KR101208304B1 - 다가불포화 지방산을 함유하는 미생물 오일의 제조방법 - Google Patents

다가불포화 지방산을 함유하는 미생물 오일의 제조방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 2단계 발효 공정으로 미생물을 배양하는 단계를 포함하는 미생물 오일의 제조 방법을 제공하며, 발효 종료에 선행하는 마지막 단계에서, 탄소원은 배지에 첨가된 것보다 더 큰 비율로 미생물에 의해서 소비되고; ≤0.30M 탄소/kg 배지의 비율로 첨가되거나, 또는 미생물의 성장에 대해 비율 제한적이다. 따라서, 미생물은 아라키돈산(ARA)을 제외한 지방 또는 지질을 우선적으로 대사하도록 탄소원을 제한함으로써 세포중의 ARA 비율을 증가시킨다. 그 다음, 용매로서 헥산을 사용하여 미생물로부터 50% 이상의 ARA 및 90% 이상의 트리글리세리드를 갖는 미생물 오일을 회수한다.
미생물 오일, 아라키돈산, 다가불포화지방산.

Description

다가불포화 지방산을 함유하는 미생물 오일의 제조방법{PREPARATION OF MICROBIAL OIL CONTAINING POLYUNSATURATED FATTY ACIDS}
본 발명은 2단계 공정으로 미생물을 배양하는 단계 및 연속적으로 미생물로부터 미생물 오일을 회수하는 단계를 포함하는, 선택적으로 미생물 오일중의 PUFA 를 제조하는 방법에 관한 것이다. 본 발명은 또한 이러한 방법으로부터 생성된 신규한 (예를 들어, 미생물) 오일에 관한 것이다. 오일 중에서, 50% 이상의 지질(또는 오일중의 PUFA)이 아라키돈산(ARA)이다. 오일은 2.5 또는 2.0 미만의 낮은 과산화물값(POV) 및/또는 1.0 미만의 낮은 아니시딘값(AnV)을 가질 수 있다. 본 발명은 또한 본 발명의 미생물 오일을 포함하거나 또는 사용하여 제조된 식품 및 식품 첨가제에 관한 것이다.
다가불포화 지방산, 즉 PUFA는 천연적으로 발견된다. 매우 다양한 PUFA가 상이한 단세포 생체(조류, 균류 등)에 의하여 생산된다. 특히 중요한 PUFA는 다수의 장쇄 다가불포화지방산 (LC-PUFA) 중 하나인 아라키돈산(ARA)이다. 화학적으로는, 아라키돈산은 cis-5,8,11,14 에이코사테트라엔산 (20:4)이고 LC-PUFA의 (n-6) 패밀리에 속한다.
아라키돈산은 프로스타글란딘, 트롬복산 및 류코트리엔을 포함하는 군인 에에이코사노이드로서 총괄적으로 알려진 다양한 생물학적 활성 화합물의 주요 전구체이다. 아라키돈산은 또한 인간 모유의 지질부 성분들 중 하나이고 영유아의 최적 신경학적 발달을 위하여 필수적인 것으로 생각된다. 아라키돈산은 영유아 조제식, 식품 및 동물 사료에서의 사용을 포함하는 다양한 용도를 갖는다.
미생물 및 특히 섬유상 균류 모르티아렐라(Mortierella)를 사용하여 아라키돈산을 얻을 수 있다. 그러나, 수득된 미생물 오일중의 아라키돈산의 비율은 일반적으로 너무 낮다. 모르티에렐라(Mortierella)로부터 아라키돈산의 수율을 증가시키고자 하는 많은 시도가 있어왔지만, 성공의 정도는 다양하였다. 아라키돈산 수준을 증가시키기 위한 많은 시도는 산업적 셋팅에서 용이하게 사용될 수 없는 공정들을 포함하였었다.
예를 들어, Eroshin 등의 문헌[Process Biochemistry:(35)2000, pp1171-1175]에서는 발효 종료 후에 약 일주일의 기간동안 배양물을 그대로 두었다. 이 문헌은 어떤 오일의 추출에 대해서는 기재하고 있지 않기 때문에, 인용된 ARA 의 양은 바이오매스에 기초한다(그것으로부터 추출된 오일에 기초하는 것이 아니다). Totani 등의 문헌[Industrial Applications of single cell oils, American Oil Chemists's Society Campaign, 1992, Chapter 4, pp52-60 및 Lipids, vol. 22 No. 12(1987) 1060-1062]에서는 일반적으로 낮은 발효 온도의 사용을 주장하고 이것은 발효가 상당히 지연된다는 것을 의미한다. 본원에서의 ARA 함량은 클로로폼/메탄올 용매 혼합물로의 추출에 기초한다. ARA 생산 분야에 관한 다른 문헌은 WO 96/21037 이다.
EP-A-1035211(Suntory)은 모르티에렐라 알피나(M. alpina)로부터 ARA 및 DHGLA 지질을 얻는 방법을 개시한다. 그러나, ARA 함량의 계산은 (그것으로부터 추출된 오일 보다는) 바이오매스 또는 (1차적으로 추출되어서 오일을 생산하고 그 다음, 이 오일에 기초하여 ARA 함량을 결정하기 보다는) 1차적으로 다가불포화 지방산이 에스테르화되고 그 다음 용매를 사용하여 추출되는 분석 방법으로부터의 결과에 기초한다.
고수율의 ARA에 관한 보고서는 엠. 알피나(M. alpina)의 균주 1S-4 를 사용하여 수집된 균사체중의 거의 70% 의 농도를 증명한다(문헌[Shimizu S., Oils-Fats-Lipids 1995, Proc. World Congr. Int. Soc. Fat Res., 21st(1996), Meeting Date 1995, Volume 1, pages 103-109 및 Biochemical 및 Biphysical Research communications, Vol. 150(1), 1988, pages 335-441]). 그러나, 이 비율은 세포에 기초한 것이며, 미생물 오일중의 ARA 비율과 동일하지 않다. 실제로, 제조된 오일은 39.0%의 ARA 함량만을 나타낸다(표 27.2, 페이지 105). (당업계에서는 ARA 함량을 측정하기 위한 다양한 방법을 사용하고, 이것은 본 명세서의 후반부에 인용된 값들과 동일한 단위이거나 동일한 분석 프로토콜에 기초한 것일 필요가 없다.) 더욱이, 이것은 엠. 알피나(M. alpina) 세포가 발효 후 6일동안 더 실온에서 방치될 때 얻어졌고, 이는 분명히 산업적 생산 공정에서 실행가능한 선택이 아니다.
