ES2567569T3 - Preparación de aceite microbiano que contiene ácidos grasos poliinsaturados - Google Patents

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Abstract

Un procedimiento para la producción de un aceite microbiano que comprende al menos 40% de ácido araquidónico (ARA) basado en el aceite y con un contenido en triglicéridos de al menos 90%, comprendiendo el procedimiento cultivar un microorganismo en un medio de cultivo en el interior de un recipiente de fermentación, según lo cual se añade fuente de carbono durante la fermentación y según lo cual en una fase que precede inmediatamente al final de la fermentación y que comienza a de 15 a 2 horas antes del final de la fermentación, la fuente de carbono es limitante de la tasa en el crecimiento de los microorganismos o se restringe de manera que los microorganismos metabolizan la grasa o las grasas y/o el lípido o los lípidos y en el que el procedimiento comprende además extraer el aceite de los microorganismos usando un disolvente no polar.

Description

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DESCRIPCION
Preparacion de aceite microbiano que contiene acidos grasos poliinsaturados.
Campo de la invencion
La presente invencion se refiere a un procedimiento para la produccion de acido araquidonico (ARA, por sus siglas en ingles), en un aceite microbiano, que comprende cultivar un microorganismo en un procedimiento de dos fases y recuperar con posterioridad el aceite microbiano de los microorganismos.
Introduccion
Los acidos grasos poliinsaturados, o los PUFA (por sus siglas en ingles), se encuentran en la naturaleza. Se produce una amplia variedad de diferentes PUFA por diferentes organismos celulares unicos (algas, hongos, etc.). Un PUFA importante en particular es el acido araquidonico (ARA), uno de una serie de Acidos Grasos Poliinsaturados de Cadena Larga (los LC-PUFA, por sus siglas en ingles). Qmmicamente, el acido araquidonico es el acido cis- 5,8,11,14-eicosatetraenoico (20:4) y pertenece a la familia (n-6) de los LC-PUFA.
El acido araquidonico es un precursor principal de una amplia variedad de compuestos biologicamente activos, conocidos colectivamente como eicosanoides, un grupo que comprende prostaglandinas, tromboxanos y leucotrienos. El acido araquidonico es tambien uno de los componentes de la fraccion lipfdica de la leche materna humana y se piensa que es esencial para el desarrollo neurologico optimo infantil. El acido araquidonico presenta una amplia variedad de diferentes aplicaciones incluyendo el uso de formulas infantiles, productos alimenticios y alimentos para animales. El acido araquidonico se puede producir usando microrganismos y en particular usando los hongos filamentosos Mortierella. Sin embargo, el porcentaje de acido araquidonico en el aceite microbiano producido es normalmente demasiado bajo. Se han realizado una serie de intentos para intentar y aumentar el rendimiento de acido araquidonico a partir de Mortierella, pero con grados variables de exito. Muchos de los intentos para aumentar los niveles de acido araquidonico han implicado etapas que no se pueden usar facilmente en un marco industrial.
Por ejemplo, Eroshin et al., Process Biochemistry: (35) 2.000, pags. 1.171-1.175 dejan reposar el cultivo durante un periodo de aproximadamente una semana despues del final de la fermentacion. Las cantidades de ARA mencionadas se basan en la biomasa (y no en aceite extrafdo de la misma) ya que este documento no describe la extraccion de ningun aceite. Totani et al., Industrial Applications of single cell oils, American Oil Chemists' Society Campaign, 1.992, Capttulo 4, pags. 52-60 y Lipids, vol. 22 N° 12 (1.987) paginas 1.060-1.062 defienden el uso de una temperatura de fermentacion anormalmente baja, lo que significa que la fermentacion se ralentiza considerablemente. El contenido en ARA aqrn se basa en la extraccion con una mezcla de disolventes cloroformo/metanol. Otro documento en el campo de produccion de ARA es la patente internacional WO 96/21037.
La patente europea EP-A-1035211 (Suntory) describe un procedimiento para producir ARA y lfpidos DHGLA de M. alpina. Sin embargo, el calculo del contenido en ARA se basa en la biomasa (en vez de un aceite extrafdo de el) o resulta de un metodo analttico en el que se esterifican primero los acidos grasos poliinsaturados y despues se extraen usando un disolvente (en vez de ser extrafdos primero, para producir un aceite, y determinandose despues el contenido en ARA sobre la base de este aceite).
Un informe de un rendimiento mayor de ARA alega una concentracion en micelio recogido de casi el 70% usando la cepa 1S-4 de M. alpina (Shimizu S., Oils-Fats-Lipids 1.995, Proc. World Congr. Int. Soc. Fat Res., 21° (1.996), Fecha del encuentro 1.995, Volumen 1, paginas 103-109 y Biochemical and Biophysical Research communications, Vol. 150 (1), 1.988, paginas 335-441). Sin embargo, este porcentaje se basa en las celulas y no es el mismo que el porcentaje de ARA en un aceite microbiano. De hecho, el aceite preparado solo proporciono un contenido en ARA de 39,0% (Tabla 27,2, pagina 105). (Observese que la tecnica usa una variedad de diferentes maneras para medir el contenido en ARA, que puede no ser necesariamente la misma unidad o estar basado en el mismo protocolo analftico que las cifras mencionadas mas adelante en esta memoria descriptiva). Ademas, esto solo se obtuvo cuando se permitio que las celulas de M. alpina reposaran a temperatura ambiente durante 6 dfas mas despues de la fermentacion, que no es claramente una opcion viable para procedimientos de produccion industrial.
