CN105713936B - 微生物油的制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种微生物油及其制备方法，其多不饱和脂肪酸的含量大于30wt%，甘油三酯含量小于90wt%，甘油二酯含量不低于5wt%且不高于20 wt%。其制备包括以下步骤：利用产油微生物发酵得到富含PUFA微生物油的发酵液；收集富含PUFA微生物油的菌体，萃取过滤后得到混合油；在混合油中加入脂肪酶和水进行酶解，纯化后得到微生物油，或向混合油中添加含有甘油二酯的混合物，混合均匀后去除溶剂得到微生物油。其含有适量的甘油二酯，有利于微生物油形成稳定的乳化液。在制备微胶囊的过程中，能使微生物油更好地被包埋，进而可降低微胶囊的表面油含量，提高微胶囊的抗氧化能力，并可适度延长微胶囊的货架期，有利于后续进一步的生产及利用。

Description

微生物油的制备方法
技术领域
本发明涉及一种微生物油的制备方法。
背景技术
多不饱和脂肪酸（polyunsaturated fatty acid，PUFA）是指含有两个或两个以上双键的脂肪酸，一般含18~22个碳原子。工业化的PUFA大多由真菌、藻类等单细胞微生物产生，故也称为微生物油。
多不饱和脂肪酸因其结构特点主要分为ω-3及ω-6两个系列。ω-3系列包括十八碳三烯酸（俗称α-亚麻酸，ALA）、二十碳五烯酸（EPA）、二十二碳六烯酸（DHA）。ω-6系列包括十八碳二烯酸（俗称亚油酸，LA）、十八碳三烯酸（俗称γ-亚麻酸，GLA）、二十碳四烯酸（俗称花生四烯酸）。多不饱和脂肪酸是人体细胞膜磷脂的主要成分，对细胞膜功能有决定性影响。一些特定的多不饱和脂肪酸如花生四烯酸和DHA是脑和视网膜中两种主要的多不饱和脂肪酸，特别对于胎儿和婴幼儿影响显著，摄入不足可能导致脑功能和视神经发育障碍。
工业化生产得到的微生物油主要是以甘油酯的形式存在。甘油酯是甘油与脂肪酸酯化而成的化合物，根据反应程度的不同，分为甘油一酯（单甘酯、MG）、甘油二酯（双甘酯、DG）、甘油三酯（甘三酯、TG）。其中，甘油三酯（TG）由3分子脂肪酸和1分子甘油酯化而成，是体内能量的主要来源，也是自然界各类生物体内油脂储存的主要形式。甘油二酯（DG）是由2分子脂肪酸与1分子甘油酯化得到的产物，是油脂的天然成分，也是油脂在人体内代谢的中间产物。同时，甘油二酯还是细胞内肌醇磷脂信号传递途径的中间物质。
工业化生产得到的微生物油很多都是功能性或针对性很强的油脂，一般用于大众消费品如乳制品的添加剂或营养强化剂，很少直接食用。由于其富含多不饱和脂肪酸，很容易被氧化而导致风味恶化，因此其在用作食品添加剂或营养强化剂时，通常需要先进行微胶囊包埋处理。微胶囊包埋主要是将微生物油芯材与适当材料及水混合、剪切、均质、乳化后，在喷雾干燥的同时加入壁材（例如麦芽糊精等）进行包埋，使油脂被紧密包裹于壁材中。这样的微胶囊产品既可以防止油脂被氧化，又能改善产品的风味和口感。通常情况下，油脂的乳化性能越强，则包埋效果越好，所生产出来的微胶囊风味和稳定性也越好。
公开号为CN1662642A的专利申请公开了一种含有至少40%多不饱和脂肪酸的微生物油，该微生物油中的甘油三酯含量大于90%。该微生物油存在以下缺陷：由于甘油三酯无亲水基团，无乳化性能，因此，该微生物油的乳化性能较差。在后续微胶囊生产的过程中，微生物油不能形成良好的包埋，最终得到的微胶囊产品，其表面油含量较高，不利于后续进一步的生产及应用。
因此，提供一种改进的微生物油实为必要。
发明内容
本发明的主要目的是提供一种制备上述微生物油的方法。
本发明的次要目的是提供一种具有良好包埋效果、表面油含量低的微胶囊。
