BR122015020130A2 - biomassa de um microorganismo, óleo e produto para alimentação - Google Patents

biomassa de um microorganismo, óleo e produto para alimentação Download PDF

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Abstract

resumo “biomassa de um microorganismo, óleo e produto para alimentação”. a presente invenção é dirigida a biomassas de microorganismos que possui ácidos graxos e uma concentração de epa, óleos microbianos extraídos de uma biomassa produzida a partir de um microorganismo isolado depositado sob o número de acesso atcc pta-10208, em que o óleo compreende ácidos graxos em que os ácidos graxos compreendem adicionalmente ácidos graxos polinsaturados ômega-3, em que os ácidos graxos poliinsaturados ômega-3 compreendem dha e epa em uma quantidade de cerca de = 90%, em peso, da quantidade total de ácidos graxos poliinsaturados ômega-3 e da quantidade de epa, em peso, que é de cerca de 6% até cerca de 65% da quantidade total de epa e dha e produtos para alimentação que compreendem biomassa.

Description

BIOMASSA DE UM MICROORGANISMO, ÓLEO E PRODUTO PARA ALIMENTAÇÃO”.
Dividido do BR 1120140014434, depositado em 20/07/2012.
FUNDAMENTOS DA INVENÇÃO
Campo da invenção [001] A presente invenção é dirigida aos microorganismos isolados, bem como às cepas e mutantes destes, biomassas, óleos microbianos, composições e culturas; métodos de produção dos óleos microbianos, biomassas e mutantes; e métodos de utilização dos microorganismos isolados, biomassas e óleos microbianos.
Fundamentos da técnica [002] Os ácidos graxos são classificados com base nas características de comprimento e saturação da cadeia de carbono. Os ácidos graxos são denominados ácidos graxos de cadeia curta, cadeia média ou cadeia longa com base no número de carbonos presentes na cadeia, são denominados ácidos graxos saturados quando nenhuma ligação dupla está presente entre os átomos de carbono, e são denominados ácidos graxos insaturados quando ligações duplas estão presentes. Ácidos graxos insaturados de cadeia longa são monoinsaturados quando apenas uma ligação dupla está presente e são poliinsaturados quando mais de uma ligação dupla está presente.
[003] Ácidos graxos poliinsaturados (PUFAs) são classificados com base na posição da primeira ligação dupla da extremidade metil do ácido graxo: ácidos graxos ômega-3 (n-3) contêm uma primeira ligação dupla no terceiro carbono, enquanto ácidos graxos ômega-6 (n-6) contêm uma primeira ligação dupla no sexto carbono. Por exemplo, ácido
2/208 docosahexaenóico (DHA) é um ácido graxo poliinsaturado ômega-3 de cadeia longa (LC-PUFA) com um comprimento de cadeia de 22 carbonos e 6 ligações duplas, freqüentemente designado 22:6 n-3. Outros LC-PUFAs ômega-3 incluem ácido eicosapentaenóico (EPA), designado 20:5 n-3 e ácido docosapentaenóico ômega-3 (DPA n-3), designado 22:5 n3. DHA e EPA foram denominados ácidos graxos essenciais. LC-PUFAs ômega-6 incluem ácido araquidônico (ARA), designado 20:4 n-6 e ácido docosapentaenóico ômega-6 (DPA n-6), designado 22:5 n-6.
[004] Ácidos graxos ômega-3 são moléculas biologicamente importantes que afetam a fisiologia celular em função de sua presença em membranas celulares, regulam a produção e expressão gênica de compostos biologicamente ativos e servem como substratos biossintéticos (Roche, H.M, Proc. Nutr. Soc. 58: 397-401 (1999)). DHA, por exemplo, é responsável por aproximadamente 15%-20% dos lipídeos no córtex cerebral humano, 30%-60% dos lipídeos na retina, está concentrado nos testículos e no esperma, e é um componente importante do leite materno (Berge, J.P., e Barnathan, G. Adv. Biochem. Eng. Biotechnol. 96: 49-125 (2005)). DHA é responsável por até 97% dos ácidos graxos ômega-3 no cérebro e até 93% dos ácidos graxos ômega-3 na retina. Além disso, DHA é essencial para o desenvolvimento tanto fetal quanto do recém-nascido, bem como na manutenção de funções cognitivas em adultos. Id. Como os ácidos graxos ômega-3 não são sintetizados de novo no corpo humano, esses ácidos graxos devem ser derivados de fontes nutricionais.
[005] O óleo de semente de linhaça e óleos de peixe são considerados boas fontes dietéticas de ácidos graxos
3/208 ômega-3. O óleo de semente de linhaça não contém EPA, DHA, DPA ou ARA, mas, ao invés disso, contém ácido linolênico (C18:3 n-3), um bloco construtivo que permite que o corpo fabrique EPA. Há evidências, no entanto, de que a taxa de conversão metabólica pode ser lenta e variável, particularmente entre aqueles com saúde prejudicada. Os óleos de peixe variam consideravelmente no tipo e nível de composição de ácido graxo, dependendo da espécie particular e de suas dietas. Por exemplo, peixes criados por aqüicultura tendem a ter um nível menor de ácidos graxos ômega-3 do que aqueles selvagens. Além disso, óleos de peixe carregam o risco de conterem contaminantes ambientais e podem estar associados a problemas de estabilidade e um odor ou gosto de peixe.
[006] Traustoquitrídeos são microorganismos da ordem Thraustochytriales. Traustoquitrídeos incluem membros dos gêneros Schizochytrium e Thraustochytrium e foram reconhecidos como uma fonte alternativa de ácidos graxos ômega-3, incluindo DHA e EPA. Veja a Patente U.S. N° 5.130.242. Óleos produzidos por esses microorganismos heterotróficos marinos freqüentemente possuem perfis de ácido graxo poliinsaturado mais simples do que óleos de peixe ou de microalgas correspondentes (Lewis, T.E., Mar. Biotechnol. 1: 580-587 (1999)). Foram relatadas cepas de espécies de traustoquitrídeo para produzir ácidos graxos ômega-3 como uma percentagem elevada dos ácidos graxos totais produzidos pelos organismos (Patente U.S. N° 5.130.242; Huang, J. e cols., J. Am. Oil. Chem. Soc. 78: 605-610 (2001); Huang, J. e cols., Mar. Biotechnol. 5: 450457 (2003)). No entanto, traustoquitrídeos isolados variam
4/208 na identidade e quantidades de LC-PUFAs produzidos, de tal forma que algumas cepas descritas previamente podem ter níveis indesejáveis de ácidos graxos ômega-6 e/ou podem demonstrar baixa produtividade em cultura. Dessa forma, existe uma necessidade contínua pelo isolamento de microorganismos que demonstrem alta produtividade e perfis de LC-PUFA desejáveis.
BREVE SUMÁRIO DA INVENÇÃO [007] Os requerentes verificaram que a quantidade de EPA e DHA, produzida por um Traustoquitrídeo que produz uma biomassa que possui pelo menos 3% de EPA, pode ser modulada pela variação das quantidades de dióxido de carbono dissolvido (CO2) em uma fase aquosa de um caldo de fermentação durante a fermentação do microorganismo. É aqui fornecido um método de produção de uma biomassa de um microorganismo que possui ácidos graxos e uma concentração de EPA, que compreende: fermentação do microorganismo em um vaso fermentador que possui um gás dissolvido em um caldo de fermentação para produzir uma biomassa, em que o microorganismo compreende um Traustoquitrídeo que produz uma biomassa que possui pelo menos 3% de EPA do peso total dos ácidos graxos; e ajuste dos níveis de CO2 dissolvido no gás dissolvido. Em uma modalidade, os níveis de CO2 dissolvido podem ser ajustados para obter um nível desejado de EPA e/ou DHA na biomassa. Em uma modalidade adicional a quantidade de CO2 dissolvido na fase aquosa de um caldo de fermentação ranges de cerca de 38 até cerca de 600 ppm do gás dissolvido total e, particularmente, de cerca de 38 até cerca de 135 ppm do gás dissolvido total.
[008] É ainda aqui fornecido um método de produção de
5/208 uma biomassa de um microorganismo que possui ácidos graxos e uma concentração de EPA, que compreende: fermentação do microorganismo em um vaso fermentador, que compreende um gás, para produzir uma biomassa, em que o microorganismo compreende um Traustoquitrídeo que produz uma biomassa que possui pelo menos 3% de EPA do peso total dos ácidos graxos; e suplementação do gás com CO2. Suplementação significa adicionar ou carregar os vasos com CO2 em uma quantidade adicional à quantidade produzida pela fermentação das células ou uma quantidade em condições ambientes. Em uma modalidade, o CO2 é suplementado ao vaso para obter uma quantidade desejada de EPA e/ou DHA na biomassa.
[009] Também é aqui fornecido um método de produção de uma biomassa de um microorganismo que possui ácidos graxos e uma concentração de EPA, que compreende: fermentação do microorganismo em um vaso fermentador para produzir uma biomassa, em que o microorganismo compreende um Traustoquitrídeo que produz uma biomassa que possui pelo menos 3% de EPA do peso total dos ácidos graxos; e ajuste da quantidade da biomassa no vaso. Em uma modalidade da invenção, a biomassa é ajustada para obter um nível desejado de EPA ou DHA na biomassa.
[010] Um método de produção de um microorganismo que possui ácidos graxos e uma concentração de EPA, que compreende: fermentação do microorganismo em um vaso fermentador para produzir uma biomassa, em que o microorganismo compreende um Traustoquitrídeo que produz uma biomassa que possui pelo menos 3% de EPA do peso total dos ácidos graxos; e ajuste da pressão na biomassa, por
6/208 exemplo, sem limitação, controle da pressão de retorno do vaso. Em uma modalidade, a pressão é ajustada para obter um nível desejado de EPA ou DHA na biomassa.
[011] Em outra modalidade, é aqui fornecido um método de produção de um microorganismo que possui ácidos graxos e uma concentração de EPA, que compreende: fermentação do microorganismo em um vaso fermentador para produzir um caldo de fermentação e uma biomassa, em que o microorganismo compreende um Traustoquitrídeo que produz uma biomassa que possui pelo menos 3% de EPA do peso total dos ácidos graxos; e ajuste da temperatura no caldo. Em uma modalidades a temperatura é ajustada para obter um nível desejado de EPA e/ou DHA na biomassa.
[012] Em várias modalidades, as quantidades de EPA e DHA também podem ser moduladas por ajuste da quantidade de CO2 dissolvido em uma fase aquosa ou caldo de fermentação do vaso por aumento ou diminuição da quantidade de CO2 no vaso. A quantidade de CO2 dissolvido pode ser ajustada por ajuste adicional da quantidade da biomassa fermentada. Por exemplo, por fermentação das células em frascos e vasos de fermentação maiores. O EPA e DHA também podem ser variados de acordo com modalidades aqui fornecidas por variação da temperatura. A quantidade de CO2 dissolvido pode ser adicionalmente ajustada, por exemplo, por ajuste da temperatura no vaso. Por exemplo, temperaturas do vaso menores produzirão concentrações maiores de EPA e concentrações menores de DHA. A quantidade de CO2 dissolvido pode ainda ser ajustada por ajuste da pressão no vaso. Por exemplo, o aumento da pressão irá provavelmente aumentar CO2 dissolvido, o que aumentará a quantidade de
7/208
EPA e diminuirá a quantidade de DHA na biomassa. Cada um dos ajustes descritos acima, por exemplo, CO2 suplementado, aumento ou diminuição na biomassa, aumento ou diminuição na temperatura ou aumento ou diminuição na pressão, pode ser combinada com quaisquer outros ajustes para obter um nível
desejado de EPA e DHA na biomassa e de qualquer óleo
extraído da biomassa. O CO2 dissolvido também pode ser
ajustado por uma alteração no pH.
[013] Em algumas modalidades, a quantidade total de EPA e DHA permanece relativamente constante comparada com a quantidade, por peso, do peso total dos ácidos graxos e ácidos graxos ômega-3.
[014] Em modalidades adicionais, o teor de EPA ou DHA da biomassa é medido prior antes da realização de um ajuste à quantidade do CO2 suplementado, pressão, temperatura ou biomassa.
[015] Sem se prender a nenhuma teoria, formulamos a hipótese de que o aumento e a diminuição nas quantidades do EPA ou DHA estão diretamente relacionados com a quantidade de CO2 dissolvido na fase aquosa do caldo de fermentação e de que os ajustes descritos acima de CO2, da pressão e da temperatura, variam a quantidade de CO2 dissolvido na biomassa.
[016] Em algumas modalidades, a invenção fornece um método de produção de uma biomassa de um microorganismo que possui concentração aumentada de EPA, o método compreendendo o crescimento do microorganismo em um meio de cultura que compreende menos do que 0,1 mg/l de vitamina B12 para produzir uma biomassa. Em algumas modalidades, o meio de cultura compreende menos do que 0,01 mg/l de
8/208 vitamina B12. Em algumas modalidades, o meio de cultura compreende menos do que 0,001 mg/l de vitamina B12. Em modalidades adicionais, o meio de cultura compreende menos do que 0,0001 mg/l de vitamina B12. Em algumas modalidades, o meio de cultura não contém vitamina B12.
[017] Em algumas modalidades, o meio de cultura ainda compreende menos do que 1 g de extrato de levedura por 50 g de biomassa livre de lipídeo. Em algumas modalidades, o meio de cultura ainda compreende menos do que 0,5 g de extrato de levedura por 50 g de biomassa livre de lipídeo. Em modalidades adicionais, o meio de cultura ainda compreende menos do que 0,1 g de extrato de levedura por 50 g de biomassa livre de lipídeo.
[018] Em algumas modalidades, a concentração de EPA está aumentada por pelo menos 400% comparada com a concentração de EPA em uma biomassa obtida do microorganismo desenvolvido em um meio de cultura que compreende mais do que 0,1 mg/l de vitamina B12. Em algumas modalidades, a concentração de EPA está aumentada por pelo menos 300% comparada com a concentração de EPA em uma biomassa de um microorganismo desenvolvido em um meio de cultura que compreende mais do que 0,01 mg/l de vitamina B12. Em modalidades adicionais, a concentração de EPA está aumentada por pelo menos 200% comparada com a concentração de EPA em uma biomassa de um microorganismo desenvolvido em um meio de cultura que compreende mais do que 0,001 mg/l de vitamina B12. Em algumas modalidades, a concentração de EPA está aumentada por pelo menos 100% comparada com a concentração de EPA em uma biomassa de um microorganismo desenvolvido em um meio de cultura que compreende mais do
9/208 que 0,0001 mg/l de vitamina B12.
[019] Em algumas modalidades, a invenção fornece um método de produção de uma biomassa de um microorganismo que possui concentração aumentada de EPA, que compreende o crescimento do microorganismo em um meio de cultura que compreende menos do que 0,1 mg/l de cobalto para produzir uma biomassa. Em algumas modalidades, o meio de cultura compreende menos do que 0,01 mg/l de cobalto. Em algumas modalidades, o meio de cultura compreende menos do que 0,001 mg/l de cobalto. Em modalidades adicionais, o meio de cultura compreende menos do que 0,0001 mg/l de cobalto. Em algumas modalidades, o meio de cultura não contém cobalto.
[020] Em algumas modalidades, o microorganismo é um Traustoquitrídeo. Em algumas modalidades, o microorganismo produz pelo menos 3% de EPA do peso total dos ácidos graxos.
[021] Em algumas modalidades, o meio de cultura possui um nível de CO2 dissolvido de pelo menos 5%. Em modalidades adicionais, o meio de cultura possui um nível de CO2 dissolvido de pelo menos 10%. Em algumas modalidades, o meio de cultura possui um nível de CO2 dissolvido de pelo menos 15%.
[022] A invenção também fornece uma biomassa isolada, e um óleo microbiano extraído da biomassa de qualquer um dos métodos aqui apresentados.
BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS [023] As várias modalidades da invenção podem ser mais plenamente compreendidas a partir da descrição detalhada seguinte, das figuras e das descrições de seqüências que a acompanham, que formam uma parte desse pedido.
10/208
[024] A FIG. 1 mostra o desempenho de PTA-9695 em um
gradiente de tiamina.
[025] A FIG. 2 mostra o desempenho de PTA-9695 em um
gradiente de vitamina B12.
[026] A FIG. 3 mostra o desempenho de PTA-9695 em um
gradiente de biotina.
[027] A FIG. 4 mostra o desempenho de PTA-9695 em um
gradiente de Ca-pantotenato.
[028] A FIG. 5 mostra o desempenho de PTA-9695 em
padrões de TSFM.
[029] FIG. 6 - FIG. 19 mostram o desempenho de PTA
9695 em um gradiente de vitamina B12 a CO2 10%.
[030] FIG. 20 - FIG. 49 mostram o desempenho de PTA
10208 em um gradiente de vitamina B12 a CO2 10%.
DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO [031] Os métodos e composições aqui fornecidos são particularmente aplicáveis a um Traustoquitrídeo que produz uma biomassa que possui pelo menos 3% de EPA do peso total dos ácidos graxos que produz. Um Traustoquitrídeo particular que produz uma biomassa que possui pelo menos 3% de EPA aqui fornecido é um microorganismo isolado da espécie depositada sob o N° de Acesso na ATCC PTA-10212. O microorganismo isolado associado ao N° de Acesso na ATCC PTA-10212 foi depositado sob o Tratado de Budapeste em 14 de julho de 2009 na American Type Culture Collection”, Depositório de Patentes, 10801 University Boulevard, Manassas, VA 201 10-2209.
[032] Um Traustoquitrídeo particular que produz uma biomassa que possui pelo menos 3% de EPA é selecionado de um microorganismo isolado depositado sob o N° de Acesso na
11/208
ATCC PTA-10212, PTA-10213, PTA-10214, PTA-10215, PTA-10208, PTA-10209, PTA-10210 ou PTA-10211.
[033] Uma modalidade particular aqui fornecida é dirigida a um microorganismo isolado que compreende um 18s rRNA que compreende uma seqüência de polinucleotídeos do ID. DE SEQ. N°: 1 ou uma seqüência de polinucleotídeos que possui pelo menos 94% de identidade para o ID. DE SEQ. N°: 1.
[034] Uma modalidade particular aqui fornecida é dirigida a um microorganismo isolado que compreende seqüência de polinucleotídeos de um 18s rRNA que possui pelo menos 94% de identidade para seqüência de polinucleotídeos de um 18s rRNA do microorganismo depositado sob o N° de Acesso na ATCC PTA-10212.
[035] Um Traustoquitrídeo particular que produz uma biomassa que possui pelo menos 3% de EPA aqui fornecido é dirigido a um microorganismo isolado da espécie depositada sob o N° de Acesso na ATCC PTA-10208.
[036] Uma modalidade particular aqui fornecida é dirigida a um microorganismo isolado da espécie depositada sob o N° de Acesso na ATCC PTA-10208, em que os ácidos graxos totais produzidos pelo microorganismo compreendem mais do que cerca de 10% por peso de ácido eicosapentaenóico.
[037] Um Traustoquitrídeo particular que produz uma biomassa que possui pelo menos 3% de EPA da presente invenção é dirigido a um microorganismo isolado que possui as características da espécie depositada sob o N° de Acesso na ATCC PTA-10208, em que os ácidos graxos totais produzidos pelo microorganismo compreendem mais do que
12/208 cerca de 10% por peso de ácido eicosapentaenóico. Um Traustoquitrídeo particular que produz uma biomassa que possui pelo menos 3% de EPA aqui fornecido é selecionado de um microorganismo isolado selecionado de uma cepa mutante depositada sob o N° de Acesso na ATCC PTA-10209, PTA-10210 ou PTA-10211. Os microorganismos associados aos Nos de Acesso na ATCC PTA-10209, PTA-10210 e PTA-10211 foram depositados sob o Tratado de Budapeste em 25 de setembro de 2009 na American Type Culture Collection”, Depositório de Patentes, 10801 University Boulevard, Manassas, V A 201 102209.
[038] Modalidades aqui fornecidas são dirigidas aos microorganismos descritos acima, suas cepas mutantes e aos microorganismos identificados no Pedido de Patente U.S. N° 12/729.013 aqui incorporado por referência em sua totalidade.
[039] Uma modalidade aqui fornecida é dirigida a um microorganismo isolado que produz uma fração de triacilglicerol, em que o teor de ácido eicosapentaenóico da fração de triacilglicerol é pelo menos cerca de 12% por peso.
[040] Uma modalidade aqui fornecida é dirigida a uma biomassa isolada, em que pelo menos cerca de 20% por peso da massa de células secas da biomassa são ácidos graxos, em que mais do que cerca de 10% por peso de ácidos graxos é ácido eicosapentaenóico, e em que os ácidos graxos compreendem menos do que cerca de 5% por peso de cada um de ácido araquidônico e ácido docosapentaenóico n-6. Em algumas modalidades, pelo menos cerca de 25% por peso dos ácidos graxos é ácido docosahexaenóico.
13/208 [041] Em algumas modalidades, a presente invenção é dirigida a uma biomassa isolada que compreende triacilglicerol, em que pelo menos cerca de 12% por peso de triacilglicerol é ácido eicosapentaenóico.
[042] Em algumas modalidades, a presente invenção é dirigida a qualquer uma das biomassas isoladas da invenção em que os ácidos graxos ainda compreendem menos do que
cerca de 5% por peso de cada um de ácido oléico, ácido
linoléico, ácido linolênico, ácido eicosenóico e ácido
erúcico.
[043] A presente invenção é dirigida a um
microorganismo traustoquitrídeo isolado da espécie traustoquitrídeo depositada sob o N° de Acesso na ATCC PTA9695 ou uma cepa dele derivada, em que os ácidos graxos totais produzidos pelo referido microorganismo ou cepa dele derivada compreendem cerca de 10% ou menos por peso de ácido eicosapentaenóico. Uma modalidade aqui fornecida é dirigida ao microorganismo descrito acima ou uma cepa dele derivada e outro microorganismo relacionado descrito na Publicação de Pedido de Patente U.S. N° US 2010/0239533 aqui incorporada por referência em sua totalidade.
[044] Também é aqui fornecido um método de aumento da concentração de EPA em uma biomassa de um microorganismo que possui ácidos graxos e uma concentração de EPA que compreende: fermentação do microorganismo em um vaso fermentador, que compreende um gás, para produzir uma biomassa, em que o microorganismo compreende um Traustoquitrídeo que produz uma biomassa que possui pelo menos 3% de EPA do peso total dos ácidos graxos; e suplementação do gás com CO2 em uma quantidade suficiente
14/208 para aumentar a concentração do EPA na biomassa. O aumento na concentração do EPA pode ser comparado, por exemplo, com a concentração de EPA no microorganismo similarmente fermentado não suplementado com CO2 ou quando comparado com um microorganismo similarmente fermentado em condições ambientes.
[045] Em outra modalidade, a quantidade de CO2 suficiente para aumentar a concentração do EPA é maior ou igual a 2% do gás total no vaso. Em outra modalidade, a quantidade do CO2 no vaso é maior ou igual a cerca de 5% até cerca de 20% do gás total no vaso. Em outra modalidade, a quantidade do CO2 no vaso é maior ou igual a cerca de 5% até cerca de 15% do gás total no vaso.
[046] Em uma modalidade adicional, a quantidade de CO2 suplementado é maior ou igual a 2% do gás total no vaso para aumentar a concentração do EPA na biomassa até mais do que cerca de 4% por peso do peso total dos ácidos graxos, mais particularmente de cerca de mais do que 4% até cerca de 45% por peso do peso total dos ácidos graxos, mais particularmente, de cerca de mais do que 4% até cerca de 40% do peso total dos ácidos graxos.
[047] Em uma modalidade adicional, a quantidade de CO2 suplementado é suficiente para aumentar os níveis de EPA de cerca de 4% até uma faixa de cerca de 6 a 30% por peso do peso total dos ácidos graxos. Em outra modalidade, a quantidade de CO2 fornecida é suficiente para aumentar a concentração do EPA de cerca de 15% até cerca de 40%, por peso do peso total dos ácidos graxos. Em outra modalidade, a quantidade de CO2 fornecida é suficiente para aumentar a concentração do EPA até mais do que 20% por peso do peso
15/208 total dos ácidos graxos. Em outra modalidade, o CO2 é fornecido em uma quantidade suficiente para aumentar a concentração do EPA de cerca de 20% até cerca de 25%.
[048] Em outra modalidade, é aqui fornecido um método de aumento da concentração de EPA em uma biomassa de um microorganismo que possui ácidos graxos e uma concentração de EPA que compreende: fermentação do microorganismo em um vaso fermentador para produzir uma biomassa; fornecimento de uma pressão na biomassa suficiente para aumentar a concentração do EPA na biomassa. O aumento na concentração do EPA pode ser comparado, por exemplo, com a concentração de EPA microorganismo similarmente fermentado que não recebeu a pressão ou quando comparado com um microorganismo similarmente fermentado em condições ambientes. Em uma modalidade adicional, a pressão fornecida na biomassa é cerca de 3,44 kPa acima da pressão atmosférica. Em outra modalidade, o vaso possui uma pressão de entrada (ou pressão de retorno) maior ou igual a cerca de 2,75 kPa, mais particularmente de cerca de 2,75 kPa até cerca de 206,84 kPa, ainda mais particularmente de cerca de 6,89 até cerca de 206,84 kPa. Em outra modalidade, o vaso possui uma pressão de entrada de cerca de 6,89 até cerca de 137,89 kPa. Em outra modalidade, a pressão fornecida é fornecida por um tempo suficiente para ajustar a quantidade de EPA na biomassa, particularmente por um tempo de até 120 horas.
[049] Em outra modalidade, é aqui fornecido um método de produção de uma biomassa de um microorganismo que produz ácidos graxos e uma concentração de EPA, que compreende as fermentação do microorganismo em um vaso fermentador para produzir uma biomassa, em que o microorganismo compreende
16/208 um Traustoquitrídeo que produz uma biomassa que possui pelo menos 3% de EPA do peso total dos ácidos graxos em uma temperatura suficiente para aumentar a concentração do EPA na biomassa. Em algumas modalidades, a temperatura suficiente para aumentar os níveis de EPA é menos do que cerca de 30°C, mais particularmente é menor ou igual a cerca de 22°C e, mais particularmente, a temperatura é menor ou igual a cerca de 21°C. O aumento na concentração do EPA pode ser comparado, por exemplo, com a concentração de EPA em um microorganismo similarmente fermentado em que a temperatura não é ajustada ou quando comparado com um microorganismo similarmente fermentado em condições ambientes.
[050] Em uma modalidade adicional, os métodos aqui fornecidos variam as quantidades de EPA geradas durante fermentação para produzir uma biomassa, e um óleo extraído, em que a quantidade de EPA fornecida é mais do que 4%, particularmente de cerca de mais do que 4% até cerca de 45%, mais particularmente de cerca de mais do que 4% até cerca de 40% por peso, do peso total dos ácidos graxos. Em outra modalidade, a quantidade de EPA produzida por um método aqui fornecido está em uma quantidade de cerca de 6% até cerca de 30% por peso do peso total dos ácidos graxos. Em uma modalidade adicional, a quantidade de EPA produzida por um método aqui fornecido está em uma quantidade de cerca de 15% até cerca de 40% por peso do peso total dos ácidos graxos. Em uma modalidade adicional, a quantidade de EPA produzida por um método aqui fornecido está em uma quantidade de mais do que cerca de 20%, mais particularmente de cerca de 20% até cerca de 25% por peso
17/208 do peso total dos ácidos graxos.
[051] Em uma modalidade adicional, o nível desejado de EPA fornecido é mais do que 4%, particularmente de cerca de mais do que 4% até cerca de 45%, mais particularmente de cerca de mais do que 4% até cerca de 40% por peso, do peso total dos ácidos graxos. Em outra modalidade, o nível desejado de EPA produzido por um método aqui fornecido está em uma quantidade de cerca de 6% até cerca de 30% por peso do peso total dos ácidos graxos. Em uma modalidade adicional, o nível desejado de EPA produzido por um método aqui fornecido está em uma quantidade de cerca de 15% até cerca de 40% por peso do peso total dos ácidos graxos. Em uma modalidade adicional, o nível desejado de EPA produzido por um método aqui fornecido está em uma quantidade de mais do que cerca de 20%, mais particularmente de cerca de 20% até cerca de 25% por peso do peso total dos ácidos graxos.
[052] Um método de aumento da concentração de EPA em uma biomassa de um microorganismo que possui ácidos graxos e uma concentração de EPA que compreende: fermentação do microorganismo em um vaso fermentador para produzir uma biomassa em que o microorganismo Traustoquitrídeo que produz uma biomassa que possui pelo menos 3% de EPA do peso total dos ácidos graxos; e aumento da biomassa em uma quantidade suficiente para aumentar a concentração do EPA na biomassa. Em algumas modalidades, a quantidade de biomassa suficiente para aumentar a concentração do EPA possui uma densidade maior ou igual a 10 g/l. Em algumas modalidades, a quantidade de biomassa suficiente para aumentar a concentração do EPA possui uma densidade de cerca de 10 g/l até cerca de 250 g/l. O aumento na
18/208 concentração do EPA pode ser comparado, por exemplo, com a concentração de EPA em um microorganismo similarmente fermentado em que a biomassa não é aumentada.
[053] Em algumas modalidades, a concentração de EPA da biomassa crescida em um meio de cultura que compreende um nível maior de CO2 (por exemplo, em um vaso que compreende CO2 em uma quantidade maior ou igual a 2%, maior ou igual a 5%, maior ou igual a 10%, maior ou igual a 15%, maior ou igual a 20%, 5% a 20% ou 5% a 15% do gás total no vaso) é pelo menos 10%, pelo menos 50%, pelo menos 100%, pelo menos 250%, pelo menos 500%, pelo menos 750%, pelo menos 1.000%, pelo menos 1.100%, pelo menos 1.200%, pelo menos 1.300%, pelo menos 1.400%, pelo menos 1.500%, pelo menos 1.600%, pelo menos 1.700%, pelo menos 1.800%, pelo menos 1.900% ou pelo menos 2.000% maior do que a concentração de EPA em uma biomassa obtida do microorganismo desenvolvido em um meio de cultura que compreende níveis menores de CO2 (por exemplo, em um vaso que compreende CO2 em uma quantidade de menos do que 2%, menos do que 5%, menos do que 10%, menos do que 15%, menos do que 20%, 0% a 4% ou 1% a 3% do gás total no vaso, respectivamente). Por exemplo, a concentração de EPA da biomassa crescida em um meio de cultura que compreende um nível maior de CO2 (por exemplo, em um vaso que compreende CO2 em uma quantidade maior ou igual a 2%, maior ou igual a 5%, maior ou igual a 10%, maior ou igual a 15%, maior ou igual a 20%, 5% a 20% ou 5% a 15% do gás total no vaso) é pelo menos 10%, pelo menos 50%, pelo menos 100%, pelo menos 250%, pelo menos 500%, pelo menos 750%, pelo menos 1.000%, pelo menos 1 100%, pelo menos 1.200%, pelo menos 1.300%, pelo menos 1.400%, pelo
19/208 menos 1.500%, pelo menos 1.600%, pelo menos 1.700%, pelo menos 1.800%, pelo menos 1.900% ou pelo menos 2.000% maior do que a concentração de EPA em uma biomassa obtida do microorganismo desenvolvido em um vaso em um nível de CO2 ambiente.
Vitamina B12 em meio de cultura [054] O termo vitamina B12”, como aqui usado, se refere a uma classe de compostos quimicamente relacionados tanto em formas de ocorrência natural e sintéticas, incluindo, sem limitação, vitamina B12, cobalamina, cianocobalamina e hidroxocobalamina. Em algumas modalidades, a invenção fornece métodos de aumento da concentração de EPA na biomassa de um microorganismo que produz EPA por crescimento do microorganismo em um meio de cultura que possui níveis baixos de vitamina B12 ou em um meio de cultura que não possui vitamina B12. Em algumas modalidades, a invenção fornece métodos de produção de uma biomassa de um microorganismo que possui concentração aumentada de EPA, que compreende o crescimento do microorganismo em um meio de cultura que compreende menos do que 0,1 mg/l de vitamina B12 para produzir uma biomassa. Em algumas modalidades, o meio de cultura compreende menos do que 0,05 mg/l, menos do que 0,01 mg/l, menos do que 0,005 mg/l, menos do que 0,001 mg/l, menos do que 0,0005 mg/l, menos do que 0,0001 mg/l ou não possui vitamina B12.
[055] Em algumas modalidades, o meio de cultura compreende menos do que 1 g de fontes de vitamina B12 (por exemplo, extrato de levedura, sólidos de maceração de milho, farinha de soja e outras fontes de nitrogênio complexas) por 50 g de biomassa livre de lipídeo. Em
20/208 algumas modalidades, o meio de cultura compreende menos do que 0,8 g, menos do que 0,5 g, menos do que 0,3 g, menos do que 0,1 g, menos do que 0,05 g ou menos do que 0,01 g dessas fontes de vitamina B12 por 50 g de biomassa livre de lipídeo. Em algumas modalidades, o meio de cultura ainda compreende menos do que 1 g de extrato de levedura por 50 g de biomassa livre de lipídeo, menos do que 0,8 g de extrato de levedura por 50 g de biomassa livre de lipídeo, menos do que 0,5 g de extrato de levedura por 50 g de biomassa livre de lipídeo, menos do que 0,3 g de extrato de levedura por 50 g de biomassa livre de lipídeo, menos do que 0,1 g de extrato de levedura por 50 g de biomassa livre de lipídeo, menos do que 0,05 g de extrato de levedura por 50 g de biomassa livre de lipídeo, ou menos do que 0,01 g de extrato de levedura por 50 g de biomassa livre de lipídeo. Como aqui usado, o termo biomassa livre de lipídeo” se refere à massa de células secas livre de gordura-alvo do microorganismo após cultivo.
[056] Em algumas modalidades, a concentração de EPA da biomassa crescida em um meio de cultura que compreende um nível menor de vitamina B12 (por exemplo, em um meio de cultura que compreende menos do que 0,1 mg/l, menos do que 0,05 mg/l, menos do que 0,01 mg/l, menos do que 0,005 mg/l, menos do que 0,001 mg/l, menos do que 0,0005 mg/l, menos do que 0,0001 mg/l ou não possui vitamina B12) é pelo menos 10%, pelo menos 25%, pelo menos 50%, pelo menos 75%, pelo
menos 100%, pelo menos 150%, pelo menos 200%, pelo menos
250%, pelo menos 300%, pelo menos 350%, pelo menos 400%,
pelo menos 450%, pelo menos 500%, pelo menos 550% , pelo
menos 600%, pelo menos 650% ou pelo menos 700% maior do que
21/208 a concentração de EPA em uma biomassa obtida do microorganismo desenvolvido em um meio de cultura que compreende níveis maiores de vitamina B12 (por exemplo, em um meio de cultura que compreende pelo menos 0,1 mg/l, pelo menos 0,05 mg/l, pelo menos 0,01 mg/l, pelo menos 0,005 mg/l, pelo menos 0,001 mg/l, pelo menos 0,0005 mg/l, pelo menos 0,0001 mg/l ou pelo menos 0,00005 mg/l de vitamina B12, respectivamente). Por exemplo, a concentração de EPA da biomassa crescida em um meio de cultura que não contém vitamina B12 é pelo menos 10%, pelo menos 25%, pelo menos 50%, pelo menos 75%, pelo menos 100%, pelo menos 150%, pelo menos 200%, pelo menos 250%, pelo menos 300%, pelo menos 350%, pelo menos 400%, pelo menos 450%, pelo menos 500%, pelo menos 550%, pelo menos 600%, pelo menos 650% ou pelo menos 700% maior do que a concentração de EPA em uma biomassa obtida do microorganismo desenvolvido em um meio de cultura que compreende vitamina B12 (por exemplo, pelo menos 0,0001 mg/l de vitamina B12).
[057] Em algumas modalidades, a concentração de EPA da biomassa crescida em um meio de cultura que compreende níveis menores de vitamina B12 (por exemplo, em um meio de cultura que compreende menos do que 0,1 mg/l, menos do que 0,05 mg/l, menos do que 0,01 mg/l, menos do que 0,005 mg/l, menos do que 0,001 mg/l, menos do que 0,0005 mg/l, menos do que 0,0001 mg/l ou não possui vitamina B12) sob um nível de CO2 ambiente é pelo menos 100%, pelo menos 200%, pelo menos 300%, pelo menos 400% ou pelo menos 500% maior do que a concentração de EPA em uma biomassa obtida do microorganismo desenvolvido em um meio de cultura que compreende níveis maiores de vitamina B12 (por exemplo, em
22/208 um meio de cultura que compreende pelo menos 0,1 mg/l, pelo menos 0,05 mg/l, pelo menos 0,01 mg/l, pelo menos 0,005 mg/l, pelo menos 0,001 mg/l, pelo menos 0,0005 mg/l, pelo menos 0,0001 mg/l ou pelo menos 0,00005 mg/l de vitamina B12, respectivamente) sob um nível de CO2 ambiente. Em algumas modalidades, a concentração de EPA da biomassa crescida em um meio de cultura que compreende níveis menores de vitamina B12 sob um nível de CO2 ambiente é 100% a 700%, 150% a 650%, 200% a 600%, 250% a 550% ou 300% a 500% maior do que a concentração de EPA em uma biomassa obtida do microorganismo desenvolvido em um meio de cultura que compreende níveis maiores de vitamina B12 sob um nível de CO2 ambiente. Em algumas modalidades, a concentração de EPA da biomassa crescida em um meio de cultura que compreende níveis menores de vitamina B12 sob um nível elevado de CO2 (por exemplo, um nível de CO2 dissolvido de pelo menos 5%, pelo menos 10%, pelo menos 15% ou pelo menos 20%) é pelo menos 5%, pelo menos 10%, pelo menos 15%, pelo menos 20%, pelo menos 25%, pelo menos 30%, pelo menos 40%, pelo menos 50%, pelo menos 60%, pelo menos 70%, pelo menos 80%, pelo menos 90% ou pelo menos 100% maior do que a concentração de EPA em uma biomassa obtida do microorganismo desenvolvido em um meio de cultura que compreende níveis maiores de vitamina B12 sob um nível elevado de CO2. Em algumas modalidades, a concentração de EPA da biomassa crescida em um meio de cultura que compreende níveis menores de vitamina B12 sob um nível elevado de CO2 (por exemplo, um nível de CO2 dissolvido de pelo menos 5%, pelo menos 10%, pelo menos 15% ou pelo menos 20%) é 5% a 200%, 10% a 175%, 15% a 150%, 20% a 125% ou 25%
23/208 a 100% maior do que a concentração de EPA em uma biomassa obtida do microorganismo desenvolvido em um meio de cultura que compreende níveis maiores de vitamina B12 sob um nível elevado de CO2. Por exemplo, a concentração de EPA da biomassa crescida em um meio de cultura que não compreende vitamina B12 sob um nível de CO2 ambiente é pelo menos 100%, pelo menos 200%, pelo menos 300%, pelo menos 400% ou pelo menos 500% maior do que a concentração de EPA em uma biomassa obtida do microorganismo desenvolvido em um meio de cultura que compreende vitamina B12 (por exemplo, pelo menos 0,0001 mg/l de vitamina B12) sob um nível de CO2 ambiente. Como outro exemplo, a concentração de EPA da biomassa crescida em um meio de cultura que não compreende
vitamina B12 sob um nível de CO2 dissolvido de pelo menos
10% é pelo menos 5%, pelo menos 10%, pelo menos 15% , pelo
menos 20%, pelo menos 25%, pelo menos 30%, pelo menos 40%,
pelo menos 50%, pelo menos 60%, pelo menos 70%, pelo menos
80%, pelo menos 90% ou pelo menos 100% maior do que a
concentração de EPA em uma biomassa obtida do microorganismo desenvolvido em um meio de cultura que compreende vitamina B12 (por exemplo, pelo menos 0,0001 mg/l de vitamina B12) sob um nível de CO2 dissolvido de pelo menos 10%.
[058] Em algumas modalidades, a concentração de EPA está aumentada por pelo menos 100%, pelo menos 200%, pelo menos 300%, pelo menos 400% ou pelo menos 500% na biomassa de um microorganismo desenvolvido em um meio de cultura que possui menos do que 0,1 mg/l de vitamina B12, comparado com o mesmo microorganismo desenvolvido em um meio de cultura que possui mais do que 0,1 mg/l de vitamina B12. Em algumas
24/208 modalidades, a concentração de EPA está aumentada por pelo menos 100%, pelo menos 200%, pelo menos 300%, pelo menos 400% ou pelo menos 500% na biomassa de um microorganismo desenvolvido em um meio de cultura que possui menos do que 0,01 mg/l de vitamina B12, comparado com o mesmo microorganismo desenvolvido em um meio de cultura que possui mais do que 0,01 mg/l de vitamina B12. Em algumas modalidades, a concentração de EPA está aumentada por pelo menos 100%, pelo menos 200%, pelo menos 300%, pelo menos 400% ou pelo menos 500% na biomassa de um microorganismo desenvolvido em um meio de cultura que possui menos do que 0,001 mg/l de vitamina B12, comparado com o mesmo microorganismo desenvolvido em um meio de cultura que possui mais do que 0,001 mg/l de vitamina B12. Em modalidades adicionais, a concentração de EPA está aumentada por pelo menos 100%, pelo menos 200%, pelo menos 300%, pelo menos 400% ou pelo menos 500% na biomassa de um microorganismo desenvolvido em um meio de cultura que possui menos do que 0,0001 mg/l de vitamina B12, comparado com o mesmo microorganismo desenvolvido em um meio de cultura que possui mais do que 0,0001 mg/l de vitamina B12. Em algumas modalidades, a concentração de EPA está aumentada por pelo menos 100%, pelo menos 200%, pelo menos 300%, pelo menos 400% ou pelo menos 500% na biomassa de um microorganismo desenvolvido em um meio de cultura que não possui vitamina B12, comparado com o mesmo microorganismo desenvolvido em um meio de cultura que contém uma quantidade de vitamina B12. A determinação do aumento na concentração de EPA na biomassa pode ser feita por crescimento de um microorganismo em um meio de cultura que
25/208 possui quantidades maiores de vitamina B12, crescimento do mesmo microorganismo em um meio de cultura que possui quantidades menores de vitamina B12 e comparando-se a concentração de EPA na biomassa resultante de cada cultura. Nessa determinação, os teores do meio de cultura que possui quantidades menores ou maiores de vitamina B12 são iguais, exceto quanto ao seu nível de vitamina B12.
[059] Em algumas modalidades, a concentração de EPA da biomassa do microorganismo desenvolvido em um meio de cultura que compreende pelo menos 0,1 mg/l, pelo menos 0,05 mg/l, pelo menos 0,01 mg/l, pelo menos 0,005 mg/l, pelo menos 0,001 mg/l, pelo menos 0,0005 mg/l ou pelo menos 0,0001 mg/l de vitamina B12 é pelo menos 1%, pelo menos 2%, pelo menos 3%, pelo menos 4% ou pelo menos 5% de EPA por peso dos ácidos graxos totais. Em algumas modalidades, a concentração de EPA da biomassa do microorganismo desenvolvido em um meio de cultura que compreende pelo menos 0,1 mg/l, pelo menos 0,05 mg/l, pelo menos 0,01 mg/l, pelo menos 0,005 mg/l, pelo menos 0,001 mg/l, pelo menos 0,0005 mg/l ou pelo menos 0,0001 mg/l de vitamina B12 é 1% a 50%, 1% a 40%, 1% a 30%, 1% a 20%, 2% a 50%, 2% a 40%, 2% a 30% ou 2% a 20% de EPA por peso dos ácidos graxos totais.
Cobalto em meio de cultura [060] Em algumas modalidades, a invenção fornece métodos de produção de uma biomassa de um microorganismo que possui concentração aumentada de EPA, que compreende o crescimento do microorganismo em um meio de cultura que compreende menos do que 0,1 mg/l de cobalto para produzir uma biomassa. Em algumas modalidades, o meio de cultura compreende menos do que 0,05 mg/l, menos do que 0,01 mg/l,
26/208 menos do que 0,005 mg/l, menos do que 0,001 mg/l, menos do que 0,0005 mg/l, menos do que 0,0001 mg/l ou não possui cobalto.
[061] Em algumas modalidades, o meio de cultura ainda compreende menos do que 1 g de extrato de levedura por 50 g de biomassa livre de lipídeo, menos do que 0,8 g de extrato de levedura por 50 g de biomassa livre de lipídeo, menos do que 0,5 g de extrato de levedura por 50 g de biomassa livre de lipídeo, menos do que 0,3 g de extrato de levedura por 50 g de biomassa livre de lipídeo, menos do que 0,1 g de extrato de levedura por 50 g de biomassa livre de lipídeo, menos do que 0,05 g de extrato de levedura por 50 g de biomassa livre de lipídeo, ou menos do que 0,01 g de extrato de levedura por 50 g de biomassa livre de lipídeo.
