JP6998934B2 - 脂質含有細胞から脂質を単離する方法 - Google Patents

脂質含有細胞から脂質を単離する方法 Download PDF

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Description

本発明は、脂質含有細胞から多価不飽和脂肪酸含有脂質を単離する方法に関する。
ＰＵＦＡ（多価不飽和脂肪酸）含有脂質は、飼料、食品及び医薬品の業界において非常に興味深いものである。乱獲により、魚油以外のＰＵＦＡ含有脂質の代替の供給源が非常に必要とされている。特定の酵母及び藻類の株に加えて、特にトラウストキトリアレス（Ｔｈｒａｕｓｔｏｃｈｙｔｒｉａｌｅｓ）目のもののような微細藻類の細胞が、ＰＵＦＡ含有脂質の非常に優れた供給源であることがわかった。
しかし、ＰＵＦＡ含有脂質を産生する微生物、特にトラウストキトリアレス目の細胞に関しては、細胞からの油の単離が特定の問題として判明した。油を単離する最も効果的な方法は、ヘキサンのような有機溶媒の使用であった。しかし、有機溶媒の使用は危険な操作条件をもたらし、高価な防爆装置の使用を要求し、さらに、環境の汚染を回避するために高価な溶媒回収プロセスの実行を要求する。
有機溶媒の使用を回避する試みにおいて、油を単離する効果的な代替の方法として、多量の塩化ナトリウムを用いた油の塩析が判明した。しかし、多量の塩化ナトリウムを使用すると、脱脂バイオマスの副産物が生じ、これは、多い塩含有量により、飼料成分として利用することができないため、このプロセスはあまり持続可能ではない。さらに、高い塩濃度は、使用される鋼製装置の急速な腐食をもたらす。
ＷＯ２０１５／０９５６９４ ＥＰ１３１７６６６１．０ ＥＰ１３１８７６３１．０ ＷＯ２０１６／０５０５６０ ＷＯ９１／０７４９８ ＷＯ９４／０８４６７ ＷＯ９７／３７０３２ ＷＯ９７／３６９９６ ＷＯ０１／５４５１０ ＵＳ７，７３２，１７０
Ｋｌｅｉｎ：Ｓｅｉｆｅｎ，Ｏｌｅ，Ｆｅｔｔｅ，Ｗａｃｈｓｅ ９４，１２（１９６８） ｔｈｅ ｔｅｘｔ ｂｏｏｋ"ＴｅｉｌｃｈｅｎｇｒｏＢｅｎｍｅｓｓｕｎｇ ｉｎ ｄｅｒ Ｌａｂｏｒｐｒａｘｉｓ"［Ｐａｒｔｉｃｌｅ ｓｉｚｅ ｍｅａｓｕｒｅｍｅｎｔ ｉｎ ｔｈｅ ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ］ｂｙ Ｒ．Ｈ．Ｍｕｌｌｅｒ ａｎｄ Ｒ． Ｓｃｈｕｈｍａｎｎ，Ｗｉｓｓｅｎｓｃｈａｆｔｌｉｃｈｅ Ｖｅｒｌａｇｓｇｅｓｅｌｌｓｃｈａｆｔ Ｓｔｕｔｔｇａｒｔ（１９９６） ｔｈｅ ｔｅｘｔ ｂｏｏｋ"Ｉｎｔｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｔｏ Ｐａｒｔｉｃｌｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ"ｂｙ Ｍ．Ｒｈｏｄｅｓ，Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ（１９９８）
従って、脂質含有細胞、特にトラウストキトリアレス目の脂質含有細胞から脂質、特にＰＵＦＡ含有脂質を単離すると同時に、バイオマスからの油の効果的な単離を実現させるために、有機溶媒の必要性を回避するだけでなく、多量の塩の必要性をさらに回避する効果的な方法を提供することが本発明の目的であった。さらに、脂肪酸エステルの同時鹸化も、好ましくは回避されるべきである。
脂質含有細胞、特にトラウストキトリアレス目の脂質含有細胞から脂質、特にＰＵＦＡ含有脂質を単離すると同時に、商業的に、好ましくは農業分野において利用することができる脱脂バイオマスを提供する方法を提供することが本発明のさらなる目的であった。
本発明の目的は、本発明の方法によって実現される。
従って、本発明の第１の対象は、多価不飽和脂肪酸（ＰＵＦＡ）含有脂質を得る方法であり、当該方法は、以下の：
ａ）ＰＵＦＡ含有脂質を有する細胞を含むバイオマスの懸濁液を提供するステップ；
ｂ）（ａ）の懸濁液を、５０℃から７０℃の温度、好ましくは５５℃から６５℃の温度まで加熱し、懸濁液に細胞壁分解酵素を添加し、さらに、必要に応じて酵素が適切に作動するのに適したｐＨ値に調整するステップ；
ｃ）少なくとも１時間、好ましくは少なくとも２時間、より好ましくは２から４時間、温度及びｐＨを（ｂ）に示される範囲内で維持するステップ；
ｄ）全乾物含量が３０から６０重量％、より好ましくは３５から５５重量％、特に４０から５０重量％に達するまで、１００℃以下、好ましくは７０℃から１００℃、より好ましくは８０℃から９０℃の温度で水を蒸発させることによって、ステップ（ｃ）で得られた懸濁液を濃縮するステップ；
ｅ）ステップ（ｄ）で得られた懸濁液において、温度を８０℃から１００℃、好ましくは８５℃から９５℃、より好ましくは約９０℃に調整し、さらに、アルカリ化剤、好ましくは苛性ソーダを添加して、ｐＨ値を９．５から１１．５、好ましくは１０．０から１１．０、より好ましくは１０．３から１０．７に調整するステップ；
ｆ）少なくとも１０時間、好ましくは１５から４０時間、より好ましくは２０から３６時間、温度を（ｅ）に示される範囲内で維持し、必要に応じてさらなるアルカリ化剤、好ましくは苛性ソーダを添加することによってｐＨ値を９．０から１１．５、好ましくは９．０から１１．０、より好ましくは９．０から１０．５の範囲内で維持し、従って、懸濁液の解乳化を可能にするステップ；
を含む。
ステップ（ｅ）及び（ｆ）は、ステップ（ａ）、（ｂ）及び（ｃ）においてバイオマスの細胞を溶解することによって得られる油含有軽質相、並びに、水、細胞片、塩及び残油含有重質相の分離をもたらす。この軽質相及び重質相の分離は、本願に関して「解乳化」又は「乳化破壊」とも呼ばれる。
ステップ（ａ）及び（ｂ）における酵素処理によって、溶解された細胞のみを含む組成物、又は、細胞片とインタクト細胞との混合物を含む組成物が生じ得る。本発明の好ましい実施形態では、（バイオマスの細胞を溶解する前に存在するインタクト細胞の総数に関して）特に２０％未満、好ましくは１０％未満、より好ましくは５％未満の少量のインタクト細胞のみが、細胞を溶解するステップの後の溶解されたバイオマスにおいて存在する。
本発明によると、細胞壁分解酵素は、プロテアーゼ、セルラーゼ（例えば、Ｃｅｌｌｕｓｔａｒ ＣＬ（Ｄｙａｄｉｃ）、Ｆｉｂｒｅｚｙｍｅ Ｇ２０００（Ｄｙａｄｉｃ）、Ｃｅｌｌｕｃｌａｓｔ（Ｎｏｖｏｚｙｍｅｓ）、Ｆｕｎｇａｍｙｌ（Ｎｏｖｏｚｙｍｅｓ）、Ｖｉｓｃｏｚｙｍｅ Ｌ（Ｎｏｖｏｚｙｍｅｓ）等）、ヘミセルラーゼ、キチナーゼ、ペクチナーゼ（例えば、Ｐｅｃｔｉｎｅｘ（Ｎｏｖｏｚｙｍｅｓ）等）、スクラーゼ、マルターゼ、ラクターゼ、アルファ－グルコシダーゼ、ベータ－グルコシダーゼ、アミラーゼ（例えば、Ａｌｐｈａｓｔａｒ Ｐｌｕｓ （Ｄｙａｄｉｃ）；Ｔｅｒｍａｍｙｌ （Ｎｏｖｏｚｙｍｅｓ）等）、リゾチーム、ノイラミニダーゼ、ガラクトシダーゼ、アルファ－マンノシダーゼ、グルクロニダーゼ、ヒアルロニダーゼ、プルラナーゼ、グルコセレブロシダーゼ、ガラクトシルセラミダーゼ、アセチルガラクトサミニダーゼ、フコシダーゼ、ヘキソサミニダーゼ、イズロニダーゼ、マルターゼ－グルコアミラーゼ、キシラナーゼ（例えば、Ｘｙｌａｎａｓｅ Ｐｌｕｓ（Ｄｙａｄｉｃ）、Ｐｅｎｔｏｐａｎ（Ｎｏｖｏｚｙｍｅｓ）等）、ベータ－グルカナーゼ（例えば、Ｖｉｎｏｆｌｏｗ Ｍａｘ（Ｎｏｖｏｚｙｍｅｓ）、Ｂｒｅｗｚｙｍｅ ＬＰ（Ｄｙａｄｉｃ）等）、マンナナーゼ、及びその組み合わせから好ましくは選択される。プロテアーゼは、セリンプロテアーゼ、スレオニンプロテアーゼ、システインプロテアーゼ、アスパラギン酸プロテアーゼ、メタロプロテアーゼ、グルタミン酸プロテアーゼ、アルカラーゼ（サブチリシン）、及びその組み合わせから選択されてもよい。キチナーゼは、キトトリオシダーゼであってもよい。ペクチナーゼは、ペクトリアーゼ、ペクトザイム、ポリガラクツロナーゼ、及びその組み合わせから選択されてもよい。
