ES2859752T3 - Métodos de producir ácido eicosapentaenoico en traustocítridos - Google Patents

Abstract

Un método de producir un aceite, comprendiendo el método: preparar una biomasa de acuerdo con un método para incrementar la concentración de EPA en una biomasa de un microorganismo que tiene ácidos grasos y una concentración de EPA, que comprende: (a) fermentar el microorganismo en un recipiente fermentador para producir una biomasa; y (b) proporcionar una presión sobre la biomasa superior o igual a 3447,4 Pa (0,5 psi) por encima de la presión atmosférica durante un tiempo suficiente para aumentar la concentración de EPA en la biomasa; y obtener el aceite a partir de la biomasa, en el que dicho microorganismo es un traustocítrido, en el que opcionalmente el aceite se extrae de la biomasa.

Description

DESCRIPCIÓN

Métodos de producir ácido eicosapentaenoico en traustocítridos

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN

Campo de la Invención

La presente invención se dirige a métodos para producir aceites microbianos.

Técnica de Antecedentes

Los ácidos grasos se clasifican en base a las características de longitud y saturación de la cadena de carbonos. Los ácidos grasos se denominan ácidos grasos de cadena corta, de cadena media o de cadena larga en base al número de carbonos presentes en la cadena, se denominan ácidos grasos saturados cuando no están presentes dobles enlaces entre los átomos de carbono y se denominan ácidos grasos insaturados cuando están presentes dobles enlaces. Los ácidos grasos insaturados de cadena larga son monoinsaturados cuando solo está presente un doble enlace y son poliinsaturados cuando está presente más de un doble enlace.

Los ácidos grasos poliinsaturados (PUFAs) se clasifican en función de la posición del primer doble enlace del extremo metilo del ácido graso: los ácidos grasos omega-3 (n-3) contienen un primer doble enlace en el tercer carbono, mientras que los ácidos grasos omega-6 (n-6) contienen un primer doble enlace en el sexto carbono. Por ejemplo, el ácido docosahexaenoico ("DHA") es un ácido graso poliinsaturado de cadena larga omega-3 (LC-PUFA) con una longitud de cadena de 22 carbonos y 6 dobles enlaces, a menudo designado como "22:6 n-3". Otros LC-PUFAs omega-3 incluyen ácido eicosapentaenoico ("EPA"), designado "20:5 n-3", y ácido docosapentaenoico omega-3 ("DPA n-3"), designado "22:5 n-3". DHA y EPA se han denominado ácidos grasos "esenciales". Los LC-PUFAs omega-6 incluyen ácido araquidónico ("ARA"), designado "20:4 n-6", y ácido docosapentaenoico omega-6 ("DPA n-6"), designado "22:5 n-6.

Ácidos grasos omega-3 son moléculas biológicamente importantes que afectan a la fisiología celular debido a su presencia en las membranas celulares, regular la producción y la expresión génica de compuestos biológicamente activos, y sirven como sustratos biosintéticos. Roche, H. M., Proc. Nutr. Soc. 58: 397-401 (1999). DHA, por ejemplo, representa aproximadamente el 15%-20% de los lípidos en la corteza cerebral humana, el 30%-60% de los lípidos en la retina, se concentra en los testículos y los espermatozoides, y es un componente importante de la leche materna. Bergé, J.P. y Bamathan, G. Adv. Biochem. Eng. Biotechnol. 96:49-125 (2005). DHA representa hasta el 97% de los ácidos grasos omega-3 en el cerebro y hasta el 93% de los ácidos grasos omega-3 en la retina. Además, DHA es esencial para el desarrollo tanto del feto como infantil, así como para el mantenimiento de las funciones cognitivas en los adultos. Id. Debido a que los ácidos grasos omega-3 no se sintetizan de novo en el cuerpo humano, estos ácidos grasos deben derivarse de fuentes nutricionales.

El aceite de linaza y los aceites de pescado se consideran buenas fuentes dietéticas de ácidos grasos omega-3. El aceite de linaza no contiene EPA, DHA, DPA o ARA, sino que contiene ácido linolénico (C18:3 n-3), un bloque de construcción que permite al cuerpo fabricar EPA. Sin embargo, existe evidencia de que la tasa de conversión metabólica puede ser lenta y variable, particularmente entre aquellos con problemas de salud. Los aceites de pescado varían considerablemente en el tipo y nivel de composición de ácidos grasos dependiendo de la especie en particular y de sus dietas. Por ejemplo, los peces criados en acuicultura tienden a tener un nivel más bajo de ácidos grasos omega-3 que los que se encuentran en la naturaleza. Además, los aceites de pescado conllevan el riesgo de contener contaminantes ambientales y pueden estar asociados con problemas de estabilidad y un olor o sabor a pescado.

Los traustocrítidos son microorganismos del orden Thraustochytriales. Traustocítridos incluyen miembros del género Schizochytrium y Thraustochytrium y han sido reconocidos como una fuente alternativa de ácidos grasos omega-3, incluyendo DHA y EPA. Véase la patente de EE.UU. N° 5.130.242. Aceites producidos a partir de estos microorganismos heterotróficos marinos tienen a menudo perfiles de ácidos grasos poliinsaturados más simples que los correspondientes aceites de pescado o microalgas. Lewis, T.E., Mar. Biotechnol. 1:580-587 (1999). Se ha informado que cepas de especies de traustocítridos producen ácidos grasos omega-3 como un alto porcentaje del total de ácidos grasos producidos por los organismos. La Patente de EE.UU. N° 5.130.242; Huang, J. et al., J. Am. Oil. Chem. Soc. 78: 605-610 (2001); Huang, J. et al., Mar. Biotechnol. 5: 450-457 (2003). Sin embargo, los traustocítridos aislados varían en la identidad y las cantidades de LC-PUFAs producidos, de modo que algunas cepas descritas previamente pueden tener niveles indeseables de ácidos grasos omega-6 y/o pueden demostrar una baja productividad en cultivo. Como tal, existe una necesidad continua de aislamiento de microorganismos que demuestren una alta productividad y perfiles de LC-PUFA deseables.

Yongmanitchai y Ward, Applied and Environmental Microbiology, feb. 1991, págs. 419-425, comentan estudios sobre los efectos de la fuente de nitrógeno, fosfato, cloruro sódico, factores de crecimiento, precursores, CO2, temperatura, pH inicial y tamaño del inóculo sobre la producción de biomasa y ácido eicosapentaenoico por Phaeodactylum tricornutum. CO2 se añadió al aire ambiente antes de la aireación.

Hosida et al, Journal of Applied Phycology (2005) 17:29-34 comenta el efecto de la concentración de CO2 durante el cultivo. CO2 puro se mezcló con el aire ambiente antes de la aireación.

BREVE SUMARIO DE LA INVENCIÓN

La solicitante ha encontrado que la cantidad de EPA y DHA producida por un traustocítrido que produce una biomasa que tiene al menos 3% de EPA, se puede modular mediante la variación de las cantidades de dióxido de carbono disuelto (CO2) en una fase acuosa de un caldo de fermentación durante la fermentación del microorganismo.

La invención se define por métodos de producción de un aceite de acuerdo con las reivindicaciones 1-9.

Además, en esta memoria se describe un método de producir una biomasa de un microorganismo que tiene ácidos grasos y una concentración de EPA, que comprende: fermentar el microorganismo en un recipiente fermentador que tiene un gas disuelto en un caldo de fermentación para producir una biomasa, en el que el microorganismo comprende un traustocítrido que produce una biomasa que tiene al menos 3% de EPA del peso total de los ácidos grasos; y ajustar los niveles de CO2 disuelto en el gas disuelto. En una realización, los niveles de CO2 disuelto se pueden ajustar para alcanzar un nivel deseado de EPA y/o DHA en la biomasa. En una realización adicional la cantidad de CO2 disuelto en la fase acuosa de un caldo de fermentación varía de aproximadamente 38 a aproximadamente 600 ppm del total de gas disuelto, y particularmente de aproximadamente 38 a aproximadamente 135 ppm del total de gas disuelto.

Además, en esta memoria se describe un método de producir una biomasa de un microorganismo que tiene ácidos grasos y una concentración de EPA, que comprende: fermentar el microorganismo en un recipiente fermentador, que comprende un gas, para producir una biomasa, en el que el microorganismo comprende un traustocítrido que produce una biomasa que tiene al menos 3% de EPA del peso total de los ácidos grasos; y complementar el gas con CO2. Complementar significa añadir o cargar los recipientes con CO2 en una cantidad adicional a la cantidad producida por la fermentación de las células o una cantidad en condiciones ambientales. En una realización, el CO2 se complementa al recipiente para lograr una cantidad deseada de EPA y/o DHA en la biomasa.

También se describe en esta memoria un método de producir una biomasa de un microorganismo que tiene ácidos grasos y una concentración de EPA, que comprende: fermentar el microorganismo en un recipiente fermentador para producir una biomasa, en el que el microorganismo comprende un traustocítrido que produce una biomasa que tiene al menos 3% de EPA del peso total de los ácidos grasos; y ajustar la cantidad de biomasa en el recipiente. En una realización de la divulgación, la biomasa se ajusta para alcanzar un nivel deseado de EPA o DHA en la biomasa.

También se describe un método de producir un microorganismo que tiene ácidos grasos y una concentración de EPA, que comprende: fermentar el microorganismo en un recipiente fermentador para producir una biomasa, en el que el microorganismo comprende un traustocítrido que produce una biomasa que tiene al menos 3% de EPA del peso total de los ácidos grasos; y ajustar la presión sobre la biomasa, por ejemplo, pero no limitado a controlar la contrapresión del recipiente. En una realización, la presión se ajusta para alcanzar un nivel deseado de EPA o DHA en la biomasa.

En otra realización descrita en esta memoria está un método de producir un microorganismo que tiene ácidos grasos y una concentración de EPA, que comprende: fermentar el microorganismo en un recipiente fermentador para producir un caldo de fermentación y una biomasa, en el que el microorganismo comprende un traustocítrido que produce una biomasa que tiene al menos 3% de EPA del peso total de los ácidos grasos, y ajustar la temperatura en el caldo. En una realización, la temperatura se ajusta para alcanzar un nivel deseado de EPA y/o DHA en la biomasa.

En diversas realizaciones, las cantidades de EPA y DHA pueden también ser moduladas mediante el ajuste de la cantidad de CO2 disuelto en un caldo de fase acuosa o de fermentación del recipiente, aumentando o disminuyendo la cantidad de CO2 en el recipiente. La cantidad de CO2 disuelto se puede ajustar ajustando adicionalmente la cantidad de la biomasa fermentada. Por ejemplo, fermentando las células en matraces y recipientes de fermentación más grandes. El EPA y el DHA también se pueden variar de acuerdo con realizaciones proporcionadas en esta memoria variando la temperatura. La cantidad de CO2 disuelto se puede ajustar adicionalmente, por ejemplo, ajustando la temperatura en el recipiente. Por ejemplo, las temperaturas más bajas de los recipientes producirán concentraciones más altas de EPA y concentraciones más bajas de DHA. La cantidad de CO2 disuelto se puede ajustar adicionalmente ajustando la presión en el recipiente. Por ejemplo, aumentar la presión probablemente aumentará el CO2 disuelto, lo que aumentará la cantidad de EPA y disminuirá la cantidad de DHA en la biomasa. Cada uno de los ajustes arriba descritos, p. ej., CO2 complementado, aumento o disminución de la biomasa, aumento o disminución de la temperatura, o aumento o disminución de la presión, se pueden combinar con cualquiera de los otros ajustes para alcanzar el nivel deseado de EPA y DHA en la biomasa y cualquier aceite extraído de la biomasa. El CO2 disuelto también se puede ajustar mediante un cambio de pH.

En algunas realizaciones, la cantidad total de EPA y DHA permanece relativamente constante en comparación con la cantidad, en peso, del peso total de los ácidos grasos y ácidos grasos omega-3.

En realizaciones adicionales, el contenido de EPA o DHA de la biomasa se mide antes de hacer un ajuste en la cantidad del CO2 complementado, la presión, la temperatura o la biomasa.

Si bien no se desea estar ligado a teoría alguna, se plantea la hipótesis de que el aumento y la disminución de las cantidades del EPA o DHA están directamente relacionados con la cantidad de CO2 disuelto en la fase acuosa del caldo de fermentación y que los ajustes de CO2, de presión y de temperatura arriba descritos varían la cantidad de CO2 disuelto en la biomasa.

En algunas realizaciones, la divulgación proporciona un método de producir una biomasa de un microorganismo que tiene una concentración incrementada de e Pa , comprendiendo el método cultivar el microorganismo en un medio de cultivo que comprende menos de 0,1 mg/L de vitamina B12 para producir una biomasa. En algunas realizaciones, el medio de cultivo comprende menos de 0,01 mg/L de vitamina B12. En algunas realizaciones, el medio de cultivo comprende menos de 0,001 mg/L de vitamina B12. En realizaciones adicionales, el medio de cultivo comprende menos de 0,0001 mg/L de vitamina B12. En algunas realizaciones, el medio de cultivo no contiene vitamina B12.

En algunas realizaciones, el medio de cultivo comprende, además, menos de 1 g de extracto de levadura por 50 g de biomasa libre de lípidos. En algunas realizaciones, el medio de cultivo comprende, además, menos de 0,5 g de extracto de levadura por cada 50 g de biomasa libre de lípidos. En realizaciones adicionales, el medio de cultivo comprende, además, menos de 0,1 g de extracto de levadura por 50 g de biomasa libre de lípidos.

En algunas realizaciones, la concentración de EPA se incrementa en al menos 400% en comparación con la concentración de EPA en una biomasa obtenida a partir del microorganismo cultivado en un medio de cultivo que comprende más de 0,1 mg/L de vitamina B12. En algunas realizaciones, la concentración de EPA se incrementa en al menos un 300% en comparación con la concentración de EPA en una biomasa de un microorganismo cultivado en un medio de cultivo que comprende más de 0,01 mg/L de vitamina B12. En realizaciones adicionales, la concentración de EPA se incrementa en al menos un 200% en comparación con la concentración de EPA en una biomasa de un microorganismo cultivado en un medio de cultivo que comprende más de 0,001 mg/L de vitamina B12. En algunas realizaciones, la concentración de EPA se incrementa en al menos un 100% en comparación con la concentración de EPA en una biomasa de un microorganismo cultivado en un medio de cultivo que comprende más de 0,0001 mg/L de vitamina B12.

Se describe, además, un método de producir una biomasa de un microorganismo que tiene una concentración incrementada de EPA, que comprende cultivar el microorganismo en un medio de cultivo que comprende menos de 0,1 mg/L de cobalto para producir una biomasa. En algunas realizaciones, el medio de cultivo comprende menos de 0,01 mg/L de cobalto. En algunas realizaciones, el medio de cultivo comprende menos de 0,001 mg/L de cobalto. En realizaciones adicionales, el medio de cultivo comprende menos de 0,0001 mg/L de cobalto. En algunas realizaciones, el medio de cultivo no contiene cobalto.

El microorganismo es un traustocítrido. En algunas realizaciones, el microorganismo produce al menos un 3% de EPA del peso total de los ácidos grasos.

En algunas realizaciones, el medio de cultivo tiene un nivel de CO2 disuelto de al menos 5%. En realizaciones adicionales, el medio de cultivo tiene un nivel de CO2 disuelto de al menos 10%. En algunas realizaciones, el medio de cultivo tiene un nivel de CO2 disuelto de al menos 15%.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS

Las diversas realizaciones de la invención se pueden entender más completamente a partir de la siguiente descripción detallada, las figuras y las descripciones de secuencia adjuntas, que forman una parte de esta solicitud.

FIG. 1 muestra el comportamiento de PTA-9695 en un gradiente de tiamina.

FIG. 2 muestra el comportamiento de PTA-9695 en un gradiente de vitamina B12.

FIG. 3 muestra el comportamiento de PTA-9695 en un gradiente de biotina.

FIG. 4 muestra el comportamiento de PTA-9695 en un gradiente de pantotenato de calcio.

FIG. 5 muestra el comportamiento de PTA-9695 en patrones de TSFM.

FIG. 6 - FIG. 19 muestran el comportamiento de PTA-9695 en un gradiente de vitamina B12 a 10% de CO2.

FIG. 20 - FIG. 49 muestran el comportamiento de PTA-10208 en un gradiente de vitamina B12 a 10% de CO2. DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN

Los métodos y las composiciones proporcionados en esta memoria son particularmente aplicables a un traustocítrido que produce una biomasa que tiene al menos 3% de EPA del peso total de los ácidos grasos que produce. Un traustocítrido particular que produce una biomasa que tiene al menos 3% de EPA proporcionado en esta memoria es un microorganismo aislado de la especie depositada en la ATCC con el N° de Acceso PTA-10212. El microorganismo aislado asociado con el N° de Acceso ATCC PTA-10212 fue depositado bajo el Tratado de Budapest el 14 de julio de 2009 en la American Type Culture Collection, Patent Depository, 10801 University Boulevard, Manassas, VA 20110­ 2209.

Un traustocítrido particular que produce una biomasa que tiene al menos 3% de EPA se selecciona de un microorganismo aislado depositado en la ATCC bajo el N° de Acceso PTA-10212, PTA-10213, PTA-10214, PTA-10215, PTA-10208, PTA 10209, PTA-10210 o PTA-10211.

Una realización particular proporcionada aquí se dirige a un microorganismo aislado que comprende un ARNr 18s que comprende una secuencia de polinucleótidos de SEQ ID NO: 1 o una secuencia de polinucleótido que tiene al menos 94% de identidad con SEQ ID NO: 1.

Una realización particular proporcionada aquí se refiere a un microorganismo aislado que comprende una secuencia de polinucleótidos de ARNr 18s que tiene al menos 94% de identidad con una secuencia de polinucleótidos de ARNr 18s del microorganismo depositado en la ATCC bajo el N° de Acceso PTA-10212.

Un traustocítrido particular que produce una biomasa que tiene al menos 3% de EPA proporcionado en esta memoria se dirige a un microorganismo aislado de la especie depositada en la ATCC bajo el N° de Acceso PTA-10208.

Una realización particular proporcionada aquí se dirige a un microorganismo aislado de la especie depositada en la ATCC bajo el N° de Acceso PTA-10208, en donde los ácidos grasos totales producidos por el microorganismo comprenden más de aproximadamente 10% en peso de ácido eicosapentaenoico.

Un traustocítrido particular que produce una biomasa que tiene al menos 3% de EPA es un microorganismo aislado que tiene las características de las especies depositadas en la ATCC bajo el N° de Acceso PTA-10208, en donde los ácidos grasos totales producidos por el microorganismo comprenden más de aproximadamente 10% en peso de ácido eicosapentaenoico. Un traustocítrido particular que produce una biomasa que tiene al menos 3% de EPA proporcionado en esta memoria se selecciona de un microorganismo aislado seleccionado de una cepa mutante depositada en la ATCC bajo el N° de Acceso PTA-10209, PTA-10210 o PTA-10211. Los microorganismos asociados con los N°s de Acceso PtA-10209, PTA-10210 y PTA-10211 de la ATCC se depositaron bajo el Tratado de Budapest el 25 de septiembre de 2009 en la American Type Culture Collection, Patent Depository, 10801 University Boulevard, Manassas, VA 20110- 2209.

Realizaciones proporcionadas en esta memoria están dirigidas a los microorganismos arriba descritos, a sus cepas mutantes y a los microorganismos identificados en la Solicitud de Patente de EE.UU. N° 12/729.013.

Una realización proporcionada en esta memoria se refiere a un microorganismo aislado que produce una fracción de triacilglicerol, en donde el contenido en ácido eicosapentaenoico de la fracción de triacilglicerol es al menos aproximadamente 12% en peso.

Una realización proporcionada en esta memoria se dirige a una biomasa aislada, en donde al menos aproximadamente 20% en peso de un peso de células secas de la biomasa son ácidos grasos, en donde más de aproximadamente 10% en peso de ácidos grasos es ácido eicosapentaenoico, y en donde los ácidos grasos comprenden menos de aproximadamente 5% en peso de cada uno de ácido araquidónico y ácido docosapentaenoico n-6. En algunas realizaciones, al menos aproximadamente 25% en peso de los ácidos grasos es ácido docosahexaenoico.

En algunas realizaciones, la presente divulgación está dirigida a una biomasa aislada que comprende triacilglicerol, en donde al menos aproximadamente 12% en peso de triacilglicerol es ácido eicosapentaenoicoo.

En algunas realizaciones, la presente divulgación está dirigida a cualquiera de las biomasas aisladas de la invención, en donde los ácidos grasos comprenden, además, menos de aproximadamente 5% en peso cada uno de ácido oleico, ácido linoleico, ácido linolénico, ácido eicosenoico y ácido erúcico.

La presente divulgación se dirige a un microorganismo traustocítrido aislado de las especies de traustocítridos depositadas en la ATCC bajo el número de acceso PTA-9695 o una cepa derivada de la misma, en donde los ácidos grasos totales producidos por dicho microorganismo o cepa derivados de los mismos comprenden aproximadamente 10% o menos en peso de ácido eicosapentaenoico. Una realización proporcionada en esta memoria está dirigida al microorganismo arriba descrito o una cepa del mismo y otro microorganismo relacionado descrito en la Publicación de la Solicitud de Patente de EE.UU. N° US 2010/0239533.

También se describe en esta memoria un método de aumentar la concentración de EPA en una biomasa de un microorganismo que tiene ácidos grasos y una concentración de EPA que comprende: fermentar el microorganismo en un recipiente fermentador, que comprende un gas, para producir una biomasa, en donde el microorganismo comprende un traustocítrido que produce una biomasa que tiene al menos 3% de EPA del peso total de los ácidos grasos; y complementar el gas con CO2 en una cantidad suficiente para aumentar la concentración de EPA en la biomasa. El aumento de la concentración del EPA se puede comparar, por ejemplo, con la concentración de EPA de un microorganismo fermentado de manera similar, no complementado con CO2 o cuando se compara con un microorganismo fermentado de manera similar en condiciones ambientales.

En otra realización, la cantidad de CO2 suficiente para aumentar la concentración del EPA es mayor que o igual a 2% del total de gas en el recipiente. En otra realización, la cantidad de CO2 en el recipiente es mayor que o igual a aproximadamente el 5% hasta aproximadamente el 20% del gas total en el recipiente. En otra realización, la cantidad de CO2 en el recipiente es mayor que o igual a aproximadamente el 5% hasta aproximadamente el 15% del gas total en el recipiente.

En una realización adicional, la cantidad de CO2 complementado es mayor que o igual a 2% del total de gas en el recipiente para aumentar la concentración del EPA en la biomasa a más de aproximadamente 4%, en peso, del peso total de los ácidos grasos, más particularmente de aproximadamente más de 4% hasta aproximadamente 45%, en peso, del peso total de los ácidos grasos, más particularmente, de aproximadamente más de 4% hasta aproximadamente 40% del peso total de los ácidos grasos.

En una realización adicional, la cantidad de CO2 complementado es suficiente para aumentar los niveles de EPA de aproximadamente 4% a un intervalo de aproximadamente 6 a 30%, en peso, del peso total de los ácidos grasos. En otra realización, la cantidad de CO2 proporcionada es suficiente para aumentar la concentración de EPA de aproximadamente el 15% hasta aproximadamente el 40%, en peso, del peso total de los ácidos grasos. En otra realización, la cantidad de CO2 proporcionada es suficiente para aumentar la concentración del EPA a más del 20%, en peso, del peso total de los ácidos grasos. En otra realización, el CO2 se proporciona en una cantidad suficiente para aumentar la concentración del EPA de aproximadamente el 20% hasta aproximadamente el 25%.

En otra realización, en esta memoria se proporciona un método de aumentar la concentración de EPA en una biomasa de un microorganismo que tiene ácidos grasos y una concentración de EPA, que comprende: fermentar el microorganismo en un recipiente fermentador para producir una biomasa; proporcionando una presión sobre la biomasa suficiente para aumentar la concentración del EPA en la biomasa. El aumento en la concentración de EPA se puede comparar, por ejemplo, con la concentración del EPA de microorganismos fermentados de manera similar, no provistos de la presión o cuando se compara con un microorganismo fermentado de manera similar en condiciones ambientales. La presión proporcionada sobre la biomasa es aproximadamente 3447,4 Pa (0,5 psi) por encima de la presión atmosférica. En otra realización, el recipiente tiene una presión de cabeza (o contrapresión) mayor que o igual a aproximadamente 2757,9 Pa (0,4 psi), más particularmente de aproximadamente 2757,9 Pa (0,4 psi) a aproximadamente 206842,7 Pa (30 psi), incluso más particularmente de aproximadamente 834,8 Pa (1 psi) a aproximadamente 206842,7 Pa (20 psi). En otra realización, el recipiente tiene una presión de cabeza de aproximadamente 6894,8 Pa (1 psi) a aproximadamente 137895,1 Pa (20 psi). La presión proporcionada se proporciona durante un tiempo suficiente para ajustar la cantidad de EPA en la biomasa, particularmente durante un tiempo de hasta 120 horas.

En otra realización proporcionada en esta memoria, es un método de producir una biomasa de un microorganismo productor de ácidos grasos y una concentración de EPA, que comprende fermentar el microorganismo en un recipiente fermentador para producir una biomasa, en donde el microorganismo comprende un traustocítrido que produce una biomasa que tiene al menos 3% de EPA del peso total de los ácidos grasos a una temperatura suficiente para aumentar la concentración de EPA en la biomasa. En algunas realizaciones, la temperatura suficiente para aumentar los niveles de EPA es menor que aproximadamente 30 °C, más particularmente es menor que o igual a aproximadamente 22 °C, y más particularmente la temperatura es menor que o igual a aproximadamente 21 °C. El aumento en la concentración del EPA se puede comparar, por ejemplo, con la concentración de EPA en un microorganismo fermentado de manera similar en que la temperatura no se ajusta o cuando se compara con un microorganismo fermentado de manera similar en condiciones ambientales.

En una realización adicional, los métodos proporcionados en esta memoria pueden variar las cantidades de EPA generadas durante la fermentación para producir una biomasa, y un aceite extraído, en donde la cantidad de EPA proporcionada es mayor que 4%, particularmente de aproximadamente mayor que 4% hasta aproximadamente 45%, más particularmente de aproximadamente mayor que 4% hasta aproximadamente 40% en peso, del peso total de los ácidos grasos. En otra realización, la cantidad de EPA producida por un método proporcionado en esta memoria está en una cantidad desde aproximadamente el 6% hasta aproximadamente el 30% en peso del peso total de los ácidos grasos. En una realización adicional, la cantidad de EPA producida por un método proporcionado en esta memoria está en una cantidad de aproximadamente el 15% hasta aproximadamente el 40% en peso del peso total de los ácidos grasos. En una realización adicional, la cantidad de EPA producido por un método proporcionado en esta memoria es superior a aproximadamente el 20%, más particularmente de aproximadamente el 20% hasta aproximadamente el 25% en peso del peso total de los ácidos grasos.

En una realización adicional, el nivel de EPA deseado proporcionado es mayor que 4%, particularmente de aproximadamente mayor que 4% a aproximadamente 45%, más particularmente de aproximadamente mayor que 4% a aproximadamente 40% en peso, del peso total de los ácidos grasos. En otra realización, el nivel de EPA deseado producido por un método proporcionado en esta memoria está en una cantidad de aproximadamente el 6% a aproximadamente el 30% en peso del peso total de los ácidos grasos. En una realización adicional, el nivel de EPA deseado producido por un método proporcionado en esta memoria está en una cantidad de aproximadamente el 15% hasta aproximadamente el 40% en peso del peso total de los ácidos grasos. En una realización adicional, el nivel de EPA deseado producido por un método proporcionado en esta memoria está en una cantidad mayor que aproximadamente el 20%, más particularmente de aproximadamente el 20% hasta aproximadamente el 25% en peso del peso total de los ácidos grasos.

Se describe un método para incrementar la concentración de EPA en una biomasa de un microorganismo que tiene ácidos grasos y una concentración de EPA, que comprende: fermentar el microorganismo en un recipiente fermentador para producir una biomasa, en el que el microorganismo es un traustocítrido que produce una biomasa que tiene en al menos 3% de EPA del peso total de los ácidos grasos; e incrementar la biomasa en una cantidad suficiente para incrementar la concentración de EPA en la biomasa. En algunas realizaciones, la cantidad de biomasa suficiente para incrementar la concentración de EPA tiene una densidad mayor que o igual a 10 g/l. En algunas realizaciones, la cantidad de biomasa suficiente para incrementar la concentración de EPA tiene una densidad de aproximadamente 10 g/l hasta aproximadamente 250 g/l. El incremento de la concentración de EPA se puede comparar, por ejemplo, con la concentración de EPA en un microorganismo fermentado de forma similar en el que no incrementa la biomasa.

En algunas realizaciones, la concentración de EPA de la biomasa cultivada en un medio de cultivo que comprende un mayor nivel de CO2 (por ejemplo, en un recipiente que comprende CO2 en una cantidad mayor que o igual al 2%, mayor que o igual al 5%, mayor que o igual al 10%, mayor que o igual al 15%, mayor que o igual al 20%, del 5% al 20% o del 5% al 15% del gas total en el recipiente) está en al menos el 10%, al menos el 50%, al menos el 100%, al menos el 250%, al menos el 500%, al menos el 750%, al menos el 1000%, al menos el 1100%, al menos el 1200%, al menos el 1300%, al menos el 1400%, al menos el 1500%, al menos el 1600%, al menos el 1700%, al menos el 1800%, al menos el 1900% o al menos el 2000% más alta que la concentración de EPA en una biomasa obtenida del microorganismo cultivado en un medio de cultivo que comprende niveles más bajos de CO2 (por ejemplo, en un recipiente que comprende CO2 en una cantidad de menos del 2%, menos del 5%, menos del 10%, menos del 15%, menos del 20%, del 0% al 4%, o del 1% al 3% del gas total en el recipiente, respectivamente). Por ejemplo, la concentración de EPA de la biomasa cultivada en un medio de cultivo que comprende un nivel más alto de CO2 (por ejemplo, en un recipiente que comprende CO2 en una cantidad mayor que o igual al 2%, mayor que o igual al 5%, mayor que o igual al 10%, mayor que o igual al 15%, mayor que o igual al 20%, del 5% al 20% o del 5% al 15% del gas total en el recipiente) es al menos el 10%, al menos el 50%, al menos el 100%, al menos el 250%, al menos el 500%, al menos el 750%, al menos el 1000%, al menos el 1100%, al menos el 1200%, al menos el 1300%, al menos el 1400%, al menos el 1500%, al menos el 1600%, al menos el 1700%, al menos el 1800%, al menos el 1900% o al menos el 2000% más alta que la concentración de EPA en una biomasa obtenida del microorganismo cultivado en un recipiente a un nivel de CO2 ambiente.

Vitamina B12 en medio de cultivo

La expresión "vitamina B12", tal como se utiliza en esta memoria, se refiere a una clase de compuestos químicamente relacionados en formas que se producen tanto de forma natural tanto como sintéticas, incluyendo, pero no limitadas a vitamina B12, cobalamina, cianocobalamina e hidroxocobalamina. En algunas realizaciones, la divulgación proporciona métodos para incrementar la concentración de EPA en la biomasa de un microorganismo que produce EPA, cultivando el microorganismo en un medio de cultivo que tiene niveles bajos de vitamina B12 o en un medio de cultivo que no tiene vitamina B12. En algunas realizaciones, la divulgación proporciona métodos para producir una biomasa de un microorganismo que tiene una concentración incrementada de EPA, que comprende cultivar el microorganismo en un medio de cultivo que comprende menos de 0,1 mg/L de vitamina B12 para producir una biomasa. En algunas realizaciones, el medio de cultivo comprende menos de 0,05 mg/L, menos de 0,01 mg/L, menos de 0,005 mg/L, menos de 0,001 mg/L, menos de 0,0005 mg/L, menos de 0,0001 mg/L, o nada de vitamina B12.

En algunas realizaciones, el medio de cultivo comprende menos de 1 g de fuentes de vitamina B12 (tales como extracto de levadura, sólidos de maíz fermentado, harina de soja, y otras fuentes de nitrógeno complejas) por cada 50 g de biomasa exenta de lípidos. En algunas realizaciones, el medio de cultivo comprende menos de 0,8 g, menos de 0,5 g, menos de 0,3 g, menos de 0,1 g, menos de 0,05 g o menos de 0,01 g de fuentes de vitamina B12 de este tipo por cada 50 g de biomasa exenta de lípidos. En algunas realizaciones, el medio de cultivo comprende, además, menos de g de extracto de levadura por cada 50 g de biomasa exenta de lípidos, menos de 0,8 g de extracto de levadura por cada 50 g de biomasa exenta de lípidos, menos de 0,5 g de extracto de levadura por cada 50 g de biomasa exenta de lípidos, menos de 0,3 g de extracto de levadura por cada 50 g de biomasa exenta de lípidos, menos de 0,1 g de extracto de levadura por cada 50 g de biomasa exenta de lípidos, menos de 0,05 g de extracto de levadura por cada 50 g de biomasa exenta de lípidos, o menos de 0,01 g de extracto de levadura por cada 50 g de biomasa exenta de lípidos. Tal como se utiliza en esta memoria, la expresión "biomasa exenta de lípidos" se refiere al peso de células secas, exentas de grasa, objetivo del microorganismo después del cultivo.

En algunas realizaciones, la concentración de EPA de la biomasa cultivada en un medio de cultivo que comprende un nivel más bajo de vitamina B12 (por ejemplo, en un medio de cultivo que comprende menos de 0,1 mg/L, menos de 0,05 mg/L, menos de 0,01 mg/L, menos de 0.005 mg/L, menos de 0,001 mg/L, menos de 0.0005 mg/L, menos de 0,0001 mg/L, o nada de vitamina B12) es al menos 10%, al menos 25%, al menos 50%, al menos 75%, al menos 100%, al menos 150%, al menos 200%, al menos 250%, al menos 300%, al menos 350%, al menos 400%, al menos 450%, al menos 500%, al menos 550%, al menos 600%, al menos 650% o al menos 700% más alta que la concentración de EPA en una biomasa obtenida del microorganismo cultivado en un medio de cultivo que comprende niveles más altos de vitamina B12 (por ejemplo, en un medio de cultivo que comprende al menos 0.1 mg/L, al menos 0,05 mg/L, al menos 0,01 mg/L, al menos 0,005 mg/L, al menos 0,001 mg/L, al menos 0,0005 mg/L, al menos 0,0001 mg/L o al menos 0,00005 mg/L de vitamina B12, respectivamente). Por ejemplo, la concentración de EPA de la biomasa cultivada en un medio de cultivo que no contiene vitamina B12 es al menos 10%, al menos 25%, al menos 50%, al menos 75%, al menos 100%, al menos 150%, al menos al menos 200%, al menos 250%, al menos 300%, al menos 350%, al menos 400%, al menos 450%, al menos 500%, al menos 550%, al menos 600%, al menos 650% o al menos un 700% más alta que la concentración de EPA en una biomasa obtenida del microorganismo cultivado en un medio de cultivo que comprende vitamina B12 (tal como al menos 0,0001 mg/L de vitamina B12).

En algunas realizaciones, la concentración de EPA de la biomasa cultivada en un medio de cultivo que comprende niveles inferiores de vitamina B12 (por ejemplo, en un medio de cultivo que comprende menos de 0,1 mg/L, menos de 0,05 mg/L, menos de 0,01 mg/L, menos de 0,005 mg/L, menos de 0,001 mg/L, menos de 0,0005 mg/L, menos de 0,0001 mg/L, o nada de vitamina B12) bajo un nivel de CO2 ambiental es al menos 100%, al menos 200%, al menos 300%, al menos 400% o al menos 500% mayor que la concentración de EPA en una biomasa obtenida del microorganismo cultivado en un medio de cultivo que comprende niveles más altos de vitamina B12 (por ejemplo, en un medio de cultivo que comprende al menos 0,1 mg/L, al menos 0,05 mg/L, al menos 0,01 mg/L, al menos 0,005 mg/L, al menos 0,001 mg/L, al menos 0,0005 mg/L, al menos 0,0001 mg/L o al menos 0,00005 mg/L de vitamina B12, respectivamente) bajo un nivel de CO2 ambiental. En algunas realizaciones, la concentración de EPA de la biomasa cultivada en un medio de cultivo que comprende niveles más bajos de vitamina B12 bajo un nivel de CO2 ambiental es del 100% al 700%, del 150% al 650%, del 200% al 600%, del 250% al 550% o del 300% al 500% mayor que la concentración de EPA en una biomasa obtenida a partir del microorganismo cultivado en un medio de cultivo que comprende niveles más altos de vitamina B12 bajo un nivel de CO2 ambiental. En algunas realizaciones, la concentración de EPA de la biomasa cultivada en un medio de cultivo que comprende niveles más bajos de vitamina B12 bajo un nivel alto de CO2 (por ejemplo, un nivel de CO2 disuelto de al menos 5%, al menos 10%, al menos 15% o al menos 20%) es al menos 5%, al menos 10%, al menos 15%, al menos 20%, al menos 25%, al menos 30%, al menos 40%, al menos 50%, al menos 60 %, al menos 70%, al menos 80%, al menos 90% o al menos 100% más alta que la concentración de EPA en una biomasa obtenida del microorganismo cultivado en un medio de cultivo que comprende niveles más altos de vitamina B12 bajo un nivel alto de CO2. En algunas realizaciones, la concentración de EPA de la biomasa cultivada en un medio de cultivo que comprende niveles más bajos de vitamina B12 bajo un nivel alto de CO2 (por ejemplo, un nivel de CO2 disuelto de al menos 5%, al menos 10%, al menos 15% o al menos 20%) es 5% a 200%, 10% a 175%, 15% a 150%, 20% a 125% o 25% a 100% más alta que la concentración de EPA en una biomasa obtenida del microorganismo cultivado en un medio de cultivo que comprende niveles más altos de vitamina B12 bajo un nivel alto de CO2. Por ejemplo, la concentración de EPA de la biomasa cultivada en un medio de cultivo que no contiene vitamina B12 bajo un nivel de CO2 ambiental es al menos 100%, al menos 200%, al menos 300%, al menos 400% o al menos 500% mayor que la concentración de EPA en una biomasa obtenida a partir del microorganismo cultivado en un medio de cultivo que comprende vitamina B12 (tal como al menos 0,0001 mg/L de vitamina B12) bajo un nivel de CO2 ambiental. Como otro ejemplo, la concentración de EPA de la biomasa cultivada en un medio de cultivo que no comprende vitamina B12 bajo un nivel de CO2 disuelto de al menos 10% es al menos 5%, al menos 10%, al menos 15%, al menos 20%, al menos 25%, al menos 30%, al menos 40%, al menos 50%, al menos 60%, al menos 70%, al menos 80%, al menos 90% o al menos 100% más alto que la concentración de EPA en una biomasa obtenida del microorganismo cultivado en un medio de cultivo que comprende vitamina B12 (tal como al menos 0,0001 mg/L de vitamina B12) bajo un nivel de CO2 disuelto de al menos 10%.