[062] Em algumas modalidades, a concentração de EPA da biomassa crescida em um meio de cultura que compreende um nível menor de cobalto (por exemplo, em um meio de cultura que compreende menos do que 0,1 mg/l, menos do que 0,05 mg/l, menos do que 0,01 mg/l, menos do que 0,005 mg/l, menos do que 0,001 mg/l, menos do que 0,0005 mg/l, menos do que 0,0001 mg/l ou não possui cobalto) é pelo menos 10%,
pelo menos 25%, pelo menos 50%, pelo menos 75%, pelo menos
100%) , pelo menos 150%, pelo menos 200%., pelo menos 250%,
pelo menos 300%, pelo menos 350%, pelo menos 400%, pelo
menos 450%, pelo menos 500%, pelo menos 550%, pelo menos
600%, pelo menos 650% ou pelo menos 700 % maior do que a
concentração de EPA em uma biomassa obtida do
microorganismo desenvolvido em um meio de cultura que compreende níveis maiores de cobalto (por exemplo, em um meio de cultura que compreende pelo menos 0,1 mg/l, pelo
27/208
menos 0,05 mg/l, pelo menos 0,01 mg/l, pelo menos 0,005
mg/l, pelo menos 0,001 mg/l, pelo menos 0,0005 mg/l, pelo
menos 0,0001 mg/l ou pelo menos 0 ,00005 mg/l de cobalto,
respectivamente). Por exemplo, a concentração de EPA da
biomassa crescida em um meio de cultura que não contém
cobalto é pelo menos 10%, pelo menos 25%, pelo menos 50%,
pelo menos 75%, pelo menos 100%, pelo menos 150%, pelo
menos 200%, pelo menos 250%, pelo menos 300%, pelo menos
350%, pelo menos 400%, pelo menos 450%, pelo menos 500%,
pelo menos 550%, pelo menos 600%, pelo menos 650% ou pelo
menos 700% maior do que a concentração de EPA em uma
biomassa obtida do microorganismo desenvolvido em um meio de cultura que compreende cobalto (por exemplo, pelo menos 0,0001 mg/l de cobalto).
[063] Em algumas modalidades, a concentração de EPA da biomassa crescida em um meio de cultura que compreende níveis menores de cobalto (por exemplo, em um meio de cultura que compreende menos do que 0,1 mg/l, menos do que 0,05 mg/l, menos do que 0,01 mg/l, menos do que 0,005 mg/l, menos do que 0,001 mg/l, menos do que 0,0005 mg/l, menos do que 0,0001 mg/l ou não possui cobalto) sob um nível de CO2 ambiente é pelo menos 100%, pelo menos 200%, pelo menos 300%, pelo menos 400% ou pelo menos 500% maior do que a concentração de EPA em uma biomassa obtida do microorganismo desenvolvido em um meio de cultura que compreende níveis maiores de cobalto (por exemplo, em um meio de cultura que compreende pelo menos 0,1 mg/l, pelo menos 0,05 mg/l, pelo menos 0,01 mg/l, pelo menos 0,005 mg/l, pelo menos 0,001 mg/l, pelo menos 0,0005 mg/l, pelo menos 0,0001 mg/l ou pelo menos 0,00005 mg/l de cobalto,
28/208 respectivamente) sob um nível de CO2 ambiente. Em algumas modalidades, a concentração de EPA da biomassa crescida em um meio de cultura que compreende níveis menores de cobalto sob um nível de CO2 ambiente é 100% a 700%, 150% a 650%, 200% a 600%, 250% a 550% ou 300% a 500% maior do que a concentração de EPA em uma biomassa obtida do microorganismo desenvolvido em um meio de cultura que compreende níveis maiores de cobalto sob um nível de CO2 ambiente. Em algumas modalidades, a concentração de EPA da biomassa crescida em um meio de cultura que compreende níveis menores de cobalto sob um nível elevado de CO2 (por exemplo, um nível de CO2 dissolvido de pelo menos 5%, pelo menos 10%, pelo menos 15% ou pelo menos 20%) é pelo menos 5%, pelo menos 10%, pelo menos 15%, pelo menos 20%, pelo menos 25%, pelo menos 30%, pelo menos 40%, pelo menos 50%, pelo menos 60%, pelo menos 70%, pelo menos 80%, pelo menos 90% ou pelo menos 100%) maior do que a concentração de EPA em uma biomassa obtida do microorganismo desenvolvido em um meio de cultura que compreende níveis maiores de cobalto sob um nível elevado de CO2. Em algumas modalidades, a concentração de EPA da biomassa crescida em um meio de cultura que compreende níveis menores de cobalto sob um nível elevado de CO2 (por exemplo, um nível de CO2 dissolvido de pelo menos 5%, pelo menos 10%, pelo menos 15% ou pelo menos 20%) é 5% a 200%, 10% a 175%, 15% a 150%, 20% a 125% ou 25% a 100% maior do que a concentração de EPA em uma biomassa obtida do microorganismo desenvolvido em um meio de cultura que compreende níveis maiores de cobalto sob um nível elevado de CO2. Por exemplo, a concentração de EPA da biomassa crescida em um meio de cultura que
29/208 compreende no cobalto sob um nível de CO2 ambiente é pelo menos 100%, pelo menos 200%, pelo menos 300%, pelo menos 400% ou pelo menos 500% maior do que a concentração de EPA em uma biomassa obtida do microorganismo desenvolvido em um meio de cultura que compreende cobalto (por exemplo, pelo menos 0,0001 mg/l de cobalto) sob um nível de CO2 ambiente. Como outro exemplo, a concentração de EPA da biomassa crescida em um meio de cultura que compreende no cobalto sob um nível de CO2 dissolvido de pelo menos 10% é pelo menos 5%, pelo menos 10%, pelo menos 15%, pelo menos 20%, pelo menos 25%, pelo menos 30%, pelo menos 40%, pelo menos 50%, pelo menos 60%, pelo menos 70%, pelo menos 80%, pelo menos 90% ou pelo menos 100% maior do que a concentração de EPA em uma biomassa obtida do microorganismo desenvolvido em um meio de cultura que compreende cobalto (por exemplo, pelo menos 0,0001 mg/l de cobalto) sob um nível de CO2 dissolvido de pelo menos 10%.
[064] Em algumas modalidades, a concentração de EPA está aumentada por pelo menos 100%, pelo menos 200%, pelo menos 300%, pelo menos 400% ou pelo menos 500% na biomassa de um microorganismo desenvolvido em um meio de cultura que possui menos do que 0,1 mg/l de cobalto comparado com o mesmo microorganismo desenvolvido em um meio de cultura que possui mais do que 0,1 mg/l de cobalto. Em algumas modalidades, a concentração de EPA está aumentada por pelo menos 100%, pelo menos 200%, pelo menos 300%, pelo menos 400% ou pelo menos 500% na biomassa de um microorganismo desenvolvido em um meio de cultura que possui menos do que 0,01 mg/l de cobalto comparado com o mesmo microorganismo desenvolvido em um meio de cultura que possui mais do que
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0,01 mg/l de cobalto. Em algumas modalidades, a concentração de EPA está aumentada por pelo menos 100%, pelo menos 200%, pelo menos 300%, pelo menos 400% ou pelo menos 500% na biomassa de um microorganismo desenvolvido em um meio de cultura que possui menos do que 0,001 mg/l de cobalto comparado com o mesmo microorganismo desenvolvido em um meio de cultura que possui mais do que 0,001 mg/l de cobalto. Em modalidades adicionais, a concentração de EPA está aumentada por pelo menos 100%, pelo menos 200%, pelo menos 300%, pelo menos 400% ou pelo menos 500% na biomassa de um microorganismo desenvolvido em um meio de cultura que possui menos do que 0,0001 mg/l de cobalto comparado com o mesmo microorganismo desenvolvido em um meio de cultura que possui mais do que 0,0001 mg/l de cobalto. Em algumas modalidades, a concentração de EPA está aumentada por pelo menos 100%, pelo menos 200%, pelo menos 300%, pelo menos 400% ou pelo menos 500% na biomassa de um microorganismo desenvolvido em um meio de cultura que possui no cobalto comparado com o mesmo microorganismo desenvolvido em um meio de cultura que contém uma quantidade de cobalto. A determinação do aumento na concentração de EPA na biomassa pode ser feita por crescimento de um microorganismo em um meio de cultura que possui quantidades maiores de cobalto, crescimento do mesmo microorganismo em um meio de cultura que possui quantidades menores de cobalto, e comparando-se a concentração de EPA na biomassa resultante de cada cultura. Nessa determinação, os teores do meio de cultura que possui quantidades menores ou maiores de cobalto são iguais, exceto quanto ao seu nível de cobalto.
[065] Em algumas modalidades, a concentração de EPA da
31/208 biomassa do microorganismo desenvolvido em um meio de cultura que compreende pelo menos 0,1 mg/l, pelo menos 0,05 mg/l, pelo menos 0,01 mg/l, pelo menos 0,005 mg/l, pelo menos 0,001 mg/l, pelo menos 0,0005 mg/l ou pelo menos 0,0001 mg/l de cobalto é pelo menos 1%, pelo menos 2%, pelo menos 3%, pelo menos 4% ou pelo menos 5% de EPA por peso dos ácidos graxos totais. Em algumas modalidades, a concentração de EPA da biomassa do microorganismo desenvolvido em um meio de cultura que compreende pelo menos 0,1 mg/l, pelo menos 0,05 mg/l, pelo menos 0,01 mg/l, pelo menos 0,005 mg/l, pelo menos 0,001 mg/l, pelo menos 0,0005 mg/l ou pelo menos 0,0001 mg/l de cobalto é 1% a 50%, 1% a 40%, 1% a 30%, 1% a 20%, 2% a 50%, 2% a 40%, 2% a 30% ou 2% a 20% de EPA por peso dos ácidos graxos totais.
[066] O meio de cultura que contém quantidades baixas de vitamina B12, extrato de levedura e/ou cobalto poderia ainda compreender um nível de CO2 dissolvido de pelo menos 5%, pelo menos 10%, pelo menos 15% ou pelo menos 20%. A presente invenção é dirigida a uma biomassa isolada dos métodos aqui revelados, bem como a um óleo microbiano extraído da biomassa dos métodos.
[067] A presente invenção é dirigida a uma cultura isolada, que compreende qualquer um dos microorganismos da invenção ou misturas destes.
[068] A presente invenção é dirigida a um produto alimentício, composição cosmética ou farmacêutica para um animal não humano ou humano, que compreende qualquer um dos microorganismos ou biomassas da invenção ou misturas destes.
[069) A presente invenção é dirigida a um óleo
32/208 microbiano que compreende pelo menos cerca de 20% por peso de ácido eicosapentaenóico e menos do que cerca de 5% por peso de cada um de ácido araquidônico, ácido docosapentaenóico n-6, ácido oléico, ácido linoléico, ácido linolênico, ácido eicosenóico, ácido erúcico e ácido estearidônico. Em algumas modalidades, o óleo microbiano ainda compreende pelo menos cerca de 25% por peso de ácido docosahexaenóico.
[070] A presente invenção é dirigida a um óleo microbiano que compreende uma fração de triacilglicerol de pelo menos cerca de 10% por peso, em que pelo menos cerca de 12% por peso dos ácidos graxos na fração de triacilglicerol é ácido eicosapentaenóico, em que pelo menos cerca de 25% por peso dos ácidos graxos na fração de triacilglicerol é ácido docosahexaenóico, e em que menos do que cerca de 5% por peso dos ácidos graxos na fração de triacilglicerol é ácido araquidônico.
[071] A presente invenção é dirigida a um produto alimentício, composição cosmética ou farmacêutica para um animal não humano ou humano, que compreende qualquer um dos óleos microbianos da invenção. Em algumas modalidades, o produto alimentício é uma fórmula infantil. Em algumas modalidades, a fórmula infantil é adequada para bebês prematuros. Em algumas modalidades, o produto alimentício é um leite, uma bebida, uma bebida terapêutica, a bebidas nutricionais ou uma combinação destas. Em algumas modalidades, o produto alimentício é um aditivo para o alimento para animal não humano ou humano. Em algumas modalidades, o produto alimentício é um suplemento nutricional. Em algumas modalidades, o produto alimentício
33/208 é uma ração animal. Em algumas modalidades, a ração animal é uma ração para aqüicultura. Em algumas modalidades, a ração animal é uma ração para animal doméstico, uma ração para animal de zoológico, uma ração para animal de trabalho, uma ração para animal de criação, ou uma combinação destas.
[072] A presente invenção é dirigida a um método para produção de um óleo microbiano que compreende ácidos graxos ômega-3, o método compreendendo: crescimento de qualquer um dos microorganismos isolados da invenção ou misturas destes em uma cultura para produzir um óleo que compreende ácidos graxos ômega-3. Em algumas modalidades, o método ainda compreende a extração do óleo.
[073] A presente invenção é dirigida a um método para produção de um óleo microbiano que compreende ácidos graxos ômega-3, o método compreendendo a extração de um óleo que compreende ácidos graxos ômega-3 de qualquer uma das biomassas da invenção. Em algumas modalidades, o óleo microbiano é extraído usando um processo de extração de solvente orgânico, por exemplo, extração de hexano. Em algumas modalidades, o óleo microbiano é extraído usando um processo de extração sem solvente.
[074] A presente invenção é dirigida a um óleo microbiano produzido por um método da invenção.
(075] A presente invenção é dirigida a um método para produção de uma biomassa da invenção, que compreende: crescimento de qualquer um dos microorganismos isolados da invenção ou misturas destes em uma cultura para produzir uma biomassa.
[076] A presente invenção é dirigida a uma biomassa
34/208 produzida por um método da invenção.
[077] A presente invenção é dirigida a um método para produção de uma cepa mutante da invenção, que compreende: mutagênese de qualquer um dos microorganismos da invenção, e isolamento da cepa mutante.
[078] A presente invenção é dirigida ao uso de qualquer um dos microorganismos isolados, biomassas ou óleos microbianos da invenção, ou misturas destes, para a fabricação de um medicamento para o tratamento de inflamação ou uma condição a ela relacionada.
[079] A presente invenção é dirigida ao uso de qualquer um dos microorganismos isolados, biomassas ou óleos microbianos da invenção, ou misturas destes, para o tratamento de inflamação ou uma condição a ela relacionada.
[080] A presente invenção é dirigida a qualquer um dos microorganismos isolados, biomassas ou óleos microbianos da invenção, ou misturas destes, para uso no tratamento de inflamação ou uma condição a ela relacionada.
[081] A presente invenção é dirigida a um método para o tratamento de inflamação ou uma condição a ela relacionada em um indivíduo que dele necessita, que compreende a administração ao indivíduo de qualquer um dos microorganismos isolados, biomassas ou óleos microbianos da invenção, ou misturas destes, e um veículo farmaceuticamente aceitável.
[082] A presente invenção é dirigida aos métodos de produção de óleos microbianos, e biomassas, pelos microorganismos da invenção, e métodos de utilização dos microorganismos, biomassas e óleos microbianos.
Microorganismos
35/208 [083] Em algumas modalidades, uma célula microbiana para uso com a presente invenção é um microorganismo do filo Labyrinthulomycota. Em algumas modalidades, uma célula microbiana do filo
Labyrinthulomycota um traustoquitrídeo, por exemplo, um Schizochytrium ou
Thraustochytrium.
De acordo com a presente invenção, termo traustoquitrídeo se refere a qualquer membro da ordem
Thraustochytriales, que inclui família
Thraustochytriaceae, e o termo labirintulídeo se refere a qualquer membro da ordem
Labyrinthulales, que inclui a família Labyrinthulaceae.
[084] Membros da família Labyrinthulaceae eram previamente considerados como sendo membros da ordem
Thraustochytriales, mas em revisões mais recentes da classificação taxonômica desses organismos, a família
Labyrinthulaceae é agora considerada como um membro da ordem Labyrinthulales.
Tanto Labyrinthulales quanto
Thraustochytriales são considerados como sendo membros do filo Labyrinthulomycota. Os teóricos taxonômicos geralmente colocam ambos esses grupos de microorganismos com as algas ou protistas do tipo algas da linhagem Stramenopile. A colocação taxonômica atual dos traustoquitrídeos e labirintulídeos pode ser resumida da seguinte forma:
Reino: Stramenopila (Chromista)
Filo: Labyrinthulomycota (Heterokonta)
Classe: Labyrinthulomycetes (Labyrinthulae)
Ordem: Labyrinthulales
Família: Labyrinthulaceae
Ordem: Thraustochytriales
Família: Thraustochytriaceae
36/208 [085] Para os objetivos da presente invenção, as cepas de células microbianas descritas como traustoquitrídeos incluem os seguintes organismos: Ordem: Thraustochytriales; Família: Thraustochytriaceae; Gêneros: Thraustochylrium (Espécies: sp., arudimentale, aureum, benthicola, globosum, kinnei, motivum, multirudimentale, pachydermum, proliferum, roseum e striatum), Ulkenia (Espécies: sp., amoeboidea, kerguelensis, minuta, profunda, radiata, sailens, sarkariana, schizochytrops, visurgensis, yorkensis e sp. BP-5601), Schizochytrium (Espécies: sp., aggregatum, limnaceum, mangrovei, minutum e octosporum), Japonochytrium (Espécie: sp., marinum), Aplanochytrium (Espécies: sp., haliotidis, kerguelensis, profunda e stocchinoi), Althornia (Espécie: sp., crouchii) ou Elina (Espécies: sp., marisalba e sinorifica). Para os objetivos dessa invenção, as espécies descrita dentro de Ulkenia serão consideradas como sendo membros do gênero Thraustochytrium. Aurantiacochytrium e Oblogospora são dois gêneros adicionais englobados pelo filo Labyrinthulomycota na presente invenção. Em algumas modalidades, uma célula microbiana é do gênero Thraustochystrium, Schizochytrium, e misturas destes.
[086] A invenção é dirigida aos microorganismos isolados e cepas deles derivadas. Uma cepa que é derivada de um microorganismo isolado da invenção pode ser um derivado natural ou artificial como, por exemplo, uma cepa mutante, variante ou recombinante. O termo isolado, como aqui usado, não reflete necessariamente a extensão até a qual um isolado foi purificado, mas indica o isolamento ou separação de uma forma nativa ou do ambiente nativo. Um
37/208 isolado pode incluir, sem limitação, um microorganismo isolado, uma biomassa isolada, uma cultura isolada, um óleo microbiano isolado e uma seqüência isolada (por exemplo, uma seqüência isolada de polinucleotídeos aqui revelados). O termo microorganismo, como aqui usado, inclui, sem limitação, os termos microalgas, traustoquitrídeo, e classificações taxonômicas associadas com qualquer um dos microorganismos depositados aqui descritos. Os termos Thraustochytriales, traustoquitrídeo, Schizochytrium, e Thraustochytrium , como usados em referência a qualquer um dos microorganismos da invenção, incluindo os microorganismos depositados aqui descritos, são baseados em classificações taxonômicas presentes que incluem informação filogenética disponível e não visam ser limitantes caso as classificações taxonômicas sejam revisadas após a data de depósito do presente pedido.
[087] Em algumas modalidades, a invenção é dirigida a um microorganismo isolado da espécie depositada sob o N° de Acesso na ATCC PTA-10212. O microorganismo isolado associado ao N° de Acesso na ATCC PTA-10212 também é aqui conhecido como Thraustochytrium sp. ATCC PTA-10212. O microorganismo isolado associado ao N° de Acesso na ATCC PTA-10212 foi depositado sob o Tratado de Budapeste em 14 de julho de 2009 na American Type Culture Collection, Depositório de Patentes, 10801 University Boulevard, Manassas, VA 201 10-2209. Em algumas modalidades, a invenção é dirigida a uma cepa isolada depositada sob o N° de Acesso na ATCC PTA-10212. Em algumas modalidades a invenção é dirigida a um microorganismo isolado depositado sob o N° de Acesso na ATCC PTA-10212, PTA-10213, PTA-10214,
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PTA-10215, PTA-10208, PTA-10209, PTA-10210 ou PTA-10211.
[088] Em algumas modalidades, a invenção é dirigida a um microorganismo isolado que possui as características da espécie depositada sob o N° de Acesso na ATCC PTA-10212 ou uma cepa dele derivada. As características da espécie depositada sob o N° de Acesso na ATCC PTA-10212 podem incluir seu propriedades de crescimento e fenotípicas (exemplos de propriedades fenotípicas incluem propriedades morfológicas e reprodutivas), suas propriedades físicas e químicas (por exemplo, pesos secos e perfis lipídicos), suas seqüências gênicas, e combinações destas, em que as características distinguem as espécies entre espécies previamente identificadas. Em algumas modalidades, a invenção é dirigida a um microorganismo isolado que possui as características da espécie depositada sob o N° de Acesso na ATCC PTA-10212, em que as características incluem um 18s rRNA que compreende a seqüência de polinucleotídeos do ID. DE SEQ. N°: 1 ou uma seqüência de polinucleotídeos que possui pelo menos 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% de identidade para o ID. DE SEQ. N°: 1, as propriedades morfológicas e reprodutivas da espécie depositada sob o N° de Acesso na ATCC PTA-10212, e os perfis de ácido graxo da espécie depositada sob o N° de Acesso na ATCC PTA-10212. Em algumas modalidades, microorganismos isolados da invenção possuem propriedades fenotípicas substancialmente idênticas àquelas do microorganismo depositado sob o N° de Acesso na ATCC PTA-10212. Em algumas modalidades, microorganismos isolados da invenção possuem propriedades de crescimento substancialmente idênticas àquelas do microorganismo depositado sob o N° de Acesso na ATCC PTA-10212. Em algumas
39/208 modalidades, a invenção é dirigida a um microorganismo isolado que compreende um 18s rRNA que compreende a seqüência de polinucleotídeos do ID. DE SEQ. N°: 1 ou uma seqüência de polinucleotídeos que possui pelo menos 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% de identidade para o ID. DE SEQ. N°: 1. Em algumas modalidades, a invenção é dirigida a um microorganismo isolado que compreende seqüência de polinucleotídeos de um 18s rRNA que possui pelo menos 94% de identidade para a seqüência de polinucleotídeos de 18s rRNA do microorganismo depositado sob o N° de Acesso na ATCC PTA-10212.
[089] Em algumas modalidades, a invenção é dirigida a uma cepa mutante do microorganismo depositado sob o N° de Acesso na ATCC PTA-10212. Em modalidades adicionais, a cepa mutante é uma cepa depositada sob o N° de Acesso na ATCC PTA-10213, PTA-10214 ou PTA-10215. Os microorganismos associados aos Nos de Acesso na ATCC PTA-10213, PTA-10214 e PTA-10215 foram depositados sob o Tratado de Budapeste em 14 de julho de 2009 na American Type Culture Collection”, Depositório de Patentes, 10801 University Boulevard, Manassas, VA 201 10-2209.
[090] Em algumas modalidades, a invenção é dirigida a um microorganismo isolado da espécie depositada sob o N° de Acesso na ATCC PTA-10208. O microorganismo isolado associado ao N° de Acesso na ATCC PTA-10208 também é aqui conhecido como Schizochytrium sp. ATCC PTA-10208. O microorganismo associado ao N° de Acesso na ATCC PTA-10208 foi depositado sob o Tratado de Budapeste em 14 de julho de 2009 na American Type Culture Collection”, Depositório de Patentes, 10801 University Boulevard, Manassas, VA 201 10
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2209. Em algumas modalidades, a invenção é dirigida a uma cepa isolada depositada sob o N° de Acesso na ATCC PTA10208.
[091] Em algumas modalidades, a invenção é dirigida a um microorganismo isolado da espécie depositada sob o N° de Acesso na ATCC PTA-10208, em que os ácidos graxos totais produzidos pelo microorganismo compreendem mais do que cerca de 10%, mais do que cerca de 11%, mais do que cerca de 12%, mais do que cerca de 13%, mais do que cerca de 14%, mais do que cerca de 15%, mais do que cerca de 16%, mais do que cerca de 17%, mais do que cerca de 18%, mais do que cerca de 19% ou mais do que cerca de 20% por peso de EPA. Em algumas modalidades, a invenção é dirigida a um microorganismo isolado da espécie depositada sob o N° de Acesso na ATCC PTA-10208, em que os ácidos graxos totais produzidos pelo microorganismo compreendem cerca de 10% até cerca de 55%, cerca de 10% até cerca de 50%, cerca de 10% até cerca de 45%, cerca de 10% até cerca de 40%, cerca de 10% até cerca de 35%, cerca de 10% até cerca de 30%, cerca de 15% até cerca de 55%, cerca de 15% até cerca de 50%, cerca de 15% até cerca de 45%, cerca de 15% até cerca de 40%, cerca de 15%) até cerca de 35%, cerca de 15% até cerca de 30%, cerca de 20% até cerca de 55%, cerca de 20% até cerca de 50%, cerca de 20% até cerca de 45%, cerca de 20% até cerca de 40%, cerca de 20% até cerca de 35% ou cerca de 20% até cerca de 30% por peso de EPA.
[092] Em algumas modalidades, a invenção é dirigida a um microorganismo isolado que possui as características da espécie depositada sob o N° de Acesso na ATCC PTA-10208, em que os ácidos graxos totais produzidos pelo microorganismo
41/208 compreendem mais do que cerca de 10% por peso de ácido eicosapentaenóico. As características do microorganismo depositado sob o N° de Acesso na ATCC PTA-10208 incluem suas propriedades de crescimento e fenotípicas (exemplos de propriedades fenotípicas incluem propriedades morfológicas e reprodutivas) , suas propriedades físicas e químicas (por exemplo, pesos secos e perfis lipídicos), suas seqüências gênicas, e combinações destas, em que as características distinguem as espécies entre espécies previamente identificadas. Em algumas modalidades, a invenção é dirigida a um microorganismo isolado que possui as características da espécie depositada sob o N° de Acesso na ATCC PTA-10212, em que as características incluem um 18s rRNA que compreende a seqüência de polinucleotídeos do ID. DE SEQ. N°: 2, as propriedades morfológicas e reprodutivas da espécie depositada sob o N° de Acesso na ATCC PTA-10208, e os perfis de ácido graxo da espécie depositada sob o N° de Acesso na ATCC PTA-10208. Em algumas modalidades, microorganismos isolados da invenção possuem propriedades físicas e químicas substancialmente idênticas àquelas do microorganismo depositado sob o N° de Acesso na ATCC PTA10208.
[093] Em algumas modalidades, a invenção é dirigida a uma cepa mutante do microorganismo depositado sob o N° de Acesso na ATCC PTA-10208. Em modalidades adicionais, a cepa mutante é uma cepa depositada sob o N° de Acesso na ATCC PTA-10209, PTA-10210 ou PTA-10211. Os microorganismos associados aos Nos de Acesso na ATCC PTA-10209, PTA-10210 e PTA-10211 foram depositados sob o Tratado de Budapeste em 25 de setembro de 2009 na American Type Culture
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Collection”, Depositório de Patentes, 10801 University Boulevard, Manassas, VA 201 10-2209.
[094] Em algumas modalidades, a invenção é dirigida a um microorganismo isolado da invenção que produz uma fração de triacilglicerol, em que o teor de EPA da fração de triacilglicerol é pelo menos cerca de 12%, pelo menos cerca de 13%, pelo menos cerca de 14%, pelo menos cerca de 15%, pelo menos cerca de 16%, pelo menos cerca de 17%, pelo menos cerca de 18%, pelo menos cerca de 19% ou pelo menos cerca de 20% por peso. Em algumas modalidades, a invenção é dirigida a um microorganismo isolado que produz uma fração de triacilglicerol, em que o teor de EPA da fração de triacilglicerol é cerca de 12% até cerca de 55%, cerca de 12 % até cerca de 50%, cerca de 12% até cerca de 45,%, cerca de 12% até cerca de 40%, cerca de 12% até cerca de 35%, cerca de 12% até cerca de 30%, cerca de 15% até cerca de 45%, cerca de 15% até cerca de 40%, cerca de 15% até cerca de 35%, cerca de 15% até cerca de 30% ou cerca de 20% até cerca de 30% por peso.
[095] Em algumas modalidades, a invenção é dirigida a um mutante, variante ou recombinante de um microorganismo isolado da invenção que produz uma fração de triacilglicerol, em que o teor de EPA da fração de triacilglicerol é pelo menos cerca de 10%, pelo menos cerca de 11%, pelo menos cerca de 12%, pelo menos cerca de 13%, pelo menos cerca de 14%, pelo menos cerca de 15%, pelo menos cerca de 16%, pelo menos cerca de 17%, pelo menos cerca de 18%, pelo menos cerca de 19% ou pelo menos cerca de 20% por peso. Em algumas modalidades, a invenção é dirigida a um mutante, variante ou recombinante de um
43/208 microorganismo isolado da invenção que produz uma fração de triacilglicerol, em que o teor de EPA da fração de triacilglicerol é cerca de 12% até cerca de 55%, cerca de 12% até cerca de 50%, cerca de 12% até cerca de 45%, cerca de 12% até cerca de 40%, cerca de 12% até cerca de 35%, cerca de 12% até cerca de 30%, cerca de 15% até cerca de 55%, cerca de 15% até cerca de 50%, cerca de 15% até cerca de 45%, cerca de 15% até cerca de 40%, cerca de 15% até cerca de 35%, cerca de 15% até cerca de 30%, cerca de 20% até cerca de 55%, cerca de 20% até cerca de 50%, cerca de 20% até cerca de 45%, cerca de 20% até cerca de 40%, cerca de 20% até cerca de 35% ou cerca de 20% até cerca de 30% por peso. Cepas mutantes podem ser produzidas por procedimentos bem conhecidos. Procedimentos comuns incluem irradiação, tratamento em temperaturas elevadas, e tratamento com um mutágeno. Cepas variantes podem ser outros isolados de ocorrência natural e/ou subisolados das espécies aqui descritas. Cepas recombinantes podem ser produzidas por quaisquer métodos bem conhecidos em biologia molecular para a expressão de genes exógenos ou alteração da função ou expressão do gene endógeno. Em algumas modalidades, a cepa mutante, variante ou recombinante produz uma quantidade maior de ácidos graxos ômega-3, particularmente EPA, do que a cepa do tipo selvagem. Em algumas modalidades, a cepa mutante, variante ou recombinante produz uma quantidade menor de um ou mais ácidos graxos, por exemplo, quantidades menores de DHA, ARA, DPA n-6, ou combinações destes. Em algumas modalidades, a cepa mutante, variante ou recombinante produz uma massa maior de células secas por litro de
44/208 cultura do que a cepa do tipo selvagem. Essas cepas mutantes, variantes ou recombinantes são exemplos de cepas derivadas de um microorganismo isolado da invenção.
[096] A presente invenção também é dirigida a um microorganismo traustoquitrídeo isolado que possui as características da espécie traustoquitrídeo depositada sob o N° de Acesso na ATCC PTA-9695, em que os ácidos graxos totais produzidos pelo referido microorganismo ou cepa dele derivada compreendem cerca de 10% ou menos por peso de ácido eicosapentaenóico.
[097] A presente invenção também é dirigida a um microorganismo traustoquitrídeo isolado, ou uma cepa dele derivada, que compreende uma fração de triglicerídeo, em que o teor de ácido docosahexaenóico da fração de triglicerídeo é pelo menos cerca de 40% por peso, em que o teor de ácido docosapentaenóico n-6 da fração de triglicerídeo é de pelo menos cerca de 0,5% por peso até cerca de 6% por peso, e em que os ácidos graxos totais produzidos pelo referido microorganismo ou cepa dele derivada compreendem cerca de 10% ou menos por peso de ácido eicosapentaenóico.
[098) A presente invenção também é dirigida a um microorganismo traustoquitrídeo isolado da mesma espécie que o traustoquitrídeo depositado sob o N° de Acesso na ATCC PTA-9695 ou uma cepa dele derivada, em que os ácidos graxos totais produzidos pelo referido microorganismo ou cepa dele derivada compreendem cerca de 10% ou menos por peso de ácido eicosapentaenóico.
[099] Em algumas modalidades, a cepa derivada do microorganismo traustoquitrídeo isolado da invenção é uma
45/208 cepa mutante.
[100] A presente invenção também é dirigida a um microorganismo isolado depositado sob o N° de Acesso na ATCC PTA-9695, PTA-9696, PTA-9697 ou PTA-9698.
[101] A presente invenção também é dirigida a uma biomassa de traustoquitrídeo que compreende qualquer um dos microorganismos traustoquitrídeo da invenção ou misturas destes.
[102] A presente invenção também é dirigida a uma biomassa de traustoquitrídeo isolado, em que pelo menos cerca de 50% por peso da massa de células secas da biomassa são ácidos graxos, e em que pelo menos cerca de 50% por peso dos ácidos graxos são ácidos graxos ômega-3. Em algumas modalidades, pelo menos cerca de 50% por peso dos ácidos graxos é ácido docosahexaenóico. A presente invenção também é dirigida a uma biomassa de traustoquitrídeo isolado, em que pelo menos cerca de 25% por peso da massa de células secas da biomassa é ácido docosahexaenóico.
[103] Em algumas modalidades, a presente invenção também é dirigida a uma biomassa de traustoquitrídeo isolado em que cerca de 10% ou menos por peso dos ácidos graxos é ácido eicosapentaenóico, e em que a proporção de peso de ácido docosahexaenóico para ácido eicosapentaenóico é pelo menos cerca de 5:1.
[104] Em algumas modalidades, a presente invenção também é dirigida a uma biomassa de traustoquitrídeo isolado em que cerca de 1,5% ou menos por peso dos ácidos graxos é ácido araquidônico, e em que a proporção de peso de ácido docosahexaenóico para ácido araquidônico é pelo menos cerca de 20:1.
46/208 [105] Em algumas modalidades, a presente invenção também é dirigida a uma biomassa de traustoquitrídeo isolado que compreende ácido docosahexaenóico e ácido docosapentaenóico n-6 em uma proporção de peso de pelo menos cerca de 10:1. Em algumas modalidades, a invenção é dirigida a um traustoquitrídeo da espécie depositada sob o N° de Acesso na ATCC PTA-9695. O traustoquitrídeo isolado também é aqui conhecido como Schizochytrium sp. ATCC PTA9695. O traustoquitrídeo associado ao N° de Acesso na ATCC PTA-9695 foi depositado sob o Tratado de Budapeste em 7 de janeiro de 2009 na American Type Culture Collection”, Depositório de Patentes, 10801 University Boulevard, Manassas, VA 201 10-2209.
[106] Em algumas modalidades, a invenção é dirigida a uma cepa de traustoquitrídeo isolada depositada sob o N° de Acesso na ATCC PTA-9695. Em algumas modalidades, a invenção é dirigida a um microorganismo traustoquitrídeo isolado da mesma espécie que o traustoquitrídeo depositado sob o N° de Acesso na ATCC PTA-9695.
[107] Em algumas modalidades, a invenção é dirigida a um traustoquitrídeo isolado que possui as características da espécie depositada sob o N° de Acesso na ATCC PTA-96 95 ou uma cepa dele derivada. As características da espécie traustoquitrídeo depositada sob o N° de Acesso na ATCC PTA9695 incluem suas propriedades de crescimento e fenotípicas (exemplos de propriedades fenotípicas incluem propriedades morfológicas e reprodutivas), suas propriedades físicas e químicas (por exemplo, pesos secos e perfis lipídicos), e suas seqüências gênicas. Em algumas modalidades, os traustoquitrídeos isolados da invenção possuem propriedades
47/208 fenotípicas substancialmente idênticas do traustoquitrídeo depositado sob o N° de Acesso na ATCC PTA-9695. Em algumas modalidades, os traustoquitrídeos isolados da invenção possuem propriedades de crescimento substancialmente idênticas do traustoquitrídeo depositado sob o N° de Acesso na ATCC PTA-9695.
[108] Em algumas modalidades, a invenção é dirigida a um mutante, variante ou recombinante de um traustoquitrídeo isolado da invenção, em que os acidos graxos totais produzidos pelo mutante, variante, ou recombinante compreendem cerca de 10% ou menos por peso de acido eicosapentaenóico.
Cepas mutantes podem ser produzidas por procedimentos bem conhecidos.
Procedimentos comuns incluem irradiação; tratamento em temperaturas elevadas;
tratamento com um mutageno.
Cepas variantes podem ser outros isolados de ocorrência natural e/ou subisolados das espécies aqui descritas. Cepas recombinantes podem ser produzidas por quaisquer métodos bem conhecidos em biologia molecular para a expressão de genes exógenos ou a alteração da função ou expressão do gene endógeno. Em algumas modalidades, a cepa mutante, variante ou recombinante produz uma quantidade maior de acidos graxos ômega-3, incluindo DHA e/ou EPA, algumas modalidades, do que a cepa do tipo selvagem. Em a cepa mutante, variante ou recombinante produz uma quantidade menor de um ou mais acidos graxos, por exemplo, quantidades menores de EPA,
ARA, DPA n-6, ou combinações destes. Em algumas modalidades, a cepa mutante, variante ou recombinante produz uma massa maior de células secas por litro de cultura do que a cepa do tipo selvagem. Essas cepas
48/208 mutantes, variantes ou recombinantes são exemplos de cepas derivadas de um traustoquitrídeo isolado da invenção.
[109] Em algumas modalidades, a invenção é dirigida a uma cepa mutante do traustoquitrídeo depositado sob o N° de Acesso na ATCC PTA-9695. Em modalidades adicionais, a cepa mutante é uma cepa depositada sob os Nos de Acesso na ATCC PTA-9696, PTA-9697 ou PTA-9698. As cepas de traustoquitrídeo associadas aos Nos de Acesso na ATCC PTA9696, PTA-9697 e PTA-9698 foram depositados sob o Tratado de Budapeste em 7 de janeiro de 2009 na American Type Culture Collection”, Depositório de Patentes, 10801 University Boulevard, Manassas, VA 201 10-2209. Essas cepas mutantes depositadas são derivadas do traustoquitrídeo depositado sob o N° de Acesso na ATCC PTA-9695.
[110] Em algumas modalidades, um traustoquitrídeo isolado da invenção, incluindo mutantes, variantes ou recombinantes deste, compreende um perfil de ácido graxo em uma ou mais frações isoladas do traustoquitrídeo. As (uma ou mais) frações isoladas do traustoquitrídeo inclui a fração de ácido graxo total, a fração de ésteres de esterol, a fração de triglicerídeo, a fração de ácido graxo livre, a fração de esterol, a fração de diglicerídeo, a fração polar (incluindo a fração de fosfolipídeo), e combinações destas.
[111] A presente invenção também é dirigida a uma cultura de traustoquitrídeo isolado que compreende qualquer um dos microorganismos traustoquitrídeo da invenção ou misturas destes. Em algumas modalidades, a cultura compreende pelo menos cerca de 5% de oxigênio dissolvido.
[112] A presente invenção também é dirigida a um
49/208 produto alimentício, composição cosmética ou farmacêutica para animais ou humanos que compreende qualquer um dos microorganismos traustoquitrídeo ou biomassas da invenção ou misturas destes.
[113] A presente invenção também é dirigida a um óleo microbiano que compreende uma fração de triglicerídeo de pelo menos cerca de 70% por peso, em que o teor de ácido docosahexaenóico da fração de triglicerídeo é pelo menos cerca de 50% por peso, e em que o teor de ácido docosapentaenóico n-6 da fração de triglicerídeo é de cerca de 0,5% por peso até cerca de 6% por peso. Em algumas modalidades, o óleo microbiano ainda compreende um teor de ácido araquidônico da fração de triglicerídeo de cerca de 1,5% ou menos por peso.
[114] A presente invenção também é dirigida a um óleo microbiano que compreende uma fração de triglicerídeo de pelo menos cerca de 70% por peso, em que o teor de ácido docosahexaenóico da fração de triglicerídeo é pelo menos cerca de 40% por peso, em que o teor de ácido docosapentaenóico n-6 da fração de triglicerídeo é de pelo menos cerca de 0,5% por peso até cerca de 6% por peso, e em que a proporção de ácido docosahexaenóico para ácido docosapentaenóico n-6 é mais do que cerca de 6:1.
[115] A presente invenção também é dirigida a um óleo microbiano que compreende uma fração de triglicerídeo de pelo menos cerca de 70% por peso, em que o teor de ácido docosahexaenóico da fração de triglicerídeo é pelo menos cerca de 60% por peso.
[116] Em algumas modalidades, pelo menos cerca de 20% dos triglicerídeos na fração de triglicerídeo do óleo
50/208 microbiano contêm ácido docosahexaenóico em duas posições no triglicerídeo selecionadas de quaisquer duas das posições sn-1, sn-2 e sn-3. Em algumas modalidades, pelo menos cerca de 5% dos triglicerídeos na fração de triglicerídeo do óleo microbiano contêm ácido docosahexaenóico em todas as três das posições sn-1, sn-2 e sn-3 no triglicerídeo.
[117] Em algumas modalidades, um microorganismo isolado da invenção, incluindo mutantes, variantes e recombinantes deste, compreende um perfil de ácido graxo em uma ou mais frações isoladas do microorganismo. As (uma ou mais) frações isoladas do microorganismo incluem a fração de ácido graxo total, a fração de ésteres de esterol, a fração de triacilglicerol, a fração de ácido graxo livre, a fração de esterol, a fração de diacilglicerol, a fração polar (incluindo a fração de fosfolipídeo), e combinações destas. O perfil de ácido graxo para uma fração específica pode incluir qualquer um dos perfis de ácido graxo associados à fração específica, como aqui revelado.
[118] A invenção é dirigida a um método de produção de um mutante que compreende a mutagênese de qualquer um dos microorganismos da invenção e o isolamento da cepa mutante.
Culturas e biomassas isoladas [119] A invenção é dirigida a uma cultura que compreende um ou mais microorganismos isolados da invenção. Vários parâmetros de fermentação para inoculação, crescimento e recuperação de microflora, por exemplo, microalgas e traustoquitrídeos, são conhecidos na técnica. Veja, por exemplo, a Patente U.S. N° 5.130.242, aqui incorporada por referência em sua totalidade. Meios
51/208 líquidos ou sólidos podem conter água do mar natural ou artificial. Fontes de carbono para crescimento heterotrófico incluem, sem limitação, glicose, frutose, xilose, sacarose, maltose, amido solúvel, melaço, fucose, glucosamina, dextrana, gorduras, óleos, glicerol, acetato de sódio e manitol. Fontes de nitrogênio incluem, sem limitação, peptona, extrato de levedura, polipeptona, extrato de malte, extrato de carne, ácido casamino, licor de maceração de milho, fontes de nitrogênio orgânico, glutamato de sódio, uréia, fontes de nitrogênio inorgânico, acetato de amônio, sulfato de amônio, cloreto de amônio e nitrato de amônio.
[120] Um meio típico para crescimento do microorganismo depositado sob o N° de Acesso na ATCC PTA10212 é mostrado na Tabela 1:
Tabela 1: Meio do vaso de PTA-10212.
Ingrediente Concentração Faixas
Na2SC>4 g/l 31,0 0-50, 15-45 ou 25-35
NaCl g/l 0,625 0-25, 0,1-10 ou 0,5-5
KCl g/l 1,0 0-5, 0,25-3 ou 0,5-2
MgSC4.7H2C g/l 5,0 0-10, 2-8, ou 3-6
(NH4)2SC4 g/l 0,44 0-10, 0,25-5 ou 0,05-3
MSG.1H2C g/l 6,0 0-10, 4-8, ou 5-7
CaCl2 g/l 0,29 0,1-5, 0,15-3 ou 0,2-1
T 154 (extrato
de levedura) g/l 6,0 0-20, 0,1-10, ou 1-7
KH2PC4 g/l 0,8 0,1-10, 0,5-5 ou 0,6-1,8
Pós-autoclave (metais)
Ácido cítrico mg/l 3,5 0,1-5000, 10-3000 ou 3-2500
52/208
FeSO4.7H2O mg/l 10,30 0,1-100, 1-50 ou 5-25
MnCl2.4H2O mg/l 3,10 0,1-100, 1-50 ou 2-25
ZnSO4.7H2O mg/l 3,10 0,01-100, 1-50 ou 2-25
CoCl2.6H2O mg/l 0,04 0-1, 0,001-0,1 ou 0,01-0,1
Na2MoO4.2H2O mg/l 0,04 0,001-1, 0,005-0,5 ou 0,01- 0,1
CuSO4.5H2O mg/l 2,07 0,1-100, 0,5-50 ou 1-25
NiSO4.6H2O mg/l 2,07 0,1-100, 0,5-50 ou 1-25
Pós-autoclave (vitaminas)
Tiamina mg/l 9,75 0,1-100, 1-50 ou 5-25
Vitamina B12 mg/l 0,16 0,01-100, 0,05-5 ou 0,1-1
Ca^ pantotenato mg/l 2,06 0,1-100, 0,1-50 ou 1-10
Biotina mg/l 3,21 0,1-100, 0,1-50 ou 1-10
Pós-autoclave (carbono)
Glicerol g/l 30,0 5-150, 10-100 ou 20-50
Alimentação de nitrogênio:
Ingrediente Concentração
MSG.1H2O g/l 17 0-150, 10-100 ou 15-50
Condições de cultivo típicas incluiriam o seguinte:
pH cerca de 6,5 - cerca de 9,5, cerca de 6,5 - cerca de 8,0 ou cerca de 6,8 - cerca de 7,8;
Temperatura: cerca de 15 - cerca de 30 graus Celsius, cerca de 18 - cerca de 28 graus Celsius ou cerca de 21 até cerca de 23 graus Celsius;
Oxigênio dissolvido: cerca de 0,1 - cerca de 100% de saturação, cerca de 5 - cerca de 50% de saturação, ou cerca de 10 - cerca de 30% de saturação; e/ou
Glicerol controlado @: cerca de 5 - cerca de 50 g/l, cerca de 10 - cerca de 40 g/l ou cerca de 15 - cerca de 35
53/208 g/l.