酵素を利用するのに適したｐＨは、その酵素の至適ｐＨ次第である。酵素の至適ｐＨは、当業者には知られているか、そうでなければ容易に決定することができる。
本発明の好ましい実施態様では、６．５から８．５、好ましくは７．０から８．０、特に約７．５の至適ｐＨを有する酵素が使用されるため、このステップにおいて適用されるｐＨは、６．５から８．５、特に７．０から８．０、好ましくは７．３から７．７である。このｐＨの範囲で使用することができる好ましい酵素はアルカラーゼである。
酵素は、濃縮酵素液の添加後の懸濁液の総量に対して添加される濃縮酵素液の量に関して、好ましくは０．０１から１．５重量％の量、より好ましくは０．０３から１．０重量％の量、とりわけ０．０５から０．５重量％の量で、濃縮酵素液として好ましくは添加される。
本発明の好ましい実施形態では、細胞の溶解は、細胞に高い機械的ストレスを加えることなく行われ、これは、酵素処理によって実現することができる。本発明によると、溶解ステップにおいて細胞上に入力されるエネルギーは、好ましくは、懸濁液１トン当たり５０ｋＷｈ以下、特に懸濁液１トン当たり４０、３０又は２０ｋＷｈ以下、特に好ましくは懸濁液１トン当たり１５、１０又は５ｋＷｈ以下に達する。
酵素処理後に得られる懸濁液は、バイオマスの細胞によって遊離した水、細胞片及び油を有するが、その他に、さらなる成分、特に塩、インタクト細胞、溶解された細胞のさらなる内容物、並びに、発酵培地の成分、特に栄養分も含み得る。
当該方法の異なるステップ内では、異なる処置の順序は一般に重要ではない。
従って、ステップ（ｂ）において、酵素は、懸濁液を加熱する前若しくは後、及び／又は、ｐＨを調整する前若しくは後に添加することができる。同じ方法で、懸濁液の加熱は、ｐＨを調整する前又は後に行うことができる。しかし、好ましい実施形態では、とにかくｐＨの調整が必要であれば、酵素は、懸濁液の加熱後及びｐＨの調整後に添加される。非常に好ましい実施形態では、全ての処置が、大体同時に行われる。
類似して、ステップ（ｅ）における処置の順序は重要ではない。温度の調整は、ｐＨ値を調整する前又は後に行うことができる。
一般に、ｐＨ値の調整は、当業者には既知の塩基又は酸のいずれかを使用することにより本発明に従って行うことができる。ｐＨの低下は、特に、硫酸、硝酸、リン酸、ホウ酸、塩酸、臭化水素酸、過塩素酸、次亜塩素酸、亜塩素酸、フルオロ硫酸、ヘキサフルオロリン酸、酢酸、クエン酸、ギ酸、又はその組み合わせのような有機酸又は無機酸を使用することによって行うことができる。高含有量の塩化物は避けることが望ましいため、本発明の好ましい実施態様においては、本発明のプロセスにおいて、塩酸は使用されないか又は少量のみ使用される。本発明によると、硫酸が、ｐＨ値を下げるための好ましい物質である。ｐＨの上昇は、特に、水酸化物、特に水酸化ナトリウム、水酸化リチウム、水酸化カリウム及び／又は水酸化カルシウム、炭酸塩、特に炭酸ナトリウム、炭酸カリウム又は炭酸マグネシウム、及び／又は、重炭酸塩、特に重炭酸リチウム、重炭酸ナトリウム及び／又は重炭酸カリウムのような有機塩基又は無機塩基を使用することによって行うことができる。取り扱いの容易さのために、酸及び塩基は、液体の形で、特に濃縮溶液として好ましくは使用される。従って、苛性ソーダが、ｐＨ値を上げるための好ましい物質である。
好ましくは、当該プロセスの全てのステップにおいて、懸濁液は、スターラー及び／又はアジテーターを使用することによって連続的に混合される。当該方法のステップ（ｅ）及び／又は（ｆ）では、特に特許文献１に開示されているように、好ましくは低剪断撹拌及び／又は軸流撹拌が適用される。ステップ（ｅ）及び／又は（ｆ）に先立つ及びその間の撹拌に適した羽根車には、特に、直線羽根型羽根車（ｓｔｒａｉｇｈｔ ｂｌａｄｅ ｉｍｐｅｌｌｅｒ）、Ｒｕｓｈｔｏｎ羽根型羽根車、軸流羽根車、遠心羽根車、凹状羽根型ディスク羽根車、高効率羽根車、プロペラ、パドル、タービン及びその組み合わせが含まれる。
ステップ（ｄ）は、水の迅速な除去を可能にするために、（例えば、ドイツのＧＥＡから入手可能である）強制循環型蒸発器内で好ましくは行われる。
本発明による方法は、さらなるステップとして、ステップ（ｆ）で得られた解乳化された組成物からＰＵＦＡ含有油を収集するステップを好ましくは含む。
ＰＵＦＡ含有油の収集は、解乳化された懸濁液の中和、続いて、そのようにして得られた油含有軽質相の、水、塩及び細胞片含有重質相からの分離を好ましくは含む。
解乳化された組成物の中和は、酸、好ましくは硫酸を添加して、ｐＨ値を５．５から８．５、特に６．５から８．５、好ましくは７．０から８．０に調整することによって好ましくは実現される。重質相から軽質相の分離を開始する前に、そのようにして得られた中和された組成物は、数分から数時間まで、上記のｐＨ値で撹拌されてもよい。
水、塩及び細胞片含有重質相からの油含有軽質相の分離は、機械的手段によって、さらに、好ましくは６０～９０℃、より好ましくは７０～８０℃の温度、及び、好ましくは６～９、より好ましくは７～８．５のｐＨ値で好ましくは実現される。「機械的手段」は、特に、当業者には既知の濾過及び遠心分離の方法を指す。
油含有軽質相の分離後、そのようにして得られたＰＵＦＡ含有油は、当業者には既知の方法、特に精製、漂白、脱臭及び／又は脱ろうを適用することによってさらにワークアップすることができる。
本発明のプロセスの特定の利点は、いかなる有機溶媒も使用せずに、特にいかなる極性又は非極性の有機溶媒も使用せずに行うことができるということである。従って、本発明の好ましい実施形態では、バイオマスからＰＵＦＡ含有油を単離するために、有機溶媒、特に極性又は非極性の有機溶媒は使用されないか又は少量のみが使用される。典型的な有機溶媒は、ヘキサン及びエタノールである。
本発明の好ましい実施形態では、２重量％未満、より好ましくは１、０．５又は０．１重量％未満の非極性有機溶媒が使用される。本発明の特に好ましい実施態様では、非極性有機溶媒は全く使用されない。本発明の非常に好ましい実施形態では、２重量％未満の有機溶媒が使用され、一般には、１、０．５又は０．１重量％未満の有機溶媒が特に好ましい。本発明の特に非常に好ましい実施態様では、バイオマスからＰＵＦＡ含有油を単離するために、有機溶媒は全く使用されない。これは、特にこの実施形態に対して、本発明による方法において利用される懸濁液、並びに、上記の単一の方法のステップによって得られる全ての組成物が、非極性有機溶媒、好ましくは有機溶媒全般を、２重量％未満、より好ましくは１重量％未満、特に０．５又は０．３重量％未満の量で、とりわけ０．１又は０．０５重量％未満の量で好ましくは有するということを意味する。
本発明の方法のさらなる利点は、残りのバイオマスからの油の非常に効果的な分離を、バイオマスから油を塩析するために通常使用される塩化ナトリウムを添加することなく、実現することができるということである。好ましくは、この方法は、油を塩析するために塩化物塩を全く添加することなく、とりわけいかなる塩も添加することなく行うことができる。しかし、少量の塩化物塩、特に塩化ナトリウムが、バイオマスの増殖に使用される発酵培地のために、懸濁液に存在してもよい。
