KR20190082331A

KR20190082331A - 에이코사펜타엔산-생산 미생물, 지방산 조성물, 및 이의 생산 방법 및 용도

Info

Publication number: KR20190082331A
Application number: KR1020197019037A
Authority: KR
Inventors: 조제 알 가르시아; 3세 조셉 더블유 파이퍼; 존 밀톤 한센; 시아오 다니엘 동; 폴 와렌 베렌스; 커크 이 앱트
Original assignee: 디에스엠 아이피 어셋츠 비.브이.
Priority date: 2011-07-21
Filing date: 2012-07-20
Publication date: 2019-07-09
Also published as: US20130172590A1; US20150223492A1; MX351174B; MY169454A; JP7134938B2; CA2842374C; IL230500A0; BR112014001443A2; NZ712497A; BR122015020130A2; SG10201605966TA; EA201400151A1; HK1198545A1; EP3050972A3; EP3050972A2; CN105255738A; MX2014000759A; AU2012285803B2; EP2734630B1; NZ710646A

Abstract

본 발명은 단리된 미생물, 및 이의 균주 및 돌연변이체, 바이오매스, 미생물 오일, 조성물 및 배양물; 상기 미생물 오일, 바이오매스 및 돌연변이체를 생산하는 방법; 및 단리된 미생물, 바이오매스 및 미생물 오일을 사용하는 방법에 관한 것이다.

Description

에이코사펜타엔산-생산 미생물, 지방산 조성물, 및 이의 생산 방법 및 용도{EICOSAPENTAENOIC ACID-PRODUCING MICROORGANISMS, FATTY ACID COMPOSITIONS, AND METHODS OF MAKING AND USES THEREOF}

본 발명은 단리된 미생물, 및 이의 균주 및 돌연변이체, 바이오매스(biomass), 미생물 오일, 조성물 및 배양물; 상기 미생물 오일, 바이오매스 및 돌연변이체를 생산하는 방법; 및 단리된 미생물, 바이오매스 및 미생물 오일을 사용하는 방법에 관한 것이다.

지방산은 탄소 쇄의 길이 및 포화 특성을 기초로 하여 분류된다. 지방산은 쇄에 존재하는 탄소수에 기초하여 단쇄, 중쇄 또는 장쇄 지방산으로 명명되고, 이중 결합이 탄소 원자들 사이에 존재하지 않는 경우에 포화 지방산으로 명명되며, 이중 결합이 존재하는 경우에 불포화 지방산으로 명명된다. 불포화 장쇄 지방산은, 단지 하나의 이중 결합이 존재하는 경우에 일불포화되고, 하나 초과의 이중 결합이 존재하는 경우에 다중불포화된다.

다중불포화된 지방산(PUFA)은 지방산의 메틸 말단으로부터 첫 번째 이중 결합의 위치를 기초로 하여 분류되며, 오메가-3(n-3) 지방산은 세 번째 탄소에서 제1 이중 결합을 함유하는 반면, 오메가-6(n-6) 지방산은 여섯 번째 탄소에서 제1 이중 결합을 함유한다. 예를 들면, 도코사헥사엔산("DHA")은, 쇄 길이가 22개 탄소이고 6개의 이중 결합을 갖는, 흔히 "22:6 n-3"으로 지정되는 오메가-3 장쇄 다중불포화 지방산(LC-PUFA)이다. 다른 오메가-3 LC-PUFA는 "20:5 n-3"으로 지정된 에이코사펜타엔산("EPA"), 및 "22:5 n-3"으로 지정된 오메가-3 도코사펜타엔산("DPA n-3")을 포함한다. DHA 및 EPA는 "필수" 지방산으로 명명된다. 오메가-6 LC-PUFA는 "20:4 n-6"으로 지정된 아라키돈산("ARA") 및 "22:5 n-6"으로 지정된 오메가-6 도코사펜타엔산("DPA n-6")을 포함한다.

오메가-3 지방산은 세포막내 이들의 존재로 인하여 세포 생리학에 영향을 미치며, 생물학적 활성 화합물의 생산 및 유전자 발현을 조절하고, 생합성 기질(substrate)로서 사용되는 생물학적으로 중요한 분자이다(문헌[Roche, H. M., Proc. Nutr. Soc. 58: 397-401 (1999)]). 예를 들면, 인간 대뇌 피질속 지질의 약 15 내지 20%, 망막 속 지질의 30 내지 60%를 차지하는 DHA는 고환 및 정자속에서 농축되며, 모유의 중요한 성분이다(문헌[Berge, J.P., and Barnathan, G.. Adv. Biochem. Eng. Biotechnol. 96:49-125 (2005)]). DHA는 뇌속 오메가-3 지방산의 97% 이하 및 망막내 오메가-3 지방산의 93% 이하를 차지한다. 또한, DHA는 태아 및 유아 발달 둘다뿐만 아니라, 성인에서 인지 기능의 유지에도 필수적이다(상기 문헌 참조). 오메가-3 지방산은 인간 체내에서 새로이 합성되지 않으므로, 이들 지방산은 영양원으로부터 유도되어야만 한다.

아마씨유(flaxseed oil) 및 어유(fish oil)는 오메가-3 지방산의 우수한 식이원으로 고려된다. 아마씨유는 EPA, DHA, DPA 또는 ARA를 함유하지 않지만 오히려 체내에서 EPA를 제조할 수 있도록 하는 구성 요소(building block)인 리놀렌산(C18:3 n-3)을 함유한다. 그러나, 대사 전환율은, 특히 건강이 악화된 인간들중에서 느리고 가변적일 수 있다는 증거가 존재한다. 어유는 특수한 종 및 이들의 식이에 따라 지방산 조성의 유형 및 수준이 상당히 변한다. 예를 들면, 양식에 의해 길러낸 어류는 야생의 것보다 더 낮은 수준의 오메가-3 지방산을 갖는 경향이 있다. 더욱이, 어유는 환경 오염 물질을 함유할 위험성을 수반하며 안정성 문제 및 비린내 또는 맛과 관련될 수 있다.

트라우스토키트리드(Thraustochytrid)는 트라우스토키트리알레스(Thraustochytriales) 목의 미생물이다. 트라우스토키트리드는 쉬조키트리움(Schizochytrium) 및 트라우스토키트리움(Thraustochytrium) 속의 구성원들을 포함하며 DHA 및 EPA를 포함하는 오메가-3 지방산의 대체 공급원으로서 인식되어 왔다(미국 특허 제5,130,242호 참고). 이러한 해양 종속영양성 미생물로부터 생산된 오일은 흔히 상응하는 어유 또는 미세조류 오일보다 더 단순한 다중불포화 지방산 프로파일을 갖는다(문헌[Lewis, T.E., Mar. Biotechnol. 1: 580-587 (1999)]). 트라우스토키트리드 종의 균주는 유기체에 의해 생산된 총 지방산의 높은 백분율로 오메가-3 지방산을 생산하는 것으로 보고되어 있다(미국 특허 제5,130,242호; 문헌[Huang, J. et al., J. Am. Oil. Chem. Soc. 78: 605-610 (2001); Huang, J. et al., Mar. Biotechnol. 5: 450-457 (2003)]). 그러나, 단리된 트라우스토키트리드는 생산된 LC-PUFA의 동일성 및 양에 있어서 다양하여, 일부 앞서 기술된 균주는 바람직하지 않은 수준의 오메가-6 지방산을 가질 수 있고/있거나 배양 시 낮은 생산성을 입증할 수 있다. 이에, 높은 생산성 및 바람직한 LC-PUFA 프로파일이 입증된 미생물의 단리가 지속적으로 요구되고 있다.

본 출원인은 3% 이상의 EPA를 갖는 바이오매스를 생산하는 트라우스토키트리드에 의해 생산된 EPA 및 DHA의 양이 미생물의 발효 동안의 발효 부용(broth)의 수성 상중의 용존 이산화 탄소(CO₂)의 양을 변화시킴으로써 조절될 수 있음을 발견하였다. 지방산의 총 중량을 기준으로 3% 이상의 EPA를 갖는 바이오매스를 생산하는 트라우스토키트리드를 포함하는 미생물을 발효 부용중의 용존 기체를 갖는 발효조 용기에서 발효시켜 바이오매스를 생산하는 단계; 및 (b) 용존 기체중의 용존 CO₂ 수준을 조정하는 단계를 포함하는, 지방산 및 소정 농도의 EPA를 갖는 미생물의 바이오매스의 생산 방법이 본원에 제공된다. 한 양태에서, 용존 CO₂ 수준을 조정하여 바이오매스중의 목적 EPA 및/또는 DHA 수준을 달성할 수 있다. 추가 양태에서, 발효 부용의 수성 상중의 용존 CO₂의 양은 총 용존 기체의 약 38 내지 약 600ppm, 특히 총 용존 기체의 약 38 내지 약 135ppm이다.

또한, 지방산의 총 중량을 기준으로 3% 이상의 EPA를 갖는 바이오매스를 생산하는 트라우스토키트리드를 포함하는 미생물을 기체를 포함하는 발효조 용기에서 발효시켜 바이오매스를 생산하는 단계; 및 C0₂를 기체에 보충하는 단계를 포함하는, 지방산 및 소정 농도의 EPA를 갖는 미생물의 바이오매스의 생산 방법이 본원에 제공된다. 보충은 CO₂를 세포의 발효에 의해 생산된 양에 부가적인 양 또는 대기 조건하의 양으로 용기에 첨가하거나 용기를 충전함을 의미한다. 한 양태에서, C0₂가 용기에 보충되어 바이오매스중의 목적 EPA 및/또는 DHA 양을 달성한다.

지방산의 총 중량을 기준으로 3% 이상의 EPA를 갖는 바이오매스를 생산하는 트라우스토키트리드를 포함하는 미생물을 발효조 용기에서 발효시켜 바이오매스를 생산하는 단계; 및 용기내의 바이오매스의 양을 조정하는 단계를 포함하는, 지방산 및 소정 농도의 EPA를 갖는 미생물의 바이오매스의 생산 방법이 또한 본원에 제공된다. 본 발명의 양태에서, 바이오매스를 조정하여 바이오매스중의 목적 EPA 또는 DHA 수준을 달성한다.

지방산의 총 중량을 기준으로 3% 이상의 EPA를 갖는 바이오매스를 생산하는 트라우스토키트리드를 포함하는 미생물을 발효조 용기에서 발효시켜 바이오매스를 생산하는 단계; 및, 예를 들어, 비제한적으로 용기의 배압을 조절하여 바이오매스에 대한 압력을 조정하는 단계를 포함하는, 지방산 및 소정 농도의 EPA를 갖는 미생물의 생산 방법이 본원에 제공된다. 한 양태에서, 압력을 조정하여 바이오매스중의 목적 EPA 또는 DHA 수준을 달성한다.

다른 양태에서, 지방산의 총 중량을 기준으로 3% 이상의 EPA를 갖는 바이오매스를 생산하는 트라우스토키트리드를 포함하는 미생물을 발효조 용기에서 발효시켜 발효 부용 및 바이오매스를 생산하는 단계; 및 부용중의 온도를 조정하는 단계를 포함하는, 지방산 및 소정 농도의 EPA를 갖는 미생물의 생산 방법이 본원에 제공된다. 한 양태에서, 온도를 조정하여 바이오매스중의 목적 EPA 및/또는 DHA 수준을 달성한다.

다양한 양태에서, EPA 및 DHA의 양은 용기내의 C0₂의 양을 증가시키거나 감소시킴으로써 용기의 수성 상 또는 발효 부용중의 용존 CO₂의 양을 조정함으로써 조절될 수 있다. 용존 C0₂의 양은 발효된 바이오매스의 양을, 예를 들어 세포를 플라스크 및 보다 큰 발효 용기에서 발효시킴으로써, 추가적으로 조정함으로써 조정될 수 있다. EPA 및 DHA는 또한 온도를 변화시킴으로써 본원에 제공된 양태에 따라 변할 수 있다. 용존 C0₂의 양은, 예를 들어 용기내의 온도를 조정함으로써, 추가적으로 조정될 수 있다. 예를 들어, 보다 낮은 용기 온도는 보다 높은 EPA의 농도 및 보다 낮은 DHA의 농도를 생성할 것이다. 용존 C0₂의 양은 용기내의 압력을 조정함으로써 더욱 조정될 수 있다. 예를 들어, 압력의 증가는 아마도 용존 CO₂를 증가시키고, 이는 바이오매스중의 EPA의 양을 증가시키고 DHA의 양을 감소시킬 것이다. 각각의 상기 조정, 예컨대 보충된 CO₂, 바이오매스의 증가 또는 감소, 온도의 증가 또는 감소, 또는 압력의 증가 또는 감소는 각각 임의의 다른 조정과 조합되어 바이오매스 및 바이오매스로부터 추출된 임의의 오일중의 목적 EPA 및 DHA 수준을 달성할 수 있다. 용존 CO₂는 또한 pH를 변화시킴으로써 조정될 수 있다.

일부 양태에서, EPA 및 DHA의 총 중량은 지방산 및 오메가-3 지방산의 총 중량의 양(중량 단위)에 비해 비교적 일정하게 유지된다.

추가 양태에서, 바이오매스의 EPA 또는 DHA 함량은 보충된 CO₂, 압력, 온도 또는 바이오매스의 양을 조정하기 전에 측정된다.

임의의 이론에 얽매이려는 것은 아니지만, EPA 또는 DHA의 양의 증가 및 감소가 발효 부용의 수성 상내의 용존 C0₂의 양과 직접적으로 관련되고, CO₂, 압력 및 온도의 상기 조정이 바이오매스중의 용존 C0₂의 양을 변화시키는 것이 가정된다.

일부 양태에서, 본 발명은 미생물을 0.1mg/L 미만의 비타민 B12를 포함하는 배지에서 성장시켜 바이오매스를 생산하는 단계를 포함하는, 증가된 농도의 EPA를 갖는 미생물의 바이오매스의 생산 방법을 제공한다. 일부 양태에서, 배지는 0.01mg/L 미만의 비타민 B12를 포함한다. 일부 양태에서, 배지는 0.001mg/L 미만의 비타민 B12를 포함한다. 추가 양태에서, 배지는 0.0001mg/L 미만의 비타민 B12를 포함한다. 일부 양태에서, 배지는 비타민 B12를 전혀 함유하지 않는다.

일부 양태에서, 배지는 지질-부재 바이오매스 50g 당 1g 미만의 효모 추출물을 추가로 포함한다. 일부 양태에서, 배지는 지질-부재 바이오매스 50g 당 0.5g 미만의 효모 추출물을 추가로 포함한다. 추가 양태에서, 배지는 지질-부재 바이오매스 50g 당 0.1g 미만의 효모 추출물을 추가로 포함한다.

일부 양태에서, EPA 농도는 0.1mg/L 초과의 비타민 B12를 포함하는 배지에서 성장한 미생물로부터 수득한 바이오매스중의 EPA 농도에 비해 400% 이상만큼 증가한다. 일부 양태에서, EPA 농도는 0.01mg/L 초과의 비타민 B12를 포함하는 배지에서 성장한 미생물로부터의 바이오매스중의 EPA 농도에 비해 300% 이상만큼 증가한다. 추가 양태에서, EPA 농도는 0.001mg/L 초과의 비타민 B12를 포함하는 배지에서 성장한 미생물로부터의 바이오매스중의 EPA 농도에 비해 200% 이상만큼 증가한다. 일부 양태에서, EPA 농도는 0.0001mg/L 초과의 비타민 B12를 포함하는 배지에서 성장한 미생물로부터의 바이오매스중의 EPA 농도에 비해 100% 이상만큼 증가한다.

일부 양태에서, 본 발명은 0.1mg/L 미만의 코발트를 포함하는 배지에서 성장시켜 바이오매스를 생산하는 단계를 포함하는, 증가된 농도의 EPA를 갖는 미생물의 바이오매스의 생산 방법을 제공한다. 일부 양태에서, 배지는 0.01mg/L 미만의 코발트를 포함한다. 일부 양태에서, 배지는 0.001mg/L 미만의 코발트를 포함한다. 추가 양태에서, 배지는 0.0001mg/L 미만의 코발트를 포함한다. 일부 양태에서, 배지는 코발트를 전혀 함유하지 않는다.

일부 양태에서, 미생물은 트라우스토키트리드이다. 일부 양태에서, 미생물은 지방산의 총 중량의 3% 이상의 EPA를 생산한다.

일부 양태에서, 배지는 5% 이상의 용존 CO₂ 수준을 갖는다. 추가 양태에서, 배지는 10% 이상의 용존 CO₂ 수준을 갖는다. 일부 양태에서, 배지는 15% 이상의 용존 CO₂ 수준을 갖는다.

본 발명은 또한 단리된 바이오매스, 및 본원의 임의의 방법의 바이오매스로부터 추출된 미생물 오일을 제공한다.

본 발명의 다양한 양태는 본원의 일부를 형성하는 하기 상세한 설명, 도면 및 첨부된 서열목록으로부터 더욱 완전히 이해될 수 있다.
도 1은 티아민 구배에서 PTA-9695의 성능을 나타낸다.
도 2는 비타민 B12 구배에서 PTA-9695의 성능을 나타낸다.
도 3은 바이오틴 구배에서 PTA-9695의 성능을 나타낸다.
도 4는 Ca-판토테네이트 구배에서 PTA-9695의 성능을 나타낸다.
도 5는 TSFM 표준에서 PTA-9695의 성능을 나타낸다.
도 6 내지 도 19는 10% CO₂하에 비타민 B12 구배에서 PTA-9695의 성능을 나타낸다.
도 20 내지 49는 10% CO₂하에 비타민 B12 구배에서 PTA-10208의 성능을 나타낸다.

본원에 제공된 방법 및 조성물은 생산되는 지방산의 총 중량의 3% 이상의 EPA를 갖는 바이오매스를 생산하는 트라우스토키트리드에 특히 적용가능하다. 본원에 제공된 3% 이상의 EPA를 갖는 바이오매스를 생산하는 특정 트라우스토키트리드는 ATCC 수탁번호 PTA-10212로 기탁된 종의 단리된 미생물이다. ATCC 수탁번호 PTA-10212와 관련된 단리된 미생물은 2009년 7월 14일자로 부다페스트 조약하에 미국 버지니아주 20110-2209 마나사스 유니버시티 불러바드 10801에 소재하는 아메리칸 타입 컬쳐 컬렉션(American Type Culture Collection)(특허 기탁소)에 기탁되었다.

3% 이상의 EPA를 갖는 바이오매스를 생산하는 특정 트라우스토키트리드는 ATCC 수탁번호 PTA-10212, PTA-10213, PTA-10214, PTA-10215, PTA-10208, PTA-10209, PTA-10210 또는 PTA-10211로 기탁된 단리된 미생물로부터 선택된다.

본원에 제공된 특정 양태는 서열번호 1의 폴리뉴클레오티드 서열 또는 서열번호 1과의 동일성이 94% 이상인 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하는 18s rRNA를 포함하는 단리된 미생물에 관한 것이다.

본원에 제공된 특정 양태는 ATCC 수탁번호 PTA-10212로 기탁된 미생물의 18s rRNA 폴리뉴클레오티드 서열과의 동일성이 94% 이상인 18s rRNA 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하는 단리된 미생물에 관한 것이다.

본원에 제공된 3% 이상의 EPA를 갖는 바이오매스를 생산하는 특정 트라우스토키트리드는 ATCC 수탁번호 PTA-10208로 기탁된 종의 단리된 미생물에 관한 것이다.

본원에 제공된 특정 양태는 ATCC 수탁번호 PTA-10208로 기탁된 종의 단리된 미생물로서, 상기 미생물에 의해 생산된 총 지방산이 약 10중량% 초과의 에이코사펜타엔산을 포함하는, 단리된 미생물에 관한 것이다.

본 발명의 3% 이상의 EPA를 갖는 바이오매스를 생산하는 특정 트라우스토키트리드는 ATCC 수탁번호 PTA-10208로 기탁된 종의 특성을 갖는 단리된 미생물로서, 상기 미생물에 의해 생산된 총 지방산이 약 10중량% 초과의 에이코사펜타엔산을 포함하는, 단리된 미생물에 관한 것이다. 본원에 제공된 3% 이상의 EPA를 갖는 바이오매스를 생산하는 특정 트라우스토키트리드는 ATCC 수탁번호 PTA-10209, PTA-10210 또는 PTA-10211로 기탁된 돌연변이체 균주로부터 선택된 단리된 미생물로부터 선택된다. ATCC 수탁번호 PTA-10209, PTA-10210 및 PTA-10211과 관련된 미생물이 2009년 9월 25일자로 부다페스트 조약하에 미국 버지니아주 20110-2209 마나사스 유니버시티 불러바드 10801에 소재하는 아메리칸 타입 컬쳐 컬렉션(특허 기탁소)에 기탁되었다.

본원에 제공된 양태는 상기 미생물, 이의 돌연변이체 균주, 및 이의 전체내용이 본원에 참고로서 혼입된 미국 특허출원 제12/729,013호에서 확인된 미생물에 관한 것이다.

본원에 제공된 양태는 트라이아실글리세롤 분획을 생산하는 단리된 미생물로서, 상기 트라이아실글리세롤 분획의 에이코사펜타엔산 함량이 약 12중량% 이상인 단리된 미생물에 관한 것이다.

본원에 제공된 양태는, 단리된 바이오매스로서, 상기 바이오매스의 건조 세포중의 약 20중량% 이상이 지방산이고, 상기 지방산의 약 10중량% 초과가 에이코사펜타엔산이고, 상기 지방산이 각각 약 5중량% 미만의 아라키돈산 및 도코사펜타엔산 n-6을 포함하는 단리된 바이오매스에 관한 것이다. 일부 양태에서, 지방산의 약 25중량% 이상은 도코사헥사엔산이다.

일부 양태에서, 본 발명은 트라이아실글리세롤을 포함하는 단리된 바이오매스로서, 트라이아실글리세롤의 약 12중량% 이상이 에이코사펜타엔산인 단리된 바이오매스에 관한 것이다.

일부 양태에서, 본 발명은 지방산이 각각 약 5중량% 미만의 올레산, 리놀레산, 리놀렌산, 에이코센산 및 에루크산을 포함하는, 본 발명의 단리된 바이오매스에 관한 것이다.

본 발명은 ATCC 수탁번호 PTA-9695로 기탁된 트라우스토키트리드 종의 단리된 트라우스토키트리드 미생물 또는 이로부터 유도된 균주에 관한 것으로서, 상기 미생물 또는 이로부터 유도된 균주에 의해 생산된 총 지방산은 약 10중량% 이하의 에이코사펜타엔산을 포함한다. 본원에 제공된 양태는 싱기 미생물 또는 이로부터의 균주, 및 이의 전체내용이 본원에 참고로서 혼입된 미국 특허출원공개 제2010/0239533호에 기술된 다른 관련 미생물에 관한 것이다.

지방산의 총 중량을 기준으로 3% 이상의 EPA를 갖는 바이오매스를 생산하는 트라우스토키트리드를 포함하는 미생물을 기체를 포함하는 발효조 용기에서 발효시켜 바이오매스를 생산하는 단계; 및 CO₂를 바이오매스중의 EPA의 농도를 증가시키기에 충분한 양으로 상기 기체에 보충하는 단계를 포함하는, 지방산 및 소정 농도의 EPA를 갖는 미생물의 바이오매스중의 EPA의 농도를 증가시키는 방법이 또한 본원에 제공된다. EPA의 농도의 증가는, 예를 들어 CO₂가 보충되지 않은 유사하게 발효된 미생물의 EPA의 농도, 또는 대기 조건하에 유사하게 발효된 미생물의 경우와 비교될 수 있다.

다른 양태에서, EPA의 농도를 증가시키기에 충분한 CO₂의 양은 용기내의 총 기체의 2% 이상이다. 다른 양태에서, 용기내의 CO₂의 양은 용기내의 총 기체의 약 5% 이상 내지 약 20% 이하이다. 다른 양태에서, 용기내의 CO₂의 양은 용기내의 총 기체의 약 5% 이상 내지 약 15% 이하이다.

추가 양태에서, 보충된 CO₂의 양은 바이오매스중의 EPA의 농도를 지방산의 총 중량의 약 4중량% 초과, 보다 특히 지방산의 총 중량의 약 4중량% 초과 내지 약 45중량% 이하, 보다 특히 지방산의 총 중량의 약 4중량% 초과 내지 약 40중량% 이하로 증가시키기 위하여 용기내의 총 기체의 2% 이상이다.

추가 양태에서, 보충된 CO₂의 양은 EPA 수준을 지방산의 총 중량의 약 4중량%로부터 약 6 내지 30중량%까지 증가시키기에 충분하다. 다른 양태에서, 제공된 CO₂의 양은 EPA의 농도를 지방산의 총 중량의 약 15 내지 약 40중량%로 증가시키기에 충분하다. 다른 양태에서, 제공된 CO₂의 양은 EPA의 농도를 지방산의 총 중량의 20중량% 초과까지 증가시키기에 충분하다. 다른 양태에서, CO₂는 EPA의 농도를 약 20 내지 약 25중량%로 증가시키기에 충분한 양으로 제공된다.

다른 양태에서, 미생물을 발효조 용기에서 발효시켜 바이오매스를 생산하는 단계; 바이오매스중의 EPA의 농도를 증가시키기에 충분한 바이오매스에 대한 압력을 제공하는 단계를 포함하는, 지방산 및 소정 농도의 EPA를 갖는 미생물의 바이오매스중의 EPA의 농도를 증가시키는 방법이 본원에 제공된다. EPA의 농도의 증가는 압력이 제공되지 않은 유사하게 발효된 미생물의 EPA의 농도, 또는 대기 조건하에 유사하게 발효된 미생물의 경우와 비교될 수 있다. 추가 양태에서, 바이오매스에 제공된 압력은 대기압보다 약 0.5psi 높다. 다른 양태에서, 용기는 약 0.4psi 이상, 보다 특히 약 0.4 내지 약 30psi, 보다 더 특히 약 1 내지 약 30psi의 수두압(또는 배압)을 갖는다. 다른 양태에서, 용기는 약 1 내지 약 20psi의 수두압을 갖는다. 다른 양태에서, 제공된 압력은 바이오매스중의 EPA의 양을 조정하기에 충분한 시간, 특히 120시간 이하의 시간 동안 제공된다.

다른 양태에서, 발효조 용기중에서 바이오매스중의 EPA의 농도를 증가시키기에 충분한 온도에서 지방산의 총 중량을 기준으로 3% 이상의 EPA를 갖는 바이오매스를 생산하는 트라우스토키트리드를 포함하는 미생물을 발효시켜 바이오매스를 생산하는 단계를 포함하는, 지방산 및 소정 농도의 EPA를 생산하는 미생물의 바이오매스의 생산 방법이 본원에 제공된다. 일부 양태에서, EPA 수준을 증가시키기에 충분한 온도는 약 30℃ 미만, 보다 특히 약 22℃ 이하이고, 보다 특히 온도는 약 21℃ 이하이다. EPA의 농도의 증가는, 예를 들어 온도가 조정되지 않은 유사하게 발효된 미생물의 EPA의 농도, 또는 대기 조건하에 유사하게 발효된 미생물의 경우와 비교될 수 있다.

추가 양태에서, 본원에 제공된 방법은 바이오매스 및 추출된 오일을 생산하기 위한 발효중에 생성된 EPA의 양을 변화시키고, 이때 제공된 EPA의 양은 지방산의 총 중량을 기준으로 4중량% 초과, 특히 약 4중량% 초과 내지 약 45중량% 이하, 보다 특히 약 4중량% 초과 내지 약 40중량% 이하이다. 다른 양태에서, 본원에 제공된 방법에 의해 생산된 EPA의 양은 지방산의 총 중량의 약 6 내지 약 30중량%의 양이다. 추가 양태에서, 본원에 제공된 방법에 의해 생산된 EPA의 양은 지방산의 총 중량의 약 15 내지 약 40중량%의 양이다. 추가 양태에서, 본원에 제공된 방법에 의해 생산된 EPA의 양은 지방산의 총 중량의 약 20중량% 초과, 보다 특히 약 20 내지 약 25중량%의 양이다.

추가 양태에서, 제공된 목적 EPA 수준은 지방산의 총 중량의 4중량% 초과, 특히 약 4중량% 초과 내지 약 45중량% 이하, 보다 특히 약 4중량% 초과 내지 약 40중량% 이하이다. 다른 양태에서, 본원에 제공된 방법에 의해 생산된 목적 EPA 수준은 지방산의 총 중량의 약 6 내지 약 30중량%의 양이다. 추가 양태에서, 본원에 제공된 방법에 의해 생산된 목적 EPA 수준은 지방산의 총 중량의 약 15 내지 약 40중량%의 양이다. 추가 양태에서, 본원에 제공된 방법에 의해 생산된 목적 EPA 수준은 지방산의 총 중량의 약 20중량% 초과, 보다 특히 약 20 내지 약 25중량%의 양이다.

지방산의 총 중량의 3% 이상의 EPA를 갖는 바이오매스를 생산하는 트라우스토키트리드인 미생물을 발효조 용기에서 발효시켜 바이오매스를 생산하는 단계; 및 바이오매스를 바이오매스중의 EPA의 농도를 증가시키기에 충분한 양으로 증가시키는 단계를 포함하는, 지방산 및 소정 농도의 EPA를 갖는 미생물의 바이오매스중의 EPA의 농도를 증가시키는 방법이 본원에 제공된다. 일부 양태에서, EPA의 농도를 증가시키기에 충분한 바이오매스의 양은 lOg/L 이상의 밀도를 갖는다. 일부 양태에서, EPA의 농도를 증가시키기에 충분한 바이오매스의 양은 약 10g/L 내지 약 250g/L의 밀도를 갖는다. EPA의 농도의 증가는, 예를 들어 바이오매스가 증가되지 않은 유사하게 발효된 미생물의 EPA의 농도와 비교될 수 있다.

일부 양태에서, 보다 높은 CO₂ 수준(예를 들어, CO₂를 포함하는 용기중에서, 용기내의 총 기체의 2% 이상, 5% 이상, 10% 이상, 15% 이상, 20% 이상, 5 내지 20% 또는 5 내지 15%의 양)을 포함하는 배지에서 성장한 바이오매스의 EPA 농도는 보다 낮은 CO₂ 수준(예를 들어, CO₂를 포함하는 용기중에서, 각각 용기내의 총 기체의 2% 미만, 5% 미만, 10% 미만, 15% 미만, 20% 미만, 0 내지 4% 또는 1 내지 3%의 양)을 포함하는 배지에서 성장한 미생물로부터 수득한 바이오매스중의 EPA 농도보다 10% 이상, 50% 이상, 100% 이상, 250% 이상, 500% 이상, 750% 이상, 1,000% 이상, 1,100% 이상, 1,200% 이상, 1,300% 이상, 1,400% 이상, 1,500% 이상, 1,600% 이상, 1,700% 이상, 1,800% 이상, 1,900% 이상, 2,000% 높다. 예를 들어, 보다 높은 CO₂ 수준(예를 들어, CO₂를 포함하는 용기중에서, 용기내의 총 기체의 2% 이상, 5% 이상, 10% 이상, 15% 이상, 20% 이상, 5 내지 20% 또는 5 내지 15%)을 포함하는 배지에서 성장한 바이오매스의 EPA 농도는 대기 CO₂ 수준의 용기에서 성장한 미생물로부터 수득한 바이오매스의 EPA 농도보다 10% 이상, 50% 이상, 100% 이상, 250% 이상, 500% 이상, 750% 이상, 1,000% 이상, 1,100% 이상, 1,200% 이상, 1,300% 이상, 1,400% 이상, 1,500% 이상, 1,600% 이상, 1,700% 이상, 1,800% 이상, 1,900% 이상 또는 2,000% 이상 높다.

배지중 비타민 B12

본원에 사용된 용어 "비타민 B12"는 천연 발생 및 합성 형태 둘다의 화학적으로 관련된 화합물의 부류를 지칭하고, 비제한적으로, 비타민 B12, 코발라민, 시아노코발라민 및 하이드록소코발라민을 포함한다. 일부 양태에서, 본 발명은 미생물을 낮은 수준의 비타민 B12를 갖는 배지 또는 비타민 B12를 갖지 않는 배지중에서 성장시킴으로써 EPA를 생산하는 미생물의 바이오매스중에서 EPA 농도를 증가시키는 방법을 제공한다. 일부 양태에서, 본 발명은 미생물을 0.1mg/L 미만의 비타민 B12를 포함하는 배지중에서 성장시켜 바이오매스를 생산하는 단계를 포함하는, 증가된 농도의 EPA를 갖는 미생물의 바이오매스의 생산 방법을 제공한다. 일부 양태에서, 배지는 0.05mg/L 미만, 0.01mg/L 미만, 0.005mg/L 미만, 0.001mg/L 미만, 0.0005mg/L 미만, 0.0001mg/L 미만의 비타민 B12를 포함하거나, 전혀 포함하지 않는다.