따라서, 미생물 오일에서 특히, 산업적 규모로 사용될 수 있는 방법으로 아라키돈산의 비율 (및 수율)을 증가시키는 방법을 확인하는 것이 요구된다.
발명의 개요
본 발명은 증가된 비율의 아라키돈산을 갖는 (미생물) 오일을 제조하기 위한 신규한 방법을 제공한다. 이것은 아라키돈산을 감소된 비용 및 증가된 비율로 얻을 수 있다는 것을 의미한다. 게다가, 본 발명은 아라키돈산의 생산 증량에 있어서 관련된 미생물의 유전적 변형에 의존하지 않기 때문에, 본 발명은 천연의 유전자 비변형 식품 성분에 대해 증가되는 요구를 충족시키는데 도움이 될 수 있다. 더욱이, 오일은 낮은 산화 전위를 가지며 따라서, 영유아 조제식와 같은, 독성이 특히 중요한 인간용 식품에의 통합에 적합하다.
따라서, 본 발명의 제 1의 양태는 미생물 오일 또는 다가불포화 지방산(PUFA)을 제조하는 방법에 관한 것이다. 이 방법은 발효 용기내에서, 적합하게는 배지에서 미생물을 발효시키는 (또는 배양시키는) 단계를 포함하고, 이에 의해 발효 종료 이전에 (또는 이에 선행하는 단계에서),
a) 탄소원은 배지에 첨가된 것보다 더 큰 비율로 미생물에 의해서 소비되고;
b) 시간당 ≤0.30M 탄소/kg 배지의 비율로 탄소원이 첨가되고;
c) 탄소원이 미생물의 성장에 대해 비율 제한적이거나 제한되어서 미생물이 (그것의 본래의) 지방(들) 및/또는 지질(들)을 대사하고;
d) 탄소원의 첨가율은 미생물에 의한 탄소원의 소비율로 또는 그 미만으로 감소되고;
e) 탄소원은 모두 사용되었거나 또는, 발효 종료시에 또는 종료 전에 약 0의 배지 농도를 갖고;
f) 탄소원 첨가는 중단되었지만 발효가 계속되며; 및/또는
g) 미생물은 ARA 에 우선하여 ARA 이외의 지방(들)(예를 들어, PUFA와 같은 세포내의 것)을 대사시키는 상태에 놓여진다.
본 발명의 제 2의 양태는 50% 이상(또는 적어도 50.5, 51 또는 52%)의 아라키돈산(ARA)을 포함하는 미생물 오일에 관한 것이다. 55, 57 또는 60% 이하의 ARA 일 수 있다. 오일은
a) 90% 이상의 트리글리세리드 함량;
b) 2.5 미만의 POV;
c) 1.0 미만의 AnV; 및/또는
d) 5% 미만의 인지질 함량을 갖을 수 있다.
오일은 제1의 양태에 따른 방법으로 제조될 수 있다. 오일은 헥산 추출될 수 있다.
일단 탄소원의 농도가 감소되거나 또는 제한된다면, 세포는 세포내의 지방 또는 지질을 대사하기 시작한다. 그러나, 세포는 1차적으로 ARA 이외의 지방을 소비한다. 이러한 방식으로 세포내 지방 또는 지질중의 ARA 비율이 증가한다. 따라서, 이러한 방식으로 제1의 양태에 따른 방법은 제2의 양태에서의 더 높은 ARA 함량 오일을 유도한다.
미생물
사용된 미생물은 박테리아, 효모, 조류 또는 균류일 수 있다. 바람직하게는 균류가 사용되고 특히 사상균이 사용된다. 바람직한 균류는 뮤코랄레스(Mucorales) 목이다. 균류는 모르티에렐라(Mortierella), 피코마이세스(Phycomyces), 엔토모프토라(Entomophthora), 피티움(Pythium), 트라우스토키트리움(Thraustochytrium), 블라케슬리아(Blakeslea), 리조뮤코르(Rhizomucor) 또는 아스퍼질러스(Aspergillus)속의 것이다. 바람직한 균류는 모르티에렐라 알피나(Mortierella alpina)종의 것이다. 바람직한 효모는 피키아 시페리(Pichia ciferii) 같은 피키아(Pichia) 또는 사카로마이세스(Saccharomyces) 속의 것다. 박테리아는 프로피오니박테리움(Propioni bacterium) 속의 것이다. 적당한 조류는 와편모충일 수 있고/또는 크립테코디늄 코니(Crypthecodinium cohnii)종의 것과 같은 크립테코디늄(Crypthecodinium), 포르피리듐(Porphyridium) 또는 니츠키아(Nitschia)속에 속한다.
본 발명에 사용된 미생물 균주는 자연 발생이거나 또는 통상 사용되는 산업용 균주일 수 있다. 균주는 예를 들어, 벡터로 형질전환되지 않았거나 또는 이형접합성 유전자(들)를 함유하지 않은 것과 같이, 유전적으로 변형되지 않았을 수 있다. 유전자 조작된 성분을 함유하지 않는 식품에 대한 현재의 선호도를 고려하면, 사용된 미생물은 이렇게 변형되지 않은 균주일 수 있다.
다가불포화 지방산(PUFA)
PUFA는 단일 PUFA 또는 둘 이상의 상이한 PUFA일 수 있다. 단일 또는 각각의 PUFA는 n-3 또는 n-6 패밀리의 것일 수 있다. 바람직하게는, C18, C20 또는 C22 PUFA이다. 그것은 18개 이상의 탄소 원자 및/또는 3 또는 4 개의 이중 결합을 갖는 PUFA일 수 있다. PUFA(들)는 자유 지방산, 염의 형태로, 지방산 에스테르 (예를 들어, 매틸 또는 에틸 에스테르), 인지질로서 및/또는 모노-, 디-, 또는 트리글리세리드 형태로 단리될 수 있다.
