BRPI0413786B1

BRPI0413786B1 - vetor recombinante com atividade dessaturase e métodos de produzir óleo de semente com ácidos graxos ômega-3, de produzir ácido graxo ômega-3 e de produzir planta compreendendo óleo de semente com níveis alterados de ácidos graxos ômega-3

Info

Publication number: BRPI0413786B1
Application number: BRPI0413786A
Authority: BR
Inventors: Froman Byron; Dong Fenggao; Gonzales Jennifer; E Screen Steven; J La Rosa Thomas; M Ursin Virginia
Original assignee: Monsanto Technology Llc
Priority date: 2003-08-21
Filing date: 2004-08-20
Publication date: 2019-12-24
Also published as: EP1656449A1; PT1656449E; US8221819B2; US10174297B2; US20170283780A1; CA2881252A1; US20130041031A1; DE602004021001D1; US8173870B2; CA2535310C; AU2004268196A1; CA2535310A1; BRPI0413786A; US20130041032A1; CA2881252C; CN1871353B; US9701947B2; US20090176879A1; WO2005021761A1; ZA200601438B

Abstract

"ácido graxo dessaturases de primula". a presente invenção, no geral, refere-se aos métodos e composições que se referem-se respeito às enzimas de dessaturase que modulam o número e a localização de ligações duplas em ácidos graxos poliinsaturados de cadeia longa (lc-pufa<39>s). em particular, a presente invenção referese a métodos e composições para melhorar os perfis de ácido graxo ômega3 em produtos vegetais e partes usando enzimas de dessaturase e ácidos nucléicos que codificam tais enzimas. em modalidades particulares, as enzimas de dessaturase são <30>6-dessaturases de primula. também são fornecidas composições de óleo de soja melhoradas tendo sda e um teor benéfico global de ácidos graxos ômega-3 relativo aos ácidos graxos ômega-6.

Description

Relatório Descritivo da Patente de Invenção para VETOR RECOMBINANTE COM ATIVIDADE DESSATURASE E MÉTODOS DE PRODUZIR ÓLEO DE SEMENTE COM ÁCIDOS GRAXOS ÔMEGA-3, DE PRODUZIR ÁCIDO GRAXO ÔMEGA-3 E DE PRODUZIR PLANTA COMPREENDENDO ÓLEO DE SEMENTE COM NÍVEIS ALTERADOS DE ÁCIDOS GRAXOS ÔMEGA-3.

Antecedentes da Invenção

Este pedido reivindica a prioridade do Pedido de Patente Provisório U.S. Ser. N^o 60/496.751, depositado em 21 de agosto de 2003, a descrição inteira do qual é especificamente aqui incorporada por referência.

1. Campo da Invenção

A invenção refere-se geral às enzimas de dessaturase que modulam o número e localização de ligações duplas em ácidos graxos poliinsaturados de cadeia longa (LC-PUFA’s). Em particular, a invenção refere-se à melhora dos perfis de ácido graxo usando enzimas de dessaturase e ácidos nucléicos que codificam tais enzimas de dessaturase.

2. Descrição da Técnica Relacionada

Os produtos primários da biossíntese de ácido graxo na maioria dos organismos são compostos de 16 e 18 carbonos. A relação relativa de comprimentos de cadeia e o grau de insaturação destes ácidos graxos variam amplamente entre as espécies. Os mamíferos, por exemplo, produzem primariamente ácidos graxos saturados e monoinsaturados, enquanto a maioria SDA plantas superiores produzem ácidos graxos com uma, duas ou três ligações duplas, as duas últimas compreendendo ácidos graxos poliinsaturados (PUFA’s).

Duas famílias principais de PUFAs são os ácidos graxos ômega3 (também representados como ácidos graxos n-3), exemplificados pelo ácido eicosapentaenóico (EPA, 20:4, n-3), e os ácidos graxos ômega-6 (também representados como ácidos graxos n-6), exemplificados pelo ácido araquidônico (ARA, 20:4, n-6). Os PUFAs são componentes importantes da membrana plasmática da célula e tecido adiposo, onde eles podem ser encontrados em formas tais como fosfolipídeos e como Segue-se página 1a

1a triglicerídeos, respectivamente. Os PUFAs são necessários para o desenvolvimento apropriado em mamíferos, particularmente no desenvolvimento do cérebro infantil e para a formação e reparo de tecido.

Diversos distúrbios respondem ao tratamento com ácidos graSegue-se folha 2 xos. A suplementação com PUFAs tem mostrado reduzir a taxa de restenose após a angioplastia. Os benefícios de saúde de certos ácidos graxos ômega3 na dieta para a doença cardiovascular e artrite reumatóide também foram bem documentados (Simopoulos, 1997; James et a/., 2000). Além disso, os PUFAs foram sugeridos para o uso em tratamentos para asma e psoríase. Evidências indicam que os PUFAs possam estar envolvidos no metabolismo de cálcio, sugerindo que os PUFAs possam ser úteis no tratamento ou prevenção de osteoporose e de cálculos renais ou do trato urinário. A maioria SDA evidências para os benefícios de saúde aplicam-se às gorduras ômega3 de cadeia longa, EPA e ácido docosahexanenóico (DHA, 22:6) que estão nos peixes e óleo de peixe. Com esta base de evidência, as autoridades de saúde e nutricionistas no Canadá (Scientific Review Committee, 1990, Nutrition Recommendations, Minister of National Health and Welfare, Canadá, Ottawa), Europa (de Deckerer et al., 1998), do reino Unido (The British Nutrition Foundation, 1992, Unsaturated fatty-acids - nutritional and physiological significance: The report of the British Nutrition Foundation’s Task Force, Chapman e Hall, Londres) e dos Estados Unidos (Simopoulos et a/., 1999) têm recomendado consumo aumentado na dieta destes PUFAs.

Os PUFAs também podem ser usados para tratar diabetes (Patente U.S. N° 4.826.877; Horrobin et al„ 1993). O metabolismo e composição de ácido graxo alterados têm sido demonstrados em animais diabéticos. Estas alterações têm sido sugeridas como estando envolvidas em algumas SDA complicações de longa duração que resultam do diabete, incluindo a retinopatia, neuropatia, nefropatia e dano ao sistema reprodutivo. O óleo de Prímula, que contém o ácido γ-linolênico (GLA, 18:3, Δ6, 9, 12), tem sido mostrado prevenir e o dano ao nervo diabético reverso.

Os PUFAs, tais como ácido linoléico (LA, 18:2, Δ9, 12) e ácido alinolênico (ALA, 18:3, Δ9, 12, 15), são considerados como ácidos graxos essenciais ha dieta porque os mamíferos carecem da capacidade para sintetizar estes ácidos. Entretanto, quando ingeridos, os mamíferos têm a capacidade para metabolizar LA e ALA para formar as famílias n-6 e n-3 de ácidos graxos poliinsaturados de cadeia longa (LC-PUFA). Estes LC-PUFA’s são componentes celulares importantes que conferem fluidez às membranas e que funcionam como precursores de eicosanóides biologicamente ativos tais como prostaglandinas, prostaciclinas e leucotrienos, que regulam funções fisiológicas normais. O ácido araquidônico é o principal precursor para a sín5 tese de eicosanóides, que incluem leucotrienos, prostaglandinas e tromboxanos e que também desempenham um papel no processo da inflamação. A administração de um ácido graxo ômega-3, tal como SDA, tem sido mostrado inibir a biossíntese de leucotrienos (Patente U.S. N- 5.158.975). O consumo de SDA tem sido mostrado levar a uma diminuição nos níveis sangüí10 neos de citocinas pró-inflamatórias TNF-α e IL-1 β (PCT US 0306870).

Em mamíferos, a formação de LC-PUFA é limitada em taxa pela etapa de dessaturação Δ6, que converte LA ao ácido γ-linolênico (GLA, 18:3, Δ6, 9, 12) e ALA para SDA (18:4, Δ6, 9, 12, 15). Muitas condições fisiológicas e patológicas mostraram deprimir esta etapa metabólica do mesmo mou 15 do e consequentemente, a produção de LC-PUFA. Para superar a etapa que limita a taxa e aumentar os níveis teciduais de EPA, poder-se-ia consumir quantidades grandes de ALA. Entretanto, o consumo de quantidades apenas moderadas de SDA fornece uma fonte suficiente de EPA, visto que o SDA é cerca de quatro vezes mais eficiente do que o ALA na elevação dos níveis 20 de EPA teciduai em seres humanos (Pedido U.S. copendente Ser. N^s10/384.369). Nos mesmos estudos, a administração de SDA também foi capaz de aumentar os níveis teciduais de ácido docosapentaenóico (DPA), que é um produto do prolongamento de EPA. Alternativa mente, desviando a dessaturação de Δ6 por intermédio da suplementação dietética com EPA ou 25 DHA pode-se aliviar eficazmente muitas doenças patológicas associadas com níveis baixos de PUFA. Entretanto, como apresentado em mais detalhes abaixo, fontes correntemente disponíveis de PUFA não são desejáveis por uma multidão de razões. A necessidade quanto a uma fonte confiável e econômica de PUFA’s tem estimulado interesse em fontes alternativas de 30 PUFA’s.

Os PUFAs de cadeia longa principais de importância incluem DHA e EPA, que são primaria mente encontrados em tipos diferentes de óleo de peixe e ARA, encontrado em fungos filamentosos tais como Mortierella. Para DHA, várias fontes existem para a produção comercial incluindo uma variedade de organismos marinhos, óleos obtidos a partir de peixes marinhos de águas frias e frações da gema do ovo. As fontes comerciais de SDA incluem os gêneros vegetais Trichodesma, Borago (borragem) e Echium. Entretanto, existem diversas desvantagens associadas com a produção comercial de PLIFAs a partir de fontes naturais. As fontes naturais de PUFAs, tais como animais e plantas, tendem a ter composições oleosas altamente heterogêneas. Os óleos obtidos a partir destas fontes portanto podem requerer purificação extensiva para separar um ou mais PUFAs desejados ou para produzir um óleo que seja enriquecido em um ou mais PUFAs.

As fontes naturais de PUFAs também estão sujeitas às flutuações incontroláveis na disponibilidade. Estoques de peixe podem sofrer variação natural ou podem ser esgotados pela pesca excessiva. Além disso, mesmo com as evidências esmagadoras de seus benefícios terapêuticos, as recomendações dietéticas com respeito aos ácidos graxos ômega-3 não são atendidas. Os óleos de peixe têm sabores e odores desagradáveis, que podem ser impossíveis de separar economicamente do produto desejado e podem tornar tais produtos inaceitáveis como suplementos alimentares. Os óleos de animal e particularmente os óleos de peixe, podem acumular poluentes ambientais. Os alimentos podem ser enriquecidos com óleos de peixe, mas mais uma vez, tal enriquecimento é problemático por causa do custo e dos estoques de peixe em declínio no mundo todo. Este problema também é um impedimento para o consumo e ingestão de peixe inteiro. Não obstante, se as mensagens de saúde aumentando a ingestão de peixe fossem aceitas pelas comunidades, provavelmente haveria um problema em satisfazer a demanda por peixe. Além disso, existem problemas com a sustentabílidade desta indústria, que conta pesadamente com os estoques de peixe selvagens em lugar de alimentada pela aqüicultura (Naylor et al., 2000).

Outras limitações naturais favorecem um novo método para a produção de ácidos graxos ômega-3. O tempo e as doenças podem causar flutuação nos rendimentos SDA fontes tanto de peixe quanto de plantas. As áreas cultiváveis disponíveis para a produção de colheitas produtoras de óleo alternativas estão sujeitas à competição da expansão constante SDA populações humanas e a necessidade crescente associada quanto à produção de alimento nas terras aráveis remanescentes. As colheitas que produ5 zem PUFAs, tais como borragem, não foram adaptadas para o cultivo comercial e podem não desempenhar bem em monocultura. O cultivo de tais colheitas assim não é economicamente competitivo onde colheitas mais lucrativas e melhor estabelecidas podem ser cultivadas. A fermentação em larga escala de organismos tais como Mortierella também é cara. Tecidos 10 animais naturais contêm quantidades baixas de ARA e são difíceis de processar. Microorganismos tais como Porphyridium e Mortierella são difíceis de cultivar em uma escala comercial.

Várias enzimas estão envolvidas na biossíntese de PUFAs. LA (18:2, Δ9, 12) é produzido a partir de ácido oléico (OA, 18:1, Δ9) por uma - 15 A12-dessaturase enquanto ALA (18:3, Δ9, 12, 15) é produzido a partir de LA por uma A15-dessaturase. SDA (18:4, Δ6, 9, 12, 15) e GLA (18:3, Δ6, 9, 12) são produzidos a partir de LA e ALA por uma A6-dessaturase. Entretanto, como estabelecido acima, os mamíferos não podem dessaturar além da posição Δ9 e portanto não podem converter ácido oléico em LA. Do mesmo 20 modo, ALA não pode ser sintetizado pelos mamíferos. Outros eucariotas, incluindo fungos e plantas, têm enzimas que dessaturam nas posições do carbono 12 e carbono 15. Os ácidos graxos poliinsaturados principais de animais portanto são derivados da dieta por intermédio da dessaturação e prolongação subsequentes do LA e ALA da dieta.

Vários genes que codificam dessaturases foram descritos. Por exemplo, a Patente U.S. N^Q 5.952.544 descreve fragmentos de ácido nucléico isolados e clonados de Brassica napus que codificam enzimas de dessaturase de ácido graxo. A expressão dos fragmentos de ácido nucléico da patente 5.952.544 resultou no acúmulo de ALA. Entretanto, em plantas transgênicas que expressam a Δΐδ-dessaturase de B. napus, LA substancial permanece não convertido pela dessaturase. Enzimas mais ativas que convertem quantidades maiores de LA a ALA seriam vantajosas. Os níveis de

ALA aumentados permitem uma A6-dessaturase, quando co-expressada com um ácido nucléico que codifica a Á15-dessaturase, para atuar no ALA, produzindo deste modo níveis maiores de SDA. Por causa da multidão de usos benéficos para SDA, existe uma necessidade para se criar um aumento 5 substancial na produção de SDA.

Ácidos nucléicos de várias fontes foram procurados para o uso no aumento da produção de SDA. Entretanto, as inovações que permitiríam a produção comercial melhorada em colheitas com base em terra são ainda necessitadas (ver, por exemplo, Reed et al., 2000). Além disso, o uso de 10 polinucleotídeos de dessaturase derivados de organismos tais como Caenorhabditis elegans (Meesapyodsuk et al., 2000) não é ideal para a produção comercial de óleos de semente de planta enriquecidos. Os genes que codificam A6-dessaturases foram isolados de duas espécies de Prímula, P. farínosa e P. vialii e estes verificados serem ativos em levedura, mas a função .15 em plantas não foi mostrada (Sayanova etal., 2003).

Portanto, seria vantajoso obter material genético envolvido na biossíntese de PUFA e expressar o material isolado em um sistema vegetal, em particular, um sistema vegetal de colheita terrestre com base em terra, que pudesse ser manipulado para fornecer a produção de quantidades co20 merciais de um ou mais PUFA’s. Existe também uma necessidade de aumentar a ingestão de gordura ômega-3 em seres humanos e animais. Assim existe uma necessidade para fornecer uma ampla faixa de alimentos e suplementos alimentícios enriquecidos com ômega-3 de modo que as pessoas pudessem escolher ração, ingredientes de ração, alimentos e ingredientes 25 alimentícios que se adaptassem aos seus hábitos dietéticos usuais. Particularmente vantajosos seriam óleos de semente com SDA aumentado.

Correntemente existe apenas um ácido graxo ômega-3, ALA, disponível em óleos vegetais. Entretanto, existe conversão deficiente de ALA ingerido aos ácidos graxos ômega-3 de cadeia mais longa tais como EPA e 30 DHA. Foi demonstrado no pedido U.S. copendente Ser. N^s 10/384.369 para Treatment And Prevention Of Inflammatory Disorders, que a ingestão de ALA elevada pela comunidade da média de 1/g dia a 14 g/dia pelo uso de óleo de linhaça aumentou apenas modestamente os níveis plasmáticos de EPA fosfolipídico. Um aumento de 14 vezes na ingestão de ALA resultou em um aumento de 2 vezes no EPA fosfolipídico plasmático (Manzioris et a/., > 1994). Assim, para esta finalidade, existe uma necessidade quanto à produ5 ção eficiente e comercialmente viável de PUFAs usando ácido graxo dessaturases, genes que as codificam e métodos recombinantes de produzi-las. Uma necessidade também existe quanto a óleos contendo proporções relativas mais altas de PUFAs específicos e composições alimentícias e suplementos que as contenham. Uma necessidade também existe quanto a mé10 todos econômicos confiáveis de produzir PUFA’s específicos.

A despeito SDA ineficiências e rendimentos baixos como descritos acima, a produção de ácidos graxos ômega-3 por intermédio da cadeia alimentar terrestre é um empreendimento benéfico para a saúde pública e, em particular, para a produção de SDA. SDA é importante porque, como ,_u 15 descrito acima, existe conversão baixa de ALA em EPA. Isto é porque a enzima inicial na conversão, a A6-dessaturase, tem atividade baixa em seres humanos e é limitada em taxa. Evidências de que a Δβ-dessaturase é limitada em taxa é fornecida pelos estudos que demonstram que a conversão do seu substrato, ALA, é menos eficiente do que a conversão do seu produto, 20 SDA em EPA em camundongos e ratos (Yamazaki et a/., 1992; Huang, 1991).

Com base em tais estudos, é observado que em colheitas de sementes oleaginosas comerciais, tais como canola, soja, milho, girassol, açafroa ou linho, a conversão de alguma fração dos ácidos graxos mono e 25 poliinsaturados que tipificam o óleo de suas sementes para SDA requer a expressão específica de semente de enzimas de dessaturase múltiplas, que incluem Δ6-, Δ12- e/ou Δΐδ-dessaturases. Óleos derivados de plantas que expressam níveis elevados de Δ6, Δ12 e Δ15-άβ883ίυΓ35β3 são ricos em SDA e outros ácidos graxos ômega-3. Tais óleos podem ser utilizados para 30 produzir alimentos e suplementos alimentícios enriquecidos em ácidos graxos ômega-3 e o consumo de tais alimentos eficazmente aumenta os níveis teciduais de EPA e DHA. Os alimentos e gêneros alimentícios, tais como leite, margarina e língüiças, todos fabricados ou preparados com óleos enriquecidos com ômega-3, resultarão em benefícios terapêuticos. Tem sido mostrado que as pessoas podem ter uma ingestão de ômega-3 comparável a EPA e DHA de pelo menos 1,8 g/dia sem alterar os seus hábitos dietéticos pela utilização de alimentos contendo óleos enriquecidos com ácidos graxos ômega-3. Assim, existe uma forte necessidade quanto a novos ácidos nucléicos de A6-dessaturases para o uso em plantas de colheita transgênicas com óleos enriquecidos em PUFAs, assim como aos óleos melhorados desse modo produzidos.

SUMÁRIO DA INVENÇÃO

Em um aspecto, a invenção fornece ácidos nucléicos isolados que codificam um polipeptídeo capaz de dessaturar uma molécula de ácido graxo no carbono 6 (A6-dessaturase). Estes podem ser usados para transformar células ou modificar a composição de ácido graxo de uma planta ou do óleo produzido por uma planta. Uma modalidade da invenção é uma seqüência de polinucleotídeo isolada, isolada de uma espécie Primula tendo atividade de dessaturase única. Em certas modalidades, os polinucleotídeos isolados são isolados, por exemplo, de Primula juliae, P. alpicola, P. waltonii, P. farinosa ou P. fíorindae. Em certas outras modalidades da invenção, os polinucleotídeos codificam um polipeptídeo tendo pelo menos 90% de identidade de seqüência com a seqüência de polipeptídeo SDA SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 24, SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 46 ou SEQ ID NO: 48, incluindo pelo menos cerca de 92%, 95%, 98% e 99% de homologia com estas seqüências. Aqueles versados na técnica reconhecerão que, como estas seqüências estão relacionadas, um dado polipeptídeo pode simultaneamente compartilhar 90% ou homologia maior com mais do que uma destas seqüências de polipeptídeo. Em certas modalidades, uma seqüência fornecida pela invenção tem uma seletividade de substrato para o ácido α-linolênico relativo ao ácido linoléico, como aqui descrito. Em outras modalidades, existe seletividade de substrato de pelo menos 2:1 para o ácido α-linolênico relativo ao ácido linoléico, incluindo de cerca de 2:1 a cerca de 2,9:1.

Em um outro aspecto, a invenção fornece um polinucleotídeo isolado que codifica um polipeptídeo tendo atividade de dessaturase que dessatura uma molécula de ácido graxo no carbono 6, compreendendo uma seqüência selecionada do grupo consistindo em: (a) um polinucleotídeo que 5 codifica o polipeptídeo da SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 24, SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 46 ou SEQ ID NO: 48; (b) um polinucleotídeo compreendendo a seqüência de ácido nucléico da SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO: 25, SEQ ID NO: 45 ou SEQ ID NO: 47; (c) um polinucleotídeo que hibridiza com 10 a SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO: 25, SEQ ID NO: 45 ou SEQ ID NO: 47 ou um complemento destas, sob condições de 5X SSC, 50% de formamida e 42°C; e (d) um polinucleotídeo que codifica um polipeptídeo com pelo menos 90% de identidade de seqüência a uma seqüência de polipeptídeo da SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, 15 SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 24, SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 46 ou SEQ ID NO: 48.

Já em um outro aspecto, a invenção fornece um vetor recombinante compreendendo um polinucleotídeo isolado de acordo com a invenção. O termo vetor recombinante como aqui usado, inclui qualquer seg20 mento recombinante de DNA que se deseja introduzir em uma célula, tecido e/ou organismo hospedeiros e especificamente inclui cassetes de expressão isolados de um polinucleotídeo de partida. Um vetor recombinante pode ser linear ou circular. Em vários aspectos, um vetor recombinante pode compreender pelo menos uma seqüência adicional escolhida do grupo consistindo 25 em: sequências reguladoras operativamente ligadas ao polinucleotídeo; marcadores de seleção operativamente ligados ao polinucleotídeo; seqüências marcadoras operativamente ligadas ao polinucleotídeo; uma porção de purificação operativamente ligada ao polinucleotídeo; e uma seqüência alvejadora operativamente ligada ao polinucleotídeo.