従って、本発明の好ましい実施形態では、油の単離を改善するために、塩化ナトリウムは使用されないか又は少量のみ使用される。本発明の好ましい実施形態では、バイオマスから油を単離するために、１重量％未満の塩化ナトリウムが使用され、より好ましくは０．５又は０．２重量％未満の塩化ナトリウムが使用され、とりわけ０．１又は０．０５重量％未満の塩化ナトリウムが使用され、ここで、重量％は、塩化ナトリウムの添加後の組成物の総重量に関する。これは、特にこの実施形態に対して、本発明による方法において利用される懸濁液、並びに、上記の単一の方法のステップによって得られる全ての組成物が、２重量％未満、より好ましくは１重量％未満、特に０．５又は０．３重量％未満の量、とりわけ０．１又は０．０５重量％未満の量の塩化ナトリウムを好ましくは有するということを意味する。
本発明の特に好ましい実施形態では、油の単離を改善するために、塩化物塩は全く使用されないか又は少量のみ使用される。この実施形態では、好ましくは１重量％未満の塩化物塩、より好ましくは０．５又は０．２重量％未満の塩化物塩が、バイオマスから油を単離するために使用され、とりわけ０．１又は０．０５重量％未満の塩化物塩が使用され、ここで、重量％は、塩化物塩の添加後の組成物の総重量に関する。これは、特にこの実施形態に対して、本発明による方法において利用される懸濁液、並びに、上記の単一の方法のステップによって得られる全ての組成物が、塩化物、特に塩化物塩を、２重量％未満、より好ましくは１重量％未満、特に０．５又は０．３重量％未満の量で、とりわけ０．１又は０．０５重量％未満の量で好ましくは有するということを意味する。
本発明の非常に好ましい実施態様では、一般に、油の単離を改善するために、塩は使用されないか、又は、少量のみ使用される。この実施形態では、好ましくは１重量％未満の塩、より好ましくは０．５又は０．２重量％未満の塩が、バイオマスから油を単離するために使用され、とりわけ０．１又は０．０５重量％未満の塩が使用され、重量％は、塩の添加後の組成物の総重量に関する。これは、特にこの実施形態に対して、本発明による方法において利用される懸濁液、並びに、上記の単一の方法のステップによって得られる全ての組成物が、２重量％未満、より好ましくは１重量％未満、特に０．５又は０．３重量％未満の量で、とりわけ０．１又は０．０５重量％未満の量で塩全般を好ましくは有するということを意味する。
本発明の方法は、細胞片及び発酵ブロスに含有される他の物質からのバイオマスに含有される油の非常に効果的な分離を可能にする。本発明の方法を使用することによって、バイオマスに含有される油のうち好ましくは８０重量％を超える、特に９０重量％を超える油を、バイオマスから分離し、さらに単離することができる。
本発明の方法を適用することによって得られる油は、これまでの最先端の開示されているＰＵＦＡ含有油と比較していくつかの有利な特徴を有するということが分かった。特に、上記の油は、非常に低い酸化状態、少ない含有量の遊離脂肪酸及び不純物、非常に低い粘度及び非常に高い引火点を示す。
従って、本発明のさらなる対象は、本発明による方法によって得られるか又は得ることができる油である。
従って、本発明のさらなる対象は、以下の特徴：ａ）０．５未満、好ましくは０．３未満、特に０．１５未満の過酸化物価；ｂ）１５未満、好ましくは１０未満のアニシジン価；ｃ）好ましくは、１重量％未満の遊離脂肪酸の含有量；ｄ）好ましくは、１重量％未満、好ましくは０．５重量％未満の水分及び不純物の含有量；ｅ）好ましくは、２５０ｃｐｓ未満、より好ましくは２００ｃｐｓ未満、特に１６０ｃｐｓ未満の粘度；ｅ）好ましくは、少なくとも３００℃、より好ましくは少なくとも３５０℃、特に少なくとも４００℃、とりわけ少なくとも４５０℃の引火点；ｆ）好ましくは、少なくとも３５重量％、好ましくは少なくとも４０又は４５重量％、とりわけ少なくとも５０重量％のオメガ３脂肪酸、特にＤＨＡ及びＥＰＡの含有量；ｇ）好ましくは、それぞれ少なくとも８重量％、好ましくは少なくとも１０重量％、とりわけ少なくとも１５重量％の量のＤＨＡ及びＥＰＡ；ｈ）好ましくは、０．５重量％未満、より好ましくは０．１重量％未満、特に０．０５重量％未満、とりわけ０．０１重量％未満の有機溶媒の量；ｉ）好ましくは、０．１重量％未満、より好ましくは０．０５重量％未満、特に０．０１重量％未満の塩化物の量；ｊ）好ましくは、９０重量％を超える粗脂肪の含有量を示すＰＵＦＡ含有脂質、特にＰＵＦＡ含有油でもある。
アニシジン価（ＡＶ）は、ＡＯＣＳ公定法Ｃｄ１８－９０に従って決定される。ＡＶは、油の酸化の間に発生するアルデヒド及びケトン等の脂肪酸の二次反応産物に対する尺度である。
過酸化物価（ＰＶ）は、ＡＯＣＳ公定法ＣＤ８－５３に従って決定される。ＰＶは、油の酸化の間に発生するペルオキシド及びヒドロペルオキシド等の一次反応産物に対する尺度である。本発明によると、ＰＶはｍｅｑ／ｋｇで測定される。
遊離脂肪酸の含有量は、ＡＯＣＳ公定法ＡＯＣＳ Ｃａ５ａ－４０に従って決定される。水分の含有量は、ＡＯＣＳ公定法ＡＯＡＣ９３０．１５、９３５．２９に従って決定される。不溶性不純物の含有量は、ＡＯＣＳ公定法ＡＯＣＳ３ａ－４６に従って決定される。ＤＨＡ及びＥＰＡの量は、ＡＯＣＳ公定法ＡＯＣＳ Ｃｅ１ｂ－８９に従って決定される。総脂肪量は、ＡＯＣＳ公定法ＡＯＣＳ９９６．０６に従って決定される。粗脂肪の量は、ＡＯＣＳ公定法ＡＯＡＣ９２０．３９、９５４．０２に従って決定される。
油の単離は、溶媒は使用されないか又は少量のみの溶媒を使用することによって、及び、塩化ナトリウムも使用されないか又は少量のみの塩化ナトリウムを使用することによって行われるため、副産物として得られる水相も、好ましくは、有機溶媒及び塩化ナトリウムを実質的に含まない。従って、水相は、油相の分離後に直接、又は、濃縮及び／又は乾燥のようなさらなるワークアップ後に、種々の方法で利用することができる。
従って、本発明のさらなる対象は、本発明による方法によって得られるか又は得ることができるバイオマス、好ましくは脱脂バイオマスを有するＰＵＦＡ含有水性懸濁液である。従って、本発明のさらなる対象は、この水性懸濁液を濃縮及び／又は乾燥することによって得られるか又は得ることができる濃縮物又は乾燥産物でもある。水性懸濁液を濃縮する場合、全乾物（ＴＤＭ）含量が２０から６０重量％に達するまで好ましくは乾燥される。以下において「本発明による水性懸濁液」という表現は、油相の分離後に得られる水相、並びに、この水相の濃縮によって得られるこの水相のいかなる濃縮された懸濁液も指す。以下においてさらに記載されるように、乾燥は、溶媒蒸発によって好ましくは行われる。
従って、本発明のさらなる対象は、１重量％未満、好ましくは０．５又は０．２重量％未満、より好ましくは０．１又は０．０５重量％未満、とりわけ０．０１重量％未満の非極性有機溶媒の含有量によって特徴づけられ、さらに、１重量％未満、好ましくは０．５又は０．２重量％未満、より好ましくは０．１又は０．０５重量％未満の塩化物イオンの含有量によって特徴づけられる、バイオマス、特に脱脂バイオマスの細胞片を有するＰＵＦＡ含有水性懸濁液でもある。
従って、本発明のさらなる対象は、特に、１重量％未満、好ましくは０．５又は０．２重量％未満、より好ましくは０．１又は０．０５重量％未満、とりわけ０．０１重量％未満の有機溶媒の含有量によって特徴づけられ、さらに、１重量％未満、好ましくは０．５又は０．２重量％未満、より好ましくは０．１又は０．０５重量％未満の塩化物イオンの含有量によって特徴づけられる、バイオマス、特に脱脂バイオマスの細胞片を有するＰＵＦＡ含有水性懸濁液でもある。
