CN114032259A - 一种酵母菌的高密度发酵及十六碳烯酸提取方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种酵母菌的高密度发酵及十六碳烯酸提取方法。本发明提供了一种酿酒酵母的高密度发酵方法，通过调节有机碳源的补加方式，实现了菌株的高密度发酵，同时提高了油脂积累中十六碳烯酸的比例，有利于获得经济价值更高的油脂产品。进一步的，本发明还提供了一种从上述高密度发酵的酿酒酵母中提取分离十六碳烯酸的方式，通过酶解及酯类有机试剂提取，可以实现较高的油脂提取率。本发明提供的发酵方法和十六碳烯酸提取方法设备成本低，工艺方法简单易行，有利于应用于十六碳烯酸油脂的工业化生产，具有良好的实际生产应用价值。

Description

一种酵母菌的高密度发酵及十六碳烯酸提取方法

技术领域

本发明属于生物油脂发酵技术领域，具体涉及一种酿酒酵母的高密度发酵方法，基于该发酵方法在十六碳烯酸生产领域的应用及基于该酿酒酵母提取分离十六碳烯酸的提取方法。

背景技术

公开该背景技术部分的信息仅仅旨在增加对本发明的总体背景的理解，而不必然被视为承认或以任何形式暗示该信息构成已经成为本领域一般技术人员所公知的现有技术。

十六碳烯酸(也即棕榈油酸，C16:1)是一种在自然界中十分珍稀的ω-7单不饱和脂肪酸。经诸多研究证实，十六碳烯酸对一些慢性疾病如代谢综合症、II型糖尿病和炎症具有良好的预防和治疗作用，已经引起人们的广泛关注，并被开发成医药制剂在欧美等一些国家上市，但这些产品的生产原料通常主要来自难以商业化养殖或种植的野生动植物资源，如深海鱼、沙棘、澳洲坚果等，这些野生资源数量极为有限，难以满足市场的需求。酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)是一类安全无害的真核微生物，其主要被用于酿造业和食品加工行业，同时其也是基础与应用研究的主要对象，在食品、医药、饲料、化工等领域应用广泛。酿酒酵母细胞的油脂中含有较高比例的十六碳烯酸，因此其在十六碳烯酸的工业化生产领域具有非常良好的应用前景。但是，通常情况下酿酒酵母的细胞自身并不能大量积累油脂，其油脂含量通常只有细胞干重的5％左右，即使在较常使用的缺氮等产油培养基中诱导培养，其油脂含量也很少超过细胞自身干重的20％，难以满足工业生产的需求，现有研究中对酿酒酵母产油特性的研究较少，而对酿酒酵母细胞中油脂的提取、浓缩以及粗油脂的制备等工艺的研究更是处于完全空白的状态。酿酒酵母产油难度大的原因在于：在发酵培养过程中优先将有机碳源转化成生物量和乙醇而不是进行油脂积累。以酿酒酵母作为油脂生产的工程菌，有机碳源的油脂转化率(也即碳源-油脂得率)很低，单位重量油脂的糖耗高，后期提取分离难度大。上述因素都显著提高了利用酿酒酵母生产富含十六碳烯酸油脂的成本。目前，通过培养基的优化，特别是控制碳氮比等来提高酿酒酵母的油脂含量是最为常用的方法。有文献报道通过响应面法实验对酿酒酵母的培养基进行优化，发酵培养4天后的酿酒酵母油脂含量最高可达14.55％，比培养基优化前有一定程度的提高。尽管如此，这一油脂含量与其他的典型产油微生物(如解脂耶氏酵母、油脂酵母、红酵母等)相比，还有非常大的差距，基本不具有生产应用价值。现有研究还报道了高碳氮比诱导培养酿酒酵母的培养方式，在高有机碳浓度(50g/L)低氮浓度(5mM)的培养基中发酵培养酿酒酵母，其油脂含量可提高到细胞干重的20％。

发明人认为，现有研究结果表明高碳氮比的油脂诱导培养方式对酿酒酵母细胞内油脂积累的促进作用仍然是极为有限的，根本无法满足工业化生产油脂的要求(例如，一般的产油作物和产油微生物的油含量在40％左右，如果低于这一值则认为其产油性价比不高，不适宜用于油脂的生产)。同时，高碳氮比往往会限制微生物的快速生长，导致酿酒酵母发酵液中菌体的生物量(即细胞密度)大幅降低，并使发酵时间延长，造成发酵设备的生产效率和产能降低，且发酵液的进一步浓缩难度也会加大，浓缩成本大幅提高。

发明内容

基于上述技术背景，本发明主要目的在于通过微生物发酵实现十六碳烯酸的制备。针对现有酵母菌发酵油脂存在的缺陷，本发明设计首先通过改善培养方式实现微生物的高密度发酵、提高产能。

因此，本发明第一方面，提供一种酵母菌的高密度发酵方法，所述发酵采用有机碳源，补加方式如下：

在生长期，当发酵液中酵母菌的细胞干重≤10g/L时，有机碳源的补加速率为1～4g/(L·h)，当发酵液中酿酒酵母的细胞干重＞10g/L时，有机碳源的补加速率为发酵液中酵母细胞干重增长速率的2～3倍；