Ainda em um outro aspecto, a invenção fornece células, tais como células de mamífero, planta, inseto, levedura e bactérias transformadas com os polinucleotídeos da presente invenção. Em uma outra modalidade, as células são transformadas com vetores recombinantes contendo promotores constitutivos e específicos de tecido além dos polinucleotídeos da presente invenção. Em certas modalidades da invenção, tais células podem ser definidas ainda como transformadas com uma seqüência de ácido nucléico que codifica um polipeptídeo tendo atividade de dessaturase que dessatura uma molécula de ácido graxo no carbono 12 e/ou 15.

A invenção também fornece um polipeptídeo compreendendo a seqüência de aminoácido da SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 24, SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 46 ou SEQ ID NO: 48; ou um fragmento destas tendo atividade de dessaturase que dessatura uma molécula de ácido graxo no carbono 6.

Ainda um outro aspecto da invenção fornece um método de produzir óleo de semente contendo ácidos graxos ômega-3 a partir de sementes de planta, compreendendo as etapas de (a) obter sementes de uma planta de acordo com a invenção; e (b) extrair o óleo a partir SDA ditas sementes. Os exemplos de uma tal planta incluem canola, soja, feijões soja, colza, girassol, algodão, cacau, amendoim, açafroa, coco, linho, óleo de palma, semente oleaginosa de Brass/ca napus e milho. Os métodos preferidos de transformar tais células vegetais incluem o uso de plasmídeos Ti e Ri de Agrobacteríum, eletroporação e bombardeamento balístico de alta velocidade.

Ainda em um outro aspecto, a invenção fornece um método de produzir uma planta compreendendo óleo de semente contendo níveis alterados de ácidos graxos ômega-3 compreendendo introduzir um vetor recombinante da invenção em uma planta produtora de óleo. No método, introduzir o vetor recombinante pode compreender transformação genética. Em modalidade, a transformação compreende as etapas de: (a) transformar uma célula vegetal com um vetor recombinante da invenção; e (b) regenerar a planta a partir da célula vegetal, em que a planta tem níveis alterados de ácidos graxos ômega-3 relativos a uma planta correspondente do mesmo genótipo que não foi transformada com o vetor. No método, a planta, por exemplo, pode ser selecionada do grupo consistindo em Arabidopsis thaliana, semen11 d

te oleaginosa de Brassica, colza, girassol, açafroa, canola, milho, soja, algodão, linho, jojoba, árvore do sebo, tabaco, cacau, amendoim, plantas frutíferas, plantas cítricas e plantas que produzem nozes e bagas. A planta pode ser definida ainda como transformada com uma seqüência de ácido nucléico que codifica um polipeptídeo tendo atividade de dessaturase que dessatura uma molécula de ácido graxo no carbono 12 e/ou 15. A planta pode compreender SDA aumentado. O método pode compreender ainda introduzir o vetor recombinante em uma pluralidade de plantas produtoras de óleo e triar as plantas ou sua progênie tendo herdado o vetor recombinante quanto a uma 10 planta tendo um perfil desejado de ácidos graxos ômega-3.

Ainda em um outro aspecto, a invenção fornece um óleo de semente de soja endógeno tendo um teor de SDA de cerca de 5% a cerca de 50% e um teor de ácido gama-linoléico de menos do que cerca de 10%. O teor de SDA, em certas modalidades, pode ser definido ainda como de cerca 15 de 5% a cerca de 32%, de cerca de 5% a cerca de 35%, de cerca de 15% a cerca de 30%, de cerca de 22% a cerca de 30% e de cerca de 22% a cerca de 40%. O teor de ácido gama-linoléico, em outras modalidades, pode ser definido como menor do que cerca de 10, 8, 5 e/ou cerca de 3%. Em modalidades particulares, o teor de ácido estearidônico pode ser de cerca de 15% 20 a cerca de 35% e o teor de ácido gama-linoléico menor do que 5%. Ainda em outras modalidades, a semente pode compreender uma relação de ácidos graxos ômega-3 para ômega-6 de cerca de 0,35:1 a cerca de 3,5:1, incluindo de cerca de 1:1 a cerca de 3,5:1 e de cerca de 2:1 a cerca de 3,5:1.

Ainda em um outro aspecto, a invenção fornece um método de 25 aumentar o valor nutricional de um produto comestível para o consumo humano ou animal, compreendendo adicionar um óleo de semente de soja fornecido pela invenção ao produto comestível. Em certas modalidades, o produto é alimento humano e/ou animal. O produto comestível também pode ser ração animal e/ou um suplemento alimentício. No método, o óleo de se30 mente de soja pode aumentar o teor de SDA do produto comestível e/ou pode aumentar a relação de ácidos graxos ômega-3 para ômega-6 do produto comestível. O produto comestível pode carecer de SDA antes da adição do óleo de semente de soja.

Ainda em um outro aspecto, a invenção fornece um método de fabricar alimento ou ração, compreendendo adicionar um óleo de semente de soja fornecido pela invenção aos ingredientes alimentícios ou de ração de partida para produzir o alimento ou ração. Em certas modalidades, o método é definido ainda como um método de fabricar alimento e/ou ração. A invenção também fornece alimento ou ração fabricados pelo método.

Ainda em um outro aspecto, a invenção compreende um método de fornecer SDA a um ser humano ou animal, compreendendo administrar o óleo de semente de soja de acordo com a reivindicação 1 ao sito ser humano ou animal. No método, o óleo de semente de soja pode ser administrado em uma composição comestível, incluindo alimento ou ração. Os exemplos de alimento incluem bebidas, alimentos infundidos, molhos, condimentos, temperos de salada, sucos de fruta, xaropes, sobremesas, glacês e recheios, produtos levemente congelados, confeitos ou alimento intermediário. A composição comestível pode ser substancial mente um líquido ou sólido. A composição comestível também pode ser um suplemento alimentício e/ou nutracêutico. No método, o óleo de semente de soja pode ser administrado a um ser humano e/ou um animal. Os exemplos de animais aos quais o óleo pode ser administrado incluem animais de criação ou aves domésticas. DESCRIÇÃO RESUMIDA SDA FIGURAS

Os seguintes desenhos formam parte do presente relatório descritivo e são incluídos para demonstrar ainda certos aspectos da presente invenção. A invenção pode ser melhor entendida por referência a um ou mais destes desenhos em combinação com a descrição detalhada SDA modalidades específicas aqui apresentadas.

A FIGURA 1 mostra o alinhamento de Prímula juliae Δ6 dessaturases PjD6D-1 e PjD6D-2 (SEQ ID NOs: 4 e 5), Prímula alpícola Pa6D-1 e Pa6D-2 (SEQ ID NOs: 22 e 24), Prímula waltonli PwD6D (SEQ ID NO: 26), Prímula farínosa D6D-2 (SEQ ID NO: 46), Prímula floríndae D6D (SEQ ID NO: 48), Borago oflcinalis D6D (SEQ ID NO: 59) e Echlum gentíanoides D6D (SEQ ID NO: 60).

A FIGURA 2 mostra o mapa de vetor pMON67011. A FIGURA 3 mostra o mapa de vetor pMON83950.

* _r A FIGURA 4 mostra o mapa de vetor pMON77245.

^h A FIGURA 5 mostra o mapa de vetor pMON77247.

A FIGURA 6 mostra o mapa de vetor pMON82821.

A FIGURA 7 mostra o mapa de vetor pMON82822.

A FIGURA 8 mostra o mapa de vetor pMON83961. A FIGURA 9 mostra o mapa de vetor pMON83962.

A FIGURA 10 mostra o mapa de vetor pMON83963.

A FIGURA 11 mostra o mapa de vetor pMON83964.

A FIGURA 12 mostra o mapa de vetor pMON83965. A FIGURA 13 mostra o mapa de vetor pMON83966.

DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO

A invenção supera as limitações da técnica anterior pelo forne„ 15 cimento de métodos e composições para a criação de plantas com teor de PUFA melhorado. A modificação do teor de ácido graxo de um organismo tal como um planta apresenta muitas vantagens, incluindo benefícios de nutrição e saúde melhorados. A modificação do teor de ácido graxo pode ser usada para se obter níveis ou perfis benéficos de PUFA’s desejados em plan20 tas, partes de planta e produtos vegetais, incluindo óleos de semente de planta. Por exemplo, quando os PUFA’s desejados são produzidos no tecido de semente de uma planta, o óleo pode ser isolado SDA sementes tipicamente resultando em um óleo superior em PUFAs desejados ou um óleo tendo um teor ou perfil de ácido graxo desejados, que pode por sua vez ser 25 usado para fornecer características benéficas em gêneros alimentícios e outros produtos. A invenção em modalidades particulares fornece óleo de soja endógeno tendo SDA embora também contenha um teor de ácido oléico benéfico.

Vários aspectos da invenção incluem métodos e composições 30 para a modificação do teor de PUFA de uma célula, por exemplo, a modificação do teor de PUFA de uma célula(s) vegetal(is). As composições relacionadas com a invenção incluem novas seqüências de polinucleotídeo iso14 ladas, construtos de poIinucleotídeo e plantas e/ou partes de planta transformadas pelos polinucleotídeos da invenção. O polinucleotídeo isolado pode codificar as ácido graxo dessaturases de Prímula e, em particular, pode codificar uma Δθ-dessaturase de PríMla. As células hospedeiras podem ser 5 manipuladas para expressar um polinucleotídeo que codifica um polipeptídeo(s) de dessaturase que catalisa(m) a dessaturação de um ácido(s) graxo(s).

Alguns aspectos da invenção incluem polipeptídeos de dessaturase e polinucleotídeos que codificam os mesmos. Várias modalidades da 10 invenção podem usar combinações de polinucleotídeos de dessaturase e os polipeptídeos codificados que tipicamente dependem da célula hospedeira, da disponibilidade de substrato(s) e do produto(s) final(is) desejado(s). Dessaturase refere-se a um polipeptídeo que pode dessaturar ou catalisar a formação de uma ligação dupla entre carbonos consecutivos de um ou mais 15 ácidos graxos para produzir um ácido graxo mono- ou poliinsaturado ou um precursor deste. De interesse particular são os polipeptídeos que podem catalisar a conversão de ácido oléico ao LA, LA ao ALA ou ALA ao SDA, que inclui enzimas que dessaturam nas posições 12, 15 ou 6. O termo polipeptídeo refere-se a qualquer cadeia de aminoácidos, independente do com20 primento ou modificação pós-traducional (por exemplo, glicosilação ou fosforilação). As considerações para a escolha de um polipeptídeo específico tendo atividade de dessaturase incluem, mas não são limitadas ao pH ótimo do polipeptídeo, se o polipeptídeo é uma enzima limitadora de taxa ou um componente desta, se a dessaturase usada é essencial para a síntese de 25 um PUFA desejado, e/ou se um co-fator é requerido pelo polipeptídeo. O polipeptídeo expressado preferivelmente tem características que são compatíveis com o ambiente bioquímico de sua localização na célula hospedeira. Por exemplo, o polipeptídeo pode ter que competir quanto ao(s) substrato(s).

As análises do K_m e atividade específica de um polipeptídeo em 30 questão podem ser consideradas na determinação da adequabilidade de um dado polipeptídeo para modificar a produção, nível ou perfil de PUFA(s) em uma dada célula hospedeira. O polipeptídeo usado em uma situação particu15 lar é um que tipicamente pode funcionar sob as condições presentes na célula hospedeira pretendida, mas de outro modo pode ser qualquer polipeptídeo de dessaturase tendo uma característica desejada ou sendo capaz de modificar a produçãb, nível ou perfil relativos de um PllFA(s) desejado(s) ou qualquer outras características desejadas como aqui debatidas. O(s) substrato^) para a enzima expressada pode(m) ser produzido(s) pela célula hospedeira ou pode(m) ser exogenamente fornecidos. Para se obter a expressão, o(s) polipeptídeo(s) da presente invenção são codificados pelos polinucleotídeos como descritos abaixo.

Os inventores isolaram e produziram enzimas de Prímula que exibem atividade de A6-dessaturase. As seqüências que codificam a Δ6dessaturase podem ser expressadas em plantas transgênicas, microorganismos ou animais para produzir síntese maior de SDA. Outros polinucleotídeos que são substancialmente idênticos aos polinucleotídeos de Δ6dessaturase aqui fornecidos ou que codificam polipeptídeos que são substancialmente idênticos aos polipeptídeos de Δβ-dessaturase, também podem ser usados. Substancialmente idênticos refere-se a uma sequência de aminoácido ou seqüência de ácido nucléico que exibem, de modo a aumentar a preferência, pelo menos 90% , 95%, 98 ou 99% de identidade à seqüência de polipeptídeo de Δβ-dessaturase na SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 24, SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 46 ou SEQ ID NO: 48 ou seqüências que codificam estes polipeptídeos. As comparações de polipeptídeo ou polinucleotídeo podem ser realizadas usando software de análise de seqüência, por exemplo, o pacote de software Sequence Analysis da GCG Wisconsin Package (Accelrys, San Diego, CA), MEGAIign (DNAStar, Inc., 1228 S. Park St., Madison, Wis. 53715) e MacVetor (Oxford Molecular Group, 2105 S. Bascom Avenue, Suite 200, Campbell, Calif. 95008). Tais software se igualam com as seqüências similares pela designação de graus de similaridade ou identidade.

São abrangidas pela presente invenção dessaturases relacionadas, incluindo variantes SDA Δβ-dessaturases divulgadas que ocorrem naturalmente dentro da mesma ou espécies diferentes de Prímula. As dessatura16 v *· ·*· * * ^: *· ses relacionadas podem ser identificadas pela sua capacidade para funcionar substancialmente do mesmo modo como as dessaturases divulgadas; isto é, tendo atividade de A6-dessaturase. As dessaturases relacionadas 4ambém podem ser identificadas triando-se base de dados de seqüência quanto aos homólogos de seqüências para as dessaturases divulgadas, pela hibridização de uma sonda com base nas dessaturases divulgadas em uma biblioteca construída a partir do organismo fonte ou pela RT-PCR usando mRNA do organismo fonte e iniciadores com base nas dessaturases divulgadas. A invenção portanto fornece ácidos nucléicos que hibridizam sob condições severas a uma seqüência codificadora de dessaturase aqui descrita. Aqueles versados na técnica entendem que as condições podem ser tomadas menos severas aumentando-se a concentração salina e diminuindo-se a temperatura. Assim, as condições de hibridização podem ser facilmente manipuladas e assim no geral serão um método de escolha dependendo dos resultados desejados. Um exemplo de condições de severidade alta é 5X SSC, 50% de formamida e 42°C. Conduzindo-se uma lavagem sob tais condições, por exemplo, por 10 minutos, estas seqüências que não hibridizam com uma seqüência alvo particular sob estas condições podem ser removidas.

Em um outro aspecto da invenção, vetores contendo um ácido nucléico ou fragmento deste, contendo um promotor, uma seqüência codificadora da A6-dessaturase e uma região de terminação podem ser transferidos em um organismo em que as regiões promotora e de terminação sejam funcionais. Conseqüentemente, organismos que produzem A6-dessaturase recombinantes são fornecidos por esta invenção. Já um outro aspecto desta invenção fornece A6-dessaturase isolada, que pode ser purificada a partir de organismos recombinantes pelos métodos padrão da purificação de proteína. (Por exemplo, ver Ausubel et aí, 1994).

Vários aspectos da invenção incluem as seqüências de ácido nucléico que codificam dessaturases, aqui descritas. Os ácidos nucléicos podem ser isolados de Prímula incluindo a SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO: 25, SEQ ID NO: 45 ou SEQ ID

NO: 47 e outras. Uma estratégia de clonagem com base em iniciadores de oligonucleotídeo planejados para amplificar seqüências identificadas como ácido graxo dessaturases potenciais, com base nas procuras BLAST de base de dados de DNA genômico, pode ser usada para séqüenciar ôiõnes indi5 viduais. Estes clones podem ser depois funcionalmente caracterizados.

Os constructos de ácido nucléico podem ser fornecidos de modo que se integrem no genoma de uma célula hospedeira ou são autonomamente duplicadas (por exemplo, epissomicamente duplicados) na célula hospedeira. Para a produção de ALA e/ou SDA, os cassetes de expressão 10 (isto é, um polinucleotídeo que codifica uma proteína que está operativamente ligada à(s) seqüência(s) de ácido nucléico que direciona(m) a expressão do polinucleotídeo) no geral usados incluem um cassete de expressão que fornece a expressão de um polinucleotídeo que codifica uma Δ6dessaturase. Em certas modalidades uma célula hospedeira pode ter teor de 15 ácido oléico do tipo selvagem.

Os métodos e composições para a construção de vetores de expressão, quando verificados considerando-se as divulgações aqui fornecidas, para a expressão de enzimas de dessaturase de Prímula estarão evidentes a uma pessoa versada na técnica. Os vetores de expressão, como 20 aqui descritos, são moléculas de DNA ou RNA engendradas para a expressão controlada de um polinucleotídeo desejado, por exemplo, os polinucleotídeos que codificam a Δδ-dessaturase. Os exemplos de vetores incluem plasmídeos, bacteriofagos, cosmídeos ou vírus. Os vetores transportadores, por exemplo (Wolk et al. 1984; Bustos et al., 1991) também são considera25 dos de acordo com a presente invenção. Revisões de vetores e métodos de prepará-los e usá-los podem ser encontradas em Sambrook et al. (2001); Goeddel (1990); e Perbal (1988). Os elementos de seqüência capazes de efetuar a expressão de um polinucleotídeo incluem promotores, elementos realçadores, seqüências ativadoras a montante, sinais de terminação de 30 transcrição e sítios de poliadenilação.

Os polinucleotídeos que codificam dessaturases podem ser colocados sob o controle transcricional de um promotor forte. Em alguns casos isto leva a um aumento na quantidade de enzima de dessaturase expressada e concomitantemente a um aumento no ácido graxo produzido como um resultado da reação catalisada pela enzima. Existe uma ampla variedade de seqüências promotoras de planta que pode ser usada para direcionar a expressão específica de tecido de polinucleotídeos que codificam dessaturases em plantas transgênicas. Na verdade, em modalidades particulares da invenção, o promotor usado é um promotor específico de semente. Os exemplos de tais promotores incluem as regiões reguladoras 5’ de tais genes como napin (Kridl et ai., Seed Sei. Res. 1: 209: 219, 1991), faseolina (Bustos, etaf., Plant Cell, 1(9): 839 a 853, 1989), inibidor da tripsina da soja (Riggs, et al., Plant Cell 1(6): 609 a 621, 1989), ACP (Baerson et al„ Plant Mol. Biol., 22(2): 255 a 267, 1993), estearoil-ACP dessaturase (Slocombe et al., Plant Physiol. 104(4): 167 a 176, 1994), subunidade a’ da soja de β-conglicinina (P-Gm7S, ver por exemplo, Chen et al., Proc. Natl. Acad. Sci. 83: 8560 a 8564, 1986), Vicia faba USP (P-Vf.Usp, ver por exemplo, as SEQ ID NOs: 1, 2 e 3, Pedido de Patente U.S. 10/429.516), O promotor da globulina (verpor exemplo Belanger e Kriz, Genet. 129: 863 a 872 (1991), subunidade alfa da soja de β-conglicinina (7S alfa) (Pedido de Patente U.S. 10/235.618, incorporado por referência) e promotor da oleosina L3 de Zea mays (P-Zm.L3, ver, por exemplo, Hong et al., Plant Mol. Biol., 34(3): 549 a 555, 1997). Também são incluídas as zeínas, que são um grupo de proteínas de armazenagem encontrado no endosperma do milho. Os clones genômicos para os genes de zeína foram isolados (Pedersen et al., Cell 29: 1015 a 1026 (1982) e Russell et a!., Transgenic Res. 6(2): 157 a 168) e os promotores destes clones, incluindo o 15 kD, 16 kD, 19 kD, 22 kD, 27 kD e genes, também podem ser usados.

O técnico versado pode determinar vetores e elementos reguladores (incluindo promotores operavelmente ligados e regiões codificadoras) adequadas para a expressão em uma célula hospedeira particular. Operavelmente ligada neste contexto significa que as sequências promotoras e terminadoras funcionam eficazmente para regular a transcrição. Como um outro exemplo, um vetor apropriado para a expressão de A6-dessaturase em plantas transgênicas podem compreender uma seqüência promotora específica de semente derivada de heliantinina, napin ou glicinina operavelmente ligada à região codificadora da A6-dessaturase e ainda operavelmente ligada a um sinal de terminaçãoMe proteína de armazenagem de semente ou ao sinal de terminação da nopalina sintase. Como um outro exemplo, um vetor para o uso na expressão de A6-dessaturase em plantas pode compreender um promotor constitutivo ou um promotor específico de tecido operavelmente ligado à região codificadora da A6-dessaturase e ainda operavelmente ligado a um terminador constitutivo ou específico de tecido ou ao sinal de terminação da nopalina sintase.

As modificações SDA seqüências de nucleotídeo ou elementos reguladores aqui descritos que mantêm as funções aqui consideradas estão dentro do escopo desta invenção. Tais modificações incluem inserções, substituições e deleções e especificamente substituições que refletem a degenerescência do código genético.

As técnicas padrão para a construção de tais vetores recombinantes são bem-conhecidas por aqueles versados na técnica e podem ser encontradas em referências tais como Sambrook et al. (2001) ou qualquer um da miríade de manuais de laboratório sobre a tecnologia de DNA recombinante que estão amplamente disponíveis. Uma variedade de estratégias estão disponíveis para ligar fragmentos de DNA, a escolha SDA quais depende da natureza SDA terminações dos fragmentos de DNA. É ainda considerado de acordo com a presente invenção incluir em um vetor de ácido nucléico outros elementos de seqüência de nucleotídeo que facilitem a clonagem, expressão ou processamento, por exemplo seqüências que codificam peptídeos de sinal, uma seqüência que codifica KDEL, que é requerido para a retenção de proteínas no retículo endoplasmático ou seqüências que codificam peptídeos de trânsito que direcionam A6-dessaturase ao cloroplasto. Tais seqüências são conhecidas por uma pessoa versada na técnica. Um peptídeo de trânsito otimizado é descrito, por exemplo, por Van den Broeck et al. (1985). As seqüências de sinal procarióticas e eucarióticas são descritas, por exemplo, por Michaelis et al. (1982).