[121] Em algumas modalidades, o microorganismo depositado sob o N° de Acesso na ATCC PTA-10212, ou um mutante, variante, ou recombinante deste, cresce heterotroficamente em glicerol como a fonte de carbono, mas não cresce em glicose como a fonte de carbono.
[122] Um meio típico para crescimento do microorganismo depositado sob o N° de Acesso na ATCC PTA10208 é mostrado na Tabela 2:
Tabela 2: Meio do vaso de PTA-10208.
Ingrediente Concentração Faixas
Na2SC>4 g/l 8,8 0-25, 2-20 ou 3-10
NaCl g/l 0,625 0-25, 0,1-10 ou 0,5-5
KCl g/l 1,0 0-5, 0,25-3 ou 0,5-2
MgSC4.7H2C g/l 5,0 0-10, 2-8, ou 3-6
(NH4)2SC4 g/l 0,42 0-10, 0,25-5 ou 0,05-3
CaCl2 g/l 0,29 0,1 -5, 0,15-3 ou 0,2- 1
T 154 (extrato g/l 1,0 0-20, 0,1-10 ou 0,5-5
de levedura)
KH2PC4 g/l 1,765 0,1 -10, 0,5-5 ou 1-3
Pós-autoclave (metais)
Ácido cítrico mg/l 46,82 0,1-5000, 10-3000 ou 40-
2500
FeSC4.7H2C mg/l 10,30 0,1 -100, 1-50 ou 5-25
MnCl2.4H2C mg/l 3,10 0,1 -100, 1-50 ou 2-25
ZnSC4.7H2C mg/l 9,3 0,01 -100, 1 -50 ou 2-25
CoCl2-6H2C mg/l 0,04 0-1, 0,001 -0,1 ou 0,01-
0,1
Na2MoC4-2H2C mg/l 0,04 0,001- 1, 0,005-0,5 ou
0,01-0,1
54/208
CuSO4-5H2O mg/l 2,07 0,1-100, 0,5-50 ou 1-25
NiSO4-6H2O mg/l 2,07 0,1-100, 0,5-50 ou 1-25
Pós-autoclave (vitaminas)
Tiamina mg/l 9,75 0,1-100, 1-50 ou 5-25
Ca^-pantotenato mg/l 3,33 0,1 -100, 0,1 -50 ou 1 -10
Biotina mg/l 3,58 0,1-100, 0,1 -50 ou 1 - 10
Pós-autoclave (carbono)
Glicose g/l 30,0 5-150, 10-100 ou 20-50
Alimentação de nitrogênio:
Ingrediente Concentração
nh4oh ml/l 23,6 0-150, 10-100 ou 15-50
Condições de cultivo típicas incluiriam o seguinte:
pH cerca de 6,5 - cerca de 8,5, cerca de 6,5 - cerca de 8,0 ou cerca de 7,0 - cerca de 8,0;
Temperatura: cerca de 17 - cerca de 30 graus Celsius, cerca de 20 - cerca de 28 graus Celsius ou cerca de 22 até cerca de 24 graus Celsius;
Oxigênio dissolvido: cerca de 2 - cerca de 100% de saturação, cerca de 5 - cerca de 50% de saturação, ou cerca de 7 - cerca de 20% de saturação; e/ou
Glicose controlada @: cerca de 5 - cerca de 50 g/l, cerca de 10 - cerca de 40 g/l ou cerca de 20 - cerca de 35 g/l.
[123] Em algumas modalidades, o volume de fermentação (volume de cultura) é de pelo menos cerca de 2 litros, pelo menos cerca de 10 litros, pelo menos cerca de 50 litros, pelo menos cerca de 100 litros, pelo menos cerca de 200 litros, pelo menos cerca de 500 litros, pelo menos cerca de 1.000 litros, pelo menos cerca de 10.000 litros, pelo menos cerca de 20.000 litros, pelo menos cerca de 50.000 litros,
55/208 pelo menos cerca de 100.000 litros, pelo menos cerca de 150.000 litros, pelo menos cerca de 200.000 litros, ou pelo menos cerca de 250.000 litros. Em algumas modalidades, o volume de fermentação é de cerca de 2 litros até cerca de 300.000 litros, cerca de 2 litros, cerca de 10 litros, cerca de 50 litros, cerca de 100 litros, cerca de 200 litros, cerca de 500 litros, cerca de 1.000 litros, cerca de 10.000 litros, cerca de 20.000 litros, cerca de 50.000 litros, cerca de 100.000 litros, cerca de 150.000 litros, cerca de 200.000 litros, cerca de 250.000 litros ou cerca de 300.000 litros.
[124] Em algumas modalidades, a invenção é dirigida a uma biomassa isolada que compreende um perfil de ácido graxo da invenção. Em algumas modalidades, pelo menos cerca de 20%, pelo menos cerca de 25%, pelo menos cerca de 30%, pelo menos cerca de 35%, pelo menos cerca de 40%, pelo menos cerca de 45%, pelo menos cerca de 50%, pelo menos cerca de 55%, pelo menos cerca de 60%, pelo menos cerca de 65%, pelo menos cerca de 70%) , pelo menos cerca de 75% ou pelo menos cerca de 80% da massa de células secas da biomassa são ácidos graxos. Em algumas modalidades, mais do que cerca de 20%, mais do que cerca de 25%, mais do que cerca de 30%, mais do que cerca de 35%, mais do que cerca de 40%, mais do que cerca de 45%), mais do que cerca de 50%, mais do que cerca de 55% ou mais do que cerca de 60% da massa de células secas da biomassa são ácidos graxos. Em algumas modalidades, cerca de 20% até cerca de 55%, cerca de 20% até cerca de 60%, cerca de 20% até cerca de 70%, cerca de 20% até cerca de 80%, cerca de 30% até cerca de 55%, cerca de 30% até cerca de 70%, cerca de 30% até cerca
56/208 de 80%, cerca de 40% até cerca de 60%, cerca de 40% até cerca de 70%, cerca de 40% até cerca de 80%, cerca de 50% até cerca de 60%, cerca de 50% até cerca de 70%, cerca de 50% até cerca de 80%, cerca de 55% até cerca de 70%, cerca de 55% até cerca de 80%, cerca de 60% até cerca de 70% ou cerca de 60% até cerca de 80% por peso da massa de células secas da biomassa são ácidos graxos. Em algumas modalidades, a biomassa compreende mais do que cerca de 10%, pelo menos cerca de 12%, pelo menos cerca de 15%, pelo menos cerca de 20%, pelo menos cerca de 25%, pelo menos cerca de 30%, pelo menos cerca de 35%, pelo menos cerca de 40% ou pelo menos cerca de 45% por peso dos ácidos graxos como EPA. Em algumas modalidades, a biomassa compreende cerca de 10% até cerca de 55%, cerca de 12% até cerca de 55%, cerca de 15% até cerca de 55%, cerca de 20% até cerca de 55%, cerca de 20% até cerca de 40% ou cerca de 20% até cerca de 30% por peso dos ácidos graxos como EPA. Em algumas modalidades, a biomassa compreende uma fração de triacilglicerol, em que pelo menos cerca de 12%, pelo menos cerca de 13%, pelo menos cerca de 14%, pelo menos cerca de 15%, pelo menos cerca de 16%, pelo menos cerca de 17%, pelo menos cerca de 18%, pelo menos cerca de 19% ou pelo menos cerca de 20% por peso da fração de triacilglicerol é EPA. Em algumas modalidades, a biomassa compreende uma fração de triacilglicerol, em que o teor de EPA da fração de triacilglicerol é de pelo menos cerca de 12% até cerca de 55%, cerca de 12% até cerca de 50%, cerca de 12% até cerca de 45%, pelo menos cerca de 12% até cerca de 40%, pelo menos cerca de 12% até cerca de 35% ou pelo menos cerca de 12% até cerca de 30%, cerca de 15% até cerca de 55%, cerca
57/208 de 15% até cerca de 50%, cerca de 15% até cerca de 45%, cerca de 15% até cerca de 40%, cerca de 15% até cerca de 35%, cerca de 15% até cerca de 30%, cerca de 20% até cerca de 55%, cerca de 20% até cerca de 50%, cerca de 20% até cerca de 45%, pelo menos cerca de 20% até cerca de 40%, pelo menos cerca de 20% até cerca de 35% ou cerca de 20% até cerca de 30% por peso. Em algumas modalidades, pelo menos cerca de 20%, pelo menos cerca de 25%, pelo menos cerca de 30%, pelo menos cerca de 35%, pelo menos cerca de 40%, pelo menos cerca de 50% ou pelo menos cerca de 60% por peso da massa de células secas da biomassa é DHA. Em algumas modalidades, cerca de 20% até cerca de 60%, cerca de 25% até cerca de 60%, cerca de 25%) até cerca de 50%, cerca de 25% até cerca de 45%, cerca de 30% até cerca de 50% ou cerca de 35% até cerca de 50% por peso da massa de células secas da biomassa é DHA. Em algumas modalidades, a biomassa compreende cerca de 10% ou menos, cerca de 9% ou menos, cerca de 8% ou menos, cerca de 7% ou menos, cerca de 6% ou menos, cerca de 5% ou menos, cerca de 4% ou menos, cerca de 3% ou menos, cerca de 2% ou menos, ou cerca de 1% ou menos por peso dos ácidos graxos como DHA. Em algumas modalidades, a biomassa compreende cerca de 1% até cerca de 10%, cerca de 1% até cerca de 5%, cerca de 2% até cerca de 5%, cerca de 3% até cerca de 5% ou cerca de 3% até cerca de 10% por peso dos ácidos graxos como DHA. Em algumas modalidades, a biomassa é substancialmente livre de DHA. Em algumas modalidades, a biomassa compreende cerca de 0,1% a menos do que cerca de 5%, cerca de 0,1% até cerca de 4%, cerca de 0,1% até cerca de 3%, cerca de 0,1% até cerca de 2%, cerca de 0,2% a menos do que cerca de 5%, cerca de 0,2%
58/208 até cerca de 4%, cerca de 0,2% até cerca de 3%, cerca de 0,2% até cerca de 2%, cerca de 0,3% até cerca de 2%, cerca de 0,1% até cerca de 0,5%, cerca de 0,2% até cerca de 0,5%, cerca de 0,1%) até cerca de 0,4%, cerca de 0,2% até cerca de 0,4%, cerca de 0,5% até cerca de 2%, cerca de 1% até cerca de 2%, cerca de 0,5% até cerca de 1,5% ou cerca de 1% até cerca de 1,5% por peso dos ácidos graxos como ARA. Em algumas modalidades, a biomassa compreende menos do que cerca de 5%, cerca de 4% ou menos, cerca de 3% ou menos, cerca de 2% ou menos, cerca de 1,5% ou menos, cerca de 1% ou menos, cerca de 0,5% ou menos, cerca de 0,4% ou menos, cerca de 0,3% ou menos, cerca de 0,2% ou menos, ou cerca de 0,1% ou menos por peso dos ácidos graxos como ARA. Em algumas modalidades, a biomassa é substancialmente livre de ARA. Em algumas modalidades, a biomassa compreende cerca de
0,4% até cerca de 2%, cerca de 0,4% até cerca de 3%, cerca de 0,4% até cerca de 4%, cerca de 0,4% até cerca de 5%, cerca de 0,4% a menos do que cerca de 5%, cerca de 0,5% até cerca de 1%, cerca de 0,5% até cerca de 2%, cerca de 0,5% até cerca de 3%, cerca de 0,5% até cerca de 4%, cerca de
0,5% até cerca de 5%, cerca de 0,5% a menos do que cerca de
5%, cerca de 1% até cerca de 2%, cerca de 1% até cerca de
3%, cerca de 1% até cerca de 4%, cerca de 1% até cerca de
5% ou cerca de 1% a menos do que cerca de 5% por peso dos
ácidos graxos como DPA n-6 . Em algumas modalidades, a
biomassa compreende cerca de 5% ou menos , menos do que
cerca de 5%, cerca de 4% ou menos, cerca de 3% ou menos, cerca de 2% ou menos, cerca de 1% ou menos, cerca de 0,75% ou menos, cerca de 0,6% ou menos, ou cerca de 0,5% ou menos por peso dos ácidos graxos como DPA n-6. Em algumas
59/208 modalidades, a biomassa é substancialmente livre de DPA n6. Em algumas modalidades, a biomassa compreende ácidos graxos com cerca de 5% ou menos, menos do que cerca de 5%, cerca de 4% ou menos, cerca de 3% ou menos, ou cerca de 2% ou menos por peso de ácido oléico (18:1 n-9), ácido linoléico (18:2 n-6), ácido linolênico (18:3 n-3), ácido eicosenóico (20:1 n-9), ácido erúcico (22:1 n-9), ou combinações destes.
[125] As características de uma biomassa isolada da invenção estão associadas às propriedades endógenas ou nativas da biomassa isolada, e não com materiais introduzidas de forma exógena. Em algumas modalidades, a biomassa isolada não contém polivinilpirrolidona ou não é isolada de uma cultura que contém polivinilpirrolidona.
[126] A presente invenção é dirigida a um método de produção de uma biomassa. Em algumas modalidades, o método para produção de uma biomassa da invenção compreende o crescimento de qualquer um dos microorganismos isolados da invenção ou misturas destes em uma cultura para produzir uma biomassa. A presente invenção é dirigida a uma biomassa produzida pelo método.
[127] Em algumas modalidades, a biomassa compreende ácidos graxos, em que os ácidos graxos ainda compreendem ácidos graxos ômega-3 poliinsaturados, em que os ácidos graxos ômega-3 poliinsaturados compreendem DHA e EPA em uma quantidade de cerca de >90%, por peso, da quantidade total de ácidos graxos ômega-3 poliinsaturados e a quantidade de EPA, por peso, é de cerca de 6% até cerca de 65% da quantidade total de EPA e DHA. É particularmente fornecida uma biomassa em que a quantidade de EPA, por peso, é de
60/208 cerca de 6% até cerca de 28% da quantidade total de EPA e DHA. É ainda aqui fornecida uma biomassa em que a quantidade de EPA, por peso, é de cerca de 36% até cerca de 65 da quantidade total do EPA e DHA. Mais particularmente, é fornecida uma biomassa em que a quantidade de EPA, por peso, é de cerca de 28% até cerca de 36% da quantidade total de EPA e DHA.
[128] Algumas modalidades aqui fornecidas compreendem uma biomassa que compreende ácidos graxos, em que os ácidos graxos ainda compreendem DHA e EPA e a quantidade de EPA, por peso, é de cerca de 15 até cerca de 60% do peso total de EPA e DHA.
[129] Algumas modalidades da invenção são ainda dirigidas a uma cultura que compreende um traustoquitrídeo, ou uma cepa mutante, depositado sob o N° de Acesso na ATCC PTA-9695. Vários parâmetros de fermentação para inoculação, crescimento e recuperação de microflora são conhecidos na técnica como, por exemplo, descritos na Patente U.S. N° 5.130.242. Qualquer meio convencional para o crescimento de traustoquitrídeos pode ser usado. Meios líquidos ou sólidos podem conter água do mar natural ou artificial. Fontes de carbono incluem, sem limitação, glicose, frutose, xilose, sacarose, maltose, amido solúvel, melaço, fucose, glucosamina, dextrana, gorduras, óleos, glicerol, acetato de sódio e manitol. Fontes de nitrogênio incluem, sem limitação, peptona, extrato de levedura, polipeptona, extrato de malte, extrato de carne, ácido casamino, licor de maceração de milho, fontes de nitrogênio orgânico, glutamato de sódio, uréia, fontes de nitrogênio inorgânico, acetato de amônio, sulfato de amônio, cloreto de amônio,
61/208 amônio nitrato, sulfato de sódio. Um meio típico é mostrado na Tabela 3.
Tabela 3: Meio do vaso de Meio do vaso de PTA-9695.
Ingrediente Concentração Faixas
NaCl g/l 12,5 0-25, 5-20 ou 10-15
KCl g/l 1,0 0-5, 0,25-3 ou 0,5-2
MgSO4-7H2O g/l 5,0
(NH4ESO4 g/l 0,6 0-10, 0,25-5 ou 0,5-3
CaCl2 g/l 0,29 0,1-5, 0,1 5-3 ou 0,2-1
T 154 (extrato de levedura) g/l 6,0 0-20, 1-15 ou 5-10
KH2PO4 g/l 1,2 0,1-10, 0,5-5 ou 1-3
Pós-autoclave (metais)
Ácido cítrico mg/l 3,5 0,1-100, 1-50 ou 2-25
FeSO4-7H2O mg/l 10,30 0,1-100, 1-50 ou 5-25
MnCl2-4H2O mg/l 3,10 0,1-100, 1-50 ou 2-25
ZnSO4 7H2O mg/l 3,10 0,1-100, 1-50 ou 2-25
CoCl2-6H2O mg/l 0,04 0,001-1, 0,005-0,5 ou 0,01-0,1
Na2MoO4-2H2O mg/l 0,04 0,001 -1, 0,005-0,5 ou 0,01-0,1
CUSO4-5H2O mg/l 2,07 0,1-100, 0,5-50 ou 1 -25
NiSO4-6H2O mg/l 2,07 0,1-100, 0,5-50 ou 1 -25
Pós-autoclave (vitaminas)
Tiamina** mg/l 9,75 0,1-100, 1-50 ou 5-25
Vitamina B12** mg/l 0,16 0,1-100, 0,1 -10 ou 0,1- 1
Ca^pantotenato** mg/l 3,33 0,1 -100, 0,1-50 ou 1-10
** Esterilizada por filtro
62/208
Pós-autoclave (carbono)
Glicose g/l 30,0 5-150, 10-100 ou 20-50
Alimentação de nitrogênio
Ingrediente Concentração
nh4oh ml/l 21,6 0-150, 10- 100 ou 15-50
Condições de cultivo típicas incluiriam o seguinte:
pH cerca de 6,5 - cerca de 8,5, cerca de 6,5 - cerca de 8,0 ou cerca de 7,0 - cerca de 7,5.
Temperatura: cerca de 17 - cerca de 30 graus Celsius, cerca de 20 - cerca de 25 graus Celsius ou cerca de 22 até cerca de 23 graus Celsius;
Oxigênio dissolvido: cerca de 5 - cerca de 100% de saturação, cerca de 10 - cerca de 80% de saturação, ou cerca de 20 - cerca de 50% de saturação;
Glicose controlada @: cerca de 5 - cerca de 50 g/l, cerca de 10 - cerca de 40 g/l ou cerca de 20 - cerca de 35 g/l.
[130] Em algumas modalidades, o meio de cultura compreende pelo menos cerca de 5%, pelo menos cerca de 10%, pelo menos cerca de 20%, pelo menos cerca de 30%, pelo menos cerca de 40%, pelo menos cerca de 50%, pelo menos cerca de 60%, pelo menos cerca de 70%, pelo menos cerca de 80% ou pelo menos cerca de 90% de oxigênio dissolvido, como uma percentagem do nível de saturação. Em algumas modalidades, o meio de cultura compreende de cerca de 5% até cerca de 20%, cerca de 5% até cerca de 50%, cerca de 5% até cerca de 100%, cerca de 10% até cerca de 20%, cerca de 10% até cerca de 50%, cerca de 10% até cerca de 100%, cerca de 20% até cerca de 50% ou cerca de 20% até cerca de 100% de oxigênio dissolvido, como uma percentagem do nível de
63/208 saturação.
[131] A invenção é ainda dirigida a uma biomassa isolada de um traustoquitrídeo da invenção. Uma biomassa de traustoquitrídeo isolado da invenção é uma biomassa celular colhida obtida por qualquer método convencional para o isolamento de uma biomassa de traustoquitrídeo, tal como descrito na Patente U.S. N° 5.130.242 e Publicação de Pedido U.S. N° 2002/0001833.
[132] Em algumas modalidades, a massa de células secas da biomassa isolada de cada litro de cultura é de pelo menos cerca de 5 0 g, pelo menos cerca de 6 0 g, pelo menos cerca de 70 g, pelo menos cerca de 80 g, pelo menos cerca de 100 g, pelo menos cerca de 120 g, pelo menos cerca de 140 g, pelo menos cerca de 160 g, pelo menos cerca de 180 g, ou pelo menos cerca de 200 g após crescimento por cerca de 7 dias a cerca de 17°C até cerca de 30°C em um meio de cultura de pH de cerca de 6,5 até cerca de 8,5 que compreende fontes de carbono, nitrogênio e nutrientes, e cerca de 950 ppm até cerca de 8.500 ppm de íons cloreto. Em algumas modalidades, a massa de células secas da biomassa isolada de cada litro de cultura é de pelo menos cerca de 50 g, pelo menos cerca de 60 g, pelo menos cerca de 70 g, pelo menos cerca de 80 g, pelo menos cerca de 100 g, pelo menos cerca de 120 g, pelo menos cerca de 140 g, pelo menos
cerca de 160 g, pelo menos cerca de 180 g, ou pelo menos
cerca de 200 g após crescimento por cerca de 7 dias a cerca
de 17°C, a cerca de 18°C, a cerca de 19°C, a cerca de 20°C,
a cerca de 21°C, a cerca de 22°C, a cerca de 23°C, a cerca
de 24°C, a cerca de 25°C, a cerca de 26°C, a cerca de 27°C,
a cerca de 28°C, a cerca de 29°C, ou a cerca de 30°C em um
64/208 meio de cultura de pH de cerca de 6,5, pH de cerca de 7, pH de cerca de 7,5, pH de cerca de 8,0 ou pH de cerca de 8,5 que compreende fontes de carbono, nitrogênio e nutrientes, e cerca de 950 ppm até cerca de 8.500 ppm de íons cloreto. Em algumas modalidades, a massa de células secas da biomassa isolada de cada litro de cultura é de cerca de 50 g até cerca de 200 g após crescimento por cerca de 7 dias a cerca de 17°C até cerca de 30°C em um meio de cultura de pH de cerca de 6,5 até pH de cerca de 8,5 que compreende fontes de carbono, nitrogênio e nutrientes, e cerca de 950 ppm até cerca de 8.500 ppm de íons cloreto. Em algumas modalidades, a massa de células secas da biomassa isolada de cada litro de cultura é de cerca de 50 g até cerca de
200 g após crescimento por cerca de 7 dias a cerca de 17°C,
a cerca de 18°C, a cerca de 19°C , a cerca de 20°C, a cerca
de 21°C, a cerca de 22°C, a cerca de 23°C, a cerca de 24°C,
a cerca de 25°C, a cerca de 26°C , a cerca de 27°C, a cerca
de 28°C, a cerca de 29°C, ou a cerca de 30 °C em um meio de
cultura de pH de cerca de 6,5, pH de cerca de 7 pH de
cerca de 7, 5, pH de cerca de 8,0 ou pH de cerca de 8 ,5 que
compreende fontes de carbono, nitrogênio e nutrientes, e cerca de 950 ppm até cerca de 8.500 ppm de íons cloreto.
[133] Em algumas modalidades, a cultura de traustoquitrídeo isolado possui uma produtividade de ácido graxo ômega-3 de pelo menos cerca de 2 g/l/dia, pelo menos cerca de 4 g/l/dia ou pelo menos cerca de 8 g/l/dia após crescimento por cerca de 7 dias a cerca de 17°C até cerca de 30°C em um meio de cultura de pH de cerca de 6,5 até pH de cerca de 8,5 que compreende fontes de carbono, nitrogênio e nutrientes, e cerca de 950 ppm até cerca de
65/208
8.500 ppm de íons cloreto. Em algumas modalidades, a cultura de traustoquitrídeo isolado possui uma produtividade de ácido graxo ômega-3 entre cerca de 1 g/l/dia até cerca de 20 g/l/dia, cerca de 2 g/l/dia até cerca de 15 g/l/dia, cerca de 2 g/l/dia até cerca de 10 g/l/dia, cerca de 3 g/l/dia até cerca de 10 g/l/dia ou cerca de 4 g/l/dia até cerca de 9 g/l/dia, após crescimento por cerca de 7 dias a cerca de 17°C até cerca de 30°C em um meio de cultura de pH de cerca de 6,5 até pH de cerca de 8,5 que compreende fontes de carbono, nitrogênio e nutrientes, e cerca de 950 ppm até cerca de 8.500 ppm de íons cloreto.
[134| Em algumas modalidades, o volume de fermentação (volume de cultura) é de pelo menos cerca de 2 litros, pelo menos cerca de 10 litros, pelo menos cerca de 50 litros, pelo menos cerca de 100 litros, pelo menos cerca de 200 litros, pelo menos cerca de 500 litros, pelo menos cerca de 1.000 litros, pelo menos cerca de 10.000 litros, pelo menos cerca de 20.000 litros, pelo menos cerca de 50.000 litros, pelo menos cerca de 100.000 litros, pelo menos cerca de 150.000 litros, pelo menos cerca de 200.000 litros, ou pelo menos cerca de 250.000 litros. Em algumas modalidades, o volume de fermentação é de cerca de 2 litros até cerca de 300.000 litros, cerca de 2 litros, cerca de 10 litros, cerca de 50 litros, cerca de 100 litros, cerca de 200 litros, cerca de 500 litros, cerca de 1.000 litros, cerca de 10.000 litros, cerca de 20.000 litros, cerca de 50.000 litros, cerca de 100.000 litros, cerca de 150.000 litros, cerca de 200.000 litros, cerca de 250.000 litros ou cerca de 300.000 litros.
66/208 [135] Em algumas modalidades, a invenção é dirigida a uma biomassa de traustoquitrídeo isolado que compreende um perfil de ácido graxo da invenção. Em algumas modalidades, pelo menos cerca de 50%, pelo menos cerca de 60%, pelo menos cerca de 7 0% ou pelo menos cerca de 80% da massa de células secas da biomassa são ácidos graxos. Em algumas modalidades, mais do que cerca de 50%, mais do que cerca de 55% ou mais do que cerca de 60% da massa de células secas da biomassa são ácidos graxos. Em algumas modalidades, de cerca de 50% até cerca de 60%, cerca de 50% até cerca de 70%, cerca de 50% até cerca de 80%, cerca de 55% até cerca de 70%, cerca de 55% até cerca de 80%, cerca de 60% até cerca de 70% ou cerca de 60% até cerca de 80% por peso da massa de células secas da biomassa são ácidos graxos. Em algumas modalidades, a biomassa compreende pelo menos cerca de 50%, pelo menos cerca de 60%, pelo menos cerca de 70% ou pelo menos cerca de 80% por peso dos ácidos graxos como ácidos graxos ômega-3. Em algumas modalidades, a biomassa compreende de cerca de 50% até cerca de 60%, cerca de 50% até cerca de 70%, cerca de 50% até cerca de 80% por peso dos ácidos graxos como ácidos graxos ômega-3. Em algumas modalidades, a biomassa compreende pelo menos cerca de 50%, pelo menos cerca de 55%, pelo menos cerca de 60%, pelo menos cerca de 65%, pelo menos cerca de 70%, pelo menos cerca de 75% ou pelo menos cerca de 80% por peso dos ácidos graxos como DHA. Em algumas modalidades, a biomassa compreende de cerca de 50% até cerca de 60%, cerca de 50% até cerca de 70% ou cerca de 50% até cerca de 80% por peso dos ácidos graxos como DHA. Em algumas modalidades, pelo menos cerca de 25%, pelo menos cerca de 30%, pelo menos
67/208 cerca de 40%, pelo menos cerca de 50% ou pelo menos cerca de 60% por peso da massa de células secas da biomassa é ácido docosahexaenóico. Em algumas modalidades, cerca de 25% até cerca de 65%, cerca de 25% até cerca de 50%, cerca de 30% até cerca de 40% ou cerca de 25% até cerca de 35% por peso da massa de células secas da biomassa é ácido docosahexaenóico. Em algumas modalidades, a biomassa compreende cerca de 10% ou menos, cerca de 9% ou menos, cerca de 8% ou menos, cerca de 7% ou menos, cerca de 6% ou menos, cerca de 5% ou menos, cerca de 4% ou menos, cerca de 3% ou menos, cerca de 2% ou menos, ou cerca de 1% ou menos por peso dos ácidos graxos como EPA. Em algumas modalidades, a biomassa compreende de cerca de 1% até cerca de 10%, cerca de 1% até cerca de 5%, cerca de 2% até cerca de 5%, cerca de 3% até cerca de 5% ou cerca de 3% até cerca de 10% por peso dos ácidos graxos como EPA. Em algumas modalidades, a biomassa é substancialmente livre de EPA. Em algumas modalidades, a biomassa compreende uma proporção de peso de DHA para EPA de pelo menos cerca de 5:1, pelo menos cerca de 7:1, pelo menos cerca de 10:1, pelo menos cerca de 11:1, pelo menos cerca de 14:1, pelo menos cerca de 15:1, pelo menos cerca de 17:1, pelo menos cerca de 20:1, pelo menos cerca de 25:1, pelo menos cerca de 50:1 ou pelo menos cerca de 100:1, em que a biomassa compreende cerca de 10% ou menos por peso dos ácidos graxos como EPA. Em algumas modalidades, a biomassa compreende de cerca de 0,1% a 0,2%, cerca de 0,1% até cerca de 0,3%, cerca de 0,1% até cerca de 0,4%, cerca de 0,1% até cerca de 0,5% ou cerca de 0,1% até cerca de 1,5% por peso dos ácidos graxos como ARA. Em algumas modalidades, a biomassa compreende cerca de 1,5% ou
68/208 menos, cerca de 1% ou menos, cerca de 0,5% ou menos, cerca de 0,4% ou menos, cerca de 0,3% ou menos, cerca de 0,2% ou menos, ou cerca de 0,1% ou menos por peso dos ácidos graxos como ARA. Em algumas modalidades, a biomassa é substancialmente livre de ARA. Em algumas modalidades, a biomassa compreende uma proporção de peso de DHA para ARA de pelo menos cerca de 20:1, pelo menos cerca de 40:1, pelo menos cerca de 60:1, pelo menos cerca de 80:1, pelo menos cerca de 100:1, pelo menos cerca de 150:1, pelo menos cerca de 200:1, pelo menos cerca de 250:1 ou pelo menos cerca de 300:1. Em algumas modalidades, a biomassa compreende de cerca de 0,5% até cerca de 1%, cerca de 0,5% até cerca de 2%, cerca de 0,5% até cerca de 5%, cerca de 0,5% até cerca de 6%, cerca de 1% até cerca de 5%, cerca de 1% até cerca de 6%, cerca de 2% até cerca de 5% ou cerca de 2% até cerca de 6% por peso dos ácidos graxos como DPA n-6. Em algumas modalidades, a biomassa compreende cerca de 6% ou menos, cerca de 5% ou menos, cerca de 2% ou menos, cerca de 1% ou menos, ou cerca de 0,5% ou menos por peso dos ácidos graxos como DPA n-6. Em algumas modalidades, a biomassa é substancialmente livre de DPA n-6. Em algumas modalidades, a biomassa compreende uma proporção de peso de DHA para DPA n-6 de mais do que cerca de 6:1, pelo menos cerca de 8:1, pelo menos cerca de 10:1, pelo menos cerca de 15:1, pelo menos cerca de 20:1, pelo menos cerca de 25:1, pelo menos cerca de 50:1 ou pelo menos cerca de 100:1. Em algumas modalidades, a biomassa compreende ácidos graxos com cerca de 5% ou menos, cerca de 4% ou menos, cerca de 3% ou menos, ou cerca de 2% ou menos por peso de cada um de ácido linoléico (18:2 n-6), ácido linolênico (18:3 n-3), ácido
69/208 eicosenóico (20:1 n-9) e ácido erúcico (22:1 n-9).
[136] Em outra modalidade, é aqui fornecida uma biomassa que compreende ácidos graxos, em que os ácidos graxos ainda compreendem ácidos graxos ômega-3 poliinsaturados, em que os ácidos graxos ômega-3 poliinsaturados compreendem DHA e
EPA em uma quantidade aproximadamente maior ou igual a cerca de 58-68%, particularmente cerca de 60% por peso, da quantidade total de ácidos graxos ômega-3 poliinsaturados e a quantidade de EPA, por peso, é de cerca de 5% até cerca de 60% da quantidade total do peso total do EPA e DHA.
[137] As características de uma biomassa isolada da invenção estão associadas às propriedades endógenas ou nativas da biomassa isolada, e não do material introduzido de forma exógena.
Óleos microbianos [138] São aqui fornecidos óleos, em particular óleos microbianos, feitos pelos métodos descritos acima.
[139] Em algumas modalidades, o óleo microbiano compreende ácidos graxos, em que os ácidos graxos ainda compreendem ácidos graxos ômega-3 poliinsaturados, em que os ácidos graxos ômega-3 poliinsaturados compreendem DHA e
EPA em uma quantidade de cerca de >90%, por peso, da quantidade total de ácidos graxos ômega-3 poliinsaturados e a quantidade de EPA, por peso, é de cerca de 6% até cerca de 65% da quantidade total de EPA e DHA. É particularmente fornecido um óleo microbiano em que a quantidade de EPA, por peso, é de cerca de 6% até cerca de 28% da quantidade total de EPA e DHA. É ainda aqui fornecido um óleo microbiano em que a quantidade de EPA, por peso, é de cerca
70/208 de 36% até cerca de da quantidade total do EPA e DHA.
Mais particularmente, é fornecido um óleo microbiano em que a quantidade de EPA, por peso, é de cerca de 28% até cerca de 36% da quantidade total de EPA e DHA.
[140] Em uma modalidade adicional, é aqui fornecido um óleo microbiano que compreende ácidos graxos, em que os ácidos graxos ainda compreendem DHA e EPA e a quantidade de
EPA, por peso, é de cerca de 15 até cerca de 60% do peso total de EPA e
DHA.
[141] Em outra modalidade, é aqui fornecido um óleo microbiano que compreende ácidos graxos, em que os ácidos graxos ainda compreendem ácidos graxos ômega-3 poliinsaturados, em que os ácidos graxos ômega-3 poliinsaturados compreendem
DHA e EPA em uma quantidade aproximadamente maior ou igual a cerca de 58-68%, particularmente cerca de
60%, por peso, da quantidade total de ácidos graxos ômega-3 poliinsaturados e a quantidade de
EPA, por peso, é de cerca de
5% até cerca de 60% da quantidade total do peso total do
EPA e DHA.
[142]
A invenção é dirigida a um óleo microbiano que compreende um perfil de ácido graxo da invenção. Um óleo microbiano da invenção é um óleo bruto” ou um óleo refinado” que compreende uma fração de triacilglicerol de pelo menos cerca de 35% por peso. Um óleo bruto” é um óleo que é extraído da biomassa do microorganismo sem processamento adicional. Um óleo refinado” é um óleo que é obtido por tratamento de um óleo bruto com processamentopadrão de refinamento, branqueamento e/ou desodorização. Veja, por exemplo, a Patente U.S. N° 5.130.242, aqui incorporada por referência em sua totalidade. Um óleo
71/208 microbiano também inclui um óleo final”, como aqui descrito, que é um óleo refinado que foi diluído com um óleo vegetal. Em algumas modalidades, um óleo final é um óleo refinado que foi diluído com óleo girassol rico em oléico. O termo microbiano”, como aqui usado, inclui, sem limitação, os termos microalga”, traustoquitrídeo” e classificações taxonômicas associadas com qualquer um dos microorganismos depositados aqui descritos. Os termos Thraustochytriales”, traustoquitrídeo”, Schizochytrium”, e Thraustochytrium” , como usados em referência a qualquer um dos óleos microbianos dos microorganismos depositados aqui descritos, são baseados em classificações taxonômicas presentes que incluem informação filogenética disponível e não visam ser limitantes caso as classificações taxonômicas sejam revisadas após a data de depósito do presente pedido.
[143] Em algumas modalidades, um ácido graxo como aqui descrito pode ser um éster de ácido graxo. Em algumas modalidades, um éster de ácido graxo inclui um éster de um ácido graxo ômega-3, ácido graxo ômega-6, e combinações destes. Em algumas modalidades, o éster de ácido graxo é um éster de DHA, um éster de EPA, ou uma combinação destes. Em algumas modalidades, um óleo ou fração deste, como aqui descrito, é esterificado para produzir um óleo ou fração deste que compreende ésteres de ácido graxo. O termo éster” se refere à substituição do hidrogênio no grupo ácido carboxílico da molécula de ácido graxo com outro substituinte. Ésteres típicos são conhecidos por aqueles
habilitados na técnica, cuja
Higuchi, T. e V. Stella em
Systems”, Vol. 14, A.
discussão é fornecida por 'Pro-drugs as Novel Delivery C.S. Symposium Series”,
72/208
Bioreversible Carriers in Drug Design”, Ed. Edward B. Roche, American Pharmaceutical Association”, Pergamon Press, 1987, e Protective Groups in Organic Chemistry”, McOmie ed., Plenum Press, Nova York, 1973. Exemplos de ésteres incluem metil, etil, propil, butil, pentil, tbutil, benzil, nitrobenzil, metoxibenzil, benzidril e tricloroetil. Em algumas modalidades, o éster é um grupo éster de proteção de ácido carboxílico, ésteres com aralquil (por exemplo, benzil, fenetil), ésteres com alquenil inferior (por exemplo, alil, 2-butenil), ésteres com alcóxi inferior-alquil inferior (por exemplo, metoximetil,
2-metoxietil,
2-etoxietil), ésteres com alcanoiloxi inferior-alquil inferior (por exemplo, acetoximetil pivaloiloximetil, 1-pivaloiloxietil), ésteres com alcoxicarbonil inferior-alquil inferior (por exemplo, metoxicarbonilmetil, isopropoxicarbonilmetil), ésteres com carbóxi-alquil inferior (por exemplo, carboximetil), ésteres com alcoxicarboniloxi inferior-alquil inferior (por exemplo, 1(etoxicarboniloxi)etil,
1(ciclohexiloxicarboniloxi)etil), ésteres com carbamoiloxi alquil inferior (por exemplo, carbamoiloximetil), e semelhantes. Em algumas modalidades, o substituinte adicionado é um grupo hidrocarboneto linear ou cíclico, por exemplo, um C1-C6 alquil, C1-C6 cicloalquil, C1-C6 alquenil ou C1-C6 aril éster. Em algumas modalidades, o éster é um alquil éster, por exemplo, um metil éster, etil éster ou propil éster. Em algumas modalidades, o substituinte éster é adicionado à molécula de ácido graxo livre quando o ácido graxo está em um estado purificado ou semipurificado. Alternativamente, o éster de ácido graxo é formado mediante
73/208 conversão de um triacilglicerol em um éster.
[144] A presente invenção é dirigida aos métodos de produção de óleos microbianos. Em algumas modalidades, o método compreende o crescimento de qualquer um dos microorganismos isolados da invenção ou misturas destes em uma cultura para produzir um óleo microbiano que compreende ácidos graxos ômega-3. Em algumas modalidades, o método ainda compreende a extração do óleo microbiano. Em algumas modalidades, o método compreende a extração de um óleo microbiano que compreende ácidos graxos ômega-3 de qualquer uma das biomassas da invenção ou misturas destas. Em algumas modalidades, o método compreende o crescimento heterotrófico do microorganismo isolado, em que a cultura compreende uma fonte de carbono como aqui descrita. O óleo microbiano pode ser extraído de uma biomassa recém colhida ou pode ser extraído de uma biomassa previamente colhida que foi armazenada sob condições que evitam a deterioração. Métodos conhecidos podem ser usados para cultivar um microorganismo da invenção, para isolar uma biomassa da cultura, para extrair um óleo microbiano da biomassa e para analisar o perfil de ácido graxo de óleos extraídos da biomassa. Veja, por exemplo, a Patente U.S. N° 5.130.242, aqui incorporada por referência em sua totalidade. A invenção é dirigida a um óleo microbiano produzido por qualquer um dos métodos da invenção.
[145] Em algumas modalidades, o óleo microbiano é extraído por um método de extração enzimática. Em algumas modalidades, o óleo microbiano é extraído por um método de extração mecânica. Em algumas modalidades, o método de extração mecânica compreende um ou mais de: (1)
74/208 processamento de um caldo de fermentação pasteurizado por meio de um homogeneizador para ajudar na lise da célula e liberar o óleo das células; (2) adição de álcool isopropílico ao caldo de fermentação após homogeneização para quebrar a emulsão de óleo e água;
(3) centrifugação da mistura para recuperar a fase oleosa;
e (4) secagem sob vácuo com adição de antioxidantes. Em algumas modalidades,
o óleo bruto é p
purificação do óleo
bombeamento do óleo
aquecimento do óleo,
ácida com misturação;
Em algumas bruto compreende um ou bruto em um tanque de óleo após e depois refinado;
modalidades, mais de: (1) refinamento e seguido por adição de uma solução (2) adição de uma solução cáustica ao tratamento ácido;
centrifugação para remoção dos metais-traço e produtos de utilização de, filtração; (5) (3) reaquecimento do óleo bruto separar a fase pesada do óleo compostos polares restantes, oxidação por exemplo, ácido, filtração a frio do do óleo refinado por
TriSyl®, argila e/ou óleo branqueado para remover ainda mais componentes com ponto de fusão elevado do óleo para obter o nível desejado de limpidez; (6) aquecimento do óleo, e depois o óleo é então resfriado e mantido por um período de tempo fazendo com que os triglicerídeos com ponto de fusão elevado e ceras cristalizem; (7) adição de um auxiliar de filtração ao óleo resfriado e depois remoção de sólidos cristalizados por filtração; (8) utilização de um desodorizador após filtração a frio, operado sob temperatura elevada e vácuo, para remover, por exemplo, peróxidos e quaisquer compostos de baixo peso molecular restantes que possam causar odor e sabores desagradáveis; (9) transferência do óleo ao tanque
75/208 de alimentação de desodorizador, desaeração e desodorização, por exemplo, em uma desodorizador de coluna de recheio; e (10) resfriamento, por exemplo, sob uma manta de nitrogênio ao final do ciclo de desodorização e adição de antioxidantes adequados ao óleo desodorizado para fornecer estabilidade oxidativa.
[146] Em algumas modalidades, o óleo microbiano compreende uma fração de ésteres de esterol de cerca de 0%, pelo menos cerca de 0,1%, pelo menos cerca de 0,2%, pelo menos cerca de 0,5%, pelo menos cerca de 1%, pelo menos cerca de 1,5%, pelo menos cerca de 2% ou pelo menos cerca de 5% por peso. Em algumas modalidades, o óleo microbiano compreende uma fração de ésteres de esterol de cerca de 0% até cerca de 1,5%, cerca de 0% até cerca de 2%, cerca de 0% até cerca de 5%, cerca de 1% até cerca de 1,5%, cerca de 0,2% até cerca de 1,5%, cerca de 0,2% até cerca de 2% ou cerca de 0,2% até cerca de 5% por peso. Em algumas modalidades, o óleo microbiano compreende uma fração de ésteres de esterol de cerca de 5% ou menos, cerca de 4% ou
menos, cerca de 3% ou menos, cerca de 2% ou menos, cerca de
1% ou menos, cerca de 0,5% ou menos, cerca de 0,3% ou
menos , cerca de 0,2% ou menos, cerca de 0,5 % ou menos,
cerca de 0,4% ou menos, cerca de 0,3% ou menos, ou cerca de
0,2% ou menos por peso.