적합한 (n-3 및 n-6) PUFA는:
적합하게는 (와편모충인) 크립테코디늄(Crypthecodinium) 또는 (균류인) 트라우스토키트리움(Thraustochytrium) 같은 조류 또는 균류 유래의 도코사헥사엔산 (DHA, 22:6 Ω3);
γ-리놀렌산 (GLA, 18:3 Ω6);
α-리놀렌산 (ALA, 18:3 Ω3);
접합된 리놀레산 (옥타데카디엔산, CLA);
디호모-γ-리놀렌산 (DGLA, 20:3 Ω6);
아라키돈산 (ARA, 20:4 Ω6); 및
에이코사펜타엔산 (EPA, 20:5 Ω3)을 포함한다.
바람직한 PUFA는 아라키돈산 (ARA), 도코사헥사엔산 (DHA), 에이코사펜타엔산 (EPA) 및/또는 γ-리놀레산 (GLA)을 포함한다. 특히, ARA 가 바람직하다.
발효
발효/배양은 전형적으로 (지질, 일반적으로 수성) 배지를 함유하는 적합한 발효조(또는 발효 용기)에서 수행될 것이다. 주요 발효 용기는 일반적으로 작은 원료 발효조로부터 무균 접종될 것이다. 전형적으로, 액내 및/또는 호기성 발효 공정이 사용된다. 이것은 깊숙한 탱크 발효조에서 이루어진다. 발효조는 pH 및 온도를 모니터하고/하거나 변화시키기 위한 장치를 구비할 수 있다. 용기는 추가적으로 통기 및/또는 용액의 교반과 같은 세포 및 지질의 혼합을 실행하도록 조정될 수 있거나, 또는 실행되도록 한다. 이것은 예를 들어, 기계적 수단을 사용하여 달성될 수 있다.
발효조 부피는 적합하게는 적어도 10, 20, 40, 또는 60m3 이다. 100 또는 150cm3 의 부피가 사용될 수 있다.
발효는 전형적으로 10일 또는 그 미만, 바람직하게는 9 일 또는 그 미만, 더욱 바람직하게는 8 일 또는 그 미만동안 지속일 것이다. 적어도 4, 5, 6, 또는 7일 일 수 있다.
선택적으로 발효는 예를 들어 160 내지 190 시간, 170 내지 180 시간과 같이, 150 내지 200 시간동안 이루어질 수 있다. 발효 종료는 일반적으로 교반 및/또는 통기가 정지되는 시점이다. 이것은 발효 용기 및/또는 부품 장치가 (효과적으로) 스위치 오프되었을 때일 수 있다. 그 다음, 미생물이 발효조로부터 제거될 수 있다.
발효는 20 내지 40℃의 온도일 수 있다.
탄소원 및 질소원
예를 들어, 미생물에 적합한 배지와 같은 어떤 적합한 배지가 발효에 사용될 수 있다. 탄소원은 말토덱스트린, 오트 가루, 오트밀, 당밀, 식물성(예를 들어, 콩) 오일, 맥아 추출물, 전분, 에탄올 또는 콩기름(과 같은 복합 공급원)을 포함할 수 있다. 바람직한 (비복합성) 탄소원은 플룩토스, 말토스, 수크로스, 크실로스, 만니톨, 글루코스 또는 락토스 또는 글리세린(예를 들어, 식물성원), 시트레이트, 아세테이트, 글리세롤, 에탄올 또는 (예를 들어, 나트륨) 아스코르베이트와 같은 탄수화물 또는 당류를 포함한다. 본 발명의 바람직한 실시양태에서, 탄소원은 글루코스, 및 특히 글루코스 시럽이거나 또는 이를 포함한다.
적합한 질소원은 효모 추출물, 요소 및 펩톤을 포함한다. 배지는 한천을 배제할 수 있다. 바람직한 질소 및/또는 탄소원은 수용성 또는 수 혼화성이다.
(질소 및/또는 탄소원과 같은) 배지의 각각의 성분들은 발효 초기에 (모두) 존재하거나, 발효동안 연속적으로 첨가되거나 또는 단계식으로 또는 배치로 첨가될 수 있다. 특히, 배지에 존재하는 탄소원의 양은 전형적으로 아래에 기술된 바와 같이, 바람직하게는 탄소원의 첨가율을 조절함으로써 조절될 것이다.
질소 및/또는 탄소원은 별도로 공급(또는 첨가)될 수 있거나 또는 동시에 공급되거나, 또는 조합된 조제물로서 공급된다. 따라서, 이들은 (필요하다고 생각되는 경우에는) 바람직하게는 액체인 동일한 조성물에 존재할 수 있다. 탄소 및/또는 질소원은 균류 세포가 (용기에) 첨가되기 전에, 즉 접종하기 전에, 또는 발효 동안에 (발효 용기에) 첨가될 수 있다. 대안으로, 이들은 발효전에 그리고 발효 동안 첨가될 수 있다.
배지
배지는 바람직하게는 수용액이다. 배지는 예를 들어, 킬레이팅제(예를 들어, 시트르산), 소포제(예를 들어, 콩기름), 비타민(예를 들어, 티아민 및/또는 리보플 라빈), 어떤 필요한 촉매 금속(예를 들어, 마그네슘 또는 칼슘과 같은 알칼리토금속, 또는 아연 또는 철 및/또는 코발트 및 구리와 같은 다른 금속), 인(예를 들어, 인산염) 및/또는 황(예를 들어, 황산염)과 같은 발효를 돕기 위한 다른 물질을 추가적으로 함유할 수 있다. 배지는, 필요하다면, 올리브 또는 콩기름과 같은 추가의 오일을 함유할 수는 있지만, 바람직하게는 배지는 이러한 오일을 함유하지 않는다.
(최적의) 성장(또는 발효) 온도는 사용된 미생물에 따라서 다양할 수 있다. 그러나, 바람직하게는 20 내지 40℃ 이고 더욱 바람직하게는 22 내지 30 또는 32℃이다. 특히, 발효를 수행하는 온도는 ≥22℃ 또는 ≤25℃, 예를 들어 22 내지 30℃, 예컨대 23 내지 28℃ 일 것이다. 발효 동안의 수용액의 pH 는 4 내지 10, 예컨대 5 내지 8, 최적으로는 6 내지 7 일 수 있다.