Os polinucieotídeos que codificam as dessaturases desejadas podem ser identificados em uma variedade de modos. Como um exemplo, uma fonte da dessaturase desejada, por exemplo bibliotecas genômicas ou de cDNAde Primula, é triada com sondas detectáveis enzimática ou quimi5 camente sintetizadas, que podem ser fabricadas a partir de DNA, RNA ou nucleotídeos que não ocorrem naturalmente ou misturas dos mesmos. As sondas podem ser enzimaticamente sintetizadas a partir de polinucieotídeos de dessaturases conhecidos por métodos de hibridização de severidade normal ou reduzida. As sondas de oligonucleotídeo também podem ser usa10 das para triar fontes e podem ser fundamentadas em seqüências de dessaturases conhecidas, incluindo seqüências conservadas entre as dessaturases conhecidas ou em seqüências de peptídeo obtidas a partir da proteína purificada desejada. As sondas de oligonucleotídeo com base em seqüências de aminoácido podem ser degeneradas para abranger a degenerescên15 cia do código genético ou podem ser tendenciosas em favor dos códons preferidos do organismo fonte. Os oligonucleotídeos também podem ser usados como iniciadores para a PCR a partir de mRNA transcrito reverso de uma fonte conhecida ou suspeita; o produto de PCR pode ser o cDNA de tamanho natural ou pode ser usado para gerar uma sonda para se obter o cDNA 20 de tamanho natural desejado. Alternativamente, uma proteína desejada pode ser totalmente seqüenciada e a síntese total de um DNA que codifica este polipeptídeo realizada.

Uma vez o DNA genômico ou cDNA desejados tenham sido isolados, estes podem ser seqüenciados pelos métodos conhecidos. É reco25 nhecido na técnica que tais métodos estão sujeitos a erros, tal que o seqüenciamento múltiplo da mesma região é rotina e é ainda esperado levar a taxas mensuráveis de erros na seqüência deduzida resultante, particularmente em regiões tendo domínios repetidos, estruturas secundárias extensivas ou composições base inusitadas, tais como regiões com alto teor de ba30 se GC. Quando discrepâncias surgem, o reseqüenciamento pode ser feito e pode utilizar métodos especiais. Os métodos especiais podem incluir alterar as condições de seqüenciamento usando-se: temperaturas diferentes; enzi21 mas diferentes; proteínas que alteram a capacidade de oligonucleotídeos para formar estruturas de ordem superior; nucleotídeos alterados tais como ITP ou dGTP metilado; composições de gel diferentes, por exemplo adicionando formamida; iniciadores diferentes ou iniciadores localizados em dtè- tâncias diferentes da região problema; ou padrões diferentes tais como DNAs de filamento único. O seqüênciamento de mRNA também pode ser utilizado.

Alguma ou toda da seqüência codificadora para um polipeptídeo tendo atividade de dessaturase pode ser de uma fonte natural. Em algumas situações, entretanto, é desejável modificar toda ou uma porção dos códons, por exemplo, para realçar a expressão, pela utilização de códons preferidos do hospedeiro. Os códons preferidos do hospedeiro podem ser determinados a partir dos códons de freqüência mais .alta nas proteínas expressadas na quantidade maior em uma espécie hospedeira particular e/ou tecido de interesse. Assim, a seqüência codificadora para um polipeptídeo tendo atividade de dessaturase pode ser sintetizada no todo ou em parte. Todo ou porções do DNA também podem ser sintetizados para remover quaisquer seqüências ou regiões de desestabilização de estrutura secundária que estaria presente no mRNA transcrito. Todo ou porções do DNA também podem ser sintetizados para alterar a composição base para uma mais preferível na célula hospedeira desejada. Métodos para sintetizar seqüências e conduzir as seqüências juntas são bem estabelecidos na literatura. A mutagênese e seleção in vitro, mutagênese direcionada ao sítio ou outros meios podem ser utilizadas para obter mutações de genes de dessaturase que ocorrem naturalmente para produzir um polipeptídeo tendo atividade de dessaturase in vivo com parâmetros físicos e cinéticos mais desejáveis para a função na célula hospedeira, tais como uma meia vida mais longa ou uma taxa mais alta de produção de um ácido graxo poliinsaturado desejado.

Uma vez que o polinucleotídeo que codifica um polipeptídeo de dessaturase tenha sido obtido, este é colocado em um vetor capaz de replicação em uma célula hospedeira ou é propagado in vitro por meio de técnicas tais como PCR ou PCR longa. Vetores replicadores podem incluir pias22 mídeos, fago, vírus, cosmídeos e outros. Os vetores desejáveis incluem aqueles úteis para a mutagênese do gene de interesse ou para a expressão do gene de interesse em células hospedeiras. A técnica de PCR longa tem tornado a propagação in vitro de construtos grandes possíveis, de modo que as modificações para o gene de interesse, tais como a mutagênese ou adição de sinais de expressão e propagação dos construtos resultantes possam ocorrer totalmente in vitro sem o uso de um vetor replicador ou de uma célula hospedeira.

Para a expressão de um polipeptídeo de dessaturase, as regiões de iniciação e terminação transcricionais e traducionais funcionais são operavelmente ligadas ao polinucleotídeo que codifica o polipeptídeo de dessaturase. A expressão da região codificadora do polipeptídeo pode ocorrer in vitro ou em uma célula hospedeira. As regiões de iniciação e terminação transcricionais e traducionais são derivadas de uma variedade de fontes não-exclusivas, incluindo o polinucleotídeo a ser expresso, genes conhecidos ou suspeitos de serem capazes de expressão no sistema, vetores de expressão, síntese química ou a partir de um local endógeno em uma célula hospedeira desejados.

A expressão em uma célula hospedeira pode ser realizada em uma maneira transitória ou estável. A expressão transitória pode ocorrer a partir de constructos introduzidos que contenham sinais de expressão funcionais na célula hospedeira, mas constructos estes que não duplicam e raramente se integram na célula hospedeira ou onde a célula hospedeira não é proliferativa. A expressão transitória também pode ser realizada induzindose a atividade de um promotor regulável operavelmente ligado ao gene de interesse, embora tais sistemas indutíveis freqüentemente exibam um nível basal baixo de expressão. A expressão estável pode ser obtida pela introdução de uma constructo que pode integrar no genoma hospedeiro ou que replica autonomamente na célula hospedeira. A expressão estável do gene de interesse pode ser selecionada através do uso de um marcador selecionável localizado no constructo de expressão ou com ela transfectado, seguido pela seleção quanto às células que expressam o marcador. Quando a expressão estável resulta da integração, a integração de constructos pode ocorrer aleatoriamente dentro do genoma hospedeiro ou pode ser alvejado através do uso de constructos contendo regiões de homologia com o genoma hospedeiro suficientes para alvejar a recombinâção com o local hospedeiro. Onde os 5 constructos são alvejados a um local endógeno, todas ou algumas das regiões reguladoras transcricionais e traducionais podem ser fornecidas pelo local endógeno.

Quando a expressão aumentada do polipeptídeo da dessaturase no organismo fonte é desejada, diversos métodos podem ser utilizados. Os 10 genes adicionais que codificam o polipeptídeo da dessaturase podem ser introduzidos no organismo hospedeiro. A expressão do local da dessaturase nativa também pode ser aumentada através da recombinâção homóloga, por exemplo pela inserção de um promotor mais forte no genoma hospedeiro para causar a expressão aumentada, pela remoção de seqüências desesta15 bilizadoras do mRNA ou da proteína codificada pela deleção desta informação do genoma hospedeiro ou pela adição de seqüências estabilizadoras ao mRNA (Patente U.S. N^s 4.910.141).

É considerado que mais do que um polinucleotídeo que codifica uma dessaturase ou um polinucleotídeo que codifica mais do que uma des20 saturase podem ser introduzidos e propagados em uma célula hospedeira através do uso de vetores de expressão epissômicos ou integrados. Onde dois ou mais genes são expressos a partir de vetores que replicam separado, é desejável que cada vetor tenha um meio diferente de replicação. Cada constructo introduzido, seja integrado ou não, deve ter um meio diferente de 25 seleção e deve carecer de homologia aos outros constructos para manter a expressão estável e impedir o reagrupamento de elementos entre os constructos. As escolhas criteriosas de regiões reguladoras, meios de seleção e método de propagação do constructo introduzido podem ser experimentalmente determinados de modo que todos os polinucleotídeos introduzidos 30 sejam expressos aos níveis necessários para fornecer a síntese dos produtos desejados.

Quando necessário para a transformação, a seqüência codifica...... · ··; ··: .·. .·* .1 ϋ 4 -I ·:= :· ··:= dora de Δβ-dessaturase da presente invenção pode ser inserida em um vetor de transformação vegetal, por exemplo o vetor binário descrito por Bevan (1984). Os vetores de transformação vegetal podem ser derivados pela modificação do sistema de transferência de gene natural de Agrobacterium tumefaciens. O sistema natural compreende plasmídeos Ti (indutores de tumor) grandes contendo um segmento grande, conhecido como T-DNA, que é transferido para as plantas transformadas. Um outro segmento do plasmídeo Ti, a região vir, é responsável pela transferência de T-DNA. A região de T-DNA é limitada pelas repetições de terminal. Nos vetores binários modificados os genes indutores de tumor foram suprimidos e as funções da região vir são utilizadas para transferir o DNA estranho limitado pelas seqüências limitadoras de T-DNA. A região T também contém um marcador selecionável para a resistência a antibiótico e um sítio de clonagem múltipla para inserir seqüências a transferir. Tais cepas engenheiradas são conhecidas como cepas de A. tumefaciens desarmadas e permitem a transformação eficiente DAS seqüências limitadas pela região T nos genomas nucleares de plantas.

A invenção objeto encontra muitas aplicações. As sondas com base nos polinucleotídeos da presente invenção pode encontrar uso em métodos para isolar moléculas relacionadas ou em métodos para detectar organismos que expressam dessaturases. Quando usados como sondas, os polinucleotídeos ou oligonucleotídeos devem ser detectáveis. Isto é usualmente realizado ligando-se um rótulo em um sítio interno, por exemplo por intermédio da incorporação de um resíduo modificado ou nos términos 5’ ou 3’. Tais rótulos podem ser diretamente detectáveis, podem se ligar a uma molécula secundária que seja detectavelmente rotulada ou pode ligar-se a uma molécula secundária não-rotulada e uma molécula terciária detectavelmente rotulada; este processo pode ser estendido tão longo como seja prático para se obter um sinal satisfatoriamente detectável sem níveis inaceitáveis de sinal de fundo. Os sistemas secundários, terciários ou que se ligam em ponte podem incluir o uso de anticorpos direcionados contra qualquer outra molécula, incluindo rótulos ou outros anticorpos ou pode envolver quaisquer moléculas que se ligam entre si, por exemplo um sistema de bioti25 na-estreptavidina/avidina. Os rótulos detectáveis tipicamente incluem isótopos radioativos, moléculas que produzem química ou enzimaticamente ou alteram a luz, enzimas que produzem produtos de reação detectáveis, moléculas magnéticas, moléculas fluorescentes ou moléculas cuja fluorescência ou características emissoras de luz mudam na ligação. Os exemplos de métodos de rotulação podem ser encontrados na Patente U.S. N^Q 5.011.770. A Item ativa mente, a ligação de moléculas alvo pode ser direta mente detectada medindo-se a mudança no calor da solução na ligação da sonda a alvejar por intermédio da calorimetria de titulação isotérmica ou pelo revestimento da sonda ou alvo em uma superfície e detectar a mudança na dispersão da luz da superfície produzida pela ligação do alvo ou sonda, respectivamente, como pode ser feito com o sistema BlAcore.

Constructros compreendendo o gene de interesse podem ser introduzidos em uma célula hospedeira pelas técnicas padrão. Por conveniência, uma célula hospedeira que foi manipulada por qualquer método para aceitar uma seqüência ou constructo de DNA será aqui aludida como transformada ou recombinante. O hospedeiro objeto terá pelo menos uma cópia do constructo de expressão e pode ter duas ou mais, por exemplo, dependendo se o gene está integrado no genoma, amplificado ou está presente em um elemento extracromossômico tendo números de cópia múltiplos.

A célula hospedeira transformada pode ser identificada pela seleção por um marcador contido no constructo introduzido. Alternativamente, um constructo de marcador separado pode ser introduzido com o constructo desejado, como muitas técnicas de transformação introduzem muitas moléculas de DNA em células hospedeiras. Tipicamente, os hospedeiros transformados são selecionados quanto a sua capacidade para crescer em meio seletivo. Os meios seletivos podem incorporar um antibiótico ou carecer de um fator necessário para o crescimento do hospedeiro não-transformado, tal como um nutriente ou fator de crescimento. Um gene marcador introduzido portanto pode conferir resistência a antibiótico ou codificar um fator de crescimento ou enzima essenciais e permitir o crescimento em meios seletivos quando expressos no hospedeiro transformado. A seleção de um hospedeiro transformado também pode ocorrer quando a proteína marcadora expressa pode ser detectada, direta ou indireta mente. A proteína marcadora pode ser expressa sozinha ou como uma fusão a uma outra proteína. A proteína marcadora pode ser detectada pela sua atividade enzimática; por exémplo, a 5 beta-galactosidase pode converter o substrato X-gal a um produto colorido e a luciferase pode converter a luciferina a um produto que emite luz. A proteína marcadora pode ser detectada pelas suas características produtoras de luz ou modificadoras; por exemplo, a proteína fluorescente verde de Aequorea victoria fluoresce quando iluminada com luz azul. Anticorpos podem ser 10 usados para detectar a proteína marcadora ou um rótulo molecular, por exemplo, em uma proteína de interesse. As células que expressam a proteína marcadora ou rótulo podem ser selecionadas, por exemplo, visualmente ou por técnicas tais como FACS ou panning usando anticorpos. Desejável mente, a resistência à canamicina e o aminoglicosídeo G418 são de interesse, 15 assim como a capacidade para cultivar no meio que carece de uracila, leucina, lisina ou triptofano.

De interesse particular é a produção mediada pela Δ6dessaturase de PUFA’s em células hospedeiras eucarióticas. As células eucarióticas incluem células vegetais, tais como aquelas de plantas de colheita 20 que produzem óleo e outras células sensíveis à manipulação genética incluindo células fúngicas. As células podem ser cultivadas ou formadas como parte ou todo de um organismo hospedeiro incluindo uma planta. Em uma modalidade preferida, o hospedeiro é uma célula vegetal que produz e/ou pode assimilar exogenamente o(s) substrato(s) fornecido(s) para uma Δ625 dessaturase e preferivelmente produz quantidades grandes de um ou mais dos substratos.

A célula hospedeira transformada é cultivada sob condições apropriadas adaptadas para um resultado final desejado. Para as células hospedeiras crescerem em cultura, as condições são tipicamente otimizadas 30 para produzir o maior ou o mais econômico rendimento de PUFA’s, que diz respeito à atividade selecionada de dessaturase. As condições dos meios que podem ser otimizadas incluem: fonte de carbono, fonte de nitrogênio, adição de substrato, concentração final de substrato adicionado, forma de substrato adicionado, cultivo aeróbico ou anaeróbico, temperatura do cultivo, agente indutor, temperatura da indução, fase de crescimento na indução, fase de crescimento na colheita, pH, densidade e manutenção de seleção.

Um outro aspecto da presente invenção fornece plantas transgênicas ou progênie de plantas contendo o DNA isolado da invenção. As plantas tanto monocotiledôneas e dicotiledôneas são consideradas. As células vegetais são transformadas com um DNA isolado que codifica a Δ6dessaturase por qualquer método de transformação de planta. A célula vegetal transformada, frequentemente em uma cultura de calo ou disco de folha, é regenerada em uma planta transgênica completa pelos métodos bemconhecidos por uma pessoa versada nma técnica(por exemplo Horsch et aí, 1985). Em uma modalidade, a planta transgênica é selecionada do grupo consistindo em Arabidopsis thaliana, canola, soja, soja, colza, girassol, algodão, cacau, amendoim, açafroa, coco, linho, óleo de palma, semente oleaginosa de Brassica napus, milho, jojoba, árvore do sebo, tabaco, plantas frutíferas, plantas cítricas ou plantas que produzem nozes e bagas. Visto que a progênie de plantas transformadas herdam o polinucleotídeo que codifica a A6-dessaturase, as sementes ou cortes DAS plantas transformadas podem ser usados para manter a linhagem de planta transgênica.

A presente invenção ainda fornece um método para fornecer plantas transgênicas com um teor aumentado de ALA e/ou SDA. Este método inclui, por exemplo, introduzir DNA que codifica a A6-dessaturase em células vegetais que carecem ou têm níveis baixos de SDA mas contêm ALA e regenerar as plantas com teor de SDA aumentado a partir DAS células transgênicas. Em certas modalidades da invenção, um DNA que codifica uma Δ15- e/ou A12-dessaturase também pode ser introduzido nas células vegetais. Tais plantas também podem compreender ou não atividade de Δ12- e/ou Δΐδ-dessaturase endógena. Em certas modalidades, as plantas de colheita comercialmente cultivadas modificadas são consideradas como o organismo transgênico, incluindo, mas não limitado a, Arabidopsis thaliana, canola, soja, soja, colza, girassol, algodão, cacau, amendoim, açafroa, coco, linho, óleo de palma, semente oleaginosa de Brassica napus, milho, jojoba, árvore do sebo, tabaco, plantas frutíferas, plantas cítricas ou plantas que produzem nozes e bagas.

A presente invenção ainda fornece um método para fornecer plantas transgênicas que podem conter níveis elevados de ALA e/ou SDA, em que os ditos níveis elevados são maiores do que os níveis encontrados em plantas não-transformadas. Os vetores de expressão compreendendo DNA que codifica uma A6-dessaturase, e/ou uma A12-dessaturase e/ou uma A15-dessaturase, podem ser construídos pelos métodos da tecnologia recombinante conhecidos por uma pessoa versada nma técnica(Sambrook et al., 2001). Em particular, plantas de colheita comercialmente cultivadas são consideradas como o organismo transgênico, incluindo, mas não limitado a, Arabidopsis thaliana, canola, soja, soja, colza, girassol, algodão, cacau, amendoim, açafroa, coco, linho, óleo de palma, semente oleaginosa Brassica napus e milho.

Para a suplementação dietética, os PUFAs purificados, as plantas ou partes de planta ou derivados destas transformados, podem ser incorporados em óleos para cozinhar, gorduras ou margarinas formuladas de modo que no uso normal o receptor possa receber a quantidade desejada. As PUFAs também podem ser incorporadas em fórmulas infantis, suplementos nutricionais ou outros produtos alimentícios e podem encontrar uso como agentes antiinflamatórios ou que abaixam o colesterol.

Como aqui usado, composição comestível é definido como composições que possam ser ingeridas por um mamífero tais como gêneros alimentícios, substâncias nutricionais e composições farmacêuticas. Como aqui usado gêneros alimentícios refere-se às substâncias que podem ser usadas ou preparadas para o uso como alimento para um mamífero e incluem substâncias que podem ser usadas na preparação de alimento (tais como óleos de fritura) ou aditivos alimentícios. Por exemplo, gêneros alimentícios incluem os animais usados para o consumo humano ou qualquer produto destes, tais como, por exemplo, ovos. Os gêneros alimentícios típicos incluem mas não são limitados às bebidas, (por exemplo, refrigerantes, bebi29 das carbonatadas, bebidas prontas para o uso), alimentos infundidos (por exemplo frutas e vegetais), molhos, condimentos, temperos de salada, sucos de fruta, xaropes, sobremesas (por exemplo, pudins, gelatina, glacês e recheios, mercadorias de panificação e sobremesas congeladas tais como sorvetes e sorvetes de frutas), produtos congelados moles (por exemplo, cremes congelados moles, sorvetes e iogurtes congelados moles, coberturas congeladas moles tais como coberturas batidas de leite ou que não de leite), óleos e produtos emulsificados (por exemplo, manteiga para fazer bolos, margarina, maionese, manteiga, óleo para cozinhar e temperos de salada) e alimentos úmidos intermediários (por exemplo, arroz e alimentos para cães).

Além disso, as composições comestíveis aqui descritas também podem ser ingeridas como um aditivo ou suplemento contido em alimentos e bebidas. Estas podem ser formuladas juntas com uma substância nutricional tal como várias vitaminas e minerais e incorporadas em composições substancialmente líquida tais como bebidas nutrientes, leites de soja e sopas; composições substancialmente sólidas; e gelatinas ou usadas na forma de um pó a ser incorporado em vários alimentos. O teor do ingrediente eficaz em um tal alimento funcional ou saudável pode ser similar à dose contida em um agente farmacêutico típico.

Os PUFAs purificados, plantas ou partes de planta transformadas também podem ser incorporadas em ração animal, particularmente de animais de criação. Deste modo, os próprios animais podem se beneficiar de uma dieta rica em PUFA, enquanto os consumidores humanos de produtos alimentícios produzidos a partir de tais animais de criação também podem se beneficiar. É esperado em certas modalidades que o DAS será convertido a EPA em animais e assim tais animais podem se beneficiar de um aumento no EPA pelo consumo de SDA.

Para o uso farmacêutico (humano ou veterinário), as composições no geral podem ser administradas oralmente mas podem ser administradas por qualquer via pela qual elas possam ser absorvidas com sucesso, por exemplo, parenteral (isto é, subcutânea, intramuscular ou intravenosamente), retal, vaginal ou topicamente, por exemplo, como um ungüento para a pele ou loção. As plantas ou partes de planta transformadas com PUFAs da presente invenção podem ser administradas sozinhas ou em combinação com um veículo ou excipiente farmaceuticamente aceitáveis. Onde disponíveis, cápsulas de gelatina são a forma preferida de administração oral. A suplementação dietética como apresentada acima também pode fornecer uma via oral de administração. Os ácidos insaturados da presente invenção podem ser administrados em formas conjugadas ou como sais, ésteres, amidas ou pró-fármacos dos ácidos graxos. Qualquer sal farmaceuticamente aceitável está abrangido pela presente invenção; especialmente preferidos 10 são os sais de sódio, potássio ou lítio. Também abrangidos são os sais de N-alquilpoliidroxamina, tais como N-metil glucamina, encontrados na publicação PCT WO 96/33155. Os ésteres preferidos são os ésteres etílicos. Como sais sólidos, os PUFAs também podem ser administrados na forma de comprimido. Para a administração intravenosa, os PUFAs ou derivados des15 tes podem ser incorporados em formulações comerciais tais como intralipídeos.