En algunas realizaciones, la concentración de EPA se incrementa en al menos 100%, al menos 200%, al menos 300%, al menos 400% o al menos 500% en la biomasa de un microorganismo cultivado en un medio de cultivo que tiene menos de 0,1 mg/L de vitamina B12 en comparación con el mismo microorganismo cultivado en un medio de cultivo que tiene más de 0,1 mg/L de vitamina B12. En algunas realizaciones, la concentración de EPA se incrementa en al menos 100%, al menos 200%, al menos 300%, al menos 400% o al menos 500% en la biomasa de un microorganismo cultivado en un medio de cultivo que tiene menos de 0,01 mg/L de vitamina B12 en comparación con el mismo microorganismo cultivado en un medio de cultivo que tiene más de 0,01 mg/L de vitamina B12. En algunas realizaciones, la concentración de EPA aumenta en al menos 100%, al menos 200%, al menos 300%, al menos 400% o al menos 500% en la biomasa de un microorganismo cultivado en un medio de cultivo que tiene menos de 0,001 mg/L de vitamina B12 en comparación con el mismo microorganismo cultivado en un medio de cultivo que tiene más de 0,001 mg/L de vitamina B12. En realizaciones adicionales, la concentración de EPA se incrementa en al menos un 100%, al menos un 200%, al menos un 300%, al menos un 400% o al menos un 500% en la biomasa de un microorganismo cultivado en un medio de cultivo que tiene menos de 0,0001 mg/L de vitamina B12 en comparación con el mismo microorganismo cultivado en un medio de cultivo que tiene más de 0,0001 mg/L de vitamina B12. En algunas realizaciones, la concentración de EPA aumenta en al menos un 100%, al menos un 200%, al menos un 300%, al menos un 400% o al menos un 500% en la biomasa de un microorganismo cultivado en un medio de cultivo que no tiene vitamina B12 en comparación con el mismo microorganismo cultivado en un medio de cultivo que contiene una cantidad de vitamina B12. La determinación del incremento de la concentración de EPA en la biomasa se puede realizar cultivando un microorganismo en un medio de cultivo que tenga mayores cantidades de vitamina B12, cultivando el mismo microorganismo en un medio de cultivo que tenga menores cantidades de vitamina B12 y comparando la concentración de EPA en la biomasa resultante de cada uno de los cultivos. En esta determinación, el contenido de los medios de cultivo que tienen cantidades más bajas o más altas de vitamina B12 es el mismo excepto por su nivel de vitamina B12.

En algunas realizaciones, la concentración de EPA de la biomasa del microorganismo cultivado en un medio de cultivo que comprende al menos 0,1 mg/L, al menos 0,05 mg/L, al menos 0,01 mg/L, al menos 0,005 mg/L, al menos 0,001 mg/L, al menos 0,0005 mg/L o al menos 0,0001 mg/L de vitamina B12 es al menos 1%, al menos 2%, al menos 3%, al menos 4% o al menos 5% de EPA en peso de los ácidos grasos totales. En algunas realizaciones, la concentración de EPA de la biomasa del microorganismo cultivado en un medio de cultivo que comprende al menos 0,1 mg/L, al menos 0,05 mg/L, al menos 0,01 mg/L, al menos 0,005 mg/L, al menos 0,001 mg/L, al menos 0,0005 mg/L o al menos 0,0001 mg/L de vitamina B12 es 1% a 50%, 1% a 40%, 1% a 30%, 1% a 20%, 2% a 50%, 2% a 40%, 2% a 30% o 2% a 20% de EPA en peso de los ácidos grasos totales.

Cobalto en Medio de Cultivo

En algunas realizaciones, la divulgación proporciona métodos de producir una biomasa de un microorganismo que tiene una concentración incrementada de EPA, que comprende cultivar el microorganismo en un medio de cultivo que comprende menos de 0,1 mg/L de cobalto para producir una biomasa. En algunas realizaciones, el medio de cultivo comprende menos de 0,05 mg/L, menos de 0,01 mg/L, menos de 0,005 mg/L, menos de 0,001 mg/L, menos de 0,0005 mg/L, menos de 0,0001 mg/L o nada de cobalto.

En algunas realizaciones, el medio de cultivo comprende, además, menos de 1 g de extracto de levadura por cada 50 g de biomasa exenta de lípidos, menos de 0,8 g de extracto de levadura por cada 50 g de biomasa exenta de lípidos, menos de 0,5 g de extracto de levadura por cada 50 g de biomasa exenta de lípidos, menos de 0,3 g de extracto de levadura por cada 50 g de biomasa exenta de lípidos, menos de 0,1 g de extracto de levadura por cada 50 g de biomasa exenta de lípidos, menos de 0,05 g de extracto de levadura por cada 50 g de biomasa exenta de lípidos o menos de 0,01 g de extracto de levadura por cada 50 g de biomasa exenta de lípidos.

En algunas realizaciones, la concentración de EPA de la biomasa cultivada en un medio de cultivo que comprende un nivel de cobalto inferior (por ejemplo, en un medio de cultivo que comprende menos de 0,1 mg/L, menos de 0,05 mg/L, menos de 0,01 mg/L, menos de 0,005 mg/L, menos de 0,001 mg/L, menos de 0,0005 mg/L, menos de 0,0001 mg/L o nada de cobalto) es al menos 10%, al menos 25%, al menos 50%, al menos 75%, al menos 100%, al menos 150%, al menos 200%, al menos 250%, al menos 300%, al menos 350%, al menos 400%, al menos 450%, al menos 500%, al menos 550%, al menos 600%, al menos 650% o al menos 700% mayor que la concentración de EPA en una biomasa obtenida del microorganismo cultivado en un medio de cultivo que comprende niveles de cobalto más altos (por ejemplo, en un medio de cultivo que comprende al menos 0,1 mg/L, al menos 0,05 mg/L, al menos 0,01 mg/L, al menos 0,005 mg/L, al menos 0,001 mg/L, al menos 0,0005 mg/L, al menos 0,0001 mg/L o al menos 0,00005 mg/L de cobalto, respectivamente). Por ejemplo, la concentración de EPA de la biomasa cultivada en un medio de cultivo que no contiene cobalto es al menos 10%, al menos 25%, al menos 50%, al menos 75%, al menos 100%, al menos 150%, al menos 200%, al menos 250%, al menos 300%, al menos 350%, al menos 400%, al menos 450%, al menos 500%, al menos 550%, al menos 600%, al menos 650% o al menos 700% más alta que la concentración de EPA en una biomasa obtenida del microorganismo cultivado en un medio de cultivo que comprende cobalto (tal como al menos 0,0001 mg/L de cobalto).

En algunas realizaciones, la concentración de EPA de la biomasa cultivada en un medio de cultivo que comprende niveles de cobalto más bajos (por ejemplo, en un medio de cultivo que comprende menos de 0,1 mg/L, menos de 0,05 mg/L, menos de 0,01 mg/L, menos de 0,005 mg/L, menos de 0,001 mg/L, menos de 0,0005 mg/L, menos de 0,0001 mg/L o nada de cobalto) bajo un nivel de CO2 ambiental es al menos 100%, al menos 200%, al menos 300%, al menos 400% o al menos 500% más alta que la concentración de EPA en una biomasa obtenida del microorganismo cultivado en un medio de cultivo que comprende niveles de cobalto más altos (por ejemplo, en un medio de cultivo que comprende al menos 0,1 mg/L, al menos 0,05 mg/L, al menos 0,01 mg/L, al menos 0,005 mg/L, al menos 0,001 mg/L, al menos 0,0005 mg/L, al menos 0,0001 mg/L o al menos 0,00005 mg/L de cobalto, respectivamente) bajo un nivel de CO2 ambiental. En algunas realizaciones, la concentración de EPA de la biomasa cultivada en un medio de cultivo que comprende niveles más bajos de cobalto bajo un nivel de CO2 ambiental es del 100% al 700%, del 150% al 650%, del 200% al 600%, del 250% al 550% o del 300% al 500% mayor que la concentración de EPA en una biomasa obtenida a partir del microorganismo cultivado en un medio de cultivo que comprende niveles de cobalto superiores bajo un nivel de CO2 ambiental. En algunas realizaciones, la concentración de EPA de la biomasa cultivada en un medio de cultivo que comprende niveles más bajos de cobalto bajo un nivel alto de CO2 (por ejemplo, un nivel de CO2 disuelto de al menos 5%, al menos 10%, al menos 15% o al menos 20%) es al menos 5%, al menos 10%, al menos 15%, al menos 20%, al menos 25%, al menos 30%, al menos 40%, al menos 50%, al menos 60%, al menos 70%, al menos 80%, al menos 90% o al menos 100% mayor que la concentración de EPA en una biomasa obtenida del microorganismo cultivado en un medio de cultivo que comprende niveles de cobalto más altos bajo un nivel alto de CO2. En algunas realizaciones, la concentración de EPA de la biomasa cultivada en un medio de cultivo que comprende niveles más bajos de cobalto bajo un nivel alto de CO2 (por ejemplo, un nivel de CO2 disuelto de al menos 5%, al menos 10%, al menos 15% o al menos 20%) es del 5% al 200%, del 10% al 175%, del 15% al 150%, del 20% al 125% o del 25% al 100% mayor que la concentración de EPA en una biomasa obtenida del microorganismo cultivado en un medio de cultivo que comprende niveles más altos de cobalto bajo un nivel alto de CO2. Por ejemplo, la concentración de EPA de la biomasa cultivada en un medio de cultivo que no contiene cobalto bajo un nivel de CO2 ambiental es al menos 100%, al menos 200%, al menos 300%, al menos 400% o al menos 500% mayor que la concentración de EPA en una biomasa obtenida a partir del microorganismo cultivado en un medio de cultivo que comprende cobalto (tal como al menos 0,0001 mg/L de cobalto) bajo un nivel de CO2 ambiental. Como otro ejemplo, la concentración de EPA de la biomasa cultivada en un medio de cultivo que no comprende cobalto bajo un nivel de CO2 disuelto de al menos 10% es al menos 5%, al menos 10%, al menos 15%, al menos 20%, al menos 25%, al menos 30%, al menos 40%, al menos 50%, al menos 60%, al menos 70%, al menos 80%, al menos 90% o al menos 100% mayor que la concentración de EPA en una biomasa obtenida del microorganismo cultivado en un medio de cultivo que comprende cobalto (tal como al menos 0,0001 mg/L de cobalto) bajo un nivel de CO2 disuelto de al menos 10%.

En algunas realizaciones, la concentración de EPA se incrementa en al menos 100%, al menos 200%, al menos 300%, al menos 400% o al menos 500% en la biomasa de un microorganismo cultivado en un medio de cultivo que tiene menos de 0,1 mg/L de cobalto en comparación con el mismo microorganismo cultivado en un medio de cultivo que tiene más de 0,1 mg/L de cobalto. En algunas realizaciones, la concentración de EPA se incrementa en al menos 100%, al menos 200%, al menos 300%, al menos 400% o al menos 500% en la biomasa de un microorganismo cultivado en un medio de cultivo que tiene menos de 0,01 mg/L de cobalto en comparación con el mismo microorganismo cultivado en un medio de cultivo que tiene más de 0,01 mg/L de cobalto. En algunas realizaciones, la concentración de EPA se incrementa en al menos 100%, al menos 200%, al menos 300%, al menos 400% o al menos 500% en la biomasa de un microorganismo cultivado en un medio de cultivo que tiene menos de 0,001 mg/L de cobalto en comparación con el mismo microorganismo cultivado en un medio de cultivo que tiene más de 0,001 mg/L de cobalto. En realizaciones adicionales, la concentración de EPA se incrementa en al menos 100%, al menos 200%, al menos 300%, al menos 400% o al menos 500% en la biomasa de un microorganismo cultivado en un medio de cultivo que tiene menos de 0,0001 mg/L de cobalto en comparación con el mismo microorganismo cultivado en un medio de cultivo que tiene más de 0,0001 mg/L de cobalto. En algunas realizaciones, la concentración de EPA se incrementa en al menos 100%, al menos 200%, al menos 300%, al menos 400% o al menos 500% en la biomasa de un microorganismo cultivado en un medio de cultivo que no tiene cobalto en comparación con el mismo microorganismo cultivado en un medio de cultivo que contiene una cantidad de cobalto. La determinación del incremento en la concentración de EPA en la biomasa se puede realizar cultivando un microorganismo en un medio de cultivo que tenga altas cantidades de cobalto, cultivando el mismo microorganismo en un medio de cultivo que tenga bajas cantidades de cobalto y comparando la concentración de EPA en la biomasa resultante de cada uno de los cultivos. En esta determinación, el contenido de los medios de cultivo que tienen cantidades más bajas o más altas de cobalto es el mismo excepto por su nivel de cobalto.

En algunas realizaciones, la concentración de EPA de la biomasa del microorganismo cultivado en un medio de cultivo que comprende al menos 0,1 mg/L, al menos 0,05 mg/L, al menos 0,01 mg/L, al menos 0,005 mg/L, al menos 0,001 mg/L, al menos 0,0005 mg/L o al menos 0,0001 mg/L de cobalto es al menos 1%, al menos 2%, al menos 3%, al menos 4% o al menos 5% de EPA en peso de los ácidos grasos totales. En algunas realizaciones, la concentración de EPA de la biomasa del microorganismo cultivado en un medio de cultivo que comprende al menos 0,1 mg/L, al menos 0,05 mg/L, al menos 0,01 mg/L, al menos 0,005 mg/L, al menos 0,001 mg/L, al menos 0,0005 mg/L o al menos 0,0001 mg/L de cobalto es % a 50%, 1% a 40%, 1% a 30%, 1% a 20%, 2% a 50%, 2% a 40%, 2% a 30% o 2% a 20% de EPA en peso de los ácidos grasos totales.

El medio de cultivo que contiene bajas cantidades de vitamina B12, extracto de levadura y/o cobalto podría comprender, además, un nivel de CO2 disuelto de al menos 5%, al menos 10%, al menos 15% o al menos 20%. La presente invención está dirigida a una biomasa aislada de los métodos descritos en esta memoria, así como a un aceite microbiano extraído de la biomasa de los métodos.

La presente divulgación está dirigida a un cultivo aislado que comprende cualquiera de los microorganismos de la divulgación o mezclas de los mismos.

La presente divulgación está dirigida a un producto alimenticio, cosmético o la composición farmacéutica para un animal no humano o ser humano, que comprende cualquiera de los microorganismos o biomasas de la divulgación o mezclas de los mismos.

La presente divulgación está dirigida a un aceite microbiano que comprende al menos aproximadamente 20% en peso de ácido eicosapentaenoico y menos de aproximadamente 5% en peso de cada uno de ácido araquidónico, docosapentaenoico ácido n-6, ácido oleico, ácido linoleico, ácido linolénico, ácido eicosenoico, ácido erúcico y ácido estearidónico. En algunas realizaciones, el aceite microbiano comprende, además, al menos aproximadamente 25% en peso de ácido docosahexaenoico.

La presente divulgación está dirigida a un aceite microbiano que comprende una fracción de triacilglicerol de al menos aproximadamente 10% en peso, en donde al menos aproximadamente 12% en peso de los ácidos grasos en la fracción de triacilglicerol es ácido eicosapentaenoico, en donde al menos aproximadamente 25 % en peso de los ácidos grasos en la fracción de triacilglicerol es ácido docosahexaenoico, y en donde menos de aproximadamente 5% en peso de los ácidos grasos en la fracción de triacilglicerol es ácido araquidónico.

La presente divulgación está dirigida a un producto alimenticio, cosmético o composición farmacéutica para un animal no humano o ser humano, que comprende cualquiera de los aceites microbianos de la divulgación. En algunas realizaciones, el producto alimenticio es una fórmula infantil. En algunas realizaciones, la fórmula infantil es adecuada para bebés prematuros. En algunas realizaciones, el producto alimenticio es una leche, una bebida, una bebida terapéutica, una bebida nutricional o una combinación de las mismas. En algunas realizaciones, el producto alimenticio es un aditivo para el alimento para el animal no humano o el ser humano. En algunas realizaciones, el producto alimenticio es un complemento nutricional. En algunas realizaciones, el producto alimenticio es una alimentación para animales. En algunas realizaciones, la alimentación para animales es una alimentación para acuicultura. En algunas realizaciones, la alimentación para animales es una alimentación para animales domésticos, una alimentación para animales de zoológicos, una alimentación para animales de trabajo, una alimentación para ganado o una combinación de las mismas.

La presente divulgación está dirigida a un método para producir un aceite microbiano que comprende ácidos grasos omega-3, comprendiendo el método: cultivar cualquiera de los microorganismos aislados de la divulgación o mezclas de los mismos en un cultivo para producir un aceite que comprende ácidos grasos omega-3. En algunas realizaciones, el método comprende además extraer el aceite.

La presente divulgación está dirigida a un método para producir un aceite microbiano que comprende ácidos grasos omega-3, comprendiendo el método extraer un aceite que comprende ácidos grasos omega-3, ácidos grasos de cualquiera de las biomasas de la divulgación. En algunas realizaciones, el aceite microbiano se extrae utilizando un proceso de extracción con disolvente orgánico, por ejemplo, extracción con hexano. En algunas realizaciones, el aceite microbiano se extrae utilizando un proceso de extracción sin disolvente.

La presente divulgación está dirigida a un aceite microbiano producido por un método de la invención.

La presente divulgación está dirigida a un método para producir una biomasa de la divulgación, que comprende: cultivar cualquiera de los microorganismos aislados de la invención o mezclas de los mismos en un cultivo para producir una biomasa.

La presente divulgación está dirigida a una biomasa producida por un método de la invención.

La presente divulgación está dirigida a un método para producir una cepa mutante de la invención, que comprende: la mutagénesis de cualquiera de los microorganismos de la invención y el aislamiento de la cepa mutante.

La presente divulgación está dirigida al uso de cualquiera de los microorganismos aislados, biomasas o aceites microbianos de la divulgación, o mezclas de los mismos, para la fabricación de un medicamento para el tratamiento de la inflamación o una afección relacionada con la misma.

La presente divulgación está dirigida al uso de cualquiera de los microorganismos aislados, biomasas o aceites microbianos de la divulgación, o mezclas de los mismos, para el tratamiento de la inflamación o una afección relacionada con la misma.

La presente divulgación está dirigida a cualquiera de los microorganismos aislados, biomasas o aceites microbianos de la divulgación, o mezclas de los mismos, para uso en el tratamiento de la inflamación o una afección relacionada con la misma.

La presente divulgación está dirigida a un método para tratar la inflamación o una afección relacionada con la misma en un sujeto en necesidad del mismo, que comprende administrar al sujeto cualquiera de los microorganismos aislados, biomasas o aceites microbianos de la divulgación, o mezclas de los mismos, y un soporte farmacéuticamente aceptable.

La presente invención está dirigida a métodos para producir los aceites microbianos a partir de los microorganismos de la divulgación, y a métodos de uso de los aceites microbianos.

Microorganismos

La célula microbiana para uso con la presente invención es un traustocítrido, tal como un Schizochytrium o Thraustochytrium. De acuerdo con la presente invención, el término “traustocítrido" se refiere a cualquier miembro del orden Thraustochytriales, que incluye la familia Thraustochytriaceae, y el término "laberintúlido" se refiere a cualquier miembro del orden Labyrinthulales, que incluye la familia Labyrinthulaceae.

Miembros de la familia Labyrinthulaceae fueron considerados previamente como miembros del orden Thraustochytriales, pero en revisiones más recientes de la clasificación taxonómica de dichos organismos, ahora se considera que la familia Labyrinthulaceae es un miembro de la orden Labyrinthulales. Tanto Labyrinthulales como Thraustochytriales se consideran miembros del filo Labyrinthulomycota. Los teóricos taxonómicos ahora colocan generalmente ambos grupos de microorganismos con las algas o protistas similares a las algas del linaje Stramenopile. La ubicación taxonómica actual de los traustocítridos y laberintúlidos se puede resumir de la siguiente manera:

Reino: Stramenopila (Chromista )

Filo: Labyrinthulomycota (Heterokonta)

Clase: Labyrinthulomycetes (Labyrinthulae)

Orden: Labyrinthulales

Familia: Labyrinthulaceae

Orden: Thraustochytriales

Familia: Thraustochytriaceae

Para los propósitos de la presente invención, cepas de células microbianas descritas como traustocítridos incluyen los siguientes organismos: Orden: Thraustochytriales; Familia: Thraustochytriaceae; Género: Thraustochytrium (Especies: Sp, arudimentale, aureum, benthicola, globosum, kinnei, motivum, multirudimentale, pachydermum, proliferum, roseum y striatum), Ulkenia (Especies:. Sp, amoeboidea, kerguelensis, minuta, profunda, radiata, sailens, sarkariana, schizochytrops, visurgensis, yorkensis y sp. BP-5601), Schizochytrium (Especies: sp, aggregatum, limnaceum, mangrovei, minutum y octosporum), Japonochytrium (Especies: sp, marinum). Aplanochytrium (Especies: Sp, haliotidis, kerguelensis, profunda y stocchinoi). Althornia (Especies: sp., crouchii) o Elina (Especies: sp, marisalba y sinorifica). Para los propósitos de esta invención, las especies descritas dentro de Ulkenia se considerarán miembros del género Thraustochytrium. Aurantiacochytrium y Oblogospora son dos géneros adicionales abarcados por el filo Labyrinthulomycota en la presente invención. En algunas realizaciones, una célula microbiana es del género Thraustochystrium, Schizochytrium y mezclas de los mismos.

La divulgación está dirigida a microorganismos aislados y cepas derivadas de los mismos. Una cepa que se "deriva" de un microorganismo aislado de la invención puede ser un derivado natural o artificial, tal como, por ejemplo, una cepa mutante, variante o recombinante. El término "aislado", tal como se utiliza en esta memoria, no refleja necesariamente el grado en el que se ha purificado un componente aislado, sino que indica aislamiento o separación de una forma nativa o entorno nativo. Un componente aislado puede incluir, pero no se limita a un microorganismo aislado, una biomasa aislada, un cultivo aislado, un aceite microbiano aislado y una secuencia aislada (tal como una secuencia de polinucleótidos aislada descrita en esta memoria). El término "microorganismo", tal como se utiliza en esta memoria, incluye, pero no se limita a los términos "microalgas", "traustocítrido" y clasificaciones taxonómicas asociadas con cualquiera de los microorganismos depositados descritos en esta memoria. Los términos "Thraustochytriales", "traustocítrido", "Schizochytrium' y "Thraustochytrium', tal como se utilizan en referencia a cualquiera de los microorganismos de la invención, incluyendo los microorganismos depositados descritos en esta memoria, se basan en las clasificaciones taxonómicas presentes que incluyen información filogenética disponible y no pretenden ser limitantes en el caso de que las clasificaciones taxonómicas sean revisadas después de la fecha de presentación de la presente solicitud.

En algunas realizaciones, la divulgación está dirigida a un microorganismo aislado de las especies depositadas en la ATCC bajo el N° de Acceso PTA-10212. El microorganismo aislado asociado con el número de acceso de la ATCC PTA-10212 también se conoce en la presente memoria como Thraustochytrium sp. ATCC PTA-10212. El microorganismo aislado asociado con el N° de Acceso PTA-10212 de la ATCC fue depositado bajo el Tratado de Budapest el 14 de julio de 2009 en la American Type Culture Collection, Patent Depository, 10801 University Boulevard, Manassas, VA 20110-2209. En algunas realizaciones, la invención está dirigida a una cepa aislada depositada en la ATCC con el N° de Acceso PTA-10212. En algunas realizaciones, la divulgación está dirigida a un microorganismo aislado depositado en la ATCC con el N° de Acceso PTA-10212, PTA-10213, PTA-10214, PTA-10215, PTA-10208, PTA-10209, PTA-10210 o PTA-10211.

En algunas realizaciones, la divulgación está dirigida a un microorganismo aislado que tiene las características de la especie depositada en la ATCC bajo el N° de Acceso PTA-10212 o una cepa derivada de la misma. Las características de la especie depositada en la ATCC bajo el N° de Acceso PTA-10212 pueden incluir su crecimiento y propiedades fenotípicas (ejemplos de propiedades fenotípicas incluyen propiedades morfológicas y reproductivas), sus propiedades físicas y químicas (tales como pesos secos y perfiles lipídicos), sus secuencias génicas y combinaciones de las mismas, en las que las características distinguen a la especie frente a especies previamente identificadas. En algunas realizaciones, la divulgación está dirigida a un microorganismo aislado que tiene las características de la especie depositada en la ATCC bajo el N° de Acceso PTA-10212, en donde las características incluyen un ARNr 18s que comprende la secuencia de polinucleótidos de SEQ ID NO: 1 o una secuencia de polinucleótidos que tiene al menos 94%, 95%, 96%, 97%, 98% o 99% de identidad con SEQ ID NO: 1, las propiedades morfológicas y reproductivas de las especies depositadas en la ATCC bajo el N° de Acceso PTA-10212, y los perfiles de ácido graso de las especies depositadas en la ATCC con el N° de acceso PTA-10212. En algunas realizaciones, los microorganismos aislados de la divulgación tienen propiedades fenotípicas sustancialmente idénticas a las del microorganismo depositado en la ATCC con el N° de acceso PTA-10212. En algunas realizaciones, los microorganismos aislados de la divulgación tienen propiedades de crecimiento sustancialmente idénticas a las del microorganismo depositado en la ATCC con el N° de acceso PTA-10212. En algunas realizaciones, la divulgación está dirigida a un microorganismo aislado que comprende un ARNr 18s que comprende la secuencia de polinucleótidos de SEQ ID NO: 1 o una secuencia de polinucleótidos que tiene al menos 94%, 95%, 96%, 97%, 98% o 99 % de identidad con SEQ ID NO: 1. En algunas realizaciones, la divulgación está dirigida a un microorganismo aislado que comprende una secuencia de polinucleótidos de ARNr 18s que tiene al menos un 94% de identidad con la secuencia de polinucleótidos de ARNr 18s del microorganismo depositado en la ATCC con el N° de acceso PTA-10212.

En algunas realizaciones, la divulgación se refiere a una cepa mutante del microorganismo depositado en la ATCC bajo el N° de acceso ATCC PTA-10212. En realizaciones adicionales, la cepa mutante es una cepa depositada en la ATCC con el N° de acceso PTA-10213, PTA-10214 o PTA-10215. Los microorganismos asociados con los N°s de acceso de la ATCC PTA-10213, PTA-10214 y PTA-10215 se depositaron bajo el Tratado de Budapest el 14 de julio de 2009 en la American Type Culture Collection, Patent Depository, 10801 University Boulevard, Manassas, VA 20110­ 2209.

En algunas realizaciones, la divulgación se refiere a un microorganismo aislado de la especie depositada en la ATCC con el N° de Acceso PTA-10208. El microorganismo aislado asociado con el N° de acceso de la ATCC PTA-10208 también se conoce en esta memoria como Schizochytrium sp. ATCC PTA-10208. El microorganismo asociado con el N° de Acceso PTA-10208 de la ATCC fue depositado bajo el Tratado de Budapest el 14 de julio de 2009 en la American Type Culture Collection, Patent Depository, 10801 University Boulevard, Manassas, VA 20110-2209. En algunas realizaciones, la divulgación se dirige a una cepa aislada depositada en la ATCC bajo el N° de Acceso PTA-10208.

En algunas realizaciones, la divulgación se refiere a un microorganismo aislado de la especie depositada en la ATCC bajo el N° de Acceso PTA-10208, en donde los ácidos grasos totales producidos por el microorganismo comprende más de aproximadamente 10%, más de aproximadamente 11%, más de aproximadamente 12%, más de aproximadamente 13%, más de aproximadamente 14%, más de aproximadamente 15%, más de aproximadamente 16%, más de aproximadamente 17%, más de aproximadamente 18%, más de aproximadamente 19% o más de aproximadamente 20% en peso de EPA. En algunas realizaciones, la divulgación está dirigida a un microorganismo aislado de la especie depositada en la ATCC bajo el N° de Acceso PTA-10208, en donde los ácidos grasos totales producidos por el microorganismo comprenden aproximadamente 10% a aproximadamente 55%, aproximadamente 10% a aproximadamente 50%, aproximadamente 10% a aproximadamente 45%, aproximadamente 10% a aproximadamente 40%, aproximadamente 10% a aproximadamente 35%, aproximadamente 10% a aproximadamente 30%, aproximadamente 15% a aproximadamente 55%, aproximadamente 15% a aproximadamente 50%, aproximadamente 15% a aproximadamente 45%, aproximadamente 15% a aproximadamente 40%, aproximadamente 15% a aproximadamente 35%, aproximadamente 15% a aproximadamente 30%, aproximadamente 20% a aproximadamente 55%, aproximadamente 20% a aproximadamente 50%, aproximadamente 20% a aproximadamente 45%, aproximadamente 20% a aproximadamente 40%, aproximadamente 20% a aproximadamente 35% o aproximadamente 20% a aproximadamente 30% en peso de EPA.

En algunas realizaciones, la divulgación está dirigida a un microorganismo aislado que tiene las características de la especie depositadas en la ATCC bajo el N° de acceso PTA-10208, en donde los ácidos grasos totales producidos por el microorganismo comprenden más de aproximadamente 10% en peso de ácido eicosapentaenoico. Las características del microorganismo depositado en la ATCC bajo el N° de Acceso PTA-10208 incluyen su crecimiento y propiedades fenotípicas (ejemplos de propiedades fenotípicas incluyen propiedades morfológicas y reproductivas), sus propiedades físicas y químicas (tales como pesos secos y perfiles de lípidos), sus secuencias génicas y combinaciones de las mismas, en que las características distinguen a la especie frente a especies previamente identificadas. En algunas realizaciones, la divulgación está dirigida a un microorganismo aislado que tiene las características de la especie depositada en la ATCC bajo el N° de Acceso PTA-10212, en donde las características incluyen un ARNr 18s que comprende la secuencia de polinucleótidos de SEQ ID NO: 2, las propiedades morfológicas y reproductivas de las especies depositadas en la ATCC bajo el N° de Acceso PTA-10208, y los perfiles de ácidos grasos de las especies depositadas en la ATCC bajo el N° de Acceso PTA-10208. En algunas realizaciones, los microorganismos aislados de la invención tienen propiedades físicas y químicas sustancialmente idénticas a las del microorganismo depositado en la ATCC bajo el N° de Acceso PTA-10208.

En algunas realizaciones, la divulgación está dirigida a una cepa mutante del microorganismo depositado en la ATCC bajo el N° de Acceso PTA-10208. En realizaciones adicionales, la cepa mutante es una cepa depositada en la ATCC bajo el N° de Acceso PTA-10209, PTA-10210 o PTA-10211. Los microorganismos asociados con los N°s de Acceso de la ATCC PTA-10209, PTA-10210 y PTA-10211 fueron depositado bajo el Tratado de Budapest el 25 de septiembre de 2009 en la American Type Culture Collection, Patent Depository, 10801 University Boulevard, Manassas, VA 20110­ 2209.

En algunas realizaciones, la divulgación está dirigida a un microorganismo aislado de la invención que produce una fracción de triacilglicerol, en donde el contenido de EPA de la fracción de triacilglicerol es al menos aproximadamente el 12%, al menos aproximadamente el 13%, al menos aproximadamente el 14%, al menos aproximadamente el 15%, al menos aproximadamente el 16%, al menos aproximadamente el 17%, al menos aproximadamente el 18%, al menos aproximadamente el 19%, o al menos aproximadamente el 20% en peso. En algunas realizaciones, la divulgación está dirigida a un microorganismo aislado que produce una fracción de triacilglicerol, en donde el contenido de EPA de la fracción de triacilglicerol es aproximadamente 12% a aproximadamente 55%, aproximadamente 12% a aproximadamente 50%, aproximadamente 12% a aproximadamente 45%. aproximadamente 12% a aproximadamente 40%, aproximadamente 12% a aproximadamente 35%, aproximadamente 12% a aproximadamente 30%, aproximadamente 15% a aproximadamente 45%, aproximadamente 15% a aproximadamente 40%, aproximadamente 15% a aproximadamente 35%, aproximadamente 15% a aproximadamente 30% o aproximadamente 20% a aproximadamente 30% en peso.

En algunas realizaciones, la divulgación está dirigida a un mutante, variante o recombinante de un microorganismo aislado de la invención que produce una fracción de triacilglicerol, en donde el contenido de EPA de la fracción de triacilglicerol es al menos aproximadamente 10%, al menos aproximadamente 11%, al menos aproximadamente 12%, al menos aproximadamente 13%, al menos aproximadamente 14%, al menos aproximadamente 15%, al menos aproximadamente 16%, al menos aproximadamente 17%, al menos aproximadamente 18%, al menos aproximadamente 19% o al menos aproximadamente 20% en peso. En algunas realizaciones, la divulgación está dirigida a un mutante, variante o recombinante de un microorganismo aislado de la invención que produce una fracción de triacilglicerol, en donde el contenido de EPA de la fracción de triacilglicerol es aproximadamente 12% a aproximadamente 55%, aproximadamente 12% a aproximadamente 50%, aproximadamente 12% a aproximadamente 45%, aproximadamente 12% a aproximadamente 40%, aproximadamente 12% a aproximadamente 35%, aproximadamente 12% a aproximadamente 30%, aproximadamente 15% a aproximadamente 55%, aproximadamente 15% a aproximadamente 50%, aproximadamente 15% a aproximadamente 45%, aproximadamente 15% a aproximadamente 40%, aproximadamente 15% a aproximadamente 35%, aproximadamente 15% a aproximadamente 30%, aproximadamente 20% a aproximadamente 55%, aproximadamente 20% a aproximadamente 50%, aproximadamente 20% a aproximadamente 45%, aproximadamente 20% a aproximadamente 40%, aproximadamente 20% a aproximadamente 35% o aproximadamente 20% a aproximadamente 30% en peso. Las cepas mutantes se pueden producir mediante procedimientos bien conocidos. Procedimientos comunes incluyen irradiación, tratamiento a altas temperaturas y tratamiento con un mutágeno. Las cepas variantes pueden ser otros componentes aislados y/o sub-aislados que se producen de forma natural de las especies descritas en esta memoria. Se pueden producir cepas recombinantes mediante cualquier método bien conocido en biología molecular para la expresión de genes exógenos o alteración de la función o expresión de genes endógenos. En algunas realizaciones, la cepa mutante, variante o recombinante produce una cantidad de ácidos grasos omega-3, particularmente EPA, mayor que la cepa de tipo salvaje. En algunas realizaciones, la cepa mutante, variante o recombinante produce una cantidad menor de uno o más ácidos grasos, tales como cantidades menores de DHA, ARA, DPA n-6 o combinaciones de los mismos. En algunas realizaciones, la cepa mutante, variante o recombinante produce un peso de células secas mayor por litro de cultivo que la cepa de tipo salvaje. Cepas mutantes, variantes o recombinantes de este tipo son ejemplos de cepas derivadas de un microorganismo aislado de la invención.

La presente divulgación también está dirigida a un microorganismo traustocítrido aislado que tiene las características de la especie traustocítrido depositada en la ATCC bajo el N° de Acceso PTA-9695, en donde los ácidos grasos totales producidos por dicho microorganismo o cepa derivada de los mismos comprenden aproximadamente 10% o menos en peso de ácido eicosapentaenoico.

La presente divulgación también está dirigida a un microorganismo traustocítrido aislado o una cepa derivada del mismo, que comprende una fracción de triglicéridos, en donde el contenido de ácido docosahexaenoico de la fracción de triglicéridos es al menos aproximadamente 40% en peso, en donde el contenido de ácido docosapentaenoico n-6 de la fracción de triglicéridos es de al menos aproximadamente 0,5% en peso a aproximadamente 6% en peso, y en donde los ácidos grasos totales producidos por dicho microorganismo o cepa derivada del mismo comprenden aproximadamente 10% o menos en peso de ácido eicosapentaenoico.

La presente divulgación también está dirigida a un microorganismo traustocítrido aislado de la misma especie que el traustocítrido depositado en la ATCC bajo el N° de Acceso PTA-9695, o una cepa derivada del mismo, en donde los ácidos grasos totales producidos por dicho microorganismo o cepa derivada del mismo comprenden aproximadamente 10% o menos en peso de ácido eicosapentaenoico.

En algunas realizaciones, la cepa derivada del microorganismo traustocítrido aislado de la divulgación es una cepa mutante.

La presente divulgación también está dirigida a un microorganismo aislado depositado en la ATCC bajo el N° de Acceso PTA-9695, PTA-9696, PTA-9697 o PTA-9698.

La presente divulgación también está dirigida a una biomasa de traustocítrido que comprende uno cualquiera de los microorganismos traustocítridos de la invención o mezclas de los mismos.

La presente divulgación también está dirigida a una biomasa de traustocítrido aislada, en donde al menos aproximadamente 50% en peso del peso de la célula seca de la biomasa son ácidos grasos, y en donde al menos aproximadamente 50% en peso de los ácidos grasos son ácidos grasos omega-3. En algunas realizaciones, al menos aproximadamente 50% en peso de los ácidos grasos es ácido docosahexaenoico. La presente divulgación también está dirigida a una biomasa de traustocítrido aislada, en donde al menos aproximadamente 25% en peso del peso de la célula seca de la biomasa es ácido docosahexaenoico.

En algunas realizaciones, la presente divulgación está dirigida también a una biomasa de traustocítrido aislada, en donde aproximadamente 10% o menos en peso de los ácidos grasos es ácido eicosapentaenoico, y en donde la relación ponderal de ácido docosahexaenoico a ácido eicosapentaenoico es al menos aproximadamente 5:1.

En algunas realizaciones, la presente divulgación está dirigida también a una biomasa de traustocítrido aislada, en donde aproximadamente 1,5% o menos en peso de los ácidos grasos es ácido araquidónico, y en donde la relación ponderal de ácido docosahexaenoico a ácido araquidónico es al menos aproximadamente 20:1.

En algunas realizaciones, la presente divulgación está dirigida también a una biomasa de traustocítrido aislada que comprende ácido docosahexaenoico y ácido docosapentaenoico n-6 en una relación ponderal de al menos aproximadamente 10:1. En algunas realizaciones, la invención está dirigida a un traustocítrido de la especie depositada en la ATCC bajo el N° de Acceso PTA-9695. El traustocítrido aislado también se conoce en esta memoria como Schizochytrium sp. At CC PTA-9695. El traustocítrido asociado con el N° de Acceso en la ATCC PTA-9695 fue depositado bajo el Tratado de Budapest el 7 de enero de 2009 en la American Type Culture Collection, Patent Depository, 10801 University Boulevard, Manassas, VA 20110-2209.

En algunas realizaciones, la divulgación está dirigida a una cepa de traustocítrido aislada depositada en la ATCC bajo el N° de Acceso PTA-9695. En algunas realizaciones, la invención está dirigida a un microorganismo traustocítrido aislado de la misma especie que el traustocítrido depositado en la ATCC bajo el N° de Acceso PTA-9695.

