ES2857173T3 - Aceites microbianos enriquecidos en ácidos grasos poliinsaturados - Google Patents

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Abstract

Un aceite microbiano enriquecido que comprende al menos un 70 % en peso de una combinación de DHA y EPA, en el que el aceite comprende al menos un 10 % en peso de EPA y en el que (i) el aceite comprende al menos un 50 % en peso de DHA y al menos un 20 % en peso de EPA; o (ii) el aceite comprende una fracción de triacilglicerol, en el que al menos un 50 % en peso de los ácidos grasos en la fracción de triacilglicerol es DHA y al menos un 20 % en peso de los ácidos grasos en la fracción de triacilglicerol es EPA.

Description

DESCRIPCIÓN
Aceites microbianos enriquecidos en ácidos grasos poliinsaturados
Referencia a una lista de secuencias remitida electrónicamente
El contenido de la lista de secuencias remitida electrónicamente ("sequence listing.txt", 5074 bytes, creado el 20 de julio de 2011) presentada con la solicitud se incorpora en la presente memoria por referencia en su totalidad.
Antecedentes de la invención
Campo de la invención
Esta solicitud divulga aceites microbianos que están enriquecidos en ácidos grasos poliinsaturados, sus ésteres, sus sales de ácido, sus alcoholes y/o sus aldehídos; composiciones que contienen aceites microbianos enriquecidos; y métodos de preparación y uso de los aceites microbianos enriquecidos.
La presente invención se refiere a métodos de uso de los aceites.
Técnica anterior
Los ácidos grasos se clasifican basándose en la longitud y características de saturación de la cadena de carbono. Los ácidos grasos se denominan ácidos grasos de cadena corta, cadena media o cadena larga basándose en el número de carbonos presentes en la cadena, se denominan ácidos grasos saturados cuando no hay dobles enlaces presentes entre los átomos de carbono, y se denominan ácidos grasos insaturados cuando hay dobles enlaces presentes. Los ácidos grasos de cadena larga insaturados son monoinsaturados cuando hay solamente un doble enlace presente y son poliinsaturados cuando hay más de un doble enlace presente.
Los ácidos grasos poliinsaturados (PUFA) se clasifican basándose en la posición del primer doble enlace desde el extremo metilo del ácido graso: los ácidos grasos omega-3 (n-3) contienen un primer doble enlace en el tercer carbono, mientras que los ácidos grasos omega-6 (n-6) contienen un primer doble enlace en el sexto carbono. Por ejemplo, el ácido docosahexaenoico ("DHA") es un ácido graso poliinsaturado de cadena larga (LC-PUFA) omega-3 con una longitud de cadena de 22 carbonos y 6 dobles enlaces, a menudo denominado "22:6 n-3". Otros LC-PUFA omega-3 incluyen ácido eicosapentaenoico ("EPA"), denominado "20:5 n-3" y ácido docosapentaenoico omega-3 ("DPA n-3"), denominado "22:5 n-3". DHA y EPA se han denominado ácidos grasos "esenciales". Los LC-PUFA omega-6 incluyen ácido araquidónico ("ARA"), denominado "20:4 n-6" y ácido docosapentaenoico omega-6 ("DPA n-6"), denominado "22:5 n-6".
Los ácidos grasos omega-3 son moléculas biológicamente importantes que afectan a la fisiología celular debido a su presencia en las membranas celulares, regulan la producción y expresión génica de compuestos biológicamente activos, y sirven como sustratos biosintéticos. Roche, H. M., Proc. Nutr. Soc. 58: 397-401 (1999). DHA, por ejemplo, representa aproximadamente un 15 %-20 % de los lípidos en la corteza cerebral humana, un 30 %-60 % de los lípidos en la retina, está concentrado en los testículos y esperma, y es un componente importante de la leche materna. Berge, J.P., y Barnathan, G. Adv. Biochem. Eng. Biotechnol. 96:49-125 (2005). DHA representa hasta un 97 % de los ácidos grasos omega-3 en el cerebro y hasta un 93 % de los ácidos grasos omega-3 en la retina. Además, DHA es esencial para el desarrollo tanto fetal como infantil, así como para el mantenimiento de las funciones cognitivas en adultos. Id. Como los ácidos grasos omega-3 no se sintetizan de novo en el organismo humano, estos ácidos grasos deben obtenerse de fuentes nutritivas.
El aceite de linaza y los aceites de pescado se consideran buenas fuentes alimenticias de ácidos grasos omega-3. El aceite de linaza no contiene EPA, DHA, DPA o ARA, sino que en su lugar contiene ácido linolénico (C18:3 n-3), un componente básico que posibilita que el organismo fabrique EPA. Hay evidencias, sin embargo, de que la tasa de conversión metabólica puede ser lenta y variable, particularmente entre los que tienen la salud deteriorada. Los aceites de pescado varían considerablemente en el tipo y nivel de composición de ácidos grasos dependiendo de la especie particular y su alimentación. Por ejemplo, los peces criados por acuacultura tienen de tener un nivel menor de ácidos grasos omega-3 que los que son silvestres. Además, los aceites de pescado corren el riesgo de contener contaminantes ambientales y pueden estar asociados con problemas de estabilidad y un olor o sabor a pescado.
Los traustoquitridios son microorganismos del orden Thraustochytriales. Los traustoquitridios incluyen miembros del género Schizochytrium y Thraustochytrium y se han reconocido como una fuente alternativa de ácidos grasos omega-3, incluyendo DHA y EPA. Véase la patente de Estados Unidos n.° 5130242. Los aceites producidos a partir de estos microorganismos heterotróficos marinos a menudo tienen perfiles de ácidos grasos poliinsaturados más simples que los aceites correspondientes de pescado o microalgas. Lewis, T.E., Mar. Biotechnol. 1: 580-587 (1999). Se ha informado de que cepas de especies de traustoquitridios producen ácidos grasos omega-3 como un alto porcentaje de los ácidos grasos totales producidos por los organismos. Patente de Estados Unidos n.° 5130242; Huang, J. et al., J. Am. Oil. Chem. Soc. 78: 605-610 (2001); Huang, J. et al., Mar. Biotechnol. 5: 450-457 (2003). Sin embargo, los traustoquitridios aislados varían en la identidad y cantidades de los LC-PUFA producidos, de modo que algunas cepas descritas previamente pueden tener niveles indeseables de ácidos grasos omega-6 y/o pueden mostrar baja productividad en cultivo. Por tanto, existe una necesidad continuada de aislamiento de microorganismos que muestren alta productividad y perfiles deseables de LC-PUFA.
Además, hay una necesidad insatisfecha de aceites microbianos enriquecidos que contengan mayores concentraciones de ácidos grasos poliinsaturados, sus ésteres, sus aldehídos, sus sales de ácido y/o sus alcoholes, que los encontrados en aceites microbianos previos.
La publicación internacional WO 2012/109545 describe métodos para sedimentar una biomasa microbiana, extraer una composición de lípidos refinada a partir de la biomasa sedimentada en condiciones supercríticas y destilar la composición de líquidos refinada, al menos una vez en condiciones de destilación de trayectoria corta, para obtener una fracción que contiene lípidos. También se divulgan métodos de preparación de concentrados de aceite que contienen lípidos a partir de la misma, por transesterificación y enriquecimiento de la fracción que contiene lípidos.
El documento US 2009/093543 describe cepas manipuladas de la levadura oleaginosa Yarrowia lipolytica que puede producir más de un 50 por ciento en peso de ácido eicosapentaenoico en la fracción de aceite total.
El documento US 2008/175975 describe un método para producir una composición de ácidos grasos que, basándose en el peso completo de los ácidos grasos y/o derivados de ácido graso contenidos en la composición de ácidos grasos, contiene al menos un 70,0 % en peso de ácido docosahexaenoico y/o éster alquílico del ácido docosahexaenoico.
Breve compendio de la invención
La presente invención se refiere a un aceite microbiano enriquecido que comprende al menos un 70 % en peso de una combinación de DHA y EPA, en el que el aceite comprende al menos un 10 % en peso de EPA y en el que (i) el aceite comprende al menos un 50 % en peso de DHA y al menos un 20 % en peso de EPA; o (ii) el aceite comprende una fracción de triacilglicerol, en el que al menos un 50 % en peso de los ácidos grasos en la fracción de triacilglicerol es DHA y al menos un 20 % en peso de los ácidos grasos en la fracción de triacilglicerol es EPA. En algunas realizaciones, el DHA y EPA están en forma de éster. Por ejemplo, el éster de DHA y EPA puede ser un éster etílico.
La presente invención se refiere a un alimento, complemento o composición farmacéutica que comprende un aceite microbiano enriquecido de la invención. La composición farmacéutica puede contener un vehículo farmacéuticamente aceptable.
En algunas realizaciones, el aceite microbiano enriquecido se puede obtener de un microorganismo aislado de una especie Schizochytrium.
En algunas realizaciones, el aceite de la invención se puede obtener de un microorganismo aislado de la especie depositada según el acceso de ATCC n.° PTA-10208, en el que los ácidos grasos totales producidos por el microorganismo comprenden más de un 10 % en peso de EPA.
En algunas realizaciones, el aceite de la invención se puede obtener de un microorganismo aislado que tiene las características de la especie depositada según el acceso de ATCC n.° PTA-10208, en el que los ácidos grasos totales producidos por el microorganismo comprenden más de aproximadamente un 10 % en peso de EPA.
En algunas realizaciones, el aceite de la invención se puede obtener de un microorganismo aislado que produce una fracción de triacilglicerol, en el que el contenido de EPA de la fracción de triacilglicerol es de al menos aproximadamente un 12 % en peso.
En algunas realizaciones, el aceite de la invención se puede obtener de un microorganismo aislado depositado según el acceso de ATCC n.° pTa -10208.
En algunas realizaciones, el aceite de la invención se puede obtener de un microorganismo aislado depositado según el acceso de ATCC n.° pTa -10209.
En algunas realizaciones, el aceite de la invención se puede obtener de un microorganismo aislado depositado según el acceso de ATCC n.° pTa -10210.
En algunas realizaciones, el aceite de la invención se puede obtener de un microorganismo aislado depositado según el acceso de ATCC n.° pTa -10211.
La presente invención se refiere a una forma farmacéutica oral que comprende los aceites microbianos enriquecidos de la invención. En algunas realizaciones, la dosificación oral comprende de 100 mg a 3000 mg de ácidos grasos poliinsaturados omega-3. En algunas realizaciones, la dosificación oral comprende de 500 mg a 1000 mg de una combinación de DHA y EPA. En algunas realizaciones, la forma farmacéutica oral es una cápsula. En algunas realizaciones, la forma farmacéutica oral es una cápsula vegetariana.
La presente invención se refiere a un método para tratar una cardiopatía o una afección relacionada con la misma en un sujeto que lo necesita, que comprende administrar al sujeto un aceite de la invención, o una mezcla de los aceites de la invención, y un vehículo farmacéuticamente aceptable.
La presente invención se refiere al uso del aceite de la invención, o mezclas de los aceites de la invención, para la fabricación de un medicamento para el tratamiento de una cardiopatía o una afección relacionada con la misma. La presente invención se refiere al uso del aceite de la invención, o mezclas de los aceites de la invención, para la fabricación de un complemento para mejorar una cardiopatía o una afección relacionada con la misma, o mantener un corazón saludable o un estado relacionado con el mismo.
La presente invención se refiere a un método para producir los aceites microbianos enriquecidos de la invención a partir de la biomasa de un microorganismo, que comprende las etapas de: a) calentar y hacer reaccionar la biomasa en presencia de un alcohol y una base para producir un éster de un ácido graso poliinsaturado a partir de la biomasa; b) separar la biomasa en una fase sustancialmente líquida, enriquecida con ácido graso poliinsaturado, y una fase sustancialmente sólida; y c) purificar la fase sustancialmente líquida recuperando una fracción que comprende el éster de ácido graso poliinsaturado.
En algunas realizaciones, el microorganismo es un microorganismo aislado de una especie Schizochytrium.
En algunas realizaciones, el microorganismo es uno cualquiera de los microorganismos aislados de las especies depositadas según los accesos de ATCC n.°: PTA-10212, PTA-10213, PTA-10214, PTA-10215, PTA-10208, PTA-10209, PTA-10210, PTA-10211, una cepa mutante de las mismas o una mezcla de las mismas.
En algunas realizaciones, la etapa de calentamiento a) se realiza de aproximadamente 80 °C a 100 °C.
En algunas realizaciones, la etapa de calentamiento a) se realiza a 90 °C.
En algunas realizaciones, la base es hidróxido de potasio.
En algunas realizaciones, el alcohol es etanol.
En algunas realizaciones, el éster es un éster etílico del ácido graso poliinsaturado.
En algunas realizaciones, el ácido graso poliinsaturado es una combinación de DHA y EPA.
En algunas realizaciones, la etapa de separación b) se realiza por centrifugación o filtración.
En algunas realizaciones, la etapa de purificación c) se realiza por cristalización con formación de aductos de urea en etanol.
En algunas realizaciones, la etapa de purificación c) se realiza por destilación fraccionada molecular al vacío.
Se divulga además un microorganismo aislado de la especie depositada según el acceso de ATCC n.° PTA-10212. Se divulga además un microorganismo aislado que tiene las características de la especie depositada según el acceso de ATCC n.2 PTA-10212.
Se divulga además un microorganismo aislado que comprende un ARNr 18s que comprende una secuencia polinucleotídica de SEQ ID NO: 1 o una secuencia polinucleotídica que tiene al menos un 94 % de identidad con SEQ ID NO:1.
Se divulga además un microorganismo aislado que comprende una secuencia polinucleotídica de ARNr 18s que tiene al menos un 94 % de identidad con una secuencia polinucleotídica de ARNr 18s del microorganismo depositado según el acceso de ATCC n.° PTA-10212.
Se divulga además un microorganismo aislado de la especie depositada según el acceso de ATCC n.° PTA-10208, en el que los ácidos grasos totales producidos por el microorganismo comprenden más de aproximadamente un 10 % en peso de ácido eicosapentaenoico.
Se divulga además un microorganismo aislado que tiene las características de la especie depositada según el acceso de ATCC n.° PTA-10208, en el que los ácidos grasos totales producidos por el microorganismo comprenden más de aproximadamente un 10 % en peso de ácido eicosapentaenoico.
Se divulga además un microorganismo aislado que produce una fracción de triacilglicerol, en el que el contenido de ácido eicosapentaenoico de la fracción de triacilglicerol es de al menos aproximadamente un 12 % en peso.
En algunas realizaciones, el microorganismo aislado es una cepa mutante.
Se divulga además un microorganismo aislado depositado según el acceso de ATCC n.° PTA-10212, PTA-10213, PTA-10214, PTA-10215, PTA-10208, PTA-10209, PTA-10210 o PTA-10211.
Se divulga además una biomasa que comprende cualquiera de los microorganismos de la invención o mezclas de los mismos.
Se divulga además una biomasa aislada, en la que al menos aproximadamente un 20 % en peso del peso celular seco de la biomasa son ácidos grasos, en la que más de aproximadamente un 10 % en peso de los ácidos grasos es ácido eicosapentaenoico, y en la que los ácidos grasos comprenden menos de aproximadamente un 5 % en peso de cada uno de ácido araquidónico y ácido docosapentaenoico n-6. En algunas realizaciones, al menos aproximadamente un 25 % en peso de los ácidos grasos es ácido docosahexaenoico.
Se divulga además una biomasa aislada que comprende triacilglicerol, en la que al menos aproximadamente un 12 % en peso del triacilglicerol es ácido eicosapentaenoico.
Se divulga además cualquiera de las biomasas aisladas como se describe en la presente memoria, en la que los ácidos grasos comprenden además menos de aproximadamente un 5 % en peso de cada uno de ácido oleico, ácido linoleico, ácido linolénico, ácido eicosenoico y ácido erúcico.
Se divulga además un cultivo aislado que comprende cualquiera de los microorganismos de la invención o mezclas de los mismos.
La presente invención se refiere a un producto alimenticio, cosmético o composición farmacéutica para un animal no humano o ser humano, que comprende cualquiera de los microorganismos o biomasas de la invención o mezclas de los mismos.
Se divulga además un aceite microbiano que comprende al menos aproximadamente un 20 % en peso de ácido eicosapentaenoico y menos de aproximadamente un 5 % en peso de cada uno de ácido araquidónico, ácido docosapentaenoico n-6, ácido oleico, ácido linoleico, ácido linolénico, ácido eicosenoico, ácido erúcico y ácido estearidónico. En algunas realizaciones, el aceite microbiano comprende además al menos aproximadamente un 25 % en peso de ácido docosahexaenoico.
Se divulga además un aceite microbiano que comprende una fracción de triacilglicerol de al menos aproximadamente un 10 % en peso, en el que al menos aproximadamente un 12 % en peso de los ácidos grasos en la fracción de triacilglicerol es ácido eicosapentaenoico, en el que al menos aproximadamente un 25 % en peso de los ácidos grasos en la fracción de triacilglicerol es ácido docosahexaenoico, y en el que menos de aproximadamente un 5 % en peso de los ácidos grasos en la fracción de triacilglicerol es ácido araquidónico.
La presente invención se refiere a un producto alimenticio, cosmético o composición farmacéutica para un animal no humano o ser humano, que comprende cualquiera de los aceites microbianos de la invención. En algunas realizaciones, el producto alimenticio es una leche maternizada de inicio. En algunas realizaciones, la leche maternizada de inicio es adecuada para lactantes prematuros. En algunas realizaciones, el producto alimenticio es una leche, una bebida, una bebida terapéutica, una bebida nutritiva o una combinación de los mismos. En algunas realizaciones, el producto alimenticio es un aditivo para el alimento del animal no humano o ser humano. En algunas realizaciones, el producto alimenticio es un complemento nutritivo. En algunas realizaciones, el producto alimenticio es un pienso para animales. En algunas realizaciones, el pienso para animales es un pienso de acuicultura. En algunas realizaciones, el pienso para animales es un pienso para animales domésticos, un pienso para animales de zoológico, un pienso para animales de trabajo, un pienso para ganado o una combinación de los mismos.
Se divulga además un método para producir un aceite microbiano que comprende ácidos grasos omega-3, comprendiendo el método: hacer crecer cualquiera de los microorganismos aislados de la invención o mezclas de los mismos en un cultivo para producir un aceite que comprende ácidos grasos omega-3. En algunas realizaciones, el método comprende además extraer el aceite.
Se divulga además un método para producir un aceite microbiano que comprende ácidos grasos omega-3, comprendiendo el método extraer un aceite que comprende ácidos grasos omega-3 de cualquiera de las biomasas de la invención. En algunas realizaciones, el aceite microbiano se extrae usando un proceso de extracción con disolvente orgánico, por ejemplo, extracción con hexano. En algunas realizaciones, el aceite microbiano se extrae usando un proceso de extracción sin disolvente.
Se divulga además un aceite microbiano producido por el método como se divulga en la presente memoria.
Se divulga además un método para producir una biomasa de la invención, que comprende: hacer crecer cualquiera de los microorganismos aislados de la invención o mezclas de los mismos en un cultivo para producir una biomasa.
Se divulga además una biomasa producida por un método de la invención.
Se divulga además un método para producir una cepa mutante de la invención, que comprende: mutagenizar cualquiera de los microorganismos de la invención, y aislar la cepa mutante.
Se divulga además el uso de cualquiera de los microorganismos aislados, biomasas o aceites microbianos como se describe en la presente memoria o mezclas de los mismos, para la fabricación de un medicamento para el tratamiento de inflamación o una afección relacionada con la misma.
Se divulga además el uso de cualquiera de los microorganismos aislados, biomasas o aceites microbianos de la invención como se describe en la presente memoria o mezclas de los mismos, para el tratamiento de inflamación o una afección relacionada con la misma.
Se divulga además cualquiera de los microorganismos aislados, biomasas o aceites microbianos como se describe en la presente memoria o mezclas de los mismos, para su uso en el tratamiento de inflamación o una afección relacionada con la misma.
Se divulga además un método para tratar inflamación o una afección relacionada con la misma en un sujeto que lo necesita, que comprende administrar al sujeto cualquiera de los microorganismos aislados, biomasas o aceites microbianos como se describe en la presente memoria o mezclas de los mismos, y un vehículo farmacéuticamente aceptable.
Breve descripción de los dibujos
La figura 1 es un diagrama esquemático de una realización ejemplar de un proceso de separación de biomasa y un proceso de enriquecimiento de aceite microbiano de acuerdo con la presente divulgación.
Descripción detallada de la invención
Microorganismos
En la presente memoria se divulgan microorganismos aislados y cepas derivadas de los mismos. Una cepa que "deriva" de un microorganismo aislado de la invención puede ser un derivado natural o artificial tal como, por ejemplo, una cepa mutante, variante o recombinante. El término "aislado", como se usa en la presente memoria, no refleja necesariamente el grado al que se ha purificado un aislado, sino que indica el aislamiento o separación de una forma natural o entorno natural. Un aislado puede incluir, aunque sin limitación, un microorganismo aislado, una biomasa aislada, un cultivo aislado, un aceite microbiano aislado y una secuencia aislada (tal como una secuencia polinucleotídica aislada divulgada en la presente memoria). El término "microorganismo", como se usa en la presente memoria, incluye, aunque sin limitación, los términos "microalga", "traustoquitridio" y clasificaciones taxonómicas asociadas con cualquiera de los microorganismos depositados descritos en la presente memoria. Los términos "Thraustochytriales", "traustoquitridio", "Schizochytrium" y "Thraustochytrium", como se usan en referencia a cualquiera de los microorganismos de la invención, incluyendo los microorganismos depositados descritos en la presente memoria, se basan en las presentes clasificaciones taxonómicas que incluyen información filogenética disponible y no se pretende que sean limitantes en caso de que las clasificaciones taxonómicas se revisen después de la fecha de presentación de la presente solicitud.
Se divulga además un microorganismo aislado de la especie depositada según el acceso de ATCC n.° PTA-10212. El microorganismo aislado asociado con el acceso de ATCC n.° PTA-10212 también se conoce en la presente memoria como Thraustochytrium sp. ATCC PTA-10212. El microorganismo aislado asociado con el acceso de ATCC n.° PTA-10212 se depositó según el Tratado de Budapest el 14 de julio de 2009 en la American Type Culture Collection, Patent Depository, 10801 University Boulevard, Manassas, VA 20110-2209. Se divulga además una cepa aislada depositada según el acceso de ATCC n.° PTA-10212.
Se divulga además un microorganismo aislado que tiene las características de la especie depositada según el acceso de ATCC n.° PTA-10212 o una cepa derivada de la misma. Las características de la especie depositada según el acceso de ATCC n.° PTA-10212 pueden incluir sus propiedades de crecimiento y fenotípicas (ejemplos de propiedades fenotípicas incluyen propiedades morfológicas y reproductoras), sus propiedades físicas y químicas (tales como pesos secos y perfiles de lípidos), sus secuencias génicas y combinaciones de los mismos, en que las características distinguen la especie sobre especies identificadas previamente. Se divulga además un microorganismo aislado que tiene las características de la especie depositada según el acceso de ATCC n.° PTA-10212, en el que las características incluyen un ARNr 18s que comprende la secuencia polinucleotídica de SEQ ID NO:1 o una secuencia polinucleotídica que tiene al menos un 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % o 99 % de identidad con SEQ ID NO:1, las propiedades morfológicas y reproductoras de la especie depositada según el acceso de ATCC n.° PTA-10212 y los perfiles de ácidos grasos de la especie depositada según el acceso de ATCC n.° PTA-10212. En algunas realizaciones, los microorganismos aislados divulgados en la presente memoria tienen propiedades fenotípicas sustancialmente idénticas a las del microorganismo depositado según el acceso de ATCC n.° PTA-10212. En algunas realizaciones, los microorganismos aislados divulgados en la presente memoria tienen propiedades de crecimiento sustancialmente idénticas a las del microorganismo depositado según el acceso de ATCC n.° PTA-10212. Se divulga además un microorganismo aislado que comprende un ARNr 18s que comprende la secuencia polinucleotídica de SEQ ID NO:1 o una secuencia polinucleotídica que tiene al menos un 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % o 99 % de identidad con SEQ ID NO:1. Se divulga además un microorganismo aislado que comprende una secuencia polinucleotídica de ARNr 18s que tiene al menos un 94 % de identidad con la secuencia polinucleotídica de ARNr 18s del microorganismo depositado según el acceso de ATCC n.° PTA-10212.
Se divulga además una cepa muíante del microorganismo depositado según el acceso de ATCC n.° PTA-10212. En otras realizaciones, la cepa muíante es una cepa depositada según el acceso de ATCC n.° PTA-10213, PTA-10214 o PTA-10215. Los microorganismos asociados con los accesos de ATCC n.° PTA-10213, PTA-10214 y PTA-10215 se depositaron según el Tratado de Budapest el 14 de julio de 2009 en la American Type Culture Collection, Patent Depository, 10801 University Boulevard, Manassas, v A 20110-2209.
Se divulga además un microorganismo aislado de la especie depositada según el acceso de ATCC n.° PTA-10208. El microorganismo aislado asociado con el acceso de ATCC n.° PTA-10208 también se conoce en la presente memoria como Schizochytrium sp. ATCC PTA-10208. El microorganismo asociado con el acceso de ATCC n.° PTA-10208 se depositó según el Tratado de Budapest el 14 de julio de 2009 en la American Type Culture Collection, Patent Depository, 10801 University Boulevard, Manassas, VA 20110-2209. Se divulga además una cepa aislada depositada según el acceso de ATCC n.° PTA-10208.
Se divulga además un microorganismo aislado de la especie depositada según el acceso de ATCC n.° PTA-10208, en el que los ácidos grasos totales producidos por el microorganismo comprenden más de aproximadamente un 10 %, más de aproximadamente un 11 %, más de aproximadamente un 12 %, más de aproximadamente un 13 %, más de aproximadamente un 14 %, más de aproximadamente un 15 %, más de aproximadamente un 16 %, más de aproximadamente un 17 %, más de aproximadamente un 18 %, más de aproximadamente un 19 % o más de aproximadamente un 20 % en peso de EPA. Se divulga además un microorganismo aislado de la especie depositada según el acceso de ATCC n.° PTA-10208, en el que los ácidos grasos totales producidos por el microorganismo comprenden de aproximadamente un 10 % a aproximadamente un 55 %, de aproximadamente un 10 % a aproximadamente un 50 %, de aproximadamente un 10 % a aproximadamente un 45 %, de aproximadamente un 10 % a aproximadamente un 40 %, de aproximadamente un 10 % a aproximadamente un 35 %, de aproximadamente un 10 % a aproximadamente un 30 %, de aproximadamente un 15 % a aproximadamente un 55 %, de aproximadamente un 15 % a aproximadamente un 50 %, de aproximadamente un 15 % a aproximadamente un 45 %, de aproximadamente un 15 % a aproximadamente un 40 %, de aproximadamente un 15 % a aproximadamente un 35 %, de aproximadamente un 15 % a aproximadamente un 30 %, de aproximadamente un 20 % a aproximadamente un 55 %, de aproximadamente un 20 % a aproximadamente un 50 %, de aproximadamente un 20 % a aproximadamente un 45 %, de aproximadamente un 20 % a aproximadamente un 40 %, de aproximadamente un 20 % a aproximadamente un 35 % o de aproximadamente un 20 % a aproximadamente un 30 % en peso de EPA.
Se divulga además un microorganismo aislado que tiene las características de la especie depositada según el acceso de ATCC n.° PTA-10208, en el que los ácidos grasos totales producidos por el microorganismo comprenden más de aproximadamente un 10 % en peso de ácido eicosapentaenoico. Las características del microorganismo depositado según el acceso de ATCC n.° PTA-10208 incluyen sus propiedades de crecimiento y fenotípicas (ejemplos de propiedades fenotípicas incluyen propiedades morfológicas y reproductoras), sus propiedades físicas y químicas (tales como pesos secos y perfiles de lípidos), sus secuencias génicas y combinaciones de los mismos, en que las características distinguen la especie sobre especies identificadas previamente. Se divulga además un microorganismo aislado que tiene las características de la especie depositada según el acceso de ATCC n.° PTA-10212, en el que las características incluyen un ARNr 18s que comprende la secuencia polinucleotídica de SEQ ID NO:2, las propiedades morfológicas y reproductoras de la especie depositada según el acceso de ATCC n.° PTA-10208 y los perfiles de ácidos grasos de la especie depositada según el acceso de ATCC n.° PTA-10208. En algunas realizaciones, los microorganismos aislados como se divulga en la presente memoria tienen propiedades físicas y químicas sustancialmente idénticas a las del microorganismo depositado según el acceso de ATCC n.° PTA-10208.
Se divulga además una cepa mutante del microorganismo depositado según el acceso de ATCC n.° PTA-10208. En otras realizaciones, la cepa mutante es una cepa depositada según el acceso de ATCC n.° PTA-10209, PTA-10210 o PTA-10211. Los microorganismos asociados con los accesos de ATCC n.° PTA-10209, PTA-10210 y PTA-10211 se depositaron según el Tratado de Budapest el 25 de septiembre de 2009 en la American Type Culture Collection, Patent Depository, 10801 University Boulevard, Manassas, Va 20110-2209.
Se divulga además un microorganismo aislado divulgado en la presente memoria, que produce una fracción de triacilglicerol, en el que el contenido de EPA de la fracción de triacilglicerol es de al menos aproximadamente un 12 %, al menos aproximadamente un 13 %, al menos aproximadamente un 14 %, al menos aproximadamente un 15 %, al menos aproximadamente un 16 %, al menos aproximadamente un 17 %, al menos aproximadamente un 18 %, al menos aproximadamente un 19 % o al menos aproximadamente un 20 % en peso. Se divulga además un microorganismo aislado que produce una fracción de triacilglicerol, en el que el contenido de EPA de la fracción de triacilglicerol es de aproximadamente un 12 % a aproximadamente un 55 %, de aproximadamente un 12 % a aproximadamente un 50 %, de aproximadamente un 12 % a aproximadamente un 45 %, de aproximadamente un 12 % a aproximadamente un 40 %, de aproximadamente un 12 % a aproximadamente un 35 %, de aproximadamente un 12 % a aproximadamente un 30 %, de aproximadamente un 15 % a aproximadamente un 45 %, de aproximadamente un 15 % a aproximadamente un 40 %, de aproximadamente un 15 % a aproximadamente un 35 %, de aproximadamente un 15 % a aproximadamente un 30 % o de aproximadamente un 20 % a aproximadamente un 30 % en peso.
Se divulga además un mutante, variante o recombinante de un microorganismo aislado divulgado en la presente memoria, que produce una fracción de triacilglicerol, en el que el contenido de EPA de la fracción de triacilglicerol es de al menos aproximadamente un 10 %, al menos aproximadamente un 11 %, al menos aproximadamente un 12 %, al menos aproximadamente un 13 %, al menos aproximadamente un 14 %, al menos aproximadamente un 15 %, al menos aproximadamente un 16 %, al menos aproximadamente un 17 %, al menos aproximadamente un 18 %, al menos aproximadamente un 19 % o al menos aproximadamente un 20 % en peso. Se divulga además un mutante, variante o recombinante de un microorganismo aislado divulgado en la presente memoria, que produce una fracción de triacilglicerol, en el que el contenido de EPA de la fracción de triacilglicerol es de aproximadamente un 12 % a aproximadamente un 55 %, de aproximadamente un 12 % a aproximadamente un 50 %, de aproximadamente un 12 % a aproximadamente un 45 %, de aproximadamente un 12 % a aproximadamente un 40 %, de aproximadamente un 12 % a aproximadamente un 35 %, de aproximadamente un 12 % a aproximadamente un 30 %, de aproximadamente un 15 % a aproximadamente un 55 %, de aproximadamente un 15 % a aproximadamente un 50 %, de aproximadamente un 15 % a aproximadamente un 45 %, de aproximadamente un 15 % a aproximadamente un 40 %, de aproximadamente un 15 % a aproximadamente un 35 %, de aproximadamente un 15 % a aproximadamente un 30 %, de aproximadamente un 20 % a aproximadamente un 55 %, de aproximadamente un 20 % a aproximadamente un 50 %, de aproximadamente un 20 % a aproximadamente un 45 %, de aproximadamente un 20 % a aproximadamente un 40 %, de aproximadamente un 20 % a aproximadamente un 35 % o de aproximadamente un 20 % a aproximadamente un 30 % en peso. Las cepas mutantes pueden producirse por procedimientos bien conocidos. Los procedimientos habituales incluyen irradiación, tratamiento a altas temperaturas y tratamiento con un mutágeno. Las cepas variantes pueden ser otros aislados de origen natural y/o subaislados de la especie descrita en la presente memoria. Las cepas recombinantes pueden producirse por cualquier método bien conocido en biología molecular para la expresión de genes exógenos o alteración de la función o expresión de genes endógenos. En algunas realizaciones, la cepa mutante, variante o recombinante produce una cantidad mayor de ácidos grasos omega-3, particularmente EPA, que la cepa de tipo silvestre. En algunas realizaciones, la cepa mutante, variante o recombinante produce una cantidad menor de uno o más ácidos grasos, tal como cantidades menores de DHA, ARA, DPA n-6 o combinaciones de los mismos. En algunas realizaciones, la cepa mutante, variante o recombinante produce un peso celular seco mayor por litro de cultivo que la cepa de tipo silvestre. Dichas cepas mutantes, variantes o recombinantes son ejemplos de cepas derivadas de un microorganismo aislado como se divulga en la presente memoria.