Se desejado, as regiões de um polipeptídeo de dessaturase importante para a atividade de dessaturase podem ser determinadas através da mutagênese de rotina seguida pela expressão dos polipeptídeos mutan20 tes resultantes e determinação de suas atividades. Os mutantes podem incluir substituições, deleções, inserções e mutações pontuais ou combinações destes. As substituições podem ser feitas com base na hidrofobicidade ou hidrofilicidade conservadas (Kyte e Doolittle, 1982) ou com base na capacidade para assumir estrutura secundária de polipeptídeo similar (Chou e 25 Fasman, 1978). Uma análise funcional típica começa com a mutagênese de deleção para determinar os limites dos terminais N e C da proteína necessária para a função e depois deleções, inserções ou mutantes pontuais internos são feitos para determinar mais regiões necessárias para a função. Outras técnicas tais como mutagênese de cassete ou síntese total também po30 dem ser usadas. A mutagênese de deleção é realizada, por exemplo, usando-se exonucleases para remover seqüencialmente as regiões codificadoras 5’ ou 3’. Kits são disponíveis para tais técnicas. Depois da deleção, a região codificadora é completada pela ligação de oligonucleotídeos contendo codons de início ou parada à região codificadora deletada depois da deleção de 5’ ou 3’, respectivamente. Alternativa mente, oligonucleotídeos que codificam códons de início ou partida são inseridos na região codificadora por uma variedade de métodos incluindo mutagênese direcionada ao sítio, PCR mutagênica ou pela ligação no DNA digerido nos sítios de restrição existentes.

As deleções internas podem ser similarmente fabricadas através de uma variedade de métodos incluindo o uso de sítios de restrição existentes no DNA, pelo uso de inicíadores mutagênicos por intermédio da mutagênese direcionada ao sítio ou PCR mutagênica. As inserções são feitas através de métodos tais como mutagênese de triagem de ligante, mutagênese direcionada ao sítio ou PCR mutagênica. As mutações pontuais são feitas através de técnicas tais como mutagênese direcionada ao sítio ou PCR mutagênica. A mutagênese química também pode ser usada para identificar regiões de um polipeptídeo de dessaturase importante para a atividade. Tal análise de estrutura-função pode determinar quais regiões podem ser deletadas, quais regiões toleram inserções e quais mutações pontuais permite que a proteína mutante funcione substancialmente do mesmo modo como a dessaturase nativa. Todas de tais proteínas mutantes e seqüências de nucleotídeo que as codificam estão dentro do escopo da presente invenção.

Como aqui descrito acima, certas modalidades da invenção corrente dizem respeito aos constructos de transformação vegetal. Por exemplo, um aspecto da invenção corrente é um vetor de transformação vegetal compreendendo um ou mais genes ou cDNAs da dessaturase. As seqüências codificadoras exemplares para o uso com a invenção incluem Δ6dessaturase de Prímula juliae (SEQ ID NOs: 2 e 3). Em certas modalidades, as seqüências de dessaturase de anti-sentido também podem ser utilizados com a invenção. As dessaturases exemplares que codificam ácidos nucléicos incluem pelo menos 20, 40, 80, 120, 300 e até o comprimento natural DAS seqüências de ácido nucléico da SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO: 25, SEQ ID NO: 45 ou SEQ ID NO: 47.

Em certos aspectos, um ácido nucléico pode codificar 1, 2, 3, 4 ou mais enzimas de dessaturase. Em modalidades particulares, um ácido nucléico pode codificar uma Δ6- e uma A15-dessaturase.

Vetores usados para a transformação vegetal podem incluir, por exemplo, plasmídeos, cosmídeos, YACs (cromossomas de levedura artificial), BACs (cromossomas artificiais bacterianos) ou qualquer outro sistema de clonagem adequado, assim como fragmentos de DNA destes. Assim quando o termo vetor” ou vetor de expressão é usado, todos os tipos anteriores de vetores, assim como as seqüências de ácido nucléico isoladas destes, são incluídos. É considerado que a utilização de sistemas de clonagem com capacidades de inserto grandes permitirão a introdução de seqüências de DNA grandes compreendendo mais do que um gene selecionado. De acordo com a invenção, isto pode ser usado para introduzir vários ácidos nucléicos que codificam dessaturase. A introdução de tais seqüências pode ser facilitada pelo uso de cromossomas bacterianos ou de levedura artificiais (BACs ou YACs, respectivamente) ou ainda cromossomas artificiais vegetais. Por exemplo, o uso de BACs para a transformação mediada por Agrobacterium foi divulgado por Hamilton et al. (1996).

Particularmente úteis para a transformação são os cassetes de expressão que foram isolados a partir de tais vetores. Os segmentos de DNA usados para transformar células vegetais, naturalmente, no geral compreenderão o cDNA, gene ou genes que se deseja introduzir e ter expressos nas células hospedeiras. Estes segmentos de DNA podem ainda incluir estruturas tais como promotores, realçadores, poliligantes ou mesmo genes reguladores como desejado. O segmento de DNA ou gene escolhido para a introdução celular freqüentemente codificará uma proteína que será expressa nas células recombinantes resultantes que resultam em um trato triável ou selecionável e/ou que comunicará um fenótipo melhorado à planta transgênica resultante. Entretanto, este pode não ser sempre o caso e a presente invenção também abrange plantas transgênicas que incorporam transgenes não-expressados. Os componentes preferidos prováveis de serem incluídos com vetores usados na invenção atual são como segue.

Em uma modalidade a presente invenção utiliza certos promotores. Os exemplos de tais promotores que podem ser usados com a presente invenção incluem, mas não são limitados ao 35S de CaMV (vírus mosaico da couve-flor), 34S de FMV (vírus mosaico da escrofulária) (ver, por exemplo, a Patente U.S. N^s 5.378.619, os conteúdos da qual são aqui incorporados na sua totalidade), Napin (de Brass/ca), 7S (da soja), Globulin e Lec (do milho). O promotor napin e os promotores que são regulados durante a maturação da semente vegetal são de interesse particular para o uso com a presente invenção. Todos de tais promotores e elementos reguladores transcricionais, isoladamente ou em combinação, são considerados para o uso nos presentes vetores de expressão replicáveis e são conhecidos por uma pessoa versada na técnica.

A seqüência de DNA entre o sítio de início de transcrição e o início da seqüência codificadora, isto é, a seqüência líder não-traduzida, também pode influenciar a expressão do gene. Pode-se assim desejar utilizar uma seqüência líder particular com um constructos de transformação da invenção. As seqüências líderes preferidas são consideradas incluir aquelas que compreendem seqüências prognosticadas para direcionar a expressão ótima do gene ligado, isto é, incluem uma seqüência líder de consenso preferida que pode aumentar ou manter a estabilidade do mRNA e prevenir o início inadequado da tradução. A escolha de tais seqüências serão conhecidas por aqueles versados na técnica considerando-se a presente descrição. As seqüências que são derivadas de genes que são altamente expressos em plantas tipicamente serão preferidas.

Os constructos de transformação preparados de acordo com a invenção tipicamente incluirão uma seqüência de DNA de extremidade 3’ que atua como um sinal para terminar a transcrição e permitir a poliadenilação do mRNA produzido pelas seqüências codificadoras operavelmente ligadas a um gene de dessaturase (por exemplo, cDNA). Em uma modalidade da invenção, o terminador nativo de um gene da dessaturase é usado. Alternativa mente, uma extremidade 3’ heteróloga pode realçar a expressão de regiões codificadoras de dessaturase. Os exemplos de termina34 dores julgados serem úteis incluem aqueles do gene da nopalina sintase de Agrobacterium tumefaciens (extremidade 3’ nos) (Bevan et a/., 1983), o terminador para o transcrito T7 do gene da octopina sintase de Agrobacterium tumefaciens, a extremidade 3’ dos genes I ou II inibidores da protease de batata ou tomate e o terminador do 35S de CaMV (tml3’). Elementos reguladores tais como um intron Adh (Callis et al., 1987), íntron da sacarose sintase (Vasil et al,, 1989) ou elemento ômega TMV (Gallie et al., 1989), podem ser ainda incluídos onde desejado.

Utilizando-se uma proteína marcadora selecionável ou triável, pode-se fornecer ou realçar a capacidade para identificar transformantes. Genes marcadores são genes que comunicam um fenótipo distinto às células que expressam a proteína marcadora e assim permitem que tais células transformadas sejam distinguidas DAS células que não têm o marcador. Tais genes podem codificar um marcador selecionável ou triável, dependendo se o marcador confere um traço que se possa selecionar por meios químicos, isto é, através do uso de um agente seletivo (por exemplo, um herbicida, antibiótico ou coisa parecida) ou se ele é simplesmente um traço que se possa identificar através da observação ou teste, isto é, pela triagem (por exemplo, a proteína fluorescente verde). Naturalmente, muitos exemplos de proteínas marcadoras adequadas são conhecidas na técnica e podem ser utilizadas na prática da invenção.

Acredita-se que os métodos adequados para a transformação de célula vegetal ou outras células para o uso com a invenção corrente incluam virtualmente qualquer método pelo qual o DNA possa ser introduzido em uma célula, tal como pela liberação direta de DNA tal como pela transformação mediada por PEG de protoplastos (Omirulleh et al., 1993), pela captação de DNA mediada pela dessecação/inibição (Potrykus et al., 1985), pela eletroporação (Patente U.S. N^s 5.384.253, especifica mente aqui incorporada por referência em sua totalidade), pela agitação com fibras de carbeto de silício (Kaeppler et al., 1990; Patente U.S. N- 5.302.523, especificamente aqui incorporada por referência em sua totalidade; e Patente U.S. N5.464.765, especifica mente aqui incorporada por referência em sua totalida35 de), por transformação mediada por Agrobacterium (Patente U.S. N^Q5.591.616 e Patente U.S. N^Q 5.563.055; ambas especificamente aqui incorporadas por referência) e pela aceleração de partículas revestidas com DNA (Patente U.S. N^Q 5.550.318; Patente U.S. N^e 5.538.877; e Patentees. N5.538.880; cada uma especificamente aqui incorporada por referência em sua totalidade), etc. Através da aplicação de técnicas tais como estas, as células virtualmente de qualquer espécie vegetal pode ser estavelmente transformada e estas células desenvolvidas em plantas transgênicas.

Depois de efetuar a liberação de DNA exógeno às células receptoras, as etapas seguintes no geral dizem respeito à identificação das células transformadas para cultivo e regeneração de planta adicionais. De modo a melhorar a capacidade para identificar transformantes, pode-se desejar utilizar um marcador selecionável ou gene triável com um vetor de transformação preparado de acordo com a invenção. Neste caso, poder-se-ia depois no geral ensaiar a população de célula potencialmente transformada expondo-se as células a um agente ou agentes seletivos ou poder-se-ia triar as células quanto ao traço do gene marcador desejado.

As células que sobrevivem à exposição ao agente seletivo ou as células que foram classificadas positivas em um ensaio de triagem, podem ser cultivadas em meios que sustentam a regeneração de plantas. Em uma modalidade exemplar, os meios MS e N6 podem ser modificados pela inclusão de outras substâncias tais como reguladores do crescimento. Um de tais reguladores do crescimento é dicamba ou 2,4-D. Entretanto, outros reguladores do crescimento podem ser utilizados, incluindo NAA, NAA + 2,4-D ou picloram. A melhora de meios desta ou de outras maneiras tem sido descoberto facilitar o crescimento de células em estágios de desenvolvimentos específicos. O tecido pode ser mantido em um meio básico com reguladores do crescimento até que tecido suficiente estivesse disponível para começar os esforços de regeneração da planta ou seguir rodadas repetidas de seleção manual, até que a morfoíogia do tecido fosse adequada para a regeneração, tipicamente pelo menos 2 semanas, depois transferido para meios condutivos à maturação de embrióides. As culturas são transferidas a cada 2 semanas neste meio. O desenvolvimento de broto sinalizará o tempo para transferir para o meio que carece de reguladores do crescimento.

Para confirmar a presença do DNA exógeno ou transgene(s) nas plantas regeneradas, uma variedade de ensaios pode ser realizada. Tais ensaios incluem, por exemplo, ensaios biológicos moleculares, tais como Southern e Northern blotting e PCR®; ensaios bioquímicos, tais como a detecção da presença de um produto de proteína, por exemplo, por meios imunológicos (ELISAs e Western blots) ou pela função enzimática; ensaios de parte de planta, tais como ensaios de folha ou raiz; e também, pela análise do fenótipo da planta regenerada inteira.

Além de direcionar a transformação de um genótipo vegetal particular com um constructo preparado de acordo com a invenção corrente, as plantas transgênicas podem ser artificialmente produzidas cruzando-se uma planta tendo um DNA selecionado da invenção com uma segunda planta que careça do DNA. As técnicas de geração de planta também podem ser usadas para introduzir dessaturases múltiplas, por exemplo Δ6, Δ12, e/ou Δ15-dessaturase(s) em uma única planta. Desta maneira, a Δ6-ύβ883ΐυΓ35β pode ser eficazmente super-regulada. Pela criação de plantas homozigóticas para uma atividade de Δβ-dessaturase e/ou outra atividade de dessaturase (por exemplo, atividade de Δ12- e/ou A15-dessaturase) metabolites benéficos podem ser aumentados na planta.

Como apresentado acima, um gene da dessaturase selecionado pode ser introduzido em uma variedade de planta particular pelo cruzamento, sem a necessidade quanto a sempre transformar diretamente uma planta daquela variedade dada. Portanto, a invenção corrente não apenas abrange uma planta diretamente transformada ou regenerada a partir das células que foram transformadas de acordo com a invenção corrente, mas também a progênie de tais plantas. Como aqui usado o termo progênie denota a descendência de qualquer geração de uma planta precursora preparada de acordo com a presente invenção, em que a progênie compreende um constructo de DNA selecionado preparado de acordo com a invenção. Cruzar uma planta para fornecer uma linhagem de planta tendo um ou mais trans37 genes ou alelos adicionados relativa a uma linhagem de planta de partida, como aqui divulgado, é definido como as técnicas que resultam em uma seqüência particular sendo introduzida em uma linhagem de planta pelo cruzamento de uma linhagem de partida com uma linhagem de planta doadora que compreenda um transgene ou alelo da invenção. Para se obter isto, por exemplo, pode-se realizar as seguintes etapas: (a) sementes de planta das primeira (linhagem de partida) e segunda (linhagem de planta doadora que compreende um transgene ou alelo desejados) plantas precursoras; (b) cultivar as sementes da primeira e segunda plantas precursoras em plantas que carregam flores; (c) polinizar uma flor da primeira planta precursora com o pólen da segunda planta precursora; e (d) colher as sementes produzidas na planta precursora que carrega a flor fertilizada.

O retrocruzamento é aqui definido como o processo incluindo as etapas de: (a) cruzar uma planta de um primeiro genótipo contendo um gene, seqüência de DNA ou elemento desejados para uma planta de um segundo genótipo que carece o dito gene, seqüência de DNA ou elemento desejados; (b) selecionar uma ou mais plantas da progênie contendo o gene, seqüência de DNA ou elemento desejados; (c) cruzar a planta progênie com uma planta do segundo genótipo; e (d) repetir as etapas (b) e (c) com o propósito de transferir uma seqüência de DNA desejada de uma planta de um primeiro genótipo para uma planta de um segundo genótipo.

A introgressão de um elemento de DNA em um genótipo vegetal é definida como o resultado do processo de conversão retrocruzada. Um genótipo vegetal no qual uma seqüência de DNA foi introgredida pode ser aludido como um genótipo, linhagem, congênito ou híbrido convertidos por retrocruzamento. Similarmente um genótipo vegetal que carece da seqüência de DNA desejada pode ser aludida como um genótipo, linhagem, congênito ou híbrido não-convertidos.

Exemplos

Os seguintes exemplos são incluídos para ilustrar modalidades da invenção. Deve ser avaliado por versado na técnica que as técnicas divulgadas nos exemplos que seguem representam técnicas descobertas pelo inventor para funcionar bem na prática da invenção. Entretanto, aqueles versados na técnica devem, considerando a presente descrição, avaliar que muitas mudanças podem ser feitas nas modalidades específicas que são divulgadas e ainda obter um resultado igual ou similar sem divergir do conceito, espírito e escopo da invenção. Mais especifica mente, estará evidente que certos agentes que estão tanto química quanto fisiologicamente relacionados podem ser substituídos no lugar dos agentes aqui descritos embora os mesmos resultados ou similares seriam obtidos. Todos de tais substitutos e modificações similares evidentes àqueles versados na técnica são considerados como estando dentro do espírito, escopo e conceito da invenção como definido pelas reivindicações anexas.

Exemplo 1

Clonagem de Seqüências da Δ6 Dessaturase de Primula juliae

A clonagem da Δ6 dessaturase de Primula juliae (PjD6D) foi obtida pela amplificação pela PCR de uma região de DNA genômico interno parcial usando oligonucleotídeos degenerados, seguidos pela marcha genômica bidirecional. O DNA genômico total foi isolado de P. juliae (Collector’s Nursery, Battleground WA) usando o Kit DNeasy Plant Mini (Qiagen, Valencia, CA), seguindo o procedimento do fabricante. Inicialmente, um fragmento de 552 pares de base que corresponde às posições 687 a 1238 da SEQ ID NO: 1 foi isolado usando oligonucleotídeos degenerados BO-1 For e BO-2 Rev como descrito por Garcia-Maroto et al. (2002). O fragmento foi clonado em pCR®4-TOPO® (Invitrogen, Carlsbad, CA) para produzir o vetor pMON83955 e o inserto foi seqüenciado. As seqüências iniciadoras BO-1 For e BO-2 Rev foram como segue:

BO-1 For: 5-ATMAGYATYGGTTGGTGGAARTGG-3’ (SEQ ID NO: 6) BO-2 Rev: 5’-AATCCACCRTGRAACCARTCCAT-3’ (SEQ ID NO: 7)

Para determinar a seqüência flanqueadora genômica do inserto de pMON83955, um Kit Universal Genome Walker® (BD Biosciences, Palo Alto, CA) foi utilizado, seguindo o procedimento do fabricante. Quatro bibliotecas genômicas de P. juliae foram geradas pela digestão do DNA com quatro enzimas de restrição: EcoRV, Pvull, Stul e Dral. Depois de uma etapa de φ

purificação, as digestões foram ligadas a um adaptador fornecido no kit. O procedimento depois envolveu duas reações de PCR, cada uma com um iniciador específico de gene e um iniciador adaptador. A reação de PCR secundária usou uma diluição dos produtos da reação de PCR primária como um padrão. Para a direção 5’, iniciadores PD6D R8 e PD6D R2 foram usados para as reações de PCR primária e secundária, respectivamente. Para a direção 3’, iniciadores PD6D F8 e PD6D F3 foram usados para as reações PCR primária e secundária, respectivamente. As sequências iniciadoras são dadas abaixo:

PD6D R8: 5 -CACACATGACCGGATAAAACGACCAGT-3’ (SEQ ID NO: 8) PD6D R2: 5’-GGGAATGTACTGGAGGTCAGGGTCGTA-3’ (SEQ ID NO: 9) PD6D F8: 5-CGTGCAGTTCAGCTTGAACCATTTCTC-3’ (SEQ ID NO: 10) PD6D F3: 5’-TGCAGGGACACTCAACATATCGTGCCC-3’ (SEQ ID NO: 11)

A marcha genômica na direção 5’ produziu um fragmento de 574 pares de base a partir da biblioteca EcoRV. Este produto foi clonado no pCR®4-TOPO® (Invitrogen) dando pMON83956 e o inserto foi seqüenciado. A sequência resultante não contém um códon de partida do gene da delta 6 dessaturase putativa e assim um outro conjunto de reações de PCR foi realizada usando iniciadores específicos de gene planejados para caminhar na direção 5’ do inserto pMON83956. Os iniciadores usados para o segundo conjunto de genoma que caminha na direção 5’ foram PD6D R15 e PD6D R14 para as reações de PCR primária e secundária, respectivamente. As sequências são dadas abaixo:

PD6D R15: 5’- GTAGGTTGGTGGAGAAGGGAGGGAGGA-3’ (SEQ ID NO: 12) PD6D R14: 5’-GGAAGGGGGATGGTAAGCGAGGAAAGC-3’ (SEQ ID NO: 13)

Um produto de 328 pares de base no comprimento da biblioteca Stul foi clonado em pCR^@4-TOPO^@ (Invitrogen) dando pMON83958 e o inserto foi seqüenciado. Este inserto conteve 2 códons de partida potenciais, 44 bases à parte. O primeiro códon de partida corresponde à posição 87 e o segundo à posição 135 da SEQ ID NO: 1. A marcha genômica na direção 3’ resultou em um fragmento de 773 pares de base da biblioteca Dral. Este produto foi clonado no pCR^@4-TOPO®, dando pMON83957. O inserto foi se40 qüenciado e descoberto conter 292 pares de base da região codificadora para o gene da delta 6 dessaturase putativo, seguidos por um códon de parada na posição 1473 com respeito à SEQ ID NO: 1.

