CN103841825B - 从微生物生物质中获取含脂质组合物的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了粒化微生物生物质、在超临界条件下从所述粒状生物质中提取精制的脂质组合物并在短程蒸馏条件下蒸馏所述精制的脂质组合物至少一次以获取含脂质级份的方法。本发明也公开了通过酯交换并富集含脂质级份制备含脂质的油浓缩物的方法。

Description

从微生物生物质中获取含脂质组合物的方法
本申请要求提交于2011年2月11日的美国临时申请61／441,836、提交于2011年2月11日的美国临时申请61／441,842、提交于2011年2月11日的美国临时申请61／441,849、提交于2011年2月11日的美国临时申请61／441,854、和提交于2011年5月17日的美国临时申请61／487,019的权益，它们全文以引用方式并入本文。
技术领域
本发明涉及从微生物生物质中获取含脂质级份的方法。具体地，提供了粒化微生物生物质、从粒状生物质中提取提取油并在短程蒸馏条件下蒸馏提取油至少一次以获取含脂质级份的方法。可进一步富集这种含脂质级份。
背景技术
微生物如丝状真菌、酵母和藻类产生多种脂质，包括脂肪酰、甘油脂、磷脂、鞘脂、糖脂、聚酮化合物、甾醇脂和孕烯醇酮脂类。从其中产生这些脂质、并且从而已经实施多种方法的微生物细胞中提取这些脂质中的一些是有利的。
通常从微生物中提取的一类脂质是甘油脂，包括脂肪酸甘油酯(“三酰基甘油”或“TAG”)。TAG是主要的脂肪酸储存单元，并且从而可含有长链多不饱和脂肪酸(PUFA)，以及较短的饱和的和不饱和的脂肪酸与较长链的饱和脂肪酸。对在药物和膳食产品中包括PUFA如二十碳五烯酸[“EPA”；ω-3]和二十二碳六烯酸[“DHA”；ω-3]的兴趣一直在持续地增长。有效地并高性价比地提取、精制和纯化包含PUFA的脂质组合物的方法因此是尤其期望的。
多种典型的脂质分离方法涉及破碎微生物细胞(例如经由机械、酶促或化学手段)，随后使用有机或绿色溶剂进行油提取。破碎方法从微生物细 胞中释放细胞内脂质，这使得其在提取期间容易触及溶剂。在提取后，通常除去溶剂(例如通过蒸发如施加真空、温度或压力变化等除去)。
所得的提取油富含亲脂组分，其在脂质体中积累。一般来讲，脂质体的主要组分由TAG、麦角固醇酯、其它甾醇酯、游离麦角固醇和磷脂组成。存在于脂质体中的PUFA主要是TAG、二酰基甘油、单酰基甘油、磷脂和游离脂肪酸组分。可随后精制提取油以产生高度纯化的富含PUFA的TAG级份。关于纯化的TAG级份的最终规格可为用途依赖性的，例如，根椐油是否用作化妆品或药物组合物等中的添加剂或补充剂(例如在食物组合物、婴儿代乳品、动物饲料等中)。可接受的污染物标准是自己制定的(其中特定污染物导致不可取的特性，例如模糊／浑浊、气味)或由外部营养委员会确定的(例如Voluntary Monograph Of TheCouncil for Responsible Nutrition[Washington，D.C.]，2006年3月，指定了ω-3EPA、ω-3DHA、以及它们的混合物的酸、过氧化物、茴香胺、TOTOX、多氯代二苯并-对-二氧杂环己烯和多氯代二苯并呋喃的最大值)。
美国专利6,727,373公开了包含PUFA的微生物油，其具有高甘油三酯含量和高氧化稳定性。此外，描述了一种从来源于经巴氏消毒的发酵液的微生物生物质中回收此类油的方法，其中所述微生物生物质经挤出形成颗粒、干燥、然后使用合适溶剂从干燥颗粒中提取所述油。
美国专利6,258,964公开了提取微生物细胞中包含的脂溶性组分的方法，其中该方法需要干燥包含脂溶性组分的微生物细胞，同时使用挤出机将干燥的微生物细胞破碎并模塑成粒料，并且使用有机溶剂提取包含的脂溶性组分。
美国专利申请公布2009／0227678公开了从包含细胞和水的组合物中获取脂质的方法，该方法包括使组合物与干燥剂接触并且从细胞中回收脂质。
美国专利4,675,132公开了浓缩鱼油中的PUFA部分的方法，所述鱼油包含相对低比例的饱和和单不饱和脂肪酸部分，其链长与拟浓缩的PUFA部分相同，包含具有低级链烷醇的酯交换鱼油甘油酯以形成低级烷基脂肪酸酯的混合物，并在超临界条件下用二氧化碳(CO2)提取所述酯。
开发用于产生高浓度EPA的连续逆流超临界CO2分级方法的工艺流程图由V.J.Krukonis等人(Adv.Seafood Biochem.，Pap.Am.Chem.Soc.Annu. Meet.(1992)，召开年份：1987，169-179)公开。该方法的原料是鲱油的尿素结晶乙酯，并且该设计的基础是在90％的产量下产物浓度为90％EPA(乙酯)。
寻找其中可在包含PUFA的脂质组合物中调节TAG、二酰基甘油、单酰基甘油和游离脂肪酸的分配的方法。期望获得包含PUFA的脂质组合物的方法，所述组合物具有改善的氧化稳定性。也期望获得富含TAG的包含PUFA的脂质组合物的方法，该方法是用于获得此类组合物的经济型方法。
美国专利6,166,230(GIST-Brocades)描述了用极性溶剂处理包含PUFA的微生物油(例如来自高山被孢霉(Mortierella alpina)的微生物油)以提取至少一种溶解在溶剂中的甾醇(例如链甾醇)，并且随后从油中分离至少一些包含该甾醇的溶剂的方法，其中油具有小于1.5％的甾醇含量。
美国专利7,695,626(Martek)描述了从微生物生物质(例如裂殖壶菌属(Schizochytrium))中回收包含PUFA的中性脂质的方法，所述方法包括下列步骤：在提取过程中使生物质与非极性溶剂接触以回收脂质，精制和／或漂白和／或除臭脂质组合物，将极性溶剂加到脂质组合物中，冷却混合物以选择性地沉淀至少一种其它化合物(例如饱和甘油三酯、含磷材料、蜡酯、包含甾醇酯的饱和脂肪酸、甾醇、角鲨烯、烃类)并且随后除去来自脂质组合物的这种不可取化合物。
以前的方法尚未利用短程蒸馏技术作为有效手段以避免将PUFA(具体地，高度不饱和的脂肪酸)暴露于高温并除去来自微生物油的麦角固醇(麦角-5,7,22-三烯-3β-醇；CAS登录号57-87-4)污染物。
国际专利申请公布WO2011／080503A2公开了用于从进料混合物中回收PUFA产物的色谱分离方法，该方法包括将进料混合物导入模拟的或实际的移动床色谱分离设备，该设备具有多个连接的色谱柱，它们包含作为洗脱液的醇水溶液，其中所述设备具有包括至少第一区域和第二区域的多个区域，每个区域具有提取物流和提余液流，从中可从所述多个连接色谱柱中收集液体，并且其中(a)包含PUFA产物连同极性较高组分的提余液流从第一区域内的柱中收集并被引入第二区域中的非邻近柱，和／或(b)包含PUFA产物连同极性较低组分的提取物流从第二区域内的柱中收集并被引入 第一区域中的非邻近柱，所述PUFA产物与每个区域中的进料混合物的不同组分分离。纯化多种来源于鱼油的原料以制备85至大于98％的EPA乙酯。虽然国际专利申请公布WO2001／080503A2展示了从鱼油中回收高纯度EPA和DHA的方法，该公开也声明适用于分馏的进料混合物可获取自“合成来源，包括获取自经基因修饰的植物、动物和微生物(包括酵母)的油”。此外，“当期望的PUFA产物是EPA时，经基因修饰的酵母尤其适用”。
发明内容
在第一实施例中，本发明涉及方法，其包括：
(a)粒化具有水分含量并包含含油微生物的微生物生物质；
(b)提取步骤(a)的粒状微生物生物质以产生提取油；以及
(c)在短程蒸馏条件下蒸馏步骤(b)的提取油至少一次，其中所述蒸馏产生馏出液级份和含脂质级份。
在所述方法的第二实施例中，含油微生物选自酵母、藻类、真菌、细菌、类眼虫、原生藻菌和卵菌。优选地，酵母是耶氏酵母(Yarrowia)。
在所述方法的第三实施例中，含油微生物包含至少一种在油中的多不饱和脂肪酸，其中多不饱和脂肪酸优选选自：亚油酸、γ-亚麻酸、二十碳二烯酸、二高-γ-亚麻酸、花生四烯酸、二十二碳四烯酸、ω-6二十二碳五烯酸、α-亚麻酸、十八碳四烯酸、二十碳三烯酸、二十碳四烯酸、二十碳五烯酸、ω-3二十二碳五烯酸和二十二碳六烯酸。
在所述方法的第四实施例中，微生物生物质的水分含量在约1至10重量％的范围内。
在所述方法的第五实施例中，所述步骤(a)粒化微生物生物质包括：
(1)将微生物生物质和至少一种能够吸收油的研磨剂混合以提供破碎的生物质混合物，所述破碎的生物质混合物包含破碎的微生物生物质；
(2)将破碎的生物质混合物与至少一种粘合剂共混以提供能够形成固体粒料的可固化混合物；以及
(3)使所述可固化混合物形成固体粒料以提供粒状微生物生物质。
优选地，步骤(1)混合微生物生物质和(2)共混至少一种粘合剂在挤出机中进行，同时进行，或在挤出机中同时进行；并且步骤(3)由所述可固化混合物形成所述固体粒料包括选自下列的步骤：
(i)通过模具挤出所述可固化混合物以形成股线；
(ii)使所述股线干燥并破裂；以及
(iii)将步骤(i)通过模具挤出所述可固化混合物以形成股线和步骤(ii)使所述股线干燥并破裂组合。
在本发明方法的第六实施例中，破碎的微生物生物质在双螺杆挤出机中产生，所述双螺杆挤出机包括：(a)约0.04至0.4KW／(kg／hr)的总比能量输入；(b)使用具有逐渐缩短的节线长度的轴衬元件的压实区；和(c)使用流量限制的压缩区；其中在挤出机内，压实区在压缩区之前。
在所述方法的第七实施例中，至少一种研磨剂优选具有选自下列的特性：
(a)所述至少一种研磨剂为具有2.0至6.0的莫氏硬度和根据ASTM方法D1483-60测定的0.8或更高的吸油系数的颗粒；
(b)所述至少一种研磨剂选自二氧化硅和硅酸盐；并且
(c)所述至少一种研磨剂以固体粒料中的微生物生物质、研磨剂和粘合剂的总重量计约1至20重量％存在。
至少一种粘合剂优选具有选自下列的特性：
(a)所述至少一种粘合剂选自水和碳水化合物，所述碳水化合物选自蔗糖、乳糖、果糖、葡萄糖和可溶性淀粉；并且
(b)所述至少一种粘合剂以固体粒料中的微生物生物质、研磨剂和粘合剂的总重量计约0.5至10重量％存在。
在所述方法的第八实施例中，粒料具有选自下列的特性：
(a)所述粒料具有约0.5至约1.5mm的平均直径和约2.0至约8.0mm的平均长度；并且
(b)所述粒料包含以固体粒料中的微生物生物质、研磨剂和粘合剂的总重量计约70至约98.5重量％的包含含油微生物的微生物生物质，约1至约20重量％的至少一种能够吸收油的研磨剂和约0.5至10重量％的至少一种粘合剂。
在所述方法的第九实施例中，用有机溶剂进行提取以产生提取油，并且所述提取油在所述步骤(c)蒸馏提取油之前被脱胶和任选地漂白。
在所述方法的第十实施例中，提取包括：
(1)用溶剂处理粒状微生物生物质，所述溶剂包括液体或超临界流体二氧化碳的，其中所述包含含油微生物的粒状微生物生物质还包含至少一种在油中的多不饱和脂肪酸，从而获取：
(i)包含基本上不含磷脂的脂质级份的提取物；和
(ii)包含磷脂的残余生物质；以及
(2)分馏步骤(1)部分(i)中获取的提取物至少一次以获取具有精制的脂质组合物的提取油，所述脂质组合物包含至少一种多不饱和脂肪酸，其中精制的脂质组合物相对于未用溶剂处理的粒状微生物生物质的油组合物富含三酰基甘油。
在所述方法的第十一实施例中，步骤(b)的提取油包含甾醇级份，步骤(c)的馏出液级份包含甾醇，并且步骤(c)的含脂质级份在与尚未经受短程蒸馏的提取油中甾醇量进行比较时包含减少的甾醇量。甾醇级份可包含一种或多种甾醇，所述甾醇选自：豆甾醇、麦角固醇、芸苔甾醇、菜油甾醇、β-谷甾醇和链甾醇。
在所述方法的第十二实施例中，具有精制的脂质组合物的提取油还包含至少300mg／100g的甾醇级份，所述脂质组合物包含至少一种多不饱和脂肪酸并且相对于未用溶剂处理的粒状微生物生物质的油组合物富含三酰基甘油。在短程蒸馏条件下蒸馏至少一次时，产生包含甾醇的馏出液级份和含脂质级份，所述含脂质级份包含三酰基甘油并且在与尚未经受短程蒸馏的具有精制的脂质组合物的提取油中甾醇量进行比较时包含减少的甾醇量。
在第十三实施例中，所述方法还包括：
(d)对步骤(c)的含脂质级份进行酯交换；以及
(e)对步骤(d)的经酯交换的含脂质级份进行富集以获取油浓缩物。
在第十四实施例中，含油微生物积累微生物油超过其干细胞重量25％；并且微生物油包含按总脂肪酸的重量％计30至70重量％的二十碳五烯酸且基本上不含二十二碳六烯酸；并且步骤(e)的富集通过至少两种方法的组合进行，所述第一方法包括分馏并且所述第二方法选自：尿素加合物 形成、液相色谱、超临界流体色谱、模拟移动床色谱、实际移动床色谱、以及它们的组合；并且油浓缩物是包含按油的重量％计至少70重量％的二十碳五烯酸且基本上不含二十二碳六烯酸的二十碳五烯酸浓缩物。
生物保藏
下列生物材料保藏于美国典型培养物保藏中心(American Type CultureCollection)(ATCC)(10801University Boulevard，Manassas，VA20110-2209)，并具有下列名称、保藏号和保藏日期。
生物材料 保藏号 保藏日期
解脂耶氏酵母(Yarrowia lipolytica)Y4128 ATCC PTA-8614 2007年8月23日
