MXPA06002028A

MXPA06002028A - Desaturasas de acido graso de primula.

Info

Publication number: MXPA06002028A
Application number: MXPA06002028A
Authority: MX
Inventors: Rosa Thomas J La
Original assignee: Monsanto Technology Llc
Priority date: 2003-08-21
Filing date: 2004-08-20
Publication date: 2006-05-17
Also published as: EP1656449A1; PT1656449E; US8221819B2; US10174297B2; US20170283780A1; CA2881252A1; US20130041031A1; DE602004021001D1; US8173870B2; CA2535310C; AU2004268196A1; CA2535310A1; BRPI0413786A; US20130041032A1; CA2881252C; CN1871353B; US9701947B2; US20090176879A1; WO2005021761A1; ZA200601438B

Abstract

La invencion se refiere en general a metodos y composiciones que se refieren a enzimas desaturasa que modulan el numero y la ubicacion de enlaces dobles en acidos grasos poliinsaturados de cadena larga, LC-PUFA's; en particular, la invencion se refiere a metodos y composiciones para mejorar el perfil de acidos grasos omega-3 en productos y partes de plantas usando enzimas desaturasa y acidos nucleicos que codifican para dichas enzimas; en modalidades particulares, las enzimas desaturasa son ?6 desaturasas de Primula; se proveen tambien composiciones de aceite de soya mejoradas que tienen SDA y un contenido general benefico de acidos grasos omega-3 respecto a acidos grasos omega-6.

Description

DESATURASAS DE ACIDO GRASO DE PRIMULA ANTECEDENTES DE LA INVENCION Esta solicitud reclama prioridad de la solicitud de patente provisional de E.U.A. número de serie 60/496,751 , presentada en agosto 21 de 2003, cuya descripción completa se incorpora específicamente en la presente como referencia.

CAMPO DE LA INVENCION La invención se refiere en general a enzimas desaturasa que modulan el número y la ubicación de dobles enlaces en ácidos grasos poliinsaturados de cadena larga (LC-PUFA's). En particular, la invención se refiere al mejoramiento de perfiles de ácidos grasos usando enzimas desaturasa, y ácidos nucleicos que codifican para dichas enzimas desaturasa.

DESCRIPCION DE LA TECNICA RELACIONADA Los productos primarios de la biosíntesis de ácidos grasos en la mayoría de los organismos, son compuestos de 16 y 18 carbonos. La relación relativa de la longitud de la cadena y el grado de ¡nsaturación de estos ácidos grasos, varía ampliamente entre las especies. Los mamíferos, por ejemplo, producen principalmente ácidos grasos saturados y monoinsaturados, mientras que la mayoría de las plantas superiores producen ácidos grasos con 1 , 2 ó 3 dobles enlaces, los últimos dos comprendiendo ácidos grasos poliinsaturados (PUFA's). Dos familias importantes de PUFAs, son los ácidos grasos omega-3 (representados también como ácidos grasos "n-3"), ejemplificados por el ácido eicosapentanoico (EPA, 20:4, n-3), y los ácidos grasos omega-6 (representados también como ácidos grasos "n-6"), ejemplificados por el ácido araquidónico (ARA, 20:4, n-6). Los PUFAs son componentes importantes de la membrana plasmática de la célula y el tejido adiposo, en donde pueden encontrarse en formas tales como fosfolípidos y como triglicéridos, respectivamente. Los PUFAs son necesarios para el desarrollo adecuado en mamíferos, en particular en el cerebro del infante en desarrollo, y para la formación y reparación de tejidos. Varios trastornos responden al tratamiento con ácidos grasos. Se ha mostrado que la complementación con PUFAs reduce la velocidad de restenosis después de angioplastía. Se han documentado también los beneficios a la salud que tienen ciertos ácidos grasos omega-3 dietéticos para enfermedad cardiovascular y artritis reumatoide (Simopoulos, 1997; James et al., 2000). Además, se han sugerido los PUFAs para su uso en tratamientos de asma y psoriasis. La evidencia indica que los PUFAs pueden intervenir en el metabolismo del calcio, sugiriendo que los PUFAs pueden ser útiles en el tratamiento o prevención de osteoporosis y de piedras del riñon o tracto urinario. La mayor parte de la evidencia sobre los beneficios a la salud, se aplica a los ácidos grasos omega-3 de cadena larga, EPA y ácido docosahexanoico (DHA, 22:6), que están en el pescado y el aceite de pescado. Con esta base de evidencia, las autoridades en salud y los especialistas en nutrición en Canadá (Scientific Review Committee, 1990, Nutrition Recommendations, Minister of National Health and Welfare, Canadá, Ottawa), Europa (de Deckerer et al., 1998), el Reino Unido (The British Nutrition Foundation, 1992, Unsaturated fatty-acids - nutritional and physiological significance: The report of the British Nutrition Foundation's Task Forcé, Chapman and Hall, Londres) y los Estados Unidos (Simopoulos et al., 1999), han recomendado el consumo dietético incrementado de estos PUFAs. Los PUFAs pueden usarse también para tratar diabetes (véase patente de E.U.A. No. 4,826,877; Horrobin et al., 1993). Se ha demostrado alteración en el metabolismo y la composición de ácidos grasos en animales diabéticos. Se ha sugerido que estas alteraciones intervienen en algunas de las complicaciones a largo plazo que resultan de la diabetes, incluyendo retinopatía, neuropatía, nefropatía y daño del sistema reproductivo. Se ha mostrado que el aceite de prímula, que contiene ácido gamma-linolénico (GLA, 18:3, ?6, 9, 12), previene y revierte el daño nervioso en el diabético. PUFAs tales como el ácido linoleico (LA, 18:2, ?9, 12) y el ácido a-linolénico (ALA, 18:3, ?9, 12, 15), son considerados como ácidos grasos esenciales en la dieta, debido a que los mamíferos carecen de la capacidad para sintetizar estos ácidos. Sin embargo, cuando son ingeridos, los mamíferos tienen la capacidad de metabolizar LA y ALA para formar las familias n-6 y n-3 de ácidos grasos poliinsaturados de cadena larga (LC-PUFA). Estos LC-PUFA's son componentes celulares importantes que confieren fluidez a las membranas, y funcionan como precursores de eicosanoides biológicamente activos tales como prostaglandinas, prostaciclinas y leucotrienos, que regulan funciones fisiológicas normales. El ácido araquidónico es el precursor principal para la síntesis de eicosanoides, que incluyen leucotrienos, prostaglandinas y tromboxanos, y que desempeñan también una función en el proceso de inflamación. Se ha mostrado que la administración de un ácido graso omega-3, tal como SDA, inhibe la biosíntesis de leucotrienos (véase la patente de E.U.A. No. 5,158,975). Se ha mostrado que el consumo de SDA lleva a una disminución en los niveles de las citocinas proinflamatorias FNT-a e IL-1 ß en sangre (véase documento del PCT US 0306870). En mamíferos, la formación de LC-PUFA es limitada en velocidad por el paso de desaturación ?6, que convierte el LA a ácido ?-linolénico (GLA, 18:3, ?6, 9, 12) y el ALA a SDA (18:4, ?6, 9, 12, 15). Se ha mostrado que muchas condiciones fisiológicas y patológicas deprimen este paso metabólico y, en consecuencia, la producción de LC-PUFA. Para superar el paso limitativo en velocidad y aumentar los niveles de EPA en los tejidos, podrían consumirse grandes cantidades de ALA. Sin embargo, el consumo de sólo cantidades moderadas de SDA provee una fuente eficiente de EPA, ya que el SDA es casi cuatro veces más eficiente que el ALA para elevar los niveles de EPA en los tejidos en humanos (véase la solicitud de E.U.A. copendiente número de serie 10/384,369). En los mismos estudios, la administración de SDA fue también capaz de aumentar los niveles de ácido docosapentanoico (DPA) en los tejidos, que es un producto de elongación de EPA. En forma alternativa, el desvío de la desaturación ?6 mediante complementación dietética con EPA o DHA, puede aliviar efectivamente muchas enfermedades patológicas asociadas con bajos niveles de PUFA. Sin embargo, como se expone en más detalle más adelante, fuentes actualmente disponibles de PUFA no son deseables por una multitud de razones. La necesidad de una fuente confiable y económica de PUFA's, ha estimulado el interés en fuentes alternativas de PUFA's. Los PUFAs de cadena larga principales de importancia, incluyen DHA y EPA, que se encuentran principalmente en diferentes tipos de aceite de pescado, y ARA, presente en hongos filamentosos tales como Mortierella. Para DHA, existen muchas fuentes para producción comercial que incluyen una variedad de organismos marinos, aceites obtenidos de peces marinos de agua fría, y fracciones de yema de huevo. Fuentes comerciales de SDA incluyen los géneros de plantas Tríchodesma, Borago (borraja) y Echium. Sin embargo, existen varias desventajas asociadas con la producción comercial de PUFAs a partir de fuentes naturales. Las fuentes naturales de PUFAs, tales como animales y plantas, tienden a tener composiciones de aceite altamente heterogéneas. Los aceites obtenidos de estas fuentes pueden requerir por lo tanto purificación extensiva para separar uno o más PUFAs deseados, o para producir un aceite que esté enriquecido en uno o más PUFAs. Las fuentes naturales de PUFAs están sujetas también a fluctuaciones incontrolables en disponibilidad. Las existencias de pescado pueden sufrir variación natural, o pueden agotarse por la pesca excesiva. Además, aún con una evidencia abrumadora de sus beneficios terapéuticos, no se hace caso a las recomendaciones dietéticas respecto a los ácidos grasos omega-3. Los aceites de pescado tienen sabores y olores desagradables, los cuales pueden ser imposibles de separar económicamente del producto deseado, y pueden hacer que dichos productos sean inaceptables como complementos alimenticios. Los aceites animales, en particular los aceites de pescado, pueden acumular contaminantes ambientales. Los alimentos pueden ser enriquecidos con aceites de pescado, pero de nuevo, dicho enriquecimiento es problemático debido al costo y la declinación de las existencias de pescado al nivel mundial. Este problema es también un impedimento al consumo e ingestión de pescado entero. Sin embargo, si los mensajes sobre la salud para incrementar la ingestión de pescado fueran aprovechados por las comunidades, probablemente habría un problema para satisfacer la demanda de pescado. Además, existen problemas con la sustentación de esta industria, que depende notablemente de las existencias de pescado silvestre como alimento en acuacultura (Naylor et al., 2000). Otras limitaciones naturales favorecen una alternativa novedosa para la producción de ácidos grasos omega-3. El tiempo atmosférico y las enfermedades pueden causar fluctuación en los rendimientos de fuentes de pescado y plantas. La tierra de cultivo disponible para la producción de cultivos alternos productores de aceite, está sujeta a competencia con la expansión estable de poblaciones humanas y la necesidad incrementada asociada para producir alimentos en la tierra cultivable restante. Cultivos que producen PUFAs, tales como la borraja, no han sido adaptados para crecimiento comercial, y pueden no tener un buen rendimiento en monocultivo. El crecimiento de dichos cultivos no es de esta manera económicamente competitivo, pues pueden desarrollarse cultivos más provechosos y mejor establecidos. La fermentación a gran escala de organismos tales como Mortierella, es también costosa. Los tejidos animales naturales contienen bajas cantidades de ARA, y son difíciles de procesar. Microorganismos tales como Porphyridium y Mortierella, son difíciles de cultivar a una escala comercial. Muchas enzimas intervienen en la biosíntesis de PUFAs. El LA, (18:2, ?9, 12) es producido a partir de ácido oleico (OA, 18:1 , ?9) por una A12-desaturasa, mientras que el ALA (18:3, ?9, 12, 15) es producido a partir de LA por una A15-desaturasa. El SDA (18:4, ?6, 9, 12, 15) y el GLA (18:3, ?6, 9, 12) son producidos a partir de LA y ALA por una ?d-desaturasa. Sin embargo, como se indicó anteriormente, los mamíferos no pueden desaturar más allá de la posición ?9, y no pueden convertir por lo tanto el ácido oleico en LA. Asimismo, el ALA no puede ser sintetizado por los mamíferos. Otros eucariontes, que incluyen hongos y plantas, tienen enzimas que desaturan en la posición del carbono 12 y el carbono 15. Los ácidos grasos poliinsaturados principales de los animales se derivan por lo tanto de la dieta mediante la desaturación y elongación subsecuentes de los LA y ALA de la dieta. Se han descrito varios genes que codifican para desaturasas. Por ejemplo, la patente de E.U.A. No. 5,952,544 describe fragmentos de ácido nucleico aislados y clonados de Brassica napus que codifican para enzimas desaturasa de ácido graso. La expresión de los fragmentos de ácido nucleico de dicha patente resulta en la acumulación de ALA. Sin embargo, en plantas transgénicas que expresan la A15-desaturasa de B. napus, el LA sustancial continúa siendo no convertido por la desaturasa. Serían ventajosas enzimas más activas que conviertan mayores cantidades de LA a ALA. Los niveles de ALA incrementados permiten que la ?ß-desaturasa, cuando es co-expresada con un ácido nucleico que codifica para la ?15-desaturasa actúe sobre el ALA, produciendo de esta manera mayores niveles de SDA. Debido a la multitud de usos benéficos del SDA, existe la necesidad de crear un incremento sustancial en el rendimiento de SDA. Se han buscado ácido nucleicos de varias fuentes para su uso en el incremento del rendimiento de SDA. Sin embargo, se necesitan aún innovaciones que permitan la producción comercial mejorada en cultivos terrestres (véase, por ejemplo, Reed et al., 2000). Además, el uso de polinucleótidos de desaturasa derivados de organismos tales como Caenorhabdi'ti's elegans (Meesapyodsuk et al., 2000), no es ideal para la producción comercial de aceites de semilla enriquecidos de plantas. Genes que codifican para A6-desatu rasas, se han aislado de dos especies de Prímula, P. farinosa y P. vialii, y se encontró que éstas son activas en levaduras, pero no se mostró su función en plantas (Sayanova et ai, 2003). Por lo tanto, sería ventajoso obtener material genético que intervenga en la biosíntesis de PUFA y que exprese el material aislado en un sistema de plantas, en particular, un sistema de plantas de cultivo terrestres, que pueda manipularse para proveer la producción de cantidades comerciales de uno o más PUFA's. Existe también la necesidad de incrementar la ingestión de ácidos grasos omega-3 en humanos y animales. De esta manera, existe la necesidad de proveer una amplia gama de alimentos y complementos alimenticios enriquecidos con ácidos grasos omega-3, de modo que los sujetos puedan seleccionar forraje, ingredientes de forraje, alimento e ingredientes alimenticios que armonicen con sus hábitos dietéticos usuales. Particularmente ventajosos serían aceites de semilla con niveles incrementados de SDA. Actualmente, existe sólo un ácido graso omega-3, ALA, disponible en aceites vegetales. Sin embargo, existe conversión deficiente del ALA ingerido a los ácidos grasos omega-3 de cadena más larga, tales como EPA y DHA. Se ha demostrado en la solicitud de E.U.A. copendiente número de serie 10/384,369, titulada "Treatment And Prevention Of Inflammatory Disorders", que el aumento de la ingestión de ALA a partir del promedio de la comunidad de 1 g al día a 14 g al día mediante el uso de aceite de linaza, sólo aumentó modestamente los niveles del fosfolípido EPA en plasma. Un incremento 14 veces mayor en la ingestión de ALA, resultó en un incremento dos veces mayor en el fosfolípido EPA en plasma ( anzioris et al., 994). De esta manera, para ese fin, existe la necesidad de una producción eficiente y comercialmente viable de PUFAs usando desaturasas de ácido graso, genes que los codifiquen, y métodos recombinantes que los produzcan. Existe también la necesidad de aceites que contengan proporciones relativas mayores de PUFAs específicos, y composiciones y complementos alimenticios que los contengan. Existe también la necesidad de métodos económicos confiables para producir PUFAs específicos. A pesar de las ineficiencias y los bajos rendimientos como se describió anteriormente, la producción de ácidos grasos omega-3 mediante la cadena alimenticia terrestre, es una empresa benéfica para la salud pública y, en particular, la producción de SDA. El SDA es importante debido a que, como se describió anteriormente, existe una baja conversión de ALA a EPA. Esto es porque la enzima inicial en la conversión, A6-desaturasa, tiene baja actividad en humanos y es limitativa en velocidad. La evidencia de que la ?6-desaturasa es limitativa en velocidad, es provista por estudios que demuestran que la conversión de su substrato, ALA, es menos eficiente que la conversión de su producto, SDA a EPA, en ratones y ratas (Yamazaki et al., 1992; Huang, 1991). Con base en dichos estudios, se observa que en cultivos de semillas oleaginosas comerciales, tales como cañóla, soya, maíz, girasol, cártamo o lino, la conversión de cierta fracción de los ácidos grasos monoinsaturados y poliinsaturados que tipifica su aceite de semilla a SDA, requiere la expresión específica de la semilla de enzimas desaturasa múltiples, que incluyen ?6-, ?12- y/o ??d-desaturasas. Los aceites derivados de plantas que expresan niveles elevados de ?6, ?12 y ??d-desaturasas, son ricos en SDA y otros ácidos grasos omega-3. Dichos aceites pueden usarse para producir alimentos y complementos alimenticios enriquecidos en ácidos grasos omega-3, y el consumo de dichos alimentos aumenta efectivamente los niveles de EPA y DHA en los tejidos. Alimentos y productos alimenticios tales como leche, margarina y embutidos, todos hechos o preparados con aceites enriquecidos en ácidos grasos omega-3, resultan en beneficios terapéuticos. Se ha mostrado que los sujetos pueden tener una ingestión de ácidos grasos omega-3 comparable a EPA y DHA de por lo menos 1.8 g al día, sin que se alteren sus hábitos dietéticos, usando alimentos que contengan aceites enriquecidos con ácidos grasos omega-3. De esta manera, existe una fuerte necesidad de ácidos nucleicos novedosos de ?6-desaturasas para su uso en plantas de cultivo transgénicas con aceites enriquecidos en PUFAs, así como los aceites mejorados producidos por las mismas.