当发酵液中酵母菌的生长达到稳定期后，有机碳源的补加速率为3～5g/(L·h)。

第一方面所述酵母菌为能够产油脂的酵母菌株，包括但不限于酿酒酵母、胶红酵母、解脂亚罗威亚酵母、弯隐球酵母、斯达氏油脂酵母、粘红酵母、产油油脂酵母、出芽丝孢酵母、圆红冬孢酵母、丛生丝孢酵母或白色隐球酵母。优选的方案中，所述酵母菌采用酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)。

现有研究还证实了，碳源的不同对菌株的发酵结果也具有影响，在上述以酿酒酵母作为发酵菌株的方式中，可行的有机碳源为葡萄糖、果糖、麦芽糖、蔗糖、糖蜜、纤维素水解糖中的一种或几种的组合；本发明提供的一种可行的实施方式中，所述有机碳源为葡萄糖；又一种可行的实施方式中，所述有机碳源为葡萄糖、果糖、麦芽糖、蔗糖、糖蜜、淀粉水解糖、纤维素水解糖的组合。

生物油脂是一种清洁能源，通过微生物发酵作用将碳源发酵成为高价值的油脂具有良好的应用前景，但是，通常情况下，微生物更倾向于将底物转化为生物量，现有底物流加方式虽然能够提高微生物的油脂发酵量，但往往以牺牲微生物的生物量为代价，不利于持续性的油脂发酵。针对该现状，本发明首先设计提供了一种微生物的高密度发酵方法。本发明所称的高密度发酵，是指在一定培养条件和体系下，使菌体的密度比普通发酵具有显著性的提高，从而获得更多的油脂生产。进一步的，本发明还设计通过调节有机碳源的补加方式，同时实现微生物的高密度发酵和油脂积累。根据该技术目的，本发明提供了上述分阶段补加碳源的方式，在一种以酿酒酵母作为发酵菌株的实施方式中，采用上述分阶段补加碳源的方式可以在不牺牲酵母生物量的前提下实现酵母菌细胞的高密度发酵，同时保证碳源流向细胞内脂肪酸和油脂的合成，抑制乙醇的累积。特别的，本发明研究发现，采用上述碳源的补加方式，除了能够促进酿酒酵母中油脂的积累，还特异性的提高了油脂中十六碳烯酸的积累。现有研究表明，十六碳烯酸对II型糖尿病、代谢功能综合征、高血压、高血脂等疾病具有显著的预防和治疗效果，是一种具有较高医用价值的原料，本发明提供的培养方式不仅克服了酿酒酵母在油脂发酵方面的不足，还可以解决十六碳烯酸资源不足的问题，具有极大的工业化应用价值、可以产生极其重要的经济效益和社会效益。

本发明第二方面，提供第一方面所述高密度发酵方法获得的酿酒酵母及培养物。

本发明第三方面，提供第一方面所述高密度发酵方法、第二方面所述酿酒酵母及培养物在十六碳烯酸生产领域的应用。

本领域研究证实了十六碳烯酸具有减少炎症，降低血管疾病、中风风险，提高人体对胰岛素敏感性等活性，在工业方面还能够用于合成辛烯等。现有十六碳烯酸的主要来源为鲸油和鱼肝油，以微生物为原料进行十六碳烯酸的相关研究还较少。本发明提供的上述高密度培养方法、酿酒酵母及培养物应用于十六碳烯酸具有重要的工业开发价值，包括但不限于在食品、酿造、医药、饲料、化妆品生产领域的应用。

本发明第四方面，提供一种十六碳烯酸的提取方法，所述提取方法包括采用第一方面所述高密度发酵方法实现油脂蓄积，再从发酵液中回收十六碳烯酸。

应当说明的是，第四方面技术方案中所述发酵液包括酵母菌株及培养物。

所述提取方法包括以下步骤：浓缩上述发酵液得到浓缩液，至浓缩液中酵母菌的细胞干重为100～300g/L；对所述浓缩液中的酵母菌细胞进行破壁处理，向破壁后的菌液中加入有机试剂进行油脂浸提；所述有机试剂选自乙酸乙酯、乙酸丙酯、乙酸丁酯、丙酸乙酯、丁酸乙酯中的一种或几种的混合。

进一步的，所述浓缩通过离心方式实现；一种实施方式中，通过碟式离心机对发酵液进行浓缩；另一种实施方式中，通过酵母分离机进行浓缩。

进一步的，所述破壁处理采用机械破碎方式，如，通过高压细胞破碎仪；一种实施方式中，当浓缩液中细胞干重为100～300g/L时，高压细胞破碎仪的操作压力为600～1200bar；当浓缩液中细胞干重浓度增大时，应适当提高细胞破碎仪的压力；反之亦然。

或，所述破壁处理采用酶解方式；酶解破壁的一种实施方式中，所述酶为碱性蛋白酶，当浓缩液中细胞干重为100～300g/L时，酶用量和细胞干重的比值为0.02～0.05，料液pH为9～10，处理温度为50～55℃，处理时长为≥4小时；酶解破碎后还包括高温灭酶步骤，灭酶温度为95～100℃，保温时间10～20分钟。