통기 촉진을 돕기위해서 배지는 발효 동안에 전형적으로 교반될 것이다. 수용액 및 세포는 적절하게 혼합되거나 또는 교반된다. 이것은 예를 들어, 공기와 같은 기체를 수용액중에 통기시킴으로써 통기가 제공되는 경우에 이루어질 수 있다. 이것은 균류 세포에 산소를 제공하는 추가의 목적을 도울 수 있다. 따라서, 발효는 바람직하게는 호기성이다. 교반 또는 혼합의 다른 수단은 예를 들어, 임펠러를 사용하는 교반을 포함한다. 이것은 수중익축(hydrofoil axial) 흐름 설계일 수 있거나 또는 수성 배지가 (터빈과 같은) 임펠러로부터 방사상으로 외부로 향하도록 설계될 수 있다. 교반을 하지 않는 경우조차도 발효동안에 미생물 세포에 산소를 제공하는 것이 바람직하고, 이러한 통기(예를 들어, 공기, 산소 또는 다른 산소 함유 기체를 통기시키는 것에 의함)가 유리하다. 통기는 0.1 내지 2.0 vvm, 예컨대 0.5 내지 1.0 vvm 일 수 있다.
바람직하게는 발효조의 부피는 적어도 2 또는 5ℓ, 바람직하게는 적어도 10ℓ이다. 그러나, 산업상 또는 산업적 규모에 사용된 발효조의 경우에, 용기 부피는 바람직하게는 적어도 50, 100, 500 또는 1,000ℓ이다.
발효의 마지막 (또는 두번째) 단계
발효 공정은 적어도 2단계로 나누어질 수 있다. 발효 종료 바로 전단계로 선행될 수 있는 두번째 또는 마지막 단계는 미생물에 대해 이용가능한 탄소원양의 감소 또는 제1의 양태에서 얻어진 특징 (a) 내지 (g) 중 어떤 것을 특징으로 한다. 전형적으로, 이 단계는 발효 종료 전 15 내지 2시간, 바람직하게는 발효 종료 후 10 시간이내, 더욱 바람직하게는 발효 종료 후 3 내지 5시간에서 개시될 수 있다. 바람직하게는, 이 단계는 전형적으로 발효 개시 후 10 일이내에 개시될 것이고, 더욱 바람직하게는 발효 종료 후 9 일 이내에, 더욱 더 바람직하게는 발효 종료 후 8 일 이내에 시작될 것이다.
발효의 첫번째 또는 초기 단계동안에, 탄소원은 과량으로 존재할 수 있다. 따라서, 이용가능한 탄소원의 양은 미생물 성장에 대해서 제한적이지 않을 것이다. 탄소원의 첨가율은 미생물에 의한 그것의 소비율을 초과할 것이다. 발효의 두번째 또는 마지막 단계에서, 첨가되어지는 탄소원의 양은 감소되거나 또는 완전히 중단될 것이다. 이것은 미생물에 이용가능한 탄소원의 양이 발효의 두번째 또는 마지막 단계동안에 감소할 것이라는 것을 의미한다. 전형적으로, 두번째, 최종 또는 마지막 단계에서, 또는 발효 종료 무렵에, 탄소는
- 배지에 첨가되는 것보다 더 큰 비율로 미생물에 의해서 소비되고(예를 들어, 첨가율은 소비율 미만이다);
- 적어도 0.01, 0.02 또는 0.05M 탄소/kg 배지/hr(탄소원 자체의 중량 또는 몰보다는 탄소원중의 탄소의 몰, 또는 몰량에 관련된 단위)을 제외하고 시간당 ≤0.30M 탄소/kg 배지의 비율, 예컨대 ≤0.25 또는 ≤0.20 로 첨가되고;
미생물의 성장 및/또는 (PUFA) 생산에 비율 제한적일 수 있다.
전형적으로, 두번째 단계동안의 탄소원의 농도는 배지의 ≤10g 탄소원/kg, 바람직하게는 0.01 또는 0.1 내지 8 또는 10g/kg, 더욱 바람직하게는 0.5 내지 5g/kg 이고, 더욱 더 바람직하게는 1 또는 2 내지 4 또는 5g/kg 이다. 이것은 발효 마지막 단계동안에 평균적으로 배지 kg 당 ≤0.30M 탄소, 바람직하게는 kg 당 0.003M 내지 0.3M 탄소가 존재할 것이라는 것을 의미한다. 유리하게도, kg 당 0.015M 내지 0.17M 탄소이고 더욱 바람직하게는 kg 당 0.03M 내지 0.17M 탄소이다.
탄소원이 글루코스를 포함하는 경우에, 전형적으로 (마지막 단계에서) 글루코스의 농도는 평균적으로 배지의 ≤10g/kg 이고, 바람직하게는 0.01 또는 0.1 내지 8 또는 10g/kg 일 것이다. 유리하게도, 이것은 0.5 내지 5g/kg 이고, 더욱 더 바람직하게는 1 또는 2 내지 4 또는 5g/kg 배지이다. 이러한 의미에서, 배지는 세포 및 수성 배지를 포함하고 즉, "육즙"(세포와 주위의 액체)이다.
마지막 단계에서 탄소원의 첨가율은 바람직하게는 kg 당 0.03M 이하의 탄소, 바람직하게는 kg(배지) 당 0.025 또는 0.02M 이하의 탄소이다. 바람직하게는, 첨가율은 kg 당 약 0.015M 탄소이다. 탄소원이 글루코스라면, 그 다음 바람직하게는 글루코스의 첨가율은 시간당 kg 배지마다 1.0 미만이고, 예를 들어, 0.8 미만, 예를 들어, 0.5g 미만의 글루코스이다.
바람직하게는, 마지막 단계에서 탄소원의 첨가율은 대략 미생물에 의한 탄소원의 소비율의 반이다. 그러나, 첨가율:소비율의 비는 1:1 내지 3, 예컨대 1:1.5 내지 2.5, 선택적으로 1:1.8 내지 2.2 로 다양하다. 대안으로, 첨가율의 비는 소비율의 30 내지 70%, 예컨대 40 내지 60%, 선택적으로 45 내지 55% 이다.