BREVE DESCRIPCION DE LA INVENCION En un aspecto, la invención provee ácidos nucleicos aislados que codifican para un polipéptido capaz de desaturar una molécula de ácido graso en el carbono 6 (A6-desaturasas). Estos pueden usarse para transformar células, o para modificar la composición de ácidos grasos de una planta o el aceite producido por una planta. Una modalidad de la invención, es una secuencia de polinucleótidos aislada, aislada de una especie de Prímula, que tiene actividad de desaturasa única. En ciertas modalidades, los polinucleótidos aislados se aislan, por ejemplo, de Prímula juliae, P. alpicola, P. waltonii, P. farinosa o P. florindae. En otras modalidades de la invención, los polinucleótidos codifican para un polipéptido que tiene por lo menos 90% de identidad de secuencias con la secuencia polipeptídica de SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 24, SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 46 o SEQ ID NO: 48, incluyendo por lo menos aproximadamente 92%, 95%, 98% o 99% de homología con estas secuencias. Los expertos en la técnica reconocerán que, puesto que estas secuencias están relacionadas, un polipéptido determinado puede compartir simultáneamente 90% o más homología con más de una de estas secuencias polipeptídicas. En ciertas modalidades, una secuencia provista por la invención tiene una selectividad por el substrato para ácido alfa-linolénico respecto a ácido linoleico, como se describe en la presente. En otras modalidades, existe por lo menos 2:1 de selectividad por el substrato para ácido alfa-linolénico respecto a ácido linoleico, incluyendo de aproximadamente 2:1 a aproximadamente 2.9:1. En otro aspecto, la invención provee un polinucleótido aislado que codifica para un polipéptido que tiene actividad de desaturasa que desatura una molécula de ácido graso en el carbono 6, que comprende una secuencia seleccionada del grupo que consiste de: (a) un polinucleótido que codifica para el polipéptido de SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 24, SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 46 o SEQ ID NO: 48; (b) un polinucleótido que comprende la secuencia de ácido nucleico de SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO: 25, SEQ ID NO: 45 o SEQ ID NO: 47; (c) un polinucleótido que híbrida con SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO: 25, SEQ ID NO: 45 o SEQ ID NO: 47, o un complemento de la misma, bajo condiciones de 5X SSC, formamida a 50% y 42°C; y (d) un polinucleótido que codifica para un polipéptido con por lo menos 90% de identidad de secuencias con una secuencia polipeptídica de SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 24, SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 46 o SEQ ID NO: 48. En otro aspecto, la invención provee un vector recombinante que comprende un polinucleótido aislado de conformidad con la Invención. El término "vector recombinante", como se usa en la presente, incluye cualquier segmento de ADN recombinante que se desee introducir en una célula, tejido y/u organismo hospedero, e incluye específicamente cassettes de expresión aislados de un polinucleótido de partida. Un vector recombinante puede ser lineal o circular. En varios aspectos, un vector recombinante puede comprender por lo menos una secuencia adicional seleccionada del grupo que consiste de: secuencias reguladoras acopladas operativamente al polinucleótido; marcadores de selección acoplados operativamente al polinucleótido; secuencias de marcación acopladas operativamente al polinucleótido; una porción de purificación acoplada operativamente al polinucleótido; y una secuencia de elección de objetivo acoplada operativamente al polinucleótido. En otro aspecto, la invención provee células, tales como células de mamífero, planta, insecto, levadura y bacteria, transformadas con los polinucleótidos de la presente invención. En otra modalidad, las células son transformadas con vectores recombinantes que contienen promotores constitutivos y específicos de tejidos, además de los polinucleótidos de la presente invención. En ciertas modalidades de la invención, dichas células pueden definirse además como transformadas con una secuencia de ácido nucleico que codifica para un polipéptido que tiene actividad de desaturasa, que desatura una molécula de ácido graso en el carbono 12 y/o 15. La invención provee también un polipéptido que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 24, SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 46 o SEQ ID NO: 48; o un fragmento del mismo que tiene actividad de desaturasa que desatura una molécula de ácido graso en el carbono 6. Otro aspecto de la invención provee un método para producir aceite de semilla que contiene ácidos grasos omega-3 de semillas de plantas, el cual comprende los pasos de: (a) obtener semillas de una planta de conformidad con la invención; y (b) extraer el aceite de dichas semillas. Ejemplos de dicha planta incluyen cañóla, soya, colza, girasol, algodón, cacao, cacahuate, cártamo, coco, lino, palma de aceite, Brassica napus de semilla oleaginosa y maíz. Métodos preferidos para transformar dichas células vegetales, incluyen el uso de plásmidos Ti y Ri de Agrobacteríum, electroporación y bombardeo balístico de alta velocidad. En otro aspecto, la invención provee un método para producir una planta que comprende aceite de semilla que contiene niveles alterados de ácidos grasos omega-3, el cual comprende introducir un vector recombinante de la invención en una planta que produce aceite. En el método, la introducción del vector recombinante puede comprender transformación genética. En una modalidad, la transformación comprende los pasos de: (a) transformar una célula vegetal con un vector recombinante de la invención; y (b) regenerar la planta a partir de la célula vegetal, en donde la planta tiene niveles alterados de ácidos grasos omega-3 respecto a una planta correspondiente del mismo genotipo que no fue transformada con el vector. En el método, la planta puede seleccionarse, por ejemplo, del grupo que consiste de Arabidopsis thaliana, Brassica de semilla oleaginosa, colza, girasol, cártamo, cañóla, maíz, soya, algodón, lino, jojoba, árbol de sebo chino, tabaco, cacao, cacahuate, plantas con fruto, plantas de cítricos, y plantas que producen nueces y bayas. La planta puede definirse además como transformada con una secuencia de ácido nucleico que codifica para un polipéptido que tiene actividad de desaturasa, que desatura una molécula de ácido graso en el carbono 12 y/o 15. La planta puede comprender SDA incrementado. El método puede comprender además introducir el vector recombinante en una pluralidad de plantas que producen aceite, y seleccionar las plantas o la progenie de las mismas que tengan heredado el vector recombinante para una planta que tenga un perfil deseado de ácidos grasos omega-3. En otro aspecto, la invención provee un aceite de semilla de soya endógeno que tiene un contenido de SDA de aproximadamente 5% a aproximadamente 50%, y un contenido de ácido gamma-linoleico menor de aproximadamente 10%. En ciertas modalidades, el contenido de SDA puede definirse además como de aproximadamente 5% a aproximadamente 32%, de aproximadamente 5% a aproximadamente 35%, de aproximadamente 15% a aproximadamente 30%, de aproximadamente 22% a aproximadamente 30%, y de aproximadamente 22% a aproximadamente 40%. En otras modalidades, el contenido de ácido gamma-linoleico puede definirse como menor de aproximadamente 10, 8, 5 y/o aproximadamente 3%. En modalidades particulares, el contenido de ácido estearidónico puede ser de aproximadamente 15% a aproximadamente 35%, y el contenido de ácido gamma-linoleico puede ser menor de 5%. En otras modalidades, la semilla puede comprender una relación de ácidos grasos omega-3 a omega-6 de aproximadamente 0.35:1 a aproximadamente 3.5:1 , incluyendo de aproximadamente 1:1 a aproximadamente 3.5:1 y de aproximadamente 2:1 a aproximadamente 3.5:1. En otro aspecto, la invención provee un método para incrementar el valor nutricional de un producto comestible para consumo humano o animal, el cual comprende añadir un aceite de semilla de soya provisto por la invención, al producto comestible. En ciertas modalidades, el producto es alimento para consumo humano y/o animal. El producto comestible puede ser también forraje y/o un complemento alimenticio para animales. En el método, el aceite de semilla de soya puede incrementar el contenido de SDA del producto comestible, y/o puede disminuir la relación de ácidos grasos omega-6 a omega-3 del producto comestible. El producto comestible puede carecer de SDA antes de añadir el aceite de semilla de soya. En otro aspecto, la invención provee un método para fabricar alimento o forraje, el cual comprende añadir un aceite de semilla de soya provisto por la invención a ingredientes de alimento o forraje de partida para producir el alimento o forraje. En ciertas modalidades, el método se define además como un método para fabricar alimento y/o forraje. La invención provee también alimento o forraje obtenido mediante el método. En otro aspecto, la invención comprende un método para proveer SDA a un humano o animal, el cual comprende administrar el aceite de semilla de soya de conformidad con la reivindicación 1 , a dicho humano o animal. En el método, el aceite de semilla de soya puede administrarse en una composición comestible, incluyendo alimento o forraje. Ejemplos de alimento incluyen bebidas, alimentos infundidos, salsas, condimentos, aderezos para ensalada, jugos de fruta, jarabes, postres, alcorzas y rellenos, productos congelados blandos, confitura o alimento de humedad intermedia. La composición comestible puede ser sustancialmente un líquido o sólido. La composición comestible puede ser también un complemento alimenticio y/o nutracéutico. En el método, el aceite de semilla de soya puede administrarse a un humano y/o un animal. Ejemplos de animales a los cuales puede administrarse el aceite, incluyen ganado o aves de corral.

BREVE DESCRIPCION DE LAS FIGURAS Los siguientes dibujos forman parte de la presente especificación, y se incluyen para demostrar además ciertos aspectos de la presente invención. La invención puede entenderse mejor con relación a uno o más de estos dibujos, en combinación con la descripción detallada de modalidades específicas presentadas en la presente. La figura 1 muestra la alineación de A6-desaturasas de Prímula juliae PjD6D-1 y PjD6D-2 (SEQ ID NOs: 4 y 5), Pa6D-1 y Pa6D-2 de Prímula alpicola (SEQ ID NOs: 22 y 24), PwD6D de Prímula waltonii (SEQ ID NO: 26), D6D-2 de Prímula farinosa (SEQ ID NO: 46), D6D de Prímula floríndae (SEQ ID NO: 48), D6D de Borago oficinalis (SEQ ID NO: 59) y D6D de Echium gentianoides (SEQ ID NO: 60). La figura 2 muestra el mapa del vector pMON670 1. La figura 3 muestra el mapa del vector pMON83950. La figura 4 muestra el mapa del vector p ON77245. La figura 5 muestra el mapa del vector pMON77247. La figura 6 muestra el mapa del vector pMON82821. La figura 7 muestra el mapa del vector pMON82822.

La figura 8 muestra el mapa del vector pMON83961. La figura S muestra el mapa del vector pMON83962. La figura 10 muestra el mapa del vector pMON83963. La figura 11 muestra el mapa del vector pMON83964. La figura 12 muestra el mapa del vector pMON83965. La figura 13 muestra el mapa del vector pMON83966.

DESCRIPCION DETALLADA DE LA INVENCION La invención supera las limitaciones de la técnica anterior, proveyendo métodos y composiciones para la creación de plantas con contenido de PUFA mejorado. La modificación del contenido de ácidos grasos de un organismo tal como una planta, presenta muchas ventajas, que incluyen nutrición mejorada y beneficios a la salud. La modificación del contenido de ácidos grasos puede usarse para obtener niveles benéficos o perfiles de PUFA's deseados en plantas, partes de plantas y productos de plantas, incluyendo aceite de las semillas de las plantas. Por ejemplo, cuando se producen los PUFA's deseados en el tejido de la semilla de una planta, el aceite puede aislarse de las semillas, resultando típicamente en un alto contenido de aceite en PUFAs deseados, o un aceite que tenga un contenido o perfil deseado de ácidos grasos, el cual puede usarse a su vez para proveer características benéficas en productos alimenticios y otros productos. La invención provee en modalidades particulares aceite de soya endógeno que tiene SDA, mientras contiene también un contenido benéfico de ácido oleíco. Varios aspectos de la invención incluyen métodos y composiciones para modificación del contenido de PUFA de una célula, por ejemplo, modificación del contenido de PUFA de las células de una planta. Las composiciones relacionadas con la invención incluyen secuencias de polinucleótidos aisladas novedosas, construcciones de polín ucleótidos y plantas y/o partes de plantas transformadas mediante polinucleótidos de la invención. El polinucleótido aislado puede codificar para desaturasas de ácido graso de Prímula y, en particular, puede codificar para una ?d-desaturasa de Prímula. Pueden manipularse células hospederas para que expresen un polinucleótido que codifica para polipéptidos de desaturasa que catalizan la desaturación de ácidos grasos. Algunos aspectos de la invención incluyen varios polipéptidos de desaturasa, y polinucleótidos que codifican para los mismos. Varias modalidades de la invención pueden usar una combinación de polinucleótidos de desaturasa y los polipéptidos codificados que dependen típicamente de la célula hospedera, la disponibilidad de substratos y los productos finales deseados. El término "desaturasa" se refiere a un polipéptido que puede desaturar o catalizar la formación de un doble enlace entre carbonos consecutivos de uno o más ácidos grasos, para producir un ácido graso monoinsaturado o poliinsaturado, o precursor del mismo. De particular interés, son los polipéptidos que pueden catalizar la conversión de ácido oleico a LA, LA a ALA o ALA a SDA, incluyendo enzimas que desaturan en las posiciones 12, 15 ó 6. El término "polipéptido" se refiere a cualquier cadena de aminoácidos, sin importar la longitud o modificación post-traducción (por ejemplo, glucosilación o fosforilación). Consideraciones para elegir un polipéptido específico que tenga actividad de desaturasa incluyen, pero no están limitadas a, el pH óptimo del polipéptido, si el polipéptido es una enzima limitativa en velocidad o un componente de la misma, si la desaturasa usada es esencial para la síntesis de un PUFA deseado, y/o si el polipéptido requiere un cofactor. El polipéptido expresado tiene de preferencia características que son compatibles con el ambiente bioquímico de su ubicación en la célula hospedera. Por ejemplo, el polipéptido puede tener que competir por los substratos. Los análisis de la Km y la actividad específica de un polipéptido en cuestión pueden considerarse al determinar la conveniencia de un polipéptido determinado para modificar la producción, el nivel o el perfil de PUFAs en una célula hospedera determinada. El polipéptido usado en una situación particular, es uno que pueda funcionar típicamente bajo las condiciones presentes en la célula hospedera deseada, pero puede ser de otra manera cualquier polipéptido de desaturasa que tenga una característica deseada o que sea capaz de modificar la producción, el nivel o el perfil relativo de un PUFA deseado, o cualquier otra característica deseada, como se discute en la presente. Los substratos para la enzima expresada pueden ser producidos por la célula hospedera, o pueden proveerse exógenamente. Para lograr la expresión, los polipéptidos de la presente invención son codificados por polinucleótidos como se describe más adelante. Los inventores han aislado y producido enzimas de Prímula que exhiben actividad de ?ß-desaturasa. Las secuencias que codifican para la ?6-desaturasa pueden expresarse en plantas, microorganismos o animales transgénicos, para efectuar mayor síntesis de SDA. Pueden usarse también otros polinucleótidos que son sustancialmente idénticos a los polinucleótidos de A6-desaturasa provistos en la presente, o que codifican para polipéptidos que son sustancialmente idénticos a los polipéptidos de ?d-desaturasa. El término "sustancialmente idéntica" se refiere a una secuencia de aminoácidos o secuencia de ácido nucleico que exhibe, en orden de preferencia creciente, por lo menos 90%, 95%, 98% o 99% de identidad con la secuencia del polipéptido de A6-desaturasa en SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 24, SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 46 o SEQ ID NO: 48, o secuencias que codifican para estos polipéptidos. Pueden hacerse comparaciones de polipéptidos o polinucleótidos, usando software de análisis de secuencias, por ejemplo, el paquete de software de análisis de secuencias de The GCG Wisconsin Package (Accelrys, San Diego, CA), MEGAlign (DNAStar, Inc., 1228 S. Park St., Madison, Wis. 53715) y MacVector (Oxford Molecular Group, 2105 S. Bascom Avenue, Suite 200, Campbell, Calif. 95008). Dicho software compara secuencias similares asignando grados de similitud o identidad. Abarcadas por la presente invención son desaturasas relacionadas, que incluyen variantes de las A6-desaturasas descritas que ocurren en forma natural dentro de la misma especie o especies diferentes de Prímula. Pueden identificarse desaturasas relacionadas por su capacidad para funcionar sustancialmente igual que las desaturasas descritas; es decir, teniendo actividad de ?d-desaturasa. Pueden identificarse también desaturasas relacionadas, seleccionando bases de datos de secuencias para secuencias homologas a las desaturasas descritas, por hibridación de una sonda basada en las desaturasas descritas con una colección construida del organismo de origen, o mediante RT-PCR usando ARN mensajero del organismo de origen, e iniciadores basados en las desaturasas descritas. La invención provee por lo tanto ácidos nucleicos que hibridan bajo condiciones severas con secuencias que codifican para una desaturasa descrita en la presente. El experto en la técnica entiende que puede hacerse que las condiciones sean menos severas, aumentando la concentración de sales y disminuyendo la temperatura. De esta manera, las condiciones de hibridación pueden manipularse fácilmente, y de esta manera serán en general un método de elección, dependiendo de los resultados deseados. Un ejemplo de condiciones altamente severas es 5X SSC, formamida a 50% y 42°C. Al llevar a cabo un lavado bajo dichas condiciones, por ejemplo, por 10 minutos, pueden removerse aquellas secuencias que no hibriden con una secuencia objetivo particular bajo estas condiciones. En otro aspecto de la invención, pueden transferirse vectores que contengan un ácido nucleico, o fragmento del mismo, conteniendo un promotor, una secuencia codificante de A6-desaturasa y una región de terminación, en un organismo en el cual el promotor y las regiones de terminación sean funcionales. Por consiguiente, esta invención provee organismos que producen ?ß-desaturasas recombinantes. Otro aspecto de esta invención provee ?d-desaturasas aisladas, que pueden purificarse de los organismos recombinantes mediante métodos estándar de purificación de proteínas (véase, por ejemplo, Ausubel et al., 1994). Varios aspectos de la invención incluyen secuencias de ácido nucleico que codifican para desaturasas descritas en la presente. Los ácidos nucleicos pueden aislarse de Prímula, e incluyen SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 21 , SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO: 25, SEQ ID NO: 45 o SEQ ID NO: 47, y similares. Una estrategia de clonación basada en oligonucleótidos iniciadores diseñados para amplificar secuencias identificadas como desaturasas de ácido graso potenciales, con base en búsquedas BLAST de la base de datos de ADN genómico, puede usarse para secuenciar clones individuales. Estos clones pueden caracterizarse entonces funcionalmente. Pueden proveerse construcciones de ácido nucleico que se integran en el genoma de una célula hospedera, o que se replican en forma autónoma (por ejemplo, que se replican episómicamente) en la célula hospedera. Para la producción de ALA y/o SDA, los cassettes de expresión (es decir, un polinucleótido que codifica para una proteína que está enlazada operativamente a la secuencia de ácido nucleico que dirige la expresión del polinucleótido) usados en general, incluyen un cassette de expresión que provee la expresión de un polinucleótido que codifica para una ?d-desaturasa.