进一步的，所述有机试剂的用量为破壁后菌体干重的6～12倍，上述用量的有机试剂可分1～3次进行油脂浸提。

进一步的，上述提取方法中，还包括对有机试剂萃取浸提部分进行分离及浓缩的步骤；所述分离通过静置分离或通过离心分离，分离后保留比重较轻的有机相部分。

进一步的，所述十六碳烯酸油脂的浓缩方法如下：通过减压蒸馏浓缩的方式实现对含油脂相的浓缩，进而获得含十六碳烯酸的油脂，并同时分离出含油脂相中的有机溶剂，其中，所述分离出的有机溶剂可被反复用于破壁处理后的酿酒酵母菌液的油脂浸提。

经本发明探究，上述方式浓缩方式获得的油脂产物中，主要成分为十六碳烯酸，其次还包含十八碳烯酸及少量其他成分，杂质成分较少，对于工业应用而言是一种优质原料；针对该浓缩后的油脂，通过柱层析等方式进行纯化获得十六碳烯酸属于本领域常规的技术方案，不具有技术难度。

以上一个或多个技术方案的有益效果是：

1)通过深入研究发现，本发明提供的技术方法，在利用酿酒酵母进行含十六碳烯酸油脂的制备过程中，通过分阶段调节有机碳源补加速率的方式既可以实现酿酒酵母的高密度发酵(生物量可高达210g/L)，又可使酿酒酵母细胞内乙醇的合成速率大幅降低，而脂肪酸及油脂的合成速率不会受到显著影响，从而促使有机碳源更多地流向脂肪酸及油脂的合成，最终使得酿酒酵母细胞内的油脂大量积累(油脂含量可达到细胞干重的40％以上)，达到含十六碳烯酸油脂的高产。需要说明的是，本发明所提供的方法与现有技术中通过控制培养液中的高碳氮比以促进微生物油脂积累的常规方法并不相同，且其作用原理也完全不同。现有技术中常规做法的作用原理是通过培养液中氮元素的缺乏使微生物的生长和蛋白质的合成受到限制，从而降低蛋白质在细胞中的含量，相对地，细胞中另外两种主要成分油脂和糖类的含量则会得到提高。但这种缺氮诱导的方法对酿酒酵母而言效果非常有限，油脂含量也只能达到细胞干重的20％左右，况且，这种方法还将导致酿酒酵母发酵液中菌体的生物量大幅降低，并使发酵时间延长，造成发酵设备的生产效率和产能降低，经济效益不佳，且发酵液的进一步浓缩难度也会加大，浓缩成本大幅提高。而本发明提供的方法的作用原理是将有机碳源的补加速率与发酵液中酿酒酵母的生物量相关联，通过有机碳源向生物量的转化效率获得补碳速率和生长速率的比值关系，以这一比值进行分阶段补充有机碳源，既可以满足酿酒酵母细胞的快速生长，达到高密度培养的目的，还可避免由于碳源的过剩导致的乙醇的大量积累，同时还可保证有足量的有机碳源流向细胞内脂肪酸和油脂的合成。因此，本发明所提供的方法完全区别于普遍方法。

2)从油脂产量来看，本发明提供的方法可使酿酒酵母的油脂产量达到84g/L以上，而常规方法由于其对生长的限制作用而只能使酿酒酵母的细胞密度达到4g/L左右(由本发明实施例提供)，因此，其油脂产量不足0.8g/L，可见本发明所提供的方法的油脂产量是现有技术中常规方法的105倍以上，有益技术效果极为显著。

3)上述技术方案提供了一种基于酿酒酵母制备含十六碳烯酸油脂的工艺方法，该工艺方法包括：酿酒酵母的高密度发酵培养，酿酒酵母细胞的浓缩，酿酒酵母细胞的破壁，酿酒酵母油脂的浸提、分离以及浓缩等。本发明提供了一整套酿酒酵母油脂生产的技术方法，填补了该领域的技术空白。

4)本发明使用高压细胞破碎仪和/或酶解法对酿酒酵母菌液进行细胞破壁，可以获得较高的细胞破碎率(细胞破碎率可达99％)，可保证细胞内的油脂被充分地提取。同时，高压细胞破碎和/或酶解破壁的方法可以直接使用菌液(或菌泥)进行操作，不需要对物料进行干燥处理，避免了干燥处理过程中大量的能耗。

5)由于酿酒酵母高蛋白含量的细胞特性，使细胞破碎液中的油脂极易乳化而难以使用油脂加工工业中常用的正己烷进行浸提，本发明通过研究提出使用具有一定亲水性的乙酸乙酯等酯类物质对酿酒酵母破碎液中的油脂进行浸提，可获得较高的油脂提取率。同时，乙酸乙酯等酯类物质相比正己烷、氯仿等有机试剂更加绿色安全。

