enlaces dobles) y una longitud total de 20 átomos de carbono o más. Específicamente, la enzima de la presente invención es funcionalmente activa (por ejemplo tiene actividad !8-desaturasa), lo que significa que añade un doble enlace entre el átomo de carbono 8 (C8)

10 y el átomo de carbono 9 (C9) de un PUFA que tiene una longitud de al menos 20 átomos de carbono y en el que preexisten enlaces dobles en la posición !9, !12 y/o !15. Como se muestra en la Figura 1, la enzima codificada por el gen de la !8-desaturasa de la presente invención produce PUFA que tienen una longitud de 20 átomos de carbono o más por medio de la ruta alternativa !8-desaturasa/ !9-elongasa. En esta ruta, la !8-desaturasa de la presente invención utiliza los sustratos, ácido #6-eicosadienoico, ácido #3-eicosatrienoico o ambos ácidos #6-eicosadienoico

15 y #3-eicosatrienoico.

El gen de la !8-desaturasa de la presente invención se aisló de Emiliana spp., concretamente Emiliana huxleyi, específicamente, Emiliana huxleyi CCMP 378. La secuencia de nucleótidos del gen de la !8-desaturasa aislado de Emiliana huxleyi CCMP 378 se muestra en la Figura 8 y la SEC ID Nº 28. Se muestra una secuencia de nucleótidos

20 con el codón optimizado, aislada de la supuesta secuencia de nucleótidos en la Figura 11 y la SEC ID Nº 30. La secuencia de aminoácidos aislada o purificada, codificada por ambas SEC ID Nº 28 y SEC ID Nº 30, se muestra en la Figura 10 y la SEC ID Nº 29.

La conversión de LA en DGLA y ALA en #3-ETA utilizando la enzima !9-elongasa y la enzima !8-desaturasa se

25 designa como ruta alternativa !8-desaturasa / !9-elongasa. La ruta convencional !6 para convertir LA en DGLA y ALA en #3-ETA utiliza la enzima !6-desaturasa para convertir LA en DGLA y ALA en SDA, y un gen de la !6elongasa para convertir el GLA en DGLA, y SDA en #3-ETA, respectivamente. En cualquiera de las rutas, la producción de ARA o EPA, se cataliza entonces, por ejemplo, por una !5-desaturasa. El DHA, por ejemplo, se puede producir en la conversión de EPA en ácido #3-docosapentaenoico (DPA), y ácido #3-docosapentaenoico en

30 DHA, utilizando, por ejemplo, una C20-elongasa y una !4-desaturasa, respectivamente.

Aunque por ejemplo, el DGLA, ARA. #3-ETrA, #3-ETA, EPA, DPA y/o DHA se pueden producir por medio tanto de la ruta alternativa !8-desaturasa / !9-elongasa como por la ruta convencional !6-elongasa, en ciertas circunstancias la ruta alternativa !8-desaturasa / !9-elongasa puede preferirse sobre la ruta convencional !6. Por ejemplo, si no se

35 desean residuos particulares de ácidos grasos intermedios omega-6 y omega-3, tales como GLA o SDA, durante la producción de DGLA, ARA, #3-ETrA, #3-ETA, EPA, DPA y/o DHA, la ruta alterativa !8-desaturasa / !9-elongasa se puede utilizar como una alternativa a la ruta convencional !6 para evitar la formación de GLA y SDA.

Como se ha tratado anteriormente, la !8-desaturasa es una enzima necesaria en la ruta alternativa !8-desaturasa /

40 !9-elongasa. El EPA, por ejemplo no se puede sintetizar por medio de la ruta alternativa !8-desaturasa / !9elongasa sin el gen de la !8-desaturasa y la enzima codificada por el mismo. Como se muestra en la Figura 1, la enzima !8-desaturasa aislada de la presente invención convierte, por ejemplo el EDA en DGLA y el #3-ETrA en #3-ETA. La producción de #3-ETA a partir de #3-ETrA, y EPA a partir de #3-ETA, se cataliza entonces, por ejemplo, por una !8-desaturasa y una !5-desaturasa, respectivamente. Como resultado de la utilización de la ruta alternativa

45 !8-desaturasa / !9-elongasa, se evitan los ácidos grasos intermedios GLA y SDA.

La presente invención también comprende secuencias de nucleótidos aisladas o purificadas (y las proteínas codificadas correspondientes) que tienen secuencias que comprenden o consisten en la SEC ID Nº 28 (la secuencia de nucleótidos de !8-desaturasa aislada de Emiliana huxleyi CCMP 378) o comprenden o consisten en al menos el

50 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% o 99% de la secuencia de nucleótidos de (es decir, que tienen una identidad de secuencia con) la SEC ID Nº 30 (la secuencia de nucleótidos con el codón optimizado aislada de Emiliana huxleyi CCMP 378). Tales secuencias pueden ser de fuentes humanas así como de otras fuentes no humanas (por ejemplo, C. elegans o ratón).

55 Las variantes de la secuencia de nucleótidos de la SEC ID Nº 28 y la SEC ID Nº 30 también se contemplan en el presente documento. Tales variantes pueden contener de una o más adiciones, sustituciones o eliminaciones de pares de bases, siempre y cuando esas adiciones, sustituciones o eliminaciones no se produzcan en cualquiera de las tres (3) regiones conservadas “cajas de histidina” o en el dominio similar al citocromo b5 que se encuentra en el extremo 5’ de la SEC ID Nº 29 (Véase la Figura 2). Las regiones “cajas de histidina” y el dominio similar al citocromo

60 b5 se tratan con más detalle en el presente documento en conexión con variantes de los aminoácidos de la SEC ID Nº 29. Ejemplos de las variantes de nucleótidos se muestran en la Tabla A, a continuación.

Tabla A

Secuencia / sustitución del codón (SEC ID Nº 28)

C73 ∃T73/ CAT ∃ TAT A674 ∃ G674 / AAC ∃ AGC A1001 ∃ T1001 / CAC ∃ CTC C1230 ∃ T1230 / GGC ∃ GGT

T65 ∃ C65 / GTC ∃ GCC C73 ∃ T73 / CAT ∃ TAT A674 ∃ G674 / AAC ∃ AGC A1001 ∃ T1001 / CAC ∃ CTC A1037 ∃ G1037 / AAC ∃ AGC

C73 ∃ T73 / CAT ∃ TAT T84 ∃ C84 / GCT ∃ GCC A674 ∃ G674 / AAC ∃ AGC A698 ∃ G698 / AAC ∃ AGC A1001 ∃ T1001 / CAC ∃ CTC G1059 ∃A1059 / TCA ∃ TCA

C73 ∃ T73 / CAT ∃ TAT A674 ∃ G674 / AAC ∃ AGC T851 ∃ C851 / GTC ∃ GCC A1001 ∃ T1001 / CAC ∃ CTC

La presente invención también engloba secuencias de nucleótidos a partir de otras fuentes, y que tienen la correspondencia descrita anteriormente con la SEC ID Nº 28 o la SEC ID Nº 30. También se engloban en la 5 presente invención las equivalentes funcionales de la SEC ID Nº 28 o SEC ID Nº 30 (es decir, secuencias que tienen !8-desaturasa).

La presente invención también engloba las secuencias de nucleótidos que codifican un polipéptido que tiene actividad !8-desaturasa, en donde la secuencia de aminoácidos de dicho polipéptido comprende la SEC ID Nº 29.

10 Tales secuencias pueden ser a partir de fuentes humanas así como otras fuentes no humanas (por ejemplo, C. elegans o ratón).

La presente invención también incluye un polipéptido aislado y/o purificado que desatura o poliinsatura ácidos grasos a través de la adición de un doble enlace entre el átomo de carbono número 8 y el átomo de carbono 9 (lo

15 que significa que tiene una actividad de !8-desaturasa) de un ácido graso que tiene una longitud de al menos 20 átomos de carbono y que contiene una insaturación en la posición del carbono 9 y comprende la secuencia de aminoácidos de la SEC ID Nº 29 (mostrada en la Figura 10). Específicamente, la presente invención incluye un polipéptido purificado que tiene una secuencia de aminoácidos de la SEC ID Nº 29.

20 También se contemplan en el presente documento las variantes del polipéptido que tiene la secuencia SEC ID Nº

29. Tales variantes pueden contener adiciones, sustituciones o eliminaciones de uno o más aminoácidos, siempre y cuando tales adiciones, sustituciones o eliminaciones no se produzcan en ninguna de las tres (3) regiones “cajas de histidina” altamente conservadas o en el dominio similar a citocromo b5 que se encuentra en el extremo 5’ de la SEC ID Nº 29 (Véase la Figura 2). Las cajas de histidina se encuentran en las posiciones de aminoácidos 155-160 25 (HDYLH (SEC ID Nº 32)), 197-201 (HNTHH (SEC ID Nº 33)), y 355-359 (QTEHH (SEC ID Nº 34)) de la SEC ID Nº 29 (Véase la Figura 2). El dominio similar al citocromo b5 en el extremo 5’ tiene un patrón de unión hemo HPGG que se conserva (posición de aminoácidos 38-41 de la SEC ID Nº 29) (Véase la Figura 2). Este dominio similar al citocromo b5 se encuentra en varias enzimas de unión de membrana “front end” desaturasas tales como !6-! 5-y ! 4-desaturasa implicadas en la producción de PUFA de cadena larga (Véase Napier JA y col. (2003) Prostaglandins

30 Leukot Essent Fatty Acids. 68: 135-43). Se cree que el citocromo b5 funciona como un donante de electrones en estas enzimas durante el proceso de la reacción de desaturación, y la disrupción de esta región puede resultar en la pérdida o cambios en la actividad enzimática (Véase, Sayanova O y col., (1999) Plant Physiol. 121: 641– 646; Guillou H. y col., (2004) J Lipid Res. 45: 32-40). Ejemplo de variantes de aminoácidos se muestran en la Tabla B, a continuación.

Tabla B

Sustitución de Aminoácidos (SEC ID Nº 29)

H25 ∃ Y25 N224 ∃ S224 H334 ∃ L334

Sustitución de Aminoácidos (SEC ID Nº

V22 ∃ A22 H25 ∃ Y25 N224 ∃ S224 H334 ∃ L334 N346 ∃ S346

H25 ∃ Y25 N224 ∃ S224 N233 ∃ S233 H334 ∃ L334

H25 ∃ Y25 N224 ∃ S224 V284 ∃ A284 H334 ∃ L334

C. Producción de la enzima 8-desaturasa

5 Una vez que la secuencia de ácido nucleico (por ejemplo, el gen) que codifica la enzima !8-desaturasa se ha aislado y/o purificado, se puede introducir en una célula huésped sea procariota o eucariota por medio de un vector

o construcción. El vector, por ejemplo, un bacteriófago, cósmido, o plásmido, puede comprender la secuencia de nucleótidos que codifica la enzima !8-desaturasa, así como cualquier secuencia reguladora (por ejemplo un promotor) la cual es funcional en la célula huésped y es capaz de desencadenar la expresión de la !8-desaturasa 10 codificada por la secuencia de nucleótidos. (Una secuencia reguladora se dice que está “unida operativamente” con una secuencia codificante si la secuencia reguladora afecta a la transcripción o expresión de la secuencia codificante). Ejemplos de promotores adecuados incluyen, pero sin limitarse a estos, aquellos de entre los genes que codifican la alcohol deshidrogenasa, gliceraldehído 3-fosfato deshidrogenada, fosfoglucoisomerasa, fosfoglicerato quinasa, fosfatasa ácida, T7, TPI, lactasa, metalotioneína, citomegalovirus precoz inmediato, proteína

15 ácida de trigo, glucoamilasa, y promotores que se activan en presencia de galactosa, por ejemplo, GAL1 y GAL10. Adicionalmente, las secuencias de nucleótidos que codifican otras proteínas, enzimas (por ejemplo, una !9elongasa), oligosacáridos, lípidos, etc. también se pueden incluir en el vector, así como otras secuencias reguladoras tales como una señal de poliadenilación (por ejemplo, la señal poliA del antígeno SV-40T, ovoalbúmina

o la hormona de crecimiento bovina). La elección de secuencias presentes en la construcción depende de los 20 productos de expresión que se deseen así como de la naturaleza de la célula huésped.

Como se señaló anteriormente, una vez que se ha construido el vector, se puede entonces introducir en la célula huésped de elección por métodos conocidos por los expertos en la técnica incluyendo, por ejemplo, la transfección, transformación y electroporación (Véase, Molecular Cloning; A Laboratory Manual, 2ª ed., Vol. 1-3, ed. Sambrook y

25 col., Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989)). La célula huésped se cultiva entonces bajo condiciones adecuadas que permitan la expresión de los genes dando lugar a la producción del PUFA deseado, el cual se recupera entonces y se purifica utilizando técnicas de rutina conocidas en la técnica.

Ejemplos de células huésped procariotas adecuadas incluyen, pero sin limitarse a estas, bacterias tales como

30 Escherichia coli, Bacillus subtilis así como cianobacterias tales como Spirulina spp. (por ejemplo, algas verdiazules). Las células eucariotas incluyen, pero sin limitarse a estas, una célula de mamífero, una célula de insecto, una célula vegetal o una célula fúngica. La célula fúngica incluye, pero sin limitarse a estas, Saccharomyces spp., Candida spp., Lipomyces spp., Yarrowia spp., Aspergillus spp., Penicillium spp., Neurospora spp., Kluyveromyces spp., Hansenula spp., Trichoderma spp. y Pichia spp. En particular, la célula fúngica puede ser una célula de levadura,

35 incluyendo pero sin limitarse a estas, Saccharomyces spp., Candida spp., Hansenula spp., y Pichia spp. La célula de levadura también puede ser Saccharomyces cerevisiae. La célula vegetal incluye, pero sin limitarse a estas, Glycine max (por ejemplo la soja), especies de Brassica, Carthamus tinctorius L. (por ejemplo, cártamo), Helianthus annuus (por ejemplo, girasol), Zea mays (por ejemplo, maíz), especies de Gossypium y Linum usitatissimium (por ejemplo, lino).

40 La expresión en una célula huésped se puede conseguir de manera transitoria o estable. La expresión transitoria puede producirse a partir de construcciones que contienen señales de expresión funcional en la célula huésped, pero cuyas construcciones no replican y raramente se integran en la célula huésped, o cuando la célula huésped no está proliferando. La expresión transitoria también puede lograrse induciendo la actividad de un promotor regulable

45 unido operativamente al gen de interés, aunque tales sistemas inducibles presentan frecuentemente un bajo nivel basal de expresión. La expresión estable se puede conseguir por la introducción de una construcción que se puede integrar en el genoma huésped o que se replica autónomamente en la célula huésped. La expresión estable del gen de interés se puede seleccionar or medio del uso de un marcador genético localizado en o transfectado con la construcción de expresión, para a continuación seleccionar las células que expresan el marcador. Cuando la expresión estable es resultado de la integración, el sitio de integración de la construcción puede producirse aleatoriamente en el genoma huésped o puede dirigirse utilizando construcciones que contienen regiones de homología con el genoma huésped suficientes para la recombinación dirigida con el locus huésped. Cuando las construcciones son dirigidas a un locus endógeno, todas o algunas de las regiones reguladoras de la traducción y

5 transcripción pueden proporcionarse por el locus endógeno.

Un mamífero transgénico también se puede utilizar con el fin de que exprese la enzima !8-desaturasa y en último término los PUFA de interés. Más específicamente, una vez que se crea la construcción descrita anteriormente, se puede insertar en el pronúcleo de un embrión. El embrión entonces se puede implantar en una hembra receptora. De manera alternativa, se puede utilizar también un método de transferencia nuclear (Schnieke y col., Science 278: 2130-2133 (1997)). Entonces, se permite la gestación y el nacimiento (Véase por ejemplo, la Patente de EE. UU Nº

5.750.176 y la Patente de EE. UU Nº 5.700.671). La leche, tejidos y otras muestras de fluido de las crías deberían contener entonces niveles alterados de PUFA cuando se compara con los niveles que se encuentran normalmente en el animal no transgénico. Las generación posteriores se pueden controlar en cuanto a la producción de niveles de

15 PUFA alterados o elevados y por tanto la incorporación del gen que codifica la enzima desaturasa deseada en sus genomas. El mamífero utilizado como huésped puede ser por ejemplo, un ratón, una rata, un conejo, un cerdo, una cabra, una oveja, un caballo y una vaca. Sin embargo, se puede utilizar cualquier mamífero siempre y cuando tenga la capacidad de incorporar el ADN que codifica la enzima de interés en su genoma.

Para la expresión de un polipéptido !8-desaturasa, las regiones funcionales de inicio de la transcripción y traducción y de terminación están unidas operativamente al ADN que codifica el polipéptido desaturasa. Las regiones de inicio de la transcripción y traducción y de terminación se derivan de una variedad de fuentes no exclusivas, incluyendo el ADN a expresarse, los genes conocidos o sospechosos de ser capaces de la expresión en el sistema deseado, vectores de expresión, síntesis química o a partir de locus endógenos en una célula huésped. La expresión en un 25 tejido vegetal y/o en una parte de una planta presenta ciertas eficacias, particularmente cuando el tejido o una parte es tal que se recolecta precozmente, tales como semillas, hojas, frutos, flores, raíces, etc. La expresión se puede dirigir a esa localización en la planta utilizando secuencias reguladoras específicas tales como las de las Patentes de EE. UU Nos 5.463.174, 4.943.674, 53106.739, 5.175.095, 5.420.034, 5.188.958, y 5.589.379. De manera alternativa, la proteína expresada puede ser una enzima que produce un producto que se puede incorporar, sea directamente o después de modificaciones en una fracción de fluido a partir de la planta huésped. La expresión del gen de la !8desaturasa, o las transcripciones de !8-desaturasa antisentido, pueden alterar los niveles de PUFA específicos, o los derivados de los mismos, que se encuentran en partes de la planta y/o en tejidos vegetales. La región codificante del polipéptido !8-desaturasa se puede expresar bien por sí mismo o con otros genes (por ejemplo, un gen que codifique una !9-elongasa, un gen que codifique una !5-desaturasa, un gen que codifique una !17-desaturasa, un

35 gen que codifique una !5-elongasa y/o un gen que codifique una !4-desaturasa), con el fin de producir tejidos y/o partes de plantas que contengan mayores proporciones de los PUFA deseados o en los que la composición de PUFA se parece más estrechamente a la leche materna humana (Véase el documento WO 95/24494). La región de terminación se puede derivar de la región 3’ del gen a partir del cual se ha obtenido la región de inicio o a partir de un gen diferente. Se conoce una gran cantidad de regiones de terminación y se han encontrado satisfactorias en una variedad de huéspedes del mismo o diferentes géneros y especies. La región de terminación normalmente se selecciona por su conveniencia más que por cualquier propiedad en particular.