En ciertas modalidades, una célula hospedera puede tener contenido de ácido oleico de tipo silvestre. Métodos y composiciones para la construcción de vectores de expresión, cuando se consideran a la luz de las enseñanzas provistas en la presente para la expresión de enzimas desaturasa de Prímula, serán evidentes para los expertos en la técnica. Los vectores de expresión, como se describe en la presente, son moléculas de ADN o ARN diseñadas para la expresión controlada de un polinucleótido deseado, por ejemplo, el polinucleótido que codifica para A6-desaturasa. Ejemplos de vectores incluyen plásmidos, bacteriófagos, cósmidos o virus. De conformidad con la presente invención, se contemplan también, por ejemplo, vectores promiscuos (Wolk et al. 1984; Bustos et al., 1991). Revisiones de vectores, y métodos para prepararlos y usarlos, pueden encontrarse en Sambrook et al. (2001); Goeddel (1990); y Perbal (1988). Elementos de secuencia capaces de efectuar la expresión de un polinucleótido, incluyen promotores, elementos intensificadores, secuencias de activación hacia el extremo 5', señales de terminación de la transcripción, y sitios de poliadenilación. Polinucleótidos que codifican para desaturasas, pueden ponerse bajo el control por transcripción de un promotor fuerte. En algunos casos, esto lleva a un incremento en la cantidad de enzima desaturasa expresada, y concomitantemente un incremento en el ácido graso producido como resultado de la reacción catalizada por la enzima. Existe una amplia variedad de secuencias de promotor en plantas que pueden usarse para dirigir la expresión de polinucleótidos específica de tejidos que codifican para desaturasas en plantas transgénicas. Por supuesto, en modalidades particulares de la Invención, el promotor usado es un promotor específico de la semilla. Ejemplos de dichos promotores incluyen las regiones reguladoras 5' de genes tales como de napina (Kridl et al., Seed Sci. Res. 1: 209: 219, 1991), faseolina (Bustos, et al., Plant Cell, 1 (9): 839-853, 1989), inhibidor de tripsina de soya (Riggs, et al., Plant Cell 1 (6): 609-621 , 1989), ACP (Baerson ef al., Plant Mol. Bloi, 22(2): 255-267, 1993), estearoü-ACP desaturasa (Slocombe et al., Plant Physiol. 104(4): 167-176, 1994), sububnidad a' de beta-conglicinina de soya (P-Gm7S, véase, por ejemplo, Chen et al., Proc. Nati. Acad. Sci. 83: 8560-8564, 1986), USP de Vicia faba (P-Vf.Usp, véase, por ejemplo, SEQ ID NOs: 1 , 2 y 3, solicitud de patente de E.U.A. 10/429,516), el promotor de globulina (véase, por ejemplo, Belanger y Kriz, Genet. 129: 863-872 (1991), subunidad alfa de beta-conglicinina de soya (7S alfa) (solicitud de patente de E.U.A. 10/235,618, incorporada en la presente como referencia) y promotor de L3 oleosina de Zea mays (P-Zm.L3, véase, por ejemplo, Hong et al., Plant Mol. Biol., 34(3): 549-555, 1997). Se incluyen también las zeínas, que son un grupo de proteínas de almacenamiento presentes en el endospermo del maíz. Se han aislado clones genómicos para genes de zeína (Pedersen et al., Cell 29: 1015-1026 (1982) y Russell et al., Transgenic Res. 6(2): 157-168), y podrían usarse también los promotores para estos clones, incluyendo 5 kD, 16 kD, 19 kD, 22 kD, 27 kD y genes. El experto en la técnica puede determinar vectores y elementos reguladores (incluyendo regiones codificantes y promotores enlazados operablemente) adecuados para expresión en una célula hospedera particular. El término "enlazado operablemente" significa en este contexto, que el promotor y las secuencias de terminador funcionan efectivamente para regular la transcripción. Como otro ejemplo, un vector adecuado para la expresión de ?d-desaturasa en plantas transgénicas, puede comprender una secuencia de promotor específica de la semilla derivada de heliantinina, napina o glicinina enlazada operablemente a la región codificante de ?6-desaturasa, y además enlazada operablemente a una señal de terminación de proteína de reserva de la semilla o la señal de terminación de nopalina sintasa. Como otro ejemplo, un vector para su uso en la expresión de ?6-desaturasa en plantas, puede comprender un promotor constitutivo o un promotor específico de tejidos enlazado operablemente a la región codificante de ?d-desaturasa, y además enlazado operablemente a un terminador constitutivo o específico de tejidos, o la señal de terminación de nopalina sintasa. Modificaciones de las secuencias de nucleótidos o elementos reguladores descritos en la presente, que mantienen las funciones contempladas en la presente, están dentro del alcance de esta invención. Dichas modificaciones incluyen inserciones, sustituciones y deleciones, y específicamente sustituciones que reflejan la degeneración del código genético. Técnicas estándar para la construcción de dichos vectores recombinantes son bien conocidas por los expertos en la técnica, y pueden encontrarse en referencias tales como Sambrook et al. (2001), o cualquiera de la miríada de manuales de laboratorio sobre tecnología de ADN recombinante que están ampliamente disponibles. Está disponible una variedad de estrategias para ligar fragmentos de ADN, cuya elección depende de la naturaleza de los extremos de los fragmentos de ADN. Se contempla además de conformidad con la presente invención, incluir en un vector de ácido nucleico otros elementos de secuencia de nucleótidos que faciliten la clonación, expresión o procesamiento, por ejemplo, secuencias que codifiquen para péptidos de señal, una secuencia que codifique para KDEL que se requiere para la retención de proteínas en el retículo endoplásmico, o secuencias que codifiquen para péptidos de tránsito que dirigen la ?6-desaturasa hacia el cloroplasto. Dichas secuencias son conocidas por los expertos en la técnica. Un péptido de tránsito optimizado se describe, por ejemplo, en Van den Broeck et al. (1985). Secuencias de señal procarióticas y eucarióticas se describen, por ejemplo, en Michaelis et al. (1982). Los polinucleótidos que codifican para desaturasas deseadas, pueden identificarse en una variedad de formas. Como ejemplo, una fuente de la desaturasa deseada, por ejemplo, colecciones genómicas o de ADNc de Prímula, se seleccionan con sondas detectables enzimáticamente o sintetizadas químicamente, las cuales pueden obtenerse de ADN, ARN o nucleótidos de ocurrencia no natural, o mezclas de los mismos. Pueden sintetizarse enzimáticamente sondas a partir de polinucleótidos de desaturasas conocidas, mediante métodos de hibridación de severidad normal o reducida. Pueden usarse también sondas de oligonucleótidos para seleccionar fuentes, y pueden basarse en secuencias de desaturasas conocidas, incluyendo secuencias conservadas entre desaturasas conocidas, o en secuencias peptídicas obtenidas de la proteína purificada deseada. Pueden degenerarse sondas de oligonucleótidos basadas en secuencias de aminoácidos para que abarquen la degeneración del código genético, o pueden inclinarse a favor de los codones preferidos del organismo de origen. Pueden usarse también oligonucleótidos como iniciadores para PCR a partir de ARN mensajero transcrito en forma inversa a partir de una fuente conocida o supuesta; el producto de PCR puede ser ADNc de longitud completa, o puede usarse para generar una sonda para obtener el ADNc de longitud completa deseado. En forma alternativa, puede secuenciarse completamente una proteína deseada, y puede realizarse la síntesis total de un ADN que codifique para ese polipéptido. Una vez que el ADNc o el ADN genómico deseado ha sido aislado, puede secuenciarse mediante métodos conocidos. Se reconoce en la técnica que dichos métodos están sujetos a errores, de modo que la secuenciación múltiple de la misma región es de rutina, y se espera aún lleve a índices mensurables de errores en la secuencia deducida resultante, en particular en regiones que tienen dominios repetidos, estructura secundaria extensiva, o composiciones de bases no usuales, tales como regiones con alto contenido de bases de GC. Cuando surgen discrepancias, puede repetirse la secuenciación, y pueden usarse métodos especiales. Los métodos especiales pueden incluir alterar las condiciones de secuenciación, usando: diferentes temperaturas; diferentes enzimas; proteínas que alteren la capacidad de los oligonucleótidos para formar estructuras de orden superior; nucleótidos alterados tales como ITP o dGTP metilado; diferentes composiciones de gel, por ejemplo, añadiendo formamida; diferentes iniciadores o iniciadores localizados a diferentes distancias de la región problema; o diferentes moldes tales como moléculas de ADN de cadena sencilla. Puede usarse también secuenciación de ARN mensajero. La secuencia codificante completa, o parte de la misma para un polipéptido que tiene actividad de desaturasa, puede ser de una fuente natural. Sin embargo, en algunas situaciones, es deseable modificar los codones completos, o una porción de los mismos, por ejemplo, para intensificar la expresión, usando codones preferidos del hospedero. Codones preferidos del hospedero pueden determinarse a partir de los codones de más alta frecuencia en las proteínas expresadas en la cantidad más grande en una especie hospedera particular y/o tejido de interés. De esta manera, la secuencia codificante para un polipéptido que tiene actividad de desaturasa, puede sintetizarse totalmente o en parte. El ADN completo, o porciones del mismo, pueden sintetizarse también para remover cualquier secuencia o región de desestabilización de estructura secundaria que estaría presente en el ARN mensajero transcrito. El ADN completo, o porciones del mismo, pueden sintetizarse también para alterar la composición de bases a una más preferible en la célula hospedera deseada. Métodos para sintetizar secuencias y reunir secuencias, están bien establecidos en la literatura. Puede usarse mutagénesis in vitro y selección, mutagénesis dirigida a sitio u otros medios, para obtener mutaciones de genes de desaturasa de ocurrencia natural para producir un polipéptido que tenga actividad de desaturasa in vivo, con parámetros físicos y de cinética más deseables para funcionar en la célula hospedera, tal como una vida media más larga o una mayor velocidad de producción de un ácido graso poliinsaturado deseado. Una vez que se haya obtenido el polinucleótido que codifica para un polipéptido de desaturasa, se pone un vector capaz de replicación en una célula hospedera, o se propaga in vitro mediante técnicas tales como PCR o PCR larga. Los vectores de replicación pueden incluir plásmidos, fagos, virus, cósmidos, y similares. Vectores deseables incluyen aquellos útiles para mutagénesis del gen de interés, o para la expresión del gen de interés en células hospederas. La técnica de PCR larga ha hecho posible la propagación in vitro de grandes construcciones, de modo que modificaciones al gen de interés, tales como mutagénesis o adición de señales de expresión, y propagación de las construcciones resultantes, pueden ocurrir enteramente in vitro sin el uso de un vector de replicación o una célula hospedera. Para la expresión de un polipéptido de desaturasa, regiones de terminación e inicio de la transcripción y traducción son enlazadas operablemente al polinucleótido que codifica para el polipéptido de desaturasa. La expresión de la región codificante del polipéptido puede ocurrir in vitro o en una célula hospedera. Regiones de terminación e inicio de la transcripción y traducción, se derivan de una variedad de fuentes no exclusivas que incluyen el polinucleótido que se va a expresar, genes conocidos o que se sospecha son capaces de expresión en el sistema deseado, vectores de expresión, síntesis química, o de un locus endógeno en una célula hospedera. La expresión en una célula hospedera puede lograrse en una forma transitoria o estable. La expresión transitoria puede ocurrir a partir de construcciones introducidas que contienen señales de expresión funcionales en la célula hospedera, pero cuyas construcciones no se replican y rara vez se integran en la célula hospedera, o en donde la célula hospedera no esté proliferando. Puede lograrse también expresión transitoria, induciendo la actividad de un promotor regulable enlazado operablemente al gen de interés, aunque dichos sistemas inducibles exhiben con frecuencia un nivel de expresión basal reducido. Puede lograrse expresión estable introduciendo una construcción que pueda integrarse en el genoma del hospedero, o que se replique en forma autónoma en la célula hospedera. La expresión estable del gen de interés puede seleccionarse a través del uso de un marcador seleccionable localizado en la construcción de expresión o transfectado con la misma, seguido de selección para células que expresan el marcador. Cuando la expresión estable resulta de integración, la integración de construcciones puede ocurrir aleatoriamente dentro del genoma del hospedero, o puede dirigirse a través del uso de construcciones que contienen regiones de homología con el genoma del hospedero suficientes para dirigir la recombinación con el locus del hospedero. En donde las construcciones son dirigidas hacia un locus endógeno, todas las regiones reguladoras de la transcripción y traducción, o algunas de las mismas, pueden ser provistas por el locus endógeno. Cuando se desee expresión incrementada del polipéptido de desaturasa en el organismo de origen, pueden usarse varios métodos. Genes adicionales que codifiquen para el polipéptido de desaturasa pueden introducirse en el organismo hospedero. La expresión del locus de desaturasa nativo puede incrementarse también a través de recombinación homologa, por ejemplo, insertando un promotor más fuerte en el genoma del hospedero que cause expresión incrementada, removiendo secuencias de desestabilización del ARN mensajero o la proteína codificada, eliminando esa información del genoma del hospedero, o añadiendo secuencias de estabilización al ARN mensajero (véase patente de E.U.A. No. 4,910,141). Se contempla que más de un polinucleótido que codifica para una desaturasa o un polinucleótido que codifica para más de una desaturasa, puede introducirse y propagarse en una célula hospedera mediante el uso de vectores de expresión episómicos o integrados. En donde dos o más genes se expresan a partir de vectores de replicación separados, es deseable que cada vector tenga un diferente medio de replicación. Cada construcción introducida, ya sea integrada o no, debe tener medios de selección diferentes, y debe carecer de homología con las otras construcciones para mantener una expresión estable y prevenir el reordenamiento de los elementos entre las construcciones. Elecciones juiciosas de regiones reguladoras, medios de selección y métodos de propagación de la construcción introducida pueden determinarse experimentalmente, de modo que todos los polinucleótidos introducidos sean expresados a los niveles necesarios para proveer la síntesis de los productos deseados. Cuando sean necesarias para la transformación, las secuencias codificantes de ?ß-desaturasa de la presente invención pueden insertarse en un vector de transformación en plantas, por ejemplo, el vector binario descrito por Bevan (1984). Pueden derivarse vectores de transformación en plantas modificando el sistema natural de transferencia de genes de Agrobacteríum tumefaciens. El sistema natural comprende grandes plásmidos Ti (inductores de tumores) que contienen un gran segmento, conocido como ADN T, que es transferido a plantas transformadas. Otro segmento del plásmido Ti, la región vir, es responsable de la transferencia del ADN T. La región de ADN T es bordeada por repeticiones terminales. En los vectores binarios modificados, los genes inductores de tumores han sido eliminados, y las funciones de la región vir se usan para transferir ADN extraño bordeado por secuencias de borde de ADN T. La región T contiene también un marcador seleccionare para resistencia a antibióticos, y un sitio de clonación múltiple para inserción de secuencias para transferencia. Dichas cepas diseñadas se conocen como cepas de A. tumefaciens "desarmadas", y permiten la transformación eficiente de secuencias bordeadas por la región T en los genomas nucleares de plantas. ¦ La presente invención encuentra muchas aplicaciones. Las sondas basadas en los polinucleótidos de la presente invención pueden encontrar uso en métodos para aislar moléculas relacionadas, o en métodos para detectar organismos que expresan desaturasas. Cuando se usan como sondas, los polinucleótidos u oligonucleótidos deben ser detectables. Esto se logra usualmente uniendo una marca en un sitio interno, por ejemplo, mediante incorporación de un residuo modificado, o en el extremo 5' o 3'. Dichas marcas pueden ser directamente detectables, pueden unirse a una molécula secundaria que es marcada detectablemente, o pueden unirse a una molécula secundaria no marcada y una molécula terciara marcada detectablemente; este procedimiento puede extenderse, en tanto sea práctico para lograr una señal satisfactoriamente detectable sin niveles inaceptables de señal de fondo. Los sistemas secundarios, terciarios o de unión mediante puentes, pueden incluir el uso de anticuerpos dirigidos contra cualquier otra molécula, incluyendo marcas u otros anticuerpos, o pueden incluir cualquier molécula que se una a alguna otra, por ejemplo, un sistema de biotina-estreptavidina/avidina. Marcas detectables incluyen típicamente isótopos radiactivos, moléculas que se producen químicamente o enzimáticamente o alteran la luz, enzimas que producen productos de reacción detectables, moléculas magnéticas, moléculas fluorescentes, o moléculas cuya fluorescencia o características de emisión de luz cambian tras la unión. Ejemplos de métodos de marcación pueden encontrarse en la patente de E.U.A. No. 5,011 ,770. En forma alternativa, la unión de moléculas objetivo puede detectarse directamente midiendo el cambio en calor de solución en la unión de la sonda al objetivo, mediante calorimetría de titulación isotérmica, o recubriendo la sonda u objetivo sobre una superficie, y detectando el cambio en dispersión de luz de la superficie producida, por unión del objetivo o sonda, respectivamente, como puede hacerse con el sistema BIAcore. Construcciones que comprendan el gen de interés, pueden introducirse en una célula hospedera mediante técnicas estándar. Por conveniencia, una célula hospedera que ha sido manipulada mediante cualquier método para captar una secuencia o construcción de ADN, será referida en la presente como "transformada" o "recombinante". El presente hospedero tendrá por lo menos una copia de la construcción de expresión, y puede tener dos o más, por ejemplo, dependiendo de si el gen es integrado en el genoma, amplificado, o está presente en un elemento extracromosómico que tiene números de copias múltiples. La célula hospedera transformada puede identificarse mediante selección de un marcador contenido en la construcción introducida. En forma alternativa, una construcción de marcación separada puede introducirse con la construcción deseada, ya que muchas técnicas de transformación introducen muchas moléculas de ADN en células hospederas. Típicamente, los hospederos transformados se seleccionan por su capacidad para crecer en medios selectivos. Los medios selectivos pueden incorporar un antibiótico, o pueden carecer de un factor necesario para el crecimiento del hospedero no transformado, tal como un nutriente o factor de crecimiento. Un gen de marcación introducido para el mismo, puede conferir resistencia a antibióticos, o puede codificar para una enzima o factor de crecimiento esencial, y permitir el crecimiento en medios selectivos cuando se expresa en el hospedero transformado. La selección de un hospedero transformado puede ocurrir también cuando la proteína de marcación expresada puede detectarse, ya sea directamente o indirectamente. La proteína de marcación puede expresarse sola o como una fusión con otra proteína. La proteina de marcación puede detectarse mediante su actividad enzimática, por ejemplo, la beta-galactosidasa puede convertir el substrato X-gal a un producto coloreado, y la luciferasa puede convertir la luciferina a un producto emisor de luz. La proteína de marcación puede detectarse por sus características de modificación o producción de luz; por ejemplo, la proteína fluorescente verde de Aequorea victoria, fluoresce cuando se ilumina con luz azul. Pueden usarse anticuerpos para detectar la proteína de marcación o una marca molecular en, por ejemplo, una proteína de interés. Células que expresan la proteína de marcación o marca pueden seleccionarse, por ejemplo, visualmente, o mediante técnicas tales como FACS o toma panorámica usando anticuerpos. Deseablemente, la resistencia a kanamicina y el aminoglucósido G418 es de interés, así como la capacidad para crecer en medios que carecen de uracilo, leucina, lisina o triptófano. De particular interés, es la producción de PUFA's mediada por ?d-desaturasa en células hospederas eucarióticas. Las células eucarióticas incluyen células vegetales, tales como las de plantas de cultivo que producen aceite y otras células sujetas a manipulación genética, incluyendo células de hongos. Las células pueden cultivarse o formarse como un organismo hospedero completo, o parte del mismo, incluyendo una planta. En una modalidad preferida, el hospedero es una célula vegetal que produce y/o puede asimilar substratos suministrados exógenamente para una ?6-desaturasa, y produce de preferencia grandes cantidades de uno o más de los substratos. La célula hospedera transformada se desarrolla bajo condiciones adecuadas adaptadas para un resultado final deseado. Para células hospederas desarrolladas en cultivo, las condiciones se optimizan típicamente para producir el rendimiento más grande o más económico de PUFA's que se relaciona con la actividad de desaturasa seleccionada. Condiciones del medio que pueden optimizarse incluyen: fuente de carbono, fuente de nitrógeno, adición de substrato, concentración final de substrato añadido, forma de substrato añadido, crecimiento aeróbico o anaeróbico, temperatura de crecimiento, agente inductor, temperatura de inducción, fase de crecimiento en la inducción, fase de crecimiento en la cosecha, pH, densidad y mantenimiento de la selección. Otro aspecto de la presente invención provee plantas transgénicas o progenie de plantas que contienen el ADN aislado de la invención. Se contemplan plantas tanto monocotiledóneas como dicotiledóneas. Se transforman células vegetales con un ADN aislado que codifica para ?d-desaturasa mediante cualquier método de transformación de plantas. La célula vegetal transformada, con frecuencia en un cultivo de callos o disco foliar, se regenera en una planta transgénica completa mediante métodos bien conocidos por los expertos en la técnica (véase, por ejemplo, Horsch et al., 1985). En una modalidad, la planta transgénica se selecciona del grupo que consiste de Arabidopsis thaliana, cañóla, soya, colza, girasol, algodón, cacao, cacahuate, cártamo, coco, lino, palma de aceite, Brassica napus de semilla oleaginosa, maíz, jojoba, árbol de sebo chino, tabaco, plantas con fruto, plantas de cítricos, o plantas que producen nueces y bayas. Puesto que la progenie de las plantas transformadas hereda el polinucleótido que codifica para A6-desaturasa, las semillas o estacas de las plantas transformadas pueden usarse para mantener la línea de plantas transgénicas. La presente invención provee además un método para proveer plantas transgénicas con un contenido incrementado de ALA y/o SDA. Este método incluye, por ejemplo, introducir ADN que codifica para ?ß-desaturasa en células vegetales que carecen o que tienen bajos niveles de SDA, pero que contienen ALÁ, y regenerar plantas con contenido incrementado de SDA a partir de las células transgénicas. En ciertas modalidades de la invención, puede introducirse también un ADN que codifique para una ?15- y/o ?12-desaturasa en las células vegetales. Dichas plantas pueden o no comprender también actividad de ?12- y/o A15-desaturasa endógena. En ciertas modalidades, plantas de cultivo modificadas desarrolladas comercialmente se contemplan como el organismo transgénico incluyendo, pero no limitado a, Arabidopsis thaüana, cañóla, soya, colza, girasol, algodón, cacao, cacahuate, cártamo, coco, lino, palma de aceite, Brassica napus de semilla oleaginosa, maíz, jojoba, árbol de sebo chino, tabaco, plantas con fruto, plantas de cítricos, o plantas que producen nueces y bayas. La presente invención provee además un método para proveer plantas transgénicas que pueden contener niveles elevados de ALA y/o SDA, en donde dichos niveles elevados son mayores que los niveles encontrados en plantas no transformadas. Vectores de expresión que comprenden ADN que codifica para una ?d-desaturasa y/o una A12-desaturasa y/o una ?15-desaturasa, pueden construirse mediante métodos de tecnología recombinante conocidos por los expertos en la técnica (véase Sambrook et al., 2001). En particular, se contemplan plantas de cultivo desarrolladas comercialmente como el organismo transgénico incluyendo, pero no limitado a, Arabidopsis thaliana, cañóla, soya, colza, girasol, algodón, cacao, cacahuate, cártamo, coco, lino, palma de aceite, Brassica napus de semilla oleaginosa y maíz. Para complementación dietética, los PUFAs purificados, plantas o partes de plantas transformadas, o derivados de los mismos, pueden incorporarse en aceites de cocina, grasas o margarinas formulados de modo que en uso normal, el sujeto reciba la cantidad deseada. Los PUFAs pueden incorporarse también en fórmulas infantiles, complementos nutricionales u otros productos alimenticios, y pueden encontrar uso como agentes antiinflamatorios o que disminuyen los niveles de colesterol.

Como se usa en la presente, "composición comestible" se define como composiciones que pueden ser ingeridas por un mamífero, tales como productos alimenticios, sustancias nutricionales y composiciones farmacéuticas. Como se usa en la presente, "productos alimenticios" se refieren a sustancias que pueden usarse o prepararse para su uso como alimento para un mamífero, e incluyen sustancias que pueden usarse en la preparación de alimento (tales como aceites para freír) o aditivos de alimentos. Por ejemplo, los productos alimenticios incluyen productos usados para consumo humano, o cualquier producto de los mismos tales como, por ejemplo, huevos. Productos alimenticios típicos incluyen, pero no están limitados a, bebidas (por ejemplo, bebidas suaves, bebidas carbonatadas, bebidas listas para mezclar), alimentos infundidos (por ejemplo, frutos y vegetales), salsas, condimentos, aderezos para ensalada, jugos de fruta, jarabes, postres (por ejemplo, pudines, gelatina, alcorzas y rellenos, conservas horneadas y postres congelados tales como helados y sorbetes), productos congelados blandos (por ejemplo, cremas congeladas blandas, helados congelados blandos y yogurt, remates congelados blandos tales como remates lácteos o remates no lácteos batidos), aceites y productos emulsificados (por ejemplo, manteca, margarina, mayonesa, mantequilla, aceite de cocina y aderezos para ensalada), y alimentos de humedad intermedia (por ejemplo, arroz y alimento para perros). Además, las composiciones comestibles descritas en la presente pueden ingerirse también como un aditivo o complemento contenido en alimentos y bebidas. Estos pueden formularse junto con una sustancia nutricional tal como varias vitaminas y minerales, e incorporados en composiciones sustancialmente líquidas tales como bebidas nutritivas, leches de soya y sopas; composiciones sustancialmente sólidas; y gelatinas, o pueden usarse en forma de un polvo que se incorporará en varios alimentos. El contenido del ingrediente efectivo en dicho alimento funcional o para la salud puede ser similar a la dosis contenida en un agente farmacéutico típico. Los PUFAs purificados, y plantas o partes de plantas transformadas, pueden incorporarse también en forraje para animales, en particular para ganado. De esta forma, los animales mismos pueden beneficiarse de una dieta rica en PUFA, mientras que los consumidores humanos de productos alimenticios producidos a partir de dicho ganado pueden beneficiarse también. Se espera que en ciertas modalidades, el SDA sea convertido a EPA en animales, y de esta manera dichos animales puedan beneficiarse de un incremento en EPA por consumo de SDA. Para uso farmacéutico (humano o veterinario), las composiciones pueden administrarse en general oralmente, pero pueden administrarse mediante cualquier vía por la cual puedan ser absorbidas exitosamente, por ejemplo, parenteralmente (es decir, subcutáneamente, intramuscularmente o intravenosamente), rectalmente, vaginalmente o tópicamente, por ejemplo, como una loción o ungüento para la piel. Los PUFAs de las plantas o partes de plantas transformadas de la presente invención, pueden administrarse solos o en combinación con un vehículo o excipiente farmacéuticamente aceptable. En donde estén disponibles, las cápsulas de gelatina son la forma preferida de administración oral. La complementación dietética como se expuso anteriormente, puede proveer también una vía de administración oral. Los ácidos insaturados de la presente invención pueden administrarse en formas conjugadas, o como sales, ésteres, amidas o profármacos de los ácidos grasos. Cualquier sal farmacéuticamente aceptable es abarcada por la presente invención; especialmente preferidas, son las sales de sodio, potasio o litio. También abarcadas son las sales de N-alqullpolihidroxamina, tales como N-metilglucamina, presente en la publicación del PCT WO 96/33155. Los ésteres preferidos son los ésteres de etilo. Como sales sólidas, los PUFAs pueden administrarse también en forma de tableta. Para administración intravenosa, los PUFAs o derivados de los mismos pueden incorporarse en formulaciones comerciales tales como Intralipid. Si se desea, las regiones de un polipéptido de desaturasa importantes para actividad de desaturasa, pueden determinarse a través de mutagénesis de rutina, seguida de expresión de los polipéptidos mutantes resultantes y determinación de sus actividades. Los mutantes pueden incluir sustituciones, deleciones, inserciones y mutaciones puntuales, o combinaciones de las mismas. Pueden hacerse sustituciones con base en el carácter hidrofílico o hidrofóbico conservado (véase Kyte y Doolittle, 1982), o con base en la capacidad para asumir una estructura secundaria de polipéptido similar (véase Chou y Fasman, 1978). Un análisis funcional típico comienza con mutagénesis por deleción para determinar los límites N- y C- terminales de ia proteína necesarios para función, y entonces se hacen mutaciones puntuales, inserciones o deleciones para determinar adicionalmente regiones necesarias para función. Pueden usarse también otras técnicas tales como mutagénesis de cassette o síntesis total. La mutagénesis por deleción se logra, por ejemplo, usando exonucleasas que remuevan secuencialmente las regiones codificantes 5' o 3'. Están disponibles equipos para dichas técnicas. Después de la deleción, la región codificante concluye ligando oligonucleótidos que contengan codones de inicio o detención a la región codificante eliminada después de deleción 5' o 3', respectivamente. En forma alternativa, se insertan oligonucleótidos que codifican para codones de inicio o detención en la región codificante, mediante una variedad de métodos que incluyen mutagénesis dirigida a sitio, PCR mutagénica o mediante ligación en ADN digerido en sitios de restricción existentes. En forma similar, pueden hacerse deleciones internas a través de una variedad de métodos que incluyen el uso de sitios de restricción existentes en el ADN, mediante el uso de iniciadores mutagénicos mediante mutagénesis dirigida a sitio o PCR mutagénica. Las inserciones se hacen a través de métodos tales como mutagénesis por exploración del enlazador, mutagénesis dirigida a sitio o PCR mutagénica. Las mutaciones puntuales se hacen a través de técnicas tales como mutagénesis dirigida a sitio o PCR mutagénica. Las mutagénesis químicas pueden usarse también para identificar regiones de un polipéptido de desaturasa importante para actividad.