解脂耶氏酵母(Yarrowia lipolytica)Y8412 ATCC PTA-10026 2009年5月14日
解脂耶氏酵母(Yarrowia lipolytica)Y8259 ATCC PTA-10027 2009年5月14日
解脂耶氏酵母(Yarrowia lipolytica)Y8406 ATCC PTA-10025 2009年5月14日
解脂耶氏酵母(Yarrowia lipolytica)Y2096 ATCC PTA-7184 2005年10月26日
解脂耶氏酵母(Yarrowia lipolytica)Y2201 ATCC PTA-7185 2005年10月26日
解脂耶氏酵母(Yarrowia lipolytica)Y2047 ATCC PTA-7186 2005年10月26日
解脂耶氏酵母(Yarrowia lipolytica)Y3000 ATCC PTA-7187 2005年10月26日
解脂耶氏酵母(Yarrowia lipolytica)Y4127 ATCC PTA-8802 2007年11月29日
上面列出的生物材料将按照国际承认的用于专利程序目的的微生物保藏的布达佩斯条约的有关条款来保存。所列出的保藏物将会被保持在指定的国际保藏机构中至少30年，并且一旦准予专利公开它就将会对公众开放。在由政府行为授予的专利权的部分废除中，保藏物的可用性不会构成实践主题发明的许可。
根据美国专利申请公布2009-0093543-A1中描述的方法，解脂耶氏酵母Y4305来源于解脂耶氏酵母Y4128。根据美国专利申请公布2010-0317072-A1中描述的方法，解脂耶氏酵母Y9502来源于解脂耶氏酵母Y8412。类似地，根据美国专利申请公布2010-0317072-A1中描述的方法，解脂耶氏酵母Y8672来源于解脂耶氏酵母Y8259。
附图说明和序列表
图1示出定制的高压提取设备流程图。
图2图示了提取的一个实施例，其中使粒状微生物生物质与CO2接触以获取随后分级的提取物。
图3图示了提取的一个实施例，其中使微生物生物质与CO2接触以获取提取物。
图4图示了实例12中获得的提取曲线。
图5以流程图形式提供了本发明方法的概观。具体地，微生物发酵产生未处理的微生物生物质，其随后被粒化。固体粒料的油提取产生残余生物质和提取油。使用短程蒸馏(SPD)条件蒸馏提取油产生馏出液级份和含脂质级份，可任选地将它们进一步酯交换并富集以产生油浓缩物。
图6提供了下列质粒的质粒图谱：(A)pZKUM；和(B)pZKL3-9DP9N。
下面的序列遵循37C.F.R.§1.821-1.825(“对含有核苷酸序列和／或氨基酸序列公开内容的专利申请的要求-序列规则”(“Requirements for Patent ApplicationsContaining Nucleotide Sequences and／or Amino Acid Sequence Disclosures theSequence Rules”))，并且符合世界知识产权组织(World Intellectual PropertyOrganization)(WIPO)ST.25标准(1998)以及EPO和PCT的序列表要求(规则5.2和49.5(a-bis)以及行政指令(Administrative Instructions)的208节和附录C)。核苷酸的符号和格式以及氨基酸序列数据符合如37C.F.R.§1.822所示的规则。
SEQ ID NO：1-8是开放阅读框编码基因、蛋白(或它们的片段)、或质粒，如表1所述。
表1：核酸和蛋白质序列号概述
具体实施方式
本文引用的所有专利和非专利文献的公开全文以引用方式并入本文。
当数量、浓度或其它值或参数以范围、优选范围或优选上限值和优选下限值的列表形式给出时，其应理解为具体地公开由任何范围上限或优选值和任何范围下限或优选值的任何一对所构成的所有范围，而不管所述范围是否被单独地公开。凡在本文中给出某一数值范围之处，该范围都意在包括其端点，以及位于该范围内的所有整数和分数，除非另行指出。不旨在将本发明的范围限制为限定范围时详述的具体值。
如本文所用，术语“包含”、“包括”、“具有”或“含有”或其任何其它变型旨在包括非排他的包括。例如，包含一系列元素的组合物、混合物、工艺、方法、制品或设备不必仅限于那些元素，而可以包括其它未明确列出的元素，或此类组合物、混合物、工艺、方法、制品或设备固有的元素。此外，除非有相反的明确说明，“或”是指包含性的“或”，而不是指排他性的“或”。例如，下列任何一个均表示满足条件A或B：A是真的(或存在的)且B是假的(或不存在的)、A是假的(或不存在的)且B是真的(或存在的)、以及A和B都是真的(或存在的)。
同样，涉及元素或组分实例(即次数)的数目在本发明元素或组分前的不定冠词“一个”或“一种”旨在是非限制性的。因此，应将“一个”或 “一种”理解为包括一个或至少一个，并且元素或组分的词语单数形式也包括复数指代，除非有数字明显表示单数。
如本文所用的，术语“发明”或“本发明”旨在指如本文中的权利要求和说明书中所描述的本发明的所有方面和所有实施例，并无意于局限于任一具体实施例或方面。
在该公开中使用下列定义：
“二氧化碳”缩写为“CO2”。
“美国典型培养物保藏中心”缩写为“ATCC”。
“多不饱和脂肪酸”缩写为“PUFA”。
“磷脂”缩写为“PL”。
“三酰基甘油”缩写为“TAG”。
“脂肪酸”缩写为“FFA”。
“总脂肪酸”缩写为“TFA”。
“脂肪酸甲酯”缩写为“FAME”。
“乙酯”缩写为“EE”。
“干细胞重量”缩写为“DCW”。
“毫托”缩写为“mTorr”。
“短程蒸馏”缩写为“SPD”。
如本文所用，术语“微生物生物质”指来自含油微生物的微生物发酵的微生物细胞物质，所述含油微生物产生微生物油。微生物生物质可以是下列形式：全细胞、全细胞溶解产物、匀化细胞、部分水解细胞物质、和／或破碎细胞。优选地，微生物油包含至少一种PUFA。
术语“未处理的微生物生物质”指在用溶剂提取前的微生物生物质。任选地，未处理的微生物生物质在用溶剂提取之前可经受至少一种机械加工(例如干燥生物质、破碎生物质、粒化生物质、或这些方法的组合)。术语“未处理的微生物生物质”和“未精制的微生物生物质”本文互换使用。
术语“粒化”或“制粒”是指制备固体粒料的方法。
术语“固体粒料”是指具有结构刚度并对外形或体积变化具有抗性的粒料。期望固体粒料在室温下不发粘。可将大量固体粒料包裹在一起多日，它们的粒料结构不降解，并且不会结合在一起；从而，期望大量粒料是自由 流动的粒化组合物。固体粒料本文由微生物生物质经由“粒化”方法形成，并且因此也可称为“粒状微生物生物质”。
术语“破碎的生物质混合物”是指通过混合微生物生物质和至少一种研磨剂获得的产物。破碎的生物质混合物包含破碎的微生物生物质。
术语“破碎的微生物生物质”是指已经经受破碎过程的微生物生物质，其中所述破碎导致占微生物生物质至少50％的破碎效率。
术语“破碎效率”是指在加工期间已经破碎或破裂的细胞壁百分比，其通过光学可视化进行定性测定或根据下式进行定量测定：％破碎效率=(％游离油*100)除以(％总油)，其中测量固体粒料的％游离油和％总油。微生物生物质提高的破碎效率通常导致微生物生物质内包含的微生物油提取量增加。
术语“％总油”是指存在于固体粒料样品内的所有油的总量(例如包括来自中性脂质级份[DAG、MAG、TAG]的脂肪酸、游离脂肪酸、磷脂等，它们存在于细胞膜、脂质体等内)。％总油通过转化已经经受机械破碎的粒化样品内的所有脂肪酸、随后进行酰基脂质的甲醇分解和甲基化来进行有效地测量。因此，脂肪酸总量(表达为甘油三酯形式)表示为样品的总油含量。在本发明中，％总油优选地通过使用研钵和研杵将固体粒料轻柔地碾磨成细粉、并且随后称重等分试样(一式三份地)用于分析来测定。通过在80℃下与乙酰氯／甲醇的反应将样品中的脂肪酸(主要以甘油三酯形式存在)转化成对应的甲酯。然后向每个样品加入已知量的C15：0内标用于校正目的。各个脂肪酸的测定通过配有火焰离子化检测器毛细管气相色谱(GC／FID)进行。并且，脂肪酸总量(表达为甘油三酯形式)表示为样品的总油含量。
术语“％游离油”是指游离的和未结合的油量(例如表达为甘油三酯形式的脂肪酸，但不是所有磷脂)，其易于从特定的固体粒料样品中提取得到。因此，例如％游离油的分析将不包括存在于未破碎的膜结合脂质体中的油。在本发明中，％游离油优选地通过与正-庚烷一起搅拌样品、离心、并且随后蒸发上清液至干燥来进行测定。所得的残余油随后进行重量分析确定并表达为初始样品的重量百分比。
术语“研磨剂”是指一种能够吸收与微生物生物质混合以产生破碎的生物质混合物的油的剂。优选地，至少一种研磨剂以100份微生物生物质计约1至50份存在。在一些优选的实施例中，研磨剂为二氧化硅或硅酸盐。其它优选的研磨剂特性在下文中讨论。
术语“可固化混合物”是指通过共混至少一种粘合剂与破碎的生物质混合物获得的产物。可固化混合物是在去除溶剂时(例如在干燥步骤中去除水)能够形成固体粒料的混合物。
术语“粘合剂”是指与破碎的生物质混合物共混以产生可固化混合物的剂。优选地，至少一种粘合剂以100份微生物生物质计约0.5至20份存在。在一些优选的实施例中，粘合剂是碳水化合物。其它优选的粘合剂特性在下文中讨论。
如本文所用，术语“残余生物质”是指来自用于产生微生物油的微生物发酵的微生物细胞物质，其已经用溶剂(例如无机或有机溶剂)提取过至少一次。当经受提取的初始微生物生物质为固体粒料形式时，残余的生物质可称为“残余粒料”。
术语“减少的”或“耗尽的”指具有较小的量，例如仅略少于初始量的量，或者例如在指定物质中完全缺失的量，并且包括上述两者之间的所有量。
术语“脂质”指任何脂溶性的(即，亲脂的)、天然存在的分子。脂质是具有多种关键生物学功能的化合物的不同组，所述功能例如细胞膜的结构组分、能量贮存来源和信号途径的中间体。可以将脂质广泛定义为疏水性或两亲性小分子，它们完全地或部分地起源于酮脂酰或异戊二烯基团。表2显示了对脂质的综述，它基于Lipid Metabolites andPathways Strategy(LIPID MAPS)分类体系(National Institute of General MedicalSciences，Bethesda，MD)。
表2：脂质类别概述
术语“油”是指在25℃时为液体且通常为多不饱和的脂类物质。在含油生物中，油构成了总脂质的主要部分。“油”主要由三酰基甘油(TAG)组成，但是也可包含其它中性脂质、磷脂(PL)和游离脂肪酸(FFA)。油脂中的脂肪酸组成和总脂质的脂肪酸组成一般是相似的；因此，总脂质中的PUFA浓度的升高或降低将对应于油脂中的PUFA浓度的升高或降低，反之亦然。
“微生物油”是由微生物产生的油。这个通用术语可指非浓缩的微生物油、提取油、含脂质级份、纯化油或浓缩的微生物油，如下文进一步描述。在纯化或富集微生物油中的特定脂肪酸后，油可以多种化学形式存在(例如三酰基甘油、烷基酯、盐或游离脂肪酸的形式)。
术语“提取油”或“原油”(上述术语本文可互换使用)是指已经从细胞物质(例如其中合成油的微生物)中分离出来的油。提取油通过多种方法获得，其中最简单的方法仅涉及物理方法。例如，使用多种挤压构造(例如，螺杆、螺旋压榨机、活塞、珠磨器等)的机械压碎能够从细胞材料分离 油。作为另外一种选择，可通过用多种有机溶剂处理(例如己烷、异己烷)、酶提取、渗透压冲击破碎、超声波提取、超临界流体提取(例如CO2提取)、皂化、以及这些方法的组合进行油提取。通常可从微生物中提取出的油量与破碎效率成比例。任选地进一步纯化或浓缩提取的油。
术语“未浓缩的微生物油”是指提取油尚未基本上富含一种或多种脂肪酸。因此，“未浓缩的微生物油”的脂肪酸组合物基本上类似于微生物产生的微生物油的脂肪酸组合物。未浓缩的微生物油可为未浓缩的提取油或未浓缩的纯化油。
术语“具有精制的脂质组合物的提取油”或“精制的脂质组合物”是指如美国专利公布2011-0263709-A1所公开的超临界二氧化碳(CO2)提取产物的微生物油组合物。因此，精制的脂质组合物是提取油。精制的脂质组合物可包含中性脂质和／或FFA，但是基本上不含PL。精制的脂质组合物优选具有小于30ppm的磷，并且更优选小于20ppm的磷，其通过题目为“Analysis for Phosphorus in Oil by Inductively Coupled Plasma OpticalEmission Spectroscopy”的American Oil Chemists’Society(AOCS)Official MethodCa20-99(Official Methods and Recommended Practices of the AOCS，第6版，Urbana，IL，AOCS，2009，该文献以引用方式并入本文)来测定。精制的脂质组合物可相对于微生物生物质的油组合物富含TAG并且可任选地包含甾醇级份。精制的脂质组合物可进行进一步纯化，例如经由如本文所述的短程蒸馏进行纯化以产生“纯化油”或“含脂质级份”。
术语“脱胶”是指降低提取油中的磷脂和其它杂质浓度的方法。
术语“漂白”是指降低提取油中颜料／颜色化合物和残余金属浓度的方法。