为达到上述主要目的，本发明提供一种微生物油的制备方法，所述微生物油中，多不饱和脂肪酸的含量大于30wt%，甘油三酯含量小于90wt%，甘油二酯含量不低于5wt%且不高于20 wt %，所述制备方法包括以下步骤：(1) 利用产油微生物发酵得到富含多不饱和脂肪酸的生物油的发酵液；(2) 收集富含多不饱和脂肪酸微生物油的菌体，萃取过滤后得到混合油；(3) 在混合油中加入脂肪酶和水进行酶解，纯化后得到微生物油。
上述方案中，步骤（2）收集菌体之前，将发酵液通过离心或者压滤方式实现固液分离。
上述方案中，在步骤（3）之后对微生物油进行精制。
上述方案中，步骤（3）中，酶解参数包括：在脂肪酶最适温度下搅拌反应0.5~2小时，脂肪酶用量为混合油质量的0.25wt%~2wt%，水用量为混合油质量的15wt%-30 wt%。
上述方案中，步骤（3）中，的纯化工艺包括分离水相和油相；过滤除去脂肪酶，蒸发除去溶剂；分子蒸馏设备除去游离脂肪酶。
本发明的微生物油的制备方法具有如下有益效果：
使用该方法制备的微生物油中含有适量的甘油二酯，由于甘油二脂具有较好的乳化性能，其有利于微生物油形成稳定的乳化液。在制备微胶囊的过程中，能使微生物油更好地被包埋，进而可降低微胶囊的表面油含量，提高微胶囊的抗氧化能力，并可适度延长微胶囊的货架期，有利于后续进一步的生产及利用。
具体实施方式
以下实施例更详细的说明本发明的微生物油生产及应用方法。
实施例一
以高山被孢霉为出发菌种，详细描述本发明含有花生四烯酸的微生物油的生产及应用。
1.发酵
配制葡萄糖含量为0.03g/mL、酵母粉含量为0.02g/mL的培养基溶液于500ml摇瓶中，可配制多瓶，灭菌后接入适量高山被孢霉菌丝及孢子，置于28℃恒温摇床，150rpm，2天后合并摇瓶，移入已灭菌的、盛放有葡萄糖含量为0.03g/mL、酵母粉含量为0.02g/mL的培养基溶液的1m3发酵罐（一级种子罐）中，持续通入无菌空气，保持培养温度28±2℃。一级种子罐培养2天后，将全部培养液移入已灭菌的、盛放有葡萄糖含量为0.03g/mL、酵母粉含量为0.02g/mL的培养基溶液的10m3发酵罐（二级种子罐）中，持续通入无菌空气，保持培养温度28±2℃。二级种子罐培养1天后，将全部培养液移入已灭菌的、盛放有葡萄糖含量为0.05g/mL、酵母粉含量为0.02g/mL的培养基溶液的45m3发酵罐中，持续通入无菌空气，保持培养温度28±2℃，根据葡萄糖消耗速度分批补加总量约0.02~0.05g/mL培养基溶液的灭菌葡萄糖溶液，再培养7天后可获得发酵产物，其中生物质含量32g/L、菌体干基中总油含量51.9wt%、总油中花生四烯酸含量50.4wt%。
2.制备富含花生四烯酸的微生物油
可采用以下不同的工艺手段制备本发明的微生物油。
手段一
将发酵产物通过离心或压滤方式实现固液分离，收集湿菌体，利用粉碎机破碎，再通过沸腾干燥塔烘干，得到干菌体。将干菌体与有机溶剂如丁烷或己烷混合浸泡萃取，过滤后得到混合油。
向混合油中加入市售脂肪酶和水进行酶解处理，该市售脂肪酶具有将甘油酯水解的功能，下述实施例均与此相同。所述的酶解处理参数包括：脂肪酶用量为微生物混合油重量的0.25wt%；水用量为微生物混合油重量的15wt%，反应温度约37℃，搅拌反应时间0.5h。酶解反应结束后对混合油进行纯化，纯化的具体步骤包括：将混合油静置，待油相与水相分层后，除去水层，过滤除去酶，蒸发脱除溶剂，通过分子蒸馏设备除去游离脂肪酸，得到微生物粗油。测得该粗油具有如下指标：多不饱和脂肪酸含量61.5wt%，TG含量88.7wt%，DG含量5.5wt%。
更进一步的，对上述微生物粗油进行精制，精制的步骤包括：将该微生物粗油经2.5wt%柠檬酸和5wt%热水脱胶、过量氢氧化钠溶液脱酸，沉降分离，过滤后再用5wt%二氧化硅及3wt%活性炭脱色，再次过滤后，在200℃的条件下直接蒸汽脱臭，添加Vc棕榈酸酯和Ve作为抗氧化剂，得到含有花生四烯酸的微生物精制油。经测定，该精制油中多不饱和脂肪酸总含量62.0 wt %，TG含量为89.8 wt %，DG含量为6.3 wt %。