Dicho análisis de función-estructura puede determinar qué regiones pueden eliminarse, qué regiones toleran inserciones, y qué mutaciones puntuales permiten que la proteína muíante funcione en sustancialmente la misma forma que la desaturasa nativa. Dichas proteínas mutantes y secuencias de nucleótidos que codifican para las mismas, están dentro del alcance de la presente invención. Como se describió anteriormente en la presente, ciertas modalidades de la presente invención se refieren a construcciones de transformación en plantas. Por ejemplo, un aspecto de la presente invención es un vector de transformación en plantas que comprende uno o más genes de desaturasa o moléculas de ADNc. Ejemplos de secuencias codificantes para su uso con la invención, incluyen la A6-desaturasa de Prímula juliae (SEQ ID NOs: 2-3). En ciertas modalidades, pueden usarse también secuencias de desaturasa antisentido con la invención. Ejemplos de ácidos nucleicos que codifican para desaturasa, incluyen por lo menos 20, 40, 80, 120, 300 y hasta la longitud completa de las secuencias de ácido nucleico de SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO: 25, SEQ ID NO: 45 o SEQ ID NO: 47. En ciertos aspectos, un ácido nucleico puede codificar para 1, 2, 3, 4 o más enzimas desaturasa. En modalidades particulares, un ácido nucleico puede codificar para una ?6- y una ?15-desaturasa. Los vectores usados para la transformación de plantas pueden incluir, por ejemplo, plásmidos, cósmidos, YACs (cromosomas artificiales de levadura), BACs (cromosomas artificiales de bacterias), o cualquier otro sistema de clonación adecuado, así como fragmentos de ADN de los mismos. De esta manera, cuando se usa el término "vector" o "vector de expresión", se incluyen todos los tipos de vectores anteriores, así como secuencias de ácido nucleico aisladas de los mismos. Se contempla que el uso de sistemas de clonación con grandes capacidades de inserción, permitirá la introducción de grandes secuencias de ADN que comprendan más de un gen seleccionado. De conformidad con la invención, esto podría usarse para introducir varios ácidos nucleicos que codifican para desaturasa. La introducción de dichas secuencias puede facilitarse mediante el uso de cromosomas artificiales de bacterias o levaduras (BACs o YACs, respectivamente), o incluso cromosomas artificiales de plantas. Por ejemplo, el uso de BACs para transformación mediada por Agrobacterium, fue descrito por Hamilton et al. (1996). Particularmente útiles para transformación, son cassettes de expresión que han sido aislados de dichos vectores. Los segmentos de ADN usados para la transformación de células vegetales comprenderán en general, de hecho, el ADNc, el gen o los genes que se desee introducir y se hayan expresado en las células hospederas. Estos segmentos de ADN pueden incluir además estructuras tales como promotores, intensificadores, polienlazadores, o incluso genes reguladores, según se desee. El gen o segmento de ADN elegido para introducción celular, codificará con frecuencia para una proteína que se expresará en las células recombinantes resultantes, resultando en un rasgo seleccionare o tamizable y/o que impartirá un fenotipo mejorado a la planta transgénica resultante. Sin embargo, este puede no ser siempre el caso, y la presente invención abarca también plantas transgénicas que incorporan transgenes no expresados. Componentes preferidos que se incluirán probablemente con vectores usados en la presente invención, son los siguientes: En una modalidad, la presente invención usa ciertos promotores. Ejemplos de dichos promotores que pueden usarse con la presente invención incluyen, pero no están limitados a, los promotores 35S del CaMV (virus del mosaico de la coliflor), 34S del FMV (virus del mosaico de la escrofularia) (véase, por ejemplo, la patente de E.U.A. No. 5,378,619, cuyo contenido se incorpora en su totalidad en la presente como referencia), napina (de Brassica), 7S (de soya), Glob y Lee (del maíz). El promotor de napina y otros promotores que son regulados durante la maduración de las semillas de la planta, son de interés particular para su uso con la presente invención. Dichos promotores y elementos reguladores de la transcripción, individualmente o en combinación, se contemplan para su uso en los presentes vectores de expresión replicables, y son conocidos por los expertos en la técnica. La secuencia de ADN entre el sitio de inicio de la transcripción y el inicio de la secuencia codificante, es decir, la secuencia guía no traducida, puede influir también sobre la expresión génica. Puede desearse de esta manera usar una secuencia guía particular con una construcción de transformación de la invención. Se contemplan secuencias guía preferidas que incluyen aquellas que comprenden secuencias que se predice dirigen la expresión óptima del gen unido, es decir, que incluyen una secuencia guía consenso preferida que puede incrementar o mantener la estabilidad del ARN mensajero, y prevenir el inicio inadecuado de la traducción. La elección de dichas secuencias será conocida por los expertos en la técnica a la luz de la presente descripción. Se preferirán típicamente secuencias que se deriven de genes que son altamente expresados en plantas. Las construcciones de transformación preparadas de conformidad con la invención, incluirán típicamente una secuencia de ADN del extremo 3' que actúe como una señal para terminar la transcripción, y permita la poliadenilación del ARN mensajero producido por secuencias codificantes enlazadas operablemente a un gen de desaturasa (por ejemplo, ADNc). En una modalidad de la invención, se usa el terminador nativo de un gen de desaturasa. En forma alternativa, un extremo 3' heíerólogo puede intensificar la expresión de las regiones codificantes de desaturasa. Ejemplos de terminadores considerados como útiles, incluyen aquellos del gen de nopalina sintasa de Agrobacteríum tumefaciens (extremo nos 3') (Bevan et ai, 1983), el terminador para el transcrito de T7 del gen de octopina sintasa de Agrobacteríum tumefaciens, el extremo 3' de los genes del inhibidor de proteasa I o II de papa o tomate, y el terminador 35S del CaMV (tml3'). En donde se desee, pueden incluirse además elementos reguladores tales como un intrón Adh (Callis, et al., 1987), intrón de sacarosa sintasa (Vasil et al., 1989) o elemento omega del TMV (Galiie eí al., 1989).

Mediante el uso de una proteína de marcación seleccionable o tamizable, es posible proveer o intensificar la capacidad para identificar transformantes. "Genes de marcación", son genes que imparten un fenotipo distinto a células que expresan la proteína de marcación, y permiten de esta manera que dichas células transformadas se diferencien de células que no tienen el marcador. Dichos genes pueden codificar para un marcador seleccionable o tamizable, dependiendo de si el marcador confiere un rasgo que puede "seleccionarse" mediante medios químicos, es decir, mediante el uso de un agente selectivo (por ejemplo, un herbicida, antibiótico, o similares), o si es simplemente un rasgo que puede identificarse a través de observación o la realización de pruebas, es decir, mediante "tamizado" (por ejemplo, la proteína fluorescente verde). De hecho, muchos ejemplos de proteínas de marcación adecuadas se conocen en la técnica, y pueden usarse en la práctica de la invención. Se piensa que métodos adecuados para la transformación de células vegetales u otras células para su uso con la presente invención, incluyen virtualmente cualquier método por el cual puede introducirse ADN en una célula, tal como mediante suministro directo de ADN, tal como mediante transformación de protoplastos mediada por PEG (Omirulleh et a/., 1993), mediante captación de ADN mediada por inhibición/desecación (Potrykus et al., 1985), mediante electroporación (patente de E.U.A. No. 5,384,253, que se incorpora específicamente en su totalidad en la presente como referencia), mediante agitación con fibras de carburo de silicio (Kaeppler eí al., 1990; patente de E.U.A. No. 5,302,523, que se incorpora específicamente en su totalidad en la presente como referencia; y patente de E.U.A. No. 5,464,765, incorporada específicamente en su totalidad en la presente como referencia), mediante transformación mediada por Agrobacterium (patente de E.U.A. No. 5,591 ,616 y patente de E.U.A. No. 5,563,055; ambas incorporadas específicamente en la presente como referencia), y mediante aceleración de partículas recubiertas de ADN (patente de E.U.A. No. 5,550,318; patente de E.U.A. No. 5,538,877; y patente de E.U.A. No. 5,538,880; cada una incorporada específicamente en su totalidad en la presente como referencia), etc. Mediante la aplicación de técnicas tales como estas, las células de virtualmente cualquier especie vegetal pueden transformarse establemente, y estas células pueden desarrollarse en plantas transgénicas. Después de efectuar el suministro de ADN exógeno a células receptoras, los siguientes pasos se refieren en general a la identificación de las células transformadas para cultivo y regeneración de la planta adicional. Para mejorar la capacidad para identificar transformantes, puede desearse usar un gen de marcación seleccionable o tamizable con un vector de transformación preparado de conformidad con la invención. En este caso, en general, se pondría entonces a prueba la población de células potencialmente transformadas exponiendo las células a un agente o agentes selectivos, o se seleccionarían las células para el rasgo deseado del gen de marcación. Las células que sobrevivan a la exposición al agente selectivo, o las células que hayan sido calificadas como positivas en una prueba de selección, pueden cultivarse en medios que sustenten la regeneración de plantas. En un ejemplo de modalidad, pueden modificarse medios MS y N6 incluyendo otras sustancias tales como reguladores del crecimiento. Uno de dichos reguladores del crecimiento es dicamba o 2,4-D. Sin embargo, pueden usarse otros reguladores del crecimiento, incluyendo NAA, NAA + 2,4-D o picloram. Se ha encontrado que la mejora de los medios facilita el crecimiento de células en etapas de desarrollo específicas. El tejido puede mantenerse en un medio básico con reguladores del crecimiento, hasta que exista tejido suficiente para iniciar los esfuerzos de regeneración de la planta, o después de rondas repetidas de selección manual, hasta que la morfología del tejido sea adecuada para regeneración, típicamente por lo menos dos semanas, y transferido entonces a medios que lleven a la maduración de los embrioides. Los cultivos se transfieren cada dos semanas a este medio. El desarrollo de brotes indicará el tiempo de transferencia al medio que carece de reguladores del crecimiento. Para confirmar la presencia del ADN exógeno o "transgenes" en las plantas en regeneración, puede llevarse a cabo una variedad de pruebas. Dichas pruebas incluyen, por ejemplo, pruebas de "biología molecular" tales como Southern y Northern blotting y PCR™, pruebas "bioquímicas", tales como detectar la presencia de un producto de proteína, por ejemplo, mediante medios inmunológicos (ELISAs y Western blots), o mediante función enzimática; pruebas de partes de la planta, tales como pruebas de hoja o raíz; y también, analizando el fenotipo de la planta regenerada completa.

Además de la transformación directa de un genotipo particular de la planta con una construcción preparada de conformidad con la presente invención, pueden obtenerse plantas transgénicas cruzando una planta que tenga un ADN seleccionado de la invención con una segunda planta que carezca del ADN. Pueden usarse también técnicas de fitomejoramiento para introducir desaturasas múltiples, por ejemplo, ?6, ?12 y/o ?15-desaturasas en una sola planta. De esta manera, la A6-desaturasa puede ser efectivamente sobrerregulada. Mediante la creación de plantas homocigóticas para una actividad de A6-desaturasa y/u otra actividad de desaturasa (por ejemplo, actividad de ?12- y/o ??d-desaturasa), pueden incrementarse metabolitos benéficos en la planta. Como se describió anteriormente, puede introducirse un gen de desaturasa seleccionado en una variedad de planta particular mediante cruzamiento, sin la necesidad de transformar directamente una planta de esa variedad determinada. Por lo tanto, la presente invención no sólo abarca una planta transformada o regenerada directamente de células que han sido transformadas de conformidad con la presente invención, sino también la progenie de dichas plantas. Como se usa en la presente, el término "progenie" denota la descendencia de cualquier generación de una planta progenitora preparada de conformidad con la presente invención, en donde la progenie comprende una construcción de ADN seleccionada preparada de conformidad con la invención. El "cruzamiento" de una planta para proveer una línea de plantas que tienen uno o más transgenes o alelos añadidos respecto a una línea de plantas de partida, como se describe en la presente, se define como las técnicas que resultan en una secuencia particular que es introducida en una línea de plantas cruzando una línea de partida con una línea de plantas donadoras que comprenden un transgen o alelo de la invención. Para lograr esto se podrían seguir, por ejemplo, los siguientes pasos: (a) sembrar semillas de la primera (línea de partida) y segunda (línea de plantas donadoras que comprenden un transgen o alelo deseado) plantas progenitoras; (b) desarrollar las semillas de la primera y segunda plantas progenitoras en plantas que poseen flores; (c) polinizar una flor de la primera planta progenitora con polen de la segunda planta progenitora; y (d) cosechar semillas producidas en la planta progenitora que posee la flor fecundada. La retrocruza se define en la presente, como el procedimiento que incluye los pasos de: (a) cruzar una planta de un primer genotipo que contiene un gen, secuencia de ADN o elemento deseado, con una planta de un segundo genotipo que carece de dicho gen, secuencia de ADN o elemento deseado; (b) seleccionar una o más plantas de la progenie que contengan el gen, secuencia de ADN o elemento deseado; (c) cruzar la planta de la progenie con una planta del segundo genotipo; y (d) repetir los pasos (b) y (c) con el propósito de transferir una secuencia de ADN deseada de una planta de un primer genotipo a una planta de un segundo genotipo. La introgresión de un elemento de ADN en el genotipo de una planta, se define como el resultado del proceso de conversión por retrocruza. El genotipo de una planta en el cual una secuencia de ADN ha sido introgresada, puede referirse como un genotipo, línea, endógamo o híbrido convertido por retrocruza. Asimismo, el genotipo de una planta que carezca de la secuencia de ADN deseada, puede referirse como un genotipo, línea, endógamo o híbrido no convertido.

EJEMPLOS Los siguientes ejemplos se incluyen para ilustrar modalidades de la invención. Los expertos en la técnica deben apreciar que las técnicas descritas en los ejemplos siguientes, representan técnicas descubiertas por el inventor que funcionan bien en la práctica de la invención. Sin embargo, los expertos en la técnica deben apreciar, a la luz de la presente descripción, que pueden hacerse muchos cambios en las modalidades específicas que se describen, y lograr aún un resultado idéntico o similar sin apartarse del concepto, espíritu y alcance de la invención. Más específicamente, será evidente que ciertos agentes que están químicamente y fisiológicamente relacionados pueden sustituir a los agentes descritos en la presente, mientras que se obtendrían los mismos resultados o resultados similares. Se considera que dichos sustituyentes y modificaciones similares evidentes para los expertos en la técnica están dentro del espíritu, alcance y concepto de la invención, como se define mediante las reivindicaciones anexas.

EJEMPLO 1 Clonación de secuencias de ?6 desaturasa de Prímula ¡uliae Se logró la clonación de la ?6 desaturasa de Prímula juliae (PjD6D) mediante amplificación por PCR, de una región de ADN genómico interna parcial usando oligonucleótidos degenerados, seguida de desplazamiento genómico bidireccional. Se aisló ADN genómico total de P. juliae (vivero del coleccionista, Battleground WA), usando el miniequipo para plantas DNeasy (Qiagen, Valencia, CA), siguiendo el procedimiento del fabricante. Inicialmente, se aisló un fragmento de 552 pares de bases que correspondía a las posiciones 687 a 1238 de SEQ ID NO: 1 , usando los oligonucleótidos degenerados BO-1 For y BO-2 Rev, como es descrito por García-Maroto et al. (2002). El fragmento fue clonado en pCR® 4-TOPO® (Invitrogen, Carlsbad, CA), para dar el vector pMON83955, y se secuenció la inserción. Las secuencias de iniciador BO-1 For y BO-2 Rev fueron las siguientes: BO-1 For: 5'-AT AGYATYGGTTGGTGGAARTGG-3' (SEQ ID NO: 6) BO-2 Rev: 5'-AATCCACCRTGRAACCARTCCAT-3' (SEQ ID NO: 7) Para determinar la secuencia de flanqueo genómica de la inserción de p ON83955, se usó un equipo Universal Genome Walker™ (BD Biosciences, Palo Alto, CA), siguiendo el procedimiento del fabricante. Se generaron cuatro colecciones genómicas de P. juíiae digiriendo el ADN con cuatro enzimas de restricción: EcoRV, PvulI, Stul y Dral. Después de un paso de purificación, las digestiones fueron ligadas a un adaptador provisto en el equipo. El procedimiento incluyó entonces dos reacciones de PCR, cada una con un iniciador específico de genes y un iniciador-adaptador. La segunda reacción de PCR usó una dilución de los productos de reacción de la primera PCR como molde. Para la dirección 5', se usaron los iniciadores PD6D R8 y PD6D R2 para la primera y segunda reacciones de PCR, respectivamente. Para la dirección 3' se usaron los iniciadores PD6D F8 y PD6D F3 para la primera y segunda reacciones de PCR, respectivamente. Las secuencias de iniciador se dan a continuación: PD6D R8: 5'-CACACATGACCGGATAAAACGACCAGT-3' (SEQ ID NO: 8) PD6D R2: 5'-GGGAATGTACTGGAGGTCAGGGTCGTA-3' (SEQ ID NO: 9) PD6D F8: 5'-CGTGCAGTTCAGCTTGAACCATTTCTC-3' (SEQ ID NO: 10) PD6D F3: 5 -TGCAGGGACACTCAACATATCGTGCCC-3' (SEQ ID NO: 11) El desplazamiento genómico en la dirección 5' dio un fragmento de 574 pares de bases de la colección de EcoRV. Este producto fue clonado en pCR®4-TOPO® (Invitrogen), dando pMON83956, y se secuenció la inserción. La secuencia resultante no contenía un codón de inicio del gen de delta 6 desaturasa putativa, y de esta manera se llevó a cabo otra serie de reacciones de PCR usando iniciadores específicos de genes diseñados para desplazarse en la dirección 5' a partir de la inserción de pMON83956. Los iniciadores usados para la segunda serie de desplazamiento genómico en la dirección 5', fueron PD6D R15 y PD6D R14 para la primera y segunda reacciones de PCR, respectivamente. Las secuencias se dan a continuación: PD6D R15: 5'-GTAGGTTGGTGGAGAAGGGAGGGAGGA-3' (SEQ ID NO: 12) PD6D R14: 5'-GGAAGGGGGATGGTAAGCGAGGAAAGC-3' (SEQ ID NO: 13) Un producto de 328 pares de bases de longitud de la colección de Stul fue clonado en pCR®4-TOPO® (Invitrogen), dando pMON83958, y se secuenció la inserción. Esta inserción contenía 2 codones de inicio potenciales, separados por 44 bases. El primer codón de inicio corresponde a la posición 87, y el segundo a la posición 135 de SEQ ID NO: 1. El desplazamiento genómico en la dirección 3', resultó en un fragmento de 773 pares de bases de la colección de Dral. Este producto fue clonado en pCR®4-TOPO®, dando pMON83957. Se secuenció la inserción, y se encontró que contiene 292 pares de bases de la región codificante para el gen de delta 6 desaturasa putativa, seguida de un codón de detención en la posición 1473 con respecto a SEQ ID NO: 1. Se alinearon las inserciones de pMON83955, pMON83956, pMON83957 y pMON83958 para formar una secuencia mixta, SEQ ID NO: 1.