En algunas realizaciones, la divulgación está dirigida a un traustocítrido aislado que tiene las características de la especie depositada en la ATCC bajo el N° de Acceso PTA-9695 o una cepa derivada de la misma. Las características de la especie de traustocítrido depositada en la ATCC bajo el N° de Acceso PTA-9695 incluyen su crecimiento y propiedades fenotípicas (ejemplos de propiedades fenotípicas incluyen propiedades morfológicas y reproductivas), sus propiedades físicas y químicas (tales como pesos secos y perfiles de lípidos), y sus secuencias génicas. En algunas realizaciones, los traustocítridos aislados de la divulgación tienen propiedades fenotípicas sustancialmente idénticas del traustocítrido depositado en la ATCC bajo el N° de Acceso Pt A-9695. En algunas realizaciones, los traustocítridos aislados de la divulgación tienen propiedades de crecimiento sustancialmente idénticas del traustocítrido depositado en la ATCC bajo el N° de Acceso PTA-9695.

En algunas realizaciones, la divulgación está dirigida a un mutante, variante o recombinante de un traustocítrido aislado de la divulgación, en donde los ácidos grasos totales producidos por el mutante, variante o recombinante comprenden aproximadamente 10% o menos en peso de ácido eicosapentaenoico. Cepas mutantes se pueden producir mediante procedimientos bien conocidos. Procedimientos comunes incluyen irradiación; tratamiento a altas temperaturas y tratamiento con un mutágeno. Cepas variantes pueden ser otros componentes aislados y/o sub­ aislados que se producen de forma natural de las especies descritas en esta memoria. Cepas recombinantes pueden producirse mediante cualquier método bien conocido en biología molecular para la expresión de genes exógenos o la alteración de la función o expresión de genes endógenos. En algunas realizaciones, la cepa mutante, variante o recombinante produce una mayor cantidad de ácidos grasos omega-3, incluyendo DHA y/o EPA, que la cepa de tipo salvaje. En algunas realizaciones, la cepa mutante, variante o recombinante produce una cantidad menor de uno o más ácidos grasos, tales como cantidades menores de EPA, ARA, DPA n-6 o combinaciones de los mismos. En algunas realizaciones, la cepa mutante, variante o recombinante produce un peso de células secas mayor por litro de cultivo que la cepa de tipo salvaje. Cepas mutantes, variantes o recombinantes de este tipo son ejemplos de cepas derivadas de un traustocítrido aislado de la divulgación.

En algunas realizaciones, la divulgación está dirigida a una cepa mutante del traustocítrido depositado en la ATCC bajo el N° de Acceso PTA-9695. En realizaciones adicionales, la cepa mutante es una cepa depositada en la ATCC bajo los N°s de Acceso PTA-9696, PTA-9697 o PTA-9698. Las cepas de traustocítrido asociadas con los N°s de Acceso de la ATCC PTA-9696, PTA-9697 y PTA-9698 se depositaron bajo el Tratado de Budapest el 7 de enero de 2009 en la American Type Culture Collection, Patent Depository, 10801 University Boulevard, Manassas, VA 20110 -2209. Estas cepas mutantes depositadas son derivados del traustocítrido depositado en la ATCC bajo el N° de Acceso PTA-9695.

En algunas realizaciones, un traustocítrido aislado de la divulgación, incluyendo los mutantes, variantes o recombinantes del mismo, comprende un perfil de ácidos grasos en una o más fracciones aisladas del traustocítrido. La una o más fracciones aisladas del traustocítrido incluye la fracción total de ácidos grasos, la fracción de ésteres de esterol, la fracción de triglicéridos, la fracción de ácidos grasos libres, la fracción de esterol, la fracción de diglicéridos, la fracción polar (incluyendo la fracción de fosfolípidos) y combinaciones de los mismos.

La presente divulgación también está dirigida a un cultivo de traustocítrido aislado que comprende uno cualquiera de los microorganismos traustocítridos de la divulgación o mezclas de los mismos. En algunas realizaciones, el cultivo comprende al menos aproximadamente 5% de oxígeno disuelto.

La presente divulgación también está dirigida a un producto alimenticio, cosmético o composición farmacéutica para animales o seres humanos que comprenden uno cualquiera de los microorganismos o biomasas de traustocítridos de la divulgación o mezclas de los mismos.

La presente divulgación también está dirigida a un aceite microbiano que comprende una fracción de triglicéridos de al menos aproximadamente 70% en peso, en donde el contenido de ácido docosahexaenoico de la fracción de triglicéridos es al menos aproximadamente 50% en peso, y en donde el contenido de ácido docosapentaenoico n-6 de la fracción de triglicéridos es de aproximadamente 0,5% en peso a aproximadamente 6% en peso. En algunas realizaciones, el aceite microbiano comprende, además, un contenido de ácido araquidónico de la fracción de triglicéridos de aproximadamente 1,5% o menos en peso.

La presente divulgación también está dirigida a un aceite microbiano que comprende una fracción de triglicéridos de al menos aproximadamente 70% en peso, en donde el contenido de ácido docosahexaenoico de la fracción de triglicéridos es al menos aproximadamente 40% en peso, en donde el contenido de ácido docosapentaenoico n-6 de la fracción de triglicéridos es de al menos aproximadamente 0,5% en peso a aproximadamente 6% en peso, y en donde la relación de ácido docosahexaenoico a ácido docosapentaenoico n-6 es superior a aproximadamente 6:1.

La presente divulgación también está dirigida a un aceite microbiano que comprende una fracción de triglicéridos de al menos aproximadamente 70% en peso, en donde el contenido de ácido docosahexaenoico de la fracción de triglicéridos es al menos aproximadamente 60% en peso.

En algunas realizaciones, al menos aproximadamente 20% de los triglicéridos en la fracción de triglicéridos del aceite microbiano contienen ácido docosahexaenoico en dos posiciones en el triglicérido seleccionado de cualquiera de los dos de las posiciones sn-1, sn-2 y sn-3. En algunas realizaciones, al menos aproximadamente 5% de los triglicéridos en la fracción de triglicéridos del aceite microbiano contienen ácido docosahexaenoico en las tres posiciones sn-1, sn-2 y sn-3 en el triglicérido.

En algunas realizaciones, un microorganismo aislado de la divulgación, incluyendo los mutantes, variantes y recombinantes del mismo, comprende un perfil de ácidos grasos en una o más fracciones aisladas del microorganismo. Las una o más fracciones aisladas del microorganismo incluyen la fracción de ácido graso total, la fracción de ésteres de esterol, la fracción de triacilglicerol, la fracción de ácido graso libre, la fracción de esterol, la fracción de diacilglicerol, la fracción polar (incluyendo la fracción de fosfolípidos) y combinaciones de los mismos. El perfil de ácidos grasos para una fracción específica puede incluir cualquiera de los perfiles de ácidos grasos asociados con la fracción específica tal como se describe en esta memoria.

La divulgación está dirigida a un método de producir un mutante, que comprende la mutagénesis de cualquiera de los microorganismos de la divulgación y el aislamiento de la cepa mutante.

Cultivos y Biomasas Aislados

La divulgación está dirigida a un cultivo que comprende uno o más microorganismos aislados de la invención. En la técnica se conocen diversos parámetros de fermentación para inocular, hacer crecer y recuperar la microflora, tales como microalgas y traustocítridos. Véase, p. ej., la Patente de EE.UU. N° 5.130.242.

Medios líquidos o sólidos pueden contener agua de mar natural o artificial. Las fuentes de carbono para el crecimiento heterótrofo incluyen, pero no se limitan a glucosa, fructosa, xilosa, sacarosa, maltosa, almidón soluble, melaza, fucosa, glucosamina, dextrano, grasas, aceites, glicerol, acetato de sodio y manitol. Fuentes de nitrógeno incluyen, pero no se limitan a peptona, extracto de levadura, polipeptona, extracto de malta, extracto de carne, casaminoácido, líquido de maceración de maíz, fuentes de nitrógeno orgánico, glutamato de sodio, urea, fuentes de nitrógeno inorgánico, acetato de amonio, sulfato de amonio, cloruro de amonio y nitrato de amonio.

Un medio típico para el crecimiento del microorganismo depositado en la ATCC bajo el N° de Acceso PTA-10212 se muestra en la Tabla 1:

Tabla 1: Medios de Recipiente PTA-10212

Ingrediente_________________________ concentración_______ intervalos

Na2SÜ4 g/L 31,0 0-50, 15-45 o 25-35

NaCl g/L 0,625 0-25, 0,1-10 o 0,5-5

KCl g/L 1,0 0-5, 0,25-3 o 0,5-2

MgSO4 ■7H2O g/L 5,0 0-10, 2-8 o 3-6

(NH4)2SO4 g/L 0,44 0-10, 0,25-5 o 0,05-3

MSG 1H2O g/L 6,0 0-10, 4-8 o 5-7

CaCl2 g/L 0,29 0,1-5, 0,15-3 o 0,2-1

T 154 (extracto de levadura) g/L 6,0 0-20, 0,1-10 o 1-7

KH2PO4 g/L 0,8 0,1-10, 0,5-5 o 0,6-1,8

Post autoclave (Metales)

Ácido cítrico mg/L 3,5 0,1-5000, 10-3000 o 3-2500

FeSO4 7H2O mg/L 10,30 0,1-100, 1-50 o 5-25

MnCl2 4H2O mg/L 3,10 0,1-100, 1-50 o 2-25

ZnSO4 7H2O mg/L 3,10 0,01-100, 1-50 o 2-25

COCl2 6H2O mg/L 0,04 0-1, 0,001-0,1 o 0,01-0,1

Na2MoO4 2H2O mg/L 0,04 0,001-1, 0,005-0,5 o 0,01-0,1

CuSO4 5H2O mg/L 2,07 0,1-100, 0,5-50 o 1-25

NiSO4 6H2O mg/L 2,07 0,1-100, 0,5-50 o 1-25

Post autoclave (Vitaminas)

Tiamina mg/L 9,75 0,1-100, 1-50 o 5-25

Vitamina B12 mg/L 0,16 0,01-100, 0,05-5 o 0,1-1

Ca^-pantotenato mg/L 2,06 0,1-100, 0,1-50 o 1-10

Biotina mg/L 3,21 0,1-100, 0,1-50 o 1-10

Post autoclave (Carbono)

Glicerol: g/L 30,0 5-150, 10-100 o 20-50

Alimentación de Nitrógeno:__________________________________________

Ingrediente___________Concentración________________________________

MSG 1H2O g/L 17 0-150, 10-100 o 15-50

Condiciones de cultivo típicas incluirían lo siguiente:

oxígeno aproximadamente aproximadamente 100% de saturación,

disuelto: aproximadamente aproximadamente

glicerol aproximadamente

controlado a: aproximadamente

g/L.

En algunas realizaciones, el microorganismo depositado en la ATCC bajo el N° de Acceso PTA-10212, o un mutante, variante o recombinante del mismo, crece heterotróficamente en glicerol como fuente de carbono, pero no crece en glucosa como fuente de carbono.

Un medio típico para el crecimiento del microorganismo depositado en la ATCC bajo el N° de Acceso PTA-10208 se muestra en la Tabla 2:

Tabla 2: Medios de Recipiente PTA-10208

Ingrediente Concentración intervalos

Na2SO4 g/L 8,8 0-25, 2-20 o 3-10

NaCl g/L 0,625 0-25, 0,1-10 o 0,5-5

KCl g/L 1,0 0-5, 0,25-3 o 0,5-2

MgSO4-7H2O g/L 5,0 0-10, 2-8 o 3-6

(NH4)2SO4 g/L 0,42 0-10, 0,25-5 o 0,05-3

CaCl2 g/L 0,29 0,1-5, 0,15-3 o 0,2-1

T 154 (extracto de levadura) g/L 1,0 0-20, 0,1-10 o 0,5-5

KH2PO4 g/L 1,765 0,1-10, 0,5-5 o 1-3

Post autoclave (metales)

Ácido cítrico mg/L 46,82 0,1-50001, 10-3000 o 40-2500

FeSO4 ■7H2O mg/L 10,30 0,1-100, 1-50 o 5-25

MnCl2 ■ 4H2O mg/L 3,10 0,1-100, 1-50 o 2-25

ZnSO4 ■7H2O mg/L 9,3 0,01-1001, 1-50 o 2-25

CoCl2 ■ 6H2O mg/L 0,04 0-1, 0,001-0,1 o 0,01-0,1

Na2MoO4 ■ 2H2O mg/L 0,04 0,001-1, 0,005-0,5 o 0,01-0,1

CuSO4 ■5H2O mg/L 2.07 0,1-100, 0,5-50 o 1-25

NiSO4 ■ 6H2O mg/L 2.07 0,1-100, 0,5-50 o 1-25

Post autoclave (Vitaminas)

Tiamina mg/L 9,75 0,1-100, 1-50 o 5-25

Ca^-pantotenato mg/L 3,33 0,1-100, 0,1-50 o 1-10

Biotina mg/L 3,58 0,1-100, 0,1-50 o 1-10

Post autoclave (Carbono)______________________________________________

Glucosa g / L 30,0 5-150, 10-100 o 20-50

Alimentación de Nitrógeno:_____________________________________________

Ingrediente Concentración

NH4OH mL/L 23,6 0-150, 10-100 o 15-50

Las condiciones de cultivo típicas incluirían lo siguiente:

pH aproximadamente 6,5 - aproximadamente 8,5, aproximadamente 6,5 -aproximadamente 8,0, o aproximadamente 7,0 - aproximadamente 8,0;

temperatura: aproximadamente 17 - aproximadamente 30 grados Celsius,

aproximadamente 20 - aproximadamente 28 grados Celsius, o

aproximadamente 22 a aproximadamente 24 grados Celsius;

oxígeno aproximadamente 2 - aproximadamente 100% de saturación,

disuelto: aproximadamente 5 - aproximadamente 50% de saturación, o

aproximadamente 7 - aproximadamente 20% de saturación; y / o

glucosa aproximadamente 5 - aproximadamente 50 g / L, aproximadamente 10

controlada @: aproximadamente 40 g/L, o aproximadamente

20 - aproximadamente 35 g/L.

En algunas realizaciones, el volumen de fermentación (volumen de cultivo) es al menos aproximadamente 2 litros, al menos aproximadamente 10 litros, al menos aproximadamente 50 litros, al menos aproximadamente 100 litros, al menos aproximadamente 200 litros, al menos aproximadamente 500 litros, al menos unos 1000 litros, al menos aproximadamente 10.000 litros, al menos aproximadamente 20.000 litros, al menos aproximadamente 50.000 litros, al menos aproximadamente 100.000 litros, al menos aproximadamente 150.000 litros, al menos aproximadamente 200.000 litros o al menos aproximadamente 250.000 litros. En algunas realizaciones, el volumen de fermentación es aproximadamente 2 litros a aproximadamente 300.000 litros, aproximadamente 2 litros, aproximadamente 10 litros, aproximadamente 50 litros, aproximadamente 100 litros, aproximadamente 200 litros, aproximadamente 500 litros, aproximadamente 1000 litros, aproximadamente 10.000 litros, aproximadamente 20.000 litros, aproximadamente 50.000 litros, aproximadamente 100.000 litros, aproximadamente 150.000 litros, aproximadamente 200.000 litros, aproximadamente 250.000 litros o aproximadamente 300.000 litros.

En algunas realizaciones, la divulgación está dirigida a una biomasa aislada que comprende un perfil de ácidos grasos de la divulgación. En algunas realizaciones, al menos aproximadamente 20%, al menos aproximadamente 25%, al menos aproximadamente 30%, al menos aproximadamente 35%, al menos aproximadamente 40%, al menos aproximadamente 45%, al menos aproximadamente 50%, al menos aproximadamente 55%, al menos aproximadamente 60%, al menos aproximadamente 65%, al menos aproximadamente 70%, al menos aproximadamente 75% o al menos aproximadamente 80% del peso de células secas de la biomasa son ácidos grasos. En algunas realizaciones, más de aproximadamente 20%, más de aproximadamente 25%, más de aproximadamente 30%, más de aproximadamente 35%, más de aproximadamente 40%, más de aproximadamente 45%, más de aproximadamente 50%, más de aproximadamente 55% o más de aproximadamente 60% del peso de células secas de la biomasa son ácidos grasos. En algunas realizaciones, aproximadamente 20% a aproximadamente 55%, aproximadamente 20% a aproximadamente 60%, aproximadamente 20% a aproximadamente 70%, aproximadamente 20% a aproximadamente 80%, aproximadamente 30% a aproximadamente 55%, aproximadamente 30% a aproximadamente 70% aproximadamente 30% a aproximadamente 80%, aproximadamente 40% a aproximadamente 60%, aproximadamente 40% a aproximadamente 70%, aproximadamente 40% a aproximadamente 80%, aproximadamente 50% a aproximadamente 60%, aproximadamente 50% a aproximadamente 70%, aproximadamente 50% a aproximadamente 80%, aproximadamente 55% a aproximadamente 70%, aproximadamente 55% a aproximadamente 80%, aproximadamente 60% a aproximadamente 70% o aproximadamente 60% a aproximadamente 80% en peso del peso de células secas de la biomasa son ácidos grasos. En algunas realizaciones, la biomasa comprende más de aproximadamente 10%, al menos aproximadamente 12%, al menos aproximadamente 15%, al menos aproximadamente 20%, al menos aproximadamente 25%, al menos aproximadamente 30%, al menos aproximadamente 35%, al menos aproximadamente 40% o al menos aproximadamente 45% en peso de los ácidos grasos como EPA. En algunas realizaciones, la biomasa comprende aproximadamente 10% a aproximadamente 55%, aproximadamente 12% a aproximadamente 55%, aproximadamente 15% a aproximadamente 55%, aproximadamente 20% a aproximadamente 55%, aproximadamente 20% a aproximadamente 40% o aproximadamente 20% a aproximadamente 30% en peso de los ácidos grasos como EPA. En algunas realizaciones, la biomasa comprende una fracción de triacilglicerol, en donde al menos aproximadamente 12%, al menos aproximadamente 13%, al menos aproximadamente 14%, al menos aproximadamente 15%, al menos aproximadamente 16%, al menos aproximadamente 17%, al menos aproximadamente 18%, al menos aproximadamente 19% o al menos aproximadamente 20% en peso de la fracción de triacilglicerol es EPA. En algunas realizaciones, la biomasa comprende una fracción de triacilglicerol, en donde el contenido de EPA de la fracción de triacilglicerol es de al menos aproximadamente 12% a aproximadamente 55%, aproximadamente 12% a aproximadamente 50%, aproximadamente 12% a aproximadamente 45%, al menos aproximadamente 12% a aproximadamente 40%, al menos aproximadamente 12% a aproximadamente 35%, o al menos aproximadamente 12% a aproximadamente 30%, aproximadamente 15% a aproximadamente 55%, aproximadamente 15% a aproximadamente 50%, aproximadamente 15% a aproximadamente 45%, aproximadamente 15% a aproximadamente 40%, aproximadamente 15% a aproximadamente 35%, aproximadamente 15% a aproximadamente 30%, aproximadamente 20% a aproximadamente 55%, aproximadamente 20% a aproximadamente 50%, aproximadamente 20% a aproximadamente 45%, al menos aproximadamente 20% a aproximadamente 40%, al menos aproximadamente 20% a aproximadamente 35% o aproximadamente 20% a aproximadamente 30% en peso. En algunas realizaciones, al menos aproximadamente 20%, al menos aproximadamente 25%, al menos aproximadamente 30%, al menos aproximadamente 35%, al menos aproximadamente 40%, al menos aproximadamente 50% o al menos aproximadamente 60% en peso del peso de células secas de la biomasa es DHA. En algunas realizaciones, aproximadamente 20% a aproximadamente 60%, aproximadamente 25% a aproximadamente 60%, aproximadamente 25% a aproximadamente 50%, aproximadamente 25% a aproximadamente 45% aproximadamente 30% a aproximadamente 50% o aproximadamente 35% a aproximadamente 50% en peso del peso de células secas de la biomasa es DHA. En algunas realizaciones, la biomasa comprende aproximadamente 10% o menos, aproximadamente 9% o menos, aproximadamente 8% o menos, aproximadamente 7% o menos, aproximadamente 6% o menos, aproximadamente 5% o menos, aproximadamente 4% o menos, aproximadamente 3% o menos, aproximadamente 2% o menos o aproximadamente 1% o menos en peso de los ácidos grasos como DHA. En algunas realizaciones, la biomasa comprende aproximadamente 1% a aproximadamente 10%, aproximadamente 1% a aproximadamente 5%, aproximadamente 2% a aproximadamente 5%, aproximadamente 3% a aproximadamente 5% o aproximadamente 3% a aproximadamente 10% en peso de los ácidos grasos como DHA. En algunas realizaciones, la biomasa está sustancialmente exenta de DHA. En algunas realizaciones, la biomasa comprende aproximadamente 0,1% a menos de aproximadamente 5%, aproximadamente 0,1% a aproximadamente 4%, aproximadamente 0,1% a aproximadamente 3%, aproximadamente 0,1% a aproximadamente 2%, aproximadamente 0,2% a menos de aproximadamente 5%, aproximadamente 0,2% a aproximadamente 4%, aproximadamente 0,2% a aproximadamente 3%, aproximadamente 0,2% a aproximadamente 2%, aproximadamente 0,3% a aproximadamente 2%, aproximadamente 0,1% a aproximadamente 0,5%, aproximadamente 0,2% a aproximadamente 0,5%, aproximadamente 0,1% a aproximadamente 0,4%, aproximadamente 0,2% a aproximadamente 0,4%, aproximadamente 0,5% a aproximadamente 2%, aproximadamente 1 % a aproximadamente 2%, aproximadamente 0,5% a aproximadamente 1,5% o aproximadamente 1% a aproximadamente 1,5% en peso de los ácidos grasos como ARA. En algunas realizaciones, la biomasa comprende menos de aproximadamente 5%, aproximadamente 4% o menos, aproximadamente 3% o menos, aproximadamente 2% o menos, aproximadamente 1,5% o menos, aproximadamente 1% o menos, aproximadamente 0,5% o menos, aproximadamente 0,4% o menos, aproximadamente 0,3% o menos, aproximadamente 0,2% o menos o aproximadamente 0,1% o menos en peso de los ácidos grasos como ARA. En algunas realizaciones, la biomasa está sustancialmente exenta de ARA. En algunas realizaciones, la biomasa comprende aproximadamente 0,4% a aproximadamente 2%, aproximadamente 0,4% a aproximadamente 3%, aproximadamente 0,4% a aproximadamente 4%, aproximadamente 0,4% a aproximadamente 5%, aproximadamente 0,4% a menos de aproximadamente 5%, aproximadamente 0,5% a aproximadamente 1%, aproximadamente 0,5% a aproximadamente 2%, aproximadamente 0,5% a aproximadamente 3%, aproximadamente 0,5% a aproximadamente 4%, aproximadamente 0,5% a aproximadamente 5%, aproximadamente 0,5% a menos de aproximadamente 5%, aproximadamente 1% a aproximadamente 2%, aproximadamente 1% a aproximadamente 3%, aproximadamente 1% a aproximadamente 4%, aproximadamente 1% a aproximadamente 5% o aproximadamente 1% a menos de aproximadamente 5% en peso de los ácidos grasos como DPA n-6. En algunas realizaciones, la biomasa comprende aproximadamente 5% o menos, menos de aproximadamente 5%, aproximadamente 4% o menos, aproximadamente 3% o menos, aproximadamente 2% o menos, aproximadamente 1% o menos, aproximadamente 0,75% o menos, aproximadamente 0,6% o menos o aproximadamente 0,5% o menos en peso de los ácidos grasos como DPA n-6. En algunas realizaciones, la biomasa está sustancialmente exenta de DPA n-6. En algunas realizaciones, la biomasa comprende ácidos grasos con aproximadamente 5% o menos, menos de aproximadamente 5%, aproximadamente 4% o menos, aproximadamente 3% o menos, o aproximadamente 2% o menos en peso de ácido oleico (18:1 n-9), ácido linoleico (18:2 n-6), ácido linolénico (18:3 n-3), ácido eicosenoico (20:1 n-9), ácido erúcico (22:1 n-9) o combinaciones de los mismos.

Las características de una biomasa aislada de la divulgación se asocian con propiedades endógenas o nativas de la biomasa aislada en lugar de materiales exógenamente introducidos. En algunas realizaciones, la biomasa aislada no contiene polivinilpirrolidona o no está aislada de un cultivo que contenga polivinilpirrolidona.

La presente divulgación se dirige a un método de producir una biomasa. En algunas realizaciones, el método para producir una biomasa de la divulgación comprende cultivar cualquiera de los microorganismos aislados de la divulgación o mezclas de los mismos en un cultivo para producir una biomasa. La presente divulgación está dirigida a una biomasa producida por el método.

En algunas realizaciones, la biomasa comprende ácidos grasos, en donde los ácidos grasos comprenden, además, ácidos grasos omega-3 poliinsaturados, en donde los ácidos grasos omega-3 poliinsaturados comprenden DHA y EPA en una cantidad de aproximadamente > 90%, en peso, de la cantidad total de ácidos grasos omega-3 poliinsaturados y la cantidad de EPA, en peso, es de aproximadamente 6% hasta aproximadamente 65% de la cantidad total de EPA y DHA. Se proporciona particularmente una biomasa, en donde la cantidad de EPA, en peso, es de aproximadamente 6% hasta aproximadamente 28% de la cantidad total de EPA y DHA. También se proporciona en esta memoria una biomasa, en donde la cantidad de EPA, en peso, es de aproximadamente 36% a aproximadamente 65% de la cantidad total de EPA y DHA. Más particularmente, se proporciona una biomasa en donde la cantidad de EPA, en peso, es de aproximadamente 28% a aproximadamente 36% de la cantidad total de EPA y DHA.

Algunas realizaciones proporcionadas en esta memoria comprenden una biomasa que comprende ácidos grasos, en donde los ácidos grasos comprenden, además, DHA y EPA y la cantidad de EPA, en peso, es de aproximadamente 15 hasta aproximadamente 60% del peso total de EPA y DHA.

Algunas realizaciones de la divulgación están dirigidas, además, a un cultivo que comprende un traustocítrido, o una cepa mutante, depositado en la ATCC bajo el N° de Acceso PTA-9695. En la técnica se conocen diversos parámetros de fermentación para inocular, cultivar y recuperar la microflora, tal como se describe en la Patente de EE.UU. N° 5.130.242. Puede utilizarse cualquier medio convencional para el cultivo de traustocítridos. Los medios líquidos o sólidos pueden contener agua de mar natural o artificial. Fuentes de carbono incluyen, pero no se limitan a glucosa, fructosa, xilosa, sacarosa, maltosa, almidón soluble, melaza, fucosa, glucosamina, dextrano, grasas, aceites, glicerol, acetato de sodio y manitol. Fuentes de nitrógeno incluyen, pero no se limitan a peptona, extracto de levadura, polipeptona, extracto de malta, extracto de carne, casaminoácido, líquido de maceración de maíz, fuentes de nitrógeno orgánico, glutamato de sodio, urea, fuentes de nitrógeno inorgánico, acetato de amonio, sulfato de amonio, amonio, cloruro, nitrato de amonio, sulfato de sodio. Un medio típico se muestra en la Tabla 3:

Tabla 3: Medios de Recipiente PTA-9695

Ingrediente concentración intervalos

NaCl g/L 12,5 0-25, 5-20 o 10-15

KCl g/L 1,0 0-5, 0,25-3 o 0,5-2

MgSO4 7H2O g/L 5,0 0-10, 2-8 o 3-6

(NH4)2SO4 g/L 0,6 0-10, 0,25-5 o 0,5-3

CaCl2 g/L 0,29 0,1-5, 0,15-3 o 0,2-1

T 154 (extracto de levadura) g/L 6,0 0-20, 1-15 o 5-10

KH2PO4 g/L 1,2 0,1-10, 0,5-5 o 1-3

Post autoclave (Metales)

Ácido cítrico mg/L 3,5 0,1-100, 1-50 o 2-25

FeSO4 7H2O mg/L 10,30 0,1-100, 1-50 o 5-25

MnCl2 4H2O mg/L 3,10 0,1-100, 1-50 o 2-25

ZnSO4 7H2O mg/L 3,10 0,1-100, 1-50 o 2-25

COCl2 6H2O mg/L 0,04 0,001-1, 0,005-0,5 o 0,01-0,1

Na2MoO4 2H2O mg/L 0,04 0,001-1, 0,005-0,5 o 0,01-0,1

CuSO4 5H2O mg/L 2,07 0,1-100, 0,5-50 o 1-25

NiSO4 6H2O mg/L 2,07 0,1-100, 0,5-50 o 1-25

Post autoclave (Vitaminas )

Tiamina ** mg/L 9,75 0,1-100, 1-50 o 5-25

Vitamina B12** mg/L 0,16 0,1-100, 0,1-10 o 0,1-1

Ca^-pantotenato ** mg/L 3,33 0,1-100, 0,1-50 o 1-10

** Filtro a esterilizar

Post autoclave (Carbono)

Glucosa g/L 30,0 5-150, 10-100 o 20-50

Alimentación de Nitrógeno:

Ingrediente Concentración

NH4OH mL/L 21,6 0-150, 10-100 o 15-50

Las condiciones de cultivo típicas incluirían lo siguiente:

PH aproximadamente 6,5 - aproximadamente 8,5, aproximadamente 6,5 -aproximadamente 8,0 o aproximadamente 7,0 - aproximadamente 7,5

temperatura: aproximadamente 17 - aproximadamente 30 grados Celsius,

aproximadamente 20 - aproximadamente 25 grados Celsius, o

aproximadamente 22 a aproximadamente 23 grados Celsius

oxigeno aproximadamente 5 - aproximadamente 100% de saturación,

disuelto: aproximadamente 10 - aproximadamente 80% de saturación, o

aproximadamente 20 - aproximadamente 50% de saturación

glucosa aproximadamente 5 - aproximadamente 50 g/L, aproximadamente 10 -controlada a: aproximadamente 40 g/L o aproximadamente 20 - aproximadamente 35

g/L.

En algunas realizaciones, el medio de cultivo comprende al menos aproximadamente 5%, al menos aproximadamente 10%, al menos aproximadamente 20%, al menos aproximadamente 30%, al menos aproximadamente 40%, al menos aproximadamente 50%, al menos aproximadamente 60%, al menos aproximadamente 70%, al menos aproximadamente 80% o al menos aproximadamente 90% de oxígeno disuelto, como porcentaje del nivel de saturación. En algunas realizaciones, el medio de cultivo comprende de aproximadamente 5% a aproximadamente 20%, aproximadamente 5% a aproximadamente 50%, aproximadamente 5% a aproximadamente 100%, aproximadamente 10% a aproximadamente 20%, aproximadamente 10% a aproximadamente 50%, aproximadamente 10% a aproximadamente 100%, aproximadamente 20% a aproximadamente 50% o aproximadamente 20% a aproximadamente 100% de oxígeno disuelto, como porcentaje del nivel de saturación.

La divulgación está dirigida, además, a una biomasa aislada de un traustocítrido de la invención. Una biomasa de un traustocítrido aislada de la divulgación es una biomasa celular recolectada, obtenida por cualquier método convencional para el aislamiento de una biomasa de un traustocítrido, tal como se describe en la Patente de EE.UU. N° 5.130.242 y la Publ. de la Solicitud de EE.UU. N° 2002/0001833.

En algunas realizaciones, el peso de la célula seca de la biomasa aislada de cada litro de cultivo es al menos aproximadamente 50 g, al menos aproximadamente 60 g, al menos aproximadamente 70 g, al menos aproximadamente 80 g, al menos aproximadamente 100 g, al menos aproximadamente 120 g, al menos aproximadamente 140 g, al menos aproximadamente 160 g, al menos aproximadamente 180 g o al menos aproximadamente 200 g después de cultivar durante aproximadamente 7 días a aproximadamente 17°C a aproximadamente 30°C en un medio de cultivo de aproximadamente pH 6,5 a aproximadamente 8,5 que comprende fuentes de carbono, nitrógeno y nutrientes, y aproximadamente 950 ppm a aproximadamente 8500 ppm de iones cloruro. En algunas realizaciones, el peso de células secas de la biomasa aislada de cada litro de cultivo es al menos aproximadamente 50 g, al menos aproximadamente 60 g, al menos aproximadamente 70 g, al menos aproximadamente 80 g, al menos aproximadamente 100 g, al menos aproximadamente 120 g, al menos aproximadamente 140 g, al menos aproximadamente 160 g, al menos aproximadamente 180 g o al menos aproximadamente 200 g después de cultivar durante aproximadamente 7 días a aproximadamente 17°C, a aproximadamente 18°C, a aproximadamente 19°C, a aproximadamente 20°C, a aproximadamente 21°C, a aproximadamente 22°C, a aproximadamente 23°C, a aproximadamente 24°C, a aproximadamente 25°C, a aproximadamente 26°C, a aproximadamente 27°C, a aproximadamente 28°C, a aproximadamente 29°C o a aproximadamente 30°C en un medio de cultivo de aproximadamente pH 6,5, aproximadamente pH 7, aproximadamente pH 7,5, aproximadamente pH 8,0 o aproximadamente pH 8,5 que comprende fuentes de carbono, nitrógeno y nutrientes, y de aproximadamente 950 ppm a aproximadamente 8500 ppm de iones cloruro. En algunas realizaciones, el peso de células secas de la biomasa aislada de cada litro de cultivo es de aproximadamente 50 g a aproximadamente 200 g después de cultivar durante aproximadamente 7 días a aproximadamente 17°C a aproximadamente 30°C en un medio de cultivo de aproximadamente pH 6,5 a aproximadamente pH 8,5 que comprende fuentes de carbono, nitrógeno y nutrientes, y de aproximadamente 950 ppm a aproximadamente 8500 ppm de iones cloruro. En algunas realizaciones, el peso de células secas de la biomasa aislada de cada litro de cultivo es de aproximadamente 50 g a aproximadamente 200 g después de cultivar durante aproximadamente 7 días a aproximadamente 17°C, a aproximadamente 18°C, a aproximadamente 19°C, a aproximadamente 20°C, a aproximadamente 21°C, a aproximadamente 22°C, a aproximadamente 23°C, a aproximadamente 24°C, a aproximadamente 25°C, a aproximadamente 26°C, a aproximadamente 27°C, a aproximadamente 28°C, a aproximadamente 29°C o a aproximadamente 30°C en un medio de cultivo de aproximadamente pH 6,5, aproximadamente pH 7, aproximadamente pH 7,5, aproximadamente pH 8,0 o aproximadamente pH 8,5 que comprende fuentes de carbono, nitrógeno y nutrientes y de aproximadamente 950 ppm a aproximadamente 8500 ppm de iones cloruro.

En algunas realizaciones, el cultivo de traustocítrido aislado tiene una productividad de ácidos grasos omega-3 de al menos aproximadamente 2 g/L/día, al menos aproximadamente 4 g/L/día, o al menos aproximadamente 8 g/L/día después de cultivar durante aproximadamente 7 días a aproximadamente 17°C a aproximadamente 30°C en un medio de cultivo de aproximadamente pH 6,5 a aproximadamente pH 8,5 que comprende fuentes de carbono, nitrógeno y nutrientes, y aproximadamente 950 ppm a aproximadamente 8500 ppm de iones cloruro. En algunas realizaciones, el cultivo de traustocítrido aislado tiene una productividad de ácidos grasos omega-3 de entre aproximadamente 1 g/L/día a aproximadamente 20 g/L/día, aproximadamente 2 g/L/día a aproximadamente 15 g/L/día, aproximadamente 2 g/L/día a aproximadamente 10 g/L/día, aproximadamente 3 g/L/día a aproximadamente 10 g/L/día o aproximadamente 4 g/L/día a aproximadamente 9 g/L/día, después de cultivar durante aproximadamente 7 días a aproximadamente 17°C a aproximadamente 30°C en un medio de cultivo de aproximadamente pH 6,5 a aproximadamente pH 8,5 que comprende fuentes de carbono, nitrógeno y nutrientes, y aproximadamente 950 ppm a aproximadamente 8500 ppm de iones cloruro.

En algunas realizaciones, el volumen de fermentación (volumen de cultivo) es al menos aproximadamente 2 litros, al menos aproximadamente 10 litros, al menos aproximadamente 50 litros, al menos aproximadamente 100 litros, al menos aproximadamente 200 litros, al menos aproximadamente 500 litros, al menos aproximadamente 1000 litros, al menos aproximadamente 10.000 litros, al menos aproximadamente 20.000 litros, al menos aproximadamente 50.000 litros, al menos aproximadamente 100.000 litros, al menos aproximadamente 150.000 litros, al menos aproximadamente 200.000 litros o al menos aproximadamente 250.000 litros. En algunas realizaciones, el volumen de fermentación es aproximadamente 2 litros a aproximadamente 300.000 litros, aproximadamente 2 litros, aproximadamente 10 litros, aproximadamente 50 litros, aproximadamente 100 litros, aproximadamente 200 litros, aproximadamente 500 litros, aproximadamente 1000 litros, aproximadamente 10.000 litros, aproximadamente 20.000 litros, aproximadamente 50.000 litros, aproximadamente 100.000 litros, aproximadamente 150.000 litros, aproximadamente 200.000 litros, aproximadamente 250.000 litros o aproximadamente 300.000 litros.