进一步测定该微生物精制油的部分理化指标：不皂化物1.1 wt%，水分0.01 wt%，不溶性杂质0.01 wt%，溶剂残留<1.0 mg/kg，酸价0.1 mgKOH/g，过氧化值0.03 meq/kg，反式脂肪酸0.06 wt%，黄曲霉毒素B1<5.0μg/kg，总砷（以As计）<0.1mg/kg，铅<0.1 mg/kg。
手段二
该工艺手段与手段一基本相同，不同之处在于酶解处理工艺参数：脂肪酶用量为微生物混合油重量的0.5wt%，水量为微生物混合油重量的20wt%，反应时间为 1h。得到的微生物粗油中，多不饱和脂肪酸含量61.7wt%，TG含量87.0wt%，DG含量7.2wt%。
使用与手段一中相同的精制工艺对本微生物粗油进行精制，得到的微生物精制油中，多不饱和脂肪酸总含量61.5wt%，TG含量88.4wt %，DG含量8.8wt %，其他理化指标与手段一获得的理化指标接近。
手段三
该工艺手段与手段一基本相同，不同之处在于酶解处理工艺参数：脂肪酶用量为微生物混合油重的1wt%，水量为微生物混合油重的20wt%，反应时间为1.5h。得到的微生物粗油中，多不饱和脂肪酸含量60.0wt%，TG含量84.0wt%，DG含量10.5wt%。
使用与手段一中相同的精制工艺对本微生物粗油进行精制，得到的微生物精制油中，多不饱和脂肪酸总含量61wt%，TG含量为85.3wt %，DG含量为11.4wt %，其他理化指标与手段一获得的理化指标接近。
手段四
该工艺手段与手段一基本相同，不同之处在于酶解处理工艺参数：脂肪酶用量为微生物混合油重的1wt%，水量为微生物混合油重的25wt%，反应时间为2h。得到的微生物粗油中，多不饱和脂肪酸含量65.0wt%，TG含量78.4wt%，DG含量13.7wt%。
使用与手段一中相同的精制工艺对本微生物粗油进行精制，得到的微生物精制油中，多不饱和脂肪酸总含量为63.8wt%，TG含量为80.9wt%，DG含量为15.1wt%，其他理化指标与手段一获得的理化指标接近。
手段五
该工艺手段与手段一基本相同，不同之处在于酶解处理工艺参数：脂肪酶用量为微生物混合油重的2wt%，水量为微生物混合油重的30wt%，反应时间为2h。得到的微生物粗油中，多不饱和脂肪酸含量57.9wt%，TG含量75.3wt%，DG含量17.8wt%。
使用与手段一中相同的精制工艺对本微生物粗油进行精制，得到的微生物精制油中，多不饱和脂肪酸总含量60wt%，TG含量为77.2wt%，DG含量为19.1wt%，其他理化指标与手段一获得的理化指标接近。
手段六
将发酵产物通过离心或压滤方式实现固液分离，收集湿菌体，利用粉碎机破碎，再通过沸腾干燥塔烘干，得到干菌体。将干菌体与有机溶剂如丁烷或己烷混合浸泡萃取，过滤后得到混合油。
向混合油中添加含甘油二酯的混合物，例如脂肪酸单双甘酯或其类似物，该混合物中甘油二酯含量为31.4wt%，添加混合物的比重为总混合油的11.5wt%。对混合油脱溶，混合均匀后得到微生物粗油。该微生物粗油具有如下指标特征：多不饱和脂肪酸含量38.0wt%，TG含量86.7wt%，DG含量5.1wt%。
更进一步的，对上述微生物粗油进行精制，精制的步骤包括：将该微生物粗油经2.5wt%柠檬酸和5wt%热水脱胶、过量氢氧化钠溶液脱酸，沉降分离，过滤后再用5wt%二氧化硅及3wt%活性炭脱色，过滤后，在200℃的条件下直接蒸汽脱臭，添加Vc棕榈酸酯和Ve作为抗氧化剂，得到含有花生四烯酸的微生物精制油。经测定，该精制油中多不饱和脂肪酸总含量达37.0 wt %，TG含量为 89.2 wt %，DG含量为6.4 wt %。