Se diseñaron tres iniciadores para amplificar por PCR dos longitudes diferentes de la secuencia codificante de ADN genómico de P. juliae, reflejando los dos codones de inicio presentes en pMON83958. La más larga de las dos secuencias, PjD6D-1 , se amplificó usando el iniciador delantero Pj D6D F2 y el iniciador inverso Pj D6D R1. La más corta de las dos, PjD6D-2, se amplificó usando el iniciador delantero Pj D6D F1 y el iniciador inverso Pj D6D R1. Las dos secuencias codificantes de delta 6 desaturasa putativa fueron entonces ligadas cada una en el vector de expresión en levaduras pYES2.1-TOPO. Después de la secuenciación, se diseñó el plásmido que contenía a PjD6D-1 de pMON83950 (SEQ ID NO: 3), y se diseñó el plásmido que contenía a PjD6D-2 de pMON67011 (SEQ ID NO: 2). Las secuencias de iniciador se dan a continuación: Pj D6D F2: 51- GTCGACATGGAAAACACATTTTCACCACCACCT-3' (SEQ ID NO: 14) Pj D6D F1 : 5 - GTCGACATGACTAAGACCATTTACATAACCAGC-3' (SEQ ID NO: 15) Pj D6D R1 : 5'- CCTGCAGGTCACCCGACATTTTTAACAGCCTCCC-3' (SEQ ID NO: 16) Los dos clones de PjA6 desaturasa, PjD6D-2 y PjD6D-1 , codifican para polipéptidos potenciales de 446 aminoácidos y 462 aminoácidos, dados en SEQ ID NO: 4 y SEQ ID NO: 5, respectivamente. El sitio MET inicial de la secuencia peptídica más corta (PjD6D-2) se localiza 16 aminoácidos hacia el extremo 3' del primer sitio MET de la secuencia más larga (PjD6D-1). 3' del segundo MET, las secuencias son idénticas. Estas secuencias tienen alta similitud con otras ?6 desaturasas (figura 1) de plantas, incluyendo un dominio de citocromo b5 N-terminal que se encuentra en todas las desaturasas de extremo delantero (Napier et al., 2003). Dentro del dominio de citocromo b5 se encuentran los ocho residuos invariables característicos de la superfamilia del citocromo b5 y el motivo de unión a hem H-P-G-G, que se ha mostrado es esencial para actividad enzimática (Napier et a!., 1997, Sayanova et al., 1999, Sperling y Heinz 2001). Dentro del dominio de desaturasa de la desaturasa de PjD6D putativa, están tres cajas de histidina conservadas que son características de todas las desaturasas unidas a membrana (Shanklin et al., 1994). Un rasgo distintivo presente en todas las desaturasas de extremo delantero, es que la tercera caja de histidina contiene un residuo de glutamina en la primera posición (Q-x-x-H-H) en lugar de una histidina (Napier et al., 1997, Napier et al., 2003, Sperling y Heinz 2001). La secuencia de aminoácidos deducida de la PjD6D tenía aproximadamente 88% de identidad con las desaturasas de Prímula vialii y P. farinosa, y aproximadamente 64% de identidad con las desaturasas de Echium pitardii y £. gentianoides. La inspección visual de la alineación de secuencias múltiple mostrada en la figura 1 , sugiere que la secuencia de ?6 desaturasa de P. juliae no contiene intrón alguno. Esto se ha observado en ?6 desaturasas de especies de Prímula y Echium (Sayanova eí al., 2003, García-Maroto et al., 2002).

EJEMPLO 2 Transformación y expresión en levaduras Se introdujeron las construcciones pMON83950 (figura 3) y pMON6701 1 (figura 2) en la cepa hospedera INVSd de Saccharomyces cerevisiae (Invitrogen), que es auxotrófica para uracilo, usando el protocolo PEG/Li Ac descrito en el manual de Invitrogen para pYES2.1/V5-His-TOPO. Se seleccionaron transformantes en placas hechas de medio mínimo SC menos uracilo con glucosa a 2%. Se usaron colonias de transformantes para inocular 5 mi de medio mínimo SC menos uracilo y glucosa a 2%, y se desarrollaron durante la noche a 30°C. Para inducción, células de levadura de fase estacionaria fueron transformadas a pellas y resuspendidas en medio mínimo SC menos uracilo complementado con galactosa a 2%, y desarrollado por 3 días a 15°C. Cuando se proveyeron ácidos grasos exógenos a los cultivos, se añadió LA a 0.01 % (?9, 12-18:2) con el emulsificante Tergitol a 0.1 %. Los cultivos se desarrollaron por 3 días a 15°C, y se cosecharon después mediante centrifugación. Las pellas de células se lavaron una vez con regulador de pH de TE estéril, pH 7.5, para remover los medios, y se liofilizaron por 24 horas. La cepa hospedera transformada con el vector que contenía al gen de LacZ, se usó como control negativo en todos los estudios. Se extrajeron lípidos de pellas de levadura liofilizadas añadiendo 0.1 mL de tolueno, e incubando durante la noche a temperatura ambiente. Los lípidos extraídos fueron convertidos a ésteres metílicos de ácido graso (FAMEs) in situ mediante la adición de 0.5 ml_ de metóxido de sodio a 0.6N en metanol, e incubando por 45 minutos. Los FAMEs se extrajeron mediante la adición de 0.8 mL de NaCI a 0% (p/v) y 0.15 mL de heptano. La capa de heptano que contenía FAMEs se removió y se usó directamente para cromatografía de gases (GC). Los FAMEs se identificaron en un 5890 II Plus GC de Hewlett-Packard (Hewlett-Packard, Palo Alto, CA) equipado con un detector de ionización de llama y una columna capilar (omegawax 250; 30 m x 0.25 mm d. i. x 0.25 µG?; Supelco, Bellefonte, PA). Se usó una relación de separación de 100:1 para las inyecciones. El inyector se mantuvo a 250°C, y el detector de ionización de llama se mantuvo a 270°C. La temperatura de la columna se mantuvo a 180°C por 1.5 minutos después de la inyección, se aumentó hasta 240°C a 40°C/minuto, y se mantuvo a 245°C por 3.38 minutos. El cuadro 1 muestra la composición de ácidos grasos para levaduras que expresan los clones de P. juliae pMON67011 (PjD6D-2), pMON83950 (PjD6D-1) o ?6 desaturasa de Mortlerella alpina, pMON77205. Se observaron productos esperados para desaturación ?6 de LA y ALA para ambos clones de P. juliae (cuadro 1 , GLA y SDA, respectivamente), demostrando que los clones contenidos en pMON67011 y pMON83950 son ?6 desaturasas. La selectividad del substrato se determinó proveyendo cantidades iguales de LA y ALA. M. alpina es un hongo filamentoso que acumula altos niveles del ácido graso n-6 ácido araquidónico, y se esperó que tuviera una ?6 desaturasa con una selectividad por n-6. El cuadro 2 muestra las selectividades del substrato de n-3: n-6 de las ?6 desaturasas de P. juliae y M. alpina. Se observó una selectividad de n-3: n-6 de aproximadamente 0.8 para la ?6 desaturasa de M. alpina. Se observó una selectividad de n-3: n-6 de ~1.5-1.9 para ambos clones de ?6 desaturasa de P. juliae.

CUADR0 1 Comparación de la composición de ácidos grasos de levaduras que expresan diferentes ?6 desaturasas Acido graso Vector Gen LA* GLA* ALA* SDA* en el medio pMON6701 1 P. juliae D6D-2 - 2.0 0.0 0.0 0.0 pMON6701 1 P. juliae D6D-2 - 2.5 0.0 0.1 0.0 pMON67011 P. juliae D6D-2 LA 25.7 14.0 0.0 0.0 pMON67011 P. juliae D6D-2 LA 28.4 16.8 0.1 0.0 PMON6701 1 P. juliae D6D-2 ALA 0.3 0.1 24.4 16.8 pMON6701 1 P. juliae D6D-2 ALA 0.3 0.1 30.6 19.0 pMON6701 P. juliae D6D-2 LA+ALA 22.7 6.0 18.0 8.5 ????6701 1 P. ¡uliae D6D-2 LA+ALA 24.3 5.8 20.4 8.9 p ON83950 P. juliae D6D-1 - 2.3 0.0 0.3 0.0 pMON83950 P. juliae D6D-1 - 2.3 0.0 0.2 0.0 pMON83950 P. juliae D6D-1 LA 26.3 15.0 0.0 0.0 pMON83950 P. juliae D6D-1 LA 23.5 16.6 0.0 0.0 pMON83950 P. juliae D6D-1 ALA 0.6 0.2 37.3 17.5 PMON83950 P. juliae D6D-1 ALA 0.7 0.1 33.9 17.4 pMON83950 P. juliae D6D-1 LA+ALA 18.8 4.3 17.1 9.4 PMON83950 P. juliae D6D-1 LA+ALA 16.9 4.8 15.7 9.8 PMON77205 M. alpina D6D - 1.7 0.0 0.2 0.0 pMON77205 M. alpina D6D - 1.0 0.0 0.0 0.0 PMON77205 M. alpina D6D LA 56.8 6.0 0.0 0.0 pMON77205 M. alpina D6D LA 25.4 4.6 0.2 0.0 pMON77205 M. alpina D6D ALA 0.5 0.0 69.2 2.6 pMON77205 M. alpina D6D ALA 0.9 0.0 23.0 5.0 ? ??77205 M. alpina D6D LA+ALA 34.8 1.3 39.7 1.1 PMON77205 M. alpina D6D LA+ALA 18.7 2.8 18.4 2.2 **Reportado como un % del total para todos los analitos incluidos en el cromatograma de GC-FID incluyendo, pero no mostrados, 16:0, 16:1 , 18:0, 20:0, 20:1 , 20:2, 22:0, 22:1 , 22:2.

CUADRO 2 Comparación de selectividades del substrato de n-3: n-6 para ?6 desatu rasas de P. iuliae y M. alpina % de % de Acido graso Relación Vector Gen conversión conversión en el medio n-3: n-6** a GLA a SDA pMON67011 P. juliae D6D-2 LA+ALA 21.0 32.1 1.53 pMON6701 P. juliae D6D-2 LA+ALA 19.2 30.3 1.58 PMON83950 P. juliae D6D-1 LA+ALA 18.7 35.4 1.89 PMON83950 P. juliae D60-1 LA+ALA 22.2 38.4 1.73 pMON77205 M. alpina D6D LA+ALA 3.6 2.8 0.78 PMON77205 M. alpina D60 LA+ALA 12.8 10.5 0.82 *EI porcentaje de conversión a GLA se calculó dividiendo el valor para GLA (cuadro 1) entre la suma de los valores para LA y GLA (cuadro 1). Se hizo el mismo cálculo para SDA usando la suma de ALA y SDA (cuadro 1). **La relación de n-3: n-6 se calculó dividiendo el % de conversión a SDA entre el % de conversión a GLA.

EJEMPLO 3 Transformación y expresión de la ?6 desaturasa de Prímula iuliae Se evaluó la actividad de la A6-desaturasa de P. juliae en soya, combinándola con una A15-desaturasa de Neurospora crassa (NcD15D), pMON77245 (figura 4) o Aspergillus nidulans (AnD15D), pMON77247 (figura 5). Se construyó el vector pMON77245 en tres pasos. Primero, se colocó la ?d-desaturasa de P. juliae (PjD6D-2) detrás del promotor 7S alfa' específico de la semilla, digiriendo pMON6701 1 con Sse8387 I, seguido de la remoción de las salientes 3', y Sal I, y ligando entonces el fragmento resultante en el sitio EcoRI y sitios Xhol ocupados del vector de expresión pMON68527, generando el vector pMON77243. Después, el cassette de expresión de PjD6D-2 se removió de pMON77243 mediante digestión con Notl, seguida de una reacción de reemplazo, y entonces el fragmento resultante fue ligado en el sitio EcoRV del vector binario de 21 pMON77244. Por último, una NcD15D optimizada en codones (SEQ ID NO: 17) bajo el control de un promotor específico de la semilla 7S alfa, se combinó con la PjD6D-2 digiriendo pMON77227 con Notl, y ligando entonces el fragmento del cassette de expresión de NcD15D resultante en p ON77344 digerido con Notl, para dar pMON77245 (figura 4). Se construyó el vector p ON77247 (figura 5) digiriendo el vector p ON77242 con Not I, y ligando el fragmento del cassette de expresión resultante que comprendía una AnD15D optimizada en codones (SEQ ID NO: 18) enlazada al promotor 7S alfa en el sitio Notl de p ON77244. Los vectores pMON77245 y pMON77247 fueron transformados en soya usando el método de Martinell et al. (patente de E.U.A. No. 6,384,301 , cuya descripción se incorpora en su totalidad en la presente como referencia). La expresión de la secuencia codificante de PjD6D-2 se midió determinando la composición de ácidos grasos de semillas de soya transgénicas R1 inmaduras (aproximadamente 30 días después de la floración), incluyendo tanto homocigotos como heterocigotos, mediante cromatografía de gases de derivados de éster metílico de lípidos (véase la solicitud del PCT US03/16144, presentada en mayo 21 de 2003, cuya descripción completa se incorpora específicamente en la presente como referencia). Los niveles de PA (ácido palmítico, 16:0), SA (ácido esteárico, 18:0), OA, LA, GLA, ALA y SDA se expresan como un porcentaje del peso total de ácidos grasos medidos, y se muestran en los cuadros 3 y 4 siguientes. La línea control no transgénica fue A3525. Cada vez que era posible, se analizaron cinco semillas individuales de cada evento. Se encontró que la semilla individual de una mayoría de los eventos transgénicos de pMON77245 acumulaba cantidades mensurables de SDA. En todos los casos, los niveles de SDA fueron mayores que los de GLA, con una relación de SDA: GLA promedio para cada evento variando de 2:1 a un valor alto de 8:1. El valor más alto para la semilla individual se observó en el evento GM_A38083, que contenía SDA a 32.0% y GLA a 2.6%, con una relación de SDA: GLA de 12:1. De los 12 eventos mostrados a continuación, 9 tuvieron valores de SDA mayores de 10% en por lo menos una semilla de cinco. Puesto que los valores de SDA aumentaron, los niveles de PA, SA y OA no variaron significativamente de los niveles control; sin embargo, existe una fuerte correlación negativa para LA. En las semillas que acumularon SDA, los niveles de GLA continuaron siendo bajos, entre 2.3 a 5.5%. Los niveles de ALA aumentaron junto con los niveles de SDA.

CUADRO 3 Resultados del por ciento de área relativa (por ciento en peso aproximado) de semillas R1 individuales transformadas con P ON77245 PMON77245 Acido graso (% en peso) Pedigree PA SA OA LA GLA ALA SDA A3525 1 1.47 5.21 16.5 56.75 0 9.15 0 A3525 1.56 4.53 18.54 54.9 0 9.51 0 A3525 11.8 5.42 16.66 56.04 0 9.14 0 A3525 1 1.41 4.91 17.64 56 0 9.08 0 A3525 11.56 4.36 17.86 56.55 0 8.77 0 GM_A38005 12.57 4.19 18.45 53.99 0 10.8 0 GM_A38005 13.73 4.77 19.32 52.42 0 9.76 0 GM_A38005 14.81 4.74 19.09 36.84 5.23 10.3 8.98 G _A38005 13.4 4.71 18.34 53.26 0 10.29 0 GM_A38005 13.21 4.38 19.97 52.19 0 10.25 0 GM_A38005 13.08 4.78 17.99 53.56 0. 10.59 • 0 GM_A38013 12.91 4.45 19.72 40.8 4.57 9.56 7.99 GM_A38013 12.45 4.38 18.9 55.04 0 9.23 0 GM_A38013 13.04 4.68 17.38 40.36 4.66 10.27 9.61 GM_A38013 13.26 4.34 17.14 40.03 4.6 10.17 10.46 G _A38013 11.67 4.26 22.5 44.26 3.3 8.95 5.05 GM_A38021 12.95 4.33 19.39 53.48 0 9.85 0 GM_A38021 13.07 4.87 18.12 54.1 0 9.84 0 GM_A38021 13.14 4.27 22.76 34.62 2.3 13.7 9.2 GM_A38021 12.98 4.08 21.58 39.6 1.6 13.7 6.45 GM_A38021 13.21 4.34 17.24 29.03 1.78 19.07 15.31 GM_A38043 13.1 4.26 19.58 52.44 0 10.62 0 GM_A38043 13.09 4.3 20.01 52.83 0 9.77 0 GM_A38043 14.01 4.35 22.05 29.98 4.39 12.18 13.05 GM_A38043 13.32 4.26 19.41 51.85 0 11.16 0 GM_A38043 12.8 4.34 19.81 53 0 10.05 0 GM_A38048 13.44 5.5 18.01 44.46 2.28 10.7 5.61 GM_A38048 13.43 4.8 18.57 44.25 2.34 10.93 5.68 GM_A38048 13.14 4.47 18.88 44.97 2.33 10.78 5.44 GM_A38048 12.98 4.89 17.79 44.92 2.43 11.23 5.76 CUADRO 3 (CONTINUACION) GM_A38048 13.3 4.56 17.95 35.88 3.41 13.15 11.75 GM_A38060 12.73 4.94 17.37 43.16 4.01 I0.4 7.39 GM_A38060 12.85 5.19 15.27 35.1 5.32 1 1.88 14.39 GM_A38060 12.73 4.99 16.41 43.44 3.95 10.25 8.23 GM A38060 13.06 5.34 16.06 42.75 4.04 10.32 8.43 GM_A38060 12.85 5.25 16.45 42.68 4.01 10.39 8.36 GM_A38064 13.32 5 18.8 42 3.86 10.16 6.87 GM_A38064 13.07 4.72 18.97 42.1 3.59 9.95 7.6 GM_A38064 13.45 4.84 19.7 41.67 3.8 9.92 6.62 GM_A38064 12.66 4.61 19.09 43.21 3.52 9.85 7.05 GM_A38064 13.03 4.73 19.58 36.38 4.94 11.28 10.06 GM_A38069 12.9 4.71 21.24 41.12 2.64 1 .43 5.97 GM_A38069 12.74 4.76 20.35 51.21 0 10.94 0 GM_A38069 12.93 4.77 20.5 51.27 0 10.53 0 GM_A38069 13.18 4.69 18.85 38.76 3.3 12.34 8.87 GM_A38069 13.08 4.79 19.16 52.08 0 10.89 0 GM_A38083 13.33 5.28 21.73 27.31 2.48 15.28 13.35 GM_A38083 12.8 4.96 16.85 11.52 2.64 18.11 32.02 GM_A38083 12.32 5.07 22.23 13.59 2.52 17.46 25.56 GM_A38083 13.22 4.26 20.83 15.89 3.81 14.69 26.12 GM_A38083 13.74 4.61 17.03 20.93 4.84 13.82 23.91 GM_A38084 12.9 4.04 22.66 41.63 3.37 9.07 5.28 GM_A38084 13.38 3.94 28.07 25.81 4.9 11.37 1.42 GM_A38084 13.92 3.75 31.36 32.26 2.89 9.23 5.51 GM_A38084 14.42 4.12 27.17 33.26 3.28 11.57 5.77 GM_A38084 12:74 3.95 22.59 40.82 3.3 9.68 5.91 GM_A38089 13.05 4.48 22.37 42.63 2.55 9.3 4.59 GM_A38089 13.15 4.63 18.82 53.48 0 9.03 0 GM_A38089 12.67 4.41 20.59 51.87 0 9.42 0.07 GM_A38089 12.64 4.29 2056 52.58 0 8.96 0 GM_A38089 12.72 4.57 21.81 50.79 0 9.16 0 GM_A38094 12.62 4.57 18.97 52.96 0 9.9 0.1 1 GM_A38094 13.3 5.08 17.08 34.49 5.35 11.39 12.35 GM_A38094 13.08 4.52 18.38 38.95 5.41 9.88 8.82 GM_A38094 13.41 5 17.27 38.5 5.49 10.26 9.1 GM_A38094 12.58 4.46 20.06 40.28 4.88 9.5 7.25 La semilla individual de los eventos transgénicos de pMON77247 acumuló cantidades similares de SDA en comparación con pMON77245, salvo el evento GM_A38083, que acumuló niveles significativamente mayores de SDA. Los niveles de PA, SA, OA y LA fueron similares a los niveles control mostrados en el cuadro 3. En general, los niveles de SDA fueron mayores que los de GLA, con una relación de SDA: GLA promedio para cada evento variando de 1:1 a 1.6:1, que fue menor que la observada para pMON77245.