6)本发明所提供的工艺方法简单易行，所需原料、设备成本低，且含十六碳烯酸油脂的生产和获取效率高，有利于其工业化生产应用，具有很好的实际生产应用价值。

附图说明

构成本发明的一部分的说明书附图用来提供对本发明的进一步理解，本发明的示意性实施例及其说明用于解释本发明，并不构成对本发明的不当限定。

图1为实施例1中分阶段调节有机碳源补加速率和氮缺乏培养对酿酒酵母生长和油脂含量的影响；

图2为实施例3中使用高压细胞破碎仪进行细胞破壁时处理条件和细胞破碎率之间的关系；

图3为实施例3中采用酶解法进行细胞破壁时处理条件与细胞破碎率之间的关系；

图4为实施例4中有机试剂种类和有机试剂用量与油脂提取率之间的关系；

图5为实施例5中以不同分离方式获得的有机溶剂回收率；

图6为实施例6中浓缩后酿酒酵母油脂的脂肪酸组成；

图7为实施例7中不同酿酒酵母菌株的油脂含量；

图8为实施例8中不同有机碳源条件下酿酒酵母的油脂含量。

具体实施方式

应该指出，以下详细说明都是例示性的，旨在对本发明提供进一步的说明。除非另有指明，本文使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属技术领域的普通技术人员通常理解的相同含义。

需要注意的是，这里所使用的术语仅是为了描述具体实施方式，而非意图限制根据本发明的示例性实施方式。如在这里所使用的，除非上下文另外明确指出，否则单数形式也意图包括复数形式，此外，还应当理解的是，当在本说明书中使用术语“包含”和/或“包括”时，其指明存在特征、步骤、操作、器件、组件和/或它们的组合。

正如背景技术所介绍的，目前十六碳烯酸主要来源于野生动植物资源，资源匮乏问题导致其市场供应不足。而随着我国老龄化进程的加速，糖尿病、高血压、高血脂等代谢功能综合征相关疾病的发病率快速上升，高血压、高血脂、高血糖等“三高”等成为中老年人群健康的头号杀手。因此，本发明所提供的方法恰好可以解决十六碳烯酸资源不足的问题，满足“三高”等代谢综合紊乱征疾病的预防、管控和治疗需要，具有重要的工业化生产及应用价值和社会效益。为了解决如上的技术问题，本发明提供了一种基于酿酒酵母高密度发酵实现十六碳烯酸生产的方式。

为了使得本领域技术人员能够更加清楚地了解本发明的技术方案，以下将结合具体的实施例与对比例详细说明本发明的技术方案。

以下实施例中，实施例1～6、8采用的酿酒酵母的编号为SC-17，购买自弗曼迪斯酵母公司，商品型号为S-23。

实施例1

酿酒酵母的高密度发酵及酿酒酵母油脂的制备，具体实施步骤如下：

以葡萄糖为有机碳源，通过连续流加补料的方式补加有机碳源培养酿酒酵母，在培养过程中间隔取样测定培养液中酿酒酵母的细胞密度(生物量，细胞干重，g/L)，并相应调整葡萄糖母液的流加速度：

处理组1，当生物量≤10g/L时，有机碳源补加速率调节为1g/(L·h)，当生物量＞10g/L时，有机碳源的补加速率调节为发酵液中酿酒酵母生物量增长速率的2倍，当发酵液中酿酒酵母的生长达到稳定期后，有机碳源的补加速率调节为3g/(L·h)；

处理组2，当生物量≤10g/L时，有机碳源补加速率调节为2g/(L·h)，当生物量＞10g/L时，有机碳源的补加速率调节为发酵液中酿酒酵母生物量增长速率的2倍，当发酵液中酿酒酵母的生长达到稳定期后，有机碳源的补加速率调节为3g/(L·h)；

处理组3，当生物量≤10g/L时，有机碳源补加速率调节为4g/(L·h)，当生物量＞10g/L时，有机碳源的补加速率调节为发酵液中酿酒酵母生物量增长速率的2倍，当发酵液中酿酒酵母的生长达到稳定期后，有机碳源的补加速率调节为3g/(L·h)；

处理组4，当生物量≤10g/L时，有机碳源补加速率调节为2g/(L·h)，当生物量＞10g/L时，有机碳源的补加速率调节为发酵液中酿酒酵母生物量增长速率的3倍，当发酵液中酿酒酵母的生长达到稳定期后，有机碳源的补加速率调节为5g/(L·h)；

处理组5，为氮缺乏组，即培养基中不添加任何氮源，从培养开始至培养结束，有机碳源补加速率保持为3g/(L·h)。

所有处理组培养6天后测定培养液中酿酒酵母的生物量(重量法)及其油脂含量(氯仿-甲醇法)。其他培养条件为酿酒酵母培养常规条件。

培养结束后，利用酵母分离机对发酵液中酿酒酵母细胞进行浓缩，浓缩液的细胞密度为300g/L，之后使用高压细胞破碎仪对酿酒酵母浓缩液进行细胞破壁，破壁时采用的操作压力为1200bar，之后用12份乙酸乙酯对1份酿酒酵母细胞破碎液中的油脂进行浸提，之后，使用离心的方法分离获得含油脂相，最后通过减压蒸馏浓缩的方法获得含十六碳烯酸的油脂，以及可重复使用的有机溶剂乙酸乙酯，对油脂的浸提过程重复操作3次。