En algunas realizaciones, un microorganismo aislado como se divulga en la presente memoria, incluyendo mutantes, variantes y recombinantes del mismo, comprende un perfil de ácidos grasos en una o más fracciones aisladas del microorganismo. La una o más fracciones aisladas del microorganismo incluyen la fracción de ácidos grasos totales, la fracción de ésteres de esterol, la fracción de triacilglicerol, la fracción de ácidos grasos libres, la fracción de esterol, la fracción de diacilglicerol, la fracción polar (incluyendo la fracción de fosfolípidos) y combinaciones de las mismas. El perfil de ácidos grasos para una fracción específica puede incluir cualquiera de los perfiles de ácidos grasos asociados con la fracción específica como se divulga en la presente memoria.
Se divulga además un método de producción de un mutante, que comprende mutagenizar cualquiera de los microorganismos como se divulga en la presente memoria y aislar la cepa mutante.
Cultivos y biomasas aisladas
Se divulga además un cultivo que comprende uno o más microorganismos aislados de la invención. Diversos parámetros de fermentación para la inoculación, crecimiento y recuperación de microflora, tales como microalgas y traustoquitridios, son conocidos en la técnica. Véase, por ejemplo, la patente de Estados Unidos n.° 5130242. Los medios líquidos o sólidos pueden contener agua de mar natural o artificial. Las fuentes de carbono para crecimiento heterotrófico incluyen, aunque sin limitación, glucosa, fructosa, xilosa, sacarosa, maltosa, almidón soluble, melazas, fucosa, glucosamina, dextrano, grasas, aceites, glicerol, acetato de sodio y manitol. Las fuentes de nitrógeno incluyen, aunque sin limitación, peptona, extracto de levadura, polipeptona, extracto de malta, extracto de carne, casaminoácidos, licor de maceración de maíz, fuentes de nitrógeno orgánico, glutamato de sodio, urea, fuentes de nitrógeno inorgánico, acetato de amonio, sulfato de amonio, cloruro de amonio y nitrato de amonio.
Un medio típico para el crecimiento del microorganismo depositado según el acceso de ATCC n.° PTA-10212 se muestra en la tabla 1:
Tabla 1: Medio de recipiente para PTA-10212 Ingrediente concentración intervalos
Na2SO4 g/l 31,0 0-50, 15-45, o 25-35 NaCl g/l 0,625 0-25, 0,1-10, o 0,5-5 KCl g/l 1,0 0-5, 0,25-3, o 0,5-2 MgSO4-7H2O g/l 5,0 0-10, 2-8, o 3-6 (NH4)2SO4 g/l 0,44 0-10, 0,25-5, o 0,05-3 MSG-1H2O g/l 6,0 0-10, 4-8, o 5-7
CaCl2 g/l 0,29 0,1-5, 0,15-3, o 0,2-1 T 154 (extracto de levadura) g/l 6,0 0-20, 0,1-10, o 1-7 KH2PO4 g/l 0,8 0,1-10, 0,5-5, o 0,6-1,8 Después de autoclave (metales)
Ácido cítrico mg/l 3,5 0,1-5000, 10-3000, o 3-2500 FeSO4-7H2O mg/l 10,30 0,1-100, 1-50, o 5-25 MnCl2-4H2O mg/l 3,10 0,1-100, 1-50, o 2-25 ZnSO4-7H2O mg/l 3,10 0,01-100, 1-50, o 2-25 COCl2-6H2O mg/l 0,04 0-1,0,001-0,1, o 0,01-0,1 Na2MoO4-2H2O mg/l 0,04 0,001-1,0,005-0,5, o 0,01-0,1 CuSO4-5H2O mg/l 2,07 0,1-100, 0,5-50, o 1-25 NiSO4-6H2O mg/l 2,07 0,1-100, 0,5-50, o 1-25 Después de autoclave (vitaminas)
Tiamina mg/l 9,75 0,1-100, 1-50, o 5-25 Vitamina B12 mg/l 0,16 0,01-100, 0,05-5, o 0,1-1 Ca1/2-pantotenato mg/l 2,06 0,1-100, 0,1-50, o 1-10 Biotina mg/l 3,21 0,1-100, 0,1-50, o 1-10 Después de autoclave (carbono)
Glicerol g/l 30,0 5-150, 10-100, o 20-50 Suministro de nitrógeno.
Ingrediente Concentración
MSG.1H2O g/l 17 0-150, 10-100, o 15-50
Las condiciones de cultivo típicas incluirían las siguientes:
pH aproximadamente 6,5 - aproximadamente 9,5, aproximadamente 6,5 -aproximadamente 8,0 o aproximadamente 6,8 - aproximadamente 7,8; temperatura: aproximadamente 15 - aproximadamente 30 °C, aproximadamente 18 -aproximadamente 28 °C o aproximadamente 21 a aproximadamente 23 °C; oxígeno aproximadamente un 0,1 - aproximadamente un 100 % de saturación,
disuelto: aproximadamente un 5 - aproximadamente un 50 % de saturación o
aproximadamente un 10 - aproximadamente un 30 % de saturación; y/o
glicerol aproximadamente 5 - aproximadamente 50 g/l, aproximadamente 10 -controlado a: aproximadamente 40 g/l o aproximadamente 15 - aproximadamente 35 g/l.
En algunas realizaciones, el microorganismo depositado según el acceso de ATCC n.° PTA-10212, o un mutante, variante o recombinante del mismo, crece de forma heterótrofa en glicerol como fuente de carbono, pero no crece en glucosa como fuente de carbono.
Un medio típico para el crecimiento del microorganismo depositado según el acceso de ATCC n.° PTA-10208 se muestra en la tabla 2:
Tabla 2: Medio de recipiente para PTA-10208
Ingrediente concentración intervalos
Na2SÜ4 g/l 8,8 0-25, 2-20, o 3-10
NaCl g/l 0,625 0-25, 0,1-10, o 0,5-5
KCl g/l 1,0 0-5, 0,25-3, o 0,5-2
MgSO4-7H2O g/l 5,0 0-10, 2-8, o 3-6
(NH4)2SO4 g/l 0,42 0-10, 0,25-5, o 0,05-3
CaCl2 g/l 0,29 0,1-5, 0,15-3, o 0,2-1
T 154 (extracto de levadura) g/l 1,0 0-20, 0,1-10, o 0,5-5
KH2PO4 g/l 1,765 0,1-10, 0,5-5, o 1-3
Después de autoclave (metales)
Ácido cítrico mg/l 46,82 0,1-5000, 10-3000, o 40-2500
FeSO4-7H2O mg/l 10,30 0,1-100, 1-50, o 5-25
MnCMH2O mg/l 3,10 0,1-100, 1-50, o 2-25
ZnSO4-7H2O mg/l 9,3 0,01-100, 1-50, o 2-25
COCl2-6H2O mg/l 0,04 0-1,0,001-0,1, o 0,01-0,1
Na2MoO4-2H2O mg/l 0,04 0,001-1,0,005-0,5, o 0,01-0,1
CuSO4-5H2O mg/l 2,07 0,1-100, 0,5-50, o 1-25
NiSO4-6H2O mg/l 2,07 0,1-100, 0,5-50, o 1-25
Después de autoclave (vitaminas)
Tiamina mg/l 9,75 0,1-100, 1-50, o 5-25
Ca1/2-pantotenato mg/l 3,33 0,1-100, 0,1-50, o 1-10
Biotina mg/l 3,58 0,1-100, 0,1-50, o 1-10
Después de autoclave (carbono)
Glucosa g/l 30,0 5-150, 10-100, o 20-50
Suministro de nitrógeno:
Ingrediente Concentración
NH4OH ml/l 23,6 0-150, 10-100, o 15-50
Las condiciones de cultivo típicas incluirían las siguientes:
pH aproximadamente 6,5 - aproximadamente 8,5, aproximadamente 6,5 -aproximadamente 8,0 o aproximadamente 7,0 - aproximadamente 8,0;
temperatura: aproximadamente 17 - aproximadamente 30 °C, aproximadamente 20 -aproximadamente 28 °C o aproximadamente 22 a aproximadamente 24 °C;
oxígeno aproximadamente un 2 - aproximadamente un 100 % de saturación,
disuelto: aproximadamente un 5 - aproximadamente un 50 % de saturación o
aproximadamente un 7 - aproximadamente un 20% de saturación; y/o
glucosa aproximadamente 5 - aproximadamente 50 g/l, aproximadamente 10 -controlada a 20: aproximadamente 40 g/l o aproximadamente 35 g/l.
En algunas realizaciones, el medio de cultivo comprende al menos aproximadamente un 0,1 %, al menos aproximadamente un 0,5 %, al menos aproximadamente un 1 %, al menos aproximadamente un 1,5 %, al menos aproximadamente un 2 %, al menos aproximadamente un 5 %, al menos aproximadamente un 7 %, al menos aproximadamente un 10 %, al menos aproximadamente un 20 %, al menos aproximadamente un 30 %, al menos aproximadamente un 40 %, al menos aproximadamente un 50 %, al menos aproximadamente un 60 %, al menos aproximadamente un 70 %, al menos aproximadamente un 80 % o al menos aproximadamente un 90 % de oxígeno disuelto, como un porcentaje del nivel de saturación. En algunas realizaciones, el medio de cultivo comprende de aproximadamente un 0,1 % a aproximadamente un 2 %, de aproximadamente un 0,1 % a aproximadamente un 5 %, de aproximadamente un 0,1 % a aproximadamente 10 %, de aproximadamente un 0,1 % a aproximadamente un 20 %, de aproximadamente un 0,1 % a aproximadamente un 30 %, de aproximadamente un 0,1 % a aproximadamente un 50 %, de aproximadamente un 0,1 % a aproximadamente un 100 %, de aproximadamente un 5 % a aproximadamente un 10 %, de aproximadamente un 5 % a aproximadamente un 20 %, de aproximadamente un 5 % a aproximadamente un 30 %, de aproximadamente un 5 % a aproximadamente un 50 %, de aproximadamente un 5 % a aproximadamente un 100 %, de aproximadamente un 7 % a aproximadamente un 10 %, de aproximadamente un 7 % a aproximadamente un 20 %, de aproximadamente un 7 % a aproximadamente un 30 %, de aproximadamente un 7 % a aproximadamente un 50 %, de aproximadamente un 7 % a aproximadamente un 100 %, de aproximadamente un 10 % a aproximadamente un 20 %, de aproximadamente un 10 % a aproximadamente un 30 %, de aproximadamente un 10 % a aproximadamente un 50 %, de aproximadamente un 10 % a aproximadamente un 100 %, de aproximadamente un 20 % a aproximadamente un 30 %, de aproximadamente un 20 % a aproximadamente un 50 % o de aproximadamente un 20 % a aproximadamente un 100 % de oxígeno disuelto, como un porcentaje del nivel de saturación.
Se divulga además una biomasa aislada de un microorganismo como se divulga en la presente memoria. Una biomasa aislada como se divulga en la presente memoria es una biomasa celular recolectada obtenida por cualquier método convencional para el aislamiento de una biomasa, tal como se describe en la patente de Estados Unidos n.° 5130242 y la publicación de solicitud de Estados Unidos n.° 2002/0001833.
En algunas realizaciones, el peso celular seco de la biomasa aislada de cada litro de cultivo es de al menos aproximadamente 10 g, al menos aproximadamente 15 g, al menos aproximadamente 20 g, al menos aproximadamente 25 g, al menos aproximadamente 30 g, al menos aproximadamente 50 g, al menos aproximadamente 60 g, al menos aproximadamente 70 g, al menos aproximadamente 80 g, al menos aproximadamente 100 g, al menos aproximadamente 120 g, al menos aproximadamente 140 g, al menos aproximadamente 160 g, al menos aproximadamente 180 g o al menos aproximadamente 200 g después de crecer durante aproximadamente 6 días a aproximadamente 8 días a aproximadamente 15 °C hasta aproximadamente 30 °C en un medio de cultivo de aproximadamente pH 6,5 a aproximadamente 9,5 que comprende fuentes de carbono, nitrógeno y nutrientes, y de aproximadamente 950 ppm a aproximadamente 8500 ppm de iones cloruro. En algunas realizaciones, el peso celular seco de la biomasa aislada de cada litro de cultivo es de al menos aproximadamente 10 g, al menos aproximadamente 15 g, al menos aproximadamente 20 g, al menos aproximadamente 25 g, al menos aproximadamente 30 g, al menos aproximadamente 50 g, al menos aproximadamente 60 g, al menos aproximadamente 70 g, al menos aproximadamente 80 g, al menos aproximadamente 100 g, al menos aproximadamente 120 g, al menos aproximadamente 140 g, al menos aproximadamente 160 g, al menos aproximadamente 180 g o al menos aproximadamente 200 g después de crecer durante aproximadamente 6 días, aproximadamente 7 días o aproximadamente 8 días a aproximadamente 15 °C, a aproximadamente 16 °C, a aproximadamente 17 °C, a aproximadamente 18 °C, a aproximadamente 19 °C, a aproximadamente 20 °C, a aproximadamente 21 °C, a aproximadamente 22 °C, a aproximadamente 23 °C, a aproximadamente 24 °C, a aproximadamente 25 °C, a aproximadamente 26 °C, a aproximadamente 27 °C, a aproximadamente 28 °C, a aproximadamente 29 °C o a aproximadamente 30 °C en un medio de cultivo de aproximadamente pH 6,5, aproximadamente pH 7, aproximadamente pH 7,5, aproximadamente pH 8,0, aproximadamente pH 8,5, aproximadamente pH 9 o aproximadamente pH 9,5 que comprende fuentes de carbono, nitrógeno y nutrientes, y de aproximadamente 950 ppm a aproximadamente 8500 ppm de iones cloruro. En algunas realizaciones, el peso celular seco de la biomasa aislada de cada litro de cultivo es de aproximadamente 10 g a aproximadamente 200 g después de crecer durante aproximadamente 6 días a aproximadamente 8 días a aproximadamente 15 °C hasta aproximadamente 30 °C en un medio de cultivo de aproximadamente pH 6,5 a aproximadamente pH 9,5 que comprende fuentes de carbono, nitrógeno y nutrientes, y de aproximadamente 950 ppm a aproximadamente 8500 ppm iones cloruro. En algunas realizaciones, el peso celular seco de la biomasa aislada de cada litro de cultivo es de aproximadamente 10 g a aproximadamente 200 g, de aproximadamente 10 g a aproximadamente 100 g, de aproximadamente 10 g a aproximadamente 50 g, de aproximadamente 15 g a aproximadamente 200 g, de aproximadamente 15 g a aproximadamente 100 g, de aproximadamente 15 g a aproximadamente 50 g, de aproximadamente 20 g a aproximadamente 200 g, de aproximadamente 20 g a aproximadamente 100 g, de aproximadamente 20 g a aproximadamente 50 g, de aproximadamente 50 g a aproximadamente 200 g o de aproximadamente 50 g a aproximadamente 100 g después de crecer durante aproximadamente 6 días, aproximadamente 7 días o aproximadamente 8 días a aproximadamente 15 °C, a aproximadamente 16 °C, a aproximadamente 17 °C, a aproximadamente 18 °C, a aproximadamente 19 °C, a aproximadamente 20 °C, a aproximadamente 21 °C, a aproximadamente 22 °C, a aproximadamente 23 °C, a aproximadamente 24 °C, a aproximadamente 25 °C, a aproximadamente 26 °C, a aproximadamente 27 °C, a aproximadamente 28 °C, a aproximadamente 29 °C o a aproximadamente 30 °C en un medio de cultivo de aproximadamente pH 6,5, aproximadamente pH 7, aproximadamente pH 7,5, aproximadamente pH 8,0, aproximadamente pH 8,5, aproximadamente pH 9 o aproximadamente pH 9,5 que comprende fuentes de carbono, nitrógeno y nutrientes, y de aproximadamente 950 ppm a aproximadamente 8500 ppm de iones cloruro. En algunas realizaciones, el cultivo aislado no contiene polivinilpirrolidona.
En algunas realizaciones, el cultivo aislado tiene una productividad de ácidos grasos omega-3 de al menos aproximadamente 0,2 g/l/día, al menos aproximadamente 0,3 g/l/día, al menos aproximadamente 0,4 g/l/día, al menos aproximadamente 0,5 g/l/día, al menos aproximadamente 1 g/l/día, al menos aproximadamente 1,2 g/l/día, al menos aproximadamente 1,5 g/l/día, al menos aproximadamente 1,7 g/l/día, al menos aproximadamente 2 g/l/día, al menos aproximadamente 3 g/l/día, al menos aproximadamente 3,5 g/l/día, al menos aproximadamente 4 g/l/día, al menos aproximadamente 4,5 g/l/día, al menos aproximadamente 5 g/l/día, al menos aproximadamente 6 g/l/día o al menos aproximadamente 8 g/l/día después de crecer durante aproximadamente 6 días, aproximadamente 7 días o aproximadamente 8 días a aproximadamente 15 °C hasta aproximadamente 30 °C en un medio de cultivo de aproximadamente pH 6,5 a aproximadamente pH 8,5 o de aproximadamente pH 6,5 a aproximadamente pH 9,5 que comprende fuentes de carbono, nitrógeno y nutrientes, y de aproximadamente 950 ppm a aproximadamente 8500 ppm de iones cloruro. En algunas realizaciones, el cultivo aislado tiene una productividad de ácidos grasos omega-3 de aproximadamente 0,2 g/l/día a aproximadamente 20 g/l/día, de aproximadamente 0,4 g/l/día a aproximadamente 20 g/l/día, de aproximadamente 0,4 g/l/día a aproximadamente 2 g/l/día, de aproximadamente 1 g/l/día a aproximadamente 2 g/l/día, de aproximadamente 1 g/l/día a aproximadamente 20 g/l/día, de aproximadamente 2 g/l/día a aproximadamente 15 g/l/día, de aproximadamente 2 g/l/día a aproximadamente 10 g/l/día, de aproximadamente 3 g/l/día a aproximadamente 10 g/l/día, de aproximadamente 4 g/l/día a aproximadamente 9 g/l/día, de aproximadamente 4 g/l/día a aproximadamente 8 g/l/día, de aproximadamente 4 g/l/día a aproximadamente 7 g/l/día o de aproximadamente 4 g/l/día a aproximadamente 6 g/l/día después de crecer durante aproximadamente 6 días, aproximadamente 7 días o aproximadamente 8 días a aproximadamente 15 °C hasta aproximadamente 30 °C en un medio de cultivo de aproximadamente pH 6,5 a aproximadamente pH 9,5 que comprende fuentes de carbono, nitrógeno y nutrientes, y de aproximadamente 950 ppm a aproximadamente 8500 ppm de iones cloruro.
En algunas realizaciones, el cultivo aislado comprende una productividad de EPA de al menos aproximadamente 0,2 g/l/día, al menos aproximadamente 0,3 g/l/día, al menos aproximadamente 0,4 g/l/día, al menos aproximadamente 0,5 g/l/día, al menos aproximadamente 0,6 g/l/día, al menos aproximadamente 0,7 g/l/día, al menos aproximadamente 0,8 g/l/día, al menos aproximadamente 0,9 g/l/día, al menos aproximadamente 1 g/l/día, al menos aproximadamente 1,2 g/l/día, al menos aproximadamente 1,5 g/l/día, al menos aproximadamente 1,7 g/l/día, al menos aproximadamente 2 g/l/día, al menos aproximadamente 3 g/l/día, al menos aproximadamente 4 g/l/día o al menos aproximadamente 5 g/l/día después de crecer durante aproximadamente 6 días, aproximadamente 7 días o aproximadamente 8 días a aproximadamente 15 °C hasta aproximadamente 30 °C en un medio de cultivo de aproximadamente pH 6,5 a aproximadamente pH 8,5 o de aproximadamente pH 6,5 a aproximadamente pH 9,5 que comprende fuentes de carbono, nitrógeno y nutrientes, y de aproximadamente 950 ppm a aproximadamente 8500 ppm de iones cloruro. En algunas realizaciones, la productividad de EPA es de aproximadamente 0,2 g/l/día a aproximadamente 5 g/l/día, de aproximadamente 0,2 g/l/día a aproximadamente 4 g/l/día, de aproximadamente 0,2 g/l/día a aproximadamente 3 g/l/día, de aproximadamente 0,2 g/l/día a aproximadamente 2 g/l/día, de aproximadamente 0,2 g/l/día a aproximadamente 1 g/l/día, de aproximadamente 0,2 g/l/día a aproximadamente 0,8 g/l/día, de aproximadamente 0,2 g/l/día a aproximadamente 0,7 g/l/día, de aproximadamente 1 g/l/día a aproximadamente 5 g/l/día, de aproximadamente 1 g/l/día a aproximadamente 4 g/l/día, de aproximadamente 1 g/l/día a aproximadamente 3 g/l/día o de aproximadamente 1 g/l/día a aproximadamente 2 g/l/día después de crecer durante aproximadamente 6 días, aproximadamente 7 días o aproximadamente 8 días a aproximadamente 15 °C hasta aproximadamente 30 °C en un medio de cultivo de aproximadamente pH 6,5 a aproximadamente pH 8,5 o de aproximadamente pH 6,5 a aproximadamente pH 9,5 que comprende fuentes de carbono, nitrógeno y nutrientes, y de aproximadamente 950 ppm a aproximadamente 8500 ppm de iones cloruro. En algunas realizaciones, cualquiera de las productividades de EPA mencionadas anteriormente están asociadas con cualquiera de las productividades de ácidos grasos omega-3 mencionadas anteriormente. En algunas realizaciones, el cultivo comprende además una productividad de DHA de aproximadamente 0 g/l/día a aproximadamente 5 g/l/día, de aproximadamente 0 g/l/día a aproximadamente 4 g/l/día, de aproximadamente 0 g/l/día a aproximadamente 3 g/l/día, de aproximadamente 0 g/l/día a aproximadamente 2 g/l/día, de aproximadamente 0 g/l/día a aproximadamente 1 g/l/día, de aproximadamente 0,2 g/l/día a aproximadamente 5 g/l/día, de aproximadamente 0,2 g/l/día a aproximadamente 4 g/l/día, de aproximadamente 0,2 g/l/día a aproximadamente 3 g/l/día, de aproximadamente 0,2 g/l/día a aproximadamente 2 g/l/día, de aproximadamente 0,2 g/l/día a aproximadamente 1 g/l/día, de aproximadamente 1 g/l/día a aproximadamente 5 g/l/día, de aproximadamente 2 g/l/día a aproximadamente 5 g/l/día, de aproximadamente 2 g/l/día a aproximadamente 4 g/l/día o de aproximadamente 2 g/l/día a aproximadamente 3 g/l/día. En algunas realizaciones, la productividad de DHA es de menos de aproximadamente 5 g/l/día, menos de aproximadamente 4 g/l/día, menos de aproximadamente 3 g/l/día, menos de aproximadamente 2 g/l/día, menos de aproximadamente 1 g/l/día, menos de aproximadamente 0,5 g/l/día, menos de aproximadamente 0,2 g/l/día o de aproximadamente 0 g/l/día.
En algunas realizaciones, el volumen de fermentación (volumen de cultivo) es de al menos aproximadamente 2 litros, al menos aproximadamente 10 litros, al menos aproximadamente 50 litros, al menos aproximadamente 100 litros, al menos aproximadamente 200 litros, al menos aproximadamente 500 litros, al menos aproximadamente 1000 litros, al menos aproximadamente 10000 litros, al menos aproximadamente 20000 litros, al menos aproximadamente 50000 litros, al menos aproximadamente 100000 litros, al menos aproximadamente 150000 litros, al menos aproximadamente 200000 litros o al menos aproximadamente 250000 litros. En algunas realizaciones, el volumen de fermentación es de aproximadamente 2 litros a aproximadamente 300000 litros, aproximadamente 2 litros, aproximadamente 10 litros, aproximadamente 50 litros, aproximadamente 100 litros, aproximadamente 200 litros, aproximadamente 500 litros, aproximadamente 1000 litros, aproximadamente 10000 litros, aproximadamente 20000 litros, aproximadamente 50000 litros, aproximadamente 100000 litros, aproximadamente 150000 litros, aproximadamente 200000 litros, aproximadamente 250000 litros o aproximadamente 300000 litros.
Se divulga además una biomasa aislada que comprende un perfil de ácidos grasos como se divulga en la presente memoria. En algunas realizaciones, al menos aproximadamente un 20 %, al menos aproximadamente un 25 %, al menos aproximadamente un 30 %, al menos aproximadamente un 35 %, al menos aproximadamente un 40 %, al menos aproximadamente un 45 %, al menos aproximadamente un 50 %, al menos aproximadamente un 55 %, al menos aproximadamente un 60 %, al menos aproximadamente un 65 %, al menos aproximadamente un 70 %, al menos aproximadamente un 75 % o al menos aproximadamente un 80 % del peso celular seco de la biomasa es ácidos grasos. En algunas realizaciones, más de aproximadamente un 20 %, más de aproximadamente un 25 %, más de aproximadamente un 30 %, más de aproximadamente un 35 %, más de aproximadamente un 40 %, más de aproximadamente un 45 %, más de aproximadamente un 50 %, más de aproximadamente un 55 % o más de aproximadamente un 60 % del peso celular seco de la biomasa es ácidos grasos. En algunas realizaciones, de aproximadamente un 20 % a aproximadamente un 55 %, de aproximadamente un 20 % a aproximadamente un 60 %, de aproximadamente un 20 % a aproximadamente un 70 %, de aproximadamente un 20 % a aproximadamente un 80 %, de aproximadamente un 30 % a aproximadamente un 55 %, de aproximadamente un 30 % a aproximadamente un 70 %, de aproximadamente un 30 % a aproximadamente un 80 %, de aproximadamente un 40 % a aproximadamente un 60 %, de aproximadamente un 40 % a aproximadamente un 70 %, de aproximadamente un 40 % a aproximadamente un 80 %, de aproximadamente un 50 % a aproximadamente un 60 %, de aproximadamente un 50 % a aproximadamente un 70 %, de aproximadamente un 50 % a aproximadamente un 80 %, de aproximadamente un 55 % a aproximadamente un 70 %, de aproximadamente un 55 % a aproximadamente un 80 %, de aproximadamente un 60 % a aproximadamente un 70 % o de aproximadamente un 60 % a aproximadamente un 80 % en peso del peso celular seco de la biomasa es ácidos grasos. En algunas realizaciones, la biomasa comprende más de aproximadamente un 10 %, al menos aproximadamente un 12 %, al menos aproximadamente un 15 %, al menos aproximadamente un 20 %, al menos aproximadamente un 25 %, al menos aproximadamente un 30 %, aproximadamente al menos aproximadamente un 35 %, al menos aproximadamente un 40 % o al menos aproximadamente un 45 % en peso de los ácidos grasos como EPA. En algunas realizaciones, la biomasa comprende de aproximadamente un 10 % a aproximadamente un 55 %, de aproximadamente un 12 % a aproximadamente un 55 %, de aproximadamente un 15 % a aproximadamente un 55 %, de aproximadamente un 20 % a aproximadamente un 55 %, de aproximadamente un 20 % a aproximadamente un 40 % o de aproximadamente un 20 % a aproximadamente un 30 % en peso de los ácidos grasos como EPA. En algunas realizaciones, la biomasa comprende una fracción de triacilglicerol, en la que al menos aproximadamente un 12 %, al menos aproximadamente un 13 %, al menos aproximadamente un 14 %, al menos aproximadamente un 15 %, al menos aproximadamente un 16 %, al menos aproximadamente un 17 %, al menos aproximadamente un 18 %, al menos aproximadamente un 19 % o al menos aproximadamente un 20 % en peso de la fracción de triacilglicerol es EPA. En algunas realizaciones, la biomasa comprende una fracción de triacilglicerol, en la que el contenido de EPA de la fracción de triacilglicerol es de al menos aproximadamente un 12 % a aproximadamente un 55 %, de aproximadamente un 12 % a aproximadamente un 50 %, de aproximadamente un 12 % a aproximadamente un 45 %, de al menos aproximadamente un 12 % a aproximadamente 40 %, de al menos aproximadamente un 12 % a aproximadamente 35 % o de al menos aproximadamente un 12 % a aproximadamente 30 %, de aproximadamente un 15 % a aproximadamente un 55 %, de aproximadamente un 15 % a aproximadamente un 50 %, de aproximadamente un 15 % a aproximadamente un 45 %, de aproximadamente un 15 % a aproximadamente un 40 %, de aproximadamente un 15 % a aproximadamente un 35 %, de aproximadamente un 15 % a aproximadamente un 30 %, de aproximadamente un 20 % a aproximadamente un 55 %, de aproximadamente un 20 % a aproximadamente un 50 %, de aproximadamente un 20 % a aproximadamente un 45 %, de al menos aproximadamente un 20 % a aproximadamente un 40 %, de al menos aproximadamente un 20 % a aproximadamente 35 % o de aproximadamente un 20 % a aproximadamente un 30 % en peso. En algunas realizaciones, al menos aproximadamente un 20 %, al menos aproximadamente un 25 %, al menos aproximadamente un 30 %, al menos aproximadamente un 35 %, al menos aproximadamente un 40 %, al menos aproximadamente un 50 % o al menos aproximadamente un 60 % en peso del peso celular seco de la biomasa es DHA. En algunas realizaciones, de aproximadamente un 20 % a aproximadamente un 60 %, de aproximadamente un 25 % a aproximadamente un 60 %, de aproximadamente un 25 % a aproximadamente un 50 %, de aproximadamente un 25 % a aproximadamente un 45 %, de aproximadamente un 30 % a aproximadamente un 50 % o de aproximadamente un 35 % a aproximadamente un 50 % en peso del peso celular seco de la biomasa es DHA. En algunas realizaciones, la biomasa comprende aproximadamente un 10 % o menos, aproximadamente un 9 % o menos, aproximadamente un 8 % o menos, aproximadamente un 7 % o menos, aproximadamente un 6 % o menos, aproximadamente un 5 % o menos, aproximadamente un 4 % o menos, aproximadamente un 3 % o menos, aproximadamente un 2 % o menos o aproximadamente un 1 % o menos en peso de los ácidos grasos como DHA. En algunas realizaciones, la biomasa comprende de aproximadamente un 1 % a aproximadamente un 10 %, de aproximadamente un 1 % a aproximadamente un 5 %, de aproximadamente un 2 % a aproximadamente un 5 %, de aproximadamente un 3 % a aproximadamente un 5 % o de aproximadamente un 3 % a aproximadamente un 10 % en peso de los ácidos grasos como DHA. En algunas realizaciones, la biomasa está sustancialmente libre de DHA. En algunas realizaciones, la biomasa comprende de aproximadamente un 0,1 % a menos de aproximadamente un 5 %, de aproximadamente un 0,1 % a aproximadamente un 4 %, de aproximadamente un 0,1 % a aproximadamente un 3 %, de aproximadamente un 0,1 % a aproximadamente un 2 %, de aproximadamente un 0,2 % a menos de aproximadamente un 5 %, de aproximadamente un 0,2 % a aproximadamente un 4 %, de aproximadamente un 0,2 % a aproximadamente un 3 %, de aproximadamente un 0,2 % a aproximadamente un 2 %, de aproximadamente un 0,3 % a aproximadamente un 2 %, de aproximadamente un 0,1 % a aproximadamente un 0,5 %, de aproximadamente un 0,2 % a aproximadamente un 0,5 %, de aproximadamente un 0,1 % a aproximadamente un 0,4 %, de aproximadamente un 0,2 % a aproximadamente un 0,4 %, de aproximadamente un 0,5 % a aproximadamente un 2 %, de aproximadamente un 1 % a aproximadamente un 2 %, de aproximadamente un 0,5 % a aproximadamente un 1,5 % o de aproximadamente un 1 % a aproximadamente un 1,5 % en peso de los ácidos grasos como ARA. En algunas realizaciones, la biomasa comprende menos de aproximadamente un 5 %, aproximadamente un 4 % o menos, aproximadamente un 3 % o menos, aproximadamente un 2 % o menos, aproximadamente un 1,5 % o menos, aproximadamente un 1 % o menos, aproximadamente un 0,5 % o menos, aproximadamente un 0,4 % o menos, aproximadamente un 0,3 % o menos, aproximadamente un 0,2 % o menos o aproximadamente un 0,1 % o menos en peso de los ácidos grasos como ARA. En algunas realizaciones, la biomasa está sustancialmente libre de ARA. En algunas realizaciones, la biomasa comprende de aproximadamente un 0,4 % a aproximadamente un 2 %, de aproximadamente un 0,4 % a aproximadamente un 3 %, de aproximadamente un 0,4 % a aproximadamente un 4 %, de aproximadamente un 0,4 % a aproximadamente un 5 %, de aproximadamente un 0,4 % a menos de aproximadamente un 5 %, de aproximadamente un 0,5 % a aproximadamente un 1 %, de aproximadamente un 0,5 % a aproximadamente un 2 %, de aproximadamente un 0,5 % a aproximadamente un 3 %, de aproximadamente un 0,5 % a aproximadamente un 4 %, de aproximadamente un 0,5 % a aproximadamente un 5 %, de aproximadamente un 0,5 % a menos de aproximadamente un 5 %, de aproximadamente un 1 % a aproximadamente un 2 %, de aproximadamente un 1 % a aproximadamente un 3 %, de aproximadamente un 1 % a aproximadamente un 4 %, de aproximadamente un 1 % a aproximadamente un 5 % o de aproximadamente un 1 % a menos de aproximadamente un 5 % en peso de los ácidos grasos como DPA n-6. En algunas realizaciones, la biomasa comprende aproximadamente un 5 % o menos, menos de aproximadamente un 5 %, aproximadamente un 4 % o menos, aproximadamente un 3 % o menos, aproximadamente un 2 % o menos, aproximadamente un 1 % o menos, aproximadamente un 0,75 % o menos, aproximadamente un 0,6 % o menos o aproximadamente un 0,5 % o menos en peso de los ácidos grasos como DPA n-6. En algunas realizaciones, la biomasa está sustancialmente libre de DPA n-6. En algunas realizaciones, la biomasa comprende ácidos grasos con aproximadamente un 5 % o menos, menos de aproximadamente un 5 %, aproximadamente un 4 % o menos, aproximadamente un 3 % o menos o aproximadamente un 2 % o menos en peso de ácido oleico (18:1 n-9), ácido linoleico (18:2 n-6), ácido linolénico (18:3 n-3), ácido eicosenoico (20:1 n-9), ácido erúcico (22:1 n-9) o combinaciones de los mismos.