Os insertos de pMON83955, pMON83956, pMON83957 e pMON83958 foram alinhados para formar uma seqüência compósita, SEQ ID NO: 1. Três iniciadores foram planejados para amplificar pela PCR 2 comprimentos diferentes da seqüência codificadora do DNA genômico de P. juliae, refletindo os dois códons de partida encontrados em pMON83958. A mais longa das duas seqüências, a PjD6D-1, foi amplificada usando o iniciador avançado Pj D6D F2 e o iniciador reverso Pj D6D R1. A mais curta das duas, PjD6D-2, foi amplificada usando o iniciador avançado Pj D6D F1 e o iniciador reverso Pj D6D R1. As duas seqüências codificadoras da delta 6 dessaturase putativas foram cada uma depois ligadas no vetor de expressão de levedura pYES2.1-TOPO. No seqüênciamento, o plasmídeo contendo PjD6D-1 foi designado pMQN83950 (SEQ ID NO: 3) e o plasmídeo contendo PjD6D-2 foi designado pMON67011 (SEQ ID NO: 2). As seqüências iniciadoras são dadas abaixo:

Pj D6D F2: 5’-GTCGACATGGAAAACACATTTTCACCACCACCT-3’ (SEQ ID NO: 14)

Pj D6D F1: 5 -GTCGACATGACTAAGACCATTTACATAACCAGC-3’ (SEQ ID NO: 15) Pj D6D R1: 5’-CCTGCAGGTCACCCGACATTTTTAACAGCCTCC C-3’ (SEQ ID NO: 16)

Os dois clones da PjA6 dessaturase, PjD6D-2 e PjD6D-1, codificam polipeptídeos potenciais de 446 aminoácidos e 462 aminoácidos, dados na SEQ ID NO: 4 e SEQ ID NO: 5, respectivamente. O sítio MET inicial da seqüência de peptídeo mais curta (PjD6D-2) está localizado 16 aminoácidos a jusante do primeiro sítio MET da seqüência mais longa (PjD6D-1). A 3’ do segundo MET, as seqüências são idênticas. Estas seqüências têm alta similaridade a outras Δ6 dessaturases vegetais (FIGURA 1), incluindo um domínio b5 de citocromo de terminal N que é encontrado em todas as dessaturases de extremidades anteriores (Napier et al., 2003). Dentro do domínio b5 de citocromo é encontrado os oito resíduos invariáveis característicos da superfamília b5 de citocromo e o motivo heme de ligação H-P-G-G, que foi mostrado ser essencial para a atividade enzimática (Napier et aí, 1997, Sayanova et al, 1999, Sperling e Heinz 2001)? Dentro do domínio da dessaturase da dessaturase PjD6D putativa estão três caixas de histidina conservada que são características de todas dessaturases ligadas à membrana (Shanklin et al., 1994). Uma característica distintiva encontrada em todas as dessaturases de extremidade frontal é que a terceira caixa de histidina contém um resíduo de glutamina na primeira posição (Q-x-x-H-H) ao invés de uma histidina (Napier et al., 1997, Napier et al., 2003, Sperling e Heinz 2001). A seqüência de aminoácido deduzida do PjD6D teve aproximadamente 88% de identidade com as dessaturases de Prímula vialii e P. farínosa e aproximadamente 64% de identidade com as dessaturases de Echium pltardll e E. gentianoides. A inspeção visual do alinhamento de seqüência múltipla mostrado na FIGURA 1 sugere que a seqüência de Δ6 dessaturase de P. juliae não contém nenhum íntron. Isto foi observado nas Δ6 dessaturases da espécies Prímula e Echium (Sayanova et al., 2003, Garcia-Maroto et al., 2002). Exemplo 2

Transformação e Expressão de Levedura

Os constructos pMON83950 (FIGURA 3) e pMON67011 (FIGURA 2) foram introduzidos na cepa hospedeira de Saccharomyces cerevisiae INVSd (Invitrogen), que é auxotrófico para uracila, usando o protocolo PEG/Li Ac como descrito no manual da Invitrogen para pYES2.1/V5-HisTOPO. Os transformantes foram selecionados em placas fabricadas de meio mínimo SC menos uracila com 2% de glicose. As colônias de transformantes foram usadas para inocular 5 ml de meio mínimo SC menos uracila e 2% de glicose e foram cultivados durante a noite a 30°C. Para a indução, as células de levedura da fase estacionária foram peletizadas e recolocadas em suspensão em meio mínimo SC menos uracila suplementado com 2% de galactose e cultivados por 3 dias a 15° C. Quando ácidos graxos exógenos foram fornecidos às culturas, 0,01% de LA (Δ9,12-18:2) foi adicionado com o emulsificador Tergitol a 0,1%. As culturas foram cultivadas por 3 dias a 15° C e * .:.*’? ·:· ·'*^; ’·* '* subseqüentemente colhidas por centrifuga ção. Os péletes de célula foram lavadas uma vez com tampão TE estéril pH 7,5, para remover o meio e liofilizado por 24 horas. A cepa hospedeira transformada com o vetor contendo o gene LacZ foi usada como um controle negativo em todos os estudos.

Os lipídeos foram extraídos dos péletes de levedura liofilizada adicionando-se 0,1 ml de tolueno e incubando durante a noite na temperatura ambiente. Os lipídeos extraídos foram convertidos aos ésteres metílicos de ácido graxo (FAMEs) in situ pela adição de 0,5 ml de metóxido de sódio

O, 6 N em metanol e incubando por 45 min. As FAMEs foram extraídas pela adição de 0,8 ml de NaCI a 10% (p/v) e 0,15 ml de heptano. A camada de heptano contendo FAMEs foi removida e usada diretamente para a cromatografia gasosa (GC). As FAMEs foram identificados em um Hewlett-Packard 5890 II Plus GC (Hewlett-Packard, Paio Alto, CA) equipado com um detetor de ionização de chama e uma coluna capilar (omegawax 250; 30 m x 0,25 mm d.i. x 0,25 μηη; Supelco, Bellefonte, PA). Uma relação de fenda de 100:1 foi usada para injeções. O injetor foi mantido a 250°C e o detetor de ionização de chama foi mantido a 270°C. A temperatura da coluna foi mantida a 180°C por 1,5 min a seguir da injeção, aumentada para 240°C a 40°C/min e mantida a 245°C por 3,38 min.

A Tabela 1 mostra a composição de ácido graxo para clones de

P. juliae que expressam levedura pMON67011 (PjD6D-2), pMON83950 (PjD6D-1) ou Δ6 dessaturase de Mortierella alpina, pMON77205. Os produtos esperados para a Δ6 dessaturação de LA e ALA foram observados tanto para os clones P. juliae (Tabela 1, GLA e SDA, respectivamente), demonstrando que os clones contidos na pMON67011 e pMON83950 são Δ6 dessaturases. A seletividade de substrato foi determinada alimentando-se quantidades iguais de LA e ALA. M. alpina é um fungo filamentoso que acumula níveis altos do ácido graxo n-6 ácido araquidônico e foi esperado ter uma Δ6 dessaturase com uma seletividade n-6. A Tabela 2 mostra as seletividades de substrato n-3:n-6 SDA Δ6 dessaturases de P. juliae e M. alpina. Uma seletividade n-3:n-6 de -0,8 foi observada para a Δ6 dessaturase de M. alpina. Uma seletividade n-3:n-6 de -1,5 a 1,9 foi observada para ambos os clones da Δ6 dessaturase de P.juliae.

Tabela 1: Comparação da composição de ácido graxo de levedura que expressam Δ6 dessaturases diferentes

Vetor Gene FA no meio	LA*	GLA*	ALA*	SDA*
pMON67011 P. juliae D6D-2-	2,0	0,0	0,0	0,0
pMON67011 P. juliae D6D-2-	2,5	0,0	0,1	0,0
pMON67011 P. Juliae D6D-2 LA	25,7	14,0	0,0	0,0
pMON67011 P. Juliae D6D-2 LA	28,4	16,8	0,1	0,0
pMON67011 P.juliae D6D-2 ALA	0,3	0,1	24,4	16,8
pMON67011 P.juliae D6D-2 ALA	0,3	0,1	30,6	19,0
pMON67011 P. juliae D6D-2 LA+ALA	22,7	6,0	18,0	8,5
pMON67011 P juliae D6D-2 LA+ALA	24,3	5,8	20,4	8,9
pMON83950 P.juliae D6D-1 -	2,3	0,0	0,3	0,0
pMON83950 P. juliae D6D-1 -	2,3	0,0	0,2	0,0
pMON83950 P. juliae D6D-1 LA	26,3	15,0	0,0	0,0
pMON83950 P.juliae D6D-1 LA	23,5	16,6	0,0	0,0
pMON83950 P. juliae D6D-1 ALA	0,6	0,2	37,3	17,5
pMON83950 P.juliae D6D-1 ALA	0,7	0,1	33,9	17,4
pMON83950 P. juliae D6D-1 LA+ALA	18,8	4,3	17,1	9,4
PMON83950 P.juliae D6D-1 LA+ALA	16,9	4,8	15,7	9,8
pMON77205 M. alpina D6D -	1,7	0,0	0,2	0,0
pMON77205 M. alpina D6D -	1,0	0,0	0,0	0,0
PMON77205 M. alpina D6D LA	56,8	6,0	0,0	0,0
ΡΜΟΝ77205 M. alpina D6D LA	25,4	4,6	0,2	0,0
pMON77205 M. alpina D6D ALA	0,5	0,0	69,2	2,6
pMON77205 M. alpina D6D ALA	0,9	0,0	23,0	5,0
pMON77205 M. alpina D6D LA+ALA	34,8	1,3	39,7	1,1
PMON772Q5 M. alpina D6D LA+ALA	18,7	2,8	18,4	2,2

** Reportado como um% do total para todos os análitos incluídos no cromatograma GC-FID, incluindo mas não mostrado (16:0, 16:1, 18:0, 20:0, 20:1, 20:2, 22:0, 22:1,22:2

Tabela 2. Comparação de seletividades de substrato n-3:n-6 para Δ6 dessaturases de P. juliae e M. alpina.

Vetor Gene FA no meio	% de conv% de conv.	Relação n- 3:n-6**
de GLA*	de SDA*
pMON67011 P. juliae D6D-2LA+ALA	21,0	32,1	1,53
pMON67011 P. juliae D6D-2LA+ALA	19,2	30,3	1,58
pMON83950 P. juliae D6D-1LA+ALA	18,7	35,4	1,89
PMON83950 P. juliae D6D-1 LA+ALA	22,2	38,4	1,73
pMON77205 M. alpina D6D LA+ALA	3,6	2,8	0,78
PMON77205 M. alpina D6D LA+ALA	12,8	10,5	0,82

* A porcentagem de conversão para GLA foi calculada dividindo-se o valor para GLA (Tabela 1) pela soma dos valores para LA e GLA (Tabela 1). O mesmo cálculo foi feito para SDA usando a soma de ALA e SDA (Tabela 1). ** A relação n-3:n-6 foi calculada dividindo-se a% de conv. de SDA pela% de conv. de GLA.

Exemplo 3

Transformação e Expressão Vegetais de Δδ-dessaturase de Prímula juliae

A atividade da A6-dessaturase de P. juliae foi avaliada em soja combinando-a com uma A15-dessaturase de Neurospora crassa (NcD15D), pMON77245 (FIGURA 4) ou Aspergillus nidulans (AnD15D), pMON77247 (FIGURA 5). O vetor pMON77245 foi construído em três etapas. A primeira Δβ-dessaturase de P. juliae (PjD6D-2) foi colocada atrás do promotor 7S alfa’ específico de semente pela digestão do pMON67011 com Sse8387 l, seguido pela remoção das projeções 3’ e Sal I e depois ligando o fragmento resultante na EcoRI e os sítios Xhol substituídos do vetor de expressão pMON68527, gerando o vetor pMON77243. Segundo, o cassete de expressão PjD6D-2 foi removido de pMON77243 pela digestão com Notl, seguido por uma reação de substituição e depois o fragmento resultante foi ligado no sítio EcoRV do vetor binário 2T pMON77244. Finalmente, um NcD15D otimizado no códon (SEQ ID NO: 17) sob o controle de um promotor específico de semente 7S alfa foi combinado com o PjD6D-2 pela digestão do pMON77227 com NotI e depois ligando o fragmento do cassete de expressão NcD15D resultante no NotI digerido pMON77344 para dar pMON77245 (FIGURA 4). O vetor pMON77247 (FIGURA 5) foi construído pela digestão do vetor pMON77242 com Not I e ligando o fragmento do cassete de expressão resultante compreendendo um AnD15D otimizado no códon (SEQ ID NO: 18) ligado ao promotor 7S alfa no sítio NotI de pMON77244. Os vetores pMON77245 e pMON77247 foram transformados na soja usando o método de Martinell et al. (Patente U.S. N- 6.384.301, a descrição da qual é aqui incorporada por referência na totalidade).

A expressão da seqüência codificadora PjD6D-2 foi medida determinando-se a composição de ácido graxo das sementes de soja transgênicas R1 imaturas (aproximadamente 30 dias depois de florescer), incluindo tanto homozigotos quanto heterozigotos, pela cromatografia gasosa de derivados de éster metílico de lipídeo (PCT US03/16144, depositado em 21 de maio de 2003, a descrição inteira da qual é aqui especificamente incorporada por referência). Os níveis de PA (ácido palmítico, 16:0), SA (ácido esteárico, 18:0), OA, LA, GLA, ALA e SDA são expressados como uma porcentagem do peso total de ácidos graxos medidos e são mostrados nas Tabelas 3 e 4 abaixo. A linhagem de controle não-transgênica foi A3525. Sempre que possível, cinco sementes individuais foram analisadas de cada evento.

A semente individual de uma maioria dos eventos transgênicos pMON77245 foram descobertos acumular quantidades mensuráveis de SDA. Em todos os casos, os níveis de SDA foram maiores do que aqueles de GLA, com uma relação SDA:GLA média para cada evento variando de 2:1 a um alto de 8:1. O valor de semente isolado mais alto foi observado do evento GM_A38083, que conteve 32,0% de SDA e 2,6% de GLA, com uma relação de SDA:GLA de 12:1. Dos 12 eventos mostrados abaixo, 9 tiveram valores SDA >10% em pelo menos uma semente das cinco. Conforme os valores de SDA aumentaram, os níveis de PA, SA e OA não variaram significantemente dos níveis de controle; entretanto, existe uma correlação negativa forte quanto ao LA. Em sementes que acumularam SDA, os níveis de GLA permaneceram baixos, entre 2,3 a 5,5%. Os níveis de ALA aumentaram juntos com os níveis de SDA.

TABELA 3: Resultados Percentuais de Área Relativa (Aprox. porcentagem em peso) de sementes R1 transformadas com pMON77245 isoladas

pMON77245	Ácido graxo (porcentagem em peso)
Linhagem	PA i	SA i	DA	LA <	GLA y	^LA í	SDA
A3525	11,47	5,21	16,5 :	56,75 i	0 í	9,15 I	9
A3525	11,66	4,53	18,54	54,9	0 !	9,51 l	3
A3525	11,8	5,42	16,66	56,04	0 I	9,14 i	0
A3525	11,41	4,91	17,64	56	0 '	9,08	0
A3525	11,56	4,36	17,86	56,55	0	8,77	0
GM A38005	12,57	4,19	18,45	53,99	0	10,8	0
GM A38005	13,73	4,77	19,32	52,42	0	9,76	0
GM A38005	14,81	4,74	19,09	36,84	5,23	10,3	8,98
GM A38005	13,4	4,71	18,34	53,26	0	10,29	0
GMA38005	13,21	4,38	19,97	52,19	0	10,25	0
GM A38005	13,08	4,78	17,99	53,56	0	10,59	0
GM A38013	12,91	4,45	19,72	40,8	4,57	9,56	7,99
GM A38013	12,45	4,38	18,9	55,04	0	9,23	0
GMA38013	13,04	4,68	17,38	40,36	4,66	10,27	9,61
GM A38013	13,26	4,34	17,14	40,03	4,6	10,17	10,46
GMA38013	11,67	4,26	22,5	44,26	3,3	8,95	5,05
GM A38021	12,95	4,33	19,39	53,48	0	9,85	0
GMA38021	13,07	4,87	18,12	54,1	0	9,84	0
GM A38021	13,14	4,27	22,76	34,62	2,3	13,7	9,2
GM A38021	12,98	4,08	21,58	39,6	1,6	13,7	6,45
GMA38021	13,21	4,34	17,24	29,03	1,78	19,07	15,31
GM A38043	13,1	4,26	19,58	52,44	0	10,62	0
GMA38043	13,09	4,3	20,01	52,83	0	9,77	0
GM A38043	14,01	4,35	22,05	29,98	4,39	12,18	13,05
GM A38043	13,32	4,26	19,41	51,85	0	11,16	0
GMA38043	12,8	4,34	19,81	53	0	10,05	\|o

pMON77245	^cido graxo (porcentagem em peso)
GM A38048	13,44	5,5	18,01 *	44,46 I	2,28	10,7 !	5,61
GM A38048	13,43	4,8	18,57 -	44,25 \	2,34	10,93 1	5,68
GM A38048	13,14	4,47	18,88 -	44,97 I	2,33	10,78 i	5,44
GM A38048	12,98	4,89	17,79 -	44,92 :	2,43	11,23 I	5,76
GM A38048	13,3	4,56	17,95 :	35,88	3,41	13,15	11,75
GM A38060	12,73	4,94	17,37 -	43,16	4,01	10,4	7,39
GM A38060	12,85	5,19	15,27	35,1	5,32	11,88	14,39
GM A38060	12,73	4,99	16,41	43,44	3,95	10,25	8,23
GM A38060	13,06	5,34	16,06	42,75	4,04	10,32	8,43
GM A38060	12,85	5,25	16,45	42,68	4,01	10,39	8,36
GM A38064	13,32	5	18,8	42	3,86	10,16	6,87
GM A38064	13,07	4,72	18,97	42,1	3,59	9,95	7,6
GM A38064	13,45	4,84	19,7	41,67	3,8	9,92	6,62
GM A38064	12,66	4,61	19,09	43,21	3,52	9,85	7,05
GM...A38064	13,03	4,73	19,58	36,38	4,94	11,28	10,06
GMA38069	12,9	4,71	21,24	41,12	2,64	11,43	5,97
GMA38069	12,74	4,76	20,35	51,21	0	10,94	0
GM A38069	12,93	4,77	20,5	51,27	0	10,53	0
GM A38069	13,18	4,69	18,85	38,76	3,3	12,34	8,87
GM A38069	13,08	4,79	19,16	52,08	0	10,89	0
GMA38083	13,33	5,28	21,73	27,31	2,48	15,28	13,35
GM„A38083	12,8	4,96	16,85	11,52	2,64	18,11	32,02
GM A38083	12,32	5,07	22,23	13,59	2,52	17,46	25,56
GM„A38083	13,22	4,26	20,83	15,89	3,81	14,69	26,12
GM A38083	13,74	4,61	17,03	20,93	4,84	13,82	23,91
GM A38084	12,9	4,04	22,66	41,63	3,37	9,07	5,28
GM A38084	13,38	3,94	28,07	25,81	4,9	11,37	11,42
GM—A38084	13,92	3,75	31,36	32,26	2,89	9,23	5,51
GM—A38084	14,42	4,12	27,17	33,26	3,28	11,57	5,77
GM—A38084	12,74	3,95	22,59	40,82	3,3	9,68	5,91

PMON77245	Ácido graxo (porcentagem em peso)
GM A38089	13,05	4,48	22,37	42,63	2,55	9,3	4,59
GM A38089	13,15	4,63	18,82	53,48	0	9,03	0
GM.A38089	12,67	4,41	20,59	51,87	0	9,42	0,07
GM A38089	12,64	4,29	20,56	52,58	0	8,96	0
GM A38089	12,72	4,57	21,81	50,79	0	9,16	0
GM..A38094	12,62	4,57	18,97	52,96	0	9,9	0,11
GM A38094	13,3	5,08	17,08	34,49	5,35	11,39	12,35
GM„A38094	13,08	4,52	18,38	38,95	5,41	9,88	8,82
GM A38094	13,41	5	17,27	38,5	5,49	10,26	9,1
GMA38094	12,58	4,46	20,06	40,28	4,88	9,5	7,25

A semente individual dos eventos transgênicos de pMON77247 acumularam quantidades similares de SDA quando comparada a pMON77245, com a exceção do evento GM_A38083 que acumulou níveis significantemente mais altos de SDA. Os níveis de PA, SA, OA e LA foram similares aos níveis de controle mostrados na Tabela 3. No geral, os níveis de SDA foram maiores do que aqueles de GLA com uma relação SDA:GLA média para cada evento variando de 1:1 a 1,6:1, que foi menor do que aquele observado para pMON77245.

TABELA 4: Resultados Percentuais de Área Relativa (Aprox. porcentagem em peso) de sementes R1 de pMON77247 isoladas

pMON77247	Ácido graxo (porcentagem em peso)
Linhagem	PA	SA	AO	LA	GLA	ALA	SDA
GM A38909	12,18	4,19	20,66	44,94	3,52	8,65	4,87
GMA38909	12,25	3,84	22,37	44,89	2,95	8,22	4,46
GM A38909	12,06	4,67	22,95	43,37	3,31	8,32	4,86
GMA38909	12,64	4,63	17,61	45,99	3,66	9,01	5,44
GM A38909	12,28	4,2	19,42	46,1	3,1	9,01	4,82
GMA38941	13,95	4,87	18,03	40,2	7,08	7,87	6,92
GM A38941	13,76	4,38	19,72	33,62	8,94	8,57	9,95

PMON77247	Ácido graxo (porcentagem em peso)
GM A38941	13,15	4,91	17,89	52,06	0,75	9,52	0,8
GM A38941	12,73	4,27	22,23	42,14	4,98	7,44	5,15
GM A38941	12,73	4,34	19,37	52,34	0,36	9,53	0,37
GM. A38946	13,02	4,68	17,4	44,66	4,54	8,83	5,89
GM A38946	13,17	4,42	17,35	43,71	5,01	8,91	6,49
GM A38946	13,63	4,24	18,96	38,16	6,36	8,89	8,75
GM A38946	13,32	4,6	17,76	43,37	4,8	8,94	6,2
GM—A38946	13,32	4,5	18,07	43,24	4,71	8,95	6,23
GMA38977	13,43	5,18	21,3	40,54	4,43	8,51	5,62
GM A38977	13,6	4,92	21,44	40,95	4,26	8,41	5,42
GM A38977	13,17	4,23	21,61	38,02	5,45	8,38	8,07
GM A38977	13,06	4,97	21,93	37,82	5,75	8,63	6,86
GM A38977	13,33	4,5	22,96	37,43	5,54	8,42	6,76
GM A39047	13,22	4,21	20,95	31,88	7,8	9,01	11,72
GM A39047	13,34	4,47	19,14	31,1	7,54	9,9	13,35
GM A39047	13,79	4,32	18,82	32,97	8,26	9,07	11,68
GM A39047	13,16	4,38	19,34	29,61	7,94	9,97	14,44
GMA39047	12,65	4,25	17,48	50,71	1,49	9,92	2,45

Exemplo 4

Atividade da A6-dessaturase de Primula juliae em combinação com a Δ15dessaturase de Neurospora crassa em canola

A atividade da Δβ-dessaturase de Primula juliae em combinação com A15-dessaturase Neurospora crassa foi avaliada pela transformação de canola com a MON82822 (FIGURA 7). pMON82822 conteve um NcD15D nativo (SEQ ID NO: 19) assim como PjD6D-2, ambos inseridos em um cassete de expressão específica de semente sob o controle do promotor de napin (PCT US03/16144, a descrição da qual é especificamente aqui incorpo10 rada por referência).

O vetor pMON82822 foi construído digerindo-se pMON77214 (PCT US03/16144) com Pmel e BamHI (substituído) e ligando o cassete de napin NcD15D nativo resultante no sítio EcoRV do vetor binário 2T pMON71801 para gerar pMON82820. Em seguida, pMON82819 foi digerido com Notl, as extremidades foram substituídas e o cassete de expressão de napin PjD6D-2 resultante foi ligado no sítio Ascl substituído de pMON82820 para gerar pMON82822.