従って、本発明の好ましい対象は、１重量％未満、好ましくは０．５又は０．２重量％未満、より好ましくは０．１又は０．０５重量％未満、とりわけ０．０１重量％未満の非極性有機溶媒の含有量によって特徴づけられ、さらに、１重量％未満、好ましくは０．５又は０．２重量％未満、より好ましくは０．１又は０．０５重量％未満の塩化物イオンの含有量によって特徴づけられる、トラウストキトリドバイオマス、特に脱脂トラウストキトリドバイオマスの細胞片を有するＰＵＦＡ含有水性懸濁液でもある。
従って、本発明の特に好ましい対象は、１重量％未満、好ましくは０．５又は０．２重量％未満、より好ましくは０．１又は０．０５重量％未満、とりわけ０．０１重量％未満の有機溶媒の含有量によって特徴づけられ、さらに、１重量％未満、好ましくは０．５又は０．２重量％未満、より好ましくは０．１又は０．０５重量％未満の塩化物イオンの含有量によって特徴付けられる、トラウストキトリドバイオマス、特に脱脂トラウストキトリドバイオマスの細胞片を有するＰＵＦＡ含有水性懸濁液でもある。
上記の本発明の水性懸濁液は、２０から６０重量％、特に２５から５５重量％、より好ましくは３０から５０重量％の全乾物（ＴＤＭ）含量を好ましくは示し、そのようなものとして濃縮された懸濁液は、以下に記載される本発明の用途に特に適していると判明した。
本発明による「塩化物」は、検出可能な塩素の量を指す。存在する塩素の量は、例えば、ＤＩＮ ＥＮ ＩＳＯ１１８８５による元素分析によって決定することができる。塩素は、「塩化物」と呼ばれる塩の形で存在する。「塩化物イオン」とも呼ばれる本発明に従って言及される塩化物の含有量は、塩化物イオンに加えてカチオン性対イオンも含む完全な塩化物塩の量ではなく、検出可能な塩素の量のみを指す。
本発明の特に好ましい実施形態では、上記の油収集ステップにおける副産物として得られる水、塩、残油及び細胞片含有水相は、９０重量％を超える全乾物含量までバイオマスを乾燥することによって乾燥バイオマスに変換される。
従って、本発明のさらなる対象は、２重量％未満、好ましくは１、０．５又は０．２重量％未満、より好ましくは０．１、０．０５又は０．０２重量％未満の非極性有機溶媒の含有量によって特徴づけられ、さらに、２重量％未満、好ましくは１、０．５又は０．２重量％未満、より好ましくは０．１又は０．０５重量％未満の塩化物イオンの含有量によって特徴付けられる、ＰＵＦＡ含有バイオマス、特に脱脂ＰＵＦＡ含有バイオマスでもある。
従って、本発明のさらなる対象は、２重量％未満、好ましくは１、０．５又は０．２重量％未満、より好ましくは０．１、０．０５又は０．０２重量％未満の有機溶媒の含有量によって特徴づけられ、さらに、２重量％未満、好ましくは１、０．５又は０．２重量％未満、より好ましくは０．１又は０．０５重量％未満の塩化物イオンの含有量によって特徴づけられる、ＰＵＦＡ含有バイオマス、特に脱脂ＰＵＦＡ含有バイオマスでもある。
従って、本発明の好ましい対象は、２重量％未満、好ましくは１、０．５又は０．２重量％未満、より好ましくは０．１、０．０５又は０．０２重量％未満の非極性有機溶媒の含有量によって特徴づけられ、さらに、２重量％未満、好ましくは１、０．５又は０．２重量％未満、より好ましくは０．１又は０．０５重量％未満の塩化物イオンの含有量によって特徴づけられる、ＰＵＦＡ含有トラウストキトリドバイオマス、特に脱脂トラウストキトリドバイオマスでもある。
従って、本発明の特に好ましい対象は、２重量％未満、好ましくは１、０．５又は０．２重量％未満、より好ましくは０．１、０．０５又は０．０２重量％未満の有機溶媒の含有量によって特徴づけられ、さらに、２重量％未満、好ましくは１、０．５又は０．２重量％未満、より好ましくは０．１又は０．０５重量％未満の塩化物イオンの含有量によって特徴づけられる、ＰＵＦＡ含有トラウストキトリドバイオマス、特に脱脂トラウストキトリドバイオマスでもある。
好ましくは、調製は、非極性有機溶媒を使用せずに、好ましくはいかなる有機溶媒も全く使用せずに、さらに、塩化ナトリウムを使用せずに、好ましくは塩化物塩を全く使用せずに行われるため、結果として生じるバイオマスは、一般に、いかなる非極性有機溶媒も好ましくは含まず、いかなる有機溶媒も好ましくは含まず、さらに、いかなる塩化物イオンも本質的に全く含まず、ここで、「本質的に含まない」とは、０．１重量％未満の量で、特に０．０５重量％未満の量で塩化物イオンを有するということを意味する。
本発明によるバイオマスは、好ましくは１０重量％未満、好ましくは５重量％未満の含水量を示す。
そのようにして得られるバイオマスは、約３から約１４重量％、特に約４から約１４重量％の量、好ましくは約４．５から約１２重量％の量、より好ましくは約５から約１０重量％の量の脂質（粗脂肪）を好ましくは含む。さらに、脂質は、ＤＨＡ及びＥＰＡから選択される少なくとも１つのＰＵＦＡ、より好ましくはＤＨＡとＥＰＡの混合物を好ましくは含み、ＤＨＡ対ＥＰＡの比は、好ましくは３：２から４：１であり、ＤＨＡの量は、好ましくは、含有される脂質の総量の３０から５０重量％であり、ＥＰＡの量は、好ましくは、含有される脂質の総量の１０から２０重量％である。従って、上記の水性懸濁液は、１０重量％以下、好ましくは５重量％以下の含水量まで水性懸濁液を乾燥させることによりそのような粗脂肪含有量及び／又はＥＰＡ含有量及び／又はＤＨＡ含有量を有するバイオマスに乾燥させることにより変換可能であることによっても好ましくは特徴づけられる。
バイオマスは、好ましくは、１５から２５重量％の量、より好ましくは１７から２３重量％の量のアミノ酸をさらに含み、さらに、好ましくは、２５から３５重量％の粗タンパク質含有量を示す。従って、上記の水性懸濁液は、１０重量％以下、好ましくは５重量％以下の含水量まで水性懸濁液を乾燥させることによりそのようなアミノ酸及び／又は粗タンパク質の含有量を有するバイオマスに乾燥させることにより変換可能であることによっても好ましくは特徴づけられる。
バイオマスは、好ましくは、５重量％未満、好ましくは２重量％未満、より好ましくは約０重量％の粗繊維含有量をさらに示す。従って、上記の水性懸濁液は、１０重量％以下、好ましくは５重量％以下の含水量に水性懸濁液を乾燥させることによりそのような粗繊維含有量を有するバイオマスに乾燥させることにより変換可能であることによっても好ましくは特徴づけられる。
乾燥バイオマスは、好ましくは脱脂バイオマスであり、これは、好ましくは本願において開示されているプロセスによって脂質の大部分が除去されているバイオマスを意味する。バイオマスからの油の分離は非常に効果的であるため、バイオマスにおける残存油は、バイオマスに最初に含有されていた油の好ましくは２０重量％未満、好ましくは１５重量％未満、より好ましくは１０重量％未満である。しかし、そのようなプロセスによって油を完全に除去することはできないため、本発明による脱脂バイオマスにも相当量の油が依然として含有されている。それは、本発明による「脱脂バイオマス」という用語が、好ましくは本願において開示されているプロセス又は方法によって油の大部分が除去されているが、相当な部分の脂質、特にＰＵＦＡ含有脂質を依然として有する溶解されたバイオマスを指し、ここで、乾燥された脱脂バイオマスにおける脂質の量は、好ましくは３～１４重量％、特に４～１４重量％、好ましくは４．５～１２重量％、より好ましくは５～１０重量％であるということを意味する。従って、本発明による「脱脂バイオマス」は、「部分的脱脂バイオマス」又は「実質的脱脂バイオマス」とも呼ばれ得る。
従って、本発明のさらなる対象は、一般に、非極性有機溶媒を実質的に含まず、好ましくは有機溶媒を含まず、さらに、一般に、塩化ナトリウムを実質的に含まず、好ましくは塩化物塩を含まないバイオマスを得る方法であり、上述の方法のステップを含む。