Hung-Der Jang, Yuh-Yih Lin y Shang-Shyng Vang, Bot. Bull. Acad. Sin. (2.000) vol. 41, paginas 41-48, describen la produccion de acido graso poliinsaturado con Mortierella alpina por fermentacion de sustratos solidos.
La patente internacional WO-A-9213086 describe metodos para la produccion de acido araquidonico.
A. Lindberg, G. Molin, Appl. Microbiol. Biotechnol. (1.993) vol. 39, paginas 450-455, describen el efecto de la temperatura y el suministro de glucosa sobre la produccion de acidos grasos poliinsaturados por el hongo Mortierella alpina CBS 343.66 en cultivos del fermentador.
H. Yamada et al., Industrial Applications of Single Cell Oils, paginas 118-138 XP001000789 describen la produccion de acido dihomo-Y-linolenico, acido araquidonico y acido eicosapentaenoico por Hongos filamentosos.
La patente internacional WO-A-9737032 describe la preparacion de aceite que contiene acido graso poliinsaturado
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microbiano a partir de biomasa pasteurizada. Se describe un aceite microbiano que presenta un contenido en trigliceridos mayor que 90%.
La patente japonesa JP-A-2/13388 (Lion Corporation) describe un procedimiento de produccion de un Ifpido que contiene acido graso insaturado.
Higashiyama et al., JAOCS, vol. 75, N° 12 (1.988), paginas 1.815 a 1.819, describen los efectos de la adicion mineral sobre la morfologfa del crecimiento de una produccion de acido araquidonico por Mortierella alpina 1S-4.
La patente japonesa JP-A-2/142486 (Lion Corporation) describe un procedimiento de produccion de un lfpido que contiene acido graso insaturado.
Shinmen et al., Appl. Microbiol, and Biotechnol. (1.989), vol. 31, paginas 11 a 16, describen la produccion de acido araquidonico por hongos Mortierella.
La patente japonesa JP-A-64/38007 (Lion Corporation) describe un producto cosmetico para la piel que contiene un lfpido que contiene acido araquidonico.
Hay, por lo tanto, una necesidad de identificar maneras de aumentar la proporcion (y asf el rendimiento) de acido araquidonico en los aceites microbianos y en particular de una manera que se pueda emplear en una escala industrial.
Sumario de la invencion
La presente invencion proporciona nuevos procedimientos para producir un aceite microbiano con una proporcion aumentada de acido araquidonico. Esto significa que el acido araquidonico puede ser producido a un coste reducido y tasa aumentada. Ademas, como la presente invencion no se basa en la modificacion genetica de los microorganismos implicados para aumentar la produccion de acido araquidonico, la invencion puede ayudar a satisfacer la demanda creciente de ingredientes alimenticios no modificados geneticamente, naturales. Ademas, el aceite presenta bajo potencial de oxidacion y asf es adecuado para la incorporacion a los alimentos humanos para los cuales es particularmente importante la toxicidad, tal como las formulas infantiles.
De acuerdo con esto, la invencion se refiere a un procedimiento para la produccion de un acido microbiano que comprende al menos 40% de acido araquidonico (ARA) basado en el aceite y que tiene un contenido en trigliceridos de al menos 90%. El procedimiento comprende fermentar (o cultivar) un microorganismo en el interior de un recipiente de fermentacion, convenientemente en un medio de cultivo, segun lo cual se anade una fuente de carbono durante la fermentacion y segun lo cual en una fase que precede inmediatamente al final de la fermentacion y que empieza a partir de 15 a 2 horas antes del final de la fermentacion la fuente de carbono es limitante de la tasa en el crecimiento de los microorganismos o se restringe de manera que los microorganismos metabolicen (su propia) grasa o grasas y/o lfpido o lfpidos y en los que el procedimiento comprende ademas extraer el aceite del microorganismo usando un disolvente no polar.
El aceite microbiano puede comprender al menos 50% (o al menos 50,5; 51 o 52%) de acido araquidonico (ARA). Puede tener hasta 55, 57 o 60% de ARA. Este aceite tiene un contenido en trigliceridos de al menos 90%.
El aceite se puede extraer en hexano.
Se cree que una vez que la concentracion de la fuente de carbono se reduce o se restringe, las celulas empiezan a metabolizar las grasas o lfpidos en el interior de la celula. Sin embargo, las celulas consumen grasas distintas de ARA primero. De esta manera la proporcion de ARA en las grasas o lfpidos en las celulas aumenta. Por lo tanto, el procedimiento de la invencion puede conducir, de esta manera, a un aceite de mayor contenido en ARA.
Descripcion detallada de la invencion
Microorganismos
Los microorganismos empleados pueden ser una bacteria, levadura, alga u hongo. Preferiblemente, se usa un hongo y en particular se usa un hongo filamentoso. Los hongos preferidos son del orden Mucorales. El hongo puede ser del genero Mortierella, Phycomyces, Entomophthora, Pythium, Thraustochytrium, Blakeslea, Rhizomucor o Aspergillus. Los hongos preferidos son de la especie Mortierella alpina.