Como se señaló anteriormente, una planta (por ejemplo, Glycine max o Brassica napus (colza)) o tejido vegetal también se puede utilizar como huésped o célula huésped, respectivamente, para la expresión de la enzima !845 desaturasa la cual, a su vez, puede utilizarse en la producción de ácidos grasos poliinsaturados. Más específicamente, los PUFA deseados pueden expresarse en las semillas. Los métodos para el aislamiento de los aceites de semillas se conocen en la técnica. Por lo tanto, además de proporcionar una fuente de PUFA, se pueden manipular los componentes del aceite de semilla por medo de la expresión del gen de la !8-desaturasa, así como de los genes de la elongasa (por ejemplo, la !9-elongasa, !5-elongasa, etc.) y otros genes desaturasa (por ejemplo, !5-desaturasa, !17-desaturasa, !4-desaturasa, etc.), con el fin de proporcionar aceites de semilla que pueden añadirse a composiciones nutricionales, composiciones farmacéuticas, alimentos de animales, y cosméticos. Una vez más, un vector que comprende una secuencia de ADN que codifica la !8-desaturasa unida operativamente a un promotor, se introducirá en el tejido vegetal o la planta durante un tiempo y bajo condiciones suficientes para la expresión del gen !8-desaturasa. El vector puede comprender también uno o más genes que codifican otras

55 enzimas, por ejemplo, !4-desaturasa, !5-desaturasa, !6-desaturasa, !10-desaturasa, !12-desaturasa, !15desaturasa, !17-desaturasas, !19-desaturasas, !9-elongasa, !6-elongasa y/o !5-elongasa. El tejido vegetal o la planta pueden producir el sustrato relevante en el que actúan las enzimas o se puede introducir un vector que codifica enzimas que producen tales sustratos en el tejido vegetal, la célula vegetal o la planta. Además, el sustrato se puede pulverizar sobre los tejidos vegetales que expresan las enzimas apropiadas. Utilizando estas técnicas variadas, se pueden producir PUFA utilizando una célula vegetal, tejido vegetal o planta. Se debería señalar también que la invención también engloba una planta transgénica que comprenda el vector descrito anteriormente, en la que la expresión de la secuencia de nucleótidos del vector da como resultado la producción de un ácido graso poliinsaturado en, por ejemplo, las semillas de la planta transgénica.

65 La regeneración, desarrollo y cultivo de las plantas a partir de protoplastos vegetales transformantes o a partir de varias explantas transformadas se conocen bien en la técnica (Weissbach y Weissbach, en: Methods for Plant Molecular Biology, (Eds), Academic Press, Inc. San Diego, CA, (1988)). Este proceso de regeneración y crecimiento incluye típicamente las etapas de selección de las células transformadas, el cultivo de aquellas células

5 individualizadas a través de las etapas normales de desarrollo embrionario a través del estadio de plántula con raíces. Los brotes enraizados transgénicos que resultan se plantan de esta manera en un medio apropiado para el crecimiento vegetal tal como el suelo.

El desarrollo o regeneración de las plantas que contienen el gen ajeno, exógeno que codifica una proteína de interés se conocen bien en la técnica. Preferentemente, las plantas regeneradas se auto polinizan para proporcionar plantas transgénicas homocigotas. O de otra manera, el polen obtenido de las plantas regeneradas se cruza para cultivar plantas de líneas importantes agronómicamente. O por el contrario, el polen de las plantas de estas líneas importantes se utiliza para polinizar las plantas regeneradas. Una planta transgénica de la presente invención que contiene un polipéptido deseado se cultiva utilizando métodos bien conocidos por un experto en la técnica.

15 Hay una variedad de métodos para la regeneración de plantas a partir de un tejido vegetal. El método particular de regeneración dependerá del tejido vegetal de partida y la especie particular de planta que se va a regenerar.

Los métodos para transformar dicotiledóneas se han publicado para el algodón, primariamente por el uso de Agrobacterium tumefaciens, y obteniendo plantas transgénicas (Patente de EE. UU Nº 5.159.135, Patente de EE. UU Nº 5.518.908); soja (Patente de EE. UU Nº 5.569.834, Patente de EE. UU

Nº 5.416.011, Mc Cabe y col., Biol. Technology 6: 923 (1988), Christou y col., Plant Physiol. 87: 671-674 (1988)); Brassica (Patente de EE. UU Nº 5.463.174); maní (Cheng y col., Plant Cell Rep. 15: 653-657 (1996), McKently y col.,

25 Plant Cell Rep. 14: 699-703 (1995)); papaya; y guisante (Grant y col., Plant Cell Rep. 15: 254-258, (1995)).

También se ha comunicado la transformación de monocotiledóneas utilizando la electroporación, bombardeo de partículas, y Agrobacterium. La transformación y la regeneración vegetal se han conseguido en espárragos (Bytebier y col., Proc. Natl. Acad. Sci. (EE. UU.) 84: 5354, (1987)); cebada (Wan y Lemaux, Plant Physiol. 104: 37 (1994)); Zea mays (Rhodes y col., Science 240: 204 (1988), Gordon-Kamm y col., Plant Cell 2: 603-618 (1990), Fromm y col., Biol. Technology 8: 833 (1990), Koziel y col., Biol. Technology 11: 194, (1993), Armstrong y col., Crop Science 35: 550-557 (1995)); avena (Somers y col., Biol. Technology 10: 1589 (1992)), pratenses (Horn y col., Plant Cell Rep.

7:469 (1988)); arroz (Toriyama y col., Thero. Appl. Genet. 205; 34, (1986); Part y col., Plant Mol. Biol. 32: 1135-1148, (1996); Abedinia y col., Aust. J. Plant Physiol. 25: 133-141 (1997); Zhang y Wu, Theor. Appl. Genet. 76: 835 (1988);

35 Zhang y col., Plant Cell Rep. 7: 379, (1988); Battraw y Hall, Plant Sci. 86: 191-202 (1992); Christou y col., Bio/Technology 9: 957 (1991)); centeno (De la Pena y col., Nature 325: 274 (1987)); caña de azúcar (Bower y Birch, Plant J. 2:409 (1992)); festucas altas (Wang y col., Biol. Technology 10: 691 (1992)), y trigo (Vasil y col., Bio/Technology 10: 667 (1992); Patente de EE. UU. Nº 5.631.152).

Los ensayos de expresión génica basados en la expresión transitoria de construcciones de ácido nucleico clonadas se han desarrollado introduciendo moléculas de ácido nucleico en las células vegetales por tratamiento con polietilenglicol, electroporación o bombardeo de partículas (Marcotte y col., Nature 335: 454-457 (1988); Marcotte y col., Plant Cell 1: 523-532 (1989); McCarty y col., Cell 66: 895-905 (1991); Hattori y col. Genes Dev. 6: 609-618 (1992); Goff y col., EMBO J. 9: 2517-2522 (1990)).

45 Los sistemas de expresión transitoria se pueden utilizar para disecar funcionalmente las construcciones genéticas (Véase, en general, Maliga y col., Methods in Plant Molecular Biology, Cold Spring Harbor Press (1995)). Se entiende que se puede introducir cualquiera de las moléculas de ácido nucleico de la presente invención en una célula vegetal de manera transitoria o permanente en combinación con otros elementos genéticos tales como vectores, promotores, potenciadores, etc.

Además de los procedimientos tratados anteriormente, los facultativos están familiarizados con los materiales de las fuentes de referencia que describen las condiciones específicas y los procedimientos para la construcción, manipulación y aislamiento de las macromoléculas (por ejemplo, moléculas de ADN, plásmidos, etc.), la generación

55 de organismos recombinantes y la selección y aislamiento de clones, (Véase Sambrook y col., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press (1989); Maliga y col., Methods in Plant Molecular Biology, Cold Spring Harbor Press (1995); Birren y col., Genome Analysis: Detectin Genes, 1, Cold Spring Harbor, Nueva York (1998); Birren y col., Genome Analysis: Analyzing DNA, 2, Cold Spring Harbor, Nueva York (1998); Plant Molecular Biology: A Laboratory Manual, eds. Clark, Springer, Nueva York (1997)).

En vista de lo anterior, la presente invención engloba también métodos para producir una enzima !8-desaturasa. Tales métodos comprenden las etapas de : 1) aislar una secuencia de nucleótidos que comprende la secuencia de nucleótidos SEC ID Nº 28 o que comprende al menos el 90% de la secuencia de nucleótidos SEC ID Nº 30, en el que la secuencia de nucleótidos codifica un polipéptido que tiene actividad !8-desaturasa; 2) construir un vector que 65 compendie dicha molécula de nucleótidos de la etapa 1) unida operativamente a una secuencia reguladora; y 3) introducir dicho vector en una célula huésped bajo condiciones y tiempo suficientes para la producción de la enzima

!8-desaturasa.

La presente invención también engloba métodos para producir ácidos grasos poliinsaturados. En un aspecto, el método implica: 1) aislar una secuencia de nucleótidos que comprenden la secuencia de nucleótidos SEC ID Nº 28 o 5 que comprende al menos el 90% de la secuencia de nucleótido SEC ID Nº 30, en donde la secuencia de nucleótidos codifica un polipéptido que tiene actividad !8-desaturasa; 2) construir un vector de expresión que comprende la secuencia de nucleótidos aislada de la etapa 1) unida operativamente a una secuencia reguladora; y 3) introducir dicho vector en una célula huésped durante un tiempo y bajo las condiciones suficientes para la producción de una enzima !8-desaturasa; y 4) exponer la enzima !8-desaturasa expresada a un sustrato seleccionado de entre el 10 grupo que consiste en ácido #6-eicosadienoico, ácido #3-eicosatrienoico o ambos ácidos #6-eicosadienoico y #3eicosatrienoico con el fin de convertir el sustrato en un primer producto ácido graso poliinsaturado. Ejemplos de un primer producto ácido graso poliinsaturado que se puede producir por este método son DGLA, #3-ETA o ambos DGLA y #3-ETA. Además, el método puede implicar también las etapas de exposición del primer producto ácido graso poliinsaturado a al menos una desaturasa o al menos una elongasa y, opcionalmente, repitiendo esta etapa 15 (principalmente, exponiendo el segundo o producto ácido graso poliinsaturado posterior a una desaturasa o elongasa (que puede ser la misma o diferente de cualquier desaturasa o elongasa utilizada previamente)) para convertir el primer producto ácido graso poliinsaturado (por ejemplo, DGLA y/o #3-ETA) en un segundo o posterior producto ácido graso poliinsaturado (por ejemplo, tercero, cuarto, quinto, sexto, etc.). Esta etapa se puede repetir tantas veces como sea necesario hasta que se obtenga el producto ácido graso poliinsaturado deseado. Por 20 ejemplo, si el primer producto ácido graso poliinsaturado es DGLA, el método puede además comprender la exposición del DGLA a una !5-desaturasa para producir ARA (un segundo producto ácido graso poliinsaturado). Opcionalmente, el ARA se puede entonces exponer a una !17-desaturasa para producir EPA (un tercer producto ácido graso poliinsaturado). Más opcionalmente, el EPA se puede exponer a !5-elongasa para producir DPA (un cuarto producto ácido graso poliinsaturado). Más opcionalmente, el DPA se puede exponer a una !4-desaturasa

25 para producir DHA (un quinto producto ácido graso poliinsaturado).

En otro aspecto el método implica: 1) aislar una secuencia de nucleótidos que comprende la secuencia de nucleótidos SEC ID Nº 28 o comprende al menos el 90% de la secuencia de nucleótidos SEC ID Nº 30, en la que la secuencia de nucleótidos codifica un polipéptido que tiene una actividad !8-desaturasa; 2) construir un vector de 30 expresión que comprende la secuencia de nucleótidos aislada de la etapa 1) unida operativamente a una secuencia reguladora; 3) introducir el vector de expresión de 2) y al menos una construcción de ADN recombinante adicional que comprende una secuencia de nucleótido aislada unida operativamente a al menos una secuencia reguladora que codifica una !9-elongasa (Véase por ejemplo, la Publicación de Patente de EE. UU. Nº 2008/0214667 que describe una secuencia de nucleótidos aislada que codifica una !9-elongasa) en una célula huésped; y 4) exponer la 35 enzima !8-desaturasa expresada y la !9-elongasa a unos sustratos seleccionados de entre el grupo que consiste en: LA, ALA o LA y ALA con el fin de convertir el sustrato en un primer producto ácido graso poliinsaturado. Ejemplos de un primer producto ácido graso poliinsaturado que se pueden producir por este método son DGLA, #3-ETA, o ambos DGLA y #3-ETA. Además, el método puede implicar las etapas de exponer el primer producto ácido graso poliinsaturado a al menos una desaturasa o al menos a una elongasa, y , opcionalmente , repetir esta etapa 40 (principalmente, exponiendo el segundo o posterior producto ácido graso poliinsaturado a una desaturasa o elongasa (que puede ser la misma o diferente de cualquier desaturasa o elongasa utilizada previamente)) para convertir el primer producto ácido graso poliinsaturado (por ejemplo, DGLA y/o #3-ETA) en un segundo o posterior (por ejemplo, tercero, cuarto, quinto, sexto, etc.) producto ácido graso poliinsaturado. Esta etapa se puede repetir tantas veces como sea necesario hasta que se obtenga el producto ácido graso poliinsaturado deseado. Por 45 ejemplo, si el primer producto ácido graso poliinsaturado es DGLA, el método puede además comprender la exposición del DGLA a una !5-desaturasa para producir ARA (un segundo producto ácido graso poliinsaturado). Opcionalmente, el ARA se puede entonces exponer a una !17-desaturasa para producir EPA (un tercer producto ácido graso poliinsaturado). Más opcionalmente, el EPA se puede exponer a !5-elongasa para producir DPA (un cuarto producto ácido graso poliinsaturado). Más opcionalmente, el DPA se puede exponer a una !4-desaturasa

50 para producir DHA (un quinto producto ácido graso poliinsaturado).

Por lo tanto, como se ejemplifica en la descripción anterior, la !8-desaturasa de la presente invención puede utilizarse en la producción de productos ácidos grasos que se pueden utilizar, a su vez, para fines particulares beneficiosos, o pueden utilizarse para la producción de otros ácidos grasos poliinsaturados.

D. Usos del gen 8-desaturasa

Como se señaló anteriormente, el gen !8-desaturasa aislado y la enzima !8-desaturasa codificada por el mismo tienen muchos usos. Por ejemplo, el gen y su correspondiente enzima se pueden utilizar en la producción de DGLA,

60 ARA, EPA, #3-ETrA, #3-ETA, DPA y/o DHA. Estos ácidos grasos poliinsaturados (es decir, los que se producen ya sea directamente o indirectamente por la actividad de la enzima !8-desaturasa) se pueden añadir, por ejemplo, a composiciones nutricionales, composiciones farmacéuticas, cosméticos, y alimentos animales. Estos usos se describen, en detalle, posteriormente.

E. Composiciones nutricionales

La presente divulgación incluye composiciones nutricionales. Tales composiciones, para los fines de la presente invención, incluyen cualquier alimento o preparación para el consumo humano incluyendo el consumo enteral o 5 parenteral, que cuando se toman, en el cuerpo (a) sirven para nutrir o para construir tejidos o como suplemento energético y/o (b) para mantener, restaurar o mantener el estado nutricional adecuado o las funciones metabólicas.

La composición nutricional de la presente divulgación comprende al menos un aceite o ácido producido directamente

o indirectamente por el uso del gen !8-desaturasa descrito en el presente documento, según la presente invención,

10 y puede estar bien en forma líquida o sólida. Adicionalmente, la composición puede incluir macronutrientes comestibles, vitaminas y minerales en cantidades deseadas para un uso particular. La cantidad de tales ingredientes variará dependiendo de si la composición se pretende utilizar en bebés normales, sanos, en niños o en adultos que tengan necesidades especiales tales como las que acompañan ciertas afecciones metabólicas (por ejemplo, trastornos metabólicos).

15 Los ejemplos de macronutrientes que se pueden añadir a la composición incluyen pero sin limitarse a estos, grasas comestibles, carbohidratos y proteínas. Ejemplos de tales grasas comestibles incluyen pero no se limitan a estas, aceite de coco, aceite de soja, y mono y diglicéridos. Ejemplos de tales carbohidratos incluyen pero sin limitarse a estos, glucosa, lactosa comestible y almidón hidrolizado. Adicionalmente, ejemplos de proteínas que se pueden

20 utilizar en la composición nutricional de la presente divulgación incluyen pero sin limitarse a estas, proteínas de soja, trigo electrodializado, leche desnatada electrodializada, suero de leche, o los hidrolizados de estas proteínas.

Con respecto a las vitaminas y minerales, a las composiciones nutricionales de la siguiente divulgación se pueden añadir los siguientes: calcio, fósforo, potasio, sodio, cloro, magnesio, manganeso, hierro, cobre, zinc, selenio, yodo,

25 y Vitaminas A, E, D, C, y el complejo B. También se pueden añadir otras vitaminas y minerales.

Los componentes utilizados en las composiciones nutricionales de la presente divulgación serán de origen semipurificado o purificado. Por semi-purificado o purificado se entiende un material que se ha preparado por purificación de un material natural o por síntesis.

30 Ejemplos de composiciones nutricionales de la presente divulgación incluyen pero sin limitarse a fórmulas de leche maternizada, suplementos alimentarios, sustitutos alimentarios, y composiciones de rehidratación. Las composiciones nutricionales de particular interés incluyen pero sin limitarse a estas, las que se utilizan para suplementación enteral y parenteral para bebés, especialmente fórmulas de leche maternizada, suplementos para

35 los ancianos, y suplementos para los que tienen dificultades gastrointestinales y/o malabsorción.