일부 양태에서, 배지는 지질-부재 바이오매스 50g 당 1g 미만의 비타민 B12 공급원(예컨대, 효모 추출물, 옥수수 침지 고형분, 대부 분말 및 다른 복합 질소 공급원)을 포함한다. 일부 양태에서, 배지는 지질-부재 바이오매스 50g 당 0.8g 미만, 0.5g 미만, 0.3g 미만, 0.1g 미만, 0.05g 미만 또는 0.01g 미만의 비타민 B12의 상기 공급원을 포함한다. 일부 양태에서, 배지는 지질-부재 바이오매스 50g 당 1g 미만의 효모 추출물, 지질-부재 바이오매스 50g 당 0.8g 미만의 효모 추출물, 지질-부재 바이오매스 50g 당 0.5g 미만의 효모 추출물, 지질-부재 바이오매스 50g 당 0.3g 미만의 효모 추출물, 지질-부재 바이오매스 50g 당 0.1g 미만의 효모 추출물, 지질-부재 바이오매스 50g 당 0.05g 미만의 효모 추출물, 또는 지질-부재 바이오매스 50g 당 0.01g 미만의 효모 추출물을 추가로 포함한다. 본원에 사용된 바와 같이, 용어 "지질-부재 바이오매스"는 배양 후 미생물의 표적 지방-부재 건조 세포 중량을 지칭한다.

일부 양태에서, 보다 낮은 비타민 B12 수준을 포함하는 배지에서(예를 들어, 0.1mg/L 미만, 0.05mg/L 미만, 0.01mg/L 미만, 0.005mg/L 미만, 0.001mg/L 미만, 0.0005mg/L 미만, 0.0001mg/L 미만의 비타민 B12를 포함하거나 전혀 포함하지 않는 배지에서) 성장한 바이오매스의 EPA 농도는 보다 높은 비타민 B12 수준을 포함하는 배지에서(예를 들어, 각각 0.1mg/L 이상, 0.05mg/L 이상, 0.01mg/L 이상, 0.005mg/L 이상, 0.001mg/L 이상, 0.0005mg/L 이상, 0.0001mg/L 이상 또는 0.00005mg/L 이상의 비타민 B12를 포함하는 배지에서) 성장한 미생물로부터 수득한 바이오매스의 EPA 농도보다 10% 이상, 25% 이상, 50% 이상, 75% 이상, 100% 이상, 150% 이상, 200% 이상, 250% 이상, 300% 이상, 350% 이상, 400% 이상, 450% 이상, 500% 이상, 550% 이상, 600% 이상, 650% 이상 또는 700% 이상 높다. 예를 들어, 비타민 B12를 전혀 함유하지 않는 배지에서 성장한 바이오매스의 EPA 농도는 비타민 B12(예컨대, 0.0001mg/L 이상의 비타민 B12)를 포함하는 배지에서 성장한 미생물로부터 수득한 바이오매스의 EPA 농도보다 10% 이상, 25% 이상, 50% 이상, 75% 이상, 100% 이상, 150% 이상, 200% 이상, 250% 이상, 300% 이상, 350% 이상, 400% 이상, 450% 이상, 500% 이상, 550% 이상, 600% 이상, 650% 이상 또는 700% 이상 높다.

일부 양태에서, 대기 CO₂ 수준하에 보다 낮은 비타민 B12 수준을 포함하는 배지에서(예를 들어, 0.1mg/L 미만, 0.05mg/L 미만, 0.01mg/L 미만, 0.005mg/L 미만, 0.001mg/L 미만, 0.0005mg/L 미만, 0.0001mg/L 미만의 비타민 B12를 포함하거나 전혀 포함하지 않는 배지에서) 성장한 바이오매스의 EPA 농도는 대기 CO₂ 수준하에 보다 높은 비타민 B12 수준을 포함하는 배지에서(예를 들어, 각각 0.1mg/L 이상, 0.05mg/L 이상, 0.01mg/L 이상, 0.005mg/L 이상, 0.001mg/L 이상, 0.0005mg/L 이상, 0.0001mg/L 이상 또는 0.00005mg/L 이상의 비타민 B12를 포함하는 배지에서) 성장한 미생물로부터 수득한 바이오매스의 EPA 농도보다 100% 이상, 200% 이상, 300% 이상, 400% 이상 또는 500% 이상 높다. 일부 양태에서, 대기 CO₂ 수준하에 보다 낮은 비타민 B12 수준을 포함하는 배지에서 성장한 바이오매스의 EPA 농도는 대기 CO₂ 수준하에 보다 높은 비타민 B12 수준을 포함하는 배지에서 성장한 미생물로부터 수득한 바이오매스의 EPA 농도보다 100 내지 700%, 150 내지 650%, 200 내지 600%, 250 내지 550% 또는 300 내지 500% 높다. 일부 양태에서, 높은 CO₂ 수준하에 보다 낮은 비타민 B12 수준(예를 들어, 5% 이상, 10% 이상, 15% 이상 또는 20% 이상의 용존 CO₂ 수준)을 포함하는 배지에서 성장한 바이오매스의 EPA 농도는 높은 CO₂ 수준하에 보다 높은 비타민 B12 수준을 포함하는 배지에서 성장한 미생물로부터 수득한 바이오매스의 EPA 농도보다 5% 이상, 10% 이상, 15% 이상, 20% 이상, 25% 이상, 30% 이상, 40% 이상, 50% 이상, 60% 이상, 70% 이상, 80% 이상, 90% 이상 또는 100% 이상 높다. 일부 양태에서, 높은 CO₂ 수준하에 보다 낮은 비타민 B12 수준(예를 들어, 5% 이상, 10% 이상, 15% 이상 또는 20% 이상의 용존 CO₂ 수준)을 포함하는 배지에서 성장한 바이오매스의 EPA 농도는 높은 CO₂ 수준하에 보다 높은 비타민 B12 수준을 포함하는 배지에서 성장한 미생물로부터 수득한 바이오매스의 EPA 농도보다 5 내지 200%, 10 내지 175%, 15 내지 150%, 20 내지 125% 또는 25 내지 100% 높다. 예를 들어, 대기 CO₂ 수준하에 비타민 B12를 전혀 포함하지 않는 배지에서 성장한 바이오매스의 EPA 농도는 대기 CO₂ 수준하에 비타민 B12(예컨대, 0.0001mg/L 이상의 비타민 B12)를 포함하는 배지에서 성장한 미생물로부터 수득한 바이오매스의 EPA 농도보다 100% 이상, 200% 이상, 300% 이상, 400% 이상 또는 500% 이상 높다. 다른 예로서, 10% 이상의 용존 CO₂ 수준하에 비타민 B12를 전혀 포함하지 않는 배지에서 성장한 바이오매스의 EPA 농도는 10% 이상의 용존 CO₂ 수준하에 비타민 B12(예컨대, 0.0001mg/L 이상의 비타민 B12)를 포함하는 배지에서 성장한 미생물로부터 수득한 바이오매스의 EPA 농도보다 5% 이상, 10% 이상, 15% 이상, 20% 이상, 25% 이상, 30% 이상, 40% 이상, 50% 이상, 60% 이상, 70% 이상, 80% 이상, 90% 이상 또는 100% 이상 높다.

일부 양태에서, EPA 농도는 0.1mg/L 초과의 비타민 B12를 갖는 배지에서 성장한 동일한 미생물에 비해 0.1mg/L 미만의 비타민 B12를 갖는 배지에서 성장한 미생물의 바이오매스에서 100% 이상, 200% 이상, 300% 이상, 400% 이상 또는 500% 이상만큼 증가된다. 일부 양태에서, EPA 농도는 0.01mg/L 초과의 비타민 B12를 함유하는 배지에서 성장한 동일한 미생물에 비해 0.01mg/L 미만의 비타민 B12를 갖는 배지에서 성장한 미생물의 바이오매스에서 100% 이상, 200% 이상, 300% 이상, 400% 이상 또는 500% 이상만큼 증가된다. 일부 양태에서, EPA 농도는 0.001mg/L 초과의 비타민 B12를 갖는 배지에서 성장한 동일한 미생물에 비해 0.001mg/L 미만의 비타민 B12를 갖는 배지에서 성장한 미생물의 바이오매스에서 100% 이상, 200% 이상, 300% 이상, 400% 이상 또는 500% 이상만큼 증가된다. 추가 양태에서, EPA 농도는 0.0001mg/L 초과의 비타민 B12를 갖는 배지에서 성장한 동일한 미생물에 비해 0.0001mg/L 미만의 비타민 B12를 갖는 배지에서 성장한 미생물의 바이오매스에서 100% 이상, 200% 이상, 300% 이상, 400% 이상 또는 500% 이상만큼 증가된다. 일부 양태에서, EPA 농도는 소정량의 비타민 B12를 갖는 배지에서 성장한 동일한 미생물에 비해 비타민 B12를 전혀 갖지 않는 배지에서 성장한 미생물의 바이오매스에서 100% 이상, 200% 이상, 300% 이상, 400% 이상 또는 500% 이상만큼 증가된다. 바이오매스중의 EPA 농도의 증가의 측정은 보다 높은 양의 비타민 B12를 갖는 배지에서 미생물을 성장시키고, 보다 적은 양의 비타민 B12를 갖는 배지에서 동일한 미생물을 성장시키고, 각각의 배양물로부터 생성된 바이오매스의 EPA 농도를 비교함으로써 수행될 수 있다. 이러한 측정에서, 보다 적거나 보다 많은 양의 비타민 B12를 갖는 배지의 내용물은 비타민 B12의 수준을 제외하고는 동일하다.

일부 양태에서, 0.1mg/L 이상, 0.05mg/L 이상, 0.01mg/L 이상, 0.005mg/L 이상, 0.001mg/L 이상, 0.0005mg/L 이상 또는 0.0001mg/L 이상의 비타민 B12를 포함하는 배지에서 성장한 미생물의 바이오매스의 EPA 농도는 총 지방산의 1중량% 이상, 2중량% 이상, 3중량% 이상, 4중량% 이상 또는 5중량% 이상의 EPA이다. 일부 양태에서, 0.1mg/L 이상, 0.05mg/L 이상, 0.01mg/L 이상, 0.005mg/L 이상, 0.001mg/L 이상, 0.0005mg/L 이상 또는 0.0001mg/L 이상의 비타민 B12를 포함하는 배지에서 성장한 미생물의 바이오매스의 EPA 농도는 총 지방산의 1 내지 50중량%, 1 내지 40중량%, 1 내지 30중량%, 1 내지 20중량%, 2 내지 50중량%, 2 내지 40중량%, 2 내지 30중량% 또는 2 내지 20중량%의 EPA이다.

배지중 코발트

일부 양태에서, 본 발명은 미생물을 0.1mg/L 미만의 코발트를 포함하는 배지에서 성장시켜 바이오매스를 생산하는 단계를 포함하는, 증가된 농도의 EPA를 갖는 미생물의 바이오매스의 생산 방법을 제공한다. 일부 양태에서, 배지는 0.05mg/L 미만, 0.01mg/L 미만, 0.005mg/L 미만, 0.001mg/L 미만, 0.0005mg/L 미만, 0.0001mg/L 미만의 코발트를 포함하거나 전혀 포함하지 않는다.

일부 양태에서, 배지는 지질-부재 바이오매스 50g 당 1g 미만의 효모 추출물, 지질-부재 바이오매스 50g 당 0.8g 미만의 효모 추출물, 지질-부재 바이오매스 50g 당 0.5g 미만의 효모 추출물, 지질-부재 바이오매스 50g 당 0.3g 미만의 효모 추출물, 지질-부재 바이오매스 50g 당 0.1g 미만의 효모 추출물, 지질-부재 바이오매스 50g 당 0.05g 미만의 효모 추출물, 또는 지질-부재 바이오매스 50g 당 0.01g 미만의 효모 추출물을 포함한다.

일부 양태에서, 보다 낮은 코발트 수준을 포함하는 배지에서(예를 들어, 0.1mg/L 미만, 0.05mg/L 미만, 0.01mg/L 미만, 0.005mg/L 미만, 0.001mg/L 미만, 0.0005mg/L 미만, 0.0001mg/L 미만의 코발트를 포함하거나 전혀 포함하지 않는 배지에서) 성장한 바이오매스의 EPA 농도는 보다 높은 코발트 수준을 포함하는 배지에서(예를 들어, 각각 0.1mg/L 이상, 0.05mg/L 이상, 0.01mg/L 이상, 0.005mg/L 이상, 0.001mg/L 이상, 0.0005mg/L 이상, 0.0001mg/L 이상 또는 0.00005mg/L 이상의 코발트를 포함하는 배지에서) 성장한 미생물로부터 수득한 바이오매스의 EPA 농도보다 10% 이상, 25% 이상, 50% 이상, 75% 이상, 100% 이상, 150% 이상, 200% 이상, 250% 이상, 300% 이상, 350% 이상, 400% 이상, 450% 이상, 500% 이상, 550% 이상, 600% 이상, 650% 이상 또는 700% 이상 높다. 예를 들어, 코발트를 전혀 함유하지 않는 배지에서 성장한 바이오매스의 EPA 농도는 코발트(예컨대, 0.0001mg/L 이상의 코발트)를 포함하는 배지에서 성장한 미생물로부터 수득한 바이오매스의 EPA 농도보다 10% 이상, 25% 이상, 50% 이상, 75% 이상, 100% 이상, 150% 이상, 200% 이상, 250% 이상, 300% 이상, 350% 이상, 400% 이상, 450% 이상, 500% 이상, 550% 이상, 600% 이상, 650% 이상 또는 700% 이상 높다.

일부 양태에서, 대기 CO₂ 수준하에 보다 낮은 코발트 수준을 포함하는 배지에서(예를 들어, 0.1mg/L 미만, 0.05mg/L 미만, 0.01mg/L 미만, 0.005mg/L 미만, 0.001mg/L 미만, 0.0005mg/L 미만, 0.0001mg/L 미만의 코발트를 포함하거나 전혀 포함하지 않는 배지에서) 성장한 바이오매스의 EPA 농도는 대기 CO₂ 수준하에 보다 높은 코발트 수준을 포함하는 배지에서(예를 들어, 각각 0.1mg/L 이상, 0.05mg/L 이상, 0.01mg/L 이상, 0.005mg/L 이상, 0.001mg/L 이상, 0.0005mg/L 이상, 0.0001mg/L 이상 또는 0.00005mg/L 이상의 코발트를 포함하는 배지에서) 성장한 미생물로부터 수득한 바이오매스의 EPA 농도보다 100% 이상, 200% 이상, 300% 이상, 400% 이상 또는 500% 이상 높다. 일부 양태에서, 대기 CO₂ 수준하에 보다 낮은 코발트 수준을 포함하는 배지에서 성장한 바이오매스의 EPA 농도는 대기 CO₂ 수준하에 보다 높은 코발트 수준을 포함하는 배지에서 성장한 미생물로부터 수득한 바이오매스의 EPA 농도보다 100 내지 700%, 150 내지 650%, 200 내지 600%, 250 내지 550% 또는 300 내지 500% 높다. 일부 양태에서, 높은 CO₂ 수준(예를 들어, 5% 이상, 10% 이상, 15% 이상 또는 20% 이상의 용존 CO₂ 수준)하에 보다 낮은 코발트 수준을 포함하는 배지에서 성장한 바이오매스의 EPA 농도는 높은 CO₂ 수준하에 보다 높은 코발트 수준을 포함하는 배지에서 성장한 미생물로부터 수득한 바이오매스의 EPA 농도보다 5% 이상, 10% 이상, 15% 이상, 20% 이상, 25% 이상, 30% 이상, 40% 이상, 50% 이상, 60% 이상, 70% 이상, 80% 이상, 90% 이상 또는 100% 이상 높다. 일부 양태에서, 높은 CO₂ 수준(예를 들어, 5% 이상, 10% 이상, 15% 이상 또는 20% 이상의 용존 CO₂ 수준)하에 보다 낮은 코발트 수준을 포함하는 배지에서 성장한 바이오매스의 EPA 농도는 높은 CO₂ 수준하에 보다 높은 코발트 수준을 포함하는 배지에서 성장한 미생물로부터 수득한 바이오매스의 EPA 농도보다 5 내지 200%, 10 내지 175%, 15 내지 150%, 20 내지 125% 또는 25 내지 100% 높다. 예를 들어, 대기 CO₂ 수준하에 코발트를 전혀 포함하지 않는 배지에서 성장한 바이오매스의 EPA 농도는 대기 CO₂ 수준하에 코발트(예컨대, 0.0001mg/L 이상의 코발트)를 포함하는 배지에서 성장한 미생물로부터 수득한 바이오매스의 EPA 농도보다 100% 이상, 200% 이상, 300% 이상, 400% 이상 또는 500% 이상 높다. 다른 예로서, 10% 이상의 용존 CO₂ 수준하에 코발트를 전혀 포함하지 않는 배지에서 성장한 바이오매스의 EPA 농도는 10% 이상의 용존 CO₂ 수준하에 코발트(예컨대, 0.0001mg/L 이상의 코발트)를 포함하는 배지에서 성장한 미생물로부터 수득한 바이오매스의 EPA 농도보다 5% 이상, 10% 이상, 15% 이상, 20% 이상, 25% 이상, 30% 이상, 40% 이상, 50% 이상, 60% 이상, 70% 이상, 80% 이상, 90% 이상 또는 100% 이상 높다.

일부 양태에서, EPA 농도는 0.1mg/L 초과의 코발트를 갖는 배지에서 성장한 동일한 미생물에 비해 0.1mg/L 미만의 코발트를 갖는 배지에서 성장한 미생물의 바이오매스에서 100% 이상, 200% 이상, 300% 이상, 400% 이상 또는 500% 이상만큼 증가된다. 일부 양태에서, EPA 농도는 0.01mg/L 초과의 코발트를 갖는 배지에서 성장한 동일한 미생물에 비해 0.01mg/L 미만의 코발트를 갖는 배지에서 성장한 미생물의 바이오매스에서 100% 이상, 200% 이상, 300% 이상, 400% 이상 또는 500% 이상만큼 증가된다. 일부 양태에서, EPA 농도는 0.001mg/L 초과의 코발트를 갖는 배지에서 성장한 동일한 미생물에 비해 0.001mg/L 미만의 코발트를 갖는 배지에서 성장한 미생물의 바이오매스에서 100% 이상, 200% 이상, 300% 이상, 400% 이상 또는 500% 이상만큼 증가된다. 추가 양태에서, EPA 농도는 0.0001mg/L 초과의 코발트를 갖는 배지에서 성장한 동일한 미생물에 비해 0.0001mg/L 미만의 코발트를 갖는 배지에서 성장한 미생물의 바이오매스에서 100% 이상, 200% 이상, 300% 이상, 400% 이상 또는 500% 이상만큼 증가된다. 일부 양태에서, EPA 농도는 소정량의 코발트를 갖는 배지에서 성장한 동일한 미생물에 비해 코발트를 전혀 갖지 않는 배지에서 성장한 미생물의 바이오매스에서 100% 이상, 200% 이상, 300% 이상, 400% 이상 또는 500% 이상만큼 증가된다. 바이오매스중의 EPA 농도의 증가의 측정은 보다 높은 양의 코발트를 갖는 배지에서 미생물을 성장시키고, 보다 적은 양의 코발트를 갖는 배지에서 동일한 미생물을 성장시키고, 각각의 배양물로부터 생성된 바이오매스의 EPA 농도를 비교함으로써 수행될 수 있다. 이러한 측정에서, 보다 적거나 보다 많은 양의 코발트를 갖는 배지의 내용물은 코발트의 수준을 제외하고는 동일하다.

일부 양태에서, 0.1mg/L 이상, 0.05mg/L 이상, 0.01mg/L 이상, 0.005mg/L 이상, 0.001mg/L 이상, 0.0005mg/L 이상 또는 0.0001mg/L 이상의 코발트를 포함하는 배지에서 성장한 미생물의 바이오매스의 EPA 농도는 총 지방산의 1중량% 이상, 2중량% 이상, 3중량% 이상, 4중량% 이상 또는 5중량% 이상의 EPA이다. 일부 양태에서, 0.1mg/L 이상, 0.05mg/L 이상, 0.01mg/L 이상, 0.005mg/L 이상, 0.001mg/L 이상, 0.0005mg/L 이상 또는 0.0001mg/L 이상의 코발트를 포함하는 배지에서 성장한 미생물의 바이오매스의 EPA 농도는 총 지방산의 1 내지 50중량%, 1 내지 40중량%, 1 내지 30중량%, 1 내지 20중량%, 2 내지 50중량%, 2 내지 40중량%, 2 내지 30중량% 또는 2 내지 20중량%의 EPA이다.

적은 양의 비타민 B12, 효모 추출물 및/또는 코발트를 함유하는 배지는 5% 이상, 10% 이상, 15% 이상 또는 20% 이상의 용존 CO₂ 수준을 추가로 포함한다. 본 발명은 본원에 개시된 방법의 단리된 바이오매스, 및 상기 방법의 바이오매스로부터 추출된 미생물 오일에 관한 것이다.

본 발명은 본 발명의 임의의 미생물 또는 이의 혼합물을 포함하는 단리된 배양물에 관한 것이다.

본 발명은 본 발명의 미생물 또는 바이오매스 또는 이의 혼합물을 포함하는, 비인간 동물 또는 인간용 식료품, 화장품 또는 약학 조성물에 관한 것이다.

본 발명은 약 20중량% 이상의 에이코사펜타엔산 및 각각 약 5중량% 미만의 아라키돈산, 도코사펜타엔산 n-6, 올레산, 리놀레산, 리놀렌산, 에이코센산, 에루크산 및 스테아리돈산을 포함하는 미생물 오일에 관한 것이다. 일부 양태에서, 미생물 오일은 약 25중량% 이상의 도코사헥사엔산을 추가로 포함한다.

본 발명은 약 10중량% 이상의 트라이아실글리세롤 분획을 포함하는 미생물 오일로서, 상기 트라이아실글리세롤 분획중의 지방산의 약 12중량% 이상이 에이코사펜타엔산이고, 상기 트라이아실글리세롤 분획중의 지방산의 약 25중량% 이상이 도코사헥사엔산이고, 상기 트라이아실글리세롤 분획중의 지방산의 약 5중량% 이상이 아라키돈산인 미생물 오일에 관한 것이다.

본 발명은 본 발명의 임의의 미생물 오일을 포함하는, 비인간 동물 또는 인간용 식료품, 화장품 또는 약학 조성물에 관한 것이다. 일부 양태에서, 상기 식료품은 영아용 조제식이다. 일부 양태에서, 상기 영아용 조제식은 조산아에 적합하다. 일부 양태에서, 상기 식료품은 우유, 음료, 치료 음료, 영양 음료 또는 이들의 조합이다. 일부 양태에서, 상기 식료품은 비인간 동물 또는 인간 음식용 첨가제이다. 일부 양태에서, 상기 식료품은 영양 보충물이다. 일부 양태에서, 상기 식료품은 동물 사료이다. 일부 양태에서, 상기 동물 사료는 수산 양식 사료이다. 일부 양태에서, 상기 동물 사료는 애완 동물 사료, 동물원 동물 사료, 노동 동물(work animal) 사료, 가축 사료 또는 이들의 조합이다.

본 발명은 본 발명의 임의의 단리된 미생물 또는 이의 혼합물을 배양물에서 성장시켜 오메가-3 지방산을 포함하는 오일을 생산하는 단계를 포함하는, 오메가-3 지방산을 포함하는 미생물 오일의 생산 방법에 관한 것이다. 일부 양태에서, 상기 방법은 오일을 추출하는 단계를 추가로 포함한다.

본 발명은 오메가-3 지방산을 포함하는 오일을 본 발명의 임의의 바이오매스로부터 추출하는 단계를 포함하는, 오메가-3 지방산을 포함하는 미생물 오일의 생산 방법에 관한 것이다. 일부 양태에서, 상기 미생물 오일은 유기 용매 추출 공정, 예를 들면, 헥산 추출을 사용하여 추출한다. 일부 양태에서, 상기 미생물 오일은 무용매 추출 공정을 사용하여 추출한다.

본 발명은 본 발명의 방법으로 생산한 미생물 오일에 관한 것이다.

본 발명은 본 발명의 임의의 단리된 미생물 또는 이들의 조합을 배양물에서 성장시켜 바이오매스를 생산하는 단계를 포함하는, 본 발명의 바이오매스의 생산 방법에 관한 것이다.

본 발명은 본 발명의 방법으로 생산한 바이오매스에 관한 것이다.

본 발명은 본 발명의 임의의 미생물을 돌연변이시키는 단계, 및 돌연변이체 균주를 단리하는 단계를 포함하는, 본 발명의 돌연변이체 균주의 생산 방법에 관한 것이다.

본 발명은 염증 또는 이와 관련된 증상의 치료용 의약을 제조하기 위한, 본 발명의 임의의 단리된 미생물, 바이오매스 또는 미생물 오일, 또는 이들의 혼합물의 용도에 관한 것이다.

본 발명은 염증 또는 이와 관련된 증상을 치료하기 위한, 본 발명의 임의의 단리된 미생물, 바이오매스 또는 미생물 오일, 또는 이들의 혼합물의 용도에 관한 것이다.

본 발명은 염증 또는 이와 관련된 증상의 치료에 사용하기 위한, 본 발명의 임의의 단리된 미생물, 바이오매스 또는 미생물 오일, 또는 이들의 혼합물의 용도에 관한 것이다.

본 발명은 본 발명의 임의의 단리된 미생물, 바이오매스 또는 미생물 오일, 또는 이들의 혼합물, 및 약학적으로 허용되는 담체를 대상체에게 투여함을 포함하는, 염증 또는 이와 관련된 증상의 치료가 필요한 대상체에서 염증 또는 이와 관련된 증상의 치료 방법에 관한 것이다.

본 발명은 본 발명의 미생물로부터 미생물 오일 및 바이오매스를 생산하는 방법, 및 상기 미생물, 바이오매스 및 미생물 오일을 사용하는 방법에 관한 것이다.

미생물

일부 양태에서, 본 발명에 사용하기 위한 미생물 세포는 라비린툴로마이코타(Labyrinthulomycota) 문의 미생물이다. 일부 양태에서, 라비린툴로마이코타 문의 미생물 세포는 트라우스토키트리드, 예컨대 쉬조키트리움 또는 트라우스토키트리움이다. 본 발명에 따라서, 용어 "트라우스토키트리드"는 트라우스토키트리알레스 목의 임의의 구성원을 지칭하고, 이는 트라우스토키트리아세아에(Thraustochytriaceae) 과를 포함하고, 용어 "라비린툴리드(labyrinthulid)"는 라비린툴라레스(Labyrinthulales) 목의 임의의 구성원을 지칭하고, 이는 라비린툴라세아에(Labyrinthulaceae) 과를 포함한다.

라비린툴라세아에 과의 구성원은 종전에는 트라우스토키트리알레스 목의 구성원으로 간주되었지만, 이러한 유기체의 분류학상 분류의 보다 최근 개정판에서, 라비린툴라세아에 과는 현재 라비린툴라레스 목의 구성원으로 간주된다. 라비린툴라레스 및 트라우스토키트리알레스는 둘다 라비린툴로마이코타 문의 구성원으로 간주된다. 분류학 이론가들은 현재 일반적으로 이러한 미생물의 군을 둘다 스트라메노파일(Stramenopile) 계통의 조류 또는 조류-유사 원생생물에 위치시켰다. 트라우스토키트리드 및 라비린툴리드의 현재 분류학상 위치는 하기와 같이 요약될 수 있다:

계: 스트라메노필라(Stramenopila)(크로미스타(Chromista))

문: 라비린툴로마이코타(헤테로콘타(Heterokonta))

강: 라비린툴로마이세테스(Labyrinthulomycetes)(라비린툴라에(Labyrinthulae))

목: 라비린툴라레스

과: 라비린툴라세아에

목: 트라우스토키트리알레스

과: 트라우스토키트리아세아에

본 발명의 목적을 위하여, 트라우스토키트리드로서 기술된 미생물 세포의 균주는 하기 유기체를 포함한다: 목: 트라우스토키트리알레스; 과: 트라우스토키트리아세아에; 속: 트라우스토키트리움(Thraustochytrium)(종: 종, 아루디멘탈레(arudimentale), 아우레움(aureum), 벤티콜라(benthicola), 글로보숨(globosum), 킨네이(kinnei), 모티붐(motivum), 멀티루디멘탈레(multirudimentale), 파키데르뭄(pachydermum), 프롤리페룸(proliferum), 로세움(roseum) 및 스트리아툼(striatum)), 울케니아(Ulkenia)(종: 종, 아모에보이데아(amoeboidea), 케르구엘렌시스(kerguelensis), 미누타(minuta), 프로푼다(profunda), 라디아타(radiata), 사일렌스(sailens), 사르카리아나(sarkariana), 쉬조키트롭스(schizochytrops), 비수르겐시스(visurgensis), 요르켄시스(yorkensis) 및 종 BP-5601), 쉬조키트리움(종: 종, 아그레가툼(aggregatum), 림나세움(limnaceum), 만그로베이(mangrovei), 미누툼(minutum) 및 옥토스포룸(octosporum)), 자포노키트리움(Japonochytrium)(종: 종, 마리눔(marinum)), 아플라노키트리움(Aplanochytrium)(종: 종, 할리오티디스(haliotidis), 케르구엘렌시스, 프로푼다 및 스토키노이(stocchinoi)), 알토르니아(Althornia)(종: 종, 크라우치(crouchii)) 또는 엘리나(Elina)(종: 종, 마리살바(marisalba) 및 시노리피카(sinorifica)). 본 발명의 목적을 위하여, 울케니아에 속하는 것으로 기술된 종은 트라우스토키트리움 속의 구성원으로 간주된다. 아루란티아코키트리움(Aurantiacochytrium) 및 오블로고스포라(Oblogospora)는 본 발명에서 라비린툴로마이코타 문에 포함되는 2개의 추가적인 속이다. 일부 양태에서, 미생물 세포는 트라우스토키스트리움(Thraustochystrium) 속, 쉬조키트리움 속 및 이들의 혼합물이다.

본 발명은 단리된 미생물 및 이로부터 유도되는 균주에 관한 것이다. 본 발명의 단리된 미생물로부터 "유도되는" 균주는 천연 또는 인공 유도체, 예를 들면, 돌연변이체, 변이체 또는 재조합체 균주일 수 있다. 본원에 사용된 용어 "단리된"은 단리물이 정제된 정도를 반드시 반영하는 것이 아니라, 천연 형태 또는 천연 환경으로부터의 단리 또는 분리를 나타낸다. 단리물은, 비제한적으로, 단리된 미생물, 단리된 바이오매스, 단리된 배양물, 단리된 미생물 오일 및 단리된 서열(예를 들면, 본원에 개시된 단리된 폴리뉴클레오티드 서열)을 포함할 수 있다. 본원에 사용된 용어 "미생물"은, 비제한적으로, 용어 "미세조류", "트라우스토키트리드", 및 본원에 기재된 임의의 기탁된 미생물과 관련된 분류학상 분류를 포함한다. 본원에 기재된 기탁된 미생물을 비롯한 본원의 임의의 미생물과 관련하여 사용된 용어 "트라우스토키트리알레스", "트라우스토키트리드", "쉬조키트리움" 및 "트라우스토키트리움"은 이용가능한 계통발생학상 정보를 포함하는 현재의 분류학상 분류에 기초하며, 분류학상 분류가 본 출원의 출원일 이후에 재분류되는 경우에 한정되는 것으로 의도되지 않는다.

일부 양태에서, 본 발명은 ATCC 수탁번호 PTA-10212로 기탁된 종의 단리된 미생물에 관한 것이다. ATCC 수탁번호 PTA-10212와 관련된 단리된 미생물은 또한 트라우스토키트리움 종 ATCC PTA-10212로서 본원에 알려져 있다. ATCC 수탁번호 PTA-10212와 관련된 단리된 미생물은 2009년 7월 14일자로 부다페스트 조약하에 미국 버지니아주 20110-2209 마나사스 유니버시티 불러바드 10801에 소재하는 아메리칸 타입 컬쳐 컬렉션(특허 기탁소)에 기탁되었다. 일부 양태에서, 본 발명은 ATCC 수탁번호 PTA-10212로 기탁된 단리된 균주에 관한 것이다. 일부 양태에서, 본 발명은 ATCC 수탁번호 PTA-10212, PTA-10213, PTA-10214, PTA-10215, PTA-10208, PTA-10209, PTA-10210 또는 PTA-10211로 기탁된 단리된 미생물에 관한 것이다.