术语“甾醇”或“甾醇级份”是指影响细胞内膜渗透性的生物组分。已经从所有大类的存活生物中分离出甾醇，然而分离出的主要甾醇多种多样。在高等动物中的主要甾醇是胆固醇，而β-谷甾醇是高等植物中常见的主要甾醇(但是它很多情况下附随有菜油甾醇和豆甾醇)。关于存在于微生物中的主要甾醇的概述是较困难的，因为组合物取决于特定的微生物菌种。例如，含油酵母解脂耶氏酵母主要包含麦角固醇，真菌菌属被孢霉属(Morteriella)主要包含胆固醇和链甾醇，并且原生藻菌(stramenopiles) 菌属裂殖壶菌属(Schizochytrium)主要包含芸苔甾醇和豆甾醇。常存在于含甾醇微生物油中的甾醇概述在下表3中示出；与之相反，这些甾醇通常不存在于鱼油中。当存在于微生物油中时，表3的甾醇趋于沉淀到提取油外面，这是由于其高熔点和在较低储存温度下减少的溶解度，这导致油浑浊。非常期望通过降低这些甾醇的浓度来最小化提取油或由此得到的油产物中不可取的浑浊。
表3：在含甾醇微生物油中的甾醇
通用名 化学名 CAS登录号
豆甾醇 豆甾-5,22-二烯-3-醇 83-48-7
麦角固醇 麦角甾-5,7,22-三烯-3β-醇 474-67-9
芸苔甾醇 麦角甾-5,22-二烯-3β-醇 57-87-4
菜油甾醇 (24R)-麦角甾-5-烯-3β-醇 474-62-4
β-谷甾醇 豆甾-5-烯-3-醇， 83-46-5
链甾醇 胆甾-5,24-二烯-3β-醇 313-04-2
术语“蒸馏”是指基于混合物在沸腾液体混合物中的挥发性差异来分离混合物的方法。蒸馏是单元操作或物理分离过程，并且不是化学反应。
术语“短程蒸馏”(“SPD”)是指在极高真空度下的分离方法操作，其中SPD装置在接近蒸发器处配有内部冷凝器，使得来自材料的挥发性化合物在蒸发后仅行进短距离到达冷凝表面。因此，这种分离方法有最小的热降解。
术语“纯化油”是指与提取油中的杂质浓度相比具有降低浓度的杂质的提取油，所述杂质例如磷脂、痕量金属、游离脂肪酸、颜色化合物、微量组分氧化产物、挥发性和／或臭味化合物、和甾醇(例如麦角固醇、芸苔甾醇、豆甾醇、胆固醇)。纯化方法通常不浓缩或富集微生物油，使得特定脂肪酸被大量富集，并且因此纯化油大部分情况下是非浓缩的。
术语“含脂质级份”和“SPD-纯化油”本文互换使用。这些术语是指提取的微生物油，其包含具有一种或多种PUFA的TAG-级份，所述油已经在SPD条件下经受蒸馏方法至少一次。如果甾醇级份存在于提取油中，与短程蒸馏之前油中的甾醇含量相比，蒸馏方法减少含脂质级份中的甾醇量。
虽然SPD能够浓缩乙酯、甲酯和游离脂肪酸，但是该方法通常不浓缩TAG(例如，除非在极端高温下运行，这随后导致TAG分解)。因为含脂质级份中的大部分PUFA为TAG形式，并且SPD方法通常不浓缩TAG使得特定的脂肪酸被大量富集，就本文所述目的大部分情况下认为含脂质级份是非浓缩的。
术语“酯交换”是指由酸或碱催化剂催化的化学反应，其中将一种脂肪酸酯转化成一种不同的脂肪酸酯。
“脂肪酸乙酯”[“FAEE”]是指一般通过在酯化作用或酯交换过程中，游离脂肪酸或它们的衍生物与乙醇的合成反应来源的脂质化学形式。
术语“富集”是指微生物油中的一种或多种脂肪酸浓度相对于未浓缩的微生物油中的一种或多种脂肪酸浓度提高的方法。例如，如本文所述，按TFA重量％计包含30至70重量％的期望PUFA的微生物油被富集或浓缩以产生“浓缩油”。
术语“浓缩油”是指包含按油重量％计至少70重量％的期望PUFA的油。优选地，浓缩油获取自按总脂肪酸重量％计包含30至70重量％期望的PUFA的微生物油，其中所述微生物油获取自含油微生物，所述含油微生物积累油超过其干细胞重量25％，这将在下文中详述。具体地，微生物油的乙酯或其它酯可能富含期望的PUFA并通过本领域常用的方法分离。
术语“二十碳五烯酸浓缩物”或“EPA浓缩物”是浓缩油并且是指包含按油重量％计至少70重量％的EPA的ω-3油且基本上不含DHA。EPA浓缩物获取自包含按总脂肪酸的重量％计30至70重量％的EPA且基本上不含DHA的微生物油，其中所述微生物油获取自含油微生物，所述含油微生物积累超过油其干细胞重量25％。至少70重量％的EPA将为游离脂肪酸、甘油三酯(例如TAG)、酯、以及它们的组合的形式。酯最优选地为乙酯形式。
“中性脂质”是指那些通常以贮存脂肪形式存在于细胞中的脂质体中的脂质，它们如此地命名是因为在细胞pH下，所述脂质无带电基团。它们一般是完全非极性的，对水无亲和力。中性脂质一般指脂肪酸的甘油单酯、二酯和／或三酯，也分别称为单酰基甘油(MAG)、二酰基甘油(DAG)或 三酰基甘油(TAG)，或统称为酰基甘油。为了从酰基甘油中释放FFA，必须发生水解反应。
术语“三酰基甘油”与术语“甘油三酯”同义并且指由三个脂肪酰残基酯化的甘油分子组成的中性脂质。TAG能够包含长链PUFA和饱和脂肪酸，以及较短链的饱和的和不饱和的脂肪酸。在存活生物中，TAG是主要的脂肪酸储存单元，因为甘油主链有助于稳定储存或运输期间的PUFA分子。与之相反，游离脂肪酸被快速氧化。
术语“总脂肪酸”(TFA)本文指所有细胞脂肪酸的总量，所述脂肪酸在给定实例中能通过碱酯交换方法(本领域已知的方法)被衍生化成脂肪酸甲酯(FAME)，例如它可以是生物质或油。因此，总脂肪酸包括来自中性脂质级份(包括DAG、MAG和TAG)和来自极性脂质级份(包括磷脂酰胆碱和磷酸酰乙醇胺级份)的脂肪酸，但不包括FFA。
术语细胞的“总脂质含量”是TFA的量度，以占干细胞重量(DCW)的百分比的形式表示，不过总脂质含量可近似地以FAME占DCW的百分比(FAME％DCW)量度。因此，总脂质含量(TFA％DCW)等于，例如，脂肪酸毫克数／100毫克DCW。
总脂质中的脂肪酸浓度本文表示为TFA的重量百分比(％TFA)，例如每100毫克TFA的给定脂肪酸毫克数。除非在本文公开内容中另作具体说明，给定脂肪酸相对于微生物细胞和微生物油中的总脂质的百分比等同于按％TFA计的脂肪酸浓度(例如总脂质的％EPA等同于EPA％TFA)。
浓缩油中的脂肪酸酯(分别为和／或脂肪酸和／或甘油三酯)的浓度用重量％油[“％油”]表示，例如给定脂肪酸酯(分别是和／或脂肪酸和／或甘油三酯)的毫克数／100毫克浓缩油。这个测量单位用于描述例如EPA浓缩物中的EPA浓度。
在一些情况下，将细胞中给定脂肪酸的含量表达为它占干细胞重量的重量％(％DCW)是有用的。因此例如二十碳五烯酸％DCW将根据下式测定：(二十碳五烯酸％TFA)*(TFA％DCW)]／100。然而，以给定的脂肪酸占干细胞重量的重量％表示的给定的脂肪酸在细胞中的含量可以近似计算为：(二十碳五烯酸％TFA)*(FAME％DCW)]／100。
术语“脂质特征”和“脂质组成”是可互换的，并且指在特定脂质级份中，例如在总脂质或油脂中，包含的各种脂肪酸分别的量，其中所述量以占TFA的重量百分比形式表示混合物中存在的脂肪酸的总量应当是100。
术语“脂肪酸”指不同链长的长链脂族酸(链烷酸)，链长为约C12-C22(尽管更长和更短链长的酸均是已知的)。主要的链长介于C16和C22之间。脂肪酸的结构可用简单的记号系统“X：Y”来表示，其中X表示具体脂肪酸中碳(“C”)原子的总数，并且Y表示双键的数目。另外的关于“饱和脂肪酸”对“不饱和脂肪酸”、“单不饱和脂肪酸”对“多不饱和脂肪酸”(“PUFA”)、以及“ω-6脂肪酸”(ω-6或n-6)对“ω-3脂肪酸”(ω-3或n-3)之间的区别的详细信息在美国专利7,238,482中有所提供，该专利以引用方式并入本文。
表4提供了用于描述本文PUFA的命名。在标题为“简化符号”一栏中，ω-指代系统用于表明碳数目、双键的数目和最接近ω碳的双键位置，双键位置的计数从ω碳开始(为此ω碳的编号为1)。该表的其余部分汇总了ω-3和ω-6脂肪酸以及它们的前体的通用名、将在整个说明书中使用的缩写以及每种化合物的化学名。
表4：多不饱和脂肪酸及其前体的命名
通用名 缩写 化学名 简化符号
肉豆蔻酸 -- 十四酸 14：0
棕榈酸 棕榈酸 十六酸 16：0
棕榈油酸 -- 9-十六碳烯酸 16：1
硬脂酸 -- 十八酸 18：0
油酸 -- 顺式-9-十八碳烯酸 18：1
亚油酸 LA 顺式-9，12-十八碳二烯酸 18：2ω-6
γ-亚麻酸 GLA 顺式-6，9，12-十八碳三烯酸 18：3ω-6
二十碳二烯酸 EDA 顺式-11，14-二十碳二烯酸 20：2ω-6
二高-γ-亚麻酸 DGLA 顺式-8，11，14-二十碳三烯酸 20：3ω-6
花生四烯酸 ARA 顺式-5,8，11，14-二十碳四烯酸 20：4ω-6
α-亚麻酸 ALA 顺式-9，12，15-十八碳三烯酸 18：3ω-3
十八碳四烯酸 STA 顺式-6，9，12，15-十八碳四烯酸 18：4ω-3
十九碳五烯酸 NDPA 顺式-5，8，11，14，17-十九碳五烯酸 19：5ω-2
二十碳三烯酸 ETrA 顺式-11，14，17-二十碳三烯酸 20：3ω-3
二十碳四烯酸 ETA 顺式-8，11，14，17-二十碳四烯酸 20：4ω-3
二十碳五烯酸 EPA 顺式-5,8，11，14，17-二十碳五烯酸 20：5ω-3
二十一碳五烯酸 HPA 顺式-6，9，12，15，18-二十一碳五烯酸 21：5ω-3
二十二碳四烯酸 DTA 顺式-7，10，13，16-二十二碳四烯酸 22：4ω-3
二十二碳五烯酸 DPAn-6 顺式-4,7，10，13，16-二十二碳五烯酸 22：5ω-6
二十二碳五烯酸 DPAn-3 顺式-7，10，13，16，19-二十二碳五烯酸 22：5ω-3
二十二碳六烯酸 DHA 顺式-4,7，10，13，16，19-二十二碳六烯酸 22：6ω-3
除非特别指出，在本公开中使用的术语EPA、DHA、NDPA和HPA将分别指相应的酸或酸衍生物(例如甘油酯、酯、磷脂、酰胺、内酯、盐等)。例如，“EPA-EE”将具体地指EPA乙酯。
NDPA和HPA通常存在于鱼油中。鱼油产生的浓缩EPA将常含有这些脂肪酸，它们在最终的EPA组合物中作为杂质存在(参见例如美国专利申请公布2010-0278879和国际专利申请公布WO2010／147994A1)。
术语“基本上不含DHA”指包含不超过约0.05重量％的DHA。因此，当DHA(以游离脂肪酸、三酰基甘油、酯、以及它们的组合的形式存在)浓度按重量％油计不超过约0.05重量％的DHA时，EPA浓缩物基本上不含DHA。相似地，当DHA(以游离脂肪酸、三酰基甘油、酯、以及它们的组 合的形式存在)浓度按TFA重量％计不超过约0.05重量％的DHA时，微生物油基本上不含DHA。
术语“基本上不含NDPA”和“基本上不含HPA”相当于上文提供的术语“基本上不含DHA”的定义，虽然脂肪酸NDPA或HPA分别被DHA取代。
术语“高水平PUFA生产”是指生产占微生物宿主总脂质至少约25％的PUFA，优选地占微生物宿主总脂质至少约30％的PUFA，更优选地占微生物宿主总脂质至少约35％的PUFA，更优选地占微生物宿主总脂质至少约40％的PUFA，更优选地占微生物宿主总脂质至少约40-45％的PUFA，更优选地占微生物宿主总脂质至少约45-50％的PUFA，更优选地占微生物宿主总脂质至少约50-60％，并且最优选地占微生物宿主总脂质至少约60-70％的PUFA。PUFA的结构形式不受限制；因此例如PUFA可在总脂质中以FFA形式或酯化形式存在，例如酰基甘油、磷脂、硫脂或糖脂。
术语“含油微生物”指能够产生微生物油的微生物。因此，含油微生物可为酵母、藻类、类眼虫、原生藻菌、真菌、或它们的组合。在优选的实施例中，含油微生物是含油的。
术语“含油的”指那些倾向于以油形式贮存它们的能源的生物(Weete，FungalLipid Biochemistry，第2版，Plenum，1980)。通常，含油微生物的细胞油脂符合S形曲线，其中脂质浓度提高直至在对数生长期晚期或稳定生长期早期达到最高浓度，随后在稳定生长期晚期和死亡期逐渐下降(Yongrmanitchai和Ward，Appl.Environ.Microbiol.，57：419-25(1991))。含油微生物积累油超过它们的干细胞重量的约25％的情形并不鲜见。
含油生物的例子包括但不限于来自选自下列菌属的生物：被孢霉属(Mortierella)、破囊壶菌属(Thraustochytrium)、裂殖壶菌属(Schizochytrium)、耶氏酵母属(Yarrowia)、假丝酵母属(Candida)、红酵母属(Rhodotorula)、红冬孢酵母属(Rhodosporidium)、隐球酵母属(Cryptococcus)、丝孢酵母属(Trichosporon)、和油脂酵母属(Lipomyces)。
术语“含油酵母”是指归类为能够产油的酵母的那些含油微生物。含油酵母的例子包括但不限于下列属：耶氏酵母属、假丝酵母属、红酵母属、红冬孢酵母属、隐球酵母属、丝孢酵母属和油脂酵母属。
如本文所用，术语“药物”指一种化合物或物质，如果它在美国售卖，将受FederalFood，Drug and Cosmetic Act的Section503或505控制。