La composición nutricional de la presente divulgación también puede añadirse a los alimentos incluso cuando no se necesita la suplementación de la dieta. Por ejemplo, la composición se puede añadir a un alimento de cualquier tipo pero sin limitarse a margarinas, mantequillas modificadas, quesos, leche, yogur, chocolate, dulces, tentempiés,

40 aceites para la ensalada, grasas para cocinar, carnes, pescado y bebidas.

En una realización preferida de la presente divulgación, la composición nutricional es un producto nutricional enteral, más preferentemente un producto nutricional para adultos o pediátrico. Esta composición se puede administrar a adultos o niños que tienen estrés o que tienen necesidades especiales debido a estados de enfermedad agudos o

45 crónicos. La composición puede comprender, además de ácidos grasos poliinsaturados producidos según la presente invención, macronutrientes, vitaminas y minerales como se ha descrito anteriormente. Los macronutrientes pueden estar en cantidades equivalentes a las presentes en la leche humana o en base a la energía, es decir en base a las calorías.

50 Los métodos para formular fórmulas nutricionales líquidas o sólidas entéricas y parenterales son bien conocidos en la técnica.

La fórmula entérica por ejemplo, se puede esterilizar y utilizarla posteriormente en una base lista para consumir (RTF) o almacenarla como un líquido concentrado o en polvo. El polvo se puede preparar secando por aerosol la

55 fórmula preparada como se ha indicado anteriormente, y reconstituyéndola rehidratando el concentrado. Las fórmulas nutricionales para adultos y pediátrica son bien conocidas en la técnica y están disponibles comercialmente (por ejemplo, Similac®, Ensure®, Jevity® y Alimentum® de Ross Products Division, Abbott Laboratories, Columbus, Ohio). Un aceite o ácido producido según la presente invención se puede añadir a cualquiera de estas fórmulas.

60 La densidad energética de las composiciones nutricionales de la presente divulgación, cuando está en forma líquida, puede variar desde aproximadamente 0,6 Kcal a aproximadamente 3 Kcal por ml. Cuando está en forma sólida o en polvo, los suplementos nutricionales pueden contener desde aproximadamente 1,2 a más de 9 Kcal por gramo, preferentemente aproximadamente de 3 a 7 Kcal por g. En general, la osmolalidad de un producto líquido debería ser menos de 700 mOsm y, más preferentemente, menos de 660 mOsm.

65 La fórmula nutricional puede incluir macronutrientes, vitaminas, y minerales, como se señaló anteriormente, además del PUFA producido según la presente invención. La presencia de estos componentes adicionales ayuda a la ingesta individual de los requerimientos mínimos diarios de estos elementos. Además de proporcionar el PUFA, también puede ser deseable añadir a la composición, zinc, cobre, ácido fólico, y antioxidantes. Se cree que estas

5 sustancias refuerzan un sistema inmune estresado y por tanto proporcionará además beneficios al individuo que recibe la composición. También se puede suplementar una composición farmacéutica con estos elementos.

En una realización más preferida, la composición nutricional comprende, además de antioxidantes y al menos un PUFA, una fuente de carbohidratos en los que al menos el 5 por ciento en peso del carbohidrato es un oligosacárido

10 indigerible. En una realización más preferida, la composición nutricional comprende además proteínas, taurina, y carnitina.

Como se señaló anteriormente, los PUFA producidos según la presente invención, o los derivados de los mismos, pueden añadirse a un sustituto o suplemento alimentario, particularmente una fórmula de leche maternizada, para 15 pacientes sometidos a alimentación intravenosa o para prevenir o tratar la malnutrición u otras alteraciones o estados de enfermedad. Como antecedente, debería señalarse que la leche materna humana tiene un perfil de ácidos grasos que comprende desde aproximadamente el 0,15% a aproximadamente el 0,36% de DHA, desde aproximadamente el 0,03% a aproximadamente el 0,13% de EPA, desde aproximadamente el 0,30% a aproximadamente el 0,88% de ARA, desde aproximadamente el 0,22% a aproximadamente el 0,67% de DGLA, y 20 desde aproximadamente el 0,27% a aproximadamente el 1,04% de GLA. Por lo tanto, los ácidos grasos tales como ARA, EPA y/o DHA, producidos según la presente invención, se pueden utilizar para modificar, por ejemplo, la composición de leche materna humana o para modificar la presencia de los PUFA que se encuentran normalmente en la leche de un mamífero no humano. En particular, una composición para su uso en un suplemento farmacológico

o alimentario, particularmente un sustituto o suplemento de la leche materna, comprenderá preferentemente uno o

25 más de entre ARA, EPA, DGLA, y DHA. Más preferentemente, el aceite comprenderá desde aproximadamente del 0,3% al 30% de ARA, y desde aproximadamente el 0,2 al 30% de DGLA.

Las composiciones nutricionales parenterales que comprenden desde aproximadamente el 2 a aproximadamente el 30 por ciento en peso de ácidos grasos calculados como triglicéridos están englobadas en la presente invención.

30 Otras vitaminas, particularmente vitaminas liposolubles tales como la vitamina A, D, E, y L-carnitina se pueden incluir opcionalmente. Si se desea, se puede añadir un conservante tal como el alfa-tocoferol en una cantidad de aproximadamente un 0,1% en peso.

Además, la relación entre ARA y DGLA se puede adaptar a un particular uso final determinado. Cuando se formula

35 como un sustituto o suplemento de leche materna, se proporcionará una composición que comprenda uno o más de entre ARA, DGLA y GLA en una relación de aproximadamente 1:19:30 a aproximadamente 6:1:0,2, respectivamente. Por ejemplo, la leche materna de animales puede variar en las relaciones ARA: DGLA: GLA que varían de 1:19:30 a 6:1:0,2, que incluye relaciones intermedias que son preferentemente 1:1:1, 1:2:1, 1:1:4. Cuando se producen juntos en una célula huésped, el ajuste de la tasa y el tanto por ciento de conversión de un sustrato

40 precursor tal como EDA y DGLA en ARA se puede utilizar para controlar con precisión las relaciones de los PUFA. Por ejemplo, se puede utilizar una tasa de conversión del 5% al 10% de DGLA en ATA para producir una relación de ARA con respecto a DGLA de aproximadamente 1:19, mientras que se puede utilizar una tasa de conversión de aproximadamente el 75% al 80% para producir una relación de ARA con respecto a DGLA de aproximadamente 6:1. Por lo tanto, en un sistema de cultivo celular o en un animal huésped, la regulación del tiempo, la extensión y la

45 especificidad de la expresión de desaturasa, así como la expresión de elongasas (tales como, pero sin limitarse a la !9-elongasa) y otras desaturasas, se puede utilizar para modular los niveles y relaciones de los PUFA. Los PUFA/ácidos producidos de acuerdo con la presente invención (por ejemplo, ARA y EPA) se pueden entonces combinar con otros PUFA/ácidos (por ejemplo, DGLA) en las concentraciones y relaciones deseadas.

50 Adicionalmente, los PUFA producidos según la presente invención o las células huésped que los contienen pueden también utilizarse como suplementos alimentarios para modificar la composición de ácidos grasos de un tejido animal o la leche para dar un producto más deseable para el consumo animal o humano.

Ejemplos de algunos de los suplementos nutricionales, formulaciones de leche maternizada, sustitutos nutricionales

55 y otras soluciones nutricionales que emplean los ácidos grasos poliinsaturados siguiendo la presente invención se describen posteriormente.

I. FORMULACIONES DE LECHE MATERNIZADA

60 A. Isomil® Fórmula de Soja con Hierro:

Utilización: Como bebida para bebés, niños y adultos con alergia o sensibilidad a la leche de vaca. Un alimento para pacientes con trastornos en los que se debería evitar la lactosa: incluyendo la deficiencia de lactasa, intolerancia a la lactosa y galactosemia.

65 Características:

-

Proteína de soja aislada para evitar los síntomas de alergia o sensibilidad a la proteína de la leche de vaca. -Formulación libre de lactosa para evitar la diarrea asociada con la lactosa. 5 -Baja osmolalidad (200 mOsm/kg de agua). -Carbohidratos duales (jarabe de Maíz y sacarosa) diseñado para maximizar la absorción y minimizar el riesgo de malabsorción.

Ingredientes: un 43,2% de Sólidos de Jarabe de Maíz, un 14,6% de Aislado de Proteína de Soja, un 11,5% Aceite de Cártamo Alto en Oleico, un 10,3% Azúcar (Sacarosa), un 8,4% de Aceite de Soja, un 8,1% de Aceite de Coco; Menos del 2% de: Fosfato Cálcico, Citrato Potásico, Cloruro Potásico, Cloruro Sódico, Ácido Ascórbico, Cloruro de Colina. L-Metionina, Taurina, Palmitato Ascorbilo, Sulfato Ferroso, m-Inositol, Mezcla de Tocoferoles, Sulfato de Zinc, Acetato de d-Alfa-Tocoferol. L-Carnitina, Niacinamida, Pantotenato Cálcico, Sulfato Cúprico, Clorhidrato de Cloruro de Tiamina, Palmitato de Vitamina A, Riboflavina, Hidrocloruro de Piridoxina, Ácido Fólico, Yoduro Potásico,

15 Hidróxido Potásico, Filoquinona, Biotina, Selenato Sódico, Beta-Caroteno, Vitamina D3 y Cianocobalamina.

B. Isomil® DF Fórmula de Soja para diarrea:

Utilización: Para el manejo alimentario de la diarrea de bebés y niños pequeños.

Características:

-

Primera fórmula para bebés que contiene fibra alimentaria añadida de fibra de soja específicamente para el manejo de la diarrea 25 -Demostrado clínicamente que reduce la duración de las heces líquidas, blandas durante la diarrea media a grave

en bebés. -Formulación sin lactosa para evitar diarrea asociada a lactosa. -Baja osmolalidad (240 mOsm/kg de agua) para reducir el riesgo de diarrea osmótica.

Ingredientes: un 85,7% de agua, un 4,8% de jarabe de maíz, un 2,6% de azúcar (sacarosa), un 2,1% de aceite de soja, un 2,0% de aislado de proteína de soja, un 1,4% de aceite de coco, un 0,77% de fibra de soja, citrato cálcico, citrato potásico, fosfato cálcico, fosfato potásico, cloruro potásico, mono y diglicéridos, lecitina de soja, cloruro magnésico, carragenina, ácido ascórbico, L-metionina, cloruro sódico, cloruro de colina, taurina, sulfato ferroso, minositol, acetato de d-alfa-tocoferol, sulfato de zinc, L-carnitina, niacinamida, pantotenato cálcico, sulfato cúprico,

35 palmitato de vitamina A, clorhidrato de cloruro de tiamina, riboflavina, hidrocloruro de piridoxina, ácido fólico, sulfato magnésico, yoduro potásico, filoquinona, biotina, selenito sódico, vitamina D3 y cianocobalamina.

C. Isomil® Advance® Fórmula de Soja con hierro:

Utilización: Como bebida para bebés, niños y adultos con alergia o sensibilidad a la leche de vaca. Un alimento para pacientes con trastornos en los que se debería evitar la lactosa: incluyendo la deficiencia de lactasa, la intolerancia a la lactosa y la galactosemia.

Características:

45 -Contiene DHA y ARA, dos nutrientes que se encuentran en la leche materna importantes para el desarrollo mental y visual. -Aislado de proteína de soja para evitar los síntomas de alergia o sensibilidad a la proteína de la leche de vaca. -Formulación libre de lactosa para evitar la diarrea asociada con la lactosa. -Baja osmolalidad (200 mOsm/kg de agua). -Carbohidratos duales (jarabe de maíz y sacarosa) diseñados para maximizar la absorción y minimizar el riesgo de malabsorción.

Ingredientes: un 43,2% de Sólidos de Jarabe de Maíz, un 14,6% de Aislado de Proteína de Soja, un 11,5% de Aceite

55 de Cártamo Alto en Oleico, un 10,3% de Azúcar (Sacarosa), un 8,4% de Aceite de Soja, un 7,7% de Aceite de Coco, Aceite de C. cohnii, Aceite de M. alpina, Fosfato Cálcico, Citrato Potásico, Palmitato Potásico, Sulfato Ferroso, m-Inositol, Mezcla de Tocoferoles, Sulfato de Zinc, Acetato de d-Alfa-Tocoferol, L-Carnitina, Niacinamida, Pantotenato de Calcio, Sulfato Cúprico, Clorhidrato de Cloruro de Tiamina, Palmitato de Vitamina A, Riboflavina, Hidrocloruro de Piridoxina, Ácido Fólico, Yoduro Potásico, Hidróxido Potásico, Filoquinona, Biotina, Selenato Sódico, Beta-Caroteno, Vitamina D3 y Cianocobalamina.

D. Isomil® Advance® 20 Fórmula con Hierro Listo para tomar, 0,7 Cal/g:

Utilización: Cuando se desea una alimentación con soja.

65 Ingredientes: un 85,9% de agua, un 6,7% de jarabe de maíz, un 1,9% de aislado de proteína de soja, un 1,4% de aceite de cártamo alto en oleico, un 1,3% de azúcar (sacarosa), un 1,1% de aceite de soja, un 1.0% de aceite de coco, aceite de C. cohnii, aceite de M. alpina, citrato cálcico, fosfato cálcico, citrato potásico, cloruro potásico, mono y diglicéridos, lecitina de soja, carragenina, ácido ascórbico. L-metionina, cloruro magnésico, fosfato potásico, cloruro sódico, cloruro de colina, taurina, sulfato ferroso, m-inositol, acetato de d-alfa-tocoferol, sulfato de zinc, L

5 carnitina, niacinamida, Pantotenato cálcico, sulfato cúprico, palmitato de vitamina A, clorhidrato de cloruro de tiamina, riboflavina, hidrocloruro de piridoxina, ácido fólico, sulfato de manganeso, yoduro potásico, filoquinona, biotina, selenito sódico, vitamina D3 y cianocobalamina.

E. Similac® Fórmula de leche maternizada:

10 Utilización: Cuando se necesita una fórmula de leche maternizada: si se toma la decisión de interrumpir la lactancia natural antes del año de edad, si se necesita un suplemento de la lactancia natural o si no se adopta una rutina de lactancia natural. En polvo, líquido concentrado y formas listas para consumo.

15 Ingredientes: Agua, leche desnatada, lactosa, aceite de cártamo alto en oleico, aceite de soja, aceite de coco, concentrado de proteína de suero de leche, aceite de C. cohnii, aceite de M. alpina, citrato potásico, carbonato cálcico, ácido ascórbico, lecitina de soja, monoglicéridos, carragenina, cloruro potásico, cloruro magnésico, sulfato ferroso, cloruro de colina, bitartrato de colina, taurina, m-inositol, sulfato de zinc, niacinamida, acetato de d-alfatocoferol, pantotenato cálcico, L-carnitina, palmitato de vitamina A, riboflavina, sulfato cúprico, clorhidrato de cloruro

20 de tiamina, hidrocloruro de piridoxina, ácido fólico, sulfato de manganeso, filoquinona, biotina, beta-caroteno, selenito sódico, vitamina D3, cianocobalamina, fosfato cálcico, fosfato potásico, cloruro sódico, hidróxido potásico y nucleótidos (adenosina 5’-monofosfato, citidina 5’-monofosfato, guanosina 5’-monofosfato disódico, uridina 5’monofosfato disódico).

25 F. Similac® Avanced® Fórmula de leche maternizada con hierro:

Utilización: Para usarse como un suplemento o alternativo de la lactancia natural. En polvo, líquido concentrado y forma lista para el consumo.

30 Ingredientes: Agua, leche desnatada, lactosa, aceite de cártamo alto en oleico, aceite de soja, aceite de coco, concentrado de proteína de suero de leche, aceite de C. cohnii, aceite de M. alpina, citrato potásico, carbonato cálcico, ácido ascórbico, lecitina de soja, monoglicéridos, carragenina, cloruro potásico, cloruro magnésico, sulfato ferroso, cloruro de colina, bitartrato de colina, taurina, m-inositol, sulfato de zinc, niacinamida, acetato de d-alfatocoferol, pantotenato cálcico, L-carnitina, palmitato de vitamina A, riboflavina, sulfato cúprico, clorhidrato de cloruro

35 de tiamina, hidrocloruro de piridoxina, ácido fólico, sulfato de manganeso, filoquinona, biotina, beta-caroteno, selenito sódico, vitamina D3, cianocobalamina, fosfato cálcico, fosfato potásico, cloruro sódico, hidróxido potásico y nucleótidos (adenosina 5’-monofosfato, citidina 5’-monofosfato, guanosina 5’-monofosfato disódico, uridina 5’monofosfato disódico).

40 G. Similac® NeoSure® Advance® Fórmula de leche maternizada con Hierro:

Utilización: Una fórmula especial para alteraciones tales como el nacimiento prematuro.

Características:

45 -Mezcla de grasas de absorción buena que contienen un 25% añadido de triglicéridos de cadena media (MCT). -Más altos niveles de proteínas, vitaminas, y minerales por 100 cal que la fórmula de referencia. -Más calcio y fósforo que la fórmula de referencia

50 Ingredientes: leche desnatada, sólidos de jarabe de maíz, lactosa, aceite de soja, aceite de cártamo alto en oleico, concentrado de proteína de suero de leche, triglicéridos de cadena media, aceite de coco, aceite de C, cohnii, aceite de M. alpina, citrato potásico, fosfato cálcico, m-inositol, ácido ascórbico, cloruro magnésico, carbonato cálcico, taurina, sulfato ferroso, bitartrato de colina, cloruro de colina, ascorbil palmitato, L-carnitina, cloruro potásico, cloruro sódico, sulfato de zinc, mezcla de tocoferoles, acetato de d-alfa-tocoferol, citrato sódico, niacinamida, fosfato

55 potásico, pantotenato cálcico, sulfato cúprico, palmitato de vitamina A, clorhidrato de cloruro de tiamina, riboflavina, hidrocloruro de piridoxina, beta caroteno, ácido fólico, sulfato de manganeso, filoquinona, biotina, selenito sódico, vitamina D3, cianocobalamina, y nucleótidos (adenosina 5’-mopnofosfato, citidina 5’-monofosfato, guanosina 5’monofosfato disódico, uridina 5’-monofosfato disódico).