Las cepas de microorganismos usadas en la presente invencion pueden ser una cepa que se encuentre en la naturaleza o cepa industrial usada comunmente. La cepa puede no haber sido modificada geneticamente por ejemplo, puede no ser transformada con un vector ni poder contener gen o genes heterologos. Dada la preferencia actual en algunas dependencias para productos alimenticios que no contengan ingredientes geneticamente logrados, el microorganismo empleado puede ser una cepa que no haya sido asf modificada.
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Fermentacion
La fermentacion/cultivo se llevara a cabo tipicamente en un fermentador adecuado (o recipiente de fermentacion) que contenga un medio de cultivo (lfquido, normalmente acuoso). Un recipiente de fermentador principal se inoculara normalmente de manera aseptica desde un pequeno fermentador de alimentacion. ^picamente, se emplea un procedimiento de fermentacion sumergida y/o aerobia. Esto puede tener lugar en un fermentador de tanque profundo. El fermentador puede estar provisto de dispositivos para controlar y/o cambiar el pH y la temperatura. El recipiente se puede adaptar adicionalmente para realizar o permitir que se lleve a cabo aireacion y/o mezcla de las celulas y lfquido, tal como agitacion de la disolucion. Esto puede ser agitando, por ejemplo conseguido usando medios mecanicos.
Convenientemente, el volumen del fermentador es al menos 10, 20, 40 o incluso 60 m3 Se pueden usar volumenes tan altos como 100 o incluso 150 m3.
La fermentacion durara tfpicamente durante 10 dfas o menos, preferiblemente 9 dfas o menos, mas preferiblemente 8 dfas o menos. Puede ser al menos 4, 5, 6 o 7 dfas.
Opcionalmente, la fermentacion puede ser durante 150 a 200 horas, tal como 160 a 190 horas, por ej. de 170 a 180 horas. El final de la fermentacion es normalmente el punto en el que se detiene la agitacion y/o aireacion. Esto puede ser cuando se apague (efectivamente) el recipiente del fermentador y/o equipo auxiliar. Los microorganismos pueden ser retirados despues del fermentador.
La fermentacion puede ser a una temperatura de desde 20 a 40°C.
Fuentes de carbono y nitrogeno.
Se puede usar cualquier medio adecuado en la fermentacion, por ejemplo, un medio apropiado para el microorganismo que se este usando. La fuente de carbono puede comprender (fuentes complejas tales como) maltodextrina, harina de avena, avena, melazas, aceite vegetable (por ejemplo, soja), extracto de malta, almidon, etanol o aceite de soja. Las fuentes de carbono preferidas (no complejas) incluyen carbohidratos o azucares, tales como fructosa, maltosa, sacarosa, xilosa, manitol, glucosa o lactosa o glicerina (por ejemplo, a partir de una fuente vegetal), citrato, acetato, glicerol, etanol o ascorbato (por ejemplo, sodico). En una realizacion preferida de la invencion, la fuente de carbono es o comprende glucosa y en particular es jarabe de glucosa.
Las fuentes de nitrogeno adecuadas incluyen extracto de levadura, urea y peptona. El medio puede excluir agar.
Las fuentes de nitrogeno y/o carbono preferidas son solubles en agua o miscibles en agua.
Los componentes individuales del medio (tales como las fuentes de nitrogeno y/o carbono) pueden estar presentes (todas) al principio de la fermentacion, anadirse de manera continua durante la fermentacion o anadirse etapa por etapa o en lotes. En particular, la cantidad de fuente de carbono presente en el medio se controlara tfpicamente como se describe a continuacion, preferiblemente controlando la tasa de adicion de la fuente de carbono.
Las fuentes de nitrogeno y/o carbono se pueden suministrar (o anadir) de manera separada o suministrar de manera simultanea o suministrar como una preparacion combinada. Pueden presentarse asf en la misma composicion (si se cree necesario), que es preferiblemente un lfquido. Las fuentes de carbono y/o nitrogeno se pueden anadir (al recipiente del fermentador) antes de que se anadan las celulas fungicas (al recipiente), en otras palabras, previamente a inoculacion o durante la fermentacion alternativamente se pueden anadir tanto antes de la fermentacion como durante.
Medio de cultivo
El medio de cultivo es preferiblemente un lfquido acuoso. Este puede contener adicionalmente otras sustancias para ayudar a la fermentacion, por ejemplo, un agente quelante (por ejemplo, acido dtrico), un agente antiespumante (por ejemplo, aceite de soja), una vitamina (por ejemplo, tiamina y/o riboflavina), cualquier metal catalftico necesario (por ejemplo, metales alcalino-terreos tales como magnesio o calcio o cinc o hierro y/u otros metales tales como cobalto y cobre), fosforo (por ejemplo, fosfato) y/o azufre (por ejemplo, sulfato). El medio puede contener, si es necesario, un aceite de aditivo tal como aceite de oliva o de soja, sin embargo, preferiblemente el medio no contiene dicho aceite.
La temperatura de crecimiento (o fermentacion) (optima) puede variar dependiendo del microorganismo usado. Sin embargo, es preferiblemente de 20 a 40°C y mas preferiblemente de 22 a 30 o 32°C. En particular, la temperatura a la que la fermentacion se lleva a cabo sera > 22°C o < 25°C, por ejemplo, 22 a 30°C, tal como de 23-28°C. El pH del lfquido acuoso durante la fermentacion puede ser de 4 a 10, tal como de 5 a 8, optimamente de 6 a 7.