CUADRO 4 Resultados de! por ciento de área relativa (por ciento en peso aproximado) de semillas R1 de pMON77247 individuales p ON77247 Acido g raso (% en peso) Pedigree PA SA OA LA GLA ALA SDA GM_A38909 12.18 4.19 20.66 44.94 3.52 8.65 4.87 GM_A38909 12.25 3.84 22.37 44.89 2.95 8.22 4.46 GM_A38909 12.06 4.67 22.95 43.37 3.31 8.32 4.86 GM_A38909 12.64 4.63 17.61 45.99 3.66 9.01 5.44 GM_A38909 12.28 4.2 19.42 46.1 3.1 9.01 4.82 GM_A38941 13.95 4.87 18.03 40.2 7.08 7.87 6.92 GM_A38941 13.76 4.38 19.72 33.62 8.94 8.57 9.95 GM_A38941 13.15 4.91 17.89 52.06 0.75 9.52 0.8 GM_A38941 12.73 4.27 22.23 42.14 4.98 7.44 5.15 GM_A38941 12.73 4.34 19.37 52.34 0.36 9.53 0.37 GM_A38946 13.02 4.68 17.4 44.66 4.54 8.83. 5.89 GM_A38946 13.17 4.42 17.35 43.71 5.01 8.91 6.49 GM_A38946 13.63 4.24 18.96 38.16 6.36 8.89 8.75 GM_A38946 13.32 4.6 17.76 43.37 4.8 8.94 6.2 GM_A38946 13.32 4.5 18.07 43.24 4.71 8.95 6.23 GM_A38977 13.43 5.18 21.3 40.54 4.43 8.51 5.62 CUADRO 4 (CONTINUACION) EJEMPLO 4 Actividad de la A6-desaturasa de Prímula ¡uliae en combinación con la A15-desaturasa de Neurospora crassa en cañóla Se evaluó la actividad de la A6-desaturasa de Prímula ¡uliae en combinación con la A15-desaturasa de Neurospora crassa, transformando cañóla con el pMON82822 (figura 7). pMON82822 contenía una NcD15D nativa (SEO. ID NO: 19), así como PjD6D-2, ambas insertadas en un cassette de expresión específico de la semilla bajo el control del promotor de napina (véase el documento del PCT US03/ 6144, cuya descripción se incorpora específicamente en la presente como referencia). Se construyó el vector pMON82822 digiriendo primero pMON77214 (véase el documento del PCT US03/16144) con Pmel y BamHI (ocupados), y ligando el cassette de napina de la NcD15D nativa resultante en el sitio EcoRV del vector binario de 2T pMON71801 , para generar p ON82820. Después, pMON82819 fue digerido con Notl, los extremos fueron ocupados, y el cassette de expresión de napina de la PjD6D-2 resultante fue ligado en el sitio Asci ocupado de pMON82820, para generar pMON82822. Se construyó también un segundo vector, pMON82821 , que contenía la NcD15D optimizada en codones (SEO. ID NO: 17) y la PjD6D-2 de pMON82821 , digiriendo primero pMON67011 con Salí y Sse 8387I, y ligando el fragmento de PjD6D-2 resultante en los sitios Salí y Xhol (ocupados) del cassette de expresión de napina en pMON82800, dando pMON82819. El cassette de napina que contenía una NcD15D optimizada en codones se construyó digiriendo pMON67024 con Pmel y BamHI (ocupados), y ligando el fragmento resultante en un vector binario de 2T digerido con EcoRV, pMON71801 , dando pMON82801. Por último, p ON82819 fue digerido con Notl, ocupado, y el cassette de expresión de napina de PjD6D-2 resultante fue ligado en el sitio Notl ocupado de pMON82801 , dando pMON82821. Se transformó a pMON82822 en cañóla (Brassica napus), usando una modificación del protocolo descrito por Radke et al. (Plant Cell Reports 11: 499-505, 1992). En resumen, se desinfectó semilla de cañóla del cultivar 'Ebony' (Monsanto Canadá, Inc., Winnipeg, Canadá), y se hizo germinar in vitro como se describe en Radke et al., 1992. El precocultivo con placas alimentadoras de tabaco, la preparación de explantes y la inoculación de los explantes con la cepa ABI de Agrobacterium tumefaciens (Koncz y Schell, Mol Gen Genet 204: 383-396 (1986)) que contenía al vector deseado, fueron como se describe con el Agrobacterium siendo mantenido en medio de LB (sólido o líquido) que contenía 75 mg/l de espectinomicina, 25 mg/l de cloranfenicol y 50 mg/l de kanamicina. Para la transformación de plantas que incluye inducción de callos, regeneración de brotes, maduración y enraizamiento, se usó selección por glifosato más que selección por kanamicina como se describe en Radke et al., 1992. Específicamente, se complementó el medio de inducción de callos B5-1 con 500 mg/l de carbenicilina y 50 mg/l de timentina (Duchefa Bioc emie BV), para inhibir el crecimiento de Agrobacterium, y se omitió la kanamicina del medio. El medio de regeneración de brotes B5BZ contenía, además, 500 mg/l de carbenicilina, 50 mg/l de timentina y 45 mg/l de glifosato, siendo transferidos dos explantes a medio fresco cada dos semanas. Se transfirieron brotes seleccionados por glifosato a medio de maduración de brotes B5-0 libre de hormonas que contenía 300 mg/l de carbenicilina y 45 mg/l de glifosato por dos semanas, y finalmente se transfirieron los brotes a medio de inducción de raíces B5 que contenía 45 mg/l de glifosato. Se transplantaron plántulas verdes enraizados a suelo para maceta, y se aclimataron a condiciones de invernadero. Las plantas se mantuvieron en un invernadero bajo condiciones estándar. Se determinó la composición de ácidos grasos de la semilla madura mediante análisis de GC de lípidos derivados de éster metílico como se hizo anteriormente para transformantes de soya. El análisis de GC de semilla de cañóla de plantas transformadas con pMON82822, dio 199 eventos con niveles de SDA variando de 0.12 a 4.49% (% en peso, grupo de 100 semillas).

EJEMPLO 5 Construcción y transformación de vectores de expresión de PjD6D para soya, maíz y cañóla La expresión de las secuencias de PjD6D sola se evalúa in planta para cañóla, maíz y soya bajo la expresión de un promotor específico de la semilla. Se construye un vector de expresión de soya digiriendo a pMON77243 con Not I, y ligando el fragmento resultante que contenía a PjD6D-2 en el sitio Not I del vector binario pMON17227: Se construye un vector de expresión de cañóla digiriendo a pMON83950 con Salí y Sse8387l (para que tenga extremos rasurados), y ligando el fragmento resultante que contenía la región codificante de PjD6D-1 en los sitios Salí y Xhol (ocupados) del vector del cassette de expresión de napina específico de la semilla, pMON82800. El plásmido resultante es digerido entonces con Not I, ligando después el cassette de expresión de napina-PjD6D-1 resultante en el sitio Not I del vector binario pMON17227. Se construye un vector de expresión de maíz digiriendo a p ON83950 con Sal I (ocupado) y Sse8387l (para que tenga extremos rasurados), y ligando el fragmento de PjD6D-1 resultante en el sitio Sfil (para que tenga extremos rasurados) del cassette de expresión de globulina en pMON7 084. El vector resultante es digerido entonces con Pmel y Hindlll, y el cassette de expresión es ligado entonces en los sitios Hpal y HindIII del vector binario pMON30167. Se evalúa la actividad de la A6-desaturasa de P. juliae en el maíz en combinación con una A15-desaturasa de Neurospora crassa optimizada en codones para maíz (NcD15Dnno) (SEQ ID NO: 20). El vector pMON67011 es digerido con Salí y Sse8387l (para que tenga extremos rasurados), y el fragmento de PjD6D-2 resultante es ligado en el sitio Sfil (ocupado) del cassette de expresión de globulina en pMON71084, para dar pMON82823. Después, pMON82806 (véase documento del PCT US03/16144) es digerido con Pmel y HindIII, y el cassette de NcD15Dnno de globulina resultante es ligado en los sitios Notl y HindIII (ocupados) del vector binario de 1T pMON30167, para dar pMON82824. Por último, el cassette de PjD6D-2 de globulina se combina con NcD15Dnno de globulina, digiriendo pMON82823 con Pmel y HindIII, y ligando el fragmento resultante en los sitios Smal y HindIII de pMON82824, dando pMON82825. El vector resultante se introduce en el maíz mediante transformación mediada por Agrobacterium tumefaciens, como es sabido por los expertos en la técnica (véase, por ejemplo, la patente de E.UA No. 6,603,061).

EJEMPLO 6 Clonación de secuencias de ?6 desaturasa de Prímula waltonü y Prímula alpícola Se logró la clonación de los genes de ?6 desaturasa de Prímula waltonü (PwD6D) y de ?6 desaturasa de P. alpícola (PaD6D), mediante amplificación por PCR de una región de ADN genómico interna parcial usando oligonucleótidos degenerados, seguida de desplazamiento genómico bidireccional. Se aisló ADN genómico total de P. waltonü y P. alpícola (vivero del coleccionista) usando el miniequipo para plantas DNeasy (Qiagen), siguiendo el procedimiento del fabricante. Se aislaron dos fragmentos del ADN genómico de P. alpícola usando los oligonucleótidos degenerados BO-1 For y BO-2 Rev, como es descrito por García-Maroto et al. 2002: BO-1 For: 5'ATMAGYATYGGTTGGTGGAARTGG-3' (SEQ ID NO: 6) BO-2 Rev: 5'-AATCCACCRTGRAACCARTCCAT-3' (SEQ ID NO: 7) El primer fragmento de P. alpícola tenía 550 pares de bases de longitud, y correspondía a las posiciones 553 a 1103 de SEQ ID NO: 21. Este fragmento fue clonado en pCR®4-TOPO® (Invitrogen), para dar el vector p ON83977 (sin intrón). El segundo fragmento de P. alpícola tenía 550 pares de bases de longitud, y correspondía a las posiciones 763 a 1313 de SEQ ID NO: 23. Este fragmento fue clonado en pCR®4-TOPO® (Invitrogen), para dar el vector pMON83975 (con intrón). Se obtuvo un fragmento de P. waltonii que tenía 550 pares de bases de longitud, y correspondía a las posiciones 763 a 1313 de SEQ ID NO: 25. Este fragmento fue clonado en pCR®4-TOPO® (Invitrogen), para dar el vector pMON83976. Las secuencias polipeptídicas codificadas por SEQ ID NOs: 21 , 23 y 25, se dan en SEQ ID NOs: 22, 24 y 26, respectivamente. Para determinar las secuencias de flanqueo genómicas de las inserciones de pMON83975, pMON83976 y pMON83977, se usó un equipo Universal Genome Walker™ (BD Biosciences), siguiendo el procedimiento del fabricante. Se generaron cuatro colecciones genómicas para cada especie de Prímula, digiriendo el ADN con cuatro enzimas de restricción: EcoRV, Pvull, Stul y Dral. Después de un paso de purificación, las digestiones fueron ligadas a un adaptador provisto en el equipo. El procedimiento incluyó entonces dos reacciones de PCR, cada una con un iniciador específico de genes, y un adaptador-iniciador. La segunda reacción de PCR usó una dilución de los productos de reacción de PCR primarios como molde.

A. DMON83975 (PaD6D-2 Para la dirección 5', se usaron los iniciadores PD6D R7 y PD6D R1 para la primera y segunda reacciones de PCR, respectivamente. Para la dirección 3', se usaron los iniciadores PD6D F7 y PD6D F1 para la primera y segunda reacciones de PCR, respectivamente. Las secuencias de iniciador se dan a continuación: PD6D R7: 5 -CAC ACATG AC C GG ATAAAAC GTC C AGT-3 ' (SEQ ID NO: 27) PD6D R1 : 5'-AGGGATATACTGGAGGTCGGGGTCGTA-3' (SEQ ID NO: 28) PD6D F7: 5'-GAGCTATTCCGTTACGGGGATACAACA-3' (SEQ ID NO: 29) PD6D F1 : 5'-TGCAGGGACACTTAACATATCGTGCCC-3' (SEQ ID NO: 30) El desplazamiento genómico en la dirección 5', dio un fragmento de 751 pares de bases de la colección de EcoRV. Este producto fue clonado en pCR®4-TOPO® (Invitrogen), dando pMON83978, y se secuenció la inserción. La secuencia resultante no contenía un codón de inicio del gen de delta 6 desaturasa putativa, y de esta manera se llevó a cabo otra serie de reacciones de PCR usando iniciadores específicos de genes diseñados para desplazarse en la dirección 5' de la inserción de pMON83978. Los iniciadores usados para la segunda serie de desplazamiento genómico en la dirección 5', fueron PD6D R17 y PD6D R16 para la primera y segunda reacciones de PCR, respectivamente. Las secuencias se dan a continuación: PD6D R17: 5'-GTGAAAGTTGTTGAGGAGGGATCGGTA-3' (SEQ ID NO: 31) PD6D R16: 5 -GTGGAAGGAGGATGGTAAGCGAGGAAA-3' (SEQ ID NO: 32) Un producto de 473 pares de bases de longitud de la colección de Pvull fue clonado en pCR®4-TOPO®, dando pMON83980, y se secuenció la inserción. Esta inserción contenía un codón de inicio que correspondía a la posición 1 de SEQ ID NO: 23. El desplazamiento genómico en la dirección 3', resultó en un fragmento de 942 pares de bases de la colección de Dral. Este producto fue clonado en pCR®4-TOPO®, dando pMON83979. Se secuenció la inserción, y se encontró que contenía 294 pares de bases de la región codificante para el gen de delta 6 desaturasa putativa, seguido de un codón de detención en la posición 1549 con respecto a SEQ ID NO: 23. Se alinearon las inserciones de pMON83975, p ON83978, pMON83980 y pMON83979 para formar una secuencia mixta de un gen de A6 desaturasa putativa para P. alpicola, dando PaD6D-2, SEQ ID NO: 23. Se diseñaron dos iniciadores para amplificar por PCR el marco de lectura abierto completo a partir de ADN genómico de P. alpicola. Las secuencias de iniciador se dan a continuación: Pa D6D F1 : 5'- GTCGACATGGCTAACAAATCTCAAACAGGTTAC-3' (SEQ ID NO: 33) Pa D6D R1 : 5'- CCTGCAGGTCACCCGAGAGTTTTAACAGCCTCC-3' (SEQ ID NO: 34) El fragmento amplificado por PCR (SEQ ID NO: 23) fue ligado entonces en el vector de expresión de levadura pYES2.1-TOPO, dando el vector pMON83968.

B. PMON83976 (PwD6D) Se amplificó por PCR una ?6 desaturasa putativa a partir de ADN genómico de P. waltonii, usando los iniciadores Pa D6D F1 (SEQ ID NO: 33) y Pa D6D R1 (SEQ ID NO: 34) mostrados anteriormente. El fragmento amplificado por PCR (SEQ ID NO: 25) fue ligado entonces en el vector de expresión de levadura pYES2.1 -TOPO, dando el vector pMON83967.

C. PMON83977 (PaD6D-1) Para la dirección 5', se usaron los iniciadores PD6D R9 y PD6D R4 para la primera y segunda reacciones de PCR, respectivamente. Para la dirección 3', se usaron los iniciadores PD6D F9 y PD6D F4 para la primera y segunda reacciones de PCR, respectivamente. La secuencia de iniciador se da a continuación: PD6D R9: 5'-CACACATTACCGGATAAAACGTCCAGT-3" (SEQ ID NO: 35) PD6D R4: 5'-AGGAATATACTGGAGGTCTGGGTCGTA-3' (SEQ ID NO: 36) PD6D F9: 5'-ATTTTTCTTCGGACGTATACATGGGCC-3' (SEQ ID NO: 37) PD6D F4: 5'-TTCGGGGACACTGAACATATCGTGCCC-3' (SEQ ID NO: 38) El desplazamiento genómico en la dirección 5', dio un fragmento de 979 pares de bases de la colección de Stul. Este producto fue clonado en pCR®4-T0P0® (Invitrogen), dando pMON83981 , y se secuenció la inserción. La secuencia resultante contenía el codón de inicio de la delta 6 desaturasa putativa en la posición 1 con respecto a SEQ ID NO: 21. El desplazamiento genómico en la dirección 3', resultó en un fragmento de 1028 pares de bases de la colección de Dral. Este producto fue clonado en pCR®4-TOPO® (Invitrogen), dando pMON83982. Se secuenció la inserción, y se encontró que contenía 295 pares de bases de la región codificante para el gen de delta 6 desaturasa putativa, seguida de un codón de detención en la posición 1339 con respecto a SEQ ID NO: 21. Se alinearon las inserciones de pMON83977, pMON83981 y pMON83982 para formar una secuencia mixta de un segundo gen de ?6 desaturasa putativa para P. alpicola dando PaD6D-1 , SEQ ID NO: 21. Se diseñaron dos iniciadores para amplificar por PCR el marco de lectura abierto completo a partir de ADN genómico de P. alpicola. Las secuencias de iniciador se dan a continuación: Pf D6D-F2: 5'- GTCGACATGGCCAACACTAGTTACATTTCCAGCT-3' (SEQ ID NO: 39) Pf D6D-R2: 5'-GATATCACCCCAGAGTGTTAACAGCTTCCCAG-3' (SEQ ID NO: 40) El fragmento amplificado por PCR fue ligado entonces en el vector de expresión de levadura pYES2.1-TOPO, dando el vector pMON67026 (SEQ ID NO: 21). La alineación de PaD6D-2 y PwD6D (abreviada también como PRIwaD6D) con otros genes de ?6 desaturasa de plantas caracterizados, reveló que estos dos genes contenían un intrón singular que correspondía a las posiciones 476 a 676 en SEQ ID NO: 23 y las posiciones 476 a 651 en SEQ ID NO: 25. Esto se ha observado en ?6 desaturasas de especies de Prímula y Echium (Sayanova et al., 2003, García-Maroto et al., 2002). Los tres clones de ?6 desaturasa codifican para polipéptidos potenciales de 446 aminoácidos para PaD6D-1 (SEQ ID NO: 22), 449 aminoácidos para PaD6D-2 (SEQ ID NO: 24) y 449 aminoácidos para PwD6D (SEQ ID NO: 26). Estas secuencias tienen alta similitud con otras ?6 desaturasa de plantas (figura 1), incluyendo un dominio de citocromo b5 N-terminal, que se encuentra en todas las desaturasas de extremo delantero (Napier et al., 2003). Dentro del dominio de citocromo bs se encuentran los ocho residuos invariables característicos de la superfamilia del citocromo bs y el motivo de unión a hem H-P-G-G, que ha mostrado es esencial para actividad enzimática (Napier ef al., 1997, Sayanova et al, 1999, Sperling y Heinz 2001). Dentro del dominio de desaturasa de las desaturasas de PaD6D-1 , PaD6D-2 y PwD6D, están tres cajas de histidina conservadas que son características de todas las desaturasas unidas a membrana (Shanklin et al., 1994). Un rasgo distintivo presente en todas las desaturasas de extremo delantero, es que la tercera caja de histidina contiene un residuo de glutamina en la primera posición (Q-x-x-H-H) en lugar de una histidina (Napier et al., 1997, Napier et al., 2003, Sperling y Heinz 2001). La secuencia de aminoácidos deducida de PaD6D-1 tenía aproximadamente 80% de identidad con PaD6D-2, y aproximadamente 80% de identidad con PwD6D. Sin embargo, los dos genes que contienen intrones, PaD6D-2 y PwD6D, se asemejan más entre sí con aproximadamente 97% de identidad, que los dos genes de P. alpicola, PaD6D-1 y PaD6D, entre sí.

EJEMPLO 7 Clonación de secuencias adicionales de ?6 desaturasa de Prímula Se aisló ADN genómico de P. farinosa y P. florindae, usando un sistema de lisis Sarkosyl/CTAB. Se molieron cinco gramos de tejido de cada especie en un mortero y mano de mortero con nitrógeno líquido hasta molerlos en un polvo fino. El tejido pulverizado se resuspendió entonces en regulador de pH de lisis (sorbitol a 140 mM, Tris-HCI a 220 mM, pH 8.0, ácido etilendiaminotetraacético (EDTA) a 22 mM, cloruro de sodio (NaCI) a 800 mM, N-laurilsarcosina a 1% y bromuro de hexadeciltrimetilamonio (CTAB) a 0.8%), y se incubó por 1 hora a 65°C con inversión suave cada 10 minutos. Después de incubación, se añadieron 10 mi de cloroformo a la suspensión de lisis, y se incubaron a temperatura ambiente con vuelco suave por 20 minutos. La suspensión de lisis se centrifugó por 10 minutos a 12,000 X g. La capa acuosa se transfirió a un tubo limpio, y el ácido nucleico se precipitó con ¡sopropanol a 0.6%. La pella de ácido nucleico se resuspendió en 4 mi de una solución que contenía Tris-HCI a 10 mM, pH 8.0, EDTA a 1 mM, NaCI a 1 M y 20 mg de proteinasa K. El ácido nucleico resuspendido se incubó entonces por 2 horas a 63°C. La proíeinasa K se inactivo entonces con calor por incubación a 75°C por 20 minutos. Se añadió ribonucleasa (2.5 µg) a la solución, y se incubó a 37°C por 1 hora. La solución se extrajo 2 veces con un volumen igual de fenol:cloroformo:alcohol ¡soamílico (25:24:1). El ADN genómico purificado se precipitó entonces con etanol. Se digirieron aproximadamente 3 µg de ADN genómico en reacciones separadas con las endonucleasas de restricción EcoRI, Hindlll, Kpnl, Salí y Xhol. Después de digestión, cada reacción se purificó usando un equipo de purificación por PCR QIAquick® (Qiagen, Valencia, CA), siguiendo el protocolo del fabricante. El ADN genómico digerido fue eluido de las columnas de purificación usando 100 µ? de regulador de pH de elución provisto en el equipo. Se llevaron a cabo interacciones intramoleculares que favorecieran la ligación, en un volumen de 200 µ? usando 20 µ? del ADN genómico digerido eluido en una reacción de ligación libre de PEG con 800 unidades de ligasa (M0202L) (New England Biolabs, Beverly A) durante la noche a 16°C, seguida de inactivación por calor a 75°C por 10 minutos. Después de ligación, la reacción se purificó de nuevo usando un equipo de purificación por PCR QIAquick®. Se llevó a cabo PCR inversa usando 6 a 20 ng de ADN ligado purificado, y de 10 a 20 pg de iniciador y el sistema de PCR Expand Long Témplate (Roche Applied Science, Indianápolis, IN). Los iniciadores se muestran en el cuadro 5, y se diseñaron usando una combinación de datos de secuencia disponibles, y datos que cubren el dominio de desaturasa. Las condiciones cíclicas térmicas consistieron de una incubación inicial a 94°C por 2 minutos; 10 ciclos de 94°C por 20 segundos; 52°C por 30 segundos y 68°C por 8 minutos; seguida de 25 ciclos de 94°C por 30 segundos, 52°C por 30 segundos y 68°C por 8 minutos, más 10 segundos por ciclo. Después de que concluyó la ciclización, se llevó a cabo otra incubación a 68°C por 7 minutos. Los productos de la colección de PCR inversa visibles después de electroforesis en agarosa, fueron clonados en pCR®2.1-TOPO o pCR®4Biunt-TOPO (Invitrogen), siguiendo el protocolo del fabricante. Los siguientes fragmentos de la colección inversa (con tamaño aproximado), fueron clonados: EcoRI de P. farinosa (6 kb) y Hindi de P. floríndae (3 kb). La secuenciación de ADN se llevó a cabo en un analizador de ADN 3730x1 de Applied Biosystems, usando el terminador v3.0 Big Dye®.

