CN114540125A

CN114540125A - 一种具有减肥降脂功效的不饱和脂肪酸的制备方法

Info

Publication number: CN114540125A
Application number: CN202210165144.7A
Authority: CN
Inventors: 林少玲; 杨阳; 赖丹宁; 陈清燕; 施源
Original assignee: Fujian Agriculture and Forestry University
Current assignee: Fujian Agriculture and Forestry University
Priority date: 2022-02-23
Filing date: 2022-02-23
Publication date: 2022-05-27

Abstract

本发明公开了一种具有减肥降脂功效的不饱和脂肪酸的制备方法。小球藻粉使用KOH/甲醇溶液辅助提取，使用尿素/甲醇溶液进行富集包合，通过抽滤、萃取、浓缩等技术手段最终得到小球藻不饱和脂肪酸。该不饱和脂肪酸主要成分为多不饱和脂肪酸亚油酸。该不饱和脂肪酸的减肥降脂功效主要体现为对体重的改善、血糖血脂水平的调节以及脂肪蓄积和肝脏损伤的减少。

Description

一种具有减肥降脂功效的不饱和脂肪酸的制备方法

技术领域

本发明属于天然产物应用领域，具体涉及一种从天然海洋生物来源物质提取出的具有减肥降脂功效的不饱和脂肪酸。

背景技术

肥胖是在全球范围内都广受关注的公共卫生问题，是一种人体能量代谢失衡所导致的疾病。近些年其发病率显著上升，并有年轻化、在青少年群体中多发的趋势。肥胖主要表现为超重和脂肪的积累导致的体型变化，不仅影响身体健康，还会对心理健康造成一定的危害。除此之外，肥胖的危害更主要地表现在对其他疾病的一些影响，如高血压、高血脂症、糖尿病、心血管疾病等，增加发病风险。随着人们对于肥胖症的重视度不断提升，为了避免传统减肥药物的副作用，天然产物的减肥降脂作用被广泛研究，膳食干预手段抗肥胖也逐渐成为研究者们关注的话题。

脂肪作为一种六大营养素之一，与人体必需脂肪酸密切相关，在人类健康中起到重要作用。而不饱和脂肪酸(unsaturated fatty acids，UFAs)，是必需脂肪酸中的一种，具有调节机体的新陈代谢、抗炎、抗肥胖等生理活性。小球藻是一种常见的、分布广泛的海洋微藻，是油脂的天然来源之一，富含多种不饱和脂肪酸，有着开发成具有减肥降脂的膳食补充剂或营养保健食品的巨大潜力。

目前，市面上尚未有以小球藻不饱和脂肪酸为原料的减肥降脂相关膳食补充剂或营养保健品。

发明内容

本发明的目的在于提供一种具有减肥降脂功效的不饱和脂肪酸的制备方法。制得的不饱和脂肪酸有明显的调节体重和血糖血脂的功效；能减轻脂肪的积累和肝脏的损伤；通过动物实验，无明显毒副作用。

为实现上述目的，本发明所采用的技术方案为：

一种具有减肥降脂功效的不饱和脂肪酸的制备方法，以小球藻粉为原料，使用KOH/甲醇溶液制备小球藻脂肪酸浓缩液；再使用尿素/甲醇溶液对浓缩液中不饱和脂肪酸进行包合富集；最后通过萃取浓缩获得具有减肥降脂功效的小球藻不饱和脂肪酸。

主要包括以下步骤：

（1）小球藻脂肪酸浓缩液的制备

A.将喷雾干燥的小球藻干粉以1：9 g/mL的比例与90℃蒸馏水混合，取200ml小球藻悬浊液在蒸汽爆破仪器中使用压力为1.5MPa、温度为120℃的饱和蒸汽加热10分钟后瞬时爆破，得到小球藻破壁溶液；

B.将小球藻破壁溶液与0.5 mol/L KOH/甲醇溶液以10:3的体积比混合；

C.在60摄氏度下恒温加热，并搅拌1小时，混合皂化；

D.对混合后的溶液进行抽滤；

E.舍弃小球藻残渣，收集滤液；

F.使用盐酸将滤液pH调节成酸性（pH3）；

G.在酸性条件下使用正己烷进行萃取，获得小球藻脂肪酸浓缩液；

（2）小球藻不饱和脂肪酸的制备

A.将小球藻脂肪酸浓缩液与0.2 g/mL 尿素/甲醇溶液按体积比1：3.5混合，并在4摄氏度下放置一夜，有尿素包合晶体析出，实现对浓缩液中不饱和脂肪酸进行富集包合；

B.将包合完成的浓缩液进行抽滤，并收集滤液；

C.对滤液使用正己烷进行萃取，浓缩，获得小球藻不饱和脂肪酸。

由以上方法制得的小球藻不饱和脂肪酸的提取得率为25.21±0.23%，远高于其他通过双溶剂提取法(16.1%)和氯仿-甲醇提取剂体系，结合超声波萃取法（18.13%）的得率，且该方法获取的提取物主要成分为亚油酸66.87wt%、棕榈油酸11.58wt%、棕榈酸8.57wt%、油酸7.90wt%。