术语“基本上不含环境污染物”分别是指油浓缩物或EPA浓缩物不含环境污染物或最多仅含痕量环境污染物，其中这些污染物包括化合物如多氯联苯[“PCB”](CAS No.1336-36-3)、二氧杂环己烯、溴化阻燃剂和杀虫剂(例如毒杀芬和二氯二苯三氯乙烷[“DDT”]及其代谢物)。
通常，含油微生物的脂质蓄积向应存在于生长培养基中的总的碳氮比率而触发。该过程(导致含油微生物中游离棕榈酸(16：0)的从头合成)在美国专利7,238,482中有详细描述。棕榈酸是长链饱和的和不饱和的脂肪酸衍生物的前体，这些脂肪酸衍生物通过延伸酶和去饱和酶的作用形成。
可将多种脂肪酸(包括饱和的和不饱和的脂肪酸以及短链和长链脂肪酸)掺入TAG，它是脂肪酸的主要贮藏单位。在本文所述的含油微生物中，向TAG中掺入长链PUFA是最合乎期望的，尽管PUFA的结构形式是不受限制的(因此，例如，EPA在总脂质中可以作为FFA或以酯化形式如酰基甘油、磷脂、硫脂或糖脂存在)。更具体地，在一个实施例中，含油微生物将产生至少一种PUFA，其选自LA、GLA、EDA、DGLA、ARA、DTA、DPAn-6、AlA、STA、ETrA、ETA、EPA、DPAn-3、DHA、以及它们的混合物。更优选地，所述至少一种PUFA具有至少C20的链长，例如PUFA选自EDA、DGLA、ARA、DTA、DPAn-6、ETrA、ETA、EPA、DPAn-3、DHA、以及它们的混合物。在一个实施例中，至少一种PUFA选自ARA、EPA、DPAn-6、DPAn-3、DHA、以及它们的混合物。在另一个优选的实施例中，所述至少一种PUFA选自EPA和DHA。
大多数PUFA以中性脂质形式掺入TAG中并储存在脂质体中。然而，重要的是认识到在含油生物中测量总PUFA应至少包括那些位于磷脂酰胆碱、磷脂酰乙醇胺和TAG级份中的PUFA。
本发明涉及方法，其包括：
(a)粒化具有水分含量并包含含油微生物的微生物生物质；
(b)提取步骤(a)的粒状微生物生物质以产生提取油；以及
(c)在短程蒸馏条件下蒸馏步骤(b)的提取油至少一次，其中所述蒸馏产生馏出液级份和含脂质级份。
在另一个实施例中，如上文所示的方法还可包括下列步骤：
(d)对步骤(c)的含脂质级份进行酯交换；以及
(e)对步骤(d)的经酯交换的含脂质级份进行富集以获取油浓缩物。
虽然本发明涉及从粒状微生物生物质中获取含脂质级份或浓缩油的方法，可用于获取含油微生物自身的相关方法也在示意图5中示出。图5的各个方面将在下文中详细讨论，本文用粗体字示出图5的特定部分。
含油微生物随着微生物的生长和繁殖，通常经由微生物发酵产生微生物生物质。微生物生物质可来自任何微生物，无论是天然存在的微生物或重组微生物(“遗传工程的”)，它们能够产生的微生物油。因此，例如含油微生物可选自酵母、藻类、类眼虫、原生藻菌、真菌、以及它们的混合物。优选地，所述微生物将能够具有在微生物油中的高水平PUFA产量。
例如商业来源的ARA油通常从被孢霉属(Mortierella，丝状真菌)、虫霉属(Entomophthora)、草腐霉枯萎属(Pythium)和紫球藻属(Porphyridium，一种红藻)微生物中产生。最需要注意的是，Martek Biosciences Corporation(Columbia，MD)生产包含ARA的真菌油(美国专利5,658,767)，其基本上不含EPA并且来源于高山被孢霉(Mortierella alpina)或腐皮病诱发腐霉(Pythium insidiuosum)。
类似地，EPA可基于利用的特定微生物的天然能力经由多个不同方法由微生物产生[例如异养生物硅藻小环藻属(Cyclotella sp.)和菱形藻属(Nitzschia sp.)(美国专利5,244,921)；假单胞菌属(Pseudomonas)、交替单胞菌属(Alteromonas)或希瓦氏菌属(Shewanella)菌种(美国专利5,246,841)；草腐霉枯萎属(Pythium)的丝状真菌(美国专利5,246,842)；或长被孢霉属(Mortierella elongata)、微小被孢霉(M.exigua)、或喜湿被孢霉(M.hygrophila)(美国专利5,401,646)；和微拟球藻(Nannochloropsis)属的微绿球藻(eustigmatophycean alga)(Krienitz，L.和M.Wirth，Limnologica，36：204-210(2006))]。
DHA也可使用基于天然微生物的天然能力的方法产生。参见例如开发用于裂殖壶菌属(Schizochytrium)菌种的方法(美国专利5,340,742；美国专利6,582,941)；吾肯氏壶菌属(Ulkenia)(美国专利6,509,178)；假单胞菌属(Pseudomonas sp.)YS-180(美国专利6,207,441)；破囊壶菌属(Thraustochytrium)菌株LFF1(U.S.2004／0161831A1)；寇氏隐甲藻(Crypthecodinium cohnii)(美国专利申请公布2004／0072330A1；de Swaaf，M.E等人，Biotechnol.Bioeng.，81(6)：666-672(2003)和Appl.Microbiol.Biotechnol.，61(1)：40-43(2003))；Emiliania sp.(日本专利公布(Kokai)5-308978(1993))；和Japonochytriumsp.(ATCC28207；日本专利公布(Kokai)199588／1989)]。此外，已知下列微生物具有产生DHA的能力：海产弧菌(Vibrio marinus)(从深海中分离出的细菌；ATCC15381)；微藻类隐秘小环藻(Cyclotella cryptica)和绿光等鞭金藻(Isochrysis galbana)；以及鞭毛虫真菌如金黄色破囊壶菌(Thraustochytrium aureum)(ATCC34304；Kendrick，Lipids，27：15(1992))和破囊壶菌属(Thraustochytrium sp.)，它们称为ATCC28211、ATCC20890和ATCC20891。目前有至少三种不同的发酵方法用于DHA的商业生产：发酵寇氏隐甲藻(C.cohnii)以生产DHASCOTM(Martek Biosciences Corporation，Columbia，MD)；发酵裂殖壶菌属(Schizochytrium sp.)以生产以前已知为DHAGold的油(Martek BiosciencesCorporation)；以及发酵吾肯氏壶菌属(Ulkenia sp.)以生产DHActiveTM(Nutrinova，Frankfurt，Germany)。
期望使用重组方法，用微生物生产微生物油中的PUFA，该方法与从天然微生物来源的生产相比具有多个优点。例如，可使用具有优选的油生产特性的重组微生物，因为可通过将新的生物合成途径导入宿主和／或通过抑制非期望的途径改变宿主天然存在的微生物脂肪酸特征，从而导致期望PUFA(或其共轭形式)的产量提高并降低非期望PUFA的产量。第二，重组微生物能够提供特殊形式的PUFA，该PUFA可具有特别的用途。此外，可通过控制培养条件操纵微生物油生产，要注意的是通过向微生物表达的酶提供特定的底物源，或通过加入化合物／基因工程以抑制不可取的生物化学途径。 因此例如改变由此生产的ω-3对ω-6脂肪酸的比率，或工程化生产不显著积累其它下游或上游PUFA产物的特殊PUFA(例如EPA)是可能的。
因此，例如通过导入合适的PUFA生物合成途径基因，例如Δ4去饱和酶、△5去饱和酶、△6去饱和酶、△12去饱和酶、△15去饱和酶、△17去饱和酶、Δ9去饱和酶、Δ8去饱和酶、Δ9延伸酶、C14／16延伸酶、C16／18延伸酶、C18／20延伸酶和C20／22延伸酶的特定组合，可将缺乏制造EPA的天然能力的微生物工程化以表达PUFA生物合成途径，但是应当认识到导入的特定酶(以及编码那些酶的基因)绝不受本发明的限制。
例如，已经将多个酵母生物进行了重组工程化以产生至少一种PUFA。参见例如对啤酒糖酵母(Saccharomyces cerevisiae)的研究(Dyer，J.M.等人，Appl.Eniv.Microbiol.，59：224-230(2002)；Domergue，F.等人，Eur.J.Biochem.，269：4105-4113(2002)；美国专利6,136,574；美国专利申请公布2006-0051847-A1)和含油酵母解脂耶氏酵母(美国专利7,238,482；美国专利7,465,564；美国专利7,588,931；美国专利7,932,077；美国专利7,550,286；美国专利申请公布2009-0093543-A1；美国专利申请公布2010-0317072-A1)。
在一些实施例中，如果微生物宿主是含油的，注意到其具有优点。含油酵母天然能够合成并积累油，其中总油含量可占细胞干重的超过约25％，更优选占细胞干重的超过约30％，而最优选占细胞干重的超过约40％。在其它实施例中，非含油酵母可经基因修饰变成含油酵母，使得它能够产生占细胞干重超过25％的油，例如酵母如啤酒糖酵母(国际专利申请公布WO2006／102342)。
通常鉴定为含油酵母的属包括但不限于：耶氏酵母属、假丝酵母属、红酵母属、红冬孢酵母属、隐球酵母属、丝孢酵母属和油脂酵母属。更具体地，示例性的油合成酵母包括：圆红冬孢酵母(Rhodosporidium toruloides)、斯达氏油脂酵母(Lipomyces starkeyii)、产油油脂酵母(L.lipoferus)、拉可夫氏假丝酵母(Candida revkaufi)、铁红假丝酵母(C.pulcherrima)、热带假丝酵母(C.tropicalis)、产朊假丝酵母(C.utilis)、茁芽丝孢酵母(Trichosporon pullans)、皮状丝孢酵母(T.cutaneum)、胶粘红酵母(Rhodotorulaglutinus)、禾木科红酵母(R. graminis)和解脂耶氏酵母(Yarrowia lipolytica)(以前归类为解脂假丝酵母(Candida lipolytica))。
最优选的是含油酵母解脂耶氏酵母；并且，在另一个实施例中，最优选的是命名为ATCC20362、ATCC8862、ATCC18944、ATCC76982和／或LGAM S(7)1的解脂耶氏酵母菌株(Papanikolaou S.和Aggelis G.，Bioresour.Technol.，82(1)：43-49(2002))。
在一些实施例中，期望含油酵母能够“产生高水平的PUFA”，其中所述生物能够产生总脂质中至少约5-10％的期望PUFA(即，LA、AlA、EDA、GLA、STA、ETrA、DGLA、ETA、ARA、DPAn-6、EPA、DPA n-3和／或DHA)。更优选地，含油酵母将产生占总脂质至少约10-70％的期望PUFA。虽然PUFA的结构形式是不受限制的，优选地TAG包含PUFA。
因此，本文所述的PUFA生物合成途径基因和基因产物可在野生型微生物宿主细胞或异源性微生物宿主细胞、尤其是在含油酵母(例如耶氏酵母)细胞中产生。重组微生物细胞中的表达可有用于产生多种不同的PUFA途径中间产物，或用于已经存在于所述宿主中的调控PUFA途径以在其中合成此前不可能使用该宿主产生的新产物。
虽然基于上文提供的引用文献多种含油酵母能够经工程化以产生优选的ω-3／ω-6PUFA，在表5中描述了含油酵母解脂耶氏酵母的代表性的PUFA生产菌株。这些菌株具有下列PUFA生物合成途径基因的多种组合：△4去饱和酶、Δ5去饱和酶、Δ6去饱和酶、△12去饱和酶、△15去饱和酶、△17去饱和酶、△9去饱和酶、△8去饱和酶、△9延伸酶、C14／16延伸酶、C16／18延伸酶、C18／20延伸酶和C20／22延伸酶，但是应当认识到导入的特定酶(以及编码那些酶的基因)和产生的特定PUFA绝不受本发明的限制。
本领域的技术人员将会知道本发明的方法不限于上述解脂耶氏酵母菌株，也不限于使用其中本发明已经展示的菌种(即，解脂耶氏酵母)或属(即，耶氏酵母属)，因为将PUFA生物合成途径导入含油酵母的方法是熟知的。相反地，能够产生微生物油(优选地包含PUFA，例如LA、GLA、EDA、DGLA、ARA、DTA、DPAn-6、ALA、STA、ETrA、ETA、EPA、DPAn-3、DHA)的任何含油酵母或任何其它合适的微生物将等同适用于本发明方法，如实例26所示(但是对于处理的每种新微生物，由于在例如每种含油微生物的细胞壁组成方面的差异，可能需要一些方法优化)。
可培养产生优选地包含PUFA的脂质的微生物菌种并在使所述微生物产生脂质的条件下，在发酵培养基中培养所述微生物。通常向所述微生物提供碳源和氮源、以及许多附加的化学物质或底物，它们允许所述微生物生长和／或产生微生物油(优选地包含PUFA)。如上文引文所述，发酵条件将取决于使用的微生物，并且可经优化以在所得生物质中得到高含量的PUFA。
通常，可通过改变碳源的类型和量、氮源的类型和量、碳氮比、不同矿物离子的量、氧水平、生长温度、pH、生物质生产期的时长、油积累期的时长以及细胞收获的时间和方法来优化培养基条件。例如解脂耶氏酵母通常在复合培养基，例如酵母提取物-蛋白胨-葡萄糖肉汤培养基(YPD)，或缺乏生长所必需的成分并因此强迫选择生产PUFA所需重组表达盒的最低限定培养基(例如，Yeast Nitrogen Base(DIFCO Laboratories，Detroit，MI))中生长。