CUADRO 5 Iniciadores y fragmentos usados en la determinación por PCR inversa, de las regiones 5' y 3' de los genes de delta 6 desaturasa Especie Iniciador Secuencia SEQ ID NO: P. farinosa Pf1107F1 TGGAGGTCTGGGTCGTAATC 41 PÍ1107R1 CTTCGGACGTATACATGGGC 42 P. floríndae PÍ1113-1F2 TCGTAATCCAGGCTATTGCA 43 Pf1113-1R2 TTTTCTTCGGACGTCCATGT 44 Se alinearon secuencias putativas con datos públicos, para determinar la región aproximada del marco de lectura abierto (ORF) cubierto para cada gen. Se diseñaron iniciadores para amplificar el marco de lectura abierto de cada gen, con base en los datos de PCR inversa alineados. Se usaron polimerasas de lectura de pruebas para amplificar los genes de delta 6 putativa, para garantizar la fidelidad del producto final. Los iniciadores usados en la clonación final de los genes de delta 6 desaturasa putativa, se muestran en el cuadro 6. Los productos fueron clonados en pUC19 o pCR®4-TOPO® (Invitrogen). Se llevó a cabo secuenciación de ADN en un analizador de ADN 3730x1 de Applied Biosystems, usando el terminador v3.0 Big Dye®. Dos genes de delta 6 desaturasa putativa fueron clonados: P. farinosa (PfaD6D) (pMON84809) (SEQ ID NO: 45) y P. floríndae (PflD6D) (pMON84810) (SEQ ID NO: 47).

CUADRO 6 Iniciadores usados para amplificar genes de delta 6 desaturasa SEQ ID Secuencia NO: P. farinosa 754F G GAACCGGAATTTTTTTTTTGGAAGGTTGGAAGGAAGGTTTTAAAATTTGAGTCAATAATA 49 P. farinosa CGACATCATAGACAATCATCAAGACACCGT 2447R P. florindae ATACCCCCTCAAAACACCCCCAAAT startF P florindae CTCAATATCACCCGAGAGTTTTAACAGCCT stopR Se diseñaron dos iniciadores para amplificar el marco de lectura abierto de PfaD6D completo a partir de pMONS4809. El fragmento resultante fue ligado en el vector de expresión de levadura pYES2.1-TOPO, dando pMON67065. Los dos iniciadores se dan a continuación: Pfar F1 : 5'- GTCGACAACAATGTCCAACACATATCCACCAAATC-3' (SEQ ID NO: 53) Pfar R1 : 5'-CCTGCAGGTCACCCCAGAGTGTTAACAGCTTC-3' (SEQ ID NO: 54) Se diseñaron dos iniciadores para amplificar el gen de PflD6D completo que contenía dos exones y un intrón de pMON84810. El fragmento resultante fue ligado en el vector pYES2.1-TOPO, dando pMON67067. Los dos iniciadores se dan a continuación: Pw F1 : 5'-GTCGACATGGCTAACAAATCTCAAAC-3' (SEQ ID NO: 55) Pw R2: 5'-CCTGCAGGTCACCCGAGAGT-3' (SEQ ID NO: 56) Los dos clones de ?6 desaturasa codifican para polipéptidos potenciales de 454 aminoácidos para PfaD6D (SEQ ID NO: 46) y 449 aminoácidos para PflD6D (SEQ ID NO: 48). Estas secuencias tienen alta similitud con otras ?6 desaturasas de plantas (figura 1), incluyendo un dominio de citocromo bs N-terminal, que se encuentra en todas las desaturasas de extremo delantero (Napier et al., 2003). Dentro del dominio de citocromo b5 se encuentran los ocho residuos invariables característicos de la superfamilia del citocromo b5 y el motivo de unión a hem H-P-G-G, que se ha mostrado es esencial para actividad enzimática (Napier et al., 1997, Sayanova et al., 1999, Sperling y Heinz 2001). Dentro del dominio de desaturasa de las desaturasas de PflD6D y PfaD6D putativas, están tres cajas de histidina conservadas que son características de todas las desaturasas unidas a membrana (Shanklin et al., 1994). Un rasgo distintivo presente en todas las desaturasas de extremo delantero, es que la tercera caja de histidina contiene un residuo de glutamina en la primera posición (Q-x-x-H-H) en lugar de una histidina (Napier et a/., 1997, Napier er a/., 2003, Sperling y Heinz 2001).

EJEMPLO 8 Remoción de intrones La alineación de los tres clones de Prímula PaD6D-2 (SEQ ID NO: 22), PwD6D (SEQ ID NO: 25) y PAD6D (SEQ ID NO: 47), reveló similitud extensiva entre !as secuencias de ADN. PaD6D-2 tenía aproximadamente 97% de identidad con PwD6D, y aproximadamente 98% de identidad con PflD6D. PwD6D tenía aproximadamente 98% de identidad con PflD6D. Se usó un procedimiento de PCR de 2 pasos para remover la región del intrón de cada gen. En resumen, el procedimiento entraña la amplificación de los dos exones en pruebas de PCR separadas, seguida de una segunda ronda de amplificación por PCR para combinar conjuntamente los dos exones. La misma serie de iniciadores se usó para cada amplificación génica debido a la similitud extensiva entre los tres genes de ?6 desaturasa. Se diseñaron dos series de iniciadores para amplificar el exón 1 de la inserción de PwD6D en pMON83967. El tamaño del producto amplificado era de 475 pares de bases, y correspondía al exón 1 de PwD6D. Los dos iniciadores se dan a continuación: Pw F1 : 5 -GTCGACATGGCTAACAAATCTCAAAC-3' (SEQ ID NO: 55) Pw R1 : 5 - GTAATGCCCAGAGTCGTGACCTATCCATCCGCACTGGATCC-3' (SEQ ID NO: 57) El exón 2 se amplificó por PCR a partir de pMON83967, usando las secuencias de iniciador mostradas a continuación. El tamaño del producto amplificado fue de 875 pares de bases. Pw F2: 5'-GATCCAGTGCGGATGGATAGGTCACGACTCTGGGCATTACCG-3' (SEQ ID NO: 58) Pw R2: 5'-CCTGCAGGTCACCCGAGAGT-3' (SEQ ID NO: 56) Los productos del exón 1 y el exón 2 amplificados, se combinaron entonces con los iniciadores Pw F1 y Pw R2 para amplificar por PCR el marco de lectura abierto completo salvo el intrón original. El fragmento resultante de 1350 pares de bases fue ligado en el vector de expresión de levadura pYES2.1-TOPO, dando pMON67062. Se llevó a cabo la remoción de la región del intrón de PaD6D-2 en pMON83968 y PflD6D en pMON84810, usando el mismo procedimiento descrito anteriormente para PwD6D. El tamaño de los exones fue igual al de PwD6D. Los fragmentos del exón combinados de 1350 pares de bases resultantes, fueron ligados en el vector de expresión de levadura pYES2.1- TOPO, dando pMON67063 para PaD6D-2 y p ON67064 para PAD6D.

EJEMPLO 9 Transformación y expresión en levaduras Se introdujeron las construcciones pMON83950 (figura 3), pMON67011 (figura 2), pMON67026, pMON67062, pMON67064 y pMON67065 en la cepa INVSd de Saccharomyces cerevisiae auxotrófica para uracilo (Invitrogen), usando el equipo de transformación EasyComp para S. cerevisiae (Invitrogen). Se seleccionaron transformantes en placas hechas de medio mínimo SC menos uracilo con glucosa a 2%. Se usaron colonias de transformantes para inocular 5 mi de medio mínimo SC menos uracilo y glucosa a 2%, y se desarrollaron durante la noche a 30°C. Para inducción, células de levadura de fase estacionaria fueron transformadas a pellas, y se resuspendieron en medio mínimo SC menos uracilo complementado con galactosa a 2%, y se desarrollaron por 1 día a 25°C seguido de 3 días a 5°C. Cuando se proveyeron ácidos grasos exógenos a los cultivos, se añadieron LA a 0.01 % (v/v) (?9, 12-18:2) y ALA a 0.01% (?9, 12, 15-18:3) con el emulsificante Tergitol a 0.1% (p/v). Los cultivos se desarrollaron por 1 día a 25°C, seguido de 3 días a 15°C, y se cosecharon después mediante centrifugación. Las pellas de células se lavaron una vez con regulador de pH de TE estéril, pH 7.5, para remover el medio, y se liofilizaron por 24 horas. La cepa hospedera transformada con el vector que contenía al gen de LacZ, se usó como control negativo en todos los estudios. Se prepararon FAMEs a partir de pellas de levadura liofilizadas mediante transmetilación con 0.5 ml_ de H2SO4 a 5% (v/v) en metanol que contenía 0.075 mg/mL de 2,6-di-ter-butil-4-metoxifenol por 90 minutos a 90°C. Los FAMEs se extrajeron mediante la adición de 0.9 mL de NaCI a 10% (p/v) y 0.3 mL de heptano. La capa de heptano que contenía FAMEs se removió, y se usó directamente para GC como se describe en el ejemplo 2. Los resultados mostrados en el cuadro 7 demuestran que los clones pMON67011 y pMON83950 de P. juliae, clones pMON67026 y pMON67063 de P. alpicola, clon pMON67062 de P. waltonii, clon pMON67064 de P. floríndae y clon pMON67065 de P. farinosa, exhiben actividad de ?6 desaturasa en un sistema de expresión en levaduras. Los datos del cuadro 8 demuestran que cada clon de Prímula codifica para una proteína con selectividad por ácidos grasos de substrato de n-3 o n-6.

CUADRO 7 Actividad de ?6 desaturasa de clones de Prímula en un sistema de expresión en levaduras Acido graso Vector Gen LA* GLA* ALA* SDA* en el medio LacZ-1 LacZ - 0.0 0.0 0.0 0.0 LacZ-2 LacZ - 0.0 0.0 0.0 0.0 LacZ-3 LacZ - 0.0 0.0 0.0 0.0 LacZ-1 LacZ LA + ALA 23.5 0.0 20.6 0.0 LacZ-2 LacZ LA + ALA 20.3 0.0 16.6 0.0 LacZ-3 LacZ LA + ALA 29.1 0.0 28.0 0.0 pMON67011 P. juliae D6D-2 - 0.0 0.0 0.0 0.0 pMON67011 P. juliae D6D-2 - 0.0 0.0 0.0 0.0 p ON67011 P. juliae D6D-2 - 0.2 0.0 0.0 0.0 pMON67011 P. juliae D6D-2 LA + ALA 18.7 6.5 12.2 8.4. pMON67011 P. juliae D6D-2 LA + ALA 14.7 5.4 9.6 7.6 pMON67011 P. juliae D6D-2 LA + ALA 18.6 5.1 14.6 8.8 - 0.0 0.0 0.0 0.0 pMON67026 P. alplcola D6D-1 pMON67026 P. alpicola D6D-1 - 0.0 0.0 0.0 0.0 pMON67026 P. alpicola D6D-1 - 0.0 0.0 0.0 0.0 ? ??67026 P. alpicola D6D-1 LA + ALA 23.0 3.6 21.8 1.5 pMON67026 P. alpicola D6D-1 LA + ALA 19.1 3.7 17.9 1.5 pMON67026 P. alpicola D6D-1 LA + ALA 22.6 3.1 24.1 1.5 pMON83950 P. juliae D6D-1 - 0.0 0.0 0.0 0.0 pMON83950 P. ;¿v//ae D6D-1 - 0.0 0.0 0.0 0.0 pMON83950 P. juliae D6D-1 - 0.0 0.0 0.0 0.0 pMON83950 P. juliae D6D-1 LA + ALA 21.2 4.0 14.9 6.7 p ON83950 P. y'i///ae D6D-1 LA + ALA 13.9 4.2 8.8 6.0 pMON83950 P. y'u//ae D6D-1 LA + ALA 21.7 4.3 16.8 8.3 pMON67062 P. wa/for?// D6D - 0.0 0.0 0.0 0.0 pMON67062 P. waltonii D6D - 0.0 0.0. 0.0 0.0 CUADRO 7 (CONTINUACION) pMON67062 P. waltonii D6D - 0.0 0.0 0.0 0.0 pMON67062 P. waltonii D6D LA + ALA 17.5 5.7 12.1 7.1 PMON67062 P. waltonii D6D LA + ALA 12.8 4.8 8.6 6.0 pMON67062 P. waltonii D6D LA + ALA 20.9 5.2 16.8 8.4 p ON67063 P. alpicola D6D-2 - 0.0 0.0 0.0 0.0 PMON67063 P. alpicola D6D-2 - 0.0 0.0 0.0 0.0 pMON67063 P. alpicola D6D-2 - 0.0 0.0 0.0 0.0 pMON67063 P. alpicola D6D-2 LA + ALA 19.9 3.7 13.4 6.7 pMON67063 P. alpicola D6D-2 LA + ALA 16.0 3.6 9.5 5.6 p ON67063 P. alpicola D6D-2 LA + ALA 19.8 3.6 14.9 7.8 pMON67064 P. florindae D6D - 0.0 0.0 0.0 0.0 pMON67064 P. florindae D6D - 0.0 0.0 0.0 0.0 pMON67064 P. florindae D6D - 0.0 0.0 0.0 0.0 pMON67064 P. florindae D6D LA + ALA 17.4 5.6 12.0 6.9 p ON67064 P. florindae D6D LA + ALA 12.8 4.8 8.3 5.9 p ON67064 P. florindae D6D LA + ALA 17.1 4.5 14.6 8.3 pMON67065 P. farinosa D6D - 0.0 0.0 0.0 0.0 pMON67065 P. farinosa D6D - 0.0 0.0 0.0 0.0 pMON67065 P. farinosa D6D - 0.0 0.0 0.0 0.0 pMON67065 P. farinosa D6D LA + ALA 22.1 0.9 19.7 0.3 pMON67065 P. farinosa D6D LA + ALA 28.8 0.8 27.5 0.2 pMON67065 P. farinosa D6D LA + ALA 21.1 0.8 22.7 0.3 *Reportado como un % del total para todos los analitos incluidos en el cromatograma de GC-FID, incluyendo 16:0, 16:1, 18:0, 20:0, 20:1, 20:2, 22:0, 22:1 y 22:2.

CUADRO 8 Comparación de las selectividades del substrato de n-3: n-6 para ?6 desaturasas de Prímula % de % de Relación Muestra Vector Gen conversión conversión n-3: n-6** a GLA* a SDA* 1 LacZ-1 LacZ 0.00 0.00 0.00 2 LacZ-2 LacZ 0.00 0.00 0.00 3 LacZ-3 LacZ 0.00 0.00 0.00 4 pMON67011 P. juliae D6D-2 25.75 40.64 1.58 5 pMON6701 1 P. ;'i7//ae D6D-2 26.98 44.07 1.63 6 PMON67011 P. y ae D6D-2 21.64 37.78 1.75 7 PMON67026 P. alpicola D6D-1 13.60 6.39 0.47 8 pMON67026 P. alpicola D6D-1 16.06 7.83 0.49 9 PMON67026 P. alpicola D6D-1 12.12 5.83 0.48 10 PMON83950 P juliae D6D-1 15.82 31.14 1.97 11 P ON83950 P. ;'u/ ae D6D-1 23.23 40.72 1.75 12 PMON83950 P .y't //ae D6D-1 16.58 32.92 1.99 13 PMON67062 P. waltonii D6D 24.46 36.80 1.50 14 PMON67062 P. waltonii D6D 27.05 41.15 1.52 15 pMON67062 P. waltonii D6D 19.77 33.41 1.69 16 PMON67063 P. alpicola D6D-2 15.74 33.48 2.13 17 PMON67063 P. alpicola D6D-2 18.53 36.82 1.99 18 PMON67063 P. alpicola D6D-2 15.37 34.39 2.24 19 PMON67064 P. florindae D6D 24.34 36.72 1.51 20 PMON67064 P. florindae D6D 27.29 41.56 1.52 21 pMON67064 P. florindae D6D 20.96 36.13 1.72 22 pMON67065 P. farinosa D6D 4.07 1.25 0.31 23 ????67065 P. farinosa D6D 2.77 0.79 0.29 24 ????67065 P. farinosa D6D 3.70 1.09 0.29 *EI porcentaje de conversión a GLA se calculó dividiendo el valor para GLA (cuadro 1 ) entre la suma de los valores para LA y GLA (cuadro 1). Se hizo el mismo cálculo para SDA usando la suma de ALA y SDA (cuadro 1 ).

**La relación de n-3: n-6 se calculó dividiendo el % de conversión a SDA entre el % de conversión a GLA.

EJEMPLO 10 Clonación, transformación y expresión en Arabidopsis Después de confirmar la actividad de las ?6 desaturasas de Prímula en levaduras, los genes fueron clonados entonces en pMON73273 (un vector binario que contiene al promotor constitutivo 35S del CaMV) para expresión en Arabidopsis thaliana, para determinar la actividad in planta. PwD6D y PaD6D-2 fueron clonados con intrones intactos. Los siguientes vectores fueron transformados en Arabidopsis: pMON83961 (MaD6D) (figura 8), pMON83962 (PaD6D-1) (figura 9), pMON83963 (PaD6D-2) (figura 10), p ON84964 (PjD6D-2) (figura 11), pMON84965 (PaD6D-1) (figura 12) y pMON83966 (PwD6D) (figura 13). Se desarrollaron plantas de Arabidopsis sembrando semillas en macetas de 10.16 cm que contenían agua de osmosis inversa (ROW) saturada MetroMix 200 (The Scotts Company, Columbus, OH). Las plantas fueron vernalizadas colocando las macetas en un semillero de cajón cubierto, en una cámara de crecimiento a 4-7°C, 8 horas de luz/día por 4 a 7 días. Los semilleros de cajón se transfirieron a una cámara de crecimiento a 22°C, 55% de humedad relativa y 16 horas de luz/día, a una intensidad promedio de 160-200 µ???e?ß???/e/??2. Se elevó la cubierta, y se deslizó hacia atrás 2.54 cm después de la germinación, y entonces se removió cuando se habían formado hojas verdaderas. Las plantas fueron aprovisionadas de agua hasta el fondo, según fuese necesario, con ROW hasta 2 a 3 semanas después de la germinación. Las plantas fueron entonces aprovisionadas de agua hasta el fondo, según fuese necesario, con solución de Plantex 15-15-18 (Plantex Corporation Ottawa, Canadá) a 50 ppm de N2. Las macetas fueron entresacadas, de modo que quedara una planta por maceta a 2 a 3 semanas después de la germinación. Una vez que las plantas comenzaron a brotar de repente, la inflorescencia primaria fue recortada para favorecer el crecimiento de yemas axilares. Se obtuvieron plantas de Arabidopsis thaliana transgénicas como es descrito por Bent er a/., Science 265: 1856-1860, 1994, o Bechtold et al., C. R. Acad. Sci. Life Sciences, 316: 1194-1199, 1993. Cultivos de la cepa ABI de Agrobacterium tumefaciens que contenían uno de los vectores de transformación pMON69804, pMON69812 o pMON69815 se desarrollaron durante la noche en medio de LB (bactotriptona a 10%, extracto de levadura a 5% y NaCI a 10% con kanamicina (75 mg/L), cloranfenicol (25 mg/L) y espectinomicina (100 mg/L)). El cultivo bacteriano se centrifugó y se resuspendió en solución de sacarosa a 5% + Silwett-77 a .05%. Las porciones aéreas de plantas Columbia de Arabidopsis thaliana enteras (de aproximadamente 5 a 7 semanas) se sumergieron en la solución resultante por 2 a 3 segundos. Se removió el exceso de solución transfiriendo las plantas sobre toallas de papel. Las plantas sumergidas se colocaron sobre su lado en un semillero de cajón cubierto, y se transfirieron a una cámara de crecimiento a 19°C. Después de 16 a 24 horas se removió el domo, y se puso a las plantas en posición vertical. Cuando las plantas habían llegado a la madurez, se contuvo el agua por 2 a 7 días antes de la cosecha de la semilla. La semilla cosechada se hizo pasar a través de un tamiz malla de acero inoxidable (40 agujeros/2.54 cm), para remover los residuos. Las semillas cosechadas descritas anteriormente se sembraron en semilleros de cajón que contenían ROW saturada MetroMix 200 (The Scotts Company). Las plantas fueron vernalizadas y se hicieron germinar como se describió anteriormente. Después de que las hojas verdaderas habían emergido, las plántulas se rociaron con Roundup para seleccionar para plantas transformadas. La composición de ácidos grasos de la semilla madura (R2) se determinó mediante análisis por GC de lípidos derivados de éster metílico como se hizo anteriormente para la semilla de soya. Los valores para la semilla agrupada de cada evento transgénico se muestran en el cuadro 9. Las selectividades del substrato de n-3 o n-6 que se observaron en las pruebas en levaduras, se confirmaron in planta.