En algunas realizaciones, la divulgación está dirigida a una biomasa de traustocítrido aislada que comprende un perfil de ácidos grasos de la divulgación. En algunas realizaciones, al menos aproximadamente 50%, al menos aproximadamente 60%, al menos aproximadamente 70% o al menos aproximadamente 80% del peso de células secas de la biomasa son ácidos grasos. En algunas realizaciones, más de aproximadamente 50%, más de aproximadamente 55% o más de aproximadamente 60% del peso de células secas de la biomasa son ácidos grasos. En algunas realizaciones, de aproximadamente 50% a aproximadamente 60%, aproximadamente 50% a aproximadamente 70%, aproximadamente 50% a aproximadamente 80%, aproximadamente 55% a aproximadamente 70%, aproximadamente 55% a aproximadamente 80%, aproximadamente 60% a aproximadamente 70% o aproximadamente 60% a aproximadamente 80% en peso del peso de células secas de la biomasa son ácidos grasos. En algunas realizaciones, la biomasa comprende al menos aproximadamente 50%, al menos aproximadamente 60%, al menos aproximadamente 70% o al menos aproximadamente 80% en peso de los ácidos grasos como ácidos grasos omega-3. En algunas realizaciones, la biomasa comprende de aproximadamente 50% a aproximadamente 60%, aproximadamente 50% a aproximadamente 70%, aproximadamente 50% a aproximadamente 80% en peso de los ácidos grasos como ácidos grasos omega-3. En algunas realizaciones, la biomasa comprende al menos aproximadamente 50%, al menos aproximadamente 55%, al menos aproximadamente 60%, al menos aproximadamente 65%, al menos aproximadamente 70%, al menos aproximadamente 75% o al menos aproximadamente 80% en peso de los ácidos grasos como DHA. En algunas realizaciones, la biomasa comprende de aproximadamente 50% a aproximadamente 60%, aproximadamente 50% a aproximadamente 70% o aproximadamente 50% a aproximadamente 80% en peso de los ácidos grasos como DHA. En algunas realizaciones, al menos aproximadamente 25%, al menos aproximadamente 30%, al menos aproximadamente 40%, al menos aproximadamente 50% o al menos aproximadamente 60% en peso del peso de células secas de la biomasa es ácido docosahexaenoico. En algunas realizaciones, aproximadamente 25% a aproximadamente 65%, aproximadamente 25% a aproximadamente 50%, aproximadamente 30% a aproximadamente 40% o aproximadamente 25% a aproximadamente 35% en peso del peso de células secas de la biomasa es ácido docosahexaenoico. En algunas realizaciones, la biomasa comprende aproximadamente 10% o menos, aproximadamente 9% o menos, aproximadamente 8% o menos, aproximadamente 7% o menos, aproximadamente 6% o menos, aproximadamente 5% o menos, aproximadamente 4% o menos, aproximadamente 3% o menos, aproximadamente 2% o menos o aproximadamente 1% o menos en peso de los ácidos grasos como EPA. En algunas realizaciones, la biomasa comprende de aproximadamente 1% a aproximadamente 10%, aproximadamente 1% a aproximadamente 5%, aproximadamente 2% a aproximadamente 5%, aproximadamente 3% a aproximadamente 5% o aproximadamente 3% a aproximadamente 10% en peso de los ácidos grasos como EPA. En algunas realizaciones, la biomasa está sustancialmente exenta de EPA. En algunas realizaciones, la biomasa comprende una relación en peso de DHA a EPA de al menos aproximadamente 5:1, al menos aproximadamente 7:1, al menos aproximadamente 10:1, al menos aproximadamente 11:1, al menos aproximadamente 14:1, al menos aproximadamente 15:1, al menos aproximadamente 17:1, al menos aproximadamente 20:1, al menos aproximadamente 25:1, al menos aproximadamente 50:1 o al menos aproximadamente 100:1, en donde la biomasa comprende aproximadamente 10% o menos en peso de los ácidos grasos como EPA. En algunas realizaciones, la biomasa comprende de aproximadamente 0,1% a 0,2%, aproximadamente 0,1% a aproximadamente 0,3%, aproximadamente 0,1% a aproximadamente 0,4%, aproximadamente 0,1% a aproximadamente 0,5% o aproximadamente 0,1% a aproximadamente 1,5% en peso de los ácidos grasos como ARA. En algunas realizaciones, la biomasa comprende aproximadamente 1,5% o menos, aproximadamente 1% o menos, aproximadamente 0,5% o menos, aproximadamente 0,4% o menos, aproximadamente 0,3% o menos, aproximadamente 0,2% o menos, o aproximadamente 0,1% o menos en peso de los ácidos grasos como ARA En algunas realizaciones, la biomasa está sustancialmente exenta de ARA. En algunas realizaciones, la biomasa comprende una relación ponderal de DHA a ARA de al menos aproximadamente 20:1, al menos aproximadamente 40:1, al menos aproximadamente 60:1, al menos aproximadamente 80:1, al menos aproximadamente 100:1, al menos aproximadamente 150:1, al menos aproximadamente 200:1, al menos aproximadamente 250:1 o al menos aproximadamente 300:1. En algunas realizaciones, la biomasa comprende de aproximadamente 0,5% a aproximadamente 1%, aproximadamente 0,5% a aproximadamente 2%, aproximadamente 0,5% a aproximadamente 5%, aproximadamente 0,5% a aproximadamente 6%, aproximadamente 1% a aproximadamente 5%, aproximadamente 1% a aproximadamente 6%, aproximadamente 2% a aproximadamente 5% o aproximadamente 2% a aproximadamente 6% en peso de los ácidos grasos como DPA n-6. En algunas realizaciones, la biomasa comprende aproximadamente 6% o menos, aproximadamente 5% o menos, aproximadamente 2% o menos, aproximadamente 1% o menos o aproximadamente 0,5% o menos en peso de los ácidos grasos como DPA n-6. En algunas realizaciones, la biomasa está sustancialmente exenta de DPA n-6. En algunas realizaciones, la biomasa comprende una relación ponderal de DHA a DPA n-6 mayor que aproximadamente 6:1, al menos aproximadamente 8:1, al menos aproximadamente 10:1, al menos aproximadamente 15:1, al menos aproximadamente 20:1, al menos aproximadamente 25:1, al menos aproximadamente 50:1 o al menos aproximadamente 100:1. En algunas realizaciones, la biomasa comprende ácidos grasos con aproximadamente 5% o menos, aproximadamente 4% o menos, aproximadamente 3% o menos o aproximadamente 2% o menos en peso de ácido linoleico (18:2 n-6), ácido linolénico (18:3 n-3), ácido eicosenoico (20:1 n-9) y ácido erúcico (22,1 n-9).

Otra realización proporcionada en esta memoria es una biomasa que comprende ácidos grasos, en donde los ácidos grasos comprenden, además, ácidos grasos omega-3 poliinsaturados, en donde los ácidos grasos omega-3 poliinsaturados comprenden DHA y EPA en una cantidad de aproximadamente mayor que o igual a aproximadamente 58-68%, en particular aproximadamente 60%, en peso, de la cantidad total de ácidos grasos omega-3 poliinsaturados y la cantidad de EPA, en peso, es de aproximadamente 5% hasta aproximadamente 60% de la cantidad total del peso total del EPA y DHA.

Las características de una biomasa aislada de la divulgación se asocian con propiedades endógenas o nativas de la biomasa aislada en lugar de material introducido de forma exógena.

Aceites Microbianos

En esta memoria se proporcionan aceites, en particular aceites microbianos, hechos por los métodos arriba descritos.

En algunas realizaciones, el aceite microbiano que comprende ácidos grasos, en donde los ácidos grasos comprenden, además, ácidos grasos omega-3 poliinsaturados, en donde los ácidos grasos omega-3 poliinsaturados comprenden DHA y EPA en una cantidad de aproximadamente > 90%, en peso, de la cantidad total de ácidos grasos omega-3 poliinsaturados y la cantidad de EPA, en peso, es de aproximadamente 6% a aproximadamente 65% de la cantidad total de EPA y DHA. Se proporciona particularmente un aceite microbiano en donde la cantidad de EPA, en peso, es de aproximadamente 6% hasta aproximadamente 28% de la cantidad total de EPA y DHA. En esta memoria se proporciona, además, un aceite microbiano, en donde la cantidad de EPA, en peso, es de aproximadamente 36% a aproximadamente 65% de la cantidad total de EPA y DHA. Más particularmente, se proporciona un aceite microbiano, en donde la cantidad de EPA, en peso, es de aproximadamente 28% a aproximadamente 36% de la cantidad total de EPA y DHA.

Una realización adicional proporcionada en esta memoria comprende un aceite microbiano que comprende ácidos grasos, en donde los ácidos grasos comprenden, además, DHA y EPA y la cantidad de EPA, en peso, es de aproximadamente 15 a aproximadamente 60% del peso total de EPA y DHA.

Otra realización proporcionada en esta memoria es un aceite microbiano que comprende ácidos grasos, en donde los ácidos grasos comprenden, además, ácidos grasos omega-3 poliinsaturados, en donde los ácidos grasos omega-3 poliinsaturados comprenden DHA y EPA en una cantidad aproximadamente mayor que o igual a aproximadamente 58-68%, en particular aproximadamente 60%, en peso, de la cantidad total de ácidos grasos omega-3 poliinsaturados y la cantidad de EPA, en peso, es de aproximadamente 5% a aproximadamente 60% de la cantidad total del peso total de EPA y DHA.

La divulgación está dirigida a un aceite microbiano que comprende un perfil de ácidos grasos de la divulgación. Un aceite microbiano de la divulgación es un "aceite bruto" o un "aceite refinado" que comprende una fracción de triacilglicerol de al menos aproximadamente 35% en peso. Un "aceite bruto" es un aceite que se extrae de la biomasa del microorganismo sin procesamiento adicional. Un "aceite refinado" es un aceite que se obtiene mediante el tratamiento de un aceite bruto con un tratamiento estándar de refinado, blanqueo y/o desodorización. Véase, p. ej., la Patente de EE.UU. N° 5.130.242. Un aceite microbiano también incluye un "aceite final" tal como se describe en esta memoria, que es un aceite refinado que ha sido diluido con un aceite vegetal. En algunas realizaciones, un aceite final es un aceite refinado que ha sido diluido con aceite de girasol con alto contenido de ácido oleico. El término "microbiano", tal como se utiliza en esta memoria, incluye, pero no se limita a los términos "microalgas", "traustocítrido" y clasificaciones taxonómicas asociadas con cualquiera de los microorganismos depositados descritos en esta memoria. Los términos "Thraustochytriales", "traustocítrido", "Schizochytrium" y "Thraustochytrium", tal como se utilizan en referencia a cualquiera de los aceites microbianos de los microorganismos depositados descritos en esta memoria se basan en clasificaciones taxonómicas actuales, incluyendo información filogenética disponible y no se pretende que sean limitante en el caso de que las clasificaciones taxonómicas sean revisadas después de la fecha de presentación de la presente solicitud.

En algunas realizaciones, un ácido graso tal como se describe en esta memoria puede ser un éster de ácido graso. En algunas realizaciones, un éster de ácido graso incluye un éster de un ácido graso omega-3, ácido graso omega-6 y combinaciones de los mismos. En algunas realizaciones, el éster de ácido graso es un éster de DHA, un éster de EPA o una combinación de los mismos. En algunas realizaciones, un aceite o fracción del mismo tal como se describe en esta memoria se esterifica para producir un aceite o fracción del mismo que comprende ésteres de ácidos grasos. El término "éster" se refiere a la sustitución del hidrógeno en el grupo ácido carboxílico de la molécula de ácido graso con otro sustituyente. Los expertos en la técnica conocen ésteres típicos, de los cuales Higuchi, T. y V. Stella proporcionan una discusión en Pro-drugs as Novel Delivery Systems, vol. 14, Serie de simposios A.C.S., Bioreversible Carriers in Drug Design, Ed. Edward B. Roche, American Pharmaceutical Association, Pergamon Press, 1987, y Protective Groups in Organic Chemistry, McOmie ed., Plenum Press, Nueva York, 1973. Ejemplos de ésteres incluyen metilo, etilo, propilo, butilo, pentilo, t- butilo, bencilo, nitrobencilo, metoxibencilo, benzhidrilo y tricloroetilo. En algunas realizaciones, el éster es un grupo éster protector de ácido carboxílico, ésteres con aralquilo (p. ej., bencilo, fenetilo), ésteres con alquenilo inferior (p. ej., alilo, 2-butenilo), ésteres con alcoxi inferior-alquilo inferior (p. ej., metoximetilo, 2-metoxietilo, 2-etoxietilo), ésteres con alcanoiloxi ionferior-alquilo inferior (p. ej., acetoximetilo, pivaloiloximetilo, 1-pivaloiloxietilo), ésteres con alcoxi inferior-carbonilo-alquilo inferior (p. ej., metoxicarbonilmetilo, isopropoxicarbonilmetilo), ésteres con carboxi-alquilo inferior (p. ej., carboximetilo), ésteres con alcoxi inferiorcarboniloxi-alquilo inferior (p. ej., 1-(etoxicarboniloxi)etilo, 1-(ciclohexiloxicarboniloxi)etilo), ésteres con carbamoiloxialquilo inferior (p. ej., carbamoiloximetilo), y similares. En algunas realizaciones, el sustituyente añadido es un grupo hidrocarbonado lineal o cíclico, p. ej., un alquilo C1-C6, cicloalquilo C1-C6, alquenilo C1-C6 o aril éster C1-C6. En algunas realizaciones, el éster es un éster alquílico, p. ej., un éster metílico, éster etílico o éster propílico. En algunas realizaciones, el sustituyente éster se añade a la molécula de ácido graso libre cuando el ácido graso está en un estado purificado o semi-purificado. Alternativamente, el éster de ácido graso se forma tras la conversión de un triacilglicerol en un éster.

La presente invención está dirigida a métodos para producir aceites microbianos. En algunas realizaciones, el método comprende cultivar cualquiera de los microorganismos aislados de la divulgación o mezclas de los mismos en un cultivo para producir un aceite microbiano que comprende ácidos grasos omega-3. En algunas realizaciones, el método comprende, además, extraer el aceite microbiano. En algunas realizaciones, el método comprende extraer un aceite microbiano que comprende ácidos grasos omega-3 de cualquiera de las biomasas de la divulgación o mezclas de las mismas. En algunas realizaciones, el método comprende cultivar heterotróficamente el microorganismo aislado, en donde el cultivo comprende una fuente de carbono tal como se describe en esta memoria. El aceite microbiano se puede extraer de una biomasa recién recolectada o se puede extraer de una biomasa recolectada previamente que ha sido almacenada en condiciones que evitan el deterioro. Pueden utilizarse métodos conocidos para cultivar un microorganismo de la invención, para aislar una biomasa del cultivo, para extraer un aceite microbiano de la biomasa y analizar el perfil de ácidos grasos de los aceites extraídos de la biomasa. Véase, p. ej., la Patente de EE.UU. N° 5.130.242. La divulgación está dirigida a un aceite microbiano producido por cualquiera de los métodos de la invención.

En algunas realizaciones, el aceite microbiano se extrae mediante un método de extracción de la enzima. En algunas realizaciones, el aceite microbiano se extrae mediante un método de extracción mecánica. En algunas realizaciones, el método de extracción mecánica comprende uno o más de: (1) procesar un caldo de fermentación pasteurizado a través de un homogeneizador para ayudar en la lisis celular y la liberación de aceite de las células; (2) añadir alcohol isopropílico al caldo de fermentación después de la homogeneización para romper la emulsión de aceite y agua; (3) centrifugar la mezcla para recuperar la fase oleosa; y (4) secar en vacío con adición de antioxidantes. En algunas realizaciones, el aceite bruto se purifica. En algunas realizaciones, la purificación del aceite bruto comprende uno o más de: (1) bombear el aceite bruto a un tanque de refinación y calentar el aceite, seguido de la adición de una solución ácida con mezcladura; (2) añadir una solución cáustica al aceite después del tratamiento con ácido; (3) recalentar el aceite bruto y luego centrifugar para separar la fase pesada del aceite refinado; (4) eliminar los compuestos polares restantes, los metales traza y productos de oxidación del aceite refinado utilizando, por ejemplo, ácido, TriSyl®, arcilla y/o filtración; (5) filtrar en frío el aceite blanqueado para eliminar adicionalmente los componentes de alto punto de fusión del aceite para lograr el nivel de claridad deseado; (6) calentar el aceite, después de lo cual el aceite se enfría y se mantiene durante un período de tiempo que hace que cristalicen los triglicéridos y las ceras de alto punto de fusión; (7) añadir un coadyuvante de filtración al aceite enfriado y luego eliminar los sólidos cristalizados por filtración; (8) utilizar un desodorante después de la filtración en frío, operado a alta temperatura y en vacío, para eliminar, por ejemplo, peróxidos y cualquier compuesto de bajo peso molecular remanente que pueda causar malos olores y sabores; (9) transferir el aceite al tanque de alimentación del desodorante, desairear y desodorizar, por ejemplo, en un desodorante de columna empaquetada; y (10) enfriar, por ejemplo, bajo una manta de nitrógeno al final del ciclo de desodorización y añadir antioxidantes adecuados al aceite desodorizado para proporcionar estabilidad oxidativa.

En algunas realizaciones, el aceite microbiano comprende una fracción de ésteres de esterol de aproximadamente 0%, al menos aproximadamente 0,1%, al menos aproximadamente 0,2%, al menos aproximadamente 0,5%, al menos aproximadamente 1%, al menos aproximadamente 1,5%, al menos aproximadamente 2% o al menos aproximadamente 5% en peso. En algunas realizaciones, el aceite microbiano comprende una fracción de ésteres de esteroles de aproximadamente 0% a aproximadamente 1,5%, aproximadamente 0% a aproximadamente 2%, aproximadamente 0% a aproximadamente 5%, aproximadamente 1% a aproximadamente 1,5%, aproximadamente 0,2% a aproximadamente 1,5%, aproximadamente 0,2% a aproximadamente 2%, o aproximadamente 0,2% a aproximadamente 5% en peso. En algunas realizaciones, el aceite microbiano comprende una fracción de ésteres de esterol de aproximadamente 5% o menos, aproximadamente 4% o menos, aproximadamente 3% o menos, aproximadamente 2% o menos, aproximadamente 1% o menos, aproximadamente 0,5% o menos, aproximadamente 0,3% o menos, aproximadamente 0,2% o menos, aproximadamente 0,5% o menos, aproximadamente 0,4% o menos, aproximadamente 0,3% o menos, o aproximadamente 0,2% o menos en peso.

En algunas realizaciones, el aceite microbiano comprende una fracción de triacilglicerol de al menos aproximadamente 35%, al menos aproximadamente 40%, al menos aproximadamente 45%, al menos aproximadamente 50%, al menos aproximadamente 55%, al menos aproximadamente 60%, al menos aproximadamente 65%, al menos aproximadamente 70%, al menos aproximadamente 75%, al menos aproximadamente 80%, al menos aproximadamente 85% o al menos aproximadamente 90% en peso. En algunas realizaciones, el aceite microbiano comprende una fracción de triacilglicerol de aproximadamente 35% a aproximadamente 98%, aproximadamente 35% a aproximadamente 90%, aproximadamente 35% a aproximadamente 80%, aproximadamente 35% a aproximadamente 70%, aproximadamente 35% a aproximadamente 70%, aproximadamente 35% a aproximadamente 65%, aproximadamente 40% a aproximadamente 70%, aproximadamente 40% a aproximadamente 65%, aproximadamente 40% a aproximadamente 55%, aproximadamente 40% a aproximadamente 50%, aproximadamente 65% a aproximadamente 95%, aproximadamente 75% a aproximadamente 95%, aproximadamente 75% a aproximadamente 98%, aproximadamente 80% a aproximadamente 95%, aproximadamente 80% a aproximadamente 98%, aproximadamente 90% a aproximadamente 96%, aproximadamente 90% a aproximadamente 97%, aproximadamente 90% a aproximadamente 98%, aproximadamente 90%, aproximadamente 95%, aproximadamente 97% o aproximadamente 98% en peso.

En algunas realizaciones, el aceite microbiano comprende una fracción de diacilglicerol de al menos aproximadamente 10%, al menos aproximadamente 11%, al menos aproximadamente 12%, al menos aproximadamente 13%, al menos aproximadamente 14%, al menos aproximadamente 15%, al menos aproximadamente 16%, al menos aproximadamente 17%, al menos aproximadamente 18%, al menos aproximadamente 19% o al menos aproximadamente 20% en peso. En algunas realizaciones, el aceite microbiano comprende una fracción de diacilglicerol de aproximadamente 10% a aproximadamente 45%, aproximadamente 10% a aproximadamente 40%, aproximadamente 10% a aproximadamente 35%, aproximadamente 10% a aproximadamente 30%, aproximadamente 15% a aproximadamente 40%, aproximadamente 15% a aproximadamente 35% o aproximadamente 15% a aproximadamente 30% en peso. En algunas realizaciones, el aceite microbiano comprende una fracción de 1,2-diacilglicerol de al menos aproximadamente 0,2%, al menos aproximadamente 0,3%, al menos aproximadamente 0,4%, al menos aproximadamente 0,5%, al menos aproximadamente 1%, al menos aproximadamente 5 %, al menos aproximadamente 10%, al menos aproximadamente 11%, al menos aproximadamente 12%, al menos aproximadamente 13%, al menos aproximadamente 14%, al menos aproximadamente 15%, al menos aproximadamente 16%, al menos aproximadamente 17%, al menos aproximadamente 18%, al menos aproximadamente 19% o al menos aproximadamente 20% en peso. En algunas realizaciones, el aceite microbiano comprende una fracción de diacilglicerol de aproximadamente 0,2% a aproximadamente 45%, aproximadamente 0,2% a aproximadamente 30%, aproximadamente 0,2% a aproximadamente 20%, aproximadamente 0,2% a aproximadamente 10%, aproximadamente 0,2% a aproximadamente 5%, aproximadamente 0,2% a aproximadamente 1%, aproximadamente 0,2% a aproximadamente 0,8%, aproximadamente 0,4% a aproximadamente 45%, aproximadamente 0,4% a aproximadamente 30%, aproximadamente 0,4% a aproximadamente 20%, aproximadamente 0,4% a aproximadamente 10%, aproximadamente 0,4% a aproximadamente 5%, aproximadamente 0,4% a aproximadamente 1%, aproximadamente 0,4% a aproximadamente 0,8%, aproximadamente 0,5% a aproximadamente 1%, aproximadamente 0,5% a aproximadamente 0,8%, aproximadamente 10% a aproximadamente 45%, aproximadamente 10% a aproximadamente 40%, aproximadamente 10% a aproximadamente 35%, aproximadamente 10% a aproximadamente 30%, aproximadamente 15% a aproximadamente 40%, aproximadamente 15% a aproximadamente 35%, aproximadamente 15% a aproximadamente 30% o aproximadamente 15% a aproximadamente 25% en peso. En algunas realizaciones, el aceite microbiano comprende una fracción de 1,3-diacilglicerol de al menos aproximadamente 0,1%, al menos aproximadamente 0,2%, al menos aproximadamente 0,5%, al menos aproximadamente 1%, al menos aproximadamente 2%, al menos aproximadamente 2,5 % o al menos aproximadamente 3% en peso. En algunas realizaciones, el aceite microbiano comprende una fracción de esteroles de al menos aproximadamente 0,3%, al menos aproximadamente 0,4%, al menos aproximadamente 0,5%, al menos aproximadamente 1%, al menos aproximadamente 1,5%, al menos aproximadamente 2% o al menos aproximadamente al menos aproximadamente 5% en peso.

En algunas realizaciones, el aceite microbiano comprende una fracción de esterol de aproximadamente 0,3% a aproximadamente 5%, aproximadamente 0,3% a aproximadamente 2%, aproximadamente 0,3% a aproximadamente 1,5%, aproximadamente 0,5% a aproximadamente 1,5%, aproximadamente 1% a aproximadamente 1,5%, aproximadamente 0,5% a aproximadamente 2%, aproximadamente 0,5% a aproximadamente 5%, aproximadamente 1% a aproximadamente 2% o aproximadamente 1% a aproximadamente 5% en peso. En algunas realizaciones, el aceite microbiano comprende una fracción de esterol de aproximadamente 5% o menos, aproximadamente 4% o menos, aproximadamente 3% o menos, aproximadamente 2% o menos, aproximadamente 1,5% o menos o aproximadamente 1% o menos en peso.

En algunas realizaciones, el aceite microbiano comprende una fracción de fosfolípidos de al menos aproximadamente 2%, al menos aproximadamente 5% o al menos aproximadamente 8% en peso. En algunas realizaciones, el aceite microbiano comprende una fracción de fosfolípidos de aproximadamente 2% a aproximadamente 25%, aproximadamente 2% a aproximadamente 20%, aproximadamente 2% a aproximadamente 15%, aproximadamente 2% a aproximadamente 10%, aproximadamente 5% a aproximadamente 25% aproximadamente 5% a aproximadamente 20%, aproximadamente 5% a aproximadamente 20%, aproximadamente 5% a aproximadamente 10% o aproximadamente 7% a aproximadamente 9% en peso. En algunas realizaciones, el aceite microbiano comprende una fracción de fosfolípidos de menos de aproximadamente 20%, menos de aproximadamente 15%, menos de aproximadamente 10%, menos de aproximadamente 9% o menos de aproximadamente 8% en peso. En algunas realizaciones, el aceite microbiano está sustancialmente exento de fosfolípidos. En algunas realizaciones, el aceite microbiano comprende insaponificables de menos de aproximadamente 2%, menos de aproximadamente 1,5%, menos de aproximadamente 1% o menos de aproximadamente 0,5% en peso del aceite. Las clases de lípidos presentes en el aceite microbiano, tales como una fracción de triacilglicerol, pueden separarse mediante cromatografía de resolución instantánea y analizarse mediante cromatografía en capa fina (TLC), o separarse y analizarse mediante otros métodos conocidos en la técnica.

En algunas realizaciones, el aceite microbiano y/o una o más fracciones del mismo seleccionadas de la fracción de triacilglicerol, la fracción de ácido graso libre, la fracción de esterol, la fracción de diacilglicerol, y combinaciones de los mismos, comprende al menos aproximadamente 5%, al menos aproximadamente 10%, más de aproximadamente 10%, al menos aproximadamente 12%, al menos aproximadamente 13%, al menos aproximadamente 14%, al menos aproximadamente 15%, al menos aproximadamente 16%, al menos aproximadamente 17%, al menos aproximadamente 18%, al menos aproximadamente 19%, al menos aproximadamente 20%, al menos aproximadamente 25%, al menos aproximadamente 30%, al menos aproximadamente 35%, al menos aproximadamente 40% o al menos aproximadamente 45% en peso de EPA. En algunas realizaciones, el aceite microbiano y/o una o más fracciones del mismo seleccionadas de la fracción de triacilglicerol, la fracción de ácido graso libre, la fracción de esterol, la fracción de diacilglicerol y combinaciones de las mismas, comprende aproximadamente 5% a aproximadamente 55%, aproximadamente 5% a aproximadamente 50%, aproximadamente 5% a aproximadamente 45%, aproximadamente 5% a aproximadamente 40%, aproximadamente 5% a aproximadamente 35%, aproximadamente 5% a aproximadamente 30%, aproximadamente 10% a aproximadamente 55%, aproximadamente 10% a aproximadamente 50%, aproximadamente 10% a aproximadamente 45%, aproximadamente 10% a aproximadamente 40%, aproximadamente 10% a aproximadamente 35%, aproximadamente 10% a aproximadamente 30%, al menos aproximadamente 12% a aproximadamente 55%, al menos aproximadamente 12% a aproximadamente 50%, al menos aproximadamente 12% a aproximadamente 45%, al menos aproximadamente 12% a aproximadamente 40%, al menos aproximadamente 12% a aproximadamente 35%, o al menos aproximadamente 12% a aproximadamente 30%, aproximadamente 15% a aproximadamente 55%, aproximadamente 15% a aproximadamente 50%, aproximadamente 15% a aproximadamente 45%, aproximadamente 15% a aproximadamente 40%, aproximadamente 15% a aproximadamente 35%, aproximadamente 15% a aproximadamente 30%, aproximadamente 15% a aproximadamente 25%, aproximadamente 15% a aproximadamente 20%, aproximadamente 20% a aproximadamente 55%, aproximadamente 20% a aproximadamente 50%, aproximadamente 20% a aproximadamente 45%, aproximadamente 20% a aproximadamente 40% o aproximadamente 20% a aproximadamente 30% en peso de EPA. En algunas realizaciones, el aceite microbiano y/o una o más fracciones del mismo seleccionadas de la fracción de triacilglicerol, la fracción de diacilglicerol, la fracción de esterol, la fracción de ésteres de esterol, la fracción de ácidos grasos libres, la fracción de fosfolípidos y combinaciones de los mismos, comprende: al menos aproximadamente 5%, al menos aproximadamente 10%, al menos aproximadamente 15%, al menos aproximadamente 20%, al menos aproximadamente 25%, al menos aproximadamente 30%, al menos aproximadamente 35%, al menos aproximadamente 40%, al menos aproximadamente 50% o al menos aproximadamente 60% en peso de DHA. En algunas realizaciones, el aceite microbiano y/o una o más fracciones del mismo seleccionadas de la fracción de triacilglicerol, la fracción de diacilglicerol, la fracción de esterol, la fracción de ésteres de esterol, la fracción de ácidos grasos libres, la fracción de fosfolípidos y combinaciones de los mismos, comprende aproximadamente 5% a aproximadamente 60%, aproximadamente 5% a aproximadamente 55%, aproximadamente 5% a aproximadamente 50%, aproximadamente 5% a aproximadamente 40%, aproximadamente 10% a aproximadamente 60%, aproximadamente 10% a aproximadamente 50%, aproximadamente 10% a aproximadamente 40%, aproximadamente 20% a aproximadamente 60%, aproximadamente 25% a aproximadamente 60%, aproximadamente 25% a aproximadamente 50%, aproximadamente 25% a aproximadamente 45%, aproximadamente 30% a aproximadamente 50%, aproximadamente 35% a aproximadamente 50% o aproximadamente 30% a aproximadamente 40% en peso de DHA. En algunas realizaciones, el aceite microbiano y/o una o más fracciones del mismo seleccionadas de la fracción de triacilglicerol, la fracción de diacilglicerol, la fracción de esterol, la fracción de ésteres de esterol, la fracción de ácidos grasos libres, la fracción de fosfolípidos y combinaciones de los mismos, comprende aproximadamente 10% o menos, aproximadamente 9% o menos, aproximadamente 8% o menos, aproximadamente 7% o menos, aproximadamente 6% o menos, aproximadamente 5% o menos, aproximadamente 4% o menos, aproximadamente 3% o menos, aproximadamente 2% o menos o aproximadamente 1% o menos en peso de DHA. En algunas realizaciones, el aceite microbiano y/o una o más fracciones del mismo seleccionadas de la fracción de triacilglicerol, la fracción de diacilglicerol, la fracción de esterol, la fracción de ésteres de esterol, la fracción de ácidos grasos libres, la fracción de fosfolípidos y combinaciones de las mismas, comprende aproximadamente 1% a aproximadamente 10%, aproximadamente 1% a aproximadamente 5%, aproximadamente 2% a aproximadamente 5%, aproximadamente 3% a aproximadamente 5% o aproximadamente 3% a aproximadamente 10% en peso de los ácidos grasos como DHA. En algunas realizaciones, el aceite microbiano y/o una o más fracciones del mismo seleccionadas de la fracción de triacilglicerol, la fracción de diacilglicerol, la fracción de esterol, la fracción de ásteres de esterol, la fracción de ácidos grasos libres, la fracción de fosfolípidos y combinaciones de los mismos, está sustancialmente exenta de DHA. En algunas realizaciones, el aceite microbiano y/o una o más fracciones del mismo seleccionadas de la fracción de triacilglicerol, la fracción de diacilglicerol, la fracción de esterol, la fracción de ásteres de esterol, la fracción de ácidos grasos libres, la fracción de fosfolípidos y combinaciones de las mismas comprende aproximadamente 0,1% a aproximadamente 5%, aproximadamente 0,1% a menos de aproximadamente 5%, aproximadamente 0,1% a aproximadamente 4%, aproximadamente 0,1% a aproximadamente 3%, aproximadamente 0,1% a aproximadamente 2%, aproximadamente 0,2% a aproximadamente 5%, aproximadamente 0,2% a menos de aproximadamente 5%, aproximadamente 0,2% a aproximadamente 4%, aproximadamente 0,2% a aproximadamente 3%, aproximadamente 0,2% a aproximadamente 2%, aproximadamente 0,3% a aproximadamente 2%, aproximadamente 0,1% a aproximadamente 0,5%, aproximadamente 0,2% a aproximadamente 0,5%, aproximadamente 0,1% a aproximadamente 0,4%, aproximadamente 0,2% a aproximadamente 0,4%, aproximadamente 0,5% a aproximadamente 2%, aproximadamente 1% a aproximadamente 2%, aproximadamente 0,5% a aproximadamente 1,5% o aproximadamente 1% a aproximadamente 1,5% en peso de ARA En algunas realizaciones, el aceite microbiano y/o una o más fracciones del mismo seleccionadas de la fracción de triacilglicerol, la fracción de diacilglicerol, la fracción de esterol, la fracción de ásteres de esterol, la fracción de ácidos grasos, la fracción de fosfolípidos y combinaciones de las mismas comprende aproximadamente 5% o menos, menos de aproximadamente 5%, aproximadamente 4% o menos, aproximadamente 3% o menos, aproximadamente 2% o menos, aproximadamente 1,5% o menos, aproximadamente 1% o menos, aproximadamente 0,5% o menos, aproximadamente 0,4% o menos, aproximadamente 0,3% o menos, aproximadamente 0,2% o menos o aproximadamente 0,1% o menos en peso de ARA. En algunas realizaciones, el aceite microbiano y/o una o más fracciones del mismo seleccionadas de la fracción de triacilglicerol, la fracción de diacilglicerol, la fracción de esterol, la fracción de ásteres de esterol, la fracción de ácidos grasos libres, la fracción de fosfolípidos y combinaciones de las mismas, está sustancialmente exenta de ARA. En algunas realizaciones, el aceite microbiano y/o una o más fracciones del mismo seleccionadas de la fracción de triacilglicerol, la fracción de diacilglicerol, la fracción de esterol, la fracción de ásteres de esterol, la fracción de ácidos grasos libres, la fracción de fosfolípidos y combinaciones de las mismas comprende aproximadamente 0,4% a aproximadamente 2%, aproximadamente 0,4% a aproximadamente 3%, aproximadamente 0,4% a aproximadamente 4%, aproximadamente 0,4% a aproximadamente 5%, aproximadamente 0,4% a menos de aproximadamente 5%, aproximadamente 0,5% a aproximadamente 1%, aproximadamente 0,5% a aproximadamente 2%, aproximadamente 0,5% a aproximadamente 3%, aproximadamente 0,5% a aproximadamente 4%, aproximadamente 0,5% a aproximadamente 5%, aproximadamente 0,5% a menos de aproximadamente 5%, aproximadamente 1% a aproximadamente 2%, aproximadamente 1% a aproximadamente 3%, aproximadamente 1% a aproximadamente 4%, aproximadamente 1% a aproximadamente 5% o aproximadamente 1% a menos de aproximadamente 5% en peso de DPA n-6. En algunas realizaciones, el aceite microbiano y/o una o más fracciones del mismo seleccionadas de la fracción de triacilglicerol, la fracción de diacilglicerol, la fracción de esterol, la fracción de ásteres de esterol, la fracción de ácidos grasos libres, la fracción de fosfolípidos y combinaciones de las mismas comprende aproximadamente 5%, menos de aproximadamente 5%, aproximadamente 4% o menos, aproximadamente 3% o menos, aproximadamente 2% o menos, aproximadamente 1% o menos, aproximadamente 0,75% o menos, aproximadamente 0,6% o menos o aproximadamente 0,5% o menos en peso de DPA n-6. En algunas realizaciones, el aceite microbiano y/o una o más fracciones del mismo seleccionadas de la fracción de triacilglicerol, la fracción de diacilglicerol, la fracción de esterol, la fracción de ásteres de esterol, la fracción de ácidos grasos libres, la fracción de fosfolípidos y combinaciones de las mismas está sustancialmente exenta de DPA n-6. En algunas realizaciones, el aceite microbiano y/o una o más fracciones del mismo seleccionadas de la fracción de triacilglicerol, la fracción de diacilglicerol, la fracción de esterol, la fracción de ásteres de esterol, la fracción de ácidos grasos libres, la fracción de fosfolípidos y combinaciones de las mismas comprende ácidos con aproximadamente 5% o menos, menos de aproximadamente 5%, aproximadamente 4% o menos, aproximadamente 3% o menos o aproximadamente 2% o menos en peso de ácido oleico (18:1 n-9), ácido linoleico (18:2 n-6), ácido linolánico (18:3 n-3), ácido eicosenoico (20:1 n-9), ácido erúcico (22:1 n-9), ácido estearidónico (18:4 n-3), o combinaciones de los mismos.

La molácula de triacilglicerol contiene 3 átomos de carbono central (C(sn-1)H2R1-(sn-2)H2R2-C(sn-3)H2 R3), permitiendo la formación de diferentes isómeros posicionales. En algunas realizaciones, el aceite microbiano comprende una fracción de triacilglicerol, en donde al menos aproximadamente 2%, al menos aproximadamente 3%, al menos aproximadamente 5%, al menos aproximadamente 10%, al menos aproximadamente 15%, al menos aproximadamente 20%, al menos aproximadamente 30%, al menos aproximadamente 35% o al menos aproximadamente 40% de los triacilgliceroles en la fracción de triacilglicerol contienen DHA en dos posiciones en el triacilglicerol (DHA di-sustituido) seleccionado de cualquiera dos de las posiciones sn-1, sn-2 y sn-3, basadas en el porcentaje de área relativa de picos en un cromatógrafo HPLC. En algunas realizaciones, el aceite microbiano comprende una fracción de triacilglicerol, en donde aproximadamente 2% a aproximadamente 55%, aproximadamente 2% a aproximadamente 50%, aproximadamente 2% a aproximadamente 45%, aproximadamente 2% a aproximadamente 40%, aproximadamente 2% a aproximadamente 35%, aproximadamente 2% a aproximadamente 30%, aproximadamente 2% a aproximadamente 25%, aproximadamente 5% a aproximadamente 55%, aproximadamente 5% a aproximadamente 50%, aproximadamente 5% a aproximadamente 45%, aproximadamente 5% a aproximadamente 40%, aproximadamente 5% a aproximadamente 35%, aproximadamente 5% a aproximadamente 30%, aproximadamente 5% a aproximadamente 25%, aproximadamente 10% a aproximadamente 55%, aproximadamente 10% a aproximadamente 50%, aproximadamente 10% a aproximadamente 45%, aproximadamente 10% a aproximadamente 40%, aproximadamente 10% a aproximadamente 35%, aproximadamente 10% a aproximadamente 30%, aproximadamente 10% a aproximadamente 25%, aproximadamente 10% a aproximadamente 20%, aproximadamente 20% a aproximadamente 40%, aproximadamente 20% a aproximadamente 35% o aproximadamente 20% a aproximadamente 25% de los triacilgliceroles en la fracción de triacilglicerol contiene EPA en dos posiciones en el triacilglicerol seleccionado de cualquiera de dos de las posiciones sn-1, sn-2 o sn-3, basado en el porcentaje de área relativa de los picos en un cromatógrafo de HPLC. En algunas realizaciones, el aceite microbiano comprende una fracción de triacilglicerol, en la que al menos aproximadamente 0,5%, al menos aproximadamente 1%, al menos aproximadamente 1,5% o al menos aproximadamente 2% de los triacilgliceroles en la fracción de triacilglicerol contienen DHA en todas las posiciones sn-1, sn-2 y sn-3 (DHA tri-sustituido), basado en el porcentaje de área relativa de los picos en un cromatógrafo de HPLC. En algunas realizaciones, el aceite microbiano comprende una fracción de triacilglicerol, en donde aproximadamente 0,5% a aproximadamente 5%, aproximadamente 0,5% a aproximadamente 3%, aproximadamente 0,5% a aproximadamente 2,5%, aproximadamente 0,5% a aproximadamente 2%, aproximadamente 1% a aproximadamente 5%, aproximadamente 1% a aproximadamente 3% o aproximadamente 1% a aproximadamente 2% de los triacilgliceroles en la fracción de triacilglicerol contienen DHA en todas las posiciones sn-1, sn-2 y sn-3, basado en el porcentaje de área relativa de los picos en un cromatógrafo HPLC. En algunas realizaciones, el aceite microbiano comprende una fracción de triacilglicerol, en la que al menos aproximadamente 10%, al menos aproximadamente 15%, al menos aproximadamente 20%, al menos aproximadamente 25%, al menos aproximadamente 30%, al menos aproximadamente 35%, al menos aproximadamente 40%, al menos aproximadamente 45%, al menos aproximadamente 50%, al menos aproximadamente 55% o al menos aproximadamente 60% de los triacilgliceroles en la fracción de triacilglicerol contienen DHA en una posición en el triacilglicerol seleccionada de cualquiera de las posiciones sn-1, sn-2 o sn-3, basado en el porcentaje de área relativa de los picos en un cromatógrafo de HPLC. En algunas realizaciones, el aceite microbiano comprende una fracción de triacilglicerol, en la que aproximadamente 10% a aproximadamente 80%, aproximadamente 10% a aproximadamente 70%, aproximadamente 10% a aproximadamente 60%, aproximadamente 15% a aproximadamente 80%, aproximadamente 15% a aproximadamente 75%, aproximadamente 15% a aproximadamente 70%, aproximadamente 15% a aproximadamente 65%, aproximadamente 15% a aproximadamente 60%, aproximadamente 35% a aproximadamente 80%, aproximadamente 35% a aproximadamente 75%, aproximadamente 35% a aproximadamente 65%, aproximadamente 35% a aproximadamente 60%, aproximadamente 40% a aproximadamente 80%, aproximadamente 40% a aproximadamente 75%, aproximadamente 40% a aproximadamente 70%, aproximadamente 40% a aproximadamente 65%, aproximadamente 40% a aproximadamente 60% o aproximadamente 40% a aproximadamente 55% de los triacilgliceroles en la fracción de triacilglicerol contiene DHA en una posición en el triacilglicerol seleccionada de una cualquiera de las posiciones sn-1, sn-2 o sn-3, basado en el porcentaje de área relativa de los picos en un cromatógrafo HPLC.