El medio tipicamente se agitara o removera durante la fermentacion para ayudar a facilitar la aireacion. El lfquido acuoso y las celulas se mezclan o se remueven convenientemente. Esto se puede conseguir si se proporciona aireacion, tal como mediante burbujeo de un gas, por ejemplo, aire, en el lfquido acuoso. Esto puede servir el fin adicional de proporcionar oxfgeno a las celulas fungicas: por lo tanto, la fermentacion es preferiblemente una
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aerobia. Otros medios de agitacion o mezclamiento incluyen, por ejemplo, usar un impulsor. Este puede ser de un diseno de flujo axial de hidroala o se puede disenar de manera que el medio acuoso ser fuerce radialmente hacia el exterior desde el impulsor (tal como una turbina). Incluso aunque no haya agitacion se prefiere que se proporcione oxfgeno a las celulas microbianas durante la fermentacion y as^ la aireacion (por ejemplo, burbujeando aire, oxfgeno u otro gas que contenga oxfgeno) es ventajosa aqm. La aireacion puede ser a de 0,1 a 2,0, tal como de 0,5 a 1,0 vvm.
Preferiblemente, el volumen del fermentador es al menos 2 o 5 litros, preferiblemente al menos 10 litros. Sin embargo, para los fermentadores usados en la industria o en una escala industrial, el volumen del recipiente es preferiblemente al menos 50, 100, 500 o 1.000 litros.
Ultima (o segunda) fase de la fermentacion.
El procedimiento de fermentacion se puede dividir en al menos dos fases. Una fase que precede inmediatamente al final de la fermentacion, se caracteriza por una disminucion en la cantidad de la fuente de carbono disponible para el microorganismo como se define en la reivindicacion 1. Esta fase empieza de 15 a 2 horas antes del final de la fermentacion, preferiblemente menos de o en 10 horas desde el final de la fermentacion, mas preferiblemente de 3 a 5 horas del final de la fermentacion. Preferiblemente, esta fase empezara tfpicamente en menos de 10 dfas despues del comienzo de la fermentacion, mas preferiblemente comenzara en menos de 9 dfas despues, incluso mas preferiblemente menos de 8 dfas despues.
Durante una primera fase o fase mas temprana de la fermentacion la fuente de carbono puede estar en exceso. Asf la cantidad de la fuente de carbono disponible puede no ser limitante para el crecimiento de los microorganismos. La tasa de adicion de la fuente de carbono puede exceder de la tasa de su consumo por los microorganismos. En la segunda o ultima fase de la fermentacion la cantidad de la fuente de carbono que se esta anadiendo puede disminuir o detenerse completamente. Esto significa que la cantidad de fuente de carbono disponible para el microorganismo disminuira durante la segunda o la ultima fase de la fermentacion.
Tfpicamente, la concentracion de la fuente de carbono durante la segunda fase es <10 g de la fuente de carbono/kg de medio, preferiblemente de 0,01 o 0,1 a 8 o 10 g/kg, mas preferiblemente de 0,5 a 5 g/kg e incluso mas preferiblemente de 1 o 2 a 4 o 5 g/kg. Esto significa que, de promedio durante la ultima fase de la fermentacion, habra < 0,30 M de carbono por kg de medio, preferiblemente de 0,003 M a 0,3 M de carbono por kg. Ventajosamente, esto es de 0,015 M a 0,17 M de carbono por kg e incluso mas preferiblemente de 0,03 M a 0,17 M de carbono por kg.
Cuando la fuente de carbono comprende glucosa, tipicamente la concentracion de glucosa (en la ultima fase) sera de promedio <10 g /kg de medio, preferiblemente de 0,01 o 0,1 a 8 o 10 g/kg. Ventajosamente, esto es de 0,5 a 5 g/kg e incluso mas preferiblemente de 1 o 2 a 4 o 5 g/kg de medio. En este sentido, el medio incluye las celulas y el medio de cultivo acuoso, es decir es el “caldo” (celulas y lfquido circundante).
La tasa de adicion de la fuente de carbono en la ultima fase es preferiblemente no mayor que 0,03 M de carbono por kg, preferiblemente no mas de 0,025 o 0,02 M de carbono por /kg (medio). Preferiblemente, la tasa de adicion es aproximadamente 0,015 M de carbono por/kg. Si la fuente de carbono es glucosa, entonces preferiblemente la tasa de adicion de glucosa es menor que 1,0, por ejemplo, menor que 0,8, por ejemplo, menor que 0,5 g de glucosa por/kg de medio por hora.
Preferiblemente, la tasa de adicion de la fuente de carbono en la ultima fase es aproximadamente la mitad de la tasa de consumo de la fuente de carbono por los microorganismos. Sin embargo, la relacion de tasa de adicion: tasa de consumo puede variar de 1:1-3, tal como de 1:1,5 a 2,5, optimamente de 1:1,8 a 2,2. Alternativamente, la tasa de adicion puede ser de 30-70%, tal como de 40 a 60%, optimamente de 45 a 55%, de la tasa de consumo.
La concentracion apropiada de la fuente de carbono durante la segunda fase de la fermentacion se puede conseguir controlando cuidadosamente la tasa de adicion de la fuente de carbono. Tfpicamente, esto se disminuira como sea apropiado durante, o para precipitar el comienzo de, la ultima fase. El muestreo periodico y el analisis del cultivo se pueden usar para determinar la concentracion de la fuente de carbono y realizar ajustes cuando sea necesario para la tasa de adicion de la fuente de carbono. Esto se puede realizar automaticamente usando un sistema informatico.