进一步测定该微生物精制油的部分理化指标：不皂化物1.0 wt%，水分0.01 wt%，不溶性杂质0.01 wt%，溶剂残留<1.0 mg/kg，酸价0.1 mgKOH/g，过氧化值0.03 meq/kg，反式脂肪酸0.04 wt%，黄曲霉毒素B1<5.0μg/kg，总砷（以As计）<0.1mg/kg，铅<0.1 mg/kg。
手段七
该工艺手段与手段六基本相同，不同之处在于：含甘油二酯混合物中，甘油二酯含量为50.8wt%，添加的混合物的比重为总混合油的17.5wt%。得到的微生物粗油中，多不饱和脂肪酸含量41.4wt%，TG含量81.2wt%，DG含量10.4wt%。
更进一步的，使用与手段六相同的精制工艺对本微生物粗油进行精制，得到的微生物精制油中，多不饱和脂肪酸总含量40.4wt %，TG含量为83.6wt %，DG含量为12.2wt %，其他理化指标与手段六获得的理化指标接近。
手段八
该工艺手段与手段六基本相同，不同之处在于：含甘油二酯混合物中，甘油二酯含量为72.2wt%，添加比例为占总混合油的22.6wt%。得到的微生物粗油中，多不饱和脂肪酸含量55.7wt%，TG含量75.6wt%，DG含量17.8wt%。
更进一步的，使用与手段六相同的精制工艺对本微生物粗油进行精制，得到的微生物精制油中，多不饱和脂肪酸总含量55.9wt %，TG含量为77.0wt %，DG含量为19.0wt %，其他理化指标与手段六获得的理化指标接近。
上述含有花生四烯酸的微生物油制备微胶囊
分别使用市售的花生四烯酸油、上述手段一、手段二、手段三制得的花生四烯酸精制油，按照如下配料表进行配料：
名称 在料液中的比例（wt%）
花生四烯酸油脂 12.5
麦芽糊精 32.5
酪蛋白酸钠 4
抗坏血酸钠 1
纯水 50
将上述料液在8000rpm的转速下剪切10min后，在40MPa下进行均质，得到乳化液。将乳化液进行压力式喷雾干燥，喷雾干燥参数如下：
进风温度 出风温度 进料速度 进风风量 喷雾压力
220℃ 90℃ 300g/min 3000m<sup>3</sup>/h 20Mpa
测得各微胶囊产品的表面油含量结果如下：
所使用的花生四烯酸油脂 表面油含量（wt%）
市售花生四烯酸油（甘油二酯含量3.8 wt %） 0.35
手段一制得的花生四烯酸精制油 0.20
手段二制得的花生四烯酸精制油 0.19
手段三制得的花生四烯酸精制油 0.17
分别使用市售花生四烯酸油、上述手段四、手段五制得的花生四烯酸精制油，按照如下配料表进行配料：
名称 在料液中的比例（wt%）
花生四烯酸油脂 11
麦芽糊精 14.5
变性淀粉 28
抗坏血酸钠 1.5
纯水 45
将上述料液在9000rpm的转速下剪切15min后，在45MPa下进行均质，得到乳化液。将此乳化液进行离心式喷雾干燥，喷雾干燥参数如下：
进风温度 出风温度 进料速度 进风风量 转盘速度
200℃ 80℃ 330g/min 3500m<sup>3</sup>/h 3500rpm
测得微胶囊的表面油含量结果如下：
所使用的花生四烯酸油脂 表面油含量（wt%）
市售花生四烯酸油脂（甘油二酯含量4wt %） 0.45
手段四制得的花生四烯酸精制油 0.29
手段五制得的花生四烯酸精制油 0.27
分别使用市售花生四烯酸油、上述手段六、手段七、手段八制得的花生四烯酸精制油，按照如下配料表进行配料：
名称 在料液中的比例（wt%）
花生四烯酸油脂 13
麦芽糊精 25
酪蛋白酸钠 4
抗坏血酸钠 3
纯水 55
将上述料液在10000rpm的转速下剪切15min后，在50MPa下进行均质，得到乳化液。将此乳化液进行喷雾造粒干燥，首先需要投入15kg麦芽糊精做底料，喷雾干燥参数如下：
进风温度 出风温度 进料速度 进风风量 转盘速度