일부 양태에서, 본 발명은 ATCC 수탁번호 PTA-10212로 기탁된 종의 특성을 갖는 단리된 미생물 또는 이로부터 유도되는 균주에 관한 것이다. ATCC 수탁번호 PTA-10212로 기탁된 종의 특성은 이의 성장 및 표현형 특성(표현형 특성의 예는 형태학적 및 생식 특성을 포함함), 이의 물리적 및 화학적 특성(예: 건조 중량 및 지질 프로파일), 이의 유전자 서열 및 이들의 조합을 포함하고, 상기 특성은 이미 동정된 종과 비교하여 상기 종을 구별한다. 일부 양태에서, 본 발명은 ATCC 수탁번호 PTA-10212로 기탁된 종의 특성을 갖는 단리된 미생물에 관한 것으로서, 상기 특성은 서열번호 1의 폴리뉴클레오티드 서열 또는 서열번호 1과의 동일성이 적어도 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99%인 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하는 18s rRNA, ATCC 수탁번호 PTA-10212로 기탁된 종의 형태학적 및 생식 특성, 및 ATCC 수탁번호 PTA-10212로 기탁된 종의 지방산 프로파일을 포함한다. 일부 양태에서, 본 발명의 단리된 미생물은 ATCC 수탁번호 PTA-10212로 기탁된 미생물과 실질적으로 동일한 표현형 특성을 갖는다. 일부 양태에서, 본 발명의 단리된 미생물은 ATCC 수탁번호 PTA-10212로 기탁된 미생물과 실질적으로 동일한 성장 특성을 갖는다. 일부 양태에서, 본 발명은 서열번호 1의 폴리뉴클레오티드 서열 또는 서열번호 1과의 동일성이 적어도 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99%인 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하는 18s rRNA를 포함하는 단리된 미생물에 관한 것이다. 일부 양태에서, 본 발명은 ATCC 수탁번호 PTA-10212로 기탁된 미생물의 18s rRNA 폴리뉴클레오티드 서열과의 동일성이 94% 이상인 18s rRNA 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하는 단리된 미생물에 관한 것이다.

일부 양태에서, 본 발명은 ATCC 수탁번호 PTA-10212로 기탁된 미생물의 돌연변이체 균주에 관한 것이다. 추가의 양태에서, 돌연변이체 균주는 ATCC 수탁번호 PTA-10213, PTA-10214 또는 PTA-10215로 기탁된 균주이다. ATCC 수탁번호 PTA-10213, PTA-10214 또는 PTA-10215와 관련된 미생물은 2009년 7월 14일자로 부다페스트 조약하에 미국 버지니아주 20110-2209 마나사스 유니버시티 불러바드 10801에 소재하는 아메리칸 타입 컬쳐 컬렉션(특허 기탁소)에 기탁되었다.

일부 양태에서, 본 발명은 ATCC 수탁번호 PTA-10208로 기탁된 종의 단리된 미생물에 관한 것이다. ATCC 수탁번호 PTA-10208과 관련된 단리된 미생물은 본원에서 또한 쉬조키트리움 종 ATCC PTA-10208로서 공지되어 있다. ATCC 수탁번호 PTA-10208과 관련된 미생물은 2009년 7월 14일자로 부다페스트 조약하에 미국 버지니아주 20110-2209 마나사스 유니버시티 불러바드 10801에 소재하는 아메리칸 타입 컬쳐 컬렉션(특허 기탁소)에 기탁되었다. 일부 양태에서, 본 발명은 ATCC 수탁번호 PTA-10208로 기탁된 단리된 균주에 관한 것이다.

일부 양태에서, 본 발명은 ATCC 수탁번호 PTA-10208로 기탁된 종의 단리된 미생물로서, 상기 미생물에 의해 생산된 총 지방산이 약 10중량% 초과, 약 11중량% 초과, 약 12중량% 초과, 약 13중량% 초과, 약 14중량% 초과, 약 15중량% 초과, 약 16중량% 초과, 약 17중량% 초과, 약 18중량% 초과, 약 19중량% 초과 또는 약 20중량% 초과의 EPA를 포함하는, 단리된 미생물에 관한 것이다. 일부 양태에서, 본 발명은 ATCC 수탁번호 PTA-10208로 기탁된 종의 단리된 미생물로서, 상기 미생물에 의해 생산된 총 지방산이 약 10 내지 약 55중량%, 약 10 내지 약 50중량%, 약 10 내지 약 45중량%, 약 10 내지 약 40중량%, 약 10 내지 약 35중량%, 약 10 내지 약 30중량%, 약 15 내지 약 55중량%, 약 15 내지 약 50중량%, 약 15 내지 약 45중량%, 약 15 내지 약 40중량%, 약 15 내지 약 35중량%, 약 15 내지 약 30중량%, 약 20 내지 약 55중량%, 약 20 내지 약 50중량%, 약 20 내지 약 45중량%, 약 20 내지 약 40중량%, 약 20 내지 약 35중량% 또는 약 20 내지 약 30중량%의 EPA를 포함하는, 단리된 미생물에 관한 것이다.

일부 양태에서, 본 발명은 ATCC 수탁번호 PTA-10208로 기탁된 종의 특성을 갖는 단리된 미생물로서, 상기 미생물에 의해 생산된 총 지방산이 약 10중량% 이상의 에이코사펜타엔산을 포함하는, 단리된 미생물에 관한 것이다. ATCC 수탁번호 PTA-10208로 기탁된 미생물의 특성은 이의 성장 및 표현형 특성(표현형 특성의 예는 형태학적 및 생식 특성을 포함함), 이의 물리적 및 화학적 특성(예: 건조 중량 및 지질 프로파일), 이의 유전자 서열 및 이들의 조합을 포함하고, 상기 특성은 이미 동정된 종과 비교하여 상기 종을 구별한다. 일부 양태에서, 본 발명은 ATCC 수탁번호 PTA-10212로 기탁된 종의 특성을 갖는 단리된 미생물에 관한 것으로서, 상기 특성은 서열번호 2의 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하는 18s rRNA, ATCC 수탁번호 PTA-10208로 기탁된 종의 형태학적 및 생식 특성 및 ATCC 수탁번호 PTA-10208로 기탁된 종의 지방산 프로파일을 포함한다. 일부 양태에서, 본 발명의 단리된 미생물은 ATCC 수탁번호 PTA-10208로 기탁된 미생물과 실질적으로 동일한 물리적 및 화학적 특성을 갖는다.

일부 양태에서, 본 발명은 ATCC 수탁번호 PTA-10208로 기탁된 미생물의 돌연변이체 균주에 관한 것이다. 추가의 양태에서, 돌연변이체 균주는 ATCC 수탁번호 PTA-10209, PTA-10210 또는 PTA-10211로 기탁된 균주이다. ATCC 수탁번호 PTA-10209, PTA-10210 및 PTA-10211로 기탁된 미생물은 2009년 9월 25일자로 부다페스트 조약하에 미국 버지니아주 20110-2209 마나사스 유니버시티 불러바드 10801에 소재하는 아메리칸 타입 컬쳐 컬렉션(특허 기탁소)에 기탁되었다.

일부 양태에서, 본 발명은 트라이아실글리세롤 분획을 생산하는 본 발명의 단리된 미생물로서, 상기 트라이아실글리세롤 분획의 EPA 함량이 약 12중량% 이상, 약 13중량% 이상, 약 14중량% 이상, 약 15중량% 이상, 약 16중량% 이상, 약 17중량% 이상, 약 18중량% 이상, 약 19중량% 이상 또는 약 20중량% 이상인 단리된 미생물에 관한 것이다. 일부 양태에서, 본 발명은 트라이아실글리세롤 분획을 생산하는 단리된 미생물로서, 상기 트라이아실글리세롤 분획의 EPA 함량이 약 12 내지 약 55중량%, 약 12 내지 약 50중량%, 약 12 내지 약 45중량%, 약 12 내지 약 40중량%, 약 12 내지 약 35중량%, 약 12 내지 약 30중량%, 약 15 내지 약 45중량%, 약 15 내지 약 40중량%, 약 15 내지 약 35중량%, 약 15 내지 약 30중량% 또는 약 20 내지 약 30중량%인, 단리된 미생물에 관한 것이다.

일부 양태에서, 본 발명은 트라이아실글리세롤 분획을 생산하는 본 발명의 단리된 미생물의 돌연변이체, 변이체 또는 재조합체로서, 상기 트라이아실글리세롤 분획의 EPA 함량이 약 10중량% 이상, 약 11중량% 이상, 약 12중량% 이상, 약 13중량% 이상, 약 14중량% 이상, 약 15중량% 이상, 약 16중량% 이상, 약 17중량% 이상, 약 18중량% 이상, 약 19중량% 이상 또는 약 20중량% 이상인, 상기 돌연변이체, 변이체 또는 재조합체에 관한 것이다. 일부 양태에서, 본 발명은 트라이아실글리세롤 분획을 생산하는 본 발명의 단리된 미생물의 돌연변이체, 변이체 또는 재조합체로서, 상기 트라이아실글리세롤 분획의 EPA 함량이 약 12 내지 약 55중량%, 약 12 내지 약 50중량%, 약 12 내지 약 45중량%, 약 12 내지 약 40중량%, 약 12 내지 약 35중량%, 약 12 내지 약 30중량%, 약 15 내지 약 55중량%, 약 15 내지 약 50중량%, 약 15 내지 약 45중량%, 약 15 내지 약 40중량%, 약 15 내지 약 35중량%, 약 15 내지 약 30중량%, 약 20 내지 약 55중량%, 약 20 내지 약 50중량%, 약 20 내지 약 45중량%, 약 20 내지 약 40중량%, 약 20 내지 약 35중량% 또는 약 20 내지 약 30중량%인, 상기 돌연변이체, 변이체 또는 재조합체에 관한 것이다. 돌연변이체 균주는 널리 공지된 과정에 의해 생산할 수 있다. 통상의 과정은 방사선 조사, 고온에서의 처리 및 돌연변이유발원을 사용한 처리를 포함한다. 변이체 균주는 본원에 기재된 종의 다른 천연 존재하는 단리물 및/또는 아단리물일 수 있다. 재조합체 균주는 외인성 유전자의 발현 또는 외인성 유전자의 기능 또는 발현의 변경을 위해 분자 생물학에서 널리 공지된 임의의 방법으로 생산할 수 있다. 일부 양태에서, 돌연변이체, 변이체 또는 재조합체 균주는 야생형 균주보다 더 많은 양의 오메가-3 지방산, 특히 EPA를 생산한다. 일부 양태에서, 돌연변이체, 변이체 또는 재조합체 균주는 보다 적은 양의 DHA, ARA, DPA n-6 또는 이들의 조합과 같은 보다 적은 양의 하나 이상의 지방산을 생산한다. 일부 양태에서, 돌연변이체, 변이체 또는 재조합체 균주는 야생형 균주보다 배양물 1L 당 보다 많은 건조 세포 중량을 생산한다. 이러한 돌연변이체, 변이체 또는 재조합체 균주는 본 발명의 단리된 미생물로부터 유도되는 균주의 예이다.

본 발명은 또한 ATCC 수탁번호 PTA-9695로 기탁된 트라우스토키트리드 종의 특성을 갖는 단리된 트라우스토키트리드 미생물에 관한 것이고, 상기 미생물 또는 이로부터 유도된 균주에 의해 생상된 총 지방산은 약 10중량% 이하의 에이코사펜타엔산을 포함한다.

본 발명은 또한 트라이글리세라이드 분획을 포함하는 단리된 트라우스토키트리드 미생물 또는 이로부터 유도되는 균주에 관한 것이고, 트라이글리세라이드 분획의 도코사헥사엔산 함량은 약 40중량% 이상이고, 트라이글리세라이드 분획의 도코사펜타엔산 n-6 함량은 적어도 약 0.5 내지 약 6중량%이고, 상기 미생물 또는 이로부터 유도된 균주에의 생산된 총 지방산이 약 10중량% 이하의 에이코사펜타엔산을 포함한다.

본 발명은 또한 ATCC 수탁번호 PTA-9695로 기탁된 트라우스토키트리드와 동일한 종의 단리된 트라우스토키트리드 미생물 또는 이로부터 유도되는 균주에 관한 것이고, 상기 미생물 또는 이로부터 유도된 균주의 총 지방산은 약 10중량% 이하의 에이코사펜타엔산을 포함한다.

일부 양태에서, 본 발명의 단리된 트라우스토키트리드 미생물로부터 유도된 균주는 돌연변이체 균주이다.

본 발명은 또한 ATCC 수탁번호 PTA-9695, PTA-9696, PTA-9697 또는 PTA-9698로 기탁된 단리된 미생물에 관한 것이다.

본 발명은 또한 본 발명의 트라우스토키트리드 미생물중 어느 하나 또는 이들의 혼합물을 포함하는 트라우스토키트리드 바이오매스에 관한 것이다.

본 발명은 또한 약 50중량% 이상의 건조 세포 중량의 바이오매스가 지방산이되, 약 50중량% 이상의 지방산이 오메가-3 지방산인 단리된 트라우스토키트리드 바이오매스에 관한 것이다. 일부 양태에서, 약 50중량% 이상의 지방산은 도코사헥사엔산이다. 본 발명은 또한 약 25중량% 이상의 건조 세포 중량의 바이오매스가 도코사헥사엔산인 단리된 트라우스토키트리드 바이오매스에 관한 것이다.

일부 양태에서, 본 발명은 또한 약 10중량% 이하의 지방산이 에이코사펜타엔산이되, 도코사헥사엔산 대 에이코사펜타엔산의 중량 비가 약 5:1 이상인 단리된 트라우스토키트리드 바이오매스에 관한 것이다.

일부 양태에서, 본 발명은 또한 약 1.5중량% 이하의 지방산이 아라키돈산이되, 도코사헥사엔산 대 아라키돈산의 중량 비가 약 20:1 이상인 단리된 트라우스토키트리드 바이오매스에 관한 것이다.

일부 양태에서, 본 발명은 또한 도코사헥사엔산 및 도코사펜타엔산 n-6을 약 10:1 이상의 중량 비로 포함하는 단리된 트라우스토키트리드 바이오매스에 관한 것이다. 일부 양태에서, 본 발명은 ATCC 수탁번호 PTA-9695로 기탁된 종의 트라우스토키트리드에 관한 것이다. 단리된 트라우스토키트리드는 또한 쉬조키트리움 종 ATCC PTA-9695로서 본원에 공지되어 있다. ATCC 수탁번호 PTA-9695와 관련된 트라우스토키트리드는 2009년 1월 7일자로 부다페스트 조약하에 미국 버지니아주 20110-2209 마나사스 유니버시티 불러바드 10801에 소재하는 아메리칸 타입 컬쳐 컬렉션(특허 기탁소)에 기탁되었다

일부 양태에서, 본 발명은 ATCC 수탁번호 PTA-9695로 기탁된 단리된 트라우스토키트리드 균주에 관한 것이다. 일부 양태에서, 본 발명은 ATCC 수탁번호 PTA-9695로 기탁된 트라우스토키트리드와 동일한 종의 단리된 트라우스토키트리드 미생물에 관한 것이다.

일부 양태에서, 본 발명은 ATCC 수탁번호 PTA-9695로 기탁된 종의 특성을 갖는 단리된 트라우스토키트리드 또는 이로부터 유도된 균주에 관한 것이다. ATCC 수탁번호 PTA-9695로 기탁된 트라우스토키트리드 종의 특성은 이의 성장 및 표현형 특성(표현형 특성의 예는 형태학적 및 생식 특성을 포함함), 이의 물리적 및 화학적 특성(예: 건조 중량 및 지질 프로파일) 및 이의 유전자 서열을 포함한다. 일부 양태에서, 본 발명의 단리된 트라우스토키트리드는 ATCC 수탁번호 PTA-9695로 기탁된 트라우스토키트리드와 실질적으로 동일한 표현형 특성을 갖는다. 일부 양태에서, 본 발명의 단리된 트라우스토키트리드는 ATCC 수탁번호 PTA-9695로 기탁된 트라우스토키트리드와 실질적으로 동일한 성장 특성을 갖는다.

일부 양태에서, 본 발명은 돌연변이체, 변이체 또는 재조합체에 의해 생산된 총 지방산이 약 10중량% 이하의 에이코사펜타엔산을 포함하는, 본 발명의 단리된 트라우스토키트리드의 돌연변이체, 변이체 또는 재조합체에 관한 것이다. 돌연변이체 균주는 널리 공지된 과정에 의해 생산될 수 있다. 통상적인 과정은 방사선 조사; 고온에서의 처리; 및 돌연변이유발원에 의한 처리를 포함한다. 변이체 균주는 본원에 기술된 종의 다른 천연 발생 단리물 및/또는 아단리물일 수 있다. 재조합체 균주는 외인성 유전자의 발현 또는 내인성 유전자 기능 또는 발현의 변경을 위해 분자 생물학에서 널리 공지된 임의의 방법에 의해 생산될 수 있다. 일부 양태에서, 돌연변이체, 변이체 또는 재조합체 균주는 야생형 균주보다 많은 양의 오메가-3 지방산, 예컨대 DHA 및/또는 EPA를 생산한다. 일부 양태에서, 돌연변이체, 변이체 또는 재조합체 균주는 보다 적은 양의 하나 이상의 지방산, 예컨대 보다 적은 양의 EPA, ARA, DPA n-6 또는 이들의 조합을 생산한다. 일부 양태에서, 돌연변이체, 변이체 또는 재조합체 균주는 야생형 균주보다 큰, 배양물 1L 당 건조 세포 중량을 생산한다. 이러한 돌연변이체, 변이체 또는 재조합체 균주는 본 발명의 단리된 트라우스토키트리드로부터 유도된 균주의 예이다.

일부 양태에서, 본 발명은 ATCC 수탁번호 PTA-9695로 기탁된 트라우스토키트리드의 돌연변이체 균주에 관한 것이다. 추가 양태에서, 돌연변이체 균주는 ATCC 수탁번호 PTA-9696, PTA-9697 또는 PTA-9698로 기탁된 균주이다. ATCC 수탁번호 PTA-9696, PTA-9697 및 PTA-9698과 관련된 트라우스토키트리드 균주가 2009년 1월 7일자로 부다페스트 조약하에 미국 버지니아주 20110-2209 마나사스 유니버시티 불러바드 10801에 소재하는 아메리칸 타입 컬쳐 컬렉션(특허 기탁소)에 기탁되었다. 이와 같이 기탁된 돌연변이체 균주는 ATCC 수탁번호 PTA-9695로 기탁된 트라우스토키트리드의 유도체이다.

일부 양태에서, 본 발명의 단리된 트라우스토키트리드(이의 돌연변이체, 변이체 또는 재조합체를 포함함)는 트라우스토키트리드로부터 단리된 하나 이상의 분획에서 지방산 프로파일을 포함한다. 트라우스토키트리드로부터 단리된 하나 이상의 분획은 총 지방산 분획, 스테롤 에스터 분획, 트라이글리세라이드 분획, 유리 지방산 분획, 스테롤 분획, 다이글리세라이드 분획, 극성 분획(예컨대, 인지질 분획) 및 이들의 조합을 포함한다.

본 발명은 또한 본 발명의 트라우스토키트리드 미생물중 어느 하나 또는 이들의 혼합물을 포함하는 단리된 트라우스토키트리드 배양물에 관한 것이다. 일부 양태에서, 배양물은 약 5% 이상의 용존 산소를 포함한다.

본 발명은 또한 본 발명의 트라우스토키트리드 미생물 또는 바이오매스중 어느 하나 또는 이들의 혼합물을 포함하는 동물 또는 인간용 식료품, 화장품 또는 약학 조성물에 관한 것이다.

본 발명은 또한 약 70중량% 이상의 트라이글리세라이드 분획을 포함하되, 트라이글리세라이드 분획의 도코사헥사엔산 함량이 약 50중량% 이상이고, 트라이글리세라이드 분획의 도코사펜타엔산 n-6 함량이 약 0.5 내지 약 6중량%인 미생물 오일에 관한 것이다. 일부 양태에서, 미생물 오일은 약 1.5중량% 이하의 트라이글리세라이드 분획의 아라키돈산 함량을 추가로 포함한다.

본 발명은 또한 약 70중량% 이상의 트라이글리세라이드 분획을 포함하되, 트라이글리세라이드 분획의 도코사헥사엔산 함량이 약 40중량% 이상이고, 트라이글리세라이드 분획의 도코사펜타엔산 n-6 함량이 적어도 약 0.5 내지 약 6중량%이고, 도코사헥사엔산 대 도코사펜타엔산 n-6의 비가 약 6:1 초과인 미생물 오일에 관한 것이다.

본 발명은 또한 약 70중량% 이상의 트라이글리세라이드 분획을 포함하되, 트라이글리세라이드 분획의 도코사헥사엔산 함량이 약 60중량% 이상인 미생물 오일에 관한 것이다.

일부 양태에서, 미생물 오일의 트라이글리세라이드 분획중 약 20% 이상의 트라이글리세라이드는 sn-l, sn-2 및 sn-3 위치중 어느 2개로부터 선택된 트라이글리세라이드의 2개의 위치에서 도코사헥사엔산을 함유한다. 일부 양태에서, 미생물 오일의 트라이글리세라이드 분획중 약 5% 이상의 트라이글리세라이드는 트라이글리세라이드의 sn-l, sn-2 및 sn-3 위치 3개 모두에서 도코사헥사엔산을 함유한다.

일부 양태에서, 본 발명의 단리된 미생물(이의 돌연변이체, 변이체 및 재조합체를 포함함)은 상기 미생물로부터 단리된 하나 이상의 분획에 지방산 프로파일을 포함한다. 상기 미생물로부터 단리된 하나 이상의 분획은 총 지방산 분획, 스테롤 에스터 분획, 트라이아실글리세롤 분획, 유리 지방산 분획, 스테롤 분획, 다이아실글리세롤 분획, 극성 분획(인지질 분획을 포함함) 및 이들의 조합을 포함한다. 특정 분획에 대한 지방산 프로파일은 본원에 개시된 특정 분획과 관련된 임의의 지방산 프로파일을 포함할 수 있다.

본 발명은 본 발명의 임의의 미생물을 돌연변이유발시키는 단계, 및 돌연변이체 균주를 단리하는 단계를 포함하는 돌연변이체를 생산하는 방법에 관한 것이다.

배양물 및 단리된 바이오매스

본 발명은 본 발명의 하나 이상의 단리된 미생물을 포함하는 배양물에 관한 것이다. 마이크로플로라(microflora), 예컨대 미세조류 및 트라우스토키트리드를 접종하고 성장시키고 회수하기 위한 다양한 발효 변수는 당해 분야에 공지되어 있다(이의 전체내용이 본원에 참고로서 혼입되는 미국 특허 제5,130,242호 참고). 액체 또는 고체 배지는 천연 또는 인공 해수를 함유할 수 있다. 종속영양성 성장을 위한 탄소원은, 비제한적으로, 글루코스, 프럭토스, 자일로스, 사카로스, 말토스, 가용성 전분, 몰라세스, 푸코스, 글루코사민, 덱스트란, 지방, 오일, 글리세롤, 나트륨 아세테이트 및 만니톨을 포함한다. 질소원은, 비제한적으로, 펩톤, 효모 추출물, 폴리펩톤, 맥아 추출물, 고기 추출물, 카사미노산, 옥수수대 액, 유기 질소원, 나트륨 글루타메이트, 우레아, 무기 질소원, 암모늄 아세테이트, 암모늄 설페이트, 암모늄 클로라이드 및 암모늄 니트레이트를 포함한다.

ATCC 수탁번호 PTA-10212로 기탁된 미생물을 성장시키기 위한 전형적인 배지는 표 1에 제시되어 있다.

[표 1]

전형적인 배양 조건은 다음을 포함할 수 있다:

pH: 약 6.5 내지 약 9.5, 약 6.5 내지 약 8.0 또는 약 6.8 내지 약 7.8;

온도: 약 15 내지 약 30℃, 약 18 내지 약 28℃ 또는 약 21 내지 약 23℃;

용존 산소: 약 0.1 내지 약 100% 포화, 약 5 내지 약 50% 포화 또는 약 10 내지 약 30% 포화; 및/또는

다음과 같이 조절된 글리세롤: 약 5 내지 약 50g/L, 약 10 내지 약 40g/L 또는 약 15 내지 약 35g/L.

일부 양태에서, ATCC 수탁번호 PTA-10212로 기탁된 미생물 또는 이의 돌연변이체, 변이체 또는 재조합체는 탄소원으로서 글리세롤상에서 종속영양적으로 성장하지만, 탄소원으로서 글루코스상에서는 성장하지 않는다.

ATCC 수탁번호 PTA-10208로 기탁된 미생물을 성장시키기 위한 전형적인 배지는 표 2에 제시되어 있다.

[표 2]

전형적인 배양 조건은 다음을 포함할 수 있다:

pH: 약 6.5 내지 약 8.5, 약 6.5 내지 약 8.0 또는 약 7.0 내지 약 8.0;

온도: 약 17 내지 약 30℃, 약 20 내지 약 28℃ 또는 약 22 내지 약 24℃;

용존 산소: 약 2 내지 약 100% 포화, 약 5 내지 약 50% 포화 또는 약 7 내지 약 20% 포화; 및/또는

다음과 같이 조절된 글루코스: 약 5 내지 약 50g/L, 약 10 내지 약 40g/L 또는 약 20 내지 약 35g/L.

일부 양태에서, 발효 부피(배양물 부피)는 약 2L 이상, 약 10L 이상, 약 50L 이상, 약 100L 이상, 약 200L 이상, 약 500L 이상, 약 1,000L 이상, 약 10,000L 이상, 약 20,000L 이상, 약 50,000L 이상, 약 100,000L 이상, 약 150,000L 이상, 약 200,000L 이상 또는 약 250,000L 이상이다. 일부 양태에서, 발효 부피는 약 2L 내지 약 300,000L, 약 2L, 약 10L, 약 50L, 약 100L, 약 200L, 약 500L, 약 1,000L, 약 10,000L, 약 20,000L, 약 50,000L, 약 100,000L, 약 150,000L, 약 200,000L, 약 250,000L 또는 약 300,000L이다.

일부 양태에서, 본 발명은 본 발명의 지방산 프로파일을 포함하는 단리된 바이오매스에 관한 것이다. 일부 양태에서, 상기 바이오매스의 건조 세포 중량의 약 20% 이상, 약 25% 이상, 약 30% 이상, 약 35% 이상, 약 40% 이상, 약 45% 이상, 약 50% 이상, 약 55% 이상, 약 60% 이상, 약 65% 이상, 약 70% 이상, 약 75% 이상 또는 약 80% 이상은 지방산이다. 일부 양태에서, 상기 바이오매스의 건조 세포 중량의 약 20% 초과, 약 25% 초과, 약 30% 초과, 약 35% 초과, 약 40% 초과, 약 45% 초과, 약 50% 초과, 약 55% 초과 또는 약 60% 초과는 지방산이다. 일부 양태에서, 상기 바이오매스의 건조 세포 중량의 약 20 내지 약 55중량%, 약 20 내지 약 60중량%, 약 20 내지 약 70중량%, 약 20 내지 약 80중량%, 약 30 내지 약 55중량%, 약 30 내지 약 70중량%, 약 30 내지 약 80중량%, 약 40 내지 약 60중량%, 약 40 내지 약 70중량%, 약 40 내지 약 80중량%, 약 50 내지 약 60중량%, 약 50 내지 약 70중량%, 약 50 내지 약 80중량%, 약 55 내지 약 70중량%, 약 55 내지 약 80중량%, 약 60 내지 약 70중량% 또는 약 60 내지 약 80중량%는 지방산이다. 일부 양태에서, 바이오매스는 약 10중량% 초과, 약 12중량% 이상, 약 15중량% 이상, 약 20중량% 이상, 약 25중량% 이상, 약 30중량% 이상, 약 35중량% 이상, 약 40중량% 이상 또는 약 45중량% 이상의 지방산으로서 EPA를 포함한다. 일부 양태에서, 상기 바이오매스는 약 10 내지 약 55중량%, 약 12 내지 약 55중량%, 약 15 내지 약 55중량%, 약 20 내지 약 55중량%, 약 20 내지 약 40중량% 또는 약 20 내지 약 30중량%의 지방산으로서 EPA를 포함한다. 일부 양태에서, 상기 바이오매스는 트라이아실글리세롤 분획을 포함하고, 상기 트라이아실글리세롤 분획의 약 12중량% 이상, 약 13중량% 이상, 약 14중량% 이상, 약 15중량% 이상, 약 16중량% 이상, 약 17중량% 이상, 약 18중량% 이상, 약 19중량% 이상 또는 약 20중량% 이상은 EPA이다. 일부 양태에서, 상기 바이오매스는 트라이아실글리세롤 분획을 포함하고, 상기 트라이아실글리세롤 분획의 EPA 함량은 적어도 약 12 내지 약 55중량%, 약 12 내지 약 50중량%, 약 12 내지 약 45중량%, 적어도 약 12 내지 약 40중량%, 적어도 약 12 내지 약 35중량% 또는 적어도 약 12 내지 약 30중량%, 약 15 내지 약 55중량%, 약 15 내지 약 50중량%, 약 15 내지 약 45중량%, 약 15 내지 약 40중량%, 약 15 내지 약 35중량%, 약 15 내지 약 30중량%, 약 20 내지 약 55중량%, 약 20 내지 약 50중량%, 약 20 내지 약 45중량%, 적어도 약 20 내지 약 40중량%, 적어도 약 20 내지 약 35중량% 또는 약 20 내지 약 30중량%이다. 일부 양태에서, 상기 바이오매스의 건조 세포 중량의 약 20중량% 이상, 약 25중량% 이상, 약 30중량% 이상, 약 35중량% 이상, 약 40중량% 이상, 약 50중량% 이상 또는 약 60중량% 이상은 DHA이다. 일부 양태에서, 상기 바이오매스의 건조 세포 중량의 약 20 내지 약 60중량%, 약 25 내지 약 60중량%, 약 25 내지 약 50중량%, 약 25 내지 약 45중량%, 약 30 내지 약 50중량% 또는 약 35 내지 약 50중량%는 DHA이다. 일부 양태에서, 상기 바이오매스는 약 10중량% 이하, 약 9중량% 이하, 약 8중량% 이하, 약 7중량% 이하, 약 6중량% 이하, 약 5중량% 이하, 약 4중량% 이하, 약 3중량% 이하, 약 2중량% 이하 또는 약 1중량% 이하의 지방산으로서 DHA를 포함한다. 일부 양태에서, 상기 바이오매스는 약 1 내지 약 10중량%, 약 1 내지 약 5중량%, 약 2 내지 약 5중량%, 약 3 내지 약 5중량% 또는 약 3 내지 약 10중량%의 지방산으로서 DHA를 포함한다. 일부 양태에서, 상기 바이오매스는 DHA를 실질적으로 함유하지 않는다. 일부 양태에서, 상기 바이오매스는 약 0.1 내지 약 5중량% 미만, 약 0.1 내지 약 4중량%, 약 0.1 내지 약 3중량%, 약 0.1 내지 약 2중량%, 약 0.2 내지 약 5중량% 미만, 약 0.2 내지 약 4중량%, 약 0.2 내지 약 3중량%, 약 0.2 내지 약 2중량%, 약 0.3 내지 약 2중량%, 약 0.1 내지 약 0.5중량%, 약 0.2 내지 약 0.5중량%, 약 0.1 내지 약 0.4중량%, 약 0.2 내지 약 0.4중량%, 약 0.5 내지 약 2중량%, 약 1 내지 약 2중량%, 약 0.5 내지 약 1.5중량% 또는 약 1 내지 약 1.5중량%의 지방산으로서 ARA를 포함한다. 일부 양태에서, 상기 바이오매스는 약 5중량% 미만, 약 4중량% 이하, 약 3중량% 이하, 약 2중량% 이하, 약 1.5중량% 이하, 약 1중량% 이하, 약 0.5중량% 이하, 약 0.4중량% 이하, 약 0.3중량% 이하, 약 0.2중량% 이하 또는 약 0.1중량% 이하의 지방산으로서 ARA를 포함한다. 일부 양태에서, 상기 바이오매스에는 ARA가 실질적으로 존재하지 않는다. 일부 양태에서, 상기 바이오매스는 약 0.4 내지 약 2중량%, 약 0.4 내지 약 3중량%, 약 0.4 내지 약 4중량%, 약 0.4 내지 약 5중량%, 약 0.4% 내지 약 5중량% 미만, 약 0.5 내지 약 1중량%, 약 0.5 내지 약 2중량%, 약 0.5 내지 약 3중량%, 약 0.5 내지 약 4중량%, 약 0.5 내지 약 5중량%, 약 0.5% 내지 약 5중량% 미만, 약 1 내지 약 2중량%, 약 1 내지 약 3중량%, 약 1 내지 약 4중량%, 약 1 내지 약 5중량% 또는 약 1 내지 약 5중량% 미만의 지방산으로서 DPA n-6을 포함한다. 일부 양태에서, 상기 바이오매스는 약 5중량% 이하, 약 5중량% 미만, 약 4중량% 이하, 약 3중량% 이하, 약 2중량% 이하, 약 1중량% 이하, 약 0.75중량% 이하, 약 0.6중량% 이하 또는 약 0.5중량% 이하의 지방산으로서 DPA n-6을 포함한다. 일부 양태에서, 상기 바이오매스는 DPA n-6을 실질적으로 포함하지 않는다. 일부 양태에서, 상기 바이오매스는 올레산(18:1 n-9), 리놀레산(18:2 n-6), 리놀렌산(18:3 n-3), 에이코센산(20:1 n-9), 에루크산(22:1 n-9) 또는 이들의 조합을 약 5중량% 이하, 약 5중량% 미만, 약 4중량% 이하, 약 3중량% 이하 또는 약 2중량% 이하로 갖는 지방산을 포함한다.