60 H. Similac Natural Care Advance Leche Humana Fortificada Baja en Hierro Lista para su Uso, 0,85 Cal/g:

Utilización: Diseñado para mezclarse con leche humana o para alimentar alternativamente con leche humana a bebés con bajo peso al nacimiento.

65 Ingredientes: Agua, leche desnatada, sólidos de jarabe de maíz, lactosa, triglicéridos de cadena media, concentrado de proteína de suero, aceite de soja, aceite de coco, aceite de C. cohnii, aceite de M. alpina, fosfato cálcico, citrato potásico, ácido ascórbico, carbonato cálcico, cloruro magnésico, lecitina de soja, mono y diglicéridos, m-inositol, citrato sódico, carragenina, bitartrato de colina, taurina, cloruro de colina, niacinamida, acetato de d-alfa-tocoferol, L

5 carnitina, sulfato de zinc, cloruro potásico, fosfato potásico dibásico, pantotenato cálcico, sulfato ferroso, sulfato cúprico, riboflavina, palmitato de vitamina A, clorhidrato de cloruro de tiamina, hidrocloruro de piridoxina, biotina, ácido fólico, beta caroteno, sulfato de manganeso, filoquinona, vitamina D3, selenito sódico, cianocobalamina y nucleótidos (adenosina 5’-mopnofosfato, citidina 5’-monofosfato, guanosina 5’-monofosfato disódico, uridina 5’monofosfato disódico).

Los distintos PUFA producidos según la presente invención se pueden sustituir y/o añadir en las fórmulas de leche maternizada descritas anteriormente y a otras fórmulas de leche maternizada conocidas en la técnica.

II. FORMULACIONES NUTRICIONALES 15

A. ENSURE®

Utilización: ENSURE, rico de sabor cremoso proporciona una fuente de nutrientes completa y equilibrada para el uso como suplemento entre o con las comidas y temporalmente como única fuente alimentaria. ENSURE puede beneficiar a las personas que tienen riesgos nutricionales, que tienen pérdida de peso involuntaria, recuperación de una enfermedad o cirugía, o para dietas modificadas o de bajo residuo. Para alimentación vía oral. Para única fuente de alimentación temporalmente. Producto vendido como suplemento nutricional por vía oral. Ingredientes: Agua, Azúcar (Sacarosa), Maltodextrina de Maíz, Aislado de Proteínas de Leche, Aceite de Soja, Aceite de maíz, Aceite de Colza, Concentrado de Proteína de Soja, Citrato Potásico, Saborizantes Naturales y Artificiales, Fosfato Magnésico,

25 Citrato Sódico, Lecitina de Soja, Fosfato Cálcico, Cloruro Magnésico, Sal (Cloruro Sódico), Cloruro de Colina, Carragenina, Ácido Ascórbico, Acetato de dl-Alfa-Tocoferol, Sulfato Ferroso, Sulfato de Zinc, Niacinamida, Pantotenato Cálcico, Sulfato de Manganeso, Sulfato Cúprico, Palmitato de Vitamina A, Clorhidrato de Cloruro deTiamina, Hidrocloruro de Piridoxina, Riboflavina, Ácido Fólico, Cloruro Crómico, Biotina, Molibdato Sódico, Selenato Sódico, Filoquinona, Yoduro Potásico, Vitamina D3 y Cianocobalamina.

B. ENSURE® ALTO EN PROTEÍNAS:

Utilización: ENSURE ALTO EN PROTEÍNAS es útil para las personas que necesitan un extra de proteínas ynutrición en su dieta. ENSURE ALTO EN PROTEÍNAS es adecuado para uso por personas en recuperación de una

35 cirugía general o de cadera u otras fracturas óseas, y es una buena fuente de nutrición para aquellos que tienen o están en riesgo de úlceras por presión. Para nutrición oral suplementaria. Ingredientes: Agua, Azúcar (sacarosa), Maltodextrina de Maíz, Caseinatos de Calcio y Sodio, Aceite de Soja, Aislado de Proteína de Soja, Aceite de Maíz, Citrato Potásico, Aceite de Colza, Fosfato Cálcico, Citrato Sódico, Cloruro Magnésico, Fosfato Magnésico, Saborizantes Artificiales, Sal (Cloruro Sódico) Lecitina de Soja, Cloruro de Colina, Ácido Ascórbico, Carragenina, Sulfato de Zinc, Acetato de d-Alfa-Tocoferol, Sulfato Férrico, Goma Gellan, Niacinamida, Pantotenato Cálcico, Sulfato De Manganeso, Sulfato Cúprico, Palmitato de Vitamina A, Clorhidrato de Cloruro de Tiamina, Hidrocloruro de Piridoxina, Riboflavina, Ácido Fólico, Cloruro Crómico, Biotina, Molibdato Sódico, Yoduro Potásico, Selenato Sódico, Filoquinona, Vitamina D3 y Cianocobalamina.

45 C. ENSURE PLUS®

Utilización: ENSURE PLUS es una fuente de nutrición completa y equilibrada que proporciona calorías y proteínas concentradas para ayudar a los pacientes a ganar o mantener un peso saludable. Se puede utilizar con o entre las comidas o como un sustituto de la comida. Para alimentación oral. Fuente única de alimento temporalmente. Para pacientes con restricciones de fluidos o que necesitan alimentación limitada en volumen.

Características:

-

650 mg de ácido graso omega-3 ALA (40% de 1,6 g RDI) para mantener la salud cardíaca.

55 -Fuente excelente de 24 vitaminas esenciales y minerales. -Fuente de antioxidantes, selenio y vitaminas C y E para fortalecer el sistema inmunológico. -Bajo en colesterol. -Kosher. -Libre de gluten. -Libre de lactosa.

Ingredientes: Vainilla: Agua, Jarabe de Maíz, Maltodextrina (Maíz), Aceite de Maíz, Caseinatos de Sodio y Calcio, Azúcar (Sacarosa), Aislado de Proteína de Soja, Cloruro Magnésico, Citrato Potásico, Fosfato Dibásico de Calcio, Lecitina de Soja, Saborizantes Naturales y Artificiales, Citrato Sódico, Cloruro Potásico, Cloruro de Colina, Ácido 65 Ascórbico, Carragenina, Sulfato de Zinc, Sulfato Ferroso, Acetato de Alfa-Tocoferol, Niacinamida, Pantotenato Cálcico, Sulfato Manganeso, Sulfato Cúprico, Clorhidrato de Cloruro de Tiamina, Hidrocloruro de Piridoxina,

Riboflavina, Palmitato de Vitamina A, Ácido Fólico, Biotina, Cloruro Crómico, Molibdato de Sodio, Yoduro Potásico, Selenito Sódico, Filoquinona, Cianocobalamina y Vitamina D3.

D. ENSURE® EN POLVO:

5 Utilización: ENSURE® EN POLVO (reconstituido con agua) es una nutrición completa y equilibrada para su uso como suplemento con o entre las comidas. Puede beneficiar a las personas con dietas modificadas, en riesgo nutricional, que experimentan pérdida de peso involuntaria, se están recuperando de una enfermedad o cirugía o en dietas baja en residuos.

Características:

-Práctico, fácil de mezclar. -Bajo residuo.

15 - Libre de lactosa y gluten.

Ingredientes: Jarabe de Maíz, Maltodextrina de Maíz, Azúcar (Sacarosa), Aceite de Maíz, Caseinatos Sódico y Cálcico, Aislado de Proteína de Soja, Saborizante Artificial, Citrato Potásico, Cloruro Magnésico, Citrato Sódico, Fosfato Cálcico, Cloruro Potásico, Lecitina de Soja, Ácido Ascórbico, Cloruro de Colina, Sulfato de Zinc, Acetato de dl-Alfa-Tocoferol, Niacinamida, Sulfato Ferroso, Pantotenato Cálcico, Sulfato de Manganeso, Sulfato Cúprico, Clorhidrato de Cloruro de Tiamina, Hidrocloruro de Piridoxina, Riboflavina, Palmitato de Vitamina A, Ácido Fólico, Biotina, Cloruro Crómico, Molibdato Sódico, Yoduro Potásico, Selenato Sódico, Filoquinona, Cianocobalamina y Vitamina D3.

25 E. ENSURE® PUDIN

Utilización: ENSURE PUDIN es una alternativa nutricional a otros tentempiés o postres. Proporciona una nutrición completa, equilibrada en una forma deliciosa y fácil de comer. Es apropiado para aquellos con bajo peso o malnutridos, o que necesitan una dieta con restricción de fluidos o de volumen limitado. Para personas con dietas de consistencia modificada (por ejemplo, blanda, en puré, o totalmente líquida). Para personas con incapacidad para masticar. Para nutrición oral suplementaria.

Características:

35 -Buena fuente de 24 vitaminas y minerales esenciales. -Práctico -no necesita refrigeración. -Libre de gluten. -Incluye 1 g de FOS por ración (los FOS son prebióticos que estimulan el crecimiento bacteriano beneficioso en el colon).

Ingredientes:

Vainilla: Agua, Azúcar (Sacarosa), Almidón de Maíz Modificado, Aceite de Soja Parcialmente Hidrogenado, Concentrado de Proteína de Leche, Leche Desnatada, Fructooligosacáridos, Sulfato Magnésico, Fosfato

45 Potásico, Fosfato Sódico, Lactilato de Stearoilo Sódico, Saborizante Artificial, Ascorbato Sódico, Sulfato De Zinc, Acetato de dl-Alfa-Tocoferol, Sulfato Ferroso, Niacinamida, Sulfato de Manganeso, Pantotenato Cálcico, FD y C Amarillo nº 5 y nº 6, Sulfato Cúprico, Clorhidrato de Cloruro de Tiamina, Hidrocloruro de Piridoxina, Palmitato de Vitamina A, Riboflavina, Ácido Fólico, Cloruro Crómico, Biotina, Molibdato Sódico, Yoduro Potásico, Selenato Sódico, Filoquinona, Vitamina D3 y Cianocobalamina.

F. ENSURE® CON FIBRA

Utilización: ENSURE CON FIBRA es una fuente de nutrición completa. equilibrada para personas que se pueden beneficiar de la fibra alimentaria y el aumento de nutrientes. La mezcla de fibra con FOS, un prebiótico, ayuda a

55 mantener la salud del tracto digestivo. ENSURE CON FIBRA es adecuado para personas que no requieren una dieta de bajo residuo. Se puede administrar por vía oral o por tubo. ENSURE CON FIBRA puede beneficiar las personas que tienen dietas modificadas, están en riesgo nutricional, están experimentando pérdida de peso involuntaria, o se están recuperando de una enfermedad o una cirugía. Para alimentación vía oral. Para fuente única de alimento temporalmente.

Características:

-

Incluye 1 g de FOS / 226,8 g de fibra FOS (carbohidratos no digestibles) ayuda a potenciar las defensas naturales en el colon. 65 -Excelente fuente de 24 vitaminas y minerales esenciales.

-

Proporciona 2,8 g de la fibra alimentaria total por cada ración de 226,8 g.

-

Libre de lactosa y gluten.

5 Ingredientes:

Vainilla: Agua, Maltodextrina de Maíz, Azúcar (Sacarosa), Caseinatos de Sodio y Calcio, Aceite de Soja, Aislado de Proteína de Soja, Aceite de Maíz, Fibra de Avena, Fructooligosacáricos, Aceite de Colza, Fibra de Soja, Fosfato Cálcico, Cloruro Magnésico, Citrato Potásico, Gel de Celulosa, Lecitina De Soja, Fosfato Potásico,

10 Citrato Sódico, Saborizantes Naturales y Artificiales, Cloruro de Colina, Fosfato Magnésico, Ácido Ascórbico, Goma de Celulosa, Cloruro Potásico, Carragenina, Sulfato Ferroso, Acetato de dl-Alfa-Tocoferol, Sulfato de Zinc, Niacinamida, Sulfato de Manganeso, Pantotenato de Calcio, Sulfato Cúprico, Palmitato de Vitamina A,Clorhidrato de Cloruro de Tiamina, Hidrocloruro de Piridoxina, Riboflavina, Ácido Fólico, Cloruro Crómico, Biotina, Molibdato Sódico, Yoduro Potásico, Selenato Sódico, Filoquinona, Vitamina D3 y Cianocobalamina.

15 Los distintos suplementos nutricionales descritos anteriormente y conocidos por otros expertos en la técnica se pueden sustituir y/o suplementar con los PUFA producidos según la presente invención.

G. OxepaTM Producto Nutricional

20 Está clínicamente demostrado que OxepaTM modula la respuesta inflamatoria en enfermos críticos, pacientes ventilados artificialmente. Es apropiado para pacientes que tienen sepsis, SIRS (síndrome sistémico de respuesta inflamatoria), ALI (lesión pulmonar aguda), o ARDS (síndrome de insuficiencia respiratoria aguda). Para alimentación por sonda. Para nutrición de fuente única.

25 0165 Distribución calórica: La distribución de calorías en Oxepa se muestra en la Tabla C.

Tabla C. Distribución calórica de Oxepa

por 226,8 g por litro % de Cal.

Calorías 355 1.500 ---

Grasa (g) 22,2 93, 55,2

Carbohidratos (g) 25 105,3 28,1

Proteína (g) 14,8 62,5 16,7

Agua (g) 186 785 --

30 Ingredientes: Agua, Caseinatos de Sodio Y Calcio, Azúcar (Sacarosa), Aceite de Colza, Triglicéridos de Cadena Media, Aceite de Sardinas, Aceite de Borraja, Cloruro Magnésico, Fosfato Cálcico, Lecitina de Soja, Citrato Potásico, Citrato Sódico, Ácido Ascórbico, Fosfato Potásico, Saborizante Natural Y Artificial, Cloruro de Colina, Taurina, Acetato de d-Alfa-Tocoferol, L-Carnitina, Sal (Cloruro Sódico), Goma Gellan, Sulfato de Zinc, Sulfato Ferroso, Niacinamida, Pantotenato Cálcico, Sulfato de Manganeso, Sulfato Cúprico, Clorhidrato de Cloruro de Tiamina,

35 Hidrocloruro de Piridoxina, Riboflavina, Beta Caroteno, Palmitato de Vitamina A, Ácido Fólico, Cloruro Crómico, Biotina, Molibdato Sódico, Yoduro Potásico, Selenato Sódico, Filoquinona, Vitamina D3 Y Cianocobalamina.

Los distintos ácidos grasos componentes de OxepaTM producto nutricional se pueden sustituir y/o suplementar con los PUFA producidos según esta invención.

F. Composiciones farmacéuticas

La presente divulgación también engloba una composición farmacéutica que comprende uno o más de los ácidos y/o aceites resultantes producidos utilizando el gen de la !8-desaturasa descrito en el presente documento, según los

45 métodos descritos en el presente documento. Más específicamente, tal composición farmacéutica puede comprender uno o más de los ácidos y/o aceites así como con un excipiente, adyuvante o vehículo de referencia, bien conocido, no tóxico, farmacéuticamente aceptable tal como, por ejemplo, solución de fosfato tamponada, agua, etanol, polioles, aceites vegetales, un agente humectante o una emulsión tal como una emulsión de aceite/agua. La composición puede estar en forma líquida o sólida. Por ejemplo, la composición puede estar en forma de

50 comprimido, cápsula, líquido o polvo para ingerir, inyectable, o una crema o ungüento tópico. Se puede mantener una fluidez apropiada, por ejemplo, manteniendo el tamaño necesario de las partículas en el caso de dispersiones y por el uso de tensioactivos. Puede también ser deseable incluir agentes isotónicos, por ejemplo, azúcares, cloruro sódico y similares. Además de tales diluyentes inertes, la composición también puede incluir adyuvantes, tales como agentes humectantes, emulsionantes y suspensores, agentes edulcorantes, agentes saborizantes y agentes

55 aromatizantes.

Las suspensiones, además de los principios activos, pueden comprender agentes suspensores tales como, por ejemplo, alcoholes isoestearílicos etoxilados, polioxietilen sorbitol y ésteres de sorbitán, celulosa microcristalina, metahidróxido de aluminio, bentonita, agar-agar y tragacanto o mezclas de estas sustancias.

Las formas sólidas de dosificación tales como comprimidos y cápsulas se pueden preparar utilizando técnicas bien conocidas en la técnica. Por ejemplo, los PUFA producidos de acuerdo con la presente invención pueden comprimirse con bases convencionales de comprimidos tales como lactosa, sacarosa y almidón de maíz en combinación con aglutinantes tales como la goma arábiga, almidón de maíz o gelatina, agentes desintegrantes tales

5 como el almidón de patata o el ácido algínico, y un lubricante tal como el ácido esteárico o el estearato magnésico. Las cápsulas se pueden preparar incorporando estos excipientes en cápsula de gelatina junto con antioxidantes y el PUFA relevante. El antioxidante y PUFA que lo componen se deben ajustar con las instrucciones presentadas anteriormente.

Para la administración intravenosa, los PUFA producidos de acuerdo con la presente invención o derivados de los mismos se puede incorporar en las formulaciones comerciales tales como IntralipidsTM. El perfil típico de ácidos grasos en el plasma de un adulto normal comprende de un 6,64 a un 9,46% de ARA, de un 1,45 a un 3,11% de DGLA, y de un 0,02 a un 0,08% de GLA. Estos PUFA o sus precursores metabólicos se pueden administrar solos o en combinación con otros PUFA con el fin de conseguir el perfil normal de ácidos grasos en un paciente. Cuando se

15 desea, los componentes individuales de las formulaciones pueden proporcionarse individualmente, en forma de kit, para un solo uso o para múltiples usos. Una dosificación típica de un ácido graso particular es desde 0,1 mg a 20 g (hasta 100 g) diariamente y es preferible desde 10 mg a 1, 2, 5, o 10 g al día.

Las vías de administración posibles de las composiciones farmacéuticas de la presente divulgación incluyen, por ejemplo, la entérica (por ejemplo vía oral y rectal) y la parenteral. Por ejemplo, una preparación líquida se puede administrar, por ejemplo, por vía oral o rectal. Adicionalmente, se puede dispersar completamente una mezcla homogénea en agua, mezclada bajo condiciones de esterilidad con diluyentes, conservantes, tampones o propelentes aceptables fisiológicamente con el fin de formar un aerosol o un inhalador.