Las características de una biomasa aislada como se divulga en la presente memoria están asociadas con propiedades endógenas o naturales de la biomasa aislada en lugar de en materiales introducidos de forma exógena. En algunas realizaciones, la biomasa aislada no contiene polivinilpirrolidona o no está aislada de un cultivo que contiene polivinilpirrolidona.
Se divulga además un método de producción de una biomasa. En algunas realizaciones, el método para producir una biomasa de la invención comprende hacer crecer cualquiera de los microorganismos aislados de la invención o mezclas de los mismos en un cultivo para producir una biomasa. Se divulga además una biomasa producida por el método.
Aceites microbianos
La invención se refiere a un aceite microbiano que comprende un perfil de ácidos grasos de la invención. Un aceite microbiano de la invención es un "aceite crudo" o un "aceite refinado" que comprende una fracción de triacilglicerol de al menos aproximadamente un 35 % en peso. Un "aceite crudo" es un aceite que se extrae de la biomasa del microorganismo sin procesamiento adicional. Un "aceite refinado" es un aceite que se obtiene tratando un aceite crudo con un procesamiento convencional de refinado, blanqueado y/o desodorizado. Véase, por ejemplo, la patente de Estados Unidos n.° 5130242. Un aceite microbiano también incluye un "aceite final" como se describe en la presente memoria, que es un aceite refinado que se ha diluido con un aceite vegetal. En algunas realizaciones, un aceite final es un aceite refinado que se ha diluido con aceite de girasol alto oleico. El término "microbiano", como se usa en la presente memoria, incluye, aunque sin limitación, los términos "microalga", "traustoquitridio" y clasificaciones taxonómicas asociadas con cualquiera de los microorganismos depositados descritos en la presente memoria. Los términos "Thraustochytriales", "traustoquitridio", "Schizochytrium" y "Thraustochytrium", como se usan en referencia a cualquiera de los aceites microbianos de los microorganismos depositados descritos en la presente memoria se basan en las presentes clasificaciones taxonómicas que incluyen información filogenética disponible y no se pretende que sean limitantes en caso de que las clasificaciones taxonómicas se revisen después de la fecha de presentación de la presente solicitud.
En algunas realizaciones, un ácido graso como se describe en la presente memoria puede ser un éster de ácido graso. En algunas realizaciones, un éster de ácido graso incluye un éster de un ácido graso omega-3, ácido graso omega-6 y combinaciones de los mismos. En algunas realizaciones, el éster de ácido graso es un éster de DHA, un éster de EPA o una combinación de los mismos. En algunas realizaciones, un aceite o fracción del mismo como se describe en la presente memoria se esterifica para producir un aceite o fracción del mismo que comprenda ésteres de ácido graso. El término "éster" se refiere al remplazo del hidrógeno en el grupo ácido carboxílico de la molécula de ácido graso con otro sustituyente. Los ésteres típicos son conocidos por los expertos en la materia, de los que se proporciona un análisis por Higuchi, T. y V. Stella en Pro-drugs as Novel Delivery Systems, Vol. 14, A.C.S. Symposium Series, Bioreversible Carriers in Drug Design, Ed. Edward B. Roche, American Pharmaceutical Association, Pergamon Press, 1987, y Protective Groups in Organic Chemistry, McOmie ed., Plenum Press, Nueva York, 1973. Ejemplos de ésteres incluyen metilo, etilo, propilo, butilo, pentilo, t-butilo, bencilo, nitrobencilo, metoxibencilo, benzhidrilo y tricloroetilo. En algunas realizaciones, el éster es un grupo éster protector de ácido carboxílico, ésteres con aralquilo (por ejemplo, bencilo, fenetilo), ésteres con alquenilo inferior (por ejemplo, alilo, 2-butenilo), ésteres con alcoxi inferior-alquilo inferior (por ejemplo, metoximetilo, 2-metoxietilo, 2-etoxietilo), ésteres con alcanoiloxi inferior-alquilo inferior (por ejemplo, acetoximetilo, pivaloiloximetilo, 1 -pivaloiloxietilo), ésteres con alcoxicarbonil inferior-alquilo inferior (por ejemplo, metoxicarbonilmetilo, isopropoxicarbonilmetilo), ésteres con carboxi-alquilo inferior (por ejemplo, carboximetilo), ésteres con alcoxicarboniloxi inferior-alquilo inferior (por ejemplo, 1-(etoxicarboniloxi)etilo, 1-(ciclohexiloxicarboniloxi)etilo), ésteres con carbamoiloxi-alquilo inferior (por ejemplo, carbamoiloximetilo) y similares. En algunas realizaciones, el sustituyente añadido es un grupo hidrocarbonado lineal o cíclico, por ejemplo, un alquilo C1-C6, cicloalquilo C1-C6, alquenilo C1-C6 o éster arílico C1-C6. En algunas realizaciones, el éster es un éster alquílico, por ejemplo, un éster metílico, éster etílico o éster propílico. En algunas realizaciones, el sustituyente éster se añade a la molécula de ácido graso libre cuando el ácido graso está en un estado purificado o semipurificado. Como alternativa, el éster de ácido graso se forma tras la conversión de un triacilglicerol en un éster.
La presente invención se refiere a métodos de producción de aceites microbianos. En algunas realizaciones, el método comprende hacer crecer cualquiera de los microorganismos aislados como se divulga en la presente memoria o mezclas de los mismos en un cultivo para producir un aceite microbiano que comprende ácidos grasos omega-3. En algunas realizaciones, el método comprende además extraer el aceite microbiano. En algunas realizaciones, el método comprende extraer un aceite microbiano que comprende ácidos grasos omega-3 de cualquiera de las biomasas como se divulga en la presente memoria o mezclas de las mismas. En algunas realizaciones, el método comprende hacer crecer de forma heterotrófica el microorganismo aislado, en el que el cultivo comprende una fuente de carbono como se describe en la presente memoria. El aceite microbiano puede extraerse de una biomasa recién recolectada o puede extraerse de una biomasa recolectada previamente que se ha almacenado en condiciones que evitan la descomposición. Pueden usarse métodos conocidos para cultivar un microorganismo como se divulga en la presente memoria, para aislar una biomasa del cultivo, para extraer un aceite microbiano de la biomasa y para analizar el perfil de ácidos grasos de los aceites extraídos de la biomasa. Véase, por ejemplo, la patente de Estados Unidos n.° 5 130242. La invención se refiere a un aceite microbiano producido por cualquiera de los métodos de la invención.
En algunas realizaciones, el aceite microbiano se extrae por un método de extracción enzimática. En algunas realizaciones, el aceite microbiano se extrae por un método de extracción mecánica. En algunas realizaciones, el método de extracción mecánica comprende uno o más de: (1) procesar un caldo de fermentación pasteurizado a través de un homogeneizado para ayudar en la lisis celular y liberar el aceite de las células; (2) añadir alcohol isopropílico al caldo de fermentación después de la homogeneización para descomponer la emulsión de aceite y agua; (3) centrifugar la mezcla para recuperar la fase oleosa; y (4) secar al vacío con la adición de antioxidantes. En algunas realizaciones, el aceite crudo se purifica. En algunas realizaciones, la purificación del aceite crudo comprende uno o más de: (1) bombear el aceite crudo en un depósito de refinado y calentar el aceite, seguido de adición de una solución ácida con mezcla; (2) añadir una solución cáustica al aceite después del tratamiento ácido; (3) volver al calentar el aceite crudo y después centrifugar para separar la fase pesada del aceite refinado; (4) retirar los compuestos polares restantes, los oligometales y los productos de oxidación del aceite refinado usando, por ejemplo, ácido, TriSyl®, arcilla y/o filtración; (5) filtrar en frío el aceite blanqueado para retirar adicionalmente los componentes de alto punto de fusión del aceite para conseguir el nivel deseado de claridad; (6) calentar el aceite, después de ello el aceite entonces se refrigera y se mantiene durante un periodo de tiempo provocando que cristalicen los triglicéridos de alto punto de fusión y las ceras; (7) añadir un filtro auxiliar al aceite enfriado y después retirar los sólidos cristalizados por filtración; (8) usar un desodorizante después de la filtración en frío, que se hace funcionar a alta temperatura y a vacío, para retirar, por ejemplo, los peróxidos y cualquier compuesto de bajo peso molecular restante que pueda provocar olor y sabor desagradable; (9) transferir el aceite al depósito de alimentación de desodorizante, desairear y desodorizar, por ejemplo, en un desodorizador de columna compactada; y (10) refrigerar, por ejemplo, bajo una capa de nitrógeno al final del ciclo de desodorización y añadir antioxidantes adecuados al aceite desodorizado para proporcionar estabilidad oxidativa.
En algunas realizaciones, el aceite microbiano comprende una fracción de ésteres de esterol de aproximadamente un 0 %, al menos aproximadamente un 0,1 %, al menos aproximadamente un 0,2 %, al menos aproximadamente un 0,5 %, al menos aproximadamente un 1 %, al menos aproximadamente un 1,5 %, al menos aproximadamente un 2 % o al menos aproximadamente un 5 % en peso. En algunas realizaciones, el aceite microbiano comprende una fracción de ésteres de esterol de aproximadamente un 0 % a aproximadamente un 1,5 %, de aproximadamente un 0 % a aproximadamente un 2 %, de aproximadamente un 0 % a aproximadamente un 5 %, de aproximadamente un 1 % a aproximadamente un 1,5 %, de aproximadamente un 0,2 % a aproximadamente un 1,5 %, de aproximadamente un 0,2 % a aproximadamente un 2 % o de aproximadamente un 0,2 % a aproximadamente un 5 % en peso. En algunas realizaciones, el aceite microbiano comprende una fracción de ésteres de esterol de aproximadamente un 5 % o menos, aproximadamente un 4 % o menos, aproximadamente un 3 % o menos, aproximadamente un 2 % o menos, aproximadamente un 1 % o menos, aproximadamente un 0,5 % o menos, aproximadamente un 0,3 % o menos, aproximadamente un 0,2 % o menos, aproximadamente un 0,5 % o menos, aproximadamente un 0,4 % o menos, aproximadamente un 0,3 % o menos o aproximadamente un 0,2 % o menos en peso.
En algunas realizaciones, el aceite microbiano comprende una fracción de triacilglicerol de al menos aproximadamente un 35 %, al menos aproximadamente un 40 %, al menos aproximadamente un 45 %, al menos aproximadamente un 50 %, al menos aproximadamente un 55 %, al menos aproximadamente un 60 %, al menos aproximadamente un 65 %, al menos aproximadamente un 70 %, al menos aproximadamente un 75 %, al menos aproximadamente un 80 %, al menos aproximadamente un 85 % o al menos aproximadamente un 90 % en peso. En algunas realizaciones, el aceite microbiano comprende una fracción de triacilglicerol de aproximadamente un 35 % a aproximadamente un 98 %, de aproximadamente un 35 % a aproximadamente un 90 %, de aproximadamente un 35 % a aproximadamente un 80 %, de aproximadamente un 35 % a aproximadamente un 70 %, de aproximadamente un 35 % a aproximadamente un 70 %, de aproximadamente un 35 % a aproximadamente un 65 %, de aproximadamente un 40 % a aproximadamente un 70 %, de aproximadamente un 40 % a aproximadamente un 65 %, de aproximadamente un 40 % a aproximadamente un 55 %, de aproximadamente un 40 % a aproximadamente un 50 %, de aproximadamente un 65 % a aproximadamente un 95 %, de aproximadamente un 75 % a aproximadamente un 95 %, de aproximadamente un 75 % a aproximadamente un 98 %, de aproximadamente un 80 % a aproximadamente un 95 %, de aproximadamente un 80 % a aproximadamente un 98 %, de aproximadamente un 90 % a aproximadamente un 96 %, de aproximadamente un 90 % a aproximadamente un 97 %, de aproximadamente un 90 % a aproximadamente un 98 %, aproximadamente un 90 %, aproximadamente un 95 %, aproximadamente un 97 % o aproximadamente un 98 % en peso.
En algunas realizaciones, el aceite microbiano comprende una fracción de diacilglicerol de al menos aproximadamente un 10 %, al menos aproximadamente un 11 %, al menos aproximadamente un 12 %, al menos aproximadamente un 13 %, al menos aproximadamente un 14 %, al menos aproximadamente un 15 %, al menos aproximadamente un 16 %, al menos aproximadamente un 17 %, al menos aproximadamente un 18 %, al menos aproximadamente un 19 % o al menos aproximadamente un 20 % en peso. En algunas realizaciones, el aceite microbiano comprende una fracción de diacilglicerol de aproximadamente un 10 % a aproximadamente un 45 %, de aproximadamente un 10 % a aproximadamente un 40 %, de aproximadamente un 10 % a aproximadamente un 35 %, de aproximadamente un 10 % a aproximadamente un 30 %, de aproximadamente un 15 % a aproximadamente un 40 %, de aproximadamente un 15 % a aproximadamente un 35 % o de aproximadamente un 15 % a aproximadamente un 30 % en peso. En algunas realizaciones, el aceite microbiano comprende una fracción de 1,2-diacilglicerol de al menos aproximadamente un 0,2 %, al menos aproximadamente un 0,3 %, al menos aproximadamente un 0,4 %, al menos aproximadamente un 0,5 %, al menos aproximadamente un 1 %, al menos aproximadamente un 5 %, al menos aproximadamente un 10 %, al menos aproximadamente un 11 %, al menos aproximadamente un 12 %, al menos aproximadamente un 13 %, al menos aproximadamente un 14 %, al menos aproximadamente un 15 %, al menos aproximadamente un 16 %, al menos aproximadamente un 17 %, al menos aproximadamente un 18 %, al menos aproximadamente un 19 % o al menos aproximadamente un 20 % en peso. En algunas realizaciones, el aceite microbiano comprende una fracción de diacilglicerol de aproximadamente un 0,2 % a aproximadamente un 45 %, de aproximadamente un 0,2 % a aproximadamente un 30 %, de aproximadamente un 0,2 % a aproximadamente un 20 %, de aproximadamente un 0,2 % a aproximadamente un 10 %, de aproximadamente un 0,2 % a aproximadamente un 5 %, de aproximadamente un 0,2 % a aproximadamente un 1 %, de aproximadamente un 0,2 % a aproximadamente un 0,8 %, de aproximadamente un 0,4 % a aproximadamente un 45 %, de aproximadamente un 0,4 % a aproximadamente un 30 %, de aproximadamente un 0,4 % a aproximadamente un 20 %, de aproximadamente un 0,4 % a aproximadamente un 10 %, de aproximadamente un 0,4 % a aproximadamente un 5 %, de aproximadamente un 0,4 % a aproximadamente un 1 %, de aproximadamente un 0,4 % a aproximadamente un 0,8 %, de aproximadamente un 0,5 % a aproximadamente un 1 %, de aproximadamente un 0,5 % a aproximadamente un 0,8 %, de aproximadamente un 10 % a aproximadamente un 45 %, de aproximadamente un 10 % a aproximadamente un 40 %, de aproximadamente un 10 % a aproximadamente un 35 %, de aproximadamente un 10 % a aproximadamente un 30 %, de aproximadamente un 15 % a aproximadamente un 40 %, de aproximadamente un 15 % a aproximadamente un 35 %, de aproximadamente un 15 % a aproximadamente un 30 % o de aproximadamente un 15 % a aproximadamente un 25 % en peso. En algunas realizaciones, el aceite microbiano comprende una fracción de 1,3-diacilglicerol de al menos aproximadamente un 0,1 %, al menos aproximadamente un 0,2 %, al menos aproximadamente un 0,5 %, al menos aproximadamente un 1 %, al menos aproximadamente un 2 %, al menos aproximadamente un 2,5 % o al menos aproximadamente un 3 % en peso. En algunas realizaciones, el aceite microbiano comprende una fracción de esterol de aproximadamente un 0,3 %, al menos aproximadamente un 0,4 %, al menos aproximadamente un 0,5 %, al menos aproximadamente un 1 %, al menos aproximadamente un 1,5 %, al menos aproximadamente un 2 % o al menos aproximadamente un 5 % en peso.
En algunas realizaciones, el aceite microbiano comprende una fracción de esterol de aproximadamente un 0,3 % a aproximadamente un 5 %, de aproximadamente un 0,3 % a aproximadamente 2 %, de aproximadamente un 0,3 % a aproximadamente un 1,5 %, de aproximadamente un 0,5 % a aproximadamente un 1,5 %, de aproximadamente un
1 % a aproximadamente un 1,5 %, de aproximadamente un 0,5 % a aproximadamente un 2 %, de aproximadamente un 0,5 % a aproximadamente un 5 %, de aproximadamente un 1 % a aproximadamente un 2 % o de aproximadamente un 1 % a aproximadamente un 5 % en peso. En algunas realizaciones, el aceite microbiano comprende una fracción de esterol de aproximadamente un 5 % o menos, aproximadamente un 4 % o menos, aproximadamente un 3 % o menos, aproximadamente un 2 % o menos, aproximadamente un 1,5 % o menos o aproximadamente un 1 % o menos en peso.
En algunas realizaciones, el aceite microbiano comprende una fracción de fosfolípido de al menos aproximadamente un 2 %, al menos aproximadamente un 5 % o al menos aproximadamente un 8 % en peso. En algunas realizaciones, el aceite microbiano comprende una fracción de fosfolípido de aproximadamente un 2 % a aproximadamente un 25 %, de aproximadamente un 2 % a aproximadamente un 20 %, de aproximadamente un 2 % a aproximadamente un 15 %, de aproximadamente un 2 % a aproximadamente un 10 %, de aproximadamente un 5 % a aproximadamente un 25 %, de aproximadamente un 5 % a aproximadamente un 20 %, de aproximadamente un 5 % a aproximadamente un 20 %, de aproximadamente un 5 % a aproximadamente un 10 % o de aproximadamente un 7 % a aproximadamente un 9 % en peso. En algunas realizaciones, el aceite microbiano comprende una fracción de fosfolípido de menos de aproximadamente un 20 %, menos de aproximadamente un 15 %, menos de aproximadamente un 10 %, menos de aproximadamente un 9 % o menos de aproximadamente un 8 % en peso. En algunas realizaciones, el aceite microbiano está sustancialmente libre de fosfolípidos. En algunas realizaciones, el aceite microbiano comprende insaponificables de menos de aproximadamente un 2 %, menos de aproximadamente un 1,5 %, menos de aproximadamente un 1 %, o menos de aproximadamente un 0,5 % en peso del aceite. Las clases de lípidos presentes en el aceite microbiano, tal como una fracción de triacilglicerol, pueden separarse por cromatografía ultrarrápida y analizarse por cromatografía en capa fina (TLC), o separarse y analizarse por otros métodos conocidos en la técnica.
En algunas realizaciones, el aceite microbiano y/o una o más fracciones del mismo seleccionadas de la fracción de triacilglicerol, la fracción de ácidos grasos libres, la fracción de esterol, la fracción de diacilglicerol y combinaciones de las mismas, comprende al menos aproximadamente un 5 %, al menos aproximadamente un 10 %, más de aproximadamente un 10 %, al menos aproximadamente un 12 %, al menos aproximadamente un 13 % aproximadamente un 14 %, al
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menos aproximadamente un 15 %, al menos aproximadamente un 16 % aproximadamente un 17 %, al menos aproximadamente un 18 %, al menos aproximadamente un 19 % aproximadamente un 20 %, al menos aproximadamente un 25 %, al menos aproximadamente un 30 %, aproximadamente al menos aproximadamente un 35 %, al menos aproximadamente un 40 % o al menos aproximadamente un 45 % en peso de EPA. En algunas realizaciones, el aceite microbiano y/o una o más fracciones del mismo seleccionadas de la fracción de triacilglicerol, la fracción de ácidos grasos libres, la fracción de esterol, la fracción de diacilglicerol y combinaciones de las mismas, comprende de aproximadamente un 5 % a aproximadamente un 55 %, de aproximadamente un 5 % a aproximadamente un 50 %, de aproximadamente un 5 % a aproximadamente un 45 %, de aproximadamente un 5 % a aproximadamente un 40 %, de aproximadamente un 5 % a aproximadamente un 35 %, de aproximadamente un 5 % a aproximadamente un 30 %, de aproximadamente un 10 % a aproximadamente un 55 %, de aproximadamente un 10 % a aproximadamente un 50 %, de aproximadamente un 10 % a aproximadamente un 45 %, de aproximadamente un 10 % a aproximadamente un 40 %, de aproximadamente un
10 % a aproximadamente un 35 %, de aproximadamente un 10 % a aproximadamente un 30 %, de al menos aproximadamente un 12 % a aproximadamente un 55 %, de al menos aproximadamente un 12 % a aproximadamente
50 %, de al menos aproximadamente un 12 % a aproximadamente un 45 %, de al menos aproximadamente un 12 % a aproximadamente un 40 %, de al menos aproximadamente un 12 % a aproximadamente un 35 % o de al menos aproximadamente un 12 % a aproximadamente un 30 %, de aproximadamente un 15 % a aproximadamente un 55 %, de aproximadamente un 15 % a aproximadamente un 50 %, de aproximadamente un 15 % a aproximadamente un
45 %, de aproximadamente un 15 % a aproximadamente un 40 %, de aproximadamente un 15 % a aproximadamente un 35 %, de aproximadamente un 15 % a aproximadamente un 30 %, de aproximadamente un 15 % a aproximadamente un 25 %, de aproximadamente un 15 % a aproximadamente un 20 %, de aproximadamente un 20 % a aproximadamente un 55 %, de aproximadamente un 20 % a aproximadamente un 50 %, de aproximadamente un
20 % a aproximadamente un 45 %, de aproximadamente un 20 % a aproximadamente un 40 % o de aproximadamente un 20 % a aproximadamente 30 % en peso de EPA. En algunas realizaciones, el aceite microbiano y/o una o más fracciones del mismo seleccionadas de la fracción de triacilglicerol, la fracción de diacilglicerol, la fracción de esterol, la fracción de ésteres de esterol, la fracción de ácidos grasos libres, la fracción de fosfolípido y combinaciones de las mismas, comprende al menos aproximadamente un 5 %, al menos aproximadamente un 10 %, al menos aproximadamente un 15 %, al menos aproximadamente un 20 %, al menos aproximadamente un 25 %, al menos aproximadamente un 30 %, al menos aproximadamente un 35 %, al menos aproximadamente un 40 %, al menos aproximadamente un 50 % o al menos aproximadamente un 60 % en peso de DHA. En algunas realizaciones, el aceite microbiano y/o una o más fracciones del mismo seleccionadas de la fracción de triacilglicerol, la fracción de diacilglicerol, la fracción de esterol, la fracción de ésteres de esterol, la fracción de ácidos grasos libres, la fracción de fosfolípido y combinaciones de las mismas, comprende de aproximadamente un 5 % a aproximadamente un 60 %, de aproximadamente un 5 % a aproximadamente un 55 %, de aproximadamente un 5 % a aproximadamente un 50 %, de aproximadamente un 5 % a aproximadamente un 40 %, de aproximadamente un 10 % a aproximadamente un 60 %, de aproximadamente un 10 % a aproximadamente un 50 %, de aproximadamente un 10 % a aproximadamente un 40 %, de aproximadamente un 20 % a aproximadamente un 60 %, de aproximadamente un 25 % a aproximadamente un 60 %, de aproximadamente un 25 % a aproximadamente un 50 %, de aproximadamente un 25 % a aproximadamente un 45 %, de aproximadamente un 30 % a aproximadamente un 50 %, de aproximadamente un 35 % a aproximadamente un 50 % o de aproximadamente un 30 % a aproximadamente un 40 % en peso de DHA. En algunas realizaciones, el aceite microbiano y/o una o más fracciones del mismo seleccionadas de la fracción de triacilglicerol, la fracción de diacilglicerol, la fracción de esterol, la fracción de ésteres de esterol, la fracción de ácidos grasos libres, la fracción de fosfolípido y combinaciones de las mismas, comprende aproximadamente un 10 % o menos, aproximadamente un 9 % o menos, aproximadamente un 8 % o menos, aproximadamente un 7 % o menos, aproximadamente un 6 % o menos, aproximadamente un 5 % o menos, aproximadamente un 4 % o menos, aproximadamente un 3 % o menos, aproximadamente un 2 % o menos o aproximadamente un 1 % o menos en peso de DHA. En algunas realizaciones, el aceite microbiano y/o una o más fracciones del mismo seleccionadas de la fracción de triacilglicerol, la fracción de diacilglicerol, la fracción de esterol, la fracción de ésteres de esterol, la fracción de ácidos grasos libres, la fracción de fosfolípido y combinaciones de las mismas, comprende de aproximadamente un 1 % a aproximadamente un 10 %, de aproximadamente un 1 % a aproximadamente un 5 %, de aproximadamente un 2 % a aproximadamente un 5 %, de aproximadamente un 3 % a aproximadamente un 5 % o de aproximadamente un 3 % a aproximadamente un 10 % en peso de los ácidos grasos como DHA. En algunas realizaciones, el aceite microbiano y/o una o más fracciones del mismo seleccionadas de la fracción de triacilglicerol, la fracción de diacilglicerol, la fracción de esterol, la fracción de ésteres de esterol, la fracción de ácidos grasos libres, la fracción de fosfolípido y combinaciones de las mismas, está sustancialmente libre de DHA. En algunas realizaciones, el aceite microbiano y/o una o más fracciones del mismo seleccionadas de la fracción de triacilglicerol, la fracción de diacilglicerol, la fracción de esterol, la fracción de ésteres de esterol, la fracción de ácidos grasos libres, la fracción de fosfolípido y combinaciones de las mismas, comprende de aproximadamente un 0,1 % a aproximadamente un 5 %, de aproximadamente un 0,1 % a menos de aproximadamente un 5 %, de aproximadamente un 0,1 % a aproximadamente un 4 %, de aproximadamente un 0,1 % a aproximadamente un 3 %, de aproximadamente un 0,1 % a aproximadamente un 2 %, de aproximadamente un 0,2 % a aproximadamente un 5 %, de aproximadamente un 0,2 % a menos de aproximadamente un 5 %, de aproximadamente un 0,2 % a aproximadamente un 4 %, de aproximadamente un 0,2 % a aproximadamente un 3 %, de aproximadamente un 0,2 % a aproximadamente un 2 %, de aproximadamente un 0,3 % a aproximadamente un 2 %, de aproximadamente un 0,1 % a aproximadamente un 0,5 %, de aproximadamente un 0,2 % a aproximadamente un 0,5 %, de aproximadamente un 0,1 % a aproximadamente un 0,4 %, de aproximadamente un 0,2 % a aproximadamente un 0,4 %, de aproximadamente un 0,5 % a aproximadamente un 2 %, de aproximadamente un 1 % a aproximadamente un 2 %, de aproximadamente un 0,5 % a aproximadamente un 1,5 % o de aproximadamente un 1 % a aproximadamente un 1,5 % en peso de ARA. En algunas realizaciones, el aceite microbiano y/o una o más fracciones del mismo seleccionadas de la fracción de triacilglicerol, la fracción de diacilglicerol, la fracción de esterol, la fracción de ésteres de esterol, la fracción de ácidos grasos libres, la fracción de fosfolípido y combinaciones de las mismas, comprende aproximadamente un 5 % o menos, menos de aproximadamente un 5 %, aproximadamente un 4 % o menos, aproximadamente un 3 % o menos, aproximadamente un 2 % o menos, aproximadamente un 1,5 % o menos, aproximadamente un 1 % o menos, aproximadamente un 0,5 % o menos, aproximadamente un 0,4 % o menos, aproximadamente un 0,3 % o menos, aproximadamente un 0,2 % o menos o aproximadamente un 0,1 % o menos en peso de ARA. En algunas realizaciones, el aceite microbiano y/o una o más fracciones del mismo seleccionadas de la fracción de triacilglicerol, la fracción de diacilglicerol, la fracción de esterol, la fracción de ésteres de esterol, la fracción de ácidos grasos libres, la fracción de fosfolípido y combinaciones de las mismas, está sustancialmente libre de ARA. En algunas realizaciones, el aceite microbiano y/o una o más fracciones del mismo seleccionadas de la fracción de triacilglicerol, la fracción de diacilglicerol, la fracción de esterol, la fracción de ésteres de esterol, la fracción de ácidos grasos libres, la fracción de fosfolípido y combinaciones de las mismas, comprende de aproximadamente un 0,4 % a aproximadamente un 2 %, de aproximadamente un 0,4 % a aproximadamente un 3 %, de aproximadamente un 0,4 % a aproximadamente un 4 %, de aproximadamente un 0,4 % a aproximadamente un 5 %, de aproximadamente un 0,4 % a menos de aproximadamente un 5 %, de aproximadamente un 0,5 % a aproximadamente un 1 %, de aproximadamente un 0,5 % a aproximadamente un 2 %, de aproximadamente un 0,5 % a aproximadamente un 3 %, de aproximadamente un 0,5 % a aproximadamente un 4 %, de aproximadamente un 0,5 % a aproximadamente un 5 %, de aproximadamente un 0,5 % a menos de aproximadamente un 5 %, de aproximadamente un 1 % a aproximadamente un 2 %, de aproximadamente un 1 % a aproximadamente un 3 %, de aproximadamente un 1 % a aproximadamente un 4 %, de aproximadamente un 1 % a aproximadamente un 5 % o de aproximadamente un 1 % a menos de aproximadamente un 5 % en peso de DPA n-6. En algunas realizaciones, el aceite microbiano y/o una o más fracciones del mismo seleccionadas de la fracción de triacilglicerol, la fracción de diacilglicerol, la fracción de esterol, la fracción de ésteres de esterol, la fracción de ácidos grasos libres, la fracción de fosfolípido y combinaciones de las mismas, comprende aproximadamente un 5 %, menos de aproximadamente un 5 %, aproximadamente un 4 % o menos, aproximadamente un 3 % o menos, aproximadamente un 2 % o menos, aproximadamente un 1 % o menos, aproximadamente un 0,75 % o menos, aproximadamente un 0,6 % o menos o aproximadamente un 0,5 % o menos en peso de DPA n-6. En algunas realizaciones, el aceite microbiano y/o una o más fracciones del mismo seleccionadas de la fracción de triacilglicerol, la fracción de diacilglicerol, la fracción de esterol, la fracción de ésteres de esterol, la fracción de ácidos grasos libres, la fracción de fosfolípido y combinaciones de las mismas, está sustancialmente libre de DPA n-6. En algunas realizaciones, el aceite microbiano y/o una o más fracciones del mismo seleccionadas de la fracción de triacilglicerol, la fracción de diacilglicerol, la fracción de esterol, la fracción de ésteres de esterol, la fracción de ácidos grasos libres, la fracción de fosfolípido y combinaciones de las mismas, comprende ácidos grasos con aproximadamente un 5 % o menos, menos de aproximadamente un 5 %, aproximadamente un 4 % o menos, aproximadamente un 3 % o menos 0 aproximadamente un 2 % o menos en peso de ácido oleico (18:1 n-9), ácido linoleico (18:2 n-6), ácido linolénico (18:3 n-3), ácido eicosenoico (20:1 n-9), ácido erúcico (22:1 n-9), ácido estearidónico (18:4 n-3) o combinaciones de los mismos.