본 발명의 단리된 바이오매스의 특성은 외인성으로 도입된 물질보다 단리된 바이오매스의 내인성 또는 천연 특성과 관련되어 있다. 일부 양태에서, 단리된 바이오매스는 폴리비닐피롤리돈을 함유하지 않거나, 폴리비닐피롤리돈을 함유하는 배양물로부터 단리되지 않는다.

본 발명은 바이오매스를 생산하는 방법에 관한 것이다. 일부 양태에서, 본 발명의 바이오매스를 생산하는 방법은 본 발명의 임의의 단리된 미생물 또는 이의 혼합물을 배양물에서 성장시켜 바이오매스를 생산하는 단계를 포함한다. 본 발명은 상기 방법으로 생산된 바이오매스에 관한 것이다.

일부 양태에서, 바이오매스는 오메가-3 다중불포화 지방산을 추가로 포함하는 지방산을 포함하되, 오메가-3 다중불포화 지방산은 DHA 및 EPA를 오메가-3 다중불포화 지방산의 총량의 약 90중량% 이상의 양으로 포함하고, EPA의 양은 EPA 및 DHA의 총량의 약 6 내지 약 65중량%이다. 특히, EPA의 양이 EPA 및 DHA의 총량의 약 6 내지 약 28중량%인 바이오매스가 제공된다. 또한, EPA의 양이 EPA 및 DHA의 총량의 약 36 내지 약 65중량%인 바이오매스가 본원에 제공된다. 보다 특히, EPA의 양이 EPA 및 DHA의 총량의 약 28 내지 약 36중량%인 바이오매스가 제공된다.

본원에 제공된 일부 양태는 DHA 및 EPA를 추가로 포함하는 지방산을 포함하되, EPA의 양이 EPA 및 DHA의 총 중량의 약 15 내지 약 60중량%인 바이오매스를 포함한다.

본 발명의 일부 양태는 ATCC 수탁번호 PTA-9695로 기탁된 트라우스토키트리드를 포함하는 배양물 또는 돌연변이체 균주에 관한 것이다. 마이크로플로라를 접종하고 성장시키고 회수하기 위한 다양한 발효 변수는 당해 분야, 예컨대 미국 특허 제5,130,242호에 공지되어 있다. 트라우스토키트리드의 성장을 위한 임의의 전통적인 배지가 사용될 수 있다. 액체 또는 고체 배지는 천연 또는 인공 해수를 함유할 수 있다. 탄소원은, 비제한적으로, 글루코스, 프럭토스, 자일로스, 사카로스, 말토스, 가용성 전분, 몰라세스, 푸코스, 글루코사민, 덱스트란, 지방, 오일, 글리세롤, 나트륨 아세테이트 및 만니톨을 포함한다. 질소원은, 비제한적으로, 펩톤, 효모 추출물, 폴리펩톤, 맥아 추출물, 고기 추출물, 카사미노산, 옥수수대 액, 유기 질소원, 나트륨 글루타메이트, 우레아, 무기 질소원, 암모늄 아세테이트, 암모늄 설페이트, 암모늄 클로라이드, 암모늄 니트레이트 및 나트륨 설페이트를 포함한다. 전형적인 배지는 표 3에 제시된다:

[표 3]

전형적인 배양 조건은 다음을 포함할 수 있다:

pH: 약 6.5 내지 약 8.5, 약 6.5 내지 약 8.0 또는 약 7.0 내지 약 7.5;

온도: 약 17 내지 약 30℃, 약 20 내지 약 25℃ 또는 약 22 내지 약 23℃;

용존 산소: 약 5 내지 약 100% 포화, 약 10 내지 약 80% 포화 또는 약 20 내지 약 50% 포화; 및

다음과 같이 제어된 글루코스: 약 5 내지 약 50g/L, 약 10 내지 약 40g/L 또는 약 20 내지 약 35g/L.

일부 양태에서, 배지는 약 5% 이상, 약 10% 이상, 약 20% 이상, 약 30% 이상, 약 40% 이상, 약 50% 이상, 약 60% 이상, 약 70% 이상, 약 80% 이상 또는 약 90% 이상의 용존 산소를 포화 수준의 백분율로서 포함한다. 일부 양태에서, 배지는 약 5 내지 약 20%, 약 5 내지 약 50%, 약 5 내지 약 100%, 약 10 내지 약 20%, 약 10 내지 약 50%, 약 10 내지 약 100%, 약 20 내지 약 50% 또는 약 20 내지 약 100%의 용존 산소를 포화 수준의 백분율로서 포함한다.

본 발명은 또한 본 발명의 트라우스토키트리드의 단리된 바이오매스에 관한 것이다. 본 발명의 단리된 트라우스토키트리드 바이오매스는 미국 특허 제5,130,242호 및 미국 특허출원공개 제2002/0001833호에 기술된 바와 같은, 트라우스토키트리드 바이오매스의 단리를 위한 임의의 전통적인 방법에 의해 수득된 수거된 세포 바이오매스이다.

일부 양태에서, 각각 1L의 배양물로부터 단리된 바이오매스의 건조 세포 중량은 탄소, 질소 및 영양분의 공급원, 및 약 950 내지 약 8,500ppm 클로라이드 이온을 포함하는 약 pH 6.5 내지 약 pH 8.5의 배지에서 약 17 내지 약 30℃에서 약 7일 동안 성장시킨 후 약 50g 이상, 약 60g 이상, 약 70g 이상, 약 80g 이상, 약 100g 이상, 약 120g 이상, 약 140g 이상, 약 160g 이상, 약 180g 이상 또는 약 200g 이상이다. 일부 양태에서, 각각 1L의 배양물로부터 단리된 바이오매스의 건조 세포 중량은 탄소, 질소 및 영양분의 공급원, 및 약 950 내지 약 8,500ppm 클로라이드 이온을 포함하는 약 pH 6.5, 약 pH 7, 약 pH 7.5, 약 pH 8.0 또는 약 pH 8.5의 배지에서 약 17℃, 약 18℃, 약 19℃, 약 20℃, 약 21℃, 약 22℃, 약 23℃, 약 24℃, 약 25℃, 약 26℃, 약 27℃, 약 28℃, 약 29℃ 또는 약 30℃에서 약 7일 동안 성장시킨 후 약 50g 이상, 약 60g 이상, 약 70g 이상, 약 80g 이상, 약 100g 이상, 약 120g 이상, 약 140g 이상, 약 160g 이상, 약 180g 이상 또는 약 200g 이상이다. 일부 양태에서, 각각 1L의 배양물로부터 단리된 바이오매스의 건조 세포 중량은 탄소, 질소 및 영양분의 공급원, 및 약 950 내지 약 8,500ppm 클로라이드 이온을 포함하는 약 pH 6.5 내지 약 pH 8.5의 배지에서 약 17 내지 약 30℃에서 약 7일 동안 성장시킨 후 약 50 내지 약 200g이다. 일부 양태에서, 각각 1L의 배양물로부터 단리된 바이오매스의 건조 세포 중량은 탄소, 질소 및 영양분의 공급원, 및 약 950 내지 약 8,500ppm 클로라이드 이온을 포함하는 약 pH 6.5, 약 pH 7, 약 pH 7.5, 약 pH 8.0 또는 약 pH 8.5의 배지에서 약 17℃, 약 18℃, 약 19℃, 약 20℃, 약 21℃, 약 22℃, 약 23℃, 약 24℃, 약 25℃, 약 26℃, 약 27℃, 약 28℃, 약 29℃ 또는 약 30℃에서 약 7일 동안 성장시킨 후 약 50 내지 약 200g이다.

일부 양태에서, 단리된 트라우스토키트리드 배양물은 탄소, 질소 및 영양분의 공급원, 및 약 950 내지 약 8,500ppm 클로라이드 이온을 포함하는 약 pH 6.5 내지 약 pH 8.5의 배지에서 약 17 내지 약 30℃에서 약 7일 동안 성장시킨 후 약 2g/L/일 이상, 약 4g/L/일 이상 또는 약 8g/L/일 이상의 오메가-3 지방산 생산성을 갖는다. 일부 양태에서, 단리된 트라우스토키트리드 배양물은 탄소, 질소 및 영양분의 공급원, 및 약 950 내지 약 8,500ppm 클로라이드 이온을 포함하는 약 pH 6.5 내지 약 pH 8.5의 배지에서 약 17 내지 약 30℃에서 약 7일 동안 성장시킨 후 약 1g/L/일 내지 약 20g/L/일, 약 2g/L/일 내지 약 15g/L/일, 약 2g/L/일 내지 약 10g/L/일, 약 3g/L/일 내지 약 10g/L/일 또는 약 4g/L/일 내지 약 9g/L/일의 오메가-3 지방산 생산성을 갖는다.

일부 양태에서, 본 발명은 본 발명의 지방산 프로파일을 포함하는 단리된 트라우스토키트리드 바이오매스에 관한 것이다. 일부 양태에서, 바이오매스의 건조 세포 중량의 약 50% 이상, 약 60% 이상, 약 70% 이상 또는 약 80% 이상은 지방산이다. 일부 양태에서, 바이오매스의 건조 세포 중량의 약 50% 초과, 약 55% 초과 또는 약 60% 초과는 지방산이다. 일부 양태에서, 바이오매스의 건조 세포 중량의 약 50 내지 약 60중량%, 약 50 내지 약 70중량%, 약 50 내지 약 80중량%, 약 55 내지 약 70중량%, 약 55 내지 약 80중량%, 약 60 내지 약 70중량% 또는 약 60 내지 약 80중량%는 지방산이다. 일부 양태에서, 바이오매스는 약 50중량% 이상, 약 60중량% 이상, 약 70중량% 이상 또는 약 80중량% 이상의 지방산으로서 오메가-3 지방산을 포함한다. 일부 양태에서, 바이오매스는 약 50 내지 약 60중량%, 약 50 내지 약 70중량% 또는 약 50 내지 약 80중량%의 지방산으로서 오메가-3 지방산을 포함한다. 일부 양태에서, 바이오매스는 약 50중량% 이상, 약 55중량% 이상, 약 60중량% 이상, 약 65중량% 이상, 약 70중량% 이상, 약 75중량% 이상 또는 약 80중량% 이상의 지방산으로서 DHA를 포함한다. 일부 양태에서, 바이오매스는 약 50 내지 약 60중량%, 약 50 내지 약 70중량% 또는 약 50 내지 약 80중량%의 지방산으로서 DHA를 포함한다. 일부 양태에서, 바이오매스의 건조 세포 중량의 약 25중량% 이상, 약 30중량% 이상, 약 40중량% 이상, 약 50중량% 이상 또는 약 60중량% 이상은 도코사헥사엔산이다. 일부 양태에서, 바이오매스의 건조 세포 중량의 약 25 내지 약 65중량%, 약 25 내지 약 50중량%, 약 30 내지 약 40중량% 또는 약 25 내지 약 35중량%는 도코사헥사엔산이다. 일부 양태에서, 바이오매스는 약 10중량% 이하, 약 9중량% 이하, 약 8중량% 이하, 약 7중량% 이하, 약 6중량% 이하, 약 5중량% 이하, 약 4중량% 이하, 약 3중량% 이하, 약 2중량% 이하 또는 약 1중량% 이하의 지방산으로서 EPA를 포함한다. 일부 양태에서, 바이오매스는 약 1 내지 약 10중량%, 약 1 내지 약 5중량%, 약 2 내지 약 5중량%, 약 3 내지 약 5중량% 또는 약 3 내지 약 10중량%의 지방산으로서 EPA를 포함한다. 일부 양태에서, 바이오매스에는 EPA가 실질적으로 존재하지 않는다. 일부 양태에서, 바이오매스는 약 5:1 이상, 약 7:1 이상, 약 10:1 이상, 약 11:1 이상, 약 14:1 이상, 약 15:1 이상, 약 17:1 이상, 약 20:1 이상, 약 25:1 이상, 약 50:1 이상 또는 약 100:1 이상의 DHA 대 EPA의 중량 비를 포함하고, 바이오매스는 약 10중량% 이하의 지방산으로서 EPA를 포함한다. 일부 양태에서, 바이오매스는 약 0.1 내지 0.2중량%, 약 0.1 내지 약 0.3중량%, 약 0.1 내지 약 0.4중량%, 약 0.1 내지 약 0.5중량% 또는 약 0.1 내지 약 1.5중량%의 지방산으로서 ARA를 포함한다. 일부 양태에서, 바이오매스는 약 1.5중량% 이하, 약 1중량% 이하, 약 0.5중량% 이하, 약 0.4중량% 이하, 약 0.3중량% 이하, 약 0.2중량% 이하 또는 약 0.1중량% 이하의 지방산으로서 ARA를 포함한다. 일부 양태에서, 바이오매스에는 ARA가 실질적으로 존재하지 않는다. 일부 양태에서, 바이오매스는 약 20:1 이상, 약 40:1 이상, 약 60:1 이상, 약 80:1 이상, 약 100:1 이상, 약 150:1 이상, 약 200:1 이상, 약 250:1 이상 또는 약 300:1 이상의 DHA 대 ARA의 중량 비를 포함한다. 일부 양태에서, 바이오매스는 약 0.5 내지 약 1중량%, 약 0.5 내지 약 2중량%, 약 0.5 내지 약 5중량%, 약 0.5 내지 약 6중량%, 약 1 내지 약 5중량%, 약 1 내지 약 6중량%, 약 2 내지 약 5중량% 또는 약 2 내지 약 6중량%의 지방산으로서 DPA n-6을 포함한다. 일부 양태에서, 바이오매스는 약 6중량% 이하, 약 5중량% 이하, 약 2중량% 이하, 약 1중량% 이하 또는 약 0.5중량% 이하의 지방산으로서 DPA n-6을 포함한다. 일부 양태에서, 바이오매스에는 DPA n-6이 실질적으로 존재하지 않는다. 일부 양태에서, 바이오매스는 약 6:1 초과, 약 8:1 이상, 약 10:1 이상, 약 15:1 이상, 약 20:1 이상, 약 25:1 이상, 약 50:1 이상 또는 약 100:1 이상의 DHA 대 DPA n-6의 중량 비를 포함한다. 일부 양태에서, 바이오매스는 각각 약 5중량% 이하, 약 4중량% 이하, 약 3중량% 이하 또는 약 2중량% 이하의 리놀레산(18:2 n-6), 리놀렌산(18:3 n-3), 에이코센산(20: 1 n-9) 및 에루크산(22:1 n-9)을 갖는 지방산을 포함한다.

다른 양태에서, 오메가-3 다중불포화 지방산을 추가로 포함하는 지방산을 포함하되, 오메가-3 다중불포화 지방산이 DHA 및 EPA를 오메가-3 다중불포화 지방산의 총량의 약 58 내지 68중량% 이상, 특히 약 60중량% 이상의 양으로 포함하고, EPA의 양이 EPA 및 DHA의 총 중량의 총량의 약 5 내지 약 60중량%인 바이오매스가 본원에 제공된다.

본 발명의 단리된 바이오매스의 특성은 외인성 도입된 물질보다는 단리된 바이오매스의 내인성 또는 천연 특성과 관련된다.

미생물 오일

상기 방법에 의해 제조된 오일, 특히 미생물 오일이 본원에 제공된다.

일부 양태에서, 미생물 오일은 오메가-3 다중불포화 지방산을 추가로 포함하는 지방산을 포함하되, 오메가-3 다중불포화 지방산은 DHA 및 EPA를 오메가-3 다중불포화 지방산의 총량의 약 90중량% 이상의 양으로 포함하고, EPA의 양은 EPA 및 DHA의 총량의 약 6 내지 약 65중량%이다. 특히, EPA의 양이 EPA 및 DHA의 총량의 약 6 내지 약 28중량%인 미생물 오일이 제공된다. 또한, EPA의 양이 EPA 및 DHA의 총량의 약 36 내지 약 65중량%인 미생물 오일이 본원에 제공된다. 보다 특히, EPA의 양이 EPA 및 DHA의 총량의 약 28 내지 약 36중량%인 미생물 오일이 제공된다.

추가 양태에서, DHA 및 EPA를 추가로 포함하는 지방산을 포함하되, EPA의 양이 EPA 및 DHA의 총 중량의 약 15 내지 약 60중량%인 미생물 오일이 본원에 제공된다.

다른 양태에서, 오메가-3 다중불포화 지방산을 추가로 포함하는 지방산을 포함하되, 오메가-3 다중불포화 지방산이 DHA 및 EPA를 오메가-3 다중불포화 지방산의 총량의 약 58 내지 68중량% 이상, 특히 약 60중량% 이상의 양으로 포함하고, EPA의 양이 EPA 및 DHA의 총 중량의 총량의 약 5 내지 약 60중량%인 미생물 오일이 본원에 제공된다.

본 발명은 본 발명의 지방산 프로파일을 포함하는 미생물 오일에 관한 것이다. 본 발명의 미생물 오일은 약 35중량% 이상의 트라이아실글리세롤 분획을 포함하는 "미정제 오일" 또는 "정제 오일"이다. "미정제 오일"은 추가의 처리 없이 미생물의 바이오매스로부터 추출되는 오일이다. "정제 오일"은 미정제 오일을 정제, 표백 및/또는 탈취의 표준 공정으로 처리함으로써 수득되는 오일이다(전체내용이 본원에 참고로서 혼입되는 미국 특허 제5,130,242호 참고). 미생물 오일은 또한 본원에 기재된 바와 같은 "최종 오일"을 포함하고, 이는 식물성 오일로 희석된 정제 오일이다. 일부 양태에서, 최종 오일은 고도 올레산 해바라기 오일로 희석된 정제 오일이다. 본원에 사용된 용어 "미생물"은, 비제한적으로, 용어 "미세조류", "트라우스토키트리드" 및 본원에 기재된 임의의 기탁된 미생물과 관련된 분류학상 분류를 포함한다. 본원에 기재된 기탁된 미생물을 포함하여 본원의 임의의 미생물과 관련하여 사용된 용어 "트라우스토키트리알레스", "트라우스토키트리드", "쉬조키트리움" 및 "트라우스토키트리움"은 이용가능한 계통발생학상 정보를 포함하는 현재의 분류학상 분류에 기초하고, 분류학상 분류가 본 출원의 출원일 이후에 재분류되는 경우에 한정되는 것으로 의도되지 않는다.

일부 양태에서, 본원에 기재된 지방산은 지방산 에스터이다. 일부 양태에서, 지방산 에스터는 오메가-3 지방산, 오메가-6 지방산 및 이들의 조합의 에스터를 포함한다. 일부 양태에서, 지방산 에스터는 DHA 에스터, EPA 에스터 또는 이들의 조합이다. 일부 양태에서, 본원에 기재된 오일 또는 이의 분획은 에스터화되어, 지방산 에스터를 포함하는 오일 또는 이의 분획을 생산한다. 용어 "에스터"는 지방산 분자의 카복실산 기중의 수소가 또 다른 치환기로 치환된 것을 지칭한다. 전형적인 에스터는 당해 분야에 공지되어 있고, 문헌[Higuchi, T. and V. Stella in Pro-drugs as Novel Delivery Systems, Vol. 14, A.C.S. Symposium Series, Bioreversible Carriers in Drug Design, Ed. Edward B. Roche, American Pharmaceutical Association, Pergamon Press, 1987, and Protective Groups in Organic Chemistry, McOmie ed., Plenum Press, New York, 1973]에 언급되어 있다. 에스터의 예는 메틸, 에틸, 프로필, 부틸, 펜틸, t-부틸, 벤질, 니트로벤질, 메톡시벤질, 벤즈하이드릴 및 트라이클로로에틸을 포함한다. 일부 양태에서, 에스터는 카복실산 보호 에스터 기, 아르알킬(예: 벤질, 펜에틸)과의 에스터, 저급-알케닐(예: 알릴, 2-부테닐)과의 에스터, 저급-알콕시-저급-알킬(예: 메톡시메틸, 2-메톡시에틸, 2-에톡시에틸)과의 에스터, 저급-알카노일옥시-저급-알킬(예: 아세톡시메틸, 피발로일옥시메틸, 1-피발로일옥시에틸)과의 에스터, 저급-알콕시카보닐-저급-알킬(예: 메톡시카보닐메틸, 이소프로폭시카보닐메틸)과의 에스터, 카복시-저급-알킬(예: 카복시메틸)과의 에스터, 저급-알콕시카보닐옥시-저급-알킬(예: 1-(에톡시카보닐옥시)에틸, 1-(사이클로헥실옥시카보닐옥시)에틸)과의 에스터, 카바모일옥시-저급-알킬(예: 카바모일옥시메틸)과의 에스터 등이다. 일부 양태에서, 첨가된 치환기는 선형 또는 사이클릭 탄화수소 기, 예를 들면, C1-C6 알킬, C1-C6 사이클로알킬, C1-C6 알케닐 또는 C1-C6 아릴 에스터이다. 일부 양태에서, 에스터는 알킬 에스터, 예를 들면, 메틸 에스터, 에틸 에스터 또는 프로필 에스터이다. 일부 양태에서, 에스터 치환기는 당해 지방산이 정제된 또는 반-정제된 상태로 존재하는 경우에 유리 지방산 분자에 부가된다. 다르게는, 지방산 에스터는 트라이아실글리세롤을 에스터로 전환 시에 형성된다.

본 발명은 미생물 오일을 생산하는 방법에 관한 것이다. 일부 양태에서, 상기 방법은 본 발명의 임의의 단리된 미생물 또는 이의 혼합물을 배양물에서 성장시켜 오메가-3 지방산을 포함하는 미생물 오일을 생산하는 단계를 포함한다. 일부 양태에서, 상기 방법은 미생물 오일을 추출하는 단계를 추가로 포함한다. 일부 양태에서, 상기 방법은 본 발명의 임의의 바이오매스 또는 이의 혼합물로부터 오메가-3 지방산을 포함하는 미생물 오일을 추출하는 단계를 포함한다. 일부 양태에서, 상기 방법은 단리된 미생물을 종속영양적으로 성장시키는 단계를 포함하고, 상기 배양물은 본원에 기재된 탄소원을 포함한다. 미생물 오일은 신선하게 수거된 바이오매스로부터 추출하거나, 부패를 방지하는 조건하에 저장된 사전 수거된 바이오매스로부터 추출할 수 있다. 공지된 방법을 사용하여 본 발명의 미생물을 배양하고, 상기 배양물로부터 바이오매스를 단리하고, 상기 바이오매스로부터 미생물 오일을 추출하고, 상기 바이오매스로부터 추출된 오일의 지방산 프로파일을 분석할 수 있다(전체내용이 본원에 참고로서 혼입된 미국 특허 제5,130,242호 참고). 본 발명은 본 발명의 임의의 방법으로 생산한 미생물 오일에 관한 것이다.

일부 양태에서, 미생물 오일은 효소 추출 방법에 의해 추출된다. 일부 양태에서, 미생물 오일은 기계적 추출 방법으로 추출된다. 일부 양태에서, 기계적 추출 방법은 (1) 균질화기를 통해 저온살균 발효 부용을 처리하여 세포 용해 및 세포로부터 오일의 방출을 보조하는 단계; (2) 균질화 후에 발효 부용에 이소프로필 알콜을 첨가하여 오일 및 물 에멀젼을 파쇄하는 단계; (3) 혼합물을 원심분리하여 오일 상을 회수하는 단계; 및 (4) 산화방지제를 첨가하면서 진공하에 건조시키는 단계중의 하나 이상을 포함한다. 일부 양태에서, 미정제 오일은 정제된다. 일부 양태에서, 미정제 오일의 정제는 (1) 미정제 오일을 정제 탱크로 펌핑하고 오일을 가열한 다음, 혼합하면서 산 용액을 첨가하는 단계; (2) 산 처리 후에 가성 용액을 오일에 첨가하는 단계; (3) 미정제 오일을 재가열한 다음, 원심분리하여 정제 오일로부터 중질 상을 단리하는 단계; (4) 예를 들면, 트라이실(TriSyl: 등록상표), 점토 및/또는 여과를 사용하여 잔류 극성 화합물, 미량 금속 및 산화 생성물을 정제 오일로부터 제거하는 단계; (5) 표백된 오일을 냉각 여과하여 고융점 성분을 오일로부터 추가로 제거함으로써 목적하는 수준의 정화도를 수득하는 단계; (6) 오일을 가열하고, 이어서 오일을 냉각시킨 다음, 고융점 트라이글리세라이드 및 왁스가 결정화되도록 하는 시간 동안 유지하는 단계; (7) 필터 보조제를 냉각된 오일에 첨가한 다음, 여과에 의해 결정화 고체를 제거하는 단계; (8) 냉각 여과 후, 고온 및 진공하에 작동되는 탈취기를 사용하여, 예를 들면, 악취 및 풍미를 유발할 수 있는 과산화물 및 임의의 잔류 저분자량 화합물을 제거하는 단계; (9) 오일을 탈취된 공급물 탱크로 옮기고, 공기 제거하고, 예를 들면, 충전 컬럼 탈취기에서 탈취시키는 단계; 및 (10) 예를 들면, 탈취 사이클의 종료 시 질소 블랭킷하에 냉각시키고, 탈취된 오일에 적합한 산화방지제를 첨가하여 산화 안정성을 제공하는 단계중의 하나 이상을 포함한다.

일부 양태에서, 상기 미생물 오일은 약 0중량%, 약 0.1중량% 이상, 약 0.2중량% 이상, 약 0.5중량% 이상, 약 1중량% 이상, 약 1.5중량% 이상, 약 2중량% 이상 또는 약 5중량% 이상의 스테롤 에스터 분획을 포함한다. 일부 양태에서, 미생물 오일은 약 0 내지 약 1.5중량%, 약 0 내지 약 2중량%, 약 0 내지 약 5중량%, 약 1 내지 약 1.5중량%, 약 0.2 내지 약 1.5중량%, 약 0.2 내지 약 2중량% 또는 약 0.2 내지 약 5중량%의 스테롤 에스터 분획을 포함한다. 일부 양태에서, 미생물 오일은 약 5중량% 이하, 약 4중량% 이하, 약 3중량% 이하, 약 2중량% 이하, 약 1중량% 이하, 약 0.5중량% 이하, 약 0.3중량% 이하, 약 0.2중량% 이하, 약 0.5중량% 이하, 약 0.4중량% 이하, 약 0.3중량% 이하 또는 약 0.2중량% 이하의 스테롤 에스터 분획을 포함한다.

일부 양태에서, 미생물 오일은 약 35중량% 이상, 약 40중량% 이상, 약 45중량% 이상, 약 50중량% 이상, 약 55중량% 이상, 약 60중량% 이상, 약 65중량% 이상, 약 70중량% 이상, 약 75중량% 이상, 약 80중량% 이상, 약 85중량% 이상 또는 약 90중량% 이상의 트라이아실글리세롤 분획을 포함한다. 일부 양태에서, 미생물 오일은 약 35 내지 약 98중량%, 약 35 내지 약 90중량%, 약 35 내지 약 80중량%, 약 35 내지 약 70중량%, 약 35 내지 약 70중량%, 약 35 내지 약 65중량%, 약 40 내지 약 70중량%, 약 40 내지 약 65중량%, 약 40 내지 약 55중량%, 약 40 내지 약 50중량%, 약 65 내지 약 95중량%, 약 75 내지 약 95중량%, 약 75 내지 약 98중량%, 약 80 내지 약 95중량%, 약 80 내지 약 98중량%, 약 90 내지 약 96중량%, 약 90 내지 약 97중량%, 약 90 내지 약 98중량%, 약 90중량%, 약 95중량%, 약 97중량% 또는 약 98중량%의 트라이아실글리세롤 분획을 포함한다.

일부 양태에서, 미생물 오일은 약 10중량% 이상, 약 11중량% 이상, 약 12중량% 이상, 약 13중량% 이상, 약 14중량% 이상, 약 15중량% 이상, 약 16중량% 이상, 약 17중량% 이상, 약 18중량% 이상, 약 19중량% 이상 또는 약 20중량% 이상의 다이아실글리세롤 분획을 포함한다. 일부 양태에서, 미생물 오일은 약 10 내지 약 45중량%, 약 10 내지 약 40중량%, 약 10 내지 약 35중량%, 약 10 내지 약 30중량%, 약 15 내지 약 40중량%, 약 15 내지 약 35중량% 또는 약 15 내지 약 30중량%의 다이아실글리세롤 분획을 포함한다. 일부 양태에서, 미생물 오일은 약 0.2중량% 이상, 약 0.3중량% 이상, 약 0.4중량% 이상, 약 0.5중량% 이상, 약 1중량% 이상, 약 5중량% 이상, 약 10중량% 이상, 약 11중량% 이상, 약 12중량% 이상, 약 13중량% 이상, 약 14중량% 이상, 약 15중량% 이상, 약 16중량% 이상, 약 17중량% 이상, 약 18중량% 이상, 약 19중량% 이상 또는 약 20중량% 이상의 1,2-다이아실글리세롤 분획을 포함한다. 일부 양태에서, 미생물 오일은 약 0.2 내지 약 45중량%, 약 0.2 내지 약 30중량%, 약 0.2 내지 약 20중량%, 약 0.2 내지 약 10중량%, 약 0.2 내지 약 5중량%, 약 0.2 내지 약 1중량%, 약 0.2 내지 약 0.8중량%, 약 0.4 내지 약 45중량%, 약 0.4 내지 약 30중량%, 약 0.4 내지 약 20중량%, 약 0.4 내지 약 10중량%, 약 0.4 내지 약 5중량%, 약 0.4 내지 약 1중량%, 약 0.4 내지 약 0.8중량%, 약 0.5 내지 약 1중량%, 약 0.5 내지 약 0.8중량%, 약 10 내지 약 45중량%, 약 10 내지 약 40중량%, 약 10 내지 약 35중량%, 약 10 내지 약 30중량%, 약 15 내지 약 40중량%, 약 15 내지 약 35중량%, 약 15 내지 약 30중량% 또는 약 15 내지 약 25중량%의 다이아실글리세롤 분획을 포함한다. 일부 양태에서, 미생물 오일은 약 0.1중량% 이상, 약 0.2중량% 이상, 약 0.5중량% 이상, 약 1중량% 이상, 약 2중량% 이상, 약 2.5중량% 이상 또는 약 3중량% 이상의 1,3-다이아실글리세롤 분획을 포함한다. 일부 양태에서, 미생물 오일은 약 0.3중량% 이상, 약 0.4중량% 이상, 약 0.5중량% 이상, 약 1중량% 이상, 약 1.5중량% 이상, 약 2중량% 이상 또는 약 5중량% 이상의 스테롤 분획을 포함한다.

일부 양태에서, 미생물 오일은 약 0.3 내지 약 5중량%, 약 0.3 내지 약 2중량%, 약 0.3 내지 약 1.5중량%, 약 0.5 내지 약 1.5중량%, 약 1 내지 약 1.5중량%, 약 0.5 내지 약 2중량%, 약 0.5 내지 약 5중량%, 약 1 내지 약 2중량% 또는 약 1 내지 약 5중량%의 스테롤 분획을 포함한다. 일부 양태에서, 미생물 오일은 약 5중량% 이하, 약 4중량% 이하, 약 3중량% 이하, 약 2중량% 이하, 약 1.5중량% 이하 또는 약 1중량% 이하의 스테롤 분획을 포함한다.

일부 양태에서, 미생물 분획은 약 2중량% 이상, 약 5중량% 이상 또는 약 8중량% 이상의 인지질 분획을 포함한다. 일부 양태에서, 미생물 오일은 약 2 내지 약 25중량%, 약 2 내지 약 20중량%, 약 2 내지 약 15중량%, 약 2 내지 약 10중량%, 약 5 내지 약 25중량%, 약 5 내지 약 20중량%, 약 5 내지 약 20중량%, 약 5 내지 약 10중량% 또는 약 7 내지 약 9중량%의 인지질 분획을 포함한다. 일부 양태에서, 미생물 오일은 약 20중량% 미만, 약 15중량% 미만, 약 10중량% 미만, 약 9중량% 미만 또는 약 8중량% 미만의 인지질 분획을 포함한다. 일부 양태에서, 미생물 오일은 인지질을 실질적으로 포함하지 않는다. 일부 양태에서, 미생물 오일은 오일중 약 2중량% 미만, 약 1.5중량% 미만, 약 1중량% 미만 또는 약 0.5중량% 미만의 불검화물(unsaponifiable)을 포함한다. 트라이아실글리세롤 분획 등의 미생물 오일에 존재하는 지질 등급은 플래쉬 크로마토그래피로 분리하여 박층 크로마토그래피(TLC)로 분석할 수 있거나, 당해 분야에 공지된 다른 방법으로 단리하여 분석할 수 있다.