当微生物已经产生所需量的微生物油(优选地包含PUFA)时，可机械加工发酵液体培养基以获取未处理的微生物生物质，其包含微生物油。例如发酵培养基可经过滤或换句话讲经处理以除去至少部分的含水组分(例如通过干燥)。本领域的技术人员将认识到这一点，未经处理的微生物生物质通常包括水。优选地，在微生物发酵后从未处理的微生物生物质中除去一部分水以提供具有小于10重量％的水分含量，更优选地小于5重量％的水分含量，以及最优选地3重量％或更少的水分含量的微生物生物质。微生物生物质水分含量可通过干燥进行控制。优选地，微生物生物质具有的水分含量在约1重量％至10重量％的范围内。
任选地，可经由其它装置巴氏消毒或处理发酵培养基和／或微生物生物质以降低能够损害微生物油和／或PUFA产量的内源性微生物酶的活性。
因此，微生物生物质可以是下列形式：全细胞、全细胞溶解产物、匀化细胞、部分水解细胞物质、和／或破碎细胞(即，破碎的微生物生物质)。
可机械加工微生物生物质以破碎生物质，例如经由细胞裂解或经由物理装置如珠磨器、螺杆挤出等加工以更易于触及细胞内容物。
破碎的微生物生物质将具有至少50％的含油微生物破碎效率。更优选地，破碎效率为含油微生物的至少75％，更优选地至少80％并且最优选地85-90％或更高。尽管上文已描述了优选的范围，破碎效率的有用例子包括从50％至100％的任何整数百分比，例如51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％、60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的破碎效率。
破碎效率是指在加工期间已经破碎或破裂的细胞壁百分比，其通过光学可视化进行定性测定或根据下式进行定量测定：％破碎效率＝(％游离油*100)除以(％总油)，其中测量固体粒料的％游离油和％总油。
尚未经受破碎方法(例如使用例如螺杆挤出、螺旋榨机、活塞、珠磨器、研钵和研杵、锤磨、气流粉碎等的机械破碎)的固体粒料将通常具有低破碎效率，因为DAG、MAG、和TAG、磷脂酰胆碱和磷脂酰乙醇胺级份内的脂肪酸和游离脂肪酸等一般直至破碎方法已经将细胞壁和多个细胞器的内膜、包括围绕脂质体的膜破碎时，才从微生物生物质中被提取出来。不同的破碎方法基于方法固有的特定剪切、压缩、静电和动力将具有不同的破碎效率。
提高的微生物生物质破碎效率通常导致提高的提取收率(例如按提取原油的重量％计)，这可能是因为随着细胞壁和膜的破碎，较多的微生物油易受存在的提取溶剂的影响。
虽然可利用多种设备制备破碎的微生物生物质，优选地在双螺杆挤出机中进行破碎。更具体地，双螺杆挤出机优选地包括：(i)在挤出机中的总比能量输入(SEI)为约0.04至0.4KW／(kg／hr)，更优选地为0.05至0.2KW／(kg/hr)并且最优选地为约0.07至0.15KW／(kg／hr)；(ii)使用具有逐渐缩短的节线长度的轴衬元件的压实区；和(iii)使用流量限制的压缩区。破碎细胞所需的大部分机械能量在压缩区中提供，其使用例如反向螺杆元件、约束环／起泡环元件或捏合元件形式的流量限制产生。在挤出机内，压实区在压缩区之前。可存在挤出机的第一区域以进料并将生物质传送到压实区内。
粒化方法一般涉及下列步骤：(1)将微生物生物质和至少一种能够吸收油的研磨剂混合以提供破碎的生物质混合物，所述破碎的生物质混合物包含破碎的微生物生物质；(2)将破碎生物质混合物与至少一种粘合剂共混以提供能够形成固体粒料的可固化混合物；以及(3)使所述可固化混合物形成固体粒料以提供粒状微生物生物质。
首先，将具有水分含量并包含含油微生物的微生物生物质和至少一种能够吸收油的研磨剂混合以提供破碎的生物质混合物。
能够吸收油的研磨剂可为具有2.0至6.0，并且优选2.0至约5.0，并且更优选约2.0至4.0的莫氏硬度；和根据美国材料与试验协会(ASTM)方法D1483-60测定的0.8或更高，优选1.0或更高，并且更优选1.3或更高的吸油系数的颗粒。优选的研磨剂具有约2至20微米，并且优选约7至10微米的中值粒径；和至少1m2／g，并且优选2至100m2／g的比表面积，其通过BET方法进行测定(Brunauer，S.等人，J.Am.Chem.Soc.，60：309(1938))。
优选的研磨剂选自二氧化硅和硅酸盐。如本文所用，术语“二氧化硅”是指大部分(按重量计至少90％，优选地至少95％)由比率为约两个氧原子对一个硅原子的硅和氧原子组成，因此具有经验式SiO2的固体化学物质。二氧化硅包括例如沉淀二氧化硅、热解法二氧化硅、无定形二氧化硅、硅石(还被称为硅藻土(D-earth))以及这些二氧化硅的硅烷化形式。术语“硅酸盐”是指大部分(按重量计至少90％，优选地至少95％)由硅原子、氧原子和至少一种金属离子组成的固体化学物质。金属离子可为 例如锂、钠、钾、镁、钙、铝、或它们的混合物。可使用天然和合成的沸石形式的硅酸铝。其它可使用的硅酸盐是硅酸钙类、硅酸镁类、硅酸钠类、和硅酸钾类。
优选的研磨剂是硅藻土(D-earth)，其具有约10-20m2／g的比表面积和1.3或更高的吸油系数。能够吸收油的商业来源的适用研磨剂是Celite209D-earth，其购自CeliteCorporation，Lompoc，CA。
其它研磨剂可为聚(甲基)丙烯酸和来源于用钠或钾碱盐部分或全部中和的聚(甲基)丙烯酸的离聚物。本文术语(甲基)丙烯酸酯是指化合物可为丙烯酸酯、甲基丙烯酸酯、或二者的混合物。
至少一种研磨剂以固体粒料中的组分(a)微生物生物质、(b)研磨剂和(c)粘合剂的总量计约1至20重量％，更优选1至15重量％，并且最优选约2至12重量％存在。
可通过任何本领域已知的方法施加能量于混合介质，混合微生物生物质和能够吸收油的研磨剂以提供破碎的生物质混合物[步骤(1)]。优选地，混合提供破碎的生物质混合物，其具有90℃或更低，并且更优选地70℃或更低的温度。
例如，可将微生物生物质和研磨剂一次全部加入或以分批的方式逐步加入搅拌器中，例如单螺杆挤塑机或双螺杆挤塑机、搅拌器、单螺杆捏合机或双螺杆捏合机、或班伯里密炼机。
如上所述，混合优选地在双螺杆挤出机中进行，其具有约0.04至0.4KW／(kg／hr)的SEI、使用具有逐渐缩短的节线长度的轴衬元件的压实区、和使用流量限制的压缩区。在这些条件下，初始的微生物生物质可为完整的干燥细胞，并且产生破碎的微生物生物质、具有至少50％含油微生物的破碎效率的细胞破碎过程可发生在混合步骤开始时或期间，即，可合并并同时进行细胞破碎和步骤(1)以产生破碎的生物质混合物。存在的研磨剂促进细胞破碎；然而，大多数细胞破碎因为双螺杆挤出机自身而发生。
因此，为清楚起见，微生物生物质的细胞破碎可在不存在研磨剂的情况下进行，例如在具有如上文所公开的压缩区的双螺杆挤出机中进行，并且随后可在双螺杆挤出机或多种其它混合器中混合研磨剂和破碎的微生物生物质以提供破碎的生物质混合物。或者，微生物生物质的细胞破碎可在存在研 磨剂的情况下进行，例如在具有压缩区的双螺杆挤出机中进行然而在任一种情况下，如果期望在后续的加工步骤中最大化来自含油微生物的提取油收率，应最大化细胞破碎(即，破碎效率)。
至少一种粘合剂随后与破碎的生物质混合物共混以提供能够形成固体粒料(即，粒状微生物生物质)的可固化混合物。
本发明中使用的粘合剂包括亲水性有机物质和亲水性无机物质，它们是水溶性的或水分散性的。优选的水溶性粘合剂在23℃下具有至少1重量％，优选至少2重量％，并且更优选至少5重量％的水中溶解度。
粘合剂在500巴和40℃下，在超临界流体二氧化碳中优选具有小于1×10-3摩尔级份，和优选小于1×10-4，更优选小于1×10-5，并且最优选小于1×10-6摩尔级份的溶解度。可根据在“Solubility in Supercritical Carbon Dioxide”，Ram Gupta和Jae-Jin Shim，Eds.，CRC(2007)中公开的方法测定溶解度。
粘合剂用于保持在粒化方法中形成的粒料的完整性和尺寸，并且还用于减少粒料的进一步加工与传输中的粉尘。
适用的有机粘合剂包括：碱金属羧甲基纤维素，其具有0.5至1的取代度；聚乙二醇和／或聚乙氧基烷，其优选地具有对于1,000的平均分子量；磷酸淀粉；纤维素和淀粉醚，例如羧甲基淀粉、甲基纤维素、羟乙基纤维素、羟丙基纤维素和对应的纤维素混合醚；蛋白质，包括明胶和酪蛋白；多糖，包括黄蓍胶、藻酸钠和藻酸钾、guam阿拉伯胶、木薯、包括麦芽糖和糊精的部分水解淀粉、以及可溶性淀粉；糖，包括蔗糖、转化糖、葡萄糖浆和糖蜜；合成水溶性聚合物，包括聚(甲基)丙烯酸酯、丙烯酸与马来酸的共聚物或包含乙烯基、聚乙烯醇、部分水解的聚乙烯醋酸和聚乙烯吡咯烷酮的化合物。如果上文提到的化合物是包含游离羧基的那些，它们通常以它们的碱金属盐，更具体地以它们的钠盐形式存在。
将磷酸淀粉理解为淀粉衍生物，其中淀粉葡糖酐单元的羟基被--O--P(O)(OH)2基团或其水溶性盐，更具体地碱金属盐如钠和／或钾盐取代。将淀粉的平均磷酸化程度理解为基于所有糖单元平均化的承载一个磷酸酯基团的酯化氧原子数／淀粉糖单体。优选的磷酸淀粉的平均磷酸化程度在1.5至2.5的范围内。
将在本发明上下文中部分水解的淀粉理解为碳水化合物的低聚物或聚合物，其可使用常规方法例如酸或酶催化方法，通过部分水解淀粉获得。部分水解的淀粉优选地是具有440至500,000的平均分子量的水解产物。具有0.5至40，更具体地2至30的右旋糖当量(DE)的多糖是优选的，DE是通过与右旋糖(其具有100的DE，即，DE100)比较的多糖还原效应的标准量度。可在磷酸化后使用麦芽糖糊精(DE3-20)和干葡萄糖糖浆(DE20-37)，并且还称为黄色糊精和白色糊精(具有约2,000至30,000的相对高平均分子量)。
优选的粘合剂类别是水和碳水化合物，其选自蔗糖、乳糖、果糖、葡萄糖、和可溶性淀粉。优选的粘合剂具有至少50℃，优选至少80℃，并且更优选至少100℃的熔点。
适用的无机粘合剂包括硅酸钠、膨润土、和氧化镁。
优选的粘合剂是被认为是“食品级”或“一般认为安全的”(GRAS)物质。
粘合剂以固体粒料中的组分(a)微生物生物质、(b)研磨剂和(c)粘合剂的总量约0.5至10重量％，优选1至10重量％，并且更优选约3至8重量％存在。
本领域的技术人员将会知道可固化混合物将具有比最终固体粒料的水分含量显著更高的水分含量，从而使其易于处理(例如将可固化混合物接触到模具中)。因此，例如可将包含蔗糖水溶液的粘合剂加到破碎的生物质混合物中，使得可固化混合物具有0.5至20重量％的水。然而，在干燥可固化混合物以形成固体粒料时，固体粒料的最终水分含量小于5重量％的水并且蔗糖小于10重量％。
可通过任何方法共混至少一种粘合剂与破碎的生物质混合物以提供可固化混合物[步骤(2)]，所述方法允许溶解粘合剂并与破碎的生物质混合物共混以提供可固化混合物。术语“可固化混合物”是指混合物在干燥步骤中除去溶剂例如水时能够形成固体粒料。
可通过多种装置共混粘合剂。一种方法包括在溶剂中溶解粘合剂以提供粘合剂溶液，随后在受控速率下测量进入破碎的生物质混合物中的粘合剂溶液。优选的溶剂是水，但是可有利地使用其它溶剂例如乙醇、异丙醇等。 另一种方法包括在混合步骤开始时或期间加入固体或溶液形式的粘合剂至生物质／研磨剂中，即，合并并同时进行步骤(1)和(2)。如果加入固体形式的粘合剂，在共混步骤期间在破碎的生物质混合物中优选地存在足量的水分以溶解粘合剂。如上文所述，优选的共混方法包括在挤出机中，优选地在压缩区后，在受控速率下测量进入破碎的生物质混合物中的粘合剂溶液。在压缩区后加入粘合剂溶液允许快速冷却破碎的生物质混合物。
从可固化混合物中形成包含粒状微生物生物质的固体粒料[步骤(3)]可通过本领域已知的多种方法进行。一种方法包括将可固化混合物挤出到模具例如圆顶制粒机中以形成均匀直径的股线，其在振动或流化床干燥机上干燥以断裂股线，从而提供粒料。粒状微生物生物质适于下游的油提取、运输、或其它目的。
期望本文公开的固体粒料在室温下不发粘。可将大量固体粒料包裹在一起多日，它们的粒料结构不降解，并且不会结合在一起。期望大量粒料是自由流动的粒化组合物。优选地，粒料具有约0.5至约1.5mm的平均直径和约2.0至约8.0mm的平均长度；优选地，固体粒料具有约0.1％至5.0％的最终水分含量，更优选约0.5％至3.0％的最终水分含量范围。在最终固体粒料中提高的水分含量可导致在储存期间由于霉菌生长带来的问题。
因此固体粒料优选包含以固体粒料中(a)、(b)和(c)的总重量计：(a)约70至约98.5重量％的包含含油微生物的破碎的生物质；(b)约1至约20重量％的能够吸收油的研磨剂；和(c)约0.5至10重量％的粘合剂。固体粒料可包含75至98重量％的(a)；1至15重量％的(b)和1至10重量％的(c)；并且优选地，粒料包含80至95重量％的(a)；2至12重量％的(b)和3至8重量％的(c)。