结果如图1所示，除处理组5以外，其他处理组的生物量均可以达到150g/L以上，最高可达到210g/L，油脂含量均可达到细胞干重的40％以上。而在处理组5中，酿酒酵母的生物量只有4g/L，油脂含量只有细胞干重的20％，通过计算可知，通过与生物量相关联的分阶段调节有机碳源补加速率来培养酿酒酵母，其所获得的油脂产率是现有技术中常规方法(缺氮诱导法)的105倍，有益技术效果极为显著。

实施例2

发酵结束后，发酵液中酿酒酵母细胞的浓缩，具体实施步骤如下：

在实施例1的各条件下发酵培养酿酒酵母，培养结束后，分别使用酵母分离机和碟式离心机对发酵液进行处理，收集浓缩后的酿酒酵母菌液，使浓缩液中酵母细胞的生物量为100～300g/L。

实施例3

酿酒酵母浓缩液的细胞破壁，具体实施步骤如下：

在实施例2中经过浓缩处理的酿酒酵母菌液，在本实施例中分别使用高压细胞破碎仪和酶解法对其进行细胞破壁处理。其中，采用高压细胞破碎仪时：

处理组1，进料浓度为细胞干重100g/L，操作压力为600bar；

处理组2，进料浓度为细胞干重200g/L，操作压力为900bar；

处理组3，进料浓度为细胞干重300g/L，操作压力为1200bar；

采用酶解法时：

处理组1，所用酶为碱性蛋白酶，料液中酿酒酵母的细胞干重为300g/L，酶用量和细胞干重的比值为0.05，料液pH为9，处理温度为50℃，处理时长为4小时；

处理组2，所用酶为β-葡聚糖酶，料液中酿酒酵母的细胞干重为300g/L，酶用量和细胞干重的比值为0.05，料液pH为7，处理温度为50℃，处理时长为4小时；

处理组3，所用酶为中性蛋白酶，料液中酿酒酵母的细胞干重为300g/L，酶用量和细胞干重的比值为0.05，料液pH为7，处理温度为50℃，处理时长为4小时；

处理组4，所用酶为碱性蛋白酶，料液中酿酒酵母的细胞干重为100g/L，酶用量和细胞干重的比值为0.05，料液pH为9，处理温度为50℃，处理时长为4小时；

处理组5，所用酶为碱性蛋白酶，料液中酿酒酵母的细胞干重为200g/L，酶用量和细胞干重的比值为0.05，料液pH为9，处理温度为50℃，处理时长为4小时；

处理组6，所用酶为碱性蛋白酶，料液中酿酒酵母的细胞干重为300g/L，酶用量和细胞干重的比值为0.02，料液pH为9，处理温度为50℃，处理时长为4小时；

处理组7，所用酶为碱性蛋白酶，料液中酿酒酵母的细胞干重为300g/L，酶用量和细胞干重的比值为0.05，料液pH为10，处理温度为50℃，处理时长为4小时；

处理组8，所用酶为碱性蛋白酶，料液中酿酒酵母的细胞干重为300g/L，酶用量和细胞干重的比值为0.05，料液pH为9，处理温度为55℃，处理时长为4小时，处理结束后进行高温灭酶，灭酶温度为95℃，保温时间20分钟；

处理组9，所用酶为碱性蛋白酶，料液中酿酒酵母的细胞干重为300g/L，酶用量和细胞干重的比值为0.05，料液pH为9，处理温度为50℃，处理时长为8小时，处理结束后进行高温灭酶，灭酶温度为100℃，保温时间10分钟。

处理组10，所用酶为碱性蛋白酶，料液中酿酒酵母的细胞干重为300g/L，酶用量和细胞干重的比值为0.05，料液pH为9，处理温度为50℃，处理时长为12小时，处理结束后进行高温灭酶，灭酶温度为100℃，保温时间10分钟。

破壁操作结束后，使用血球计数板对细胞破碎率进行统计。

采用高压细胞破碎仪进行细胞破壁的结果如图2所示，在进料浓度为细胞干重100～300g/L，操作压力为600～1200bar的条件下，酿酒酵母的细胞破碎率为72％～99％。

采用酶解法进行细胞破壁的结果如图3所示，β-葡聚糖酶和中性蛋白酶的酶解破壁效果不佳，为30％左右，碱性蛋白酶的破壁效果较好，可达到50％左右，进一步，在料液中酿酒酵母的细胞干重为100～300g/L，酶用量和细胞干重的比值为0.02～0.05，料液pH为9～10，处理温度为50～55℃，处理时长为≥4小时的条件下，酿酒酵母细胞的破碎率为51％～92％。

实施例4

酿酒酵母破壁处理后油脂的浸提，具体实施步骤如下：

分别以氯仿/甲醇(1:1，v/v)、氯仿、正己烷、石油醚、二氯甲烷、乙酸乙酯、乙酸丙酯、乙酸丁酯、丙酸乙酯、丁酸乙酯等有机溶剂对实施例3中破壁处理后的酿酒酵母菌液进行油脂浸提，设置以下的处理组：