200℃ 80℃ 330g/min 3500m<sup>3</sup>/h 3500rpm
测得微胶囊的表面油含量结果如下：
所使用的花生四烯酸油脂 表面油含量（wt%）
市售花生四烯酸油脂（甘油二酯含量3.5wt %） 0.31
手段六制得的花生四烯酸精制油 0.19
手段七制得的花生四烯酸精制油 0.16
手段八制得的花生四烯酸精制油 0.12
上述含有花生四烯酸的微生物油制备奶粉
分别使用市售花生四烯酸油、上述手段一至八制得的花生四烯酸精制油，按照如下配料表进行配料：
名称 在料液中的比例（wt%）
花生四烯酸油脂 0.2
鲜奶 80
乳清粉 13
乳糖 1
植物油 5.8
按照上述配方比例投料后，在5000rpm的转速下剪切10min后，在20MPa下进行均质，得到乳化液。然后经过三级降膜式真空浓缩器将此乳化液浓缩至水分含量50%，最后进行压力式喷雾干燥，喷雾干燥参数如下：
进风温度 出风温度 进料速度 进风风量 喷雾压力
190℃ 75℃ 400g/min 3800m<sup>3</sup>/h 15MPa
测得奶粉的表面油含量结果如下：
所使用的花生四烯酸油脂 表面油含量（wt%）
市售花生四烯酸油脂（甘油二脂含量4 wt %） 0.62
手段一制得的花生四烯酸精制油 0.44
手段二制得的花生四烯酸精制油 0.42
手段三制得的花生四烯酸精制油 0.39
手段四制得的花生四烯酸精制油 0.37
手段五制得的花生四烯酸精制油 0.35
手段六制得的花生四烯酸精制油 0.45
手段七制得的花生四烯酸精制油 0.43
手段八制得的花生四烯酸精制油 0.31
微胶囊的表面油含量是表征微胶囊质量的一项重要指标，其表示未被包埋的油脂在微胶囊表面的比例。微胶囊的表面油含量越高，表明越多表面油脂会被氧化，则产品的质量就越差。通过以上数据对比可以看出，在同等工艺条件下，由本发明的含有花生四烯酸的微生物油所制得的微胶囊及奶粉，其表面油含量更低。这主要是因为：本发明的微生物油含有较多的甘油二酯，它可以帮助微生物油形成更稳定的乳化液，使微生物油脂更好地被包埋，从而降低微胶囊及奶粉的表面油含量，提高微胶囊及奶粉的抗氧化能力，延长微胶囊及奶粉的货架期。
实施例二
以裂殖壶菌为出发菌种，详细描述本发明含有二十二碳六烯酸的微生物油的生产及应用。
1.发酵
配制葡萄糖含量0.04g/mL、酵母浸膏含量0.02g/mL的培养基溶液于1000ml摇瓶中，可配制多瓶，灭菌后接入适量冷藏裂殖壶菌液，置于28℃恒温摇床，180rpm进行活化。2天后接入二级扩大摇瓶进行培养，2天后合并摇瓶，移入已灭菌的、含5wt%葡萄糖及2wt%酵母浸膏的1m3发酵罐（一级种子罐）中，持续通入无菌空气，保持培养温度29±1℃。一级种子罐培养2天后，将全部培养液移入已灭菌的、含葡萄糖含量为0.03g/mL及酵母浸膏含量0.02g/mL的10m3发酵罐（二级种子罐）中，持续通入无菌空气，保持培养温度29±1℃。二级种子罐培养1天后，移全部培养液入已灭菌的、含葡萄糖含量0.05g/mL及酵母浸膏含量0.02g/mL的45m3发酵罐中，持续通入无菌空气，保持培养温度29±1℃，根据葡萄糖消耗速度批次补加总约0.02~0.04g/mL的灭菌葡萄糖溶液，再培养5天后可获得发酵产物，其中生物量89.7g/L、总油含量38.5g/L、总油中二十二碳六烯酸含量51.0 wt %。
2.制备富含二十二碳六烯酸的微生物油
手段一
将发酵产物通过离心或压滤方式实现固液分离，收集湿菌体，利用粉碎机破碎，再通过沸腾干燥塔烘干，得到干菌体。将干菌体与有机溶剂如丁烷或己烷混合浸泡萃取，过滤后得到混合油。