La presente invención está dirigida, además, a métodos de producir aceites microbianos. En algunas realizaciones, el método comprende cultivar un traustocítrido de la divulgación en un cultivo para producir una biomasa y extraer de la biomasa un aceite que comprende ácidos grasos omega-3. El aceite se puede extraer de una biomasa recién recolectada o se puede extraer de una biomasa recolectada previamente que ha sido almacenada en condiciones que evitan el deterioro. Se pueden utilizar métodos conocidos para cultivar un traustocítrido de la invención, para aislar una biomasa del cultivo, para extraer un aceite microbiano de la biomasa y para analizar el perfil de ácidos grasos de los aceites extraídos de la biomasa. Véase, p. ej., la Patente de EE.UU. N° 5.130.242.

La divulgación está dirigida, además, a un aceite microbiano que comprende un perfil de ácidos grasos de la divulgación. Un aceite microbiano de la divulgación puede ser cualquier aceite derivado de un microorganismo, incluyendo, por ejemplo: un aceite bruto extraído de la biomasa del microorganismo sin procesamiento adicional; un aceite refinado que se obtiene tratando un aceite microbiano bruto con etapas de procesamiento adicionales, tales como refinamiento, blanqueo y/o desodorización; un aceite microbiano diluido, obtenido diluyendo un aceite microbiano bruto o refinado; o un aceite enriquecido que se obtiene, por ejemplo, tratando un aceite microbiano bruto o refinado con métodos adicionales de purificación para aumentar la concentración de un ácido graso (tal como DHA) en el aceite.

En algunas realizaciones, el aceite microbiano comprende una fracción de ésteres de esterol de aproximadamente 0%, al menos aproximadamente 0,1%, al menos aproximadamente 0,2%, al menos aproximadamente 0,5%, al menos aproximadamente 1%, al menos aproximadamente 1,5%, al menos aproximadamente 2% o al menos aproximadamente 5% en peso. En algunas realizaciones, el aceite microbiano comprende una fracción de ésteres de esterol de aproximadamente 0% a aproximadamente 1,5%, aproximadamente 0% a aproximadamente 2%, aproximadamente 0% a aproximadamente 5%, aproximadamente 1% a aproximadamente 1,5%, aproximadamente 0,2% a aproximadamente 1,5%, aproximadamente 0,2% a aproximadamente 2% o aproximadamente 0,2% a aproximadamente 5% en peso. En algunas realizaciones, el aceite microbiano comprende una fracción de ésteres de esterol de menos de aproximadamente 5%, menos de aproximadamente 4%, menos de aproximadamente 3% o menos de aproximadamente 2% en peso. En algunas realizaciones, el aceite microbiano comprende una fracción de triglicéridos de al menos aproximadamente 65%, al menos aproximadamente 70%, al menos aproximadamente 75%, al menos aproximadamente 80%, al menos aproximadamente 85% o al menos aproximadamente 90% en peso. En algunas realizaciones, el aceite microbiano comprende una fracción de triglicéridos de aproximadamente 65% a aproximadamente 95%, aproximadamente 75% a aproximadamente 95% o aproximadamente 80% a aproximadamente 95% en peso o aproximadamente 97% en peso o aproximadamente 98% por peso. En algunas realizaciones, el aceite microbiano comprende una fracción de ácidos grasos libres de al menos aproximadamente 0,5%, al menos aproximadamente 1%, al menos aproximadamente 1,5%, al menos aproximadamente 2%, al menos aproximadamente 2,5% o al menos aproximadamente 5% en peso. En algunas realizaciones, el aceite microbiano comprende una fracción de ácidos grasos libres de aproximadamente 0,5% a aproximadamente 5%, aproximadamente 0,5% a aproximadamente 2,5%, aproximadamente 0,5% a aproximadamente 2%, aproximadamente 0,5% a aproximadamente 1,5%, aproximadamente 0,5% a aproximadamente 1%, aproximadamente 1% a aproximadamente 2,5%, aproximadamente 1% a aproximadamente 5%, aproximadamente 1,5% a aproximadamente 2,5%, aproximadamente 2% a aproximadamente 2,5% o aproximadamente 2% a aproximadamente 5% en peso. En algunas realizaciones, el aceite microbiano comprende una fracción de ácidos grasos libres de menos de aproximadamente 5%, menos de aproximadamente 4%, menos de aproximadamente 3%, menos de aproximadamente 2% o menos de aproximadamente 1% en peso. En algunas realizaciones, el aceite microbiano comprende una fracción de esteroles de al menos aproximadamente 0,5%, al menos aproximadamente 1%, al menos aproximadamente 1,5%, al menos aproximadamente 2% o al menos aproximadamente 5% en peso. En algunas realizaciones, el aceite microbiano comprende una fracción de esteroles de aproximadamente 0,5% a aproximadamente 1,5%, aproximadamente 1% a aproximadamente 1,5%, aproximadamente 0,5% a aproximadamente 2%, aproximadamente 0,5% a aproximadamente 5%, aproximadamente 1% a aproximadamente 2% o aproximadamente 1% a aproximadamente 5% en peso. En algunas realizaciones, el aceite microbiano comprende una fracción de esteroles de menos de aproximadamente 5%, menos de aproximadamente 4%, menos de aproximadamente 3%, menos de aproximadamente 2% o menos de aproximadamente 1% en peso. En algunas realizaciones, el aceite microbiano comprende una fracción de diglicéridos de al menos aproximadamente 1,5%, al menos aproximadamente 2%, al menos aproximadamente 2,5%, al menos aproximadamente 3%, al menos aproximadamente 3,5% o al menos aproximadamente 5% en peso. En algunas realizaciones, el aceite microbiano comprende una fracción de diglicéridos de aproximadamente 1,5% a aproximadamente 3%, aproximadamente 2% a aproximadamente 3%, aproximadamente 1,5% a aproximadamente 3,5%, aproximadamente 1,5% a aproximadamente 5%, aproximadamente 2,5% a aproximadamente 3%, aproximadamente 2,5% a aproximadamente 3,5% o aproximadamente 2,5% a aproximadamente 5% en peso. En algunas realizaciones, el aceite microbiano comprende insaponificables de menos de aproximadamente 2%, menos de aproximadamente 1,5%, menos de aproximadamente 1% o menos de aproximadamente 0,5% en peso del aceite. Las clases de lípidos presentes en el aceite microbiano, tal como la fracción de triglicéridos, pueden separarse mediante cromatografía de resolución instantánea y analizarse mediante cromatografía en capa fina (TLC), o separarse y analizarse mediante otros métodos conocidos en la técnica.

En algunas realizaciones, el aceite microbiano y/o una o más fracciones del mismo seleccionadas de la fracción de triglicéridos, la fracción de ácidos grasos libres, la fracción de esterol, la fracción de diglicéridos y combinaciones de las mismas, comprende al menos aproximadamente 40%, al menos al menos aproximadamente 45%, al menos aproximadamente 50%, al menos aproximadamente 55%, al menos aproximadamente 60%, al menos aproximadamente 65%, al menos aproximadamente 70%, al menos aproximadamente 75% o al menos aproximadamente 80% en peso de DHA. En algunas realizaciones, el aceite microbiano y/o una o más fracciones del mismo seleccionadas de la fracción de triglicéridos, la fracción de ácidos grasos libres, la fracción de esterol, la fracción de diglicéridos y combinaciones de las mismas, comprende de aproximadamente 40% a aproximadamente 45%, aproximadamente 40% a aproximadamente 50%, aproximadamente 40% a aproximadamente 60%, aproximadamente 50% a aproximadamente 60%, aproximadamente 55% a aproximadamente 60%, aproximadamente 40% a aproximadamente 65%, aproximadamente 50% a aproximadamente 65%, aproximadamente 55% a aproximadamente 65%, aproximadamente 40% a aproximadamente 70%, aproximadamente 40% a aproximadamente 80%, aproximadamente 50% a aproximadamente 80%, aproximadamente 55% a aproximadamente 80%, aproximadamente 60% a aproximadamente 80% o aproximadamente 70% a aproximadamente 80% en peso de DHA. En algunas realizaciones, el aceite microbiano comprende una fracción de ésteres de esterol que comprende aproximadamente 45% o menos, aproximadamente 40% o menos, aproximadamente 35% o menos, aproximadamente 30% o menos, aproximadamente 25% o menos, aproximadamente 20% o menos, aproximadamente 15% o menos o aproximadamente 13% o menos en peso de DHA En algunas realizaciones, el aceite microbiano y/o una o más fracciones del mismo se seleccionan de la fracción de triglicéridos, la fracción de ácidos grasos libres, la fracción de esterol, la fracción de diglicéridos y combinaciones de las mismas, comprende aproximadamente 10% o menos, aproximadamente 9% o menos, aproximadamente 8% o menos, aproximadamente 7% o menos, aproximadamente 6% o menos, aproximadamente 5% o menos, aproximadamente 4% o menos, aproximadamente 3% o menos, aproximadamente 2% o menos o aproximadamente 1% o menos en peso de EPA. En algunas realizaciones, el aceite microbiano y/o una o más fracciones del mismo seleccionadas de la fracción de triglicéridos, la fracción de ácidos grasos libres, la fracción de esterol, la fracción de diglicéridos y combinaciones de las mismas, comprende de aproximadamente 2% a aproximadamente 3%, aproximadamente 2% a aproximadamente 3,5%, aproximadamente 2,5% a aproximadamente 3,5%, aproximadamente 2% a aproximadamente 6%, aproximadamente 2,5% a aproximadamente 6%, aproximadamente 3,0% a aproximadamente 6%, aproximadamente 3,5% a aproximadamente 6%, aproximadamente 5% a aproximadamente 6% o aproximadamente 2% a aproximadamente 10% en peso de EPA. En algunas realizaciones, el aceite microbiano y/o una o más fracciones del mismo se seleccionan de la fracción de ésteres de esterol, la fracción de triglicéridos, la fracción de ácidos grasos libres, la fracción de esterol, la fracción de diglicéridos, la fracción polar (incluyendo la fracción de fosfolípidos) y combinaciones de las mismas, está sustancialmente exento de EPA. En algunas realizaciones, el aceite microbiano y/o una o más fracciones del mismo se seleccionan de la fracción de ésteres de esterol, la fracción de triglicéridos, la fracción de ácidos grasos libres, la fracción de esterol, la fracción de diglicéridos, la fracción polar (incluyendo la fracción de fosfolípidos) y combinaciones de las mismas, comprende una relación ponderal de DHA a EPA de al menos aproximadamente 5:1, al menos aproximadamente 7:1, al menos aproximadamente 9:1, al menos aproximadamente 10:1, al menos aproximadamente 15:1, al menos aproximadamente 20:1, al menos aproximadamente 25:1, al menos aproximadamente 30:1 o al menos aproximadamente 50:1, en donde el aceite microbiano y/o una o más fracciones del mismo comprende 10% o menos en peso de EPA. En algunas realizaciones, el aceite microbiano y/o una o más fracciones del mismo se seleccionan de la fracción de ésteres de esterol, la fracción de triglicéridos, la fracción de ácidos grasos libres, la fracción de esterol, la fracción de diglicéridos, la fracción polar (incluyendo la fracción de fosfolípidos) y combinaciones de las mismas, comprende una relación ponderal de DHA a EPA de al menos aproximadamente 5:1, pero menos de aproximadamente 20:1. En algunas realizaciones, la relación ponderal de DHA a EPA es de aproximadamente 5:1 a aproximadamente 18:1, de aproximadamente 7:1 a aproximadamente 16:1, o de aproximadamente 10:1 a aproximadamente 15:1. En algunas realizaciones, el aceite microbiano y/o una o más fracciones del mismo se seleccionan de la fracción de ésteres de esterol, la fracción de triglicéridos, la fracción de ácidos grasos libres, la fracción de esterol, la fracción de diglicéridos, la fracción polar (incluyendo la fracción de fosfolípidos) y combinaciones de las mismas comprende de aproximadamente 0,1% a aproximadamente 0,25%, de aproximadamente 0,2% a aproximadamente 0,25%, de aproximadamente 0,1% a aproximadamente 0,5% o de aproximadamente 0,1% a aproximadamente 1,5% en peso de ARA. En algunas realizaciones, el aceite microbiano y/o una o más fracciones del mismo se seleccionan de la fracción de ésteres de esterol, la fracción de triglicéridos, la fracción de ácidos grasos libres, la fracción de esterol, la fracción de diglicéridos, la fracción polar (incluyendo la fracción de fosfolípidos) y combinaciones de las mismas, comprende aproximadamente 1,5% o menos, aproximadamente 1% o menos, aproximadamente 0,5% o menos, aproximadamente 0,2% o menos o aproximadamente 0,1% o menos en peso de ARA. En algunas realizaciones, el aceite microbiano y/o una o más fracciones del mismo se seleccionan de la fracción de ésteres de esterol, la fracción de triglicéridos, la fracción de ácidos grasos libres, la fracción de esterol, la fracción de diglicéridos, la fracción polar (incluyendo la fracción de fosfolípidos) y combinaciones de las mismas, está sustancialmente exento de ARA. En algunas realizaciones, el aceite microbiano y/o una o más fracciones del mismo se seleccionan de la fracción de ésteres de esterol, la fracción de triglicéridos, la fracción de ácidos grasos libres, la fracción de diglicéridos, la fracción polar (incluyendo la fracción de fosfolípidos) y combinaciones de las mismas, comprende una relación ponderal de DHA a ARA de al menos aproximadamente 20:1, al menos aproximadamente 30:1, al menos aproximadamente 35:1, al menos aproximadamente 40:1, al menos aproximadamente 60:1, al menos aproximadamente 80:1, al menos aproximadamente 100:1, al menos aproximadamente 150:1, al menos aproximadamente 200:1, al menos aproximadamente 250:1 o al menos aproximadamente 300:1. En algunas realizaciones, el aceite microbiano y/o una o más fracciones del mismo se seleccionan de la fracción de ésteres de esterol, la fracción de triglicéridos, la fracción de ácidos grasos libres, la fracción de esterol, la fracción de diglicéridos, la fracción polar (incluyendo la fracción de fosfolípidos) y combinaciones de las mismas, comprende de aproximadamente 0,5% a aproximadamente 1%, aproximadamente 0,5% a aproximadamente 2%, aproximadamente 0,5% a aproximadamente 2,5%, aproximadamente 0,5% a aproximadamente 3%, aproximadamente 0,5% a aproximadamente 3,5%, aproximadamente 0,5% a aproximadamente 5%, aproximadamente 0,5% a aproximadamente 6%, aproximadamente 1% a aproximadamente 2%, aproximadamente 2% a aproximadamente 3%, aproximadamente 2% a aproximadamente 3,5%, aproximadamente 1% a aproximadamente 2,5%, aproximadamente 1% a aproximadamente 3 %, aproximadamente 1% a aproximadamente 3,5%, aproximadamente 1% a aproximadamente 5% o aproximadamente 1% a aproximadamente 6% en peso de DPA n-6. En algunas realizaciones, el aceite microbiano y/o una o más fracciones del mismo se seleccionan de la fracción de ésteres de esterol, la fracción de triglicéridos, la fracción de ácidos grasos libres, la fracción de esterol, la fracción de diglicéridos, la fracción polar (incluyendo la fracción de fosfolípidos) y combinaciones de las mismas, comprende aproximadamente 6% o menos, aproximadamente 5% o menos, aproximadamente 3% o menos, aproximadamente 2,5% o menos, aproximadamente 2% o menos, aproximadamente 1% o menos, o aproximadamente 0,5% o menos en peso de DPA n-6. En algunas realizaciones, el aceite microbiano y/o una o más fracciones del mismo se seleccionan de la fracción de ésteres de esterol, la fracción de triglicéridos, la fracción de ácidos grasos libres, la fracción de esterol, la fracción de diglicéridos, la fracción polar (incluyendo la fracción de fosfolípidos) y combinaciones de las mismas, está sustancialmente exento de DPA n-6. En algunas realizaciones, el aceite microbiano y/o una o más fracciones del mismo se seleccionan de la fracción de ésteres de esterol, la fracción de triglicéridos, la fracción de ácidos grasos libres, la fracción de esterol, la fracción de diglicéridos, la fracción polar (incluyendo la fracción de fosfolípidos) y combinaciones de las mismas, comprende una relación ponderal de DHA a DPA n-6 mayor que aproximadamente 6:1, de al menos aproximadamente 8:1, al menos aproximadamente 10:1, al menos aproximadamente 15:1, al menos aproximadamente 20:1, al menos aproximadamente 25:1, al menos aproximadamente 50:1 o al menos aproximadamente 100:1. En algunas realizaciones, el aceite microbiano y/o una o más fracciones del mismo se seleccionan de la fracción de ésteres de esterol, la fracción de triglicéridos, la fracción de ácidos grasos libres, la fracción de esterol, la fracción de diglicéridos, la fracción polar (incluyendo la fracción de fosfolípidos) y combinaciones de las mismas, comprende aproximadamente 5% o menos, aproximadamente 4% o menos, aproximadamente 3% o menos, aproximadamente 2% o menos, aproximadamente 1,5% o menos, aproximadamente 1% o menos o aproximadamente 0,5% o menos en peso cada uno de ácido linoleico (18:2 n-6), ácido linolénico (18:3 n-3), ácido eicosenoico (20:1 n-9) y ácido erúcico (22:1 n-9). En algunas realizaciones, el aceite microbiano y/o una o más fracciones del mismo se seleccionan de la fracción de ésteres de esterol, la fracción de triglicéridos, la fracción de ácidos grasos libres, la fracción de esterol, la fracción de diglicéridos, la fracción polar (incluyendo la fracción de fosfolípidos) y combinaciones de las mismas, comprende aproximadamente 5% o menos, aproximadamente 4% o menos, aproximadamente 3% o menos, aproximadamente 2% o menos, aproximadamente 1,5% o menos o aproximadamente 1% o menos en peso de ácido heptadecanoico (17:0). En algunas realizaciones, el aceite microbiano y/o una o más fracciones del mismo comprenden aproximadamente 0,01% a aproximadamente 5% en peso, aproximadamente 0,05% a aproximadamente 3% en peso o aproximadamente 0,1% a aproximadamente 1% en peso de ácido heptadecanoico.

La molécula de triglicérido contiene 3 átomos de carbono central (Csn-1H2R1-Csn-2H2R2-Csn-3H2R3), lo que permite la formación de diferentes isómeros posicionales. En algunas realizaciones, el aceite microbiano comprende una fracción de triglicéridos, en la que al menos aproximadamente el 20%, al menos aproximadamente el 30%, al menos aproximadamente el 35% o al menos aproximadamente el 40% de los triglicéridos en la fracción de triglicéridos contienen DHA en dos posiciones en el triglicérido (DHA di-sustituido) seleccionado de cualquiera dos de las posiciones sn-1, sn-2 y sn-3, basado en el porcentaje de área relativa de los picos en un cromatógrafo de HPLC. En algunas realizaciones, el aceite microbiano comprende una fracción de triglicéridos, en la que aproximadamente 20% a aproximadamente 40%, aproximadamente 20% a aproximadamente 35%, aproximadamente 30% a aproximadamente 40% o aproximadamente 30% a aproximadamente 35% de los triglicéridos en la fracción de triglicéridos contiene DHA en dos posiciones en el triglicérido seleccionado de cualquiera de las dos posiciones sn-1, sn-2 y sn-3, basado en el porcentaje de área relativa de los picos en un cromatógrafo HPLC. En algunas realizaciones, el aceite microbiano comprende una fracción de triglicéridos en la que al menos aproximadamente 5%, al menos aproximadamente 10%, al menos aproximadamente 15% o al menos aproximadamente 20% de los triglicéridos en la fracción de triglicéridos contienen DHA en todas las posiciones sn-1, sn-2 y sn-3 (DHA tri-sustituido), basado en el porcentaje de área relativa de los picos en un cromatógrafo de HPLC. En algunas realizaciones, el aceite microbiano comprende una fracción de triglicéridos en la que de aproximadamente 5% a aproximadamente 20%, aproximadamente 5% a aproximadamente 15%, aproximadamente 10% a aproximadamente 20% o aproximadamente 10% a aproximadamente 15% de los triglicéridos en la fracción de triglicéridos contiene DHA en todas las posiciones sn-1, sn-2 y sn-3, basado en el porcentaje de área relativa de los picos en un cromatógrafo de HPLC. Por el contrario, la especie TAG descrita en la patente de EE.UU. N° 6.582.941 no contiene DHA en las tres posiciones. En algunas realizaciones, el aceite microbiano comprende una fracción de triglicéridos en la que al menos aproximadamente 50%, al menos aproximadamente 55%, al menos aproximadamente 60%, al menos aproximadamente 65%, al menos aproximadamente 70% o al menos aproximadamente 75% de los triglicéridos en la fracción de triglicéridos contienen DHA en una posición en el triglicérido seleccionado de una cualquiera de las posiciones sn-1, sn-2 y sn-3, basado en el porcentaje de área relativa de los picos en un cromatógrafo de HPLC. En algunas realizaciones, el aceite microbiano comprende una fracción de triglicéridos en la que de aproximadamente 50% a aproximadamente 75%, aproximadamente 50% a aproximadamente 70%, aproximadamente 50% a aproximadamente 65%, aproximadamente 60% a aproximadamente 75%, aproximadamente 60% a aproximadamente 70% o aproximadamente 60% a aproximadamente 65% de los triglicéridos en la fracción de triglicéridos contienen DHA en una posición en el triglicérido seleccionada de cualquiera de las posiciones sn-1, sn-2 y sn-3, en base al porcentaje de área relativa de los picos en un cromatógrafo de HPLC.

Composiciones

La divulgación está dirigida a composiciones que comprenden un microorganismo de la divulgación, una biomasa aislada de la divulgación, un aceite microbiano de la divulgación o combinaciones de los mismos.

Un microorganismo, biomasa o aceite microbiano de la divulgación puede ser modificado adicionalmente o procesado química o físicamente sobre la base de los requisitos de la composición mediante cualquier técnica conocida.

Células o biomasas de microorganismos se pueden secar antes de su uso en una composición mediante métodos que incluyen, pero no se limitan a secado por congelación, secado al aire, secado por pulverización, secado en túnel, secado en vacío (liofilización) y un proceso similar. Alternativamente, una biomasa recolectada y lavada se puede utilizar directamente en una composición sin secar. Véanse, p. ej., las patentes de EE.UU. N°s 5.130.242 y 6.812.009.

Aceites microbianos de la divulgación se puede utilizar como material de partida para producir de manera más eficiente un producto enriquecido en un ácido graso tal como EPA. Por ejemplo, los aceites microbianos de la divulgación se pueden someter a diversas técnicas de purificación conocidas en la técnica, tales como destilación o aducción de urea, para producir un producto de mayor potencia con concentraciones más altas de EPA u otro ácido graso. Los aceites microbianos de la divulgación también pueden utilizarse en reacciones químicas para producir compuestos derivados de ácidos grasos en los aceites, tales como ésteres y sales de EPA u otro ácido graso.

Una composición de la divulgación puede incluir uno o más excipientes. Tal como se utiliza en esta memoria, "excipiente" se refiere a un componente, o mezcla de componentes, que se utiliza en una composición de la presente divulgación para dar características deseables a la composición, incluyendo alimentos, así como composiciones farmacéuticas, cosméticas e industriales. Un excipiente de la presente divulgación se puede describir como un excipiente "farmacéuticamente aceptable" cuando se añade a una composición farmacéutica, lo que significa que el excipiente es un compuesto, material, composición, sal y/o forma de dosificación que está, dentro del alcance del sano juicio médico, adecuado para el contacto con tejidos de seres humanos y animales no humanos sin una toxicidad, irritación, respuesta alérgica u otras complicaciones problemáticas excesivas durante la duración deseada del contacto acorde con una relación beneficio/riesgo razonable. En algunas realizaciones, la expresión "farmacéuticamente aceptable" significa aprobado por una agencia reguladora del Gobierno Federal o Estatal o enumerado en la Farmacopea de EE.UU. u otra farmacopea internacional generalmente reconocida para uso en animales, y más particularmente en seres humanos. Pueden utilizarse diversos excipientes. En algunas realizaciones, el excipiente puede ser, pero no se limita a un agente alcalino, un estabilizador, un antioxidante, un agente de adhesión, un agente de separación, un agente de recubrimiento, un componente de la fase exterior, un componente de liberación controlada, un disolvente, un tensioactivo, un humectante, un agente tampón, una carga, un emoliente o combinaciones de los mismos. Excipientes además de los discutidos en esta memoria pueden incluir excipientes enumerados en, aunque no limitados a Remington: The Science and Practice of Pharmacy, 2 la ed. (2005). La inclusión de un excipiente en una clasificación particular en esta memoria (p. ej., "disolvente") pretende ilustrar más que limitar el papel del excipiente. Un excipiente particular puede caer dentro de múltiples clasificaciones.

Composiciones de la divulgación incluyen, pero no se limitan a productos alimenticios, composiciones farmacéuticas, cosméticos y composiciones industriales.

En algunas realizaciones, la composición es un producto alimenticio. Un producto alimenticio es cualquier alimento para el consumo humano o animal no humano, e incluye tanto composiciones sólidas como líquidas. Un producto alimenticio puede ser un aditivo para alimentos para animales o seres humanos. Alimentos incluyen, pero no se limitan a alimentos comunes; productos líquidos, incluidas leches, bebidas, bebidas terapéuticas y bebidas nutritivas; alimentos funcionales; complementos; nutracéuticos; fórmulas para lactantes, incluidas fórmulas para lactantes prematuros; alimentos para mujeres embarazadas o lactantes; alimentos para adultos; alimentos geriátricos; y alimentos para animales.

En algunas realizaciones, un microorganismo, una biomasa o un aceite microbiano de la divulgación se puede utilizar directamente como o incluido como un aditivo dentro de uno o más de: un aceite, manteca, producto para untar, otro ingrediente graso, bebida, salsa, alimentos basados en productos lácteos o basados en soja (tales como leche, yogur, queso y helado), un producto horneado, un producto nutricional, p. ej., como un complemento nutricional (en forma de cápsula o tableta), un complemento vitamínico, un complemento dietético, una bebida en polvo y un producto alimenticio en polvo acabado o semi-acabado. En algunas realizaciones, el complemento nutricional tiene la forma de una cápsula vegetariana que no está formada a partir de ni contiene componente alguno de una fuente animal.

Una lista parcial de composiciones de alimentos que pueden incluir un aceite microbiano de la divulgación incluye, pero no se limita a productos basados en soja (leches, helados, yogures, bebidas, natas, productos para untar, blanqueadores); sopas y mezclas para sopas; masas, rebozados y alimentos horneados, incluyendo, por ejemplo, productos de panadería fina, cereales para el desayuno, tortas, tartas de queso, pasteles, magdalenas, galletas, barras, panes, panecillos, bizcochos, magdalenas, masas, escones, picatostes, galletas saladas, productos dulces, pastelillos, pasteles, barras de granola/aperitivo y masas para tostar; caramelos; confitería dura; chocolate y otros productos de confitería; goma de mascar; productos alimenticios líquidos, por ejemplo leches, bebidas energéticas, preparados para lactantes, bebidas carbonatadas, tés, comidas líquidas, zumos de frutas, bebidas a base de frutas, bebidas a base de vegetales; jarabes multivitamínicos, sustitutos de comidas, alimentos medicinales y jarabes; mezclas de bebidas en polvo; pasta; productos de pescado procesados; productos cárnicos procesados; productos avícolas procesados; salsas espesas y salsas; condimentos (salsa de tomate, mayonesa, etc.); productos para untar a base de aceite vegetal; productos lácteos; yogur; mantequillas; productos lácteos congelados; helados; postres helados; yogures helados; productos alimenticios semisólidos, tales como alimentos para bebés; pudines y postres de gelatina; queso procesado y sin procesar; mezclas para panqueques; barritas alimenticias, incluyendo barritas energéticas; mezclas para gofres; aderezos para ensaladas; mezclas de sustitutos al huevo; nueces y productos para untar a base de nueces; aperitivos salados, tales como patatas fritas y otras patatas fritas al estilo inglés o patatas fritas, chips de maíz, chips de tortilla, aperitivos extrudidos, palomitas de maíz, pretzels, patatas a la francesa y nueces; y aperitivos especiales, tales como salsas, aperitivos de frutos secos, aperitivos de carne, chicharrones, barras de alimentos saludables y pasteles de arroz/maíz.

En algunas realizaciones, un aceite microbiano de la divulgación se puede utilizar para complementar la fórmula infantil. La fórmula infantil se puede complementar con un aceite microbiano de la invención solo o en combinación con un aceite refinado físicamente derivado de un microorganismo productor de ácido araquidónico (ARA). Un microorganismo productor de ARA, por ejemplo, es Mortierella alpina o Mortierella sect. schmuckeri. Alternativamente, las fórmulas infantiles se pueden complementar con un aceite microbiano de la invención en combinación con un aceite rico en ARA, incluyendo ARASCO® (Martek Biosciences, Columbia, MD).

En algunas realizaciones, la composición es un pienso para animales. Un "animal" incluye organismos no humanos que pertenecen al reino Animalia e incluye, sin limitación, animales acuáticos y animales terrestres. La expresión "pienso para animales" o "alimento para animales" se refiere a cualquier alimento destinado a animales no humanos, ya sea para peces; peces comerciales; peces ornamentales; larvas de peces; bivalvos; moluscos; crustáceos; mariscos; camarón; camarones larvales; artemia; rotíferos; artemia liofilizada; filtradores; anfibios; reptiles; mamíferos; animales domésticos; animales de granja; animales de zoológicos; animales para deportes; cría de ganado; animales de carreras; animales de exhibición; animales reliquia; animales raros o en peligro de extinción; animales de compañía; animales mascotas, tales como perros, gatos, cobayas, conejos, ratas, ratones o caballos; primates, tales como monos (p. ej., cebús, rhesus, verde africano, patas, cynomolgus y cercopithecus), simios, orangutanes, babuinos, gibones y chimpancés; cánidos, tales como perros y lobos; félidos, tales como gatos, leones y tigres; équidos, tales como caballos, burros y cebras; animales comestibles, tales como vacas, ganado, cerdos y ovejas; ungulados, tales como ciervos y jirafas; o roedores, tales como ratones, ratas, hámsteres y cobayas; etcétera. Un pienso para animales incluye, pero no se limita a un pienso para acuicultura, un pienso para animales domésticos que incluye pienso para mascotas, un pienso para animales de zoológicos, un pienso para animales de trabajo, un pienso para ganado y combinaciones de los mismos.

En algunas realizaciones, la composición es un pienso o complemento de pienso para cualquier animal cuya carne o productos son consumidos por los seres humanos, tales como cualquier animal del que se deriva carne, huevos o leche para el consumo humano. Cuando se alimenta a este tipo de animales, se pueden incorporar nutrientes tales como LC-PUFAs a la carne, la leche, los huevos u otros productos de dichos animales para aumentar su contenido de estos nutrientes.

En algunas realizaciones, la composición es un material secado por pulverización que puede ser desmenuzado para formar partículas de un tamaño adecuado para el consumo por el zooplancton, artemia, rotíferos y filtradores. En algunas realizaciones, el zooplancton, artemia o rotíferos alimentados por la composición se alimentan a su vez a larvas de peces, peces, mariscos, bivalvos o crustáceos.

En algunas realizaciones, la composición es una composición farmacéutica. Composiciones farmacéuticas adecuadas incluyen, pero no se limitan a una composición antiinflamatoria, un fármaco para el tratamiento de la enfermedad coronaria, un fármaco para el tratamiento de la arteriosclerosis, un agente quimioterapéutico, un excipiente activo, un fármaco para la osteoporosis, un antidepresivo, un anticonvulsivo, un fármaco anti-Helicobacter pylori, un fármaco para el tratamiento de enfermedades neurodegenerativas, un fármaco para el tratamiento de la enfermedad hepática degenerativa, un antibiótico, una composición para reducir el colesterol y una composición para reducir el triacilglicerol. En algunas realizaciones, la composición es un alimento médico. Un alimento médico incluye un alimento que está en una composición para ser consumido o administrado externamente bajo la supervisión de un médico y que está destinado a la gestión dietética específica de una condición, para la cual se establecen por evaluación médica requisitos nutricionales distintivos, basados en principios científicos reconocidos.

En algunas realizaciones, el aceite microbiano se puede formular en una forma de dosificación. Formas de dosificación pueden incluir, pero no se limitan a comprimidos, cápsulas, sellos, gránulos, píldoras, polvos y gránulos, y formas de dosificación parenteral, que incluyen, pero no se limitan a soluciones, suspensiones, emulsiones y polvos secos que comprenden una cantidad efectiva del aceite microbiano. También se sabe en la técnica que formulaciones de este tipo también pueden contener diluyentes, cargas, desintegrantes, aglutinantes, lubricantes, tensioactivos, vehículos hidrofóbicos, vehículos hidrosolubles, emulsionantes, tampones, humectantes, hidratantes, solubilizantes, conservantes y similares farmacéuticamente aceptables. Formas de administración pueden incluir, pero no se limitan a comprimidos, grageas, cápsulas, comprimidos oblongos y píldoras, que contienen el aceite microbiano y uno o más soportes farmacéuticamente aceptables adecuados.

Para la administración oral, el aceite microbiano se puede combinar con soportes farmacéuticamente aceptables bien conocidos en la técnica. Soportes de este tipo permiten formular los aceites microbianos de la invención como comprimidos, píldoras, grageas, cápsulas, líquidos, geles, jarabes, suspensiones densas, suspensiones y similares, para ingestión oral por un sujeto a tratar. En algunas realizaciones, la forma de dosificación es un comprimido, píldora o comprimido oblongo. Preparaciones farmacéuticas para uso oral se pueden obtener mediante la adición de un excipiente sólido, opcionalmente moliendo la mezcla resultante y procesando la mezcla de gránulos, después de añadir auxiliares adecuados, si se desea, para obtener núcleos de comprimidos o grageas. Excipientes adecuados incluyen, pero no se limitan a cargas tales como azúcares, que incluyen, pero no se limitan a lactosa, sacarosa, manitol y sorbitol; preparaciones de celulosa tales como, pero no limitadas a almidón de maíz, almidón de trigo, almidón de arroz, fécula de patata, gelatina, goma de tragacanto, metilcelulosa, hidroxipropilmetilcelulosa, carboximetilcelulosa de sodio y polivinilpirrolidona (PVP). Si se desea, se pueden añadir agentes desintegrantes, tales como, pero no limitados a polivinilpirrolidona reticulada, agar o ácido algínico o una sal de los mismos, tal como alginato de sodio. Preparaciones farmacéuticas que pueden utilizarse por vía oral incluyen, pero no se limitan a cápsulas duras hechas de gelatina, así como cápsulas blandas selladas hechas de gelatina y un plastificante, tal como glicerol o sorbitol. En algunas realizaciones, la forma de dosificación es una forma de dosificación vegetariana, en la que la forma de dosificación no está formada por ni contiene componente alguno de una fuente animal. En algunas realizaciones, la forma de dosificación vegetariana es una cápsula vegetariana.

En algunas realizaciones, la composición es un cosmético. Cosméticos incluyen, pero no se limitan a emulsiones, cremas, lociones, mascarillas, jabones, champús, limpiadores, cremas faciales, acondicionadores, maquillajes, agentes de baño y líquidos de dispersión. Los agentes cosméticos pueden ser medicinales o no medicinales.

En algunas realizaciones, la composición es una composición industrial. En algunas realizaciones, la composición es un material de partida para una o más fabricaciones. Una fabricación incluye, pero no se limita a un polímero; un material fotográfico fotosensible; un detergente un aceite industrial; o un detergente industrial. Por ejemplo, la Patente de EE.UU. N° 7.259.006 describe el uso de grasas y aceites que contienen DHA para la producción de ácido behénico y la producción de materiales fotosensibles utilizando ácido behénico.

Métodos de Utilizar las Composiciones

En algunas realizaciones, las composiciones se pueden utilizar en el tratamiento de una afección en seres humanos o animales no humanos. En algunas realizaciones, las composiciones se pueden utilizar para la nutrición en seres humanos o animales no humanos.

Los términos "tratar" y "tratamiento" se refieren tanto al tratamiento terapéutico como a medidas profilácticas o preventivas, en donde el objetivo es prevenir o ralentizar (reducir) una afección fisiológica, enfermedad o trastorno no deseado, o para obtener resultados clínicos beneficiosos o deseados. Para los propósitos de esta invención, los resultados clínicos beneficiosos o deseados incluyen, pero no se limitan a, el alivio o la eliminación de los síntomas o signos asociados con una afección, enfermedad o trastorno; disminución del alcance de una afección, enfermedad o trastorno; estabilización de una afección, enfermedad o trastorno (es decir, en los casos en los que la afección, enfermedad o el trastorno no empeora); retraso en la aparición o progresión de la afección, enfermedad o trastorno; mejora de la afección, enfermedad o trastorno; remisión (ya sea parcial o total y ya sea detectable o indetectable) de la afección, enfermedad o trastorno; o mejora o mejora de una afección, enfermedad o trastorno. El tratamiento incluye provocar una respuesta clínicamente significativa sin efectos secundarios excesivos. El tratamiento también incluye prolongar la supervivencia en comparación con la supervivencia esperada si no se recibe tratamiento.