Um segundo vetor, pMON82821, também foi construído contendo o NcD15D otimizado no códon (SEQ ID NO: 17) e PjD6D-2 pMON82821 digerindo-se primeiro pMON67011 com Sail e Sse8387l e ligando o fragmento PjD6D-2 resultante nos sítios Sail e Xhol (substituídos) do cassete de expressão napin em pMQN82800 dando pMON82819. O cassete napin con10 tendo um NcD15D otimizado no códon foi construído pela digestão do pMON67024 com Pmel e BamHI (substituídos) e ligando o fragmento resultante em um vetor binário 2T digerido com EcoRV, pMON71801, dando pMON82801. Finalmente, pMON82819 foi digerido com Notl, substituído e o cassete de expressão de napin PjD6D-2 resultante foi ligado no sítio Notl . 15 substituído de pMON82801 dando pMON82821.

pMON82822 foi transformado em canola (Brassica napus) usan* do uma modificação do protocolo descrito por Radke et al., (Plant Cell Reports 11: 499 a 505, 1992). Em resumo, sementes de canola do cultivar Έbony’ (Monsanto Canada, Inc., Winnipeg, Canadá) foram desinfectadas e germinadas in vitro como descrito em Radke et al., 1992. O pré co-cultivo com placas alimentadoras de tabaco, preparação de explante e inoculação de explantes com cepa ABI Agrobacterium tumefaciens (Koncz e Schell, Mol Gen Genet 204: 383 a 396 (1986)) contendo o vetor desejado foram como descritos com o Agrobacterium sendo mantido em meio LB (sólido ou líqui25 do) contendo 75 mg/l de espectinomicina, 25 mg/l de cloranfenicol e 50 mg/l de canamicina. Para a transformação vegetal incluindo indução de calo, regeneração de broto, maturação e enraizamento, a seleção de glifosato foi usada ao invés da seleção de canamicina como descrito em Radke et al., 1992. Especificamente, o meio de indução de calo B5-1 foi suplementado com 500 mg/l de carbenicilina e 50 mg/l de Timentina (Duchefa Biochemie BV) para inibir o crescimento de Agrobacterium e a canamicina foi omitida do meio. O meio de regeneração de broto B5BZ conteve, além disso, 500 mg/l de carbenicilina, 50 mg/l de Timentina e 45 mg/l de glifosato com explantes sendo transferidos para meio fresco a cada duas semanas.

Os brotos selecionados em glifosato foram transferidos para meio de maturação de broto B5-0 isento de hormônio contendo 300 mg/l de 5 carbenicilina e 45 mg/l de glifosato por duas semanas e finalmente os brotos foram transferidos para meio de indução de raiz B5 contendo 45 mg/l de glifosato. As plantinhas verdes enraizadas foram transplantadas para solo de vaso e aclimadas às condições da estufa. As plantas foram mantidas em uma estufa sob condições padrão. A composição de ácido graxo de semente 10 madura foi determinada pela análise de GC de lipídeos derivados de éster metílico como feito acima para os transformantes da soja. A análise de GC de semente de canola das plantas transformadas com pMON82822 produziu 199 eventos com níveis de SDA variando de 0,12 a 4,49% (% em peso, 100 reservatórios de semente).

Exemplo 5

Construção e transformação de vetores de expressão PjD6D para Soja, Milho e Canola

A expressão das seqüências PjD6D isoladas é avaliada in planta para canola, milho e soja sob a expressão de um promotor específico de 20 semente. Um vetor de expressão da soja é construído pela digestão do pMON77243 com Not I e ligação do fragmento resultante contendo PjD6D-2 no sítio Not I do vetor binário pMON17227. Um vetor de expressão de canola é construído pela digestão do pMON83950 com Sail e Sse8387l (feito abrupto) e ligação do fragmento resultante, que contém a região codificadora de 25 PjD6D-1 nos sítios Sail e Xhol (substituídos) do cassete de vetor de expressão de napin específico de semente pMON82800. O plasmídeo resultante é depois digerido com Not I seguido pela ligação do cassete de expressão PjD6D-1 de napin resultante no sítio Not I do vetor binário pMON17227. Um vetor de expressão do milho é construído pela digestão do pMON83950 com 30 Sal I (substituído) e Sse83872l (feito abrupto) e ligando o fragmento PjD6D-1 resultante no sítio Sfil (feito abrupto) do cassete de expressão da globulina em pMON71084. O vetor resultante é depois digerido com Pmel e Hindlll e o cassete de expressão é depois ligado nos sítios Hpal e Hindi II do vetor binário pMON30167.

A atividade da Δβ-dessaturase de P. juliae no milho é avaliada em combinação com uma A15-dessaturase de Neurospora crassa otimizada 5 no códon para milho (NcD15Dnno) (SEQ ID NO: 20). O vetor pMON67011 é digerido com Sail e Sse8387l (feito abrupto) e o fragmento PjD6D-2 resultante é ligado no Sfil (substituído) do cassete de expressão de globulina em pMON71084 para dar pMON82823. Em seguida, pMON82806 (PCT US03/16144) é digerido com Pmel e Hindlll e o cassete de globulina 10 NcD15Dnno resultante é ligado nos sítios Notl (substituído) e Hindlll do vetor binário 1T pMON30167 para dar pMON82824. Finalmente o cassete de PjD6D-2 da globulina é combinado com NcD15Dnno da globulina pela digestão do pMON82823 com Pmel e Hindlll e ligando o fragmento resultante nos sítios Smal e Hindlll de pMON82824 dando pMON82825. O vetor resultante 15 é introduzido no milho por intermédio da transformação mediada Agrobacterium tumefaciens como conhecido a uma pessoa versados na técnica, por exemplo, Patente U.S. N- 6.603.061.

Exemplo 6

Clonagem de Sequências de Δ6 Dessaturase de Prímula waltonii e Prímula 20 alpicola

A clonagem de genes da Δ6 dessaturase de Prímula waltonii (PwD6D) e Δ6 dessaturase de P. alpicola (PaD6D) foi obtida pela amplificação pela PCR de uma região de DNA genômico interno parcial usando oligonucleotídeos degenerados, seguidos pela marcha genômica bidirecional.

O DNA genômico total foi isolado de P. waltonii e P. alpicola (Collector’s Nursery) usando o Kit DNeasy Plant Mini (Qiagen), seguindo o procedimento do fabricante. Dois fragmentos foram isolados do DNA genômico de P. alpicola usando os oligonucleotídeos degenerados BO-1 For e BO-2 Rev como descrito por Garcia-Maroto et aL 2002:

BO-1 For: 5-ATMAGYATYGGTTGGTGGAARTGG-3’ (SEQ ID NO: 6) BO-2 Rev: 5-AATCCACCRTGRAACCARTCCAT-3’ (SEQ ID NO: 7)

O primeiro fragmento de P. alpicola teve 550 pares de base no comprimento e correspondeu às posições 553 a 1103 da SEQ ID NO: 21. Este fragmento foi clonado no pCR®4-TOPO® (fnvitrogen) para produzir o vetor pMON83977 (nenhum íntron). O segundo fragmento de P. alpicola teve 550 pares de base no comprimento e correspondeu às posições 763 a 1313 5 da SEQ ID NO: 23. Este fragmento foi clonado no pCR®4-TOPO® (Invitrogen) para produzir o vetor pMON83975 (contém íntron). Um fragmento foi obtido de P. waltonü que teve 550 pares de base no comprimento e correspondeu às posições 763 a 1313 da SEQ ID NO: 25. Este fragmento foi clonado no pCR®4-TOPO® (Invitrogen) para produzir o vetor pMON83976. As 10 seqüências de polipeptídeo codificadas pelas SEQ ID NOs: 21,23 e 25 são dadas nas SEQ ID NOs: 22, 24 e 26, respectivamente.

Para determinar as seqüências flanqueadoras genômicas dos insertos pMON83975, pMON83976 e pMON83977, um Kit Universal Genome Walker® (BD Biosciences) foi utilizado, seguindo o procedimento do fa15 bricante. Quatro bibliotecas genômicas para cada espécie de Primula foram geradas pela digestão do DNA com quatro enzimas de restrição: EcoRV, Pvull, Stul e Dral. Depois de uma etapa de purificação, as digestões foram ligadas a um adaptador fornecido no kit. O procedimento depois envolveu duas reações de PCR, cada uma com um iniciador específico de gene e um 20 iniciador adaptador. A reação de PCR secundária usada uma diluição dos produtos da reação de PCR primária como um padrão.

A. pMON83975 (PaD6D-2)

Para a direção 5’, iniciadores PD6D R7 e PD6D R1 foram usados para as reações de PCR primária e secundária, respectiva mente. Para a 25 direção 3’, iniciadores PD6D F7 e PD6D F1 foram usados para as reações de PCR primária e secundária, respectivamente. As seqüências iniciadoras são dadas abaixo:

PD6D R7: 5 -CACACATGACCGGATAAAACGTCCAGT-3’ (SEQ ID NO: 27) PD6D R1: 5’-AGGGATATACTGGAGGTCGGGGTCGTA-3’ (SEQ ID NO: 28) 30 PD6D F7: 5’- GAGCTATTCCGTTACGGGGATACAACA -3’ (SEQ ID NO: 29) PD6D F1: 5’- TGCAGGGACACTTAACATATCGTGCCC-3’ (SEQ ID NO: 30) A marcha genômica na direção 5’ produziu um fragmento de 751 pares de base a partir da biblioteca EcoRV. Este produto foi clonado no pCR®4-TOPO® (Invitrogen) dando pMON83978 e o inserto foi seqüenciado. A seqüência resultante não contém um códon de partida do gene da delta 6 dessaturase putativa e assim um outro conjunto de reações de PCR foi reali5 zado usando iniciadores específicos de gene planejados para caminhar na direção 5’ do inserto pMON83978. Os iniciadores usados para o segundo conjunto de marcha genômica na direção 5’ foram PD6D R17 e PD6D R16 para as reações de PCR primária e secundária, respectiva mente. As seqüências são dadas abaixo:

PD6D R17: 5’-GTGAAAGTTGTTGAGGAGGGATCGGTA-3' (SEQ ID NO:

31)

PD6D R16: 5’-GTGGAAGGAGGATGGTAAGCGAGGAAA-3’ (SEQ ID NO:

32)

Um produto de 473 pares de base no comprimento da biblioteca . 15 Pvull foi clonado no pCR^@4-TOPO® dando pMON83980 e o inserto foi seqüenciado. Este inserto conteve um códon de partida que corresponde à ê posição 1 da SEQ ID NO: 23. A marcha genômica na direção 3’ resultou em um fragmento de 942 pares de base da biblioteca Dral. Este produto foi clonado no pCR®4-TOPO®, dando pMON83979. O inserto foi seqüenciado e 20 descoberto conter 294 pares de base da região codificadora para o gene da delta 6 dessaturase putativo, seguidos por um códon de parada na posição 1549 com respeito à SEQ ID NO: 23.

Os insertos de pMON83975, pMON83978, pMON83980 e pMON83979 foram alinhados para formar uma seqüência compósita de um gene da Δ6 dessaturase putativa para P. alpicola dando PaD6D-2, SEQ ID NO: 23. Dois iniciadores foram planejados para amplificar pela PCR a matriz de leitura aberta completa do DNA genômico de P. alpicola. As seqüências iniciadoras são dadas abaixo:

Pa D6D F1: 5’- GTCGACATGGCTAACAAATCTCAAACAGGTTA C-3’ (SEQ 30 ID NO: 33)

Pa D6D R1: 5’- CCTGCAGGTCACCCGAGAGTTTTAACAGCCTCC-3” (SEQ ID NO: 34)

O fragmento amplificado de PCR (SEQ ID NO: 23) foi depois ligado no vetor de expressão de levedura pYES2.1-TOPO dando o vetor pMON83968.

B. pMON83976 (PwD6D)

Uma Δ6 dessaturase putativa foi amplificada por PCR de DNA genômico de P. waltonii usando os iniciadores Pa D6D F1 (SEQ ID NO: 33) e Pa D6D R1 (SEQ ID NO: 34) mostrados acima. O fragmento amplificado pela PCR (SEQ ID NO: 25) foi depois ligado no vetor de expressão de levedura pYES2.1-TOPO dando o vetor pMON83967.

C. pMON83977 (PaD6D-1)

Para a direção 5’, iniciadores PD6D R9 e PD6D R4 foram usados para as reações de PCR primária e secundária, respectivamente. Para a direção 3’, iniciadores PD6D F9 e PD6D F4 foram usados para as reações de PCR primária e secundária, respectivamente. As seqüências iniciadoras . 15 são dadas abaixo:

PD6D R9: 5’-CACACATTACCGGATAAAACGTCCAGT-3’ (SEQ ID NO: 35) PD6D R4: 5’-AGGAATATACTGGAGGTCTGGGTCGTA-3’ (SEQ ID NO: 36) PD6D F9: 5’- ATI I I ICTTCGGACGTATACATGGGCC -3’ (SEQ ID NO: 37) PD6D F4: 5’- TTCGGGGACACTGAACATATCGTGCCC-3' (SEQ ID NO: 38)

A marcha genômica na direção 5’ produziu um fragmento de 979 pares de base da biblioteca de Stul. Este produto foi clonado no pCR®4TOPO® (Invitrogen) dando pMON83981 e o inserto foi seqüenciado. A seqüência resultante conteve o códon de partida da delta 6 dessaturase putativa na posição 1 com respeito à SEQ ID NO: 21. A marcha genômica na dire25 ção 3’ resultou em um fragmento de 1028 pares de base da biblioteca Dral. Este produto foi clonado no pCR®4-TOPO® (Invitrogen), dando pMON83982.

O inserto foi seqüenciado e descoberto conter 295 pares de base da região codificadora para o gene da delta 6 dessaturase putativo, seguidos por um códon de parada na posição 1339 com respeito à SEQ ID NO: 21.

Os insertos de pMON83977, pMON83981 e pMON83982 foram alinhados para formar uma seqüência compósita de um segundo gene da Δ6 dessaturase putativa para P. alpicofa dando PaD6D-1, SEQ ID NO: 21. Dois íniciadores foram planejados para amplificar pela PCR a matriz de leitura aberta completa de DNA genômico de P. alpicola. As seqüências iniciadoras são dadas abaixo.

Pf D6D-F2: 5-GTCGACATGGCCAACACTAGTTACATTTCCAGC T-3’ (SEQ 5 ID NO: 39)

Pf D6D-R2: 5’- GATATCACCCCAGAGTGTTAACAGCTTCCCAG-3’ (SEQ ID NO: 40)

O fragmento de PCR amplificado foi depois ligado no vetor de expressão de levedura pYES2.1-TOPO dando o vetor pMON67026 (SEQ ID 10 NO 21).

O alinhamento de PaD6D-2 e PwD6D (também abreviado PRIwaD6D) com outros genes de Δ6 dessaturase vegetal caracterizados revelou que estes dois genes continham um único íntron que corresponde às posições 476 a 676 na SEQ ID NO: 23 e posições 476 a 651 na SEQ ID NO: 25.

Isto foi observado nas Δ6 dessaturases das espécies Prímula e Echíum (Sayanova et aí, 2003, Garcia-Maroto etal., 2002).

Os três clones de Δ6 dessaturase codificam polipeptídeos potenciais de 446 aminoácídos para PaD6D-1 (SEQ ID NO: 22), 449 aminoácidos para PaD6D-2 (SEQ ID NO: 24) e 449 aminoácídos para PwD6D (SEQ 20 ID NO: 26). Estas seqüências têm similaridade alta a outras Δ6 dessaturases vegetais (FIGURA 1), incluindo um domínio bs de citocromo de terminal N, que é encontrado em todas as dessaturases de extremidade frontal (Napier et al., 2003). Dentro do domínio bs de citocromo é encontrado os oito resíduos invariáveis característicos da superfamília b₅ de citocromo e o motivo 25 heme de ligação H-P-G-G, que tem sido mostrado ser essencial para a atividade enzimática (Napier etal., 1997, Sayanova etal, 1999, Sperling e Heinz 2001). Dentro do domínio de dessaturase das PaD6D-1, PaD6D-2 e PwD6D dessaturases são três caixas de histidina conservadas que são características de todas as dessaturases ligadas à membrana (Shanklin et al., 1994). 30 Uma característica distintiva encontrada em todas as dessaturases de extremidade frontal é que a terceira caixa de histidina contém um resíduo de glutamina na primeira posição (Q-x-x-H-H) ao invés de uma histidina (Napier et al., 1997, Napier et al., 2003, Sperling e Heinz 2001). A seqüência de aminoácido deduzida do PaD6D-1 teve aproximadamente 80% de identidade a PaD6D-2 e aproximadamente 80% de identidade a PwD6D. Entretanto, os dois genes contendo íntróh, PaD6D-2 e PwD6D, são mais similares entre si 5 com aproximadamente 97% de identidade, do que os dois genes de P. alpicola genes, PaD6D-1 e PaD6D o são entre si.

Exemplo 7

Clonagem Adicional de Seqüências de Δ6 Dessaturase de Prímula

O DNA genômico foi isolado de P. farínosa e P. floríndae usando um sistema de lise Sarkosyl/CTAB. Cinco gramas de tecido de cada espécie foram triturados em um almofariz e pistilo com nitrogênio líquido até triturados em um pó fino. O tecido em pó foi depois recolocado em suspensão em tampão de lise (140 mM de sorbitol, 220 mM de Tris-HCI, pH 8,0, 22 mM de ácido etilenodiaminotetraacético (EDTA), 800 mM de cloreto de sódio (NaCI),

1% de N-laurilsarcosina e 0,8% de brometo de hexadeciltrimetil amônio (CTAB)) e incubados por 1 hora a 65°C com inversão suave a cada 10 minutos. Depois de incubação, 10 ml de clorofórmio foram adicionados à suspensão de lise e incubados na temperatura ambiente com oscilação suave por 20 minutos. A suspensão de lise foi centrifugada por 10 minutos a 12.000 X

g. A camada aquosa foi transferida para um tubo limpo e o ácido nucléico precipitado com 0,6% de isopropanol. O péllete de ácido nucléico foi recolocado em suspensão em 4 ml de uma solução contendo 10 mM de Tris-HCI, pH 8,0, 1 mM de EDTA, 1 M de NaCI e 20 mg de Proteinase K. O ácido nucléico recolocado em suspensão foi depois incubado por 2 horas a 63°C. A

Proteinase K foi depois inativada por calor pela incubação a 75°C por 20 minutos. RNase (2,5 μg) foi adicionado à solução e incubado a 37°C por 1 hora. A solução foi extraída com um volume igual de fenol:clorofórmio:álcool isoamílico (25:24:1) 2 vezes. O DNA genômico purificado foi depois precipitado com etanol.

Aproximadamente, 3 pg de DNA genômico foi digerido em reações separadas com as endonucleases de restrição, EcoRI, HindiII, Kpnl, Sail e Xhol. Depois da digestão, cada reação foi purificada usando um Kit de

Purificação de PCR QIAquick® (Qiagen, Valencia, CA), seguindo o protocolo do fabricante. O DNA genômico digerido foi eluído das colunas de purificação usando 100 μΙ de tampão de eluição fornecido no kit. As interações intramoleculares que favorecem a ligação foi realizada em um volume de 200 μΙ usando 20 μΙ do DNA genômico digerido eluído em uma reação de ligação isenta de PEG com 800 unidades de ligase (M0202L) (New England Biolabs, Beverly MA) durante a noite a 16°C, seguido pela inativação por calor a 75°C por 10 minutos. Depois de ligação, a reação foi mais uma vez purificada usando um Kit de Purificação pela PCR QIAquick®. A PCR inversa foi realizada usando 6 a 20 ng de DNA ligado purificado e de 10 a 20 pg de iniciador e o Sistema de PCR Padrão Expand Long (Roche Applied Science, Indianápolis, IN). Os iniciadores são mostrados na Tabela 5 e foram planejados usando uma combinação de dados de seqüência disponíveis e dados que abrangem o domínio da dessaturase. As condições de ciclo térmico consistiram em uma incubação inicial a 94°C por 2 minutos; 10 ciclos de 94°C por 20 segundos, 52°C por 30 segundos e 68°C por 8 minutos; seguidos por 25 ciclos de 94°C por 30 segundos, 52°C por 30 segundos e 68°C por 8 minutos mais 10 segundos por ciclo. Depois que a ciclagem foi completada, uma outra incubação a 68°C por 7 minutos foi realizada. Os produtos da biblioteca de PCR inversa visível depois da eletroforese em agarose foram clonados no pCR®2.1-TOPO ou pCR®4Blunt-TOPO (Invitrogen) seguindo o protocolo do fabricante. Os seguintes fragmentos de biblioteca inversos (com tamanho aproximado) foram clonados: P. far/nosa-EcoRI (6 kb) e P f/orincfae-Hindlll (3 kb). O seqüenciamento de DNA foi realizado em um Analisador de DNA Applied Biosystems 3730x1, usando Big Dye® Terminator v3.0.

Tabela 5. Iniciadores e fragmentos usados na determinação da PCR inversa das regiões 5’ e 3’ dos genes da delta 6 dessaturase.

Espécie	Iniciador	Seqüência	SEQ ID NO:
P. farínosa	PÍ1107F1	TGGAGGTCTGGGTCGTAATC	41
	PÍ1107R1	CTTCGGACGTATACATGGGC	42
P. fíoríndae	Pf1113-1F2	TCGTAATCCAGGCTATTGCA	43

Pf 1113-1R2 TTTTCTTCGGACGTCCATGT

As seqüências putativas foram alinhadas com dados públicos para determinar a região aproximada da matriz de leitura aberta (ORF) abrangida por cada gene. Os iniciadores para amplificar a ORF de cada gene foram planejados com base nos dados de PCR inversos alinhados. As pollmerases de revisão de prova foram usadas para amplificar os genes delta 6 putativos para garantir a fidelidade do produto final. Os iniciadores usados na clonagem final dos genes da delta 6 dessaturase putativos são mostrados na Tabela 6. Os produtos foram clonados no pUC19 ou pCR®4Blunt-TOPO (Invitrogen). O seqüenciamento do DNA foi realizado em um Analísador de DNA Applied Biosystems 3730x1, usando Big Dye® Terminator v3.0. Dois genes delta 6 dessaturase putativos foram clonados: P. farinosa (PfaD6D) (pMON84809) (SEQ ID NO: 45) e P. florindae (PflD6D) (pMON84810) (SEQ ID NO: 47).

Tabela 6. Iniciadores usados para amplificar genes da delta 6 dessaturase.