일부 양태에서, 미생물 오일, 및/또는 트라이아실글리세롤 분획, 유리 지방산 분획, 스테롤 분획, 다이아실글리세롤 분획 및 이들의 조합으로부터 선택된 하나 이상의 이의 분획은 약 5중량% 이상, 약 10중량% 이상, 약 10중량% 초과, 약 12중량% 이상, 약 13중량% 이상, 약 14중량% 이상, 약 15중량% 이상, 약 16중량% 이상, 약 17중량% 이상, 약 18중량% 이상, 약 19중량% 이상, 약 20중량% 이상, 약 25중량% 이상, 약 30중량% 이상, 약 35중량% 이상, 약 40중량% 이상 또는 약 45중량% 이상의 EPA를 포함한다. 일부 양태에서, 미생물 오일, 및/또는 트라이아실글리세롤 분획, 유리 지방산 분획, 스테롤 분획, 다이아실글리세롤 분획 및 이들의 조합으로부터 선택된 하나 이상의 이의 분획은 약 5 내지 약 55중량%, 약 5 내지 약 50중량%, 약 5 내지 약 45중량%, 약 5 내지 약 40중량%, 약 5 내지 약 35중량%, 약 5 내지 약 30중량%, 약 10 내지 약 55중량%, 약 10 내지 약 50중량%, 약 10 내지 약 45중량%, 약 10 내지 약 40중량%, 약 10 내지 약 35중량%, 약 10 내지 약 30중량%, 적어도 약 12 내지 약 55중량%, 적어도 약 12 내지 약 50중량%, 적어도 약 12 내지 약 45중량%, 적어도 약 12 내지 약 40중량%, 적어도 약 12 내지 약 35중량%, 적어도 약 12 내지 약 30중량%, 약 15 내지 약 55중량%, 약 15 내지 약 50중량%, 약 15 내지 약 45중량%, 약 15 내지 약 40중량%, 약 15 내지 약 35중량%, 약 15 내지 약 30중량%, 약 15 내지 약 25중량%, 약 15 내지 약 20중량%, 약 20 내지 약 55중량%, 약 20 내지 약 50중량%, 약 20 내지 약 45중량%, 약 20 내지 약 40중량% 또는 약 20 내지 약 30중량%의 EPA를 포함한다. 일부 양태에서, 미생물 오일, 및/또는 트라이아실글리세롤 분획, 다이아실글리세롤 분획, 스테롤 분획, 스테롤 에스터 분획, 유리 지방산 분획, 인지질 분획 및 이들의 조합으로부터 선택된 하나 이상의 이의 분획은 약 5중량% 이상, 약 10중량% 이상, 약 15중량% 이상, 약 20중량% 이상, 약 25중량% 이상, 약 30중량% 이상, 약 35중량% 이상, 약 40중량% 이상, 약 50중량% 이상 또는 약 60중량% 이상의 DHA를 포함한다. 일부 양태에서, 미생물 오일, 및/또는 트라이아실글리세롤 분획, 다이아실글리세롤 분획, 스테롤 분획, 스테롤 에스터 분획, 유리 지방산 분획, 인지질 분획 및 이들의 조합으로부터 선택된 하나 이상의 이의 분획은 약 5 내지 약 60중량%, 약 5 내지 약 55중량%, 약 5 내지 약 50중량%, 약 5 내지 약 40중량%, 약 10 내지 약 60중량%, 약 10 내지 약 50중량%, 약 10 내지 약 40중량%, 약 20 내지 약 60중량%, 약 25 내지 약 60중량%, 약 25 내지 약 50중량%, 약 25 내지 약 45중량%, 약 30 내지 약 50중량%, 약 35 내지 약 50중량% 또는 약 30 내지 약 40중량%의 DHA를 포함한다. 일부 양태에서, 미생물 오일, 및/또는 트라이아실글리세롤 분획, 다이아실글리세롤 분획, 스테롤 분획, 스테롤 에스터 분획, 유리 지방산 분획, 인지질 분획 및 이들의 조합으로부터 선택된 하나 이상의 이의 분획은 약 10중량% 이하, 약 9중량% 이하, 약 8중량% 이하, 약 7중량% 이하, 약 6중량% 이하, 약 5중량% 이하, 약 4중량% 이하, 약 3중량% 이하, 약 2중량% 이하 또는 약 1중량% 이하의 DHA를 포함한다. 일부 양태에서, 미생물 오일, 및/또는 트라이아실글리세롤 분획, 다이아실글리세롤 분획, 스테롤 분획, 스테롤 에스터 분획, 유리 지방산 분획, 인지질 분획 및 이들의 조합으로부터 선택된 하나 이상의 이의 분획은 약 1 내지 약 10중량%, 약 1 내지 약 5중량%, 약 2 내지 약 5중량%, 약 3 내지 약 5중량% 또는 약 3 내지 약 10중량%의 지방산으로서 DHA를 포함한다. 일부 양태에서, 미생물 오일, 및/또는 트라이아실글리세롤 분획, 다이아실글리세롤 분획, 스테롤 분획, 스테롤 에스터 분획, 유리 지방산 분획, 인지질 분획 및 이들의 조합으로부터 선택된 하나 이상의 이의 분획은 DHA를 실질적으로 포함하지 않는다. 일부 양태에서, 미생물 오일, 및/또는 트라이아실글리세롤 분획, 다이아실글리세롤 분획, 스테롤 분획, 스테롤 에스터 분획, 유리 지방산 분획, 인지질 분획 및 이들의 조합으로부터 선택된 하나 이상의 이의 분획은 약 0.1 내지 약 5중량%, 약 0.1 내지 약 5중량% 미만, 약 0.1 내지 약 4중량%, 약 0.1 내지 약 3중량%, 약 0.1 내지 약 2중량%, 약 0.2 내지 약 5중량%, 약 0.2 내지 약 5중량% 미만, 약 0.2 내지 약 4중량%, 약 0.2 내지 약 3중량%, 약 0.2 내지 약 2중량%, 약 0.3 내지 약 2중량%, 약 0.1 내지 약 0.5중량%, 약 0.2 내지 약 0.5중량%, 약 0.1 내지 약 0.4중량%, 약 0.2 내지 약 0.4중량%, 약 0.5 내지 약 2중량%, 약 1 내지 약 2중량%, 약 0.5 내지 약 1.5중량% 또는 약 1 내지 약 1.5중량%의 ARA를 포함한다. 일부 양태에서, 미생물 오일, 및/또는 트라이아실글리세롤 분획, 다이아실글리세롤 분획, 스테롤 분획, 스테롤 에스터 분획, 유리 지방산 분획, 인지질 분획 및 이들의 조합으로부터 선택된 하나 이상의 이의 분획은 약 5중량% 이하, 약 5중량% 미만, 약 4중량% 이하, 약 3중량% 이하, 약 2중량% 이하, 약 1.5중량% 이하, 약 1중량% 이하, 약 0.5중량% 이하, 약 0.4중량% 이하, 약 0.3중량% 이하, 약 0.2중량% 이하 또는 약 0.1중량% 이하의 ARA를 포함한다. 일부 양태에서, 미생물 오일, 및/또는 트라이아실글리세롤 분획, 다이아실글리세롤 분획, 스테롤 분획, 스테롤 에스터 분획, 유리 지방산 분획, 인지질 분획 및 이들의 조합으로부터 선택된 하나 이상의 이의 분획은 ARA를 실질적으로 포함하지 않는다. 일부 양태에서, 미생물 오일, 및/또는 트라이아실글리세롤 분획, 다이아실글리세롤 분획, 스테롤 분획, 스테롤 에스터 분획, 유리 지방산 분획, 인지질 분획 및 이들의 조합으로부터 선택된 하나 이상의 이의 분획은 약 0.4 내지 약 2중량%, 약 0.4 내지 약 3중량%, 약 0.4 내지 약 4중량%, 약 0.4 내지 약 5중량%, 약 0.4 내지 약 5중량% 미만, 약 0.5 내지 약 1중량%, 약 0.5 내지 약 2중량%, 약 0.5 내지 약 3중량%, 약 0.5 내지 약 4중량%, 약 0.5 내지 약 5중량%, 약 0.5 내지 약 5중량% 미만, 약 1 내지 약 2중량%, 약 1 내지 약 3중량%, 약 1 내지 약 4중량%, 약 1 내지 약 5중량% 또는 약 1 내지 약 5중량% 미만의 DPA n-6을 포함한다. 일부 양태에서, 미생물 오일, 및/또는 트라이아실글리세롤 분획, 다이아실글리세롤 분획, 스테롤 분획, 스테롤 에스터 분획, 유리 지방산 분획, 인지질 분획 및 이들의 조합으로부터 선택된 하나 이상의 이의 분획은 약 5중량%, 약 5중량% 미만, 약 4중량% 이하, 약 3중량% 이하, 약 2중량% 이하, 약 1중량% 이하, 약 0.75중량% 이하, 약 0.6중량% 이하 또는 약 0.5중량% 이하의 DPA n-6을 포함한다. 일부 양태에서, 미생물 오일, 및/또는 트라이아실글리세롤 분획, 다이아실글리세롤 분획, 스테롤 분획, 스테롤 에스터 분획, 유리 지방산 분획, 인지질 분획 및 이들의 조합으로부터 선택된 하나 이상의 이의 분획은 DPA n-6을 실질적으로 포함하지 않는다. 일부 양태에서, 미생물 오일, 및/또는 트라이아실글리세롤 분획, 다이아실글리세롤 분획, 스테롤 분획, 스테롤 에스터 분획, 유리 지방산 분획, 인지질 분획 및 이들의 조합으로부터 선택된 하나 이상의 이의 분획은 약 5중량% 이하, 약 5중량% 미만, 약 4중량% 이하, 약 3중량% 이하 또는 약 2중량% 이하의 올레산(18:1 n-9), 리놀레산(18:2 n-6), 리놀렌산(18:3 n-3), 에이코센산(20:1 n-9), 에루크산(22:1 n-9), 스테아리돈산(18:4 n-3) 또는 이들의 조합을 갖는 지방산을 포함한다.

트라이아실글리세롤 분자는 3개의 중심 탄소 원자(C(sn-1)H₂R1-(sn-2)H₂R2-C(sn-3)H₂R3)를 함유함으로써 상이한 위치 이성질체의 형성을 허용한다. 일부 양태에서, 미생물 오일은 트라이아실글리세롤 분획을 포함하고, 이때 트라이아실글리세롤 분획중 트라이아실글리세롤의 약 2% 이상, 약 3% 이상, 약 5% 이상, 약 10% 이상, 약 15% 이상, 약 20% 이상, 약 30% 이상, 약 35% 이상 또는 약 40% 이상은, HPLC 크로마토그래피상의 피크의 상대적인 면적 백분율을 기초로 하여, sn-1, sn-2 또는 sn-3 위치중의 어느 2개로부터 선택된 트라이아실글리세롤내 2개 위치(이치환된 DHA)에서 DHA를 함유한다. 일부 양태에서, 미생물 오일은 트라이아실글리세롤 분획을 포함하고, 이때 트라이아실글리세롤 분획중 트라이아실글리세롤의 약 2 내지 약 55%, 약 2 내지 약 50%, 약 2 내지 약 45%, 약 2 내지 약 40%, 약 2 내지 약 35%, 약 2 내지 약 30%, 약 2 내지 약 25%, 약 5 내지 약 55%, 약 5 내지 약 50%, 약 5 내지 약 45%, 약 5 내지 약 40%, 약 5 내지 약 35%, 약 5 내지 약 30%, 약 5 내지 약 25%, 약 10 내지 약 55%, 약 10 내지 약 50%, 약 10 내지 약 45%, 약 10 내지 약 40%, 약 10 내지 약 35%, 약 10 내지 약 30%, 약 10 내지 약 25%, 약 10 내지 약 20%, 약 20 내지 약 40%, 약 20 내지 약 35% 또는 약 20 내지 약 25%는, HPLC 크로마토그래피상의 피크의 상대적인 면적 백분율을 기초로 하여, sn-1, sn-2 또는 sn-3 위치중의 어느 2개로부터 선택된 트라이아실글리세롤내 2개 위치에서 EPA를 함유한다. 일부 양태에서, 미생물 오일은 트라이아실글리세롤 분획을 포함하고, 이때 트라이아실글리세롤 분획중 트라이아실글리세롤의 약 0.5% 이상, 약 1% 이상, 약 1.5% 이상 또는 약 2% 이상은, HPLC 크로마토그래피상의 피크의 상대적인 면적 백분율을 기초로 하여, sn-1, sn-2 및 sn-3 위치 모두(삼치환된 DHA)에서 DHA를 함유한다. 일부 양태에서, 미생물 오일은 트라이아실글리세롤 분획을 포함하고, 이때 트라이아실글리세롤 분획중 트라이아실글리세롤의 약 0.5 내지 약 5%, 약 0.5 내지 약 3%, 약 0.5 내지 약 2.5%, 약 0.5 내지 약 2%, 약 1 내지 약 5%, 약 1 내지 약 3% 또는 약 1 내지 약 2%는, HPLC 크로마토그래피상의 피크의 상대적인 면적 백분율을 기초로 하여, sn-1, sn-2 및 sn-3 위치 모두에서 DHA를 함유한다. 일부 양태에서, 미생물 오일은 트라이아실글리세롤 분획을 포함하고, 이때 트라이아실글리세롤 분획중 트라이아실글리세롤의 약 10% 이상, 약 15% 이상, 약 20% 이상, 약 25% 이상, 약 30% 이상, 약 35% 이상, 약 40% 이상, 약 45% 이상, 약 50% 이상, 약 55% 이상 또는 약 60% 이상은 HPLC 크로마토그래피상의 피크의 상대적인 면적 백분율을 기초로 하여, sn-1, sn-2 및 sn-3 위치중 어느 하나로부터 선택된 트라이아실글리세롤내 하나의 위치에서 DHA를 포함한다. 일부 양태에서, 미생물 오일은 트라이아실글리세롤 분획을 포함하고, 이때 트라이아실글리세롤 분획중 트라이아실글리세롤의 약 10 내지 약 80%, 약 10 내지 약 70%, 약 10 내지 약 60%, 약 15 내지 약 80%, 약 15 내지 약 75%, 약 15 내지 약 70%, 약 15 내지 약 65%, 약 15 내지 약 60%, 약 35 내지 약 80%, 약 35 내지 약 75%, 약 35 내지 약 65%, 약 35 내지 약 60%, 약 40 내지 약 80%, 약 40 내지 약 75%, 약 40 내지 약 70%, 약 40 내지 약 65%, 약 40 내지 약 60% 또는 약 40 내지 약 55%는 HPLC 크로마토그래피상의 피크의 상대적인 면적 백분율을 기초로 하여, sn-1, sn-2 및 sn-3 위치중 어느 하나로부터 선택된 트라이아실글리세롤내 하나의 위치에서 DHA를 포함한다.

본 발명은 또한 미생물 오일의 생산 방법에 관한 것이다. 일부 양태에서, 상기 방법은 본 발명의 트라우스토키트리드를 배양물에서 성장시켜 바이오매스를 생산하는 단계; 및 오메가-3 지방산을 포함하는 오일을 바이오매스로부터 추출하는 단계를 포함한다. 상기 오일은 신선하게 수거된 바이오매스로부터 추출될 수 있거나, 부패를 방지하는 조건하에 저장된 사전에 수거된 바이오매스로부터 추출될 수 있다. 공지된 방법이 본 발명의 트라우스토키트리드를 배양하여 바이오매스를 배양물로부터 단리하고, 미생물 오일을 바이오매스로부터 추출하고, 바이오매스로부터 추출된 오일의 지방산 프로파일을 분석하는데 사용될 수 있다(미국 특허 제5,130,242호 참고).

본 발명은 또한 본 발명의 지방산 프로파일을 포함하는 미생물 오일에 관한 것이다. 본 발명의 미생물 오일은 미생물로부터 유도된 임의의 오일, 예를 들어, 추가 가공 없이 미생물의 바이오매스로부터 추출된 미정제 오일; 미정제 미생물 오일을 정제, 표백 및/또는 탈취와 같은 추가 가공 단계에 의해 처리함으로써 수득한 정제 오일; 미정제 또는 정제 미생물 오일을 희석함으로써 수득한 희석된 미생물 오일; 또는 예를 들어, 미정제 또는 정제 미생물 오일을 오일중 지방산(예컨대, DHA)의 농도를 증가시키기 위한 추가 정제 방법에 의해 처리함으로써 수득한 강화된 오일일 수 있다.

일부 양태에서, 미생물 오일은 약 0중량%, 약 0.1중량% 이상, 약 0.2중량% 이상, 약 0.5중량% 이상, 약 1중량% 이상, 약 1.5중량% 이상, 약 2중량% 이상 또는 약 5중량% 이상의 스테롤 에스터 분획을 포함한다. 일부 양태에서, 미생물 오일은 약 0 내지 약 1.5중량%, 약 0 내지 약 2중량%, 약 0 내지 약 5중량%, 약 1 내지 약 1.5중량%, 약 0.2 내지 약 1.5중량%, 약 0.2 내지 약 2중량% 또는 약 0.2 내지 약 5중량%의 스테롤 에스터 분획을 포함한다. 일부 양태에서, 미생물 오일은 약 5중량% 미만, 약 4중량% 미만, 약 3중량% 미만 또는 약 2중량% 미만의 스테롤 에스터 분획을 포함한다. 일부 양태에서, 미생물 오일은 약 65중량% 이상, 약 70중량% 이상, 약 75중량% 이상, 약 80중량% 이상, 약 85중량% 이상 또는 약 90중량% 이상의 트라이글리세라이드 분획을 포함한다. 일부 양태에서, 미생물 오일은 약 65 내지 약 95중량%, 약 75 내지 약 95중량%, 약 80 내지 약 95중량%, 약 97중량% 또는 약 98중량%의 트라이글리세라이드 분획을 포함한다. 일부 양태에서, 미생물 오일은 약 0.5중량% 이상, 약 1중량% 이상, 약 1.5중량% 이상, 약 2중량% 이상, 약 2.5중량% 이상 또는 약 5중량% 이상의 유리 지방산 분획을 포함한다. 일부 양태에서, 미생물 오일은 약 0.5 내지 약 5중량%, 약 0.5 내지 약 2.5중량%, 약 0.5 내지 약 2중량%, 약 0.5 내지 약 1.5중량%, 약 0.5 내지 약 1중량%, 약 1 내지 약 2.5중량%, 약 1 내지 약 5중량%, 약 1.5 내지 약 2.5중량%, 약 2 내지 약 2.5중량% 또는 약 2 내지 약 5중량%의 유리 지방산 분획을 포함한다. 일부 양태에서, 미생물 오일은 약 5중량% 미만, 약 4중량% 미만, 약 3중량% 미만, 약 2중량% 미만 또는 약 1중량% 미만의 유리 지방산 분획을 포함한다. 일부 양태에서, 미생물 오일은 약 0.5중량% 이상, 약 1중량% 이상, 약 1.5중량% 이상, 약 2중량% 이상 또는 약 5중량% 이상의 스테롤 분획을 포함한다. 일부 양태에서, 미생물 오일은 약 0.5 내지 약 1.5중량%, 약 1 내지 약 1.5중량%, 약 0.5 내지 약 2중량%, 약 0.5 내지 약 5중량%, 약 1 내지 약 2중량% 또는 약 1 내지 약 5중량%의 스테롤 분획을 포함한다. 일부 양태에서, 미생물 오일은 약 5중량% 미만, 약 4중량% 미만, 약 3중량% 미만, 약 2중량% 미만 또는 약 1중량% 미만의 스테롤 분획을 포함한다. 일부 양태에서, 미생물 오일은 약 1.5중량% 이상, 약 2중량% 이상, 약 2.5중량% 이상, 약 3중량% 이상, 약 3.5중량% 이상 또는 약 5중량% 이상의 다이글리세라이드 분획을 포함한다. 일부 양태에서, 미생물 오일은 약 1.5 내지 약 3중량%, 약 2 내지 약 3중량%, 약 1.5 내지 약 3.5중량%, 약 1.5 내지 약 5중량%, 약 2.5 내지 약 3중량%, 약 2.5 내지 약 3.5중량% 또는 약 2.5 내지 약 5중량%의 다이글리세라이드 분획을 포함한다. 일부 양태에서, 미생물 오일은 오일의 약 2중량% 미만, 약 1.5중량% 미만, 약 1중량% 미만 또는 약 0.5중량% 미만의 불검화물을 포함한다. 미생물 오일에 존재하는 지질 부류, 예컨대 트라이글리세라이드 분획은 플래쉬 크로마토그래피에 의해 분리되고 박층 크로마토그래피(TLC)에 의해 분석되거나, 당해 분야에 공지된 다른 방법에 의해 분리되고 분석될 수 있다.

일부 양태에서, 미생물 오일, 및/또는 트라이글리세라이드 분획, 유리 지방산 분획, 스테롤 분획, 다이글리세라이드 분획 및 이들의 조합으로부터 선택된 이의 하나 이상의 분획은 약 40중량% 이상, 약 45중량% 이상, 약 50중량% 이상, 약 55중량% 이상, 약 60중량% 이상, 약 65중량% 이상, 약 70중량% 이상, 약 75중량% 또는 약 80중량% 이상의 DHA를 포함한다. 일부 양태에서, 미생물 오일, 및/또는 트라이글리세라이드 분획, 유리 지방산 분획, 스테롤 분획, 다이글리세라이드 분획 및 이들의 조합으로부터 선택된 이의 하나 이상의 분획은 약 40 내지 약 45중량%, 약 40 내지 약 50중량%, 약 40 내지 약 60중량%, 약 50 내지 약 60중량%, 약 55 내지 약 60중량%, 약 40 내지 약 65중량%, 약 50 내지 약 65중량%, 약 55 내지 약 65중량%, 약 40 내지 약 70중량%, 약 40 내지 약 80중량%, 약 50 내지 약 80중량%, 약 55 내지 약 80중량%, 약 60 내지 약 80중량% 또는 약 70 내지 약 80중량%의 DHA를 포함한다. 일부 양태에서, 미생물 오일은 약 45중량% 이하, 약 40중량% 이하, 약 35중량% 이하, 약 30중량% 이하, 약 25중량% 이하, 약 20중량% 이하, 약 15중량% 이하 또는 약 13중량% 이하의 DHA를 포함하는 스테롤 에스터 분획을 포함한다. 일부 양태에서, 미생물 오일, 및/또는 트라이글리세라이드 분획, 유리 지방산 분획, 스테롤 분획, 다이글리세라이드 분획 및 이들의 조합으로부터 선택된 이의 하나 이상의 분획은 약 10중량% 이하, 약 9중량% 이하, 약 8중량% 이하, 약 7중량% 이하, 약 6중량% 이하, 약 5중량% 이하, 약 4중량% 이하, 약 3중량% 이하, 약 2중량% 이하 또는 약 1중량% 이하의 EPA를 포함한다. 일부 양태에서, 미생물 오일, 및/또는 트라이글리세라이드 분획, 유리 지방산 분획, 스테롤 분획, 다이글리세라이드 분획 및 이들의 조합으로부터 선택된 이의 하나 이상의 분획은 약 2 내지 약 3중량%, 약 2 내지 약 3.5중량%, 약 2.5 내지 약 3.5중량%, 약 2 내지 약 6중량%, 약 2.5 내지 약 6중량%, 약 3.0 내지 약 6중량%, 약 3.5 내지 약 6중량%, 약 5 내지 약 6중량% 또는 약 2 내지 약 10중량%의 EPA를 포함한다. 일부 양태에서, 미생물 오일, 및/또는 스테롤 에스터 분획, 트라이글리세라이드 분획, 유리 지방산 분획, 스테롤 분획, 다이글리세라이드 분획, 극성 분획(예컨대, 인지질 분획) 및 이들의 조합으로부터 선택된 이의 하나 이상의 분획에는 EPA가 실질적으로 존재하지 않는다. 일부 양태에서, 미생물 오일, 및/또는 스테롤 에스터 분획, 트라이글리세라이드 분획, 유리 지방산 분획, 스테롤 분획, 다이글리세라이드 분획, 극성 분획(예컨대, 인지질 분획) 및 이들의 조합으로부터 선택된 이의 하나 이상의 분획은 약 5:1 이상, 약 7:1 이상, 약 9:1 이상, 약 10:1 이상, 약 15:1 이상, 약 20:1 이상, 약 25:1 이상, 약 30:1 이상 또는 약 50:1 이상의 DHA 대 EPA의 중량 비를 포함하고, 미생물 오일, 및/또는 이의 하나 이상의 분획은 10중량% 이하의 EPA를 포함한다. 일부 양태에서, 미생물 오일, 및/또는 스테롤 에스터 분획, 트라이글리세라이드 분획, 유리 지방산 분획, 스테롤 분획, 다이글리세라이드 분획, 극성 분획(예컨대, 인지질 분획) 및 이들의 조합으로부터 선택된 이의 하나 이상의 분획은 약 5:1 이상 및 약 20:1 미만의 DHA 대 EPA의 중량 비를 포함한다. 일부 양태에서, DHA 대 EPA의 중량 비는 약 5:1 내지 약 18:1, 약 7:1 내지 약 16:1 또는 약 10:1 내지 약 15:1이다. 일부 양태에서, 미생물 오일, 및/또는 스테롤 에스터 분획, 트라이글리세라이드 분획, 유리 지방산 분획, 스테롤 분획, 다이글리세라이드 분획, 극성 분획(예컨대, 인지질 분획) 및 이들의 조합으로부터 선택된 이의 하나 이상의 분획은 약 0.1 내지 약 0.25중량%, 약 0.2 내지 약 0.25중량%, 약 0.1 내지 약 0.5중량% 또는 약 0.1 내지 약 1.5중량%의 ARA를 포함한다. 일부 양태에서, 미생물 오일, 및/또는 스테롤 에스터 분획, 트라이글리세라이드 분획, 유리 지방산 분획, 스테롤 분획, 다이글리세라이드 분획, 극성 분획(예컨대, 인지질 분획) 및 이들의 조합으로부터 선택된 이의 하나 이상의 분획은 약 1.5중량% 이하, 약 1중량% 이하, 약 0.5중량% 이하, 약 0.2중량% 이하 또는 약 0.1중량% 이하의 ARA를 포함한다. 일부 양태에서, 미생물 오일, 및/또는 스테롤 에스터 분획, 트라이글리세라이드 분획, 유리 지방산 분획, 스테롤 분획, 다이글리세라이드 분획, 극성 분획(예컨대, 인지질 분획) 및 이들의 조합으로부터 선택된 이의 하나 이상의 분획에는 ARA가 실질적으로 존재하지 않는다. 일부 양태에서, 미생물 오일, 및/또는 스테롤 에스터 분획, 트라이글리세라이드 분획, 유리 지방산 분획, 다이글리세라이드 분획, 극성 분획(예컨대, 인지질 분획) 및 이들의 조합으로부터 선택된 이의 하나 이상의 분획은 약 20:1 이상, 약 30:1 이상, 약 35:1 이상, 약 40:1 이상, 약 60:1 이상, 약 80:1 이상, 약 100:1 이상, 약 150:1 이상, 약 200:1 이상, 약 250:1 이상 또는 약 300:1 이상의 DMA 대 ARA의 중량 비를 포함한다. 일부 양태에서, 미생물 오일, 및/또는 스테롤 에스터 분획, 트라이글리세라이드 분획, 유리 지방산 분획, 스테롤 분획, 다이글리세라이드 분획, 극성 분획(예컨대, 인지질 분획) 및 이들의 조합으로부터 선택된 이의 하나 이상의 분획은 약 0.5 내지 약 1중량%, 약 0.5 내지 약 2중량%, 약 0.5 내지 약 2.5중량%, 약 0.5 내지 약 3중량%, 약 0.5 내지 약 3.5중량%, 약 0.5 내지 약 5중량%, 약 0.5 내지 약 6중량%, 약 1 내지 약 2중량%, 약 2 내지 약 3중량%, 약 2 내지 약 3.5중량%, 약 1 내지 약 2.5중량%, 약 1 내지 약 3중량%, 약 1 내지 약 3.5중량%, 약 1 내지 약 5중량% 또는 약 1 내지 약 6중량%의 DPA n-6을 포함한다. 일부 양태에서, 미생물 오일, 및/또는 스테롤 에스터 분획, 트라이글리세라이드 분획, 유리 지방산 분획, 스테롤 분획, 다이글리세라이드 분획, 극성 분획(예컨대, 인지질 분획) 및 이들의 조합으로부터 선택된 이의 하나 이상의 분획은 약 6중량% 이하, 약 5중량% 이하, 약 3중량% 이하, 약 2.5중량% 이하, 약 2중량% 이하, 약 1중량% 이하 또는 약 0.5중량% 이하의 DPA n-6을 포함한다. 일부 양태에서, 미생물 오일, 및/또는 스테롤 에스터 분획, 트라이글리세라이드 분획, 유리 지방산 분획, 스테롤 분획, 다이글리세라이드 분획, 극성 분획(예컨대, 인지질 분획) 및 이들의 조합으로부터 선택된 이의 하나 이상의 분획에는 DPA n-6이 실질적으로 존재하지 않는다. 일부 양태에서, 미생물 오일, 및/또는 스테롤 에스터 분획, 트라이글리세라이드 분획, 유리 지방산 분획, 스테롤 분획, 다이글리세라이드 분획, 극성 분획(예컨대, 인지질 분획) 및 이들의 조합으로부터 선택된 이의 하나 이상의 분획은 약 6:1 초과, 약 8:1 이상, 약 10:1 이상, 약 15:1 이상, 약 20:1 이상, 약 25:1 이상, 약 50:1 이상 또는 약 100:1 이상의 DHA 대 DPA n-6의 중량 비를 포함한다. 일부 양태에서, 미생물 오일, 및/또는 스테롤 에스터 분획, 트라이글리세라이드 분획, 유리 지방산 분획, 스테롤 분획, 다이글리세라이드 분획, 극성 분획(예컨대, 인지질 분획) 및 이들의 조합으로부터 선택된 이의 하나 이상의 분획은 각각 약 5중량% 이하, 약 4중량% 이하, 약 3중량% 이하, 약 2중량% 이하, 약 1.5중량% 이하, 약 1중량% 이하 또는 약 0.5중량% 이하의 리놀레산(18:2 n-6), 리놀렌산(18:3 n-3), 에이코센산(20:1 n-9) 및 에루크산(22:1 n-9)을 포함한다. 일부 양태에서, 미생물 오일, 및/또는 스테롤 에스터 분획, 트라이글리세라이드 분획, 유리 지방산 분획, 스테롤 분획, 다이글리세라이드 분획, 극성 분획(예컨대, 인지질 분획) 및 이들의 조합으로부터 선택된 이의 하나 이상의 분획은 약 5중량% 이하, 약 4중량% 이하, 약 3중량% 이하, 약 2중량% 이하, 약 1.5중량% 이하 또는 약 1중량% 이하의 헵타데칸산(17:0)을 포함한다. 일부 양태에서, 미생물 오일, 및/또는 이의 하나 이상의 분획은 약 0.01 내지 약 5중량%, 약 0.05 내지 약 3중량% 또는 약 0.1 내지 약 1중량%의 헵타데칸산을 포함한다.

트라이글리세라이드 분자는 상이한 위치 이성질체의 형성을 가능하게 하는 3개의 중심 탄소 원자(C_sn-1H₂Rl-C_sn-2H₂R2-C_sn-3H₂R3)를 함유한다. 일부 양태에서, 미생물 오일은 트라이글리세라이드 분획중 트라이글리세라이드의 약 20% 이상, 약 30% 이상, 약 35% 이상 또는 약 40% 이상이 HPLC 크로마토그래피상의 피크의 상대적인 면적 백분율을 기초로 하여, sn-1, sn-2 및 sn-3 위치중 어느 2개로부터 선택된 트라이아실글리세라이드내의 2개의 위치에서 DHA(이치환된 DHA)를 포함하는 트라이글리세라이드 분획을 포함한다. 일부 양태에서, 미생물 오일은 트라이글리세라이드 분획중 트라이글리세라이드의 약 20 내지 약 40%, 약 20 내지 약 35%, 약 30 내지 약 40% 또는 약 30 내지 약 35%가 HPLC 크로마토그래피상의 피크의 상대적인 면적 백분율을 기초로 하여, sn-1, sn-2 및 sn-3 위치중 어느 2개로부터 선택된 트라이글리세라이드내의 2개의 위치에서 DHA를 함유하는 트라이글리세라이드 분획을 포함한다. 일부 양태에서, 미생물 오일은 트라이글리세라이드 분획중 트라이글리세라이드의 약 5% 이상, 약 10% 이상, 약 15% 이상 또는 약 20% 이상이 HPLC 크로마토그래피상의 피크의 상대적인 면적 백분율을 기초로 하여, sn-1, sn-2 및 sn-3 위치 모두에서 DHA(삼치환된 DHA)를 함유하는 트라이글리세라이드 분획을 포함한다. 일부 양태에서, 미생물 오일은 트라이글리세라이드 분획중 트라이글리세라이드의 약 5 내지 약 20%, 약 5 내지 약 15%, 약 10 내지 약 20% 또는 약 10 내지 약 15%가 HPLC 크로마토그래피상의 피크의 상대적인 면적 백분율을 기초로 하여, sn-1, sn-2 및 sn-3 위치 모두에서 DHA를 함유하는 트라이글리세라이드 분획을 포함한다. 대조적으로, 미국 특허 제6,582,941호에 보고된 TAG 종은 3개의 모든 위치에서 DHA를 함유하지 않는다. 일부 양태에서, 미생물 오일은 트라이글리세라이드 분획중 트라이글리세라이드의 약 50% 이상, 약 55% 이상, 약 60% 이상, 약 65% 이상, 약 70% 이상 또는 약 75% 이상이 HPLC 크로마토그래피상의 피크의 상대적인 면적 백분율을 기초로 하여, sn-1, sn-2 및 sn-3 위치중 어느 하나로부터 선택된 트라이글리세라이드내의 1개의 위치에서 DHA를 함유하는 트라이글리세라이드 분획을 포함한다. 일부 양태에서, 미생물 오일은 트라이글리세라이드 분획중 트라이글리세라이드의 약 50 내지 약 75%, 약 50 내지 약 70%, 약 50 내지 약 65%, 약 60 내지 약 75%, 약 60 내지 약 70% 또는 약 60 내지 약 65%가 HPLC 크로마토그래피상의 피크의 상대적인 면적 백분율을 기초로 하여, sn-1, sn-2 및 sn-3 위치중 어느 하나로부터 선택된 트라이글리세라이드내의 1개의 위치에서 DHA를 함유하는 트라이글리세라이드 분획을 포함한다.