[147] Em algumas modalidades, o óleo microbiano
compreende uma fração de triacilglicerol de pelo menos cerca de 35%, pelo menos cerca de 40%, pelo menos cerca de 45%, pelo menos cerca de 50%, pelo menos cerca de 55%, pelo menos cerca de 60%, pelo menos cerca de 65%, pelo menos cerca de 70%, pelo menos cerca de 75%, pelo menos cerca de
76/208
80%, pelo menos cerca de 85% ou pelo menos cerca de 90% por peso. Em algumas modalidades, o óleo microbiano compreende uma fração de triacilglicerol de cerca de 35% até cerca de 98%, cerca de 35% até cerca de 90%, cerca de 35% até cerca de 80%, cerca de 35% até cerca de 70%, cerca de 35% até cerca de 70%, cerca de 35% até cerca de 65%, cerca de 40% até cerca de 70%, cerca de 40% até cerca de 65%, cerca de 40% até cerca de 55%, cerca de 40% até cerca de 50%, cerca de 65% até cerca de 95%, cerca de 75% até cerca de 95%, cerca de 75% até cerca de 98%, cerca de 80% até cerca de 95%, cerca de 80% até cerca de 98%, cerca de 90% até cerca de 96%, cerca de 90% até cerca de 97%, cerca de 90% até cerca de 98%, cerca de 90%, cerca de 95%, cerca de 97% ou cerca de 98% por peso.
[148] Em algumas modalidades, o óleo microbiano compreende uma fração de diacilglicerol de pelo menos cerca de 10%, pelo menos cerca de 11%, pelo menos cerca de 12%, pelo menos cerca de 13%, pelo menos cerca de 14%, pelo menos cerca de 15%, pelo menos cerca de 16%, pelo menos cerca de 17%, pelo menos cerca de 18%, pelo menos cerca de 19% ou pelo menos cerca de 20% por peso. Em algumas modalidades, o óleo microbiano compreende uma fração de diacilglicerol de cerca de 10% até cerca de 45%, cerca de 10% até cerca de 40%, cerca de 10% até cerca de 35%, cerca de 10% até cerca de 30%, cerca de 15% até cerca de 40%, cerca de 15% até cerca de 35% ou cerca de 15% até cerca de 30% por peso. Em algumas modalidades, o óleo microbiano compreende uma fração de 1,2-diacilglicerol de pelo menos cerca de 0,2%, pelo menos cerca de 0,3%, pelo menos cerca de 0,4%; pelo menos cerca de 0,5%, pelo menos cerca de 1%,
77/208 pelo menos cerca de 5%, pelo menos cerca de 10%, pelo menos cerca de 11%, pelo menos cerca de 12%, pelo menos cerca de 13%, pelo menos cerca de 14%, pelo menos cerca de 15%, pelo menos cerca de 16%, pelo menos cerca de 17%, pelo menos cerca de 18%, pelo menos cerca de 19% ou pelo menos cerca de 20% por peso. Em algumas modalidades, o óleo microbiano compreende uma fração de diacilglicerol de cerca de 0,2%
até cerca de 45%, cerca de 0,2% até cerca de 30%, cerca de
0,2% até cerca de 20%, cerca de 0,2% até cerca de 10%,
cerca de 0,2% até cerca de 5%, cerca de 0,2% até cerca de
1%, cerca de 0,2% até cerca de 0,8%, cerca de 0,4% até
cerca de 45%, cerca de 0 ,4% até cerca de 30%, cerca de 0 ,4%
até cerca de 20%, cerca de 0,4% até cerca de 10%, cerca de
0,4% até cerca de 5%, cerca de 0,4% até cerca de 1%, cerca
de 0,4% até cerca de 0,8%, cerca de 0,5% até cerca de 1%, cerca de 0,5% até cerca de 0,8%, cerca de 10% até cerca de 45%, cerca de 10% até cerca de 40%, cerca de 10% até cerca de 35%, cerca de 10% até cerca de 30%, cerca de 15% até cerca de 40%, cerca de 15% até cerca de 35%, cerca de 15% até cerca de 30% ou cerca de 15% até cerca de 25% por peso. Em algumas modalidades, o óleo microbiano compreende uma fração de 1,3-diacilglicerol de pelo menos cerca de 0,1%, pelo menos cerca de 0,2%, pelo menos cerca de 0,5%, pelo menos cerca de 1%, pelo menos cerca de 2%, pelo menos cerca de 2.5% ou pelo menos cerca de 3% por peso. Em algumas modalidades, o óleo microbiano compreende uma fração de esterol de pelo menos cerca de 0,3%, pelo menos cerca de 0,4%, pelo menos cerca de 0,5%, pelo menos cerca de 1%, pelo menos cerca de 1,5%, pelo menos cerca de 2% ou pelo menos cerca de 5% por peso.
78/208 [149] Em algumas modalidades, o óleo microbiano compreende uma fração de esterol de cerca de 0,3% até cerca de 5%, cerca de 0,3% até cerca de 2%, cerca de 0,3% até cerca de 1,5%, cerca de 0,5% até cerca de 1,5%, cerca de 1% até cerca de 1,5%, cerca de 0,5% até cerca de 2%, cerca de 0,5% até cerca de 5%, cerca de 1% até cerca de 2% ou cerca de 1% até cerca de 5% por peso. Em algumas modalidades, o óleo microbiano compreende uma fração de esterol de cerca
de 5% ou menos, cerca de 4% ou menos, cerca de 3% ou menos,
cerca de 2% ou menos, cerca de 1,5% ou menos, ou cerca de
1% ou menos por peso.
[150] Em algumas modalidades, o óleo microbiano
compreende uma fração de fosfolipídeo de pelo menos cerca de 2%, pelo menos cerca de 5% ou pelo menos cerca de 8% por peso. Em algumas modalidades, o óleo microbiano compreende uma fração de fosfolipídeo de cerca de 2% até cerca de 25%,
cerca de 2% até cerca de 20%, cerca de 2% até cerca de 15%,
cerca de 2% até cerca de 10%, cerca de 5% até cerca de 25%,
cerca de 5% até cerca de 20%, cerca de 5% até cerca de 20%,
cerca de 5% até cerca de 10% ou cerca de 7% até cerca de 9%
por peso. Em algumas modalidades, o óleo microbiano
compreende uma fração de fosfolipídeo de menos do que cerca de 20%, menos do que cerca de 15%, menos do que cerca de 10%, menos do que cerca de 9% ou menos do que cerca de 8% por peso. Em algumas modalidades, o óleo microbiano é substancialmente livre de fosfolipídeos. Em algumas modalidades, o óleo microbiano compreende não saponificáveis de menos do que cerca de 2%, menos do que cerca de 1,5%, menos do que cerca de 1% ou menos do que cerca de 0,5% por peso do óleo. As classes de lipídeos
79/208 presentes no óleo microbiano, por exemplo, uma fração de triacilglicerol, podem ser separadas por cromatografia instantânea e analisadas por cromatografia de camada delgada (TLC), ou separadas e analisadas por outros métodos conhecidos na técnica.
[151] Em algumas modalidades, o óleo microbiano e/ou uma ou mais frações deste selecionadas da fração de triacilglicerol, da fração de ácido graxo livre, da fração de esterol, da fração de diacilglicerol, e combinações destas, compreende pelo menos cerca de 5%, pelo menos cerca de 10%, mais do que cerca de 10%, pelo menos cerca de 12%, pelo menos cerca de 13%, pelo menos cerca de 14%, pelo menos cerca de 15%, pelo menos cerca de 16%, pelo menos cerca de 17%, pelo menos cerca de 18%, pelo menos cerca de 19%, pelo menos cerca de 20%, pelo menos cerca de 25%, pelo menos cerca de 30%, pelo menos cerca de 35%, pelo menos cerca de 40% ou pelo menos cerca de 45% por peso de EPA. Em algumas modalidades, o óleo microbiano e/ou uma ou mais frações deste selecionadas da fração de triacilglicerol, da fração de ácido graxo livre, da fração de esterol, da fração de diacilglicerol, e combinações destas, compreende
cerca de 5% até cerca de 55%, cerca de 5% até cerca de 50%,
cerca de 5% até cerca de 45%, cerca de 5% até cerca de 40%,
cerca de 5% até cerca de 35%, cerca de 5% até cerca de 30%,
cerca de 10% até cerca de 55%, cerca de 10% até cerca de 50%, cerca de 10% até cerca de 45%, cerca de 10% até cerca de 40%, cerca de 10% até cerca de 35%, cerca de 10% até cerca de 30%, pelo menos cerca de 12% até cerca de 55%, pelo menos cerca de 12% até cerca de 50%, pelo menos cerca de 12% até cerca de 45%), pelo menos cerca de 12% até cerca
80/208 de 40%, pelo menos cerca de 12% até cerca de 35% ou pelo menos cerca de 12% até cerca de 30%, cerca de 15% até cerca de 55%, cerca de 1% até cerca de 50%, cerca de 15% até cerca de 45%, cerca de 15% até cerca de 40%, cerca de 15% até cerca de 35%, cerca de 15% até cerca de 30%, cerca de 15% até cerca de 25%, cerca de 15% até cerca de 20%, cerca de 20% até cerca de 55%, cerca de 20% até cerca de 50%, cerca de 20% até cerca de 45%, cerca de 20% até cerca de 40% ou cerca de 20% até cerca de 30% por peso de EPA. -Em algumas modalidades, o óleo microbiano e/ou uma ou mais frações deste selecionadas da fração de triacilglicerol, da fração de diacilglicerol, da fração de esterol, da fração de ésteres de esterol, da fração de ácidos graxos livres, da fração de fosfolipídeo, e combinações destas, compreende pelo menos cerca de 5%, pelo menos cerca de 10%, pelo menos cerca de 15%, pelo menos cerca de 20%, pelo menos cerca de 25%, pelo menos cerca de 30%, pelo menos cerca de 35%, pelo menos cerca de 40%, pelo menos cerca de 50% ou pelo menos cerca de 6 0% por peso de DHA. Em algumas modalidades, o óleo microbiano e/ou uma ou mais frações deste selecionadas da fração de triacilglicerol, da fração de diacilglicerol, da fração de esterol, da fração de ésteres de esterol, da fração de ácidos graxos livres, da fração de fosfolipídeo, e combinações destas, compreende cerca de 5% até cerca de 60%, cerca de 5% até cerca de 55%, cerca de 5% até cerca de 50%, cerca de 5% até cerca de 40%, cerca de 10% até cerca de 60%, cerca de 10% até cerca de 50%, cerca de 10% até cerca de 40%, cerca de 20% até cerca de 60%, cerca de 25% até cerca de 60%, cerca de 25% até cerca de 50%, cerca de 25% até cerca de 45%, cerca de 30% até cerca de 50%, cerca
81/208 de 35% até cerca de 50% ou cerca de 30% até cerca de 40% por peso de DHA. Em algumas modalidades, o óleo microbiano e/ou uma ou mais frações deste selecionadas da fração de triacilglicerol, da fração de diacilglicerol, da fração de esterol, da fração de ésteres de esterol, da fração de ácidos graxos livres, da fração de fosfolipídeo, e combinações destas, compreende cerca de 10% ou menos, cerca de 9% ou menos, cerca de 8% ou menos, cerca de 7% ou menos, cerca de 6% ou menos, cerca de 5% ou menos, cerca de 4% ou menos, cerca de 3% ou menos, cerca de 2% ou menos, ou cerca de 1% ou menos por peso de DHA. Em algumas modalidades, o óleo microbiano e/ou uma ou mais frações deste selecionadas da fração de triacilglicerol, da fração de diacilglicerol, da fração de esterol, da fração de ésteres de esterol, da fração de ácidos graxos livres, da fração de fosfolipídeo, e combinações destas, compreende cerca de 1% até cerca de 10%, cerca de 1% até cerca de 5%, cerca de 2% até cerca de 5%, cerca de 3% até cerca de 5% ou cerca de 3% até cerca de 10% por peso dos ácidos graxos como DHA. Em algumas modalidades, o óleo microbiano e/ou uma ou mais frações deste selecionadas da fração de triacilglicerol, da fração de diacilglicerol, da fração de esterol, da fração de ésteres de esterol, da fração de ácidos graxos livres, da fração de fosfolipídeo, e combinações destas, é substancialmente livre de DHA. Em algumas modalidades, o óleo microbiano e/ou uma ou mais frações deste selecionadas da fração de triacilglicerol, da fração de diacilglicerol, da fração de esterol, da fração de ésteres de esterol, da fração de ácidos graxos livres, da fração de fosfolipídeo, e combinações destas, compreende cerca de 0,1% até cerca de
82/208
5%, cerca de 0,1% a menos do que cerca de 5%, cerca de 0,1% até cerca de 4%, cerca de 0,1% até cerca de 3%, cerca de 0,1% até cerca de 2%, cerca de 0,2% até cerca de 5%, cerca de 0,2% a menos do que cerca de 5%, cerca de 0,2% até cerca de 4%, cerca de 0,2% até cerca de 3%, cerca de 0,2% até cerca de 2%, cerca de 0,3% até cerca de 2%, cerca de 0,1% até cerca de 0,5%, cerca de 0,2% até cerca de 0,5%, cerca de 0,1% até cerca de 0,4%, cerca de 0,2% até cerca de 0,4%, cerca de 0,5% até cerca de 2%, cerca de 1% até cerca de 2%, cerca de 0,5% até cerca de 1,5% ou cerca de 1% até cerca de 1,5% por peso de ARA. Em algumas modalidades, o óleo microbiano e/ou uma ou mais frações deste selecionadas da fração de triacilglicerol, da fração de diacilglicerol, da fração de esterol, da fração de ésteres de esterol, da fração de ácidos graxos livres, da fração de fosfolipídeo, e combinações destas, compreende cerca de 5% ou menos, menos do que cerca de 5%, cerca de 4% ou menos, cerca de 3% ou menos, cerca de 2% ou menos, cerca de 1,5% ou menos, cerca de 1% ou menos, cerca de 0,5% ou menos, cerca de 0,4% ou menos, cerca de 0,3% ou menos, cerca de 0,2% ou menos, ou cerca de 0,1% ou menos por peso de ARA. Em algumas modalidades, o óleo microbiano e/ou uma ou mais frações deste selecionadas da fração de triacilglicerol, da fração de diacilglicerol, da fração de esterol, da fração de ésteres de esterol, da fração de ácidos graxos livres, da fração de fosfolipídeo, e combinações destas, é substancialmente livre de ARA. Em algumas modalidades, o óleo microbiano e/ou uma ou mais frações deste selecionadas da fração de triacilglicerol, da fração de diacilglicerol, da fração de esterol, da fração de ésteres de esterol, da
83/208 fração de ácidos graxos livres, da fração de fosfolipídeo, e combinações destas, compreende cerca de 0,4% até cerca de 2%, cerca de 0,4% até cerca de 3%, cerca de 0,4% até cerca de 4%, cerca de 0,4% até cerca de 5%, cerca de 0,4% a menos do que cerca de 5%, cerca de 0,5% até cerca de 1%, cerca de 0,5% até cerca de 2%, cerca de 0,5% até cerca de 3%, cerca
de 0,5% até cerca de 4%, cerca de 0, 5% até cerca de 5%,
cerca de 0,5 % a menos do que cerca de 5% , cerca de 1% até
cerca de 2%, cerca de 1% até cerca de 3% , cerca de 1% até
cerca de 4%, cerca de 1% até cerca de 5% ou cerca de 1% a
menos do que cerca de 5% por peso de DPA n-6. Em algumas
modalidades, o óleo microbiano e/ou uma ou mais frações
deste selecionadas da fração de triacilglicerol, da fração de diacilglicerol, da fração de esterol, da fração de ésteres de esterol, da fração de ácidos graxos livres, da fração de fosfolipídeo, e combinações destas, compreende cerca de 5%, menos do que cerca de 5%, cerca de 4% ou menos, cerca de 3% ou menos, cerca de 2% ou menos, cerca de 1% ou menos, cerca de 0,75% ou menos, cerca de 0,6% ou menos, ou cerca de 0,5% ou menos por peso de DPA n-6. Em algumas modalidades, o óleo microbiano e/ou uma ou mais frações deste selecionadas da fração de triacilglicerol, da fração de diacilglicerol, da fração de esterol, da fração de ésteres de esterol, da fração de ácidos graxos livres, da fração de fosfolipídeo, e combinações destas, é substancialmente livre de DPA n-6. Em algumas modalidades, o óleo microbiano e/ou uma ou mais frações deste selecionadas da fração de triacilglicerol, da fração de diacilglicerol, da fração de esterol, da fração de ésteres de esterol, da fração de ácidos graxos livres, da fração de
84/208 fosfolipídeo, e combinações destas, compreende ácidos graxos com cerca de 5% ou menos, menos do que cerca de 5%, cerca de 4% ou menos, cerca de 3% ou menos, ou cerca de 2% ou menos por peso de ácido oléico (18:1 n-9), ácido linoléico (18:2 n-6), ácido linolênico (18:3 n-3), ácido eicosenóico (20:1 n-9), ácido erúcico (22:1 n-9), ácido estearidônico (18:4 n-3), ou combinações destes.
[152] A molécula de triacilglicerol contém 3 átomos de carbono centrais (C(sn-1)H2R1-(sn-2)H2R2-C(sn-3)H2R3), que permitem a formação de isômeros posicionais diferentes. Em algumas modalidades, o óleo microbiano compreende uma fração de triacilglicerol na qual pelo menos cerca de 2%, pelo menos cerca de 3%, pelo menos cerca de 5%, pelo menos cerca de 10%, pelo menos cerca de 15%, pelo menos cerca de 20%, pelo menos cerca de 30%, pelo menos cerca de 35% ou pelo menos cerca de 40% dos triacilgliceróis na fração de triacilglicerol contêm DHA em duas posições no triacilglicerol (DHA dissubstituído) selecionadas de quaisquer duas das posições sn-1, sn-2 e sn-3, com base no percentual da área relativa de picos em um cromatográfico de HPLC. Em algumas modalidades, o óleo microbiano compreende uma fração de triacilglicerol na qual cerca de
2% até cerca de 55%, cerca de 2% até cerca de 50%, cerca de
2% até cerca de 45%, cerca de 2% até cerca de 40%, cerca de
2% até cerca de 35%, cerca de 2% até cerca de 30%, cerca de
2% até cerca de 25%, cerca de 5% até cerca de 55%, cerca de
5% até cerca de 50%, cerca de 5% até cerca de 45%, cerca de
5% até cerca de 40%, cerca de 5% até cerca de 35%, cerca de
5% até cerca de 30%, cerca de 5% até cerca de 25%, cerca de
10% até cerca de 55%, cerca de 10% até cerca de 50%, cerca
85/208 de 10% até cerca de 45%, cerca de 10% até cerca de 40%, cerca de 10% até cerca de 35%, cerca de 10% até cerca de 30%, cerca de 10% até cerca de 25%, cerca de 10% até cerca de 20%, cerca de 20% até cerca de 40%, cerca de 20% até cerca de 35% ou cerca de 20% até cerca de 25% dos triacilgliceróis na fração de triacilglicerol contêm EPA em duas posições no triacilglicerol selecionadas de quaisquer duas posições sn-1, sn-2 ou sn-3, com base no percentual da área relativa de picos em um cromatográfico de HPLC. Em algumas modalidades, o óleo microbiano compreende uma fração de triacilglicerol na qual pelo menos cerca de 0,5%, pelo menos cerca de 1%, pelo menos cerca de 1,5% ou pelo menos cerca de 2% dos triacilgliceróis na fração de triacilglicerol contêm DHA em todas as posições sn-1, sn-2 e sn-3 (DHA trissubstituído), com base no percentual da área relativa de picos em um cromatográfico de HPLC.
Em algumas modalidades, o óleo microbiano compreende uma fração de triacilglicerol de 5%, cerca de 0,5% até na qual cerca de 0,5% até cerca cerca de 3%, cerca de 0,5% até cerca de 2,5%, cerca de 0,5% até cerca de 2%, cerca de 1% até cerca de 5%, cerca de 1% até cerca de 3% ou cerca de 1% até cerca de 2% dos triacilgliceróis na fração de triacilglicerol contêm DHA em todas as posições sn-1, sn-2 e sn-3, com base no percentual da área relativa de picos em um cromatográfico de HPLC. Em algumas modalidades, o óleo microbiano compreende uma fração de triacilglicerol na qual pelo menos cerca de 10%, pelo menos cerca de 15%, pelo menos cerca de 20%, pelo menos cerca de 25%, pelo menos cerca de 30%, pelo menos cerca de 35%, pelo menos cerca de
40%, pelo menos cerca de 45%, pelo menos cerca de 50%, pelo
86/208 menos cerca de 55% ou pelo menos cerca de 60% dos triacilgliceróis na fração de triacilglicerol contêm DHA em uma posição no triacilglicerol selecionada de qualquer uma das posições sn-1, sn-2 área relativa de picos ou sn-3, com base no percentual da em um cromatográfico de HPLC. Em algumas modalidades, o óleo microbiano compreende uma
10% até cerca de fração de triacilglicerol na qual cerca de
80%, cerca de 10% até cerca de 70%, cerca de 10% até cerca
de 60%, cerca de 15% até cerca de 80%, cerca de 15% até
cerca de 75%, cerca de 15% até cerca de 70%, cerca de 15%
até cerca de 65%, cerca de 15% até cerca de 60%, cerca de
35% até cerca de 80%, cerca de 35% até cerca de 75%, cerca
de 35% até cerca de 65%, cerca de 35% até cerca de 60%,
cerca de 40% até cerca de 80%, cerca de 40% até cerca de
75%, cerca de 40% até cerca de 70%, cerca de 40% até cerca
de 65%, cerca de 40% até cerca de 60% ou cerca de 40% até
fração de na dos triacilgliceróis cerca de 55% triacilglicerol contêm
DHA em uma posição no triacilglicerol selecionada de qualquer uma das posições sn-1, sn-2 e sn-3, com base no percentual da área relativa de picos em um cromatográfico de HPLC.
[153] A presente invenção é ainda dirigida aos métodos de produção de óleos microbianos. Em algumas modalidades, o método compreende o crescimento de um traustoquitrídeo da invenção em uma cultura para produzir uma biomassa e extração de um óleo que compreende ácidos graxos ômega-3 da biomassa. O óleo pode ser extraído de uma biomassa recém colhida ou pode ser extraído de uma biomassa previamente colhida que foi armazenada sob condições que evitam a deterioração. Métodos conhecidos podem ser usados para
87/208 cultivar um traustoquitrídeo da invenção, para isolar uma biomassa da cultura, para extrair um óleo microbiano da biomassa e para analisar o perfil de ácido graxo de óleos extraídos da biomassa. Veja, por exemplo, a Patente U.S. N° 5.130.242.
[154] A invenção é ainda dirigida a um óleo microbiano que compreende um perfil de ácido graxo da invenção. Um óleo microbiano da invenção pode ser qualquer óleo derivado de um microorganismo, incluindo, por exemplo: um óleo bruto extraído da biomassa do microorganismo sem processamento adicional; um óleo refinado que é obtido por tratamento de um óleo microbiano bruto com etapas adicionais de processamento como, por exemplo, refinamento, branqueamento e/ou desodorização; um óleo microbiano diluído obtido por diluição de um óleo microbiano bruto ou refinado; ou um óleo enriquecido que é obtido, por exemplo, por tratamento de um óleo microbiano bruto ou refinado com métodos de purificação adicionais para aumentar a concentração de um ácido graxo (por exemplo, DHA) no óleo.
[155] Em algumas modalidades, o óleo microbiano compreende uma fração de ésteres de esterol de cerca de 0%, pelo menos cerca de 0,1%, pelo menos cerca de 0,2%, pelo menos cerca de 0,5%, pelo menos cerca de 1%, pelo menos cerca de 1,5%, pelo menos cerca de 2% ou pelo menos cerca de 5% por peso. Em algumas modalidades, o óleo microbiano
compreende uma fração de ésteres de esterol de cerca de 0%
até cerca de 1, 5%, cerca de 0% até cerca de 2%, cerca de 0%
até cerca de 5 %, cerca de 1% até cerca de 1,5%, cerca de
0,2% até cerca de 1,5%, cerca de 0,2% até cerca de 2% ou
cerca de 0,2% até cerca de 5% por peso. Em algumas
88/208 modalidades, o óleo microbiano compreende uma fração de ésteres de esterol de menos do que cerca de 5%, menos do que cerca de 4%, menos do que cerca de 3% ou menos do que cerca de 2% por peso. Em algumas modalidades, o óleo microbiano compreende uma fração de triglicerídeo de pelo menos cerca de 65%, pelo menos cerca de 70%, pelo menos cerca de 75%, pelo menos cerca de 80%, pelo menos cerca de 85% ou pelo menos cerca de 90% por peso. Em algumas modalidades, o óleo microbiano compreende uma fração de triglicerídeo de cerca de 65% até cerca de 95%, cerca de 75% até cerca de 95% ou cerca de 80% até cerca de 95% por peso, ou cerca de 97% por peso, ou cerca de 98% por peso. Em algumas modalidades, o óleo microbiano compreende uma fração de ácido graxo livre de pelo menos cerca de 0,5%, pelo menos cerca de 1%, pelo menos cerca de 1,5%, pelo menos cerca de 2%, pelo menos cerca de 2,5% ou pelo menos cerca de 5% por peso. Em algumas modalidades, o óleo microbiano compreende uma fração de ácido graxo livre de cerca de 0,5% até cerca de 5%, cerca de 0,5% até cerca de 2,5%, cerca de 0,5% até cerca de 2%, cerca de 0,5% até cerca de 1,5%, cerca de 0,5% até cerca de 1%, cerca de 1% até cerca de 2,5%, cerca de 1% até cerca de 5%, cerca de 1,5% até cerca de 2,5%, cerca de 2% até cerca de 2,5% ou cerca de 2% até cerca de 5% por peso. Em algumas modalidades, o óleo microbiano compreende uma fração de ácido graxo livre de menos do que cerca de 5%, menos do que cerca de 4%, menos do que cerca de 3%, menos do que cerca de 2% ou menos do que cerca de 1% por peso. Em algumas modalidades, o óleo microbiano compreende uma fração de esterol de pelo menos cerca de 0,5%, pelo menos cerca de
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1%, pelo menos cerca de 1,5%, pelo menos cerca de 2% ou pelo menos cerca de 5% por peso. Em algumas modalidades, o óleo microbiano compreende uma fração de esterol de cerca de 0,5% até cerca de 1,5%, cerca de 1% até cerca de 1,5%, cerca de 0,5% até cerca de 2%, cerca de 0,5% até cerca de 5%, cerca de 1% até cerca de 2% ou cerca de 1% até cerca de 5% por peso. Em algumas modalidades, o óleo microbiano compreende uma fração de esterol de menos do que cerca de 5%, menos do que cerca de 4%, menos do que cerca de 3%, menos do que cerca de 2% ou menos do que cerca de 1% por peso. Em algumas modalidades, o óleo microbiano compreende uma fração de diglicerídeo de pelo menos cerca de 1,5%, pelo menos cerca de 2%, pelo menos cerca de 2,5%, pelo menos cerca de 3%, pelo menos cerca de 3,5% ou pelo menos cerca de 5% por peso. Em algumas modalidades, o óleo microbiano compreende uma fração de diglicerídeo de cerca de 1,5% até cerca de 3%, cerca de 2% até cerca de 3%, cerca de 1,5% até cerca de 3,5%, cerca de 1,5% até cerca de 5%, cerca de 2,5% até cerca de 3%, cerca de 2,5% até cerca de 3,5% ou cerca de 2,5% até cerca de 5% por peso. Em algumas modalidades, o óleo microbiano compreende não saponificáveis de menos do que cerca de 2%, menos do que cerca de 1,5%, menos do que cerca de 1% ou menos do que cerca de 0,5% por peso do óleo. As classes de lipídeos presentes no óleo microbiano, por exemplo, a fração de triglicerídeo, podem ser separadas por cromatografia instantânea e analisadas por cromatografia de camada delgada (TLC), ou separadas e analisadas por outros métodos conhecidos na técnica.
[156] Em algumas modalidades, o óleo microbiano e/ou
90/208 uma ou mais frações deste selecionadas da fração de triglicerídeo, da fração de ácido graxo livre, da fração de esterol, da fração de diglicerídeo, e combinações destas, compreende pelo menos cerca de 40%, pelo menos cerca de 45%, pelo menos cerca de 50%, pelo menos cerca de 55%, pelo menos cerca de 60%, pelo menos cerca de 65%, pelo menos cerca de 70%, pelo menos cerca de 75% ou pelo menos cerca de 80% por peso de DHA. Em algumas modalidades, o óleo microbiano e/ou uma ou mais frações deste selecionadas da fração de triglicerídeo, da fração de ácido graxo livre, da fração de esterol, da fração de diglicerídeo, e combinações destas, compreende de cerca de 40% até cerca de 45%, cerca de 40% até cerca de 50%, cerca de 40% até cerca de 60%, cerca de 50% até cerca de 60%, cerca de 55% até cerca de 60%, cerca de 40% até cerca de 65%, cerca de 50% até cerca de 65%, cerca de 55% até cerca de 65%, cerca de 40% até cerca de 70%, cerca de 40% até cerca de 80%, cerca de 50% até cerca de 80%, cerca de 55% até cerca de 80%, cerca de 60% até cerca de 80% ou cerca de 70% até cerca de 80% por peso de DHA. Em algumas modalidades, o óleo microbiano compreende uma fração de ésteres de esterol que compreende cerca de 45% ou menos, cerca de 40% ou menos, cerca de 35% ou menos, cerca de 30% ou menos, cerca de 25% ou menos, cerca de 2 0% ou menos, cerca de 15% ou menos, ou cerca de 13% ou menos por peso de DHA. Em algumas modalidades, o óleo microbiano e/ou uma ou mais frações deste selecionadas da fração de triglicerídeo, da fração de ácido graxo livre, da fração de esterol, da fração de diglicerídeo, e combinações destas, compreende cerca de 10% ou menos, cerca de 9% ou menos, cerca de 8% ou menos, cerca de 7% ou menos,
91/208 cerca de 6% ou menos, cerca de 5% ou menos, cerca de 4% ou menos, cerca de 3% ou menos, cerca de 2% ou menos, ou cerca de 1% ou menos por peso de EPA. Em algumas modalidades, o óleo microbiano e/ou uma ou mais frações deste selecionadas da fração de triglicerídeo, da fração de ácido graxo livre, da fração de esterol, da fração de diglicerídeo, e combinações destas, compreende de cerca de 2% até cerca de 3%, cerca de 2% até cerca de 3,5%, cerca de 2,5% até cerca de 3,5%, cerca de 2% até cerca de 6%, cerca de 2,5% até
cerca de 6%, cerca de 3,0 o, % até cerca de 6%, cerca de 3,5%
até cerca de 6%, cerca de 5% até cerca de 6% ou cerca de 2%
até cerca de 10% por peso de EPA . Em algumas modalidades, o
óleo microbiano e/ou uma ou mais frações deste selecionadas da fração de ésteres de esterol, da fração de triglicerídeo, da fração de ácido graxo livre, da fração de esterol, da fração de diglicerídeo, da fração polar (incluindo a fração de fosfolipídeo), e combinações destas, é substancialmente livre de EPA. Em algumas modalidades, o óleo microbiano e/ou uma ou mais frações deste selecionadas da fração de ésteres de esterol, da fração de triglicerídeo, da fração de ácido graxo livre, da fração de esterol, da fração de diglicerídeo, da fração polar (incluindo a fração de fosfolipídeo), e combinações destas, compreende uma proporção de peso de DHA para EPA de pelo menos cerca de 5:1, pelo menos cerca de 7:1, pelo menos cerca de 9:1, pelo menos cerca de 10:1, pelo menos cerca de 15:1, pelo menos cerca de 20:1, pelo menos cerca de 25:1, pelo menos cerca de 30:1 ou pelo menos cerca de 50:1, em que o óleo microbiano e/ou uma ou mais frações deste compreende 10% ou menos por peso de EPA. Em algumas
92/208 modalidades, o óleo microbiano e/ou uma ou mais frações deste selecionadas da fração de ésteres de esterol, da fração de triglicerídeo, da fração de ácido graxo livre, da fração de esterol, da fração de diglicerídeo, da fração polar (incluindo a fração de fosfolipídeo), e combinações destas, compreende uma proporção de peso de DHA para EPA de pelo menos cerca de 5:1, mas menos do que cerca de 20:1. Em algumas modalidades, a proporção de peso de DHA para EPA é
de cerca de 5:1 até cerca de 18:1, de cerca de 7: 1 até
cerca de 16:1 ou de cerca de 10:1 até cerca de 15:1. Em
algumas modalidades, o óleo microbiano e/ou uma ou mais
frações deste selecionadas da fração de ésteres de esterol, da fração de triglicerídeo, da fração de ácido graxo livre, da fração de esterol, da fração de diglicerídeo, da fração polar (incluindo a fração de fosfolipídeo), e combinações destas compreende de cerca de 0,1% até cerca de 0,25%, cerca de 0,2% até cerca de 0,25%, cerca de 0,1% até cerca de 0,5% ou cerca de 0,1% até cerca de 1,5% por peso de ARA. Em algumas modalidades, o óleo microbiano e/ou uma ou mais frações deste selecionadas da fração de ésteres de esterol, da fração de triglicerídeo, da fração de ácido graxo livre, da fração de esterol, da fração de diglicerídeo, da fração polar (incluindo a fração de fosfolipídeo), e combinações
destas, compreende cerca de 1,5% ou menos, cerca de 1% ou
menos, cerca de 0,5% ou menos, cerca de 0,2% ou menos, ou
cerca de 0, 1% ou menos por peso de ARA. Em algumas
modalidades, o óleo microbiano e/ou uma ou mais frações
deste selecionadas da fração de ésteres de esterol, da fração de triglicerídeo, da fração de ácido graxo livre, da fração de esterol, da fração de diglicerídeo, da fração
93/208 polar (incluindo a fração de fosfolipídeo), e combinações destas, é substancialmente livre de ARA. Em algumas modalidades, o óleo microbiano e/ou uma ou mais frações deste selecionadas da fração de ésteres de esterol, da fração de triglicerídeo, da fração de ácido graxo livre, da fração de diglicerídeo, da fração polar (incluindo a fração de fosfolipídeo), e combinações destas, compreende uma proporção de peso de DMA para ARA de pelo menos cerca de 20:1, pelo menos cerca de 30:1, pelo menos cerca de 35:1, pelo menos cerca de 40:1, pelo menos cerca de 60:1, pelo menos cerca de 80:1, pelo menos cerca de 100:1, pelo menos cerca de 150:1, pelo menos cerca de 200:1, pelo menos cerca de 250:1 ou pelo menos cerca de 300:1. Em algumas modalidades, o óleo microbiano e/ou uma ou mais frações deste selecionadas da fração de ésteres de esterol, da fração de triglicerídeo, da fração de ácido graxo livre, da fração de esterol, da fração de diglicerídeo, da fração polar (incluindo a fração de fosfolipídeo), e combinações destas, compreende de cerca de 0,5% até cerca de 1%, cerca de 0,5% até cerca de 2%, cerca de 0,5% até cerca de 2,5%, cerca de 0,5% até cerca de 3%, cerca de 0,5% até cerca de 3,5%, cerca de 0,5% até cerca de 5%, cerca de 0,5% até cerca de 6%, cerca de 1% até cerca de 2%, cerca de 2% até cerca de 3%, cerca de 2% até cerca de 3,5%, cerca de 1% até cerca de 2,5%, cerca de 1% até cerca de 3%, cerca de 1% até cerca de 3,5%, cerca de 1% até cerca de 5% ou cerca de 1% até cerca de 6% por peso de DPA n-6. Em algumas modalidades, o óleo microbiano e/ou uma ou mais frações deste selecionadas da fração de ésteres de esterol, da fração de triglicerídeo, da fração de ácido graxo livre, da
94/208 fração de esterol, da fração de diglicerídeo, da fração polar (incluindo a fração de fosfolipídeo), e combinações destas, compreende cerca de 6% ou menos, cerca de 5% ou menos, cerca de 3% ou menos, cerca de 2,5% ou menos, cerca de 2% ou menos, cerca de 1% ou menos, ou cerca de 0,5% ou menos por peso de DPA n-6. Em algumas modalidades, o óleo microbiano e/ou uma ou mais frações deste selecionadas da fração de ésteres de esterol, da fração de triglicerídeo, da fração de ácido graxo livre, da fração de esterol, da fração de diglicerídeo, da fração polar (incluindo a fração de fosfolipídeo), e combinações destas, é substancialmente livre de DPA n-6. Em algumas modalidades, o óleo microbiano e/ou uma ou mais frações deste selecionadas da fração de ésteres de esterol, da fração de triglicerídeo, da fração de ácido graxo livre, da fração de esterol, da fração de diglicerídeo, da fração polar (incluindo a fração de fosfolipídeo), e combinações destas, compreende uma
proporção de peso de DHA para DPA n-6 de mais do que cerca
de 6: 1, de pelo menos cerca de 8:1, pelo menos cerca de
10:1, pelo menos cerca de 15 :1, pelo menos cerca de 20:1,
pelo menos cerca de 25 : 1, pelo menos cerca de 50:1 ou pelo
menos cerca de 100 : 1 . Em algumas modalidades, o óleo
microbiano e/ou uma ou mais frações deste selecionadas da
fração de ésteres de esterol, da fração de triglicerídeo, da fração de ácido graxo livre, da fração de esterol, da fração de diglicerídeo, da fração polar (incluindo a fração de fosfolipídeo), e combinações destas, compreende cerca de 5% ou menos, cerca de 4% ou menos, cerca de 3% ou menos, cerca de 2% ou menos, cerca de 1,5% ou menos, cerca de 1% ou menos, ou cerca de 0,5% ou menos por peso de cada um de
95/208 ácido linoléico (18:2 n-6), ácido linolênico (18:3 n-3), ácido eicosenóico (20:1 n-9) e ácido erúcico (22:1 n- 9). Em algumas modalidades, o óleo microbiano e/ou uma ou mais frações deste selecionadas da fração de ésteres de esterol, da fração de triglicerídeo, da fração de ácido graxo livre, da fração de esterol, da fração de diglicerídeo, da fração polar (incluindo a fração de fosfolipídeo), e combinações destas, compreende cerca de 5% ou menos, cerca de 4% ou menos, cerca de 3% ou menos, cerca de 2% ou menos, cerca de 1,5% ou menos, ou cerca de 1% ou menos por peso de ácido heptadecanóico (17:0). Em algumas modalidades, o óleo microbiano e/ou uma ou mais frações deste compreendem cerca de 0,01% até cerca de 5% por peso, cerca de 0,05% até cerca de 3% por peso, ou cerca de 0,1% até cerca de 1% por peso de ácido heptadecanóico.
[157] A molécula de triglicerídeo contém 3 átomos de carbono centrais (Csn-1H2R1-Csn-2H2R2-Csn-3H2R3) , que permitem a formação de isômeros posicionais diferentes. Em algumas modalidades, o óleo microbiano compreende uma fração de triglicerídeo na qual pelo menos cerca de 20%, pelo menos cerca de 30%, pelo menos cerca de 35% ou pelo menos cerca de 40% dos triglicerídeos na fração de triglicerídeo contêm DHA em duas posições no triglicerídeo (DHA dissubstituído) selecionadas de quaisquer duas das posições sn-1, sn-2 e sn-3, com base no percentual da área relativa de picos em um cromatográfico de HPLC. Em algumas modalidades, o óleo microbiano compreende uma fração de triglicerídeo na qual de cerca de 20% até cerca de 40%, cerca de 20% até cerca de 35%, cerca de 30% até cerca de 40% ou cerca de 30% até cerca de 35% dos triglicerídeos na fração de triglicerídeo
96/208 contêm DHA em duas posições no triglicerídeo selecionadas de quaisquer duas das posições sn-1, sn-2 ou sn-3, com base no percentual da área relativa de picos em um cromatográfico de HPLC. Em algumas modalidades, o óleo microbiano compreende uma fração de triglicerídeo na qual pelo menos cerca de 5%, pelo menos cerca de 10%, pelo menos cerca de 15% ou pelo menos cerca de 20% dos triglicerídeos na fração de triglicerídeo contêm DHA em todas as posições sn-1, sn-2 e sn-3 (DHA trissubstituído), com base no percentual da área relativa de picos em um cromatográfico de HPLC. Em algumas modalidades, o óleo microbiano compreende uma fração de triglicerídeo na qual de cerca de 5% até cerca de 20%, cerca de 5% até cerca de 15%, cerca de 10% até cerca de 20%, ou cerca de 10% até cerca de 15% dos triglicerídeos na fração de triglicerídeo contêm DHA em todas as posições sn-1, sn-2 e sn-3, com base no percentual da área relativa de picos em um cromatográfico de HPLC. Em contraste, as espécies de TAG relatadas na Patente U.S. N° 6.582.941 does não contêm DHA em todas as três posições. Em algumas modalidades, o óleo microbiano compreende uma fração de triglicerídeo na qual pelo menos cerca de 50%, pelo menos cerca de 55%, pelo menos cerca de 60%, pelo menos cerca de 65%, pelo menos cerca de 70% ou pelo menos cerca de 75% dos triglicerídeos na fração de triglicerídeo contêm DHA em uma posição no triglicerídeo selecionada de qualquer uma das posições sn-1, sn-2 ou sn-3, com base no percentual da área relativa de picos em um cromatográfico de HPLC. Em algumas modalidades, o óleo microbiano compreende uma fração de triglicerídeo na qual de cerca de 50% até cerca de 75%, cerca de 50% até cerca de 70%, cerca
97/208 de 50% até cerca de 65%, cerca de 60% até cerca de 75%, cerca de 60% até cerca de 70% ou cerca de 60% até cerca de
65% dos triglicerídeos na fração de triglicerídeo contêm DHA em uma posição no triglicerídeo selecionada de qualquer uma das posições sn-1, sn-2 e sn-3, com base no percentual da área relativa de picos em um cromatográfico de HPLC.
Composições [158] A invenção é dirigida às composições que compreendem um microorganismo da invenção, uma biomassa isolada da invenção, um óleo microbiano da invenção, ou combinações destes.
[159] Um microorganismo, biomassa ou óleo microbiano da invenção pode ainda ser modificado ou processado química ou fisicamente com base nas necessidades da composição por qualquer técnica conhecida.
[160] Células de microorganismos ou biomassas podem ser secos antes do uso em uma composição por métodos que incluem, sem limitação, secagem por congelamento, secagem ao ar, secagem por atomização, secagem em túnel, secagem a vácuo (liofilização), e um processo similar. Alternativamente, a biomassa colhida e lavada pode ser usada diretamente em uma composição sem secagem. Veja, por exemplo, as Patentes U.S. Nos 5.130.242 e 6.812.009, cada uma aqui incorporada por referência em sua totalidade.
[161] Os óleos microbianos da invenção podem ser usados como material de partida para produzir mais eficientemente um produto enriquecido em um ácido graxo como, por exemplo, EPA. Por exemplo, os óleos microbianos da invenção podem ser submetidos a várias metodologias de purificação conhecidas na técnica, por exemplo, destilação
98/208 ou adução de uréia, para produzir um produto com potência maior com concentrações maiores de EPA ou de outro ácido graxo. Os óleos microbianos da invenção também podem ser usados em reações químicas para produzir compostos derivados de ácidos graxos nos óleos, por exemplo, ésteres e sais de EPA ou de outro ácido graxo.
[162] Uma composição da invenção pode incluir um ou mais excipientes. Como aqui usado, excipiente se refere a um componente, ou mistura de componentes, que é usado em uma composição da presente invenção para dar características desejáveis à composição, incluindo alimentos, bem como composições farmacêuticas, cosméticas e industriais. Um excipiente da presente invenção pode ser descrito como um excipiente farmaceuticamente aceitável quando adicionado a uma composição farmacêutica, o que significa que o excipiente é um composto, material, composição, sal e/ou forma de dosagem que é, dentro dos critérios de uma avaliação médica sólida, adequado ao contato com tecidos de seres humanos e animais não humanos sem toxicidade excessiva, irritação, resposta alérgica ou outras complicações problemáticas ao longo da duração desejada de contato compatível com uma proporção risco/benefício razoável. Em algumas modalidades, o termo farmaceuticamente aceitável significa aprovado por um órgão regulador do governo federal ou estadual ou listado na U.S. Pharmacopeia ou em outra farmacopéia internacional geralmente reconhecida para uso em animais e, mais particularmente, em humanos. Vários excipientes podem ser usados. Em algumas modalidades, o excipiente pode ser, sem limitação, um agente alcalino, um estabilizante, um
99/208 antioxidante, um agente de adesão, um agente de separação, um agente de revestimento, um componente de fase exterior, um componente de liberação controlada, um solvente, um tensoativo, um umectante, um agente de tamponamento, um enchimento, um emoliente, ou combinações destes. Excipientes além daqueles aqui discutidos podem incluir excipientes listados em, embora sem limitação, Remington: The Science and Practice of Pharmacy”, 21a Edição (2005) . A inclusão de um excipiente em uma classificação particular aqui apresentada (por exemplo, solvente”) visa ilustrar, e não limitar, o papel do excipiente. Um excipiente particular pode se enquadrar em múltiplas classificações.