９０重量％を超える全乾物含量までバイオマスを乾燥させることによる、油収集ステップにおける副産物として得られる水、塩、残存油及び細胞片含有重質相の乾燥バイオマスへの変換は、種々の方法で行うことができる。
非常に好ましい方法では、３０～５０重量％、好ましくは３５～４５重量％の乾物含量まで重質相を濃縮し、続いて流動層造粒によってバイオマスを噴霧造粒することによって転換は行われる。そうすることによって、非常に効率的な方法で、有利な特性を有するバイオマスを得ることができる。流動層造粒による噴霧造粒は、特許文献２においてより詳細に開示されている。
その方法で得られるバイオマスは、以下のいくつかのさらなる有利な特徴を有し：それは、（好ましくは少なくともグレード４の）優れた流動性、（好ましくはダストを含まない）低いダスト値（ｄｕｓｔ ｖａｌｕｅ）、好ましくは５００ｋｇ／ｍ３を超える高いかさ密度、及び／又は、少なくとも３５００ｋｃａｌ／ｋｇ、好ましくは約３８００から４２００ｋｃａｌ／ｋｇの高いエネルギー値を有する。
３０～５０重量％の乾物含量まで重質相を濃縮することは、溶媒蒸発、特に真空蒸発によって、及び／又は、ロータリー蒸発器、薄膜式蒸発器又は薄膜流下式蒸発器を使用することによって好ましくは行われる。溶媒蒸発に代わる有用な方法は、逆浸透法である。
粒状バイオマスの流動性を決定するために、異なるサイズの流出開口部を有する円錐型ガラス排出容器が使用される（非特許文献１）。ガラス容器は、７０ｍｍの高さ、３６ｍｍの最大内径、４０ｍｍの最大外径、及び、以下の直径：２．５；５；８；１２；１８；ｍｍを有するガラス容器の円錐形の端部にて円形開口部を示す。ガラス容器は、粒状バイオマスで完全に満たされ、続いて開口部が下に向けられてラックに固定される。好ましくは、ガラス容器の開口部は、ガラス容器をラックに固定させた後に開口部に位置する被覆を除去することによって開けられる。
流動性は以下のように決定される：粒状材料がよどむことなく最小直径（２．５ｍｍ）を有する容器から流出することができる場合、流動性は１と決定され；よどむことなく５ｍｍの直径を有する容器から流出することができる場合、流動性は２と決定される；等である。６の流動性は、粒状材料が最も広い直径（１８ｍｍ）を有する容器から全く流出することができないか、又は、よどみを有してのみこの容器から流出することができるということを意味する。従って、４の流動性は、粒状材料がよどむことなく１２ｍｍの直径を有する容器から流出することができるということを意味する。
本発明による「ダストのない」は、１００マイクロメートル以下の粒径のわずかな割合（＜１０重量％、好ましくは＜５重量％、特に＜３重量％、特に＜１重量％）のみ有する粉末を意味するとして理解される。
本発明の好ましい実施形態において、少なくとも８０重量％、特に少なくとも９０重量％、特に好ましくは少なくとも９５重量％、特に少なくとも９８重量％の割合のバイオマスの粒子が、１００から２５００マイクロメートル、好ましくは３００から２５００マイクロメートル、特に５００から２２００マイクロメートル、より好ましくは１０００から２０００マイクロメートルの粒径を有する。
バイオマスの粒子の平均粒径ｄ５０は、好ましくは５００から２２００マイクロメートルの範囲内、より好ましくは１０００から２０００マイクロメートルの範囲内、特に１３００から１９００マイクロメートルの範囲内にある。
粒度又は粒径は、レーザー回折分光法によって本発明に従って好ましくは決定される。あり得る方法が、非特許文献２及び非特許文献３に記載されている。様々な方法を使用することができるので、粒径の測定に対する非特許文献２からの最初に引用された使用可能な方法が好ましくは使用される。
本発明によるバイオマスのかさ密度は、好ましくは４００から８００ｋｇ／ｍ３、特に好ましくは４５０から７５０ｋｇ／ｍ３、特に５００から７５０ｋｇ／ｍ３である。
噴霧造粒に代わるものとして、濃縮された重質相の他の乾燥方法、特にトンネル式乾燥又は噴霧乾燥、特にノズル式噴霧乾燥のような他の対流乾燥方法、又は、ドラム乾燥のような接触乾燥方法、又は、赤外線乾燥のような放射乾燥方法が、適用可能な代替の方法であり、それらの方法を使用することによって、通常は、より小さな又はより大きな直径を有する粒子が得られる。
本発明によると、乾燥プロセスの間に、固化防止剤、特にシリカ、好ましくは疎水性又は親水性のシリカを、固化を防ぐためにバイオマスに任意的に添加することができる。このために、バイオマス並びにシリカを含む発酵ブロスが、特定の乾燥ゾーン内に好ましくは噴霧される。或いは又は加えて、バイオマスは、乾燥プロセスの後に固化防止剤と混合されてもよい。固化防止剤としてのシリカの使用に関しては、特に特許文献３を参照されたい。
特定の実施形態では、本発明によるバイオマスは、０．２から１０重量％、特に０．５から７重量％、特に０．５から５重量％の固化防止剤、特にシリカ、好ましくは親水性又は疎水性のシリカの濃度を有する。
粗粒でダストのない生成物への微細粒粉末の変換は、造粒プロセスによって実現することができる。結合剤、ゲル化剤又は増粘剤として食品加工又は飼料加工において典型的に使用されるデンプン、ゼラチン、セルロースの誘導体又は類似の物質等の従来の有機又は無機の補助剤又は支持体を、この後の造粒プロセスにおいて任意的に使用することができる。本発明に従って好ましく使用されるさらなる補助剤は、特許文献４において開示されており、カルボキシメチルセルロースが特に好ましい結合剤である。
従って、本発明の特定の実施形態では、バイオマスは、凝集補助剤、特に修飾多糖、好ましくはカルボキシメチルセルロースを、０．０５から１０重量％の量で、好ましくは０．１から５重量％の量で有する。
所望の粒径及び／又は粒径分布を有する生成物は、乾燥及び／又は後のふるい又は集塵による造粒によって得られる粒状物から任意的に得ることができる。
バイオマスの乾燥、任意的に造粒及び／又はふるいの後、乾燥バイオマスは、好ましくは貯蔵又は包装される。
本発明の粒状バイオマス並びに本発明の水性懸濁液は、種々の方法で使用することができ、例えば、本発明によるバイオマス及び水性懸濁液は、驚くべきことに動物によって、特に肉牛によって飼料成分として十分に受け入れられることが判明したため、食料品又は飼料原料を生成するために使用することができる。或いは、本発明の粒状バイオマス並びに本発明の水性懸濁液は、食料品又は飼料原料として直接使用されてもよい。
従って、本発明による粒状バイオマス又は水性懸濁液を含む飼料原料又は食料品は、本発明のさらなる対象である。飼料原料は、例えば、家禽、ブタ、ミンク、反すう動物、特に肉牛若しくは子牛、ヒツジ、ヤギ、コンパニオンアニマル、又は、養殖で保持されている動物を飼養するために使用されてもよい。本発明の非常に好ましい実施形態では、飼料原料は、肉牛を飼養するために使用される。飼料原料又は食料品は、２から６０重量％の量、好ましくは５から５０重量％の量、より好ましくは１０から３０重量％の量のバイオマスを好ましくは含む。
従って、本発明のさらなる対象は、同様に、食料品又は飼料原料を生成するための本発明による粒状バイオマス及び／又は水性懸濁液の使用である。
従って、本発明のさらなる対象は、同様に、本発明による粒状バイオマス及び／又は水性懸濁液が使用され、さらに、さらなる飼料原料又は食料品の成分と好ましくは混合される、飼料原料又は食料品を生成する方法である。
本発明の好ましい実施形態では、粒状バイオマス及び／又は水性懸濁液は、食料品又は飼料原料を生成するために使用され、ここで、バイオマス及び／又は水性懸濁液は、他の食料品又は飼料原料の成分と好ましくは混合され、次に、加工されて、食料品又は飼料原料が与えられる。