발효의 두번째 단계동안 탄소원의 적당한 농도는 탄소원의 첨가율을 조심스럽게 조절함으로써 얻어질 수 있다. 전형적으로, 이것은 마지막 단계동안에 또는 마지막 단계의 개시를 촉진하기 위해서 적절하게 감소될 것이다. 배양물의 주기적인 표본추출 및 분석을 사용하여 탄소원의 농도를 결정하고 탄소원의 첨가율에 필요한 조절을 수행한다. 이것은 컴퓨터 시스템을 사용하여 자동적으로 실행될 수 있다.
저온살균 공정
파스퇴르 살균은 발효가 종료된 후에 통상 수행될 것이다. 바람직한 실시양태에서, 파스퇴르 살균 동안의 열이 세포를 사멸시키므로 파스퇴르 살균은 발효를 종결시킬 것이다. 그러므로, 파스퇴르 살균은 발효 육즙 (또는 액상 (수성) 배지 내의 세포) 상에서 수행될 수 있지만, 그것은 육즙으로부터 얻은 미생물 바이오매스 상에서 수행될 수 있다. 전자의 경우에, 미생물 세포가 아직 발효조 내에 있는 동안에 파스퇴르 살균이 이루어질 수 있다. 바람직하게는, 파스퇴르 살균은 미생물 세포의 임의의 추가의 처리, 예를 들어 (예를 들어 압출성형에 의한) 과립화, 분말화 또는 반죽화 전에 이루어진다.
바람직하게는, 파스퇴르 살균 프로토콜은 PUFA 또는 미생물 오일에 악영향을 주거나 이를 분해할 수 있는 하나 이상의 효소, 예를 들어 리파제를 저해하거나 불활성화시키기에 충분하다.
일단 발효가 종결되면, 발효 육즙을 여과시키거나 그렇지 않으면 물이나 수성 액체를 제거하도록 처리한다. 수분 제거 후, 바이오 매스 "케이크"를 얻을 수 있다. 파스퇴르 살균이 일어나지 않았으면, 탈수된 세포 (또는 바이오메스 케이크)를 파스퇴르 살균시킬 수 있다.
오일 추출
바람직하게는, 예를 들어, 발효가 종료된 후에, 미생물은 사멸되거나 또는 파스퇴르 살균될 수 있다. 이것은 어떤 바람직하지 않은 효소, 예를 들어, 오일을 분해할 수 있거나 또는 PUFA 의 수율을 감소시킬 수 있는 효소를 불활성화시키는 것이다.
배양 또는 발효가 완료되거나 또는 종료된 후에, 발효조로부터 발효 육즙(세포 및 수용액)을 제거하고, 필요하다면 발효조로부터 액체(일반적으로 물)를 제거한다. 어떤 적합한 고용액 분리 기술이 사용될 수 있다. 이것(탈수)은 원심분리 및/또는 여과일 수 있다. 예를 들어, (물과 같은) 수용액을 사용하여 예를 들어, 세포외 수용성 또는 수분산성 화합물을 제거하기 위해서 세포를 세척할 수 있다. 그 다음, 예를 들어, 용매를 사용하여 미생물로부터 오일을 회수할 수 있고 오일은 용매 추출되거나, 바람직하게는 헥산 추출될 수 있다.
오일은 GLA 및/또는 DGLA 를 포함하지 않을 수 있다(또는 실질적으로 GLA 및/또는 DGLA 가 결여되어 있다).
PUFA 추출 공정
PUFA (또는 일반적으로 PUFA 를 함유하는 미생물 오일)는 세포를 포함하는 (예를 들어, 건조된) 과립(예를 들어, 압출물)으로부터 추출될 수 있다. 추출은 용매를 사용하여 수행될 수 있다. 바람직하게는, 예를 들어, C1-C8, C2-6 알칸, 예컨대 헥산과 같은 비극성 용매가 사용된다. 일반적으로 (예를 들어, 임계 초과 상태인 액상에서) 이산화탄소를 사용할 수 있다.
따라서, 유기 용매로, 바람직하게는 질소 흐름하에서 세포를 추출할 수 있다. 다른 사용가능한 용매는 에테르, 메탄올, 에탄올 클로로포름, 디클로로메탄 및/또는 석유 에테르를 포함한다. 메탄올 및 석유 에테르로의 추출 및/또는 클로로포름, 메탄올, 및 물로 구성되는 단층 용매 시스템으로의 추출이 또한 사용될 수 있다. 감압하에서 추출물로부터 유기 용매(들)의 증발은 고농도로 아라키돈산을 함유하는 미생물을 제공할 수 있다.
바람직하게는, 용매는 건조 과립에 대해서 용매가 삼출되도록 할 수 있다. 적합한 미생물 과립화 및 압출 기법 및 연이은 미생물 PUFA 함유 오일의 추출은 WO-A-97/37032에 기재되어 있다.
용매는 당업자가 미정제 PUFA 함유 오일을 얻도록 허용한다. 이 오일은 더 이상의 처리없이 그 상태로 사용될 수 있거나, 1회 이상의 정련 단계를 거칠 수 있다. 적합한 정제 프로토콜은 국제 특허출원번호 PCT/EP01/08902(이 문헌의 내용 및 여기에 기재된 모든 다른 문헌은 여기에 참고문헌으로서 수록된다)에 기재되어 있다. 예를 들어, 오일은 산처리 또는 고무제거, 알칼리 처리 또는 자유 지방산 제거, 표백 또는 색소 제거, 여과, 냉각화 (또는 예를 들어, 포화 트리글리세리드를 제거하기 위한 냉각), 탈취화 (또는 자유 지방산의 제거) 및/또는 연마가공 (또는 오일-불용성 물질의 제거)을 거칠 수 있다.
결과의 오일은 영양적 목적에 특히 적합하고, (인간용) 식품 또는 (동물용)사료에 첨가될 수 있다. 예는 우유, 영유아 조제식, 건강 음료, 빵 및 동물 사료를 포함한다.
정제/정련
미생물 오일이 정련되고 정제될 수 있다. 이것은 다음의 성분들; 인지질, 미량금속, 색소, 탄수화물, 단백질, 자유 지방산(FFA), 오일 불용성 물질, 수-불용성 물질, 비누 또는 비누화 물질, 산화물, 황, 모노 또는 디글리세리드, 색소 분해 산물, 용매 및/또는 스테롤 중 하나 이상을 제거하는 것을 포함할 수 있다. 정제는 "무미"를 감소시키거나 제거시킬 수 있고 및/또는 오일의 안정성을 향상시킬 수 있다.