Procedimiento de pasteurizacion.
La pasteurizacion normalmente tendra lugar despues de que haya terminado la fermentacion. En una realizacion preferida, la pasteurizacion acabara la fermentacion, debido a que el calor durante la pasteurizacion destruira las celulas. La pasteurizacion se puede realizar, por lo tanto, en el caldo de fermentacion (o las celulas en el medio lfquido (acuoso)), aunque se puede realizar en la biomasa microbiana obtenida del caldo. En el primer caso, la pasteurizacion puede tener lugar mientras las celulas microbianas estan aun en el interior del fermentador. La pasteurizacion tiene lugar preferiblemente antes que cualquier tratamiento adicional de las celulas microbianas, por ejemplo, granulacion (por ejemplo, por extrusion) desmenuzamiento o amasado.
Preferiblemente, el protocolo de pasteurizacion es suficiente para inhibir o inactivar una o mas enzimas que puedan
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afectar de manera prejudicial o degradar un PUFA o aceite microbiano, por ejemplo, una lipasa.
Una vez que ha terminado la fermentacion, se puede filtrar el caldo de la fermentacion o tratar de otro modo para retirar agua o lfquido acuoso. Despues de la eliminacion del agua, se puede obtener una biomasa “torta”. Si no ha tenido lugar pasteurizacion, entonces las celulas deshidratadas (o torta de biomasa) se pueden someter a pasteurizacion.
Extraccion de aceite
Si es deseable, y por ejemplo despues de que haya terminado la fermentacion, los microrganismos pueden ser destruidos o pasteurizados. Esto puede ser para inactivar cualquier enzima no deseable, por ejemplo, las enzimas que podfan degradar el aceite o reducir el rendimiento de los PUFA.
Despues de que se ha completado o ha terminado el cultivo o la fermentacion, el caldo de la fermentacion (celulas y lfquido acuoso) pueden ser retirados despues del fermentador y si es necesario es retirado lfquido (normalmente agua) de ahT Se puede usar cualquier tecnica de separacion solido-lfquido adecuado. Esto (deshidratacion) puede ser por centrifugacion y/o filtracion. Las celulas se pueden lavar, por ejemplo, usando una disolucion acuosa (tal como agua) por ejemplo para retirar cualquier compuesto soluble en agua o dispersible en agua, extracelular. Se puede recuperar despues un aceite de los microbios, de manera que el aceite se extrae en disolvente, preferiblemente se extrae en hexano.
El aceite puede no tener (o estar sustancialmente exento de) GLA y/o DGLA.
Procedimiento de extraccion de PUFA
El aceite microbiano que contiene el ARA) puede ser extrafdo de granulos (por ej. secos) (por ej., mezclas extrmdas) que contienen las celulas. La extraccion se lleva a cabo usando un disolvente no polar, por ejemplo, un alcano C1-8, por ej., C2-6, por ejemplo, hexano. Se puede usar dioxido de carbono (en una forma lfquida, por ejemplo, en un estado supercntico).
Preferiblemente, se permite que el disolvente se filtre por los granulos secos. Las tecnicas de granulacion y extrusion de microorganismos adecuadas y la extraccion posterior de un aceite que contiene PUFA microbiano, se describen en la patente internacional WO-A-97/37032.
El disolvente permite que se obtenga un aceite que contenga PUFA bruto. Este aceite se puede usar en ese estado, sin mas tratamiento, o se puede someter a una o mas etapas de refinado. Los protocolos de refinado adecuados se describen en la solicitud de Patente internacional n° PCT/EP01/08902. Por ejemplo, el aceite se puede someter a un tratamiento acido o desgomado, tratamiento alcalino o eliminacion de aceite graso libre, blanqueamiento o eliminacion de pigmento, filtracion, frigelizacion (o enfriamiento, por ejemplo, para eliminar trigliceridos saturados), desodorizacion (o eliminacion de acidos grasos libres) y/o clarificacion (o eliminacion de sustancias insolubles en aceite).
El aceite resultante es particularmente adecuado para fines nutricionales y se puede anadir a alimentos (humanos) o piensos (animales). Los ejemplos incluyen leche, formulas infantiles, bebidas saludables, pan y alimentacion para animales.
Purificacion/Refinado
El aceite microbiano puede ser refinado y purificado. Esto puede implicar eliminar uno o mas de los siguientes componentes: un fosfolfpido, metal traza, pigmento, carbohidrato, protema, acido graso libre (FFA, por sus siglas en ingles), sustancia insoluble en aceite, sustancia insoluble en agua, jabon o sustancia saponificada, producto de oxidacion, azufre, mono- o diglicerido, producto de descomposicion de pigmentos, disolvente y/o esterol. La purificacion puede reducir o eliminar "sabores desagradables" y/o mejorar la estabilidad del aceite.
Para efectuar esto, el procedimiento (por ejemplo, purificacion) puede comprender desgomado (o tratamiento acido), neutralizacion (o tratamiento alcalino), lavado con agua, blanqueamiento, filtracion, desodorizacion, clarificacion y/o enfriamiento (o frigelizacion). Preferiblemente, la purificacion comprende tratamiento con acido y/o tratamiento alcalino (desgomado y neutralizacion). Alternativamente, los metodos de purificacion pueden comprender blanqueamiento y/o desodorizacion. Preferiblemente, sin embargo, la purificacion implicara blanqueamiento y/o desodorizacion y, optimamente ademas tratamiento con acido y/o alcali.