25 La vía de administración, por supuesto, dependerá del efecto deseado. Por ejemplo, si la composición se va a utilizar para tratar la piel áspera, seca o envejecida, para tratar lesiones de la piel o quemaduras, o para tratar la piel

o el pelo afectado por una enfermedad o afección, puede quizás aplicarse tópicamente.

La dosificación de la composición que se administra a un paciente puede determinarla alguien experto en la técnica y depende de varios factores tales como el peso del paciente, la edad del paciente, el estado inmunitario del paciente, etc.

Con respecto a la forma, la composición puede ser, por ejemplo, una solución, una dispersión, una suspensión, una emulsión o un polvo estéril que luego se reconstituye.

35 La presente divulgación también incluye el tratamiento de varios trastornos por el uso de las composiciones farmacéutica y/o nutricional descritas en el presente documento. En particular, las composiciones de la presente divulgación se pueden utilizar para tratar la restenosis después de la angioplastia. Además, se pueden tratar también los síntomas de inflamación, artritis reumatoide, asma y psoriasis con las composiciones de la presente divulgación. Las pruebas también indican que los PUFA pueden estar implicados en el metabolismo del calcio; por lo tanto las composiciones de la presente divulgación pueden quizá, utilizarse en el tratamiento o prevención de osteoporosis y de los cálculos del tracto urinario.

Adicionalmente, las composiciones de la presente divulgación también se pueden utilizar en el tratamiento del

45 cáncer. Se ha demostrado que las células malignas tienen composiciones alteradas de ácidos grasos. La adición de ácidos grasos se ha demostrado que enlentecen su crecimiento, producen la muerte celular e incrementan su susceptibilidad a los agentes terapéuticos. Además, las composiciones de la presente divulgación también pueden ser útiles en el tratamiento de la caquexia asociada con el cáncer.

Las composiciones de la presente divulgación pueden también utilizarse en el tratamiento de la diabetes (Véase Patente de EE. UU. Nº 4.826.877 y Horrobin DF y col., (1993) Am J. Clin. Nutr. Vol. 57 (Supl) 7325 -7375). Se ha demostrado la alteración del metabolismo de ácidos grasos y la composición en animales diabéticos.

Además, las composiciones de la presente divulgación, que comprenden los PUFA producidos sea directamente o

55 indirectamente por medio del uso de la enzima !8-desaturasa, pueden utilizarse también en el tratamiento del eczema, en la reducción de la presión sanguínea, y en la mejoría de las valoraciones matemáticas de exámenes. Además, las composiciones de la presente divulgación se pueden utilizar en la inhibición de la agregación plaquetaria, la inducción de la vasodilatación, la reducción de los niveles de colesterol, la inhibición de la proliferación de la musculatura lisa de la pared vascular y el tejido fibroso (Brenner y col., (1976) Adv. Exp. Med. Biol. Vol. 83, p. 85-101), la reducción o prevención de sangrado gastrointestinal y otros efectos secundarios de los fármacos antiinflamatorios no esteroides (Véase la Patente de EE. UU. Nº 4.666.701) la prevención o el tratamiento e endometriosis y síndrome premenstrual (Véase la Patente de EE. UU. Nº 4.758.592) y en el tratamiento de encefalomielitis miálgica y fatiga crónica después de infecciones víricas (Véase la Patente de EE.UU. Nº 5.116.871).

65 Otros usos de las composiciones de la presente divulgación incluyen su uso en el tratamiento del SIDA, esclerosis múltiple, y trastornos inflamatorios de la piel, así como para el mantenimiento de la salud general.

Adicionalmente, la composición de la presente divulgación se puede utilizar con fines cosméticos. Se puede añadir a composiciones cosméticas pre-existentes tal que se forma una mezcla o se utiliza como una única composición.

G. Aplicaciones veterinarias

5 Debería señalarse que las composiciones farmacéuticas y nutricionales descritas anteriormente pueden utilizarse en conexión con animales (es decir, domésticos o no domésticos), así como con seres humanos, ya que los animales experimentan muchas de las mismas necesidades y afecciones que los seres humanos. Por ejemplo, el aceite o los ácidos de la presente divulgación se pueden utilizar en un suplemento alimentario para animales o en acuicultura,

10 como sustitutos de la alimentación animal, vitaminas para animales o en ungüentos tópicos para animales.

Ejemplo 1

Diseño de oligonucleótidos degenerados para el aislamiento de una !8-desaturasa de Emiliana huxleyi CCMP 378 y 15 construcción de la biblioteca de ADNc

0183 El análisis de la composición de los ácidos grasos de algunas algas marinas reveló la presencia de una cantidad considerable de ácido docosahexaenoico (DHA, 22:6 n-3) (40% por peso de lípidos totales) en Emiliana huxleyi CCMP 378 (Véase la Tabla 1). Además, este organismo presentaba intermediarios de la ruta alterativa ‘!820 desaturasa/ !9-elongasa’ (Véase la Figura 1), lo que indicaba que esta ruta estaba activa en estos organismos. Por lo tanto, es predecible que este organismo contenía una !9-elongasa activa capaz de convertir el ácido linoleico (LA,

18:2 n-6) en ácido eicosadienoico (EDA 20:2 n-6), o el ácido alfa-linolénico (ALA, 18:3 n-3) en ácido eicosatrienoico (ETrA, 20:3 n-3), así como una !8-desaturasa activa que convertía el ácido eicosadienoico (EDA, 20:2 n-6) en ácido dihomo-gamma-linolénico (DGLA, 20:3 n-6), o el ácido #3-eicosatrienoico (#3-ETrA, 20:3 n-3) en #3

25 eicosatetraenoico (#3-ETA, 20:4 n-3) (Véase la Figura 1).

Tabla 1

Perfil de ácidos grasos de Emiliana huxleyi CCMP 378

Ácido graso

% Total de lípidos

18:0

0,23

18:1 n-9

2,98

18:2 n-6

1,05

18:3 n-6

0,13

18:3 n-3

3,58

18:4 n-3

14,03

20:2 n-6

0,10

20:3 n-6

0,09

20:4 n-6

0,11

20:3 n-3

6,21

20:4 n-3

0,18

20:5 n-3

1,30

22:4 n-6

0,08

22:5 n-6

0,12

22:4 n-3

0,11

22:5 n-3

1,09

22:6 n-3

40,88

La meta de este estudio era aislar el gen predicho de la !8-desaturasa de longitud completa a partir de Emiliana

huxleyi CCCMP 378 y verificar su funcionalidad por la expresión en Saccharomyces cerevisiae. Para hacer esto, se 30 construyó una biblioteca de ADNc para Emiliana huxleyi CCMP 378. Los aglomerados celulares de Emiliana huxleyi

CCMP 378 se obtuvieron de Provasoli-Guillard-National Center for Marine Phytoplankton (CCMP-Bigelow

Laboratories, West Boothbay, Maine) Se purificó el ARN total a partir de estos utilizando el kit RNeasy Maxi Qiagen

(Qiagen, Valencia, CA) según el protocolo del fabricante. En resumen, los aglomerados celulares congelados se

machacaron en nitrógeno líquido utilizando un mortero y un pilón, se suspendieron en tampón RLT (kit RNeasy Mini 35 Qiagen), y se pasó a través de QiaShredder. El ARN se purificó utilizando las columnas RNeasy maxi según el

protocolo del fabricante.

Se construyeron las bibliotecas primaria y normalizada de Emiliana huxleyi CCMP 378 con el Agencourt Biosciences (Waltham, MA), utilizando su tecnología registrada. El Agencourt utiliza varias etapas únicas y registradas que durante la primera cadena da lugar finalmente a un 25 a 30% de aumento de eficacia sobre las técnicas que se usan normalmente. Durante el proceso registrado, el ARN se transcribe inversamente en ADNss utilizando unas 5 condiciones diseñadas para reducir o eliminar los acontecimientos de cebado internos. La combinación de esto y un programa de ciclos especializado aumentan el número de clones de longitud completa. Después de sintetizar la segunda cadena, los clones de ADNc se seleccionan por su tamaño hasta los mayores de 1,2 kb para descender a la clonación preferencial de ADNc pequeños, truncados. Para la biblioteca de inserción grande, se selecciona el tamaño de la inserción gt;4 kb para potenciar la inserción de clones más grande. A continuación de la selección por tamaño, los extremos de ADNc se pulen y los ADNc se digieren utilizando un corte enzimático infrecuente. Una enzima de restricción “cortadora infrecuente” y el sitio en el cual se introduce en los clones durante la etapa de cebado de ADNc, se utilizan entonces para preparar los clones por clonación direccional en el vector pAGEN. La enzima de restricción “cortadora infrecuente” es 20 veces menos probable que corte en los clones de ADNc, dando lugar a muchos más clones de longitud completa en comparación con otros procesos de construcción de bibliotecas

15 de ADNc, que utilizan enzimas de restricción más comunes que cortan a intervalos aleatorios a lo largo del clon. El resultado es una inserción con un extremo 5’ romo y un 3’ protuberante creado con la enzima de restricción cortadora infrecuente. Debido a este proceso, no se necesita ningún adaptador de unión adicional para asegurar la clonación direccional. Esto mejora toda la eficacia del proceso de clonación. El vector se manipula especialmente para clonación direccional sin utilizar adaptadores 5’, además de aumentar la eficacia de transformación debido a un número reducido de manipulaciones del ADNc durante la clonación. Después de que la biblioteca de ADNc primaria está completa, se ensaya para ver el número de clones independientes, el porcentaje de clones recombinantes y la media del tamaño de la inserción.

El proceso de normalización se inicia dividiendo la biblioteca de referencia en dos poblaciones. La primera población

25 se linealiza y se transcribe a partir del ADNc en ARN, incorporando nucleótidos biotinilados. La segunda población se hace en plásmido ADN de cadena única por medio de producción de fagémidos. La doble cadena de ADN en el lisado celular se digiere con ADNasa I. Esto elimina la contaminación con ADN bicatenario en el plásmido de la preparación de ADN de una cadena.

Las dos poblaciones se mezclan entonces, y cualquiera de los clones sobre representados del plásmido ADNss se hibridarán con sus parejas de la población del ARN biotinilado. Agencourt utiliza oligos dT y cebadores de extensión para pre-bloquear la región del poliA antes de la hibridación. Esto previene la hibridación del clon poli-A y el poli-U del ARN. Utilizando un procedimiento de extracción con estreptavidina /fenol, se eliminan todos los pares biotinilados hibridados y los ARN linealizados biotinilados, dejando así detrás los plásmidos ADN bajo-representados de cadena

35 sencilla. Utilizando un oligo que se hibride solamente con los clones que contienen la inserción, la síntesis de ADN se ceba para re-crear los clones ADNc de doble cadena. Los clones entonces se transforman en bacterias apara crear la biblioteca de ADNc normalizada terminada. Utilizando este protocolo, se generó una biblioteca ADNc normalizada con un título de 2,5 x 107 ufc/ml, el número total de colonias que se obtuvieron era 1,8 x 108, con un tamaño medio de la inserción de 1, 05 kb.

Para aislar los candidatos similares a !8-desaturasa de la biblioteca, se diseñaron oligonucleótidos degenerados (es decir, cebadores) que codificaban aminoácidos patrón conservados presentes en !8-desaturasa conocidas. Estos cebadores se utilizaron entonces en una reacción PCR para identificar fragmentos de ADN que contienen estas regiones conservadas en la !8-desaturasa supuesta.

45 Se utilizaron las secuencias de aminoácidos conocidas de !8-desaturasa de los siguientes organismos para el alineamiento y el diseño de cebadores: Euglena gracialis (Nº de Registro AF139720, SEC ID Nº 1; Figura 3 A), Pavlova lutheri CCMP 459 (Documento WO 2007/127381A2, SEC ID Nº 2, Figura 3B), Pavlova salina (Nº de Registro DQ995518, SEC ID Nº 3, Figura 4A), Perkinsus marinus (Nº de Registro DQ508730, SEC ID Nº 4; Figura 4B) y Acanthamoeba castellani (Nº de Registro CS608483, SEC ID Nº; Figura 4C).

Los cebadores degenerados utilizados fueron los siguientes:

Patrón Proteico 1: (SEC ID Nº 38):

55 NH3-RD AT D/E A/Q F E/M S/V Y/M H –COOH Cebador RO 1714 (directo) (SEC ID Nº 6):

5’-CGC GAC GCG ACG GAS SMG TTC RWG KYK WWS CAC-3’

Este cebador contenía el patrón de secuencia conservado del supuesto dominio citocromo b5.

Patrón Proteico 2: (SEC ID Nº 39):

NH3-GW L A/S H D Y/I L/S H H–COOH 65 Cebador RO 1715 (directo) (SEC ID Nº 7)

5’-GGC TGG CTT KCK CAC GAC WWC YYG CAT CAC – 3’

Este cebador contiene la secuencia patrón conservada ‘caja de histidina 1’. Patrón Proteico 3: SEC ID Nº 40); 5 NH3 –W K/R A/L R H N T/A H H – COOH

Cebador RO 1716 (Directo) (SEC ID Nº 8)

5’ – TGG MRS SYG CGC CAT AAC RCG CAC CAC GTG KSC AGC AAC – 3’

Este cebador contiene la secuencia patrón conservada ‘caja de histidina 2’.

Patrón proteico 4: (SEC ID Nº 41):

15 NH3–F A/G T A/G I/V V V F A T H Y –COOH

Cebador RO 1717 (Inverso) (SEC ID Nº 9)

5’ – ATA GTG GGT TGC AAA GAC AAC SAY SSC CGT CSC GAA – 3’

Patrón Proteico 5: (SEC ID Nº 42):

NH3 –Q I/T E H H L F P T/M M P –COOH

25 Cebador RO 1718 (Inverso) (SEC ID Nº 10)

5’ – GGG CAT SRT GGG GAA GAG GTG ATG CTC GRT CTG – 3’

Este cebador contenía la secuencia patrón conservada ‘caja de histidina 3’

La MixBase de definición estándar para la síntesis de oligonucleótidos era: K=G,T; R=A,G; S=C,G; M=A,C; W=A,C;

Y=C,T; B=C,G,T; H=A,C,T; V=A,C,G; D=A,T,C; X=A,C,G,T.

Ejemplo 2

35 Aislamiento de un supuesto gen !8-desaturasa de Emiliana huxleyi CCMP 378

Para aislar un gen de !8-desaturasa de Emiliana, se utilizaron varias permutaciones y combinaciones de los oligonucleótidos degenerados mencionados anteriormente (Véase el Ejemplo 1) en las reacciones PCR. La amplificación PCR se llevó a cabo en un volumen de 50 %l que contenía: 2 %l del ADN plásmido aislado a partir de la biblioteca normalizada de ADNc como matriz, 1x tampón de PCR menos MgCl2 (Tris-HCl 20 mM, pH 8,4, KCl 50 mM), MgSO4 1,5 mM, 200 %M de cada dNTP, 2 pmoles de cada cebador y ADN polimerasa platinum Taq (Invitrogen). Se llevó a cabo la amplificación de la manera siguiente: Una desnaturalización inicial a 94 ºC / 3 min, después 35 ciclos siguientes (94 ºC / 30 segundos; 55 ºC / 30 segundos; 72 ºC / 1 minuto), una extensión final a 72

45 ºC / 5 minutos, y la reacción se terminó a 4 ºC. Toda la reacción PCR se purificó utilizando el kit de limpieza de reacción MinElute Qiagen (Qiagen Valencia, CA) y se redisolvió la reacción en gel de agarosa a 0,8T. Las bandas de tamaño apropiado (basándose en las !8-desaturasas conocidas) se purificaron en gel utilizando el kit de extracción en gel QiaQuick (Qiagen), y los fragmentos de ADN se clonaron en el vector de clonación TOPO-TA (Invitrogen, Carlsbad, CA), según el protocolo del fabricante. Los plásmidos recombinantes se transformaron en células TOP 10 supercompetentes (Invitrogen, Carlsbad, CA), y se secuenciaron los clones. De los varios grupos que se ensayaron, la combinación de cebadores que generaba fragmentos de ADN con similitud de secuencia a las !8-desaturasas conocidas fueron solamente RO 1715 y RO 1717.

Se aisló así un clon que mostraba homología de secuencia con las !8-desaturasas identificadas previamente. Este

55 clon (ED3-8) tenía una longitud de 531 pb y su secuencia de aminoácidos deducida derivada presentaba una identidad de secuencia del 62% con la !8-desaturasa de Pavlova lutheri CCMP 459 (Véase el documento WO 2007/127381A2, SEC ID Nº 2: Figura 3B) como la coincidencia con valor más alto en la búsqueda BLAST. El ADN y la secuencia de aminoácidos deducidos de este clon se ha indicado (SEC ID Nos 11 y 12; Figuras 5 y 6, respectivamente).

Para aislar el extremo 5’ del ED3-8, se llevó a cabo la amplificación por PCR utilizando el plásmido ADN purificado de la biblioteca de ADNc como matriz y los oligonucleótidos (cebadores): RO 1720 (SEC ID Nº 13) (5’ – GAT CAC CGG GCT GTT GCG CAC GAA G – 3’) y RO 899 (SEC ID Nº 14) (5’ -AGC GGA TAA CAA TTT CAC ACA GGA AAC AGC – 3’). El cebador RO 1720 se diseñó basándose en el fragmento ED3-8 de esta supuesta !8-desaturasa, 65 y el cebador RO 899 correspondía a la secuencia del vector pAGEN que se utilizó para la preparación de la

biblioteca ADNc. Se llevó a cabo la amplificación utilizando 10 pmol de cada cebador, 1 %l de matriz de ADN, 1,5 %l de MgSO4 50 mM, 1x tampón PCR (Qiagen), 0,5x solución potenciadora (concentración final), 1 %l de dNTP 10 mM, y 0,5 %l de ADN polimerasa Taq platino (Qiagen) en un volumen final de 50 %l según las instrucciones del fabricante. Las muestras se desnaturalizaron inicialmente a 94 ºC durante 2 minutos, después 35 ciclos como se muestra a

5 continuación: 94 ºC durante 45 segundos, 55 ºC durante 30 segundos, 68 ºC durante 1 minuto. Se llevó a cabo un ciclo final de extensión a 68 ºC durante 7 minutos antes de que se terminara la reacción a 4 ºC. Los fragmentos de PCR se redisolvieron en un gel de agarosa al 0,8% y se purificó en gel utilizando el kit de extracción en gel Mini-Elute de Qiagen. Los fragmentos de ADN se clonaron en el vector de clonación TOPO-TA (Invitrogen). Los plásmidos recombinantes se transformaron en células TOP10 supercompetentes (Invitrogen), y se secuenciaron los clones.