이를 실행시키기 위해서, 이 공정(예를 들어, 정제)은 고무제거 (또는 산 처리), 중화 (또는 알칼리 처리), 물 세척, 표백, 여과, 탈취, 연마가공 및/또는 냉각(또는 냉각화)을 포함할 수 있다. 바람직하게는, 정제는 산 처리 및/또는 알칼리 처리(고무제거 및 중화)를 포함한다. 대안으로, 정제 방법은 표백 및/또는 탈취를 포함할 수 있다. 그러나, 바람직하게는 정제는 표백 및/또는 탈취를 포함할 것이고, 최적으로는 추가적으로 산 및/또는 알칼리 처리를 포함할 것이다.
오일
본 발명의 제 2의 양태는 ARA 와 같은 하나 이상의 PUFA 의 35 또는 40% 를 포함하는 미생물 오일을 제공한다. 오일은 ARA 와 같은 PUFA 의 적어도 50, 55, 또는 60% 또는 그 이상을 포함할 수 있다. 90% 이상의 트리글리세리드 함량을 가질 수 있다. 바람직하게는, 미생물 오일은 50, 55, 또는 60 내지 90% 아라키돈산, 더욱 바람직하게는 60 내지 80% 및 더욱 더 바람직하게는 60 내지 70%를 아라키돈산을 포함한다.
바람직하게는, 미생물 오일은 90 내지 100%, 예컨대 90 또는 96% 이상, 바람직하게는 98% 이상, 더욱 바람직하게는 99% 이상, 및 최적으로는 99.5% 이상의 트리글리세리드 함량을 갖는다. 전형적으로, 미생물 오일은 5% 미만, 바람직하게는 1% 미만 및 더욱 바람직하게는 0.5% 미만의 에이코사펜타엔산(EPA)을 포함할 것이다. 오일은 C20, C20:3, C22:0 및/또는 C24:0 다가불포화 지방산(PUFA) 각각의 5% 미만, 2% 미만, 1% 미만을 포함할 수 있다. 자유 지방산(FFA) 함량은 ≤0.4, 0.2 또는 0.1% 일 수 있다.
트리글리세리드 중에서, 존재하는 PUFA 의 바람직하게는 40% 이상, 예컨대 50% 이상 및 더욱 바람직하게는 60% 이상이 1 또는 3 위치로 또한 알려진 (트리글리세리드 골격에 존재하는) 글리세롤의 α-위치에 존재한다. PUFA(s)의 20% 이상, 예컨대 30% 이상, 더욱 바람직하게는 40% 이상이 β(2)위치에 존재하는 것이 바람직하다.
오일의 인지질 함량은 최대 5%, 3% 또는 2%에서 적합하고 및/또는 최소 0.1, 0.5 또는 1.0% 일 수 있다.
전형적으로, 미생물 오일은 본 발명의 제1의 양태에 따른 방법에 의해서 얻어질 수 있는 것이다. 바람직하게는, 오일은 균류로부터 분리되고, 더욱 바람직하게는 오일은 모르티에렐라(Mortierella)로부터 분리되고 특히 엠. 알피나(M.alpina)로부터 분리된다. 오일은 적합하게는 헥산 추출된다.
ARA 함량
특히, 문헌은 종종 서로 다른 원리에 기초하여 ARA 함량을 계산하기 때문에, 단순히 명료함의 목적으로, ARA 함량 백분율의 계산법이 설명될 것이다. ARA 백분율은 (바이오매스로부터 추출되어진) 오일에 기초하며, 바이오매스 그 자체에 기초하는 것은 아니다. 그것은 중량에 기초한다. 그것은 헥산에 의해서 추출된 오일에 기초하고, 따라서 헥산 추출가능한 지질(HEL)에 기초한다. 그것은 총 오일량에 기초하며, (때때로 잘못된 큰 숫자를 나타내는) 지방산의 총량에 기초하는 것이 아니다. ARA 함량은 AOCS Cel b89 에 상세하게 기술된 잘 알려진 FAME 분석 프로토콜(지방산 메틸 에스테르 사용)에 의해서 결정된다. 상이한 용매가 상이한 지질을 추출할 것이다. 본 발명에서, 우선 오일이 헥산으로 추출되고 그 다음, 오일의 ARA 함량이 FAME 분석에 의해서 결정된다는 것을 주의하시오. 우선 아라키돈산(아직 세포내에 있는 동안)을 에스테르화하고 그 다음 더이상의 분석을 위해서 결과의 메틸 에스테르를 추출하는 것과 상이한 결과를 얻을 수 있다.
과산화물값(POV)
바람직하게는 미생물 오일의 POV 는 3.0, 2.5 또는 2.0 이하이다. 그러나, 본 발명의 방법을 사용하여 훨씬 낮은 POV값을 얻을 수 있고, 이들 값은 1.5 또는 1.0 미만일 수 있다. 0.8 미만 및 심지어 0.4 미만의 값이 얻어질 수 있다.
아니시딘값(AnV)
바람직하게는 미생물 오일의 아니시딘값은 1.0 이하, 예를 들어, 0.6, 0.3 미만 또는 심지어는 0.1 이하이다.
용도 및 산물
본 발명의 제 3 양태는 제 2 양태의 오일을 포함하는 조성물에 관한 것이고, 여기서는 하나 이상의 (추가적) 물질이 이용된다. 조성물은 인간 또는 동물에 대한 식품 및/또는 식품 첨가제이다. 인간 소비를 위한 것인 본 발명의 실시양태에서 오일은 인간 소비에 적당하게, 전형적으로는 미생물로부터 얻은 오일을 정련 또는 정제함으로써 제공될 수 있다.
조성물은 영유아 조제식 또는 (인간) 식품일 수 있다. 여기에서 조제식의 조성물은 정상 모유와 유사한 양의 지질 또는 PUFA를 갖도록 조정될 수 있다. 이것은 적당한 조성물을 얻기 위하여 본 발명의 미생물 오일을 다른 오일과 배합하는 것을 포함한다.