Aceites
Preferiblemente, el aceite microbiano comprende de 50, 55 o 60 a 90% de acido araquidonico, mas preferiblemente de 60 a 80% e incluso mas preferiblemente de 60 a 70% de acido araquidonico.
Preferiblemente, el aceite microbiano tiene un contenido en trigliceridos de desde 90 a 100%, tal como al menos 90 o 96%, preferiblemente al menos 98%, mas preferiblemente al menos 99% y optimamente por encima de 99,5%. Tfpicamente, el aceite microbiano tendra un contenido en acido eicosapentaenoico (EPA, por sus siglas en ingles)
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por debajo de 5%, preferiblemente por debajo del 1% y mas preferiblemente por debajo de 0,5%. El aceite puede presentar menos de 5%, menos de 2%, menos de 1% de cada uno de, acido graso poliinsaturado C20, C20 3, C22 0 y/o C24 0, (los PUFA). El contenido en acido graso libre (FFA) puede ser < 0,4; 0,2 0 0,1%.
De los trigliceridos, preferiblemente al menos el 40%, tal como al menos 50% y mas preferiblemente al menos 60% de los PUFA presentes esta en la posicion a del glicerol (presente en la cadena principal del triglicerido) tambien conocido en la posicion 1 o 3. Se prefiere que al menos el 20%, tal como al menos 30%, mas preferiblemente al menos 40% de los PUFA este en la posicion p(2).
El contenido en fosfolfpido del aceite es convenientemente un maximo de 5%, 3% 0 2% y/o puede ser un mmimo de desde 0,1; 0,5 0 1,0%.
Preferiblemente, el aceite habra sido asilado de un hongo, mas preferiblemente el aceite se afsla de Mortierella y en particular de M. alpina. El aceite se extrae convenientemente de hexano.
Contenido en ARA.
Puramente por claridad, se explicara el calculo del contenido en ARA en porcentaje, especialmente como se puede calcular segun la bibliograffa, en ocasiones, el contenido en ARA sobre una base diferente. El porcentaje de ARA se basa en el aceite (que ha sido extrafdo de la biomasa) y no la propia biomasa. Es sobre una base peso por peso. Se basa en un aceite extrafdo por hexano y se basa, por lo tanto, en lfpidos extrafbles en hexano (HEL, por sus siglas en ingles). Se basa en la cantidad total de aceite y no en la cantidad total de acidos grasos (que a veces puede proporcionar una cifra mayor erronea). El contenido en ARA se determina mediante el protocolo analttico FAME conocido (usando los esteres metilicos de acidos grasos), detallado en AOCS Cel b89. En diferentes disolventes se extraeran diferentes lfpidos. Observese que, en el caso presente, el aceite se extrae primero con hexano y despues se determina el contenido en ARA del aceite mediante analisis FAME. Esto proporcionara un resultado diferente de esterificar primero el acido araquidonico (por ejemplo, mientras esta aun en las celulas) y extrayendo despues los esteres metilicos resultantes para analisis adicional.
fndice de peroxido (IPO)
Preferiblemente, el IPO del aceite microbiano no es mayor que 3,0; 2,5 o 2,0. Sin embargo, se pueden obtener valores de IPO mucho menores usando el procedimiento de la invencion y estos valores pueden ser menores que 1,5 o menores que 1,0. Se pueden obtener valores menores que 0,8 e incluso menores que 0,4.
fndice de anisidina (lAn)
Preferiblemente, el mdice de anisidina del aceite microbiano no es mayor que 1,0, por ejemplo, no mayor que 0,6; 0,3 o incluso no mayor que 0,1.
Usos y productos.
Se describe ademas una composicion que comprende el aceite y en el caso de que sea apropiado una o mas sustancias (adicionales). La composicion puede ser un pienso y/o un suplemento alimenticio para animales o seres humanos. En realizaciones de la invencion que son para consumo humano los aceites se pueden hacer adecuados para consumo humano, tipicamente mediante refinado o purificacion del aceite obtenido de los microbios.
La composicion puede ser una formula infantil, productos alimenticios (seres humanos). En este caso la composicion de la formula se puede ajustar asf de manera que tenga una cantidad similar de lfpidos o PUFA para leche materna normal. Esto puede implicar el mezclamiento del aceite microbiano de la invencion con otros aceites para conseguir la composicion apropiada.
La composicion puede ser una composicion o suplemento alimenticio animal o marino. Dichos alimentos y suplementos se pueden proporcionar a cualquier animal de criadero, en particular oveja, ganado vacuno y aves de corral. Ademas, los alimentos o suplementos pueden ser proporcionados a organismos marinos de criadero tales como pescado y crustaceos. La composicion puede incluir asf una o mas sustancias o ingredientes alimenticios para dicho animal.
El aceite puede ser vendido directamente como aceite y estar contenido en un envase apropiado, tipicamente botes de aluminio de una pieza recubiertos internamente con la laca epoxifenolica y purgados con nitrogeno. El aceite puede contener uno o mas antioxidantes (por ejemplo, tocoferol, vitamina E, palmitato) cada uno por ejemplo a una concentracion de desde 50 a 800 ppm, tal como 100 a 700 ppm.