向混合油中加入市售脂肪酶和水进行酶解处理，该市售脂肪酶具有将甘油酯水解的功能。所述的酶解处理参数包括：脂肪酶用量为微生物混合油重量的0.25wt%；水用量为微生物混合油重量的30wt%，反应温度约37℃，搅拌反应时间0.5h。酶解反应结束后对混合油进行纯化，纯化的具体步骤包括：将混合油静置，待油相与水相分层后，除去水层，过滤除去酶，蒸发脱除溶剂，通过分子蒸馏设备除去游离脂肪酸，得到微生物粗油。测得该粗油具有如下指标：多不饱和脂肪酸含量64.0wt%，TG含量86.0wt%，DG含量9.8wt%。
更进一步的，对上述微生物粗油进行精制，精制的步骤包括：将该微生物粗油经2.5wt%柠檬酸和5wt%热水脱胶、过量氢氧化钠溶液脱酸，沉降分离，过滤后再用5wt%二氧化硅及3wt%活性炭脱色，再次过滤后，在200℃的条件下直接蒸汽脱臭，添加Vc棕榈酸酯和Ve作为抗氧化剂，得到含有二十二碳六烯酸的微生物精制油。经测定，该精制油中多不饱和脂肪酸总含量达64.0wt %，TG含量为 88.7wt %，DG含量为11.5wt %。
进一步测定该微生物精制油的部分理化指标：不皂化物1.0wt%，水分0.01wt%，不溶性杂质0.01wt%，溶剂残留<1.0mg/kg，酸价0.1mgKOH/g，过氧化值0.03meq/kg，反式脂肪酸0.06wt%，黄曲霉毒素B1<5.0μg/kg，总砷（以As计）<0.1mg/kg，铅<0.1 mg/kg。
手段二
将发酵产物通过离心或压滤方式实现固液分离，收集湿菌体，利用粉碎机破碎，再通过沸腾干燥塔烘干，得到干菌体。将干菌体与有机溶剂如丁烷或己烷混合浸泡萃取，过滤后得到混合油。
向混合油中添加含甘油二酯的混合物，例如脂肪酸单双甘酯或其类似物，该混合物中甘油二酯含量为54.9wt%，添加混合物的比重为总混合油的16.2wt%。对混合油脱溶，混合均匀后得到微生物粗油。该微生物粗油具有如下指标特征：多不饱和脂肪酸含量47.2wt%，TG含量82.1wt%，DG含量10.4wt%。
更进一步的，对上述微生物粗油进行精制，精制的步骤包括：将该微生物粗油经2.5wt%柠檬酸和5wt%热水脱胶、过量氢氧化钠溶液脱酸，沉降分离，过滤后再用5wt%二氧化硅及3wt%活性炭脱色，再次过滤后，在200℃的条件下直接蒸汽脱臭，添加Vc棕榈酸酯和Ve作为抗氧化剂，得到含有二十二碳六烯酸的微生物精制油。经测定，该精制油中多不饱和脂肪酸总含量达48.1wt %，TG含量为 84.8wt %，DG含量为12.0wt %。其他理化指标与手段一获得的理化指标接近。
3.应用
上述含有二十二碳六烯酸的微生物油制备微胶囊
使用市售的二十二碳六烯酸油、上述手段一、手段二制得的二十二碳六烯酸油，按照如下配料表进行配料：
名称 在固形物中的比例（wt%）
二十二碳六烯酸油脂 12.5
麦芽糊精 20
变性淀粉 15
抗坏血酸钠 2.5
纯水 50
将上述料液在8000rpm的转速下剪切10min后，在40MPa下进行均质，得到乳化液。将此乳化液进行压力式喷雾干燥，喷雾干燥参数如下：
进风温度 出风温度 进料速度 进风风量 喷雾压力
220℃ 90℃ 300g/min 3000m<sup>3</sup>/h 20Mpa
测得微胶囊的表面油含量结果如下：
所使用的二十二碳六烯酸油脂 表面油含量（wt%）
市售二十二碳六烯酸油脂（甘油二酯含量4wt%） 0.85
手段一制得的二十二碳六烯酸油脂 0.52
手段二制得的二十二碳六烯酸油脂 0.50
上述含有二十二碳六烯酸的微生物油制备奶粉
使用市售的二十二碳六烯酸油、上述手段一、手段二制得的二十二碳六烯酸油，按照如下配料表进行配料：
名称 在料液中的比例（wt%）
二十二碳六烯酸油脂 0.2
鲜奶 80
乳清粉 11
乳糖 3
植物油 5.8
按照上述配方比例投料后，在5000rpm的转速下剪切10min后，在20MPa下进行均质，得到乳化液。然后经过三级降膜式真空浓缩器将此乳化液浓缩至水分含量50%，最后进行压力式喷雾干燥，喷雾干燥参数如下：