如上文所示的粒化方法已经证明是有效的、高扩展性的、强力的并且使用者友好的，同时允许在相对高的收率和高通量比率下生产。发现使用常规技术如喷雾干燥、使用高剪切混合器等的细胞破碎不足以破碎例如包含甲壳质的酵母细胞壁。现有的湿磨机破碎方法产生粉尘和胶态的污染，其需要进一步的分离步骤并导致显著的油损耗。另外，湿磨步骤引入液体载体(例如异己烷或水)，其需要导致油损耗的液体-固体分离步骤，使得下游加工复杂化。本文所述的粒化方法依赖产生破碎的生物质混合物；然而，有利地 是，破碎不需要液体载体即可发生。此外，在固体粒料内存在研磨剂似乎有利于高含量的油提取。并且因为粒料在整个提取方法中保持耐用状态，这有助于可操作性和循环时间。
用溶剂提取粒状微生物生物质以提供提取油和提取过的粒料(即，“残余生物质”或“残余粒料”)。
可通过用多种有机溶剂处理(例如己烷、异己烷)、酶提取、渗透压冲击破碎、超声波提取、超临界流体提取(例如CO2提取)、皂化、以及这些方法的组合进行油提取。
在一个实施例中，用有机溶剂进行提取以产生提取油，并且所述提取油在所述步骤(c)蒸馏提取油之前被脱胶和任选地漂白。更具体地，可通过磷脂和其它极性与中性脂质复合物的水合或酸水合给原油脱胶，随后从油中分离沉淀的胶。作为另外一种选择，可通过接触油与极性溶剂如丙酮或通过酶促脱胶除去磷脂和其它可水合的杂质。还可使用粘土、二氧化硅或碳漂白脱过胶的油以除去颜色化合物和残余的金属等。
在替代实施例中，使用超临界条件进行提取。超临界流体(SCF)表现出介于那些气体和液体之间的中间体特性。SCF的一个关键特征是通过改变温度或压力、或它们的组合能够持续改变流体密度，从液体样密度变为气体样密度。多个密度依赖性的物理特性同样表现出在此范围内类似的连续改变。这些特性中的一些包括但不限于溶剂强度(这一点通过不同物质在SCF介质中的溶解度得到证明)、极性、粘度、扩散性、热容、热导率、等温压缩率、膨胀性、收缩性、流动性、和分子堆积。SCF中的密度变化也影响溶质的化学势并因此影响反应速率和平衡常数。因此，在SCF介质中的溶剂环境可通过调节多个密度依赖性流体特性进行优化以供特定用途。
当体系温度和压力超过由临界温度(Tc)和临界压力(Pc)限定的相应临界点值时，流体处于SCF状态。对于纯物质，气相和液相能够共存时Tc和Pc是最高的。高于Tc时，无论施加多大压力，液体不会形成纯物质。相似地，在对应于气相和液相共存状态的这一Tc，限定了Pc和临界摩尔体积。虽然多组分混合物更为复杂，但混合物临界状态类似地进行鉴定，因为气相和液相共存时的条件变得不能区别。为了讨论超临界流体，参见Kirk- OthmerEncycl.of Chem.Technology，第4版，第23卷，第452-477页，John Wiley和Sons，NY(1997)。
任何适用的SCF或液体溶剂可用于油提取步骤，例如使溶剂接触固体粒料以从微生物生物质中分离油，所述溶剂包括但不限于CO2、四氟甲烷、乙烷、乙烯、丙烷、丙烯、丁烷、异丁烷、异丁烯、戊烷、己烷、环己烷、苯、甲苯、二甲苯、以及它们的混合物，前提条件是它对所有试剂和产物是惰性的。优选的溶剂包括CO2或C3-C6烷烃。较优选的溶剂是CO2、戊烷、丁烷、和丙烷。大多数优选的溶剂是超临界流体溶剂，其包含CO2。
在一个优选的实施例中，进行超临界CO2提取，如美国专利公布2011-0263709-A1所公开。通过使用这种特定的方法，粒状微生物生物质经受超临界油提取条件。磷脂(PL)保留在残余的生物质(即，提取后的残余粒料)内，同时分馏所得提取物(即，包含基本上不含磷脂的脂质级份的提取物)至少一次以产生具有精制的脂质组合物的提取油，所述精制的脂质组合物可包含中性脂质和／或游离脂肪酸(FFA)，然而基本上不含PL。精制的脂质组合物相对于不经溶剂处理的粒状微生物生物质的油组合物可富含TAG(优选地包含PUFA)。精制的脂质组合物可进行进一步纯化以产生纯化油。
在这种方法中，包含CO2的超临界流体还可包含至少一种附加溶剂(即，共溶剂)，例如一种或多种上述溶剂，只要存在的附加溶剂或者附加溶剂的量对所述方法无害，例如在最初的提取步骤期间不增溶微生物生物质中包含的PL。然而，可加入一种极性共溶剂如乙醇、甲醇、丙酮等以有意地赋予溶剂相极性，使得能够从微生物生物质中提取PL(在任选的二次油提取期间)以分离PL。
根据至少两种方法，包含含油的破碎微生物生物质的固体粒料可在合适的提取条件下与液体或超临界CO2接触以提供提取油和残余生物质。根据美国专利申请公布2011-0263709-A1的第一方法，在对应于提高溶剂密度的提取条件下(例如在提高压力和／或降低温度下)使粒状微生物生物质与CO2接触多次以获取包含精制的脂质组合物的提取物，其中脂质级份基本上不含PL。提取物的精制的脂质组合物根据它们的相对溶解度在FFA、单酰基甘油(MAG)、二酰基甘油(DAG)和TAG的分配上不同，所述相对溶解度取决于对应于多个提取中每一个所选提取条件的溶剂密度。
作为另外一种选择并且根据本发明方法，在美国专利申请公布2011-0263709-A1的第二方法中，在选择用于提供提取物的提取条件下使粒状微生物生物质与溶剂如CO2接触，所述提取物包含基本上不含PL的脂质级份，其随后经历一系列多阶段降压步骤以提供精制的脂质组合物。这些分段降压步骤中的每一个在分隔体容器中进行，进行的压力和温度条件对应于降低的溶剂密度以分离液相精制的脂质组合物，其能够通过例如简单的滗析从提取相中分离出来。提供的精制的脂质组合物根据它们的相对溶解度在FFA、MAG、DAG和TAG的分配上不同，所述相对溶解度取决于对应于分段分隔体容器所选条件的溶剂密度。
当提取条件相同时，使用上述第二方法获取的具有精制的脂质组合物的提取油可相当于在第一方法中获取的提取物。因此据信通过实施第一种方法例示如本文所述可获得的精制的脂质组合物是可能的。
根据本发明方法，可用溶剂如液体或SCF CO2在某一温度和压力接触包含含油的破碎微生物生物质的固体粒料足够的时间以获得提取物，其包含基本上不含PL的脂质级份。脂质级份可包含中性脂质(例如包含TAG、DAG和MAG)以及FFA。可选择接触和分级温度以在PUFA的热稳定范围内提供液体或SCF CO2，并且提供足够的CO2密度以增溶TAG、DAG、MAG和FFA。一般来讲，接触和分级温度可为约20℃至约100℃，例如约35℃至约100℃；压力可为约60巴至约800巴，例如约80巴至约600巴。足够的接触时间以及适当的CO2对微生物生物质比率可通过制作特定固体粒料样品的提取曲线来测定。这些提取曲线取决于温度、压力、CO2流量的提取条件，以及变量如细胞破碎程度和微生物生物质形式。在本发明方法的一个实施例中，所述溶剂包含液体或超临界流体CO2并且CO2对微生物生物质的质量比为约20：1至约70：1，例如约20：1至约50：1。
然后可分级包含基本上不含PL的脂质级份的提取物以获取包含至少一种PUFA的具有精制的脂质组合物的提取油，其中精制的脂质组合物相对于未用溶剂处理的粒状微生物生物质的油组合物富含TAG。精制的脂质组合物还可包含DAG、MAG、或这些物质的组合。精制的脂质组合物还可包含 FFA。在分级步骤中可分开或组合获得的其它精制的脂质组合物包括消耗了FFA的富含TAG的产物、消耗了TAG的富含FFA的产物、富含MAG和／或DAG的富含FFA的产物、消耗了MAG和／或DAG的富含FFA的产物、富含MAG和／或DAG的富含TAG的产物、以及消耗了MAG和／或DAG的富含TAG的产物。根据使用的分级条件，在本发明方法的一个实施例中，精制的脂质组合物可相对于粒状微生物生物质的油组合物消耗FFA。在一个实施例中，精制的脂质组合物可相对于粒状微生物生物质的油组合物富含至少一种PUFA。在一个实施例中，精制的脂质组合物可相对于粒状微生物生物质的油组合物富含至少一种具有20或更多个碳原子的PUFA。
所述分级通过改变所述分级条件的温度、压力、或温度和压力进行。可在多个分离过程的其中一个中完成分级，包括例如富含超临界流体的提取物的连续减压、在一系列混合澄清槽塔板或提取塔中的液体或溶剂提取、短程蒸馏、真空汽提、或熔融结晶。可重复分级所述提取物的步骤一次或多次以提供附加的精制的脂质组合物。
降低例如所述提取物的压力降低溶解溶质的溶解度，在每个分离容器中形成分离的液相。可例如通过使用换热器调节给料于每个分离容器的提取物的温度，从而在每个分离容器中提供期望的溶剂密度和相应的溶质溶解度。初始的提取物由多个类型的脂质组分(例如FFA、MAG、DAG和TAG)的络含混合物组成，所述脂质组分表现出相似的溶解度参数，因此将不会很好地分离不同的组分，而是在分级步骤中获得的每个精制的脂质组合物将包含分配的产物。然而，一般来讲，溶解度较低的化合物在最高压力下运行的第一分离容器中冷凝，而溶解度最高的化合物在最低压力下运行的最终分离容器中冷凝。最终分离容器将提取物相的压力降至足以基本上除去提取物相中剩余的大量溶质，并且向来自这一容器顶部的相对纯的CO2流可再循环到初始的提取容器中。
图2示意性地图示了本文提取方法的一个实施例。在图2中，包含粒状微生物生物质的流10和包含CO2的流38显示进入容器14。包含粒状微生物生物质的流12和流16显示进入容器18。包含至少一种PUFA的粒状微生物生物质与CO2的接触发生在初始温度T14和压力P14的容器14与温度T18和压力P18的容器18中。T14可与T18相同或不同；P14可与P18相同或不同。平衡CO2和提取物的所得混合物以流16的形式离开容器14，进入容器18，在其中进一步接触生物质和CO2以提供包含基本上不含PL的脂质级份的提取物，它显示为流20。残余生物质(未示出)保留在容器14和16中。如果需要，所述方法可包括附加的提取容器(未示出)。作为另外一种选择，如果需要，所述方法可仅使用一个提取容器(未示出)。使用多于一个提取容器可为有利的，因为这能够通过改变加到提取容器(未示出)中的溶剂的相对顺序使连续的CO2流过，并且同时一个或多个提取容器离线(未示出)以例如用于充满粒状微生物生物质或用于除去残余生物质。
提取容器的下游显示具有两个串联的分离容器，容器22和28，其中通过分段降压，任选地通过调节温度如通过使用换热器(未示出)进行提取物的分级。如果需要，所述方法可包括附加的分离容器(未示出)。包含CO2和基本上不含PL的脂质级份的提取物显示以流20的形式进入容器22。在容器22中，压力P22低于P18并且温度T22可与T18相同或不同；在所述方法的运行条件下，形成包含较少可溶脂质组分的分离液相。得自所述提取物分级的分离液相显示以流24的形式离开容器22，它提供第一精制的脂质组合物。将显示为流26的剩余提取物导入下一个分离容器28，其中所述压力P28与P22相比降低，并且温度T28可与T22相同或不同。所述方法的运行条件能够在容器28中形成分离的液相，其显示以流30的形式离开分离容器28。流30提供了第二精制的脂质组合物。
容器28中的包含相对纯CO2的剩余提取物显示为流32，它可再循环到提取容器14和／或另一个提取容器(未示出)中。CO2的回收利用通常提供比一次性使用CO2更大的经济有益效果。可使用显示为流34的吹扫流除去挥发性组分，所述挥发性组分可因为方法连续回收利用的CO2而积聚起来。可加入补偿CO2以抵消清洗导致的CO2损失。可加入补偿CO2到再循环CO2流中，如图2所示，通过加入流36的补偿CO2流8提供混合CO2流38。作为另外一种选择，可将附加的CO2加到容器14和／或容器18中作为分离的进料流(未示出)。
图3图示了本发明方法的提取步骤的一个实施例。在图3中，将包含CO2的流70导入提取容器76中，其包含粒状微生物生物质(未示出)。任选地，用泵(未示出)将共溶剂(显示为流72)加到CO2流中以提供包含 CO2和共溶剂的混合流74。在其中不使用共溶剂的情况下，流70和流74是相同的并且仅包含CO2。在容器76中用CO2接触包含至少一种PUFA的粒状微生物生物质，并且以流78的形式从容器中除去包含基本上不含PL的脂质级份的提取物以及CO2溶剂和任选的共溶剂。残余生物质(未示出)保留在提取容器中。然后可如上所述在至少一个分离容器中分级包含基本上不含PL的脂质级份的提取物，参见图2，或者任选地，可通过排出CO2和任选的共溶剂(未示出)从提取物中分离基本上不含PL的脂质级份。
来自上文初始提取的残余生物质包含PL。这种残余的生物质可用极性提取溶剂进行二次提取，例如极性有机溶剂如二氯甲烷或包含CO2和极性共溶剂如醇的混合溶剂，从而获得不含中性脂质的PL级份。极性共溶剂可包括例如甲醇、乙醇、1-丙醇、和／或2-丙醇。包含PL和提取PL级份的残余生物质可适用作例如水产养殖饲料。
本文所述的基于CO2的提取方法提供了相对于常规的基于有机溶剂的方法的多个优点。例如，CO2是无毒的、不易燃的、环保的、易得的和廉价的。CO2(Tc=31.1℃)能够在相对低的温度下从微生物生物质中提取热不稳定的脂质以最小化油中的脂质降解。提取的脂质可从通过简单地从加压提取物中排出CO2，而不是通过热处理反提取有机溶剂，从CO2溶剂中分离出来。精制的脂质级份可分离自提取物，其包含基本上不含PL的脂质级份。包含PL的残余微生物生物质可为可售卖的副产品，例如水产养殖饲料。可从残余微生物生物质中提取PL，它是消耗了中性脂质的相对纯的副产物。可分级提取的基本上不含PL的中性脂质级份以产生相对于基本上不含PL的脂质级份富含FFA和DAG(并且消耗了TAG)的脂质级份以及相对于基本上不含PL的脂质级份富含TAG(并且消耗了FFA和DAG)的精制的脂质级份。