バイオマス及び／又は水性懸濁液と他の食料品又は飼料原料の成分との混合物は、販売の準備ができている食料品又は飼料原料の一部を得るために、押出し法によって好ましい実施形態において加工される。或いは、ペレット化の方法も使用することができる。
スクリュー押出機又は二軸スクリュー押出機が、押出し法において好ましくは利用される。押出し法は、８０～２２０℃、特に１００～１９０℃の温度、１０～４０バールの圧力、及び、１００～１０００ｒｐｍ、特に３００～７００ｒｐｍのシャフト回転速度で好ましくは行われる。導入される混合物の滞留時間は、好ましくは５～３０秒、特に１０～２０秒である。
本発明に従って好ましい押出し法のモードでは、該方法は圧縮ステップ及び加圧ステップを含む。
押出し法を行う前に成分を互いによく混合することが好ましい。これは、羽根を備えたドラム内で好ましくは行われる。この混合ステップでは、好ましい実施形態は、特に存在していることが好ましいデンプンの膨張を引き起こすように、蒸気の注入を含む。
バイオマス及び／又は水性懸濁液と混合する前に、均一な混合物が混合ステップにおいて得られるということを確実にするように、必要に応じてさらなる食料品又は飼料原料の成分は好ましくは粉砕される。さらなる食料品又は飼料原料の成分の粉砕は、例えばハンマーミルを使用して行われてもよい。
従って、本発明のさらなる対象は、好ましくは粒状バイオマス及び／又は水性懸濁液をさらなる飼料原料の成分と混合した後に、本発明による粒状バイオマス及び／又は水性懸濁液が動物に提供される、動物を飼養する方法であり、ここで、動物は、家禽、ブタ、ミンク、反すう動物から、特に子牛及び肉牛、ヒツジ、ヤギ、コンパニオンアニマル、又は、養殖で保持されている動物から好ましくは選択される。
或いは、本発明によるバイオマス及び／又は水性懸濁液は、土壌還元において、特に（有機）肥料、ＮＰＣ（窒素／亜リン酸／カリウム源）、土壌改良剤、植物改良剤及び／又は堆肥補助剤として、バイオガスを生成するため、廃水処理のため、又は、代替燃料として、特にセメントキルンのために使用されてもよい。本発明によるバイオマス及び／又は水性懸濁液は、微生物を生成するための、特にさらなるＰＵＦＡ含有バイオマスを生成するための発酵培地の一部としてさらに使用されてもよい。
従って、本発明のさらなる対象は、本発明による粒状バイオマス及び／又は水性懸濁液が、土の上にふりまかれ、場合によっては土、特に農地の土壌又は庭の土壌と混合される、土壌を改良する方法である。
従って、本発明のさらなる対象は、本発明による粒状バイオマス及び／又は水性懸濁液が、土の上にふりまかれ、場合によっては土、特に農地の土壌又は庭の土壌と混合される、土、特に農地又は庭を肥沃にする及び／又は土、特に農地又は庭に堆肥を施す方法でもある。
従って、本発明のさらなる対象は、本発明による粒状バイオマス及び／又は水性懸濁液が、特にメタン生成細菌を利用することによって、嫌気性の条件下で微生物分解を受ける、バイオガスを生成する方法でもある。
従って、本発明のさらなる対象は、廃水が、本発明による粒状バイオマス及び／又は水性懸濁液と混合される、廃水を処理する方法でもある。
従って、本発明のさらなる対象は、本発明による粒状バイオマス及び／又は水性懸濁液が発酵培地の一部として使用される、微生物を生成する、特にＰＵＦＡ含有バイオマスを生成する方法でもある。
本発明による方法は、細胞の溶解を行う前に、前処理ステップとしてバイオマスの懸濁液の低温殺菌をさらに含んでもよい。低温殺菌は、５から８０分間、特に２０から６０分間、５０から１２１℃、特に５０から７０℃の温度で好ましくは行われる。
バイオマスのＰＵＦＡ含有細胞は、好ましくは微生物細胞又は植物細胞である。好ましくは、細胞は、ポリケチドシンターゼ系によりＰＵＦＡを産生する能力を有する。ポリケチドシンターゼ系は、内因性のもの、又は、遺伝子工学により外因性のものであってもよい。
従って、本発明による「脱脂バイオマス」とは、特に先にさらに開示された油単離プロセスを受けた後の、特に以下にさらに開示されるそのようなＰＵＦＡ含有細胞を含むバイオマスの残留物を特に指す。
本発明による植物細胞は、特に、アブラナ科、グミ科及びマメ科の細胞から選択されてもよい。アブラナ科の細胞は、アブラナ属から、特にアブラナ、カブ（ｔｕｒｎｉｐ ｒａｐｅ）及びカラシナから選択されてもよく；グミ科の細胞は、グミ属から、特にオリーブ種から選択されてもよく；マメ科の細胞は、グリシン属から、特にダイズ種から選択されてもよい。
ＰＵＦＡ含有脂質を有する微生物は、従来技術において広範に記載されている。使用される細胞は、これに関連して、特に、ＰＵＦＡ（多価不飽和脂肪酸）を既に自然に産生する細胞であってもよい；しかし、ともかく、適した遺伝子工学方法の結果として、又は、ランダム突然変異誘発により、ＰＵＦＡの改善された産生を示すか又はＰＵＦＡを産生する能力を有するようにされた細胞であってもよい。ＰＵＦＡの産生は、栄養要求性、混合栄養性又は従属栄養性であってもよい。
バイオマスは、従属栄養的にＰＵＦＡを産生する細胞を好ましくは含む。本発明による細胞は、藻類、真菌類、特に酵母菌、細菌、又は原生生物から好ましくは選択される。細胞は、より好ましくは微生物藻類又は真菌類である。
適した油産生酵母菌の細胞は、特に、ヤロウイア属（Ｙａｒｒｏｗｉａ）、カンジダ属（Ｃａｎｄｉｄａ）、ロドトルラ属（Ｒｈｏｄｏｔｏｒｕｌａ）、ロードスポリジウム属（Ｒｈｏｄｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ）、クリプトコッカス属（Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）、トリコスポロン属（Ｔｒｉｃｈｏｓｐｏｒｏｎ）及びリポマイセス属（Ｌｉｐｏｍｙｃｅｓ）の菌株である。
適した油産生微細藻類及び藻類様微生物の細胞は、特に、ストラメノパイル（Ｓｔｒａｍｅｎｏｐｉｌｅｓ）門（不等毛類とも呼ばれる）から選択される微生物である。ストラメノパイル門の微生物は、特に、以下の微生物の群：ハマトレス（Ｈａｍａｔｏｒｅｓ）、プロテロモナズ（Ｐｒｏｔｅｒｏｍｏｎａｄｓ）、オパリネス（Ｏｐａｌｉｎｅｓ）、ディベロペイエルラ（Ｄｅｖｅｌｏｐａｙｅｌｌａ）、ディプロフリス（Ｄｉｐｌｏｐｈｒｙｓ）、ラビリンツリド（Ｌａｂｒｉｎｔｈｕｌｉｄｓ）、トラウストキトリド（Ｔｈｒａｕｓｔｏｃｈｙｔｒｉｄｓ）、ビオセシド（Ｂｉｏｓｅｃｉｄｓ）、卵菌類（Ｏｏｍｙｃｅｔｅｓ）、ヒポチトリジオミセテス（Ｈｙｐｏｃｈｙｔｒｉｄｉｏｍｙｃｅｔｅｓ）、コマチオン（Ｃｏｍｍａｔｉｏｎ）、レチキュロスファエラ（Ｒｅｔｉｃｕｌｏｓｐｈａｅｒａ）、ペラゴモナス（Ｐｅｌａｇｏｍｏｎａｓ）、ペラゴコッカス（Ｐｅｌａｇｏｃｏｃｃｕｓ）、オリコラ（Ｏｌｌｉｃｏｌａ）、アウレオコッカス（Ａｕｒｅｏｃｏｃｃｕｓ）、パルマレス（Ｐａｒｍａｌｅｓ）、珪藻類（Ｄｉａｔｏｍｓ）、キサントフィテス（Ｘａｎｔｈｏｐｈｙｔｅｓ）、ファエオフィテス（Ｐｈａｅｏｐｈｙｔｅｓ）（褐藻類）、ユースチグマトフィテス（Ｅｕｓｔｉｇｍａｔｏｐｈｙｔｅｓ）、ラフィドフィテス（Ｒａｐｈｉｄｏｐｈｙｔｅｓ）、シヌリドス（Ｓｙｎｕｒｉｄｓ）、（リゾクロムリナアレス（Ｒｈｉｚｏｃｈｒｏｍｕｌｉｎａａｌｅｓ）、ペディネルラレス（Ｐｅｄｉｎｅｌｌａｌｅｓ）、ディクチオカレス（Ｄｉｃｔｙｏｃｈａｌｅｓ）を含む）アキソディネス（Ａｘｏｄｉｎｅｓ）、クリソメリダレス（Ｃｈｒｙｓｏｍｅｒｉｄａｌｅｓ）、サルキノクリシダレス（Ｓａｒｃｉｎｏｃｈｒｙｓｉｄａｌｅｓ）、ヒドルラレス（Ｈｙｄｒｕｒａｌｅｓ）、ヒバーディアレス（Ｈｉｂｂｅｒｄｉａｌｅｓ）、及びクロムリナレス（Ｃｈｒｏｍｕｌｉｎａｌｅｓ）から選択されてもよい。他の好ましい微細藻類の群には、緑藻類のメンバー、及び、クリプテコディニウム（Ｃｒｙｐｔｈｅｃｏｄｉｕｒｎ）属のメンバーを含む渦鞭毛藻類のメンバーが含まれる。