Iniciador

Seqüência

SEQ ID NO:

Pfarinosa754

FGACGATTTTTGAGTGAGAGTTAATTTGAGTCAATAATA 49

Pfarinosa2447R

CGACATCATAGACAATCATCAAGACACCGT

PflorindaestartF

ATACCCCCTCAAAACACCCCCAAAT

PflorindaestopR

CTCAATATCACCCGAGAGTTTTAACAGCCT

Dois iniciadores foram planejados para amplificar a matriz de leitura aberta PfaD6D completa de pMON84809. O fragmento resultante foi ligado no vetor de expressão de levedura pYES2.1-TOPO dando pMON67065. Os dois iniciadores são dados abaixo.

Pfar F1: 5-GTCGACAACAATGTCCAACACATATCCACCAAATC -3’ (SEQ

ID NO: 53)

Pfar R1: 5 - CCTGCAGGTCACCCCAGAGTGTTAACAGCTTC -3’ (SEQ ID

NO: 54)

Os dois iniciadores foram planejados para amplificar o gene PflD6D completo contendo dois éxons e um íntron de pMON84810. O fragmento resultante foi ligado no vetor pYES2.1-TOPO dando pMON67067. Os dois iniciadores são dados abaixo.

Pw F1: 5- GTCGACATGGCTAACAAATCTCAAAC -3’ (SEQ ID NO: 55) Pw R2: 5’- CCTGCAGGTCACCCGAGAGT -3’ (SEQ ID NO: 56)

Os dois clones da Δ6 dessaturase codificam polipeptídeos potenciais de 454 aminoácidos para PfaD6D (SEQ ID NO: 46) e 449 aminoácidos para PÍID6D (SEQ ID NO: 48). Estas seqüências têm alta similaridade a outras Δ6 dessaturases vegetais (FIGURA 1), incluindo um domínio b5 de citocromo de terminal N, que é encontrado em todas as dessaturases de extremidade frontal (Napier et al., 2003). Dentro do domínio de citocromo b₅é encontrado os oito resíduos invariáveis característicos da superfamília do citocromo bs e do motivo heme de ligação H-P-G-G, que mostrou ser essencial para a atividade enzimática (Napier et al., 1997, Sayanova et al, 1999, Sperling e Heinz 2001). Dentro do domínio de dessaturase das dessaturases PflD6D e PfaD6D putativas estão três caixas de histidina conservadas que são características de todas as dessaturases ligadas à membrana (Shanklin et al., 1994). Uma característica distintiva encontrada em todas as dessaturases de extremidade frontal é que a terceira caixa de histidina contém um resíduo de glutamina na primeira posição (Q-x-x-H-H) ao invés de uma histidina (Napier et al., 1997, Napier et al., 2003, Sperling e Heinz 2001). Exemplo 8 Remoção de íntron

O alinhamento dos três clones de Prímula PaD6D-2 (SEQ ID NO: 22), PwD6D (SEQ ID NO: 25) e PÍID6D (SEQ ID NO: 47) revelaram similaridade extensa entre as seqüências de DNA. PaD6D-2 teve aproximadamente 97% de identidade ao PwD6D e aproximadamente 98% de identidade ao PflD6D. PwD6D teve aproximadamente 98% de identidade ao PflD6D. Um procedimento de PCR de 2 etapas foi utilizado para remover a região de íntron de cada gene. Em resumo, o procedimento acarreta a amplificação dos dois éxons em PCRs separadas, seguido por uma segunda rodada de amplificação pela PCR para combinar os dois éxons juntos. O mesmo conjunto de iniciadores foi usado para cada amplificação de gene por causa da similaridade extensiva entre os três genes da Δ6 dessaturase.

Dois conjuntos de iniciadores foram planejados para amplificar o éxon 1 do inserto PwD6D no pMON83967. O tamanho do produto amplificado foi de 475 pares de base e correspondeu ao éxon 1 de PwD6D. Os dois iniciadores são dados abaixo.

Pw F1: 5 - GTCGACATGGCTAACAAATCTCAAAC -3’ (SEQ ID NO: 55)

Pw R1: 5’-GTAATGCCCAGAGTCGTGACCTATCCATCCGCACTGGATCC3’ (SEQ ID NO: 57)

O éxon 2 foi amplificado pela PCR a partir de pMON83967 usando as seqüências iniciadoras mostradas abaixo. O tamanho do produto amplificado foi de 875 pares de base.

Pw F2: 5’-GATCCAGTGCGGATGGATAGGTCACGACTCTGGGCATTACCG-3’ (SEQ ID NO: 58)

Pw R2: 5-CCTGCAGGTCACCCGAGAGT-3’ (SEQ ID NO: 56)

Os produtos de éxonl e éxon2 amplificados foram depois combinados juntos com os iniciadores Pw F1 e Pw R2 para amplificar pela PCR a ORF completa menos o íntron original. O fragmento de 1350 pares de base resultantes foi ligado no vetor de expressão de levedura pYES2.1-TOPO dando pMON67062.

A remoção da região de íntron de PaD6D-2 em pMON83968 e PflD6D em pMON84810 foi feita utilizando o mesmo procedimento como descrito acima para PwD6D. Os tamanhos dos éxons foram os mesmos como aqueles de PwD6D. Os fragmentos de éxon combinados de 1350 pares de base resultantes foram ligados no vetor de expressão de levedura pYES2.1-TOPO dando pMON67063 para PaD6D-2 e pMON67064 para PflD6D.

Exemplo 9

Transformação e Expressão de Levedura

Os constructos pMON83950 (FIGURA 3), pMON67011 (FIGURA 2), pMON67026, pMON67062, pMON67064 e pMON67065 foram introduzidos na cepa de Saccharomyces cerevisiae auxotrófica em uracila INVSd (Invitrogen) usando o Kit de Transformação S. cerevisiae EasyComp (Invitrogen). Os transformantes foram selecionados nas placas feitas de meio mínimo SC menos uracila com 2% de glicose. As colônias de transformantes foram usadas para ínocular 5 ml de meio mínimo SC menos uracila e 2% de glicose e foram cultivados durante a noite a 30° C. Para a indução, as células de levedura da fase estacionária foram peletizadas e recolocadas em suspensão em meio mínimo SC menos uracila suplementado com 2% de galactose e cultivadas por 1 dia a 25° C seguidos por 3 dias a 15°C. Quando ácidos graxos exógenos foram fornecidos às culturas, 0,01% (v/v) de LA (Δ9, 12-18:2) e 0,01% de ALA (Δ9, 12, 15-18:3) foram adicionados com o emulsificador 0,1% (p/v) de Tergitol. As culturas foram cultivadas 1 dia a 25° C seguido por 3 dias a 15°C e subseqüentemente colhidas pela centrifugação.

Os péletes de célula foram lavados uma vez com tampão TE estéril pH 7,5, para remover o meio e liofilizados por 24 h. A cepa hospedeira transformada com o vetor contendo o gene LacZ foi usada como um controle negativo em todos os estudos.

As FAMEs foram preparadas a partir dos péletes de levedura

- 15 liofilizada pela transmetílação com 0,5 ml de H₂SO₄ a 5% (v/v) em metanol contendo 0,075 mg/ml de 2,6-Di-terc-butil-4-metoxifenol por 90 min a 90°C.

Os FAMEs foram extraídos pela adição de 0,9 ml de NaCI a 10% (p/v) e 0,3 ml de heptano. A camada heptano contendo FAMEs foi removida e usada diretamente para GC como descrito no Exemplo 2.

Os resultados mostrados na Tabela 7 demonstram que os clones de P. juliae pMON67011 e pMON83950, os clones de P. alpicola pMON67026 e pMON67063, o clone de P. waltonii pMON67062, o clone de P. floríndae pMON67064 e o clone de P. farinosa pMON67065 exibiram atividade de Δβ-dessaturase em um sistema de expressão de levedura. Os dados na Tabela 8 demonstram que cada clone de Prímula codifica uma proteína com seletividade para os ácidos graxos de substrato n-3 ou n-6.

Tabela 7: atividade de Δ6 dessaturase de clones de Prímula em um sistema de expressão de levedura.

Vetor	Gene	FA em meio LA*	GLA*	ALA*	SDA*
LacZ-1	LacZ	0,0	0,0	0,0	0,0
LacZ-2	LacZ	0,0	0,0	0,0	0,0

Vetor	Gene	FA em meio	LA*	GLA*	ALA*	SDA*
LacZ-3	LacZ	-	0,0	0,0	0,0	0,0
LacZ-1	LacZ	LA + ALA	23,5	0,0	20,6	0,0
LacZ-2	LacZ	LA + ALA	20,3	0,0	16,6	0,0
LacZ-3	LacZ	LA + ALA	29,1	0,0	28,0	0,0
pMON67011	P. juliae D6D-2	-	0,0	0,0	0,0	0,0
pMON67011	P. juliae D6D-2	-	0,0	0,0	0,0	0,0
pMON67011	P. juliae D6D-2	-	0,2	0,0	0,0	0,0
pMON67011	P. juliae D6D-2	LA + ALA	18,7	6,5	12,2	8,4
PMON67011	P. juliae D6D-2	LA + ALA	14,7	5,4	9,6	7,6
PMON67011	P. juliae D6D-2	LA + ALA	18,6	5,1	14,6	8,8
PMON67026	P. alpicola D6D1	-	0,0	0,0	0,0	0,0
pMON67026	P. alpicola D6D-1	-	0,0	0,0	0,0	0,0
pMON67026	P. alpicola D6D-1	-	0,0	0,0	0,0	0,0
pMON67026	P. alpicola D6D-1	LA + ALA	23,0	3,6	21,8	1,5
pMON67026	P. alpicola D6D-1	LA + ALA	19,1	3,7	17,9	1,5
PMON67026	P. alpicola D6D-1	LA + ALA	22,6	3,1	24,1	1,5
pMON83950	P. juliae D6D-1	-	0,0	0,0	0,0	0,0
pMON83950	P. juliae D6D-1	-	0,0	0,0	0,0	0,0
pMON83950	P. juliae D6D-1	-	0,0	0,0	0,0	0,0
PMON83950	P. juliae D6D-1	LA + ALA	21,2	4,0	14,9	6,7
pMON83950	P. Juliae D6D-1	LA + ALA	13,9	4,2	8,8	6,0
PMON83950	P. juliae D6D-1	LA + ALA	21,7	4,3	16,8	8,3
pMON67062	P. waltonii D6D	-	0,0	0,0	0,0	0,0
PMON67062	P. waltonii D6D	-	0,0	0,0	0,0	0,0
pMON67062	P. waltonii D6D	-	0,0	0,0	0,0	0,0
pMON67062	P. waltonii D6D	LA + ALA	17,5	5,7	12,1	7,1
pMON67062	P. waltonii D6D	LA + ALA	12,8	4,8	8,6	6,0
pMON67062	P. waltonii D6D	LA + ALA	20,9	5,2	16,8	8,4
PMON67063	P. alpicola D6D-2	-	0,0	0,0	0,0	0,0
PMON67063	P. alpicola D6D-2	-	0,0	0,0	0,0	0,0

Vetor	Gene	FA em meio LA*	GLA*	ALA*	SDA*
pMON67063	P. alplcola D6D-2	-	0,0	0,0	0,0	0,0
pMON67063	P. alpicola D6D-2	LA + ALA	19,9	3,7	13,4	6,7
PMON67063	P. alpicola D6D-2	LA + ALA	16,0	3,6	9,5	5,6
PMON67063	P. alpicola D6D2-	LA + ALA	19,8	3,6	14,9	7,8
pMON67064	P. floríndae D6D	-	0,0	0,0	0,0	0,0
pMON67064	P. floríndae D6D	-	0,0	0,0	0,0	0,0
pMON67064	P. floríndae D6D	-	0,0	0,0	0,0	0,0
pMON67064	P. floríndae D6D	LA + ALA	17,4	5,6	12,0	6,9
pMON67064	P. floríndae D6D	LA + ALA	12,8	4,8	8,3	5,9
PMON67064	P. floríndae D6D	LA + ALA	17,1	4,5	14,6	8,3
pMON67065	P. farínosa D6D	-	0,0	0,0	0,0	0,0
PMON67065	P. farínosa D6D	-	0,0	0,0	0,0	0,0
pMON67065	P. farínosa D6D	-	0,0	0,0	0,0	0,0
pMON67065	P. farínosa D6D	LA + ALA	22,1	0,9	19,7	0,3
PMON67065	P. farínosa D6D	LA + ALA	28,8	0,8	27,5	0,2
PMON67065	P. farínosa D6D	LA + ALA	21,1	0,8	22,7	0,3

*Re portadas como uma% do total para todos análitos incluídos no cromatograma GC-FID, incluindo (16:0,16:1,18:0, 20:0, 20:1, 20:2, 22:0, 22:1,22:2) Tabela 8: Comparação de seletividades de substrato n-3:n-6 para Δ6 dessaturases de Prímula.

⁶⁵ :·· L ϋ . . .:: A

Amostra Vetor	Gene	% de conv.% de conv.Relação
de GLA*	de SDA*	n-3:n-6
1	LacZ-1	LacZ	0,00	0,00	0,00
2	LacZ-2	LacZ	0,00	0,00	0,00
3	LacZ-3	LacZ	0,00	0,00	0,00
4	PMON67011	P. juliae D6D-2	25,75	40,64	1,58
5	pMON67011	P. juliae D6D-2	26,98	44,07	1,63
6	PMON67011	P. juliae D6D-2	21,64	37,78	1,75
7	pMON67026	P. alpicola D6D-1	13,60	6,39	0,47
8	pMON67026	P. alpicola D6D-1	16,06	7,83	0,49
9	ΡΜΟΝ67026	P. alpicola D6D-1	12,12	5,83	0,48
10	PMON83950	P. juliae D6D-1	15,82	31,14	1,97
11	PMON83950	P. juliae D6D-1	23,23	40,72	1,75
12	PMON83950	P. juliae D6D-1	16,58	32,92	1,99
13	PMON67062	P. waltonii D6D	24,46	36,80	1,50
14	PMON67062	P. waltonii D6D	27,05	41,15	1,52
15	PMON67062	P. waltonii D6D	19,77	33,41	1,69
16	PMON67063	P, alpicola D6D-2	15,74	33,48	2,13
17	PMON67063	P. alpicola D6D-2	18,53	36,82	1,99
18	PMON67063	P. alpicola D6D-2	15,37	34,39	2,24
19	PMON67064	P. florindae D6D	24,34	36,72	1,51
20	PMON67064	P. florindae D6D	27,29	41,56	1,52
21	PMON67064	P. florindae D6D	20,96	36,13	1,72
22	pMON67065	P. farinosa D6D	4,07	1,25	0,31
23	pMON67065	P. farinosa D6D	2,77	0,79	0,29
24	pMON67065	P. farinosa D6D	3,70	1,09	0,29

* A conversão percentual para GLA foi calculada dividindo-se o valor para GLA (Tabela 1) pela soma dos valores para LA e GLA (Tabela 1). O mesmo cálculo foi feito para SDA usando a soma de ALA e SDA (Tabela 1).

** A relação n-3:n-6 foi calculada dividindo-se a % de conv. de SDA pela% de conv. de GLA.

Exemplo 10

Clonagem, Transformação e Expressão de Arabidopsis

Depois de confirmar a atividade das Primula Δ6 dessaturases em levedura, os genes foram então clonados no pMON73273 (um vetor bi5 nário contendo o promotor 35S CaMV constitutivo) para a expressão em Arabidopsis thaliana para determinar a atividade in planta. PwD6D e PaD6D-2 foram clonados com introns intactos. Os seguintes vetores foram transformados em Arabidopsis: pMON83961 (MaD6D) (FIGURA 8), pMON83962 (PjD6D-1) (FIGURA 9), pMON83963 (PaD6D-2) (FIGURA 10), pMON84964 10 (PjD6D-2) (FIGURA 11), pMON84965 (PaD6D-1) (FIGURA 12) e pMON83966 (PwD6D) (FIGURA 13).

As plantas de Arabidopsis foram cultivadas semeando-se as sementes em vasos de 10,16 cm (4 polegadas) contendo MetroMix 200 saturado com água em osmose reversa (ROW) (The Scotts Company, Colum15 bus, OH). As plantas foram vernalizadas colocando-se os vasos em uma câmara de cultivo coberta plana entre 4 e 7°C, 8 horas luz/dia por 4 a 7 dias. Os planos foram transferidos para uma câmara de cultivo a 22° C, 55% de umidade relativa e 16 horas de luz/dia em uma intensidade média de 160 a 200 μΕinstein/s/m². A coberta foi levantada e deslizada 2,54 cm (1 polegada) 20 depois da germinação e depois foi removida quando as folhas verdadeiras se formaram. As plantas foram regadas pelo fundo, como necessário, com ROW até 2 a 3 semanas depois da germinação. As plantas foram depois regadas pelo fundo, como necessário, com solução de Plantex 15-15-18 (Plantex Corporation Ottawa, Canadá) a 50 ppm de N2. Os vasos foram des25 bastados de modo que 1 planta permanecesse por vaso em 2 a 3 semanas depois da germinação. Uma vez que as plantas começaram a enrolar, a inflorescência primária foi cortada para encorajar o crescimento de brotos axilares.

As plantas de Arabidopsis thaliana transgênica foram obtidas 30 como descrito por Bent et al., Science, 265: 1856 a 1860, 1994 ou Bechtold etal., C. R. Acad. Sci, Life Sciences, 316: 1194 a 1199, 1993. As culturas da cepa ABI de Agrobacterium tumefaciens contendo um dos vetores de trans formação pMON69804, pMON69812 ou pMON69815 foram cultivados durante a noite em LB (10% bacto-triptona, 5% de extrato de levedura e 10% de NaCI com canamicina (75 mg/l), cloranfenicol (25 mg/l) e espectinomicina (100 mg/l). A cultura bacteriana foi centrifugada e recolocada em suspensão 5 em 5% de sacarose + 0,05% de solução de Silwet-77. As porções aéreas de plantas Arabídopsis thaliana Columbia inteiras (em cerca de 5 a 7 semanas de idade) foram imersas na solução resultante por 2 a 3 segundos. A solução em excesso foi removida secando-se as plantas sobre toalhas de papel. As plantas imersas foram colocadas de lado em um plano coberto e transfe10 ridas a uma câmara de cultivo a 19° C. Depois de 16 a 24 horas o domo foi removido e as plantas foram colocadas em posição vertical. Quando as plantas atingiram a maturidade, água foi negada por 2 a 7 dias antes da colheita da semente. A semente colhida foi passada através de uma peneira de malha de aço inoxidável ((16 furos/cm) 40 furos/polegada) para remover os 15 fragmentos.

As sementes colhidas descritas acima foram semeadas em planos contendo MetroMix 200 saturado com ROW (The Scotts Company). As plantas foram vernalizadas e germinadas como descrito acima. Depois que as folhas verdadeiras emergiram, as mudas foram pulverizadas com Roun20 dup para selecionar quanto as plantas transformadas.

As composição de ácido graxo de semente madura (R2) foi determinada pela análise GC de lipídeos derivados de éster metílico como feito acima para a semente de soja. Os valores para as sementes reunidas de cada evento transgênico são mostrados na Tabela 9. As seletividades de 25 substrato n-3 ou n-6 que foram observadas nos ensaios de levedura foram confirmados in planta.