El clon PK15 que contenía una inserción de 692 pb (SEC ID Nº 15; Figura 7A) que se identificó que contenía el extremo 5’ del gen de la supuesta !8-desaturasa basándose en la homología de secuencia de aminoácidos con !8desaturasas conocidas y la presencia del codón de inicio ‘ATG’ ‘Met’. Se ha indicado la secuencia de aminoácidos

15 codificada de este clon PK15 que contiene el extremo 5’ de la supuesta !8-desaturasa (SEC ID Nº 16; Figura 7B).

Para aislar el extremo 3’ de esta !8-desaturasa de Emiliana huxleyi se utilizaron los siguientes cebadores:

Cebadores directos RO 1719 (SEC ID Nº 17):

5’ –GTA CCA GTG GCT GCT GCT GAC GAT G –3’

o Cebadores directos RO 1724 (SEC ID Nº 18): 25 5’ – CTG GCG CTT CGA GTC GAT GCA GTA CCT – 3’

o

Cebadores directos RO 1727 (SEC ID Nº 19):

5’ – CTT CGT GCG CAA CAG CCC GGT GTAT C – 3’

y Cebador inverso RO 898 (SEC ID Nº 20): 35 5’ – CCC AGTACAC GAC GTT GTA AAA CGA CGG CCA G – 3’

Los cebadores RO 1719, RO 1724 y RO 1727 se diseñaron basándose en la secuencia del fragmento ED3-8 identificado anteriormente. El RO 898 se diseñó basándose en la secuencia del vector pAGEN utilizado para la construcción de la biblioteca de ADNc, indicada para amplificar por PCR el extremo 3’ de la !8-desaturasa de la biblioteca ADNc. Se utilizaron las mismas condiciones de PCR que las descritas para el aislamiento del extremo 5’ de ED3-8. Sin embargo, ninguno de los productos PCR generados así contenía el extremo 3’ de la supuesta !8desaturasa ED3-8.

45 Se llevó a cabo también la PCR utilizando la enzima Taq platinum de alta fidelidad (HF) (Invitrogen) según las especificaciones del fabricante utilizando 1x tampón HF PCR (concentración final) que se proporciona, 10 pmol de cada cebador, 1 %l de matriz de ADN, 1,5 %l de MgSO4 50 mM, 1 %l de dNTP 10 mM, y 0,5 %l ADN polimerasa Taq HF platinum (Qiagen) con un volumen final de 50 %l. Las muestras se desnaturalizaron inicialmente a 94 ºC durante 2 minutos, seguido por 30 ciclos de la manera siguiente: 94 ºC durante 30 segundos, 55 ºC durante 30 segundos, 68 ºC durante 2 minutos. Se llevó a cabo un ciclo final de extensión a 68 ºC durante 7 minutos antes de que se terminara la reacción a 4 ºC. Sin embargo, no se generó de esta forma ningún producto PCR que contuviera el extremo 3’ de la supuesta !8-desaturasa ED3-8.

Se llevó a cabo una amplificación PCR final utilizando los cebadores RO 1727 y RO 898 con ADN polimerasa

55 AccuPrime pfx (Invitrogen) según el protocolo del fabricante. La reacción PCR incluía 2 %l de la biblioteca de ADNc como matriz ADN, 1x de tampón AccuPrime Pfx a una concentración final, 20 pmol de cada cebador y 1 %l de ADN polimerasa AccuPrime pfx en un volumen total de reacción de 50 %l. Las muestras se desnaturalizaron inicialmente a 95 ºC durante 2 minutos, seguida por 30 ciclos de la manera siguiente: 95 ºC durante 15 segundos, 55 ºC durante 30 segundos, 68 ºC durante 1 minuto. La reacción se terminó a 4 ºC. Sin embargo, ningún producto PCR así generado contenía el extremo 3’ del ED3-8 de la supuesta !8-desaturasa.

Entonces se procedió a una nueva estrategia para aislar el extremo 3’ del gen de la supuesta !8-desaturasa, ED3-8. Se llevó a cabo la RACE (Amplificación rápida de extremos de ADNc) utilizando el kit Gene Racer (Invitrogen) para aislar el extremo 3’. Se utilizaron 5 %g de ARN total aislado de Emiliana, junto con el cebador oligo dT Gene Racer 65 (5’ – GCT GTC AAC GAT ACG CTA CGT AAC GGC ATG ACA GTG (T) 24 – 3’ (SEC ID Nº 43)) para generar una

primera cadena de ADNc según las especificaciones del fabricante.

Se llevó a cabo la amplificación PCR del ADNc preparado por RACE, generado anteriormente, utilizando 30 pmol del cebador 3’ Gene Racer (5’ – GCT GTC AAC GAT ACG CTA CGT AAC G – 3’ (SEC ID Nº 22)) y 10 pmol del cebador 5 directo RO 1724 (SEC ID Nº 18) que era específico de la supuesta !8-desaturasa (ED3-8), según las especificaciones del fabricante. La reacción PCR contenía 2 %l de matriz ADNc, 1c tampón PCR HF (Invitrogen), 1 %l de dNTP 10 mM, 2 %l de MgSO4 50 mM, 0,5 %l de ADN polimerasa Taq HF platinum junto con los cebadores mencionados anteriormente en un volumen total de reacción de 50 %l. La amplificación PCR se llevó a cabo de la siguiente manera: desnaturalización inicial a 94 ºC / 2 minutos; 5 ciclos de desnaturalización a 94 ºC / 30 segundos; 10 una extensión a 72 ºC / 1 minuto; 5 ciclos de desnaturalización a 94 ºC / 30 segundos; extensión a 70 ºC / 1 minuto; 20 ciclos de desnaturalización a 94 ºC / 30 segundos; extensión final a 65 ºC / 10 minutos; se terminó la reacción a 4 ºC. Los análisis de los productos de la PCR revelaron muchas bandas débiles, probablemente debido a la baja proporción del gen en el grupo de ADNc. Se llevó a cabo por tanto la PCR anidada utilizando 1 %l de la reacción PCR generada anteriormente como matriz. junto con 10 pmoles del cebador génico específico RO 1719 (SEC ID Nº

15 17) y 10 pmoles del cebador anidado 3’ Gene Racer (5’ – CGC TAC GTA ACG GCA TGA CAG TG – 3’ (SEC ID Nº 23)). La reacción PCR fue idéntica a la que se describió para la reacción primaria con la matriz ADNc preparada con el RACE (anteriormente). Las condiciones de amplificación fueron las siguientes: desnaturalización a 94 ºC / 2 minutos; 25 ciclos de desnaturalización a 94 ºC / 30 segundos, hibridación a 65 ºC / 30 segundos, extensión a 68 ºC / 1 minuto; extensión final a 69 ºC / 10 minutos y la reacción se terminó a 4 ºC. Los análisis de los fragmentos PCR

20 en un gel de agarosa al 0,8% revelaron la presencia de bandas distintivas. Estas se purificaron en gel utilizando el kit de extracción en gel Mini-elute de Qiagen. Los extremos de los fragmentos de ADN se llenaron utilizando T4 polimerasa y los fragmentos resultantes con extremos romos se clonaron en el vector de clonación TOPO-blunt (Invitrogen). Los plásmidos recombinantes se transformaron en células TOP10 supercompetentes (Invitrogen), y se secuenciaron los clones. La secuenciación reveló una inserción de 589 pb (SEC ID Nº 24; Figura 8A) que codificaba

25 la secuencia de aminoácidos (SEC ID Nos 25 y 44-46; Figura 8B) que contenía el extremo 3’ supuesto de ED3-8, basándose en la homología de secuencia de aminoácidos con las !8-desaturasas conocidas y la presencia del codón de parada ‘TAG’ y la cola poliA.

El gen de longitud completa de la supuesta !8-desaturasa, ED3-8, se aisló por amplificación PCR utilizando los 30 siguientes cebadores:

RO 1736 (SEC ID Nº 26) (directo, que contiene el codón de inicio ATG (en negrita) y un sitio de clonación EcoRI (subrayado) 5’ – AAA GAA TTC ATG GGC AAG GGC GGC AAC GCG AAC C – 3’

35 RO 173 (SEC ID Nº 27): (inverso que contiene el codón de parada TGA (en negrita) y un sitio de clonación HindIII (subrayado) 5’ – AAA SSG CTT CTA GTG CGG CAT CTC TGC CCA CTC G – 3’

Las matrices que se utilizaron en la reacción PCR incluyen tanto el ADNc preparado con RACE como el ADN aislado 40 de la biblioteca normalizada de ADNc de Emiliana, de la manera siguiente:

Condiciones PCR

Matriz biblioteca ADNc (2 %l) ADNc preparado RACE (1 %l) 10 X Mezcla Accuprime Pfx Rxn (Tampón 1): 5 ul 5 ul Cebador 1 (10 pmol/ul): 2 ul 2 ul Cebador 2 (10 pmol/ul): 2 ul 2 ul Accuprime Pfx pol (Invitrogen): 1 ul 1 ul Agua: 38 ul 39 ul Total: 50 ul 50 ul

45 Se llevó a cabo la amplificación de la manera siguiente: una desnaturalización inicial a 95 ºC / 2 minutos; 30 ciclos de (desnaturalización 95 ºC / 15 segundos; hibridación a 55 ºC / 30 segundos; extensión 68 ºC / 1,5 minutos); extensión final a 68 ºC / 4 minutos; se terminó la reacción a 4 ºC. La PCR dio como resultado una banda única de & 1254 pb, la cual se clonó en el vector TOPO-Blunt (Invitrogen) según el protocolo del fabricante. Ambas matrices dieron como resultado la misma banda de tamaño de ADN. La secuenciación del producto PCR obtenido (ED3-8

50 EP2-5) a partir de la utilización de la biblioteca de ADNc como matriz, reveló la secuencia de 1254 pb del gen completo de la supuesta !8-desaturasa de Emiliana huxleyi CCMP 378 (SEC ID Nº 28; Figura 9), que codifica una proteína que contiene 417 aminoácidos (SEC ID Nº 29; Figura 10). Este gen se designó ED3-8, y se utilizó en los estudios de expresión.

55 Además del ED3-8, se identificaron variantes adicionales de clones durante la secuenciación que presentaban algunas variaciones de secuencia en ciertas regiones del gen de longitud completa (Véase la Tabla 2). Estas variaciones estaban causadas probablemente por mutaciones que ocurren comúnmente durante el proceso de amplificación PCR, debido a la baja especificidad de la ADN polimerasa utilizada. Los clones también se obtuvieron cuando se utilizada la biblioteca ADNc como matriz (designada ED3-8-EP-x) o cuando se utilizaba el ADNc preparado con RACE como matriz (designado como ED3-8-ER-x). Estos genes también se evaluaron en cuanto a su actividad !8-desaturasa, de la forma que se describió para el clon original ED3-8.

La secuencia de nucleótidos que codifica la !8-desaturasa ED3-8 se clonó en el vector de clonación pUC57 y se designó pRSP61. Este vector se depositó en la Colección Americana de Tipos de Cultivo (ATCC), 10801 Bulevar Universidad, Manassas, VA 20110 bajo los términos el Tratado de Budapest el 09 de septiembre de 2008 y se ha acordado un número de designación de patente ATCC PTA-9477.

Tabla 2

Variantes de clones que presentan cambios en sus secuencias de aminoácidos codificadas en comparación con la proteína codificada por ED3-8

Nombre del Clon

Secuencia / Cambio del codón Variación en los aminoácidos

ED3-8-EP-1-4

C73 ∃ T73 / CAT ∃ TAT A674 ∃ G674 / AAC ∃ AGC A1001 ∃ T1001 / CAC ∃ CTC C1230 ∃T1230 / GGC ∃ GGT H25 ∃ Y25 N224 ∃ S224 H334 ∃ L334 G410 ∃ G410 (Silente)

ED3-8-EP-2-1

T65 ∃ C65 / GTC ∃ GCC C73 ∃ T73 / CAT ∃ TAT A674 ∃ G674 / AAC ∃ AGC A1001 ∃ T1001 / CAC ∃ CTC A1037 ∃G1037 / AAC ∃ AGC V22 ∃ A22 H25 ∃ Y25 N224 ∃ S224 H334 ∃ L334 N346 ∃ S346

ED3-8-ER-3-4

C73 ∃ T73 / CAT ∃ TAT T84 ∃ C84 / GCT ∃ GCC A674 ∃ G674 / AAC ∃ AGC A698 ∃ G698 / AAC ∃ AGC A1001 ∃ T1001 / CAC ∃ CTC G1059∃ A1059 / TCA ∃ TCA H25 ∃ Y25 A28 ∃ A28 (Silente) N224 ∃ S224 N233 ∃ S233 H334 ∃ L334 S353 ∃ S353 (Silente)

ED3-8-ER-4-6

C73 ∃ T73 / CAT ∃ TAT A674 ∃ G674 / AAC ∃ AGC T851 ∃ C851 / GTC ∃ GCC A1001 ∃ T1001 / CAC ∃ CTC H25 ∃ Y25 N224 ∃ S224 V284 ∃ A284 H334 ∃ L334

10 El análisis de Blast revelaba que la secuencia de aminoácidos codificada por el gen de longitud completa ED3-8 (SEC ID Nº 29) mostraba una homología de secuencia de aminoácidos más alta con las !8-desaturasas conocidas. Estas incluían las !8-desaturasa de Pavlova lutheri CCMP459 ((SEC ID Nº 2; Figura 3B), Pavlova salina (SEC ID Nº 3; Figura 4A), Perkinsus marinus (SEC ID Nº 4, Figura 4B) y Euglena gracialis (SEC ID Nº 1; Figura 3A). Esta

15 proteína codificada muestra una secuencia de identidad de aminoácidos más alta (52,3%) con la !8-desaturasa de Pavlova lutheri. También contiene las tres cajas de histidina conservadas que se encuentran en todas las desaturasas de unión a membrana conocidas (Okuley, y col. (1994) The Plant Cell 6: 147-158; Pereira SK y col. (2003) Prostaglandins Leukit Essent Fatty Acids, 68:97-106), que se sabe que son esenciales para la actividad enzimática (Sayanova O y col. (2001) J Exp Bot, 52:1581-1585; Sayanova O y col. (2000) Biochem Soc. Trans. 28;

20 636 – 638). Las cajas de histidina conservadas en la proteína codificada por ED3-8 estaban presentes en las posiciones de aminoácidos 155-160 (HDYLH (SEC ID Nº 32)), 197-201 (HNTHH (SEC ID Nº 33)), y 355-359 (QTEHH (SEC ID Nº 34)) (Véase la Figura 2). Esta secuencia también contiene un dominio similar al citocromo b5 en el extremo 5’, con el patrón conservado de enlace Hemo HPGG (aminoácido de la posiciones 38-41) (Véase la Figura 2). El contenido total de G+C en este gen es & 65%.

Ejemplo 3

Caracterización de la actividad enzimática de la supuesta !8-desaturasa codificada por el gen ED3-8.

30 El gen ED3-8 que codifica la supuesta !8-desaturasa se clonó en los sitios EcoRI/HindIII del vector de expresión en levaduras pYX242 (Novagen) para generar el clon pRSP60, que se transformó entonces en la cepa SC334 de Saccharomyces cerevisiae competente. La transformación de las levaduras se llevó a cabo utilizando el kit de transformación de levaduras álcali-catión (QBioGen) de acuerdo con las condiciones especificadas por el fabricante. Los transformantes se seleccionaron por auxotropía de leucina en medios carentes de leucina (DOB [-Leu]).

35 Para determinar la actividad desaturasa específica de la enzima codificada por ED3-8, se cultivaron transformantes en presencia de sustratos específicos de ácidos grasos 50 %M (enumerados posteriormente) y se utilizó la conversión en productos específicos para determinar la especificidad de sustrato:

Para la actividad de 8-desaturasas:

Ácido eicosadienoico (EDA, 20:2 n-6) ∃ ácido dihomo-gamma-linolénico (DGLA, 20:3 n-6) Ácido eicosatrienoico (ETrA, 20:3 n-3) ∃ ácido #3-eicosatetraenoico (#3-ETA, 20:4 n-3) 5

Para la actividad de !6-desaturasa:

Ácido linoleico (18:2 n-6) ∃ ácido gamma-linolénico (GLA, 18:3 n-6) Ácido alfa-linolénico (18:3 n-3) ∃ ácido estearidónico (SDA, 18:4 n-3)

10 Para la actividad de !5-desaturasa:

Ácido dihomo-gamma-linolénico (20:3 n-6) ∃ ácido araquidónico (ARA, 20:4 n-6)

Ácido #3-eicosatetraenoico (#3-ETA, 20:4 n-3) ∃ ácido eicosapentaenoico (EPA, 20:5 n-3)

15 Para la actividad de la !4-desaturasa:

Ácido #6-adrénico (ADA, 22:4 n-6) ∃ ácido #6-docosapentaenoico (#6-DPA, 22:5 n-6)

Ácido #3-docosapentaenoico (#3-DPA, 22:5 n-3) ∃ ácido docosahexaenoico (DHA, 22:6 n-3)

20 La cepa de control negativo consistía en el vector pYX242 expresado en S. cerevisiae 334.

Las colonias transformadas aisladas por selección en medio DOB [-Leu] se cultivaron durante una noche en 10 ml de caldo líquido YPD a 30 ºC, con agitación vigorosa. Entonces se añadieron a 5 ml del cultivo de una noche a 45 ml de medio selectivo (DOB [-Leu]) que contenía 50 o 25 %M (concentración final) de varios sustratos de ácidos grasos

25 (como se especifican), y se agitaron vigorosamente (250 rpm) durante 48 a 72 horas (como se indica) a 24 ºC.