조성물은 동물 또는 양식어류 사료 조성물 또는 첨가제일 수 있다. 이같은 사료 및 첨가제는 어떤 농장 동물, 특히 양, 젖소 및 가금에 제공될 수 있다. 또 한 사료 또는 첨가제는 물고기와 어패류 같은 해양 양식 생물체에 제공될 수 있다. 그러므로 조성물은 이같은 동물에 대한 하나 이상의 사료 물질 또는 성분을 함유한다.
본 발명의 오일은 오일로서 직접 판매되거나 판매 적당한 포장, 전형적으로 에폭시 페놀 래커로 내부 코팅되고 질소 세척된 한 개의 알루미늄 병에 담긴 상태로 판매될 수 있다. 오일은 하나 이상의 항산화제 (예를 들어, 토코페롤, 비타민 E, 팔미테이트) 각각을 예를 들어 50 내지 800 ppm, 예컨대 100 내지 700 ppm 의 농도로 함유할 수 있다.
적합한 조성물은 예를 들어 경구용 약제학적 또는 수의학적 조성물 또는 화장품 조성물을 포함한다. 오일은 직접 섭취되거나 또는 예를 들어 껍질 내에 캡슐화되고, 따라서 캡슐 형태일 수 있다. 껍질 또는 캡슐은 젤라틴 및/또는 글리세롤을 포함할 수 있다. 조성물은 다른 성분, 예를 들어 향신료 (예를 들어, 레몬 또는 라임 향) 또는 약제학적 또는 수의학적으로 허용되는 담체 또는 부형제를 함유할 수 있다.
본 발명의 한 양태의 바람직한 성질 및 특징이 다른 양태에도 필요한 변형을 가하여 동등하게 적용된다.
이제 본 발명을, 예로서 하기 실시예를 참고로 하여 설명하는데, 실시예는 설명을 위한 것일 뿐 발명의 범위를 제한하고자 의도된 것이 아니다.
실시예 1 및 2(=비교예 1 및 2) 및 실시예 3 및 4
아라키돈산(ARA)의 제조
엠. 알피나(Mortierella alpina) 균주 CBS 168.95(네덜란드 2600 MA Delft DSM N.V.(DSM N.V.는 본 출원인이 기탁된 생물학적 물질을 분양받을 수 있는 권한을 부여하였다)가 네덜란드 3508 에이디 우트레흐트 P.O.Box 85167 센트라뷰로 보르 쉬멜쿨트레스(CBS)에 1995.2.20자로 기탁번호 DS 30340하에 기탁함)현탁액의 1ml 바이알을 -80℃에서 저장하였고, 무균에서 개봉하였다.
글루코스, 20;
효모 추출물(Gistex
Figure 112008044274137-pct00001
페이스트(고형부 80%, 단백질(N x 6.25) 46%, NaCl 16%, pH (2% 용액) 5.6, 회분 22%, 총 플레이트수 104/g, 엔테로박테리아케에(Enterobacteriaceae) 〈10/g, 이. 콜라이(E. coli) 〈1/g, 효모 및 곰팡이〈100/g, DSM N.V. 에서 구입, 세이버리(Savory) 성분 PO 박스 1,2600 MA Delft), 12.5;
소포제(영국 OX14 IRZ, 옥스포드, 아빙돈, 킴버 로드, 바실돈 케미칼 컴파니의 제조자의 지시에 따라 사용된 Basildon 86/013K 규소/비-규소 소포제 화합물), 0.2를 (g/ℓ) 함유하는 100ml 배지를 500ml 플라스크에 접종시켰다. 배지의 pH 는 가압멸균전에 7.0 으로 조정되었다.
250rpm 에서 진탕하면서 25℃에서 48시간동안 배양하였고, 글루코스, 20; 효모 추출물(Gistex
Figure 112004059748113-pct00002
paste), 25; 소포제(Basildon 86/013K), 0.2를 함유하는 500ml 의 배지를 사용하여 4개의 2000ml 플라스크의 접종에 사용하였다. 멸균전의 pH 는 7.0 이였다.
이들 배양물을 25℃에서 24시간동안 배양하였고 2000ml 플라스크에 사용된 것과 동일한 조성을 가진 2400ℓ 배지를 함유하는 5m3 접종 발효조에 시딩하였다(멸균전의 pH 는 6.0이였다).
발효 온도는 25℃로 고정하였고, 150rpm 에서 교반하였고, 용기 압력은 0.5바로 하였고, 통기율은 0.5VVM 이였다.
접종 발효조의 배양물을 약 36 시간후에 주요 발효조에 옮겼다(산소 섭취율은 〉3mmol/kg/h 였다).
주요 발효조는
글루코스, 35;
효모 추출물(Expresa 2200
Figure 112004059748113-pct00003
분말, 저 나트륨 양조 효모, 펩톤(추출물), 고형분 ≥96%, 총 N 〉10%, 아미노 N 6-7%, NaCl〈1%, pH (2% 용액 5.3-6.3), 회분 〈12.5%, DSM N.V. 로부터 구입가능한 균질의 분말, 세이버리 성분), 5.0;
NaH2PO4 .2H2O, 1.0;
KH2PO4, 2.0;
MgSO4.7H2O 0.5;
Basildon 86/013K, 0.3; 시트르산, 1H2O, 0.6;
ZnCl2, 0.010;
Fe2(SO4)3 20% H2O, 0.025;
MnSO4.1H2O, 0.010; (멸균전의 pH 5.0)을 함유(g/ℓ)하였다.
글루코스를 별도로 멸균시켰고, 멸균후에 주요 발효조에 첨가하였다.
발효는 175시간동안 지속시켰다. 0.5VVM 의 통기(공기 흐름), 0.8 바의 기압 및 70rpm 의 교반으로 배지의 pH 를 약 pH 6(+/-0.1)으로 유지시켰다. 산소 수준은 연속적으로 교반속도를 100rpm 으로 그리고, 공기흐름을 0.9VVM 으로 증가시킴으로써 D.O.≥30% 에서 유지되었다.
약 50%(w/w)의 무균 글루코스 용액을 발효조에 주입하여 글루코스 농도를 10g/ℓ이상으로 유지하였고 약 30 내지 78 시간동안 25% 효모 추출물 용액의 625kg을 암모니아 농도가〈30mg/ℓ로 조절된 공급율로 발효조에 주입하였다.