处理组1，1份酵母干重使用6份氯仿/甲醇(1:1，v/v)，浸提1次；

处理组2，1份酵母干重使用6份氯仿，浸提1次；

处理组3，1份酵母干重使用6份正己烷，浸提1次；

处理组4，1份酵母干重使用6份石油醚，浸提1次；

处理组5，1份酵母干重使用6份二氯甲烷，浸提1次；

处理组6，1份酵母干重使用6份乙酸乙酯，浸提1次；

处理组7，1份酵母干重使用9份乙酸乙酯，浸提1次；

处理组8，1份酵母干重使用12份乙酸乙酯，浸提1次；

处理组9，1份酵母干重使用6份乙酸丙酯，浸提1次；

处理组10，1份酵母干重使用12份乙酸丙酯，浸提1次；

处理组11，1份酵母干重使用6份乙酸丁酯，浸提1次；

处理组12，1份酵母干重使用12份乙酸丁酯，浸提1次；

处理组13，1份酵母干重使用6份丙酸乙酯，浸提1次；

处理组14，1份酵母干重使用12份丙酸乙酯，浸提1次；

处理组15，1份酵母干重使用6份丁酸乙酯，浸提1次；

处理组16，1份酵母干重使用12份丁酸乙酯，浸提1次；

处理组17，1份酵母干重使用6份乙酸乙酯，浸提2次；

处理组18，1份酵母干重使用6份乙酸乙酯，浸提3次。

将上述每一个处理组充分混匀后离心，分离出含油脂的有机相，以重量法计算每个处理组的油脂提取率，其中，以常规使用的干粉研磨-氯仿/甲醇浸提所测得的油脂含量作为计算油脂提取率的参比。

结果如图4所示，在各种有机试剂中，虽然氯仿的油脂提取率可以达到80％以上，但考虑到其具有一定的毒性，不适宜在酿酒酵母油脂的工业化生产中使用，而正己烷、石油醚、二氯甲烷等有机试剂的油脂提取率较低，主要是因为酿酒酵母细胞破壁液中的油滴和蛋白质混合极易发生乳化，导致油滴难以释放到有机相中，造成提取效率偏低，因此，这些有机试剂也不适宜在工业化生产中使用。乙酸乙酯、乙酸丙酯、乙酸丁酯、丙酸乙酯、丁酸乙酯等有机溶剂对酿酒酵母细胞破壁液中油脂的浸提效率较高，在有机溶剂的使用量为每1份酵母细胞干重使用6～12份有机溶剂、浸提过程只进行1次或重复1～3次的条件下，油脂提取率可以达到80％～98％，提取效果非常理想，这主要是因为这些酯类化合物具有一定的亲水性，可以改变乳化液中乳化颗粒的表面特性，使油滴更容易释放到有机试剂中，进而提高油脂提取率。更重要的是这些酯类化合物还具有绿色安全的特点，非常适合在工业化生产中使用。

实施例5

浸提混合液中含油脂相的分离，具体实施步骤如下：

分别以12份乙酸乙酯、乙酸丙酯、乙酸丁酯、丙酸乙酯和丁酸乙酯对含有1份酿酒酵母细胞干重的细胞破碎液(由实施例3获得)进行其中油脂的浸提，充分混匀之后，分别以离心和静置两种方式对混合液进行处理，其中，离心条件为转速6000rpm，离心10分钟，静置条件为静置4小时。之后使用分液漏斗分离出含有油脂的有机相(上层)，测量有机相的重量，计算有机相的回收率。

结果如图5所示，离心分离后各有机溶剂的回收率可以达到95％～100％，静置分离后各有机溶剂的回收率可以达到85％～96％，两种方式都可以获得良好的分离效果。

实施例6

含油脂有机相的浓缩以及浓缩后酿酒酵母油脂的脂肪酸组成，具体实施步骤如下：

对实施例5中获得的含油脂的有机相(以乙酸乙酯为例)通过减压蒸馏浓缩的方式进行浓缩分离，具体操作压力和温度以处理液不产生爆沸现象为宜，并随着有机相的不断被分离，逐步适宜地提高加热温度以加快减压蒸馏浓缩的进程。直至有机溶剂完全被蒸出，采用气相色谱法测定浓缩后油脂的脂肪酸组成。脂肪酸测定结果如图6所示，酿酒酵母油脂的脂肪酸组成中以十六碳烯酸(C16:1)为主，其占总脂肪酸的50％左右。如前所述，十六碳烯酸是一种在自然界中极为稀有且价格非常昂贵的单不饱和脂肪酸，它在医药、保健品以及食品等领域具有非常重要的应用价值。而采用本发明所提供的工艺方法可以大幅提高富含十六碳烯酸的酿酒酵母油脂含量，同时，本发明也提供了一整套酿酒酵母油脂的制备工艺，填补了该领域的技术空白，从而有效解决了十六碳烯酸资源不足的问题，具有极大的工业化应用价值，也具有很好的社会效益和经济效益。