本発明によるバイオマスは、好ましくはラビリンチュラ（Ｌａｂｙｒｉｎｔｈｕｌｏｍｙｃｅｔｅｓ）分類群（ラビリンチュラ（Ｌａｂｙｒｉｎｔｈｕｌｅａ）、ネットスライム真菌類（ｎｅｔ ｓｌｉｍｅ ｆｕｎｇｉ）、スライムネット（ｓｌｉｍｅ ｎｅｔ））、特にトラウストキトリアシエ（Ｔｈｒａｕｓｔｏｃｈｙｔｒｉａｃｅａｅ）科由来の細胞を含み、好ましくは本質的にそのような細胞から成る。トラウストキトリアシエの科（トラウストキトリド）には、アルソミア（Ａｌｔｈｏｍｉａ）、アプラノキトリウム（Ａｐｌａｎｏｃｈｙｔｒｉｕｍ）、オーランチオキトリウム（Ａｕｒａｎｔｉｏｃｈｙｔｒｉｕｍ）、ボトリオキトリウム（Ｂｏｔｒｙｏｃｈｙｔｒｉｕｍ）、エルニア（Ｅｌｎｉａ）、ジャポノキトリウム（Ｊａｐｏｎｏｃｈｙｔｒｉｕｍ）、オブロンギキトリウム（Ｏｂｌｏｎｇｉｃｈｙｔｒｉｕｍ）、パリエチキトリウム（Ｐａｒｉｅｔｉｃｈｙｔｒｉｕｍ）、シゾキトリウム（Ｓｃｈｉｚｏｃｈｙｔｒｉｕｍ）、シソイドキトリウム（Ｓｉｃｙｏｉｄｏｃｈｙｔｒｉｕｍ）、トラウストキトリウム（Ｔｈｒａｕｓｔｏｃｈｙｔｒｉｕｍ）、及びウルケニア（Ｕｌｋｅｎｉａ）の属が含まれる。バイオマスは、特に、オーランチオキトリウム、オブロンギキトリウム、シゾキトリウム、又はトラウストキトリウムの属由来の細胞、とりわけシゾキトリウム属由来の細胞を好ましくは含む。
本発明によると、多価不飽和脂肪酸（ＰＵＦＡ）は、好ましくは高度不飽和脂肪酸（ＨＵＦＡ）である。
バイオマスに存在する細胞は、それぞれ細胞乾燥物質に基づいて、少なくとも２０重量％、好ましくは少なくとも３０重量％、特に少なくとも３５重量％のＰＵＦＡを有するという事実によって好ましくは区別される。
本発明によると、「脂質」という用語は、リン脂質；遊離脂肪酸；脂肪酸のエステル；トリアシルグリセロール；ステロール及びステロールエステル；カロテノイド；キサントフィル（例えば、オキシカロテノイド等）；炭化水素；イソプレノイド由来の化合物、及び、当業者には既知の他の脂質；を含む。「脂質」及び「油」という用語は、本発明に従って交換可能に使用される。
好ましい実施形態では、この場合の脂質の大部分は、好ましくは少なくとも５０重量％、特に少なくとも７５重量％のトリグリセリドの形で存在し、特に好ましい実施形態では、少なくとも９０重量％の脂質が細胞内に存在し、トリグリセリドの形で存在する。
本発明によると、多価不飽和脂肪酸（ＰＵＦＡ）は、少なくとも２つ、特に少なくとも３つのＣ－Ｃ二重結合を有する脂肪酸を意味すると理解される。本発明によると、高度不飽和脂肪酸（ＨＵＦＡ）は、ＰＵＦＡの中でも好ましい。本発明によると、ＨＵＦＡは、少なくとも４つのＣ－Ｃ二重結合を有する脂肪酸を意味すると理解される。
ＰＵＦＡは、遊離の形又は結合した形で細胞内に存在し得る。結合した形での存在の例は、ＰＵＦＡのリン脂質及びエステル、特にモノアシル－、ジアシル－及びトリアシルグリセリドである。好ましい実施形態では、ＰＵＦＡの大部分は、好ましくは少なくとも５０重量％、特に少なくとも７５重量％のトリグリセリドの形で存在し、特に好ましい実施形態では、少なくとも９０重量％のＰＵＦＡが細胞内に存在し、トリグリセリドの形で存在する。
好ましいＰＵＦＡは、オメガ３脂肪酸及びオメガ６脂肪酸であり、オメガ３脂肪酸が特に好ましい。ここで好ましいオメガ３脂肪酸は、エイコサペンタエン酸（ＥＰＡ、２０：５ω－３）、特に（５Ｚ、８Ｚ、１１Ｚ、１４Ｚ、１７Ｚ）－イコサ－５，８，１１，１４，１７－ペンタエン酸、及び、ドコサヘキサエン酸（ＤＨＡ、２２：６ω－３）、特に（４Ｚ、７Ｚ、１０Ｚ、１３Ｚ、１６Ｚ、１９Ｚ）－ドコサ－４，７，１０，１３，１６，１９－ヘキサエン酸である。
本発明の非常に好ましい実施形態では、同時に相当量のＥＰＡ及びＤＨＡを産生する細胞、特にシゾキトリウム菌株が利用され、ここで、（それぞれ、細胞に含有される脂質の総量に関して）ＤＨＡは、少なくとも２０重量％の量で、好ましくは少なくとも３０重量％の量で、特に３０から５０重量％の量で好ましくは産生され、ＥＰＡは、少なくとも５重量％の量で、好ましくは少なくとも１０重量％の量で、特に１０から２０重量％の量で産生される。ＤＨＡ及びＥＰＡ産生シゾキトリウム菌株は、連続した突然変異誘発、それに続く、優れたＥＰＡ及びＤＨＡの産生及び特定のＥＰＡ：ＤＨＡ比を実証する突然変異株の適した選択によって得ることができる。酵母菌細胞への遺伝的変化を誘発する能力を有するいかなる化学的又は非化学的（例えば紫外線（ＵＶ）照射等の）作用物質も、突然変異原として使用することができる。これらの作用物質は、単独で又は互いに組み合わせて使用することができ、化学的作用物質は、そのままで又は溶媒と共に使用することができる。
上述のように、相当量で同時にＥＰＡ及びＤＨＡを生産する好ましいシゾキトリウム属の微生物の種は、ＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ－１０２０８、ＰＴＡ－１０２０９、ＰＴＡ－１０２１０、又は、ＰＴＡ－１０２１１、ＰＴＡ－１０２１２、ＰＴＡ－１０２１３、ＰＴＡ－１０２１４、ＰＴＡ－１０２１５として寄託されている。
ＰＵＦＡ含有脂質を得ることができる、本発明によるバイオマスの懸濁液は、好ましくは発酵ブロス、特に（乾物含量として計算される）少なくとも８０又は１００ｇ／ｌ、好ましくは少なくとも１２０又は１４０ｇ／ｌ、より好ましくは少なくとも１６０又は１８０ｇ／ｌのバイオマス密度を有する発酵ブロスである。従って、懸濁液は、それによってＰＵＦＡが微生物により産生される条件下で発酵培地において適した細胞を培養及び増殖させることによって得ることができる。
バイオマス、特にトラウストキトリアレス目の、特に脂質、特にＰＵＦＡを有する細胞を含むバイオマスを生成する方法は、従来技術において詳細に記載されている（例えば、特許文献５乃至９を参照されたい）。一般に、上記の生成は、微生物の増殖及びＰＵＦＡの産生を可能にするミネラルのような多くのさらなる物質と共に、炭素源及び窒素源の存在下で発酵槽において細胞が培養されることによって起こる。これに関連して、１リットル当たり１００グラムを超えるバイオマス密度及び１時間当たり１リットル当たり０．５グラムを超える脂質の産生速度を達成することができる。このプロセスは、フェドバッチ法として知られている方法で好ましくは行われ、すなわち、炭素源及び窒素源が、発酵の間に徐々に与えられる。所望のバイオマスが得られた場合、脂質産生は、種々の処置によって、例えば窒素源、炭素源若しくは酸素含有量又はこれらの組み合わせを制限することによって誘発され得る。
本発明の好ましい実施形態では、細胞は、（乾物含量として計算される）少なくとも８０又は１００ｇ／ｌ、より好ましくは少なくとも１２０又は１４０ｇ／ｌ、特に少なくとも１６０又は１８０ｇ／ｌのバイオマス密度に達するまで増殖させられる。そのようなプロセスは、例えば特許文献１０において開示されている。
好ましくは、細胞は、特に腐食を回避するように、低塩分濃度を有する培地において発酵させられる。これは、例えば硫酸ナトリウム、炭酸ナトリウム、炭酸水素ナトリウム又はソーダ灰等、塩化ナトリウムの代わりにナトリウム源として無塩素ナトリウム塩を使用することによって達成することができる。好ましくは、塩化物が、３ｇ／ｌ未満、特に５００ｍｇ／ｌ未満、特に好ましくは１００ｍｇ／ｌ未満の量で発酵において使用される。
適した炭素源は、アルコール性炭素源及び非アルコール性炭素源の両方である。アルコール性炭素源の例は、メタノール、エタノール及びイソプロパノールである。非アルコール性炭素源の例は、フルクトース、グルコース、スクロース、糖蜜、デンプン及びコーンシロップである。