조성물

본 발명은 또한 본 발명의 미생물, 본 발명의 단리된 바이오매스, 본 발명의 미생물 오일 또는 이들의 조합을 포함하는 조성물에 관한 것이다.

본 발명의 미생물, 바이오매스 또는 미생물 오일은 또한 임의의 공지된 기술에 의해서 조성물의 요건을 기초로 하여 화학적으로 또는 물리적으로 개질되거나 가공될 수 있다.

미생물 세포 또는 바이오매스는, 비제한적으로, 냉동 건조, 공기 건조, 분무 건조, 터널 건조(tunnel drying), 진공 건조(동결 건조: lyophilization) 또는 유사한 공정을 비롯한 방법에 의해 조성물에서 사용하기 전에 건조시킬 수 있다. 다르게는, 수거하거나 세척한 바이오매스는 건조하지 않고 조성물에 직접 사용할 수 있다(전체 내용이 본원에 참고로서 혼입된 미국 특허 제5,130,242호 및 제6,812,009호 참고).

본 발명의 미생물 오일은 EPA 등의 지방산 속에 강화된 생성물을 더 효율적으로 생산하기 위한 출발 물질로서 사용될 수 있다. 예를 들면, 본 발명의 미생물 오일은 증류 또는 우레아 첨가와 같은, 당해 분야에 공지된 각종 정제 기술에 적용시켜 보다 높은 농도의 EPA 또는 다른 지방산을 갖는 보다 높은 효능의 생성물을 생산할 수 있다. 본 발명의 미생물 오일은 또한 EPA 또는 다른 지방산의 에스터 및 염과 같이 오일내 지방산으로부터 유도된 화합물을 생산하기 위한 화학 반응에 사용될 수 있다.

본 발명의 조성물은 하나 이상의 부형제를 포함할 수 있다. 본원에 사용된 바와 같이, "부형제"는 식품 및 약제, 화장품 및 산업용 조성물을 비롯한 조성물에 바람직한 특성을 제공하기 위해 본 발명의 조성물에 사용된, 성분 또는 성분들의 혼합물을 지칭한다. 본 발명의 부형제는 약학 조성물에 첨가되는 경우에 "약학적으로 허용되는" 부형제로 기재될 수 있으며, 이는, 온전한 의학적 판단 영역내에서, 부형제가 이상적인 이익/위험 비에 적합한 바람직한 접촉 기간에 걸쳐 과도한 독성, 자극, 알러지 반응 또는 다른 문제가 많은 합병증 없이 인간 및 비인간 동물의 조직과 접촉하기에 적합한 화합물, 물질, 조성물, 염 및/또는 투여 형태임을 의미한다. 일부 양태에서, 용어 "약학적으로 허용되는"은 동물 및 보다 특히 인간에서 사용하기 위한 미국 약전 또는 다른 일반적으로 인지된 국제 약전에 수록되거나 미국 연방 또는 주 정부의 감독 기관에 의해 승인됨을 의미한다. 각종 부형제가 사용될 수 있다. 일부 양태에서, 부형제는, 비제한적으로, 알칼리제, 안정화제, 산화방지제, 부착제, 분리제, 피복제, 외부 상 성분, 방출 조절 성분, 용매, 계면활성제, 습윤제, 완충제, 충전제, 진정제 또는 이들의 조합일 수 있다. 본원에 기술된 것 외의 부형제는, 비제한적으로, 문헌[Remington: The Science and Practice of Pharmacy, 21st ed. (2005)]에 수록되어 있다. 본원의 특정 등급의 부형제(예를 들면, "용매")의 포함은 부형제의 역할을 제한하는 것이 아니라 설명하는 것으로 의도된다. 특정 부형제는 다중 등급내에 속할 수 있다.

본 발명의 조성물은, 비제한적으로, 식료품, 약학 조성물, 화장품 및 산업용 조성물을 포함한다.

일부 양태에서, 조성물은 식료품이다. 식료품은 비인간 동물 또는 인간 소비용의 임의의 식품이며, 고체 및 액체 조성물 둘다를 포함한다. 식료품은 동물 또는 인간 식품에 대한 첨가제일 수 있다. 식료품은, 비제한적으로, 일반적인 식품; 우유, 음료, 치료 음료 및 영양 음료를 비롯한 액체 제품; 기능성 식품; 보충물; 기능 식품; 조산아용 분유를 비롯한 영아용 조제식; 임신 또는 수유모용 식품; 성인용 식품; 노인용 식품; 및 동물 식품을 포함한다.

일부 양태에서, 본 발명의 미생물, 바이오매스 또는 미생물 오일은 직접 사용되거나 오일, 쇼트닝(shortening), 스프레드(spread), 다른 지방 성분, 음료, 소스, 낙농 또는 대두 식품(예를 들면, 우유, 요구르트, 치즈 및 아이스크림), 제과 제빵류, 영양 제품, 예를 들면, 영양 보충물(캡슐 또는 정제형)로서, 비타민 보충물, 식이 보충물, 분말 음료, 가공 또는 반-가공 분말 식료품중의 하나 이상에 첨가제로서 포함될 수 있다. 일부 양태에서, 영양 보충물은 동물 공급원으로부터 형성되지 않고 동물 공급원으로부터의 어떠한 성분도 함유하지 않는 채식주의자 캡슐 형태이다.

본 발명의 미생물 오일을 포함할 수 있는 식품 조성물의 일부 목록은, 비제한적으로, 대두계 제품(우유, 아이스크림, 요구르트, 음료, 크림, 스프레드, 분말 크림(whitener); 수프 및 수프 혼합물; 도우(dough), 배터(batter) 및, 예를 들면, 제빵 제품(bakery ware), 아침식사용 시리얼, 케익, 치즈케익, 파이, 컵케익, 쿠키, 바(bar), 빵, 롤, 비스킷, 머핀, 페스트리, 스콘(scone), 크루톤(crouton), 크래커, 감미 제품, 스낵 케익, 파이, 그래놀라(granola)/스낵 바 및 토스터 페스트리를 비롯한 제과 제빵류 품목; 사탕; 단단한 과자류; 초콜렛 및 다른 과자류; 츄잉검; 액체 식료품, 예를 들면, 우유, 열량 음료, 영아용 조제식, 탄산음료, 차, 액상 식사(liquid meal), 과일 쥬스, 과일계 음료, 야채계 음료; 다중비타민 시럽, 식사 대용품, 의료용 식품 및 시럽; 분말 음료 혼합물; 파스타; 가공된 어류 제품; 가공된 고기 제품; 가공된 가금류 제품; 그래비(gravy) 및 소스; 조미료(케찹, 마요네스 등); 야채 오일계 스프레드; 유제품; 요구르트; 버터; 냉동 유제품; 아이스크림; 냉동 디저트; 냉동 요구르트; 유아 식품 등의 반고체 식료품; 푸딩 및 젤라틴 디저트; 가공 및 비가공 치즈; 팬케익 믹스; 열량 바를 비롯한 식품 바; 와플 믹스; 샐러드 드레싱; 대체란 믹스(replacement egg mix); 견과 및 견과계 스프레드; 감자칩 및 기타 칩 또는 크리스프(crisp), 옥수수 칩, 토틸라 칩(tortilla chip), 압출된 스낵, 팝콘, 프레첼(pretzel), 감자 크리스프 및 견과 등의 소금가미 스낵; 딥(dip), 건조 과일 스낵, 고기 스낵, 돼지껍질 스낵(pork rind), 건강 식품 바 및 쌀/옥수수 케익 등의 특수 스낵을 포함한다.

일부 양태에서, 본 발명의 미생물 오일은 영아용 조제식을 보충하는데 사용될 수 있다. 영아용 조제식은 본 발명의 미생물 오일을 단독으로 또는 아라키돈산(ARA)-생산 미생물로부터 유도된 물리적으로 정제된 오일과 함께 보충시킬 수 있다. ARA-생산 미생물은, 예를 들면, 모르티에렐라 알피나(Mortierella alpina) 또는 모르티에렐라 종파 슈무크케리(Mortierella sect. schmuckeri)이다. 다르게는, 영아용 조제식은 본 발명의 미생물 오일을, 아라스코(ARASCO: 등록상표)(마르텍 바이오사이언시스(Martek Biosciences), 미국 미들랜드주 콜롬비아)를 비롯한 ARA가 풍부한 오일과 함께 보충할 수 있다.

일부 양태에서, 조성물은 동물 사료이다. "동물"은 동물계에 속하는 특정의 비인간 유기체를 의미하며, 비제한적으로, 수생 동물 및 육상 동물을 포함한다. 용어 "동물 사료" 또는 "동물 식품"은, 어류; 시판 어류; 관상 어류; 어류 유충; 쌍각류; 연체동물; 갑각류; 패류; 새우; 새우 유충; 아르테미아(artemia); 담륜충(rotifer); 브라인 새우(brine shrimp); 여과 섭식동물; 양서류; 파충류; 포유류; 사육 동물; 농장 동물; 동물원 동물; 스포츠 동물; 종계(breeding stock); 경주용 동물; 쇼 동물(show animal); 보존 동물(heirloom animal); 희귀 동물 또는 멸종위기 동물; 애완동물, 예를 들면, 개, 고양이, 기니아 피크, 토끼, 래트, 마우스 또는 말; 원숭이(예를 들면, 세부스(cebus), 레서스(rhesus), 아프리카 녹색(African green), 파타스(patas), 시노몰구스(cynomolgus) 및 세르코피테쿠스(cercopithecus)), 유인원, 오랑우탄, 개코원숭이, 긴팔원숭이 및 침팬지 등의 영장류; 개 및 늑대 등의 개과 동물; 고양이, 사자 및 호랑이 등의 고양이과; 말, 당나귀 및 얼룩말 등의 말과; 암소, 소, 돼지 및 양 등의 식용 동물; 사슴 및 기린 등의 유제류; 마우스, 래트, 햄스터 및 기니아 피그 등의 설치류 등에 상관 없이, 비인간 동물에 의도된 임의의 식품을 말한다. 동물 식품은, 비제한적으로, 양식 사료, 애완동물 사료, 동물원 동물 사료, 노동 동물 사료, 가축 동물 사료 또는 이들의 조합을 포함하는 사육 동물 사료를 포함한다.

일부 양태에서, 조성물은, 이의 고기 또는 생산물이 인간에 의해 소비되는 임의의 동물, 예를 들면, 고기, 알 또는 우유가 이로부터 인간 소비용으로 유도되는 임의의 동물용 사료 또는 사료 보충물이다. 이러한 동물에게 공급되는 경우, LC-PUFA 등의 영양분이 고기, 우유, 알 또는 이러한 동물의 다른 생산물에 혼입되어 이들 영양분들의 함량을 증가시킬 수 있다.

일부 양태에서, 조성물은 동물성 플랑크톤, 아르테미아, 담륜충, 및 여과 섭식 동물에 의한 소비용으로 적합한 크기의 입자를 형성하기 위해 부서질 수 있는 분무-건조시킨 물질이다. 일부 양태에서, 조성물에 의해 공급된 동물성 플랑크톤, 아르테미아 또는 담륜충은 순차로 어류 유충, 어류, 조개류, 쌍각류 또는 갑각류에게 공급된다.

일부 양태에서, 조성물은 약학 조성물이다. 적합한 약학 조성물은, 비제한적으로, 항염 조성물, 관상동맥심질환의 치료용 약물, 동맥경화증의 치료용 약물, 화학치료제, 활성 부형제, 골다공증 약물, 항우울증제, 항경련제, 항헬리코박터 필로리 약물, 신경변성 질환의 치료용 약물, 변성 간 질환의 치료용 약물, 항생제, 콜레스테롤 저하 조성물 및 트라이아실글리세롤 저하 조성물을 포함한다. 일부 양태에서, 조성물은 의학 식품이다. 의학 식품은 주치의의 감독하에 외부적으로 소모되거나 투여되는 조성물로 존재하고 인지된 과학 원리를 기초로 하여, 명백한 영양 요건이 의학적 평가에 의해 확립되는 조건의 특수한 식이 조절을 위해 의도된 식품을 포함한다.

일부 양태에서, 미생물 오일은 투약 형태로 제형화될 수 있다. 투약 형태는, 비제한적으로, 효과량의 미생물 오일을 포함하는, 비제한적으로, 액제, 현탁제, 유제 및 건조 분말을 포함하는, 비제한적으로, 정제, 캡슐제, 카세제(cachet), 펠렛, 환제, 산제 및 과립제 및 비경구적 투약 형태를 포함할 수 있다. 이러한 제형이 또한 약학적으로 허용되는 희석제, 충전제, 붕해제, 결합제, 윤활제, 계면활성제, 소수성 비히클, 수용성 비히클, 유화제, 완충제, 습윤제, 습윤화제, 가용화제, 방부제 등을 함유할 수 있음은 당해 분야에 또한 공지되어 있다. 투여 형태는, 비제한적으로, 미생물 오일 및 하나 이상의 적합한 약학적으로 허용되는 담체를 함유하는 정제, 당의제(dragee), 캡슐제, 카플렛(caplet) 및 환제를 포함할 수 있다.

경구 투여를 위해, 미생물 오일은 당해 분야에 공지된 약학적으로 허용되는 담체와 혼합할 수 있다. 이러한 담체는, 치료할 대상체가 경구 섭취하기 위해 본 발명의 미생물 오일이 정제, 환제, 당의제, 캡슐제, 액제, 겔제, 시럽제, 슬러리제, 현탁제 등으로서 제형화되도록 할 수 있다. 일부 양태에서, 투약 형태는 정제, 환제 또는 카플렛이다. 경구용의 약학 제제는 고체 부형제를 가하고, 수득되는 혼합물을 선택적으로 분쇄하고, 경우에 따라, 적합한 보조제를 첨가한 후, 과립의 혼합물을 가공하여 정제 또는 당의제 코어를 수득함으로써 수득할 수 있다. 적합한 부형제는, 비제한적으로, 락토스, 수크로스, 만니톨 및 소르비톨을 비롯한 당류 등의 충전제; 비제한적으로, 옥수수 전분, 밀 전분, 쌀 전분, 감자 전분, 젤라틴, 검 트라가칸트, 메틸 셀룰로스, 하이드록시프로필메틸 셀룰로스, 나트륨 카복시메틸 셀룰로스 및 폴리비닐피롤리돈(PVP) 등의 셀룰로스 제제를 포함한다. 필요에 따라, 비제한적으로, 가교결합된 폴리비닐 피롤리돈, 아가(agar), 또는 알긴산 또는 나트륨 알긴에이트 등의 이의 염과 같은 붕해제를 가할 수 있다. 경구적으로 사용될 수 있는 약학 제제는, 비제한적으로, 젤라틴으로 제조된 푸쉬-핏 캡슐(push-fit capsule), 및 또한 젤라틴 및 글리세롤 또는 소르비톨 등의 가소제로 제조된 연질의 밀봉된 젤라틴 캡슐을 포함한다. 일부 양태에서, 투약 형태는 채식주의자 투약 형태이고, 이때 투여 형태는 동물 공급원으로부터 형성되지 않고 동물 공급원으로부터의 어떠한 성분도 함유하지 않는다. 일부 양태에서, 채식주의자 투약 형태는 채식주의자 캡슐이다.

일부 양태에서, 조성물은 화장품이다. 화장품은, 비제한적으로, 유제, 크림제, 로션제, 차폐제, 비누, 샴푸, 세척액, 화장 크림(facial cream), 컨디셔너(conditioner), 메이크업(make-up), 목욕 제제 및 분산 액체를 포함한다. 화장 제제는 의약이거나 의약이 아닐 수 있다.

일부 양태에서, 조성물은 산업용 조성물이다. 일부 양태에서, 조성물은 하나 이상의 제제(manufacture)용 출발 물질이다. 제제는, 비제한적으로, 중합체; 사진 감광성 물질; 세제; 산업용 오일; 또는 산업용 세제를 포함한다. 예를 들면, 미국 특허 제7,259,006호는 베헨산의 생산 및 베헨산을 사용한 사진 민감성 물질의 생산을 위한 DHA-함유 지방 및 오일의 용도를 기술하고 있다.

조성물의 사용 방법

일부 양태에서, 조성물은 인간 또는 비인간 동물에서의 증상 치료에 사용될 수 있다. 일부 양태에서, 조성물은 인간 또는 비인간 동물에서 영양섭취(nutrition)에 사용될 수 있다.

용어 "치료하다" 및 "치료"는 치료학적 처치 및 예방학적 또는 예방적 조치(measure) 둘다를 지칭하고, 이때 이의 목적은 바람직하지 않는 생리학적 증상, 질병 또는 질환을 방지하거나 서서히 강하(경감)시키거나, 유리하거나 바람직한 임상 결과를 수득하기 위한 것이다. 본 발명의 목적을 위해, 유리하거나 바람직한 임상 결과는, 비제한적으로, 증상, 질병 또는 질환과 관련된 징후 또는 전조의 경감 또는 완화; 증상, 질병 또는 질환의 정도의 감소; 증상, 질병 또는 질환의 안정화(즉, 증상, 질병 또는 질환이 악화되지 않는 경우); 증상, 질병 또는 질환의 발병 또는 진행의 지연; 증상, 질병 또는 질환의 개량; 증상, 질병 또는 질환의 완화(부분적이거나 전체적인 것에 상관 없이 및 검출가능하거나 검출가능하지 않는 것에 상관 없이); 또는 증상, 질병 또는 질환의 향상 또는 개선을 포함한다. 치료는 과도한 부작용 없이 임상적으로 유의한 반응을 유도하는 것을 포함한다. 치료는 또한 치료를 받지 않는 경우의 예측 수명과 비교하여 연장된 생존을 포함한다.

일부 양태에서, 조성물은 여드름, 급성 염증, 나이 관련 황반병, 알러지, 알츠하이머병, 관절염, 천식, 죽상경화증, 자가면역 질환, 혈중 지질 질환, 유방 낭종, 악액질, 암, 심장 재협착, 심혈관병, 만성 염증, 관상심질환, 낭성섬유증, 간의 변성 질환, 당뇨병, 습진, 위장 질환, 심장병, 고 트라이아실글리세롤 수준, 고혈압, 과다활동, 면역질환, 억제성 종양 성장, 염증 증상, 장 질환, 신장 기능장애, 백혈병, 주요 우울증, 다발성 경화증, 신경변성 질환, 골관절염, 골다공증, 페르옥시솜병(peroxisomal disorder), 자간전증, 조기분만, 건선, 폐질환, 류마티스 관절염, 심장병의 위험 또는 혈전증 등의 증상, 질병 또는 질환을 치료하는데 사용된다.

일부 양태에서, 본 발명의 조성물을 사용하여 임신 3개월(trimester)에서 임신 기간을 증가시킨다.

일부 양태에서, 조성물은 혈압을 조절하는데 사용된다.

일부 양태에서, 조성물은 인지 기능을 개선시키거나 유지하는데 사용된다.

일부 양태에서, 조성물은 기억을 개선시키거나 유지하는데 사용된다.

조성물 또는 투약 형태는 대상체의 신체내에 조성물 또는 투약 형태와 혼화성인 임의의 경로에 의해 투여할 수 있다. 물질이 대상체에 의해 대상체의 신체내로 도입되는 경우, 또는 다른 인간, 기계 또는 장치가 물질을 대상체의 신체내로 도입하는 경우에 당해 물질은 "투여"되는 것으로 고려된다. 따라서, "투여하는"은, 예를 들면, 자가-투여, 다른 것에 의한 투여 및 간접 투여를 포함한다. "투여"와 관련하여 본원에 사용된 용어 "연속" 또는 "연이은"은, 투여 횟수가 매일 1회 이상임을 의미한다. 그러나, 투여 횟수는 매일 1회보다 많을 수 있으며, 여전히 "연속" 또는 "연이은", 예를 들면, 본원에 규정된 투약 수준을 초과하지 않는 한, 매일 2회 또는 심지어 3회일 수 있다. 투여 수단 및 방법은 당해 분야에 공지되어 있으며, 숙련가들은 각종 안내용 약리학적 문헌을 참조할 수 있다. 예를 들면, 문헌["Modern Pharmaceutics," Banker & Rhodes, Informa Healthcare, USA, 4th ed. (2002); and "Goodman & Gilman's The Pharmaceutical Basis of Therapeutics," McGraw-Hill Companies, Inc., New York, 10th ed. (2001)]을 참고할 수 있다.

"대상체", "개인" 또는 "환자"는, 진단, 예후 또는 치료 또는 조성물 또는 투약 형태의 투여가 요구되는 인간 또는 비인간에 상관없는 임의의 대상체를 의미한다. 포유동물 대상체는, 비제한적으로, 인간; 사육 동물; 농장 동물; 동물원 동물; 스포츠 동물; 애완 동물, 예를 들면, 개, 고양이, 기니아 피그, 토끼, 래트, 마우스 또는 말; 영장류, 예를 들면, 원숭이(예를 들면, 세부스, 레서스, 아프리카 녹색, 파타스, 시노몰구스 및 세르코피테쿠스), 유인원, 오랑우탄, 개코원숭이, 긴팔원숭이 및 침팬지 등의 영장류; 개 및 늑대 등의 개과 동물; 고양이, 사자 및 호랑이 등의 고양이과; 말, 당나귀 및 얼룩말 등의 말과; 암소, 소, 돼지 및 양 등의 식용 동물; 사슴 및 기린 등의 유제류; 마우스, 래트, 햄스터 및 기니아 피그 등의 설치류 등을 포함한다. 용어 "대상체"는 또한 모델 동물, 예를 들면, 질병 모델 동물을 포함한다. 일부 양태에서, 용어 "대상체"는 경제적으로 또는 달리 귀중한 동물, 예를 들면, 경제적으로 중요한 육종 가축, 경주용 동물, 쇼 동물, 국보 동물, 희귀 또는 멸종위기 동물 또는 반려 동물을 포함한다. 특정 양태에서, 대상체는 인간 대상체이다. 특정 양태에서, 대상체는 비인간 대상체이다.

조성물은 "영양학적 양", "치료학적 효과량", "예방학적 효과량", "치료학적 투약량" 또는 "예방학적 투약량"으로서 투여될 수 있다. "영양학적 양"은 필요한 투약량 및 기간 동안 목적하는 영양 결과를 달성하는데 효과적인 양을 지칭한다. 영양학적 결과는, 예를 들면, 대상체에서 바람직한 지방산 성분의 증가된 수준일 수 있다. "치료학적 효과량" 또는 "치료학적 투약량"은 필요한 투약량 및 기간 동안 바람직한 치료 효과를 달성하기에 효과적인 양을 지칭한다. 치료학적 결과는, 예를 들면, 징후의 감소, 연장된 생존, 개선된 이동성 등일 수 있다. 치료학적 결과는 "치유"일 필요는 없다. "예방학적 효과량" 또는 "예방학적 투약량"은 필요한 투약량 및 기간 동안 바람직한 예방학적 결과를 달성하기에 효과적인 양을 지칭한다. 전형적으로, 예방학적 투약량은 질병의 조기 단계 이전에 또는 조기 단계에 대상체에서 사용되므로, 예방학적 효과량은 질병의 진전된 단계의 치료를 위한 치료학적 효과량보다 적을 것이다.

약학 조성물의 각종 투약량, 투약 형태 또는 약학 조성물은 대상체에게 투여될 미생물, 바이오매스 또는 미생물 오일의 EPA 또는 다른 지방산 성분의 양을 기초로 하여, 대상체에게 투여될 수 있다. 용어 "1일 투약량", "1일 투약량 수준" 및 "1일 투약량"은 본원에서 1일 당(24시간 기간 당) 투여된 EPA 또는 다른 지방산 성분의 총량을 지칭한다. 따라서, 예를 들면, 2mg의 1일 투약량에서 대상체에게 EPA를 투여하는 것은, EPA가 2mg의 EPA를 포함하는 단일 투약 형태로서, 또는 다르게는 0.5mg의 EPA 각각을 포함하는 4회 투약 형태(총 2mg의 EPA)로서 투여되는 것에 상관 없이, 대상체가 1일 기준으로 총 2mg의 EPA를 제공받음을 의미한다. 일부 양태에서, EPA의 1일 양은 단일 투약 형태, 또는 2회 투약 형태로 투여된다. 본 발명의 투약 형태는 단일 적용 또는 다중 적용으로 취해질 수 있다. 예를 들면, 4개의 정제를 매일 섭취하는 경우, 0.5mg의 EPA를 포함하는 각각의 정제, 이어서 모두 4개의 정제를 1일 1회 섭취할 수 있거나, 2개의 정제를 1일 2회 섭취할 수 있거나, 1개의 정제를 6시간마다 섭취할 수 있다. 일부 양태에서, 1일 투약량은 약 100mg 내지 약 15g의 EPA이다. 일부 양태에서, 1일 투약량은 약 0.5 내지 약 250mg, 약 100 내지 약 250mg, 약 100 내지 약 500mg, 약 100mg 내지 약 1g, 약 1 내지 약 2.5g, 약 1 내지 약 5g, 약 1 내지 약 10g, 약 1 내지 약 15g, 약 5 내지 약 10g, 약 5 내지 약 15g, 약 10 내지 약 15g, 약 100mg 내지 약 10g, 약 100mg 내지 약 5g 또는 약 100mg 내지 약 2.5g의 EPA, DHA 또는 이들의 조합이다. 일부 양태에서, 조성물은 투약 형태당 약 0.5 내지 약 250mg, 100 내지 약 250mg, 약 0.5 내지 약 500mg, 약 100 내지 약 500mg, 약 0.5mg 내지 약 1g 또는 약 100mg 내지 약 1g의 EPA, DHA 또는 이들의 조합을 포함하는 투약 형태이다.

본 발명의 조성물 또는 투약 형태의 투여는 각종 섭생을 사용하여 달성할 수 있다. 예를 들면, 일부 양태에서, 투여는 매일 연속일로, 또는 다르게는 격일마다(2일마다) 수행한다. 투여는 1일 이상의 일로 수행할 수 있다.

조성물 및 투약 형태의 투여는 증상의 치료를 위해 사용된 다른 섭생과 조합시킬 수 있다. 예를 들면, 본 발명의 방법은 식이 섭생(예를 들면, 저탄수화물 식이, 고단백질 식이, 고섬유 식이 등), 운동 섭생, 체중 감소 섭생, 금연 섭생 또는 이들의 조합과 결합시킬 수 있다. 본 발명의 방법은 또한 증상의 치료 시 다른 약학 제품과 함께 사용할 수 있다. 본 발명의 조성물 또는 투약 형태는 다른 섭생 또는 약학 제품의 투여 전 또는 후에 투여할 수 있다.

조성물을 포함하는 키트

본 발명은 또한 본 발명의 조성물의 하나 이상의 단위를 함유하는 키트 또는 포장에 관한 것이다. 키트 또는 포장은 본 발명의 미생물, 바이오매스 또는 미생물 오일 또는 이들의 조합을 포함하는 식료품, 약학 조성물, 화장품 또는 산업용 조성물의 단위를 포함할 수 있다. 키트 또는 포장은 또한 식품, 화장품, 약학 조성물 또는 산업용 조성물의 제조를 위한 본 발명의 미생물, 바이오매스 또는 미생물 오일 또는 이들의 조합을 포함하는 첨가물을 포함할 수 있다.

일부 양태에서, 키트 또는 포장은 본 발명의 방법에 따라 투여될 약학 조성물의 하나 이상의 단위를 함유한다. 키트 또는 포장은 하나의 투약량 단위 또는 하나 이상의 투약량 단위(즉, 다중 투약량 단위)를 함유할 수 있다. 다중 투약량 단위가 키트 또는 포장속에 존재하는 경우, 다중 투약량 단위는 순차적인 투여를 위해 선택적으로 정렬될 수 있다.

본 발명의 키트는 선택적으로 키트의 단위 또는 투약 형태와 관련된 지시사항을 함유할 수 있다. 이러한 지시사항은 약학 제품의 제조, 사용 또는 판매를 감독하는 정부 기관에 의해 규정된 형태일 수 있으며, 이러한 주의사항은 증상 또는 질환을 치료하기 위해 인간 투여용으로의 제조, 사용 또는 판매의 대리인에 의한 승인을 반영한다. 지시사항은 본 발명의 방법에 따른 키트내 단위 또는 투약 형태의 사용에 대한 정보를 전달하는 임의의 형태일 수 있다. 예를 들면, 지시사항은 인쇄물의 형태 또는 앞서 기록된 의학 장치의 형태일 수 있다.

환자의 시험 과정중에, 의학적 전문가는 본 발명의 방법중 하나의 투여가 환자에게 적절한지를 결정할 수 있거나, 주치의는, 환자의 증상이 본 발명의 방법중 하나의 투여에 의해 개선될 수 있는지를 결정할 수 있다. 임의의 섭생을 기재하기 전에, 주치의는 환자에게, 예를 들면, 섭생과 관련된 각종 위험 및 이점에 대해 조언할 수 있다. 환자는 섭생과 관련된 모든 공지되고 예측된 위험의 완전한 기술내용을 제공받을 수 있다. 이러한 조언과정은 구두로 및 인쇄물로 제공될 수 있다. 일부 양태에서, 주치의는 환자에게 제품 정보, 교육 자료 등의 섭생에 대한 문헌 자료를 제공할 수 있다.

본 발명은 또한 치료 방법에 대해 소비자를 교육시키는 방법에 관한 것이며, 당해 방법은 투약 형태를 판매 시점의 소비자 정보와 함께 분배함을 포함한다. 일부 양태에서, 이러한 분배는 약사 또는 건강관리 제공자의 판매 시점에 수행할 것이다.

용어 "소비자 정보"는, 비제한적으로, 영문 교재, 비영문 교재, 시각적 정보, 도표, 전화 기록물, 웹사이트 및 실시간 소비자 서비스 대표자에 대한 접근을 포함한다. 일부 양태에서, 소비자 정보는 본 발명의 방법에 따른 투약 형태의 사용, 적절한 연령 사용, 지표, 부작용, 적절한 투약량, 경고문, 전화번호 또는 웹사이트 주소에 대한 지시사항을 제공할 것이다. 일부 양태에서, 당해 방법은 본 발명의 방법에 따라 기재된 섭생의 사용에 관한 소비자 질문에 답하는 위치에 있는 관계자에 대한 전문 정보를 제공함을 추가로 포함한다. 용어 "전문 정보"는, 비제한적으로, 의학적으로 전문적이어서 소비자 질문에 답할 수 있도록 설계된 본 발명의 방법에 따라 투여된 경우에 섭생에 관한 정보를 포함한다. "의학적 전문가"는, 예를 들면, 의사, 의사 보조자, 간호원, 전문 간호사, 약사 및 소비자 서비스 대표자를 포함한다.

본 발명을 일반적으로 기술하였지만, 본원에 제공된 실시예를 참조로 하여 추가의 이해가 수득될 수 있다. 이들 실시예는 단지 설명할 목적이며 제한하는 것으로 의도되지 않는다.