En algunas realizaciones, la composición se utiliza para tratar una afección, enfermedad o trastorno, tal como acné, inflamación aguda, maculopatía relacionada con la edad, alergia, Alzheimer, artritis, asma, aterosclerosis, enfermedad autoinmune, trastorno de lípidos en sangre, quistes de mama, caquexia, cáncer, reestenosis cardíaca, enfermedades cardiovasculares, inflamación crónica, enfermedad coronaria, fibrosis quística, trastorno degenerativo del hígado, diabetes, eccema, trastorno gastrointestinal, enfermedad cardíaca, niveles altos de triacilglicerol, hipertensión, hiperactividad, enfermedades inmunológicas, inhibición del crecimiento del tumor, afecciones inflamatorias, trastornos intestinales, disfunción renal, leucemia, depresión mayor, esclerosis múltiple, trastorno neurodegenerativo, osteoartritis, osteoporosis, trastorno peroxisomal, preeclampsia, parto prematuro, psoriasis, trastorno pulmonar, artritis reumatoide, riesgo de enfermedad cardíaca o trombosis.

En algunas realizaciones, la composición se utiliza para aumentar la duración de la gestación de un feto en el tercer trimestre.

En algunas realizaciones, la composición se utiliza para controlar la presión arterial.

En algunas realizaciones, la composición se utiliza para mejorar o mantener la función cognitiva.

En algunas realizaciones, la composición se utiliza para mejorar o mantener la memoria.

La composición o forma de dosificación puede administrarse en el cuerpo de un sujeto por cualquier vía compatible con la composición o forma de dosificación. Una sustancia se considera ser "administrada" si la sustancia es introducida por parte del sujeto en el cuerpo del sujeto, o si otra persona, una máquina o un dispositivo introducen la sustancia en el cuerpo del sujeto. "Administrar", por lo tanto, incluye, p. ej., auto-administración, administración por otros y administración indirecta. El término "continuo" o "consecutivo", tal como se utiliza en esta memoria en referencia a "administración", significa que la frecuencia de administración es al menos una vez al día. Sin embargo, téngase en cuenta que la frecuencia de administración puede ser mayor que una vez al día y aún ser "continua" o "consecutiva", p. ej., dos o incluso tres veces al día, siempre que no se excedan los niveles de dosificación tal como se especifican en esta memoria. Los medios y métodos de administración son conocidos en la técnica y un experto puede consultar diversas referencias farmacológicas como guía. Por ejemplo, se puede consultar "Modem Pharmaceutics", Banker & Rhodes, Informa Healthcare, EE.UU., 4a ed. (2002); y "Goodman & Gilman's The Pharmaceutical Basis of Therapeutics", McGraw-Hill Companies, Inc., Nueva York, 10a ed. (2001).

Por "sujeto", "individuo" o "paciente" se entiende cualquier sujeto, ya sea humano o no humano, para el cual se desea el diagnóstico, pronóstico, la terapia o la administración de la composición o forma de dosificación. Sujetos mamíferos incluyen, pero no se limitan a seres humanos; animales domésticos; animales de granja; animales de zoológicos; animales deportivos; animales de mascota, tales como perros, gatos, cobayas, conejos, ratas, ratones o caballos; primates tales como monos (p. ej., cebus, rhesus, verde africano, patas, cynomolgus y cercopithecus), simios, orangutanes, babuinos, gibones y chimpancés; cánidos, tales como perros y lobos; félidos, tales como gatos, leones y tigres; équidos, tales como caballos, burros y cebras; animales comestibles, tales como vacas, ganado, cerdos y ovejas; ungulados, tales como ciervos y jirafas; roedores, tales como ratones, ratas, hámsteres y cobayas; etcétera. El término sujeto también abarca animales modelo, p. ej., animales modelo de enfermedad. En algunas realizaciones, el término sujeto incluye animales valiosos, ya sea económicamente o de otro modo, p. ej., animales reproductores económicamente importantes, animales de carreras, animales de exhibición, animales reliquia, animales raros o en peligro de extinción, o animales de compañía. En determinadas realizaciones, el sujeto es un sujeto humano. En determinadas realizaciones, el sujeto es un sujeto no humano.

La composición se puede administrar como una "cantidad nutricional", "cantidad terapéuticamente eficaz", una "cantidad profilácticamente eficaz", una "dosis terapéutica" o una "dosis profiláctica". Una "cantidad nutricional" se refiere a una cantidad eficaz, en las dosis y durante los períodos de tiempo necesarios, para lograr un resultado nutricional deseado. Un resultado nutricional puede ser, p. ej., niveles aumentados de un componente de ácido graso deseable en un sujeto. Una "cantidad terapéuticamente eficaz" o "dosis terapéutica" se refiere a una cantidad eficaz, en las dosis y durante los períodos de tiempo necesarios, para lograr un resultado terapéutico deseado. Un resultado terapéutico puede ser, p. ej., la disminución de los síntomas, la supervivencia prolongada, la movilidad mejorada, y similares. Un resultado terapéutico no tiene por qué ser una "cura". Una "cantidad profilácticamente eficaz" o "dosis profiláctica" se refiere a una cantidad eficaz, en las dosis y durante los períodos de tiempo necesarios, para lograr el resultado profiláctico deseado. Típicamente, dado que se utiliza una dosis profiláctica en sujetos antes o en una etapa temprana de la enfermedad, una cantidad profilácticamente eficaz será menor que una cantidad terapéuticamente eficaz para el tratamiento de una etapa avanzada de la enfermedad.

Diversas cantidades de dosificación de la composición, forma de dosificación o composición farmacéutica se pueden administrar a un sujeto, basado en la cantidad de EPA u otro componente de ácido graso del microorganismo, la biomasa o aceite microbiano a ser administrado al sujeto. Las expresiones "dosis diaria", "nivel de dosis diaria" y "cantidad de dosis diaria" se refieren en esta memoria a la cantidad total de EPA u otro componente de ácido graso administrado por día (por período de 24 horas). Así, por ejemplo, la administración de EPA a un sujeto en una dosis diaria de 2 mg significa que el sujeto recibe un total de 2 mg de EPA diariamente, ya sea que el EPA se administre como una forma de dosificación única que comprende 2 mg de EPA, o alternativamente, cuatro formas de dosificación que comprenden 0,5 mg de EPA cada una (para un total de 2 mg de EPA). En algunas realizaciones, la cantidad diaria de EPA se administra en una única forma de dosificación o en dos formas de dosificación. Las formas de dosificación de la presente invención se pueden tomar en una sola aplicación o en múltiples aplicaciones. Por ejemplo, si se toman cuatro comprimidos al día, cada uno de los comprimidos contiene 0,5 mg de e Pa , entonces los cuatro comprimidos se pueden tomar una vez al día, o se pueden tomar 2 comprimidos dos veces al día, o se puede tomar 1 comprimido cada 6 horas. En algunas realizaciones, la dosis diaria es de aproximadamente 100 mg a aproximadamente 15 g de EPA. En algunas realizaciones, la dosis diaria es de aproximadamente 0,5 mg a aproximadamente 250 mg, aproximadamente 100 mg a aproximadamente 250 mg, aproximadamente 100 mg a aproximadamente 500 mg, aproximadamente 100 mg a aproximadamente 1 g, aproximadamente 1 g a aproximadamente 2,5 g, aproximadamente 1 g a aproximadamente 5 g, aproximadamente 1 g a aproximadamente 10 g, aproximadamente 1 g a aproximadamente 15 g, aproximadamente 5 g a aproximadamente 10 g, aproximadamente 5 g a aproximadamente 15 g, aproximadamente 10 g a aproximadamente 15 g, aproximadamente 100 mg a aproximadamente 10 g, aproximadamente 100 mg a aproximadamente 5 g o aproximadamente 100 mg a aproximadamente 2,5 g de EPA, DHA o una combinación de los mismos. En algunas realizaciones, la composición es una forma de dosificación que comprende aproximadamente 0,5 mg a aproximadamente 250 mg, 100 mg a aproximadamente 250 mg, aproximadamente 0,5 mg a aproximadamente 500 mg, aproximadamente 100 mg a aproximadamente 500 mg, aproximadamente 0,5 mg a aproximadamente 1 g o aproximadamente 100 mg a aproximadamente 1 g de EPA, DHA o una combinación de los mismos por forma de dosificación.

La administración de las composiciones o formas de dosificación de la presente divulgación se puede lograr utilizando diversos regímenes. Por ejemplo, en algunas realizaciones, la administración se produce diariamente en días consecutivos o, alternativamente, se produce cada dos días (dos veces al día). La administración puede ocurrir en uno o más días.

La administración de las composiciones y formas de dosificación se puede combinar con otros regímenes utilizados para el tratamiento de la afección. Por ejemplo, el método de la presente divulgación se puede combinar con regímenes dietéticos (p. ej., dietas bajas en hidratos de carbono, dietas ricas en proteínas, dietas ricas en fibra, etc.), regímenes de ejercicio, regímenes de pérdida de peso, regímenes para dejar de fumar o combinaciones de los mismos. El método de la presente divulgación también se puede utilizar en combinación con otros productos farmacéuticos en el tratamiento de la afección. Las composiciones o formas de dosificación de la presente divulgación se pueden administrar antes o después de otros regímenes o productos farmacéuticos.

Kits que Comprenden las Composiciones

La divulgación se refiere a kits o envases que contienen una o más unidades de una composición de la invención. Los kits o envases pueden incluir unidades de un producto alimenticio, composición farmacéutica, cosmética o composición industrial que comprende el microorganismo, la biomasa o el aceite microbiano de la invención, o combinaciones de los mismos. Los kits o envases también pueden incluir un aditivo que comprende el microorganismo, la biomasa o el aceite microbiano de la divulgación, o combinaciones de los mismos, para la preparación de una composición alimentaria, cosmética, farmacéutica o industrial.

En algunas realizaciones, el kit o envase contiene una o más unidades de una composición farmacéutica a administrar de acuerdo con los métodos de la presente invención. El kit o envase puede contener una unidad de dosificación o más de una unidad de dosificación (es decir, múltiples unidades de dosificación). Si están presentes múltiples unidades de dosificación en el kit o envase, las múltiples unidades de dosificación pueden disponerse opcionalmente para la administración secuencial.

Los kits de la presente divulgación pueden contener opcionalmente instrucciones asociadas con las unidades o formas de dosificación de los kits. Dichas instrucciones pueden estar en una forma prescrita por una agencia gubernamental que regula la fabricación, el uso o la venta de productos farmacéuticos, cuyo aviso refleja la aprobación de la agencia de la fabricación, el uso o la venta para la administración humana para tratar una afección o un trastorno. Las instrucciones pueden estar en cualquier forma que transmita información sobre el uso de las unidades o formas de dosificación en el kit de acuerdo con los métodos de la divulgación. Por ejemplo, las instrucciones pueden estar en forma de material impreso o en forma de un dispositivo de medios pre-grabados.

En el curso del examen de un paciente, un profesional médico puede determinar que la administración de uno de los métodos de la presente invención es apropiada para el paciente, o el médico puede determinar que el estado del paciente puede mejorarse mediante la administración de uno de los métodos de la presente divulgación. Antes de prescribir cualquier régimen, el médico puede aconsejar al paciente, por ejemplo, sobre los diversos riesgos y beneficios asociados con el régimen. Se puede proporcionar al paciente una divulgación completa de todos los riesgos conocidos y de los que se sospecha que estén asociados con el régimen. Este tipo de asesoramiento se puede proporcionar tanto verbalmente como por escrito. En algunas realizaciones, el médico puede proporcionar al paciente materiales bibliográficos sobre el régimen, tal como información sobre el producto, materiales educativos y similares.

La presente divulgación está dirigida a métodos de educar a los consumidores acerca de los métodos de tratamiento, comprendiendo el método la distribución de las formas de dosificación con la información al consumidor en un punto de venta. En algunas realizaciones, la distribución se producirá en un punto de venta que tenga un farmacéutico o proveedor de atención médica.

La expresión "información del consumidor" puede incluir, pero no se limita a, un texto en inglés, texto en otro idioma que no sea inglés, imagen visual, gráfico, grabación telefónica, sitio web y acceso a un representante de servicio al cliente en vivo. En algunas realizaciones, la información para el consumidor proporcionará instrucciones para el uso de las formas de dosificación de acuerdo con los métodos de la presente divulgación, uso apropiado para la edad, indicación, contraindicaciones, dosificación adecuada, advertencias, número de teléfono o dirección del sitio web. En algunas realizaciones, el método comprende, además, proporcionar información profesional a personas relevantes en condiciones de responder a las preguntas de los consumidores con respecto al uso de los regímenes descritos de acuerdo con los métodos de la presente divulgación. La expresión "información profesional" incluye, pero no se limita a información relativa al régimen cuando se administra de acuerdo con los métodos de la presente divulgación que está diseñado para permitir que un profesional médico responda las preguntas de los clientes. Un "profesional médico" incluye, por ejemplo, un médico, un asistente médico, una enfermera, un profesional de enfermería, un farmacéutico y un representante de servicio al cliente.

Habiendo descrito en general esta invención, una comprensión adicional puede obtenerse por referencia a los ejemplos proporcionados en esta memoria. Estos ejemplos son para propósitos de ilustración solamente y no pretenden ser limitantes.

Ejemplo 1

En este ejemplo, Schizochytrium sp. se cultivó en matraces de agitación Erlenmeyer de 250 ml que contenían 50 ml de medio de cultivo. Se preparó un inóculo en el mismo medio que consistía en 0,625 g de NaCl, 1,0 g de KCl, 5 g de MgSO47H2O, 0,1 g de (n H4)2SO4, 0,29 g de CaCl22H2O, 1,0 g de glutamato monosódico monohidrato, 1,0 g de extracto de levadura y 23,8 g de tampón HEPES disueltos en aproximadamente 900 ml de agua destilada. El medio se llevó a pH 7 utilizando NaOH. El volumen final del medio se llevó a 896 ml y el medio se esterilizó mediante autoclave. Después de esterilizar en autoclave, se añadieron al medio en condiciones estériles los siguientes componentes: 0,89 ml de 56,5 g/l de KH2PO4, 100 ml de 500 g/l de glucosa, 2 ml de solución madre de metales traza y 1 ml de solución madre de vitaminas. La solución madre de metales traza contenía lo siguiente: 90 g de ácido cítrico, 5,15 g de FeSO47H2O, 1,55 g de MnCl24H2O, 0,965 g de ZnSO4 7H2O, 0,02 g de CoCh 6H2O, 0,02 g de Na2MoO4 2H2O, 1,035 g de CuSO45H2O, 1,035 g de NiSO46H2O disueltos en un litro de agua destilada y se llevó a pH 2,5 con HCl. La solución madre de vitamina contenía lo siguiente: 0,16 g de vitamina B12, 9,75 g de tiamina y 3,33 g de pantotenato de calcio disueltos en un litro de agua destilada. Los matraces de agitación se inocularon con 1 ml de inóculo. Matraces por triplicado se colocaron en un conjunto de incubadora de CO2 para mantener una atmósfera de cualquiera de 5, 10 o 15% de CO2 ambiente. Otro conjunto de matraces por triplicado se colocaron en una incubadora a niveles de CO2 ambiente. Todos los conjuntos de matraces se agitaron a 200 rpm y todas las incubadoras se ajustaron a 22,5°C. Después de siete días de crecimiento, se recogió la biomasa de los matraces de agitación mediante centrifugación, se liofilizó la biomasa y se determinó el perfil de ácidos grasos de la biomasa utilizando procedimientos estándares de esterificación con metilo. Los niveles elevados de CO2 produjeron cambios significativos en la biomasa, el % de grasa y los perfiles de ácidos grasos. Destacó el cambio producido en los valores de % de EPA y % de DHA entre las condiciones de CO2 y las ambientales. Además, los cambios en estos ácidos grasos se hicieron más pronunciados a medida que aumentaba el nivel de CO2. Los resultados se presentan en la Tabla 4.

Tabla 4

Ejemplo 2

En este ejemplo, Schizochytrium sp. se cultivó en matraces de agitación Erlenmeyer de 250 ml que contenían 50 ml de medio de cultivo. Se preparó un inóculo en el mismo medio que consistía en 0,625 g de NaCl, 1,0 g de KCl, 5 g de MgSO47H2O, 0,1 g de (NH4) 2SO4, 0,29 g de CaCl22H2O, 1.0 g de glutamato monosódico monohidrato, 1,0 g de extracto de levadura y 23,8 g de tampón HEPES disueltos en aproximadamente 900 ml de agua destilada. El medio se llevó a pH 7 utilizando NaOH. El volumen final del medio se llevó a 896 ml y el medio se esterilizó mediante autoclave. Después de esterilizar en autoclave, se añadieron al medio en condiciones estériles los siguientes componentes: 0,89 ml de 56,5 g/l de KH2PO4, 100 ml de 500 g/l de glucosa, 2 ml de solución madre de metales traza y 1 ml de solución madre de vitaminas. La solución madre de metales traza contenía lo siguiente: 90 g de ácido cítrico, 5,15 g de FeSO4 7H2O, 1,55 g de MnCl2 4H2O, 0,965 g de ZnSO4 7H2O, 0,02 g de CoCl2 6H2O, 0,02 g de Na2MoO42H2O, 1,035 g de CuSO45H2O, 1,035 g de NiSO46H2O disueltos en un litro de agua destilada y pH a 2,5 con HCl. La solución madre de vitamina contenía lo siguiente: 0,16 g de vitamina B12, 9,75 g de tiamina y 3,33 g de pantotenato de calcio disueltos en un litro de agua destilada. Los matraces de agitación se inocularon con 1 ml de inóculo. Matraces duplicados se colocaron en un conjunto de incubadora de CO2 para mantener una atmósfera de cualquiera de 5, 10 o 15% de CO2 ambiente. Otro conjunto de matraces por duplicado se colocaron en una incubadora a niveles de CO2 ambiente. Todos los conjuntos de matraces se agitaron a 200 rpm y todas las incubadoras se ajustaron a 22,5°C. Después de siete días de crecimiento, se recogió la biomasa de los matraces de agitación mediante centrifugación, se liofilizó la biomasa y se determinó el perfil de ácidos grasos de la biomasa utilizando procedimientos estándares de esterificación con metilo. Los niveles elevados de CO2 produjeron cambios significativos en la biomasa, el % de grasa y los perfiles de ácidos grasos. Destacó el cambio producido en los valores de % de EPA y % de DHA entre las condiciones de CO2 y las ambientales. Además, los cambios en estos ácidos grasos se hicieron más pronunciados a medida que aumentaba el nivel de CO2. Los resultados se presentan en la Tabla 5 que figura a continuación.

Tabla 5

Ejemplo 3

En este ejemplo, Thrasutochytrium sp. se cultivó en matraces de agitación Erlenmeyer de 250 ml que contenían 50 ml de medio de cultivo. Se preparó un inóculo en el mismo medio que consistía en 42 g de Na2SO4, 0,625 g de NaCl, 1,0 g de KCl, 5 g de MgSO47h 2O, 0,1 g de (NH4)2SO4, 0,29 g de CaCl22H2O, 1,0 g de glutamato monosódico monohidrato, 1,0 g de extracto de levadura y 23,8 g de tampón HEPES disueltos en aproximadamente 900 ml de agua destilada. El medio se llevó a pH 7 utilizando NaOH. El volumen final del medio se llevó a 961 ml y el medio se esterilizó mediante autoclave. Después de esterilizar en autoclave, se añadieron al medio en condiciones estériles los siguientes componentes: 0,89 ml de 56,5 g/l de KH2PO4, 35 ml de 500 g/l de glicerol, 2 ml de solución madre de metales traza y 1 ml de solución madre de vitaminas. La solución madre de metales traza contenía lo siguiente: 9 g de ácido cítrico, 5,15 g de FeSO47H2O, 1,55 g de MnCb 4H2O, 0,965 g de ZnSO4 7H2O, 0,02 g de CoCb 6H2O, 0,02 g de Na2MoO4 2H2O, 1,035 g de CuSO45H2O, 1,035 g de NiSO46H2O disueltos en un litro de agua destilada y se llevó a pH 2,5 con HCl. La solución madre de vitamina contenía lo siguiente: 0,16 g de vitamina B12, 9,75 g de tiamina y 3,33 g de pantotenato de calcio disueltos en un litro de agua destilada. Los matraces de agitación se inocularon con 1 ml de inóculo. Matraces por triplicado se colocaron en un conjunto de incubadora de CO2 para mantener una atmósfera de 15% de CO2 ambiente. Otro conjunto de matraces por triplicado se colocaron en una incubadora a niveles de CO2 ambiente. Ambos conjuntos de matraces se agitaron a 200 rpm y ambas incubadoras se ajustaron a 22,5°C. Después de siete días de crecimiento, se recogió la biomasa de los matraces de agitación mediante centrifugación, se liofilizó la biomasa y se determinó el perfil de ácidos grasos de la biomasa utilizando procedimientos estándares de esterificación con metilo. Una atmósfera de 15% de CO2 en el aire produjo cambios sustanciales en el cultivo de Thraustochytrium. Con CO2 alto, la biomasa y el % de grasa fueron menores que en condiciones ambientales. El % de 16:0 y el % de DHA fueron menores y el % de EPA fue significativamente mayor que en condiciones ambientales. Los resultados se presentan en la Tabla 6 que figura a continuación.

Tabla 6

Ejemplo 4

En este ejemplo [NBx0614et10], Schizochytrium especie (ATCC PTA-10208) se cultivó en cuatro fermentadores New Brunswick Scientific BioFlo 6000 de 100 litros en un volumen objetivo final (receta) de 80 litros con un proceso semicontinuo de carbono (glucosa) y nitrógeno (hidróxido de amonio) en diversas condiciones de sobrepresión para evaluar la sensibilidad del cultivo al aumento de dióxido de carbono disuelto. Las fermentaciones se inocularon cada una con 8 litros de cultivo. Para la propagación del inóculo, se utilizó un fermentador New Brunswick Scientific BioFlo 5000 de 80 litros. El medio de inóculo consistió en 65 litros de medio preparado en seis grupos separados. El grupo 1 consistió en 585 g de MSG * 1H2O, 65 g de KCl, 325 g de MgSO4 * 7H2O, 24,05 g de (NH4)2SO4, 40,625 g de NaCl, 390 g de T154 (extracto de levadura) y 13 mL de Dow 1520US (antiespumante). El grupo 1 se esterilizó por lotes a 121 grados en el fermentador de inóculo a un volumen de aproximadamente 60 litros. El grupo 2 consistió en 18,85 g de CaCl2 * 2H2O. El grupo 3 consistió en 33,8 g de KH2PO4. Los grupos 2 y 3 se sometieron a autoclave cada uno en soluciones separadas durante aproximadamente 45-60 minutos y se añadieron al grupo 1 asépticamente después de la esterilización. El grupo 4 consistió en 201,5 mg de MnCl2 * 4H2O, 201.5 mg ZnSO4 * 7H2O, 2,6 mg de CoCl2 * 6H2O, 2,6 mg de Na2MoO4 * 2H2O, 134,6 mg de CuSO4 * 5H2O, 134,6 mg de NiSO4 * 6H2O, 669,4 mg de FeSO4 * 7H2O y 1,522 g de ácido cítrico. El grupo 4 se sometió a autoclave de la misma manera que los grupos 2 y 3. El grupo 5 consistió en 633,75 mg de tiamina- HCl, 10,4 mg de vitamina B12 y 216,5 mg de sal hemicálcica del ácido pantoténico. El grupo 5 se disolvió en agua RO y luego se esterilizó por filtración. El grupo 6 consistió en 3250 g de glucosa disueltos en un volumen de 3000 mL de agua RO. Después de que el fermentador de inóculo se enfrió a 22,5 grados Celsius, se añadieron los grupos 2, 3, 4, 5 y 6 al fermentador. Utilizando hidróxido de sodio y ácido sulfúrico, se ajustó el pH del fermentador a 7 y el oxígeno disuelto se extendió al 100% antes de la inoculación. El fermentador de inóculo se inoculó con 1300 mL de un cultivo de fermentación más pequeño (el cultivo de fermentación más pequeño se preparó y cultivó de la misma manera que el cultivo de inóculo de 65 litros) y se cultivó a 22,5 grados Celsius, pH 7, agitación de 180 rpm y 32,5 lpm de aire durante un período de 37 horas, momento en el cual se transfirieron 8 litros de caldo de inóculo a cada uno de los fermentadores de 100 litros. Cada uno de los fermentadores de 100 litros contenía 80 litros de medio de fermentación. El medio de fermentación se preparó de manera similar al fermentador de inóculo. Para cada uno de los fermentadores de 100 litros el medio de fermentación consistió en 6 grupos de medios por lotes. Para los recipientes NB5, NB6 y NB7, el grupo 1 contenía 704 g de Na2SO4, 50 g de NaCl, 80 g de KCl, 400 g de MgSO4*7H2O, 33,6 g de (NH4)2SO4, 80 g de extracto de levadura T154 y 8 mL de antiespumante Dow 1520-US. El grupo 1 se esterilizó con vapor a 122 grados Celsius durante 60 minutos en los termentadores de 100 litros a un volumen de aproximadamente 35 litros. El grupo 2 contenía 23,2 g de CaCl2*2H2O en un volumen de aproximadamente 300 mL. El grupo 3 contenía 141,2 g de KH2PO4 disueltos en agua RO. El grupo 4 contenía 248 mg de MnCl2*4H2O, 744 mg de ZnSO4*7H2O, 3,2 mg de Na2MoO4*2H2O, 165,6 mg de CuSO4*5H2O y 165,6 mg de NiSO4*6H2O, 824 mg de FeSO4*7H2O y 80 g de ácido cítrico, todos disueltos en agua RO. El grupo 5 contenía 780 mg de tiamina-HCl, 266,4 mg de sal hemicálcica del ácido pantoténico y 286,4 ug de biotina, todos disueltos y esterilizados por filtración en agua RO. El grupo 6 contenía 2400 g de glucosa en aproximadamente 3 litros de agua RO. Los grupos 2, 3, 4, 5 y 6 se combinaron y se añadieron al termentador después de que el termentador alcanzó una temperatura de funcionamiento de 22,5 grados Celsius. Para el recipiente NB8, todos los grupos eran los mismos que las otras tres condiciones, con la excepción del ácido cítrico. En n B8, el grupo 4 solo contenía ~ 3,75 g de ácido cítrico. El volumen de cada uno de los termentadores antes de la inoculación era de aproximadamente 52-53 litros. Cada uno de los termentadores se inoculó con 8 litros de caldo de la fermentación del inóculo arriba descrita. Se controló el pH de la termentación utilizando una solución de 7,3 litros de hidróxido de amonio 4N a un pH de 7 hasta el agotamiento del nitrógeno, momento en el que se utilizaron hidróxido de sodio 4N y ácido sultúrico 4N para el control del pH. El oxígeno disuelto se controló para mantener un objetivo del 20% durante la termentación utilizando agitación de 180 a 480 rpm y tlujo de aire de 40 LPM a 80 LPM. Cada uno de estos recipientes se controló a una presión de cabeza diterente (NB5 = 13789,5 Pa (2 psi), NB6 = 103421,4 Pa (15 psi) y NB7 = 137895,1 Pa (20 psi)) para evaluar la sensibilidad del organismo al aumento de dióxido de carbono disuelto. Durante toda la termentación, se alimentó una solución de 850 g/L de dextrosa (jarabe de maíz) al 95% para mantener una concentración de glucosa menor que 50 g/L. Después de 8 días, el peso de células secas y el título de omega-3 de cada uno de los termentadores de 80 litros tue similar con NB5 a 110,1 g/L de DCW y 44,37 g/L de omega-3; NB6 a 117,7 g/L de DCW y 45,78 g/L de omega-3; NB7 a 114,1 g/L de DCW y 48,43 g/L de omega-3; NB8 a 119,5 g/L de DCW y 43,55 g/L de omega-3. A medida que se incrementó la presión, el % de DHA/FAME disminuyó, el % de EPA/FAME aumentó y la proporción de DHA a EPA disminuyó. Al comparar el contenido tinal de ácidos grasos de 13789,5 Pa (2 psi) con 137895,1 Pa (20 psi), el % de DHA/FAME disminuyó del 50,48% al 41,26% y el % de EPA/FAME aumentó del 18,95% al 23,28%. Los resultados se presentan en la Tabla 7.

Tabla 7

Ejemplo 5

En este ejemplo [Nx0719et10], Schizochytrium especie (ATCC PTA-10208) se cultivó en cuatro termentadores New Brunswick Scientific BioFlo 310 de 14 litros en un volumen objetivo final (receta) de 10 litros con un proceso semi-continuo de carbono (glucosa) y nitrógeno (hidróxido de amonio). Tres de los cuatro termentadores se complementaron con dióxido de carbono en diferentes momentos durante la fermentación para evaluar la sensibilidad del cultivo al aumento de dióxido de carbono disuelto. NBS1, NBS2 y NBS3 se complementaron con dióxido de carbono comenzando a las 12, 24 y 48 horas, respectivamente. Las fermentaciones se inocularon cada una con 1 litro de cultivo cada una. Para la propagación del inóculo se utilizó un fermentador Virtis de 14 litros. El medio de inóculo consistió en 10 litros de medio preparado en cuatro grupos separados. El grupo 1 consistió en 90 g de MSG*1H2O, 10 g de KCl, 50 g de MgSO4*7H2O, 3,3 g de (NH4)2SO4, 6,25 g de NaCl, 60 g de T154 (extracto de levadura), 4,97 g de KH2PO4, 2,9 g de CaCl2*2H2O y 2 mL de Dow 1520US (antiespumante). El grupo 1 se sometió a autoclave a 121 grados durante 120 minutos a un volumen de aproximadamente 9,8 litros. El grupo 2 consistió en 500 g de glucosa disueltos en un volumen de 800 mL de agua RO. El grupo 3 consistió de 31 mg de MnCl2*4H2O, 31 mg de ZnSO4*7H2O, 0,4 mg de CoCl2*6H2O, 0,4 mg de Na2MoO4*2H2O, 20,7 mg de CuSO4*5H2O, 20,7 mg de NiSO4*6H2O, 103 mg de FeSO4*7H2O y 234,1 mg de ácido cítrico. Los grupos 2 y 3 se sometieron a autoclave cada uno durante 60 minutos. El grupo 4 consistió en 97,5 mg de tiamina-HCl, 1,6 mg de vitamina B12 y 33,3 mg de sal hemicálcica del ácido pantoténico. El grupo 4 se disolvió en agua RO y luego se esterilizó por filtración. Después de haber enfriado el fermentador a 22,5 grados Celsius, se añadieron los grupos 2, 3, 4 y 5 al fermentador. Utilizando hidróxido de sodio y ácido sulfúrico, se ajustó el pH del fermentador a 7 y el oxígeno disuelto se extendió al 100% antes de la inoculación. El fermentador de inóculo se inoculó con 150 mL de un cultivo de fermentación más pequeño (el cultivo de fermentación más pequeño se preparó y cultivó de la misma manera que el cultivo de inóculo de 10 litros) y se cultivó a 22,5 grados Celsius, pH 7, agitación de 433 rpm y 5 lpm de aire durante un período de 44,5 horas, momento en el que se transfirió 1 litro de caldo de inóculo a cada uno de los fermentadores de 14 litros. Cada uno de los fermentadores de 14 litros contenía 10 litros de medio de fermentación. El medio de fermentación se preparó de manera similar al fermentador de inóculo. Para cada uno de los fermentadores de 14 litros, el medio de fermentación consistió en 6 grupos de medios por lotes. Para todos los recipientes, el grupo 1 contenía 60 g de Na2SO4, 6,25 g de NaCl, 10 g de KCl, 50 g de MgSO4*7H2O, 0,43 g de (NH4)2SO4, 10 g de extracto de levadura T154 y 1 mL de antiespumante Dow 1520-US. El grupo 1 se sometió a autoclave a 121 grados Celsius durante 120 minutos en los fermentadores de 14 litros a un volumen de aproximadamente 6,5 litros. El grupo 2 contenía 2,9 g de CaCl2*2H2O en un volumen de aproximadamente 20 mL de agua RO. El grupo 3 contenía 17,61 g de KH2PO4 disueltos en 100 mL de agua RO. El grupo 4 contenía 31 mg de MnCl2*4H2O, 93 mg de ZnSO4*7H2O, 0,4 mg de Na2MoO4*2H2O, 20.7 mg de CuSO4*5H2O, 20,7 mg de NiSO4*6H2O, 103 mg de FeSO4*7H2O y 10 g de ácido cítrico, todos disueltos en 50 mL de agua RO. El grupo 5 contenía 97,5 mg de tiamina-HCl, 33,3 mg de sal hemicálcica del ácido pantoténico y 36,3 ug de biotina, todos disueltos y esterilizados por filtración en 10 mL de agua RO. El grupo 6 contenía 300 g de glucosa en aproximadamente 0,5 litros de agua RO. Los grupos 2, 3, 4, 5 y 6 se combinaron y se añadieron al fermentador después de que el fermentador alcanzó una temperatura de funcionamiento de 22,5 grados Celsius. Cada volumen de fermentador antes de la inoculación era de aproximadamente 6,5 litros. Cada uno de los fermentadores se inoculó con 1 litro de caldo de la fermentación del inóculo descrita anteriormente. Se controló el pH de la fermentación utilizando una solución de 0,85 litros de hidróxido de amonio 4N a un pH de 7 hasta el agotamiento del nitrógeno, momento en el cual se utilizaron hidróxido de sodio 4N y ácido sulfúrico 3N para el control del pH a un punto de ajuste de 7,5. El oxígeno disuelto se controló para mantener un objetivo del 20% durante la fermentación utilizando agitación de 357 a 833 rpm y flujo de aire de 7 LPM a 7 LPM. Los recipientes NBS1, NBS2, NBS3 se complementaron cada uno con dióxido de carbono durante diferentes períodos de tiempo para evaluar la sensibilidad del organismo al aumento del dióxido de carbono disuelto. A lo largo de la fermentación, se alimentó una solución de 850 g/L de dextrosa (jarabe de maíz) al 95% para mantener una concentración de glucosa menor que 50 g/L. Después de 8 días, el peso de células secas y el título de omega-3 de cada uno de los fermentadores de 10 litros variaron dependiendo de las condiciones de complementación de dióxido de carbono. A las 183 horas, NBS1 estaba en 109,1 g/L de DCW y 45,87 g/L de omega-3; NBS1 estaba en 108,9 g/L de DCW y 45,41 g/L de omega-3; NBS3 estaba en 116,4 g/L de DcW y 50,6 g/L de omega-3; NBS4 estaba en 95.7 g/L de DCW y 40,36 g/L de omega-3. Poco después de que se iniciara la complementación con dióxido de carbono, el % de DHA/FAMe disminuyó, el % de EPA/FAME aumentó y la relación de DHA a EPA disminuyó. Al comparar el contenido máximo de % de EPA/FAME de las condiciones complementadas con dióxido de carbono y las condiciones ambientales, existe un aumento del 65% en el contenido máximo de EPA en condiciones complementadas con CO2. Los resultados se presentan en la Tabla 8.

Tabla 8

dióxido de carbono complementado durante el intervalo resaltado

Ejemplo 6

En este ejemplo [Nx0106et10], Schizochytrium especie (ATCC PTA-10208) se cultivó en cuatro fermentadores New Brunswick Scientific BioFlo 310 de 14 litros en un volumen objetivo final (receta) de 10 litros con un proceso semicontinuo de carbono (glucosa) y nitrógeno (hidróxido de amonio). La temperatura se controló a lo largo del proceso de fermentación para mantener un objetivo de 21,0 °C, 22,5 °C, 24,0 °C y 25,5 °C para NBS1, NBS2, NBS3 y NBS4, respectivamente. Las fermentaciones se inocularon cada una con 1 litro de cultivo cada una. Para la propagación del inóculo, se utilizó un fermentador Virtis de 14 litros. El medio de inóculo consistió en 10 litros de medio preparado en cuatro grupos separados. El grupo 1 consistió en 90 g de MSG*1H2O, 10 g de KCl, 50 g de MgSO4*7H2O, 3,7 g de (NH4)2SO4, 6,25 g de NaCl, 60 g de T154 (extracto de levadura), 5,2 g de KH2PO4, 2,9 g de CaCl2*2H2O y 2 mL de Dow 1520US (antiespumante). El grupo 1 se sometió a autoclave a 121 grados durante 120 minutos a un volumen de aproximadamente 9,8 litros. El grupo 2 consistió en 500 g de glucosa disueltos en un volumen de 800 mL de agua RO. El grupo 3 consistió en 31 mg de MnCl2*4H2O, 31 mg de ZnSO4*7H2O, 0,4 mg de CoCl2*6H2O, 0,4 mg de Na2MoO4*2H2O, 20,7 mg de CuSO4*5H2O, 20,7 mg de NiSO4*6H2O, 103 mg de FeSO4*7H2O y 234,1 mg de ácido cítrico. Los grupos 2 y 3 se sometieron a autoclave durante 60 minutos. El grupo 4 consistió en 97,5 mg de tiamina-HCl, 1,6 mg de vitamina B12 y 33,3 mg de sal hemicálcica del ácido pantoténico. El grupo 4 se disolvió en agua RO y luego se esterilizó por filtración. Después de que el fermentador se enfrió a 22,5 grados Celsius, se añadieron los grupos 2, 3, 4 y 5 al fermentador. Utilizando hidróxido de sodio y ácido sulfúrico, se ajustó el pH del fermentador a 7 y el oxígeno disuelto se extendió al 100% antes de la inoculación. El fermentador de inóculo se inoculó con 200 mL de un cultivo de fermentación más pequeño (el cultivo de fermentación más pequeño se preparó y cultivó de la misma manera que el cultivo de inóculo de 10 litros) y se cultivó a 22.5 grados Celsius, pH 7, agitación de 433 rpm y 5 lpm de aire durante un período de 42 horas, momento en el cual se transfirió 1 litro de caldo de inóculo a cada uno de los fermentadores de 14 litros. Cada uno de los fermentadores de 14 litros contenía 10 litros de medio de fermentación. El medio de fermentación se preparó de manera similar al fermentador de inóculo. Para cada uno de los fermentadores de 14 litros, el medio de fermentación consistió en 4 grupos de medios por lotes. Para todos los recipientes, el grupo 1 contenía 88 g de Na2SO4, 6,25 g de NaCl, 10 g de KCl, 50 g de MgSO4*7H2O, 4,2 g de (NH4)2SO4, 2,9 g de CaCl2*2H2O, 17,65 g de KH2PO4, 10 g de extracto de levadura T154 y 1 mL de antiespumante Dow 1520-US. El grupo 1 se sometió a autoclave a 121 grados Celsius durante 120 minutos en los fermentadores de 14 litros a un volumen de aproximadamente 7,0 litros. El grupo 2 contenía 31 mg de MnCl2*4H2O, 93 mg de ZnSO4*7H2O, 0,4 mg de Na2MoO4*2H2O, 20,7 mg de CuSO4*5H2O, 20,7 mg de NiSO4*6H2O, 103 mg de FeSO4*7H2O y 468 mg de ácido cítrico disueltos en 50 mL de agua RO. El grupo 2 se sometió a autoclave durante 60 minutos. El grupo 3 contenía 97,5 mg de tiamina-HCl, 33,3 mg de sal hemicálcica del ácido pantoténico y 35,8 ug de biotina, todos disueltos y esterilizados por filtración en 10 mL de agua RO. El grupo 4 contenía 300 g de glucosa en aproximadamente 0,5 litros de agua RO y se esterilizó en autoclave durante 60 minutos. Los grupos 2, 3 y 4 se combinaron y se añadieron al fermentador después de que el fermentador alcanzara una temperatura de funcionamiento de 22,5 grados Celsius. Cada volumen de fermentador antes de la inoculación era de aproximadamente 6,5 litros. Cada uno de los fermentadores se inoculó con 1 litro de caldo de la fermentación del inóculo arriba descrita. El pH de la fermentación se controló a 7,0 a lo largo de la fermentación utilizando una solución de 0,85 litros de solución de hidróxido de amonio 4N hasta el agotamiento del nitrógeno, momento en el cual se utilizaron hidróxido de sodio 4N y ácido sulfúrico 3N para el control del pH en un punto de ajuste. El oxígeno disuelto se controló para mantener un objetivo del 20% hasta el agotamiento del nitrógeno. Después del agotamiento del nitrógeno, el oxígeno disuelto se controló para mantener un objetivo del 10% hasta el final de la fermentación utilizando agitación de 357 a 714 rpm y 8 LPM de flujo de aire. A lo largo de la fermentación, se suministró una solución de 850 g/L de dextrosa (jarabe de maíz) al 95% para mantener una concentración de glucosa inferior a 50 g/L. Después de 8 días, el peso de células secas o el título de omega-3 varió ligeramente para las diferentes temperaturas evaluadas; sin embargo, las temperaturas de fermentación más bajas dieron como resultado un % de EpA/FAME más alto. A las 184 horas, NBS1 estaba en 85,2 g/L de DCW y 29,9 g/L de omega-3; NBS2 estaba en 92,0 g/L de DCW y 35,0 g/L de omega-3; NBS3 estaba en 86,8 g/L de DCW y 31,7 g/L de omega-3; NBS4 estaba en 84,2 g/L de DCW y 29,4 g/L de omega-3.