Las composiciones adecuadas pueden incluir composiciones farmaceuticas o veterinarias, por ejemplo, para tomarse por via oral o composiciones cosmeticas. El aceite puede ser tomado como tal, o puede estar encapsulado, por ejemplo, en una carcasa, y puede estar asf en la forma de capsulas. La carcasa o las capsulas pueden comprender gelatina y/o glicerol. La composicion puede contener otros ingredientes, por ejemplo, saborizantes (por ej., sabor a limon o lima) o un portador o excipiente farmaceuticamente o veterinariamente aceptable.
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Los elementos y caractensticas preferidos de un aspecto de la invencion son igualmente aplicables a otro aspecto mutatis mutandis.
Ejemplos comparativos 1 y 2 y Ejemplos 3 y 4.
Produccion de acido araquidonico (ARA).
Se almaceno un vial de 1 ml de suspension de cepa Mortierella alpina CBS 168.95 (depositada por DSM N. V., 2600 MA Delft, Pafses Bajos (que ha autorizado la presente solicitud para referirse a este material biologico depositado) en Centraal Bureau voor Schimmelcultures (CBS), Apartado de Correos 85.167, 3508 AD Utrecht, Pafses Bajos, el 20 de febrero de 1.995 bajo el deposito n° DS 30340), a -80°C y se abrio de manera aseptica. Se usaron los contenidos para inocular un matraz de 500 ml con 100 ml de un medio que contema (g/l):
glucosa, 20;
extracto de levadura (pasta Gistex ® (80% de solidos, 46% de protema (Nx6,25), 16% de NaCl, pH (disolucion al 2%) 5,6, 22% de ceniza, recuento de placa total 104/g, Enterobacteriaceae < 10/g, E. coli < 1/g, levadura y mohos < 100/g, disponible en DSM N. V., Savory Ingredients Apartado de correos 1, 2600 MA Delft), 12,5;
antiespumante (compuesto antiespumante de silicio/no silicona Basildon 86/013K usado de acuerdo con las instrucciones del fabricante, Basildon Chemical Company, Kimber Road, Abingdon, Oxford, Inglaterra OX14IRZ), 0,2.
El pH del medio se ajusto a 7,0 antes de autoclave.
El cultivo se cultivo a 25°C durante 48 h con agitacion a 26 rad/s (250 rpm) y se uso para la inoculacion de cuatro matraces de 2.000 ml con 500 ml de un medio que contema (g/l):
glucosa, 20; extracto de levadura (pasta Gistex ®), 25; antiespumante (Basildon 86/013K), 0,2. El pH antes de esterilizacion fue 7,0.
Estos cultivos se cultivaron a 25°C durante 24 h y usaron para siembra un fermentador de inoculacion de 5 m3 que contema medio de 2.400 litros de la misma composicion que se uso en los matraces de 2.000 ml (el pH antes de esterilizacion fue 6,0).
Se fijo la temperatura de la fermentacion a 25°C, agitacion a 16 rad/s (150 rpm), presion del recipiente a 50 kPa (0,5 bar) y tasa de aireacion a 0,5 VVM.
El cultivo del fermentador del inoculo se transfirio al fermentador principal despues de aproximadamente 36 horas (la tasa de absorcion del oxfgeno fue >3 mmoles/kg/h).
El principal fermentador contema (g/l):
glucosa, 35;
extracto de levadura (polvo Expresa 2200 ®, levadura de cerveza baja en sodio, peptona (extracto), solidos > 96%, N total > 10%, N amino 6-7%, NaCl < 1%, pH (disolucion al 2% 5,3-6,3), ceniza < 12,5%, polvo homogeneo disponible en DSM N. V., Savory Ingredients), 5,0;
NaH2PO4.2H2O, 1,0;
KH2PO4, 2,0;
MgSO4.7H2O 0,5;
Basildon 86/013K, 0,3; acido cftrico. 1H2O, 0,6;
ZnCl2, 0,010;
Fe2(SO4)3 20% H2O, 0,025;
MnSO4.1H2O, 0,010; (pH antes de esterilizacion 5,0).
La glucosa se esterilizo por separado y se anadio al fermentador principal despues de esterilizacion.
La fermentacion duro durante 175 horas. El pH del medio continuo siendo aproximadamente pH 6 (+/- 0,1) con una aireacion (flujo de aire) de 0,5 VVM, la presion del aire a 80 kPa (0,8 bar) y agitacion a 7 rad/s (70 rpm). Se mantuvo el nivel de oxfgeno a D. O. > 30% aumentando secuencialmente la velocidad de agitacion a 10,5 rad/s (100 rpm) y
flujo de aire a 0,9 VVM.
Se alimento una disolucion de glucosa esteril de aproximadamente 50% (p/p) al fermentador para mantener la concentracion de glucosa a aproximadamente 10 g/l y de aproximadamente 30 a 78 h, se alimentaron 625 kg de una disolucion de extracto de levadura al 25% al fermentador con una tasa de alimentacion controlada de tal manera que 5 la concentracion de amomaco fue < 30 mg/l.
El experimento se llevo a cabo cuatro veces (Ejemplos 1 a 4) y la concentracion de glucosa del medio de cultivo se controlo a lo largo del tiempo. En el ejemplo 4, la concentracion de glucosa fue 2,2 g/kg a 172 horas. Esto fue tres horas antes del final de la fermentacion (EoF). El nivel de glucosa fue cero a aproximadamente una hora antes del EoF.