蒸馏步骤包括使提取的微生物油(例如精制的脂质组合物)通过短程蒸馏(SPD)蒸馏器至少一次。商业SPD蒸馏器是化学工程领域所熟知的。适用的蒸馏器可购自例如PopeScientific(Saukville，WI)。SPD蒸馏器包括蒸发器和冷凝器。典型的蒸馏受到蒸发器温度、冷凝器温度、油进料到蒸馏器中的进料速率和蒸馏器真空水平的控制。
本领域的技术人员将会知道，通过SPD蒸馏器的次数将取决于提取油的含水量。如果含水量低，通过SPD蒸馏器一次可能足够了。
然而，优选地蒸馏是多次通过方法，其包括使包含提取油(例如精制的脂质组合物)连续通过SPD蒸馏器两次或更多次。第一次通过通常在约1至50torr，以及优选地约5至30torr的压力下进行，并且蒸发器的表面温度相对较低，例如约100至150℃。这产生脱水的油，因为残余的水和低分子量的有机材料被蒸发了。脱水的油随后在较高的蒸发器温度和较低压力下通过蒸发器以提供馏出液级份和包含TAG的级份(即，含脂质级份)。
在一些实施例中，提取油包含甾醇级份，其可在SPD条件下在蒸馏后被去除。更具体地，当提取油包含甾醇级份时，在短程蒸馏条件下蒸馏至少一次产生包含甾醇的馏出液级份和含脂质级份，所述含脂质级份在与尚未经受短程蒸馏的提取油中的甾醇量进行比较时包含减少的甾醇量。如上文所述，甾醇级份可包括一种或多种甾醇，所述甾醇选自：豆甾醇、麦角固醇、芸苔甾醇、菜油甾醇、β-谷甾醇和链甾醇。
可使包含TAG的脂质级份再次通过蒸馏器以进一步除去甾醇。随着每次附加通过的进行，可相对于蒸馏温度可相对于之前刚进行的蒸馏的温度提高。优选地，进行足够次数的通过使得甾醇级份的量在与含甾醇微生物油中的甾醇级份进行比较时减少至少约40％-70％，优选至少约70％-80％，并且更优选大于约80％。
优选地，SPD条件包括使含甾醇微生物油(即，精制的脂质组合物)在不超过30mTorr，并且优选不超过5mTorr的真空水平下通过至少一次。优选地，SPD条件包括在约220至300℃，以及优选在约240至280℃下通过至少一次。
因此例如在一个实施例中，提取油是精制的脂质组合物，其包含：(i)至少一种PUFA并富含TAG(相对于未用溶剂处理的粒状微生物生物质的油组合物)；和(ii)至少300mg／100g的甾醇级份。当在SPD条件下经受至少一次蒸馏时，蒸馏产生包含甾醇的馏出液级份和包含TAG的含脂质级份，所述含脂质级份具有减少的甾醇级份，其在与尚未经受SPD的精制的脂质组合物进行比较时具有改善的透明度。改善的透明度是指油中无浑浊或不透明现象。含甾醇微生物油在低于约10℃的温度下储存时变得浑 浊，这是由于油中的甾醇在较低温度下降低的溶解度。蒸馏方法用于除去大部分甾醇级份，使得所得含脂质级份具有减少的甾醇量，并且从而在约10℃下储存时保持澄清或基本上澄清。可用于评估油透明度的测试方法是American Oil Chemists’Society(AOCS)Official Method Cc11-53(“ColdTest”，Official Methods and Recommended Practices of the AOCS，第6版，Urbana，IL，AOCS，2009，其以引用方式并入本文)。
令人惊讶地是，去除蒸馏方法中的甾醇可在不显著降解油的情况下完成，所述油富含PUFA如EPA。可基于PUFA含量和色谱分离表达谱(如实例23所示，见下文)评估油降解。
可通过在完成通过蒸发器后使级份改道通向合适容器来回收含脂质级份。
在提取的微生物油或其产物(例如含脂质级份)中的脂肪酸通常为例如甘油三酯或磷脂的生物形式。因为富集这些形式的脂肪酸分布型是困难的，微生物油的各个脂肪酸将通常使用本领域技术人员熟知的技术，通过酯交换被释放出来。因为脂肪酸酯混合物具有与酯交换之前的微生物油基本上相同的脂肪酸分布型，酯交换方法的产物通常仍被认为是非浓缩的微生物油(即，酯形式的微生物油)。
富集包含按TFA重量％计30至70重量％的期望PUFA的微生物油(其中微生物油获取自含油微生物，其积累超过其干细胞重量25％的油)产生油浓缩物，其包含按油重量％计至少70重量％的期望PUFA(即，“油浓缩物”)。具体地，微生物油的乙酯或其它酯可富含期望的PUFA(例如LA、EDA、GLA、DGLA、ARA、DTA、DPAn-6、ALA、STA、ETrA、ETA、EPA、DPAn-3、DHA)并通过本领域常用的方法分离，例如：分馏、尿素加合物形成、短程蒸馏、使用逆流柱的超临界流体分馏、超临界流体色谱、液相色谱、酶分离并用银盐处理、模拟移动床色谱、实际移动床色谱、以及它们的组合。
因此例如本文所公开的是制备EPA浓缩物的方法，该浓缩物包含按油重量％计至少70重量％的EPA且基本上不含DHA，所述方法包括：
a)对本发明的含脂质级份进行酯交换，其包含按TFA重量％计30至70重量％的EPA且基本上不含DHA；以及
b)对步骤(a)的经酯交换的油进行富集以获取EPA浓缩物，其包含按油重量％计至少70重量％的EPA且基本上不含DHA。
例如，未浓缩的纯化微生物油(即，含脂质级份)包含按TFA重量％计58.2％的EPA且基本上不含来自解脂耶氏酵母的DHA，该微生物油在本文实例27中提供。在实例28中经由尿素加合物形成方法富集这种含脂质级份，使得所得EPA乙酯(EPA-EE)浓缩物包含按油重量％计76.5％的EPA-EE且基本上不含DHA。相似地，实例29展示经由液相色谱富集相同的含脂质级份，其中所得EPA-EE浓缩物包含按油重量％计82.8％或95.4％的EPA-EE且基本上不含DHA。实例30展示经由超临界流体色谱富集相同的含脂质级份，产生EPA浓缩物，其包含按油重量％计85％或89.8％的EPA-EE，其基本上不含DHA。
备选的未浓缩的SPD-纯化的微生物油(即，含脂质级份)包含按TFA重量％计56.1％的EPA且基本上不含来自解脂耶氏酵母的DHA，该微生物油在实例31中提供。在实例32中富集这种含脂质级份经由分馏进行，从而制备EPA浓缩物，其包含按油重量％计73％的EPA-EE且基本上不含DHA。分馏有利地去除油中存在的多种低分子量乙酯(即，主要是但不限于实例32的含脂质级份中的C18)。
备选的未浓缩的SPD-纯化的微生物油(即，含脂质级份)包含按TFA重量％计54.7％的EPA且基本上不含来自解脂耶氏酵母的DHA、NDPA和HPA，该微生物油在实例34中提供。富集这种含脂质级份经由分馏和液相色谱进行，从而制备EPA浓缩物，其包含按油重量％计97.4％的EPA-EE且基本上不含DHA、NDPA和HPA。本领域的技术人员应当认识到可利用富集方法的其它组合(例如分馏、尿素加合物形成、短程蒸馏、使用逆流柱的超临界流体分馏、超临界流体色谱、液相色谱、酶分离并用银盐处理、模拟移动床色谱、实际移动床色谱)制备本发明的EPA浓缩物。
例如可能尤其有利地是制备EPA浓缩物，该浓缩物包含按油重量％计至少70重量％的EPA且基本上不含DHA，所述方法包括：(a)含脂质级份的酯交换反应，该级份包含按TFA重量％计30至70重量％的EPA；(b)第一富集方法，该方法包括用于除去多种低分子量乙酯的分馏，即，包含C14、C16和C18脂肪酸的乙酯；以及(c)至少一种附加的富集方 法，其选自：尿素加合物形成、液相色谱、超临界流体色谱、模拟移动床色谱、实际移动床色谱、以及它们的组合。作为分馏的结果，在油样品中较低浓度的C14、C16和C18脂肪酸可有利于后续的富集方法。
本领域的技术人员将认识到，如果需要，上述任何乙酯形式的EPA浓缩物可被容易地转化成其它形式，例如甲酯、酸或甘油三酯、或者任何其它适用的形式或它们的组合。用于将PUFA从一种衍生物化学转化成另一种的方法是熟知的。例如，可通过皂化将甘油三酯转化成裂解酸的钠盐并通过酸化进一步转化成游离脂肪酸，并且可经由甘油解将乙酯再次酯化成甘油三酯。因此，虽然期望EPA浓缩物初始将为乙酯形式，这绝非旨在成为限制。在EPA浓缩物内按油重量％计至少70重量％的EPA将因此是指游离脂肪酸、三酰基甘油、酯、以及它们的组合形式的EPA，其中酯最优选地为乙酯形式。
本领域的普通技术人员将会知道可优化加工条件以产生富集包含脂质级份的任何优化水平的PUFA，使得期望的PUFA浓缩物具有按油重量％计至少70重量％的期望PUFA(虽然提高的PUFA纯度常常与PUFA收率负相关)。因此，本领域的技术人员将会知道期望PUFA的重量％可为从70％至并且包括100％的任何整数百分比(或其级份)，即，具体地，按油重量％计70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％和100％的期望PUFA。
更具体地，在本发明的一个实施例中，提供的EPA浓缩物包含按油重量％计至少80重量％的EPA且基本上不含DHA。在另一个实施例中，提供的EPA浓缩物包含按油重量％计至少90重量％的EPA且基本上不含DHA。并且在另一个实施例中，提供的EPA浓缩物包含按油重量％计至少95重量％的EPA且基本上不含DHA。
在优选的实施例中，上述EPA浓缩物包含按油重量％计至少70重量％的EPA且基本上不含DHA，该浓缩物可被进一步表征为基本上不含NDPA且基本上不含HPA。
虽然不限制任何具体的应用，本发明的PUFA浓缩物尤其良好地适用作药物。本领域的技术人员熟知的是可在胶囊、片剂、颗粒、可分散在饮料 或另一种固体口服剂型中的粉末、液体(例如糖浆)、软凝胶胶囊、涂覆的软凝胶胶囊或其它方便的剂型如胶囊中的口服液体中施用的PUFA。胶囊可为硬壳或软壳胶囊，并且可为明胶或植物来源。PUFA也可包含在适于注射或注入的液体中。
另外，PUFA也可与一种或多种非活性药物成分(本文一般也称为“赋形剂”)的组合一起施用。非活性成分例如用于将活性成分增溶、悬浮、增稠、稀释、乳化、稳定、保存、保护、着色、加味、并成形到适用的和有效的制剂中，该制剂是安全方便的以及使用可接受的。
赋形剂可包括但不限于表面活性剂如单辛酸丙二醇酯、甘油和长链脂肪酸的聚乙二醇酯的混合物、多乙氧基化蓖麻油、甘油酯、油酸聚乙二醇甘油酯、丙二醇单月桂酸、丙二醇二辛酸酯／二癸酸酯、聚乙烯-聚丙二醇共聚物和聚氧乙烯脱水山梨糖醇单油酸酯，共溶剂如乙醇、甘油、聚乙烯乙二醇、和丙二醇，以及油如椰子、橄榄或红花油。表面活性剂、共溶剂、油或它们的组合的用途是制药领域一般已知的，并且将为本领域技术人员所了解，任何适用的表面活性剂可与本发明及其实施例联合使用。
组合物的剂量浓度、给药方案和给药周期应足以表达要达到的效果，并且可根椐例如剂型、给药途径、症状严重度、体重、年龄等进行充分的调节。当口服时，组合物可每日三次分开给药，但是作为另外一种选择，组合物可以单剂量或多个分剂量给药。
包含至少一种PUFA如EPA(或其衍生物)的提取油组合物将具有熟知的临床和药物价值。参见例如美国专利申请公布2009-0093543A1。例如包含PUFA的脂质组合物可被用作膳食替代品或补充剂，尤其是婴儿代乳品，用于接受静脉内营养法的患者或用来预防或治疗营养不良。作为另外一种选择，可以将纯化的PUFA(或其衍生物)掺入食用油、脂肪或调配的人造黄油中，以便食用者在正常使用中将获得所需量的膳食补充。PUFA还可以掺入婴儿代乳品、营养补充剂或其它食品中，并且可用作抗炎或降胆固醇剂。任选地，该组合物可以用于药用(人药或兽药)。
给人或动物补充PUFA可导致加入的PUFA以及它们的代谢物的水平升高。例如，用EPA处理不但可以导致EPA的水平升高，而且还可以导致EPA的下游产物如类二十烷酸(即前列腺素、白三烯和血栓素)、DPAn-3 和DHA的水平升高。复杂的调节机制使得期望组合多种PUFA或者添加不同的PUFA缀合物，以便预防、控制或克服这种机制来在个体中实现所需水平的特定PUFA。
作为另外一种选择，PUFA或其衍生物能应用于动物或水产饲料的合成中，如干饲料、半湿饲料和湿饲料，因为这些制剂一般需要至少1-2％的营养物质组合物是ω-3和／或ω-6PUFA。
实例
本发明将在下面的实例中得到进一步阐述。应该理解，这些实例尽管说明了本发明的优选实例，但仅是以例证的方式给出的。从上文的讨论和这些实例中，本领域的技术人员能够确定本发明的特性，并且在不脱离其实质和范围的情况下，能对本发明进行各种变化和修改以适应不同的用途和条件。
使用下列缩写：“HPLC”是高效液相色谱法，“ASTM”是美国材料与试验协会(ASTM)，“C”是摄氏，“kPa”是千帕斯卡，“mm”是毫米，“μm”是微米，“μL”是微升，“mL”是毫升，“L”是升，“min”是分钟，“mM”是毫摩尔每升，“mTorr”是毫托，“cm”是厘米，“g”是克，“wt”是重量，“h”或“hr”是小时，“temp”或“T”是温度，“SS”是不锈钢，“in”是英寸，“i.d.”是内径，并且“o.d.”是外径。
材料
生物质的制备
下文描述了解脂耶氏酵母菌株，它们生产不同量的包含PUFA的微生物油。生物质在2-阶段分批补料发酵方法中获得，然后经如下所述的下游加工。