Para NBS1, el % de EPA/FAME varió de 12,36% a 19,02% de principio a fin del proceso de fermentación, con un máximo de 21,57%. Para NBS2, el % de EPA/FAME osciló entre el 11,72% y el 18,11% desde el inicio hasta el final del proceso de fermentación con un máximo de 20,21%. NBS3, el % de EPA/FAME osciló entre 11,49% y 15,43% desde el inicio hasta el final del proceso de fermentación con un máximo de 18,09%. NBS4, el % de EPA/FAME osciló entre 11,65% y 13,65% desde el inicio hasta el final del proceso de fermentación con un máximo de 15,70%. Al comparar el % máximo de EPA/FAME, la temperatura de fermentación más baja resultó en un aumento del 37% en el contenido máximo de EPA sobre la temperatura de fermentación más alta evaluada. Los resultados se proporcionan en la Tabla 9 que figura a continuación.

Tabla 9

Ejemplo 7

En este ejemplo [Nx0614et10], Schizochytrium especie (ATCC PTA-10208) se cultivó en dos fermentadores New Brunswick Scientific BioFlo 310 de 14 litros en un volumen objetivo final (receta) de 10 litros con un proceso semicontinuo de carbono (glucosa) y nitrógeno (hidróxido de amonio). Un fermentador (NBS15) se roció con aire complementado con un 15% de dióxido de carbono desde el inicio hasta el final del proceso de fermentación y el otro fermentador (NBS17) se roció con aire solo para evaluar la sensibilidad del cultivo al aumento de dióxido de carbono disuelto. Las fermentaciones se inocularon cada una con 1 litro de cultivo cada una. Para la propagación del inóculo, se utilizó un termentador Virtis de 14 litros. El medio de inoculo consistió en 10 litros de medio preparado en cuatro grupos separados. El grupo 1 consistió en 90 g de MSG*1H2O, 10 g de KCl, 50 g de MgSO4*7H2O, 3,3 g de (NH4)2SO4, 6,25 g de NaCl, 60 g de T154 (extracto de levadura), 4,97 g de KH2PO4, 2,9 g de CaCl2*2H2O y 2 mL de Dow 1520US (antiespumante). El grupo 1 se sometió a autoclave a 121 grados durante 120 minutos a un volumen de aproximadamente 9,8 litros. El grupo 2 consistió en 500 g de glucosa disueltos en un volumen de 800 mL de agua RO. El grupo 3 consistió en 31 mg de MnCl2*4H2O, 31 mg de ZnSO4*7H2O, 0,4 mg de CoCl2*6H2O, 0,4 mg de Na2MoO4*2H2O, 20,7 mg de CuSO4*5H2O, 20,7 mg de NiSO4*6H2O, 103 mg de FeSO4*7H2O y 234,1 mg de ácido cítrico. Los grupos 2 y 3 se sometieron a autoclave durante 60 minutos. El grupo 4 consistió en 97,5 mg de tiamina-HCl, 1,6 mg de vitamina B12 y 33,3 mg de sal hemicálcica del ácido pantoténico. El grupo 4 se disolvió en agua RO y luego se esterilizó por filtración. Después de haber enfriado el fermentador a 22,5 grados Celsius, se añadieron los grupos 2, 3, 4 y 5 al fermentador. Utilizando hidróxido de sodio y ácido sulfúrico, se ajustó el pH del fermentador a 7 y el oxígeno disuelto se extendió al 100% antes de la inoculación. El fermentador de inóculo se inoculó con 200 mL de un cultivo de fermentación más pequeño (el cultivo de fermentación más pequeño se preparó y cultivó de la misma manera que el cultivo de inóculo de 10 litros) y se cultivó a 22.5 grados Celsius, pH 7, agitación de 433 rpm y 5 lpm de aire durante un período de 40 horas, momento en el cual se transfirió 1 litro de caldo de inóculo a cada uno de los fermentadores de 14 litros. Cada uno de los fermentadores de 14 litros contenía 10 litros de medio de fermentación. El medio de fermentación se preparó de manera similar al fermentador de inóculo. Para cada uno de los fermentadores de 14 litros, el medio de fermentación consistió en 6 grupos de medios por lotes. Para todos los recipientes, el grupo 1 contenía 88 g de Na2SO4, 6,25 g de NaCl, 10 g de KCl, 50 g de MgSO4*7H2O, 4,2 g de (NH4)2SO4, 10 g de extracto de levadura T154 y 1 mL de antiespumante Dow 1520-US. El grupo 1 se sometió a autoclave a 121 grados Celsius durante 120 minutos en los fermentadores de 14 litros a un volumen de aproximadamente 6,5 litros. El grupo 2 contenía 2,9 g de CaCl2*2H2O en un volumen de aproximadamente 20 mL de agua RO. El grupo 3 contenía 17,65 g de KH2PO4 disueltos en 100 mL de agua RO. El grupo 4 contenía 31 mg de MnCl2*4H2O, 93 mg de ZnSO4*7H2O, 0,4 mg de Na2MoO4*2H2O, 20,7 mg de CuSO4*5H2O, 20,7 mg de NiSO4*6H2O, 103 mg de FeSO4*7H2O y 468 mg de ácido cítrico disuelto en 50 mL de agua RO. Los grupos 2, 3 y 4 se sometieron a autoclave durante 60 minutos. El grupo 5 contenía 97,5 mg de tiamina-HCl, 33,3 mg de sal hemicálcica del ácido pantoténico y 36,3 ug de biotina, todos disueltos y esterilizados por filtración en 10 mL de agua RO. El grupo 6 contenía 300 g de glucosa en aproximadamente 0,5 litros de agua RO y se esterilizó en autoclave durante 60 minutos. Los grupos 2, 3, 4, 5 y 6 se combinaron y se añadieron al fermentador después de que el fermentador alcanzó una temperatura de funcionamiento de 22,5 grados Celsius. Cada volumen de fermentador antes de la inoculación era de aproximadamente 6,5 litros. Cada uno de los fermentadores se inoculó con 1 litro de caldo de la fermentación del inóculo arriba descrita. El pH de la fermentación se controló a 7,0 a lo largo de la fermentación utilizando una solución de 0,85 litros de solución de hidróxido de amonio 4N hasta el agotamiento del nitrógeno, momento en el cual se utilizaron hidróxido de sodio 4N y ácido sulfúrico 3N para el control del pH en un punto de ajuste. El oxígeno disuelto se controló para mantener un objetivo del 20% hasta el agotamiento del nitrógeno. Después del agotamiento del nitrógeno, se controló el oxígeno disuelto para mantener un objetivo del 10% hasta el final de la fermentación utilizando agitación de 357 a 833 rpm y 8 LPM de flujo de aire. A lo largo de la fermentación, se alimentó una solución de 850 g/L de dextrosa (jarabe de maíz) al 95% para mantener una concentración de glucosa menor que 50 g/L. Después de 8 días, el peso de células secas y el título de omega-3 de cada uno de los fermentadores de 10 litros variaron dependiendo de las condiciones de complementación de dióxido de carbono. A las 188 horas, NBS15 estaba en 54,5 g/L de DCW y 13,7 g/L de omega-3; NBS17 estaba en 96,1 g/L de DCW y 37,5 g/L de omega-3. El % de EPA/FAME fue más alto en NBS15 (condición complementada con CO2 durante todo el proceso) que en NBS17 (sin complementación con CO2). Para NBS15, el % de e Pa /FAME osciló entre el 25,50% y el 35,48% desde el inicio hasta el final del proceso de fermentación con un máximo de 38,34%. Para NBS 17, el % de EPA/FAME osciló entre el 12,31% y el 19,80% desde el inicio hasta el final del proceso de fermentación con un máximo de 22,29%. Al comparar el contenido máximo de % de EPA/FAME de las condiciones complementadas con dióxido de carbono y las condiciones ambientales, hay un aumento del 73% en el contenido máximo de EPA en condiciones complementadas con CO2.

El % de DHA/FAME fue menor para las condiciones complementadas con CO2 que para las condiciones ambientales durante todo el proceso de fermentación. Los resultados se proporcionan en la Tabla 10 que figura a continuación.

Tabla 10

Ejemplo 8

En este ejemplo [K019], Schizochytrium especie (ATCC PTA-10208) se cultivó en un termentador agitado de 157.000 litros en un volumen objetivo final (receta) de 100.000 kg con un proceso semi-continuo de carbono (glucosa) y nitrógeno (hidróxido de amonio). La fermentación se inoculó con 4500 kg de cultivo. Para la propagación del inóculo se utilizó un termentador de siembra agitado de 7500 litros. El medio de inóculo consistió en 4500 kg de medio preparado en cuatro grupos separados. El grupo 1 consistió en 40,5 kg de MSG*1H2O, 4,5 kg de KCl, 22,5 kg de MgSO4*7H2O, 1,7 kg de (NH4)2SO4, 2,81 kg de NaCl, 27 kg de T154 (extracto de levadura), 2 kg de KH2PO4, 985 g de CaCl2 y 0,9 kg de Dow 1520US (antiespumante) disueltos en agua de proceso con un peso total de 2300 kg. El grupo 2 consistió en 247,5 kg de glucosa.1H2O disueltos en agua de proceso con un peso total de 1500 kg. El grupo 1 se esterilizó en el termentador de siembra y el grupo 2 se esterilizó en un recipiente separado, con vapor en el lugar a 122-123 grados Celsius durante 30 minutos. El grupo 3 consistió en 14 g de MnCl2*4H2O, 14 g de ZnSO4*7H2O, 180 mg de CoCl2*6H2O, 180 mg de Na2MoO4*2H2O, 9,3 g de CuSO4*5H2O, 9,3 g de NiSO4*6H2O, 46,4 g de FeSO4*7H2O y 105,3 g de ácido cítrico disuelto en 5 L de agua destilada. El grupo 3 se sometió a autoclave a 121 grados Celsius durante 60 minutos. El grupo 4 consistió en 43,9 g de tiamina-HCl, 720 mg de vitamina B12 y 15 g de sales hemicálcicas de ácido pantoténico disueltas en 5 L de agua destilada y luego se esterilizó por filtración. Después de haber enfriado el termentador de semillas a 22,5 grados Celsius, se añadieron los grupos 2, 3, 4 al termentador. Utilizando hidróxido de sodio y ácido sulfúrico, se ajustó el pH del termentador a 7 y el oxígeno disuelto se extendió al 100% antes de la inoculación. El termentador de siembra se inoculó con 12 L de un cultivo de fermentación más pequeño (el cultivo de fermentación más pequeño se preparó y cultivó de la misma manera que el cultivo de siembra) y se cultivó a 22,5 grados Celsius, pH 7, agitación de 90 rpm y 130-170 Nm3/h de aire durante un período de 4-5 días para obtener un peso de células secas de aproximadamente 15 g/L. El medio de fermentación se preparó de manera similar al termentador de inóculo. El medio de fermentación consistía en 5 grupos. El grupo 1 contenía 177 kg de KH2PO4, 880 kg de Na2SO4, 500 kg de MgSO4*7H2O, 42 kg de (NH4)2SO4, 100 kg de extracto de levadura T154 y 10 kg de antiespumante Dow 1520-US en una solución de 9.000 kg. El grupo 2 contenía 21,9 kg de CaCl2, 62,5 kg de NaCl, 100 kg de KCl, en una solución de 9.000 kg. Los grupos 1 y 2 se bombearon al termentador a través de un intercambiador de calor, seguido de agua para obtener 67.000 kg de peso en el termentador. El grupo 3 contenía 310 g de MnCl2*4H2O, 930 g de ZnSO4*7H2O, 4 g de Na2MoO4*2H2O, 207 g de CuSO4*5H2O, 207 g de NiSO4*6H2O, 1,03 kg de FeSO4*7H2O y 4,68 kg de ácido cítrico disuelto en 1500 kg de agua de proceso. El grupo 4 contenía 4300 kg de jarabe de maíz (DE-95, al 70,5%). El grupo 3 y el grupo 4 se esterilizaron en diferentes recipientes, con vapor en el lugar a 122-123 grados Celsius durante 30 minutos. El grupo 5 contenía 975 g de tiamina-HCl, 333 g de sal hemicálcica del ácido pantoténico y 358 mg de biotina, disueltos y esterilizados por filtración en 5 L de agua destilada. Los grupos 3, 4 y 5 se añadieron al termentador después de haber entriado el termentador a 22,5 grados Celsius. El peso en el volumen del termentador antes de la inoculación tue de aproximadamente 73.500 kg. Después de establecer la condición de fermentación inicial (temperatura: 22,5 °C, presión: 0,34 bares, flujo de aire: 3000 Nm3/h, agitación, 40 rpm), el pH de la fermentación se ajustó a 7 y el oxígeno disuelto se extendió al 100%. El peso después de la inoculación tue de aproximadamente 78.000 kg. Al principio, el pH se controló a 7 utilizando amoniaco anhidro hasta que se añadieron 550 kg de amoniaco, y luego se utilizó una solución de hidróxido de sodio al 30% para el control del pH a un punto de ajuste de 7,5. El oxígeno disuelto se controló para mantener un objetivo del 20% durante la alimentación de amoníaco y del 10% después utilizando agitación de 40 a 100 rpm y flujo de aire de 2000 a 8000 Nm3/h. A lo largo de la fermentación se alimentó con una solución de jarabe de maíz DE-95 al 65% para mantener una concentración de glucosa de alrededor de 35 g/L. En otro ejemplo [K020], se hicieron tres cambios con respecto al ejemplo K019: 1) la presión se redujo a 0,15 bares, 2) el peso después de la inoculación se redujo a 68.000 kg, 3) el flujo de aire se incrementó a por encima de 5000 Nm3/h a 60 h después de la inoculación y se mantuvo alto a lo largo del proceso independientemente de la concentración de oxígeno disuelto. Los tres cambios anteriores redujeron la concentración de dióxido de carbono disuelto en el caldo. Los resultados demostraron que con la reducción de CO2, el % de DHA/FAME se incrementó de 38,38% a 43,8% y el % de EPA/FAME se redujo de 24,42% a 20,68%. La relación DHA:EPA se incrementó de 1,57 a 2,12. Los resultados se presentan en la Tabla 11 que figura a continuación.

Tabla 11

Ejemplo 9

En la siguiente tabla, el CO2 máximo disuelto se calcula para varios de los ejemplos utilizando la constante de Henry. La primera condición, "10 L de (NBS4 0719et10) a 0 PSI de contrapresión y 45,5 mmol/L/hora de CER" es el CO2 disuelto calculado para NBS4 en la Tabla 8 a una tasa de desprendimiento de dióxido de carbono de 45,5 mmol/L/hora, un volumen de fermentación de 10 litros, una tasa de aireación de 0,8 vvm y una contrapresión de 0 Pa (0 psi). La segunda condición, "10 L de (NBS20719et10) a 0 Pa (0 psi) de contrapresión con 6% de CO2 en el gas de entrada y 50 mmol/L/hora de CER" es el CO2 disuelto calculado para NBS2 en la Tabla 8 en una tasa de desprendimiento de dióxido de carbono de 50 mmol/L/hora, un volumen de fermentación de 10 litros, una tasa de aireación de 0.8 vvm, a una contrapresión de 0 Pa (0 psi) y con CO2 complementado en la corriente de entrada al 6% del gas total medido por espectrometría de masas usando un espectrómetro de masas Thermo Prima dB. La tercera condición, "80 litros de (NB5 0614et10) a 13789,5 Pa (2 psi) de contrapresión y 55 mmol/L/hora de CER" es el CO2 disuelto calculado para NB5 en la Tabla 7 a una tasa de desprendimiento de dióxido de carbono de 55 mmol/L/hora, un volumen de fermentación de 80 litros, una tasa de aireación de 1,0 vvm y una contrapresión de 13789,5 Pa (2 psi). La cuarta condición, "80 litros de (NB60614et10) a 103421,4 Pa (15 psi) de contrapresión y 50 mmol/L/hora de CER" es el CO2 disuelto calculado para NB6 en la Tabla 7 a una tasa de desprendimiento de dióxido de carbono de 50 mmol/L/hora, un volumen de fermentación de 80 litros, una tasa de aireación de 1,0 vvm y una contrapresión de 103421,4 Pa (15 psi). La quinta condición, "80 litros de (NB7 y NB80614et10) a 137895,1 Pa (20 psi) de contrapresión y 50 mmol/L/hora de CER" es el CO2 disuelto calculado para NB7 y NB8 en la Tabla 7 con una tasa de desprendimiento de dióxido de carbono de 50 mmol/L/hora, un volumen de fermentación de 80 litros, una tasa de aireación de 1,0 vvm y 137895,1 Pa (20 psi) de contrapresión. Todos los valores de CER se calcularon utilizando datos de CO2 de gases de escape recopilados con un espectrómetro de masas Thermo Prima dB. Los resultados de los cálculos se proporcionan en las Tablas 13 y 14 que figuran a continuación.

Tabla 13

(continuación)

Tabla 14

Ejemplo 10

Se realizaron experimentos para determinar el efecto de los gradientes de vitamina en el rendimiento (peso de células secas de biomasa (DW),% de DHA,% de grasa y % de EPA) utilizando N° de acceso en la ATCC PTA-9695 en Medio de Matraz de Agitación de Thraustochytrium (TSFM) bajo el nivel de CO2 ambiente.

Materiales y Métodos: Cuatro vitaminas (tiamina.HCl, B12, biotina y pantotenato de Ca) se utilizaron en medio TSFM con 0,25 g/L de tastona y 0,625 g/L de NaCl (véase la Tabla 16). Se añadieron MSG y KH2PO4 adicionales al medio para mantener su contenido total de nitrógeno y fósforo. Las concentraciones totales de vitamina en el medio fueron 0, 0.5x, 1x, 5x, 10x, 20x o 30x la cantidad estándar, dependiendo de las vitaminas estudiadas (véase la Tabla 17). El estudio de gradiente se realizó con cada una de las vitaminas por separado. Sin embargo, en el caso de biotina y pantotenato de Ca, también se incorporaron en el medio cantidades estándares de tiamina.HCl y B12, ya que las concentraciones de los dos últimos eran muy bajas en el TSFM regular. También se incluyeron tres controles de TSFM en el experimento para comparación. Estos controles fueron TSFM estándar con 2 g/L de tastona (véase la Tabla 15) y 1x tiamina.HCl y 1x B12 (C1); TSFM exento de tastona sin vitaminas (A); y TSFM exento de tastona con 1x tiamina.HCl y 1x B12 (B). Todos los controles contenían 0,625 g/L de NaCl. Se utilizó un cultivo de tres días de PTA-9695 para inocular matraces de agitación duplicados de 250 ml a 0,1 g de peso seco/L. Todos los matraces (de fondo plano, con un total de 50 ml de medio) se incubaron en condiciones aerobias a 22,5 /- 1 °C en un agitador rotatorio (200 RPM). Todos los cultivos se recolectaron después de 7 días y se realizó el análisis FAME en las muestras de biomasa liofilizadas finales.

Tabla 15

Medio de Matraz de Agitación de Thraustochytrium (TSFM) con 2 g/L de tastona

Componente Cantidad por [Material] mL de material a

litro (g) (g/l) utilizar por litro

NaCl 0,625 seco

KCl 1 50 20 ml

MgSO4.7H2O 5 227 22 ml

(NH4) 2SO4 0,2 190 1,05 ml

CaCl22H2O 0,29 seco

MSG

Monohidrato 2 seco

Tastona 154 2 seco

HEPES (100

mM0 pH 7 23,8 seco

KH2PO4 0,1 56,5 1,77 ml añadir después de someter a autoclave Glucosa 50 500 100 ml añadir después de someter a autoclave Metales traza véase 1 ml añadir después de abajo esterilizar en autoclave Vitaminas véase 1 ml añadir después de abajo esterilizar en autoclave Metales traza

Solución

FeCl3.6H2O 2,9 mg 2,9

CuSO4.5H2O 0,02 mg 0,02

MnCl2.4H2O 8,6 mg 8,6

CoCl2.6H2O 0,26 mg 0,26

ZnCl2 0,6 mg 0,6

Ácido cítrico 12 mg 12 g

(seco)

Solución de

vitamina

Tiamina 10 ug 10 mg/l

Vitamina B12 1 ug 1 mg/L

Tabla 16

Medio de Matraz de Agitación de Thraustochytrium (TSFM) con 0,25 g/L de tastona Componente Cantidad por [Material] mL de material

litro (g) (g/l) a utilizar por litro

NaCl 0,625 seco

KCl 1 50 20 ml

MgSO4.7H2O 5 227 22 ml

(NH4) 2SO4 0,2 190 1,05 ml

CaCl22H2O 0,29 seco

MSG monohidrato 4,554 seco

Tastona GC 7189-1 0,25 seco

HEPES (100 mM0

pH 7 23,8 seco

KH2PO4 0,1 56,5 4,28 ml añadir después de someter a autoclave Glucosa 50 500 100 ml añadir después de someter a autoclave Metales traza véase 1 ml añadir después de abajo someter a autoclave Vitaminas véase 1 ml añadir después de abajo someter a autoclave TSFM Metales traza

FeCl3.6H2O 2,9 mg 2,9

CuSO4.5H2O 0,02 mg 0,02

MnCl2.4H2O 8,6 mg 8,6

CoCl2.6H2O 0,26 mg 0,26

ZnCl2 0,6 mg 0,6

Ácido cítrico 12 mg 12 g

(seco)

Solución de Vitaminas

Tiamina 10 ug 10 mg/l

Vitamina B12 1 ug 1 mg/L

Tabla 17

Concentraciones de vitamina utilizadas en este estudio (mg/L):

conc. de vitamina [X] Tiamina.HCl B12 Biotina Pantotenato de Ca

0 0,0 0,0 0,0 0,0

0,5 0,005 0,00234

1 0,010 0,001 0,00468 3,33

5 0,050 0,005 16,65

10 0,100 0,010 0,0468 33,30

20 0,200 0,020 0,0936 66,60

30 0,1404

Resultados: Se consiguió el mayor DW y % de grasa (6,7 g/L y 38,5%, respectivamente) para el gradiente de tiamina cuando la cantidad añadida de esta vitamina al medio fue 5 veces el nivel estándar (Figura 1). El % de DHA a este nivel de tiamina fue del 44,1%. Por debajo y por encima de 5x de tiamina, tanto el DW como el % de grasa comenzaron a disminuir. El % de DHA también disminuyó en los medios con menos de 5x de tiamina, y fluctuó ligeramente por encima de 5x de tiamina sin una mejora significativa. El % de EPA en los cultivos en gradiente de tiamina osciló entre 8,6 y 11,5. Cuando no se añadieron tastona o vitaminas al medio (Figura 5, medio A), todo, excepto el % de DHA se redujo significativamente. El aumento en el % de DHA, sin embargo, pareció ser artificial, ya que tanto el DW como el % de grasa fueron extremadamente bajos para esta condición. La concentración 1x de B12 pareció ser óptima para DW, % de DHA, % de grasa y % de EPA (Figura 2). Con este nivel de vitamina B12, se logró lo siguiente: 7,1 g/L de DW, 50,6% de DHA, 42,7% de grasa y 2,1% de e Pa . El porcentaje de EPA más alto (11,5) se obtuvo cuando no se añadió B12 al medio. El medio exento de tastona sin vitaminas añadidas no mejoró adicionalmente el rendimiento del organismo, y el % de DHA más alto parecía ser artificial, tal como se describió anteriormente (Figura 5, medio A).

Del mismo modo, la concentración 1x de biotina fue óptima para DW, % de DHA y % de grasa (Figura 3). Los valores correspondientes para estos parámetros fueron: 6,8 g/L, 47,7% y 37,9%, respectivamente. El porcentaje de EPA en este punto era 1,9. El medio exento de tastona con 1x tiamina y 1x B12 (Figura 5, medio B) comprometió significativamente el rendimiento global de PTA-9695.

Pantotenato de Ca produjo el mayor DW, % de DHA y % de grasa cuando se añadió esta vitamina al medio a 10x la cantidad estándar (Figura 4). Las concentraciones óptimas de estos parámetros fueron 7,0 g/L, 47,3% y 39,1%, en consecuencia. El contenido de EPA en todo el experimento de gradiente de pantotenato de calcio fue inferior al 2%. Se observó una reducción significativa en el rendimiento global de PTA-9695 cuando el organismo se cultivó en medio exento de tastona con solo 1x tiamina y 1x B12 (Figura 5, medio B).

Los resultados también se muestran en las tablas de datos siguientes.

conc. de vitamina estándar

Tiamina.HCl [1x |

B12 [1x]

Biotina [1x]

Pantotenato de Ca [1x]

gradientes de vitaminas [x] -> 0 0,5 1 5 10 20 30 Tiamina.HCl (g/L) 0 5,00E-06 1,00E-05 5,00E-05 1,00E-04 2,00E-04 3,00E-04 B12 (g/L) 0 5,00E-07 1,00E-06 5,00E-06 1,00E-05 2,00E-05 3,00E-05 Blotin (g/L) 0 2,34E-06 4,68E-06 2,34E-05 4,68E-05 9,36E-05 1,40E-04 Pantotenato de Ca (g/L) 0 1,67E-03 3,33E-03 1,67E-02 3,33E-C2 6,66E-02 9,99E-02

Concentraciones totales de vitaminas, incluido el arrastre del inoculo:

Concentraciones totales de vitamina (mg/L) incluyendo el arrastre del inoculo:

ID Trt -> 19a 9b 20a 20b 21a 21b 22a 22b C1a (0,625 C1b (0,625 g/L NaCl) g/L NaCl ) Tiamina.HCl [x] 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 B12 [x] 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 Biotina [x] 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 Pantotenato de Ca [x] 1 1 5 5 10 10 20 20 0 0 % de DHA 45,05 41,28 44,94 48,70 50,68 43,87 44,23 38,53 58,95 56,92 % promedio de DHA 43,16 45,82 47,27 41,38 56,93 % de grasa 32,05 31,10 32,32 36,07 45,61 32,51 25,50 27,42 50,11 53,39 % promedio de grasa 31,57 34,20 39,08 28,48 51,75 % de EPA 1,94 1,73 1,66 1,83 1,87 1,82 2,21 1,73 2,50 2,45 % promedio de EPA 1,83 1,84 1,85 1,97 2,47 % de 16:0 41,55 45,27 41,79 40,38 37,09 42,91 42,30 47,58 31,04 31,08 % promedio de 16:0 43,41 41,09 40,00 44,93 31,05 % de ARA 0,00 0,00 0,00 0,00 0,15 0,00 0,00 0,00 0,20 0,21 % promedio de ARA 0,00 0,00 0,08 0,00

0,20

Ejemplo 11

Se realizaron experimentos para determinar el requisito mínimo del N° de Acceso en la ATCC PTA-9695 para la vitamina B12 para lograr un rendimiento máximo a 10% de CO2, incluyendo la cantidad mínima de la vitamina B12 que se requiere para el cultivo de PTA-9695 a la máxima producción en peso seco y rendimiento de DHA en condiciones de 10% de CO2.

Temperatura: 22,5 /- 1C (a 10% de CO2)

Velocidad del agitador: 200 rpm

Medio Base: Medio del Fermentador Definido a Escala Reducida (DSDFM-B) (Tabla 20).

Inóculo: cultivo de 3 días de PTA-9695 desarrollado en DSDFM-B con diferentes concentraciones de vitamina B12. Un nuevo criovial de PTA-9695 se descongeló inicialmente en SDFM-B (Tabla 19), y posteriormente se cultivó y se transfirió varias veces en SDFM-B Definido bajo 10% de CO2. Se utilizó un cultivo de 3 días de PTA-9695 en DSDFM-B (al 4%) para preparar los matraces de inóculo inicial que contenían DSDFM-B con diversas concentraciones de vitamina B12 (es decir, de 7,68 mg/L a cero mg/L de B12 para los tratamientos A hasta I, en consecuencia; véase la Tabla 18). Los matraces de inóculo para cada una de las concentraciones de la vitamina B12 se mantuvieron bajo 10% de CO2 y mediante la transferencia de los cultivos en sus respectivos medios recientes cada 7 días. La transferencia semanal de los cultivos fue esencial para eliminar por lavado cualquier exceso de vitamina B12 que pudiera haberse almacenado dentro de las células, de modo que se pudiera determinar con mayor precisión el requerimiento mínimo de esta vitamina. Se inocularon matraces de agitación por duplicado con sus respectivos inóculos de 3 días a un DW teórico de 0,1 g/L, utilizando la Densidad Óptica a 600 nm. Los cultivos se cultivaron bajo 10% de CO2 durante 9 días, antes de ser recolectados y analizados adicionalmente por ensayo FAME.

Resultados:

Nota: Los puntos de datos para la semana 3 no se tomarán en cuenta para este estudio, ya que el suministro de CO2 a la incubadora había sido interrumpida, y los matraces tuvieron que ser retirados de la incubadora durante 6 horas durante la renovación de laboratorio.

La exposición prolongada (hasta 4 semanas) de PTA-9695 a altas concentraciones de la vitamina B12 (mayor que 3,84 mg/L) puede afectar adversamente el peso en seco, el % de grasa y el rendimiento de DHA, mientras que una concentración de entre 1,5 y 768 ug/L de vitamina B12 no tiene un efecto significativo en el rendimiento del DW de PTA-9695, el % de grasa, el % de EPA y DHA.

Un incremento en el número de células individuales (hasta 15, en contraposición a 3-4) se observó en cultivos que habían sido cultivados en presencia de 768 mg/L de vitamina B12 (tratamiento A).

La eliminación de la vitamina B12 de la receta del medio aumenta significativamente el % de EPA en aproximadamente un 10%, mientras que disminuye ligeramente tanto el % de DHA como el % de 16:0. Las Figuras 6-19 y la Tabla 21 que figura más adelante muestran los resultados de los experimentos.

Conclusión:

Un mínimo de aproximadamente 1,5 ug/L de vitamina B12 (1/500a la concentración estándar en SDFM-B) es esencial para la obtención de un DW, % de DHA, % de grasa y rendimiento de DHA máximos. Si bien concentraciones muy altas de vitamina B12 (superiores a 3,84 mg/L) pueden reducir sustancialmente el contenido de DW, el % de grasa y el rendimiento de DHA, una privación completa de PTA-9695 de esta vitamina puede aumentar significativamente (aproximadamente un 10%) su % de EPA. Los niveles muy altos de vitamina B12 también pueden desempeñar un papel en la promoción de la transformación del cultivo "grumoso" en "células individuales".

Tabla 18. Tratamientos con Vitamina B12

Tabla 19. Medio del Fermentador a Escala Reducida para PTA-9695 (SDFM-B), pH 7

Tabla 20. SDFM-B definido (DSDFM-B), pH 7

Ejemplo 12

N° de acceso en la ATCC PTA-10208 Gradientes de vitamina B12 al 10% de CO2

Experimentos realizados para determinar la concentración de la vitamina B12 que proporciona óptimo crecimiento PTA-10208 y productividad de EPA.

Temperatura: 23 ° C

Velocidad del agitador: 200 rpm

Medio base: SDf M-O definido (DSDFM-O)

Inóculo: Descongelar un vial de PTA-10208 en SDFM-O en condiciones ambientales. Transferir 2 mL de cultivo a 48 mL de DSDFM-O al 10% de CO2. Transferir el cultivo a DSDFM-O reciente (10% de CO2) (véase la Tabla 22). Transferir el cultivo a DSDFM-O reciente (10% de CO2). Utilizar el cultivo para inocular el experimento de gradiente de vitamina B12 Semana n° 1 (2 mL/matraz) (10% de CO2).

Configuración experimental:

Todos los cultivos se cultivaron en matraces de agitación de 50 mL y matraces duplicados se cultivaron para cada condición. Se inoculó PTA-10208 en gradientes de vitamina B12 de nueve días en DSDFM-O (sin tastona) cada siete días. Se mantuvieron inóculos para cada concentración de Vitamina B12 durante el transcurso del experimento. Al continuar transfiriendo PTA-10208 en concentraciones reducidas de Vitamina B12, el exceso de Vitamina B12 se eliminó eficazmente por lavado de las células. Se transfirieron inóculos para cada concentración de Vitamina B12 cada siete días. Se utilizaron inóculos de cuatro días para comenzar cada gradiente de Vitamina B12 de nueve días. Cada uno de los gradientes de nueve días se marca consecutivamente como Conjunto de Experimentos A, B, C, D, E, F, G, H, I, J y K en la Tabla 23 que figura más adelante. Antes de cada inoculación en gradiente, se midió la densidad óptica para cada concentración de Vitamina B12 con el fin de transferir aproximadamente la misma cantidad de células. Después de nueve días de crecimiento, se recolectaron todos los cultivos para medir el pH, el peso seco y el perfil de ácidos grasos. El experimento terminó una vez que se encontró que los pesos secos en cada concentración de vitamina B12 se habían estabilizado durante al menos tres gradientes consecutivos de nueve días.

Tabla 23

Se llevaron a cabo siete 5x consecutivas a 1/500x gradientes de Vitamina B12. Al final del último experimento, se inició un nuevo experimento que compara el crecimiento de PTA-10208 y la producción de EPA a 1/500x (0,0015 mg/L) y 0x (0 mg/L de Vitamina B12). Se llevaron a cabo cuatro experimentos consecutivos de Vitamina B121/500x frente a 0x.

Resultados:

(Para 5x -> 1/500x de Vitamina B12): Durante siete experimentos consecutivos de nueve días, el peso seco de PAT-10208, % de EPA, % de DHA, % de grasa y rendimiento de EPA no cambiaron en las concentraciones de Vitamina B12 que varían de 5x (3,84 mg/L) a 1/500x (0,0015 mg/L).

(Para 1/500x y 0x de Vitamina B12): Los resultados en el transcurso de cuatro experimentos consecutivos de nueve días demuestran que PTA-10208 cultivado en DSDFM-O que contiene 0 mg/L de Vitamina B12 tiene un porcentaje de EPA mucho más alto que cuando se cultiva con solo 1/500x (0,0015 mg/L) de vitamina B12. Mientras que el % de EPA aumenta de aproximadamente un 18% con 1/500x (0,0015 mg/L) de vitamina B12 a aproximadamente un 27% sin vitamina B12, el % de DHA disminuye de aproximadamente un 45% con 1/500x (0,0015 mg/L) de vitamina B12 a aproximadamente 36% sin vitamina B12. El peso seco y el % de grasa de PTA-10208 aumentan ligeramente cuando la Vitamina B12 se elimina por completo de DSDFM-O. Como resultado del aumento en el % de EPA y los ligeros aumentos en el peso seco y el % de grasa, el rendimiento de PTA-10208 EPA aumenta en aproximadamente un 60% cuando se elimina la Vitamina B12 del DSDFM-O.

Los resultados también se muestran en las Figuras 20 - 49 y en las Tablas siguientes.