La molécula de triacilglicerol contiene 3 átomos de carbono centrales (C(sn-1)H2R1 -(sn-2)H2R2-C(sn-3)H2R3), que permiten la formación de diferentes isómeros de posición. En algunas realizaciones, el aceite microbiano comprende una fracción de triacilglicerol en que al menos aproximadamente un 2 %, al menos aproximadamente un 3 %, al menos aproximadamente un 5 %, al menos aproximadamente un 10 %, al menos aproximadamente un 15 %, al menos aproximadamente un 20 %, al menos aproximadamente un 30 %, al menos aproximadamente un 35 % o al menos aproximadamente un 40 % de los triacilgliceroles en la fracción de triacilglicerol contiene DHA en dos posiciones en el triacilglicerol (DHA disustituido) seleccionadas de dos cualesquiera de las posiciones sn-1, sn-2 y sn-3, basándose en el porcentaje de área relativa de los picos en una cromatografía de HPLC. En algunas realizaciones, el aceite microbiano comprende una fracción de triacilglicerol en que de aproximadamente un 2 % a aproximadamente un 55 %, de aproximadamente un 2 % a aproximadamente un 50 %, de aproximadamente un 2 % a aproximadamente un 45 %, de aproximadamente un 2 % a aproximadamente un 40 %, de aproximadamente un 2 % a aproximadamente un 35 %, de aproximadamente un 2 % a aproximadamente un 30 %, de aproximadamente un 2 % a aproximadamente un 25 %, de aproximadamente un 5 % a aproximadamente un 55 %, de aproximadamente un 5 % a aproximadamente un 50 %, de aproximadamente un 5 % a aproximadamente un 45 %, de aproximadamente un 5 % a aproximadamente un 40 %, de aproximadamente un 5 % a aproximadamente un 35 %, de aproximadamente un 5 % a aproximadamente un 30 %, de aproximadamente un 5 % a aproximadamente un 25 %, de aproximadamente un 10 % a aproximadamente un 55 %, de aproximadamente un 10 % a aproximadamente un 50 %, de aproximadamente un 10 % a aproximadamente un 45 %, de aproximadamente un 10 % a aproximadamente un 40 %, de aproximadamente un 10 % a aproximadamente un 35 %, de aproximadamente un 10 % a aproximadamente un 30 %, de aproximadamente un 10 % a aproximadamente un 25 %, de aproximadamente un 10 % a aproximadamente un 20 %, de aproximadamente un 20 % a aproximadamente un 40 %, de aproximadamente un 20 % a aproximadamente un 35 % o de aproximadamente un 20 % a aproximadamente un 25 % de los triacilgliceroles en la fracción de triacilglicerol contiene EPA en dos posiciones en el triacilglicerol seleccionadas de dos cualesquiera de las posiciones sn-1, sn-2 o sn-3, basándose en el porcentaje de área relativa de los picos en una cromatografía de HPLC. En algunas realizaciones, el aceite microbiano comprende una fracción de triacilglicerol en que al menos aproximadamente un 0,5 %, al menos aproximadamente un 1 %, al menos aproximadamente un 1,5 % o al menos aproximadamente un 2 % de los triacilgliceroles en la fracción de triacilglicerol contiene DHA en todas las posiciones sn-1, sn-2 y sn-3 (DHA trisustituido), basándose en el porcentaje de área relativa de los picos en una cromatografía de HPLC. En algunas realizaciones, el aceite microbiano comprende una fracción de triacilglicerol en que de aproximadamente un 0,5 % a aproximadamente un 5 %, de aproximadamente un 0,5 % a aproximadamente un 3 %, de aproximadamente un 0,5 % a aproximadamente un 2,5 %, de aproximadamente un 0,5 % a aproximadamente un 2 %, de aproximadamente un 1 % a aproximadamente un 5 %, de aproximadamente un 1 % a aproximadamente un 3 % o de aproximadamente un 1 % a aproximadamente un 2 % de los triacilgliceroles en la fracción de triacilglicerol contiene DHA en todas las posiciones sn-1, sn-2 y sn-3, basándose en el porcentaje de área relativa de los picos en una cromatografía de HPLC. En algunas realizaciones, el aceite microbiano comprende una fracción de triacilglicerol en que al menos aproximadamente un 10 %, al menos aproximadamente un 15 %, al menos aproximadamente un 20 %, al menos aproximadamente un 25 %, al menos aproximadamente un 30 %, al menos aproximadamente un 35 %, al menos aproximadamente un 40 %, al menos aproximadamente un 45 %, al menos aproximadamente un 50 %, al menos aproximadamente un 55 % o al menos aproximadamente un 60 % de los triacilgliceroles en la fracción de triacilglicerol contiene DHA en una posición en el triacilglicerol seleccionada de una cualquiera de las posiciones sn-1, sn-2 o sn-3, basándose en el porcentaje de área relativa de los picos en una cromatografía de HPLC. En algunas realizaciones, el aceite microbiano comprende una fracción de triacilglicerol en que de aproximadamente un 10 % a aproximadamente un 80 %, de aproximadamente un 10 % a aproximadamente un 70 %, de aproximadamente un 10 % a aproximadamente un 60 %, de aproximadamente un 15 % a aproximadamente un 80 %, de aproximadamente un 15 % a aproximadamente un 75 %, de aproximadamente un 15 % a aproximadamente un 70 %, de aproximadamente un 15 % a aproximadamente un 65 %, de aproximadamente un 15 % a aproximadamente un 60 %, de aproximadamente un 35 % a aproximadamente un 80 %, de aproximadamente un 35 % a aproximadamente un 75 %, de aproximadamente un 35 % a aproximadamente un 65 %, de aproximadamente un 35 % a aproximadamente un 60 %, de aproximadamente un 40 % a aproximadamente un 80 %, de aproximadamente un 40 % a aproximadamente un 75 %, de aproximadamente un 40 % a aproximadamente un 70 %, de aproximadamente un 40 % a aproximadamente un 65 %, de aproximadamente un 40 % a aproximadamente un 60 % o de aproximadamente un 40 % a aproximadamente un 55 % de los triacilgliceroles en la fracción de triacilglicerol contiene DHA en una posición en el triacilglicerol seleccionada de una cualquiera de las posiciones sn-1, sn-2 y sn-3, basándose en el porcentaje de área relativa de los picos en una cromatografía de HPLC.
Composiciones
Se divulgan además composiciones que comprenden un microorganismo como se divulga en la presente memoria, una biomasa aislada divulgada en la presente memoria, un aceite microbiano de la invención o combinaciones de los mismos.
Un microorganismo, biomasa como se divulga en la presente memoria o aceite microbiano de la invención puede modificarse además química o físicamente o procesarse basándose en los requisitos de la composición por cualquier técnica conocida.
Las células o biomasas del microorganismo pueden secarse antes de su uso en una composición por métodos que incluyen, aunque sin limitación, secado por congelación, secado al aire, secado por pulverización, secado en embudo, secado al vacío (liofilización) y un proceso similar. Como alternativa, una biomasa recolectada y lavada puede usarse directamente en una composición sin secado. Véanse, por ejemplo, las patentes de Estados Unidos n.° 5130242 y 6 812009, cada uno.
Los aceites microbianos de la invención pueden usarse como material de partida para producir más eficazmente un producto enriquecido en un ácido graso tal como EPA. Por ejemplo, los aceites microbianos de la invención pueden someterse a diversas técnicas de purificación conocidas en la técnica, tales como destilación o formación de aductos de urea, para producir un producto de mayor potencia con mayores concentraciones de EPA u otro ácido graso. Los aceites microbianos de la invención también pueden usarse en reacciones químicas para producir compuestos derivados de ácidos grasos en los aceites, tales como ésteres y sales de EPA u otro ácido graso.
Una composición de la invención puede incluir uno o más excipientes. Como se usa en la presente memoria, "excipiente" se refiere a un componente, o mezcla de componentes, que se usa en una composición de la presente invención para dar características deseables a la composición, incluyendo alimentos, así como composiciones farmacéuticas, cosméticas e industriales. Un excipiente de la presente invención puede describirse como un excipiente "farmacéuticamente aceptable" cuando se añade a una composición farmacéutica, lo que significa que el excipiente es un compuesto, material, composición, sal y/o forma farmacéutica que es, dentro del alcance de criterio médico razonable, adecuado para su contacto con tejidos de seres humanos y animales no humanos sin excesiva toxicidad, irritación, respuesta alérgica u otras complicaciones problemáticas durante el periodo deseado de contacto proporcional a una relación de beneficio/riesgo razonable. En algunas realizaciones, la expresión "farmacéuticamente aceptable" significa aprobado por una agencia reguladora del gobierno federal o estatal o enumerado en la Farmacopea Estadounidense u otra farmacopea internacional reconocida en general para su uso en animales, y más particularmente en seres humanos. Pueden usarse diversos excipientes. En algunas realizaciones, el excipiente puede ser, aunque sin limitación, un agente alcalino, un estabilizante, un antioxidante, un agente de adhesión, un agente de separación, un agente de recubrimiento, un componente de fase exterior, un componente de liberación controlada, un disolvente, un tensioactivo, un humectante, un agente tamponante, un relleno, un emoliente o combinaciones de los mismos. Los excipientes además de los analizados en la presente memoria pueden incluir excipientes enumerados en, aunque sin limitación, Remington: The Science and Practice of Pharmacy, 21.a ed. (2005). La inclusión de un excipiente en una clasificación particular en la presente memoria (por ejemplo, "disolvente") pretende ilustrar, en lugar de limitar, la función del excipiente. Un excipiente particular puede estar dentro de múltiples clasificaciones.
Las composiciones de la invención incluyen, aunque sin limitación, productos alimenticios, composiciones farmacéuticas, cosméticos y composiciones industriales.
En algunas realizaciones, la composición es un producto alimenticio. Un producto alimenticio es cualquier alimento para consumo por animales no humanos o seres humanos, e incluye tanto composiciones sólidas como líquidas. Un producto alimenticio puede ser un aditivo para alimentos para animales o para seres humanos. Los alimentos incluyen, aunque sin limitación, alimentos comunes; productos líquidos, incluyendo leches, bebidas, bebidas terapéuticas y bebidas nutritivas; alimentos funcionales; complementos; nutracéuticos; leches maternizadas de inicio, incluyendo leches maternizadas para lactantes prematuros; alimentos para mujeres embarazadas o lactantes; alimentos para adultos; alimentos geriátricos; y alimentos animales.
En algunas realizaciones, un microorganismo, biomasa, como se divulga en la presente memoria o aceite microbiano de la invención puede usarse directamente como o incluirse como un aditivo dentro de uno o más de: un aceite, margarina, untable, otro ingrediente graso, bebida, puré, alimento lácteo o a base de soja (tal como leche, yogur, queso y helado), un producto de panadería, un producto nutritivo, por ejemplo, como un complemento nutritivo (en forma de cápsula o comprimido), un complemento vitamínico, un complemento de la dieta, una bebida en polvo y un producto alimenticio en polvo acabado o semiacabado. En algunas realizaciones, el complemento nutritivo está en forma de una cápsula vegetariana que no se forma a partir de y no contiene ningún componente de una fuente animal.
Una lista parcial de composiciones alimenticias que pueden incluir un aceite microbiano de la invención incluye, aunque sin limitación, productos a base de soja (leches, helados, yogures, bebidas, cremas, untables, blanqueadores); sopas y mezclas de sipa; masas, mezclas para rebozar y productos de panadería incluyendo, por ejemplo, productos de panadería finos, cereales de desayuno, tortas, pasteles de queso, tartas, pastelitos, galletitas, barritas, panes, panecillos, galletas, magdalenas, pasteles, bollos, picatostes, galletas saladas, productos dulces, tortas de aperitivo, tartas, barritas de granola/aperitivo y pastas tostadas; caramelos; golosinas duras; chocolate y otros dulces de repostería; chicles; productos alimenticios líquidos, por ejemplo, leches, bebidas energéticas, leches maternizadas de inicio, bebidas carbonatadas, tés, comidas líquidas, zumos de frutas, bebidas a base de frutas, bebidas a base de hortalizas; jarabes multivitamínicos, sustitutos de comidas, alimentos medicinales y jarabes; mezclas de bebida en polvo; pasta; productos de pescado procesados; productos de carne procesados; productos de pollería procesados; salsas y purés; condimentos (kétchup, mayonesa, etc.); untables a base de aceite vegetal; productos lácteos; yogur; mantequillas; productos lácteos congelados; helados; postres congelados; yogures congelados; productos alimenticios semisólidos tales como alimentos para bebés; pudines y postres de gelatina; queso procesado y sin procesar; mezclas de panqueque; barritas alimenticias incluyendo barritas energéticas; mezclas de gofre; aderezos de ensalada; mezclas sustitutivas de huevo; nuez y untables a base de nuez; aperitivos salados tales como patatas fritas y otros tipos de virutas o crujientes, virutas de maíz, nachos, aperitivos extruidos, palomitas de maíz, crujientes de patata, y nueces; y aperitivos espaciales tales como salas, aperitivos de frutas secas, aperitivos de carne, cortezas de cerdo, barritas alimenticias saludables y totas de arroz/maíz.
En algunas realizaciones, un aceite microbiano de la invención puede usarse para complementar una leche maternizada de inicio. La leche maternizada de inicio puede complementarse con un aceite microbiano de la invención en solitario o en combinación con un aceite físicamente refinado derivado de un microorganismo productor de ácido araquidónico (ARA). Un microorganismo productor de ARA, por ejemplo, es Mortierella alpina o Mortierella sect. schmuckeri. Como alternativa, las leches maternizadas de inicio pueden complementarse con un aceite microbiano de la invención en combinación con un aceite rico en ARA, incluyendo ARASCO® (Martek Biosciences, Columbia, MD).
En algunas realizaciones, la composición es un pienso para animales. Un "animal" incluye organismos no humanos que pertenecen al reino Animalia, e incluye, sin limitación, animales acuáticos y animales terrestres. La expresión "pienso para animales" o "alimento para animales" se refiere a cualquier alimento destinado a animales no humanos, ya se para peces; peces comerciales; peces ornamentales; larvas de pescado; bivalvos; moluscos; crustáceos; marisco; camarones; larvas de camarón; artemias; rotíferos; quisquilla; filtradores; anfibios; reptiles; mamíferos; animales domésticos; animales de granja; animales de zoológico; animales de deportes; animales de cría; animales de carreras; animales de exhibición; animales de reliquia; animales raros o en peligro; animales de compañía; mascotas tales como perros, gatos, cobayas, conejos, ratas, ratones o caballos; primates tales como monos (por ejemplo, mono capuchino, macaco de la India, mono verde africano, mono patas, macaco cangrejero y cercopitecos), simios, orangutanes, babuinos, gibones y chimpancés; cánidos tales como perros y lobos; félidos tales como gatos, leones y tigres; équidos tales como caballos, burros y cebras; animales para alimentación tales como vacas, ganado bovino, cerdos y ovejas; ungulados tales como ciervos y jirafas; o roedores tales como ratones, ratas, hámsteres y cobayas; y similares. Un pienso para animales incluye, aunque sin limitación, un pienso de acuicultura, un pienso para animales domésticos incluyendo un pienso para mascotas, un pienso para animales de zoológico, un pienso para animales de trabajo, un pienso para ganado y combinaciones de los mismos.
En algunas realizaciones, la composición es un pienso o complemento de pienso para cualquier animal cuya carne o productos se consuman por seres humanos, tal como cualquier animal del que se obtenga carne, huevos o leches para consumo humano. Cuando se suministran a dichos animales, pueden incorporarse nutrientes tales como LC-PUFA en la carne, leche, huevos u otros productos de dichos animales para aumentar su contenido de estos nutrientes.
En algunas realizaciones, la composición se un material secado por pulverización que puede desmenuzarse para formar partículas de un tamaño apropiado para su consumo por zooplancton, artemias, rotíferos y filtradores. En algunas realizaciones, el zooplancton, las artemias o los rotíferos alimentados por la composición se suministran, a su vez, a larvas de pescado, peces, marisco, bivalvos o crustáceos.
En algunas realizaciones, la composición es una composición farmacéutica. Las composiciones farmacéuticas adecuadas incluyen, aunque sin limitación, una composición antiinflamatoria, un fármaco para el tratamiento de cardiopatía coronaria, un fármaco para el tratamiento de arteriesclerosis, un agente quimioterápico, un excipiente activo, un fármaco contra la osteoporosis, un antidepresivo, un anticonvulsivo, un fármaco contra Helicobacter pylor, un fármaco para el tratamiento de enfermedad neurodegenerativa, un fármaco para el tratamiento de hepatopatía degenerativa, un antibiótico, una composición que reduce el colesterol y una composición que reduce el triacilglicerol. En algunas realizaciones, la composición es un alimento médico. Un alimento médico incluye un alimento que está en una composición a consumir o administrar externamente bajo la supervisión de un médico y que está destinado al control alimenticio específico de una afección, para la que se establecen requisitos nutricionales distintivos, basados en principios científicos reconocidos, mediante evaluación médica.
En algunas realizaciones, el aceite microbiano puede formularse en una forma farmacéutica. Las formas farmacéuticas pueden incluir, aunque sin limitación, comprimidos, cápsulas, obleas, miniesferas, píldoras, polvos y gránulos, y formas farmacéuticas parenterales que incluyen, aunque sin limitación, soluciones, suspensiones, emulsiones y polvos secos que comprenden una cantidad eficaz del aceite microbiano. También se sabe en la técnica que dichas formulaciones también pueden contener diluyentes, rellenos, disgregantes, aglutinantes, lubricantes, tensioactivos, vehículos hidrófobos, vehículos solubles en agua, emulsionantes, tampones, humectantes, hidratantes, solubilizantes, conservantes y similares farmacéuticamente aceptables. Las formas de administración pueden incluir, aunque sin limitación, comprimidos, grageas, cápsulas, comprimidos oblongos y píldoras, que contienen el aceite microbiano y uno o más vehículos farmacéuticamente aceptables adecuados.
Para administración oral, el aceite microbiano puede combinarse con vehículos farmacéuticamente aceptables bien conocidos en la técnica. Dichos vehículos posibilitan que los aceites microbianos de la invención se formulen como comprimidos, píldoras, grageas, cápsulas, líquidos, geles, jarabes, suspensiones espesas, suspensiones y similares, para ingesta oral por parte de un sujeto a tratar. En algunas realizaciones, la forma farmacéutica es un comprimido, píldora o comprimido oblongo. Las preparaciones farmacéuticas para uso oral pueden obtenerse añadiendo un excipiente sólido, opcionalmente triturando la mezcla resultante y procesando la mezcla de gránulos, después añadiendo auxiliares adecuados, si se desea, para obtener comprimidos o núcleos de gragea. Los excipientes adecuados incluyen, aunque sin limitación, rellenos tales como glúcidos incluyendo, aunque sin limitación, lactosa, sacarosa, manitol y sorbitol; preparaciones de celulosa tales como, aunque sin limitación, almidón de maíz, almidón de trigo, almidón de arroz, almidón de patata, gelatina, goma de tragacanto, metil celulosa, hidroxipropilmetil celulosa, carboximetil celulosa sódica y polivinilpirrolidona (PVP). Si se desea, pueden añadirse agentes disgregantes tales como, aunque sin limitación, la polivinilpirrolidona reticulada, agar o ácido algínico o una sal del mismo tal como alginato de sodio. Las preparaciones farmacéuticas que pueden usarse por vía oral incluyen, aunque sin limitación, cápsulas de ajuste a presión hechas de gelatina, así como cápsulas blandas selladas hechas de gelatina y un plastificante, tal como glicerol o sorbitol. En algunas realizaciones, la forma farmacéutica es una forma farmacéutica vegetariana, en que la forma farmacéutica no se forma a partir de y no contiene ningún componente de una fuente animal. En algunas realizaciones, la forma farmacéutica vegetariana es una cápsula vegetariana.
En algunas realizaciones, la forma farmacéutica tiene un peso de llenado diana de 200 mg a 1500 mg, de 250 mg a 1250 mg, de 300 mg a 1100 mg o de 350 mg a 1000 mg. En algunas realizaciones, la forma farmacéutica tiene un peso de llenado diana de 350 mg, 500 mg, 750 mg, 800 mg, 900 mg o 1000 mg. El peso de llenado real de la forma farmacéutica puede desviarse del peso de llenado diana en más o menos un 5 %.
En algunas realizaciones, se proporciona un aceite que comprende de 120 mg a 220 mg de EPA por gramo de aceite y de 240 mg a 450 mg de DHA por gramo de aceite. En algunas realizaciones, se proporciona un aceite que comprende de 200 mg a 350 mg de EPA por gramo de aceite y de 500 mg a 700 mg de DHA por gramo de aceite. En algunas realizaciones, se proporciona un aceite que comprende de 250 mg a 300 mg de EPA por gramo de aceite y de 550 mg a 650 mg de DHA por gramo de aceite. En algunas realizaciones, se proporciona un aceite que comprende de 300 mg a 700 mg de EPA por gramo de aceite. En algunas realizaciones, se proporciona un aceite que comprende de 400 mg a 650 mg o de 500 mg a 600 mg de EPA por gramo de aceite. En algunas realizaciones, la forma farmacéutica oral es una cápsula vegetariana que comprende almidón de maíz modificado, carragenina, glicerina, sorbitol, agua purificada, beta-caroteno y polvo de caramelo. En algunas realizaciones, la cápsula puede formularse con un aceite compuesto de 100 mg, 200 mg, 300 mg, 400 mg, 500 mg, 600 mg, 700 mg, 800 mg o 950 mg de una combinación de DHA y EPA.
En algunas realizaciones, la composición es un cosmético. Los cosméticos incluyen, aunque sin limitación, emulsiones, cremas, lociones, máscaras, jabones, champús, limpiadores, cremas faciales, acondicionadores, maquillajes, productos de baño y líquidos de dispersión. Los agentes cosméticos pueden ser medicinales o no medicinales.
En algunas realizaciones, la composición es una composición industrial. En algunas realizaciones, la composición es un material de partida para una o más confecciones. Una confección incluye, aunque sin limitación, un polímero; un material fotosensible fotográfico; un detergente; un aceite industrial; o un detergente industrial. Por ejemplo, la patente de Estados Unidos n.° 7259006 describe el uso de una grasa o aceite que contiene DHA para la producción de ácido behénico y la producción de materiales sensibles fotográficos usando ácido behénico.
Métodos de uso de las composiciones
En algunas realizaciones, las composiciones pueden usarse en el tratamiento de una afección en seres humanos o animales no humanos. En algunas realizaciones, las composiciones pueden usarse para nutrición en seres humanos o animales no humanos.
Los términos "tratar" y "tratamiento" se refieren tanto a tratamiento terapéutico como a medidas profilácticas o preventivas, en las que el objeto es prevenir o ralentizar (reducir) una situación fisiológica indeseada, enfermedad o trastorno, o para obtener resultados clínicos beneficiosos o deseados. Para los propósitos de esta invención, los resultados clínicos beneficiosos o deseados incluyen, aunque sin limitación, alivio o eliminación de los síntomas o signos asociados con una afección, enfermedad o trastorno; disminución del grado de una afección, enfermedad o trastorno; estabilización de una afección, enfermedad o trastorno (es decir, cuando la afección, enfermedad o trastorno no está empeorando); retardo en la aparición o progresión de la afección, enfermedad o trastorno; mejora de la afección, enfermedad o trastorno; remisión (ya sea parcial o total y ya sea detectable o indetectable) de la afección, enfermedad o trastorno; o potenciación o mejora de una afección, enfermedad o trastorno. El tratamiento incluye provocar una respuesta clínicamente significativa sin excesivos efectos secundarios. El tratamiento también incluye prolongar la supervivencia en comparación con la supervivencia esperada si no se recibe tratamiento.
En algunas realizaciones, la composición se usa para tratar una afección, enfermedad o trastorno tal como acné, inflamación aguda, maculopatía senil, alergia, enfermedad de Alzheimer, artritis, asma, ateroesclerosis, enfermedad autoinmunitaria, trastorno lipídico sanguíneo, quistes de mama, caquexia, cáncer, reestenosis cardiaca, enfermedades cardiovasculares, inflamación crónica, cardiopatía coronaria, fibrosis quística, trastorno degenerativo del hígado, diabetes, eccema, trastorno gastrointestinal, cardiopatía, niveles altos de triacilglicerol, hipertensión, hiperactividad, enfermedades inmunológicas, inhibición del crecimiento tumoral, afecciones inflamatorias, trastornos intestinales, disfunción renal, leucemia, depresión mayor, esclerosis múltiple, trastorno neurodegenerativo, osteoartritis, osteoporosis, trastorno peroxisómico, preeclampsia, nacimiento pretérmino, psoriasis, trastorno pulmonar, artritis reumatoide, riesgo de cardiopatía o trombosis.
En algunas realizaciones, la composición se usa para aumentar el tiempo de gestación de un feto en el tercer trimestre.
En algunas realizaciones, la composición se usa para controlar la tensión arterial.
En algunas realizaciones, la composición se usa para mejorar o mantener la función cognitiva.
En algunas realizaciones, la composición se usa para mejorar o mantener la memoria.
La composición o forma farmacéutica puede administrarse al organismo de un sujeto por cualquier vía compatible con la composición o forma farmacéutica. Una sustancia se considera "administrada" si la sustancia se introduce en el organismo del sujeto por el sujeto, o si otra persona, una máquina o un dispositivo introduce la sustancia en el organismo del sujeto. "Administración", por lo tanto, incluye, por ejemplo, autoadministración, administración por otros y administración indirecta. El término "continua" o "consecutiva", como se usa en la presente memoria en referencia a "administración", significa que la frecuencia de administración es de al menos una vez al día. Obsérvese, sin embargo, que la frecuencia de administración puede ser mayor de una vez al día y aún ser "continua" o "consecutiva", por ejemplo, dos veces o incluso tres veces al día, siempre que no se excedan los niveles de dosificación como se especifica en la presente memoria. El medio y los métodos para la administración son conocidos en la técnica y un experto en la materia puede remitirse a diversas referencias farmacológicas para obtener directrices. Por ejemplo, pueden consultarse "Modern Pharmaceutics", Banker & Rhodes, Informa Healthcare, EE. UU., 4.a ed. (2002); y "Goodman & Gilman's The Pharmaceutical Basis of Therapeutics", McGraw-Hill Companies, Inc., Nueva York, 10.a ed. (2001).
Por "sujeto", "individuo" o "paciente" se entiende cualquier sujeto, sea humano o no humano, para el que se desea diagnóstico, pronóstico, tratamiento o administración de la composición o forma farmacéutica. Los sujetos mamíferos incluyen, aunque sin limitación, seres humanos; animales domésticos; animales de granja; animales de zoológico; animales de deportes; mascotas tales como perros, gatos, cobayas, conejos, ratas, ratones o caballos; primates tales como monos (por ejemplo, mono capuchino, macaco de la India, mono verde africano, mono patas, macaco cangrejero y cercopitecos), simios, orangutanes, babuinos, gibones y chimpancés; cánidos tales como perros y lobos; félidos tales como gatos, leones y tigres; équidos tales como caballos, burros y cebras; animales para alimentación tales como vacas, ganado bovino, cerdos y ovejas; ungulados tales como ciervos y jirafas; roedores tales como ratones, ratas, hámsteres y cobayas; y similares. El término sujeto también abarca animales de modelo, por ejemplo, animales de modelo de enfermedad. En algunas realizaciones, el término sujeto incluye animales valiosos, económicamente o de otro modo, por ejemplo, ganado de cría económicamente importante, animales de carreras, animales de exhibición, animales de reliquia, animales raros o en peligro o animales de compañía. En determinadas realizaciones, el sujeto es un sujeto humano. En determinadas realizaciones, el sujeto es un sujeto no humano.
La composición puede administrarse como una "cantidad nutritiva", "cantidad terapéuticamente eficaz", una "cantidad profilácticamente eficaz", una "dosis terapéutica" o una "dosis profiláctica". Una "cantidad nutritiva" se refiere a una cantidad eficaz, a dosificaciones y durante periodos de tiempo necesarios, para conseguir un resultado nutritivo deseado. Un resultado nutritivo puede ser, por ejemplo, niveles aumentados de un componente de ácido graso deseable en un sujeto. Una "cantidad terapéuticamente eficaz" o "dosis terapéutica" se refiere a una cantidad eficaz, a dosificaciones y durante periodos de tiempo necesarios, para conseguir un resultado terapéuticamente deseado. Un resultado terapéutico puede ser, por ejemplo, reducir los síntomas, supervivencia prolongada, movilidad mejorada y similares. Un resultado terapéutico no tiene que ser una "cura". Una "cantidad profilácticamente eficaz" o "dosis profiláctica" se refiere a una cantidad eficaz, a dosificaciones y durante periodos de tiempo necesarios, para conseguir el resultado profiláctico deseado. Típicamente, como una dosis profiláctica se usa en sujetos antes de o en una etapa inicial de la enfermedad, una cantidad profilácticamente eficaz será menor de una cantidad terapéuticamente eficaz para el tratamiento de una etapa avanzada de la enfermedad.
Diversas cantidades de dosificación de la composición, forma farmacéutica o composición farmacéutica pueden administrarse a un sujeto, basándose en la cantidad de EPA u otro componente de ácido graso del microorganismo, biomasa o aceite microbiano a administrar al sujeto. Las expresiones "dosificación diaria", "nivel de dosificación diaria" y "cantidad de dosificación diaria" se refieren en la presente memoria a la cantidad total de EPA u otro componente de ácido graso administrado al día (por periodo de 24 horas). Por tanto, por ejemplo, la administración de EPA a un sujeto a una dosificación diaria de 2 mg significa que el sujeto recibe un total de 2 mg de EPA en una base diaria, se administre el EPA como una sola forma farmacéutica que comprende 2 mg de EPA, o como alternativa, cuatro formas farmacéuticas que comprenden 0,5 mg de EPA cada una (para un total de 2 mg de EPA). En algunas realizaciones, la cantidad diaria de EPA se administra en una sola forma farmacéutica o en dos formas farmacéuticas. Las formas farmacéuticas de la presente invención pueden tomarse en una sola aplicación o en múltiples aplicaciones. Por ejemplo, si se toman cuatro comprimidos al día, comprendiendo cada comprimido 0,5 mg de EPA, entonces pueden tomarse los cuatro comprimidos una vez al día, o pueden tomarse 2 comprimidos dos veces al día, o puede tomarse 1 comprimido cada 6 horas. En algunas realizaciones, la dosificación diaria es de aproximadamente 100 mg a aproximadamente 15 g de EPA. En algunas realizaciones, la dosificación diaria es de aproximadamente 0,5 mg a aproximadamente 250 mg, de aproximadamente 100 mg a aproximadamente 250 mg, de aproximadamente 100 mg a aproximadamente 500 mg, de aproximadamente 100 mg a aproximadamente 1 g, de aproximadamente 1 g a aproximadamente 2,5 g, de aproximadamente 1 g a aproximadamente 5 g, de aproximadamente 1 g a aproximadamente 10 g, de aproximadamente 1 g a aproximadamente 15 g, de aproximadamente 5 g a aproximadamente 10 g, de aproximadamente 5 g a aproximadamente 15 g, de aproximadamente 10 g a aproximadamente 15 g, de aproximadamente 100 mg a aproximadamente 10 g, de aproximadamente 100 mg a aproximadamente 5 g o de aproximadamente 100 mg a aproximadamente 2,5 g de EPA, DHA o una combinación de los mismos. En algunas realizaciones, la composición es una forma farmacéutica que comprende de aproximadamente 0,5 mg a aproximadamente 250 mg, de 100 mg a aproximadamente 250 mg, de aproximadamente 0,5 mg a aproximadamente 500 mg, de aproximadamente 100 mg a aproximadamente 500 mg, de aproximadamente 0,5 mg a aproximadamente 1 g o de aproximadamente 100 mg a aproximadamente 1 g de EPA, DHA o una combinación de los mismos por forma farmacéutica.
En algunas realizaciones, la dosificación diaria de ácidos grasos poliinsaturados omega-3 (incluyendo DHA y/o EPA) es de 100 mg a 3000 mg, de 200 mg a 2000 mg, de 300 mg a 1500 mg, de 400 mg a 1250 mg o de 500 mg a 1000 mg. En algunas realizaciones, la dosificación diaria de una combinación de DHA y EPA es de 500 mg a 1000 mg. En algunas realizaciones, la dosificación diaria de una combinación de DHA y EPA es de 100 mg, 250 mg, 500 mg, 750 mg, 1000 mg, 1500 mg, 2000 mg, 2500 mg o 3000 mg.
La administración de las composiciones o formas farmacéuticas de la presente invención puede conseguirse usando diversas pautas. Por ejemplo, en algunas realizaciones, la administración se produce diariamente en días consecutivos, o como alternativa, se produce en días alternos (cada dos días). La administración puede producirse en uno o más días.
La administración de las composiciones y formas farmacéuticas puede combinarse con otras pautas usadas para el tratamiento de la afección. Por ejemplo, el método de la presente invención puede combinarse con dietas (por ejemplo, dietas bajas en carbohidratos, dietas latas en proteínas, dietas altas en fibra, etc.), pautas de ejercicios, pautas de pérdida de peso, pautas para dejar de fumar o combinaciones de las mismas. El método de la presente invención también puede usarse en combinación con otros productos farmacéuticos en el tratamiento de la afección. Las composiciones o formas farmacéuticas de la presente invención pueden administrarse antes o después de otras pautas o productos farmacéuticos.
Kits que comprenden las composiciones
Se divulgan además kits o envases que contienen una o más unidades de una composición de la invención. Los kits o envases pueden incluir unidades de un producto alimenticio, composición farmacéutica, cosmético o composición industrial que comprende el microorganismo, biomasa como se divulga en la presente memoria o aceite microbiano de la invención, o combinaciones de los mismos. Los kits o envases también pueden incluir un aditivo que comprende el microorganismo, biomasa como se divulga en la presente memoria o aceite microbiano de la invención, o combinaciones de los mismos para la preparación de un alimento, cosmético, composición farmacéutica o composición industrial.
En algunas realizaciones, el kit o envase contiene una o más unidades de una composición farmacéutica a administrar de acuerdo con los métodos de la presente invención. El kit o envase puede contener una unidad de dosificación, o más de una unidad de dosificación (es decir, múltiples unidades de dosificación). Si hay múltiples unidades de dosificación presentes en el kit o envase, las múltiples unidades de dosificación pueden disponerse opcionalmente para administración secuencial.
Los kits como se divulga en la presente memoria pueden contener opcionalmente instrucciones asociadas con las unidades o formas farmacéuticas de los kits. Dichas instrucciones pueden estar en una forma autorizada por una agente gubernamental que regula la fabricación, uso o venta de productos farmacéuticos, que es un aviso que refleja la aprobación, por parte de la agencia, de fabricación, uso o venta para administración a seres humanos para tratar una afección o trastorno. Las instrucciones pueden estar en cualquier forma que traslade información sobre el uso de las unidades o formas farmacéuticas en el kit de acuerdo con los métodos de la invención. Por ejemplo, las instrucciones pueden estar en forma de materia impresa, o en forma de un dispositivo en medio grabado previamente.
En el transcurso del examen de un paciente, un profesional médico puede determinar que la administración de uno de los métodos de la presente invención es apropiada para el paciente, o el médico puede determinar que el estado del paciente puede mejorarse mediante la administración de uno de los métodos de la presente invención. Antes de recetar cualquier pauta, el médico puede orientar al paciente, por ejemplo, sobre los diversos riesgos y beneficios asociados con la pauta. Al paciente se le puede proporcionar una divulgación completa de todos los riesgos conocidos y sospechados asociados con la pauta. Dicha orientación puede proporcionarse de manera verbal, así como de forma escrita. En algunas realizaciones, el médico puede proporcionar al paciente con materiales impresos sobre la pauta, tal como información del producto, materiales educativos y similares.