Para la extracción total de lípidos, las células de levadura se precipitaron por centrifugación a 2000 rpm/ 15 minutos y se añadieron 0,5 ml de agua, se centrifugaron las muestras, a continuación se añadieron 10 ml de metanol removiendo suavemente. Entonces se añadieron 20 ml de cloroformo, las muestras se removieron durante un

30 minuto a alta velocidad y se dejaron estar durante 2 horas a temperatura ambiente. Luego se añadieron 6 ml de solución salina a la muestra y a continuación se centrifugó a 2200 rpm durante 10 minutos. La capa superior de cloroformo se retiró a un vial limpio/seco de 20 ml y se evaporó el cloroformo hasta que se secó a 40 ºC bajo una corriente de nitrógeno. Una vez que los disolventes se habían evaporado completamente, se añadieron 2 ml de cloroformo a cada vial y loas muestras se derivaron.

35 Para la derivación de los lípidos a metil ésteres de ácidos grasos (FAME), en cada tubo se añadieron 100 %l de Triheptadecanoina (17,216 %g /100 %l) de referencia interna. El cloroformo se evaporó hasta sequedad bajo nitrógeno a 40 ºC, se añadieron 2 ml de trifluoruro de boro en metanol al 14%, y a continuación se añadieron 2 gotas ( 50 %l) de Tolueno. Cada vial se llenó con nitrógeno, y se calentaron durante 15 minutos a 95 ºC. Después de que

40 se enfriaran, se añadieron 2 ml de solución salina y se extrajeron los lípidos con 4 ml de hexano por agitado vigoroso durante un minuto. El extracto en hexano se transfirió a un tubo de 20 ml seco/limpio con tapa de rosca, se añadieron 5 ml de di-H2O y se removió la muestra, y se centrifugó a 1500 rpm durante 4 minutos. El hexano lavado se transfirió entones a un tubo de reactivo de 20 ml. Se evaporó el hexano hasta que se secó y cada muestra se reconstituyó con 0,5 ml de hexano nuevo. El hexano final reconstituido se removió para dispersar los lípidos. La

45 muestra entera entonces se cargó en los viales del automuestreador GC y se inyectaron 4 %l para analizarlos. El GC se calibró con el nuChek Std. 461.

El porcentaje de conversión del sustrato para el producto se calculó utilizando la fórmula:

La Tabla 3 representa la actividad enzimática de la proteína codificada por ED3-8 basándose en el porcentaje de conversión del sustrato añadido. El clon pRSP60 que contiene el gen ED3-8 de Emiliana convirtió el 1,68% de sustrato de EDA (20:2 n-6) en DGLA (20:3 n-6), y el 0,58% de sustrato ETrA (20:3 n-3) en ETA (20:4 n-3). Esto

55 indicaba que el gen ED3-8 codifica una !8-desaturasa que puede reconocer tanto los sustratos de ácidos grasos n-6 y n-3, con una preferencia por el sustrato n-6, EDA. No se detectó ninguna actividad de fondo (conversión no específica del sustrato) con el control que tenía solo el vector (Véase la Tabla 2). La enzima codificada por ED3-8 no tenía actividad sobre ninguno de los otros sustratos ensayados (datos no mostrados), indicando que no tenían actividad de !6-, !5-o !4-desaturasa.

Tabla 3

Actividad !8-desaturasa de la proteína codificada por ED3-8 expresada en Saccharomyces cerevisiae

% del Total de ácidos grasos

pRSP60 (ED3-8 + pYX242 pYX242

EDA (20:2 n-6, !11,14)a

6,91 5,10

DGLA (20:3 n-6, !8, 11,14)b

0,118 0

% de Conversión c

1,68 --

ETrA (20:3 n-3, !11, 14, 17)a

6,82 8,55

ETA (20:4 n-3, !8, 11, 14, 17)b

0,04 0

% de Conversión c

0,58 -

a Cultivos que crecen en presencia de 50 %M de sustrato a 24 ºC durante 48 h. Los números representan una media de 3 experimentos diferentes.b Cantidad de producto formadoc % de Conversión = ([producto] / {[producto] + [sustrato]}) x 100

Además, las otras variantes de las proteínas codificadas por ED3-8 (Véase la Tabla 2) se expresaron en S. cerevisiae bajo las mismas condiciones de cultivo (Véase la tabla 4). Los resultados indican que las variantes tenían 5 baja actividad !8-desaturasa o ninguna actividad en comparación con la proteína original codificada por ED3-8. Por lo tanto un cambio menor en la secuencia de aminoácidos de ED3-8 puede influir en la actividad enzimática, dependiendo de su localización. Es posible que estos cambios afecten los centros catalíticos de la enzima, o la estabilidad de la enzima resultando en una actividad más baja. Como aún no se ha descifrado la estructura cristalina de estas desaturasas de unión de membrana, no es posible predecir cada región de la enzima que es esencial para

10 la actividad enzimática. Se sabe bien que las regiones caja de histidina y la región citocromo b5 son esenciales para la actividad. Sin embargo ninguna de estas variantes de ED3-8 tienen cambios en las cajas de histidina o en las regiones citocromo b5 (Véase la Tabla 2). Por tanto se identificaron regiones adicionales en esta !8-desaturasa codificada por ED3-8 que eran importantes para la actividad enzimática.

Tabla 4

Actividad !8-desaturasa de variantes ED3-8 expresadas en Saccharomyces cerevisiae

Clon

% Conversión a (20:2 n-6b 20:3 n-6)

EP3-8-EP1-4

0,90

EP3-8-EP2-1

0

EP3-8-ER3-4

0,37

EP3-8-ER4-6

0,49

vector pYX242

0

b % Conversión = ([producto] / {[producto] + [sustrato]}) x 100b Los cultivos crecieron en presencia de 50 %M de sustrato a 24 ºC durante 48 h.

15 Como la actividad de !8-desaturasa de ED3-8 era menor bajo las condiciones de cultivo ensayadas, las condiciones de cultivo se modificaron para determinar si la actividad podía mejorarse de alguna manera, sea cambiando al cantidad de sustrato añadido o cambiando la temperatura o el tiempo durante la expresión. Por lo tanto se cultivó un cultivo de levadura transformada por pRSP60 en presencia de 25 %M de sustrato a 24 ºC durante 48 o, bien 50 %M o

20 25 %M de sustrato a 20 ºC durante 72 horas. La Tabla 5 indica que los cambios en las condiciones de cultivo puede mejorar la expresión en las levaduras. El porcentaje de conversión del sustrato en producto aumentaba desde & 1,7% a & 4,5%.

Tabla 5

Actividad !8-desaturasa de ED3-8 (pRSP60) cuando se expresa en Saccharomyces cerevisiae bajo diferentes condiciones de cultivo

Condiciones para la expresión de pRSP60

Sustrato a 20:2 n-6 Producto a 20:3 n-6 % Conversión b

50 %M de sustrato a 24 ºC durante 48 h

6,91 0,118 1,68%

25 %M de sustrato a 24 ºC durante 48 h

8,77 0,164 1,83%

Actividad !8-desaturasa de ED3-8 (pRSP60) cuando se expresa en Saccharomyces cerevisiae bajo diferentes condiciones de cultivo

Condiciones para la expresión de pRSP60

Sustrato a 20:2 n-6 Producto a 20:3 n-6 % Conversión b

50 %M de sustrato a 20 ºC durante 72 h

12,05 0,535 4,2%

25 %M de sustrato a 20 ºC durante 72 h

6,283 0,368 5,53%

a Los números representan el porcentaje del total de ácidos grasos. Media de 3 experimentos diferentes b % Conversión = ([producto] / {[producto] + [sustrato]}) x 100

Ejemplo 4

5 Optimización de Codón de ED3-8 y expresión de su proteína codificada en Saccharomyces cerevisiae

Como el contenido de G + C de ED3-8 es alto ( 65%), podría contarse posiblemente entre las causas de la relativamente baja actividad !8-desaturasa que muestra la expresión en levaduras. Por tanto el uso del codón por ED3-8 de la !8-desaturasa de Emiliana huxleyi CCMP 378 (SEC ID Nº 28; Figura 9) se optimizó para la expresión

10 en Saccharomyces cerevisiae. El patrón de uso del codón de Saccharomyces cerevisiae se determinó por la base de datos de tablas de uso de codones (Véase Nakamura, Y. Gojobori, T. e Ikemura, T. (2000) Nucl. Acids Res. 28,292) y se aplicó a la secuencia del gen ED3-8 utilizando el programa Vector NTI (Invitrogen). Se modificaron 412 pb del total de 1254 pb de la región codificante (&33%) para alinear el uso del codón con el de Saccharomyces cerevisiae, Además se eliminó un sitio interno HindIII para facilitar la clonación del gen en el sitio HindIII del sitio de

15 clonación múltiple de varios vectores de expresión. Así, se transformaron un total de 414 pb de los 1.254 pb de la región codificante. La nueva secuencia con el codón optimizado compartía un 66,98% de identidad de secuencia con la secuencia del gen ED3-8. Ninguna de las modificaciones en el gen con el codón optimizado produjo un cambio en la secuencia de aminoácidos de la proteína codificada (SEC ID Nº 29; Figura 10). Además, se añadió ‘AAA’ 5’ al codón de inicio de la traducción ATG, que se pensaba que facilitaba la expresión en levaduras. Esta secuencia se

20 denominó ‘ED-8-EP-5-SC’ (SEC ID Nº 30; Figura 11). Se añadieron también sitios de restricción en los flancos para facilitar la clonación en varios vectores de expresión. El gen denominado ‘ED3-8-EP2-5-SC’ se sintetizó en la GenScript Corporation (Piscataway, NJ) y se clonó en la región de clonación ‘TA’ del vector de clonación pUC57. Este gen entonces se subclonó en el sitio EcoRI/SpeI del vector de expresión de levaduras pESC-Ura (Stratagene) para generar una construcción, denominada pRSP62.

25 El clon que contenía el gen ED3-8-EP2-5-SC (SEC ID Nº 30) clonado en el vector pESC-Ura, designado como pRSP62 se depositó en la Colección Americana de tipos de cultivo (ATCC), 10801 University Boulevard, Manassas, VA 20110 bajo los términos del tratado de Budapest el 26 de septiembre de 2008 y se acordó la designación como depósito de patente ATCC PTA-9532.

30 El pRSP62 se transformó en Saccharomyces cerevisiae utilizando el mismo protocolo descrito en el Ejemplo 3, y los transformantes se seleccionaron por auxotrofía de Uracilo utilizando un medio carente de uracilo (DOB [-Ura]) (QBioGene). Las colonias transformadas aisladas del medio DOB [-Ura] se cultivaron una noche en 10 ml de caldo líquido YPD a 30 ºC, con agitación vigorosa. Se añadieron entonces 5 ml del cultivo de la noche a 45 ml de medio

35 selectivo (DOB [-Ura] libre de dextrosa) con un 2% de galactosa (concentración final) añadida para inducir la expresión de pRSP62 y 50 %M (concentración final) de varios sustratos de ácidos grasos (como se especifica). Los cultivos se agitaron vigorosamente (250 rpm) durante 48 h a 24 ºC. El aislamiento y el análisis del total de ácidos grasos también se llevaron a cabo como se describe en el Ejemplo 3.

40 La Tabla 6 representa la actividad enzimática de la proteína codificada por ‘ED3-8-EP2-5-SC’ basándose en el porcentaje de conversión del sustrato añadido. La actividad !8-desaturasa del gen ED3-8 con el codón optimizado era mucho mayor que la de la proteína original codificada por ED3-8. Los resultados indican un 12,51% de conversión del sustrato EDA (20:2 n-6) en DGLA (20:3 n-6), y un 8,45% de conversión del sustrato ETrA (20:3 n-3) en ETA (20:4 n-3). No se detectó ninguna actividad de fondo (conversión no específica de conversión del sustrato)

45 en el control con solo el vector pESC-Ura (Véase Tabla 6). La enzima codificada por ED3-8 con el codón optimizado no demostró actividad !6-, !5-o !4-desaturasa en ninguno de los otros sustratos ensayados (datos no mostrados).

Tabla 6

Actividad !8-desaturasa de la proteína codificada por ED3-8-EP2-5-SC expresada en Saccharomyces cerevisiae

% del Total de ácidos grasos

pRSP62 (ED3-8-EP2-5-SC) Vector pESC-Ura

EDA (20:2 n-6, !11,14)a

12,90 9,95

DGLA (20:3 n-6, !8, 11,14)b

1,84 0

Actividad !8-desaturasa de la proteína codificada por ED3-8-EP2-5-SC expresada en Saccharomyces cerevisiae

% del Total de ácidos grasos

pRSP62 (ED3-8-EP2-5-SC) Vector pESC-Ura

% de Conversión c

12,51 --

ETrA (20:3 n-3, !11, 14, 17)a

19,40 12,22

ETA (20:4 n-3, !8, 11, 14, 17)b

1,79 0

% de Conversión c

8,45 -

a Cultivos que crecen en presencia de 50 %M de sustrato a 24 ºC durante 48 h. Los números representan una media de 2 experimentos diferentes.b Cantidad de producto formadoc % de Conversión = ([producto] / {[producto] + [sustrato]}) x 100

Ejemplo 5

Co-expresión de ED3-8-EP2-5-SC !8-desaturasa con el codón optimizado y !9-elongasa de Isochrysis en levaduras

5 El ‘ED3-8-EP2-5-SC’ !8-desaturasa con el codón optimizado se co-expresó con una secuencia de ácido nucleico !9-elongasa derivada de Isochrysis galbana (IsoD9) (Número de Registro CQ831422, SEC ID Nº 31; Figura 12). Una construcción génica sintética del gen IsoD9 se fabricó con GenScript (Piscataway, NJ) y se clonó en el vector de clonación pUC57. Este gen se subclonó en los sitios EcoRI / BamHI del vector de expresión pYX242 de levadura

10 y la construcción se denominó plsoD9.

Las construcciones pRSP62 (ED3-8-EP2-5-SC en pESC-Ura) y plsoD9 se co-transformaron en la cepa SC334 de Saccharomyces cerevisiae según el protocolo descrito en el Ejemplo 3. Se hizo la selección de los transformantes utilizando tanto la auxotropía por uracilo como por leucina (medio DOB [Leu-Ura]). Las colonias transformadas se

15 cultivaron una noche en 10 ml de caldo líquido YPD a 30 ºC, con agitación vigorosa. Se añadieron 5 ml de este cultivo de una noche a 45 ml de medio selectivo (DOB [Leu-Ura] libre de dextrosa + 2% de Galactosa) que contenía 50 %M (concentración final) de LA (18:2 n-6) o ALA (18:3 n-3) (como se ha especificado), y se agitaron vigorosamente (250 rpm) durante 48 a 72 horas (como se indicó) a 24 ºC o 20 ºC. El aislamiento y análisis de los ácidos grasos también se llevaron a cabo como se ha descrito en el Ejemplo 3.

Tabla 7

Co-expresión del gen ED3-8-EP2-5-SC de la !8-desaturasa con el codón optimizado (pRSP62) y el gen IsoD9 de la !9-elongasa de Isochrysis (plsoD9) en Saccharomyces cerevisiae

% del Total de ácidos grasos

pRSP62 + plsoD9 pESC-Ura + pYX242

LA (18:2 n-6)

13,7 19,05

EDA (20:2 n-6, !11,14) b

4,97 0,100

% de Conversión c (% 9-elongación)

26,62 --

EDA (20:2 n-6, !11,14)a

2,36 0,100

DGLA (20:3 n-6, !8, 11,14)b

2,61 -

% de Conversión c (% 8-desaturación)

52,5 --

LA (18:2 n-6)

13,7 19,05

DGLA (20:3 n-6, !8, 11,14)b

2,61 0

% de Conversión c ( 9-elongación + 8-desaturación)

16,0 -

a Cultivos que crecen en presencia de 50 %M de sustrato a 24 ºC durante 72 h. Los números representan una media de 3 experimentos diferentes.b Cantidad de producto formadoc % de Conversión = ([producto] / {[producto] + [sustrato]}) x 100

La !8-desaturasa y la !9-elongasa son capaces de funcionar en conjunto lo que resulta en la conversión de LA (18:2 n-6) en DGLA (20:3 n-3). La !9-elongasa (IsoD9) convierte el LA en EDA (20:2 n-6) y la !8-desaturasa (enzima codificada por ED3-8-EP2-5-SC) convierte el EDA en DGLA. Esto demuestra que la !8-desaturasa codificada por

25 ED3-8 aislada de Emiliana huxleyi puede funcionar en la ruta alternativa (!8-desaturasa / !9-elongasa) dando lugar a ácido araquidónico (ARA) o biosíntesis de EPA / DHA. Estas enzimas pueden por tanto utilizarse en combinación con desaturasas y elongasas adicionales (es decir, !5-desaturasa, C20-elongasa y !4-desaturasa) para generar ARA a partir de LA o EPA / DHA a partir de ALA en varios hospedadores.

Ejemplo 6

Expresión en Plantas

5 El gen ED3-8-EP2-5-SC de !8-desaturasa con codón optimizado se co-expresó con un gen !9-elongasa derivado de Isochrysis galbana (IsoD9) (Nº de registro CQ831422. SEC ID Nº 31; Figura 12), así como un gen de la !9elongasa derivado de Euglenoid deses Ehr. CCMP2916 (EugMO7ELO, SEC ID Nº 35) (descrito con más detalle en la Solicitud de Patente de EE.UU. Nº US 2011016585, en un modelo de plantas con semillas oleosas de Arabidopsis.

10 La secuencia codificante EugMO7ELO (SEC ID Nº 35) se amplificó por PCR a partir de un plásmido que contenía el correspondiente gen con los oligonucleótidos sentido y antisentido: 5’ – TAT AGA ATT CAA ATG GAC GTC GCG ACT ACG CTG – 3’ (SEC ID Nº 36) y 5’ – TATTCTCGAGTTCTAGTCCACTTTCTTCTCATCCTTC – 3’ (SEC ID Nº 37) (las secuencias de reconocimiento de la enzima de restricción añadidas están subrayadas). La reacción PCR se

15 realizó con polimerasa de fusión de alta fidelidad (New England Biolab). Después de la digestión con la enzima de restricción con EcoRI y XhoI, el producto se unió en su extremo 5’ a un promotor glicina 1 específico de semillas de soja y en su extremo 3’ al 3’ de la región no traducida de la glicina -1 en el vector binario pBinGlyRed2 para generar el plásmido pEugMO7ELO. Los elementos reguladores de la glicina -1 han sido descritos anteriormente (Nielsen, N.