Experimento 600 nm mg/L Vit Tara Fuera de g/L Inoc . peso

Conjunto MUESTRA 0.0. B12 pH (g) (g) peso Biomasa nódulo seco (g)

A 5 x (1) 3,84 6,80 10,4757 10,723 0,2473 4,95

5 x (2) 3,84 6,80 10,4534 10,689 0,2356 4,71 1x (1) 0,77 6,80 10,5142 10,7449 0,2307 4,61 1x (2) 0,77 6,81 10,431 10,6512 0,2202 4,40 1 / 2x (1) 0,38 6,82 10,5684 10,7882 0,2198 4,40 1 / 2x (2) 0,38 6,82 10,6373 10,8691 0,2318 4,64 1/5 x (1) 0,15 6,81 10,5044 10,7348 0,2304 4,61 1/5 x (2) 0,15 6,82 10,5219 10,747 0,2251 4,50 1/10 x (1) 0,077 6,83 10,5221 10,7481 0,226 4,52 1/10 x (2) 0,077 6,83 10,4705 10,6979 0,2274 4,55 1 / 20x (1) 0,038 6,83 10,4743 10,6988 0,2245 4:49 1 / 20x (2) 0,038 6,83 10,7322 10,9646 0,2324 4,65 1/50 x (1) 0,015 6,84 10,4777 10,6945 0,2168 4,34 1/50 x (2) 0,015 6,85 10,4766 10,7018 0,2252 4,50 1 / 100x

(1) 0,0077 6,84 10,4543 10,6863 0,232 4,64

1 / 100x

(2) 0,0077 6,85 10,5041 10,7452 0,2411 4,82

1 / 500x

< (1) 0,0015 6,66 10,5152 10,7563 0,2411 4,82

1 / 500x

(2) 0,0015 6,85 10,574 10,8081 0,2341 4,68

5 x (1) 4,0445 3,84 6,63 10,5021 10,7338 0,2317 4,63 5 x (2) 4,0445 3,84 ' 6,65 10,4735 10,7152 0,2417 4,83 1x (1) 4,3024 0,77 6,64 10,5011 10,7394 0,2383 4,77 1x (2) 4,3024 0,77 6,65 10,4004 10,6362 0,2358 4,72 1 / 2x (1) 4,1648 0,38 6,64 10,4599 10,71 0,2501 5,00 1 / 2x (2) 4,1648 0,38 6,64 10,5630 10,804 0,241 4,82 1/5 x (1) 4,1600 0,15 6,63 10,6521 10,889 0,2369 4,74 1/5 x (2) 4,1600 0,15 6,63 10,5032 10,7341 0,2309 4,62 1/10 x (1) 4,4997 0,077 6,65 10,4726 10,6998 0,2272 4,54 1/10 x (2) 4,4997 0,077 6,64 10,4841 10,7279 0,2438 4,88 1 / 20x (1) 4,9716 0,038 6,64 10,3785 10,6112 0,2327 4,65 1 / 20x (2) 4,9716 0,038 6,64 10,3832 10,6154 0,2322 4,64 1/50 x (1) 4,3049 0,015 6,65 10,3782 10,612 0,2338 4,68 1/50 x (2) 4,3049 0,015 6,65 10,5546 10,7877 0,2331 4,66 1 / 100x

(1) 4,6035 0,0077 6,65 10,4858 10,7172 0,2314 4,63

1 / 100x

(2) 4,6035 0,0077 6,66 10,4771 10,7122 0,2351 4,70

1 / 500x

(1) 4.4494 0,0015 6.65 10,6083 10,8163 0,208 4,16

1 / 500x

(2) 4.4494 0,0015 6.65 10,5722 10,7896 0,2174 4,35

C 5 x (1) 4,1784 3,84 6,77 10,4842 10,7237 0,2395 4,79

5 x (2) 4,1784 3,84 6,80 10,5261 10,7553 0,2292 4,58

1x (1) 4,2842 0,77 6,80 10,3785 10,6194 0,2409 4,82

1x (2) 4,2842 0,77 6,77 10,6083 10,8459 0,2376 4,75

1 / 2x (1) 4,8665 0,38 8,81 10,5274 10,7183 0,1909 3,82

1 / 2x (2) 4,8865 0,38 6,81 10,4713 10,6853 0,214 4,28

1/5 x (1) 4,5411 0,15. 6,81 10,3831 10,5997 0,2166 4,33

1/5 x (2) 4,5411 0,15 6,84 10,5444 10,7666 0,2222 4,44

1/10 x (1) 5,2960 0,077. 6,80 10,501 10,7181 0,2171 4,34

1/10 x (2) 5,2960 0,077 6,82 10,3783 10,5978 0,2195 4,39

1 / 20x (1) 5,2480 0,038 6,82 10,4521 10,6539 0,2018 4,04

1 / 20x (2) 5,2480 0,038 6,83 10,4018 10,5881 0,1863 3,73

1/50 x (1) 5,6680 0,015 6,82 10,5049 10,7248 0,2199 4,40

1/50 x (2) 5,6680 0,015 6,83 10,4197 10,6441 0,2244 4,49

1 / 100x

(1) 4,9024 0,0077 6,83 10,5531 10,7847 0,2316 4,63

1 / 100x

(2) 4,9024 0,0077 6,83 10,7098 10,9412 0,2314 4,63

1 / 500x

(1) 4,6011 0,0015 6,83 10,5543 10,7942 0,2399 4,80

1 / 500x

(2) 4,6011 0,0015 6,83 10,3382 10,5746 0,2364 - 4,73

Conjunto MUESTRA 0.0. 812 pH (g) (g) peso Biomasa nódulo

seco (g)

D 5 x(1) 4,3297 3,84 6,85 10,3415 10,5976 0,2561 5,12

5 x (2) 4,3297 3,84 6,85 10,4549 10,698 0,2431 4,86 1x (1) 5,3731 0,77 6,85 10,3785 10,6143 0,2358 4,72 1x (2) 5,3731 0,77 6,85 10,6117 10,8401 0,2284 4,57 1 / 2x (1) 4,9040 0,38 6,85 10,4318 10,6573 0,2255 4,51 1 / 2x (2) 4,9040 0,38 6,85 10,6572 10,8742 0,217 4,34 1/5 x (1) 4,7084 0,15 6,85 10,552 10,7791 0,2271 4,54 1/5 x (2) 4,7084 0,15 6,85 10,7118 10,9623 0,2505 5,01 1/10 x (1) 4,9843 0,077 6,85 10,6174 10,8589 0,2415 4,83 1/10 x (2) 4,9843 0,077 6,86 10,5229 10,7614 0,2385 4,77 1 / 20x (1) 4,7533 0,038 6,84 10,5045 10,7446 0,2401 4,80 1 / 20x (2) 4,7533 0,038 6,84 10,5049 10,7281 0,2232 4,46 1/50 x (1) 4,3732 0,015 6,86 10,5161 10,7566 0,2405 4,81 1/50 x (2) 4,3732 0,015 6,85 10,5234 10,7574 0,234 4,68 1/100 x (1) 4,0902 0,0077 6,86 10,4858 10,7193 0,2335 4,67 1/100 x (2) 4,0902 0,0077 6,86 10,5523 10,7856 0,2333 4,67 1 / 500x (1) 4,2472 0,0015 6,86 10,553 10,8032 0,2502 5,00 1 / 500x (2) 4,2472 0,0015 6,86 10,4488 10,6976 0,2488 4,98 E 5 x (1) 4,5635 3,84 6,79 10,3613 10,6103 0,249 4,98

5 x (2) 4,5635 3,84 6,80 10,5311 10,7546 0,2235 4,47 1x (1) 4,2673 0,77 6,80 10,3311 10,5651 0,234 4,68 1x (2) 4,2673 0,77 6,80 10,466 10,7162 0,2502 5,00 1 / 2x (1) 5,1989 0,38 6,79 10,6796 10,9054 0,2258 4,52 1 / 2x (2) 5,1989 0,38 6,80 10,5552 10,7836 0,2284 4,57 1/5 x (1) 5,0275 0,15 6,80 10,4877 10,721 0,2333 4,67 1/5 x (2) 5,0275 0,15 6,80 10,5061 10,7331 0,227 4,54 1/10 x (1) 5,6680 0,077 6,81 10,3585 10,5946 0,2361 4,72 1/10 x (2) 5,6680 0,077 6,80 10,6807 10,9116 0,2309 4,62 1 / 20x (1) 5,2891 0,038 6,81 10,3664 10,6143 0,2479 4,96 1 / 20x (2) 5,2891 0,038 6,81 10,3745 10,6253 0,2508 5,02 1/50 x (1) 5,0356 0,015 6,81 10,4285 10,682 0,2535 5,07 1/50 x (2) 5,0356 0,015 6,80 10,4022 10,6524 0,2502 5,00 1/100 x (1) 5,7271 0,0077 6,81 10,3332 10,5937 0,2605 5,21 1/100 x (2) 5,7271 0,0077 6,81 10,525 10,7782 0,2532 5,06 1 / 500x (1) 5,1000 0,0015 6,81 10,4192 10,6785 0,2593. 5,19 1 / 500x (2) 5,1000 0,0015 6,81 10,3991 10,6668 0,2677 5,70 F 5 x (1) 4,5635 3,84 6,75 10,524 10,7696 0,2456 5,23

5 x(2) 4,5635 3,84 6,75 10,3291 10,5729 0,2438 4,88 1x (1) 4,2673 0,77 6,75 10,4927 10,7424 0,2497 4,99 1x (2) 4,2673 0,77 6,78 10,5257 10,7852 0,2395 4,79 1 / 2x (1) 5,1989 0,38 6,75 10,463 10,6908 0,2278 4,56 1 / 2x (2) 5,1989 0,38 6,76 10,3756 10,6003 0,2247 4,49 1/5 x (1) 5,0275 0,15 6,76 10,4212 10,6704 0,2492 4,98 1/5 x (2) 5,0275 0,15 6,76 10,5061 10,7509 0,2448 4,90 1/10 x (1) 5,6680 0,077 6,76 10,3829 10,6062 0,2233 4,47 1/10 x (2) 5,6680 0,077 6,76 10,3651 10,6068 0,2417 4,83 1 / 20x (1) 5,2891 0,038 6,75 10,5096 10,7442 0,2346 4,69 1 / 20x (2) 5,2891 0,038 6,77 10,3875 10,6226 0,2351 4,70 1/50 x (1) 5,0356 0,015 6,78 10,3584 10,6063 0,2479 4,96 1/50 x (2) 5,0356 0,015 6,76 10,5235 10,7671 0,2436 4,87 1/100 x (1) 5,7271 0,0077 6,77 10,3664 10,6148 0,2484 4,97 1/100 x (2) 5,7271 0,0077 6,78 10,5055 10,7441 0,2386 4,77 1 / 500x (2) 5,1000 0,0015 6,80 10,3279 10,591 0,2631 5,26 G 5 x (1) 3,7017 3,84 6,83 10,362 10,6077 0,2457 4,91

5 x (2) 3,7017 3,84 6,82 10,3595 10,6145 0,255 5,10 1x (1) 4,2905 0,77 6,84 10,3648 10,6151 0,2503 5,01 1x (2) 4,2905 0,77 6,85 10,3356 10,5972 0,2616 5,23 1 / 2x (1) 4,4548 0,38 6,84 10,5096 10,7683 0,2587 5,17 1 / 2x (2) 4,4508 0,38 6,84 10,435 10,6889 0,2539 5,08 1/5 x (1) 4,6844 0,15 6,84 10,3305 10,5868 0,2563 5,13 1/5 x (2) 4,6844 0,15 6,85 10,4964 10,7476 0,2512 5,02 1/10 x (1) 5,8389 0,077 6,85 10,3637 10,6173 0,2536 5,07 1/10 x (2) 5,8369 0,077 6,85 10,3351 10,5881 0,253 5,08 1 / 20x (1) 4,4483 0,038 6,85 10,4393 10,6958 0,2565 5,13 1 / 20x (2) 4,4483 0,038 6,86 10,3798 10,6416 0,2618 5,24 1/50 x (1) 3,9821 0,015 6,86 10,3619 10,619 0,2571 5,14 1/50 x (2) 3,9821 0,015 6,87 10,5179 10,7721 0,2542 5,08 1/100 x (1) 5,0043 0,0077 6,87 10,4756 10,7288 0,2532 5,06 1/100 x (2) 5,0043 0,0077 6,87 10,4993 10,7561 0,2568 5,14 1 / 500x (1) 5,0108 0,0015 6,88 10,434 10,6941 0,2601 5,20 1 / 500x (2) 5,0108 0,0015 6,87 10,3896 10,6446 0,255 5,10 H 1 / 500x (1) 4,6921 0,0015 6,85 10,3599 10,5954 0,2355 4,71

1 / 500x (2) 4,6921 0,0015 6,85 10,3720 10,6254 0,2534 5,07 0x (1) 4,8144 0,0000 6,85 10,3624 10,6052 0,2428 4,86 0x (2) 4,8144 0,0000 6,86 10,3585 10,6093 0,2508 5,02 I 1 / 500x (1) 4,7906 0,0015 6,89 10,5492 10,7920 0,2428 4,86

(2) 4,7906 0,0015 6,90 10,5958 10,8508 0,255 5,10 0x (1) 4,7063 0,0000 6,89 10,5505 10,8037 0,2532 5,06 0x (2) 4,7063 0,0000 6,89 10,5120 10,7693 0,2573 5,15 J 1 / 500x (1) 5,8805 0,0015 6,99 10,5433 10,8089 0,2656 5,31

1 / 500x (2) 5,8805 0,0015 7,00 10,5974 10,8714 0,274 5,48 0x (1) 4,6385 0,0000 7,00 10,5509 10,8145 0,2636 5,27 0x (2) 4,6385 0,0000 6,98 10,5462 10,8252 0,279 5,58 K 1 / 500x (1) 4,7133 0,0015 6,87 10,5424 10,8085 0,2661 5,32

1 / 500x (2) 4,7133 0,0015 6,88 10,3444 10,6111 0,2667 5,33 0x (1) 4,2141 0,0000 6,86 10,3873 10,6587 0,2714 5,43 0x (2) 4,2141 0,0000 6,86 10,4188 10,6866 0,2678 5,36 Conjunto de MUESTRA % de % % de (n-6) (n-3) % de % de experimentos 16:0 de ARA EPA DPA DPA DHA Grasa A 5 x (1) 27,53 1,67 16,01 2,22 2,33 41,72 67,22

5 x (2) 27,65 1,71 16,02 2,16 2,41 41,17 66,07 1x (1) 27,73 1,72 16,00 2,15 2,44 41,08 66,25 1x (2) 27,72 1,75 16,32 2,10 2,48 40,46 65,42 1 / 2x (1) 27,86 1,74 16,36 2,09 2,49 40,54 65,45 1 / 2x (2) 27,73 1,77 16,53 2,14 2,32 40,93 66,57 1/5 x (1) 27,60 1,73 16,33 2,13 2,38 41,03 66,59 1/5 x (2) 27,88 1,74 15,94 2,17 2,43 41,04 66,28 1/10 x (1) 27,87 1,75 16,28 2,09 2,56 40,66 65,14 1/10 x (2) 27,81 1,74 16,07 2,13 2,48 40,96 65,39 1 / 20x (1) 27,70 1,75 16,36 2,08 2,52 40,53 65,64 1 / 20x (2) 27,63 1,75 16,42 2,13 2,36 40,93 66,30 1/50 x (1) 27,83 1,76 16,61 2,07 2,43 40,60 66,02 1/50 x (2) 27,82 1,69 16,35 2,11 2,49 40,84 64,97 1/100 x (1) 27,50 1,72 16,13 2,16 2,50 41,19 66,21 1/100 x (2) 27,60 1,69 15,64 2,24 2,34 41,72 66,56 1 / 500x 27,58 1,70 15,63 2,24 2,28 41,74 66,99 (1)

1 / 500x 27,57 1,75 16,86 2,06 2,41 40,59 64,91 (2)

B 5x (1) 28,30 1,75 16,86 2,06 2,41 40,59 64,91

5 x (2) 28,45 1,74 15,96 2,36 2,36 42,62 62,46 1x (1) 28,55 1,74 16,10 2,32 2,43 42,35 62,96 1x (2) 28,47 1,78 16,33 2,33 2,44 42,26 63,13 1 / 2x (1) 28,21 1,71 15,90 2,39 2,34 42,95 64,75 1 / 2x (2) 28,16 1,75 16,65 2,29 2,33 42,32 63,50 1/5 x(1) 28,51 1,74 16,34 2,29 2,37 42,23 62,02 1/5 x (2) 28,43 1,75 16,35 2,29 2,48 42,24 63,88 1/10 x (1) 28,66 1,77 15,85 2,37 2,45 42,45 62,47 1/10 x (2) 28,52 1,74 15,74 2,40 2,39 42,70 63,14 1 / 20x 28,67 1,75 15,86 2,33 2,37 42,55 63,10 (1)

1 / 20x 28,36 1,75 16,13 2,35 2,26 42,62 63,90 (2)

1/50 x (1) 28,36 1,79 16,64 2,29 2,42 42,04 62,31 1/50 x (2) 28,43 1,77 15,92 2,40 2,42 42,57 62,77 1/100 x 28,81 1,75 16,01 2,30 2,49 42,16 61,70 (1)

1/100 x 28,61 1,73 15,93 2,35 2,40 42,51 63,60 (2)

1 / 500x 28,62 1,85 17,15 2,17 2,59 41,19 60,91 (1)

1 / 500x 28,30 1,84 17,39 2,20 2,43 41,40 61,56 (2)

C 5 x (1) 27,97 1,95 16,08 2,60 2,43 42,37 67,30 5 x (2) 28,24 1,96 15,99 2,55 2,54 42,02 66,72 1x (1) 28,20 1,94 15,96 2,60 2,61 42,06 66,98 1x (2) 28,10 1,98 16,39 2,54 2,64 41,73 66,30 1 / 2x (1) 27,77 2,14 17,67 2,40 2,85 40,46 64,53 1 / 2x (2) 27,84 2,10 17,27 2,50 2,62 40,85 65,79 1/5 x (1) 27,57 2,06 17,37 2,46 2,64 41,17 66,69 1/5 x(2) 27,71 2,05 17,05 2,50 2,70 41,31 65,86 1/10 x (1) 28,02 2,06 16,89 2,48 2,70 41,27 65,53 1/10 x (2) 27,66 2,05 16,76 2,55 2,64 41,66 65,85 1 / 20x 27,64 2,13 17,27 2,52 2,74 41,03 65,00 (1)

1 / 20x 27,56 2,19 18,62 2,27 2,88 39,82 64,23 (2)

1/50 x (1) 27,78 2,02 16,98 2,51 2,52 41,61 66,22 1/50 x(2) 27,82 2,01 16,92 2,53 2,65 41,47 65,85 1/100 x 27,85 2,01 16,77 2,54 2,67 41,50 65,23 (1)

1/100 x 27,91 2,01 16,61 2,58 2,59 41,72 66,87 (2)

1 / 500x 27,73 2,02 17,42 2,41 2,58 41,10 65,60 (1)

1 / 500x 27,48 2,05 17,93 2,39 2,54 40,85 65,85 (2)

D 5 x (1) 27,80 1,85 15,97 2,59 2,32 42,99 67,08 5 x (2) 27,89 1,86 16,27 2,52 2,42 42,60 66,60 1x (1) 27,60 1,92 16,59 2,54 2,53 42,42 66,32 1x (2) 27,75 1,89 16,40 2,53 2,48 42,60 66,35 1 / 2x (1) 27,35 1,98 17,19 2,52 2,53 41,97 65,19 1 / 2x (2) 27,26 2,01 17,65 2,45 2,45 41,58 66,67 1/5 x (1) 27,42 1,97 17,53 2,42 2,55 41,72 66,69 1/5 x (2) 27,46 1,91 16,60 2,60 2,45 42,44 66,58 1/10 x (1) 27,45 1,97 17,03 2,50 2,61 42,04 66,06 1/10 x (2) 27,45 1,90 16,66 2,52 2,46 42,46 66,91 1 / 20x 27,45 1,96 16,95 2,58 2,41 42,11 66,10 (1)

1 / 20x 27,30 2,00 17,94 2,42 2,45 41,50 65,30 (2)

1/50 x (1) 27,58 1,87 16,65 2,55 2,33 42,61 66,84 1/50 x (2) 27,69 1,89 16,85 2,50 2,44 42,27 65,40 1/100 x 27,44 1,92 16,88 2,51 2,51 42,38 65,88 (1)

1/100 x 27,47 1,92 16,67 2,58 2,43 42,56 65,83 (2)

1 / 500x 26,91 1,98 18,05 2,40 2,47 41,66 66,18 (1)

1 / 500x 27,03 1,99 18,08 2,40 2,36 41,69 65,80 (2)

E 5 x (1) 27,46 1,89 16,02 2,60 2,30 43,33 66,12 5 x (2) 27,86 1,93 16,05 2,50 2,38 43,02 63,64 1x (1) 27,75 1,95 15,91 2,58 2,39 43,09 65,41 1x (2) 27,51 1,94 15,59 2,72 2,29 43,52 67,35 1 / 2x (1) 27,07 2,04 16,99 2,52 2,42 42,64 65,01 1 / 2x (2) 28,88 2,05 17,23 2,48 2,35 42,59 65,00 1/5 x (1) 27,05 1,96 16,65 2,55 2,29 43,21 65,66 1/5 x (2) 27,12 1,98 16,69 2,52 2,41 43,08 63,58 1/10 x (1) 27,35 1,95 16,45 2,55 2,48 42,94 64,34 1/10 x (2) 27,31 1,92 16,22 2,60 2,41 43,24 64,49 1 / 20x 26,72 1,93 16,73 2,64 2,31 43,21 65,83 (1)

1 / 20x 26,47 1,94 17,11 2,65 2,21 43,14 66,13 (2)

1/50 x (1) 26,63 1,86 16,30 2,72 2,19 43,84 65,30 1/50 x (2) 26,68 1,86 16,33 2,69 2,26 43,76 65,67 1 / 100x

(1) 1 / 26,47 1,87 16,39 2,69 2,28 43,89 63,98 100x

(2) 1 / 26,45 1,89 16,78 2,62 2,38 43,49 65:21 500x

(1) 26,06 1,88 17,13 2,60 2,23 43,73 66,13 1 / 500x 25,95 1,88 17,58 2,57 2,10 43,40 65,46 (2)

F 5 x (1) 25,71 1,96 17,50 2,46 2,34 43,56 65,46

5 (2) 25,91 1,93 17,26 2,47 2,38 43,73 65,71 1x (1) 25,93 1,90 16,70 2,54 2,43 43,93 66,05 1x (2) 26,03 1,94 17,17 2,48 2,39 43,41 65,34 1 / 2x (1) 25,76 2,03 18,11 2,43 2,38 42,76 65,27 1 / 2x (2) 25,74 2,05 18,52 2,37 2,31 42,52 65,75 1/5 x (1) 25,44 1,95 17,62 2,49 2,27 43,73 65,80 1/5 x (2) 25,41 1,94 17,35 2,52 2,32 43,99 65,88 1/10 x (1) 26,13 2,04 18,06 2,36 2,55 42,43 64,10 1/10 x (2) 25,62 1,98 17,53 2,48 2,44 43,52 65,51 1 / 20x 25,77 2,01 17,97 2,45 2,34 42,94 65,21 (1)

1 / 20x 25,55 2,03 18,45 2,42 2,24 42,78 66,05 (2)

1/50 x (1) 25,26 1,96 17,54 2,55 2,18 44,07 66,41 1/50 x (2) 25,48 1,95 17,58 2,50 2,30 43,72 85,93 1/100 x 25,50 1,93 17,00 2,62 2,23 44,36 65,37 (1)

1/100 x 25,59 1,96 17,37 2,56 2,26 43,80 65,18 (2)

1 / 500x 25,54 1,99 18,11 2,45 2,20 43,08 65,05 (1)

1 / 500x 25,55 2,00 18,59 2,36 2,18 42,66 64,57 (2)

G 5 x (1) 25,74 1,95 17,58 2,37 2,08 43,04 63,68 5 x (2) 25,79 1,89 16,83 2,51 2,04 43,69 63,67 1x (1) 26,01 1,90 16,69 2,52 2,08 43,42 64,95 1x (2) 25,71 1,91 16,74 2,57 1,98 43,85 65,37 1 / 2x (1) 25,47 1,93 17,14 2,52 1,97 43,69 64,28 1 / 2x (2) 25,68 1,95 17,80 2,42 1,94 42,76 64,15 1/5 x (1) 25,63 1,94 17,43 2,46 2,02 43,21 63,70 1/5 x (2) 25,86 1,91 17,03 2,47 2,04 43,16 64,14 1/10 x (1) 26,34 1,95 17,09 2,48 2,14 42,35 63,27 1/10 x (2) 26,24 1,93 16,79 2,52 2,04 42,93 64,71 1 / 20x 25,47 1,97 18,06 2,37 2,12 42,62 63,38 (1)

1 / 20x 25,38 1,98 18,16 2,40 1,95 42,73 62,81 (2)

1/50 x (1) 25,46 1,94 18,06 2,37 2,02 42,72 63,38 1/50 x (2) 25,50 1,94 17,46 2,48 2,04 43,15 63,66 1/100 x 25,52 1,92 16,69 2,60 1,81 44,16 65,74 (1)

1/100 x 25,96 1,92 17,11 2,48 1,98 43,00 63,89 (2)

1 / 500x 25,71 1,95 17,78 2,41 1,97 42,83 64,61 (1)

1 / 500x 25,56 2,02 18,25 2,37 1,90 42,63 64,80 (2)

H 1150Dx 25,19 2,03 19,36 2,14 2,02 41,86 65,21

(1)

1 / 500x 25,41 1,94 17,85 2,37 1,83 43,31 65,75 (2)

0x (1) 21,45 2,62 27,54 1,31 2,50 35,78 67,83 0x (2) 21,79 2,63 27,33 1,30 2,51 35,66 67,07 I 1 / 500x 25,21 2,02 19,89 2,15 2,10 41,48 64,17

(1)

1 / 500x 25,00 2,02 20,00 2,11 2,09 41,63 64,04 (2)

0x (1) 21,82 2,62 28,55 1,20 2,61 34,16 67,22 0x (2) 21,66 2,64 28,83 1,18 2,55 34,20 66,93 J 1 / 500x 24,44 1,81 16,75 2,49 2,22 45,20 63,43

(1)

1 / 500x 24,34 1,82 17,73 2,39 1,95 44,71 63,88 (2)

0x (1) 21,56 2,58 28,98 1,30 2,60 36,04 66,74 0x (2) 21,53 2,61 27,30 1,31 2,43 35,96 65,71 K 1 / 500x 23,87 1,82 17,33 2,48 2,00 45,45 64,67

(1)

1 / 500x 24,07 1,82 17,67 2,42 1,93 45,06 64,30 (2)

0x (1) 21,77 2,63 26,13 1,39 2,81 36,49 68,14 ____ 0x(2)___ 21,91 2,63 27,19 1,29 2,63 35,60 66,81 Conjunto de MUESTRA (g/L) mg/g Rendimiento (g/L) (g/L) g de B12/g g/L experimentos Rendimiento EPA de DHA mg/g LFDW de LFDW de EPA de grasa DHA

A 5 x (1) 0,53 107,64 1,39 291,68 1,62 0,0024 3,32

5 x (2) 0,50 105,83 1,28 282,95 1,60 0,0024 3,11 1x (1) 0,49 105,99 1,26 282,93 1,56 0,00049 3,06 1x (2) 0,47 106,77 1,17 275,34 1,52 0,00051 2,88 1 / 2x (1) 0,47 107,06 1,17 275,98 1,52 0,00025 2,88 1 / 2x (2) 0,51 110,04 1,26 283,39 1,55 0,00025 3,09 1/5 x (1) 0,50 108,74. 1,28 284,18 1,54 0,00010 3,07 1/5 x (2) 0,48 105,63 1,22 282,95 1,52 0,00010 2,98 1/10 x (1) 0,48 106,01 1,20 275,47 1,58 0,000049 2,94 1/10 x (2) 0,48 105,07 1,22 278,58 1,57 0,000049 2,97 1 / 20x (1) 0,48 107,36 1,19 276,71 1,54 0,000025 2,95 1 / 20x (2) 0,51 108,87 1,26 282,24 1,57 0,000024 3,08 1/50 x (1) 0,48 109,67 1,16 278,77 1,47 0,000010 2,86 1/50 x (2) 0,48 106,19 1,19 275,96 1,58 0,000010 2,93 1/100 x (1) 0,50 106,81 1,27 283,69 1,57 0,0000049 3,07 1/100 x (2) 0,50 104,11 1,34 288,86 1,61 0,0000048 3,21 1 / 500x 0,50 104,68 1,35 290,83 1,59 0,00000094 3,23 (1)

1 / 500x 0,51 109,46 1,23 274,01 1,64 0,00000091 3,04 (2)

B 5 x (1) 0,49 105,34 1,26 279,16 1,66 0,0023 2,97

5 x (2) 0,48 99,71 1,29 273,81 1,81 0,0021 3,02 1x (1) 0,48 101,34 1,27 274,22 1,77 0,00044 3,00 1x (2) 0,49 103,10 1,26 274,39 1,74 0,00044 2,98 1 / 2x (1) 0,52 102,99 1,39 286,04 1,76 0,00022 3,24 1 / 2x (2) 0,51 105,75 1,30 276,38 1,76 0,00022 3,06 1/5 x (1) 0,48 101,38 1,24 269,37 1,80 0,000083 2,94 1/5 x (2) 0,48 104,41 1,25 277,49 1,67 0,000090 2,95 1/10 x (1) 0,45 98,98 1,20 272,75 1,71 0,000045 2,84 1/10 x (2) 0,48 99,38 1,31 277,29 1,80 0,000043 3,08 1 / 20x (1) 0,47 100,10 1,25 276,16 1,72 0,000022 2,94 1 / 20x (2) 0,48 103,06 1,26 280,15 1,68 0,000023 2,97 1/50 x (1) 0,48 103,67 1,22 269,42 1,76 0,0000085 2,91 1/50 x (2) 0,47 99,90 1,25 274,84 1,74 0,0006086 2,93 1/100 x (1) 0,46 98,77 1,20 267,53 1,77 0,0000043 2,86 1/100 x (2) 0,48 101,29 1,27 278,11 1,71 0,0000045 2,99 1 / 500x 0,43 104,49 1,04 258,03 1,63 0,00000092 2,53 (1)

1 / 500x 0,47 107,03 1,11 262,14 1,67 0,00000090 2,68 (2)

C 5 x (1) 0,52 108,25 1,37 292,82 1,57 0,0025 3,22

5 x (2) 0,49 106,70 1,29 287,91 1,53 0,0025 3,06 1x (1) 0,51 106,88 1,36 289,31 1,59 0,00048 3,23 1x (2) 0,52 108,67 1,31 284,09 1,60 0,00048 3,15 1 / 2x (1) 0,44 114,02 1,00 268,13 1,35 0,00028 2,48 1 / 2x (2) 0,49 113,61 1,15 275,95 1,46 0,00026 2,82 1/5 x (1) 0,50 115,85 1,19 281,94 1,44 0,00010 2,89 1/5 x (2) 0,50 112,29 1,21 279,43 1,52 0,00010 2,93 1/10 x (1) 0,48 110,70 1,17 277,71 1,50 0,000051 2,85 1/10 x (2) 0,48 110,39 1,20 281,73 1,50 0,000051 2,89 1 / 20x (1) 0,45 112,23 1,08 273,88 1,41 0,000027 2,62 1 / 20x (2) 0,45 119,57 0,95 262,65 1,33 0,000029 2,39 1/50 x (1) 0,49 112,42 1,21 282,97 1,49 0,000010 2,91 1/50 x (2) 0,50 111,40 1,23 280,41 1,53 0,000010 2,96 1/100 x (1) 0,51 109,40 1,25 278,02 1,61 0,0000048 3,02 1/100 x (2) 0,51 111,08 1,29 286,49 1,53 0,0000050 3,09 1 / 500x 0,55 114,30 1,29 276,88 1,65 0,00000091 3,15 (1)

1 / 500x 0,56 118,05 1,27 - 276,25 1,61 0,00000093 3,11 (2)

D 5 x (1) 0,55 107,16 1,48 296,16 1,69 0,0023 3,44

5 x (2) 0,53 108,39 1,38 291,37 1,62 0,0024 3,24 1x (1) 0,52 110,03 1,33 288,89 1,59 0,00048 3,13 1x (2) 0,50 108,83 1,29 290,26 1,54 0,00050 3,03 1 / 2x (1) 0,51 112,05 1,23 281,00 1,57 0,00024 2,94 1 / 2x (2) 0,51 117,67 1,20 284,69 1,45 0,00026 2,89 1/5 x (1) 0,53 116,92 1,28 285,74 1,51 0,00010 3,03 1/5 x (2) 0,55 110,50 1,42 290,20 1,67 0,000090 3,34 1/10 x (1) 0,54 112,52 1,34 285,20 1,64 0,000047 3,19 1/10 x (2) 0,53 111,48 1,36 291,77 1,58 0,000049 3,19 1 / 20x (1) 0,54 112,02 1,34 285,86 1,63 0,000023 3,17 1 / 20x (2) 0,52 117,18 1,21 278,32 1,55 0,000025 2,91 1/50 x (1) 0,54 111,32 1,37 292,53 1,59 0,0000094 3,22 1/50 x (2) 0,52 110,19 1,29 283,91 1,62 0,0000093 3,06 1/100 x (1) 0,52 111,21 1,30 286,73 1,59 0,0000048 3,08 1 / 100x 0,51 109,75 1,31 287,74 1,59 0,0000048 3,07 1 / 500x 0,60 119,41 1,38 283,11 1,69 0,00000089 3,31 (1)

1 / 500x 0,59 118,98 1,37 281,74 1,70 0,00000088 3,27 (2)

E 5 x (1) 0,53 105,94 1,43 294,23 1,69 0,0023 3,29

5 x (2) 0,46 102,13 1,22 281,16 1,63 0,0024 2,84 1x (1) 0,49 104,07 1,32 289,48 1,62 0,00048 3,06 1x (2) 0,53 104,97 1,47 301,01 1,63 0,00047 3,37 1 / 2x (1) 0,50 110,46 1,25 284,65 1,58 0,00024 2,94 1 / 2x (2) 0,51 112,01 1,26 284,34 1,60 0,00024 2,97 1/5 x (1) 0,51 109,31 1,32 291,38 1,60 0,000094 3,06 1/5 x (2) 0,48 106,13 1,24 281,31 1,65 0,000091 2,89 1/10 x (1) 0,50 105,82 1,30 283,74 1,68 0,000046 3,04 1/10 x (2) 0,48 104,57 1,29 286,39 1,64 0,000047 2,98 1 / 20x (1) 0,55 110,12 1,41 292,12 1,69 0,000022 3,28 1 / 20x (2) 0,57 113,13 1,43 293,02 1,70 0,000022 3,32 1/50 x (1) 0,54 106,44 1,45 294,03 1,76 0,0000085 3,31 1/50 x (2) 0,54: 107,21 1,44 295,14 1,72 0,0000087 3,29 1/100 x (1) 0,55 104,88 1,46 288,40 1,88 0,0000041 3,33 1/100 x (2) 0,55 109,40 1,44 291,26 1,76 0,0000044 3,30 1 / 500x 0,59 113,27 1,50 296,97 1,76 0,00000085 3,43 (1)

1 / 500x 0,66 115,09 1,62 291,79 1,97 0,00000076 3,73 (2)

F 5 x (1) 0,60 114,57 1,49 292,02 1,80 0,00212779 3,42

5 x (2) 0,55 113,41 1,40 294,25 1,67 0,00229687 3,20 1x (1) 0,55 110,28 1,45 297,11 1,70 0,00045415 3,30 1x (2) 0,54 112,21 1,36 290,41 1,66 0,00046376 3,13 1 / 2x (1) 0,54 118,20 1,27 285,84 1,58 0,00024017 2,97 1 / 2x (2) 0,55 121,79 1,26 286,25 1,54 0,00024686 2,95 1/5 x (1) 0,58 115,91 1,43 294,66 1,70 0,00008801 3,28 1/5 x (2) 0,56 114,29 1,42 296,75 1,67 0,00008979 3,23 1/10 x (1) 0,52 115,79 1,21 278,51 1,60 0,00004803 2,86 1/10 x (2) 0,56 114,86 1,38 291,97 1,67 0,00004619 3,17 1 / 20x (1) 0,55 117,21 1,31 286,75 1,63 0,00002328 3,06 1 / 20x (2) 0,57 121,84 1,33 289,39 1,60 0,00002381 3,11 1/50 x (1) 0,58 116,45 1,45 299,69 1,67 0,00000901 3,29 1/50 x (2) 0,56 115,90 1,40 295,17 1,66 0,00000904 3,21 1/100 x (1) 0,55 111,13 1,44 296,95 1,72 0,00000448 3,25 1/100 x (2) 0,54 113,25 1,36 292,35 1,66 0,00000463 3,11 1 / 500x 0,60 117,81 1,43 286,97 1,78 0,00000084 3,31 (1)

1 / 500x 0,63 120,03 1,45 282,05 1,86 0,00000080 3,40 (2)

G 5 x (1) 0,55 111,96 1,35 279,27 1,78 0,00215168 3,13

5 x (2) 0,55 107,14 1,42 283,43 1,85 0,00207251 3,25 1x (1) 0,54 108,42 1,41 287: 1,75 0,00043883 3,25

31

1x (2) 0,57 109,44 1,50 292,04 1,81 0,00042495 3,42 1 / 2x (1) 0,57 110,17 1,45 286,10 1,85 0,00020558 3,33 1 / 2x (2) 0,58 114,19 1,39 279,49 1,82 0,00020874 3,26 1/5 x (1) 0,57 111,03 1,41 280,46 1,86 0,00008062 3,27

Claims (9)

REIVINDICACIONES

1. Un método de producir un aceite, comprendiendo el método:

preparar una biomasa de acuerdo con un método para incrementar la concentración de EPA en una biomasa de un microorganismo que tiene ácidos grasos y una concentración de EPA, que comprende:

(a) fermentar el microorganismo en un recipiente fermentador para producir una biomasa; y

(b) proporcionar una presión sobre la biomasa superior o igual a 3447,4 Pa (0,5 psi) por encima de la presión atmosférica durante un tiempo suficiente para aumentar la concentración de EPA en la biomasa;

y obtener el aceite a partir de la biomasa, en el que dicho microorganismo es un traustocítrido, en el que opcionalmente el aceite se extrae de la biomasa.

2. El método de la reivindicación 1, en el que el recipiente tiene una presión de cabeza de aproximadamente 2757,9 Pa (0,4 psi) a aproximadamente 206842,7 Pa (30 psi), opcionalmente de aproximadamente 6894,8 Pa (1 psi) a aproximadamente 206842,7 Pa (30 psi), opcionalmente de aproximadamente 6894,8 Pa (1 psi) a aproximadamente 137895,1 Pa (20 psi).

3. El método de la reivindicación 1, en el que la presión se proporciona hasta aproximadamente 120 horas.

4. El método de una cualquiera de las reivindicaciones 1-3, en el que el aceite comprende ácidos grasos, en donde los ácidos grasos comprenden, además, ácidos grasos omega-3 poliinsaturados, en donde los ácidos grasos omega-3 poliinsaturados comprenden DHA y EPA en una cantidad de aproximadamente > 90%, en peso, de la cantidad total de ácidos grasos omega-3 poliinsaturados y la cantidad de EPA, en peso, es de aproximadamente 6% a aproximadamente 65% la cantidad total de EPA y DHA, opcionalmente en donde la biomasa se produce de un microorganismo aislado depositado en la ATCC bajo el N° Acceso PTA-10208.

5. El método de la reivindicación 4, en el que la cantidad de EPA, en peso, es (i) de aproximadamente 6% a aproximadamente 28% de la cantidad total de EPA y DHA; (ii) de aproximadamente 36% a aproximadamente 65 de la cantidad total de EPA y DHA; o (iii) de aproximadamente 28% a aproximadamente 36% de la cantidad total de EPA y DHA.

6. El método de cualquier reivindicación precedente, en el que dicho aceite microbiano es un aceite bruto extraído de la biomasa sin procesamiento adicional o un aceite refinado.

7. Un método, que comprende producir un aceite microbiano mediante el procedimiento de una cualquiera de las reivindicaciones 1-6 e incorporar el aceite microbiano en un producto alimenticio.

8. El método de la reivindicación 7, en el que dicho producto alimenticio es un alimento o complemento alimenticio.

9. El método de la reivindicación 8, en el que dicho alimento es un alimento para animales, opcionalmente un alimento para acuicultura.