실시예 1

본 실시예에서, 쉬조키트리움 종을 50mL의 배지를 함유하는 250mL 삼각 진탕 플라스크에서 배양하였다. 접종원을 약 900mL의 증류수에 용해된 0.625g NaCl, 1.0g KCl, 5g MgS0₄·7H₂0, 0.1g (NH₄)₂S0₄, 0.29g CaCl₂·2H₂0, 1.0g 일나트륨 글루타메이트 일수화물, 1.0g 효모 추출물 및 23.8g HEPES 완충제로 이루어진 동일한 배지에서 제조하였다. NaOH를 사용하여 배지를 pH 7로 조정하였다. 배지의 최종 부피는 896mL이었고, 배지를 고압살균으로 살균하였다. 고압살균 후, 하기 성분을 배지에 살균 첨가하였다: 0.89mL의 56.5g/L KH₂PO₄, 100mL의 500g/L 글루코스, 2mL의 미량 금속 저장 용액 및 1mL의 비타민 저장 용액. 미량 금속 저장 용액은 하기 성분을 함유하였다: 1L의 증류수에 용해되고 HCl에 의해 pH 2.5로 조정된, 90g 시트르산, 5.15g FeS0₄·7H₂0, 1.55g MnCl₂·4H₂0, 0.965g ZnS0₄·7H₂0, 0.02g CoCl₂·6H₂0, 0.02g Na₂Mo0₄·2H₂0, 1.035g CuS0₄·5H₂0, 1.035g NiS0₄·6H₂0. 비타민 저장 용액은 하기 성분을 함유하였다: 1L의 증류수에 용해된, 0.16g 비타민 B12, 9.75g 티아민 및 3.33g 칼슘 판토테네이트. 진탕 플라스크에 1mL의 접종원을 접종하였다. 3벌의 플라스크를 공기중 5, 10 또는 15% CO₂의 대기를 유지하도록 설정된 CO₂ 인큐베이터에 위치시켰다. 3벌의 플라스크의 다른 세트를 대기 CO₂ 수준인 인큐베이터에 위치시켰다. 모든 플라스크 세트를 200rpm으로 진탕하고, 모든 인큐베이터를 22.5℃로 설정하였다. 7일의 성장 후, 바이오매스를 원심분리에 의해 진탕 플라스크로부터 수집하고, 바이오매스를 동결 건조하고, 바이오매스의 지방산 프로파일을 표준 메틸 에스터화 과정을 사용하여 측정하였다. 상승된 CO₂ 수준은 바이오매스, % 지방 및 지방산 프로파일에서 유의한 변화를 야기하였다. CO₂ 조건과 대기 조건 사이의 % EPA 및 % DHA 값에서 생성된 변화가 주목할만하다. 또한, 이러한 지방산의 변화는 CO₂ 수준이 증가함에 따라 더욱 확연하다. 결과가 표 4에 제공된다.

[표 4]

실시예 2

본 실시예에서, 쉬조키트리움 종을 50mL의 배지를 함유하는 250mL 삼각 진탕 플라스크에서 배양하였다. 접종원을 약 900mL의 증류수에 용해된 0.625g NaCl, 1.0g KCl, 5g MgS0₄·7H₂0, 0.1g (NH₄)₂S0₄, 0.29g CaCl₂·2H₂0, 1.0g 일나트륨 글루타메이트 일수화물, 1.0g 효모 추출물 및 23.8g HEPES 완충제로 이루어진 동일한 배지에서 제조하였다. NaOH를 사용하여 배지를 pH 7로 조정하였다. 배지의 최종 부피는 896mL이었고, 배지를 고압살균으로 살균하였다. 고압살균 후, 하기 성분을 배지에 살균 첨가하였다: 0.89mL의 56.5g/L KH₂PO₄, 100mL의 500g/L 글루코스, 2mL의 미량 금속 저장 용액 및 1mL의 비타민 저장 용액. 미량 금속 저장 용액은 하기 성분을 함유하였다: 1L의 증류수에 용해되고 HCl에 의해 pH 2.5로 조정된, 90g 시트르산, 5.15g FeS0₄·7H₂0, 1.55g MnCl₂·4H₂0, 0.965g ZnS0₄·7H₂0, 0.02g CoCl₂·6H₂0, 0.02g Na₂Mo0₄·2H₂0, 1.035g CuS0₄·5H₂0, 1.035g NiS0₄·6H₂0. 비타민 저장 용액은 하기 성분을 함유하였다: 1L의 증류수에 용해된, 0.16g 비타민 B12, 9.75g 티아민 및 3.33g 칼슘 판토테네이트. 진탕 플라스크에 1mL의 접종원을 접종하였다. 2벌의 플라스크를 공기중 5, 10 또는 15% CO₂의 대기를 유지하도록 설정된 CO₂ 인큐베이터에 위치시켰다. 2벌의 플라스크의 다른 세트를 대기 CO₂ 수준인 인큐베이터에 위치시켰다. 모든 플라스크 세트를 200rpm으로 진탕하고, 모든 인큐베이터를 22.5℃로 설정하였다. 7일의 성장 후, 바이오매스를 원심분리에 의해 진탕 플라스크로부터 수집하고, 바이오매스를 동결 건조하고, 바이오매스의 지방산 프로파일을 표준 메틸 에스터화 과정을 사용하여 측정하였다. 상승된 CO₂ 수준은 바이오매스, % 지방 및 지방산 프로파일에서 유의한 변화를 야기하였다. CO₂ 조건과 대기 조건 사이의 % EPA 및 % DHA 값에서 생성된 변화가 주목할 만하다. 또한, 이러한 지방산의 변화는 CO₂ 수준이 증가함에 따라 더욱 확연하다. 결과가 하기 표 5에 제공된다.

[표 5]

실시예 3

본 실시예에서, 트라수토키트리움 종을 50mL의 배지를 함유하는 250mL 삼각 진탕 플라스크에서 배양하였다. 접종원을 약 900mL의 증류수에 용해된 42g Na₂SO₄, 0.625g NaCl, 1.0g KCl, 5g MgS0₄·7H₂0, 0.1g (NH₄)₂S0₄, 0.29g CaCl₂·2H₂0, 1.0g 일나트륨 글루타메이트 일수화물, 1.0g 효모 추출물 및 23.8g HEPES 완충제로 이루어진 동일한 배지에서 제조하였다. NaOH를 사용하여 배지를 pH 7로 조정하였다. 배지의 최종 부피는 961mL이었고, 배지를 고압살균으로 살균하였다. 고압살균 후, 하기 성분을 배지에 살균 첨가하였다: 0.89mL의 56.5g/L KH₂PO₄, 35mL의 500g/L 글리세롤, 2mL의 미량 금속 저장 용액 및 1mL의 비타민 저장 용액. 미량 금속 저장 용액은 하기 성분을 함유하였다: 1L의 증류수에 용해되고 HCl에 의해 pH 2.5로 조정된, 9g 시트르산, 5.15g FeS0₄·7H₂0, 1.55g MnCl₂·4H₂0, 0.965g ZnS0₄·7H₂0, 0.02g CoCl₂·6H₂0, 0.02g Na₂Mo0₄·2H₂0, 1.035g CuS0₄·5H₂0, 1.035g NiS0₄·6H₂0. 비타민 저장 용액은 하기 성분을 함유하였다: 1L의 증류수에 용해된, 0.16g 비타민 B12, 9.75g 티아민 및 3.33g 칼슘 판토테네이트. 진탕 플라스크에 1mL의 접종원을 접종하였다. 3벌의 플라스크를 공기중 15% CO₂의 대기를 유지하도록 설정된 CO₂ 인큐베이터에 위치시켰다. 3벌의 플라스크의 다른 세트를 대기 CO₂ 수준인 인큐베이터에 위치시켰다. 플라스크 세트를 둘다 200rpm으로 진탕하고, 인큐베이터를 둘다 22.5℃로 설정하였다. 7일의 성장 후, 바이오매스를 원심분리에 의해 진탕 플라스크로부터 수집하고, 바이오매스를 동결 건조하고, 바이오매스의 지방산 프로파일을 표준 메틸 에스터화 과정을 사용하여 측정하였다. 공기중 15% CO₂의 대기는 트라우스토키트리움 배양물의 실질적인 변화를 야기하였다. 높은 CO₂ 바이오매스 및 % 지방은 대기 조건하의 값보다 낮았다. % 16:0 및 % DHA는 대기 조건하의 값보다 낮고, % EPA는 대기 조건하의 값보다 상당히 높았다. 결과가 하기 표 6에 제공된다.

[표 6]

실시예 4

본 실시예에서, [NBx0614etlO] 쉬조키트리움 종(ATCC PTA-10208)을 4개의 100L 뉴 브룬스윗 사이언티픽 바이오플로(New Brunswick Scientific BioFlo) 6000 발효조에서 80L의 표적 최종 (레시피) 부피로 탄소(글루코스) 및 질소(암모늄 하이드록사이드) 유가식 공정을 사용하여 다양한 과압력 조건에서 배양하여 증가된 용존 이산화 탄소에 대한 배양물의 민감성을 평가하였다. 발효조에 8L의 배양물을 각각 접종하였다. 접종원 증식을 위하여, 80L 뉴 브룬스윗 사이언티픽 바이오플로 5000 발효조를 이용하였다. 접종원 배지는 6개의 별개의 군으로 제조된 65L의 배지로 이루어졌다. 군 1은 585g MSG·1H₂0, 65g KCl, 325g MgS0₄·7H₂0, 24.05g (NH₄)₂S0₄, 40.625g NaCl, 390g T154(효모 추출물) 및 13mL 다우(Dow) 1520US(소포제)로 이루어졌다. 군 1은 약 60L 부피의 접종원 발효조에서 121℃로 살균된 회분이었다. 군 2는 18.85g CaCl₂·2H₂0로 이루어졌다. 군 3은 33.8g KH₂P0₄로 이루어졌다. 군 2 및 3은 각각 약 45 내지 60분 동안 별개의 용액에서 고온살균되고, 살균 후 무균적으로 군 1에 첨가되었다. 군 4는 201.5mg MnCl₂·4H₂0, 201.5mg ZnS0₄·7H₂0, 2.6mg CoCl₂·6H₂0, 2.6mg Na₂Mo0₄·2H₂0, 134.6mg CuS0₄·5H₂0, 134.6mg NiS0₄·6H₂0, 669.4mg FeS0₄·7H₂0 및 1.522g 시트르산으로 이루어졌다. 군 4는 군 2 및 3과 동일한 방식으로 고온살균되었다. 군 5는 633.75mg 티아민-HCl, 10.4mg 비타민 B12 및 216.5mg 판토텐산 헤미-칼슘 염으로 이루어졌다. 군 5를 RO 물에 용해시키고, 이어서 필터-살균하였다. 군 6은 3,000mL RO 물의 부피에 용해된 3,250g 글루코스로 이루어졌다. 접종원 발효조를 22.5℃까지 냉각시킨 후, 군 2, 3, 4, 5 및 6을 발효조에 첨가하였다. 나트륨 하이드록사이드 및 황산을 사용하여, 발효조의 pH를 7로 조정하고, 용존 산소를 접종 전에 100%에 미치게 하였다. 접종원 발효조에 1,300mL의 보다 적은 발효 배양물(보다 적은 발효 배양물을 제조하고, 65L 접종원 배양물과 동일한 방식으로 배양하였음)을 접종하고, 22.5℃, pH 7, 180rpm 교반 및 32.5LPM의 공기에서 37시간의 기간 동안 배양하고, 이때 8L의 접종원 부용을 각각의 100L 발효조로 옮겼다. 각각의 100L 발효조는 80L의 발효 배지를 함유하였다. 발효 배지를 접종원 발효조와 유사한 방식으로 제조하였다. 각각의 100L 발효조의 경우, 발효 배지는 6개의 회분처리된 배지 군으로 이루어졌다. 용기 NB5, NB6 및 NB7의 경우, 군 1은 704g Na₂S0₄, 50g NaCl, 80g KCl, 400g MgS0₄·7H₂0, 33.6g (NH₄)₂S0₄, 80g T154 효모 추출물 및 8mL 다우 1520-US 소포제를 함유하였다. 군 1을 100L 발효조에서 약 35L의 부피로 122℃에서 60분 동안 증기 살균하였다. 군 2는 23.2g CaCl₂·2H₂0를 약 300mL의 부피로 함유하였다. 군 3은 RO 물에 용해된 141.2g KH₂P0₄를 함유하였다. 군 4는 모두 RO 물에 용해된 248mg MnCl₂·4H₂0, 744mg ZnS0₄·7H₂0, 3.2mg Na₂Mo0₄·2H₂0, 165.6mg CuS0₄·5H₂0 및 165.6mg NiS0₄·6H₂0, 824mg FeS0₄·7H₂0 및 80g 시트르산을 함유하였다. 군 5는 모두 RO 물에 용해되고 필터 살균된 780mg 티아민-HCl, 266.4mg 판토텐산 헤미-칼슘 염 및 286.4μg의 바이오틴을 함유하였다. 군 6은 약 3L의 RO 물중 2,400g의 글루코스를 함유하였다. 군 2, 3, 4, 5 및 6를 합하고, 발효조가 22.5℃의 작동 온도에 도달한 후 발효조에 첨가하였다. 용기 NB8의 경우, 모든 군은 시트르산을 제외하고는 다른 3개의 조건이 동일하였다. NB8에서, 군 4는 단지 약 3.75g의 시트르산을 함유하였다. 접종 전에 각각의 발효조 부피는 약 52 내지 53L이었다. 각각의 발효조에 상기 접종원 발효로부터의 8L의 부용을 접종하였다. 발효의 pH를 질소 배기까지 pH 7에서 4N 암모늄 하이드록사이드의 7.3L 용액을 이용하여 조절하였고, 이때 4N 나트륨 하이드록사이드 및 4N 황산을 pH 조절을 위해 이용하였다. 용존 산소를 조절하여 20%의 표적을 180 내지 480rpm의 교반 및 40 내지 80LPM의 기류를 사용하여 발효중에 유지하였다. 각각의 이들 용기를 상이한 수두압(B5=2psi, NB6=15psi 및 NB7=20psi)에서 조절하여 증가된 용존 이산화 탄소에 대한 유기체의 민감성을 평가하였다. 발효중에, 95% 덱스트로스(옥수수 시럽)의 850g/L 용액을 공급하여 글루코스 농도를 50g/L 미만으로 유지하였다. 8일 후, 각각의 80L 발효조의 건조 세포 중량 및 오메가-3 역가는 NB5에서 110.1g/L DCW 및 44.37g/L 오메가-3; NB6에서 117.7g/L DCW 및 45.78g/L 오메가-3; NB7에서 114.1g/L DCW 및 48.43g/L 오메가-3; NB8에서 119.5g/L DCW 및 43.55g/L 오메가-3으로 유사하였다. 압력이 증가함에 따라, % DHA/FAME는 감소하고, % EPA/FAME는 증가하고, DHA 대 EPA의 비는 감소하였다. 2 내지 20psi의 최종 지방산 함량을 비교하는 경우, % DHA/FAME는 50.48%로부터 41.26%까지 감소하고, % EPA/FAME는 18.95%로부터 23.28%까지 증가하였다. 결과가 표 7에 제공된다.

[표 7]

실시예 5

본 실시예에서, [Nx0719etl0] 쉬조키트리움 종(ATCC PTA-10208)을 4개의 14L 뉴 브룬스윗 사이언티픽 바이오플로 310 발효조에서 10L의 표적 최종 (레시피) 부피로 탄소(글루코스) 및 질소(암모늄 하이드록사이드) 유가식 공정을 사용하여 배양하였다. 4개의 발효조중 3개에 이산화 탄소를 발효중 상이한 시점에 보충하여 증가된 용존 이산화 탄소에 대한 배양물의 민감성을 평가하였다. NBS1, NBS2 및 NBS3에 각각 log 12시간, log 24시간 및 log 48시간에서 시작하여 이산화 탄소를 보충하였다. 각각의 발효조에 각각 1L의 배양물을 접종하였다. 접종원 증식을 위하여, 14L 비르티스(Virtis) 발효조를 이용하였다. 접종원 배지는 4개의 별개의 군으로 제조된 10L의 배지로 이루어졌다. 군 1은 90g MSG·1H₂0, 10g KCl, 50g MgS0₄·7H₂0, 3.3g (NH₄)₂S0₄, 6.25g NaCl, 60g T154(효모 추출물), 4.97g KH₂P0₄, 2.9g CaCl₂·2H₂0 및 2mL 다우 1520US(소포제)로 이루어졌다. 군 1을 121℃에서 120분 동안 약 9.8L의 부피로 고온살균하였다. 군 2는 800mL RO 물의 부피에 용해된 500g 글루코스로 이루어졌다. 군 3은 31mg MnCl₂·4H₂0, 31mg ZnS0₄·7H₂0, 0.4mg CoCl₂·6H₂0, 0.4mg Na₂Mo0₄·2H₂0, 20.7mg CuS0₄·5H₂0, 20.7mg NiS0₄·6H₂0, 103mg FeS0₄·7H₂0 및 234.1mg 시트르산으로 이루어졌다. 군 2 및 3을 각각 60분 동안 고온살균하였다. 군 4는 97.5mg 티아민-HCl, 1.6mg 비타민 B12 및 33.3mg 판토텐산 헤미-칼슘 염으로 이루어졌다. 군 4를 RO 물에 용해시키고, 이어서 필터-살균하였다. 발효조를 22.5℃까지 냉각한 후, 군 2, 3, 4 및 5를 발효조에 첨가하였다. 나트륨 하이드록사이드 및 황산을 이용하여, 발효조의 pH를 7까지 조정하고, 용존 산소를 접종 전에 100%에 미치게 하였다. 접종원 발효조에 150mL의 보다 적은 발효 배양물(보다 적은 발효 배양물을 제조하고, 10L 접종원 배양물과 동일한 방식으로 배양하였음)을 접종하고, 22.5℃, pH 7, 433rpm 교반 및 5LPM의 공기에서 44.5시간의 기간 동안 배양하고, 이때 1L의 접종원 부용을 각각 14L 발효조로 옮겼다. 각각의 14L 발효조는 10L의 발효 배지를 함유하였다. 발효 배지를 접종원 발효조와 유사한 방식으로 제조하였다. 각각의 14L 발효조의 경우, 발효 배지는 6개의 회분처리된 배지 군으로 이루어졌다. 모든 용기의 경우, 군 1은 60g Na₂S0₄, 6.25g NaCl, 10g KCl, 50g MgS0₄·7H₂0, 0.43g (NH₄)₂S0₄, 10g T154 효모 추출물 및 1mL 다우 1520-US 소포제를 함유하였다. 군 1을 121℃에서 120분 동안 14L 발효조에서 약 6.5L의 부피로 고온살균하였다. 군 2는 약 20mL RO 물의 부피에서 2.9g CaCl₂·2H₂0를 함유하였다. 군 3은 100mL의 RO 물에 용해된 17.61g KH₂P0₄를 함유하였다. 군 4는 모두 50mL의 RO 물에 용해된 31mg MnCl₂·4H₂0, 93mg ZnS0₄·7H₂0, 0.4mg Na₂Mo0₄·2H₂0, 20.7mg CuS0₄·5H₂0, 20.7mg NiS0₄·6H₂0, 103mg FeS0₄·7H₂0 및 10g 시트르산을 함유하였다. 군 5는 모두 10mL RO 물에 용해되고 필터-살균된 97.5mg 티아민-HCl, 33.3mg 판토텐산 헤미-칼슘 염 및 36.3μg의 바이오틴을 함유하였다. 군 6은 약 0.5L의 RO 물중 300g의 글루코스를 함유하였다. 군 2, 3, 4, 5 및 6을 합하고, 발효조가 22.5℃의 작동 온도에 도달한 후 발효조에 첨가하였다. 접종 전의 각각의 발효조 부피는 약 6.5L이었다. 각각의 발효조에 상기 접종원 발효로부터의 1L의 부용을 접종하였다. 발효의 pH를 질소 배기까지 pH 7에서 4N 암모늄 하이드록사이드의 0.85L 용액을 이용하여 조절하고, 이때 4N 나트륨 하이드록사이드 및 3N 황산을 7.5의 설정치에서 pH 조절을 위해 이용하였다. 357 내지 833rpm의 교반 및 7 내지 7LPM의 기류를 사용하여 용존 산소를 조절하여 발효중에 20%의 표적을 유지하였다. 용기 NBS1, NBS2 및 NBS3 각각에 상이한 기간 동안 이산화 탄소를 보충하여 증가된 용존 이산화 탄소에 대한 유기체의 민감성을 평가하였다. 발효중에, 95% 덱스트로스(옥수수 시럽)의 850g/L 용액을 공급하여 글루코스 농도를 50g/L 미만으로 유지하였다. 8일 후, 각각의 10L 발효조의 건조 세포 중량 및 오메가-3 역가는 이산화 탄소 보충 조건에 따라 변하였다. 183시간에서, NBS1은 109.1g/L DCW 및 45.87g/L 오메가-3이었고; NBS2는 108.9g/L DCW 및 45.41g/L 오메가-3이었고; NBS3은 116.4g/L DCW 및 50.6g/L 오메가-3이었고; NBS4는 95.7g/L DCW 및 40.36g/L 오메가-3이었다. 이산화 탄소 보충이 개시된 직후, % DHA/FAME는 감소하였고, % EPA/FAME는 증가하였고, DHA 대 EPA의 비는 감소하였다. 이산화 탄소 보충된 조건 및 대기 조건의 최대 % EPA/FAME 함량을 비교하는 경우, CO₂ 보충된 조건하에 최대 EPA 함량이 65% 증가하였다. 결과는 표 8에 제공된다.

[표 8]

실시예 6

본 실시예에서, [Nx0106etl0] 쉬조키트리움 종(ATCC PTA-10208)을 4개의 14L 뉴 브룬스윗 사이언티픽 바이오플로 310 발효조에서 10L의 표적 최종 (레시피) 부피로 탄소(글루코스) 및 질소(암모늄 하이드록사이드) 유가식 공정을 사용하여 배양하였다. 온도를 발효 실행중에 조절하여 NBS1, NBS2, NBS3 및 NBS4 각각에 대해 21.0℃, 22.5℃, 24.0℃ 및 25.5℃의 표적을 유지하였다. 발효조를 각각 1L의 배양물로 각각 접종하였다. 접종원 증식을 위하여, 14L 비르티스 발효조를 이용하였다. 접종원 배지는 4개의 별개의 군으로 제조된 10L의 배지로 이루어졌다. 군 1은 90g MSG·1H₂0, 10g KCl, 50g MgS0₄·7H₂0, 3.7g (NH₄)₂S0₄, 6.25g의 NaCl, 60g의 T154(효모 추출물), 5.2g KH₂P0₄, 2.9g CaCl₂·2H₂0 및 2mL 다우 1520US(소포제)로 이루어졌다. 군 1을 121℃에서 120분 동안 약 9.8L의 부피에서 고온살균하였다. 군 2는 800mL RO 물의 부피에 용해된 500g 글루코스로 이루어졌다. 군 3은 31mg MnCl₂·4H₂0, 31mg ZnS0₄·7H₂0, 0.4mg CoCl₂·6H₂0, 0.4mg Na₂Mo0₄·2H₂0, 20.7mg CuS0₄·5H₂0, 20.7mg NiS0₄·6H₂0, 103mg FeS0₄·7H₂0 및 234.1mg 시트르산으로 이루어졌다. 군 2 및 3을 각각 60분 동안 고온살균하였다. 군 4는 97.5mg 티아민-HCl, 1.6mg 비타민 B12 및 33.3mg 판토텐산 헤미-칼슘 염으로 이루어졌다. 군 4를 RO 물에 용해시키고, 이어서 필터-살균하였다. 발효조를 22.5℃까지 냉각시킨 후, 군 2, 3, 4 및 5를 발효조에 첨가하였다. 나트륨 하이드록사이드 및 황산을 사용하여, 발효조의 pH를 7까지 조정하고, 용존 산소를 접종 전에 100%에 미치게 하였다. 접종원 발효조에 200mL의 보다 적은 발효 배양물(보다 적은 발효 배양물을 제조하고, 10L 접종원 배양물과 동일한 방식으로 배양하였음)을 접종하고, 22.5℃, pH 7, 433rpm 교반 및 5LPM의 공기에서 42시간의 기간 동안 배양하였고, 이때 1L의 접종원 부용을 각각 14L 발효조로 옮겼다. 각각의 14L 발효조는 10L의 발효 배지를 함유하였다. 발효 배지를 접종원 발효조와 유사한 방식으로 제조하였다. 각각의 14L 발효조의 경우, 발효 배지는 4개의 회분처리된 배지 군으로 이루어졌다. 모든 용기의 경우, 군 1은 88g Na₂S0₄, 6.25g NaCl, 10g KCl, 50g MgS0₄·7H₂0, 4.2g (NH₄)₂S0₄, 2.9g CaCl₂·2H₂0, 17.65g KH₂P0₄, 10g T154 효모 추출물 및 1mL 다우 1520-US 소포제를 함유하였다. 군 1을 121℃에서 120분 동안 14L 발효조에서 약 7.0L의 부피로 고온살균하였다. 군 2는 50mL의 RO 물에 용해된 31mg MnCl₂·4H₂0, 93mg ZnS0₄·7H₂0, 0.4mg Na₂Mo0₄·2H₂0, 20.7mg CuS0₄·5H₂0, 20.7mg NiS0₄·6H₂0, 103mg FeS0₄·7H₂0 및 468mg의 시트르산을 함유하였다. 군 2를 60분 동안 고온살균하였다. 군 3은 모두 10mL RO 물에 용해되고 필터 살균된, 97.5mg 티아민-HCl, 33.3mg 판토텐산 헤미-칼슘 염 및 35.8μg의 바이오틴을 함유하였다. 군 4는 약 0.5L의 RO 물중 300g의 글루코스를 함유하고, 60분 동안 고온살균하였다. 군 2, 3 및 4를 합하고, 발효조가 22.5℃의 작동 온도에 도달한 후에 발효조에 첨가하였다. 접종 전의 각각의 발효조 부피는 약 6.5L이었다. 각각의 발효조에 상기 접종원 발효로부터의 1L의 부용을 접종하였다. 질소 배기까지 4N 암모늄 하이드록사이드의 0.85L 용액을 이용하여 발효중에 발효의 pH를 7.0으로 조절하였고, 이때 4N 나트륨 하이드록사이드 및 3N 황산을 설정치에서의 pH 조절을 위해 이용하였다. 용존 산소를 조절하여 질소 배기까지 20%의 표적을 유지하였다. 질소 배기 후, 357 내지 714rpm의 교반 및 8LPM의 기류를 사용하여 용존 산소를 조절하여 10%의 표적을 발효의 종결까지 유지하였다. 발효중에, 95% 덱스트로스(옥수수 시럽)의 850g/L 용액을 공급하여 글루코스 농도를 50g/L 미만으로 유지하였다. 8일 후, 건조 세포 중량 또는 오메가-3 역가는 평가된 상이한 온도에 대해 약간 변하지만, 보다 낮은 발효 온도는 보다 높은 % EPA/FAME를 야기하였다. 184시간에서, NBS1은 85.2g/L DCW 및 29.9g/L 오메가-3이었고; NBS2는 92.0g/L DCW 및 35.0g/L 오메가-3이었고; NBS3은 86.8g/L DCW 및 31.7g/L 오메가-3이었고; NBS4는 84.2g/L DCW 및 29.4g/L 오메가-3이었다.

NBS1의 경우, % EPA/FAME는 발효 실행의 시작부터 종결까지 12.36 내지 19.02%이고, 21.57%의 최대치를 가졌다. NBS2의 경우, % EPA/FAME는 발효 실행의 시작부터 종결까지 11.72 내지 18.11%이고, 20.21%의 최대치를 가졌다. NBS3의 경우, % EPA/FAME는 발효 실행의 시작부터 종결까지 11.49 내지 15.43%이고, 18.09%의 최대치를 가졌다. NBS4의 경우, % EPA/FAME는 발효 실행의 시작부터 종결까지 11.65 내지 13.65%이고, 15.70%의 최대치를 가졌다. 최대 % EPA/FAME를 비교하는 경우, 가장 낮은 발효 온도는 평가된 가장 높은 발효 온도보다 큰 최대 EPA 함량에서의 37% 증가를 야기하였다. 결과가 하기 표 9에 제공된다.

[표 9]

실시예 7

본 실시예에서, [Nx0614etl0] 쉬조키트리움 종(ATCC PTA-10208)을 2개의 14L 뉴 브룬스윗 사이언티픽 바이오플로 310 발효조에서 10L의 표적 최종 (레시피) 부피로 탄소(글루코스) 및 질소(암모늄 하이드록사이드) 유가식 공정을 사용하여 배양하였다. 하나의 발효조(NBS15)에 발효 실행의 시작부터 종결까지 15% 이산화 탄소가 보충된 공기를 뿌리고, 다른 발효조(NBS 17)에 공기만을 뿌려서 증가된 용존 이산화 탄소에 대한 배양물의 민감성을 평가하였다. 각각의 발효조에 각각 1L의 배양물을 접종하였다. 접종원 증식을 위하여, 14L 비르티스 발효조를 이용하였다. 접종원 배지는 4개의 별개 군으로 제조된 10L의 배지로 이루어졌다. 군 1은 90g MSG·1H₂0, 10g KCl, 50g MgS0₄·7H₂0, 3.3g (NH₄)₂S0₄, 6.25g NaCl, 60g T154(효모 추출물), 4.97g KH₂P0₄, 2.9g CaCl₂·2H₂0 및 2mL 다우 1520US(소포제)로 이루어졌다. 군 1을 121℃에서 120분 동안 약 9.8L의 부피로 고온살균하였다. 군 2는 800mL RO 물의 부피에 용해된 500g 글루코스로 이루어졌다. 군 3은 31mg MnCl₂·4H₂0, 31mg ZnS0₄·7H₂0, 0.4mg CoCl₂·6H₂0, 0.4mg Na₂Mo0₄·2H₂0, 20.7mg CuS0₄·5H₂0, 20.7mg NiS0₄·6H₂0, 103mg FeS0₄·7H₂0 및 234.1mg 시트르산으로 이루어졌다. 군 2 및 3을 각각 60분 동안 고온살균하였다. 군 4는 97.5mg 티아민-HCl, 1.6mg 비타민 B12 및 33.3mg 판토텐산 헤미-칼슘 염으로 이루어졌다. 군 4를 RO 물에 용해시키고, 이어서 필터-살균하였다. 발효조를 22.5℃까지 냉각시킨 후, 군 2, 3, 4 및 5를 발효조에 첨가하였다. 나트륨 하이드록사이드 및 황산을 사용하여, 발효조의 pH를 7로 조정하고, 용존 산소를 접종 전에 100%에 미치게 하였다. 접종원 발효조를 200mL의 보다 적은 발효 배양물(보다 적은 발효 배양물을 제조하고, 10L 접종원 배양물과 동일한 방식으로 배양하였음)로 접종하고, 22.5℃, pH 7, 433rpm 교반 및 5LPM의 공기에서 40시간의 기간 동안 배양하였고, 이때 1L의 접종원 부용을 각각의 14L 발효조에 옮겼다. 각각의 14L 발효조는 10L의 발효 배지를 함유하였다. 발효 배지를 접종원 발효조와 유사한 방식으로 제조하였다. 각각의 14L 발효조의 경우, 발효 배지는 6개의 회분처리된 배지 군으로 이루어졌다. 모든 용기의 경우, 군 1은 88g Na₂S0₄, 6.25g NaCl, 10g KCl, 50g MgS0₄·7H₂0, 4.2g (NH₄)₂S0₄, 10g T154 효모 추출물 및 1mL 다우 1520-US 소포제를 함유하였다. 군 1을 121℃에서 120분 동안 14L 발효조에서 약 6.5L의 부피로 고온살균하였다. 군 2는 약 20mL RO 물의 부피중 2.9g CaCl₂·2H₂0를 함유하였다. 군 3은 100mL의 RO 물에 용해된 17.65g KH₂P0₄를 함유하였다. 군 4는 50mL의 RO 물에 용해된 31mg MnCl₂·4H₂0, 93mg ZnS0₄·7H20, 0.4mg Na₂Mo0₄·2H₂0, 20.7mg CuS0₄·5H₂0, 20.7mg NiS0₄·6H₂0, 103mg FeS0₄·7H₂0 및 468mg의 시트르산을 함유하였다. 군 2, 3 및 4를 각각 60분 동안 고온살균하였다. 군 5는 모두 10mL RO 물에 용해되고 필터 살균된 97.5mg 티아민-HCl, 33.3mg 판토텐산 헤미-칼슘 염 및 36.3μg의 바이오틴을 함유하였다. 군 6은 약 0.5L의 RO 물중 300g의 글루코스를 함유하였고, 60분 동안 고온살균되었다. 군 2, 3, 4, 5 및 6을 합하고, 발효조가 22.5℃의 작동 온도에 도달한 후 발효조에 첨가하였다. 접종 전의 각각의 발효조 부피는 약 6.5L이었다. 각각의 발효조에 상기 접종원 발효로부터의 1L의 부용을 접종하였다. 질소 배기까지 4N 암모늄 하이드록사이드의 0.85L 용액을 이용하여 발효의 pH를 발효중에 7.0으로 조절하였고, 이때 4N 나트륨 하이드록사이드 및 3N 황산을 설정치에서 pH 조절을 위해 이용하였다. 용존 산소를 제어하여 20%의 표적을 질소 배기까지 유지하였다. 질소 배기 후, 357 내지 833rpm의 교반 및 8LPM의 기류를 사용하여 용존 산소를 조절하여 발효의 종결까지 10%의 표적을 억제하였다. 발효중에, 95% 덱스트로스(옥수수 시럽)의 850g/L 용액을 공급하여 글루코스 농도를 50g/L 미만으로 유지하였다. 8일 후, 각각의 10L 발효조의 건조 세포 중량 및 오메가-3 역가는 이산화 탄소 보충 조건에 따라 변하였다. 188시간에서, NBS15는 54.5g/L DCW 및 13.7g/L 오메가-3이었고; NBS17은 96.1g/L DCW 및 37.5g/L 오메가-3이었다. % EPA/FAME는 NBS17(CO²가 전혀 보충되지 않음)에서 보다 NBS15(실행중에 CO₂ 보충된 조건)에서 높았다. NBS15의 경우, % EPA/FAME는 발효 실행의 시작부터 종결까지 25.50 내지 35.48%이고, 38.34%의 최대치를 가졌다. NBS17의 경우, % EPA/FAME는 발효 실행의 시작부터 종결까지 12.31 내지 19.80%이고, 22.29%의 최대치를 가졌다. 이산화 탄소 보충된 조건 및 대기 조건의 최대 % EPA/FAME 함량을 비교하는 경우, CO₂ 보충된 조건하에 최대 EPA 함량이 73% 증가한다.