Se divulgan además métodos de educación de los consumidores sobre los métodos de tratamiento, comprendiendo el método distribuir las formas farmacéuticas con información para el consumidor en un punto de venta. En algunas realizaciones, la distribución se producirá en un punto de venta que tenga un farmacéutico o profesional sanitario.
La expresión "información para el consumidor" puede incluir, aunque sin limitación, un texto en inglés, texto en otro idioma, imagen visual, diagrama, registro telefónico, sitio web y acceso a un representante en vivo del servicio al cliente. En algunas realizaciones, la información para el consumidor proporcionará instrucciones de uso de las formas farmacéuticas de acuerdo con los métodos de la presente invención, la edad apropiada de uso, las indicaciones, contraindicaciones, dosis apropiadas, advertencias, número de teléfono o dirección del sitio web. En algunas realizaciones, el método comprende además proporcionar información profesional a las personas pertinentes en posición de contestar las preguntas de los clientes con respecto al uso de las pautas divulgadas de acuerdo con los métodos de la presente invención. La expresión "información profesional" incluye, aunque sin limitación, información referente a la pauta cuando se administra de acuerdo con los métodos de la presente invención que está diseñada para posibilitar que un profesional médico responda a las preguntas del cliente.
Un "profesional médico" incluye, por ejemplo, un médico, asistente médico, enfermero, facultativo de enfermería, farmacéutico y representante del servicio al cliente.
Aceites microbianos enriquecidos
La invención se refiere a aceites microbianos enriquecidos o concentrados que tienen mayores concentraciones de ácidos grasos poliinsaturados, sus ésteres, sales, alcoholes y/o aldehídos. La invención se refiere a un aceite microbiano enriquecido que comprende al menos un 70 % en peso de una combinación de DHA y EPA, en el que el aceite comprende al menos un 10 % en peso de EPA, basado en el peso del aceite. En algunas realizaciones, el aceite microbiano enriquecido comprende al menos un 75 % en peso, al menos un 80 % en peso o al menos un 85 % en peso de una combinación de DHA y EPA, en el que el aceite comprende al menos un 10 % en peso de EPA, basado en el peso del aceite. En algunas realizaciones, el aceite microbiano enriquecido comprende al menos un 70 % en peso, al menos un 75 % en peso, al menos un 80 % en peso o al menos un 85 % en peso de una combinación de DHA y EPA, en el que el aceite comprende al menos un 10 % en peso, al menos un 15 % en peso, al menos un 20 % en peso, al menos un 25 % en peso o al menos un 30 % en peso de EPA, basado en el peso del aceite.
En algunas realizaciones, la presente invención se refiere a un aceite microbiano enriquecido que comprende al menos un 50 % en peso de DHA y al menos un 20 % en peso EPA, basado en el peso del aceite. En algunas realizaciones, el aceite microbiano enriquecido comprende al menos un 55 % en peso, al menos un 60 % en peso, al menos un 65 % en peso o al menos un 70 % en peso de DHA, basado en el peso del aceite. En algunas realizaciones, el aceite microbiano enriquecido comprende al menos un 25 % en peso, al menos un 30 % en peso o al menos un 35 % en peso de EPA, basado en el peso del aceite.
En algunas realizaciones, el aceite microbiano enriquecido de la invención comprende de un 50 % a un 70 %, de un 55 % a un 65 % o de un 53 % a un 63 % en peso de DHA, basado en el peso del aceite. En algunas realizaciones, el aceite microbiano enriquecido de la invención comprende de un 20% a un 35%, de un 23% a un 33% o de un 25% a un 30% en peso de EPA, basado en el peso del aceite.
Se divulga además un aceite microbiano enriquecido que comprende al menos un 30 % en peso de EPA, basado en el peso del aceite. En algunas realizaciones, el aceite comprende al menos un 35 %, al menos un 40 %, al menos un 45 %, al menos un 50 %, al menos un 55 %, al menos un 60 %, al menos un 65 % o al menos un 70 % en peso de EPA, basado en el peso del aceite. En algunas realizaciones, el aceite comprende de un 30 % a un 75 % en peso, de un 35 % a un 70 % en peso, de un 40 % a un 65 % en peso o de un 45 % a un 60 % en peso o de un 50 % a un 60 % en peso de EPA, basado en el peso del aceite.
En algunas realizaciones, los aceites de la invención, incluyendo los aceites microbianos enriquecidos de la invención, se obtienen de una sola fuente. En algunas realizaciones, los aceites de la invención se obtienen de microorganismos de la misma especie. En algunas realizaciones, los aceites de la invención se obtienen de una sola cepa de microorganismo. En algunas realizaciones, los aceites de la invención se obtienen de un solo aislado o subaislado de una cepa de microorganismo.
En algunas realizaciones, el DHA y EPA están en forma de triacilglicerol. En algunas realizaciones, el DHA y EPA están en forma de éster. Por ejemplo, el éster de DHA y EPA puede ser un éster etílico.
La presente invención se refiere a un alimento, complemento o medicamento que comprende un aceite microbiano enriquecido de la invención.
En algunas realizaciones, el aceite microbiano enriquecido se puede obtener de un microorganismo aislado de una especie Schizochytrium.
En algunas realizaciones, el aceite de la invención se puede obtener de un microorganismo aislado de la especie depositada según el acceso de ATCC n.° PTA-10208, en el que los ácidos grasos totales producidos por el microorganismo comprenden más de un 10 % en peso de EPA. En algunas realizaciones, el aceite de la invención se puede obtener de un microorganismo aislado de la especie depositada según el acceso de ATCC n.° PTA-10208, en el que los ácidos grasos totales producidos por el microorganismo comprenden más de un 11 %, más de un 12 %, más de un 13 %, más de un 14 %, más de un 15 %, más de un 16 %, más de un 17 %, más de un 18 %, más de un 19 % o más de un 20 % en peso de EPA.
En algunas realizaciones, el aceite de la invención se puede obtener de un microorganismo aislado que tiene las características de la especie depositada según el acceso de ATCC n.° PTA-10208, en el que los ácidos grasos totales producidos por el microorganismo comprenden más de aproximadamente un 10 % en peso de EPA. En algunas realizaciones, el aceite de la invención se puede obtener de un microorganismo aislado que tiene las características de la especie depositada según el acceso de ATCC n.° PTA-10208, en el que los ácidos grasos totales producidos por el microorganismo comprenden más de un 11 %, más de un 12 %, más de un 13 %, más de un 14 %, más de un 15 %, más de un 16 %, más de un 17 %, más de un 18 %, más de un 19 % o más de un 20 % en peso de EPA.
En algunas realizaciones, el aceite de la invención se puede obtener de un microorganismo aislado que produce una fracción de triacilglicerol, en el que el contenido de EPA de la fracción de triacilglicerol es de al menos un 12 % en peso. En algunas realizaciones, el aceite de la invención se puede obtener de un microorganismo aislado que produce una fracción de triacilglicerol, en el que el contenido de EPA de la fracción de triacilglicerol es de al menos un 13 %, al menos un 14 %, al menos un 15 %, al menos un 16 %, al menos un 17 %, al menos un 18 %, al menos un 19 % o al menos un 20 % en peso. En algunas realizaciones, el aceite de la invención se puede obtener de un microorganismo aislado que produce una fracción de triacilglicerol, en el que el contenido de EPA de la fracción de triacilglicerol es de un 12 % a un 55 %, de un 12 % a un 50 %, de un 12 % a un 45 %, de un 12 % a un 40 %, de un 12 % a un 35 %, de un 12 % a un 30 %, de un 15 % a un 45 %, de un 15 % a un 40 %, de un 15 % a un 35 %, de un 15 % a un 30 % o de un 20 % a un 30 % en peso.
En algunas realizaciones, el aceite de la invención se puede obtener de un microorganismo aislado depositado según el acceso de ATCC n.° pTa -10208.
En algunas realizaciones, el aceite de la invención se puede obtener de un microorganismo aislado depositado según el acceso de ATCC n.° PTA-10209.
En algunas realizaciones, el aceite de la invención se puede obtener de un microorganismo aislado depositado según el acceso de ATCC n.° pTa -10210.
En algunas realizaciones, el aceite de la invención se puede obtener de un microorganismo aislado depositado según el acceso de ATCC n.° pTa -10211.
Antioxidantes
Los aceites de la invención opcionalmente pueden incluir un antioxidante. Ejemplos de uno o más antioxidantes que, individualmente o en cualquier combinación, pueden incluirse opcionalmente en cualquier aceite de esta divulgación incluyen: ácido ascórbico, un éster de ácido ascórbico, una sal de ácido ascórbico, glutatión, un caroteno, betacaroteno, vitamina E, alfa-tocoferol, beta-tocoferol, gamma-tocoferol, delta-tocoferol, alfa-tocotrienol, beta-tocotrienol, gamma-tocotrienol, delta-tocotrienol, ubiquinol, ácido ascórbico y/o ubiquinona.
La vitamina E, para los propósitos de esta solicitud, se define como alfa-tocoferol, beta-tocoferol, gamma-tocoferol, delta-tocoferol, alfa-tocotrienol, beta-tocotrienol, gamma-tocotrienol, delta-tocotrienol o una combinación de los mismos.
El uno o más antioxidantes pueden estar presentes opcionalmente en cualquier aceite de esta divulgación de modo que la cantidad de estos, en total, varíe, por ejemplo, de un 0,001 % en peso a un 5 % en peso, incluyendo todos los valores y subintervalos intermedios como si es escribieran explícitamente, basado en el peso total del aceite. La cantidad total de uno o más antioxidantes puede ser, por ejemplo, de un 0,01 % en peso, un 0,01 % en peso, un 0,1 % en peso, un 1 % en peso, un 2 % en peso, un 3 % en peso o un 4 % en peso, basado en el peso total del aceite.
Este uno o más antioxidantes, individualmente o en combinación, pueden excluirse opcionalmente de cualquier aceite de esta divulgación.
Aldehidos y alcoholes
Un aldehido contiene el grupo funcional: -C(O)H.
Un alcohol contiene el grupo funcional: -OH.
Ácidos
Un ácido contiene el grupo funcional: -C(O)OH.
Ácidos de alto interés en esta solicitud son ácidos grasos. Ácidos grasos de particular interés incluyen ácidos grasos omega-3, ácidos grasos omega-6 y combinaciones de los mismos. Ácidos grasos de interés muy particular incluyen DHA, EPA o una combinación de estos.
Sales de ácido
Una sal de ácido contiene el grupo funcional: -C(O)O- M+, en el que -C(O)O- es un anión y M+ es un catión. M+ puede ser un catión inorgánico o un catión orgánico. El número de grupos aniónicos -C(O)O- asociados con el catión puede ajustarse para satisfacer la valencia del catión. Por ejemplo, M+ puede ser cualquier catión de un metal del grupo I o grupo II de la Tabla Periódica de los Elementos. Ejemplos específicos de cationes inorgánicos incluyen Na+, K+, Li+, Rb+, Cs+, Fr+, Ca2+, Mg2+, Be2+, Sr2+, Ba2+, Ra2+ y amonio. Los cationes también pueden ser orgánicos. Por ejemplo, los cationes orgánicos pueden ser aminoácidos protonados, o cuaternizados de nitrógeno, tales como: arginina, histidina, lisina, ácido aspártico, ácido glutámico, serina, treonina, asparagina, glutamina, cisteína, glicina, prolina, alanina, isoleucina, leucina, metionina, fenilalanina, glicina, valina, fenilalanina, triptófano y tirosina. Los aminoácidos protonados o cuaternizados pueden ser racémicos o de la configuración D o L.
Sales de ácido de alto interés en esta solicitud son sales de ácidos grasos. Sales de ácido graso de particular interés incluyen sales de un ácido graso omega-3, sales de un ácido graso omega-6 y combinaciones de los mismos. Sales de ácido graso de interés muy particular incluyen una sal de DHA, una sal de EPA o una combinación de estas.
Ésteres
En algunas realizaciones, un éster de ácido graso incluye un éster de un ácido graso omega-3, ácido graso omega-6 y combinaciones de los mismos. En algunas realizaciones, el éster de ácido graso es un éster de DHA, un éster de EPA o una combinación de los mismos. En algunas realizaciones, un aceite o fracción del mismo como se describe en la presente memoria se esterifica para producir un aceite o fracción del mismo que comprenda ésteres de ácido graso. El término "éster" se refiere al remplazo del hidrógeno en el grupo ácido carboxílico de la molécula de ácido graso con otro sustituyente. Los ésteres típicos son conocidos por los expertos en la materia, de los que se proporciona un análisis por Higuchi, T. y V. Stella en Pro-drugs as Novel Delivery Systems, Vol. 14, A.C.S. Symposium Series, Bioreversible Carriers in Drug Design, Ed. Edward B. Roche, American Pharmaceutical Association, Pergamon Press, 1987, y Protective Groups in Organic Chemistry, McOmie ed., Plenum Press, Nueva York, 1973. Ejemplos de ésteres incluyen metilo, etilo, propilo, butilo, pentilo, t-butilo, bencilo, nitrobencilo, metoxibencilo, benzhidrilo y tricloroetilo. En algunas realizaciones, el éster es un grupo éster protector de ácido carboxílico, ésteres con aralquilo (por ejemplo, bencilo, fenetilo), ésteres con alquenilo inferior (por ejemplo, alilo, 2-butenilo), ésteres con alcoxi inferior-alquilo inferior (por ejemplo, metoximetilo, 2-metoxietilo, 2-etoxietilo), ésteres con alcanoiloxi inferior-alquilo inferior (por ejemplo, acetoximetilo, pivaloiloximetilo, 1-pivaloiloxietilo), ésteres con alcoxicarbonil inferior-alquilo inferior (por ejemplo, metoxicarbonilmetilo, isopropoxicarbonilmetilo), ésteres con carboxi-alquilo inferior (por ejemplo, carboximetilo), ésteres con alcoxicarboniloxi inferior-alquilo inferior (por ejemplo, 1-(etoxicarboniloxi)etilo, 1-(ciclohexiloxicarboniloxi)etilo), ésteres con carbamoiloxi-alquilo inferior (por ejemplo, carbamoiloximetilo) y similares. En algunas realizaciones, el sustituyente añadido es un grupo hidrocarbonado lineal o cíclico, por ejemplo, un alquilo C1-C6, cicloalquilo C1-C6, alquenilo C1-C6 o éster arílico C1-C6. En algunas realizaciones, el éster es un éster alquílico, por ejemplo, un éster metílico, éster etílico o éster propílico. En algunas realizaciones, el sustituyente éster se añade a la molécula de ácido graso libre cuando el ácido graso está en un estado purificado o semipurificado. Como alternativa, el éster de ácido graso se forma tras la conversión de un triacilglicerol en un éster.
Ésteres de alto interés en esta solicitud son ésteres de ácido graso. Ésteres de ácido graso de particular interés incluyen ésteres de un ácido graso omega-3, ésteres de un ácido graso omega-6 y combinaciones de los mismos. Ésteres de ácido graso de interés muy particular incluyen un éster de DHA, un éster de EPA o una combinación de los mismos.
Los ésteres pueden ésteres de diglicérido (es decir, ésteres formados a partir de ácidos y glicerol). Los ésteres de glicérido pueden adoptar la forma de monoacil glicéridos, diacil glicéridos y/o triacil glicéridos. Ésteres de glicérido de alto interés en esta solicitud son ésteres de glicérido que contienen ácido graso poliinsaturado. Ésteres de glicérido de particular interés incluyen ésteres de glicérido de un ácido graso omega-3, un ácido graso omega-6 y combinaciones de los mismos. Ésteres de glicérido de interés muy particular incluyen un éster de glicérido que contiene DHA, un éster de glicérido que contiene EPA o una combinación de los mismos.
Técnicas de enriquecimiento para producir aceites microbianos enriquecidos
Se conocen diversos métodos en la técnica para aumentar la concentración de ácidos grasos poliinsaturados en una composición. Ejemplos de dichos métodos se divulgan, por ejemplo, en la patente de Estados Unidos n.° 7588791; la patente de Estados Unidos n.° 6528669; la patente de Estados Unidos n.° 6395778; la publicación de solicitud de Estados Unidos n.° 2011/0098356; y la publicación de solicitud de Estados Unidos n.° 2010/0130608.
En la presente invención, cualquier técnica de concentración, reacción y/o purificación puede combinarse con cualquier otra técnica de concentración, reacción y/o purificación para producir aceites microbianos enriquecidos en: ácidos grasos poliinsaturados, sus ésteres, sus sales, aldehídos de los mismos y/o alcoholes de los mismos. Las técnicas de enriquecimiento pueden usarse en cualquier orden y combinación. En algunas realizaciones, puede usarse un aceite microbiano crudo o refinado como material de partida para producir los aceites microbianos enriquecidos de la invención. Por ejemplo, el acondicionamiento al frío simple de un aceite microbiano crudo o refinado puede producir un primer aceite microbiano enriquecido que está enriquecido en triacil glicéridos que contienen ácido graso poliinsaturado. El primer aceite microbiano enriquecido entonces puede, por ejemplo, someterse a hidrólisis de triacil glicérido catalizado con base para producir un segundo aceite microbiano enriquecido que contiene y está enriquecido en ácidos grasos poliinsaturados. El segundo aceite microbiano enriquecido entonces puede, por ejemplo, destilarse de forma fraccionada a presión reducida para concentrar adicionalmente los ácidos grasos poliinsaturados, produciendo de ese modo un tercer aceite microbiano enriquecido. El tercer aceite microbiano enriquecido entonces puede, por ejemplo, enriquecerse adicionalmente en el contenido de ácido graso poliinsaturado mediante el uso de cromatografía de líquidos de alto rendimiento para producir un cuarto aceite microbiano enriquecido en ácidos grasos poliinsaturados. En una realización preferida, puede usarse una biomasa como material de partida para producir los aceites microbianos enriquecidos de la invención. La biomasa, como se usa en esta ocasión, se refiere a un caldo de cultivo de algas al menos parcialmente drenado.
Los triacil glicéridos son materiales preferidos a partir de los que se preparan ácidos grasos (y, en particular, ácidos grasos poliinsaturados), sus sales, sus aldehídos, sus alcoholes y/o sus ésteres que no son de glicérido. Los triacil glicéridos pueden estar presentes en un aceite microbiano crudo o en un aceite microbiano refinado. Los triacil glicéridos pueden concentrarse a partir de un aceite microbiano crudo o refinado antes de realizar alguna reacción química que provoque la obtención de ácidos grasos (y, en particular, ácidos grasos poliinsaturados), sus sales, sus aldehídos, sus alcoholes y/o sus ésteres que no son de glicérido.
El contenido de los triacil glicéridos en el aceite microbiano crudo o refinado puede variar, por ejemplo, de un 10% a un 99 % en peso, incluyendo todos los valores y subintervalos intermedios como si estuvieran escritos explícitamente, basado en el peso total del aceite microbiano crudo o refinado. Por ejemplo, el contenido de triacil glicérido del aceite microbiano crudo o refinado puede ser de un 15 %, 20 %, 25 %, 30 %, 35 %, 40 %, 45 %, 50 % , 60 %, 70 %, 80 %, 90%, 95 %, o 99 %, basado en el peso del aceite microbiano.
El aceite microbiano crudo o refinado puede manipularse para aumentar el contenido de triacil glicérido que contiene ácido graso poliinsaturado en el mismo por, por ejemplo, acondicionamiento al frío simple.
Acondicionamiento al frío simple
En el acondicionamiento al frío simple, el aceite microbiano crudo o refinado se enfría en ausencia de disolvente, y precipita una fracción sólida en el aceite enfriado. La fracción sólida contiene triacil glicéridos que contienen predominantemente ácidos grasos saturados unidos a los mismos mediante enlaces éster. La fracción líquida contiene triacil glicéridos que contienen predominantemente ácidos grasos poliinsaturados unidos a los mismos mediante enlaces éster. Después de enfriarla, la fracción líquida se separa de la fracción sólida por, por ejemplo, decantación y/o filtración y/o mediante centrifugación seguida de decantación y/o filtración. También puede realizarse evaporación, donde sea apropiado. Si se realiza, la centrifugación puede ser, por ejemplo, a 1000 - 4000 g, incluyendo todos los valores y subintervalos intermedios como si estuvieran escritos explícitamente.
En el acondicionamiento al frío simple, la temperatura de enfriamiento puede variar, por ejemplo, de 0 °C a -120 °C, incluyendo todos los valores y subintervalos intermedios como si estuvieran escritos explícitamente. Por ejemplo, la temperatura de enfriamiento puede ser -5 °C, -10 °C, -20 °C, -30 °C, -40 °C, -50 °C, -60 °C, -70 °C, -80 °C, -90 °C, -100 °C, -110 °C o -120 °C. El tiempo de enfriamiento puede variar de 1 minuto a 5 días, incluyendo todos los valores y subintervalos intermedios como si estuvieran escritos explícitamente. El tiempo de enfriamiento puede ser, por ejemplo, 5 minutos, 10 minutos, 20 minutos, 30 minutos, 40 minutos, 50 minutos, 60 minutos, 2 horas, 3 horas, 4 horas, 5 horas, 6 horas, 7 horas, 8 horas, 9 horas, 10 horas, 11 horas, 12 horas, 24 horas, 2 días, 3 días o 4 días.
Después del acondicionamiento al frío simple, el contenido de triacil glicéridos (que contienen ácidos grasos poliinsaturados unidos a los mismos mediante enlaces éster) en el aceite sometido a acondicionamiento al frío simple se potencia, y puede variar, por ejemplo, de un 20 % a un 99,9 % en masa, incluyendo todos los valores y subintervalos intermedios como si estuvieran escritos explícitamente, basado en la masa total del aceite sometido a acondicionamiento al frío simple. Por ejemplo, el contenido de triacil glicérido que contiene ácido graso poliinsaturado del aceite sometido a acondicionamiento al frío simple puede de un 25 %, 30 %, 35 %, 40 %, 45 %, 50 %, 55 %, 60 %, 65 %, 70 %, 75 %, 80%, 90 %, 95 %, 99 %, o 99,9 % en masa, basado en la masa total del aceite sometido a acondicionamiento al frío simple.
El contenido de ácido graso poliinsaturado en los triacil glicéridos del aceite sometido a acondicionamiento al frío simple puede variar, por ejemplo, de un 30 % de todos los enlaces éster del triacil glicérido (por ejemplo, un 30 % de los enlaces éster del triacil glicérido son con ácidos grasos poliinsaturados) a un 100 % de todos los enlaces éster del triacil glicérido, incluyendo todos los valores y subintervalos intermedios como si estuvieran escritos explícitamente. Por ejemplo, el contenido de ácido graso poliinsaturado de los triacil glicéridos puede ser de un 25 %, 30 %, 35 %, 40 %, 45 %, 50 %, 55 %, 60 %, 65 %, 70 %, 80 %, 90%, o 95% de todos los enlaces éster del triacil glicérido en los triacil glicéridos en el aceite sometido a acondicionamiento al frío simple.
El aceite microbiano crudo o refinado puede manipularse para aumentar el contenido de triacil glicérido que contiene ácido graso poliinsaturado en el mismo por, por ejemplo, acondicionamiento al frío complejo.
Acondicionamiento al frío complejo
En el acondicionamiento al frío complejo, el aceite microbiano crudo o refinado se enfría en presencia de un disolvente, y precipita una fracción sólida en el aceite enfriado. La fracción sólida contiene triacil glicéridos que contienen predominantemente ácidos grasos saturados unidos a los mismos mediante enlaces éster. La fracción líquida contiene triacil glicéridos que contienen predominantemente ácidos grasos poliinsaturados unidos a los mismos mediante enlaces éster. Después de enfriarla, la fracción líquida se separa de la fracción sólida por, por ejemplo, decantación y/o filtración y/o mediante centrifugación seguida de decantación y/o filtración. También puede realizarse evaporación, donde sea apropiado. Si se realiza, la centrifugación puede ser, por ejemplo, a 1000 - 4000 g, incluyendo todos los valores y subintervalos intermedios como si estuvieran escritos explícitamente.
El disolvente puede ser, por ejemplo, etanol, metanol, propano, butano, acetato de butilo, acetato de etilo, dióxido de carbono, dióxido de carbono supercrítico, acetona, monóxido de dinitrógeno, hexano, etil metil cetona, isopropanol, diclorometano o cualquier combinación de estos disolventes.
Cuando se usan dos disolventes juntos, la relación de volumen/volumen de los dos disolventes puede variar de 5:95 a 95:5, incluyendo todos los valores y subintervalos intermedios como si estuvieran escritos explícitamente, donde el volumen de disolvente combinado total es de un 100 %. Por ejemplo, la relación de volumen/volumen puede ser 10:90, 20:80, 30:70, 40:60, 50:50, 60:40, 70:30, 80:20 o 90:10.
La relación de disolvente a aceite puede variar, por ejemplo, de 1 g de aceite: 1 ml de disolvente a 1 g de aceite: 100 ml de disolvente, incluyendo todos los valores y subintervalos intermedios como si estuvieran escritos explícitamente. Por ejemplo, la relación de aceite a disolvente puede ser de 1 g: 2 ml, 1 g: 3 ml, 1 g: 4 ml, 1 g: 5 ml, 1 g: 6 ml, 1 g: 7 ml, 1 g: 8 ml, 1 g: 9 ml, 1 g: 10 ml, 1 g: 20 ml, 1 g: 30 ml, 1 g: 40 ml, 1 g: 50 ml, 1 g: 60 ml, 1 g: 70 ml, 1 g: 80 ml o 1 g: 90 ml.
En el acondicionamiento al frío complejo, la temperatura de enfriamiento puede variar, por ejemplo, de 0 °C a -120 °C, incluyendo todos los valores y subintervalos intermedios como si estuvieran escritos explícitamente. Por ejemplo, la temperatura de enfriamiento puede ser -5 °C, -10 °C, -20 °C, -30 °C, -40 °C, -50 °C, -60 °C, -70 °C, -80 °C, -90 °C, -100 °C, -110 °C o -120 °C. El tiempo de enfriamiento puede variar de 1 minuto a 5 días, incluyendo todos los valores y subintervalos intermedios como si estuvieran escritos explícitamente. El tiempo de enfriamiento puede ser, por ejemplo, 5 minutos, 10 minutos, 20 minutos, 30 minutos, 40 minutos, 50 minutos, 60 minutos, 2 horas, 3 horas, 4 horas, 5 horas, 6 horas, 7 horas, 8 horas, 9 horas, 10 horas, 11 horas, 12 horas, 24 horas, 2 días, 3 días o 4 días.
Después del acondicionamiento al frío complejo y la eliminación del disolvente, el contenido de triacil glicéridos (que contienen ácidos grasos poliinsaturados unidos a los mismos mediante enlaces éster) en el aceite sometido a acondicionamiento al frío complejo se potencia, y puede variar, por ejemplo, de un 20 % a un 99,9 % en masa, incluyendo todos los valores y subintervalos intermedios como si estuvieran escritos explícitamente, basado en la masa total del aceite sometido a acondicionamiento al frío complejo. Por ejemplo, el contenido de triacil glicérido que contiene ácido graso poliinsaturado del aceite sometido a acondicionamiento al frío complejo puede de un 25 %, 30 %, 35 %, 40 %, 45 %, 50 %, 55 %, 60 %, 65 %, 70 %, 75 %, 80 %, 90 %, 95 %, 99 %, o 99,9 % en masa, basado en la masa total del aceite sometido a acondicionamiento al frío complejo.
El contenido de ácido graso poliinsaturado en los triacil glicéridos del aceite sometido a acondicionamiento al frío complejo puede variar, por ejemplo, de un 20 % a un 100 % de todos los enlaces éster del triacil glicérido (por ejemplo, de un 20 % a un 100 % de todos los enlaces éster del triacil glicérido están unidos a ácidos grasos poliinsaturados), incluyendo todos los valores y subintervalos intermedios como si estuvieran escritos explícitamente. Por ejemplo, un 25 %, 30 %, 35 %, 40 %, 45 %, 50 %, 55 %, 60 %, 60 %, 70 %, 80 %, 90 %, 95 %, o 99% de los enlaces éster en el aceite sometido a acondicionamiento al frío simple pueden estar unidos a uno o más ácidos grasos poliinsaturados.
Se hace referencia al contenido de la patente de Estados Unidos n.° 7588791 en su totalidad.
Hidrólisis
Los ácidos grasos y, particularmente, los ácidos grasos poliinsaturados, puede obtenerse hidrolizando triacil glicéridos y/o diacil glicéridos y/o monoacil glicéridos que contienen ácidos grasos, particularmente ácidos grasos poliinsaturados. Los triacil glicéridos están contenidos en un aceite microbiano crudo o refinado que puede someterse opcionalmente a acondicionamiento al frío simple y/o acondicionamiento al frío complejo. La hidrólisis puede realizarse con una base tal como un hidróxido de metal, por ejemplo, hidróxido de sodio, hidróxido de potasio, hidróxido de litio, hidróxido de calcio, hidróxido de magnesio, hidróxido de cesio o cualquier combinación de estos. La relación de base (por ejemplo, hidróxido de metal) a aceite, en una base de peso:peso, puede variar de 1: 1 a 1000: 1, incluyendo todos los valores y subintervalos intermedios como si estuvieran escritos explícitamente. Por ejemplo, una relación en peso:peso de base a aceite puede ser: 2:1,3:1,4:1,5:1,6:1,7:1,8:1,9:1, 10:1,20:1,30:1,40:1,50:1,60:1,70:1,80:1, 90:1, 100:1, 200:1, 300:1, 400:1, 500:1, 500:1, 700:1, 800:1 o 900:1. La hidrólisis puede llevarse a cabo en agua, y opcionalmente empleando un codisolvente que puede ser completamente, parcialmente o nada miscible en absoluto con el agua. Los codisolventes pueden incluir, aunque sin limitación, éter dietílico, metanol, etanol, hexano, pentano, acetato de etilo, N,N-dimetilformamida, dimetilsulfóxido y/o un éter corona. El éter corona puede ser, por ejemplo, 12-corona-4, 15-corona-5, 18-corona-6, dibenzo-18-corona-6, diaza-18-corona-6 o una combinación de estos.
La reacción de hidrólisis puede llevarse a cabo a una temperatura que varía de 10 °C a 80 °C, incluyendo todos los valores y subintervalos intermedios como si estuvieran escritos explícitamente. La reacción de hidrólisis puede llevarse a cabo, por ejemplo, a 15 °C, a 20 °C, a 30 °C, a 40 °C, a 50 °C, a 60 °C o a 70 °C.
La reacción de hidrólisis puede hacerse durante un periodo de tiempo que varía de 1 hora a 1 semana, incluyendo todos los subintervalos y valores intermedios como si estuvieran escritos explícitamente. Por ejemplo, la reacción de hidrólisis puede llevarse a cabo durante 2 horas, 4 horas, 6 horas, 8 horas, 10 horas, 12 horas, 14 horas, 16 horas, 18 horas, 20 horas, 22 horas, 24 horas, 2 días, 3 días, 4 días, 5 días o 6 días.
El pretratamiento de la reacción de hidrólisis puede hacerse de muchas maneras conocidas por los expertos en la materia. Si la reacción de hidrólisis se pretrata con una fuente de protones (que puede diluirse con agua antes de comenzar el pretratamiento), por ejemplo, cloruro de amonio o un ácido mineral, se producirán moléculas de ácido libres del ácido graso hidrolizado. Los ácidos minerales incluyen ácido clorhídrico, ácido sulfúrico y/o ácido fosfórico.
Como alternativa, las sales de ácido graso formadas en la reacción de hidrólisis pueden aislarse por concentración, por ejemplo, por eliminación de agua (y opcionalmente codisolventes) de la reacción de hidrólisis. La eliminación del disolvente de la reacción que contiene ácido graso o sal de ácido graso puede realizarse a presión atmosférica reducida, por ejemplo, en un evaporador giratorio o un liofilizador o un TurboVap®. La presión atmosférica reducida puede realizarse por, por ejemplo, un aspirador o bomba de vacío.
La presión reducida puede variar de 0,0001 atmósferas a 0,9 atmósferas, incluyendo todos los valores y subintervalos intermedios como si estuvieran escritos explícitamente. Una atmósfera se abrevia ''atm'' y equivale a 101,325 Pa. La presión reducida puede ser, por ejemplo, 0,001 atm, 0,01 atm, 0,1 atm, 0,2 atm, 0,3 atm, 0,4 atm, 0,5 atm, 0,6 atm, 0,7 atm o 0,8 atm.
Formación de éster/transesterificación
Los ésteres de ácido graso, en particular ésteres de ácido graso poliinsaturado, pueden prepararse de maneras que son conocidas por los expertos en la materia.
Por ejemplo, los triacil glicéridos, diacil glicéridos y/o monoacil glicéridos que contienen ácidos grasos, particularmente ácidos grasos poliinsaturados, pueden hacerse reaccionar con un alcohol en presencia de un ácido o una base para producir ésteres. La divulgación de la solicitud de patente de Estados Unidos n.° 12/163555, que se publicó como publicación preconcedida de solicitud de patente de Estados Unidos n.° 2009/0023808.
Los alcoholes pueden incluir, por ejemplo, alcoholes de alquilo C1-C6, por ejemplo, etanol, metanol, n-propanol, isopropanol, n-butanol, iso-butanol, sec-butanol, terc-butanol, n-pentanol y n-hexanol. El alcohol puede usarse como disolvente y correactivo de la reacción, en solitario o con un codisolvente. La cantidad del alcohol puede variar de un 25 % a un 50 % en peso de la mezcla de reacción, incluyendo todos los valores y subintervalos intermedios como si estuvieran escritos explícitamente. Por ejemplo, la cantidad de alcohol en la mezcla de reacción puede ser de un 30 %, 35 %, 40 % o 45 % en peso de la mezcla de reacción.