[163] As composições da invenção incluem, sem limitação, produtos alimentícios, composições farmacêuticas, cosméticos e composições industriais.
[164] Em algumas modalidades, a composição é um produto alimentício. Um produto alimentício é qualquer alimento para consumo por animal não humano ou humano, e inclui composições tanto sólidas quanto líquidas. Um produto alimentício pode ser um aditivo para alimentos animais ou humanos. Alimentos incluem, sem limitação, alimentos comuns; produtos líquidos, incluindo leites, bebidas, bebidas terapêuticas e bebidas nutricionais; alimentos funcionais; suplementos; nutracêuticos; fórmulas infantis, incluindo fórmulas para bebês prematuros; alimentos para mulheres grávidas ou em amamentação; alimentos para adultos; alimentos geriátricos; e alimentos para animais.
[165] Em algumas modalidades, um microorganismo, biomassa ou óleo microbiano da invenção pode ser usado
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diretamente ou incluído como um aditivo dentro de um ou
mais de: um óleo, gordura vegetal hidrogenada, pasta, outro
ingrediente gorduroso, bebida, molho, alimento a base de
laticínios ou de soja (por exemplo, leite, iogurte, queijo e sorvete), um produto assado, um produto nutricional, por exemplo, como um suplemento nutricional (em forma de
cápsula ou comprimido), um suplemento vitamínico, um
suplemento dietético, uma bebida em pó e um produto
alimentício em pó acabado ou semi-acabado. Em algumas
modalidades, o suplemento nutricional está na forma de uma cápsula vegetariana que não é formada por e não contém quaisquer componentes de uma fonte animal.
[166] Uma lista parcial de composições alimentícias que podem incluir um óleo microbiano da invenção inclui, sem limitação, produtos à base de soja (leites, sorvetes, iogurtes, bebidas, cremes, pastas, branqueadores); sopas e mistura para sopa; massas, massas de farinha com ovos e leite e itens alimentícios cozidos incluindo, por exemplo, produtos para confeitaria fina, cereais para o café da manhã, bolos, cheesecakes, tortas, bolinhos, biscoitos, barras, pães, brioches, biscuits, bolinhos redondos, artigos de confeitaria, scones, croutons, bolachas, doces, bolinhos para aperitivos, tortas, barras de granola/refeição e artigos tostados de confeitaria; balas; confeitos duros; chocolate e outros confeitos; goma de mascar; produtos alimentícios líquidos, por exemplo, leites, bebidas energéticas, fórmula infantil, bebidas carbonadas, chás, refeições líquidas, sucos de fruta, bebidas à base de frutas, bebidas à base de vegetais; xaropes multivitamínicos, substituintes de refeições,
101/208 alimentos e xaropes medicinais; misturas de bebida em pó; pasta; produtos processados de peixe; produtos processados de carne; produtos processados de aves; caldos e molhos; condimentos (ketchup, maionese etc.); pastas à base de óleo vegetal; laticínios; iogurte; manteigas; laticínios congelados; sorvetes; sobremesas congeladas; iogurtes congelados; produtos alimentícios semi-sólidos como, por exemplo, alimento infantil; pudins e sobremesas de gelatina; queijo processado e não processado; misturas par panqueca; barras alimentícias incluindo barras energéticas; misturas para waffle; molhos para saladas; misturas substitutas de ovos; pastas de nozes e à base de nozes; aperitivos salgados como, por exemplo, batatas fritas e outros chips ou salgadinhos crocantes, chips de milho, chips de tortilha, aperitivos extrusados, pipoca, pretzels, crisps de batata e nozes; e aperitivos especiais como, por exemplo, molhos, aperitivos de frutas secas, aperitivos de carne, torresmos, barras alimentícias saudáveis e bolos de arroz/milho.
[167] Em algumas modalidades, um óleo microbiano da invenção pode ser usado para suplementar uma fórmula infantil. Uma fórmula infantil pode ser suplementada com um óleo microbiano da invenção isoladamente ou em combinação com um óleo fisicamente refinado derivado de um microorganismo produtor de ácido araquidônico (ARA). Um microorganismo produtor de ARA, por exemplo, é Mortierella alpina ou Mortierella sect, schmuckeri. Alternativamente, fórmulas infantis podem ser suplementadas com um óleo microbiano da invenção in combinação com um óleo rico em ARA, incluindo ARASCO® (Martek Biosciences, Columbia, MD).
102/208 [168] Em algumas modalidades, a composição é uma ração animal. Um animal inclui organismos não humanos que pertencem ao reino Animalia, e inclui, sem limitação, animais aquáticos e animais terrestres. O termo ração animal ou alimento animal se refere a qualquer alimento destinado a animais não humanos, por exemplo, peixe; peixe comercial; peixe ornamental; larvas de peixe; bivalves; moluscos; crustáceos; marisco; camarão; camarão larval; artêmia; rotíferos; camarão de água salgada; coletoresfiltradores; anfíbios; répteis; mamíferos; animais domésticos; animais de criação; animais de zoológico; animais de esportes; animais reprodutores; animais de corrida; animais de espetáculos; animais de patrimônio; animais raros ou em risco de extinção; animais de companhia; animais de estimação como, por exemplo, cães, gatos, porquinhos-da-índia, coelhos, ratos, camundongos ou cavalos; primatas como, por exemplo, macacos (por exemplo, micos, Rhesus, verde africano, patas, Cynomolgus e Cercopithecus), símios, orangotangos, babuínos, gibões e chimpanzés; canídeos como, por exemplo, cães e lobos; felídeos como, por exemplo, gatos, leões e tigres; eqüídeos como, por exemplo, cavalos, asnos e zebras; animais para alimentação como, por exemplo, vacas, gado, porcos e carneiros; ungulados como, por exemplo, veados e girafas; ou roedores como, por exemplo, camundongos, ratos, hamsters e porquinhos-da-índia; e assim por diante. Uma ração animal inclui, sem limitação, uma ração para aqüicultura, uma ração para animal doméstico, incluindo ração para animal de estimação, uma ração para animal de zoológico, uma ração para animal de trabalho, uma ração para animal de criação,
103/208 e combinações destas.
[169] Em algumas modalidades, a composição é uma ração ou suplemento de ração para qualquer animal cuja carne ou produtos sejam consumidos por humanos, por exemplo, qualquer animal do qual a carne, ovos ou leite seja derivada para consumo humano. Quando dada a esses animais, nutrientes como, por exemplo, LC-PUFAs, podem ser incorporados na carne, leite, ovos ou outros produtos desses animais para aumentar seu teor desses nutrientes.
[170] Em algumas modalidades, a composição é um material atomizado que pode ser esfarelado para formar partículas de um tamanho apropriado para consumo por zooplânctons, artêmias, rotíferos e coletores-filtradores. Em algumas modalidades, os zooplânctons, artêmias ou rotíferos alimentados pela composição servem, por sua vez, de alimento para larvas de peixe, peixes, mariscos, bivalves ou crustáceos.
[171] Em algumas modalidades, a composição é uma composição farmacêutica. Composições farmacêuticas adequadas incluem, sem limitação, uma composição antiinflamatória, um fármaco para o tratamento de doença cardíaca coronariana, um fármaco para o tratamento de arteriosclerose, um agente quimioterápico, um excipiente ativo, um fármaco para osteoporose, um antidepressivo, um anticonvulsivante, um fármaco anti-Helicobacter pilori, um fármaco para o tratamento de doença neurodegenerativa, um fármaco para o tratamento de doença hepática degenerativa, um antibiótico, uma composição para redução do colesterol e uma composição para redução do triacilglicerol. Em algumas modalidades, a composição é um alimento médico. Um alimento
104/208 médico inclui um alimento que está em uma composição a ser consumida ou administrada externamente sob a supervisão de um médico e que se destina ao gerenciamento dietético específico de uma condição, para a qual necessidades nutricionais distintas, com base em princípios científicos reconhecidos, são estabelecidas por avaliação médica.
[172] Em algumas modalidades, o óleo microbiano pode ser formulado em uma forma de dosagem. Formas de dosagem podem incluir, sem limitação, comprimidos, cápsulas, sinetes, péletes, pílulas, pós e grânulos, e formas de dosagem parenterais, que incluem, sem limitação, soluções, suspensões, emulsões, e pós secos que compreendem uma quantidade eficaz do óleo microbiano. Sabe-se também na técnica que essas formulações também podem conter diluentes farmaceuticamente aceitáveis, enchimentos, desintegrantes, aglutinantes, lubrificantes, tensoativos, veículos hidrofóbicos, veículos hidrossolúveis, emulsificantes, tampões, umectantes, hidratantes, solubilizantes, conservantes e semelhantes. As formas de administração podem incluir, sem limitação, comprimidos, drágeas, cápsulas, pastilhas e pílulas, que contêm o óleo microbiano e um ou mais veículos farmaceuticamente aceitáveis adequados.
[173] Para administração oral, o óleo microbiano pode ser combinado com veículos farmaceuticamente aceitáveis bem conhecidos na técnica. Esses veículos permitem que os óleos microbianos da invenção sejam formulados como comprimidos, pílulas, drágeas, cápsulas, líquidos, géis, xaropes, caldos, suspensões e semelhantes, para ingestão oral por um indivíduo a ser tratado. Em algumas modalidades, a forma de
105/208 dosagem é um comprimido, pílula ou pastilha. Preparações farmacêuticas para uso oral podem ser obtidas por adição de um excipiente sólido, opcionalmente trituração da mistura resultante e processamento da mistura de grânulos, após adição de auxiliares adequados, se desejado, para obter comprimidos ou núcleos de drágeas. Excipientes adequados incluem, sem limitação, enchimentos como, por exemplo, açúcares, incluindo, sem limitação, lactose, sacarose, manitol e sorbitol;
preparações de celulose como, por exemplo, sem limitação, amido de milho, amido de trigo, amido de arroz, amido de batata, gelatina, goma tragacanto, metil celulose, hidroxipropilmetil celulose, carboximetil celulose sódica e polivinilpirrolidona (PVP). Se desejado, agentes desintegrantes podem ser adicionados como, por exemplo, sem limitação, a polivinilpirrolidona reticulada, ágar ou ácido algínico ou um sal deste como, por exemplo, alginato de sódio. Preparações farmacêuticas que podem ser usadas oralmente incluem, sem limitação, cápsulas push-fit feitas de gelatina, bem como cápsulas lacradas macias feitas de gelatina e um plastificante, por exemplo, glicerol ou sorbitol. Em algumas modalidades, a forma de dosagem é uma forma de dosagem vegetariana, em que a forma de dosagem não é formada por e não contém nenhum componente de uma fonte animal. Em algumas modalidades, a forma de dosagem vegetariana é uma cápsula vegetariana.
[174] Em algumas modalidades, a composição é um cosmético. Cosméticos incluem, sem limitação, emulsões, cremes, loções, máscaras, sabonetes, shampoos, lavagens, cremes faciais, condicionadores, maquiagens, agentes de banho e líquidos de dispersão. Agentes cosméticos podem ser
106/208 medicinais ou não medicinais.
[175] Em algumas modalidades, a composição é uma composição industrial. Em algumas modalidades, a composição é um material de partida para uma ou mais manufaturas. Uma manufatura inclui, sem limitação, um polímero, um material fotográfico fotossensível; um detergente; um óleo industrial; ou um detergente industrial. Por exemplo, a Patente U.S. N° 7.259.006 descreve uso de gordura e óleo contendo DHA para produção de ácido behênico e produção de materiais fotográficos sensíveis que utilizam ácido behênico.
Métodos de utilização das composições [176] Em algumas modalidades, as composições podem ser usadas no tratamento de uma condição em humanos ou animais não humanos. Em algumas modalidades, as composições podem ser usadas para nutrição em humanos ou animais não humanos.
[177] Os termos tratar e tratamento se referem tanto ao tratamento terapêutico quanto às medidas profiláticas ou preventivas, em que o objetivo é evitar ou tornar mais lenta (reduzir) uma condição, doença ou distúrbio fisiológico indesejado, ou para obter resultados clínicos benéficos ou desejados. Para os objetivos dessa invenção, resultados clínicos benéficos ou desejados incluem, sem limitação, alívio ou eliminação dos sintomas ou sinais associados a uma condição, doença ou distúrbio; diminuição da extensão de uma condição, doença ou distúrbio; estabilização de uma condição, doença ou distúrbio, (ou seja, em que a condição, doença ou distúrbio não esteja piorando); retardo no surgimento ou progressão da condição, doença ou distúrbio; melhora da condição,
107/208 doença ou distúrbio; remissão (seja ela parcial ou total e seja ela detectável ou indetectável) da condição, doença ou distúrbio; ou melhora de uma condição, doença ou distúrbio. O tratamento inclui desenvolver uma resposta clinicamente significante sem efeitos colaterais excessivos. O tratamento também inclui o prolongamento da sobrevida, quando comparada com a sobrevida esperada caso não receba tratamento.
[178] Em algumas modalidades, a composição é usada para tratar uma condição, doença ou distúrbio como, por exemplo, acne, inflamação aguda, maculopatia relacionada à idade, alergia, doença de Alzheimer, artrite, asma, aterosclerose, doença autoimune, distúrbio de lipídeos sangüíneos, cistos da mama, caquexia, câncer, reestenose cardíaca, doenças cardiovasculares, inflamação crônica, doença cardíaca coronariana, fibrose cística, distúrbio degenerativo do fígado, diabetes, eczema, distúrbio gastrointestinal, doença cardíaca, níveis elevados de triacilglicerol, hipertensão, hiperatividade, doenças imunológicas, inibição de crescimento tumoral, condições inflamatórias, distúrbios intestinais, disfunção renal, leucemia, depressão maior, esclerose múltipla, distúrbio neurodegenerativo, osteoartrite, osteoporose, distúrbio do peroxissomo, pré-eclâmpsia, parto prematuro, psoríase, distúrbio pulmonar, artrite reumatóide, risco de doença cardíaca ou trombose.
[179] Em algumas modalidades, a composição é usada
para aumentar a duração da gestação de um feto no terceiro
trimestre.
[180] Em algumas modalidades, a composição é usada
108/208 para controlar a pressão arterial.
para para [181] Em melhorar [182] Em melhorar algumas ou manter algumas ou manter modalidades, a composição é usada a função cognitiva.
modalidades, a composição é usada a memória.
dosagem pode ser [183] A composição ou forma de
administrada no corpo de um indivíduo por qualquer via
compatível com a composição ou forma de dosagem. Uma
substância é considerada como sendo administrada se a
substância é introduzida no corpo do indivíduo pelo
indivíduo, ou se outra pessoa, uma máquina ou um
dispositivo introduz a substância no corpo do indivíduo.
Administração, portanto, inclui, por exemplo, autoadministração, administração por outros e administração indireta. O termo contínua ou consecutiva, como aqui usado, em referência à administração, significa que a freqüência de administração é pelo menos uma vez ao dia.
Observe, no entanto, que a freqüência de administração pode ser mais do que uma vez ao dia e ainda ser contínua ou consecutiva, por exemplo, duas vezes ou até mesmo três vezes ao dia, desde que os níveis de dosagem como aqui especificados não sejam excedidos. Os meios e métodos para administração são conhecidos na técnica e um profissional pode consultar várias referências farmacológicas para obter diretrizes. Por exemplo, Modern Pharmaceutics, Banker & Rhodes, Informa Healthcare, USA, 4a Edição (2002); e Goodman & Gilman's The Pharmaceutical Basis of Therapeutics, McGraw-Hill Companies, Inc., Nova York, 10a Edição (2001), podem ser consultados.
[184] O termo pessoa, indivíduo ou paciente
109/208 significa qualquer indivíduo, seja ele humano ou não humano, para o qual o diagnóstico, prognóstico, terapia ou administração da composição ou forma de dosagem é desejado. Indivíduos mamíferos incluem, sem limitação, humanos; animais domésticos; animais de criação; animais de zoológico; animais de esportes; animais de estimação como, por exemplo, cães, gatos, porquinhos-da-índia, coelhos, ratos, camundongos ou cavalos; primatas como, por exemplo, macacos (por exemplo, micos, Rhesus, verde africano, patas, Cynomolgus, e Cercopithecus), símios, orangotangos, babuínos, gibões e chimpanzés; canídeos como, por exemplo, cães e lobos; felídeos como, por exemplo, gatos, leões e tigres; eqüídeos como, por exemplo, cavalos, asnos e zebras; animais para alimentação como, por exemplo, vacas, gado, porcos e carneiros; ungulados como, por exemplo, veados e girafas; roedores como, por exemplo, camundongos, ratos, hamsters e porquinhos-da-índia; e assim por diante. O termo indivíduo também engloba animais de modelo, por exemplo, animais de modelo de doença. Em algumas modalidades, o termo indivíduo inclui animais valiosos, economicamente ou de alguma outra forma, por exemplo, animais reprodutores economicamente importantes, animais de corrida, animais de espetáculos, animais de patrimônio, animais raros ou em risco de extinção ou animais de companhia. Em certas modalidades, o indivíduo é um indivíduo humano. Em certas modalidades, o indivíduo é um indivíduo não humano.
[185] A composição pode ser administrada como uma quantidade nutricional, quantidade terapeuticamente eficaz, uma quantidade profilaticamente eficaz, uma
110/208 dose terapêutica” ou uma dose profilática”. Uma quantidade nutricional” se refere a uma quantidade eficaz, em dosagens e por períodos de tempo necessários, para obter um resultado nutricional desejado. Um resultado nutricional pode ser, por exemplo, níveis aumentados de um componente de ácido graxo desejável em um indivíduo. Uma quantidade terapeuticamente eficaz” ou dose terapêutica” se refere a uma quantidade eficaz, em dosagens e por períodos de tempo necessários, para obter um resultado terapêutico desejado. Um resultado terapêutico pode ser, por exemplo, redução de sintomas, sobrevida prolongada, mobilidade aumentada, e semelhantes. Um resultado terapêutico não precisa ser uma cura”. Uma quantidade profilaticamente eficaz” ou dose profilática” se refere a uma quantidade eficaz, em dosagens e por períodos de tempo necessários, para obter o resultado profilático desejado. Tipicamente, na medida em que uma dose profilática seja usada em indivíduos antes ou em um estágio inicial de doença, uma quantidade profilaticamente eficaz será menor do que uma quantidade terapeuticamente eficaz para o tratamento de um estágio avançado de doença.
[186] Várias quantidades de dosagem da composição, forma de dosagem ou composição farmacêutica podem ser administradas a um indivíduo, com base na quantidade de EPA ou de outro componente de ácido graxo do microorganismo, biomassa ou óleo microbiano a ser administrada ao indivíduo. Os termos dosagem diária”, nível de dosagem diária” e quantidade de dosagem diária” se referem aqui à quantidade total de EPA ou de outro componente de ácido graxo administrada por dia (por período de 24 horas). Dessa forma, por exemplo, a administração de EPA a um indivíduo
111/208 em uma dosagem diária de 2 mg significa que o indivíduo recebe um total de 2 mg de EPA diariamente, seja o EPA administrada como uma forma de dosagem única que compreende 2 mg de EPA ou, alternativamente, quatro formas de dosagem que compreendem 0,5 mg de EPA cada (para um total de 2 mg de EPA). Em algumas modalidades, a quantidade diária de EPA é administrada em uma forma de dosagem única, ou em duas formas de dosagem. As formas de dosagem da presente invenção podem ser tomadas em uma aplicação única ou em múltiplas aplicações. Por exemplo, se quatro comprimidos são tomados diariamente, cada comprimido compreendendo 0,5 mg de EPA, então todos os quatro comprimidos serão tomados uma vez ao dia, ou 2 comprimidos podem ser tomados duas vezes ao dia, ou 1 comprimido pode ser tomado a cada 6 horas. Em algumas modalidades, a dosagem diária é de cerca de 100 mg até cerca de 15 g de EPA. Em algumas modalidades, a dosagem diária é de cerca de 0,5 mg até cerca de 250 mg, cerca de 100 mg até cerca de 250 mg, cerca de 100 mg até cerca de 500 mg, cerca de 100 mg até cerca de 1 g, cerca de 1 g até cerca de 2,5 g, cerca de 1 g até cerca de 5 g, cerca de 1 g até cerca de 10 g, cerca de 1 g até cerca de 15 g, cerca de 5 g até cerca de 10 g, cerca de 5 g até cerca de 15 g, cerca de 10 g até cerca de 15 g, cerca de 100 mg até cerca de 10 g, cerca de 100 mg até cerca de 5 g, ou cerca de 100 mg até cerca de 2,5 g de EPA, DHA, ou uma combinação destes. Em algumas modalidades, a composição é uma forma de dosagem que compreende cerca de 0,5 mg até
cerca de 250 mg, 100 mg até cerca de 250 mg, cerca de 0,5
mg até cerca de 500 mg, cerca de 100 mg até cerca de 500
mg, cerca de 0,5 mg até cerca de 1 g , ou cerca de 100 mg
112/208 até cerca de 1 g de EPA, DHA, ou uma combinação destes por forma de dosagem.
[187] A administração das composições ou formas de dosagem da presente invenção pode ser obtida usando vários regimes. Por exemplo, em algumas modalidades, a administração ocorre diariamente em dias consecutivos ou, alternativamente, ocorre em dias alternados (a cada dois dias). A administração pode ocorrer em um ou mais dias.
[188] A administração das composições e formas de dosagem pode ser combinada com outros regimes usados para o tratamento da condição. Por exemplo, o método da presente invenção pode ser combinado com regimes dietéticos (por exemplo, dietas com pouco carboidrato, dietas ricas em proteína, dietas ricas em fibras etc.), regimes de exercícios, regimes de perda de peso, regimes de cessação do tabagismo, ou combinações destes. O método da presente invenção também pode ser usado em combinação com outros produtos farmacêuticos no tratamento da condição. As composições ou formas de dosagem da presente invenção podem ser administradas antes ou depois de outros regimes ou produtos farmacêuticos.
Kits que compreendem as composições [189] A invenção é ainda dirigida a kits ou embalagens que contêm uma ou mais unidades de uma composição da invenção. Kits ou embalagens podem incluir unidades de um produto alimentício, composição farmacêutica, cosmético ou composição industrial que compreende o microorganismo isolado, biomassa ou óleo microbiano da invenção, ou combinações destes. Kits ou embalagens também podem incluir um aditivo que compreende o microorganismo isolado,
113/208 biomassa ou óleo microbiano da invenção, ou combinações destes, para preparação de um alimento, cosmético, composição farmacêutica ou composição industrial.
[190] Em algumas modalidades, o kit ou embalagem contém uma ou mais unidades de uma composição farmacêutica a ser administrada de acordo com os métodos da presente invenção. O kit ou embalagem pode conter uma unidade de dosagem, ou mais de uma unidade de dosagem (ou seja, múltiplas unidades de dosagem). Se múltiplas unidades de dosagem estão presentes no kit ou embalagem, as múltiplas unidades de dosagem podem ser opcionalmente dispostas para administração seqüencial.
[191] Os kits da presente invenção podem opcionalmente conter instruções associadas às unidades ou formas de dosagem dos kits. Essas instruções podem estar em uma forma prescrita por um órgão governamental que regula a fabricação, uso ou venda de produtos farmacêuticos, cujo alerta reflete a aprovação pelo órgão da fabricação, uso ou venda para administração humana para tratar uma condição ou distúrbio. As instruções podem estar em qualquer forma que forneça informações sobre o uso das unidades ou formas de dosagem no kit de acordo com os métodos da invenção. Por exemplo, as instruções podem estar na forma de material impresso, ou na forma de um dispositivo de meios prégravados.
[192] Na evolução do exame de um paciente, um profissional médico pode determinar que a administração de um dos métodos da presente invenção é adequada ao paciente, ou o médico pode determinar que a condição do paciente pode ser melhorada pela administração de um dos métodos da
114/208 presente invenção. Antes de prescrever qualquer regime, o médico pode aconselhar o paciente, por exemplo, sobre os vários riscos e benefícios associados ao regime. O paciente pode receber informações totais sobre todos os riscos conhecidos e suspeitos associados ao regime. Esse aconselhamento pode ser fornecido verbalmente, bem como em forma escrita. Em algumas modalidades, o médico pode fornecer ao paciente materiais de literatura sobre o regime, por exemplo, informações sobre o produto, materiais educativos, e semelhantes.
[193] A presente invenção é dirigida aos métodos de educação de consumidores sobre os métodos de tratamento, o método compreendendo a distribuição das formas de dosagem com informação ao consumidor em um ponto de venda. Em algumas modalidades, a distribuição ocorrerá em um ponto de venda que possui um farmacêutico ou profissional de saúde.
[194] O termo informação ao consumidor” pode incluir, sem limitação, um texto em inglês, um texto em um idioma diferente de inglês, imagem visual, tabelas, gravação telefônica, página da Internet e acesso a um representante do atendimento ao consumidor. Em algumas modalidades, a informação ao consumidor fornecerá instruções para uso das formas de dosagem de acordo com os métodos da presente invenção, idades de uso apropriadas, indicações, contraindicações, dosagem apropriadas, avisos, número de telefone e endereço da Internet. Em algumas modalidades, o método ainda compreende o fornecimento de informações profissionais para pessoas relevantes em condição de responder às questões do consumidor em relação ao uso dos regimes revelados de acordo com os métodos da presente
115/208 invenção. O termo informação profissional” inclui, sem limitação, informação em relação ao regime quando administrado de acordo com os métodos da presente invenção que é projetado para permitir que um profissional médico responda às questões do consumidor. Um profissional médico” inclui, por exemplo, um médico, assistente médico, enfermeira, farmacêutico e representante do serviço ao consumidor.
[195] Após essa invenção ter sido geralmente descrita, uma compreensão adicional pode ser obtida por referência aos exemplos aqui fornecidos. Esses exemplos têm finalidade apenas ilustrativa, e não visam ser limitantes.
Exemplo 1 [196] Nesse exemplo, Schizochytrium sp. foi cultivado em frascos de Erlenmeyer agitados de 250 ml contendo 50 ml de meio de cultura. Um inóculo foi preparado no mesmo meio que consistia em 0,625 g de NaCl, 1,0 g de KCl, 5 g de MgSO4.7H2O, 0,1 g de (NH4%SO4, 0,2 9 g de CaCl2.2H2O, 1,0 g de monoidrato de glutamato monossódico, 1,0 g de extrato de levedura e 23,8 g de tampão HEPES dissolvidos em aproximadamente 900 ml de água destilada. O meio foi levado até o pH 7 usando NaOH. O volume final do meio foi levado até 896 ml, e o meio foi esterilizado por autoclavagem. Após autoclavagem, os seguintes componentes foram adicionados de forma estéril ao meio: 0,89 ml de 56,5 g/l de KH2PO4, 100 ml de 500 g/l de glicose, 2 ml de solução de estoque de metal-traço e 1 ml de solução de estoque de vitamina. A solução de estoque de metal-traço continha o seguinte: 90 g de ácido cítrico, 5,15 g de FeSO4.7H2O, 1,55 g de MnCl2.4H2O, 0,965 g de ZnSO4.7H2O, 0,02 g de CoCl2.6H2O,
116/208
0,02 g de Na2MoO4.2H2O, 1,035 g de CuSO4.5H2O, 1,035 g de NiSO4.6H2O dissolvidos em um litro de água destilada e pH levado até 2.5 com HCl. A solução de estoque de vitamina continha o seguinte: 0,16 g de vitamina B12, 9,75 g de tiamina e 3,33 g de pantotenato de cálcio dissolvidos em um litro de água destilada. Os frascos agitados foram inoculados com 1 ml de inóculo. Frascos em triplicata foram colocados em uma incubadora de CO2 ajustada para manter uma atmosfera de 5, 10 ou 1% de CO2 no ar. Outro conjunto de frascos em triplicata foi colocado em uma incubadora em níveis ambientes de CO2. Todos os conjuntos de frascos foram agitados a 200 rpm e todas as incubadoras ajustadas em 22,5°C. Após sete dias de crescimento, a biomassa foi coletada dos frascos agitados por centrifugação, a biomassa foi seca por congelamento e o perfil de ácido graxo da biomassa foi determinado usando procedimentos padronizados de metil esterificação. Níveis elevados de CO2 produziram alterações significantes na biomassa, no % de gordura e nos perfis de ácido graxo. Foi notável a alteração produzida nos valores de % de EPA e % de DHA entre condições de CO2 e condições ambientes. Além disso, as alterações nesses ácidos graxos se tornava mais pronunciadas à medida que o nível de CO2 aumentava. Os resultados são apresentados na Tabela 4.
Tabela 4
AMOSTRA Biomassa (g/l) % de 16:0 % de EPA % de DHA % de gordura
Ambiente (1) 3,43 33,55 4,24 54,15 54,55
Ambiente (2) 3,35 33,29 4,30 54,42 52,67
Ambiente (3) 3,27 33,29 4,29 54,38 50,62
117/208
15% de CO2 (1) 2,96 28,41 26,12 29,52 53,31
15% de CO2 (2) 2,94 28,13 26,20 29,98 55,46
15% de CO2 (3) 2,80 28,12 26,61 29,46 53,20
Ambiente (1) 3,89 35,34 3,95 52,31 60,21
Ambiente (2) 3,85 34,74 4,00 53,03 58,33
Ambiente (3) 3,91 34,76 4,04 52,95 58,18
10% de CO2 (1) 4,91 33,35 12,94 41,13 69, 98
10% de CO2 (2) 5,03 33,28 12,99 41,15 , 69,58
10% de CO2 (3) 4,95 33,46 12,84 41,02 69,08
Ambiente (1) 3,51 29,95 3,00 45,06 58,48
Ambiente (2) 3,69 30,57 2,97 44,92 54,87
Ambiente (3) 3,43 29,98 3,13 45,20 53,29
5% de CO2 (1) 4,18 32,03 5,59 40,55 42,89
5% de CO2 (2) 4,16 31,87 5,85 40,36 43,47
5% de CO2 (3) 4,14 31,58 6,13 40,43 44,13
Exemplo 2 [197] Nesse exemplo, Schizochytrium sp. foi cultivado em frascos de Erlenmeyer agitados de 250 ml contendo 50 ml de meio de cultura. Um inóculo foi preparado no mesmo meio que consistia em 0,625 g de NaCl, 1,0 g de KCl, 5 g de MgSO4.7H2O, 0,1 g de (NHJ2SO4, 0,2 9 g de CaCl2.2H2O, 1,0 g de monoidrato de glutamato monossódico, 1,0 g de extrato de levedura e 23,8 g de tampão HEPES dissolvidos em aproximadamente 900 ml de água destilada. O meio foi levado até o pH 7 usando NaOH. O volume final do meio foi levado até 896 ml, e o meio foi esterilizado por autoclavagem. Após autoclavagem, os seguintes componentes foram adicionados de forma estéril ao meio: 0,89 ml de 56,5 g/l de KH2PO4, 100 ml de 500 g/l de glicose, 2 ml de solução de estoque de metal-traço e 1 ml de solução de estoque de
118/208 vitamina. A solução de estoque de metal-traço continha o seguinte: 90 g de ácido cítrico, 5,15 g de FeSO4.7H2O, 1,55 g de MnCl2.4H2O, 0,965 g de ZnSO4.7H2O, 0,02 g de CoCl2.6H2O, 0,02 g de Na2MoO4.2H2O, 1,035 g de CuSO4.5H2O, 1,035 g de NiSO4.6H2O dissolvidos em um litro de água destilada e pH levado até 2,5 com HCl. A solução de estoque de vitamina continha o seguinte: 0,16 g de vitamina B12, 9,75 g de tiamina e 3,33 g de pantotenato de cálcio dissolvidos em um litro de água destilada. Os frascos agitados foram inoculados com 1 ml de inóculo. Frascos em duplicata foram colocados em uma incubadora de CO2 ajustada para manter uma atmosfera de 5, 10 ou 15% de CO2 no ar. Outro conjunto de frascos em duplicata foi colocado em uma incubadora em níveis ambientes de CO2. Todos os conjuntos de frascos foram agitados a 200 rpm e todas as incubadoras ajustadas em 22,5°C. Após sete dias de crescimento, a biomassa foi coletada dos frascos agitados por centrifugação, a biomassa foi seca por congelamento e o perfil de ácido graxo da biomassa foi determinado usando procedimentos padronizados de metil esterificação. Níveis elevados de CO2 produziram alterações significantes na biomassa, no % de gordura e nos perfis de ácido graxo. Foi notável a alteração produzida nos valores de % de EPA e % de DHA entre condições de CO2 e condições ambientes. Além disso, as alterações nesses ácidos graxos se tornava mais pronunciadas à medida que o nível de CO2 aumentava. Os resultados são fornecidos na Tabela 5 abaixo.
Tabela 5
Biomassa % de % de % de % de
AMOSTRA (g/l) 16:0 EPA DHA gordura
119/208
Ambiente (1) 5,81 28,22 3,88 58,69 60,86
Ambiente (2) 6,03 26,54 3,89 60,87 66,74
15% de CO2 (1) 4,38 14,67 36,12 35,84 62,44
15% de CO2 (2) 4,44 14,31 36,09 36,59 63,00
10% de CO2 (1) 5,36 21,44 19,88 46,40 64,94
10% de CO2 (2) 5,63 21,39 19,88 46,74 65,82
5% de CO2 (1) 6,40 24,71 11,56 54,04 77,16
5% de CO2 (2) 6,33 24,62 11,74 54,36 67,94
Exemplo 3 [198] Nesse exemplo, Thraustochytrium sp. foi cultivado em frascos de Erlenmeyer agitados de 250 ml contendo 50 ml de meio de cultura. Um inóculo foi preparado no mesmo meio que consistia em 42 g de Na2SO4, 0,625 g de
NaCl, 1,0 g de KCl, 5 g de MgSO4.7H2O, 0,1 g de (NH4)2SO4, 0,29 g de CaCl2.2H2O, 1,0 g de monoidrato de glutamato monossódico, 1,0 g de extrato de levedura e 2 3,8 g de tampão HEPES dissolvidos em aproximadamente 900 ml de água destilada. O meio foi levado até o pH 7 usando NaOH. O volume final do meio foi levado até 961 ml, e o meio foi esterilizado por autoclavagem. Após autoclavagem, os seguintes componentes foram adicionados de forma estéril ao meio: 0,89 ml de 56,5 g/l de KH2PO4, 35 ml de 500 g/l glicerol, 2 ml de solução de estoque de metal-traço, e 1 ml de solução de estoque de vitamina. A solução de estoque de metal-traço continha o seguinte: 9 g de ácido cítrico, 5,15 g de FeSO4.7H2O, 1,55 g de MnCl2.4H2O, 0,965 g de ZnSO4.7H2O,
120/208
0,02 g de C0CI2 6H2O, 0,02 g de Na2MoO4.2H2O, 1,035 g de CuSO4.5H2O, 1,035 g de NiSO4.6H2O dissolvidos em um litro de água destilada e o pH ajustado até 2,5 com HCl. A solução de estoque de vitamina continha o seguinte: 0,16 g de vitamina B12, 9,75 g de tiamina e 3,33 g de pantotenato de cálcio dissolvidos em um litro de água destilada. Os frascos agitados foram inoculados com 1 ml de inóculo. Frascos em triplicata foram colocados em uma incubadora de CO2 ajustada para manter uma atmosfera de 15% de CO2 no ar. Outro conjunto de frascos em triplicata foi colocado em uma incubadora em níveis ambientes de CO2. Ambos os conjuntos de frascos foram agitados a 200 rpm e ambas as incubadoras foram ajustadas a 22,5°C. Após sete dias de crescimento, a biomassa foi coletada dos frascos agitados por centrifugação, a biomassa foi seca por congelamento e o perfil de ácido graxo da biomassa foi determinado usando procedimentos padronizados de metil esterificação. Uma atmosfera de 15% de CO2 no ar produziu alterações substanciais na cultura de Thraustochytrium. Em CO2 elevado, a biomassa e o % de gordura foram menores do que sob condições ambientes. O %de 16:0 e o % de DHA foram menores e o % de EPA foi significativamente maior do que sob condições ambientes. Os resultados são apresentados na Tabela 6 abaixo.
Tabela 6
Biomassa % de % de % de % de
Atmosfera (g/l) 16:0 EPA DHA gordura
Ambiente (1) 3,39 31,74 11,61 44,65 53,32
Ambiente (2) 3,42 30,88 11,95 44,99 53,30
Ambiente (3) 3,39 32,13 11,46 44,19 53,93
121/208
15% de CO., (1) 2,23 22,12 36,94 19,04 38,73
15% de CO2 (2) 2,05 21,40 37,14 18,57 39,34
15% de CO., (3) 2,11 21,68 36,83 18,52 40,86
Exemplo 4 [199] Nesse exemplo [NBx0614et10] , espécie de Schizochytrium (ATCC PTA-10208), foi cultivado em quatro fermentadores de 100 litros New Brunswick Scientific BioFlo 6000 em um volume final-alvo (receita) de 80 litros com um processo de batelada alimentada de carbono (glicose) e nitrogênio (hidróxido de amônio) em várias condições pressão em excesso para avaliar a sensibilidade da cultura ao dióxido de carbono dissolvido aumentado. Cada uma das fermentações foi inoculada com 8 litros de cultura. Para propagação do inóculo, um fermentador New Brunswick Scientific BioFlo 5000 de 80 litros foi utilizado. O meio do inóculo consistiu em 65 litros de meio preparados em seis grupos separados. O Grupo 1 consistia em 585 g de MSG.1H2O, 65 g de KCl, 325 g de MgSO4.7H2O, 24,05 g de (NH4)2SO4, 40,625 g de NaCl, 390 g de T154 (extrato de levedura) e 13 ml de Dow 1520US (antiespuma). O Grupo 1 foi esterilizado em batelada a 121 graus no fermentador de inóculo em um volume de aproximadamente 60 litros. O Grupo 2 consistia em 18,85 g de CaCl2.2H2O. O Grupo 3 consistia em 33,8 g de KH2PO4. Cada um dos Grupos 2 e 3 foi autoclavado em soluções separadas por aproximadamente 45-60 minutos e adicionado ao Grupo 1 assepticamente pósesterilização. O Grupo 4 consistia em 201,5 mg de MnCl2.4H2O, 201,5 mg de ZnSO4.7H2O, 2,6 mg de CoCl2.6H2O, 2,6 mg de Na2MoO4.2H2O, 134,6 mg de CuSO4.5H2O, 134,6 mg de NiSO4.6H2O, 669,4 mg de FeSO4.7H2O e 1,522 g de ácido
122/208 cítrico. O Grupo 4 foi autoclavado da mesma forma que os Grupos 2 e 3. O Grupo 5 consistia em 633,75 mg de tiaminaHCl, 10,4 mg de vitamina B12 e 216,5 mg de sal hemicálcico de ácido pantotênico. O Grupo 5 foi dissolvido em água tratada por osmose reversa e depois esterilizado por filtro. O Grupo 6 consistia em 3.250 g de glicose dissolvidos em um volume de 3.000 ml de água tratada por osmose reversa (RO water) . Após o fermentador de inóculo ter sido resfriado até 22,5 graus Celsius, Os Grupos 2, 3, 4, 5 e 6 foram adicionados ao fermentador. Usando hidróxido de sódio e ácido sulfúrico, o fermentador teve o pH ajustado até 7 e o oxigênio dissolvido foi aumentado para 100% antes da inoculação. O fermentador de inóculo foi inoculado com 1.300 ml de uma cultura de fermentação menor (a cultura de fermentação menor foi preparada e cultivada da mesma forma que a cultura de inóculo de 65 litros) e cultivada a 22,5 graus Celsius, pH 7, agitação a 180 rpm e 32,5 l/min de ar por um período de 37 horas, quando então 8 litros de caldo de inóculo foram transferidos para cada fermentador de 100 litros. Cada fermentador de 100 litros continha 80 litros de meio de fermentação. O meio de fermentação foi preparado de forma similar ao fermentador de inóculo. Para cada fermentador de 100 litros, o meio de fermentação consistia em 6 grupos de meios em batelada. Para os vasos NB5, NB6 e NB7, o Grupo 1 continha 704 g de Na2SO4, 50 g de NaCl, 80 g de KCl, 400 g de MgSO4.7H2O, 33,6 g de (NH4)2SO4, 80 g de extrato de levedura T154 e 8 ml de antiespuma Dow 1520-US. O Grupo 1 foi esterilizado a vapor a 122 graus Celsius por 60 minutos nos fermentadores de 100 litros em um volume de aproximadamente 35 litros. O Grupo 2
123/208 continha 23,2 g de CaCl2.2H2O em um volume de aproximadamente 300 ml. O Grupo 3 continha 141,2 g de
KH2PO4 dissolvidos em água tratada por osmose reversa. O Grupo 4 continha 248 mg de MnCl2.4H2O, 744 mg de ZnSO4.7H2O, 3,2 mg de Na2MoO4.2H2O, 165,6 mg de CuSO4.5H2O e 165,6 mg de NiSO4.6H2O, 824 mg de FeSO4.7H2O e 80 g de ácido cítrico, todos dissolvidos em água tratada por osmose reversa. O Grupo 5 continha 780 mg de tiamina-HCl, 266,4 mg de sal hemicálcico de ácido pantotênico e 286,4 pg de biotina, todos dissolvidos e esterilizados por filtro em água tratada por osmose reversa. O Grupo 6 continha 2.400 g de glicose em aproximadamente 3 litros de água tratada por osmose reversa. Os Grupos 2, 3, 4, 5 e 6 foram combinados e adicionados ao fermentador após o fermentador ter alcançado uma temperatura de operação de 22,5 graus Celsius. Para o vaso NB8, todos os grupos eram iguais às outras três condições, com a exceção do ácido cítrico. Em NB8, o Grupo 4 continha apenas aproximadamente 3,75 g de ácido cítrico. Cada volume de fermentador antes da inoculação era de aproximadamente 52-53 litros. Cada fermentador foi inoculado com 8 litros de caldo da fermentação de inóculo descrito acima. A fermentação teve o pH controlado por utilização de uma solução de 7,3 litros de hidróxido de amônio 4 N em um pH de 7 até exaustão do nitrogênio, quando então hidróxido de sódio 4 N e ácido sulfúrico 4 N foram utilizados para controle do pH. O oxigênio dissolvido foi controlado para manter um alvo de 2 0% por toda a fermentação usando agitação de 180 a 480 rpm e fluxo de ar de 40 l/min a 80 l/min. Cada um desses vasos foi controlado em uma pressão de entrada diferente (B5 = 13,78, NB6 =
124/208
103,42 e NB7 = 137,89 kPa) para avaliar a sensibilidade do organismo ao dióxido de carbono dissolvido aumentado. Por toda a fermentação, uma solução de 850 g/l de dextrose 95% (xarope de milho) foi alimentada para manter uma concentração de glicose menor do que 50 g/l. Após 8 dias, a massa de células secas e a titulação de ômega-3 de cada fermentador de 80 litros eram similares com NB5 a 110,1 g/l de DCW e 44,37 g/l de ômega-3; NB6 a 117,7 g/l de DCW e 45,78 g/l de ômega-3; NB7 a 114,1 g/l de DCW e 48,43 g/l de ômega-3; NB8 a 119,5 g/l de DCW e 43,55 g/l de ômega-3. À medida que a pressão era aumentada, o % de DHA/FAME diminuía, o % de EPA/FAME aumentava, e a proporção de DHA para EPA diminuía. Quando se compara o teor final de ácido graxo de 13,78 kPa com 137,89 kPa, o % de DHA/FAME diminuiu de 50,48% para 41,26% e o % de EPA/FAME aumentou de 18,95% para 23,28%. Os resultados são apresentados na Tabela 7.