进风温度 出风温度 进料速度 进风风量 喷雾压力
190℃ 75℃ 400g/min 3800m<sup>3</sup>/h 15Mpa
测得奶粉的表面油含量结果如下：
所使用的二十二碳六烯酸油脂 表面油含量（wt%）
市售二十二碳六烯酸油脂（甘油二脂含量4wt %） 0.68
手段一制得的二十二碳六烯酸油脂 0.42
手段二制得的二十二碳六烯酸油脂 0.39
通过以上实验数据可以看出，在同等工艺条件下，由本发明的含有二十二碳六烯酸的微生物油所制得的微胶囊及奶粉，其表面油含量更低。这主要是因为：本发明的微生物油含有较多的甘油二酯，它可以帮助微生物油形成更稳定的乳化液，使微生物油脂更好地被包埋，从而降低微胶囊及奶粉的表面油含量，提高微胶囊及奶粉的抗氧化能力，延长微胶囊及奶粉的货架期。
实施例三
以终极腐霉为出发菌种，详细描述含有二十碳五烯酸的微生物油的生产及应用。
1. 发酵
配制蔗糖含量为0.05g/mL及酵母粉含量为0.005g/mL的培养基溶液于1000ml摇瓶中，可配制多瓶，灭菌后接入适量终极腐霉，置于28℃恒温摇床，180rpm进行活化。2天后接入二级扩大摇瓶进行培养，2天后合并摇瓶，移入已灭菌的、蔗糖含量为0.05g/mL及酵母粉含量为0.005g/mL的1m3发酵罐（一级种子罐）中，持续通入无菌空气，保持培养温度28±1℃。一级种子罐培养2天后，移全部培养液入已灭菌的、蔗糖含量为0.05g/mL及酵母粉含量为0.005g/mL的10m3发酵罐（二级种子罐）中，持续通入无菌空气，保持培养温度28±1℃。二级种子罐培养1天后，移全部培养液入已灭菌的、蔗糖含量为0.05g/mL及酵母粉含量为0.005g/mL的45m3发酵罐中，持续通入无菌空气，保持培养温度28±1℃，根据蔗糖消耗速度批次补加总约0.02~0.04g/mL的灭菌蔗糖溶液，再培养5天后可获得发酵产物，其中二十碳五烯酸含量207.8mg/L。
2. 制备富含二十碳五烯酸的微生物油
手段一
将发酵产物通过离心或压滤方式实现固液分离，收集湿菌体，利用粉碎机破碎，再通过沸腾干燥塔烘干，得到干菌体。将干菌体与有机溶剂如丁烷或己烷混合浸泡萃取，过滤后得到混合油。
向混合油中加入市售脂肪酶和水进行酶解处理，该市售脂肪酶具有将甘油酯水解的功能。所述的酶解处理参数包括：脂肪酶用量为微生物混合油重量的0.25wt%；水用量为微生物混合油重量的30wt%，反应温度约37℃，搅拌反应时间0.5h。酶解反应结束后对混合油进行纯化，纯化的具体步骤包括：将混合油静置，待油相与水相分层后，除去水层，过滤除去酶，蒸发脱除溶剂，通过分子蒸馏设备除去游离脂肪酸，得到微生物粗油。该粗油具有如下指标特征：多不饱和脂肪酸含量59.8wt%，TG含量85.1wt%，DG含量8.5wt%。
更进一步的，对上述微生物粗油进行精制，精制的步骤包括：将该微生物粗油经2.5wt%柠檬酸和5wt%热水脱胶、过量氢氧化钠溶液脱酸，沉降分离，过滤后再用5wt%二氧化硅及3wt%活性炭脱色，再次过滤后，在200℃的条件下直接蒸汽脱臭，添加Vc棕榈酸酯和Ve作为抗氧化剂，得到含有二十碳五烯酸的微生物精制油。经测定，该精制油中多不饱和脂肪酸总含量达59.4wt %，TG含量为 87.5wt %，DG含量为10.4wt %。
进一步测定该微生物精制油的部分理化指标：不皂化物0.8wt%，水分0.01wt%，不溶性杂质0.01wt%，溶剂残留<1.0mg/kg，酸价0.1mgKOH/g，过氧化值0.03meq/kg，反式脂肪酸0.06wt%，黄曲霉毒素B1<5.0μg/kg，总砷（以As计）<0.1mg/kg，铅<0.1 mg/kg。
手段二
将发酵产物通过离心或压滤方式实现固液分离，收集湿菌体，利用粉碎机破碎，再通过沸腾干燥塔烘干，得到干菌体。将干菌体与有机溶剂如丁烷或己烷混合浸泡萃取，过滤后得到混合油。