La base puede ser, por ejemplo, un alquilóxido de metal. Los alquilóxidos de metal incluyen etóxido de sodio, metóxido de sodio, n-propóxido de sodio, iso-propóxido de sodio, n-butóxido de sodio, iso-butóxido de sodio, sec-butóxido de sodio, terc-butóxido de sodio, n-pentóxido de sodio, n-hexóxido de sodio, etóxido de litio, metóxido de litio, n-propóxido de litio, iso-propóxido de litio, n-butóxido de litio, iso-butóxido de litio, sec-butóxido de litio, terc-butóxido de litio, npentóxido de litio, n-hexóxido de litio, etóxido de potasio, metóxido de potasio, n-propóxido de potasio, iso-propóxido de potasio, n-butóxido de potasio, iso-butóxido de potasio, sec-butóxido de potasio, terc-butóxido de potasio, npentóxido de potasio y/o n-hexóxido de potasio.
En algunas situaciones, la base puede prepararse añadiendo metal sodio, metal potasio o metal litio a una solución alcohólica.
En algunas situaciones, la base puede prepararse añadiendo un hidruro de metal, tal como hidruro de litio, hidruro de sodio o hidruro de potasio, a una solución alcohólica.
La relación de base a aceite, en una base de peso:peso puede variar, por ejemplo, de 1:1 a 1000:1, incluyendo todos los valores y subintervalos intermedios como si estuvieran escritos explícitamente. Por ejemplo, la relación de base a aceite, en una base de peso a peso, puede ser de 2:1,3:1,4:1,5:1,6:1,7:1,8:1,9:1, 10:1,20:1,30:1,40:1,50:1,60:1, 70:1,80:1, 90:1, 100:1,200:1,300:1,400:1,500:1,600:1,700:1,800:1 o 900:1.
La reacción de esterificación puede llevarse a cabo a una temperatura que varía de 10 °C a 100 °C, incluyendo todos los valores y subintervalos intermedios como si estuvieran escritos explícitamente. Por ejemplo, la reacción de esterificación puede llevarse a cabo a 20 °C, 30 °C, 40 °C, 50 °C, 60 °C, 70 °C, 80 °C o 90 °C.
La reacción de esterificación puede llevarse a cabo abierta a la atmósfera, o en una atmósfera inerte tal como nitrógeno o argón.
El pretratamiento y aislamiento de los ésteres de ácido graso pueden hacerse de maneras conocidas por los expertos en la materia, por ejemplo, por extracción con un disolvente orgánico y/o agua. El disolvente orgánico puede ser, por ejemplo, pentano, hexano, éter dietílico, acetato de etilo o una combinación de estos. El agua puede contener opcionalmente otras sustancias tales como bicarbonato de sodio, carbonato de sodio, cloruro de amonio y/o ácido mineral diluido.
Reducción
Además, los ésteres de ácido graso pueden reducirse para formar alcoholes o aldehídos de los ácidos grasos.
Por ejemplo, los triacil glicéridos pueden tratarse con reactivos reductores tales como LiBH4 , opcionalmente en presencia de MeOH y/o diglyme; LiBH4 en presencia de cloruro de trimetilsililo; NaBH4 en presencia de eterato de trifluoruro de boro; NaBH4 en presencia de AlCl3 o TiCl4 o H2SO4 ; Zn(BH4)2 ; iBuAlH; LiAlH4 opcionalmente en presencia de AlCh; y/o NaAlH4. Se describen reactivos generales para conseguir la reducción en Larock, R. C., Comprehensive Organic Transformations, 2.a edición (1999).
La reducción puede llevarse a cabo, por ejemplo, a una temperatura que varía de -78 °C a 80 °C, incluyendo todos los valores y subintervalos intermedios como si estuvieran escritos explícitamente. Por ejemplo, la reducción puede realizarse a -70°C, -60°C, -50°C, -40°C, -30°C, -20°C, - 10°C, 0°C, 10°C, 20°C, 30°C, 40°C, 50°C, 60°C, o 70°C.
La reducción se realiza preferiblemente en una atmósfera inerte tal como nitrógeno o argón.
La elección del disolvente de reacción puede variar, pero puede incluir, por ejemplo, tetrahidrofurano, éter dietílico, hexano, pentano, tetrahidropirano o cualquier combinación de estos. El disolvente es preferiblemente inerte para el reactivo reductor. El disolvente es preferiblemente anhidro.
La relación del reactivo reductor al triacil glicérido, en una base de mol:mol, puede variar de 0,33:1 a 50:1, incluyendo todos los valores, intervalos y subintervalos intermedios como si estuvieran escritos explícitamente. Por ejemplo, la relación de reactivo reductor a triacil glicérido en una base de mol:mol puede ser de 0,5 : 1, 0,6 : 1,0,7 : 1,0,8 : 1,0,9 : 1, 1 : 1,2 : 1,3 : 1,4 : 1,5 : 1, 6 : 1, 7 : 1,8 : 1,9 : 1, 10 : 1,20 : 1,30 : 1,40 : 1, o 50 : 1.
Oxidación
Los alcoholes de los ácidos grasos resultantes de la reducción pueden convertirse en aldehídos realizando una oxidación. El agente oxidante puede ser, por ejemplo, dimetilsulfóxido con un complejo de piridina-trióxido de azufre y diisopropil etil amina; C6 FsSeO2H; perrutenato de tetrapropilamonio; y/o el reactivo peryodinano de Dess-Martin ("DMP"). Se describen reactivos generales para conseguir la reducción en Larock, R. C., Comprehensive Organic Transformations, 2.a edición (1999).
La oxidación puede llevarse a cabo, por ejemplo, a una temperatura que varía de -78 °C a 80 °C, incluyendo todos los valores y subintervalos intermedios como si estuvieran escritos explícitamente. Por ejemplo, la oxidación puede realizarse a -70°C, -60°C, -50°C, -40°C, -30°C, -20°C, - 10°C, 0°C, 10°C, 20°C, 30°C, 40°C, 50°C, 60°C, o 70°C.
La oxidación se realiza preferiblemente en una atmósfera inerte tal como nitrógeno o argón.
La elección del disolvente de reacción puede variar, pero puede incluir, por ejemplo, tetrahidrofurano, éter dietílico, hexano, pentano, tetrahidropirano o cualquier combinación de estos. El disolvente es preferiblemente inerte para el reactivo oxidante. El disolvente es preferiblemente anhidro, aunque puede añadirse agua en cualquier punto durante la oxidación.
La relación del reactivo oxidante al alcohol, en una base de mol:mol, puede variar de 0,33:1 a 50:1, incluyendo todos los valores, intervalos y subintervalos intermedios como si estuvieran escritos explícitamente. Por ejemplo, la relación de reactivo oxidante a alcohol en una base de mol:mol puede ser de 0,5 : 1,0,6 : 1,0,7 : 1,0,8 : 1,0,9 : 1, 1 : 1,2 : 1, 3 : 1,4 : 1, 5 : 1,6 : 1,7 : 1,8 : 1,9 : 1, 10 : 1, 20 : 1,30 : 1,40 : 1, o 50 : 1.
Los ácidos grasos poliinsaturados, ésteres de los mismos, sales de los mismos, aldehídos preparados a partir de los mismos o alcoholes preparados a partir de los mismos pueden enriquecerse por purificación.
Purificación por HPLC/enriquecimiento
Por ejemplo, los ácidos grasos poliinsaturados, sales de los mismos, ésteres de los mismos, aldehídos formados a partir de los mismos y/o alcoholes formados a partir de los mismos (colectivamente "el producto o productos deseados") formados a partir de los mismos, pueden purificarse por cromatografía de líquidos de alto rendimiento usando, por ejemplo, una columna en fase inversa. La columna en fase inversa puede ser, por ejemplo, una columna C8, una columna C18, una columna C19, una columna C20, una columna C21 o una columna C22.
El uno o más productos deseados pueden eluirse con una fase móvil que es un solo disolvente, una mezcla de disolventes o con un gradiente de disolvente empleando dos disolventes. Los disolventes incluyen, aunque sin limitación, acetonitrilo, metanol, etanol, n-propanol, i-propanol, acetona, acetato de etilo, agua, agua con cantidades mínimas (por ejemplo, un 0,001 % - 0,1 % en volumen/volumen) de ácido trifluoroacético o ácido fórmico, hexano, pentano y combinaciones de los mismos. Los productos deseados también pueden eluirse con dióxido de carbono a alta presión o supercrítico.
El uno o más productos deseados pueden detectarse según salen de la columna, por ejemplo, mediante detectores de uv-visible, series de diodos, índice de refracción y/o fluorescencia.
El uno o más productos deseados pueden recogerse en fracciones (por ejemplo, en tubos de ensayo) en un colector de fracciones, y después pueden concentrarse por eliminación del disolvente, a presión reducida o, como alternativa, soplando una atmósfera inerte sobre las fracciones recogidas, para producir un aceite enriquecido en el o los productos deseados.
Purificación por Chromatotron®/enriquecimiento
Otra manera de concentrar el producto o productos deseados en el aceite es purificar el producto o productos deseados con un Chromatotron®. El Chromatotron® es un cromatógrafo preparativo, de capa fina radial, acelerado deforma centrífuga. El aceite en bruto se carga en el Chromatotron®, opcionalmente en presencia de uno o más disolventes tales como dimetilsulfóxido, N,N-dimetilformamida, acetona, acetato de etilo, hexano, metanol, etanol, propanol, tetrahidrofurano, éter dietílico, pentano, diclorometano, cloroformo y tetrahidropirano. La placa radial del Chromatotron® puede recubrirse con una fase estacionaria que separa el medio que puede ser gel de sílice, alúmina y/o gel de sílice impregnado con nitrato de plata.
El uno o más productos deseados pueden recogerse en fracciones (por ejemplo, en tubos de ensayo), y después pueden concentrarse por eliminación del disolvente presión reducida o, como alternativa, soplando una atmósfera inerte sobre las fracciones recogidas, para producir un aceite enriquecido en el o los productos deseados.
Cromatografía en columna
Otra manera de concentrar el producto o productos deseados en el aceite es purificar los productos deseados con cromatografía en columna. Una columna se compacta con una fase estacionaria tal como gel de sílice, alúmina y/o gel de sílice impregnado con nitrato de palta, y se humedece con un disolvente o una mezcla de disolventes. El aceite que contiene el o los productos deseados se carga en la columna, y se eluye con uno o más disolventes de fase móvil tales como dimetilsulfóxido, N,N-dimetilformamida, acetato de etilo, hexano, metanol, acetona, etanol, propanol, tetrahidrofurano, éter dietílico, pentano, diclorometano, cloroformo y tetrahidropirano.
El uno o más productos deseados pueden recogerse en fracciones (por ejemplo, en tubos de ensayo), y después pueden concentrarse por eliminación del disolvente presión reducida o, como alternativa, soplando una atmósfera inerte sobre las fracciones recogidas, para producir un aceite enriquecido en el o los productos deseados.
Destilación fraccionada molecular al vacío/enriquecimiento
Otra manera de concentrar el producto o productos deseados en el aceite es purificar el producto o productos deseados con destilación fraccionada El aceite se coloca en un matraz de calentamiento, y el matraz se calienta, opcionalmente a presión reducida. En un ejemplo, el o los productos deseados se convierte en fase de vapor cuando se alcanzan sus puntos de ebullición y pasan a través de una columna de fraccionamiento, se condensan en un condensador y se recogen en un matraz de recepción. En un ejemplo alternativo, el o los productos deseados permanecen en el matraz de calentamiento y las impurezas se destilarán del producto o productos deseados.
La destilación fraccionada puede llevarse a cabo a una temperatura que varía de, por ejemplo, 40 °C a 500 °C, incluyendo todos los valores y subintervalos intermedios como si estuvieran escritos explícitamente. Por ejemplo, la destilación fraccionada puede llevarse a cabo a 50°C, 60°C, 70°C, 80°C, 90°C, 100°C, 110°C, o 120°C, 130°C, 140°C, 150°C, 160°C, 170°C, 180°C, 190°C, 200°C, 210°C, 220°C, 230°C, o 240°C, 250°C, 260°C, 270°C, 280°C, 290°C, 300°C, 310°C, 320°C, 330°C, 340°C, 350°C, o 360°C, 370°C, 380°C, 390°C, 400°C, 410°C, 420°C, 430°C, 440°C, 450°C, 460°C, 470°C, 480°C, o 490°C.
La destilación fraccionada se realiza preferiblemente a presión reducida. La presión reducida puede variar de 0,0001 atmósferas a 0,9 atmósferas, incluyendo todos los valores y subintervalos intermedios como si estuvieran escritos explícitamente. Una atmósfera se abrevia ''atm'' y equivale a 101,325 Pa. La presión reducida puede ser, por ejemplo, 0,001 atm, 0,01 atm, 0,1 atm, 0,2 atm, 0,3 atm, 0,4 atm, 0,5 atm, 0,6 atm, 0,7 atm o 0,8 atm.
Cristalización de aductos de urea
Otra manera de concentrar el producto o productos deseados en el aceite es purificar el producto o productos deseados con precipitación de urea y/o cristalización de aductos de urea. En esta, el aceite que contiene el producto o productos deseados se disuelve en un disolvente, por ejemplo, metanol. El disolvente, por ejemplo, metanol, se calienta, por ejemplo, hasta un intervalo de 40 °C a 70 °C, incluyendo todos los valores y subintervalos intermedios como si estuvieran escritos explícitamente. Por ejemplo, la solución en metanol del aceite que contiene los productos deseados puede calentarse hasta 45 °C, 50 °C, 55 °C, 60 °C o 65 °C o 70 °C. Entonces se disuelve urea en la mezcla de aceite y disolvente calentada. La cantidad de urea, en una base de 100 mg de aceite, puede variar de 1 g a 6 g de urea, incluyendo todos los valores y subintervalos intermedios como si estuvieran escritos explícitamente. Por ejemplo, por 100 mg de aceite, la cantidad de urea puede ser 1,5 g, 2,0 g, 2,5 g, 3,0 g, 3,5 g, 4,0 g, 4,5 g, 5,0 g o 5,5 g. La solución resultante se enfría, por ejemplo, hasta 0 °C, o 5 °C, o 10 °C, o 15 °C, o 20 °C, y después de que pase un periodo de tiempo, por ejemplo, 1 hora, o 2 horas, o 3 horas, o 4 horas, o 5 horas, o 6 horas, o 7 horas, o 8 horas, se centrifuga la combinación de precipitado resultante/solución. Después de la centrifugación, el disolvente, por ejemplo, metanol, se elimina, y el o los productos deseados se extraen del precipitado usando, por ejemplo, pentano, hexano, y/o heptano. Puede realizarse más de una extracción, por ejemplo, 2, 3, 4 o 5 extracciones. Los extractos resultantes de pentano, hexano y/o heptano se concentran para eliminar el pentano, hexano y/o heptano produciendo de ese modo aceites enriquecidos en el o los productos deseados.
Se hace referencia a los contenidos de las solicitudes de Estados Unidos n.° 12/729013 y 61/296456 en la presente memoria en sus totalidades.
Enriquecimiento de aceite microbiano a partir de biomasa
Otro aspecto de los métodos y sistemas descritos en la presente memoria es la capacidad de extraer y purificar aceites microbianos a partir de una biomasa microbiana. Los métodos divulgados en la presente memoria de extracción de aceites microbianos a partir de biomasa microbiana comprenden un proceso personalizado de mezcla y calentamiento de la biomasa con un alcohol y una base para producir ésteres de ácidos grasos poliinsaturados. La biomasa se separa en una fase sustancialmente líquida y una fase sustancialmente sólida. La fase sustancialmente líquida se purifica adicionalmente recuperando una fracción que comprende los ésteres de ácidos grasos poliinsaturados.
Los sistemas y métodos divulgados en la presente memoria pueden comenzar con biomasa húmeda, reduciendo los costes de secado y drenado. Se conoce en la técnica la extracción de aceite a partir de masa de algas secada usando hexano como disolvente. Este proceso requiere mucha energía. El uso de calor para secar y hexano para la extracción produce un producto de menor calidad ya que este tipo de procesamiento provoca degradación de los lípidos. Por tanto, extraer y purificar aceites microbianos de una biomasa microbiana proporciona una alternativa rentable a los métodos tradicionales.
Tradicionalmente, los aceites microbianos se purifican y enriquecen a partir de aceite crudo en lugar de directamente a partir de biomasa. No se usaba biomasa como material de partida para la extracción de aceite microbiano porque era difícil de producir. Era difícil separar la biomasa de algas del caldo de fermentación de algas. El caldo de fermentación de algas es una fuerte emulsión en una forma similar a leche agria. Esto hace que sea difícil separar la biomasa del caldo de fermentación de algas, si no factible. Los tensioactivos generados durante el proceso de fermentación en general son responsables de la emulsión. Se consideró ineficaz extraer aceite de la biomasa del caldo de fermentación a causa de la baja tasa de recuperación de aceite debido a emulsión. Como resultado, el material de partida para la extracción de aceites microbianos es aceite crudo en lugar de biomasa.
Sorprendentemente, el proceso novedoso de separación de biomasa divulgado en la presente invención provoca más de un 90 % de recuperación de aceite. La pequeña cantidad de lípidos en la biomasa restante (o denominada bioharina o biomasa usada) permanece útil como suministro.
El proceso propuesto de separación de biomasa implica romper la emulsión añadiendo alcohol al caldo de algas para fracturar la emulsión. En una realización preferida, el alcohol usado en la reacción es etanol. En otra realización, el etanol es 0,3-1,0 en volumen del caldo de algas de partida. En otra realización, el etanol es 0,3-0,5 en volumen del caldo de algas de partida. Después de mezclar el alcohol con el caldo de algas, la mezcla se centrifuga para separar una fase de biomasa y una fase de sobrenadante. La fase de biomasa se procesa adicionalmente para producir aceites microbianos enriquecidos. La figura 1 proporciona una visión global esquemática de las etapas implicadas en las realizaciones ejemplares de métodos usados en la separación de biomasa de caldo de algas, y el enriquecimiento de aceites microbianos de biomasa, que se describirá a continuación.
En algunas realizaciones de la invención, un método de extracción de aceite de una biomasa de algas comprende hacer reaccionar la biomasa con un alcohol y un catalizador de base para producir ésteres de ácidos grasos poliinsaturados.
Los alcoholes adecuados para su uso en la presente invención incluyen cualquier alcohol de alquilo inferior que contenga de 1-6 átomos de carbono (es decir, un alcohol de alquilo C1-6). En determinadas realizaciones, el alcohol es etanol o metanol. En estas realizaciones, los ésteres de ácidos grasos poliinsaturados producidos son un éster metílico y un éster etílico de los ácidos grasos poliinsaturados, respectivamente. En el proceso de la presente invención, el alcohol típicamente comprende entre 2 y 5 veces el peso de la biomasa. En algunas realizaciones, el alcohol comprende aproximadamente 4 veces el peso de la biomasa. En determinadas realizaciones, la biomasa y la base pueden añadirse a etanol puro o metanol puro. En general, la cantidad de alcohol usada puede variar con la solubilidad del aceite o composición que contiene triglicéridos que tienen residuos de ácidos grasos poliinsaturados en el alcohol.
Puede usarse en la presente invención cualquier base conocida en la técnica como adecuada para su uso como reactivo. Las bases de fórmula RO-M, en la que M es un elemento metálico y R es un hidrógeno o un alcohol de alquilo C1-6, son particularmente adecuados para la presente invención. Ejemplos de bases adecuadas incluyen hidróxido de potasio, hidróxido de sodio y etóxido de sodio. En algunas realizaciones, la base es hidróxido de potasio. En procesos de la presente invención, la base se añade típicamente en una cantidad entre aproximadamente un 5 % en peso de equivalentes de la biomasa a la etapa de reacción con la composición y el alcohol. En determinadas realizaciones, la base se añade típicamente en una cantidad de aproximadamente un 2,5 % en peso de equivalentes de la biomasa a la etapa de reacción con la composición y el alcohol.
La biomasa que comprende triglicéridos que tienen residuos de ácidos grasos poliinsaturados, el alcohol y la base se hacen reaccionar juntos a una temperatura y durante una cantidad de tiempo que permitan la producción de un éster entre los residuos de ácido graso y el alcohol. Los tiempos y temperaturas de reacción adecuados pueden determinarlos los expertos en la materia para producir un éster. Si la intención de limitarse a teoría alguna, se cree que los ácidos grasos, incluyendo los PUFA, se escinden de la cadena principal de glicerol del triglicérido y los ésteres de cada ácido graso se forman durante la etapa de reacción. En determinadas realizaciones, la etapa de reacción de la composición en presencia de un alcohol y una base se realiza a una temperatura de aproximadamente 60 °C a aproximadamente 120 °C, de aproximadamente 70 °C a aproximadamente 110 °C, de aproximadamente 75 °C a aproximadamente 100 °C o de aproximadamente 80 °C a aproximadamente 90 °C. En otras realizaciones, la etapa de reacción de la composición en presencia de un alcohol y una base se realiza a una temperatura de aproximadamente 75 °C, 80 °C, 85 °C, 90 °C o 95 °C. En algunas realizaciones, la etapa de reacción de la composición en presencia de un alcohol y una base se realiza durante un tiempo de aproximadamente 2 horas a aproximadamente 12 horas, de aproximadamente 3 horas a aproximadamente 11 horas, de aproximadamente 4 horas a aproximadamente 10 horas, de aproximadamente 5 horas a aproximadamente 9 horas o de aproximadamente 6 horas a aproximadamente 8 horas. En determinadas realizaciones, la etapa de reacción de la composición en presencia de un alcohol y una base se realiza durante aproximadamente 5,5, 6, 6,5, 7, 7,5, 8, 8,5, 9, 9,5 o 10 horas.
En una realización, la etapa de reacción de la composición de aceite, alcohol y base puede realizarse calentando a reflujo los componentes para producir los ésteres de PUFA. En realizaciones adicionales, la etapa de reacción de la composición de aceite puede realizarse a una temperatura que no provoque el reflujo de los componentes de reacción. Por ejemplo, realizar la etapa de reacción de la composición de aceite a presiones mayores de la presión atmosférica puede aumentar el punto de ebullición de los disolventes presentes en la mezcla de reacción. En dichas condiciones, la reacción puede producirse a una temperatura a la que los disolventes no hervirían a presión atmosférica, pero no provocaría el reflujo de los componentes de reacción. En algunas realizaciones, la reacción se realiza a una presión de aproximadamente 5 a aproximadamente 20 libras por pulgada cuadrada (psi) (137,89 kPa); de aproximadamente 7 (48,26) a aproximadamente 15 psi (103,42 kPa); o de aproximadamente 9 (62,05) a aproximadamente 12 psi (82,73 kPa). En determinadas realizaciones, la reacción se realiza a una presión de aproximadamente 7, 8, 9, 10, 11 o 12 psi (48,26, 55,15, 62,05, 68,94, 75,84 u 82,73 kPa). Las reacciones realizadas a presión pueden realizarse a las temperaturas de reacción enumeradas anteriormente. En algunas realizaciones, las reacciones realizadas a presión pueden realizarse a aproximadamente 70 °C, 75 °C, 80 °C, 85 °C o 90 °C.
La mezcla de reacción que comprende ésteres de PUFA puede procesarse adicionalmente para obtener los ésteres de PUFA de la mezcla. En una realización, los ésteres de PUFA pueden separarse de la mezcla de reacción destilando la composición para recuperar una fracción que comprende el éster del ácido graso poliinsaturado. De esta manera, puede separarse una fracción diana de la mezcla de reacción que incluye ésteres de PUFA de interés de la mezcla de reacción y recuperarse. Pueden encontrarse detalles de este método en una parte anterior de esta solicitud, en la subsección titulada "Destilación fraccionada molecular al vacío/enriquecimiento". En otra realización, los ésteres de PUFA se someten a una etapa de cristalización de urea. Cuando la urea cristaliza en una solución que contiene ésteres de PUFA (por ejemplo, ésteres de DHA) y ésteres de ácidos grasos saturados formados por la transesterificación de una fuente de glicérido usando las técnicas analizadas anteriormente, se forma un precipitado que comprende la urea y al menos una parte de los ésteres de ácidos grasos saturados. Este precipitado, sin embargo, comprende una fracción sustancialmente menor de los ésteres de PUFA que la mezcla de reacción inicial. El grueso de los ésteres de PUFA en su lugar permanecen en solución y, por lo tanto, pueden separarse fácilmente de los ésteres de ácidos grasos saturados precipitados. Pueden encontrarse detalles de este método en una parte anterior de esta solicitud, en la subsección titulada "Cristalización de aductos de urea".
Las especies de microalgas que pueden usarse con el método de enriquecimiento descrito en la presente invención no se limitan a Schizochytrium sp. En algunas realizaciones, los organismos incluyen los seleccionados del grupo que consiste en algas doradas (tales como microorganismos del reino Stramenopiles), algas verdes, diatomeas, dinoflagelados (tales como microorganismos del orden Dinophyceae, incluyendo miembros del género Crypthecodinium tales como, por ejemplo, Crypthecodinium cohnii), levaduras y hongos de los géneros Mucor y Mortierella, incluyendo, aunque sin limitación, Mortierella alpina y Mortierella sect. schmuckeri. Miembros del grupo microbiano Stramenopiles incluyen microalgas y microorganismos similares a algas, incluyendo los siguientes grupos de microorganismos: Hamatores, Proteromonadales, Opalinas, Develpayella, Diplophrys, Labrintúlidos, Traustoquitridios, Biosecidos, Oomicetos, Hipoquitridiomicetos, Commation, Reticulosphaera, Pelagomonas, Pelagococcus, Ollicola, Aureococcus, Parmales, Diatomeas, Xantofitos, Feofitos (algas pardas), Eustigmatofitos, Rafidofitos, Sinúridos, Axodinos (incluyendo Rhizochromulinaales, Pedinellales, Dictyochales), Crisomeridales, Sarcinocrisidales, Hidrurales, Hibberdiales y Cromulinales. Los traustoquitridios incluyen los géneros Schizochytrium (las especies incluyen aggregatum, limnaceum, mangrovei, minutum, octosporum), Thraustochytrium (las especies incluyen arudimentale, aureum, benthicola, globosum, kinnei, motivum, multirudimentale, pachydermum, proliferum, roseum, striatum), Ulkenia (las especies incluyen amoeboidea, kerguelensis, minuta, profunda, radiate, sailens, sarkariana, schizochytrops, visurgensis, yorkensis), Aplanochytrium (las especies incluyen haliotidis, kerguelensis, profunda, stocchinoi), Japonochytrium (las especies incluyen marinum), Althornia (las especies incluyen crouchii) y Elina (las especies incluyen marisalba, sinorifica). Los labrintúlidos incluyen los géneros Labyrinthula (las especies incluyen algeriensis, coenocystis, chattonii, macrocystis, macrocystis atlantica, macrocystis macrocystis, marina, minuta, roscoffensis, valkanovii, vitellina, vitellina pacifica, vitellina vitellina, zopfi), Labyrinthomyxa (las especies incluyen marina), Labyrinthuloides (las especies incluyen haliotidis, yorkensis), Diplophrys (las especies incluyen archeri), Pyrrhosorus* (las especies incluyen marinus), Sorodiplophrys* (las especies incluyen stereorea), Chlamydomyxa* (las especies incluyen labyrinthuloides, montana). (* = no hay consenso general actualmente sobre la colocación taxonómica exacta de estos géneros).
Habiendo descrito esta invención en líneas generales, puede obtenerse una comprensión adicional por referencia a los ejemplos proporcionados en la presente memoria.
Ejemplo 1
Aislamiento de microorganismos
Se recogieron muestras de hábitats intermareales durante la marea baja, incluyendo bahías y estuarios a lo largo de la costa occidental de Norteamérica (California, Oregón y Washington) y Hawái. El agua, los sedimentos, el material vegetal vivo y las plantas en descomposición/desechos animales se colocaron en tubos estériles de 50 ml. Se extendieron partes de cada muestra con el agua sobre placas de agar sólido de medio de aislamiento. El medio de aislamiento consistía en: 500 ml de agua de mar artificial, 500 ml de agua destilada, 1 g de glucosa, 1 g de glicerol, 13 g de agar, 1 g de glutamato, 0,5 g de extracto de levadura, 0,5 g hidrolizado de caseína, 1 ml de una solución de vitaminas (100 mg/l de tiamina, 0,5 mg/l de biotina, 0,5 mg de B12), 1 ml de una solución de oligominerales (metales PII, que contiene por litro: 6,0 g de FeCh6H2O, 6,84 g de H3BO3, 0,86 g de MnCh4H2O, 0,06 g de ZnCl2, 0,026 de CoCl26H2O, 0,052 g de MSO4H2O, 0,002 g de CuSO45H2O y 0,005 g de Na2MoO42H2O), y 500 mg de cada uno de penicilina G y sulfato de estreptomicina. Las placas de agar se incubaron en la oscuridad a 20-25 °C. Después de 2­ 4 días, las placas de agar se examinaron bajo un aumento, y se cogieron colonias de células con un mondadientes estéril y se volvieron a sembrar en estrías en una placa nueva de medio. Las células se sembraron en estrías repetidamente en medio nuevo hasta que se eliminaron los organismos contaminados. Dos de los microorganismos aislados se depositaron según los accesos de ATCC n.° PTA-10212 y PTA-10208.
Características taxonómicas del microorganismo aislado depositado según el acceso de ATCC n.° PTA-10212
Los cultivos del microorganismo aislado depositado según el acceso de ATCC n.° PTA-10212 ("PTA-10212") tenían el aspecto de colonias blancas, húmedas y esparcidas sin soros aislados visibles.
Se hizo crecer PTA-10212 en FFM sólido y líquido, KMV sólido, suspensión espesa KMV (1 %), caldo KMV y caldo MH para examinar adicionalmente las características de crecimiento. Se observó que PTA-10212 crecía rápidamente en KMV y MH. Véase, por ejemplo, Porter D., 1989. Phylum Labyrinthulomycota. En Margulis, L., Corliss, J.O., Melkonian, M., Chapman, D.J. (Eds.) Handbook of Protoctista, Jones y Bartlett, Boston, pág. 388-398 (KMV); Honda et al., Mycol. Res. 102:439-448 (1998) (MH); y la patente de Estados Unidos n.° 5130242 (FFM), que se incorporan cada uno de ellos en la presente memoria por referencia en su totalidad.
Se hicieron las siguientes observaciones después del crecimiento de PTA-10212 durante varios días en medio FFM sólido, después de 72 horas de crecimiento en medio KMV y caldo MH. Los esporangios no se agruparon en/sobre ningún medio y eran muy pequeños (5-10 gm). PTA-10212 no mostró las abundantes tétradas características de los patrones de escisión de Schizochytrium. Aparecieron células amoeboides aproximadamente 24 horas después de la transferencia a medio sólido nuevo. Estas células ameboides desparecieron a los pocos días y no fueron evidentes en medio líquido o de suspensión espesa. A diferencia de Aurantiochytrium, descrito por Yokoyama, R. et al., Mycoscience 48(6): 329-341 (2007), que tiene el aspecto de "pequeños granos de arena sobre el fondo del matraz" cuando se hacía crecer en medio líquido, PTA-10212 no sedimentó en el fondo del matraz, sino que se suspendió en medio líquido KMV y MH. Los esporangios no eran tan densos como los típicos de Schizochytrium u Oligochytrium, que también tienen redes ectoplásmicas robustas que estaban ausentes de PTA-10212. Aunque la mayoría de especies experimentan escisión vegetativa de pequeños esporangios o células asimilativas mediante la división de un esporangio más grande durante varias horas, PTA-10212 formaba células asimilativas alargadas con forma de mancuerna, que después formaban un istmo delgado que se estiraba según se separaban los extremos de la mancuerna. Las células resultantes parecían ser células asimilativas pequeñas. No se observó transformación directa de una célula ameboide en la célula asimilativa con forma de mancuerna. Se observaron zoosporas biflageladas típicas nadando, pero eran relativamente infrecuentes. PTA-10212 no se dividía prolíficamente por escisión vegetativa. No se observó liberación directa de zoosporas, aunque se observaron zoosporas nadando. Las células vegetativas eran muy pequeñas (2 gm a 5 gm).
PTA-10212 se examinó adicionalmente usando la técnica de flujo directo, en que se prepararon portaobjetos de microscopio suspendiendo una pequeña parte de una colonia que había crecido en agar en una gota de agua de mar diluida al 50 %. Con esta técnica, se observaron esporangios primarios globosos y de aproximadamente 10 gm de diámetro. Las paredes eran muy delgadas y no se observaban restos cuando se iniciaba la división binaria del protoplasto. La división binaria repetida produjo 8-16 esporangios secundarios más pequeños (4-5 gm de diámetro). Los esporangios secundarios permanecieron quiescentes durante varias horas antes de liberar de nuevo un protoplasto amorfo. El protoplasto amorfo se dividió por pellizco y tirón, produciendo inicialmente estados intermedios con forma de mancuerna típicos y produciendo finalmente 4-8 cuerpos globosos pequeños de 2,5-2,8 gm de diámetro. Los últimos reposaron durante varios minutos hasta 1-2 horas, después cambiaron de forma (alargados) y se convirtieron en zoosporas biflageladas, 2,3-2,5 x 3,7-3,9 gm. Las zoosporas eran abundantes y podían medirse de forma precisa cuando entraban en reposo. Las zoosporas entonces se redondeaban y empezaban un nuevo ciclo de desarrollo. Las zoosporas eran más grandes que Sicyoidochytrium minutum y más pequeñas que Ulkenia visurgensis.