实施例7

不同酿酒酵母菌株在分阶段调节有机碳源补加速率培养条件下的油脂含量，具体实施步骤如下：

以葡萄糖为有机碳源，通过分阶段调节有机碳源补加速率的方式培养40株酿酒酵母菌株，这些酿酒酵母菌株均通过商业渠道购买得到，分别编号为SC1至SC40，其中，SC1～SC6购买自安琪酵母公司(SY葡萄酒酵母、RW葡萄酒酵母、普通型酵母、低糖型酵母、耐高糖型酵母、白酒酵母)，SC7～SC17购买自弗曼迪斯酵母公司(S-33、BE-134、S-04、US-05、BE-256、WB-06、T-58、K-97、W-34/70、S-189、S-23)，SC18～SC32购买自红树杰克酵母公司(M44、M05、M21、M76、M36、M20、M02、M29、M42、M47、M41、M54、M84、M15、M31)，SC33～SC40购买自拉曼酵母公司(型号分别为温莎英式艾尔、赛森、慕尼黑、比利时修道院、钻石、西海岸BRY-97、伦敦ESD、诺丁汉)。分阶段补加有机碳源的具体条件为：当生物量≤10g/L时，有机碳源补加速率调节为2g/(L·h)，当生物量＞10g/L时，有机碳源的补加速率调节为发酵液中酿酒酵母生物量增长速率的3倍，当发酵液中酿酒酵母的生长达到稳定期后，有机碳源的补加速率调节为5g/(L·h)。培养6天后测定发酵液中酿酒酵母细胞的油脂含量(氯仿-甲醇法)。

结果如图7所示，通过分阶段调节有机碳源补加速率培养40株不同编号的酿酒酵母菌株，这些酿酒酵母菌株细胞内的油脂含量均可达到40％左右。说明本方法对酿酒酵母菌株具有广泛的适用性。

实施例8

不同种类的有机碳源在分阶段调节有机碳源补加速率的培养条件下，对酿酒酵母油脂含量的影响，具体实施步骤如下：

分别以葡萄糖、果糖、麦芽糖、蔗糖、糖蜜、淀粉水解糖、纤维素水解糖为有机碳源，通过分阶段调节有机碳源补加速率的方式培养酿酒酵母。分阶段补加有机碳源的具体条件为：当生物量≤10g/L时，有机碳源补加速率调节为2g/(L·h)，当生物量＞10g/L时，有机碳源的补加速率调节为发酵液中酿酒酵母生物量增长速率的3倍，当发酵液中酿酒酵母的生长达到稳定期后，有机碳源的补加速率调节为5g/(L·h)。培养6天后测定发酵液中酿酒酵母细胞的油脂含量(氯仿-甲醇法)。

结果如图8所示，在各种有机碳源条件下，分阶段调节有机碳源补加速率都可以使酿酒酵母的油脂含量达到40％左右。因此，本方法对各种常用的有机碳源都具有适用性。

实施例9

酿酒酵母油脂在各类食用油中的添加应用，具体实施步骤如下：

将实施例6中获得的酿酒酵母油脂按不同比例添加于大豆油、花生油和橄榄油中，并测定各混合油脂中的脂肪酸组成。由于大豆油、花生油和橄榄油等常用食用油中十六碳烯酸的含量很低，仅有总脂肪酸的0.2％～3.5％，当适量添加酿酒酵母油脂后，可以显著提高其十六碳烯酸的含量。结果表明，按照1:9的比例将酿酒酵母油脂和各种食用油混合后，十六碳烯酸的含量可以提高至6％左右，当按照1:4的比例进行混合后，十六碳烯酸的含量可以提高至12％左右。由此可见，仅需添加少量的酿酒酵母油脂即可显著提高各种食用油中十六碳烯酸的含量。

实施例10

高油脂含量的酿酒酵母在酿造产品中的添加应用，具体实施步骤如下：

将1份实施例1中获得的高油脂含量的酿酒酵母菌体添加到100份啤酒发酵液中，在继续发酵的过程中，由于细胞的衰亡和自溶，会使酿酒酵母细胞内的油脂释放到发酵液中，有助于提高啤酒产品中游离脂肪酸(主要是有益于生理健康的十六碳烯酸)的含量，增加啤酒的营养价值。

实施例11

酿酒酵母油脂胶囊的制备，具体实施步骤如下：

将实施例6中获得的酿酒酵母油脂，经过滤除杂之后，与明胶、甘油、山梨醇等其他原材料一起，使用自动旋转轧囊机制备成含有酿酒酵母油脂的胶囊。由于酿酒酵母油脂中含有的十六碳烯酸对一些慢性疾病如代谢综合症、II型糖尿病和炎症等具有良好的预防和治疗作用，因此其胶囊产品可应用于医药、保健品等领域。