本发明的有益效果在于：

本发明提供了一种来源天然小球藻的具有减肥降脂功效的不饱和脂肪酸的制备方法；所述小球藻不饱和脂肪酸主要成分为多不饱和脂肪酸亚油酸（检出含量为57668.72mg/kg），以及部分单不饱和脂肪酸棕榈油酸（检出含量为9983.67mg/kg）、油酸（检出含量为6812.11 mg/kg）和其余多种脂肪酸。小球藻不饱和脂肪酸能显著地降低体重及血糖血脂水平；能显著降低脂肪细胞大小，减轻脂肪积累和肝脏肥大的情况。实验结果证明，小球藻不饱和脂肪酸具有有效的减肥降脂作用，且无明显毒副作用，来源安全可靠。

附图说明

图1为小球藻不饱和脂肪酸对小鼠（A）空腹血糖值FBG及血脂水平（B）TG、（C）TC和（D）LDL-C/HDL-C的影响；

图2为小球藻不饱和脂肪酸对小鼠附睾脂肪（A）H＆E染色及（B）脂肪细胞大小的影响；

图3为小球藻不饱和脂肪酸对小鼠肝脏（A）H＆E染色、（B）油红O染色及（C）脂滴大小的影响。

具体实施方式

以下结合实际，通过具体实施案例对本发明所述的技术方案做进一步的详细说明，但是本发明不仅限于此，不能将其理解为本发明的全部保护范围。

实施例1

小球藻不饱和脂肪酸的制备：

（1）小球藻脂肪酸浓缩液的制备

1.将喷雾干燥的小球藻干粉以1：9 g/mL的比例与90℃蒸馏水混合，取200ml小球藻水溶液在蒸汽爆破仪器中使用压力为1.5MPa、温度为120℃的饱和蒸汽加热10分钟后瞬时爆破，得到小球藻破壁溶液；

2.将小球藻破壁溶液与0.5 mol/L KOH/甲醇溶液以10:3的体积比混合；

3.在60摄氏度下恒温加热，并搅拌1小时，混合皂化；

4.对混合后的溶液进行抽滤；

5.舍弃小球藻残渣，收集滤液；

6.使用盐酸将滤液pH调节成酸性（pH3）；

7.在酸性条件下使用正己烷进行萃取，获得小球藻脂肪酸浓缩液；

（2）小球藻不饱和脂肪酸的制备

1.将小球藻脂肪酸浓缩液与0.2 g/mL 尿素/甲醇溶液按体积比1：3.5混合，并在4摄氏度下放置一夜，有尿素包合晶体析出，实现对浓缩液中不饱和脂肪酸进行富集包合；

2.将包合完成的浓缩液进行抽滤，并收集滤液；

3.对滤液使用正己烷进行萃取，浓缩，获得小球藻不饱和脂肪酸。

（3）小球藻不饱和脂肪酸成分的检测

1.将小球藻不饱和脂肪酸样品甲酯化预处理，使用GC-MS对样品进行成分测定；

2.色谱条件: HP－5MS，石英弹性毛细管柱（30 m×0.25 mm×0.2 μm），溶剂为正己烷，载气为高纯氦气（99.99 % ）；初温80 ℃，保持1.1 min，以17 ℃/min升至240 ℃，保持0.7 min，再以1 ℃/min升至253 ℃，保持4 min，进样口温度253℃；流速1 mL /min，进样量1.0 μL，分流比20:1；

3.质谱条件：EI 电离源，电子能量 70 eV，离子源温度 230 ℃，四级杆温度 150℃，EM 电压 1024 V，质量扫描范围 40～600 u。

实验结果：小球藻不饱和脂肪酸的成分检测如表1所示，可看出小球藻不饱和脂肪酸中主要组成成分为亚油酸。

表1 小球藻不饱和脂肪酸组成成分

实施例2

小球藻不饱和脂肪酸对肥胖小鼠减肥降脂的研究。

实验方法：

将实施例1中提取出的小球藻不饱和脂肪酸以不同比例喂养小鼠。

36只4周龄的清洁级C57BL/6J雄性小鼠（14~16g），在温度23℃±1℃、湿度55%±5%、12小时的光/暗循环的环境下饲养。适应1周后，随机将分为6组(n=6)，其中除正常组(Normal Diet，ND)是用正常饲料喂养外其余五组高脂组(High Fat Diet，HFD)、低剂量组（Unsaturated Fatty Acid 1, UFA1）、高剂量组（Unsaturated Fatty Acid 2, UFA2）、小球藻粉组（Dry Chlorella Powder，DCP）、亚麻籽油组（Flaxseed Oil，FO）均采用高脂饲料喂养。所有小鼠均经灌胃处理，ND组灌胃内容为生理盐水，HFD组和DCP组灌胃内容为等量的大豆油，UFA1、UFA2和FO组灌胃等量不同剂量C.UFAs或亚麻籽油部分替代的大豆油。食物和水均提供小鼠自由摄食，具体饲养方案见表2。连续给小鼠灌胃16周，每日记录小鼠单日的摄食量，每1周测量一次小鼠的体重。