Tabela 9 Análise de Ácido Graxo de Semente de Arabídopsis

Gene	Linhagem	Construção	PA	SA	OA	LA	GLA	ALA	SDA
MaD6D	At S54435:@	pMON83961	7,47	3,73	14,18:	26,31	2,3	17,3	0,72
MaD6D	At S54436:@	PMON83961	7,44	3,91	14,72	25,51	1,72	18,57	0,44
MaD6D	At S54437:@	pMON83961	7,65	3,72	14,51	28,49	0,37	17,97	0

Gene	Linhagem	Construção	PA	SA	OA	LA	GLA	ALA :	SDA
MaD6D	At S54438:@	pMON83961	7,65	3,53	13,55	25,48	2,09	19,18*	0,87
MaD6D	At S54439:@	pMON83961	7,7	3,51	13,69	27,81	1,63	17,07	0,45
MaD6D	At S54440:@	pMON83961	7,38	3,55	14,42	25,95	1,6	18,26	0,53
MaD6D	At S54441:@	pMON83961	7,24	3,54	13,53	24,24	4,4	17,68	1,52
MaD6D	At S54442:@	pMON83961	7,29	3,6	14,7	25,31	3,58	16,45	0,98
MaD6D	At S54443:@	PMON83961	7,01	3,61	14,46	27,25	0,44	18,49	0
MaD6D	At S54444:@	PMON83961	7,68	3,75	14,34	27,89	1,19	17,95	0,05
PjD6D-1	At S54446:@	PMON83962	7,5	3,34	13,52	25,05	2,06	13,81	5,93
PjD6D-1	At S54447:@	pMON83962	7,29	3,15	14,03	26,18	1,64	14	5,25
PjD6D-1	At S54448:@	pMON83962	7,2	3,08	13,37	27,24	0,49	17	2,72
PjD6D-1	At_S54449:@	pMON83962	7,24	3,17	14,28	27,52	0,46	16,65	2,44
PjD6D-1	At S54450:@	PMON83962	7,24	3,18	13,38	26,3	1,32	15,16	4,92
PjD6D-1	At S54451:@	PMON83962	7,53	3,04	14,49	28,01	1,8	13,03	4,79
PjD6D-1	At S54452:@	PMON83962	7,59	3,44	13,16	25,54	1,72	13,3	6,69
PjD6D-1	At S54453:@	pMON83962	7,22	3,21	14,05	26,72	1,14	14,35	4,48
PjD6D-1	At S54454:@	pMON83962	6,98	3,23	13,48	25,12	2,27	12,62	6,55
PjD6D-1	At S54455:@	pMON83962	7,34	3,18	14,63	27,07	0,16	18,57	1,1
PjD6D-1	At S54456:@	PMON83962	7,26	3,44	15,8	27,83	0,5	15,81	2,45
PjD6D-1	At S54457:@	PMON83962	7,41	3,11	14,03	27,39	1,92	12,97	4,95
PjD6D-1	At S54458:@	pMON83962	7,2	3,26	13,38	26,18	1,31	14,54	5,1
PjD6D-1	At S54459:@	pMON83962	7,23	3,16	13,25	26,38	1,32	15,07	4,46
PjD6D-1	At S54460:@	pMON83962	7,21	3,19	13,48	26,35	1,32	14,36	5,16
PjD6D-1	At_S54461	ΡΜΟΝ83962	7,18	3,34	13,5	26,64	0,79	15,65	3,96
PjD6D-1	At S54462:@	PMON83962	7,11	3,15	13,88	27,28	1,12	15,02	3,84
PjD6D-1	At S54463:@	pMON83962	7,4	3,19	13,37	26,35	0,61	17,58	2,93
PjD6D-1	At S54464:@	pMON83962	7,57	3,34	13,72	26,12	1,24	15,26	4,69
PaD6D-2	At S54466:@	pMON83963	7,25	3,18	14,44	26,54	1,46	14,44	4,45
PaD6D-2	At S54467:@	PMON83963	7,28	3,07	14,66	27,82	0,31	17,25	1,59
PaD6D-2	At S54468:@	pMON83963	7,34	3,22	15,05	26,37	2,01	13,14	4,86
PaD6D-2	At S54469:@	PMON83963	6,91	2,94	14,35	26,77	1,32	14,33	4,38

Gene	Linhagem	Construção	PA	SA	OA	LA	GLA	ALA	SDA
PaD6D-2	At S54470:@	PMON83963	7,36	3,26	13,31	27,8	1,36	13,39	4,52
PaD6D-2	At S54471:@	PMON83963	7,14	3,07	14,38	25,73	3,26	11,32	6,18
PaD6D-2	At S54472:@	PMON83963	7,67	3,28	14,01	27,82	0	19,54	0,3
PaD6D-2	At S54473:@	PMON83963	7,48	3,27	13,95	26,26	2,12	13,24	5,57
PaD6D-2	At S54474:@	pMON83963	7,22	3,01	14,95	27,87	1,02	14,5	3,48
PaD6D-2	At S54475:@	pMON83963	7,44	3,07	13,33	26,46	1,58	14,27	5,24
PaD6D-2	At S54476:@	PMON83963	7,35	3,17	14,22	27,48	0,8	15,51	3,25
PaD6D-2	At S54477:@	PMON83963	8,01	2,7	15,85	30,18	0	16,8	0
PaD6D-2	At S54478:@	PMON83963	7,45	3,05	13,47	27,48	0,13	19,53	0,84
PaD6D-2	At S54479:@	PMON83963	7,14	2,99	15,32	27,71	0,24	17,74	0,9
PaD6D-2	At S54480:@	pMON83963	7,37	3,1	14,8	27,87	0,07	18,64	0,45
PaD6D-2	At S54481:@	pMON83963	7,39	3,2	13,49	27,32	0,1	19,9	0,6
PaD6D-2	At S54482:@	PMON83963	7,29	3,1	13,72	27,63	0,25	17,96	1,63
PaD6D-2	At S54483:@	PMON83963	7,04	2,97	15,2	28,08	0	18,71	0,1
PaD6D-2	At S54484:@	PMON83963	7,09	2,89	14,89	28,18	0,05	19,73	0
PaD6D-2	At S54485:@	PMON83963	7,17	2,93	15,33	27,21	1,52	13,48	4,57
PjD6D-2	At S54487:@	pMON83964	7,18	3,06	14,91	27,66	0,79	15,58	3
PjD6D-2	At S54488:@	pMON83964	7,36	3,09	14,13	27,75	1,34	14,21	4,15
PjD6D-2	ALS54489:@	PMON83964	7,48	2,9	13,86	27,52	0,6	16,94	2,95
PjD6D-2	At S54490:@	PMON83964	7,39	3,08	14,12	27,93	0,63	16,23	2,88
PJD6D-2	At S54491:@	pMON83964	7,35	3,05	15,03	28,07	0	19,04	0,16
PjD6D-2	At S54492:@	PMON83964	7,59	3,07	14,84	27,99	0	19,18	0,33
PjD6D-2	At S54493:@	pMON83964	7,36	2,97	13,57	28,18	0,68	16,38	2,96
PjD6D-2	At S54494:@	PMON83964	7,39	3,03	13,37	27,5	0,98	15,71	3,96
PjD6D-2	At S54495:@	PMON83964	7,46	2,98	13,59	26,97	1,02	16,11	3,83
PjD6D-2	At S54496:@	PMON83964	7,65	3,02	14,54	27,83	0,35	17,43	1,87
PjD6D-2	At S54497:@	PMON83964	7,62	2,94	13,64	28,44	0,89	15,27	3,61
PjD6D-2	At S54498:@	pMON83964	7,55	3,06	14,06	27,53	1,01	14,89	4,37
PjD6D-2	At S54499:@	pMON83964	7,19	3,12	14,62	26,77	1,55	13,28	5,14
PjD6D-2	At S54500:@	PMON83964	7,42	2,9	13,83	27,84	0,39	17,55	2,3

Gene	Linhagem	Construção	PA	SA	OA	LA	GLA	ALA	SDA
PjD6D-2	At S54501;@	PMON83964	7,51	3,09	14,23	28,21	0	19,5	0,1
PjD6D-2	At S54502:@	PMON83964	7,41	3	13,56	27,41	0,81	16,36	3,33
PjD6D-2	At S54503:@	pMON83964	7,33	2,95	13,46	26,74	1,09	15,92	4,28
PaD6D-1	At S54505:@	pMON83965	7,24	2,97	14,25	27,24	0,96	19,3	0,21
PaD6D-1	At S54506:@	pMON83965	7,37	3,12	14,25	26,81	1,26	19,08	0,24
PaD6D-1	At S54507:@	PMON83965	7,48	3,03	15,61	26,86	0,52	18,75	0,09
PaD6D-1	At S54508:@	pMON83965	7,61	3,07	13,41	25,28	2,2	19,67	0,51
PaD6D-1	At S54509:@	pMON83965	7,33	3,24	14,21	25,71	2,32	18,64	0,48
PaD6D-1	At S54510:@	pMON83965	7,66	3,09	15,86	24,84	1,1	18,88	0,23
PaD6D-1	At S54511:@	pMON83965	7,55	3,08	15,2	25,25	0,94	19,36	0,21
PaD6D-1	At S54512:@	pMON83965	7,43	3,16	13,51	26	1,37	19,63	0,29
PaD6D-1	At S54513:@	ΡΜΟΝ83965	8,11	3,3	14,94	24,33	0,45	20,26	0,12
PaD6D-1	At S54514:@	pMON83965	7,35	3,14	14,18	26,35	1,36	19,27	0,36
PaD6D-1	At S54515:@	ΡΜΟΝ83965	7,52	2,95	12,14	26,65	0,63	22,45	0,21
PaD6D-1	At S54516:@	pMON83965	7,86	3,29	15,13	23,72	0,74	20,03	0,21
PaD6D-1	At S54517:@	pMON83965	7,2	3,49	15,25	27,77	0,26	18,14	0
PaD6D-1	At S54518:@	pMON83965	7,17	2,81	15,7	23,13	0,06	20,4	0
PaD6D-1	ALS54519:@	pMON83965	6,9	3,07	15,34	26,65	0,14	19,19	0
PaD6D-1	At S54520:@	pMON83965	8,64	3,7	15,97	20,96	0,97	18,39	0,28
PaD6D-1	At S54521:@	pMON83965	7,2	3,19	13,39	26,03	1,63	19,36	0,32
PaD6D-1	At—S54522:@	pMON83965	8,77	3,69	15,83	20,94	0	18,92	0
PaD6D-1	At S54523:@	pMON83965	7,43	3,33	14,1	26,94	0,23	19,93	0
PwD6D	At S54524:@	pMON83966	7,37	3,17	15,27	25,68	2,72	13,22	4,36
PwD6D	At S54525:@	pMON83966	7,15	3,38	14,38	25,61	2,86	12,9	4,82
PwD6D	At S54526:@	pMON83966	6,87	3,6	14,68	27,25	0,23	17,54	1,19
PwD6D	At S54527:@	pMON83966	7,01	3,45	15,06	26,18	1,43	14,72	3,88
PwD6D	At—S54528:@	PMON83966	7,21	3,04	14,6	27,87	0,11	18,52	0,65
PwD6D	At—S54530:@	pMON83966	7,59	3,17	15,34	21,81	0,77	17,64	2,92
PwD6D	At S54531:@	pMON83966	7,4	3,58	14,39	26,71	0,4	17,68	1,74
PwD6D	At—S54532:@	pMON83966	6,28	3,44	14,76	24,09	2,51	12,87	6,1

Gene	Linhagem	Construção	PA	SA	OA	LA	GLA	ALA	SDA
PwD6D	At S54533:@	pMON83966	7,01	3,48	14,15	25,54	2,01	12,98	5,54
PwD6D	At S54534:@	pMON83966	7,35	3,35	14,6	26,37	2,25	13,61	4,32
PwD6D	At S54535:@	pMON83966	7,24	3,56	14,59	27,04	0,45	17,02	2,17
PwD6D	ALS54536:@	PMON83966	7,22	3,54	13,14	25,92	1,49	15,35	4,53
PwD6D	At S54537:@	pMON83966	7,18	3,6	13,51	26,27	1,61	15,03	4,02
PwD6D	At S54538:@	pMON83966	7,75	3,29	13,57	25,43	2,33	13,96	5,35
PwD6D	At S54539:©	PMON83966	7,15	3,13	14,86	26,63	0,16	18,99	0,35
PwD6D	At S54540:@	PMON83966	7,66	3,28	14,22	26,2	0,97	16,45	3,24
PwD6D	At-S54541:@	PMON83966	7,39	2,98	13,83	27,29	0	20,28	0
PwD6D	At S54542:@	PMON83966	7,39	3,32	14,71	26,08	1,56	14	4,18
controle	At S54543:@	pMON26140	6,82	3,04	14,82	25,91	0	20,07	0
controle	At„S54544:@	pMON26140	7,49	3,23	13,69	27,33	0	19,77	0
controle	At„S54545:@	PMON26140	7,32	3,23	15,05	27,47	0	18,6	0
controle	At S54546:@	pMON26140	7,52	3,3	13,73	27,15	0	19,86	0
controle	At—S54547:@	PMON26140	7,44	3,21	14,21	27,43	0	19,36	0
controle	At S54548:@	pMON26140	7,39	3,25	14,1	27,05	0	19,59	0
controle	At S54549:@	PMON26140	7,71	3,28	13,61	27,98	0	20	0
controle	At-S54550:@	pMON26140	7,62	3,24	13,58	28,28	0	18,83	0
controle ;	At S54551:@	PMON26140	7,52	3,18	14,73	27,27	0	19,78	0
controle	At S54552:@	PMON26140	7,44	3,21	14,95	27,69	0	18,43	0
controle	ALS54553:@	pMON26140	7,72	3,26	13,74	27,2	0	19,94	0
controle	At S54554:@	pMON26140	7,3	3,11	15,09	27,73	0	18,75	0
controle	At S54555:@	pMON26140	7,44	2,99	14,51	29,21	0	18,34	0
controle	Àt S54556:@	pMON26140	7,52	3,19	15,22	27,24	0	18,92	0
controle	At S54557;©	PMON26140	7,49	3,07	14,6	28,87	0	18,17	0
controle	At S54558:@	PMON26140	7,45	3,11	14,72	27,88	0	18,88	0
controle	At-S54559:@	PMON26140	7,63	3,26	14,39	27,12	0	19,57	0
controle	At S54560:@	pMON26140	7,74	3,15	13,17	28,5	0	19,61	0
controle	At S54561:@	pMON26140	7,39	3,15	14,34	27,06	0	19,42	0
controle	At S54562:@	pMON26140	7,25	3,12	15,78	27,96	0	17,93	0

Gene	Linhagem	Construção	PA	SA	OA	LA	GLA	ALA	SDA
controle	At„S54563:@	pMON26140	7,59	3,24	14,32	27,2	0	19,54	0
controle	At S54564:@	pMON26140	6,73	2,82	16,17	26,66	0	18,63	0 .
controle	At S54565:@	PMON26140	7,2	3	15,14	27,78	0	18,66	0
controle	At_S54566:@	PMON26140	7,33	3,16	14,6	27,28	0	19,26	0

Exemplo 10

Transformação e Expressão de Canola

Os vetores pMON83961, pMON83962, pMON83963 e pMON83964 descritos no Exemplo 9 também foram transformados em Ca5 nola de acordo com os métodos no Exemplo 4. pMON70500 foi incluído como um controle negativo. A composição de ácido graxo das folhas foi determinada pela análise GC de lipídeos derivados de éster metílico. Os dados são mostrados na Tabela 10. Mais uma vez as seletividades de substrato observadas em levedura e Arabidopsis foram confirmadas.

_M 10 Tabela 10 Análise de Ácido Graxo de Tecido de Folha de Canola

Evento	Construção	PA	SA	OA	LA	GLA	ALA	SDA
BN G8912	PMON70500	11,64	0,63	0,39	10,68	0	53,2	0
BN„G8913	pMON70500	12,31	0,79	0,57	11,93	0	53,87	0
BN—G8914	pMON70500	16,59	1,72	2,09	20,81	0	47,72	0
BNG8915	PMON70500	11,74	0,82	0,27	7,86	0	58,66	0
BN G8918	PMON70500	10,14	0,59	0,35	11,18	0	52,94	0
BNG8919	PMON70500	10,47	0,75	0,43	13,63	0	50,63	0
BN G8925	PMON70500	11,3	0,72	0,51	13,69	0	50,95	0
BN G8926	PMON70500	11,61	0,84	0,77	15,8	0	49,08	0
BN G8928	PMON70500	10,93	0,69	0,63	16,22	0	49,41	0
BNG8929	PMON70500	15,53	2,06	2,18	13,04	0	47,53	0
BNG9007	PMON83961	14,54	1,83	2,23	11,27	3,3	46,08	1,5
BN—G9008	PMON83961	16,91	2,38	1,41	10,26	3,81	46,21	2,01
BN G9009	PMON83961	17,11	1,86	3,04	16,21	0,48	47,15	0,23
BN G9011	PMON83961	18,45	2,27	3,2	19,45	7,25	37,69	1,95
BN„G9013	PMON83961	17,95	2,39	2,66	20,5	1,29	44,84	0,37

BN G9014	PMON83961	16,65	1,94	1,83	12	4,73	42,26	2,79
BNG9033	PMON83962	16,89	2,23	1,16	16,35	0	50,45	2,52
BN G9034	PMON83962	15,83	2,16	1,64	15,89	0	50,66	1,11
BNG9035	PMON83962	16,36	3,18	2,74	23	0	40,73	3,14
BNG9036	ΡΜΟΝ83962	17,01	2,65	2,4	21,09	0,37	41,23	5,12
BNG9037	PMON83962	16,08	2,64	1,82	17,68	0,17	44,39	3,29
BNG8828	PMON83963	13,18	1,32	2,58	14	0,15	47,07	4,1
BN G8829	PMON83963	11,56	1,34	1,42	12,07	0,66	37,31	7,55
BNG8830	PMON83963	12,49	1,37	1,31	12,24	0,31	41,45	5,87
BN G9020	PMON83963	16,66	2,54	4,3	23,54	1,42	41,6	0
BNG9021	pMON83963	16,72	1,91	2,01	14,58	0	47,55	1,36
BNJG9024	pMON83964	18,32	2,63	2,14	25,17	0,63	37,29	5,34
BN G9025	pMON83964	18,41	2,42	3,16	26,57	0	39,23	0,51
BN G9026	pMON83964	12,23	1,53	1,8	15,08	0,14	42,48	2,99

Todas as composições e métodos aqui divulgadas e reivindicadas podem ser fabricadas e executadas sem experimentação indevida considerando-se a presente descrição. Embora as composições e métodos des5 ta invenção tenham sido descritas em termos das modalidades preferidas, estará evidente para aqueles versados na técnica que variações podem ser aplicadas às composições e métodos e nas etapas ou na seqüência de etapas do método aqui descrito sem divergir do conceito, espírito e escopo da invenção. Mais especificamente, estará evidente que certos agentes que são 10 tanto química quanto fisiologicamente relacionados podem ser substituídos no lugar dos agentes aqui descritos embora os mesmos resultados ou similares são obtidos. Todos de tais substitutos e modificações similares evidentes àqueles versados na técnica são considerados como estando dentro do espírito, escopo e conceito da invenção como definidos pelas reivindicações 15 anexas.

REFERÊNCIAS

As referências listadas abaixo são aqui incorporadas por referência até o grau em que elas suplementem, expliquem, forneçam um ante74 cedente ou divulguem a metodologia, técnicas e/ou composições aqui utilizados.

Patente U.S. 4.826.877

Patente U.S. 4.910.141

Patente U.S. 5.011.770

Patente U.S. 5.158.975

Patente U.S. 5.302,523

Patente U.S. 5.378.619

Patente U.S. 5.384.253

Patente U.S. 5.464.765

Patente U.S. 5.538.877

Patente U.S. 5.538.880

Patente U.S. 5.550.318

Patente U.S. 5.563.055

Patente U.S. 5.591.616

Patente U.S. 5.952.544

Patente U.S. 6.603.061

Ausubel et aí, Em: Current Protocols in Molecular Biology, Green Publishing

Assoc., NY, 1994.

Baerson etal., Plant Mol. Biol., 22(2): 255 a 267, 1993.

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Claims

1. Vetor recombinante, caracterizado pelo fato de que compreende um polinucleotídeo que compreende a sequência de ácido nucléico de SEQ ID NO: 2 ou SEQ ID NO: 3 ou uma sequência de nucleotídeos degenerada da mesma codificando a mesma sequência de aminoácidos, em que o polinucleotídeo é operacionalmente ligado a um promotor heterólogo.

2. Vetor recombinante de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que compreende ainda pelo menos uma sequência adicional escolhida de:

(a) sequências reguladoras operativamente ligadas ao polinucleotídeo;

(b) marcadores de seleção operativamente ligados ao polinucleotídeo;

(c) sequências marcadoras operativamente ligadas ao polinucleotídeo; e (d) uma sequência direcionadora operativamente ligada ao polinucleotídeo.

3. Vetor recombinante de acordo com a reivindicação 1 ou 2, caracterizado pelo fato de que o referido promotor é um promotor regulado no desenvolvimento, específico de organela, específico de tecido, constitutivo ou específico de célula.

4. Vetor recombinante de acordo com a reivindicação 1 ou 2, caracterizado pelo fato de que o referido promotor é selecionado do grupo consistindo em 35S CaMV, 34S FMV, Napin, 7S alfa, 7S alfa', Glob e Lec.

5. Vetor recombinante de acordo com a reivindicação 1 ou 2, caracterizado pelo fato de que é um cassete de expressão.

6. Método de produzir óleo de semente contendo ácidos graxos ômega-3 a partir de sementes de planta, caracterizado pelo fato de que compreende as etapas de:

(a) incorporar em uma célula de planta o vetor recombinante, como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 5;

(b) obter plantas transgênicas a partir das referidas células de

Petição 870160019414, de 12/05/2016, pág. 10/17 planta transformadas;

(c) triar as referidas plantas ou descendência da mesma tendo herdado o vetor recombinante por possuir um perfil de ácidos graxos ômega3 desejável;

(d) obter sementes das referidas plantas; e (e) extrair o óleo a partir das referidas sementes.

7. Método de acordo com a reivindicação 6, caracterizado pelo fato de que o óleo da semente contém ácido estearidônico.

8. Método de acordo com a reivindicação 6, caracterizado pelo fato de que compreende ainda uma etapa de cultivar as células de planta transformadas.

9. Método de acordo com a reivindicação 8, caracterizado pelo fato de que o ácido graxo ômega-3 é ácido estearidônico.

10. Método de produzir uma planta compreendendo óleo de semente contendo ácidos graxos ômega-3, caracterizado pelo fato de que compreende introduzir o vetor recombinante como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 5, em uma planta produtora de óleo.

11. Método de acordo com a reivindicação 10, caracterizado pelo fato de que a planta é canola ou soja.

12. Método de acordo com a reivindicação 10, caracterizado pelo fato de que a planta é definida ainda como transformada com uma sequência de ácido nucléico que codifica um polipeptídeo tendo atividade de dessaturase que dessatura uma molécula de ácido graxo no carbono 15.

13. Método de acordo com a reivindicação 10, caracterizado pelo fato de que o método é definido ainda por compreender a introdução do vetor recombinante, como definido na reivindicação 3, em uma pluralidade de plantas produtoras de óleo e a triagem das referidas plantas ou sua descendência tendo herdado o vetor recombinante para uma planta tendo um perfil desejado de ácidos graxos ômega-3.

14. Método de acordo com a reivindicação 10, caracterizado pelo fato de que a planta é transformada com uma sequência de ácido nucleico compreendendo SEQ ID NO:17, 18 ou 19 ou uma sequência de nucleotí-

Petição 870160019414, de 12/05/2016, pág. 11/17

3 deos degenerada da mesma codificando a mesma sequência de aminoácidos.

15. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 614, caracterizado pelo fato de que a planta é soja e o óleo de semente tem um teor de ácido estearidônico de 5% a 50% e um teor de ácido gamalinoleico de menos do que 10%.

16. Método de acordo com a reivindicação 15, caracterizado pelo fato de que o óleo de semente compreende menos do que 10% de ácido alfa-linoleico, ácido linoleico e ácido gama-linoleico combinados.

17. Método de acordo com a reivindicação 15, caracterizado pelo fato de que o óleo de semente tem um teor de ácido estearidônico de 15% a 35%.

18. Método de acordo com a reivindicação 15, caracterizado pelo fato de que o óleo de semente tem um teor de ácido estearidônico de 22% a 30%.

19. Método de acordo com a reivindicação 15, caracterizado pelo fato de que o óleo de semente tem menos do que 5% de ácido gamalinoleico.

20. Método de acordo com a reivindicação 15, caracterizado pelo fato de que o óleo de semente tem um teor de ácido estearidônico de 15% a 35% e um teor de ácido gama-linoleico de menos do que 5%.

21. Método de acordo com a reivindicação 15, caracterizado pelo fato de que o óleo de semente tem uma relação de ácidos graxos ômega3 para ômega-6 de 0,35:1 a 3,5:1.

22. Método de acordo com a reivindicação 15, caracterizado pelo fato de que o óleo de semente tem uma relação de ácidos graxos ômega3 para ômega-6 de 1:1 a 3,5:1.

23. Método de acordo com a reivindicação 10, caracterizado pelo fato de que a planta é uma planta selecionada do grupo consistindo em Arabidopsis thaliana, semente oleaginosa de Brassica, colza, girassol, açafroa, milho, algodão, linho, jojoba, árvore do sebo, tabaco, cacau, amendoim, plantas frutíferas, plantas cítricas e plantas que produzem nozes e bagas.