Tabela 7
% de EPA/FAME
Horas NB5 (13,78 kPa) NB6 (103,42 kPa) NB7 (137,89 kPa) NB8 (137,89 kPa)
17,5 12,63 13,43 13,15 14, 32
41,5 12,05 12,01 11,54 16, 37
65,5 14,03 16,54 15,34 20, 37
89,5 18,67 20,04 20,86 23, 08
116,5 21,99 21,40 24,55 24, 52
139,0 21,24 21,57 25,85 25, 25
161,5 19,95 20,42 24,78 24, 96
185,5 18,95 18,89 23,28 23, 90
125/208
% de DHA/FAME
Horas NB5 (13,78 kPa) NB6 (103,42 kPa) NB7 (137,89 kPa) NB8 (137,89 kPa)
17,5 48,66 52,94 52, 56 49,15
41,5 52,62 52,38 52, 98 43,43
65,5 45,69 41,45 44, 05 35,17
89,5 4035 39,22 34, 81 31,87
116,5 42,26 39,77 34, 14 32,42
139,0 45,70 41,83 34, 92 33,31
161,5 48,55 44,96 00 09 35,65
185,5 50,48 47,52 41, 26 38,38
Proporção DHA/FPA
Horas NB5 (13,78 kPa) NB6 (103,42 kPa) NB7 (137,89 kPa) NB8 (137,89 kPa)
17,5 3,85 3,94 4,00 3,43
41,5 4,37 4,36 4,59 2,65
65,5 3,26 2,51 2,87 1,73
89,5 2,16 1,96 1,67 1,38
116,5 1,92 1,86 1,39 1,32
139,0 2,15 1,94 1,35 1,32
161,5 2,43 2,20 1,54 1,43
185,5 2,66 2,52 1,77 1,61
Exemplo 5 [200] Nesse exemplo [Nx0719et10] , uma espécie de Schizochytrium (ATCC PTA-10208), foi cultivado em quatro fermentadores New Brunswick Scientific BioFlo 310 de 14 litros em um volume final-alvo (receita) de 10 litros com
126/208 um processo de batelada alimentada de carbono (glicose) e nitrogênio (hidróxido de amônio). Três dos quatro fermentadores foram suplementados com dióxido de carbono em pontos do tempo diferentes durante a fermentação para avaliar a sensibilidade da cultura ao dióxido de carbono dissolvido aumentado. NBS1, NBS2 e NBS3 foram suplementados com dióxido de carbono começando em log 12, 24 e 48 horas, respectivamente. Cada uma das fermentações foi inoculada com 1 litro de cada cultura. Para propagação do inóculo, um fermentador Virtis de 14 litros foi utilizado. O meio do inóculo consistiu em 10 litros de meio preparados em quatro grupos separados. O Grupo 1 consistia em 90 g de MSG.1H2O, 10 g de KCl, 50 g de MgSO4.7^O, 3,3 g de (NH4)2SO4, 6,25 g de NaCl, 60 g de T154 (extrato de levedura), 4,97 g de KH2PO4, 2,9 g de CaCl2.2H2O e 2 ml de Dow 1520US (antiespuma). O Grupo 1 foi autoclavado a 121 graus por 120 minutos em um volume de aproximadamente 9,8 litros. O Grupo 2 consistia em 500 g de glicose dissolvidos em um volume de 800 ml de água tratada por osmose reversa. O Grupo 3 consistia em 31 mg de MnCl2.4H2O, 31 mg de ZnSO4.7H2O, 0,4 mg de CoCl2.6H2O, 0,4 mg de Na2MoO4.2H2O, 20,7 mg de CuSO4.5H2O, 20,7 mg de NiSO4.6H2O, 103 mg de FeSO4.7H2O e 234,1 mg de ácido cítrico. Cada um dos Grupos 2 e 3 foi autoclavado por 60 minutos. O Grupo 4 consistia em 97,5 mg de tiamina-HCl, 1,6 mg de vitamina B12 e 33,3 mg de sal hemicálcico de ácido pantotênico. O Grupo 4 foi dissolvido em água tratada por osmose reversa e depois esterilizado por filtro. Após o fermentador ter sido resfriado até 22,5 graus Celsius, os Grupos 2, 3, 4 e 5 foram adicionados ao fermentador. Usando hidróxido de sódio e ácido sulfúrico, o
127/208 fermentador teve o pH ajustado até 7 e o oxigênio dissolvido foi aumentado para 100% antes da inoculação. O fermentador de inóculo foi inoculado com 150 ml de uma cultura de fermentação menor (a cultura de fermentação menor foi preparada e cultivada da mesma forma que a cultura de inóculo de 10 litros) e cultivada a 22,5 graus Celsius, pH 7, agitação a 433 rpm e 5 l/min de ar por um período de 44,5 horas, quando então 1 litro de caldo de inóculo foi transferido para cada fermentador de 14 litros. Cada fermentador de 14 litros continha 10 litros de meio de fermentação. O meio de fermentação foi preparado de forma similar ao fermentador de inóculo. Para cada fermentador de 14 litros, o meio de fermentação consistia em 6 grupos de meios em batelada. Para todos os vasos, o Grupo 1 continha 60 g de Na2SO4, 6,25 g de NaCl, 10 g de KCl, 50 g de
MgSO4.7H2O, 0,43 g de (NH4)2SO4, 10 g de extrato de levedura
T154 e 1 ml de antiespuma Dow 1520-US. O Grupo 1 foi autoclavado a 121 graus Celsius por 120 minutos nos fermentadores de 14 litros em um volume de aproximadamente 6,5 litros. O Grupo 2 continha 2,9 g de CaCl2.2H2O em um volume de aproximadamente 20 ml de água tratada por osmose reversa. O Grupo 3 continha 17,61 g de KH2PO4 dissolvidos em 100 ml de água tratada por osmose reversa. O Grupo 4 continha 31 mg de MnCl2.4H2O, 93 mg de ZnSO4.7H2O, 0,4 mg de Na2MoO4.2H2O, 2 0,7 mg de CuSO4.5H2O, 2 0,7 mg de NiSO4.6H2O, 103 mg de FeSO4.7H2O e 10 g de ácido cítrico, todos dissolvidos em 50 ml de água tratada por osmose reversa. O Grupo 5 continha 97,5 mg de tiamina-HCl, 33,3 mg de sal hemicálcico de ácido pantotênico e 36,3 pg de biotina, todos dissolvidos e esterilizados por filtro em 10 ml de
128/208 água tratada por osmose reversa. O Grupo 6 continha 300 g de glicose em aproximadamente 0,5 litro de água tratada por osmose reversa. Os Grupos 2, 3, 4, 5 e 6 foram combinados e adicionados ao fermentador após o fermentador ter alcançado uma temperatura de operação de 22,5 graus Celsius. Cada volume de fermentador antes da inoculação era de aproximadamente 6,5 litros. Cada fermentador foi inoculado com 1 litro de caldo da fermentação de inóculo descrito acima. A fermentação teve o pH controlado por utilização de a 0,85 litro de solução de hidróxido de amônio 4 N em um pH de 7 até exaustão do nitrogênio, quando então hidróxido de sódio 4 N e ácido sulfúrico 3 N foram utilizados para controle do pH em um ponto predeterminado de 7,5. O oxigênio dissolvido foi controlado para manter um alvo de 20% por toda fermentação usando agitação de 357 a 833 rpm e fluxo de ar de 7 l/min a 7 l/min. Cada um dos vasos NBS1, NBS2 e NBS3 foi suplementado com dióxido de carbono por diferentes intervalos de tempo para avaliar a sensibilidade do organismo ao dióxido de carbono dissolvido aumentado. Por toda a fermentação, uma solução de 850 g/l de dextrose 95% (xarope de milho) foi alimentada para manter uma concentração de glicose menor do que 50 g/l. Após 8 dias, a massa de células secas e a titulação de ômega-3 de cada fermentador de 10 litros variaram dependendo das condições
de suplementação de dióxido de carbono. Em 183 horas, NBS1
estava a 109,1 g/l de DCW e 45,87 g/l de ômega-3; NBS2
estava a 108,9 g/l de DCW e 45,41 g/l de ômega-3; NBS3
estava a 116,4 g/l de DCW e 50,6 g/l de ômega-3; NBS4
estava a 95,7 g/l de DCW e 40,36 g/l de ômega-3. Logo após
a suplementação de dióxido de carbono ter sido iniciada, o
129/208 % de DHA/FAME diminuiu, o % de EPA/FAME aumentou e a proporção de DHA para EPA diminuiu. Quando se compara o teor máximo do % de EPA/FAME das condições de dióxido de carbono suplementado e da condição ambiente, há um aumento de 65% no teor máximo de EPA sob condições de CO2 suplementado. Os resultados são apresentados na Tabela 8.
Tabela 8
% de EPA/FAME
Horas NBS1 (+CO2 @ 12 horas) NBS2 (+CO2 @ 24 horas) NBS3 (+CO2 @ 48 horas) NBS4 (sem CO2 adicionado)
15 12,29 10,67 10,22 10,14
39 22,82 10,32 10,37 9,85
63 23,79 24,58 19,77 15,09
87 23,69 23,71 23,83 14,09
114 27,85 27,55 26,91 16,98
137 20,47 27,94 26,76 17,81
159 29,13 27,20 28,52 17,81
183 27,62 25,50 25,62 17,09
Vo DHA / FAME
Horas NBS1 NBS2 NBS3 NBS4
15 43,27 44,69 46,34 45,91
39 33,34 43,14 39,54 38,81
63 32,18 33,65 36,22 47,31
87 26,33 26,65 27,82 45,79
114 23,99 24,36 28,09 44,13
137 25,43 27,47 31,11 46,47
159 28,54 30,59 33,70 48,59
130/208
183 31,83 33,70 35,98 50,98
183 31,83 33,70 35,98 50,98
Proporção de DHA/EPA
Horas NBS1 NBS2 NBS3 NBS4
15 3,52 4,19 4,53 4,53
39 1,46 2,23 3,81 3,94
63 1,35 1,37 1,83 3,14
87 1,11 1,12 1,17 3,25
114 0,86 0,88 1,04 2,60
137 0,86 0,98 1,16 2,61
159 0,98 1,12 1,27 2,73
183 1,15 1,3 1,40 2,98
Dióxido de carbono suplementado durante intervalo de tempo realçado.
Exemplo 6 [201] Nesse exemplo [Nx0106et10] , espécie de Schizochytrium (ATCC PTA-10208), foi cultivado em quatro fermentadores New Brunswick Scientific BioFlo 310 de 14 litros em um volume final-alvo (receita) de 10 litros com um processo de batelada alimentada de carbono (glicose) e nitrogênio (hidróxido de amônio). A temperatura foi controlada por toda a rodada de fermentação para manter um alvo de 21,0°C, 22,5°C, 24,0°C e 25,5°C para NBS1, NBS2, NBS3 e NBS4, respectivamente. Cada uma das fermentações foi inoculada com 1 litro de cada cultura. Para propagação do inóculo, um fermentador Virtis de 14 litros foi utilizado. O meio do inóculo consistiu em 10 litros de meio preparados em quatro grupos separados. O Grupo 1 consistia em 90 g de MSG.1H2O, 10 g de KCl, 50 g de MgSO4.7H2O, 3,7 g de (NH4)2SO4, 6,25 g de NaCl, 60 g de T154 (extrato de
131/208 levedura), 5,2 g de KH2PO4, 2,9 g de CaCl2.2H2O e 2 ml de Dow 1520US (antiespuma) . O Grupo 1 foi autoclavado a 121 graus por 120 minutos em um volume de aproximadamente 9,8 litros. O Grupo 2 consistia em 500 g de glicose dissolvidos em um volume de 800 ml de água tratada por osmose reversa. O Grupo 3 consistia em 31 mg de MnCl2.4H2O, 31 mg de ZnSO4.7H2O, 0,4 mg de CoCl2.6H2O, 0,4 mg de Na2MoO4.2H2O,
20,7 mg de CuSO4.5H2O, 20,7 mg de NiSO4.6H2O, 103 mg de FeSO4.7H2O e 234,1 mg de ácido cítrico. Cada um dos Grupos 2 e 3 foi autoclavado por 60 minutos. O Grupo 4 consistia em 97,5 mg de tiamina-HCl, 1,6 mg de vitamina B12 e 33,3 mg de sal hemicálcico de ácido pantotênico. O Grupo 4 foi dissolvido em água tratada por osmose reversa e depois esterilizado por filtro. Após o fermentador ter sido resfriado até 22,5 graus Celsius, os Grupos 2, 3, 4 e 5 foram adicionados ao fermentador. Usando hidróxido de sódio e ácido sulfúrico, o fermentador teve o pH ajustado até 7 e o oxigênio dissolvido foi aumentado para 100% antes da inoculação. O fermentador de inóculo foi inoculado com 200 ml de uma cultura de fermentação menor (a cultura de fermentação menor foi preparada e cultivada da mesma forma que a cultura de inóculo de 10 litros) e cultivada a 22,5 graus Celsius, pH 7, agitação a 433 rpm e 5 l/min de ar por um período de 42 horas, quando então 1 litro de caldo de inóculo foi transferido para cada fermentador de 14 litros. Cada fermentador de 14 litros continha 10 litros de meio de fermentação. O meio de fermentação foi preparado de forma similar ao fermentador de inóculo. Para cada fermentador de 14 litros, o meio de fermentação consistia em 4 grupos de meios em batelada. Para todos os vasos, o Grupo 1 continha
132/208 g de Na2SO4, 6,25 g de NaCl, 10 g de KCl, 50 g de MgSO4.7H2O, 4,2 g de (NH4)2SO4, 2,9 g de CaCl2.2H2O, 17,65 g de KH2PO4, 10 g de extrato de levedura T154 e 1 ml de antiespuma Dow 1520-US. O Grupo 1 foi autoclavado a 121 graus Celsius por 120 minutos nos fermentadores de 14 litros em um volume de aproximadamente 7,0 litros. O Grupo 2 continha 31 mg de MnCl2.4H2O, 93 mg de ZnSO4.7H2O, 0,4 mg de Na2MoO4.2H2O, 2 0,7 mg de CuSO4.5H2O, 2 0,7 mg de NiSO4.6H2O, 103 mg de FeSO4.7H2O e 468 mg de ácido cítrico dissolvidos em 50 ml de água tratada por osmose reversa. O Grupo 2 foi autoclavado por 60 minutos. O Grupo 3 continha
97.5 mg de tiamina-HCl, 33,3 mg de sal hemicálcico de ácido pantotênico e 35,8 pg de biotina, todos dissolvidos e esterilizados por filtro em 10 ml de água tratada por osmose reversa. O Grupo 4 continha 300 g de glicose em aproximadamente 0,5 litro de água tratada por osmose reversa e autoclavado por 60 minutos. Os Grupos 2, 3 e 4 foram combinados e adicionados ao fermentador após o fermentador ter alcançado uma temperatura de operação de
22.5 graus Celsius. Cada volume de fermentador antes da inoculação era de aproximadamente 6,5 litros. Cada fermentador foi inoculado com 1 litro de caldo da fermentação de inóculo descrito acima. O pH da fermentação foi controlado em 7,0 por toda a fermentação utilizando uma solução de 0,85 litro de hidróxido de amônio 4 N até exaustão do nitrogênio, quando então hidróxido de sódio 4 N e ácido sulfúrico 3 N foram utilizados para controle do pH em um ponto predeterminado.
O oxigênio dissolvido foi controlado para manter um alvo de 20% até exaustão do nitrogênio.
Após exaustão do nitrogênio, o oxigênio
133/208 dissolvido foi controlado para manter um alvo de 10% até o final da fermentação usando agitação de 357 a 714 rpm e 8 l/min de fluxo de ar. Por toda a fermentação, uma solução de 850 g/l de dextrose 95% (xarope de milho) foi alimentada para manter uma concentração de glicose menor do que 50 g/l. Após 8 dias, a massa de células secas ou a titulação de ômega-3 variaram ligeiramente para as diferentes temperaturas avaliadas; no entanto, as temperaturas de fermentação menores resultaram em % maior de EPA/FAME. Em 184 horas, NBS1 estava a 85,2 g/l de DCW e 29,9 g/l de ômega-3; NBS2 estava a 92,0 g/l de DCW e 35,0 g/l de ômega3; NBS3 estava a 86,8 g/l de DCW e 31,7 g/l de ômega-3; NBS4 estava a 84,2 g/l DCW e 29,4 g/l de ômega-3, [202] Para NBS1, o % de EPA/FAME variou de 12,36% a 19,02% desde o início até o final da rodada de fermentação, com um máximo de 21,57%. Para NBS2, o % de EPA/FAME variou de 11,72% a 18,11% desde o início até o final da rodada de fermentação, com um máximo de 20,21%. Para NBS3, o % de EPA/FAME variou de 11,49% a 15,43% desde o início até o final da rodada de fermentação, com um máximo de 18,09%. Para NBS4, o % de EPA/FAME variou de 11,65% a 13,65% desde o início até o final da rodada de fermentação, com um máximo de 15,70%. Quando se compara o % máximo de EPA/FAME, a menor temperatura de fermentação resultou em um aumento de 37% no teor máximo de EPA em relação à maior temperatura de fermentação avaliada. Os resultados são fornecidos na Tabela 9 abaixo.
Tabela 9
% de EPA/FAME
Horas NBS1 (21°C) NBS2 (22,5°C) NBS3 (24°C) NBS4
134/208
(25,5°C)
24 12,36 11,72 11,49 11,65
40 14,17 13,61 12,21 13,04
64 14,48 14,94 14,23 13,62
89 19,52 18,45 17,42 15,70
112 21,57 20,21 18,09 15,69
136 21,05 20,11 17,15 14,82
160 19,90 18,88 16,15 13,98
184 19,02 18,11 15,43 13,65
% de DHA / FAME
Horas NBS1 (21°C) NBS2 (22,5°C) NBS3 (24°C) NBS4 (25,5°C)
24 56,58 55,61 54,62 53,56
40 52,80 51,58 52,17 49,77
64 47,46 45,36 46,41 44,57
89 38,89 39,69 39,46 39,54
112 40,08 40,89 41,72 42,20
136 43,22 43,87 45,23 45,56
160 45,92 46,98 47,80 48,07
184 48,04 48,99 49,38 49,39
Proporção de DHA/EPA
Horas NBS1 (21°C) NBS2 (22,5°C) NBS3 (24°C) NBS4 (25,5°C)
24 4,58 4,75 4,75 4,60
40 3,73 3,79 4,27 3,82
64 3,28 3,04 3,26 3,27
89 1,99 2,15 2,27 2,52
135/208
112 1,86 2,02 2,31 2,69
136 2,05 2,18 2,64 3,07
160 2,31 2,49 2,96 3,44
184 2,53 2,71 3,20 3,62
Exemplo 7 [203] Nesse exemplo [Nx0614et10], espécie de Schizochytrium (ATCC PTA-10208), foi cultivado em dois fermentadores New Brunswick Scientific BioFlo 310 de 14 litros em um volume final-alvo (receita) de 10 litros com um processo de batelada alimentada de carbono (glicose) e nitrogênio (hidróxido de amônio). Um fermentador (NBS15) foi aspergido com ar suplementado com dióxido de carbono 15% desde o início até o final da rodada de fermentação, e o outro fermentador (NBS17) foi aspergido com ar apenas para avaliar a sensibilidade da cultura ao dióxido de carbono dissolvido aumentado. Cada uma das fermentações foi inoculada com 1 litro de cada cultura. Para propagação do inóculo, um fermentador Virtis de 14 litros foi utilizado. O meio do inóculo consistiu em 10 litros de meio preparados em quatro grupos separados. O Grupo 1 consistia em 90 g de MSG.1H2O, 10 g de KCl, 50 g de MgSO4.7H2O, 3,3 g de (NH4)2SO4, 6,25 g de NaCl, 60 g de T154 (extrato de levedura), 4,97 g de KH2PO4, 2,9 g de CaCl2.2H2O e 2 ml de
Dow 1520US (antiespuma). O Grupo 1 foi autoclavado a 121 graus por 120 minutos em um volume de aproximadamente 9,8 litros. O Grupo 2 consistia em 500 g de glicose dissolvidos em um volume de 800 ml de água tratada por osmose reversa. O Grupo 3 consistia em 31 mg de MnCl2.4H2O, 31 mg de ZnSO4.7H2O, 0,4 mg de CoCl2.6H2O, 0,4 mg de Na2MoO4.2H2O,
20,7 mg de CuSO4.5H2O, 20,7 mg de NiSO4.6H2O, 103 mg de
136/208
FeSO4.7H2O e 234,1 mg de ácido cítrico. Cada um dos Grupos 2 e 3 foi autoclavado por 60 minutos. O Grupo 4 consistia em 97,5 mg de tiamina-HCl, 1,6 mg de vitamina B12 e 33,3 mg de sal hemicálcico de ácido pantotênico. O Grupo 4 foi dissolvido em água tratada por osmose reversa e depois esterilizado por filtro. Após o fermentador ter sido resfriado até 22,5 graus Celsius, os Grupos 2, 3, 4 e 5 foram adicionados ao fermentador. Usando hidróxido de sódio e ácido sulfúrico, o fermentador teve o pH ajustado até 7 e o oxigênio dissolvido foi aumentado para 100% antes da inoculação. O fermentador de inóculo foi inoculado com 200 ml de uma cultura de fermentação menor (a cultura de fermentação menor foi preparada e cultivada da mesma forma que a cultura de inóculo de 10 litros) e cultivada a 22,5 graus Celsius, pH 7, agitação a 433 rpm e 5 l/min de ar por um período de 40 horas, quando então 1 litro de caldo de inóculo foi transferido para cada fermentador de 14 litros. Cada fermentador de 14 litros continha 10 litros de meio de fermentação. O meio de fermentação foi preparado de forma similar ao fermentador de inóculo. Para cada fermentador de 14 litros, o meio de fermentação consistia em 6 grupos de meios em batelada. Para todos os vasos, o Grupo 1 continha 88 g de Na2SO4, 6,25 g de NaCl, 10 g de KCl, 50 g de MgSO4.7H2O, 4,2 g de (NH4)2SO4, 10 g de extrato de levedura T154 e 1 ml de antiespuma Dow 1520-US. O Grupo 1 foi autoclavado a 121 graus Celsius por 120 minutos nos fermentadores de 14 litros em um volume de aproximadamente
6,5 litros. O Grupo 2 continha 2,9 g de CaCl2.2H2O em um volume de aproximadamente 20 ml de água tratada por osmose reversa. O Grupo 3 continha 17,65 g de KH2PO4 dissolvidos
137/208 em 100 ml de água tratada por osmose reversa. O Grupo 4 continha 31 mg de MnCl2.4H2O, 93 mg de ZnSO4.7H2O, 0,4 mg de
Na2MoO4.2H2O, 2 0,7 mg de CuSO4.5H2O, 2 0,7 mg de NiSO4.6H2O, 103 mg de FeSO4.7H2O e 468 mg de ácido cítrico dissolvidos em 50 ml de água tratada por osmose reversa. Cada um dos Grupos 2, 3 e 4 foi autoclavado por 60 minutos. O Grupo 5 continha 97,5 mg de tiamina-HCl, 33,3 mg de sal hemicálcico de ácido pantotênico e 36,3 pg de biotina, todos dissolvidos e esterilizados por filtro em 10 ml de água tratada por osmose reversa. O Grupo 6 continha 300 g de glicose em aproximadamente 0,5 litro de água tratada por osmose reversa e autoclavado por 60 minutos. Os Grupos 2, 3, 4, 5 e 6 foram combinados e adicionados ao fermentador após o fermentador ter alcançado uma temperatura de operação de 22,5 graus Celsius. Cada volume de fermentador antes da inoculação era de aproximadamente 6,5 litros. Cada fermentador foi inoculado com I litro de caldo da fermentação de inóculo descrito acima. O pH da fermentação foi controlado em 7,0 por toda a fermentação utilizando uma solução de 0,85 litro de hidróxido de amônio 4 N até exaustão do nitrogênio, quando então hidróxido de sódio 4 N e ácido sulfúrico 3 N foram utilizados para controle do pH em um ponto predeterminado.
O oxigênio dissolvido foi controlado para manter um alvo de 20% até exaustão do nitrogênio.
Após exaustão do nitrogênio, o oxigênio dissolvido foi controlado para manter um alvo de 10% até o final da fermentação usando agitação de 357 a 833 rpm e 8 l/min de fluxo de ar. Por toda a fermentação, uma solução de 850 g/l de dextrose 95% (xarope de milho) foi alimentada para manter uma concentração de glicose menor do que 50
138/208 g/l. Após 8 dias, a massa de células secas e a titulação de ômega-3 de cada fermentador de 10 litros variaram dependendo das condições de suplementação de dióxido de carbono. Em 188 horas, NBS15 estava a 54,5 g/l de DCW e
13,7 g/l de ômega-3; NBS17 estava a 96,1 g/l de DCW e 37,5 g/l de ômega-3, % de EPA/FAME foi maior em NBS15 (condição de CO2 suplementado por toda a rodada) do que NBS17 (em suplementação de CO2) . Para NBS15, o % de EPA/FAME variou de 25,50% a 35,48% desde o início até o final da rodada de fermentação, com um máximo de 38,34%. Para NBS17, o % de EPA/FAME variou de 12,31% a 19,80% desde o início até o final da rodada de fermentação, com um máximo de 22,29%. Quando se compara o teor máximo do % de EPA/FAME das condições de dióxido de carbono suplementado e da condição ambiente, há um aumento de 73% no teor máximo de EPA sob condições de CO2 suplementado.
[204] O % de DHA/FAME foi menor para as condições de CO2 suplementado do que para a condição ambiente por toda a rodada de fermentação. Os resultados são fornecidos na Tabela 10 abaixo.
Tabela 10
% de EPA/FAME
Horas NBS1 (21°C) NBS2 (22,5°C) NBS3 (24°C) NBS4 (25,5°C)
24 12,36 11,72 11,49 11,65
40 14,17 13,61 12,21 13,04
64 14,48 14,94 14,23 13,62
89 19,52 18,45 17,42 15,70
112 21,57 20,21 18,09 15,69
136 21,05 20,11 17,15 14,82
160 19,90 18,88 16,15 13,98
139/208
184 19,02 18,11 15,43 13,65
% de DHA / FAME
Horas NBS1 (21°C) NBS2 (22,5°C) NBS3 (24°C) NBS4 (25,5°C)
24 56,58 55,61 54,62 53,56
40 52,80 51,58 52,17 49,77
64 47,46 45,36 46,41 44,57
89 38,89 39,69 39,46 39,54
112 40,08 40,89 41,72 42,20
136 43,22 43,87 45,23 45,56
160 45,92 46,98 47,80 48,07
184 48,04 48,99 49,38 49,39
Proporção de DHA/EPA
Horas NBS1 (21°C) NBS2 (22,5°C) NBS3 (24°C) NBS4 (25,5°C)
24 4,58 4,75 4,75 4,60
40 3,73 3,79 4,27 3,82
64 3,28 3,04 3,26 3,27
89 1,99 2,15 2,27 2,52
112 1,86 2,02 2,31 2,69
136 2,05 2,18 2,64 3,07
160 2,31 2,49 2,96 3,44
184 2,53 2,71 3,20 3,62
Exemplo 8 [205] Nesse exemplo [K019] , espécie de Schizochytrium (ATCC PTA-10208), foi cultivado em um fermentador agitado de 157.000 litros em um peso final-alvo (receita) de 100.000 kg com um processo de batelada alimentada de carbono (glicose) e nitrogênio (gás amônia anidro). A
140/208 fermentação foi inoculada com 4.500 kg de cultura.
Para propagação do inóculo, um fermentador de semeadura agitado de 7.500 litros foi utilizado
O meio do inóculo consistiu em 4.500 kg de meio preparado em quatro grupos separados. O Grupo 1 consistia em 40,5 kg de MSG.1H2O, 4,5 kg de KCl,
22,5 kg de MgSO4.7H2O, 1,7 kg de (NH4ESO4, 2,81 kg de NaCl, 27 kg de T154 (extrato de levedura) , 2 kg de KH2PO4, 985 g de CaCl2 e 0,9 kg de Dow 1520US (antiespuma) dissolvidos em água processada com um peso total de 2.300 kg. O Grupo 2 consistia em 247,5 kg de glicose.1H2O dissolvidos em água processada com um peso total de 1.500 kg. O Grupo 1 foi esterilizado no fermentador de semeadura, e o Grupo 2 foi esterilizado em um vaso separado, com steam-in-place a 122123 graus Celsius por 30 minutos. O Grupo 3 consistia em 14 g de MnCl2.4H2O, 14 g de ZnSO4.7H2O, 180 mg de CoCl2.6H2O,
180 mg de Na2MoO4.2H2O, 9,3 g de CuSO4.5H2O, 9,3 g de NiSO4.6H2O, 46,4 g de FeSO4.7H2O e 105,3 g de ácido cítrico dissolvidos em 5 litros de água destilada. O Grupo 3 foi autoclavado a 121 graus Celsius por 60 minutos. O Grupo 4 consistia em 43,9 g Tiamina-HCl, 720 mg de vitamina B12 e 15 g de sais hemicálcicos de ácido pantotênico dissolvidos em 5 litros de água destilada e depois esterilizado por filtro. Após o fermentador de semeadura ter sido resfriado até 22,5 graus Celsius, os
Grupos 2, 3, 4 foram adicionados ao fermentador. Usando hidróxido de sódio e ácido sulfúrico, o fermentador teve o pH ajustado até 7 e oxigênio dissolvido foi aumentado para 100% antes da inoculação. O fermentador de semeadura foi inoculado com litros de uma cultura de fermentação menor (a cultura de fermentação menor foi preparada e cultivada da mesma forma
141/208 que a cultura de semeadura) e cultivada a 22,5 graus Celsius, pH 7, agitação a 90 rpm, e 130-170 Nm3/h de ar por um período de 4-5 dias para obter uma massa de células
secas de cerca de 15 g/l. O meio de fermentação foi
preparado de forma similar ao fermentador de inóculo. O
meio de fermentação consistia em 5 grupos. O Grupo 1
continha 177 kg de KH2PO4, 880 kg de Na2SO4, 500 kg de
MgSO4.7H2O , 42 kg de (NH4) 2SO4 , 100 kg de extrato de
levedura T154 e 10 kg de antiespuma Dow 1520-US em uma solução de 9.000 kg. O Grupo 2 continha 21,9 kg de CaCl2,
62,5 kg de NaCl, 100 kg de KCl, em uma solução de 9.000 kg. Os Grupos 1 e 2 foram bombeados através de um trocador de calor para dentro fermentador, seguido por água para obter 67.000 kg de peso no fermentador. O Grupo 3 continha 310 g de MnCl2.4H2O, 930 g de ZnSO4.7H2O, 4 g de Na2MoO4.2H2O, 207 g de CuSO4.5H2O, 207 g de NiSO4.6H2O, 1,03 kg de FeSO4.7H2O e 4,68 kg de ácido cítrico dissolvidos em 1.500 kg de água processada. O Grupo 4 continha 4.300 kg de xarope de milho (DE-95, 70,5%). O Grupo 3 e o Grupo 4 foram esterilizados em vasos diferentes, com steam-in-place a 122-123 graus Celsius por 30 minutos. O Grupo 5 continha 975 g de tiamina-HCl, 333 g de sal hemicálcico de ácido pantotênico, e 358 mg de biotina, dissolvidos e esterilizados por filtro em 5 litros de água destilada. Os Grupos 3, 4 e 5 foram adicionados ao fermentador após o fermentador ter sido resfriado até 22,5 graus Celsius. O peso no volume de fermentador antes da inoculação foi de aproximadamente 73.500 kg. Após o início, a condição de fermentação foi ajustada (temperatura: 22,5°C, pressão: 0,34 bar, fluxo de ar: 3.000 Nm3/h, agitação, 40 rpm), o pH da fermentação foi
142/208 ajustado até 7 e o oxigênio dissolvido foi aumentado para 100%. O peso após inoculação era de cerca de 78.000 kg. No começo, o pH foi controlado em 7 utilizando amônia anidra até que 550 kg de amônia fossem adicionados, e depois solução a 30% de hidróxido de sódio foi utilizada para controle do pH em um ponto predeterminado de 7,5. O oxigênio dissolvido foi controlado para manter um alvo de 20% durante a alimentação de amônia e 10% posteriormente usando agitação de 40 a 100 rpm e fluxo de ar de 2.000 a 8000 Nm3/h. Por toda a fermentação, uma solução a 65% de xarope de milho DE-95 foi alimentada para manter uma concentração de glicose em torno de g/l. Em outro exemplo [K020], foram feitas três alterações em relação ao Exemplo K019: 1) a pressão foi reduzida para 0,15 bar, 2) o peso após inoculação foi reduzido para 68.000 kg, 3) o fluxo de ar foi aumentado para mais de 5.000 Nm3/h em 60 horas após inoculação e foi mantido elevado por toda a rodada, independentemente da concentração de oxigênio dissolvido. As três alterações acima reduziram a concentração de dióxido de carbono dissolvido no caldo. Os resultados mostraram que com o CO2 reduzido, o % de DHA/FAME foi aumentado de 38,38% para 43,8%, e o % de EPA/FAME foi reduzido de 24,42% para 20,68%. A proporção de DHA/EPA foi aumentada de 1,57 para 2,12. Os resultados são apresentados na Tabela 11 abaixo.
Tabela 11
K019
Horas % de DHA/FAME % de EPA/FAME Proporção de DHA/EPA
38 56,32 11,47 4,91
143/208
50 51,03 13,2 3,87
62 43,99 16,97 2,59
74 34,65 19,94 1,74
86 32,14 22,56 1,42
98 30,05 25,2 1,19
134 31,45 28,36 1,11
146 33,54 27,43 1,22
158 35,48 26,29 1,35
170 37,16 25,47 1,46
182 38,38 24,42 1,57
Tabela 12
K020 (CO2 dissolvido reduzido)
Horas % de DHA/FAME % de EPA/FAME Proporção de DHA/EPA
12 56,3 13,03 4,32
28 58,12 12 4,84
40 55,55 12,13 4,58
52 52,13 14,03 3,72
64 45,14 16,94 2,66
76 37,54 18,57 2,02
84 35,06 18,72 1,87
96 35,24 20,05 1,76
132 39,42 22,29 1,77
156 42,05 21,54 1,95
180 43,8 20,68 2,12
Exemplo 9 [206] Na tabela abaixo, o CO2 dissolvido máximo é calculado para vários dos exemplos usando constante de Henry. A primeira condição, 10 L (NBS4 0719et10) em
144/208 pressão de retorno de 0 kPa e 45,5 mmol/l/hora de CER” é o CO2 dissolvido calculado para NBS4 na Tabela 8 em uma taxa de evolução de dióxido de carbono de 45,5 mmol/l/hora, um volume de fermentação de 10 litros, uma taxa de aeração de 0,8 vvm e pressão de retorno de 0 kPa. A segunda condição, 10 L (NBS2 0719et10) em pressão de retorno de 0 kPa com 6% de CO2 no gás de entrada e 50 mmol/l/hora de CER” é o CO2 dissolvido calculado para NBS2 na Tabela 8 em uma taxa de evolução de dióxido de carbono de 50 mmol/l/hora, um volume de fermentação de 10 litros, uma taxa de aeração de 0,8 vvm, em pressão de retorno de 0 kPa, e com CO2 suplementado na corrente de entrada a 6% do gás total, como medido por espectrometria de massa usando um espectrômetro de massa Thermo Prima dB. A terceira condição, 80 litros (NB5 0614et10) em pressão de retorno de 13,78 kPa e 55 mmol/l/hora de CER” é o CO2 dissolvido calculado para NB5 na Tabela 7 em uma taxa de evolução de dióxido de carbono de 55 mmol/l/hora, um volume de fermentação de 80 litros, uma taxa de aeração de 1,0 vvm e pressão de retorno de 13,78 kPa. A quarta condição, 80 litros (NB6 0614et10) em pressão de retorno de 103,42 kPa e 50 mmol/l/hora de CER” é o CO2 dissolvido calculado para NB6 na Tabela 7 em uma taxa de evolução de dióxido de carbono de 50 mmol/l/hora, um volume de fermentação de 80 litros, uma taxa de aeração de 1,0 vvm e pressão de retorno de 103,42 kPa. A quinta condição, 80 litros (NB7 & NB8 0614et10) em pressão de retorno de 137,89 kPa e 50 mmol/l/hora de CER” é o CO2 dissolvido calculado para NB7 e NB8 na Tabela 7 em uma taxa de evolução de dióxido de carbono de 50 mmol/l/hora, um volume de fermentação de 80 litros, uma taxa de aeração de
145/208
1,0 vvm e pressão de retorno de 137,89 kPa. Todos os valores de CER foram calculados usando dados de CO2 offgas coletados com um espectrômetro de massa Thermo Prima dB. Os resultados dos cálculos são fornecidos nas Tabelas 13 e 14 abaixo.
Tabela 13
10 L (NBS4 0719et10) em RV 10 litros
pressão de retorno de 0
kPa e 45,5 mmol/l/hora de
CER
Pressão absoluta Entrada 1,01 bar
Fluxo de ar Entrada 8 l/min
Vvm 0,8
CO2 necessário na entrada Saída 0,14%
de ar
Delta CO2 no offgas 2,309125%
CO2 no offgas 2,446301%
Pressão parcial de CO2 0,024708 bar
CO2 dissolvido 0,000785 mol/l
CO2 dissolvido 34,53 ppm
10 L (NBS2 0719et10) em RV 10 litros
pressão de retorno de 0
kPa com 6% de CO2 no gás
de entrada e 50
mmol/l/hora de CER
Pressão absoluta Entrada 1,01 bar
Fluxo de ar Entrada 8 l/min
Vvm 0,8
CO2 necessário na entrada Saída 7,00%
de ar
146/208
Delta CO2 no offgas 2,5375%
CO2 no offgas 9,534653%
Pressão parcial de CO2 0,0963 bar
CO2 dissolvido 0,003059 mol/l
CO2 dissolvido 134,58 ppm
80 litros (NB5 0614et10) RV 80 litros
em pressão de retorno de
13,78 kPa e 55
mmol/l/hora de CER
Pressão de retorno Entrada 0,138 bar
Pressão total 1,21 bar
Fluxo de ar Entrada 80 l/min
Vvm 1
Delta CO2 De CPR 2,233%
CO2 na saída 2,233%
Pressão parcial de CO2 0,026975 bar
CO2 dissolvido 0,000857 mol/l
CO2 dissolvido 37,70 ppm
80 litros (NB6 0614et10) RV 80 litros
em pressão de retorno de
103,42 kPa e 50
mmol/l/hora de CER
Pressão de retorno Entrada 1,0345 bar
Pressão total 2,10 bar
Fluxo de ar Entrada 80 l/min
Vvm 1
Delta CO2 De CPR 2,03%
CO2 na saída 2,03%
Pressão parcial de CO2 0,042721 bar
CO2 dissolvido 0,001357 mol/l
147/208
CO2 dissolvido 59,71 ppm
80 litros (NB7 & NB8 RV 80 litros
0614et10) em pressão de
retorno de 137,89 kPa e
50 mmol/l/hora de CER
Pressão de retorno Entrada 1,38 bar
Pressão total 2,45 bar
Fluxo de ar Entrada 80 l/min
Vvm 1
Delta CO2 De CPR 2,03%
CO2 na saída 2,03%
Pressão parcial de CO2 0,049735 bar
CO2 dissolvido 0,00158 mol/l
CO2 dissolvido 69,51 ppm
148/208
Tabela 14
NB5 (13,78 kPa) NB6 (103,42 kPa) NB7 (137,89 kPa) NB8 (137,89 kPa) NBS2 (+CO2 @ 24 horas) NBS4 (sem CO2 adicionado)
% de EPA/FAME 21,99 21,57 25,85 25,25 27,94 17,81
% de DHA/FAME 40,35 39,22 34,14 32,42 24,36 38,81
CO2 dissolvido máximo 37,70 59,71 69,51 69,51 134,58 34,53
149/208
Exemplo 10 [207] Foram feitos experimentos para determinar o efeito de gradientes de vitamina sobre o desempenho (massa de células secas de biomassa (DW), % de DHA, % de gordura e % de EPA) usando N° de Acesso na ATCC PTA-96 95 em Meio de Frasco Agitado de Thraustochytrium (TSFM) sob nível de CO2 ambiente.
[208] Materiais e métodos: Quatro vitaminas (Tiamina.HCl, B12, biotina e Ca-pantotenato) foram usadas em meio TSFM com 0,25 g/l de tastona e 0,625 g/l de NaCl (veja a Tabela 16). Mais MSG e KH2PO4 foram adicionados ao meio para manter seu teor total de nitrogênio e fósforo. As concentrações globais de vitamina no meio foram, 0, 0,5x, 1x, 5x, 10x, 20x ou 30x a quantidade-padrão, dependendo das vitaminas estudadas (veja a Tabela 17). O estudo de gradiente foi realizado em cada vitamina separadamente. No entanto, no caso de biotina e Ca-pantotenato, quantidadespadrão de Tiamina.HCl e B12 também foram incorporadas no meio, na medida em que as concentrações das últimas duas eram muito baixas no TSFM regular. Três controles de TSFM também foram incluídos no experimento para comparação. Esses controles eram TSFM-padrão com 2 g/l de tastona (veja a Tabela 15) e 1x Tiamina.HCl e 1x B 12 (CI); TSFM livre de tastona sem nenhuma vitaminas (A); e TSFM livre de tastona com 1x Tiamina.HCl e 1x B12 (B). Todos os controles continham 0,625 g/l de NaCl. Uma cultura com 3 dias de idade de PTA-9695 foi usada para inocular frascos agitados de 250 ml em duplicata a 0,1 g de DW/l. Todos os frascos (de fundo achatado, com total de 50 ml de meio) foram incubados aerobicamente a 22,5 +/- 1°C em uma agitadora
150/208 rotatória (200 RPM). Todas as culturas foram colhidas após 7 dias, e a análise FAME foi realizada nas amostras de biomassa secas por congelamento finais.
Tabela 15
Meio de Frasco Agitado de Thraustochytrium (TSFM) com 2 g/l de tastona.
Componente Quantidade por litro (g) [Estoque] (g/l) ml de estoque para usar por litro
NaCl 0,625 Seco
KCl 1 50 2 0 ml
MgSO4.7H2O 5 227 22 ml
(NH4)2SO4 0,2 190 1,05 ml
CaCl2.2H2O 0,29 Seco
Monoidrato de MSG 2 Seco
Tastona 154 2 Seco
HEPES (100 mM) pH 7 23,8 Seco
KH2PO4 0,1 56,5 1,77 ml Adicionar após autoclavagem
Glicose 50 500 100 ml Adicionar após autoclavagem
Metaistraço Vej a abaixo 1 ml Adicionar após autoclavagem
151/208
Vitaminas Vej a abaixo 1 ml Adicionar após autoclavagem
Solução de metaltraço
FeCla.6H2O 2,9 mg 2,9
CUSO4.5H2O 0,02 mg 0,02
MnCl2.4H2O 8,6 mg 8,6
CoCl2.6H2O 0,26 mg 0,26
ZnCl2 0,6 mg 0,6
Ácido cítrico 12 mg 12 g (seco)
Solução de vitamina
Tiamina 10 Pg 10 mg/l
Vitamina B12 1 Pg 1 mg/l
Tabela 16
Meio de Frasco Agitado de Thraustochytrium (TSFM) com 0,25 g/l de tastona.
Componente Quantidade por litro (g) [Estoque] (g/l) ml de estoque para usar por litro
NaCl 0,625 Seco
KCl 1 50 2 0 ml
MgSO4.7H2O 5 227 22 ml
(NH4)2SO4 0,2 190 1,05 ml
152/208
CaCl2.2H2O 0,29 Seco
Monoidrato de MSG 4,554 Seco
Tastona GC 7189-1 0,25 Seco
HEPES (100 mM) pH 7 23,8 Seco
KH2PO4 0,1 56,5 4,28 ml Adicionar após autoclavagem
Glicose 50 500 100 ml Adicionar após autoclavagem
Metais- traço Vej a abaixo 1 ml Adicionar após autoclavagem
Vitaminas Veja abaixo 1 ml Adicionar após autoclavagem
Metaltraço-TSFM
FeCl3.6H2O 2,9 mg 2,9
CUSO4.5H2O 0,02 mg 0,02
MnCl2.4H2O 8,6 mg 8,6
CoCl2.6H2O 0,26 mg 0,26
ZnCl2 0,6 mg 0,6
Ácido cítrico 12 mg 12 g (seco)
Solução de
153/208
vitamina
Tiamina 10 pg 10 mg/l
Vitamina B12 1 pg 1 mg/l
Tabela 17
Concentrações de vitamina usadas nesse estudo (mg/l):
Conc. de vitamina [X] Tiamina.HCl B12 Biotina Ca- Pantotenato
0 0,0 0,0 0,0 0,0
0,5 0,005 0,00234
1 0,010 0,001 0,00468 3,33
5 0,050 0,005 16,65
10 0,100 0,010 0,0468 33,30
20 0,200 0,020 0,0936 66,60
30 0,1404
[209] Resultados: Os maiores DW e % de gordura (6,7 g/l e 38,5%, respectivamente) para o gradiente de tiamina foram obtidos quando a quantidade adicionada dessa vitamina ao meio foi 5 vezes o nível-padrão (Figura 1). O % de DHA nesse nível de tiamina foi de 44,1%. Abaixo e acima de 5x tiamina, tanto DW quanto o % de gordura começaram a declinar. O % de DHA também declinou no meio com menos do que 5x tiamina, e ligeiramente flutuou acima de 5x tiamina, sem aumento significante. O % de EPA na culturas de gradiente de tiamina variou entre 8,6 e 11,5. Quando não foi adicionada tastona ou vitaminas ao meio (Figura 5, meio A), tudo, exceto o % de DHA, declinou significativamente. O aumento no % de DHA, no entanto, pareceu ser artificial, na medida em que tanto a DW quanto o % de gordura estavam
154/208 extremamente baixos para essa condição. A concentração de 1x de B12 pareceu ser ótima para DW, % de DHA, % de gordura e % de EPA (Figura 2) . Nesse nível de vitamina B12, foram obtidos os seguintes: 7,1 g/l de DW, 50,6% de DHA, 42,7% de gordura e 2,1% de EPA. O maior % de EPA (11,5) foi obtido quando não foi adicionada nenhuma B12 ao meio. Meio livre de tastona sem vitaminas adicionadas não aumentou mais o desempenho do organismo, e o % maior de DHA pareceu ser artificial, como descrito previamente (Figura 5, meio A).