適した窒素源は、無機窒素源及び有機窒素源の両方である。無機窒素源の例は、硝酸塩及びアンモニウム塩、特に硫酸アンモニウム及び水酸化アンモニウムである。有機窒素源の例は、アミノ酸、特にグルタミン酸及び尿素である。
加えて、無機又は有機リン化合物、及び／又は、例えば酵母エキス又はコーンスティープリカー等の既知の増殖促進物質も、発酵に好ましい効果をもたらすために添加されてもよい。
細胞は、３から１１、特に４から１０のｐＨで、さらに、好ましくは少なくとも２０℃、特に２０から４０℃、特に好ましくは少なくとも３０℃の温度で好ましくは発酵させられる。典型的な発酵プロセスは、最大で約１００時間かかる。
発酵が終了した後、細胞を死滅させ、且つ、脂質分解を促進し得る酵素を非活性化させるために、細胞は低温殺菌されてもよい。低温殺菌は、５から８０分、特に２０から６０分の間、５０から１２１℃、好ましくは５０から７０℃の温度までバイオマスを加熱することによって好ましくは引き起こされる。
同様に、発酵が終了した後、バイオマスに存在するＰＵＦＡを酸化的分解から保護するために、抗酸化物質が添加されてもよい。これに関連して好ましい抗酸化物質は、ＢＨＴ、ＢＨＡ、ＴＢＨＡ、エトキシキン、ベータカロテン、ビタミンＥ、特にトコフェロール、及びビタミンＣである。抗酸化物質は、使用される場合、抗酸化物質の添加後の発酵ブロスの総量に関して、０．００１から０．１重量％の量で、好ましくは０．００２から０．０５重量％の量で好ましくは添加される。
１００ｇ／ｌを超えるバイオマス密度で微生物細胞（シゾキトリウム種）を有する未洗浄細胞ブロスを、撹拌容器内で６０℃まで加熱した。懸濁液を加熱した後、アルカラーゼ（Ａｌｃａｌａｓｅ（登録商標）２．４ＦＧ（Ｎｏｖｏｚｙｍｅｓ））を（重量ブロスによる）０．５重量％の量で液体の形で添加する前に、苛性ソーダ（５０重量％のＮａＯＨ溶液）を使用することによってｐＨを７．５に調整した。撹拌を、６０℃で３時間続けた。その後、溶解した細胞混合物を、（ドイツのＧＥＡから得た）強制循環型蒸発器内に移し、８５℃の温度まで加熱した。その混合物を、全乾物含量が約３０重量％に達するまで、強制循環型蒸発器内で濃縮した。濃縮した溶解細胞混合物を新しい容器内に移し、苛性ソーダを添加することによってｐＨを１０．５に調整しながら、低剪断攪拌下で９０℃まで加熱した。９０℃に温度を維持し、苛性ソーダを添加することによって９．０より高いｐＨを維持しながら、低剪断攪拌を約３０時間続けた。
その後、結果として生じる解乳化した混合物を、硫酸を添加してｐＨを７．５に調整することによって中和した。油を有する軽質相、並びに、水、細胞片、残油及び塩を有する重質相への相分離は、ディスクスタックセパレーター（Ａｌｆａ Ｌａｖａｌ Ｄｉｓｃ Ｓｔａｃｋ Ｃｅｎｔｒｉｆｕｇｅ，ＬＡＰＸ４０４／Ｃｌａｒａ２０）を使用することによって機械的に行った。
粗製油を分離した後、残りの細胞片を水相において再懸濁し、濃縮して、噴霧造粒によって乾燥した。
効率的な解乳化により、有機溶媒又は塩化ナトリウムを添加することなく、９０重量％を超える油をバイオマスから分離することができた。
残りの重質相を、約９０℃の温度で４５重量％の全乾物量まで蒸発を介して濃縮し、続いて流動層噴霧造粒装置における噴霧造粒を介して乾燥することによって、固体のバイオマスに変換した。結果として得られるバイオマスは、５３０ｋｇ／ｍ３を超える高いかさ密度、約４０００ｋｃａｌ／ｋｇの高いエネルギー値、及び、非常に優れた取扱性状、特に４の流動性を示す。市販のシゾキトリア由来の同等のバイオマスは、６のはるかに悪い流動性と、３２５から５００ｋｇ／ｍ３のはるかに低いかさ密度とを全てにおいて示す。

Claims (6)

  1. 多価不飽和脂肪酸（ＰＵＦＡ）含有脂質を得る方法であって、
    ａ）トラウストキトリド科のＰＵＦＡ含有脂質を有する細胞を含むバイオマスの懸濁液を提供するステップと、
    ｂ）（ａ）の懸濁液を、５０℃～７０℃の温度まで、又は５５℃～６５℃の温度まで加熱し、前記懸濁液に細胞壁分解酵素を添加し、さらに、必要に応じて前記酵素が適切に作動するのに適したｐＨ値に調整するステップと、
    ｃ）少なくとも１時間、好ましくは少なくとも２時間、又は２～４時間、前記温度及び前記ｐＨを（ｂ）に示される範囲内で維持するステップと、
    ｄ）全乾物含量が３０～６０重量％、又は３５～５５重量％に達するまで、１００℃以下、７０℃～１００℃、又は８０℃～９０℃の温度で水を蒸発させることによって、ステップ（ｃ）で得られた前記懸濁液を濃縮するステップと、
    ｅ）ステップ（ｄ）で得られた懸濁液において、温度を８０℃～１００℃、８５℃～９５℃、又は約９０℃に調整し、さらに、アルカリ化剤、又は苛性ソーダを添加して、ｐＨ値を９．５～１１．５、１０．０～１１．０、又は１０．３～１０．７に調整するステップと、
    ｆ）少なくとも１０時間、１５～４０時間、又は２０～３６時間、前記温度を（ｅ）に示される範囲内で維持し、必要に応じてさらなるアルカリ化剤、又は苛性ソーダを添加することによって前記ｐＨ値を９．０～１１．５、９．０～１１．０、又は９．０～１０．５の範囲内で維持し、従って、前記懸濁液の解乳化を可能にするステップと、
    さらに、ＰＵＦＡ含有油を収集するステップであって、解乳化された前記懸濁液を中和し、続いてそのようにして得られた油含有軽質相を、水、塩及び細胞片含有重質相から分離することを含むステップと、を含み、
    ここで、１重量％未満、０．５重量％未満、又は０．１重量％未満の塩化物が使用される、
    む方法。
  2. 前記ＰＵＦＡ含有油を収集するステップにおいて、中和は、酸、又は硫酸を添加して、ｐＨ値を５．５～８．５、６．５～８．５、又は７．０～８．０に調整することによって実現され、水、塩及び細胞片含有重質相からの油含有軽質相の分離は、機械的手段によって、６０～９０℃、又は７０～８０℃の温度、及び、６～９、又は７～８．５のｐＨ値で実現される、請求項１に記載の方法。
  3. １重量％未満、０．５重量％未満、又は０．１重量％未満の有機溶媒が当該方法において使用される、請求項１又は２に記載の方法。
  4. ９０重量％を超える全乾物含量まで前記バイオマスを乾燥させることによって、水、塩、残油及び細胞片含有重質相を乾燥バイオマスに変換するステップをさらなるステップとして含み、乾燥バイオマスへの変換は、３０～５０重量％の乾物含量まで前記重質相を濃縮し、続いて流動層造粒装置を使用することにより前記バイオマスを噴霧造粒することによって行われる、請求項２又は３に記載の方法。
  5. 前記懸濁液は、少なくとも８０、１００、１２０又は１４０ｇ／ｌのバイオマス密度を有する発酵ブロスとして提供される、請求項１～４のいずれか一項に記載の方法。
  6. 前記細胞壁分解酵素は、プロテアーゼ、セルラーゼ、ヘミセルラーゼ、キチナーゼ、ペクチナーゼ、スクラーゼ、マルターゼ、ラクターゼ、アルファ－グルコシダーゼ、ベータ－グルコシダーゼ、アミラーゼ、リゾチーム、ノイラミニダーゼ、ガラクトシダーゼ、アルファ－マンノシダーゼ、グルクロニダーゼ、ヒアルロニダーゼ、プルラナーゼ、グルコセレブロシダーゼ、ガラクトシルセラミダーゼ、アセチルガラクトサミニダーゼ、フコシダーゼ、ヘキソサミニダーゼ、イズロニダーゼ、マルターゼ－グルコアミラーゼ、ベータ－グルカナーゼ、マンナナーゼ、及びその組み合わせから選択される、請求項１～５のいずれか一項に記載の方法。
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