% DHA/FAME는 발효 실행중에 대기 조건의 경우보다 CO₂ 보충된 조건의 경우 낮았다. 결과가 하기 표 10에 제공된다.

[표 10]

실시예 8

본 실시예에서, [K019] 쉬조키트리움 종(ATCC PTA-10208)을 157,000L 교반된 발효조에서 100,000kg의 표적 최종 (레시피) 중량으로 탄소(글루코스) 및 질소(무수 암모니아 기체) 유가식 공정을 사용하여 배양하였다. 발효조에 4,500kg의 배양물을 접종하였다. 접종원 증식을 위하여, 7,500L 교반된 시드 발효조를 이용하였다. 접종원 배지는 4개의 별개의 군으로 제조된 4,500kg의 배지로 이루어졌다. 군 1은 2,300kg의 총 중량을 갖는 공정수에 용해된 40.5kg MSG·1H₂0, 4.5kg KCl, 22.5kg MgS0₄·7H₂0, 1.7kg (NH₄)₂S0₄, 2.81kg의 NaCl, 27kg의 T154(효모 추출물), 2kg KH₂P0₄, 985g CaCl₂ 및 0.9kg 다우 1520US(소포제)로 이루어졌다. 군 2는 1,500kg의 총 중량을 갖는 공정수에 용해된 247.5kg 글루코스·1H₂0로 이루어졌다. 122 내지 123℃에서 30분 동안 스팀-인-플레이스(steam-in-place)를 사용하여, 군 1을 시드 발효조에서 살균하고, 군 2를 별개의 용기에서 살균하였다. 군 3은 5L의 증류수에 용해된 14g MnCl₂·4H₂0, 14g ZnS0₄·7H₂0, 180mg CoCl₂·6H₂0, 180mg Na₂Mo0₄·2H₂0, 9.3g CuS0₄·5H₂0, 9.3g NiS0₄·6H₂0, 46.4g FeS0₄·7H₂0 및 105.3g 시트르산으로 이루어졌다. 군 3을 121℃에서 60분 동안 고온살균하였다. 군 4는 5L 증류수에 용해된 43.9g 티아민-HCl, 720mg 비타민 B12 및 15g 판토텐산 헤미-칼슘 염으로 이루어졌고, 이어서 필터-살균하였다. 시드 발효조를 22.5℃까지 냉각시킨 후, 군 2, 3, 4를 발효조에 첨가하였다. 나트륨 하이드록사이드 및 황산을 사용하여, 발효조의 pH를 7로 조정하고, 용존 산소를 접종 전에 100%에 미치게 하였다. 시드 발효조에 12L의 보다 적은 발효 배양물(보다 적은 발효 배양물을 제조하고, 시드 배양물과 동일한 방식으로 배양하였음)을 접종하고, 22.5℃, pH 7, 90rpm 교반 및 130 내지 170Nm³/시의 공기에서 4 내지 5일의 기간 동안 배양하여 건조 세포 중량 약 15g/L를 수득하였다. 발효 배지를 접종원 발효조와 유사한 방식으로 제조하였다. 발효 배지는 5개의 군으로 이루어졌다. 군 1은 9,000kg의 용액중에 177kg KH₂P0₄, 880kg Na₂S0₄, 500kg MgS0₄·7H₂0, 42kg (NH₄)₂S0₄, 100kg T154 효모 추출물 및 10kg의 다우 1520-US 소포제를 함유하였다. 군 2는 9,000kg 용액중에 21.9kg CaCl₂, 62.5kg NaCl, 100kg KCl을 함유하였다. 군 1 및 2를 열 교환기를 통해 발효조로 펌핑하고, 이어서 물을 펌핑하여 발효조에서 67,000kg의 중량을 수득하였다. 군 3은 1,500kg의 공정수에 용해된 310g MnCl₂·4H₂0, 930g ZnS0₄·7H₂0, 4g Na₂Mo0₄·2H₂0, 207g CuS0₄·5H₂0, 207g NiS0₄·6H₂0, 1.03kg FeS0₄·7H₂0 및 4.68kg 시트르산을 함유하였다. 군 4는 4,300kg의 옥수수 시럽(DE-95, 70.5%)을 함유하였다. 군 3 및 군 4를 122 내지 123℃에서 30분 동안 스팀-인-플레이스를 사용하여 상이한 용기에서 살균하였다. 군 5는 5L 증류수에 용해되고 필터 살균된 975g 티아민-HCI, 333g 판토텐산 헤미-칼슘 염 및 358mg의 바이오틴을 함유하였다. 발효조를 22.5℃로 냉각시킨 후, 군 3, 4 및 5를 발효조에 첨가하였다. 접종 전 발효조 부피내의 중량은 약 73,500kg이었다. 출발 발효 조건(온도: 22.5℃, 압력: 0.34bar, 기류: 3,000Nm³/시, 교반, 40rpm)을 설정한 후, 발효 pH를 7로 조정하고, 용존 산소를 100%에 미치게 하였다. 접종 후의 중량은 약 78,000kg이었다. 시작 시, 550kg의 암모니아가 첨가될 때까지 무수 암모니아를 이용하여 pH를 7에서 조정한 후, 30% 나트륨 하이드록사이드 용액를 7.5의 설정치에서의 pH 조절에 이용하였다. 용존 산소를 조절하여 암모니아 공급물중 20%의 표적, 및 40 내지 100rpm 교반 및 2,000 내지 8,000Nm³/시의 기류를 사용한 후 10%의 표적을 유지하였다. 발효중에, 65% DE-95 옥수수 시럽 용액을 공급하여 글루코스 농도를 약 35g/L로 유지하였다. 다른 예 [K020]에서, 3개의 변화가 예 [K019]로부터 수행되었다: 1) 압력을 0.15bar로 감소시키고, 2) 접종 후의 중량을 68,000kg으로 감소시키고, 3) 기류를 접종 후 60시간에 5,000Nm³/시 초과까지 증가시키고 용존 산소 농도와 상관 없이 실행중에 높게 유지시켰다. 상기 3개의 변화는 부용내의 용존 이산화 탄소 농도를 감소시켰다. 결과는, 감소된 CO₂에 의해 % DHA/FAME가 38.38%로부터 43.8%까지 증가되고, % EPA/FAME가 24.42%로부터 20.68%까지 감소됨을 나타냈다. DHA:EPA 비는 1.57로부터 2.12까지 증가되었다. 결과가 하기 표 11에 제공된다.

[표 11]

[표 12]

실시예 9

하기 표에서, 최대 용존 CO₂가 헨리(Henry) 상수를 사용하여 여러 가지 예에 대해 계산되었다. 제1 조건 "0psi 배압 및 45.5mmol/L/시 CER에서 10L(NBS4 0719etl0)"는 45.5mmol/L/시의 이산화 탄소 진화 속도(evolution rate), 10L의 발효 부피, 0.8vvm의 용존 산소량(aeration rate) 및 0psi 배압하에 표 8에서 NBS4에 대해 계산된 용존 CO₂이다. 제2 조건 "유입구 기체중 6% CO₂에 의한 0psi 배압 및 50mmol/L/시 CER에서 10L(NBS2 0719etl0)"는 50mmol/L/시의 이산화 탄소 진화 속도, 10L의 발효 부피, 0.8vvm의 용존 산소량 및 0psi 배압하에, 써모 프리마 디비(Thermo Prima dB) 질량 분석계를 사용하여 질량 분석에 의해 측정된 총 기체의 6%에서 유입구 스트림에 보충된 CO₂에 의해 표 8에서 NBS2에 대해 계산된 용존 CO₂이다. 제3 조건 "2psi 배압 및 55mmol/L/시 CER에서 80L(NB5 0614etl0)"는 55mmol/L/시의 이산화 탄소 진화 속도, 80L의 발효 부피, 1.0vvm의 용존 산소량 및 2psi 배압하에 표 7에서 NB5에 대해 계산된 용존 CO₂이다. 제 4조건 "15psi 배압 및 50mmol/L/시 CER에서 80L(NB6 0614etl0)"는 50mmol/L/시의 이산화 탄소 진화 속도, 80L의 발효 부피, 1.0vvm의 용존 산소량 및 15psi 배압하에 표 7에서 NB6에 대해 계산된 용존 CO₂이다. 제5 조건 "20psi 배압 및 50mmol/L/시 CER에서 80L(NB7 & NB8 0614etl0)"는 50mmol/L/시의 이산화 탄소 진화 속도, 80L의 발효 부피, 1.0vvm의 용존 산소량 및 20psi 배압하에 표 7에서 NB7 및 NB8에 대해 계산된 용존 CO₂이다. 모든 CER 값을 써모 프리마 디비 질량 분석계에 의해 수집된 배출 가스 CO₂ 데이터를 사용하여 계산하였다. 상기 계산의 결과가 하기 표 13 및 14에 제공된다.

[표 13]

[표 14]

실시예 10

대기 CO₂ 수준하에 트라우스토키트리움 쉐이크 플라스크 미디엄(Thraustochytrium Shake Flask Medium: TSFM)에서 ATCC 수탁번호 PTA-9695를 사용하여 성능(바이오매스의 건조 세포 중량(DW), % DHA, % 지방 및 % EPA)에 대한 비타민 구배의 효과를 측정하기 위한 실험을 수행하였다.

재료 및 방법: 4개의 비타민(티아민·HCl, B12, 바이오틴 및 Ca-판토테네이트)을 0.25g/L 타스톤 및 0.625g/L NaCl(표 16 참고)을 갖는 TSFM 배지에서 사용하였다. 추가적인 MSG 및 KH₂P0₄를 상기 배지에 첨가하여 이의 총 질소 및 인 함량을 유지하였다. 배지내의 전체 비타민 농도는 연구된 비타민에 따라서 0, 0.5x, 1x, 5x, 10x, 20x 또는 30x 표준량이었다(표 17 참고). 구배 연구를 각각의 비타민에 대해 개별적으로 수행하였다. 그러나, 바이오틴 및 Ca-판토테네이트의 경우에서, 티아민·HCl 및 B12의 농도가 통상적인 TSFM에서 매우 낮으므로, 이들의 표준량을 또한 배지에 혼입하였다. 3개의 TSFM 대조군을 또한 비교를 위한 실험에 포함하였다. 이러한 대조군은 2g/L 타스톤(표 15 참고) 및 1x 티아민·HCl 및 1x B12를 갖는 표준 TSFM(C1); 어떠한 비타민도 없는 타스톤-부재 TSFM(A); 및 1x 티아민·HCl 및 1x B12를 갖는 타스톤-부재 TSFM(B)이었다. 모든 대조군은 0.625g/L NaCl을 함유하였다. PTA-9695의 3일된 배양물을 2벌의 250mL 진탕 플라스크를 O.1g DW/L로 접종하는데 사용하였다. 모든 플라스크(평평한 저부, 총 50mL 배지)를 회전 진탕기(200rpm)상에서 22.5+/-1℃에서 호기적으로 항온처리하였다. 모든 배양물을 7일 후에 수거하고, FAME 분석을 최종 동결 건조된 바이오매스 샘플에 대해 수행하였다.

[표 15]

[표 16]

[표 17]

결과: 티아민 구배에 대한 최고 DW 및 % 지방(각각 6.7g/L 및 38.5%)이 배지로 첨가된 이러한 비타민의 양이 표준 수준의 5배인 경우에 달성되었다(도 1). 이러한 티아민 수준에서의 % DHA는 44.1%이었다. 5x 초과 및 미만의 티아민에서, 둘다의 DW 및 % 지방이 감소하기 시작하였다. % DHA는 또한 5x 미만의 티아민을 갖는 배지에서 감소되었고, 5x 초과의 티아민에서 약간 변동이 있었고 유의한 개선은 없었다. 티아민 구배 배양물내의 % EPA는 8.6 내지 11.5이었다. 타스톤 또는 비타민이 배지에 전혀 첨가되지 않은 경우(도 5, 배지 A), % DHA를 제외하고는 모든 것이 상당히 감소하였다. 그러나, DW 및 % 지방 둘다가 이러한 조건에 대해 매우 낮으므로 % DHA의 증가는 인공적인 것으로 나타났다. B12의 1x 농도는 DW, % DHA, % 지방 및 % EPA에 대해 최적인 것으로 보인다(도 2). 비타민 B12의 이러한 수준에서, 7.1g/L DW, 50.6% DHA, 42.7% 지방 및 2.1% EPA가 달성되었다. 최고 % EPA(11.5)는 B12가 배지에 전혀 첨가되지 않은 경우에 수득되었다. 첨가된 비타민이 전혀 없는 타스톤-부재 배지는 유기체의 성능을 추가로 개선시키지 않았고, 보다 높은 % DHA는 상기 기술된 바와 같이 인공적인 것으로 보인다(도 5, 배지 A).

유사하게, 바이오틴의 1x 농도는 DW, % DHA 및 % 지방에 대해 최적이었다(도 3). 이러한 변수에 대한 상응하는 값은 6.8g/L, 47.7% 및 37.9%이었다. 이때, % EPA는 1.9이었다. 1x 티아민 및 1x B12를 갖는 타스톤-부재 배지(도 5, 배지 B)는 PTA-9695의 전체 성능을 상당히 절충하였다.

Ca-판토테네이트는 이러한 비타민이 배지에 10x 표준량으로 첨가되는 경우, 최고 DW, % DHA 및 % 지방을 생산하였다(도 4). 이에 따라, 이러한 변수의 최적 농도는 7.0g/L, 47.3% 및 39.1%이었다. 전체 Ca-판토테네이트 구배 실험에서의 EPA 함량은 2% 미만이었다. PTA-9695의 전반적인 성능에서의 상당한 감소가 유기체가 단지 1x 티아민 및 1x B12를 갖는 타스톤-부재 배지에서 성장하는 경우에 나타났다(도 5, 배지 B).

결과가 또한 하기 데이터 표에 제시된다.

실시예 11

PTA-9695 배양물이 10% CO₂ 조건하의 최대 건조 중량 및 DHA 수율을 야기하는데 요구되는 비타민 B12의 최소량을 비롯한, 비타민 B12가 10% CO₂에서 최대 성능을 달성하기 위한 ATCC 수탁번호 PTA-9695의 최소 요구조건을 측정하기 위해 실험을 수행하였다.

온도: 22.5+/-1℃(10% CO₂)

진탕기 속도: 200rpm

기본 배지: 한정된 소규모 발효조 배지(Defined Scaled-Down Fermentator Medium: DSDFM-B)(표 20).

접종원: 상이한 농도의 비타민 B12를 갖는 DSDFM-B에서 성장한 PTA-9695의 3일된 배양물.

PTA-9695의 새로운 크라이오바이알(cryovial)을 초기에 SDFM-B(표 19)에서 해동하고, 이어서 성장시키고, 10% CO₂하에 한정된 SDFM-B에 여러번 옮겼다. DSDFM-B중 PTA-9695의 3일된 배양물을 (4%) 사용하여 다양한 농도의 비타민 B12를 갖는 DSDFM-B를 함유하는 초기 접종원 플라스크(즉, 이에 따라, 처리 A 내지 I의 경우 7.68mg/L 내지 0mg/L의 B12; 표 18 참고)를 제조하였다. 각각의 농도의 비타민 B12를 위한 접종원 플라스크를, 10% CO₂하에 7일에 1회 배양물을 이들 각각의 신선한 배지로 옮김으로써 유지하였다. 배양물을 매주 옮기는 것은 세포 내부에 저장될 수 있는 임의의 과도한 비타민 B12를 세척하여 이러한 비타민의 최소 요구조건을 보다 정확히 측정할 수 있도록 하는데 필수적이다. 2벌의 진탕 플라스크를 600nm에서의 광학 밀도를 사용하여, 0.1g/L의 이론적 DW에서 이들 각각의 3일된 접종원으로 접종하였다. 배양물을 10% CO₂하에 9일 동안 성장시킨 후, 수거하고, FAME 분석에 의해 추가로 분석하였다.

결과:

주의: 실험실 수리하는 동안 인큐베이터로의 CO₂의 공급이 중단되었고 플라스크가 인큐베이터로부터 6시간 동안 제거되었으므로, 3주 동안의 데이터 점은 본 연구에서 무시되었다.

고 농도의 비타민 B12(3.84mg/L 초과)에 대한 PTA-9695의 장기 노출(4주 이하)은 건조 중량, % 지방 및 DHA 수율에 나쁜 영향을 줄 수 있지만, 1.5 내지 7.68μg/L 비타민 B12의 농도는 PTA-9695의 DW, % 지방, % EPA 및 DHA 수율에 대한 유의한 효과를 갖지 않는다.

단일 세포의 수의 증가(15 이하, 3-4와 반대임)는 7.68mg/L 비타민 B12의 존재하에 성장한 배양물에서 나타났다(처리 A).

비타민 B12를 배지 레시피로부터 제거함으로써, % EPA를 약 10%만큼 상당히 증가시키지만, % DHA 및 % 16:0 둘다를 약간 감소시킨다. 하기 도 6 내지 19 및 표 21은 실험의 결과를 나타낸다.

결론:

약 1.5μg/L 비타민 B12(SDFM-B중 1/500 표준 농도)의 최소치는 최대 DW, % DHA, % 지방 및 DHA 수율을 수득하는데 필수적이다. 매우 높은 농도의 비타민 B12(3.84mg/L 초과)는 DW, % 지방 및 DHA 수율을 실질적으로 감소시키고, 이러한 비타민으로부터의 PTA-9695의 완전한 결핍은 이의 % EPA를 상당히 (약 10%) 감소시킬 수 있다. 매우 높은 수준의 비타민 B12는 "단일 세포"로의 "덩어리" 배양물의 변형을 촉진시키는 역할을 할 수 있다.

[표 18]

[표 19]

[표 20]

[표 21]

실시예 12

10% CO ₂ 에서의 ATCC 수탁번호 PTA-10208 비타민 B12 구배

최적 PTA-10208 성장 및 EPA 생산성을 제공하는 비타민 B12의 농도를 측정하기 위해 실험을 수행하였다.

온도: 23℃

진탕기 속도: 200rpm

기본 배지: 한정된 SDFM-O(DSDFM-O)

접종원: PTA-10208의 바이알을 대기 조건에서 SDFM-0로 해동하다. 2mL의 배양물을 10% CO₂에서 48mL의 DSDFM-0로 옮겼다. 배양물을 신선한 DSDFM-O(10% CO₂)로 옮겼다(표 22 참고). 배양물을 신선한 DSDFM-O(10% CO₂)로 옮겼다. 배양물을 사용하여 비타민 B12 구배 실험 주 1(2mL/플라스크)(10% CO₂)에 접종하였다.

실험 설정

모든 배양물을 50mL 진탕 플라스크에서 성장시키고, 2벌 플라스크를 각각의 조건에 대해 성장시켰다. PTA-10208을 7일에 1회 DSDFM-O(타스톤 없음)중 9일 비타민 B12 구배에 접종시켰다. 각각의 농도의 비타민 B12에 대한 접종원을 실험 과정중에 유지하였다. PTA-10208을 감소된 농도의 비타민 B12에 계속 옮김으로써, 과량의 비타민 B12를 세포로부터 효과적으로 세척하였다. 각각의 농도의 비타민 B12의 접종원을 7일에 1회 옮겼다. 4일된 접종원을 사용하여 각각의 9일 비타민 B12 구배를 개시하였다. 각각의 9일 구배는 실험 세트 A, B, C, D, E, F, G, H, I, J 및 K로서 하기 표 23에 연속적으로 표지된다. 각각의 구배 접종 전에, 광학 밀도를 대략적으로 동일한 양의 세포를 옮기기 위하여 각각의 농도의 비타민 B12에 대해 측정하였다. 9일의 성장 후, 모든 배양물을 수거하여 pH, 건조 중량 및 지방산 프로파일을 측정하였다. 각각의 농도의 비타민 B12에서 건조 중량이 3개 이상의 연속적인 9일 구배 동안 안정화된 것으로 밝혀지는 경우 실험을 종결하였다.

[표 22]

[표 23]

7개의 연속적인 5x 내지 1/500x 비타민 B12 구배를 수행하였다. 마지막 실험의 종결 시, 1/500x(0.0015mg/L) 및 0x(0mg/L 비타민 B12)에서의 PTA-10208 성장 및 EPA 생산을 비교하는 새로운 실험을 시작하였다. 4개의 연속적인 1/500x 대 0x 비타민 B12 실험을 수행하였다.

결과:

(5x --> 1/500x 비타민 B12의 경우): 7개의 연속적인 9일 실험의 경우, PAT- 10208 건조 중량, % EPA, % DHA, % 지방 및 EPA 수율은 5x(3.84mg/L) 내지 1/500x(0.0015mg/L)의 범위의 비타민 B12 농도를 변화시키지 않았다.

(1/500x 및 0x 비타민 B12의 경우): 4개의 연속적인 9일 실험의 과정에 걸친 결과는 0mg/L 비타민 B12를 함유하는 DSDFM-0에서 성장한 PTA-10208이 단지 1/500x(0.0015mg/L) 비타민 B12에 의해 성장하는 경우보다 훨씬 높은 % EPA를 가짐을 나타냈다. % EPA가 1/500x(0.0015mg/L) 비타민 B12에 의한 약 18%로부터 어떠한 비타민 B12도 없는 약 27%까지 증가하는 반면, % DHA는 1/500x(0.0015mg/L) 비타민 B12에 의한 약 45%로부터 어떠한 비타민 B12도 없는 약 36%까지 감소한다. PTA-10208 건조 중량 및 % 지방은 비타민 B12가 DSDFM-O로부터 완전히 제거되는 경우 약간 증가한다. % EPA의 증가 및 건조 중량 및 % 지방의 약간의 증가의 결과로서, PTA-10208 EPA 수율은 비타민 B12가 DSDFM-O로부터 제거되는 경우 약 60%만큼 증가한다.

결과가 또한 도 20 내지 49 및 하기 표에 나타난다.

결론: PTA-10208 성장 및 EPA 생산성은 10% CO₂하에 DSDFM-O중의 5x(3.84mg/L) 내지 1/500x(0.0015mg/L)의 비타민 B12 농도에서 변하지 않았다. 그러나, 비타민 B12가 DSDFM-O로부터 완전히 제거되는 경우, % EPA는 약 50%만큼 증가하고, 건조 중량 및 % 지방이 또한 약간 증가하고, 이는 EPA 생산성에서의 60% 증가를 야기한다.

본원에 기재된 모든 다양한 측면, 양태 및 선택사항은 임의의 모든 변형으로 조합될 수 있다.

본 명세서에서 언급된 모든 공개문헌, 특허 및 특허출원은, 각각의 개별적인 공개문헌, 특허 또는 특허출원이 구체적으로 및 개별적으로 참고로서 혼입되는 것으로 나타낸 바와 동일한 정도로 본원에 참고로서 포함된다.

SEQUENCE LISTING <110> DSM IP ASSETS B.V. <120> EICOSAPENTAENOIC ACID-PRODUCING MICROORGANISMS, FATTY ACID COMPOSITIONS, AND METHODS OF MAKING AND USES THEREOF <130> 2715.256PC01 <140> PCT/US2012/047728 <141> 2012-07-20 <150> US61/510,464 <151> 2011-07-21 <160> 2 <170> PatentIn version 3.3 <210> 1 <211> 1705 <212> DNA <213> Thraustochytrium sp. <400> 1 aagatacctg gttgatcctg ccagtagtca tacgctcgtc tcaaagatta agccatgcat 60 gtgtcagtat aaatactttt actttgaaac tgcgaacggc tcattaaatc agtaattatc 120 tacatggtaa cgaaaattat atggataacc gtagtaattc tagggctaat acatgcgtaa 180 aatctgggta actggatgca tttattggat tgaagccaac attaaaaggt gattcacgat 240 aactaagcgg agcgttttag gacgctgaat cattcgagtt tctgccctat cagctgtcga 300 tggtaaggta ttggcttacc atggcgttaa cgggtaacgg agaattaggg ttcgattccg 360 gagagggagc ctgagagacg gctaccacat ccaaggaagg cagcaggcgc gtaaattgcc 420 caatgagaac ttctcgaggc agtgacaaga aatatcaaag tgatgccgtt aggtattgca 480 tttgaaatga gaacgatgta caacttctaa cgatgatcaa ttggagggca agtctggtgc 540 cagcagccgc ggtaattcca gctccaatag cgtatactaa cgttgctgca gttaaaacgc 600 ccgtagttga attagtatca tggtatttta accttattcg atgaatttga gttgaaagct 660 aggatatata ggaagcgatt cctcatttac tgtaaaaaaa ttagagtgtt tcacacagat 720 cgtaagatcg ggatatatta gtatggaata ataagatagg actttggtgc tattttgttg 780 gtttgcacac caaagtaatg attaataggg acagttgggg gtattcgtat ttaattgtca 840 gaggtgaaat tcttggattt atgaaagacg aactactgcg aaagcattta ccaaggatgt 900 tttcattaat caaggacgaa agttagggga tcgaagatga ttagatacca tcgtagtctt 960 aaccataaac tatgccgact gaggattctt gaaatttgta aatgaattta agagcactcc 1020 atgagaaatc aaagtctttg ggttccgggg ggagtatggt cgcaagtctg aaacttaaag 1080 gaattgacgg aagggcacca ccaggagtgg agcctgcggc ttaatttgac tcaacacggg 1140 aaaacttacc aggtccagac atagtgagga ttgacagatt gatagctctt tcttgattct 1200 atgggtggtg gtgcatggcc gttcttagtt ggtggtttga actgtctgct taattgcgtt 1260 aacgaacgag acctcagcct actaaatagt atgttgttta gtaataaatg atatgacttc 1320 ttagagggac atttcgggtt taccggaagg aagtttgagg caataacagg tctgtgatgc 1380 ccttagatgt tctgggccgc acgcgcgcta cactgacgag ctcaacaagt aatatttggt 1440 tgtctggaag gattgcctaa tcttttaaat actcgtcgtg atggggctag attcttgtaa 1500 ttattaatct ccaacgagga attcctagta aacgcaagtc atcagcttgc attgattacg 1560 tccctgccct ttgtacacac cgcccgtcgc acctaccgat tggatggtcc ggtgaaatct 1620 tcggatgttt ttttacaata gtagagagac aaaagttgag taaaccttac catctagagg 1680 aaggtgaagt cgtaacaagg atctt 1705 <210> 2 <211> 1713 <212> DNA <213> Schizochytrium sp. <400> 2 acctggttga tcctgccagc tgtcatttgc tcgtctaaaa gattaagcca tgcatgtcta 60 agtataaaca aattatacgg tgaaactgcg aacggctcat tatatcagtt atagtttctt 120 tgatagtgta tttctatatc tatttggata actgtggcaa ttctagagct aacacatgct 180 ttcgagtggg actttttggt accactgcat ttattagatt ttgaagccaa cgtaaaattg 240 gtgattcatg ataactttgc gaatcgcagt agcgtcttgt acgcggcgat gaatcattca 300 agtttctgcc ccatcagctg tcgatggtac ggtattggcc taccatggct ttcacgggtg 360 acggagaatt agggtttgat tccggagagg acgcttgaga gacggcgacc acatccaagg 420 aaggcagcag gcgcgtaaat tacccaatgg ggactccccg aggtagtgac aagaaataaa 480 aatgaggagc gctttgcgtt tttcaatttg aatgagagaa tcgtacaatc ctcatcgagg 540 atcaattgga gggcaagtct ggtgccagca gccgcggtaa ctccagctcc aatagcaaat 600 attagagttg ttgcagttaa aaagctcgta gttgaatttc cgatagtctt tggccgtgtc 660 cttggtctcg tatcatgggt ttattgtgcc aagatgatcg tcctctatgg ttagtgatag 720 tcatagtcgt ttactgtaaa aaaactggag tgtttaaagc atttctttgg gaaaggtaca 780 tattagtata ggataattag ataggacctg tgattcttat ttggttggtt tgtgagtcat 840 ggtaatgatt aatagggaca atcgggggta ttcgaattta attgtcagag gtgaaattct 900 tggatttaag aaagtcgaac tactgcgaag gcatttacca aggatgtttt cattaataaa 960 gaacgaaagt taggggatcg aagatgatta gataccatcg tagtcttaac tgtaaactat 1020 gccgacttgc gattgtccgt cgttgttttt tcaaaaaaga gacctgggca gcagcacatg 1080 agaaatcaaa gtttttgggt tccgggggga gtatggtcgc aaggctgaaa cttaaaggaa 1140 ttgacggaag ggcaccacca ggagtggagc ctgcggctta attcgactca acacgggaaa 1200 acttaccagg tccagacata gtaaggattg acagattgag agctctttct tgattctatg 1260 ggtggtggtg catggccgtt cttagttggt ggagtgattt gtctggttaa ttccgttaac 1320 gaacgagacc tcagcctact aaatagtggt gcatattgtg agatatgtga caaaaatcgc 1380 ttcttagagg gacatttcgg gtttaccgga aggaagtttg aggcaataac aggtctgtga 1440 tgcccctaga tgttctgggc cgcacgcgcg ctacaatgac agattcaaca agtccggtag 1500 tggagctttt gcttctctat tattactttt ccgagaggaa tggttaatct tctaaatgtc 1560 tgtcgtgatg gggctagatt tttgcaatta ttaatctcca acgaggaatt cctagtaaac 1620 gcaagtcatc agcttgcatt gattacgtcc ctgccctttg tacacaccgc ccgtcgcacc 1680 taccgattga acggtcctat gaaatcttcg gat 1713

Claims

미생물을 0.01mg/L 미만의 비타민 B12를 포함하는 배양 배지에서 성장시켜 바이오매스를 생산하는 단계를 포함하는, 증가된 농도의 에이코사펜타엔산(EPA) 및 지방산을 갖는 미생물의 바이오매스의 생산 방법으로서,
상기 EPA 농도가 0.01mg/L 초과의 비타민 B12를 포함하는 배양 배지에서 성장한 미생물 유래 바이오매스에서의 EPA 농도에 비하여 300% 이상 증가된 것이고,
상기 미생물은 트라우스토키트리드(Thraustochytrid)인, 바이오매스의 생산 방법.
제1항에 있어서,
상기 배양 배지가 0.001 mg/L 미만의 비타민 B12를 포함하는 생산 방법.
제2항에 있어서,
상기 배양 배지가 0.0001 mg/L 미만의 비타민 B12를 포함하는 생산 방법.
제3항에 있어서,
상기 배양 배지가 비타민 B12를 함유하지 않는 생산 방법.
제2항에 있어서,
상기 EPA 농도가 0.001mg/L 초과의 비타민 B12를 포함하는 배양 배지에서 성장한 미생물 유래 바이오매스에서의 EPA 농도에 비하여 200% 이상 증가된 것인 생산 방법.
제3항에 있어서,
상기 EPA 농도가 0.0001mg/L 초과의 비타민 B12를 포함하는 배양 배지에서 성장한 미생물 유래 바이오매스에서의 EPA 농도에 비하여 100% 이상 증가된 것인 생산 방법.
제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 미생물이 지방산의 총 중량의 3 중량% 이상의 EPA를 생산하는 생산 방법.
(a) 미생물을 발효조 용기에서 발효시켜 바이오매스를 생산하는 단계; 및
(b) 상기 바이오매스 중의 EPA의 농도를 증가시키기 위하여 대기압보다 0.5psi 이상 높은 압력을 120시간 이하의 시간 동안 상기 바이오매스에 제공하는 단계
를 포함하는, 지방산 및 소정 농도의 EPA를 갖는 미생물의 바이오매스 중의 EPA의 농도를 증가시키는 방법.
제8항에 있어서,
상기 용기가 0.4 내지 30psi의 수두압(head pressure)을 갖는 방법.
제9항에 있어서,
상기 용기가 1 내지 30psi의 수두압을 갖는 방법
제10항에 있어서,
상기 용기가 1 내지 20psi의 수두압을 갖는 방법.