PTA-10212 se caracterizó adicionalmente basándose en la similitud de su gen de ARNr 18s con el de especies conocidas. Se preparó ADN genómico de PTA-10212 por procedimientos convencionales. Véase, por ejemplo, Sambrook J. y Russell D. 2001. Molecular cloning: A laboratory manual, 3.a edición. Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, Nueva York. En resumen: (1) se centrifugaron 500 gl de células a partir de un cultivo semilogarítmico. Las células se volvieron a centrifugar y todos los rastros de líquido se retiraron del sedimento celular con una puntas de bajo calibre; (2) los sedimentos se resuspendieron con 200 gl de tampón de lisis (Tris 20 mM pH 8,0, 125 gg/ml de proteinasa K, NaCl 50 mM, EDTA 10 mM pH 8,0, SDS al 0,5 %); (3) las células se lisaron a 50 °C durante 1 hora; (4) la mezcla de lisis se pipeteó en tubos de 2 ml de gel de sincronización de fase (PLG-Eppendorf); (5) se añadió un volumen igual de P:C:I y se dejó mezclar durante 1,5 horas; (6) los tubos se centrifugaron a 12000 x g durante 5 minutos; (7) la fase acuosa se retiró de encima del gel dentro del tubo PLG y se añadió un volumen igual de cloroformo a la fase acuosa, y se mezcló durante 30 minutos; (8) los tubos se centrifugaron a 14000 x g durante aproximadamente 5 minutos; (9) la capa superior (fase acuosa) se pipeteó del cloroformo, y se colocó en un tubo nuevo; (10) se añadió 0,1 volumen de NaOAC 3 M y se mezcló (se invirtió varias veces); (11) se añadieron 2 volúmenes de EtOH al 100 % y se mezclaron (se invirtieron varias veces) con formación de precipitante de ADN genómico en esta fase; (12) los tubos se centrifugaron a 4 °C en una microcentrifugadora a 14000 x g durante aproximadamente 15 minutos; (13) el líquido se vertió suavemente con el ADN genómico restante en el fondo del tubo; (14) se lavó el sedimento con 0,5 ml de EtOH al 70 %; (15) los tubos se centrifugaron a 4 °C en una microcentrifugadora a 14000 x g durante aproximadamente 5 minutos; (16) el EtOH se vertió suavemente y el sedimento de ADN genómico se secó; y (17) se añadió un volumen adecuado de H2O y RNasa directamente al sedimento de ADN genómico. La amplificación por PCR del gen de ARNr 18s se realizó con cebadores descritos previamente (Honda etal., J. Euk. Micro. 46(6): 637­ 647 (1999). Las condiciones de PCR con molde de ADN cromosómico fueron las siguientes: 0,2 gM de dNTP, 0,1 gM de cada cebador, DMSO al 8 %, 200 ng de ADN cromosómico, 2,5 U de ADN polimerasa Herculase® II Fusion (Stratagene) y tampón Herculase® (Stratagene) en un volumen total de 50 gl. El protocolo de PCR incluía las siguientes etapas: (1) 95 °C durante 2 minutos; (2) 95 °C durante 35 segundos; (3) 55 °C durante 35 segundos; (4) 72 °C durante 1 minuto y 30 segundos; (5) repetir las etapas 2-4 durante 30 ciclos; (6) 72 °C durante 5 minutos; y (7) mantenimiento a 4 °C.
La amplificación por PCR produjo un producto de ADN distinto con el tamaño esperado usando el molde cromosómico descrito anteriormente. El producto de PCR se clonó en el vector pJET1.2/romo (Fermentas) de acuerdo con las instrucciones del fabricante, y se determinó la secuencia de la inserción usando cenadores convencionales aportados.
El análisis filogenético sitúa PTA-10212 dentro del linaje que incluye Thraustochytrium pachydermum y Thraustochytrium aggregatum con respaldo moderado. Los esporangios de T. pachydermum tiene paredes celulares muy gruesas. T. aggregatum forma grupos claramente visibles de soros que son opacos. PTA-10212 no muestra ninguna de estas características. La presencia de muchas células ameboides se ha descrito en otros taxones, tales como Ulkenia, T. gaertnerium, A. limiacinum, y S. mangrovei; sin embargo, las descripciones asociadas con esos taxones difieren de las características observadas del aislado. Además, PTA-10212 no mostraba afinidad filogenética hacia ninguno de estos taxones.
La tabla 3 muestra una comparación de la secuencia de ARNr 18s del microorganismo depositado según el acceso de ATCC n.° PTA-10212 con las secuencias de ADN de la base de datos electrónica del National Center for Biotechnology Information (NCBI). El porcentaje de identidad se determinó usando dos cálculos diferentes. El "cálculo n.° 1" tiene en consideración cualquier "hueco" que se produzca en las secuencias, de regiones no homólogas o secuencia parcial (ajustes por defecto de AlignX-VectorNTI). El "cálculo n.° 2" no incluye penalizaciones calculadas para los huecos (ajuste de matriz de "IDENTIDAD" de AlignX-VectorNTI).
Tabla 3: Comparación de secuencias de ARNr 18s
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Como se muestra en la tabla 3, se descubrió que, en términos de % de identidad, la secuencia génica de ARNr 18s (SEQ ID NO:1) del microorganismo depositado según el acceso de ATCC n.° PTA-10212 está relacionada, aunque no es idéntica, con las secuencias génicas de ARNr 18s disponibles en la base de datos del NCBI. En general se reconoce que los organismos pueden tener secuencias génicas de ARNr 18s muy relacionadas, aunque pertenezcan a un género o especie diferente.
Basándose en la caracterización anterior, se cree que el microorganismo aislado depositado según el acceso de ATCC n.° PTA-10212 representa una nueva especie Thraustochytrium y, por lo tanto, también se denomina Thraustochytrium sp. ATCC PTA-10212.
Características taxonómicas del microorganismo aislado depositado según el acceso de ATCC n.° PTA-10208
El microorganismo depositado según el acceso de ATCC n.° PTA-10208 ("PTA-10208") se identificó como un subaislado (una célula individual aislada de un cultivo y mantenido como un nuevo cultivo separado y distinto) del microorganismo depositado según el acceso de ATCC n.° PTA-9695 ("PTA-9695"), descrito en la solicitud de Estados Unidos n.° 12/407687 y el documento PCT/US2009/001720, que se incorporan cada uno de ellos en la presente memoria por referencia en su totalidad.
PTA-10208 comparte características taxonómicas con PTA-9695. Se descubrió que PTA-9695 tiene zoosporas biflageladas en descarga que nadan activamente desde el esporangio maduro, cuyos restos de la pared eran claramente visibles (en contraste de fases) después de la liberación de esporas. Los esporangios de PTA-9695 medían de 12,5 pm a 25 pm de diámetro, y las zoosporas eran de 2,5 pm a 2,8 pm x 4,5 pm a 4,8 pm de tamaño. Había de 8 a 24 esporas por esporangio individual de PTA-9695. Las zoosporas sedimentadas de PTA-9695 se alargaban y experimentaban rápidamente divisiones binarias que daban lugar a tétradas, óctadas y finalmente a grupos de esporangios. La formación de tétradas comenzó en un estado muy inicial antes de la madurez de los esporangios. Estas características están de acuerdo con el género Schizochytrium. En términos de % de identidad, se descubrió que la secuencia génica del ARNr 18s de PTA-9695 (SEQ ID NO:2), que comparte con PTA-10208, estaba muy relacionada, aunque no era idéntica, a la secuencia génica de ARNr 18s de T. aggregatum proporcionada en Honda, D, etal., J. Euk. Micro.46(6): 637-647 (1999). La secuencia de ARNr 18s publicada para Thraustochytrium aggregatum es una secuencia parcial, con un huevo de aproximadamente 71 nucleótidos de ADN en el centro de la secuencia. Se cree que PTA-9695 representa una nueva especie Schizochytrium. Por tanto, el subaislado PTA-10208 también se denomina Schizochytrium sp. ATCC PTA-10208.
Ejemplo 2
Características de crecimiento del microorganismo aislado depositado según el acceso de ATCC n.° PTA-10212
El microorganismo aislado depositado según el acceso de ATCC n.° PTA-10212 se examinó para las características de crecimiento en ciclos de fermentación individuales, como se describe a continuación. Los medios y condiciones de cultivo típicos se muestran en la tabla 1.
En cultivos con aporte de carbono (glicerol) y nitrógeno con 1000 ppm de Cl- a 22,5 °C con oxígeno disuelto al 20 % a pH 7,3, PTA-10212 produjo un peso celular seco de 26,2 g/l después de 138 horas de cultivo en un volumen de termentador de 10 l. La producción de lípidos fue de 7,9 g/l; la producción de omega-3 fue de 5,3 g/l; la producción de EPA fue de 3,3 g/l; y la producción de DHA fue de 1,8 g/l. El contenido de ácidos grasos fue de un 30,3 % en peso; el contenido de EPA fue de un 41,4 % de ésteres metílicos de ácido graso (FAME); y el contenido de DHA fue de un 26,2 % de FAME. La productividad de lípidos fue de 1,38 g/l/día, y la productividad de omega-3 fue de 0,92 g/l/día en estas condiciones, con 0,57 g/l/día de productividad de EPA y 0,31 g/l/día de productividad de DHA.
En cultivos con aporte de carbono (glicerol) y nitrógeno con 1000 ppm de Cl- a 22,5 °C con oxígeno disuelto al 20 % a pH 7,3, PTA-10212 produjo un peso celular seco de 38,4 g/l después de 189 horas de cultivo en un volumen de fermentador de 10 l. La producción de lípidos fue de 18 g/l; la producción de omega-3 fue de 12 g/l; la producción de EPA fue de 5 g/l; y la producción de DHA fue de 6,8 g/l. El contenido de ácidos grasos fue de un 45 % en peso; el contenido de EPA fue de un 27,8 % de FAME; y el contenido de DHA fue de un 37,9 % de FAME. La productividad de lípidos fue de 2,3 g/l/día, y la productividad de omega-3 fue de 1,5 g/l/día en estas condiciones, con 0,63 g/l/día de productividad de EPA y 0,86 g/l/día de productividad de DHA.
En cultivos con aporte de carbono (glicerol) y nitrógeno con 1000 ppm de Cl- a 22,5 °C con oxígeno disuelto al 20 % a pH 6,8-7,7, PTA-10212 produjo un peso celular seco de 13 g/l después de 189 horas de cultivo en un volumen de fermentador de 10 l. La producción de lípidos fue de 5,6 g/l; la producción de omega-3 fue de 3,5 g/l; la producción de EPA fue de 1,55 g/l; y la producción de DHA fue de 1,9 g/l. El contenido de ácidos grasos fue de un 38 % en peso; el contenido de EPA fue de un 29,5 % de FAME; y el contenido de DHA fue de un 36 % de FAME. La productividad de lípidos fue de 0,67 g/l/día, y la productividad de omega-3 fue de 0,4 g/l/día en estas condiciones, con 0,20 g/l/día de productividad de EPA y 0,24 g/l/día de productividad de DHA.
En cultivos con aporte de carbono (glicerol) y nitrógeno con 1000 ppm de Cl- a 22,5-28,5 °C con oxígeno disuelto al 20 % a pH 6,6-7,2, PTA-10212 produjo un peso celular seco de 36,7 g/l -48,7 g/l después de 191 horas de cultivo en un volumen de fermentador de 10 l. La producción de lípidos fue de 15,2 g/l - 25,3 g/l; la producción de omega-3 fue de 9,3 g/l - 13,8 g/l; la producción de EPA fue de 2,5 g/l - 3,3 g/l; y la producción de DHA fue de 5,8 g/l - 11 g/l. El contenido de ácidos grasos fue de un 42,4 % - 53 % en peso; el contenido de EPA fue de un 9,8 % - 22 % de FAME; y el contenido de DHA fue de un 38,1 % - 43,6 % de Fa Me . La productividad de lípidos fue de 1,9 g/l/día - 3,2 g/l/día, y la productividad de omega-3 fue de 1,2 g/l/día - 1,7 g/l/día en estas condiciones, con 0,31 g/l/día - 0,41 g/l/día de productividad de EPA y 0,72 g/l/día - 1,4 g/l/día de productividad de DHA.
Características de crecimiento del microorganismo aislado depositado según el acceso de ATCC n.° PTA-10208
El microorganismo aislado depositado según el acceso de ATCC n.° PTA-10208 se examinó para las características de crecimiento en ciclos de fermentación individuales, como se describe a continuación. Los medios y condiciones de cultivo típicos se muestran en la tabla 2.
En cultivos con aporte de carbono (glucosa) y nitrógeno con 1000 ppm de Cl- a 22,5 °C a pH 7,0 con oxígeno disuelto al 20 % durante el aporte de nitrógeno y oxígeno disuelto al 10 % después de ello, PTA-10208 produjo un peso celular seco de 95 g/l después de 200 horas de cultivo en un volumen de fermentador de 10 l. La producción de lípidos fue de 53,7 g/l; la producción de omega-3 fue de 37 g/l; la producción de EPA fue de 14,3 g/l; y la producción de DHA fue de 21 g/l. El contenido de ácidos grasos fue de un 57 % en peso; el contenido de EPA fue de un 27,7 % de FAME; y el contenido de DHA fue de un 39,1 % de FAME. La productividad de lípidos fue de 6,4 g/l/día, y la productividad de omega-3 fue de 4,4 g/l/día en estas condiciones, con 1,7 g/l/día de productividad de EPA y 2,5 g/l/día de productividad de DHA.
En cultivos con aporte de carbono (glucosa) y nitrógeno con 1000 ppm de Cl- a 22,5 °C a pH 7,5 con oxígeno disuelto al 20 % durante el aporte de nitrógeno y oxígeno disuelto al 10 % después de ello, PTA-10208 produjo un peso celular seco de 56 g/l después de 139 horas de cultivo en un volumen de fermentador de 10 l. La producción de lípidos fue de 53 g/l; la producción de omega-3 fue de 34 g/l; la producción de EPA fue de 11,5 g/l; y la producción de DHA fue de 22 g/l. El contenido de ácidos grasos fue de un 58 % en peso; el contenido de EPA fue de un 21,7% de FAME; y el contenido de DHA fue de un 41,7% de FAME. La productividad de lípidos fue de 9,2 g/l/día, y la productividad de omega-3 fue de 5,9 g/l/día en estas condiciones, con 2 g/l/día de productividad de EPA y 3,8 g/l/día de productividad de DHA.
En cultivos con aporte de carbono (glucosa) y nitrógeno con 1000 ppm de Cl- a 22,5 °C a pH 7,0 con oxígeno disuelto al 20 % durante el aporte de nitrógeno y oxígeno disuelto al 10 % después de ello, PTA-10208 produjo un peso celular seco de 93,8 g/l después de 167 horas de cultivo en un volumen de fermentador de 2000 l. La producción de lípidos fue de 47,2 g/l; la producción de omega-3 fue de 33,1 g/l; la producción de EPA fue de 10,5 g/l; y la producción de DHA fue de 20,4 g/l. El contenido de ácidos grasos fue de un 50,6 % en peso; el contenido de EPA fue de un 23 % de FAME; y el contenido de DHA fue de un 42,6 % de FAME. La productividad de lípidos fue de 6,8 g/l/día, y la productividad de omega-3 fue de 4,7 g/l/día en estas condiciones, con 1,5 g/l/día de productividad de EPA y 2,9 g/l/día de productividad de DHA.
En cultivos con aporte de carbono (glucosa) y nitrógeno con 1000 ppm de Cl- a 22,5 °C a pH 7,0 con oxígeno disuelto al 20 % durante el aporte de nitrógeno y oxígeno disuelto al 10 % después de ello, PTA-10208 produjo un peso celular seco de 105 g/l después de 168 horas de cultivo en un volumen de fermentador de 2000 l. La producción de lípidos fue de 46,4 g/l; la producción de omega-3 fue de 33 g/l; la producción de EPA fue de 10,7 g/l; y la producción de DHA fue de 20,3 g/l. El contenido de ácidos grasos fue de un 43,9 % en peso; el contenido de EPA fue de un 24 % de FAME; y el contenido de DHA fue de un 43,7 % de FAME. La productividad de lípidos fue de 6,6 g/l/día, y la productividad de omega-3 fue de 4,7 g/l/día en estas condiciones, con 1,5 g/l/día de productividad de EPA y 2,9 g/l/día de productividad de DHA.
En cultivos con aporte de carbono (glucosa) y nitrógeno con 1000 ppm de Cl- a 22,5 °C a pH 7,0 con oxígeno disuelto al 20 % durante el aporte de nitrógeno y oxígeno disuelto al 10 % después de ello, PTA-10208 produjo un peso celular seco de 64,8 g/l después de 168 horas de cultivo en un volumen de fermentador de 2000 l. La producción de lípidos fue de 38,7 g/l; la producción de omega-3 fue de 29,9 g/l; la producción de EPA fue de 8,5 g/l; y la producción de DHA fue de 16,7 g/l. El contenido de ácidos grasos fue de un 59,6 % en peso; el contenido de EPA fue de un 23 % de FAME; y el contenido de DHA fue de un 42,3 % de FAm E. La productividad de lípidos fue de 5,53 g/l/día, y la productividad de omega-3 fue de 3,8 g/l/día en estas condiciones, con 1,2 g/l/día de productividad de EPA y 2,3 g/l/día de productividad de DHA.
Ejemplo 3
Perfiles de ácidos grasos de las cepas de los microorganismos ATCC PTA-10208 y PTA-10212
Se analizaron cuatro muestras de biomasa (PTA-10208 Muestra n.° 1; PTA-10208 Muestra n.° 2; PTA-10212 Muestra n.° 1; y PTA-10212 Muestra n.° 2) para el contenido de aceite crudo total por extracción con disolvente, se determinaron las clases de lípidos por cromatografía de líquidos de alto rendimiento/detección de dispersión de luz evaporativa (HPLC/ELSD), se analizó el triacilglicerol (TAG) por HPLC/espectrometría de masas (HPLC/MS) y se determinaron los perfiles de ácidos grasos (FA) por cromatografía de gases con detección por ionización de llama (GC-FID). El contenido de lípido crudo de cada biomasa secada por congelación se determinó usando trituración con disolvente con hexano y se comparó con la suma de FAME (mg/g) generada por transesterificación directa, y los ésteres metílicos de ácido graso resultantes (FAME) se cuantificaron por análisis de GC/FID. Los ácidos grasos en el lípido crudo extraído también se cuantificaron por transesterificación y se cuantificaron usando análisis de GC/FID de los FAME resultantes. El porcentaje ponderal de todos los lípidos neutros (NL) y ácidos grasos libres (FFA) se determinó en el lípido crudo extraído usando HPLC en fase normal con ELSD e identificación con ionización química a presión atmosférica-MS (APCI-MS). El método separa y cuantifica los ésteres de esterol (SE), TAG, ácidos grasos libres (FFA), 1,3-diacilgliceroles (1,3-DAG), esteroles, 1,2-diacilgliceroles (1,2-DAG) y monoacilgliceroles (MAG). Los resultados se muestran en las tablas 4 y 5, a continuación.
Se aislaron TAG y fosfolípidos (PL) de los aceites crudos extraídos de las cuatro muestras de biomasa (PTA-10208 Muestra n.° 1; Pt A-10208 Muestra n.° 2; PTA-10212 Muestra n.° 1; y PTA-10212 Muestra n.° 2). Se aisló Ta G usando cromatografía ultrarrápida a baja presión y se aisló PL usando extracción en fase sólida (SPE). La identidad de cada fracción aislada se confirmó por cromatografía en capa fina (TLC). Los perfiles de ácidos grasos de las fracciones de TAG y PL aisladas se determinaron después de transesterificación directa usando GC-FID como FAME. Los resultados se muestran en las tablas 6 y 7, a continuación.
El contenido de aceite crudo total y los perfiles de ácidos grasos de las clases de lípidos aisladas también se determinaron para dos muestras adicionales de biomasa de la cepa del microorganismo ATCC PTA-10212 (PTA-10212 Muestra n.° 3 y PTA-10212 Muestra n.° 4). El aceite crudo se obtuvo de cada muestra por extracción con hexano, y las clases de lípidos individuales se aislaron usando cromatografía ultrarrápida a baja presión. Los perfiles de ácidos grasos de la biomasa, aceite crudo y fracciones aisladas se determinaron usando GC-FID como FAME. Los resultados se muestran en las tablas 8-11, a continuación.
Las clases de lípidos individuales se aislaron de una muestra de aceite crudo de la cepa del microorganismo ATCC PTA-10212 (PTA-10212 Muestra n.° 5) previamente extraído usando el proceso FRIOLeX®, y los perfiles de ácidos grasos de cada clase se determinaron usando GC-FID como FAME. Los resultados se muestran en las tablas 12 y 13, a continuación.
Las clases de lípidos individuales se aislaron de una muestra de aceite crudo de la cepa del microorganismo ATCC PTA-10208 (Pt A-10208 Muestra n.° 3) usando HPLC normal con ELSD e identificación con APCI-MS.
Procedimientos experimentales
Extracción de aceite crudo - Se extrajo aceite crudo de muestras de biomasa secada por congelación usando trituración con disolvente. Por ejemplo, se pesaron aproximadamente 3 gramos de biomasa en un tubo sueco. Se añadieron tres rodamientos de bola y 30 ml de hexano al tubo sueco, que se cerró herméticamente con un tapón de neopreno y se colocó en un agitador durante 2 horas. La suspensión resultante se filtró usando un embudo Buchner y papel de filtro Whatman. El líquido filtrado se recogió, el disolvente se retiró al vacío y la cantidad de lípido crudo restante se determinó gravimétricamente.
Análisis de ácidos grasos - Las muestras de biomasa, lípido crudo extraído y clases de lípidos aislados se analizaron para la composición de ácidos grasos como FAME. En resumen, se pesaron la biomasa secada por congelación y las clases de lípidos aisladas directamente en tubos de ensayo de tapón a rosca, mientras que las muestras del aceite crudo se disolvieron en hexano para dar una concentración de aproximadamente 2 mg/ml. Se añadió patrón interno que contenía tolueno, y HCl 1,5 N en metanol a cada tubo. Los tubos se mezclaron con agitadora vorticial, después se taparon y se calentaron hasta 100 °C durante 2 horas. Los tubos se dejaron enfriar, y se añadió NaCl saturado en agua. Los tubos se mezclaron en agitadora vorticial de nuevo y se centrifugaron para permitir que las capas se separaran. Entonces una parte de la capa orgánica se colocó en un vial de GC y se analizó por GC-FID. Los FAME se cuantificaron usando una curva de calibración de 3 puntos generada usando el patrón de referencia Nu-Check-Prep GLC (NuCheck, Elysian, MN). Los ácidos grasos presentes en el extracto se expresaron como mg/g y como un porcentaje ponderal. El contenido de grasa en las muestras se estimó suponiendo una respuesta igual al patrón interno cuando se analizaban por GC-FID.
Método HPLC/ELSD/MS-
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Gradiente
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Extracción en fase sólida - Las fracciones de PL se separaron del lípido crudo por extracción en fase sólida (SPE) usando cartuchos de aminopropilo de 2 g (Biotage, Uppsala, Suecia) colocados en un aparato Vac Elut (Varian Inc, Palo Alto, EE. UU.). El cartucho se acondicionó con 15 ml de hexano, y se disolvieron ~60 mg de cada muestra en 1 ml de CHCl3 y se aplicaron al cartucho. La columna se lavó con 15 ml de CHCl3:alcohol isopropílico 2:1 para eluir todos los lípidos neutros, que se descartaron. Los ácidos grasos entonces se eluyeron con 15 ml de ácido acético (HOAc) al 2 % en éter, que se descartaron. La parte de PL se eluyó con 15 ml de metanol:cloroformo 6:1, que se recogieron, se secaron en atmósfera de nitrógeno y se pesaron.
Cromatografía ultrarrápida - Se usó cromatografía ultrarrápida para separar las clases de lípidos presentes en el aceite crudo. Se inyectaron aproximadamente 200 mg de aceite crudo disuelto en hexano en la parte superior de la columna. El sistema de cromatografía utilizó gel de sílice 60 (EMD Chemical, Gibbstown, NJ) con fase móvil compuesta de éter de petróleo y acetato de etilo a 5 ml/min (tablas 6-7) o 3 ml/min (tablas 8-13). Se usó un gradiente escalonado para eluir selectivamente cada clase de lípidos de la columna. El gradiente de la fase móvil empezó desde un 100 % de éter de petróleo y acabó con un 50 % de acetato de etilo. Las fracciones se recogieron en tubos de ensayo de 10 ml usando un colector de fracciones de lecho grande Gilson FC 204 (Gilson, Inc., Middleton, WI). Cada tubo se analizó por cromatografía en capa fina (TLC) y los tubos que contenían clases de lípidos individuales (consideradas por manchas individuales en la placa de TLC con el factor de retención (Rf) esperado) se combinaron, se concentraron a sequedad y se pesaron. El contenido de la fracción total se determinó entonces gravimétricamente.
Análisis por TLC - Se realizó cromatografía en capa fina sobre placas de gel de sílice. Las placas se eluyeron usando un sistema disolvente que consiste en éter de petróleo:éter etílico:ácido acético (80:20:1) y se visualizaron usando vapor de yodo. Los valores de Rf de cada mancha se compararon entonces con valores presentados en la bibliografía para cada clase de lípidos.
Análisis de fracciones de TAG y PL - Las fracciones de TAG y PL aisladas se analizaron para la composición de ácidos grasos como ésteres metílicos de ácido graso (FAME). Las fracciones de TAG se disolvieron en hexano para dar una concentración de aproximadamente 1-2 mg/ml. Se concentraron a sequedad alícuotas de 1 ml de las soluciones en atmósfera de nitrógeno. Se añadió patrón interno que contenía tolueno, y HCl 1,5 N en metanol a cada tubo. Los tubos se mezclaron con agitadora vorticial, después se taparon y se calentaron hasta 100 °C durante 2 horas. El patrón interno y el HCl en metanol se añadieron directamente a los tubos que contenían la fracción de PL y se calentaron. Los tubos se dejaron enfriar, y se añadió NaCl saturado en agua. Los tubos se mezclaron en agitadora vorticial de nuevo y se centrifugaron para permitir que las capas se separaran. Entonces una parte de la capa orgánica se colocó en un vial de GC y se analizó por GC-FID. Los FAME se cuantificaron usando una curva de calibración de 3 puntos generada usando el patrón de referencia Nu-Check-Prep GLC 502B (NuCheck, Elysian, MN). Los ácidos grasos presentes en el extracto se expresaron como mg/g y como % de FAME.
Resultados
PTA-10208 Muestra n.21
El perfil de ácidos grasos de la biomasa y el lípido crudo extraído para PTA-10208 Muestra n.° 1 se determinaron usando GC/FID. Los ácidos grasos en la biomasa se transesterificaron in situ pesando 28,6 mg de biomasa directamente en un tubo de FAME, mientras que una muestra del lípido crudo extraído se preparó pesando 55,0 mg de lípido crudo en un matraz volumétrico de 50 ml y transfiriendo 1 ml a un tubo de FAME separado. El contenido de lípido crudo estimado de la biomasa se determinó en un 53,2 % (como suma de FAME) usando GC con detección FID, mientras que se extrajo un 52,0 % (p/p) de lípido de la biomasa seca, dando un 97,8 % de recuperación de lípido total. El lípido crudo se determinó en un 91,9 % de ácidos grasos (como suma de FAME) usando GC/FID. Los ácidos grasos principales contenidos en el lípido crudo fueron C16:0 (182,5 mg/g), C20:5 n-3 (186,8 mg/g) y C22:6 n-3 (423,1 mg/g).
El perfil de clases de lípidos del lípido crudo extraído se determinó pesando 55,0 mg de lípido crudo en un matraz volumétrico de 50 ml y transfiriendo una alícuota a un vial de HPLC para análisis de HPLC/ELSD/MS. De acuerdo con el análisis de HPLC/ELSD/MS, el lípido crudo contenía un 0,2 % de ésteres de esterol (SE), un 95,1 % de TAG, un 0,4 % de esteroles y un 0,5 % de 1,2-diacilglicerol (DAG). Un 5 % de la fracción de TAG incluía un pico que eluía directamente después del pico de TAG, pero no dio un espectro de masas reconocible.
El TAG aislado de esta muestra determinado por cromatografía ultrarrápida constituía aproximadamente un 92,4 % del aceite crudo. El PL no se detectó por peso o TLC después de aislamiento por SPE. Los ácidos grasos principales (>50 mg/g) contenidos en el TAG fueron C16:0 (189 mg/g), C20:5 n-3 (197 mg/g) y C22:6 n-3 (441 mg/g).
PTA-10208 Muestra n.22
El perfil de ácidos grasos de la biomasa y el lípido crudo extraído para PTA-10208 Muestra n.° 2 se determinaron usando GC/FID. Los ácidos grasos en la biomasa se transesterificaron in situ pesando 32,0 mg de biomasa directamente en un tubo de FAME, mientras que una muestra del lípido crudo extraído se preparó pesando 60,1 mg de lípido crudo en un matraz volumétrico de 50 ml y transfiriendo 1 ml a un tubo de FAME separado. El contenido de lípido crudo estimado de la biomasa se determinó en un 52,4% (como suma de FAME) usando GC con detección FID, mientras que se extrajo un 48,0% (p/p) de lípido de la biomasa seca, dando un 91,7% de recuperación de lípido total.
El lípido crudo se determinó en un 95,3% de ácidos grasos (como suma de FAME) usando GC/FID. Los ácidos grasos principales contenidos en el lípido crudo fueron C16:0 (217,5 mg/g), C20:5 n-3 (169,3 mg/g) y C22:6 n-3 (444,1 mg/g).
El perfil de clases de lípidos del lípido crudo extraído se determinó pesando 60,1 mg de lípido crudo en un matraz volumétrico de 50 ml y transfiriendo una alícuota a un vial de HPLC para análisis de HPLC/ELSD/MS. De acuerdo con el análisis de HPLC/ELSD/MS, el lípido crudo contenía un 0,2 % de SE, un 95,7 % de TAG, un 0,3 % de esteroles y un 0,7 % de 1,2-DAG. Un 5,1 % de la fracción de TAG incluía un pico que eluía directamente después del pico de TAG, pero no dio un espectro de masas reconocible.
El TAG aislado de esta muestra constituía aproximadamente un 93,9 % del aceite crudo. El PL no se detectó por peso o TLC después de aislamiento por SPE. Los ácidos grasos principales (>50 mg/g) contenidos en el TAG fueron C16:0 (218 mg/g), C20:5 n-3 (167 mg/g) y C22:6 n-3 (430 mg/g).
PTA-10208 Muestra n.23
Se analizó una muestra de aceite crudo del microorganismo depositado según el acceso de ATCC n.° PTA-10208 (PTA-10208 Muestra n.° 3) usando HPLC/ELSD/MS. Se recuperó un total de un 98,38 % de lípidos, representando la fracción de éster de esterol (SE) un 0,32 %, representando la fracción de TAG un 96,13 %, representando la fracción de 1,3-diacilglicerol (DAG) un 0,22 %, representando la fracción de 1,2-DAG un 0,78 % y representando la fracción de esterol un 0,93 %.
PTA-10212 Muestra n.° 1
El perfil de ácidos grasos de la biomasa y el lípido crudo extraído para PTA-10212 Muestra n.° 1 se determinaron usando GC/FID. Los ácidos grasos en la biomasa se transesterificaron in situ pesando 27,0 mg de biomasa directamente en un tubo de FAME, mientras que una muestra del lípido crudo extraído se preparó pesando 52,5 mg de lípido crudo en un matraz volumétrico de 50 ml y transfiriendo 1 ml a un tubo de FAME separado. El contenido de lípido crudo estimado de la biomasa se determinó en un 38,3 % (como suma de FAME) usando GC con detección FID, mientras que se extrajo un 36,3 % (p/p) de lípido de la biomasa seca, dando un 94,6 % de recuperación de lípido total. El lípido crudo se determinó en un 83,2 % de ácidos grasos (como suma de FAME) usando GC/FID. Los ácidos grasos principales contenidos en el lípido crudo fueron C16:0 (328,5 mg/g), C20:5 n-3 (90,08 mg/g) y C22:6 n-3 (289,3 mg/g).
El perfil de clases de lípidos del lípido crudo extraído se determinó pesando 52,5 mg de lípido crudo en un matraz volumétrico de 50 ml y transfiriendo una alícuota a un vial de HPLC para análisis de HPLC/ELSD/MS. De acuerdo con el análisis de HPLC/ELSD/MS, el lípido crudo contenía un 0,2 % de Se , un 64,2 % de TAG, un 1,9 % de FFA, un 2,8 % de 1,3-DAG, un 1,4 % de esteroles, un 18,8 % de 1,2-DAG y un 0,5 % de Ma G. Un 3,4 % de la fracción de t Ag incluía un pico que eluía directamente después del pico de TAG, pero no dio un espectro de masas reconocible.
El TAG aislado de esta muestra constituía aproximadamente un 49,8 % del aceite crudo. El PL aislado constituía aproximadamente un 8,1 % del aceite crudo. Los ácidos grasos principales (>50 mg/g) contenidos en la fracción de TAG son C16:0 (400 mg/g), C20:5 n-3 (91 mg/g) y C22:6 n-3 (273 mg/g). Los ácidos grasos principales (>50 mg/g) contenidos en la fracción de PL son C16:0 (98 mg/g), C20:5 n-3 (33 mg/g) y C22:6 n-3 (227 mg/g).