CUADRO 9 Análisis de ácidos grasos de semilla de Arabidopsís Gen Peolgree Construcción PA SA OA LA GLA ALA SDA MaD6D Ai S5 435:® 7.47 3.73 14,1 S 26.31 2,3 . 1 .3 0.72 ¾ltsD6D Át S5443ó:@. jpMDNS39dl 7,44 3J1 14.72 25.51 1.72 18,57 0,44 ÍMEIDÓD [?G854437:@ jpMÜNS39<S! 7.65 3.72 14,51 28.49 0.37 17.97 0 MaDSD i S5443&@ |>MÓN8390l 7.65 3.53 13.55 25.4S 2,09 19.18 0.S7 | MoD6D At S54 39;@ fcMGNS306l 7.7 3.51 13.6 S 27.SI 1.63 17.07 0,45 ¡ MaD6D At S54440:<f¾ pMON83961 7.38 3.55 14.42 25.95 í 1.6 18,26 0.53 ! MaD6D M S54441:® ¿MON83961 7.24 ? G 13.53 24,24 4.4 17.68 1.52 ; MauD6D _ Al S5 42:@ MON83963 7.29 3.6 14.7 2531 3.5S 16.45 0.98 ,' MaD6'D AJ 554 3:1% f MÓNgS i 7,01 3,61 G?446" 27.25 0.44 1S.49 0 At S5 444i@ ¾> ON83¾?l 7.68 3.75 14,34 27J9 1.19 17,95 0.05 PjDSD-í 7.5 334 13,52 25,05 2.05 13.81 5.93 ppm-i Ai S54447:® ?>?????839???· 7.2.9 3Ü5 14.03 26,18 1.64 14 5.25 L4t S5 44fc@ faMGNS39ú2 7.2 3.QS 1337 27'.24 0.49 17 2.72 !¾J63 r AiJ54449:@ bMOM83962: 7.24 3.17 14,26 27,52 0.46 16.65 2.44 PjD6JL l At S54450:@ ? ??83962· 7.24 3.ÍS I3.3S 2 .3 1.32 15.16 4.92 PJD6D-1 At .S5445f:@ MDNS39dZ 7.53 14.49 28.01 1.3 13.03 4.79 íjDtí!}-! At _S54452:@ pMONS3962 7.59 3.44 i 13.16 25.54 1,72 133 6.69 VjD6D-l Al_S54453:@ p ONS3962 7,22 3,21 14.05 26,72 1.14 I 14.35 4.4S Pp6D-l AL 554454;(¾ pMONS3962 6.98 3.23 i 13.4S 25,12 2.27 1 12.62 6.55 ¾D6D-I At 55¾_ pMQNS3962Í7,34: 3J.S 1 14.63 27.07 0.16 | 18.57 1.1 PjD6tM, At.S54456;© pMONS3962¡7,26 3.44 j 15.» 27. «3 0.5 ! 15.81 2,45 |J'ÍD€D-1 Ai_S5 457:@ P QNB3S62 7.41 : 3Í1 1 14.03 27.39 ?.92 | 12.9 4.95 j¾BSD-I At S544S8:@ ? ??83?¾2| 13. 316 1 Í3 S 26.1 S 131 j .14.54 5.1 S¾D€D-1 At SS4459:® PMON8396217.23 3.16 ) 13,25 26.38 132 1 15.07 4.46 í CUADRO 9 fCONTINUACiON) Gen Pedigree onstrucciór PA SA OA LA G LA ALA SDA PjDóD-l At S5445Ü:<¾ | MQNS3 62 7.21 3,19 13.45 26.35 132 1436 5.16 Pj*D6D At S54461:® |p OKI§3562 7.18 3.34 13,5 26.64 0.79 15.65 3.96 PJD6D-1 At S544<52:<¾ pMONS39 2 7.11 3J 5 13.88 27.28 1.12 15.02 3.84 PjDGD-i ¾t. .354463:® pMQTKÍ839S2 7.4 3.19 1337 26.35 0.61 L7.5S 2.93 PJDGD-1 At S54464:® MCm $¿ 7.57 3.34 13.72 26.12 Í.24 15.26 4.69 PaD6D-2 Át S54466:<® bMCM¾3 3 17.25 3.18 14.44 26.54 1.46 14.44 " 4 5 1 PaD61 ?. Al S54467:® jpMON83963 7.28 3.07 14.66 27.S2 031 17.25 1.59 PaD6I>-2 !At S5446S:@ MON83963 7.34 3.22 15.05 26.37 2.01 13.14 4.S6 PaD6D-2 At SS4469:@ bMONS3963 6.91 2.94 Í4.35 26.77 1.32 14.33 438 PaD6D-2 At S54470:@ bMONí>39S3 736 3.26 ¡ 1331 27.8 1.35 1339 4.52 PaD6D-2 At S54471:® bMON83963 7.14 3.07 14.38 25,73 3,26 1132 6.18 PaDSD-2 At S54472:® b¾rONS3963 7.67 JJk23_ 14.01 27.82 0 19.54 03 PaDS -2 At S54473:@ }M'ON83¾3 7.48 3.27 13.95 26.26 242 13.24 5.57 PaMD-2 kt S54474:® pMO S3963 7.22 3.01 14.95 27.S7 1,02 14.5 3.4S PaD6D-2 At S54475:É¾ bMQN83963 7.44 3.07 1333 26.46 1-58 14.27 5.24 ] FaD6D-2 At .S54476;í¾ I ÜN83963 7.35 3.17 14.22 27.48 0,8 15.51 3.25 PaD6D-2 At S54477:jg MON839iS3 8.01 ¡ 2.7 15.S5 30.18 0 16.8 0 ?aD5I -2 At 554478: b ON539¿3 7* 5 3.05 13.47 27.4S 0.13 19.53 G.S4 PaD6E>-2 At S54479r@ bMON83963 7.14 2.99 1532 27.71 0.24 17.74 0.9 . 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S54496:# bM0MS3964 7.65 3.02 14.54 27.83 0,35 17.43 1.87 PJD6D-2 A¿ JS54497;® ?????83964 7.62 2.94 13.64 28,44 0.89 15,27 3.51 PJD6D-2 At S5&49&- PMONS3964 7.55 3.06 14.06 27.53 1.01 14.89 437 PJD6D-2 At. S54499:® pMON83964 7,19 3.12 14,52 26,77 155 13.28 5.14 vjnf>i}-2 Át_S5450O:@ E)MON839S4 7.42 2.9 13.83 27,84 039 17.55 2.3 PjD6D-2¡ At S54S01:<g MONS3964 7.51 3.09 14.23 2821 0 19.5 0.1 PjD6D-2 At S5«Q2r@ PMONB3964 7.41 3 13.56 27.41 0.S1 1636 333 FjD6D*2 At 554503:® ON83954 733 ' 2.95 13.46 26.74 L09 15.92 428 PaDtíD-1 ¾_S54505:@ JMON839S5 724 2.97 14.25 2724 0.96 193 0.21 PaD6D-l At S5450S:«¾ pMONS3965 7.37 3.12 14.25 2tí.Sl 1.26 19.08 0 PaD6D-l . At S54507:® pMGN83965 |7.48 3.03 15.61 26.B6 0.52 18.75 i 0.09 Pá tiD-1 At S545Q8;{¾ p CJNS396§ |7,tíÍ 3.07 1341 25.2S 2,2 19.67 031 PaDtíM pMO 839á517.33 3.24 1 14.21 25.71 2.32 ! 18.64 0.4S CUADRO 9 (CONTINUACION) CUADRO 9 (CONTINUACION) EJEMPL0 10 Transformación y expresión en canoia Los vectores pMON83961 , pMON83962, pMON83963 y pMON83964 descritos en el ejemplo 9, fueron transformados también en canoia de acuerdo a los métodos del ejemplo 4. Se incluyó a p ON70500 como control negativo. La composición de ácidos grasos de las hojas se determinó mediante análisis por GC de lípidos derivados de éster metílico. Los datos se muestran en el cuadro 10. De nuevo, se confirmaron las selectividades del substrato observadas en levaduras y Arabidopsis.

CUADRO 10 Análisis de ácidos grasos de tejido foliar de cañóla Todos los métodos y composiciones descritos y reclamados en la presente pueden desarrollarse y ejecutarse sin experimentación indebida a la luz de la presente descripción. Aunque los métodos y composiciones de esta invención se han descrito en términos de modalidades preferidas, será evidente para los expertos en la técnica que pueden aplicarse variaciones a los métodos y composiciones y en los pasos o en la secuencia de pasos del método descrito en la presente sin que se aparten del concepto, espíritu y alcance de la invención. Más específicamente, será evidente que ciertos agentes que están químicamente y fisiológicamente relacionados pueden sustituir a los agentes descritos en la presente, aunque se obtendrían los mismos resultados o resultados similares. Se considera que dichos sustituyentes y modificaciones similares evidentes para los expertos en la técnica están dentro del espíritu, alcance y concepto de la invención, como se define mediante las reivindicaciones anexas.

REFERENCIAS Las referencias enlistadas a continuación se incorporan en la presente como referencia, al grado de que complementan, explican, proveen un antecedente, o enseñan metodología, técnicas y/o composiciones usadas en la presente.

Patente de E.U.A. 4,826,877 Patente de E.U.A. 4,910,141 Patente de E.U.A. 5,011,770 Patente de E.U.A. 5,158,975 Patente de E.U.A. 5,302,523 Patente de E.U.A. 5,378,619 Patente de E.U.A. 5,384,253 Patente de E.U.A. 5,464,765 Patente de E.U.A. 5,538,877 Patente de E.U.A. 5,538,880 Patente de E.U.A. 5,550,318 Patente de E.U.A. 5,563,055 Patente de E.U.A. 5,591,616 Patente de E.U.A. 5,952,544 Patente de E.U.A. 6,603,061 Ausubel et al., en: Current Protocols in Molecular Biology, Green Publishing Assoc, NY, 1994. Baerson et al., Plant Mol. Biol., 22(2): 255-267, 1993. Bevan et al., Nucleic Acids Res., 11 (2): 369-385, 1983. Bevan, Nucleic Acids Res., 12: 8111 , 1984. Bustos et al., J. Bacterio!., 174: 7525-7533, 1991. Bustos, et al., Plant Cell, 1(9): 839-853, 1989. Callis et al., Genes Dev., 1 : 1 183-1200, 1987. Chen et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 83: 8560-8564, 1986. Chou y Fasman, Adv. Enzymol., 47: 45-148,1978. deDeckerer, Eur. J. Clin. Nutr., 52: 749, 1998. García- aroto et al., Lipids, 37(4), 2002. Gelvin et al., en: Plant Molecular Biology Manual, 1990. Goeddel, en: Methods in Enzymology, Perbal (ed.), Academic Press, John Wiley and Sons, 185, 1988. Hamilton et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 93(18): 9975-9979, 1996. Hong et al., Plant Mol. Biol., 34(3): 549-555, 1997. Horrobin et al., Am. J. Clin. Nutr., 57(Supl.): 732S-737S, 1993. Horsch et al., Science, 227: 1229, 1985. Huang, Biochem. Biophys. Acta, 1082: 319, 1991. James et al., Semin. Arthritis Rheurn., 28: 85, 2000. Kaeppler et al., Plant Cell Reports, 9: 415-418, 1990. Koncz y Scheli, Mol. Gen. Genet, 204: 383-396, 1986.

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Claims

NOVEDAD DE LA INVENCION REIVINDICACIONES 1.- Un polinucleótido aislado que codifica para un polipéptido que tiene actividad de desaturasa que desatura una molécula de ácido graso en el carbono 6, en donde el polinucleótido se selecciona del grupo que consiste de: (a) un polinucleótido que codifica para la secuencia polipeptídica de SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 24, SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 46 o SEQ ID NO: 48; (b) un polinucleótido que comprende la secuencia de ácido nucleico de SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO: 25, SEQ ID NO: 45 o SEQ ID NO: 47; (c) un polinucleótido que híbrida con SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO: 25, SEQ ID NO: 45 o SEQ ID NO: 47, o un complemento de la misma, bajo condiciones de 5X SSC, formamida a 50% y 42°C; y (d) un polinucleótido que codifica para un polipéptido con por lo menos 90% de identidad de secuencias con una secuencia polipeptídica de SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 24, SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 46 o SEQ ID NO: 48. 2.- El polinucleótido aislado de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizado además porque el polinucleótido codifica para el polipéptido de SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 24, SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 46 o SEQ ID NO: 48. 3. - El polinucleótido aislado de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizado además porque se define que codifica para un polipéptido que tiene por lo menos 95% de identidad de secuencias con una secuencia polipeptídica de SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 24, SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 46 o SEQ ID NO: 48. 4. - El polinucleótido aislado de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizado además porque se define que está enlazado operablemente a un promotor heterólogo. 5. - Un polipéptido aislado que comprende la secuencia polipeptídica de SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 24, SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 46 o SEQ ID NO: 48, o un fragmento del mismo que tiene actividad de desaturasa que desatura una molécula de ácido graso en el carbono 6. 6. - Un vector recombinante que comprende la secuencia de polinucleótidos aislada de conformidad con la reivindicación 1. 7. - El vector recombinante de conformidad con la reivindicación 6, caracterizado además porque comprende por lo menos una secuencia adicional seleccionada del grupo que consiste de: (a) secuencias reguladoras enlazadas operativamente al polinucleótido; (b) marcadores de selección enlazados operativamente al polinucleótido; (c) secuencias de marcación enlazadas operativamente al polinucleótido; (d) una porción de purificación enlazada operativamente al polinucleótido; y (e) una secuencia de elección de objetivo enlazada operativamente al polinucleótido. 8. - El vector recombinante de conformidad con la reivindicación 6, caracterizado además porque se define que comprende un promotor enlazado operablemente a dicho polinucleótido aislado. 9. - El vector recombinante de conformidad con la reivindicación 8, caracterizado además porque el promotor es un promotor regulado por el desarrollo, específico de organelos, específico de tejidos, constitutivo o específico de células. 10. - El vector recombinante de conformidad con la reivindicación 8, caracterizado además porque dicho promotor se selecciona del grupo que consiste de 35S del CaMV, 34S del FMV, napina, 7S alfa, 7S alfa', Glob y Lee. 11. - El vector recombinante de conformidad con la reivindicación 6, caracterizado además porque se define como un cassette de expresión aislado. 12. - Una planta transgénica transformada con el vector recombinante de conformidad con la reivindicación 6. 13. - La planta transgénica de conformidad con la reivindicación 12, caracterizada además porque se define que es transformada con una secuencia de ácido nucleico que codifica para un polipéptido que tiene actividad de desaturasa que desatura una molécula de ácido graso en el carbono 12. 14. - La planta transgénica de conformidad con la reivindicación 12, caracterizada además porque se define que es transformada con una secuencia de ácido nucleico que codifica para un polipéptido que tiene actividad de desaturasa que desatura una molécula de ácido graso en el carbono 15. 15.- Una célula hospedera transformada con el vector recombinante de conformidad con la reivindicación 6. 16.- La célula hospedera de conformidad con la reivindicación 15, caracterizada además porque dicha célula hospedera expresa una proteína codificada por dicho vector. 17. - La célula hospedera de conformidad con la reivindicación 15, caracterizada además porque la célula tiene heredado dicho vector recombinante de un progenitor de la célula. 18. - La célula hospedera de conformidad con la reivindicación 15, caracterizada además porque la célula ha sido transformada con dicho vector recombinante. 19. - La célula hospedera de conformidad con la reivindicación 15, caracterizada además porque se define como una célula vegetal. 20. - Una semilla de la planta de conformidad con la reivindicación 12, en donde la semilla comprende el vector recombinante. 21- Un método para producir aceite que contiene ácidos grasos omega-3 de semillas de plantas, que comprende los pasos de: (a) obtener semillas de una planta de conformidad con la reivindicación 2; y (b) extraer el aceite de dichas semillas. 22.- Un método para producir una planta que comprende aceite de semilla que contiene niveles alterados de ácidos grasos omega-3, que comprende introducir el vector recombinante de conformidad con la reivindicación 6 en una planta que produce aceite. 23. - El método de conformidad con la reivindicación 22, caracterizado además porque la introducción del vector recombinante comprende fitomejoramiento. 24. - El método de conformidad con la reivindicación 22, caracterizado además porque la introducción del vector recombinante comprende transformación genética. 25. - El método de conformidad con la reivindicación 22, caracterizado además porque la planta es una planta seleccionada del grupo que consiste de Arabidopsis thaliana, Brassica de semilla oleaginosa, colza, girasol, cártamo, cañóla, maíz, soya, algodón, lino, jojoba, árbol de sebo chino, tabaco, cacao, cacahuate, plantas frutales, plantas de cítricos y plantas que producen nueces y bayas. 26.- El método de conformidad con la reivindicación 22, caracterizado además porque la planta se define además como transformada con una secuencia de ácido nucleico que codifica para un polipéptido que tiene actividad de desaturasa que desatura una molécula de ácido graso en el carbono 15. 27.- El método de conformidad con la reivindicación 26, caracterizado además porque se incrementa el contenido de ácido estearidónico. 28 - El método de conformidad con la reivindicación 22, caracterizado además porque se define que comprende introducir el vector recombinante de conformidad con la reivindicación 6 en una pluralidad de plantas que producen aceite, y seleccionar dichas plantas o progenie de las mismas que tengan heredado el vector recombinante para una planta que tiene un perfil deseado de ácidos grasos omega-3. 29.- Un aceite de semilla de soya endógeno que tiene un contenido de ácido estearidónico de aproximadamente 5% a aproximadamente 50%, y un contenido de ácido gamma-linoleico menor de 10%. 30.- El aceite de semilla de soya de conformidad con la reivindicación 29, caracterizado además porque se define que comprende menos de 10% de ácido alfa-linoleico, ácido linoleico y ácido gamma-linoleico combinados. 31. - El aceite de semilla de soya de conformidad con la reivindicación 29, caracterizado además porque el contenido de ácido estearidónico se define además como de aproximadamente 15% a aproximadamente 35%. 32. - El aceite de semilla de soya de conformidad con la reivindicación 29, caracterizado además porque el contenido de ácido estearidónico se define además como de aproximadamente 22% a aproximadamente 50%. 33. - El aceite de semilla de soya de conformidad con la reivindicación 29, caracterizado además porque el contenido de ácido gamma- linoleico se define además como menor de 5%. 34. - El aceite de semilla de soya de conformidad con la reivindicación 29, caracterizado además porque el contenido de ácido estearidónico se define además como de aproximadamente 15% a aproximadamente 35%, y el contenido de ácido gamma-linoleico se define además como menor de 5%. 35. - El aceite de semilla de soya de conformidad con la reivindicación 29, caracterizado además porque la relación de ácidos grasos omega-3 a omega-6 en el aceite, es de aproximadamente 0.35:1 a aproximadamente 3.5: 1. 36. - El aceite de semilla de soya de conformidad con la reivindicación 29, caracterizado además porque la relación de ácidos grasos omega-3 a omega-6 en el aceite, es de aproximadamente 1:1 a aproximadamente 3.5:1. 37.- Un método para aumentar el valor nutricional de un producto comestible para consumo humano o animal no humano, que comprende añadir el aceite de semilla de soya de conformidad con la reivindicación 29 al producto comestible. 38. - El método de conformidad con la reivindicación 37, caracterizado además porque el producto comestible se selecciona del grupo que consiste de alimento para consumo humano, pienso y un complemento alimenticio. 39. - El método de conformidad con la reivindicación 37, caracterizado además porque el aceite de semilla de soya aumenta el contenido de ácido estearidónico del producto comestible. 40. - El método de conformidad con la reivindicación 37, caracterizado además porque el aceite de semilla de soya aumenta la relación de ácidos grasos omega-3 a omega-6 del producto comestible. 41. - El método de conformidad con la reivindicación 37, caracterizado además porque el producto comestible carece de ácido estearidónico antes de añadir el aceite de semilla de soya. 42. - Un método para fabricar alimento y/o forraje, que comprende añadir el aceite de semilla de soya de conformidad con la reivindicación 29 a ingredientes de alimento y/o forraje de partida para producir el alimento y/o forraje. 43. - Un alimento o forraje obtenido mediante el método de conformidad con la reivindicación 42. 44.- Un método para proveer ácido estearidónico a un animal humano o no humano, que comprende administrar el aceite de semilla de soya de conformidad con la reivindicación 29 a dicho animal humano o no humano. 45. - El método de conformidad con la reivindicación 44, caracterizado además porque el aceite de semilla de soya se administra en una composición comestible. 46. - El método de conformidad con la reivindicación 45, caracterizado además porque la composición comestible es alimento o forraje. 47. - El método de conformidad con la reivindicación 46, caracterizado además porque el alimento comprende bebidas, alimentos infundidos, salsas, condimentos, aderezos para ensalada, jugos de fruta, jarabes, postres, alcorzas y rellenos, productos congelados blandos, confitura o alimento de humedad intermedia. 48. - El método de conformidad con la reivindicación 45, caracterizado además porque la composición comestible es sustancialmente un líquido o un sólido. 49. - El método de conformidad con la reivindicación 45, caracterizado además porque la composición comestible es un complemento alimenticio y/o un nutracéutico. 50. - El método de conformidad con la reivindicación 44, caracterizado además porque el aceite de semilla de soya se administra a un humano. 51 - El método de conformidad con la reivindicación 44, caracterizado además porque el aceite de semilla de soya se administra a un animal no humano. 52 - El método de conformidad con la reivindicación 51 , caracterizado además porque el aceite de semilla de soya se administra a ganado o aves de corral.