실험을 4회(실시예 1 내지 4) 수행하였고, 배지의 글루코스 농도를 시간에 대해 모니터링하였다. 발효 시간에 대한 글루코스 농도 그래프는, g/kg 으로 표 1에 제시된다. 이 표는 실시예 4의 마지막 값이 172 시간에서 2.2g/kg 이였다는 것을 나타낸다. 이것은 발효 종료(EoF) 3시간 전이였다. EoF 약 1 시간전에 글루코스 수준은 0 이였다.
비교예 1 및 2에서, 탄소원(글루코스)의 농도는 발효 종료시에 5g/kg 이상이였다. 더욱이, EoF 10 시간 전에, 글루코스 농도는 약 20g/kg 이였다. 따라서, 실시예 1 및 2에서, 글루코스의 농도는 미생물 군, 또는 ARA 의 제조에 대하여 제한적이지 않았다.
실시예 3 및 4에서, 발효 마지막 단계, EoF 에 바로 선행하는 단계에서 글루 코스 농도는 약 EoF 10 시간 전에 글루코스의 농도가 약 5g/kg 이 되도록 조절되었다. 이 마지막 단계동안에, 10시간에 걸쳐서, 0.5g/kg/hr 의 첨가율로 글루코스를 첨가하였다. EoF 에서 글루코스 농도는 실제로 0 이였다. 이 기간동안에, 글루코스의 소비율은 첨가율의 약 2배, 즉 약 1/g/kg/hr 이였다.
발효동안 수시간에 걸친 배지중의 글루코스 농도(g/kg)는 표 1 내지 4에 제시된다(각각은, 실시예 1 내지 4에 대응한다).
시간(hrs) 글루코스 농도 g/kg
0 48.7
24 57.6
28 47.8
54 46.4
78 62.0
102 62.5
126 48.2
150 42.5
167 20
시간(hrs) 글루코스 농도 g/kg
0 47.8
28 32.5
54 32.2
78 41.3
102 49.5
126 46.8
150 29.9
165 17.1
시간(hrs) 글루코스 농도 g/kg
0 49.2
28 60.1
54 40.8
78 34.0
102 37.3
126 23.2
150 16.7
172 7
시간(hrs) 글루코스 농도 g/kg
0 45
28 34.1
54 34.7
78 29.2
102 38.1
126 45
150 23.5
172 2.2
발효 종료시에, 미생물 및 주변의 수용액(발효 육즙)을 발효조로부터 제거하였다. 육즙에서 고용액을 분리시켜서 얼마간의 물을 제거한다. 그 다음, 잔존 세포를 압출하였고, 헥산을 사용하여 용매-추출시켰다. 따라서, ARA 함유 미생물 오일(헥산 추출가능한 지질)을 4개의 상이한 발효 프로토콜 각각을 실행시킨 세포로부터 얻었다.
오일중의 ARA 함량(중량 기준)의 백분율은 잘 알려진 FAME 분석 프로토콜(AOCS Celb89 에 상세하게 기술)을 사용하여 결정되었다. 실시예 3에서, 미생물 오일중의 ARA 농도는 508g/kg (50.8%)였다. 실시예 4에 대한 등가의 값은 545 g/kg(54.5% ARA)였다. 비교해보면, 비교예 1 및 2에서 세포로부터 추출된 미생물 오일은 각각 36.8% 및 36.7% 로서 훨씬 낮았다.

Claims (29)

  1. 삭제
  2. 삭제
  3. 삭제
  4. 삭제
  5. 삭제
  6. 삭제
  7. 오일을 기준으로 중량 대 중량에 기초하여 50중량% 이상의 아라키돈산(ARA)을 포함하는 미생물 오일로서,
    오일을 기준으로 중량 대 중량에 기초하여 90중량% 이상의 트리글리세리드 함량을 갖는 것을 특징으로 하는 미생물 오일.
  8. 삭제
  9. 제 7 항에 있어서,
    미생물 오일이 헥산 추출된 미생물 오일.
  10. 삭제
  11. 삭제
  12. 삭제
  13. 제 7 항 또는 제 9 항에 있어서,
    미생물 오일이 모르티에렐라 알피나(Mortierella alpina)로부터 분리된 미생물 오일.
  14. 제 7 항 또는 제 9 항에 있어서,
    미생물 오일이 3.0 이하의 과산화물값(POV)을 갖는 미생물 오일.
  15. 제 13 항에 있어서,
    미생물 오일이 3.0 이하의 과산화물값(POV)을 갖는 미생물 오일.
  16. 제 14 항에 있어서,
    미생물 오일이 1.0 이하의 과산화물값(POV)을 갖는 미생물 오일.
  17. 제 15 항에 있어서,
    미생물 오일이 1.0 이하의 과산화물값(POV)을 갖는 미생물 오일.
  18. 제 7 항 또는 제 9 항에 따른 미생물 오일을 포함하는, 식료품, 식품, 사료, 사료 첨가제 또는 화장품용 조성물.
  19. 제 13 항에 따른 미생물 오일을 포함하는, 식료품, 식품, 사료, 사료 첨가제 또는 화장품용 조성물.
  20. 제 14 항에 따른 미생물 오일을 포함하는, 식료품, 식품, 사료, 사료 첨가제 또는 화장품용 조성물.
  21. 제 15 항에 따른 미생물 오일을 포함하는, 식료품, 식품, 사료, 사료 첨가제 또는 화장품용 조성물.
  22. 제 16 항에 따른 미생물 오일을 포함하는, 식료품, 식품, 사료, 사료 첨가제 또는 화장품용 조성물.
  23. 제 17 항에 따른 미생물 오일을 포함하는, 식료품, 식품, 사료, 사료 첨가제 또는 화장품용 조성물.
  24. 제 7 항 또는 제 9 항에 따른 미생물 오일을 포함하는 영유아 조제식.
  25. 제 13 항에 따른 미생물 오일을 포함하는 영유아 조제식.
  26. 제 14 항에 따른 미생물 오일을 포함하는 영유아 조제식.
  27. 제 15 항에 따른 미생물 오일을 포함하는 영유아 조제식.
  28. 제 16 항에 따른 미생물 오일을 포함하는 영유아 조제식.
  29. 제 17 항에 따른 미생물 오일을 포함하는 영유아 조제식.
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