小鼠解剖前进行空腹血糖测试。禁食12小时后，称量体重并使用水合氯醛麻醉，眼球取血，将全血在 4 ℃ 3000 rmp条件下离心5 min，取上清液。使用全自动生化分析仪测定血清中高密度脂蛋白胆固醇（HDL-C），低密度脂蛋白胆固醇（LDL-C），甘油三酯（TG），总胆固醇（TC）的含量。断颈处死后取小鼠体内脏器待测。小鼠部分肝脏、脂肪组织解剖后在4%多聚甲醛中固定，之后使用石蜡包埋切片(5 μm)，并使用苏木精-伊红(HE)对组织切片进行染色，经过脱水、封片步骤，通过倒置显微镜观察组织病理学结构变化。小鼠部分肝脏组织解剖后在-80℃下保存，剪碎，加入预冷后的中性PBS 溶液制成10%的肝脏组织匀浆，并按照试剂盒说明测定肝脏细胞组织中TG、TC、FFA水平。

表2 实验小鼠饲养方案

实验结果：

1. 无明显毒副作用

在实验给药干预过程中，未见小鼠出现行为异常、毛发异常等情况，未见中毒、过敏反应症状。小鼠存活状态正常，实验过程中无死亡小鼠出现。

2. 降低体重

如表3所示，干预16周后，膳食干预的四组小鼠最终体重均极显著低于HFD组，说明小球藻不饱和脂肪酸对降低体重有良好的效果；且小球藻不饱和脂肪酸低剂量干预后减轻肝脏重量，说明其对小鼠脏器情况有改善作用。

表3 小球藻对小鼠体重及脏器指标的影响

注：表中数据为平均值±方差。每行中不同上标字母表示差异显著，P <0.05

3. 调节血糖、血脂

小球藻不饱和脂肪酸能降低血糖、血脂水平（图1），且UFA1比例（250 mg/kg•dC.UFAs+大豆油）的效果更佳，具有良好的降血糖降脂效果。

4. 减少脂肪蓄积

小球藻不饱和脂肪酸能改善高脂饮食导致的脂肪细胞排列松散（图2中A），及脂肪细胞面积增大的情况（图2中B），从而控制脂肪组织的大小。同时，从肝脏H＆E（图3中A）及油红O染色（图3中B）图中可以看到，小球藻不饱和脂肪酸的添加改善了高脂饮食造成的肝脏细胞的排列紊乱和肿大，减小了肝脏中脂滴的面积，最终减轻肝脏中脂质蓄积的情况（图3中C）。以上结果说明小球藻不饱和脂肪酸不仅具有减肥降脂功效，对肝脏也有一定的保护作用。

以上所述仅为本发明选择的较佳实施例，在该技术领域下，不脱离本发明原理及申请专利范围可做一定程度的相关变化和修饰，这些变化和修饰均应视为本发明的保护范围。

Claims

1.一种具有减肥降脂功效的不饱和脂肪酸的制备方法，其特征在于：将小球藻粉和KOH/甲醇溶液加热搅拌后进行萃取，再使用尿素/甲醇溶液进行包合，通过萃取浓缩获得小球藻不饱和脂肪酸。

2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于：包括以下步骤：

（1）小球藻脂肪酸浓缩液的制备：将小球藻干粉以1：9 g/mL的比例与90℃蒸馏水混合后在蒸汽爆破仪器中1.5MPa、120℃加热10分钟后破壁；将小球藻破壁溶液与0.5 mol/LKOH/甲醇溶液以10: 3的体积比在60℃下搅拌1小时，抽滤，舍弃小球藻残渣，收集滤液并在酸性条件下使用正己烷进行萃取，获得小球藻脂肪酸浓缩液；

（2）小球藻不饱和脂肪酸的制备：将小球藻脂肪酸浓缩液与0.2 g/mL 尿素/甲醇溶液在4℃下放置一夜进行包合；将包合完成的浓缩液使用抽滤收集滤液；对滤液使用正己烷进行萃取，浓缩，获得小球藻不饱和脂肪酸。

3.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于：步骤（1）中酸性条件是指体系的pH为3。

4.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于：步骤（2）中小球藻脂肪酸浓缩液与尿素/甲醇溶液的体积比为1：3.5。

5.一种如权利要求1-4任一所述的制备方法制得的具有减肥降脂功效的不饱和脂肪酸，其特征在于：主要成分为亚油酸66.87wt%、棕榈油酸11.58wt%、棕榈酸8.57wt%、油酸7.90wt%。