PTA-10212 Muestra n.22
El perfil de ácidos grasos de la biomasa y el lípido crudo extraído para PTA-10212 Muestra n.° 2 se determinaron usando GC/FID. Los ácidos grasos en la biomasa se transesterificaron in situ pesando 29,5 mg de biomasa directamente en un tubo de FAME, mientras que una muestra del lípido crudo extraído se preparó pesando 56,5 mg de lípido crudo en un matraz volumétrico de 50 ml y transfiriendo 1 ml a un tubo de FAME separado. El contenido de lípido crudo estimado de la biomasa se determinó en un 40,0 % (como suma de FAME) usando GC con detección FID, mientras que se extrajo un 41,3 % (p/p) de lípido de la biomasa seca, dando un 106,1 % de recuperación de lípido total. El lípido crudo se determinó en un 82,8 % de ácidos grasos (como suma de FAME) usando GC/FID. Los ácidos grasos principales contenidos en el lípido crudo fueron C16:0 (327,3 mg/g), C20:5 n-3 (92,5 mg/g) y C22:6 n-3 (277,6 mg/g).
El perfil de clases de lípidos del lípido crudo extraído se determinó pesando 56,5 mg de lípido crudo en un matraz volumétrico de 50 ml y transfiriendo una alícuota a un vial de HPLC para análisis de HPLC/ELSD/MS. De acuerdo con el análisis de HPLC/ELSD/MS, el lípido crudo contenía un 0,2 % de Se , un 58,2 % de TAG, un 2,3 % de FFA, un 3,4 % de 1,3-DAG, un 1,7 % de esteroles, un 23,4 % de 1,2-DAG y un 0,6% de MAG. Un 3,3 % de la fracción de t Ag incluía un pico que eluía directamente después del pico de TAG, pero no dio un espectro de masas reconocible.
El TAG aislado de esta muestra constituía aproximadamente un 51,9 % del aceite crudo. El PL aislado constituía aproximadamente un 8,8 % del aceite crudo. Los ácidos grasos principales (>50 mg/g) contenidos en la fracción de TAG son C16:0 (402 mg/g), C20:5 n-3 (92 mg/g) y C22:6 n-3 (245 mg/g). Los ácidos grasos principales (>50 mg/g) contenidos en la fracción de PL son C16:0 (121 mg/g), C20:5 n-3 (48 mg/g) y C22:6 n-3 (246 mg/g).
Tabla 4: Perfiles de ácidos grasos de biomasas y lípidos crudos extraídos (mg/g) de PTA-10208 y PTA-10212
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Tabla 5: Perfiles de ácidos grasos de biomasas y lípidos crudos extraídos (%) de PTA-10208 y PTA-10212
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Table 6: Perfiles de ácido grasos de TAG aislado de PTA-10208 y PTA-10212
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Table 7: Perfiles de ácidos grasos de PL aislado de PTA-10212
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PTA-10212 Muestra n.23
El contenido de lípidos de la biomasa para PTA-10212 Muestra n.° 3 se estimó en un 34 % como la suma de FAME, y la cantidad de aceite crudo obtenida después de extracción con disolvente fue de un 37 % en peso, dando una recuperación de un 109 % de la grasa presente en la biomasa. Después del fraccionamiento usando cromatografía ultrarrápida, aproximadamente un 46 % del aceite crudo se aisló como TAG, un 28 % se aisló como DAG. El aceite crudo contenía 309 mg/g de DHA y 264 mg/g de EPA. El TAG aislado contenía 341 mg/g de DHA y 274 mg/g de EPA. La fracción de DAG aislada contenía 262 mg/g de DHA y 237 mg/g de EPA. Los perfiles de ácidos grasos totales de la biomasa, el aceite crudo extraído y las fracciones aisladas se muestran a continuación en la tabla 8 y la tabla 9, calculados como mg/g y % de FAME, respectivamente.
Tabla 8: Perfiles de ácidos grasos de biomasa y lípido crudo extraído (mg/g) de PTA-10212 Muestra n.° 3
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Tabla 9: Perfiles de ácidos grasos de biomasa y lípido crudo extraído (%) de PTA-10212 Muestra n.° 3
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PTA-10212 Muestra n.° 4
PTA-10212 Muestra n.° 4 contenía aproximadamente un 23 % de lípidos determinados como la suma de FAME, de los que un 107 % se recuperó usando extracción con hexano. Después del fraccionamiento usando cromatografía ultrarrápida, aproximadamente un 42 % del aceite crudo se aisló como TAG, un 18 % se aisló como DAG. El aceite crudo contenía 275 mg/g de DHA y 209 mg/g de EPA. El TAG aislado contenía 296 mg/g de DHA y 205 mg/g de EPA. La fracción de DAG aislada contenía 245 mg/g de DHA y 219 mg/g de EPA. Los perfiles de ácidos grasos totales de la biomasa, el aceite crudo extraído y las fracciones aisladas se muestran a continuación en la tabla 10 (mg/g) y la tabla 11 (% de FAME).
Tabla 10: Perfiles de ácidos grasos de biomasa y lípido crudo extraído (mg/g) de PTA-10212 Muestra n.° 4
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Tabla 11: Perfiles de ácidos grasos de Biomasa y lípido crudo extraído (%) de PTA-10212 Muestra n.° 4
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PTA-10212 Muestra n.° 5
Se extrajo una muestra de aceite crudo de una biomasa de PTA-10212 usando el proceso FRIOLEX® (GEA Westfalia Separator UK Ltd., Milton Keynes, Inglaterra) para producir aceite microbiano PTA-10212 Muestra n.° 5. Se aislaron las clases de lípidos individuales de PTA-10212 Muestra n.° 5 usando cromatografía ultrarrápida a baja presión, y se determinó el porcentaje ponderal de cada clase. El perfil de ácidos grasos de cada clase se determinó usando GC-FlD.
En resumen, la muestra se preparó disolviendo 240 mg de aceite crudo en 600 pl de hexano y aplicándolo a la parte superior de la columna. Después del fraccionamiento de la muestra usando cromatografía ultrarrápida, los pesos combinados de todas las fracciones eran de 240 mg, dando un 100 % de recuperación. La fracción de éster de esterol representaba un 0,9 %, la fracción de TAG representaba un 42,6 %, la fracción de ácidos grasos libres (FFA) representaba un 1,3 %, la fracción de esterol representaba un 2,2 %, la fracción de DAG representaba un 41,6 %. Los perfiles de ácidos grasos totales del aceite crudo FRIOLEX® y las fracciones aisladas se muestran a continuación en la tabla 12 y la tabla 13, calculados como mg/g y % de FAME, respectivamente.
Table 12: Perfiles de ácidos grasos de aceite crudo de PTA-10212 Muestra n.° 5 (mg/g)
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Tabla 13: Perfiles de ácidos grasos de aceite crudo (%) de PTA-10212 Muestra n.° 5
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Ejemplo 4
La cantidad relativa y la composición de ácidos grasos de cada isómero de TAG presente en el aceite crudo extraído se determinó para cada una de las muestras PTA-10208 Muestra n.° 1, PTA-10208 Muestra n.° 2, PTA-10212 Muestra n.° 1, PTA-10212 Muestra n.° 2 y PTA-10212 Muestra n.° 3, PTA-10212 Muestra n.° 4 y PTA-10212 Muestra n.° 5 del ejemplo 3 usando separación no acuosa con HPLC en fase inversa y detección por APCI-MS.
Método de TAG-Instrumento Agilent 1100 HPLC
Agilent 1100 MSD
Columna(s) Dos Phenomenex Luna C18 (2), 150 x 4,6 mm, tamaño de partícula
de 3 gm, conectadas en serie
Fase móvil A - Acetonitrilo
Gradiente B - IPA con un 0,1 % de acetato de amonio
Tiempo, min. % de A % de B
Figure imgf000056_0001
140 80 20
Temp. de columna 20 °C
Caudal 0,5 ml/min
Volumen de inyección 5 gl
MSD Intervalo de masas 350 - 1150
Fragmentador 225 V
Temperatura de gas de secado 350 °C,
Temperatura de vaporizador 325 °C
Voltaje del capilar 3500 V
Corriente de corona 10 gA
PTA-10208 Muestra n.° 1
El lípido crudo aislado de PTA-10208 Muestra n.° 1 se preparó para el análisis TAG preparada para el análisis TAG pesando 5,5 mg de aceite en un vial de HPLC y diluyendo con 1 ml de hexano.
Tabla 14: Identificación de especies de TAG en PTA-10208 Muestra n.° 1
Figure imgf000057_0001
PTA-10208 Muestra n.22
El lípido crudo aislado de PTA-10208 Muestra n.° 2 se preparó para el análisis TAG preparada para el análisis TAG pesando 5,3 mg de aceite en un vial de HPLC y diluyendo con 1 ml de hexano.
Tabla 15: identificación de especies de TAG en PTA-10208 Muestra n.° 2
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PTA-10212 Muestra n.° 1
El lípido crudo aislado de PTA-10212 Muestra n.° 1 se preparó para el análisis TAG preparada para el análisis TAG pesando 5,3 mg de aceite en un vial de HPLC y diluyendo con 1 ml de hexano.
Table 16: identificación de especies de TAG en PTA-10212 Muestra n.° 1
Figure imgf000059_0001
ND = No detectado
PTA-10212 Muestra n.22
El lípido crudo aislado de PTA-10212 Muestra n.° 2 se preparó para el análisis TAG preparada para el análisis TAG pesando 3,6 mg de aceite en un vial de HPLC y diluyendo con 1 ml de hexano.
Tabla 17: Identificación de especies de TAG en PTA-10212 Muestra n.° 2
Figure imgf000060_0001
ND= No detectado
PTA-10212 Muestra n.23
Una muestra de la fracción de TAG de PTA-10212 Muestra n.° 3 se preparó en hexano y se analizó por HPLC/APCI/MS para determinar las identidades de los isómeros de TAG individuales.
Tabla 18: Identificación de especies de TAG en PTA-10212 Muestra n.° 3
Figure imgf000061_0001
Figure imgf000062_0001
ND= No detectado
PTA-10212 Muestra n.° 4
Una muestra de la fracción de TAG de PTA-10212 Muestra n.° 4 se preparó en hexano y se analizó por HPLC/APCI/MS para determinar las identidades de los isómeros de TAG individuales.
Tabla 19: Identificación de especies de TAG en PTA-10212 Muestra n.° 4
Figure imgf000062_0002
Figure imgf000063_0001
ND - No detectado
PTA-10212 Muestra n.° 5
Una muestra de la fracción de TAG de PTA-10212 Muestra n.° 5 se preparó en hexano y se analizó por HPLC/APCI/MS para determinar las identidades de los isómeros de TAG individuales.
Tabla 20: Identificación de especies de TAG en PTA-10212 Muestra n.° 5
Figure imgf000063_0002
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Ejemplo 5
Los aceites crudos se procesaron adicionalmente mediante refinado, blanqueado y desodorizado para obtener aceites refinados. Los aceites refinados se diluyeron con aceite de girasol alto oleico para obtener aceites finales con un contenido de DHA de aproximadamente 400 mg/g. Las clases de lípidos individuales se aislaron y se determinaron los perfiles de ácidos grasos de cada clase usando GC-FID como FAME.
PTA-10208 Aceites finales
Los perfiles de ácidos grasos para PTA-10208 Aceites finales n.° 1-5 se resumen en las tablas 21-22, incluyendo los perfiles asociados dentro de la fracción de TAG aislada (tablas 23-24) y la fracción de esteroles/DAG aislada (tablas 24-26).
También se determinaron las clases de lípidos individuales en los aceites finales usando cromatografía ultrarrápida (tabla 27) y HPLC normal con ELSD y confirmación por APCI-MS (tabla 28).
Tabla 21: Perfiles de ácidos grasos de PTA-10208 Aceites finales (mg/g)
Figure imgf000065_0001
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Tabla 22: Perfiles de ácidos grasos de PTA-10208 Aceites finales (%)
Figure imgf000066_0002
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Tabla 23: Perfiles de ácidos grasos de TAG aislado: PTA-10208 Aceites finales (mg/g)
Figure imgf000068_0001
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Tabla 24: Perfiles de ácidos grasos de TAG aislados: PTA-10208 Aceites finales (%)
Figure imgf000069_0002
Figure imgf000070_0001
Tabla 25: Perfiles de ácidos grasos de esteroles/DAG aislados: PTA-10208 Aceites finales (mg/g)
Figure imgf000070_0002
Figure imgf000071_0001
Tabla 26: Perfiles de ácidos grasos de esteroles/DAG aislados: PTA-10208 Aceites finales (%)
Figure imgf000072_0001
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Tabla 27: Separación de clases de lípidos por cromatografía ultrarrápida (% en peso)
Figure imgf000073_0003
Tabla 28: Separación de clases de lípidos por HPLC-ELSD (% en peso)
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ND - No detectado
PTA-10212 Aceite final
El DHA estaba presente en un aceite final de PTA-10212 a un 41,63 % y 366,9 mg/g, mientras que el EPA estaba presente a un 16,52 %. Se determinaron los perfiles de ácidos grasos individuales y se resumen en la tabla 29.
Tabla 29: Perfiles de ácidos grasos de PTA-10212 Aceite final (% de FAME)
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Ejemplo 6
Se realizó un análisis de los triacilglicéridos (TAG) de los aceites finales de PTA-10208 descritos en el ejemplo 5 usando técnicas descritas en el ejemplo 4. Se hizo la identificación de cada resto de ácido graso, como se resume en la tabla 30 a continuación.
Tabla 30: Identificación de especies de TAG en PTA-10208 Aceite final
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Ejemplo 7
Se preparó un matraz de inóculo de dos días de antigüedad de los microorganismos aislados depositados según los accesos de ATCC n.° PTA-10208 y 10212 como un cultivo con aporte de carbono y nitrógeno en medio de acuerdo con las tablas 1 y 2.
Se realizó mutagénesis de acuerdo con el siguiente procedimiento:
Un matraz estéril T=2 días de antigüedad, de aproximadamente 50 ml, se vertió en un homogeneizador de vidrio de 40 ml estéril. El cultivo recibió 50 recorridos en el homogeneizador. El cultivo se pipeteó y se filtró a través de un filtro de malla de 50 micrómetros estéril, que se puso en un tubo estéril de 50 ml (la malla se usó como medio de retención de los grumos más grandes de colonias mientras que deja para los grupos más pequeños y las células individuales a través de la malla de 50 micrómetros). El macerado concentrado completo se recogió en un tubo estéril de 50 ml. El cultivo macerado se mezcló en agitadora vorticial y se hicieron diluciones niveles de hasta factor 1:100. Las muestras de macerado diluido se mezclaron en agitadora vorticial antes de añadir 200 pl de inóculo a una placa de medio de agar, de 100 x 15 mm, que contenía 4-5 microesferas de vidrio (microesferas de vidrio de 3 mm). Cada placa se agitó suavemente en un esfuerzo porque las microesferas extendieran el inóculo uniformemente alrededor de la placa. Las microesferas se retiraron de las placas y las placas se dejaron asentar con las cubiertas puestas durante aproximadamente 5 minutos para que se secaran. Se apagaron las luces tanto en la campana estéril como en las zonas adyacentes ya que el procedimiento se realizó en luz tenue. Había un mínimo de luz disponible para poder realizar el procedimiento, pero solamente indirecta y tenue.
Se colocaron cinco placas replicadas en el suelo del reticulador XL (Spectronics Corporation, Nueva York) con las tapas quitadas mientras se irradiaban las muestras. El reticulador suministraba energía en términos de microjulios y se buscó un nivel que consiguiera una destrucción de un 90 %-95 %. Se inocularon cinco placas de control replicadas con células sin mutagenizar usando el mismo protocolo. Estos recuentos de células se usaron para calcular el % de destrucción. Una vez se acabó la irradiación, se recogieron las placas, se volvieron a poner las tapas y las placas se envolvieron en Parafilm seguido de una envoltura de papel de aluminio. Fue imperativo que las placas crecieran durante la primera semana en la oscuridad de modo que no pudieran reparar los genes dañados.
Las placas se colocaron en una sala a 22,5 °C durante aproximadamente 10 días antes del recuento de las colonias. Cuando se hicieron los recuentos finales, se cogieron colonias individuales con un asa de siembra estéril y se volvieron a sembrar en estrías en nuevas placas de medio. Cada colonia se sembró en una placa individual. Según crecían las placas en densidad, se recogía una muestra, usando un asa de siembra, y se inoculaba en un matraz de agitación estéril de 250 ml que contenía 50 ml de medio. Este matraz se puso en una agitadora a 200 rpm en una sala a 22,5 °C. En T=7 días, el cultivo en matraz de agitación se recolectó en un tubo estéril de 50 ml. Se tomó el pH y se centrifugó la muestra para recoger el sedimento de biomasa. Cada muestra se aclaró y se resuspendió en una mezcla 50:50 de alcohol isopropílico y agua destilada antes de volver a centrifugarse. El sedimento recogido se liofilizó, se pesó y se realizó un análisis de FAME. Los datos de las tablas 31 y 32 representan mutantes producidos con el proceso anterior a partir de las cepas PTA-10208 y PTA-10212, respectivamente.
Tabla 31: Mutantes de PTA-10208
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Tabla 32: Mutantes de PTA-10212
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Los ejemplos 8-15 a continuación son ejemplos proféticos.
Ejemplo 8
Un matraz de tres bocas de 1000 ml equipado con un agitador mecánico, condenador de relujo, embudo de adición, vaina, mando de calentamiento y atmósfera de nitrógeno se carga con 10 gramos de un aceite microbiano que contiene un 30 % en peso de triglicéridos que contienen aproximadamente un 60 % en peso de DHA unido mediante enlaces éster a los mismos, 193 gramos de etanol y 28 gramos de agua. Se añade hidróxido de sodio (80 gramos de solución al 50 %) a través del embudo de adición. La mezcla resultante se calienta a 64 °C durante 145 minutos. Se añade ácido clorhídrico (84 ml de 12 N) durante cinco minutos. Se añaden 14 ml adicionales de HCl en pequeñas porciones hasta que se obtiene un pH de 2. Se detiene la agitación y la solución de reacción se vierte en un embudo de decantación. La solución de reacción se extrae con acetato de etilo (3x) y las fracciones orgánicas se combinan y se secan con sulfato de magnesio. El sulfato de magnesio se filtra y el disolvente se retira por evaporación giratoria. Se obtiene un aceite de producto que contiene DHA en su forma de ácido graso libre. El rendimiento de producto de DHA es de un 78 % en peso teórico.
Ejemplo 9
Se coloca un gramo de un aceite microbiano que contiene un 40 % en peso de triglicéridos que contienen un 50 % en peso de EPA unido mediante enlaces éster a los mismos en un tubo de ensayo de vidrio de borosilicato de 10 ml. El tubo de ensayo se inunda de gas nitrógeno, se tapa y se enfría hasta -80 °C. El tubo de ensayo se deja reposar a -80 °C durante 5 horas. Al final del periodo de 5 horas, se forma un precipitado y también hay una capa oleosa separada presente. El tubo de ensayo se centrifuga durante 2 minutos a 1000 g, y el aceite se decanta. El aceite de producto decantado se aísla en 0,25 g y se descubre que contiene un 70 % en peso de los triglicéridos que contienen aproximadamente un 50 % en peso de EPA unido mediante enlaces éster a los mismos.
Ejemplo 10
Se coloca un gramo de un aceite que contiene un 50 % en peso del éster etílico de EPA en un matraz Erlenmeyer de 50 ml. Se añaden 30 ml de metanol al matraz, y la solución resultante se calienta hasta 67 °C. El aceite se disuelve y se añaden 6 g de urea a la solución. También se disuelve la urea. El matraz entonces se enfría hasta 5 °C y se deja que permanezca a esta temperatura durante 6 horas. Un precipitado cristalino es visible en el matraz. El metanol se elimina del matraz por decantación y el precipitado se extrae 3x cada vez con 25 ml de hexano. Los extractos de hexano se combinan y el hexano se elimina por evaporación giratoria. Se produce un aceite de producto en una cantidad de 0,3 g. El aceite de producto contiene un 75 % del éster etílico de EPA.
Ejemplo 11
Se colocan 0,5 g de un aceite que contiene un 50 % en peso de alcohol holo-cis-4,7,10,13,16,19-docosahexaenoico en un matraz de 3 bocas de 75 ml equipado con un embudo de adición y una barra de agitación. El matraz se coloca en atmósfera de nitrógeno y se añaden 20 ml de diclorometano mediante una jeringa. Se inicia la agitación y se disuelve el aceite. Entonces se añade peryodinano de Dess-Martin (DMP) sólido en una cantidad correspondiente a 1,45 equivalentes de (DMP) a 1 equivalente de alcohol holo-cis-4,7,10,13,16,19-docosahexaenoico. Se añade lentamente agua durante el transcurso de media hora mediante una jeringa que se acciona mediante una bomba de jeringa. La reacción se detiene después de 1 hora y la solución resultante y los sólidos contenidos en la misma se colocan en un embudo de decantación. Se añade diclorometano adicional (30 ml) y se realiza extracción 3x con agua que contiene NaOH 0,1 N. El diclorometano se recoge del embudo de decantación, se seca sobre sulfato de sodio y se filtra. La evaporación giratoria del diclorometano produce 0,35 g de un aceite que contiene un 50 % en peso de aldehído holo-cis-4,7,10,13,16,19-docosahexaenoico.
Ejemplo 12
Se coloca un aceite que contiene un 50 % de triacil glicéridos donde los triacil glicéridos contienen 0,1 mol de una mezcla equimolar de EPA y DHA en forma de éster en un matraz de fondo redondo de 500 ml equipado con un condensador. Se añade etanol (50 ml) y se inicia la agitación. Se añade una solución de NaOH de modo que la cantidad total de NaOH sea equivalente a 0,11 mol. Se añade agua. La reacción se calienta hasta 70 °C y se mantiene en este estado durante 20 horas. La reacción se enfría. El matraz se separa del condensador de reflujo y se retira la barra de agitación del matraz. El matraz se fija al evaporador giratorio y el agua y el etanol se retiran con calentamiento y a presión reducida. Se descubre que el material resultante contiene EPA y DHA en las formas de sal de sodio.
Ejemplo 13
Se añaden 100 g de un aceite que contiene un 50 % en peso de triglicéridos que contienen DHA en un 80 % de los enlaces éster en los mismos a un matraz de 1000 ml equipado con un condensador. Se añaden 500 ml de una solución en etanol de etóxido de sodio, de modo que la relación molar de etóxido de sodio a los enlaces éster en el triglicérido sea de 30: 1. La reacción se calienta hasta 77 °C y se deja reposar a esta temperatura durante 24 horas. La reacción se deja enfriar. Se añade una cantidad neutralizante de solución de HCl 0,1 N. El matraz se separa del condensador, se retira la barra de agitación y se elimina el etanol a presión reducida. La solución acuosa resultante se extrae (3x) con acetato de etilo, y las fracciones de acetato de etilo se secan sobre sulfato de sodio. Las fracciones de acetato de etilo secadas se filtran y se someten a evaporación giratoria a presión reducida. Se aíslan 18 g de un producto oleoso. Se descubre que el producto oleoso es un 93 % puro y contiene el éster etílico de DHA como componente principal.
Ejemplo 14
Se disuelven 80 g de un aducto de urea reciclado (que contiene aproximadamente un 3,5 % en peso de grasa, donde el aducto de urea reciclado se extrae previamente con CO2 supercrítico a una temperatura de aproximadamente 75 °C, a presión de aproximadamente 250 bar y un caudal de aproximadamente 0,7 kg/h, durante aproximadamente tres horas) en 88 g de etanol y se calienta a reflujo durante 30 min. Entonces, se añaden 40 g de una muestra que contiene ácidos grasos en las cantidades relativas enumeradas en la tabla 4, PTA-10208 Muestra n.° 1, lípido crido, en sus formas de éster etílico. La solución resultante se calienta a reflujo durante 2 horas adicionales. La solución posteriormente se enfría hasta 10 °C, y precipita un aducto de urea en una combinación de aceite de productodisolvente. El aducto de urea se retira por filtración y el disolvente se evapora del aceite de producto. El aceite de producto pesa 18 g. El aceite de producto se analiza por cromatografía de gases y se descubre que contiene un 85 % de una combinación de EPA y DHA en sus formas de éster etílico, donde la concentración del éster etílico de DHA en el aceite de producto es de un 65 % y la concentración del éster etílico de EPA en el aceite de producto es de un 20 %.
Ejemplo 15
Se obtiene un aceite microbiano crudo ("CMO") como un aceite de partida. El CMO contiene un 95,1 % en peso de triacil glicéridos, basado en el peso total del aceite microbiano crudo. Los ácidos grasos principales contenidos en el CMO incluyen: EPA (19,7 % en peso de los ácidos grasos totales) y DHA (44,1 % en peso de los ácidos grasos totales). Se disuelven 3,8 g del CMO en 100 ml de una mezcla de disolventes de n-hexano/etanol (10:90; v:v) para formar una solución de disolvente-CMO. La solución de disolvente-CMO se congela entonces durante 8 horas a -85 °C, y posteriormente se centrifuga durante 2 minutos, a 3600 rpm, a 0 °C. Después de centrifugarlo, se recoge el sobrenadante usando una pipeta Pasteur, y se eliminan los disolventes (por ejemplo, n-hexano y etanol). La eliminación del disolvente produce 174,9 mg de un producto oleoso amarillo transparente y 3,62 g de un residuo oleoso amarillo turbio. El análisis de GC (empleando el método divulgado en la patente de Estados Unidos n.° 7588791, en la columna 9, líneas 4-17) para el aceite de producto, da un contenido de EPA de un 26,6 % en peso de los ácidos grasos totales, y un contenido de DHA de un 67,0 % en peso de los ácidos grasos totales.
Ejemplo 16
Este ejemplo ilustra un método de la presente invención para extraer ácidos grasos poliinsaturados etílicos de la biomasa de Schizochytrium sp., acceso de ATCC n.° PTA-10208.
Se usó una biomasa obtenida de caldo de Schizochytrium sp. por centrifugación después de mezclar con etanol directamente sin ningún procesamiento adicional.
Se mezclaron 640 g de biomasa húmeda (aproximadamente un 70 % de sólidos en peso), obtenida por precipitación del caldo completo, con 3000 ml de etanol y se agitó en atmósfera de nitrógeno. Se añadieron 13 g de hidróxido de potasio en polvo a la mezcla en agitación y se calentó a reflujo a aproximadamente 90 °C en atmósfera de nitrógeno. El calentamiento se continuó durante 8 horas. La reacción se controló por TLC. No se observaron triglicéridos (aceite), solamente se observaron ésteres. La mezcla de reacción se enfrió y se filtró para separar la solución en etanol de los ésteres de la biomasa usada (bioharina). La solución de etanol se concentró al vacío para producir 268 g de ésteres crudos (>90 % de recuperación basado en el contenido de aceite de la biomasa). La bioharina sobrante se secó para obtener 171 g de bioharina usada. Los ésteres crudos se enriquecieron adicionalmente por destilación molecular fraccionada o formación de aductos de urea. Un análisis de GC de la biomasa indicó la presencia de aproximadamente un 41 % de éster etílico de DHA, aproximadamente un 20 % de éster etílico de EPA y aproximadamente un 4 % de éster etílico de DPA. Los materiales restantes eran predominantemente ésteres etílicos de menor peso molecular (véase la tabla 33).
Tabla 33. Análisis de GC de ésteres etílicos crudos
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Ejemplo 17
Este ejemplo ilustra un método de la presente invención para enriquecer ésteres crudos por cristalización de aductos de urea.
Se disolvieron 60 g de urea en 500 ml de metanol mientras se calentaba a reflujo en atmósfera de nitrógeno. Se añadieron 100 g de ésteres crudos, obtenidos de esterificación directa de biomasa, a la solución de urea/metanol en atmósfera de nitrógeno. La mezcla se calentó a reflujo durante aproximadamente 2 horas y se dejó enfriar hasta temperatura ambiente con agitación. La mezcla se enfrió adicionalmente hasta aproximadamente 5 °C hasta la cristalización completa. Los sólidos se separaron por filtración. La torta de filtro se lavó con metanol frío para recuperar la mayor parte del producto suspendido en el aducto de urea. El filtrado metanólico se concentró al vacío para obtener concentrado enriquecido en PUFA con más de un 88 % de PUFA (véase la tabla 34)
Tabla 34. Análisis de GC de productos de éster etílico después de cristalización de aductos de urea
Figure imgf000081_0002

Claims (15)

REIVINDICACIONES
1. Un aceite microbiano enriquecido que comprende al menos un 70 % en peso de una combinación de DHA y EPA, en el que el aceite comprende al menos un 10 % en peso de EPA y en el que
(i) el aceite comprende al menos un 50 % en peso de DHA y al menos un 20 % en peso de EPA; o
(ii) el aceite comprende una fracción de triacilglicerol, en el que al menos un 50 % en peso de los ácidos grasos en la fracción de triacilglicerol es DHA y al menos un 20 % en peso de los ácidos grasos en la fracción de triacilglicerol es EPA.
2. El aceite de acuerdo con la reivindicación 1, que comprende al menos un 50 % en peso de DHA y al menos un 20 % en peso de EPA.
3. El aceite de acuerdo con la reivindicación 1, en el que el aceite comprende una fracción de triacilglicerol, en el que al menos un 50 % en peso de los ácidos grasos en la fracción de triacilglicerol es DHA y al menos un 20 % en peso de los ácidos grasos en la fracción de triacilglicerol es EPA.
4. El aceite de cualquier reivindicación precedente, en el que el DHA y EPA están en forma de éster.
5. El aceite de acuerdo con la reivindicación 4, en el que el éster de DHA y el éster de EPA son ésteres etílicos.
6. El aceite de cualquier reivindicación precedente, que se puede obtener de
(i) un microorganismo aislado de la especie depositada según el acceso de ATCC n.° PTA-10208, en el que los ácidos grasos totales producidos por el microorganismo comprenden más de un 10 % en peso de EPA;
(ii) un microorganismo aislado que tiene las características de la especie depositada según el acceso de ATCC n.° PTA-10208, en el que los ácidos grasos totales producidos por el microorganismo comprenden más de un 10 % en peso de EPA;
(iii) un microorganismo aislado que produce una fracción de triacilglicerol, en el que el contenido de EPA de la fracción de triacilglicerol es de al menos un 12 % en peso;
(iv) un microorganismo aislado depositado según el acceso de ATCC n.° PTA-10208;
(v) un microorganismo aislado depositado según el acceso de ATCC n.° PTA-10209;
(vi) un microorganismo aislado depositado según el acceso de ATCC n.° PTA-10210; o
(vii) de un microorganismo aislado depositado según el acceso de ATCC n.° PTA-10211.
7. Un método para obtener un alimento o complemento, comprendiendo dicho método incorporar el aceite de una cualquiera de las reivindicaciones 1 -6 en dicho alimento o complemento.
8. Un método para obtener una composición farmacéutica, comprendiendo dicho método incorporar el aceite de una cualquiera de las reivindicaciones 1-6 y un vehículo farmacéuticamente aceptable en dicha composición farmacéutica.
9. Un método para obtener una forma farmacéutica oral, comprendiendo dicho método incorporar el aceite de una cualquiera de las reivindicaciones 1-6 en dicha forma farmacéutica oral, preferiblemente en el que la forma farmacéutica oral comprende de 100 mg a 3000 mg de ácidos grasos poliinsaturados omega-3, preferiblemente de 500 mg a 1000 mg de una combinación de DHA y EPA.
10. El método de acuerdo con la reivindicación 9, en el que dicha forma farmacéutica oral es una cápsula o una cápsula vegetariana.
11. Un aceite de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, o una mezcla de los mismos, y un vehículo farmacéuticamente aceptable, para su uso en el tratamiento de una cardiopatía o una afección relacionada con la misma en un sujeto que lo necesita.
12. Un aceite de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, o mezclas de los mismos, para su uso en la mejora de una cardiopatía o una afección relacionada con la misma, o el mantenimiento de un corazón sano o un estado relacionado con el mismo.
13. Un método para producir el aceite microbiano enriquecido de la reivindicación 1 a partir de la biomasa de un microorganismo, que comprende:
a) calentar y hacer reaccionar la biomasa en presencia de un alcohol y una base para producir un éster de un ácido graso poliinsaturado a partir de la biomasa;
b) separar la biomasa en una fase sustancialmente líquida, enriquecida con ácido graso poliinsaturado y una fase sustancialmente sólida; y
c) purificar la fase sustancialmente líquida recuperando una fracción que comprende el éster de ácido graso poliinsaturado.
14. El método de la reivindicación 13, en el que el microorganismo es (i) un microorganismo aislado de una especie Schizochytrium o (ii) uno cualquiera de los microorganismos aislados de las especies depositadas según los accesos de ATCC n.2: PTA-10212, PTA-10213, PTA-10214, PTA-10215, PTA-10208, PTA-10209, PTA-10210, PTA-10211, una cepa mutante de las mismas o una mezcla de las mismas.
15. El método de una cualquiera de las reivindicaciones 13-14, en el que
(i) la etapa de calentamiento a) se realiza de 80 °C a 100 °C, preferiblemente a 90 °C;
(ii) la base es hidróxido de potasio;
(iii) el alcohol es etanol;
(iv) el éster es un éster etílico del ácido graso poliinsaturado;
(v) el ácido graso poliinsaturado es una combinación de DHA y EPA;
(vi) la etapa de separación b) se realiza por centrifugación o filtración;
(vii) la etapa de purificación c) se realiza por cristalización con formación de aductos de urea en etanol; y/o (viii) la etapa de purificación c) se realiza por destilación fraccionada molecular al vacío.
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