10 En los Ejemplos comparativos 1 y 2, la concentracion de la fuente de carbono (glucosa) estuvo muy por encima de 5 g/kg al final de la fermentacion. Por supuesto, 10 horas antes del EoF, la concentracion de glucosa fue aproximadamente 20 g/kg. Asf, en los Ejemplos 1 y 2, la concentracion de glucosa fue de modo que no fuera limitante en el grupo de los microorganismos o en la produccion de ARA.
En los Ejemplos 3 y 4, la concentracion de glucosa en la ultima fase de la fermentacion, inmediatamente 15 precediendo al EoF, se controlo de tal manera que aproximadamente 10 horas antes del EoF la concentracion de glucosa fue aproximadamente 5 g/kg. Durante esta ultima fase, mas de 10 horas, la glucosa se anadio a una tasa de adicion de 0,5 g/kg/h. La concentracion de glucosa fue virtualmente cero en el EoF. Durante este periodo, la tasa de consumo de la glucosa fue aproximadamente dos veces la tasa de adicion, es decir aproximadamente 1 g/kg/h.
La concentracion de glucosa (g/kg) en el medio de cultivo con el tiempo, durante la fermentacion se muestra en las 20 Tablas 1 a 4 (que corresponde a los Ejemplos 1 a 4).
Tabla 1
Tiempo (h)
Concentracion de glucosa g/kg
0
48,7
24
57,6
28
47,8
54
46,4
78
62,0
102
62,5
126
48,2
150
42,5
167
20
Tabla 2
Tiempo (h)
Concentracion de glucosa g/kg
0
47,8
28
32,5
54
32,2
78
41,3
102
49,5
Tiempo (h)
Concentracion de glucosa g/kg
126
46,8
150
29,9
165
17,1
Tabla 3
Tiempo (h)
Concentracion de glucosa g/kg
0
49,2
28
60,1
54
40,8
78
34,0
102
37,3
126
23,2
150
16,7
172
7
Tabla 4
Tiempo (h)
Concentracion de glucosa g/kg
0
45
28
34,1
54
34,7
78
29,2
102
38,1
126
45
150
23,5
172
2,2
5
Al final de la fermentacion, los microorganismos y el Ifquido acuoso circundante (el caldo de fermentacion) se retiraron del fermentador. El caldo sufrio separacion solido-Kquido para retirar algo del agua. Despues se extruyeron las celulas restantes y se sometieron a extraccion en disolvente usando hexano. As^ se obtuvo un aceite microbiano que contema ARA (lfpidos extrafoles en hexano) de celulas que experimentaban cada uno de los cuatro protocolos 10 de fermentacion diferentes.
El contenido en ARA en porcentaje del aceite (sobre una base peso por peso) se determino entonces usando el protocolo analttico FAME conocido (como se detalla en AOCS Ce1b89). En el Ejemplo 3, la concentracion de ARA en el aceite microbiano fue 508 g/kg (50,8%). La cifra equivalente para el Ejemplo 4 fue 545 g/kg (ARA al 54,5%). Por comparacion, el aceite microbiano extrafdo de las celulas en los Ejemplos comparativos 1 y 2 fue mucho menor
a 36,8% y 36,7%, respectivamente.

Claims (10)

  1. 5
    10
    15
    20
    25
    REIVINDICACIONES
    1. Un procedimiento para la produccion de un aceite microbiano que comprende al menos 40% de acido araquidonico (ARA) basado en el aceite y con un contenido en trigliceridos de al menos 90%, comprendiendo el procedimiento cultivar un microorganismo en un medio de cultivo en el interior de un recipiente de fermentacion, segun lo cual se anade fuente de carbono durante la fermentacion y segun lo cual en una fase que precede inmediatamente al final de la fermentacion y que comienza a de 15 a 2 horas antes del final de la fermentacion, la fuente de carbono es limitante de la tasa en el crecimiento de los microorganismos o se restringe de manera que los microorganismos metabolizan la grasa o las grasas y/o el lfpido o los lfpidos y en el que el procedimiento comprende ademas extraer el aceite de los microorganismos usando un disolvente no polar.
  2. 2. Un procedimiento segun la reivindicacion 1, en el que la fuente de carbono es glucosa.
  3. 3. Un procedimiento segun la reivindicacion 1 o 2, en el que la fermentacion (completa) se lleva a cabo a una temperatura > 22°C y < 30°C.
  4. 4. Un procedimiento segun cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en el que:
    h) se realiza en ausencia de un aceite aditivo;
    i) la fermentacion no dura mas de 9 dfas y/o
    j) el volumen del fermentador es al menos 20 m3.
  5. 5. Un procedimiento segun cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en el que el microorganismo es Mortierella.
  6. 6. Un procedimiento segun cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en el que el microorganismo es Mortierella alpina.
  7. 7. Un procedimiento segun cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en el que durante una etapa mas temprana de fermentacion la fuente de carbono esta en exceso.
  8. 8. Un procedimiento segun cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en el que el disolvente es hexano.
  9. 9. Un procedimiento segun cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en el que las celulas se pasteurizan despues de que termina la fermentacion.
  10. 10. Un procedimiento segun cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en el que el aceite comprende al menos ARA al 50% basado en el aceite.
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