[210] Similarmente, a concentração de 1x de biotina foi ótima para DW, % de DHA e % de gordura (Figura 3). Os valores correspondentes para esses parâmetros foram: 6,8 g/l, 47,7% e 37,9%, respectivamente. O percentual de EPA nesse ponto foi de 1,9. Meio livre de tastona com 1x tiamina e 1x B12 (Figura 5, meio B) comprometeu significativamente o desempenho global de PTA-9695.
[211] Ca-pantotenato produziu os maiores DW, % de DHA e % de gordura quando essa vitamina foi adicionada ao meio a 10x a quantidade-padrão (Figura 4). As concentrações ótimas desses parâmetros foram: 7,0 g/l, 47,3% e 39,1%, respectivamente. O teor de EPA em todo o experimento de gradiente de Ca-pantotenato foi menor do que 2%. Uma redução significante no desempenho global de PTA-9695 foi observada quando o organismo foi desenvolvido em meio livre de tastona com apenas 1x tiamina e 1x B12 (Figura 5, meio B).
|212] Os resultados também são mostrados nas tabelas de dados abaixo.
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162/208
Exemplo 11 [213] Foram feitos experimentos para determinar a necessidade mínima de N° de Acesso na ATCC PTA-9695 para vitamina B12 para obter desempenho máximo a CO2 10%, incluindo a quantidade mínima de vitamina B12 que é necessária para cultura de PTA-9695 para produzir peso seco e rendimento de DHA máximos sob condições de CO2 10%.
[214] Temperatura: 22,5 +/- 1°C (@ CO2 10%) [215] Velocidade da agitadora: 200 rpm [216] Meio de base: Meio de Fermentador Definido Reduzido Proporcionalmente (DSDFM-B) (Tabela 20).
[217] Inóculo: cultura de 3 dias de idade de PTA-9695 desenvolvida em DSDFM-B com diferentes concentrações de vitamina B12.
[218] Um novo criofrasco de PTA-9695 foi inicialmente descongelado em SDFM-B (Tabela 19), e foi subseqüentemente desenvolvido e transferido várias vezes em SDFM-B Definido sob CO2 10%. Uma cultura de 3 dias de idade de PTA-9695 em DSDFM-B foi usada (a 4%) para preparar os frascos de inóculo iniciais contendo DSDFM-B com várias concentrações de vitamina B12 (ou seja, de 7,68 mg/l a zero mg/l de B12 para os tratamentos A a I, conseqüentemente; veja a Tabela 18). Os frascos de inóculo para cada concentração de vitamina B12 foram mantidos sob CO2 10% e por transferência das culturas em seus respectivos meios frescos a cada 7 dias. A transferência semanal das culturas era essencial para a retirada por lavagem de qualquer vitamina B12 em excesso que possa ter sido armazenada dentro das células, de tal forma que a necessidade mínima para essa vitamina pudesse ser determinada com mais precisão. Frascos em
163/208 duplicata agitados foram inoculados com seus respectivos
inóculos de 3 dias de idade em um DW teorético de 0,1 g/l,
usando a densidade óptica a 600 nm. As culturas foram
desenvolvidas sob CO2 10% por 9 dias, antes de serem
colhidas e posteriormente analisadas por ensaio FAME .
[219] Resultados:
[220] Observação: Os pontos de dados para a semana 3
estão sendo desconsiderados nesse estudo, uma vez que o
suprimento de CO2 para a incubadora foi interrompido, e os frascos tiveram quer ser removidos da incubadora por 6 horas durante renovação do laboratório.
[221] A exposição prolongada (até 4 semanas) de PTA9695 a concentrações elevadas de vitamina B12 (mais do que 3,84 mg/l) pode afetar adversamente o peso seco, o % de gordura e o rendimento de DHA, enquanto uma concentração de entre 1,5 a 768 pg/l de vitamina B12 não possui efeito significante sobre o DW, % de gordura, % de EPA, e rendimento de DHA de PTA-9695.
[222] Um aumento no número de células únicas (até 15, em oposição a 3-4) foi observado em culturas que foram desenvolvidas na presença de 7,68 mg/l de vitamina B12 (tratamento A).
[223] A eliminação da vitamina B12 da receita do meio aumenta significativamente o % de EPA por cerca de 10%, enquanto diminui ligeiramente tanto o % de DHA quanto o % de 16:0. As Figuras 6-19 e a Tabela 21 abaixo mostram os resultados dos experimentos.
[224] Conclusão:
[225] Um mínimo de cerca de 1,5 pg/l vitamina B12 (1/500° da concentração-padrão em SDF-B) é essencial para
164/208 obtenção de DW, % de DHA, % de gordura e rendimento de DHA máximos. Enquanto concentrações muito elevadas de vitamina B12 (mais do que 3,84 mg/l) possam reduzir substancialmente o DW, o % de gordura e o rendimento de DHA, uma privação completa de PTA-9695 dessa vitamina pode aumentar significativamente (aproximadamente 10%) seu % de EPA. Níveis muito elevados de vitamina B12 também podem ter um papel na promoção da transformação da cultura agrupada em células únicas.
165/208
Tabela 18. Tratamentos de vitamina B12.
Tratamentos A B C D E F G H I J
Vit. B12 (pg/l) 7680 3840 768 384 153,6 76,8 15,36 7,68 1,536 0
Tabela 19. Meio de Fermentador Definido Reduzido Proporcionalmente para PTA-9695 (SDFM-B), pH 7 ml.
Componente MW [Estoque] (g/l) ml de estoque em frasco agitado de 1 litro Gramas de ingrediente seco em frasco agitado de 1 litro Concentração final (g/l)
NaCl 58,44 0,625 0,625
KCl 74,56 56 17,9 1,0
MgSO4.7H2O 246,5 227 22 5,0
(NH4)2SO4 132,14 190 0,525 0,1
CaCl2.2H2O 147 60 4,833 0,290
MSG (W/ 1 mole H2O) 187,1 1,0 1,0
Na2SO4 142,04 6,0 6,0
K2SO4 174,27 1,0959 1,0959
Tastona (GC9156-1) 1,0 1,0
HEPES (100 mM) pH 7,0 195,2 23,8 23,8
166/208
kh2po4 136,07 56,5 0,885 0,05
Glicose 180 500 100, 50
Mistura de metal- traço
FeSO4.7H2O 278,02 1,03 10 0,0103
MnCl2.4H2O 198 3,1 1 0,0031
ZnSO4.7H2O 287,4 9,3 1 0,0093
Na2MoO4.2H2O 241,95 0,04 1 0,00004
CUSO4.5H2O 249,5 2,07 1 0,00207
NiSO4.6H2O 262,84 2,07 1 0,00207
Ácido cítrico (em FeSO4.7H2O) 117,5 1,175
Solução de vitamina
Vitamina B12 1355,4 0,768 1 0,000768
Tiamina.HCl 337,3 11,7 1 0,0117
Ca-Pantotenato 476,54 3,996 1 0,003996
167/208
Biotina 244,3 0,002 2,17 0,00000434
Tabela 20. SDFM-B Definido (DSDFM-B), pH 7.
Componente MW [Estoque] (g/l) ml de estoque em frasco agitado de 1 litro Gramas de ingrediente seco em frasco agitado de 1 litro Concentração final (g/l)
NaCl 58,44 0,625 0,625
KCl 74,56 56 17,9 1,0
MgSO4.7H2O 246,5 227 22 5,0
(NH4)2SO4 132,14 190 1,1483 0,218
CaCl2.2H2O 147 60 4,833 0,290
MSG (p/ 1 mol de H2O) 187,1 2,188 2,188
Na2SO4 142,04 6,0 6,0
K2SO4 174,27 1,1240 1,1240
Tastona (GC9156-1) 0,0 0,0
HEPES (100 mM) pH 7,0 195,2 23,8 23,8
KH2PO4 136,07 56,5 2,475 0,140
Glicose 180 500 100 50
168/208
Mistura de metal-traço
FeSO4.7H2O 278,02 1,03 10 0,0103
MnCl2.4H2O 198 3,1 1 0,0031
ZnSO4.7H2O 287,4 9,3 1 0,0093
Na2MoO4.2H2O 241,95 0,04 1 0,00004
CUSO4.5H2O 249,5 2,07 1 0,00207
NiSO4.6H2O 262,84 2,07 1 0,00207
Ácido cítrico (em FeSO4.7H2O) 117,5 1,175
Solução de vitamina
Vitamina B12 1355,4 0,768 1 0,000768
Tiamina. HCl 337,3 11,7 1 0,0117
Ca-Pantotenato 476,54 3,996 1 0,003996
Biotina 244,3 0,002 2,65 0,0000053
Tabela 21. Dados de experimentos.
Série de frascos
agitados (SF) 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1
169/208
Tratamento ID A B C D E F G H I J
Conc. de vit. B12 (mg/l) 7680 3840 768 384 153,6 76,8 15,36 7,68 1,536 0
Conc. de vit. B12 (Log 10-mg/l) 3,885361 3,584331 2,885361 2,584331 2,186391 1,885361 1,186391 0,885361 0,186391 0,001
DW (g/l)
Frasco 1 2,832 3,48 3,64 4,186 3,728 3,952 3,71 3,96 4,5 3,868
Frasco 2 3,03 3,324 3,88 3,412 3,626 3,746 4,024 3,682 4,17 4,094
Média 2,931 3,402 3,76 3,799 3,677 3,849 3,867 3,821 4,335 3,981
% de gordura (por % da área)
Frasco 1 56,9 55,5 58,9 , 63,9 61,6 60,5 60,4 64,7 66,6 60,4
Frasco 2 52,4 56,7 61,6 59, 8 58,7 60,7 64,1 57,9 66,3 62,9
Média 54,6 56,1 60,3 61, 9 60,1 60,6 62,2 61,3 66,5 61,7
% de DHA
Frasco 1 45,4 45,8 46,6 48,2 45,3 46,4 47,9 47,4 48,9 46,4
170/208
Frasco 2 45,7 44,0 47,1 46,4 46,3 46,0 48,8 46,6 48,0 46,5
Média 45,5 44,9 46,9 47,3 45,8 46,2 48,4 47,0 48,4 46,5
DHA (mg/g)
Frasco 1 260,1 256,6 277,2 310,6 281,1, 283,0 291,7 309,4 328,2 283,0
Frasco 2 241,4 251, 1 292,7 279,8 274,2 281,7 315,4 271, 9 320,9 294,9
Média 250,8 253,9 285,0 295,2 277,7 282,3 303,5 290,6 324,6 289, 0
% de gordura (por mg/l)
Frasco 1 57,3 56,0 59,4 64,4 62,1 61,0 60,9 65,2 67,1 60,9
Frasco 2 52,8 57,1 62,1 60,3 59,2 61,2 64,6 58,4 66,9 63,4
Média 55,1 56,5 60,8 62,4 60,6 61,1 62,7 61,8 67,0 62,2
Fat(g/l)
Frasco 1 1,6 1,9 2,2 2,7 2,3 2,4 2,3 2,6 3,0 2,4
Frasco 2 1,6 1,9 2,4 2,1 2,1 2,3 2,6 2,1 2,8 2,6
171/208
Média 1,6 1,9 2,3 2,4 2,2 2,4 2,4 2,4 2,9 2,5
Rendimento de DHA (g/l)
Frasco 1 0,7 0,9 1,0 1,3 1, 0 1,1 1,1 1,2 1,5 1,1
Frasco 2 0,7 0,8 1,1 1, 0 1, 0 1,1 1,3 1,0 1,3 1,2
Média 0,7 0,9 1,1 1, 1 1, 0 1,1 1,2 1,1 1,4 1,2
% de EPA
Frasco 1 19,2 20,1 18,7 16,7 20,4 19,0 16,1 17,5 15,5 19,3
Frasco 2 18,6 21,6 18,2 18,3 19, 0 19,5 15,2 18,9 16,7 19,2
Média 18,9 20,8 18,5 17,5 19,7 19,2 15,6 18,2 16,1 19,3
EPA (mg/g)
Frasco 1 108,2 110,3 109,2 105,8 124,7 113,6 96,1 112,2 102,5, 115,5
Frasco 2 96,3 121,4 111, 1 108,4 110,6 117,3 96,3 108,1 110,0 120,0
Média 102,3 115,8 110,2 107,1 117,7 115,5 96,2 110,1 106,3 117,7
172/208
Rendimento de EPA (g/l)
Frasco 1 0,3 0,4 0,4 0,5 0,5 0,5 0,4 0,5 0,5 0,5
Frasco 2 0,3 0,4 0,4 0,4 0,4 0,4 0,4 0,4 0,5 0,5
Média 0,3 0,4 0,4 0,4 0,4 0,5 0,4 0,4 0,5 0,5
L-F DW (g/l)
Frasco 1 1,2 1,5 1,5 1,5 1,4 1,5 1,5 1,4 1,5 1,5
Frasco 2 1,4 1,4 1,5 1,4 1,5 1,5 1,4 1,5 1,4 1,5
Média ,1,3 1,5 1,5 1,4 1,4 1,5 1,4 1,5 1,4 1,5
% de 16:0
Frasco 1 24,0 22,8 23,1 23,6 22,6 23,0 24,4 23,4 23,9 22,5
Frasco 2 24,2 22,7 23,1 23,8 23,1 22,8 24,5 23,0 23,6 22,5
Média 24,1 22,7 23,1 23,7 22,9 22,9 24,4 23,2 23,7 22,5
% de DPA n-3
173/208
Frasco 1 1, 1 1,0 1,2 1, 0 1,2 1,1 1,1 1,1 1, 0 1,1
Frasco 2 1, 1 1,1 1,1 1,2 1, 1 1,2 1,1 1,1 1, 0 1,1
Média 1, 1 1,1 1,1 1, 1 1,2 1,2 1,1 1,1 1, 0 1,1
% de DPA n-6
Frasco a 2,1 2,1 2,3 2,5 2,1 2,2 2,4 2,4 2,6 2,2
Frasco 2 2,2 2,0 2,3 2,2 2,2 2,2 2,5 2,2 2,5 2,2
Média 2,1 2,0 2,3 2,3 2,2 2,2 2,5 2,3 2,5 2,2
% Total de ômega-3
Frasco 1 65,7 66,9 66,5 66,0 66,9 66,5 65,1 66,0 65,4 66,9
Frasco 2 65,4 66,7 66,5 65,9 66,5 66,7 65,1 66,5 65,8 66,9
Média 65,6 66,8' 66,5 65,9 66,7 66,6 65,1 66,3 65,6 66,9
PH
Frasco 1 6,81 6,83 6,84 6,83 6,82 6,82 6,83 6,83 6,82 6,81
Frasco 2 6,81 6,83 6,81 6,82 6,83 6,82 6,82 6,82 6,82 6,81
Média 6,81 6,83 6,83 6,83 6,83 6,82 6,83 6,83 6,82 6,81
174/208
Tabela 21 (CONTINUAÇÃO)
Série de frascos agitados (SF) 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2
ID do tratamento A B C D E F G H 1 J
Conc. de vit. B12
(mg/l) 7680 3840 768 384 153,6 76,8 15,36 7,68 1,536 0
Conc. de vit. B12
(Log 10-mg/l) 3,885361 3,584331 2,885361 2,584331 2,186391 1,885361 1,186391 0,885361 0,186391 0,001
DW (g/l)
Frasco 1 2,01 4,17 4,176 3,764 4,276 4,218 3,916 4,44 4,59 3,676
Frasco 2 2,574 3,354 4,106 3,824 3,922 4,21 4,046 4,352 4,518 3,174
Média 2,292 3,762 4,141 3,794 4,099 4,214 3,981 4,396 4,554 3,425
% de gordura (por % da área) 28,8 62,2 64,4 60,5 65,3 58,8 58,2 66,4 63,0 61,4
Frasco 1 39,2 55,6 65,0 55,9 62,6 62,2 65,4 62,0 66,3 53,0,
Frasco 2 34,0 58,9 64,7 58,2 63,9 60,5 61,8 64,2 64,7 57 :2
Média
175/208
DHA 38,9 46,4 47,5 46,1 48,0 45,7 43,2 47,7 47,9 38,5
Frasco 1 40,9 41,3 46,9 43,6 46,3 47,1 45,2 47,6 47,5 35,3
Frasco 2 39,9 43,9 47,2 44,9 47,1 46,4 44,2 47,6 47,7 36,9
Média
DHA (mg/g) 109,7 283,1 300,1 273,9 307,2 263,4 246,7 310,6 296,0 232,1
Frasco l 157,3 225,4 299, 0 239,5 284,4 287,8 290,3 289,4 309,4 183,6
Frasco 2 133,5 254,3 299,6 256,7 295,8 275,6 268,5 300,0 302,7 207,8
Média 28,8 62,2 64,4 60,5 65,3 58,8 58,2 66,4 63,0 61,4
% de gordura (por mg/g)
Frasco 1 28,2 61, 0 63,1 59,4 64,0 57,7 57,1 65,1 61,9 60,2
Frasco 2 38,5 54,5 63,7 54,9 61,4 61,1 64,2 60,8 65,1 52,0
Média 33,3 57,8 63,4 57,2 62,7 59,4 60,6 63,0 63,5 56,1
Gordura (g/l)
176/208
Frasco 1 0,6 2,5 2,6 2,2 2,7 2,4 2,2 2,9 2,8 2,2
Frasco 2 1,0 1, 8 2,6 2,1 2,4 2,6 2,6 2,6 2,9 1,7
Média 0,8 2,2 2,6 2,2 2,6 2,5 2,4 2,8 2,9 1,9
Rendimento de DHA (g/l)
Frasco 1 0,2 1,2 1,3 1,0 1,3 1,1 1,0 1,4 1,4 0,9
Frasco 2 0,4 0,8 1,2 0,9 1, 1 1,2 1,2 1,3 1,4 0,6
Média 0,3 1, 0 1,2 1,0 1,2 1,2 1,1 1,3 1,4 0,7
% de EPA
Frasco 1 22,9 19, 0 18,8 17,4 17,1 18,8 21,6 18,0 16,4 28,3
Frasco 2 20,8 24,5 18,8 19,6 18,8 17,0 20,0 16,1 16,8 31,4
Média 21,8 21, 8 18,8 18,5 17,9 17,9 20,8 17,0 16,6 29,8
EPA (mg/g)
Frasco 1 63,9 114,9 117,4 102,4 108,3 107,6 122,1 115,8 100,5 168,9
Frasco 2 79,1 132,4 118,6 106,6 114,4 102,8 127,0 96,9 108,3 161,6
177/208
Média 71,5 123,6 118,0 104,5 111,4 105,2 124,5 106,4 104,4 165,2
Rendimento de EPA (g/l)
Frasco 1 0,1 0,5 0,5 0,4 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 0,6
Frasco 2 0,2 0,4 0,5 0,4 0,5 0,4 0,5 0,4 0,5 0,5
Média 0,2 0,5 0,5 0,4 0,5 0,4 0,5 0,5 0,5 0,6
L-F DW (g/l)
Frasco 1 1,4 1,6 1,5 1,5 1,5 1,8 1,7 1,5 1,8 1,5
Frasco 2 1,6 1,5 1,5 1,7 1,5 1,6 1,5 1,7 1,6 1,5
Média 1,5 1,6 1,5 1,6 1,5 1,7 1,6 1,6 1,7 1,5
% de 16:0
Frasco 1 26,0 22,5 21,7 24,3 22,5 23,1 23,0 22,0 23,2 20,2
Frasco 2 25,9 22,1 21,9 24,2 22,6 23,3 22,5 23,5 23,1 19,9
Média 26,0 22,3 21,8 24,3 22,5 23,2 22,7 22,8 23,2 20,0
178/208
% de DPA n-3
Frasco 1 1,5 1, 0 1,1 1,0 1, 0 1,0 1,0 0,9 1,0 1,4
Frasco 2 1,2 1, 1 1,0 1,0 1, 0 1,0 0,9 1, 0 0,9 1,4
Média 1,4 1, 0 1,1 1,0 1, 0 1,0 1,0 1, 0 0,9 1,4
% de DPA n-6
Frasco 1 1,3 2,3 2,3 2,3 2,5 2,3 1,9 2,4' 2,6 1,3
Frasco 2 1,7 1,6 2,3 2,1 2,3 2,5 2,1 2,6 2,5 1,1
Média 1,5 1, 9 2,3 2,2 2,4 2,4 2,0 2,5 2,6 1,2
% Total de ômega-3
Frasco 1 63,2 66,4 67,4 64,5 66,1 65,5 65,8 66,6 65,2 68,2
Frasco 2 62,9 66,9 66,7 64,2 66,1 65,1 66,1 64,6 65,2 68,1
Média 63,1 66,7 67,0 64,4 66,1 65,3 66,0 65,6 65,2 68,1
PH
Frasco 1 6,70 6,69 6,72 6,71 6,71 6,72 6,71 6,71 6,72 6,71
Frasco 2 6,67 6,71 6,72 6,71 6,72 6,72 6,71 6,71 6,72 6,71
179/208
Média 6,69 6,70 6,72 6,71 6,72 6,72 6,71 6,71 6,72 6,71
Tabela 21 (CONTINUAÇÃO)
Série de frascos
agitados (SN) 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3
ID do tratamento A B C D E F G H I J
Conc. de vit. B12
(mg/l) 7680 3840 768 384 153,6 76,8 15,36 7,68 1,536 0
Conc. de vit. B12
(Log 10-mg/l) 3,885361 3,584331 2,885361 2,584331 2,186391 1,885361 1,186391 0,885361 0,186391 0,001
DW (g/l)
Frasco 1 2,786 2,92 4,108 3,258 3,524 4,258 3,974 3,794 3,74 3,902
Frasco 2 2,868 3,106 2,87 3,376 3,234 4,39 4,834 3,374 4,434 3,82
Média 2,827 3,013 3,489 3,317 3,379 4,324 4,404 3,584 4,087 3,861
% de gordura (por % da área)
Frasco 1 42,6 41,0 54,5 46,5 50,7 59, 8 57,0 51,0 55,9 62,3
Frasco 2 44,0 43,1 48,4 49,8 49,3 56,8 62,2 52,3 56,4 56,5
180/208
Média 43,3 42,0 51,4 48,1 50,0 58,3 59,6 51,7 56,2 59,4
% de DHA
Frasco 1 42,0 39,8 43,0 43,1 43,1 44,8 45,4 44,0 43,4 45,4
Frasco 2 41,9 39,9 40,5 42,8 42,5 44,2 46,3 43,8 37,7 38,3
Média 41,9 39,9 41, 8 42,9 42,8 44,5 45,9 43,9 40,6 41, 9
DHA (mg/g)
Frasco 1 177,2 161,7 232,4 198,4 216,2 265,6 256,5 222,5 240,8 280,2
Frasco 2 182,6 170,3 194,2 210,9 207,6 248,8 285,6 227,2 211,0 214,4
Média 179, 9 166,0 213,3 204,6 211,9 257,2 271, 1 224,8 225,9 247,3
% de gordura (por mg/g)
Frasco 1 42,2 40,6 54,0 46,1 50,2 59,2 56,4 50,5 55,4 61,7
Frasco 2 43,6 42,7 47,9 49,3 48,9 56,3 61,7 51,9 55,9 56,0
Média 42,9 41,7 51, 0 47,7 49,5 57,8 59, 1 51,2 55,7 58,8
181/208
Gordura (g/l)
Frasco 1 1,2 1,2 2,2 1,5 1, 8 2,5 2,2 1, 9 2,1 2,4
Frasco 2 1,2 1,3 1,4 1,7 1,6 2,5 3,0 1,7 2,5 2,1
Média 1,2 1,3 1,8 1,6 1,7 2,5 2,6 1, 8 2,3 2,3
Rendimento de DHA (g/l)
Frasco 1 0,5 0,5 1,0 0,6 0,8 1, 1 1,0 0,8 0,9 1,1
Frasco 2 0,5 0,5 0,6 0,7 0,7 1, 1 1,4 0,8 0,9 0,8
Média 0,5 0,5 0,8 0,7 0,7 1, 1 1,2 0,8 0,9 1,0
% de EPA
Frasco 1 22,4 24,7 23,9 22,0 23,5 22,1 20,9 22,3 23,8 21,3
Frasco 2 23,0 24,9 25,7 22,8 24,4 23,0 20,1 22,6 31,3 30,9
Média 22,7 24,8 24,8 22,4 24,0 22,6 20,5 22,4 27,5 26,1
EPA (mg/g)
Frasco 1 93,6 99,2 127,3 100,4 116,5 129,6 116,7 111,3 130,2 129, 9
182/208
Frasco 2 98,9 105,2 121,5 111,2 118,0 128,1 122,6 115,5 173,1 170,7
Média 96,2 102,2 124,4 105,8 117,2 128,8 119,7 113,4 151,6 , 150,3,
Rendimento de EPA (g/l)
Frasco 1 0,3 0,3 0,5 0,3 0,4 0,6 0,5 0,4 0,5 0,5
Frasco 2 0,3 0,3 0,4 0,4 0,4 0,6 0,6 0,4 0,8 0,7
Média 0,3 0,3 0,4 0,4 0,4 0,6 0,5 0,4 0,6 0,6
IF DW (g/l)
Frasco 1 1,6 1,7 1,9 1, 8 1, 8 1,7 1,7 1, 9 1,7 1,5
Frasco 2 1,6 1, 8 1,5 1,7 1,7 1, 9 1,9 1,6 2,0 1,7
Média 1,6 1, 8 1,7 1,7 1,7 1, 8 1,8 1, 8 1, 8 1,6
% de 16:0
Frasco 1 24,0 23,8 21,4 23,1 21,7 21,3 21, 9 22,0 21,0 21,6
Frasco 2 23,5 23,5 21,7 22,8 21,4 21, 0 21,5 22,0 18,2 18,0
Média 23,7 23,6 21,5 23,0 21,6 21,1 21,7 22,0 19,6 19, 8
183/208
% de DPA n-3
Frasco 1 1,2 1,2 1,0 1,2 1,2 1, 0 1,0 1, 1 1, 0 0,9
Frasco 2 1,2 1,2 1,1 1,2 1,2 1, 0 1,0 1, 1 1,3 1,4
Média 1,2 1,2 1,1 1,2 1,2 1, 0 1,0 1, 1 1,2 1,1
% de DPA n- 6
Frasco 1 1,7 1,4 1,8 1, 8 1, 8 2,0 2,1 1, 9 1, 8 2,1
Frasco 2 1,7 1,5 1,5 1, 8 1,7 2,0 2,3 1, 9 1,2 1,3
Média 1,7 1,5 1,7 1, 8 1, 8 2,0 2,2 1, 9 1,5 1,7
% Total de ômega-3
Frasco 1 65,6 65,8 67,9 66,3 67,7 67,9 67,4 67,4 68,2 67,6
Frasco 2 66,0 66,0 67,3 66,8 68,1 68,3 67,4 67,5 70,4 70,5
Média 65,8 65,9 67,6 66,6 67,9 68,1 67,4 67,5 69,3 69, 1
PH
Frasco 1 6,85 6,89 6,89 6,88 6,88 6,88 6,87 6,88 6,88 6,87
184/208
Frasco 2 6,86 6,89 6,89 6,88 6,88 6,89 6,86 6,87 6,88 6,86
Média 6,86 6,89 6,89 6,88 6,88 6,89 6,87 6,88 6,88 6,87
Tabela 21 (CONTINUAÇÃO)
Série de frascos agitados (SF) 4 4 4 4 4 4 4 4 4 4
ID do tratamento A B C D E F G H I J
Conc. de vit. B12
(mg/l) 7680 3840 768 384 153,6 76,8 15,36 7,68 1,536 0
Conc. de vit. B12
(log 10-mg/l) 3,885361 3,584331 2,885361 2,584331 2,186391 1,885361 1,186391 0,885361 0,186391 0,001
DW (g/l)
Frasco 1 2,538 2,512 4,242 4,528 , 2,498 3,796 3,79 3,87 3,676 3,972
Frasco 2 2,646 3,162 2,86 4,368 2,744 3,774 3,81 4,002 4,202 4,35
Média 2,592 2,837 3,551 4,448 2,621 3,785 3,8 3,936 3,939 4,161
% de gordura (por
% da área)
185/208
Frasco 1 42,5 41,9 57,5 66,7 43,6 58,1 58,2 60,0 57,1 59,2
Frasco 2 44,6 32,9 45,4 63,0 43,9 57,3 57,7 59,9 60,4 62,0
Média 43,5 37,4 51,5 64,9 43,8 57,7 57,9 59,9, 58,8 60,6
% de DHA
Frasco 1 41,1 38,0 47,6 47,1 36,6 45,1 46,0 44,6 43,8 38,0
Frasco 2 40,2 40,8 40,0 46,7 39,0 45,5 45,1 45,9 46,7 40,2
Média 40,7 39,4 43,8 46,9 37,8 45,3 45,5 45,2 45,2 39, 1
DHA (mg/g)
Frasco 1 172,7 157,5 270,6 311, 0 157,7 259,4 264,6 264,2 247,3 222,3
Frasco 2 177,2 132,8 179,6 290,9 169,2 257,3 257,1 271,7 278,5 246,0
Média 175,0 145,2 225,1 300,9 163,5 258,4 260,9 267,9 262,9 234,2
% de gordura (por mg/g)
Frasco 1 42,0 41,4 56,9 66,0 43,1 57,5 57,5 59,3 56,5 58,5
186/208
Frasco 2 44,1 32,5 44,9 62,3 43,4 56,6 57,0 59,2 59,7 61,3
Média 43,0 37,0 50,9 64,1 43,2 57,0 57,3 59,3 58,1 59, 9
Gordura (g/l)
Frasco 1 1,1 1,0 2,4 3,0 1,1 2,2 2,2 2,3 2,1 2,3
Frasco 2 1,2 1,0 1,3 2,7 1,2 2,1 2,2 2,4 2,5 2,7
Média 1,1 1,0 1, 8 2,9 1,1 2,2 2,2 2,3 2,3 2,5
Rendimento de DHA (g/l)
Frasco 1 0,4 0,4 1, 1 1,4 0,4 1, 0 1, 0 1,0 0,9 0,9
Frasco 2 0,5 0,4 0,5 1,3 0,5 1, 0 1, 0 1,1 1,2 1, 1
Média 0,5 0,4 0,8 1,3 0,4 1, 0 1, 0 1,1 1, 0 1, 0
% de EPA
Frasco 1 22,8 27,1 17,8 16,7 29,2 21,6 20,0 21,9 22,2 31,3
Frasco 2 24,5 24,4 26,7 19,5 26,3 21,0 20,9 20,5 19,2 28,5
187/208
Média 23,6 25,7 22,3 18,1 27,7 21,3 20,4 21,2 20,7 29, 9
EPA (mg/g)
Frasco 1 94,9 111,3 100,5 109, 1 124,9 123,0 114,1 128,8 124,1 181,9
Frasco 2 106,9 78,5 118,8 120,4 113,0 118,1 117,9 120,4 113,7 173,2
Média 100,9 94,9 109,7 114,7 119, 0 120,5 116,0 124,6 118,9 177,6
Rendimento de EPA (PSL)
Frasco 1 0,2 0,3 0,4 0,5 0,3 0,5 0,4 0,5 0,5 0,7
Frasco 2 0,3 0,3 0,3 0,5 0,3 0,4 0,5 0,5 0,5 0,8
Média 0,3 0,3 0,4 0,5 0,3 0,5 0,4 0,5 0,5 0,7
L-F DW (g/l)
Frasco 1 1,5 1,5 1, 8 1,5 1,4 1,6 1,6 1,6 1,6 1,6
Frasco 2 1,5 2,1 1,6 1,6 1,6 1,6 1,6 1,6 1,7 1,7
Média 1,5 1,8 1,7 1,6 1,5 1,6 1,6 1,6 1,6 1,7
188/208
% de 16:0
Frasco 1 24,1 23,1 22,7 24,5 22,4 21,6 22,3 21,7 22,3 17,8
Frasco 2 23,6 23,1 21,6 22,0 22,9 21,8 22,5 21,9 22,2 18,4
Média 23,9 23,1 22,1 23,3 22,7 21,7 22,4 21,8 22,2 18,1
% de DPA n-3
Frasco 1 1,5 1,4 1,2 1,2 1,5 1, 1 1,2 1,1 1, 1 1,4
Frasco 2 1,5 1,3 1,5 1,1 1,4 1, 1 1, 1 1,1 1,2 1,3
Média 1,5 1,4 1,4 1,2 1,5 1, 1 1,2 1, 1, 1, 1 1,3
% de DPA n-6
Frasco 1 1,6 1,2 2,4 2,3 1,1 2,1 2,2 2,0 1, 9 1,2
Frasco 2 1,5 1,6 1,4 2,2 1,3 2,1 2,1 2,2 2,2 1,4
Média 1,5 1,4 1, 9 2,3 1,2 2,1 2,1 2,1 2,1 1,3
% Total de ômega-3
189/208
Frasco 1 65,4 66,6 66,6 65,0 67,3 67,8 67,2 67,6 67,0 70,7
Frasco 2 66,2 66,5 68,2 67,3 66,8 67,6 67,0 67,5 67,1 70,0
Média 65,8 66,5 67,4 66,2 67,0 67,7 67,1 67,5 67,0 70,3
pH
Frasco i 6,83 6,84 6,82 6,84 6,83 6,84 6,84 6,84 6,86 6,85
Frasco 2 6,82 6,84 6,81 6,84 6,83 6,84 6,84 6,84 6,84 6,85
Média 6,83 6,84 6,82 6,84 6,83 6,84 6,84 6,84 6,85 6,85
190/208
Exemplo 12
Gradientes de vitamina B12 para N° de Acesso na ATCC PTA-10208 a CO2 10% [226] Foram feitos experimentos para determinar a concentração de vitamina B12 que fornece crescimento de PTA-10208 e produtividade de EPA ótimos.
[227] Temperatura: 23°C [228] Velocidade da agitadora: 200 rpm [229] Meio de base: SDFM-O Definido (DSDFM-O) [230] Inóculo: Descongelar um frasco de PTA-10208 em
SDFM-O em condições ambientes. Transferir 2 ml de cultura em 48 ml de DSDFM-O a CO2 10%. Transferir a cultura em
DSDFM-O fresco (CO2 10%) (veja a Tabela 22). Transferir a em DSDFM-O fresco (CO2 10%). Usar a cultura para inocular experimento de gradiente de vitamina B12 Semana #1 (2 ml/frasco) (CO2 10%).
[231] Configuração experimental:
[232] Todas as culturas foram desenvolvidas em frascos agitados de 50 ml e frascos em duplicata foram desenvolvidos para cada condição. PTA-10208 foi inoculado em gradientes de vitamina B12 de nove dias em DSDFM-O (sem tastona) a cada sete dias. Inóculos para cada concentração de vitamina B12 foram mantidos por toda a duração do experimento. Por continuação da transferência de PTA-10208 em concentrações reduzidas de vitamina B12, vitamina B12 em excesso foi eficazmente retirada por lavagem das células. Inóculos para cada concentração de vitamina B12 foram transferidos a cada sete dias. Inóculos com quatro dias de idade foram usados para iniciar cada gradiente de vitamina B12 de nove dias. Cada gradiente de nove dias é marcado
191/208 consecutivamente como Conjunto de Experimento A, B, C, D, E, F, G, H, I, J, e abaixo na Tabela 23. Antes de cada inoculação de gradiente, a densidade óptica foi medida para cada concentração de vitamina B12 a fim de transferir aproximadamente a mesma quantidade de células. Após nove dias de crescimento, todas as culturas foram colhidas para medir o pH, peso seco e perfil de ácido graxo. O experimento foi terminado após ser constatado que os pesos secos em cada concentração de vitamina B12 se estabilizaram por pelo menos três gradientes de nove dias consecutivos.
192/208
Tabela 22. Meio de Fermentador Definido Reduzido Proporcionalmente para Orca (DSDFM-O).
Componente Quant. por litro (g) [Estoque] (g/l) ml de estoque para usar por litro g/l mg/l
Na K Mg Ca Cl Fe Cu Mn Co Zn
NaCl 0,625 Seco 0,25 0,38
Na2SO4 7,52 Seco
K2SO4 0,1 50 2 ml 0,04
KCl 1 50 2 0 ml 0,52 0,48
MgSO4.7H2O 5 227 22 ml 0,47
(NH4)2SO4 0,217 190 1,14 ml
CaCl2.2H2O 0,29 Seco 0,08 0,14
Monoidrato de
MSG 2,16 Seco
HEPES (100 mM)
pH 7 23,8 Seco
KH2PO4 0,136 56,5 2,4 Adicionar 0,04
193/208
Componente Quant. por litro (g) [Estoque] (g/l) ml de estoque para usar por litro g/l mg/l
Na K Mg Ca Cl Fe Cu Mn Co Zn
após autoclavagem
Glicose 50 500 10 0 ml Adicionar após autoclavagem
Solução de citrato-Fe Vej a abaixo 10 ml Adicionar após autoclavagem
Metais-traço Veja abaixo 1 ml Adicionar após
194/208
Componente Quant. por litro (g) [Estoque] (g/l) ml de estoque para usar por litro g/l mg/l
Na K Mg Ca Cl Fe Cu Mn Co Zn
autoclavagem
Vitaminas Veja abaixo 1 ml Adicionar após autoclavagem
Solução de citrato-Fe
Ácido cítrico 1175 mg 117,5
FeSO4.7H2O 10,3 mg 1,03 2,07
Solução de metal-traço
195/208
Quant. ml de
por estoque
litro [Estoque] para usar
Componente (g) (g/l) por litro g/l mg/l
Na K Mg Ca Cl Fe Cu Mn Co Zn
MnCl2.4H2O 3,1 mg 3,1 0,86
ZnSO4.7H2O 9,3 mg 9,3 2,12
Na2MoO4.2H2O 0,04 mg 0,04
CUSO4.5H2O 2,07 mg 2,07 0,53
N1SO4.6H2O 2,07 mg 2,07
pH até 2,5 com
HCl
Solução de
vitamina
Vitamina B12 0,768 mg 0,768
Tiamina 11,7 mg 11,7
Ca-Pantotenato 3,996 mg 3,996
196/208
Componente Quant. por litro (g) [Estoque] (g/l) ml de estoque para usar por litro g/l mg/l
Na K Mg Ca Cl Fe Cu Mn Co Zn
Biotina 0,00434 mg 4,34 mg
Totais de íons (ppm) 607,32 995,8536
197/208
Tabela 23
[] Vitamina B12 mg/l de vitamina B12
5x 3,84
1x 0,77
1/2x 0,38
1/5x 0,15
1/10x 0,077
1/20x 0,038
1/50x 0,015
1/100x 0,0077
1/500x 0,0015
0x 0
[233] Sete gradientes de vitamina B12 consecutivos de 5x a 1/500x foram realizados. Ao final do último experimento, um novo experimento foi iniciado comparando o crescimento de PTA-10208 e a produção de EPA a 1/500x (0,0015 mg/l) e 0x (0 mg/l de vitamina B12). Quatro experimentos consecutivos de 1/500x vs. 0x de vitamina B12 foram realizados.
[234] Resultados:
[235] (Para 5x --> 1/500x de vitamina B12): Para sete experimentos de nove dias consecutivos, peso seco de PAT10208, % de EPA, % de DHA, % de gordura e rendimento de EPA não se alteraram em concentrações de vitamina B12 que variam de 5x (3,84 mg/l) a 1/500x (0,0015 mg/l).
[236] (Para 1/500x e 0x de vitamina B12) : Os resultados ao longo do período de quatro experimentos de nove dias consecutivos mostram que PTA-10208 que cresceu em DSDFM-O contendo 0 mg/l de vitamina B12 possui % bem maior de EPA do que quando cresceu com apenas 1/500x (0,0015
198/208
mg/l ) de vitamina B12. Enquanto o % de EPA aumenta cerca de
18% com l/500x (0,0015 mg/l) de vitamina B12 até cerca de
27% sem nenhuma vitamina B12, o % de DHA diminui cerca de
45% com l/500x (0,0015 mg/l) de vitamina B12 até cerca de
36% sem nenhuma vitamina B12. 0 peso seco de PTA- 10208 e : o
% de gordura aumentam ligeiramente quando a vitamina B12 é completamente removida de DSDFM-O. Em conseqüência do aumento no % de EPA e nos ligeiros aumentos no peso seco e no % de gordura, o rendimento de EPA de PTA-102 0 8 aumenta cerca de 60% quando a vitamina B12 é removida de DSDFM-O.
[0237] Os resultados também são mostrados nas Figuras 20 - 49 e nas Tabelas abaixo.
Exper intento O.D. da rag/1 de Vit PH
inóculo· BI 2
Conjmto AWSTRA & 6Q0
A 5>P1) 3.B4 6 60
5k{2) 3.84 6.30
1x{1) 0.77 6, ao
Tara Peso Out Peao aeco Biomaaaa
(g> (g) do pélete g/i
10.4757 10.723 0.2473 4.95
10.4534 10.609 0.2356 4.71
10-5142 10.7449 0.2307 4.61
199/208
Experimenta Ο.Π. do mg/l de Vit pH Tara Peso Out Peao aeco Biamassa
Conjunto Al.JDSTBA inóculo a 600 rjD BI 2 íq) da pélete (g) g/1
1x(2) 0.77 B.ai 10.431 10-6512 07202 4,40
t/2a(1) 0.38 5 82 10.5684 10.7882 0.2198 4.40
1«*(2) 038 6.82 10.6373 1D.8691 0.2310 4.64
1/5*(1) 0.15 6.81 10.5044 10.7348 0 2304 4.61
1/5* (2) 0.15 852 10-5216 10.747 0.2251 4.50
1/10* (1) 0.077 8.83 10-5221 10.7481 0226 4.52
1/10* ¢2) οοπ 683 10.4705 10 6879 0.2274 4.55
1/20* ¢1) Ó.038 683 10.4743 10.6983 0.2245 4.49
1/20* (2) 0.038 6.83 10.7322 10.9646 0.2324 4.65
1/50* (1) 0.015 6.84 10.4777 10.6945 0.2168 4.34
1/50* (2) 0.015 6.85 10.4766 10.7018 67252 4.50
1/1 GO*
<1) 1/lODx 00077 6-84 10.4543 10.6833 0.232 4.64
(2) 1/500* 0.0077 6.85 '6.86 10.5041 10.7452 02411 4.82 4 82
0) 1/500* 0.0015 10.5152 10.7563 0.2411
Í2) 0.0015 6.85 10.574 10.8081 0.2341 4.68
5x(1) 4.0445 3.34 6.63 10.5021 10.733a 0 2317 4.63
5* {2} 4.0445 3.64 6.65 10.4735 10,7152 0.2417 4.63
1X<1) 4.3024 0.77 6.64 10.5011 10.7394 0-2383 4 77
1x(2) 4.3024 0.77 6j85 10.4Q04 1 tJ 6362 0.2358 4.72
1/2* (1) 4.1640 0 38 6.64 10.4699 10.71 0.25'01 5.00
1/2* (2) 4.1643 0-38 6.64 10.5630 10.864 0241 4.82
1/5* (1) 4.1600 0-15 663 10.6521 10.889 0.2369 4 74
1/6* (2) 4.1600 0.15 6.63 1 D.5032 10,7341 0.2309 4.62
1/10* (1) 4 4997 0.077 6 65 10.4726 10.6990 0-2272 4 54
1/10* (2) 4.4997 0.077 664 10 4841 10 7279 0.2438 4.08
1/20* (1) 4.9716 0.038 6 64 10.3785 10.6112 02327 4-65
1/20* (2) 4.9716 0.038 6.64 1 D.3B32 10.6154 0.2322 4.64
1/50* (1) 4.3049 0.015 6.65 10.3782 10.612 0.2338 4.68
1/50* (2) 1/100* 4.3049 0015 8.65 10-5546 10.7877 07331 4.66
(1> 1/1 CD* 4.6035 O.C077 6 65 10.4868 10 7172 07314 4.63
<2j 1/500* 4.6035 0.0077 6.66 10-4771 10-7122 0.2351 4.70
<1> 1/500* 4.4494 0,0015 665 10.6083 10.8163 0708 4.16
<21 4,44 94 0.0015 6 65 10 5722 10,7896 0-2174 4.35
5* ¢1) 4.1784 3.84 6.77 10-4842 10.7237 0.2395 4.79
5* (2) 4.1784 3.84 6.80 10 5261 10.7553 07292 4 58
i*0) 4.2342 0.77 6.80 10.3785 10,6194 07409 4.82
1* (2) 4.2842 0.77 6.77 10.6083 10 8459 07376 4.75
1/2* (1) 4.B365 0.38 6.81 10.5274 10,7183 0.1909 3.82
1/2* (2) 4.6365 0.38 6.81 10.4713 10.6853 0714 4.28
1/5* (1) 4,5411 0.15 6.81 10-3831 10,599? 0.2166 4.33
1/5* (2} 4 5411 0.15 6.84 10.5444 10.7866 0.2222 4.44
1/10* (1) 5.2960 0.07? 6.80 10.501 10.7181 07171 4.34
1/10* (2) 5.2980 0.077 6.82 10.3703 10.5978 0.2195 4.39
1/20* (1) 5.2480 0.038 6.82 10.4521 10,6639 07018 4.04
1/20* (2) 5.2480 0-038 6.83 10.4018 10.5881 0.1863 3.73
r/50* (1) 5.6680 0.015 6.82 10.5049 10.7248 0 21S9 4.4<J
1/50* (2) 1/100* 5.6680 0.015 6-83 10.4197 106441 07244 4.49
(1} 1/1 OQx 4.9024 0.0077 6.83 10 5531 10-7847 0 2318 4.63
(2) 1/500* 4 9024 0.0077 6.83 10.7098 10.9412 0.2314 4.63
(1) 1/5Q0* 4.6011 0.0015 6.83 10.5543 10.7942 0.2399 4.B0
Êi 4.6011 0.0018 6.83 10-3382 1D.5746 07364 4.73
200/208
1Experimento Ο.Π. do mg/1 de Vit pH Tara Peso Out P&3O aeco Biomassa.