向混合油中添加含甘油二酯的混合物，例如脂肪酸单双甘酯或其类似物，该混合物中甘油二酯含量为56.1wt%，添加的混合物的比重为总混合油的15.0wt%。对混合油脱溶，混合均匀后得到微生物粗油。该粗油具有如下指标特征：多不饱和脂肪酸含量45.0wt%，TG含量82.0wt%，DG含量9.9wt%。
更进一步的，对上述微生物粗油进行精制，精制的步骤包括：将该微生物粗油经2.5wt%柠檬酸和5wt%热水脱胶、过量氢氧化钠溶液脱酸，沉降分离，过滤后再用5wt%二氧化硅及3wt%活性炭脱色，再次过滤后，在200℃的条件下直接蒸汽脱臭，添加Vc棕榈酸酯和Ve作为抗氧化剂，得到含有二十碳五烯酸的微生物精制油。经测定，该精制油中多不饱和脂肪酸总含量达44.9wt %，TG含量为 84.3wt %，DG含量为11.9wt %。其他理化指标与手段一获得的理化指标接近。
3. 应用
上述含有二十碳五烯酸的微生物油制备微胶囊
使用市售的二十碳五烯酸油、上述手段一、手段二制得的二十碳五烯酸油，按照如下配料表进行配料：
名称 在固形物中的比例（wt%）
二十碳五烯酸油脂 14
麦芽糊精 32
酪蛋白酸钠 2.5
抗坏血酸钠 1.5
纯水 50
将上述料液在8000rpm的转速下剪切10min后，在40MPa下进行均质，得到乳化液。将此乳化液进行喷雾干燥，喷雾干燥参数如下：
进风温度 出风温度 进料速度 进风风量 喷雾压力
220℃ 90℃ 300g/min 3000m<sup>3</sup>/h 20Mpa
测得微胶囊的表面油含量结果如下：
所使用的二十碳五烯酸油脂 表面油含量（wt%）
市售二十碳五烯酸油脂（甘油二酯含量4wt%） 0.79
手段一制得的二十碳五烯酸油脂 0.51
手段二制得的二十碳五烯酸油脂 0.47
上述含有二十碳五烯酸的微生物油制备奶粉
使用市售的二十碳五烯酸油、上述手段一、手段二制得的二十碳五烯酸油，按照如下配料表进行配料：
名称 在料液中的比例（wt%）
二十碳五烯酸油脂 0.1
鲜奶 80
乳清粉 12
乳糖 2
植物油 5.9
按照上述配方比例投料后，在5000rpm的转速下剪切10min后，在20MPa下进行均质，得到乳化液。然后经过三级降膜式真空浓缩器将此乳化液浓缩至水分含量50%，最后进行压力式喷雾干燥，喷雾干燥参数如下：
进风温度 出风温度 进料速度 进风风量 喷雾压力
190℃ 75℃ 400g/min 3800m<sup>3</sup>/h 15Mpa
测得奶粉的表面油含量结果如下：
所使用的二十碳五烯酸油脂 表面油含量（wt%）
市售二十碳五烯酸油脂（甘油二脂含量4wt %） 0.72
手段一制得的二十碳五烯酸油脂 0.48
手段二制得的二十碳五烯酸油脂 0.44

Claims (2)

1.一种微生物油的制备方法，所述微生物油中，多不饱和脂肪酸的含量大于30wt％，甘油三酯含量小于90wt％，甘油二酯含量不低于5wt％且不高于20wt％，所述制备方法包括以下步骤：
(1)利用产油微生物发酵得到富含多不饱和脂肪酸的生物油的发酵液；
(2)收集富含多不饱和脂肪酸微生物油的菌体，萃取过滤后得到混合油；
(3)在混合油中加入脂肪酶和水进行酶解，纯化后得到微生物油；
步骤(2)收集菌体之前，将发酵液通过离心或者压滤方式实现固液分离；
步骤(3)中，酶解参数包括：在脂肪酶最适温度下搅拌反应0.5～2小时，脂肪酶用量为混合油质量的0.25wt％～2wt％，水用量为混合油质量的15wt％～30wt％。
2.根据权利要求1所述的微生物油的制备方法，其特征在于：在步骤(3)之后对微生物油进行精制。
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