C. y col. (1989) Characterization of the glycinin gene family in soybean. Plant Cell, 1, 313-328), Este vector también

20 contiene un transgén Ds-Red bajo el control del promotor del virus del mosaico de la mandioca para seleccionar las semillas transformadas por fluorescencia y un marcador de resistencia a la kanamicina para selección bacteriana. Este vector también contiene varios sitios de restricción enzimática (por ejemplo, MluI) que posibilita la clonación de otros transgenes para expresión génica de multigenes en la planta huésped. Como control para estos experimentos, se clonó también la Isochrysis galbana !9-ELO (SEC ID Nº 31) con un fragmento EcoRI / XhoI bajo el control del

25 promotor glicina -1 en pBinGlyRed2 para generar el plásmido plsoD9.

0228 La secuencia codificante ED3-8-EP2-5-SC (SEC ID Nº 30) se sintetizó con los sitios de restricción enzimática NotI que flanqueaban la fase de lectura abierta. La secuencia codificante ED3-8-EP2-5-SC se clonó como un fragmento NotI en los correspondientes sitios del vector pBCon que contiene el promotor específico de semillas para 30 la soja subunidad-∋ del gen (-conglicinina y la región 3’ no traducida para el gen de faseolina de Phaseolus vulgaris. El ED3-8-EP2-5-SC estaba flanqueado en su extremo 5’ por la secuencia del promotor (.conglicinina y en su extremo 3’ por la región 3’ faseolina no traducida. El casete resultante que contiene el promotor, la secuencia codificante ED3-8-EP2-5-SC, y la región 3’ sin traducir se retiraron del vector pBCon utilizando los sitios de restricción enzimática AscI que flanquean el casete. El casete AscI se clonó posteriormente en el sitio compatible

35 MluI de pEugELO para generar el plásmido PEugMO7ELO-‘ED3-8-EP2-5-SC’ que contiene transgenes para la coexpresión específica de semillas de EugMO7ELO y ED3-8-EP2-5-SC desaturasa. El casete AscI que contenía el transgén específico de semillas para el ED3-8-EP2-5-SC desaturasa también fue clonado en el sitio MluI del plsoD9 para generar el plsoD9-‘ED3-8-EP2-5-SC’.

40 Se introdujeron el pEugMO7ELO-ED3-8-EP2-5-SC y plsoD9-ED3-8-EP2-5-SC en Agrobacterium tumefaciens cepa C58 MP90 por electroporación. Los Agrobacterium resistentes a kanamicina se utilizaron entonces para la transformación de Arabidopsis thaliana ecotipo Col-0 por el método de inmersión floral (Clough, S. J. y Bent, A.F. (1998) Floral dip: a simplified method for Agrobacterium-mediated transformation of Arabidopsis thaliana. Plant J, 16, 735 – 743). A continuación de la inmersión floral en Agrobacterium, las plantas se mantuvieron a 22 ºC con una

45 duración de día de 16 h hasta que alcanzaron la madurez y se secaron. Se utilizó para esos experimentos, un mutante fad3 /fae 1 de Arabidopsis que contiene bajos niveles de ácido ∋-linolénico y ácidos grasos de cadena muy pequeña ()C20) pero tiene niveles elevados de ácido linoleico en el aceite de su semilla (Cahoon, E.B. y col (2006) Conjugated fatty acids accumulate to high levels in phospholipids of metabolically engineered soybean and Arabidopsis seeds. Phytochemistry, 67, 1155-1176). Este escenario genético se aproxima al perfil de ácidos grasos

50 de los aceites de semilla de cultivos tales como el cártamo y soja baja en ácido linolénico. Las semillas transgénicas obtenidas de las plantas de Arabidopsis sometidas a la inmersión con el Agrobacterium se identificaron por fluorescencia de la proteína marcadora DsRed utilizando la metodología conocida (Pidkowich, M. S. y col (2007) Modulating seed beta-ketoacyl-acyl carrier protein synthase II level converts the composition of a temperate seed oil to that of a palm-like tropical oil. Proc Natl Acad Sci EE.UU., 195, 4742-4747). Las semillas de control transgénicas

55 simples y no transgénicas se sometieron a transesterificación directa de los lípidos constituyentes, incluyendo triacilgliceroles, con el uso del reactivo hidróxido de trimetilsulfonio (TMSH) (Cahoon, E.B. y Shanklin, J. (2000) Substrate-dependent mutant complementation to select fatty acid desaturase variants for metabolic engineering of plant seed oils. Proc Natl Acad Sci EEUU, 97. 12350-12355). Los metil ésteres de ácidos grasos obtenidos de las semillas sencillas se analizaron por cromatografía de gases con detección por ionización en llama con el uso de un

60 cromatógrafo de gas Agilent 7890 ajustado con una columna INNOWax (30 m de longitud x 0,25 mm de diámetro interno) y programada la temperatura del horno desde185 ºC (mantenida 1 minuto) a 230 ºC (mantenida 2 min) a 7 ºC/min. Los metil ésteres de ácidos grasos componentes se identificaron basándose en sus tiempos de retención con respecto a los metil ésteres de ácidos grasos de identidad conocida de las semillas del tipo silvestre de Arabidopsis thaliana Col-0 y por comparación de los tiempos de retención con los de los metil ésteres de ácidos

65 grasos de referencia.

En la Tabla 8 se muestran las composiciones de ácidos grasos de semillas sencillas T1 de cinco casos de transformación independientes de plantas transformadas con pEugMO7ELO-ED3-8-EP2-5-SC. También se muestran las composiciones de ácidos grasos de semillas sencillas T1 que representan casos independientes de plantas transformadas con plsoD9-ED3-8-EP2-5-SC (Tabla 9). Las semillas de pEugMO7ELO-ED3-8-EP2-5-SC 5 transformantes que co-expresaban la Euglena-MO7-elongasa y la ED3-8 !8-desaturasa acumulaban primariamente ácido !8, 11, 14-eicosatrienoico (20:3 !8, 11, 14) y menos cantidades de !11, 14-eicosadienoico. En estas semillas. el 20:3 !8, 11, 14 era el ácido graso más abundante, y sus cantidades relativas variaban desde un 28% a un 37% de los ácidos grasos totales. Las cantidades relativas de 20:2 !11, 14, en estas semillas variaban desde un 10, 8% a 14,5% del total de ácidos grasos. Por comparación, 20:3 !8, 11, 14 y 20:2 !11, 14 no se detectaron o solo se 10 encontraron cantidades traza en las semillas de las plantas Arabidopsis fad3/fae1 no transformadas (Tabla 10). En las semillas que co-expresan la !9 ELO y ED3-8 !8-desaturasa de Isochrysis galbana, el 20:3 !8, 11, 14 se encontraba en hasta el 37% de los ácidos grasos totales y el 20:2 !11, 14 componía hasta el 6% del total de los ácidos grasos (Tabla 9). En total, estos hallazgos muestran que las semillas ricas en 18:2 que co-expresan la Euglena-MO7-elongasa y ED3-8 !8-desaturasa o la !9 ELO y ED3-8 !8-desaturasa de Isochrysis galbana pueden 15 producir cantidades sustanciales de 20:3 !8, 11, 14, un precursor biosintético inmediato de ácido araquidónico (20:4 !5, 8, 11, 14). Estos hallazgos también demuestran la viabilidad de la co-expresión de una elongasa específica de

18:2 tal como la EugMO7ELO y 20:2 !8-desaturasa tal como la ED3-8 !8-desaturasa para manipular las etapas esenciales de la producción de ARA o EPA /DHA en semillas oleaginosas. Es factible co-expresar estos genes con una !5-desaturasa para conseguir la meta final de la producción de aceites ARA o EPA en semillas de oleaginosas

20 transgénicas.

Tabla 8

Composición de ácidos grasos de semillas sencillas T1de Arabidopsis fad3/fae1 transgénica que co-expresan genes que codifican la !9-elongasa, EugMO7ELO (SEC ID Nº 35) y la !8-desaturasa, ED3-8-EP2-5-SC (SEC ID Nº 30). Cada semilla representa un caso transgénico independiente. Los valores mostrados son % pp del total de ácidos grasos en la semilla

Ácido graso

Línea 1 Línea 2 Línea 3 Línea 4 Línea 5

16:0

6,6 9,2 5,5 8,9 9,5

18:0

4,6 4,3 4,9 4,9 4,2

18:1

14,5 19,7 13,0 17,8 21,1

18:2

18,5 20,0 23,4 25,3 19,4

18:3

1,0 1,3 0,9 1,1 0,4

20:0

1,0 1,2 1,1 1,2 1,1

20:1

1,3 2,2 1,6 1,5 2,0

20:2

14,5 10,8 15,1 12,8 14,1

20:3

37,1 31,1 34,3 26,4 28,3

Tabla 9 Tabla 10

Composición de ácidos grasos de semillas sencillas T1de Arabidopsis fad3/fae1 transgénica que co-expresan genes que codifican la !9-elongasa (IsoD9) (SEC ID Nº 31) de Isochrysis galbana y la !8-desaturasa, ED3-8EP2-5-SC (SEC ID Nº 30). Cada semilla representa un caso transgénico independiente. Los valores mostrados son % pp del total de ácidos grasos en la semilla

Ácido graso

Línea 1 Línea 2 Línea 3

16:0

8,4 8,9 9,0

18:0

4,2 4,6 3,3

18:1

32,8 23,6 17,8

18:2

16,0 24,8 27,4

18:3

1,0 1,3 1,4

20:0

1,1 1,0 1,1

20:1

1,0 1,1 0,7

20:2

6,1 3,5 2,6

20:3

27,5 31,2 36,6

Composición de ácidos grasos de semillas de Arabidopsis fad3/fae1 no transformadas (control). Los valores mostrados son % pp del total de ácidos grasos en la semilla

Ácido graso

Semilla 1 Semilla 2 Semilla 3 Semilla 4

16:0

7,2 8,4 6,9 8,9

18:0

4,2 3,9 3,2 5,3

18:1

31,0 34,7 40,6 32,5

18:2

53,6 49,6 46,8 50,9

18:3

1,8 1,8 1,0 1,3

20:0

1,0 0,7 0,8 1,0

20:1

0,5 0,4 0,4 0,2

20:2

0,1 0,1 0,1 0,1

20:3

n.d n.d n.d n.d

La invención que se describe ilustrativamente en el presente documento se puede poner en práctica adecuadamente en ausencia de cualquier elemento o elementos, limitación o limitaciones que no se han desvelado específicamente 5 en el presente documento. Los términos y expresiones que se han empleado se utilizan en términos de descripción y no de limitación y no tienen la intención en el uso de tales términos y expresiones de excluir cualquier equivalente de las características mostradas y descritas o partes de las mismas. Se reconoce la posibilidad de realizar varias modificaciones dentro del ámbito de la invención que se reivindica. Por tanto, debería entenderse que aunque la presente invención se ha desvelado específicamente por medio de realizaciones preferidas, los expertos en la

10 técnica pueden recurrir a características opcionales, modificaciones y variaciones de los conceptos desvelados en el presente documento y tales modificaciones y variaciones se consideran que están en el ámbito de la presente invención como se define en las reivindicaciones adjuntas.

Claims (17)

1. REIVINDICACIONES

   1. Un ácido nucleico aislado que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido que tiene

   actividad desaturasa, donde la secuencia de aminoácidos del polipéptido comprende la secuencia de aminoácidos 5 SEC ID Nº 29.

2. 2.

   Una secuencia de nucleótidos aislada que comprende la secuencia de nucleótidos SEC ID Nº 28 o que comprende al menos un 90% de la secuencia de nucleótidos SEC ID Nº 30, donde la secuencia de nucleótidos codifica un polipéptido que tiene actividad desaturasa.

3. 3.

   La secuencia de nucleótidos aislada de la reivindicación 2, donde la secuencia codifica una enzima !8-desaturasa funcionalmente activa que utiliza el ácido #6-eicosadienoico o el ácido #3-eicosatrienoico como sustrato.

4. 4.

   Un vector de expresión que comprende:

   15 una secuencia de nucleótidos unida operativamente a una secuencia reguladora, donde la secuencia de nucleótidos comprende la secuencia de nucleótidos SEC ID Nº 28 o comprende al menos el 90% de la secuencia de nucleótidos SEC ID Nº 30, donde la secuencia de nucleótidos codifica un polipéptido que tiene actividad desaturasa.

5. 5.

   Una célula huésped que comprende el vector de la reivindicación 4.

6. 6.

   La célula huésped de la reivindicación 5, donde la célula huésped es una célula eucariota, donde la célula

   eucariota se selecciona de entre el grupo que consiste en: una célula de mamífero, una célula de insecto, una célula 25 vegetal y una célula fúngica.

7. 7.

   Una célula vegetal, semilla de una planta, planta o tejido vegetal que comprende el vector de la reivindicación 4, donde la expresión de la secuencia de nucleótidos del vector da como resultado la producción de al menos un ácido graso poliinsaturado por la célula vegetal, semilla de la planta, planta o tejido vegetal.

8. 8.

   La célula vegetal, semilla de una planta, planta o tejido vegetal de la reivindicación 7, donde el ácido graso poliinsaturado se selecciona de entre el grupo que consiste en ácido araquidónico (ARA), ácido eicosapentaenoico (EPA), ácido docosahexaenoico (DHA), ácido dihomo-gamma-linolénico (DGLA) u #3-eicosatetraenoico (#3-ETA) y combinaciones de los mismos.

9. 9.

   Un polipéptido purificado codificado por una secuencia de nucleótidos que comprende la secuencia de nucleótidos SEC ID Nº 28 o que comprende al menos el 90% de la secuencia de nucleótidos SEC ID Nº 30, donde el polipéptido purificado tiene actividad desaturasa.

10. 10.

    Un polipéptido purificado que desatura un sustrato de ácidos grasos de 20 carbonos de largo (C20-PUFA) entre el átomo de carbono 8 y el átomo de carbono 9 del sustrato y donde el polipéptido comprende la secuencia de aminoácidos SEC ID Nº 29.

11. 11. El polipéptido purificado de la reivindicación 10, donde el polipéptido tiene una secuencia de aminoácidos SEC 45 ID Nº 29.
12. 12. Un método de producción de una enzima !8-desaturasa, comprendiendo el método las etapas de:

    a) aislar una secuencia de nucleótidos que comprende la secuencia de nucleótidos SEC ID Nº 28 o que comprende al menos el 90% de la secuencia de nucleótidos SEC ID Nº 30, donde la secuencia de nucleótidos codifica un polipéptido que tiene actividad !8-desaturasa. b) construir un vector de expresión que comprende la secuencia de nucleótidos aislada de la etapa a) unida operativamente a una secuencia reguladora; e c) introducir el vector de expresión en una célula huésped durante un tiempo y bajo condiciones suficientes para

    55 la producción de la enzima !8-desaturasa.
13. 13. Un método para producir un ácido graso poliinsaturado que comprende las etapas de:

    a) aislar una secuencia de nucleótidos que comprende la secuencia de nucleótidos SEC ID Nº 28 o que comprende al menos el 90% de la secuencia de nucleótidos SEC ID Nº 30, donde la secuencia de nucleótidos codifica un polipéptido que tiene actividad !8-desaturasa. b) construir un vector de expresión que comprende la secuencia de nucleótidos aislada de la etapa a) unida operativamente a una secuencia reguladora; c) introducir el vector de expresión en una célula huésped durante un tiempo y bajo condiciones suficientes para

    65 la producción de una enzima !8-desaturasa; y d) exponer la enzima !8-desaturasa expresada a un sustrato seleccionado de entre el grupo que consiste en; ácido #6-eicosadienoico, ácido #3-eicosatrienoico y combinaciones de los mismos con el fin de convertir el sustrato en un producto ácido graso poliinsaturado.

    5 14. El método de la reivindicación 13, donde el producto ácido graso poliinsaturado es el ácido dihomo-gammalinolénico (DGLA), #3-eicosatetraenoico (#3-ETA) o cualquier combinación de los mismos.
14. 15. El método de la reivindicación 13, que comprende además la etapa de:

    10 exponer el producto ácido graso poliinsaturado a al menos una desaturasa adicional o a una elongasa con el fin de convertir el producto ácido graso poliinsaturado en otro o adicional ácido graso poliinsaturado.
15. 16. Un método para producir ácidos grasos poliinsaturados en una célula huésped que comprende las etapas de:

    15 a) aislar una secuencia de nucleótidos que comprende la secuencia de nucleótidos SEC ID Nº 28 o comprende al menos el 90% de la secuencia de nucleótidos SEC ID Nº 30, donde la secuencia de nucleótidos codifica un polipéptido que tiene actividad !8-desaturasa; b) construir un vector de expresión que comprende la secuencia de nucleótidos aislada de la etapa a) unida operativamente a una secuencia reguladora;

    20 c) introducir el vector de expresión de b) y al menos una construcción ADN recombinante adicional que comprende una secuencia de nucleótidos aislada unida operativamente a al menos una secuencia reguladora que codifica una delta-9 elongasa en una célula huésped; d) exponer la enzima !8-desaturasa y la delta-9 elongasa expresadas a un sustrato seleccionado de entre el grupo que consiste en: ácido linoleico (LA), ácido alfa-linolénico (ALA) y combinaciones de los mismos con el fin

    25 de convertir el sustrato en un producto ácido graso poliinsaturado.
16. 17. El método de la reivindicación 16, donde el producto ácido graso poliinsaturado es el ácido dihomo-gammalinolénico (DGLA) o el ácido #3-eicosatetraenoico (#3-ETA) o cualquier combinación de los mismos.

    30 18. El método de la reivindicación 16, que comprende además la etapa de: exponer el producto ácido graso poliinsaturado a al menos una desaturasa adicional o a una elongasa con el fin de convertir el producto ácido graso poliinsaturado en otro o adicional ácido graso poliinsaturado.
17. 19. El método de la reivindicación 18, donde el otro o adicional ácido graso poliinsaturado es el ácido araquidónico 35 (ARA), ácido eicosapentaenoico (DPA), ácido docosahexaenoico (DHA) o cualquier combinación de los mimos.