Conjunto AiJDSTRA inóculo a 600 ma BI 2 (g> (g) do pélete (g) g/i
D 5x(1) 4.3297 3.04 6.85 10 3415 10.5976 0.2561 5.12
5« ¢2) 4.3297 3.84 6 85 10,4549 10.698 0-2431 4.06
ix (1) 5.3731 0.77 6.85 1O37B5 106143 0-2358 4.72
IX (2) 5.3731 0.77 6.85 106117 10 8401 0.2284 4.57
1/21 (1) 4.9040 0,38 6 35 10-4316 10.6573 D.2255 4.51
1/2x (2) 4.9040 0-38 6 65 106572 10.8742 0.217 4.34
1/5x(1) 4.7084 α is 6.85 10.552 10.7791 0.2271 4.54
1/5x (2} 4.7004 0.15 6,85 10.7118 10.9623 0-2505 5.01
1/10* oj 4.9843 0.07? 6.85 10.6174 10.8589 0.2410 4.83
1/101 (2) 4.9843 D.077 6.85 10.5229 10.7614 0.2385 4.77
1/201(1) 4.7533 0.038 6 84 10.5045 10.7446 0.2401 4.BQ
1/20x (2) 4.7533 0.038 684 10.5049 10.7281 0.2232 4.46
1250« (1) 4.3732 0-015 6.66 10.5161 10.7566 0.24D5 4.01
1/50« (2) 1/1 001 4.3732 0-015 665 10-5234 10.7574 0234 4.68
fD 1/IDOx 4.0902 0.0077 6.66 10 4856 10.7193 0.2335 4.67
(2) 1/5W 4.0902 0.0077 6.66 105523 10.7656 0.2333 4.67
(1) 1/5OQX 4.2472 0,0015 6,86 10-553 10.8032 0.2502 5.00
(2) 4.2472 0.0015 8.88 10.4488 10.6976 0.2468 4.98
E 5x (Ό 4.5635 3.84 6.79 10.3613 106103 0.249 4.98
5< (2) 4.5635 3-84 6.60 10.5311 107546 0 2235 4.47
1x{t) 4.2673 0.77 6.80 10.3311 10.5651 0.234 4.60
1X12) 4 2673 0.77 6 80 10.466 10.7162 0.2502 5 00
U2x [1) 5, tsea 0.38 6.79 10.6796 10.9054 07250 4.52
U2i (2) 5.1939 0 38 6.80 10.5552 10.7836 0.2204 4.57
V5x(1) 5.0275 0.15 6.00 10 4877 10-721 0.2333 4 67
1/51 (2) 5.0275 0.15 6.80 10.5061 10-7331 0.227 4.54
1/101/1) 5.66B0 0.077 6.81 10.3505 10.5945 0-2361 4.72
t/iox m 5.6BBÜ 0.077 6.80 1068D7 10.9116 0-2309 4.52
1/201(1) 5.2591 0.038 6.81 10.3064 10-6143 0.2479 4.96
1/20« (2) 5 2891 0 038 6.81 10.3745 10,6253 0.2508 5.02
1/501(1) 5.C35G 0.015 6.81 10.42B5 10.682 02535 5.07
1/50* (7) 1/1D01 5.0356 0 015 8.80 10.4022 10.6524 0.2502 5.00
ü) 1/10/h 5.7271 0.0077 6.81 10.3332 10.593? 0 2605 5.21
(2) V5001 5.7271 0.0077 6.81 10.525 10.7702 0 2532 5.06
(1) 1/500« 5-1OQ0 0.0015 6.01 104192 10.6785 0.2593 5.19
0 51(1) 5.1000 0.0015 6.81 10.3991 10-Θ66Θ 0.2677 5.70
F 4.5635 3.04 6.75 10.524 10.7695 07456 5.23
51 (2) 4.5535 3.54 6 75 10.3291 10.5729 0.2438 4.00
1x (1) 4.2673 0.77 675 10.4927 10.7424 07497 4.99
1K/2) 4.2673 0.77 676 10.5257 10.7652 07395 4.79
1/21(1) 5.1939 0.36 675 10-463 10.6908 0 2278 4.56
1/21(2) 5,1939 0.30 6,76 10-3756 10.6003 0 2247 4 49
1/51(1) 5 0275 0.15 6 76 104212 106704 0.2492 4.98
1/5x (2) 5.0275 0,15 6.76 10.5061 10,7509 07448 4.90
1/101 (1 i 56680 0.077 6.76 10.3829 10.5052 07233 4.47
1/101 (2) 5.6650 0.077 6 76 10.3651 10.6068 0.2417 4.83
1/20x (1) 5.2891 0.030 6.75 10.5096 10.7442 0.2346 4.89
1/201(2) 5.2891 0.038 67? 10.3875 10.6226 0.23S1 4.70
1/50Χ/1) 5.0356 0.015 6.78 10.3584 10.6063 0,2479 4.96
1/501 (2) 1/100« 5.0356 0.015 6.76 10-5235 10.7671 0.2436 4.07
¢1) 1/1001 5.7271 0.0077 6 77 10.3664 10.6148 0.2404 4.97
(2) 5 7271 0.007? 678 10.5055 10.7441 0.2386 4.77
201/208
Experimento- Ο.Π. do inócul-o· a €DQ nm 5.1000 5 100Ü mg/l de Vit B12 D.QOtS O.OÚ15 pH 6.79 6.80 Tara 10 3322 10,3279 Peso· Out w 10.5668 10.591 Peso seco do· pélete (g) Q.254È 0.2631 Bi-o-massa 5/1 5.09 5 26
Conjunto ÃMDSTRA 1/500* in 1/500* 12}
G 5*(1) 3.7017 3 64 6.83 10.362 10.6077 0.2457 4.91
5* ¢2) 3.7017 3.84 6.82 10 3595 10.6145 0255 5.10
1*(1) 4.29Q5 0-77 6.B4 10.3648 10.6151 0.2503 5 01
1*(2) 4.29D5 0.77 6.85 10.3356 10.5972 0.2616 S.23
1/2*(1} 4.4548 0l36 6.84 10.5096 107583 0.2587 517
1/2* (2) 4.45ΟΘ 0.38 6.84 10.435 105889 0.2539 5 08
1/5* (1) 4.6344 0.15 6-84 10.3305 10.5868 0.2563 6.13
1/5* (2) 4.6844 0 15 685 10.4964 10.7476 0.2512 5.02
t/10* (tj 5 B389 0.077 6.65 10.3637 10.6173 0.2536 5.07
1/1 Ox (2) 5.8359 0077 6.85 10,3351 105881 Q.253 5.06
1/20* O) 4,4463 0.038 6.85 10.4393 10.6958 0.2565 5,13
1,-20* (2J 4.44« 0038 6.86 10379B 10.6416 0.2518 5.24
1/5QX (1) 3.9821 0 015 5.88 10.3619 10.619 0.2571 5.14
1/50* (2) 3 9821 0.015 6.67 10.5179 10.7721 0.2542 5.08
1/100*
(1) 1/100* 5.0043 0.0077 6.87 10.4756 10.7268 0.2532 5.06
(2) 1/M0* 5-0043 0 0077 6.87 10.4993 10.7561 0.2568 5 14 570
O) 1/500* 5-0108 0 0015 6 88 10-434 10.6941 0.2601
(2) 5.0108 00015 6.87 10.3896 10.6446 0.255 5.10
1/500*
H (1) 1/500* 4.5921 00015 6.85 10.3599 10.5954 0.2355 4.71
12) 4 6921 0.Ü015 665 10.3720 10.6254 0 2534 5.07
0*(1) 4.B144 0-0000 6.85 10.3624 1 D.6052 0.2428 4.66
Ox(2) 4.8144 O.QOÜO 6.36 103555 1 D.6093 0.2506 5.02
t/500* 4 86
1 (1) 1/500* 4.7906 0.0015 689 10.5492 10.7920 0.2428
510
(2> 4.7906 0 0015 690 10.5958 10.8506 a.255
O*(1) 4.7063 0.0000 6.69 10.5505 10.8037 0.2532 5.06
0*12) 1/5D0* 4-7063 0.0000 6.39 10.5120 107893 0.2573 5.15
5.31
J (1) 1/500* 5.8605 0.0015 6.99 10.5433 10.8089 0.2656
<2) 5.8605 00015 700 10.5974 10.8714 0.274 5.48
0*0) 4.8365 0.0000 700 10.5509 10-8145 02636 5.27
0* (2) 4.8385 0.0000 6 98 10.5462 10.8252 0279 558
1/500*
K (1) t/500* 4.7133 0.0015 687 105424 10.8085 0.2661 5 32
(2) 4.7133 00015 6.88 10.3444 10.6111 0.2667 5.33
0*11) 4.2141 0.0000 6.86 10.3673 10.6587 0.2714 5 43
0* <?J 4.2141 O.oooo 6.86 10.4186 10.6566 0 2670 536
Experimento- ΐ de 4 de 4 de
Coniunto MESTRA 16:0 ARA EPA
A 5x(1) 27.53 1.67 1601
5xf2] 27.65 1.71 1602
1*(1) 27.73 1.72 16.00
1x(2) 27.72 1.75 16.32
1/2* (1) 27.65 1.74 16-36
1/2x(2) 27.73 1.77 1653
1/Sx(1] 27.60 1.73 16 33
1/5* (2) 27.88 1.74 15.94
1/10* [1) 27.87 1.75 16.28
1/10* (2) 27.81 1.74 16-07
ín-6) (n-3) 4 de %
DPA DPA DHA go-rdura
2.22 2.33 41.72 6722
2.16 2.41 41.17 66.07
2.15 2-44 41.06 66 25
2.10 2,48 40.46 65.42
2.09 2-49 40.54 65 45
2.14 2.32 40 93 66 57
2.13 2.38 41.03 66 59
2.17 2.43 41.04 66.28
2.09 2.56 40.66 65.14
2.13 2.46 40.96 65.30
202/208
Experimento- ΐ de 4 de « de (n-6) (n-3J Λ de %
Coniunto AMOSTRA 16:0 ARA EPA ÜPA DP A DHA go-rdura
1/2Üa(1> 27.70 1.75 16.36 2.08 2.52 40 53 65 b4
1/20x (2) 27 63 1.75 16.42 2 13 2.36 40.93 66.30
1/50® (1) 27 63 1.76 16.61 2.07 2.43 40.60 66 02
V50w (2) 1/IOOx 27 62 1.59 16.35 2 11 2.43 40.Ô4 64.97
(U 1/100* 27.60 1.72 16.13 2.16 2.50 41.19 56 21
(2) 1/500x 27 60 1.69 15.64 224 2.34 41.72 66.56
(1) 1/500x 27.56 1.70 18.63 2.24 2 26 41,74 86.99
(2) 27 57 1.75 16.65 2 06 2.41 40.59 64 91
Θ 5*(1 J 28.30 1.75 16.44 2.32 2 35 42.35 6409
5λ(2) 28.45 1.74 1596 2.36 2 36 4262 62.46
1ϊ(1) 26.55 1.74 16.10 232 2.43 42 35 62.96
1®(2) za.47 1.70 16.33 2 33 2.44 42.26 63.13
1/2x(1) 28.21 1.71 15.90 2.39 2.34 42.95 6475
1/2® (2) 26.15 1 75 16 65 2.29 2.33 42.32 63.50
ι/5χ (η 28 51 1.74 16.34 229 2.37 42.23 62-02
1/5Χ (2) 28.43 1.75 16.35 2-29 2.48 42 24 63-80
1/10χ(1) 28 66 1.77 15.85 2.37 2.45 42.45 62 47
1/1 Οχ (2) 28.52 174 15.74 2.40 2 39 4270 03.14
1/20χ ¢1} 28.67 1-75 1586 2.33 2 37 4255 63.10
1 /Μχ (2} 2Β.35 1 75 16 13 2.35 2.26 42.62 63.90
1/5ÜX (1} 26.36 1.79 16 64 229 2.42 42.94 62.31
1/50χ (2} 1/ΗΧΐΧ 28.43 1.77 15.92 2.40 2.42 42.57 62 77
(1) 1/1 ΟΟκ 28.81 1.75 16,01 2.30 2.49 42 16 6170
(2) 1/50Οχ 23.61 1.73 15-93 2.35 2.40 42 51 63 60
(1) 1/500* 28.62 1.85 17,15 2.17 2.59 41.19 60.91
(2) 28,30 1.84 17.39 2.20 2.43 41.40 61.56
c 5Χ(1) 27.37 ’ 1.95 1608' 2.60 2,43 42.37 67.30
5χ(2) 28.24 1.96 15.99 2.55 2.54 42 02 6672
ι«ΐυ 28.20 1.94 15,96 2-60 2.61 4206 86.96
1χ(2) 2a.ίο 1.98 1639 2.54 2.64 41,73 66.30
1/2χ (1) 27.77 2.14 17.67 2.40 2.85 40.45 64.53
ι/2χ (2) 27.B4 2-10 17,27 2.60 2,62 40.65 6579
1/5« (11 27.57 2.06 17.37 2.45 2.64 41,17 66.69
1/5χ (2) 27.71 2.05 17,05 2-50 2.70 41 31 65.86
1/10® (1) 28.02 2.06 16.89 2.48 2.70 41 27 65.53
1/10χ (2) 27.66 2 05 16.76 2.55 2.64 41 66 65.85
1/20« (1) 27.64 2.13 17.27 2.52 2.74 41,03 65 00
1/20χ (2) 27 56 2 19 16.62 2.27 2.88 39.82 64.23
1/50« (1) 27.78 2.02 16.30 2.51 2.52 41.61 66.22
1/50® (2) 1/100® 27.82 2.01 16.92 2.53 2.55 41 47 65.85
01 1/100® 27.85 2. ÓÍ 16 7? 2.54 2.67 41,50 65.23
<2> 1/500« 27.91 2.01 16.61 2.50 2,59 41.72 6607
<1 > 1/50Ú® 27.73 2.Q2 1742 2.41 2.58 41,10 65.60
<21 27.48 2.05 1793 2 39 2.54 40 85 65.85
Ο 5χ (1J 27-80 1.85 15.97 2.59 2.32 42.99 67.08
5χ (2) 27.89 1.86 16,27 2.52 2,42 42 60 66.60
1χ(1) 27.60 - 1.92 16.59 2.54 2.53 42.42 66.52
1χ(2) 27.75 1.89 16,40 2.53 2-40 4260 66.35
1/2Χ (1) 37.35 1-96 17 19 2.52 2-53 41 97 65.19
1/2χ (2) 27.26 2-01 17.65 2.45 2.45 41.50 66.67
1/5χ (1) 27.42 1.97 17.53 2.42 2.55 4172 66 69
V5x (2) 27.46 1.91 16.60 2.60 2.45 4244 68.58
203/208
Experimento ΐ de % de $ de <n-6: (n-3) ΐ de %
Coniimto A1E3TRA 16:0 ARA EPA OPA DPA DHA gordura
1H0x(1J 27.45 1.97 17.08 2.50 2.81 42.04 66.06
1/10« (2j 27 45 1.9C 16.66 2.52 2.46 42.46 66.91
1/20« (1) 27.45 1.96 16.95 2.58 2.41 42.11 6610
1/?Qx (2) 27.30 2.00 17.94 2 42 2.45 41.50 65.30
1/50x0) 27.50 1.67 16.65 255 2.33 42.81 6684
VWx ¢2) 1/100« 27.69 1-69 16.85 2.5Q 2.44 42.27 65 40
(1) i/iqo« 27.44 1.92 16.88 251 2.51 42.38 65,88
(2) V50Qx 27 47 1.92 16.87 2 58 2.43 42.56 65 83
ίυ 1/500« 26.01 1 96 16.05 2.40 2.47 41 66 66.18
¢2) 27.03 1.99 18.00 240 2.36 41.69 65.80
E 5x0} 27.46 1.89 1602 260 2-30 43.33 66.12
5x(2) 27.86 1.93 16.05 2 50 2.38 4302 63.64
1X0) 27.75 1.95 15.91 2,58 2.39 43 09 65.41
1«(2) 27.51 1.94 15.59 2.72 2.29 43.52 67.35
t/2x(1) 27.07 2.04 16.99 2 52 2-42 42.64 65 01
1/2X (2) 26.86 2.05 17,23 2.40 2.35 42 59 65 00
1/5X0) 2705 1.96 16 65 2 55 2 29 43.21 65.66
1/5x (2) 27 12 1.96 16.69 2 52 2.41 43 00 63.50
UI 0x(1) 27 35 1 95 16.45 2.55 2.48 42.94 64.34
U1 Úx (2) 27 31 1 92 15.2Z 2 60 2.41 43.24 64.49
1/20« ¢1) 26.72 1 93 18.73 264 2.31 43.21 65.33
1/20x 12) 26.47 1.94 17.11 265 2.21 43 14 66 13
VSOx 0) 2663 1.86 16.30 2.72 2.19 4384 65 30
USOx ¢2) 1/IMx 23 68 1-56 16.33 2.69 2 26 43 75 65.67
(D i/100x 25-47 1.87 16.39 2 69 2.28 43.89 63.96
(2) 1/500« 26.45 1.89 18.78 2 62 2.38 43.49 65.21
(D l/SDOx 26.06 1-58 17.13 2.60 223 43.73 65.13
® 25.95 1.65 17,58 2.57 2.10 43.40 65.46
F 5x0) 2571 1.96 17.50 2 46 2.34 43.55 65.46
5x (2) 25.91 1 93 17.26 2.47 2.38 43.73 6571
7x0) 25.93 1.90 16.7Q 2 54 2.43 43.93 6605
IX (2) 25.03 1.94 17.17 2 48 2.39 4341 65.34
1/2x0) 25-76 2 03 10.11 243 2.38 42.76 65.27
1/2X (2) 25-74 2.05 1652 2 37 2 31 42.62 65.75
U5x0) 25.44 1-95 1762 249 2.27 43.73 65.00
U5x (2) 25.41 1.94 17.35 2 52 2.32 43.99 65.86
1/10x0} 26.13 2 04 18.06 2.36 2.55 42.43 64.10
1/10x Í2) 25.62 1 98 17.53 2 48 2.44 43.52 65.51
1/20x0) 25-77 2.01 17 9? 245 2.34 42.94 65.21
1/20x {2) 25-55 2.03 18.45 2.42 2.24 42.78 66.05
1/50x0} 25.26 1.96 17.64 2.65 2.18 44 07 66.41
1/5OX (2) UI Oth 25.48 1.95 17.58 2 50 230 43.72 65.93
0) 1/100« 2560 1.93 17,00 2.62 2.23 44.36 Ê5.37
(2) 1/50&X 25.59 1.96 17.37 2 56 2.26 43.00 65.18
0) U500X 25.54 1.99 18 11 2.45 2.20 43.00 65.05
¢2) 25.55 2.00 18.59 2 36 2.10 42.66 64.57
G 5x0} 25 74 1.95 17.58 237 2.08 43.04 63.66
5M2) 25.79 1 89 16.63 2 51 204 43.69 63.67
ΐχΐυ 25.01 T-90 16.69 2 52 2.05 43.42 64.95
1x{2) 25 71 1.91 1674 2.57 1.96 43.85 65.37
1/2x (1) 2547 1.93 17.14 2.52 1.97 43.69 64.26
204/208
Eicperiioento « de 4 de Ψ de ln3) % de %
Coniunto A1CSTRA. 16:0 ARA EPA DPA ' DPA DHA gordura
1/2x (2) 25.6B 1 95 17.80 2.42 1 94 42.76 64.15
1/5X(1) 25 63 1.94 17,43 2.46 2.02 43.21 53.70
1/5» (2) 25 86 1.91 17 03 2.47 2.04 43.16 64.14
1/1 Οχ ¢1) 26.34 1.95 17.09 2.48 2.1* 4235 63.27
1/10X (2) 26.24 1.93 16.79 752 2.04 42 93 64.71
1/20x (1) 25.47 1.97 1806 237 2,12 42.62 63.38
1/Mx (2) 25.86 1 98 1816 240 1 95 42 73 62.81
iraox tu 25.46 1 94 18.06 2.37 2 02 42.72 63.38
i/90x{2) 2550 1 94 17,46 2.46 2 04 43.15 63.66
V100x
(Ί 25 52 1-92 16,69 2.60 1-81 44 16 85.74
IHQOí
(2) 25.96 1.92 17.11 2.48 1.96 43.00 63.89
1/5Q0X
(1) 2571 195 17-78 2.41 1.97 42 63 64.61
1/50QX
(2) 25.56 2.02 18.25 2.37 1.90 *2 63 64 80
1/SQOx
H (’) 2S.1Ô 2 03 19.36 2.14 2.02 41.86 55.21
1/ÇOQx
¢2) 25.41 1.9* 17.05 2.37 1.83 43.31 65.75
Dx(1] 21.45 262 27.54 1.31 2.5D 35.78 67.33
Dx(21 21.79 2.63 27.33 1.30 2.51 35 68 67.07
1/500*
1 ¢1) 25.21 2 02 19.09 2.15 2.10 41.48 64.17
1/500x
(2) 25.00 2 02 20.00 2.11 2.09 41.63 64.04
Ox(1] 21.52 2.62 25.55 1.20 2.61 34.16 67.22
0x (21 21.66 2-64 25.03 1.18 2.55 34 20 66.93
1/500-x
J tn 24.44 1.81 16.75 2.49 2.22 *520 63.43
V500x
¢) 24.34 1.02 17.73 2 39 1.95 44.71 6388
Ox<1] 21 56 2.58 26.98 1.30 2.6D 3604 66.74
Ox(Z) 21 53 2.61 27.30 1.31 2.43 35 96 65.71
ItóOtht
K Π) 23.87 162 17.33 2.46 2.00 45.45 64.67
V500x
(2) 24.07 1.62 17.6? 2.42 1.93 45.06 6* 30
Ox <1) 21.77 2 63 26.13 1.39 2.ai 36 49 68.14
0xJ3 21.91 2 63 27.19 1.29 2.63 3560 68.81
Experimento Rend. de Rend. tfl/L) mg/g OHA (9l·) g B12J g/l de
Coniunto AMOSTRA EPA (g/l> mg/g EPA de DHA LFDW g Lf-DW gordura
A 5x(1} 0.53 107,6* 1.39 291.68 1 62 0.0024 3.32
5x(2) 0.50 105.B3 1.28 282.95 1.60 0.0024 3.11
lx(1J 0.49 105.99 1.26 282.93 1.56 0.00049 3.06
U(2) 0.47 106,77 1.17 275.34 1 52 0,00051 2.08
1/&Í1) 0.47 107,06 1.17 275.98 1.52 0.00025 2.8B
1/Zx(2) 0.51 110.04 1 26 283.39 1.55 0.00025 3.09
1/5x (1j 0.50 1Q8.74 . 1.26 284.18 1 54 0.00010 307
1/5x{2} 0.48 105.63 1.22 282.95 1 52 000310 2.96
1/l0x (1J 0.48 106.01 1.20 275 47 1 58 0.000049 294
1/Wx<2) 0.48 105.07 1.22 278-5B 1 57 0.000049 2 97
1/20x<1] 0.48 107.36 1.19 276.71 1.5* 0.000025 2 95
i/20x (2) 0 51 108.87 1.28 2B2.24 1 57 0.000024 3.06
1/SDx (1) 0.48 109-87 1.16 270.77 1,47 0.000010 2 86
1/5Qx (21 UlOOx 0.48 106-19 1.19 276.95 1,58 O.OOOOW 2.93
1/100* 0.50 106.01 1.27 253.69 1 57 D.0000049 3.07
(31 0.50 104.11 1.34 288.85 1 61 0.0000048 3.21
IlíOOx (1) 0 50 104.68 1.35 290.83 1.59 0.00000094 3.23
205/208
Experimente Rend. de Rend. (9^-) íng/g OHA (9l·) 0 B12J g/l de
Eon5unto AIDSTRA 1/fiMrc EPA (g/l) mg/fl EPA de ΠΗΑ LFOW g LFDW g-o-rdura
(2) 0.51 109.40 1 23 27401 1.64 0.00000091 3.04
B 5« (1) 0.49 105 34 126 279.16 1.66 0.0023 2.97
5« (2) 0.48 99.71 1 29 273 81 1,31 00021 3-02
U(1) 0.40 101.34 1.27 274.22 1.77 0.00044 3.00
ix{2j 0.49 103.10 1.26 274,39 1.74 0.00044 2.98
1/2« (1) 0.52 102,99 1 39 286.04 176 O.O0O22 3.24
1/2« (2) 0.51 105.75 1 30 27B.33 1-76 D.0002Z 3.06
1/5« (1) 0.48 101.33 1.24 269.37 1.80 0.000033 2.94
1/5« (2) 0.40 104.41 1 25 277,49 1-67 0.000090 2-95
1/1ÜX (1) 0.45 98.98 1.20 272.75 1.71 0.000045 2.64
via* ¢2) 0.43 99.38 1.31 277.29 1.80 O.OC0043 3.08
1/20« ¢1) 0,47 100.10 1.25 276.16 172 0.000622 2.94
1/20« (?) 0.43 103.06 1 28 280 15 1,68 0.000023 2.97
V50* (1) 0.4B 103.37 1.22 269.42 1.78 0.0000035 291
1/50« (2) 1/100« 0.47 99.90 1.25 274.84 1.74 0.0000086 2.93
<υ 1/100« 0.46 98.77 1.20 267 53 1.77 0.0000043 206
(2) 1/500« Q.4B 101.29 1.27 278 11 1.71 Q.0QQ0O45 2.99
. (1) 1/500« 0.43 1Q4.49 1.04 253.03 1.63 0.00000092 2.53
Í3L 5* (D Qj47 107.03 1.11 262.14 1.67 0.00000090 2.63
C D.52 103.25 1.37 292.82 1.57 0.0025 3 22
5« (2) 0.49 106.70 1.29 287.91 1.53 0.0025 3.06
1ϊ(1) 0.51 WBBa 1.35 28931 1.59 OOW48 3.23
1x(2) 0.52 108.67 1.31 284.09 1.60 0.00043 3.15
1/2x{1) 0.44 114.02 1.00 288.13 1.35 0.00028 2.46
1/2* (2) 0.49 113,31 1.15 275.95 1.46 0 00026 2.82
V5í(1) 0-50 115.35 1.19 281.94 1.44 Q.OOT10 2.89
1/5« (2) 0.50 112.25 1.21 279 43 1.52 0.DOOÍO 2.93
1/IQx (1) 0.43 110.70 1.17 277.71 1.50 0.000051 2.85
1/1Qx (2) 0.4 B 110.39 1.20 281.73 1.50 0 000051 2.89
1/20x (1) 0.45 112.23 1.08 273.88 1.41 0000027 2.62
1/2üx (2) 0.45 119:57 0.95 262.65 1.33 0 000029 2.39
1/50X (1) 0.49 112.42 1 21 282.97 1.49 0.000010 2.91
1/50x (21 1/100« O.50 111.4Q 1.23 280.41 1.53 O.00O010 2.96
(1) 1/100« 0.51 109.40 1.25 278.02 1.51 Q.QOOCQ48 3.02
(21 1/500Χ 0.51 11103 1.29 286.48 1.53 0.OOOÜQ5Ü 3-09
ÍD 1/500« 0.55 114.30 1.29 276.88 1.65 0.00000091 3.15
(2) 0.56 113,05 1.27 . 276.28 1.61 □ 00000093 3.11
D 5x<1) 0.55 107,16 1.48 296.18 1.69 0.0023 3.44
5x (2) Q.53 103.39 1.38 291.37 1.62 0.0024 324
1<(1) 0.52 110.03 1.33 283.89 1.59 0.00048 3.13
1«<2) 0-50 108.83 1.29 29026 1.54 0.00050 3.03
1/2*(1) 0.51 112.05 1.23 231.00 1.57 0 00024 2.94
1/2« (2) 0.51 117,57 1.20 264.69 1.45 0.00026 2.89
1/5« (1) 0.33 116.92 1 26 285.74 1.51 ο.αοοιο 3.03
1/5* (2) 0-55 110.50 1.42 290.20 1.87 0.000090 3.34
1/10« (1) 0.54 112 52 1.34 28520 1.64 0,000047 3.19
VIOx (2) 0.53 111.48 1.36 291.77 1.5B 0.000049 3.19
1/2t)x(1) 0.54 112.02 1.34 285 86 1 63 0000023 3.17
1/20« (2) 0.52 117.13 1.21 278.32 1.55 0.000025 2.91
1/50« (1) 0.54 111.32 1.37 292.53 1.59 0.0000094 3.22
1/50« (2) 1/100« 0.52 110.19 1.29 283.91 1.82 00000093 3-05
tn 0-52 111.21 1 30 28B.73 1.59 0.0000043 3.08
1/100« 0 51 109.75 1.31 28774 1.59 0.0000043 3.07
206/208
Experimento Rand. de Rerid. de ΠΗΑ t .30 1 37 (0/L) mg/g DHA 263.11 261.74 (g/t) LFDW 1 69 1.70 0 B1SJ gLFÜW O.OOOOOOB9 O.O00O00B8 g/l de gordura 3.31 3.27
Conj-unto A13DSTRA (2} 1/50ÜX (D 1/5OD» (2} EPA (g/l) O5Í 0.50 mg/g EPA 119,41 118.98
E 5«(υ 0.53 105 94 1.43 294.23 1.69 0.0023 3.29
5x (2) 0.46 102.13 1.22 281 ta 1.63 0,0024 284
1X (1) 0.49 104.07 1.32 289.48 1,62 0.00048 3.06
1x(2) 0.53 104.97 1.4? 301.01 1 63 0.00047 3.37
1f2x (1] 0.50 110.46 1.25 26465 1.58 0.D0024 2,94.
V2x{2) 0.51 112.01 1.26 284.34 1.60 Q.00024 2.97
1(5* <1) 0.51 109.31 1.32 291.38 1.60 Q.OOOÜ94 3,06
1/5* (2) 0.43 106.13 1.24 281.31 1.65 0,000091 2.89
1/10* (1) o.so 105.82 1.30 283.74 1,66 0-000045 3.84
mo* <2> 0.4B 104.57 1.29 286.39 1,64 0-000047 2.9B
1/20* (1> 0.55 110.12 1.41 292-12 1.69 D.ODOOZ2 326
i/20x (2)· 0.57 113.13 1.43 293-02 1.70 0.000022 3.32
1/50* (1) 0.54 106.44 1.45 294.03 1.76 0.0000085 3.31
1/50* (2) 1/1B0* 0.54 107.21 1.44 235.14 1.72 O.OÜDOOBZ 3.29
¢0 V10Q* 0.55 104.56 1.46 288.40 1.88 0-0000041 3 33
(2} 1/500x 0.55 109.40 1.44 291-25 1,76 0.0000044 3 30
(1} 1/500« 0.59 113.27 1 50 296.97 1.76 0,00000005 343
(2) 0.65 11509 1.62 291.79 1,97 0.00000078 373
F 5* (lí 0.60 114.57 1.49 292.02 1.80 □-00212779 3.42
5« {2) 0.55 113.41 1.40 294.25 1.87 0.00229637 3.20
1X(1) 0.55 11 Q.20 1.45 297.11 1.70 0.00045415 3.30
fxffi 0.54 112.21 1.35 290.41 1.66 0,00046376 3.13
1/2x (1) 0.54 116.20 1.27 285.64 1.58 O.Ü0024017 2.97
1/2x (2) 0.55 121.79 1 25 2B6.25 1.54 0.00024686 2.95
i/5x (D 0.58 115 91 1.43 294.68 1,70 0.00008801 3 28
1/5x (2) 0.56 114.29 1.42 296.75 1.87 0.00008979 3.23
1/10* ¢1) 0.5? 115.79 1 21 27551 1.60 0.00004803 2.86
1/10* (2) 0.56 11.4 86 1.38 291 97 1,67 OOOOD4619 3.17
1/20* (1) 0.55 117.21 1.31 286.75 1.63 0.00002328 3.06
1/20X ¢2) 0.57 121.64 1.33 289.39 1.B0 0 00002351 3.11
1/50* (1) 0.58 116.45 1 45 299.09 1 67 0.00000901 3.29
1/50* (2) 1/100* 0.56 115.90 1 40 295.17 1.66 0.00000904 3.21
(U 1/100* 0.55 111.13 1.44 296.95 1.72 0,00000440 3.25
(2) 1/500* 0.54 113.25 1.36 292.35 1.66 0.00000463 5.11
0) 1/500* 0.60 117.81 1.43 286.97 1.78 0.00000084 3.31
(2) 0.63 120.03 1.45 282.05 1.88 0.00000080 3.40
G 5x(1] 0.55 111.96 1.35 279,27 1.7a 0.00215168 313
5* (2) 0.55 107.14 1.42 283.43 1.85 0,00207251 3.25
1X(1J 0.54 106.42 1 41 287,31 1.75 0,00043883 3.25
1x(2J 0.57 109.44 1 50 292.04 1.81 000042495 3 42
1/2*{1! 0.57 110.17 1.45 286.10 1.85 O.OÚ020558 3.33
1/2* (2) 0.50 114.19 1.39 279.49 1-82 ΟΌΟΟ20874 3.26
1/5*(1} 0.57 111.03 1.41 2B0.46 1,86 000008062 3.27
1/5x (2) 0.55 109.25 1.39 282.05 1.80 000008326 3.22
1/lQx(1) 0.55 106,14 1.35 273.02 1.86 000004134 3.21
1/tÇ* (2) 0.55 106 66 1.41 283.05 1.79 □ 00004313 3.27
1/20* (1) 0.59 114.45 1.39 27522 1.88 0.00002023 3.25
1/20* (2) 0.60 114.04 1.41 273.40 1.95 0,00001951 3.29
1/50* (1} 0.59 114.46 1.39 275.82 1.88 0.OQ0D0797 325
207/208
Expariroento RemS l. de Rand. tg/L) mjj/g OHA (9flJ gBW g/l de
Coniunto AUDSTRA EPA (g/i) mata EPA de DHA LFDW gLFDW gordura
1/5Qx ¢2) 0.57 111.16 1.40 279.89 1 85 0.00000612 324
1/lOQx (U 0.56 109.75 1.47 295.79 1.73 0.00000444 3.33
VlOOx (2) 0.50 1Q9.31 1,41 27992 1.85 0.0QOOD415 3,28
1/SOÜx 0.60 114 86 1.44 281.92 1 84 0,00000081 3.36
1/SO0x (2) 0.60 118.27 1.41 281.47 1.79 O.OQD00084 3.31
H 1/500X (D 0,50 126.25 1 29 279.17 1.64 0.00000092 3.07
1/500* (2) 0.59 117.35 1 44 291.28 1.74 0.00000006 3.33
Ox ¢1) 0.91 186-81 1.10 243.20 1.56 Q.OO0O00O0 3.29
. 0* ί2ί_______ 1/500« (i) 0 92 183.32 1.20 244.63 1.65 0.00000000 3.36
i 0.62 127.64 1.29 272.24 1.74 0.00000006 3.12
1/SOOx (2) 055 12805 1.36 272.66 1.83 D.00000082 3.27
0x(1} 0.97 191-93 1.16 234.37 1.66 Q.OODODOOO 3.40
Ox í2) 0.99 192.97 1.18 234.10 1.70 O.QOOOÜ000 3.44
J 1/SOOx (D 0.56 106.22 1 52 202.66 1.94 O.MQDO077 3.37
1/500« (2) 0.62 113-25 1.57 291.57 . 1 96 0.00000076 3,60
cw d) 0.95 179.92 1.27 245 50 1.75 0.00000000 3.52
0« (2J 1/500« (’) 1.00 179.36 1.32 241,17 1.91 O.OOO0O0M 3.87
K 0.60 112,09 1,56 296 08 1.68 0.00000080 3.44
1/500« (2) 0.61 113.60 1.55 293-84 1.90 0-00000079 3-43 ‘
0x(1) 0.94 172.82 1.31 244.79 1.84 0.00000000 3.59
0xí2} 097 181,66 1.27 241.23 1.78 0.00000000 3.56
208/208 [238] Conclusão: O crescimento de PTA-10208 e a produtividade de EPA não se alteram em concentrações de vitamina B12 que variam entre 5x (3,84 mg/l) e 1/500x (0,0015 mg/l) em DSDFM-O a CO2 10%. No entanto, quando a vitamina B12 é completamente removida de DSDFM-O, o % de EPA aumenta por cerca de 50%, enquanto o peso seco e o % de gordura também aumentam ligeiramente, resultando em um aumento de 60% na produtividade de EPA.
[239] Todos os vários aspectos, modalidades e opções aqui descritos podem ser combinados em qualquer e todas as variações.
[240] Todas as publicações, patentes e pedidos de patente mencionados nesse relatório descritivo são aqui incorporados por referência no mesmo grau como se cada publicação, patente ou pedido de patente individual fosse específica e individualmente indicado para ser incorporado por referência.

Claims (17)

REIVINDICAÇÕES
1. Biomassa de um micro-organismo que possui ácidos graxos e uma concentração de EPA, caracterizada pelo fato de que a referida biomassa é produzida por um método que compreende:
(A) a fermentação do microrganismo em um vaso fermentador para produzir biomassa; e (B) fornecer uma pressão sobre a biomassa maior ou igual a 3,44 KPa (0,5 psi) acima da pressão atmosférica durante um período de tempo suficiente para aumentar a concentração de EPA na biomassa.
2/5 (a) a fermentação do micro-organismo em um vaso fermentador para produzir biomassa, em que o microorganismo compreende um Traustoquitrídeo que produz uma biomassa que possui pelo menos 3% de EPA do peso total dos ácidos graxos; e (b) atingir um nível desejado de EPA na biomassa por (i) ajuste da quantidade de biomassa no vaso, e (ii) opcionalmente ajustar a pressão na biomassa.
2. Biomassa de um micro-organismo que possui ácidos graxos e uma concentração de EPA, caracterizada pelo fato de que a referida biomassa é produzida por um método que compreende:
(a) a fermentação do micro-organismo em um vaso fermentador para produzir um caldo de fermentação tendo uma fase aquosa e biomassa, em que a fase aquosa possui um gás dissolvido, em que o micro-organismo compreende um Traustoquitrídeo que produz uma biomassa que possui pelo menos 3% de EPA do peso total dos ácidos graxos; e (b) atingir um nível desejado de EPA na biomassa por (i) ajuste do CO2 dissolvido a >2% do gás dissolvido, e (ii) opcionalmente ajustar a pressão na biomassa e (iii) opcionalmente ajustar a temperatura do caldo de fermentação.
3/5 produz uma biomassa que possui pelo menos 3% de EPA do peso total dos ácidos graxos; e (b) atingir um nível desejado de EPA na biomassa por (i) ajuste dos níveis de CO2 no gás e (ii) opcionalmente ajustar a pressão na biomassa.
3. Biomassa de um micro-organismo que possui ácidos graxos e uma concentração de EPA, caracterizada pelo fato de que a referida biomassa é produzida por um método que compreende:
4/5 produzir uma biomassa.
4. Biomassa de um micro-organismo que possui ácidos graxos e uma concentração de EPA, caracterizada pelo fato de que a referida biomassa é produzida por um método que compreende:
(a) a fermentação do micro-organismo em um vaso fermentador, para produzir um caldo de fermentação e uma biomassa, em que o micro-organismo compreende um Traustoquitrídeo que produz uma biomassa que possui pelo menos 3% de EPA do peso total dos ácidos graxos; e (b) atingir um nível desejado de EPA na biomassa por (i) ajuste da temperatura no caldo de fermentação, e (ii) opcionalmente ajustar a pressão na biomassa.
5/5 alimentação é uma ração para animais.
5. Biomassa, de acordo com a reivindicação 4, caracterizada pelo fato de que a temperatura é ajustada para menos que cerca de 30°C.
6. Biomassa de um micro-organismo que possui ácidos graxos e uma concentração de EPA, caracterizada pelo fato de que a referida biomassa é produzida por um método que compreende:
(a) a fermentação do micro-organismo em um vaso fermentador, compreendendo gás, para produzir uma biomassa, em que o micro-organismo compreende um Traustoquitrídeo que
7. Biomassa de um micro-organismo que possui ácidos graxos e uma concentração de EPA, caracterizada pelo fato de que a referida biomassa é produzida por um método que compreende:
(a) a fermentação do micro-organismo em um vaso fermentador, compreendendo gás, para produzir uma biomassa, em que o micro-organismo compreende um Traustoquitrídeo que produz uma biomassa que possui pelo menos 3% de EPA do peso total dos ácidos graxos; e (b) suplementar o gás com CO2 suficiente para aumentar a concentração de EPA na biomassa.
8. Biomassa de acordo c om a reivindicação 7, caracterizada pelo fato de que a quantidade de CO2 é superior ou igual a 2% (mol) do gás na câmara e a concentração de EPA na biomassa é aumentada para mais de
cerca de 4%, em peso , do peso total dos ácidos graxos.
9. Biomassa de acordo com a reivindicação 8, caracterizada pelo fato de que a concentração de EPA é aumentada em mais do que cerca de 4% até cerca de 45%, em peso, do peso total dos ácidos graxos.
10. Biomassa de um microrganismo com ácidos graxos e uma concentração de EPA, caracterizada pelo fato de que a referida biomassa é produzida por um método compreendendo o crescimento do microrganismo em um meio de cultura que compreende menos do que 0,1 mg/L de vitamina B12 para
11. Óleo extraído de uma biomassa como definida em qualquer uma das reivindicações 1 a 10, caracterizado pelo fato de que a biomassa é produzida a partir de um microorganismo isolado depositado sob o número de acesso ATCC PTA-10208, em que o óleo compreende ácidos graxos em que os ácidos graxos compreendem adicionalmente ácidos graxos poli-insaturados ômega-3, em que os ácidos graxos poliinsaturados ômega-3 compreendem DHA e EPA em uma quantidade de cerca de > 90%, em peso, da quantidade total de ácidos graxos poli-insaturados ômega-3 e da quantidade de EPA, em peso, que é de cerca de 6% até cerca de 65% da quantidade total de EPA e DHA.
12. Óleo de acordo com a reivindicação 11, caracterizado pelo fato de que o referido óleo é um óleo bruto extraído a partir da biomassa, sem processamento adicional.
13. Óleo de acordo com a reivindicação 11, caracterizado pelo fato de que o referido óleo é um óleo refinado.
14. Produto para alimentação, caracterizado pelo fato de que compreende uma biomassa como definida em qualquer uma das reivindicações 1 a 10 ou um óleo como definido em qualquer uma das reivindicações 11 a 13.
15. Produto para alimentação de acordo com a reivindicação 14, caracterizado pelo fato de que o referido produto alimentar é um suplemento alimentar humano ou animal.
16. Produto para alimentação de acordo com a reivindicação 14, caracterizado pelo fato de que a referida
17. Produto para alimentação da reivindicação 14, caracterizado pelo fato de que a referida alimentação é uma alimentação de aquicultura.
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