实施例12

酿酒酵母菌体及其油脂在饲料中的添加应用，具体实施步骤如下：

将2份实施例1中获得的高油脂含量的酿酒酵母菌体和1份实施例6中获得的酿酒酵母油脂分别与10份玉米粉混合制作成饲料，以该饲料喂养1日龄商品肉鸡，以完全玉米粉饲料作为对照。喂养实验持续40天，所有受试肉鸡均自由采食和饮水，每20天随机取20羽肉鸡个体测量其体重，喂养实验结束后计算平均日生长量与成活率。结果表明，以酿酒酵母菌粉和酿酒酵母油脂与玉米粉混合的饲料喂养肉鸡时，40天后的平均体重和成活率均高于对照组。由此可见，酿酒酵母菌粉和酿酒酵母油脂适于作为肉鸡的饲料，其与玉米粉的混合饲料的喂养效果优于完全玉米粉饲料。

实施例13

酿酒酵母油脂用于面膜的制作，具体实施步骤如下：

将10份实施例6中获得的酿酒酵母油脂与1份丁二醇、5份蜂蜜、50份蒸馏水混合，加热至55℃，持续搅拌并维持温度20分钟，待冷却至40℃，加入3份酸奶，持续搅拌并维持温度20分钟。待冷却后制得含有酿酒酵母油脂的面膜。将所制得的酿酒酵母油脂面膜均匀涂于皮肤表面，并辅以轻柔按摩，20分钟后将面膜洗去。经试用，酿酒酵母油脂面膜具有良好的补水、美白、除皱以及消炎效果。

以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种酵母菌的高密度发酵方法，其特征在于，所述发酵采用有机碳源，补加方式如下：

在生长期，当发酵液中酵母菌的细胞干重≤10g/L时，有机碳源的补加速率为1～4g/(L·h)，当发酵液中酿酒酵母的细胞干重＞10g/L时，有机碳源的补加速率为发酵液中酵母细胞干重增长速率的2～3倍；当发酵液中酵母菌的生长达到稳定期后，有机碳源的补加速率为3～5g/(L·h)。

2.如权利要求1所述酵母菌的高密度发酵方法，其特征在于，所述酵母菌为能够产油脂的酵母菌株，包括但不限于酿酒酵母、胶红酵母、解脂亚罗威亚酵母、弯隐球酵母、斯达氏油脂酵母、粘红酵母、产油油脂酵母、出芽丝孢酵母、圆红冬孢酵母、丛生丝孢酵母或白色隐球酵母；

进一步优选的，所述酵母菌采用酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)。

3.如权利要求1所述酵母菌的高密度发酵方法，其特征在于，所述有机碳源为葡萄糖、果糖、麦芽糖、蔗糖、糖蜜、纤维素水解糖中的一种或几种的组合；

具体的，所述有机碳源为葡萄糖；

具体的，所述有机碳源为葡萄糖、果糖、麦芽糖、蔗糖、糖蜜、淀粉水解糖、纤维素水解糖的组合。

4.权利要求1-3任一项所述高密度发酵方法获得的酿酒酵母及培养物。

5.权利要求1-3任一项所述高密度发酵方法、权利要求4所述酿酒酵母及培养物在十六碳烯酸生产领域的应用。

6.如权利要求1-3任一项所述高密度发酵方法、权利要求4所述酿酒酵母及培养物在十六碳烯酸生产领域的应用，其特征在于，所述应用领域包括但不限于食品、酿造、医药、饲料、化妆品生产领域的应用。

7.一种十六碳烯酸的提取方法，其特征在于，所述提取方法包括采用权利要求1-3任一项所述高密度发酵方法实现油脂蓄积，再从发酵液中回收十六碳烯酸。

8.如权利要求7所述十六碳烯酸的提取方法，其特征在于，所述提取方法包括以下步骤：浓缩上述发酵液得到浓缩液，至浓缩液中酵母菌的细胞干重为100～300g/L；对所述浓缩液中的酵母菌细胞进行破壁处理，向破壁后的菌液中加入有机试剂进行油脂浸提；所述有机试剂选自乙酸乙酯、乙酸丙酯、乙酸丁酯、丙酸乙酯、丁酸乙酯中的一种或几种的混合。

9.如权利要求8所述十六碳烯酸的提取方法，其特征在于，所述浓缩通过离心方式实现；

优选的，通过碟式离心机对发酵液进行浓缩；或，通过酵母分离机进行浓缩；

优选的，所述破壁处理采用机械破碎方式，具体的，通过高压细胞破碎仪，当浓缩液中细胞干重为100～300g/L时，高压细胞破碎仪的操作压力为600～1200bar；

或，所述破壁处理采用酶解方式；具体的，所述酶为碱性蛋白酶，当浓缩液中细胞干重为100～300g/L时，酶用量和细胞干重的比值为0.02～0.05，料液pH为9～10，处理温度为50～55℃，处理时长为≥4小时；酶解破碎后还包括高温灭酶步骤，灭酶温度为95～100℃，保温时间10～20分钟。

10.如权利要求8所述十六碳烯酸的提取方法，其特征在于，所述有机试剂的用量为破壁后菌体干重的6～12倍，上述用量的有机试剂可分1～3次进行油脂浸提；

或，上述提取方法中，还包括对有机试剂萃取浸提部分进行分离及浓缩的步骤；所述分离通过静置分离或通过离心分离，分离后保留比重较轻的有机相部分；所述浓缩通过减压蒸馏的方式对有机相部分进行浓缩，以获得含十六碳烯酸的油脂。

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