解脂耶氏酵母菌株：解脂耶氏酵母菌株Y8672的生成在美国专利申请公布2010-0317072-A1中进行了描述。菌株Y8672来源于解脂耶氏酵母ATCC20362，能够通过表达Δ9延伸酶／△8去饱和酶途径产生相对于总脂质约61.8％的EPA。
针对野生型解脂耶氏酵母ATCC20362的菌株Y8672的最终基因型为Ura+，Pex3-，未知1-，未知2-，未知3-，未知4-，未知5-，未知6-，未知7-，未知8-，Leu+，Lys+，YAT1：：ME3S：：Pex16，GPD：：ME3S：：Pex20， GPD：：FmD12：：Pex20，YAT1：：FmD12：：Oct，EXP1：：FmD12S：：ACO，GPAT：：EgD9e：：Lip2，FBAINm：：EgD9eS：：Lip2，EXP1：：EgD9eS：：Lip1，YAT1：：EgD9eS：：Lip2，FBAINm：：EgD8M：：Pex20，FBAIN：：EgD8M：：Lip1，EXP1：：EgD8M：：Pex16，GPD：：EaD8S：：Pex16(2个拷贝)，YAT1：：E389D9eS／EgD8M：：Lip1，YAT1：：EgD9eS／EgD8M：：Aco，FBAIN：：EgD5SM：：Pex20，YAT1：：EgD5SM：：Aco，GPM：：EgD5SM：：Oct，EXP1：：EgD5M：：Pex16，EXP1：：EgD5SM：：Lip1，YAT1：：EaD5SM：：Oct，YAT1：：PaD17S：：Lip1，EXP1：：PaD17：：Pex16，FBAINm：：PaD17：：Aco，GPD：：Y1CPT1：：Aco和YAT1：：MCS：：Lip1。
上述表达盒的结构通过简单的记号系统“X：：Y：：Z”表示，其中X描述启动子片段，Y描述基因片段，并且Z描述终止子片段，它们均彼此可操作地连接。缩写如下：FmD12是串珠镰孢菌(Fusarium moniliforme)△12去饱和酶基因[美国专利7，,04,259]；FmD12S是经密码子优化的△12去饱和酶基因，来源于串珠镰孢菌(F.moniliforme)[美国专利7,504,259]；ME3S是经密码子优化的C16／18延伸酶基因，来源于高山被孢霉(Mortierella alpina)[美国专利7,470,532]；EgD9e是小眼虫(Euglena gracilis)Δ9延伸酶基因[美国专利7,645,604]；EgD9eS是经密码子优化的△9延伸酶基因，来源于小眼虫(E.gracilis)[美国专利7,645,604]；EgD8M是合成突变Δ8去饱和酶基因[美国专利7,709,239]，来源于小眼虫(E.gracilis)[美国专利7,256,033]；EaD8S是经密码子优化的Δ8去饱和酶基因，来源于Euglena ahabaena[美国专利7,790,156]；E389D9eS／EgD8M是将来源于小型绿藻属(Eutreptiella sp.)CCMP389Δ9延伸酶的经密码子优化的Δ9延伸酶基因(“E389D9eS”)(美国专利7,645,604)连接到△8去饱和酶“EgD8M”(参见上文)[美国专利申请公布2008-0254191-A1]产生的DGLA合酶；EgD9eS／EgD8M是将△9延伸酶“EgD9eS”(参见上文)连接到△8去饱和酶“EgD8M”(参见上文)[美国专利申请公布2008-0254191-A1]产生的DGLA合酶；EgD5M和EgD5SM是合成突变△5去饱和酶基因[美国专利申请公布2010-0075386-A1]，其来源于小眼虫(E.gracilis)[美国专利7,678,560]；EaD5SM是合成突变△5去饱和酶基因[美国专利申请公布2010-0075386-A1]，其来源于E.Anabaena[美国专利7,943,365]；PaD17是瓜果腐 霉菌(Pythium aphanidermatum)△17去饱和酶基因[美国专利7,556,949]；PaD17S是经密码子优化的△17去饱和酶基因，来源于瓜果腐霉菌(P.aphanidermatum)[美国专利7,556,949]；YlCPT1是解脂耶氏酵母二酰基甘油磷酸胆碱转移酶基因[美国专利7,932,077]；并且MCS是经密码子优化的丙二酰-辅酶A合成酶基因，来源于豌豆根瘤菌(Rhizobiumleguminosarum bv.viciae)3841[美国专利申请公布2010-0159558-A1]。
为了详细分析菌株Y8672中的总脂质含量和组合物，进行烧瓶测定，其中细胞在2个阶段生长总计7天。根据分析，菌株Y8672产生3.3g／L的干细胞重量[“DCW”]，细胞的总脂质含量为26.5[“TFA％DCW”]，以干细胞重量％[“EPA％DCW”]表示的EPA含量为16.4，并且脂质特征如下所示，其中每种脂肪酸的浓度为重量％TFA[“％TFA”]：16：0(棕榈酸)-2.3，16：1(棕榈油酸)--0.4，18：0(硬脂酸)--2.0，18：1(油酸)--4.0，18：2(LA)--16.1，AlA--1.4，EDA--1.8，DGLA--1.6，ARA--0.7，ETrA--0.4，ETA--1.1，EPA--61.8，其它--6.4。
解脂耶氏酵母菌株Y9502的生成在美国专利申请公布2010-0317072-A1中进行了描述，其全文以引用方式并入本文。菌株Y9502来源于解脂耶氏酵母ATCC20362，能够通过表达△9延伸酶／△8去饱和酶途径产生相对于总脂质约57.0％的EPA。
相对于野生型解脂耶氏酵母ATCC20362的菌株Y9502的最终基因型为Ura+，Pex3-，未知1-，未知2-，未知3-，未知4-，未知5-，未知6-，未知7-，未知8-，未知9-，未知10-，YAT1：：ME3S：：Pex16，GPD：：ME3S：：Pex20，YAT1：：ME3S：：Lip1，FBAINm：：EgD9eS：：Lip2，EXP1：：EgD9eS：：Lip1，GPAT：：EgD9e：：Lip2，YAT1：：EgD9eS：：Lip2，FBAINm：：EgD8M：：Pex20，EXP1：：EgD8M：：Pex16，FBAIN：：EgD8M：：Lip1，GPD：：EaD8S：：Pex16(2个拷贝)，YAT1：：E389D9eS／EgD8M：：Lip1，YAT1：：EgD9eS／EgD8M：：Aco，FBAINm：：EaD9eS／EaD8S：：Lip2，GPD：：FmD12：：Pex20，YAT1：：FmD12：：Oct，EXP1：：FmD12S：：Aco，GPDIN：：FmD12：：Pex16，EXP1：：EgD5M：：Pex16，FBAIN：：EgD5SM：：Pex20，GPDIN：：EgD5SM：：Aco，GPM：：EgD5SM：：Oct，EXP1：：EgD5SM：：Lip1，YAT1：：EaD5SM：：Oct，FBAINm：：PaD17：：Aco，EXP1：：PaD17：：Pex16， YAT1：：PaD17S：：Lip1，YAT1：：YlCPT：：Aco，YAT1：：MCS：：Lip1，FBA：：MCS：：Lip1，YAT1：：MaLPAAT1S：：Pex16。
上文未定义的缩写如下：EaD9eS／EgD8M是将来源于Euglena anabaena△9延伸酶的经密码子优化的△9延伸酶基因(“EaD9eS”)[美国专利7,794,701]连接到△8去饱和酶“EgD8M”(参见上文)[美国专利申请公布2008-0254191-A1]产生的DGLA合酶；并且MaLPAAT1S是经密码子优化的溶血磷脂酸酰基转移酶基因，来源于高山被孢霉(Mortierella alpina)[美国专利7,879,591]。
为对菌株Y9502中的总脂质含量和组分进行详细分析进行了烧瓶测定，其中细胞在总计7天中进行2阶段生长。根据分析，菌株Y9502产生3.8g／L的干细胞重量[“DCW”]，细胞的总脂质含量为37.1[“TFA％DCW”]，以干细胞重量％[“EPA％DCW”]表示的EPA含量为21.3，并且脂质特征如下所示，其中每种脂肪酸的浓度为重量％TFA[“％TFA”]：16：0(棕榈酸)-2.5，16：1(棕榈油酸)--0.5，18：0(硬脂酸)--2.9，18：1(油酸)--5.0，18：2(LA)-12.7，AlA-0.9，EDA-3.5，DGLA-3.3，ARA--0.8，ETrA--0.7，ETA-2.4，EPA-57.0，其它-7.5。
在美国专利申请公布2011-0059204-A1中描述了经由表达△9延伸酶／△8去饱和酶途径产生来源于解脂耶氏酵母ATCC20362并能够产生相对于总脂质约50-52％的EPA并具有28-32％的总脂质含量[“TFA％DCW”]的菌株Y4305F1B1，其全文以引用方式并入本文。具体地，菌株Y4305F1B1来源于解脂耶氏酵母菌株Y4305，其以前已经在美国专利申请公布2008-0254191的一般方法中进行了描述，其公开内容全文并入本文。
相对于野生型解脂耶氏酵母ATCC20362的菌株Y4305的最终基因型是SCP2-(YALI0E01298g)，YALI0C18711g-，Pex10-，YALI0F24167g-，未知1-，未知3-，未知8-，GPD：：FmD12：：Pex20，YAT1：：FmD12：：OCT，GPM／FBAIN：：FmD12S：：OCT，EXP1：：FmD12S：：Aco，YAT1：：FmD12S：：Lip2，YAT1：：ME3S：：Pex16，EXP1：：ME3S：：Pex20(3个拷贝)，GPAT：：EgD9e：：Lip2，EXP1：：EgD9eS：：Lip1，FBAINm：：EgD9eS：：Lip2，FBA：：EgD9eS：：Pex20，GPD：：EgD9eS：：Lip2，YAT1：：EgD9eS：：Lip2，YAT1：：E389D9eS：：OCT，FBAINm：：EgD8M：：Pex20，FBAIN：：EgD8M：：Lip1(2 个拷贝)，EXP1：：EgD8M：：Pex16，GPDIN：：EgD8M：：Lip1，YAT1：：EgD8M：：Aco，FBAIN：：EgD5：：Aco，EXP1：：EgD5S：：Pex20，YAT1：：EgD5S：：Aco，EXP1：：EgD5S：：ACO，YAT1：：RD5S：：OCT，YAT1：：PaD17S：：Lip1，EXP1：：PaD17：：Pex16，FBAINm：：PaD17：：Aco，YAT1：：YlCPT1：：ACO，GPD：：YlCPT1：：ACO。
上文未定义的缩写如下：EgD5是小眼虫(Euglena gracilis)△5去饱和酶[美国专利7,678,560]；EgD5S是经密码子优化的△5去饱和酶基因，来源于小眼虫(E.gracilis)[美国专利7,678,560]；并且RD5S是经密码子优化的△5去饱和酶，来源于多甲藻属(Peridinium sp.)CCMP626[美国专利7,695,950]；
Y4305细胞的总脂质含量为27.5[“TFA％DCW”]，并且脂质特征如下所示，其中每种脂肪酸的浓度为重量％TFA[“％TFA”]：16：0(棕榈酸)-2.8，16：1(棕榈油酸)-0.7，18：0(硬脂酸)-1.3，18：1(油酸)-4.9，18：2(LA)-17.6，AlA-2.3，EDA-3.4，DGLA-2.0，ARA--0.6，ETA-1.7和EPA-53.2。
基于磺酰脲类[“SUR”]抗性，菌株Y4305用解脂耶氏酵母的显性非抗生素标记转化。更具体地，该标记基因是具有单个氨基酸改变(即W497L)的天然乙酰羟酸合酶(“AHAS”或乙酰乳酸合酶；E.C.4.1.3.18)，其赋予磺酰基脲抗除草剂性(SEQ ID NO：292，国际专利申请公布WO2006／052870)。将SUR遗传标记随机整合进耶氏酵母属菌株Y4305中，所述整合用于鉴定当在含油条件下生长时相对于亲本Y4305菌株具有提高的脂质含量的那些细胞，如美国专利申请公布2011-0059204-A1所述。
当在2升发酵条件下评估时，菌株Y4305的平均EPA产量[“EPA％DCW”]是50-56，与之相比突变体SUR菌株Y4305-F1B1是50-52。菌株Y4305的平均脂质含量[“TFA％DCW”]是20-25，与之相比菌株Y4305-F1B1是28-32。因此，菌株Y4503-F1B1中的脂质含量提高了29-38％，对EPA产量具有最小的影响。
发酵：在摇瓶中从解脂耶氏酵母的冷冻培养物制备菌剂。在孵育期后，使用培养物接种种子发酵罐。当种子培养物达到合适的目标细胞密度 时，用它接种较大的发酵罐。发酵是2-阶段分批补料方法。在第一阶段，在促进酵母快速生长至高细胞密度的条件下培养酵母；培养基包含葡萄糖、多种氮源、微量金属和维生素。在第二阶段，限制酵母的氮源并连续给料葡萄糖以促进脂质和PUFA积累。方法变量包括温度(控制在30-32℃之间)、pH(控制在5-7之间)、溶解氧浓度和葡萄糖浓度，监控并按照标准运行条件控制这些变量以确保过程性能始终如一和最终的PUFA油质量。
发酵领域的技术人员将了解特定耶氏酵母属菌株的油特征将取决于发酵运行自身、培养条件、方法参数、规模大小等、以及特定的培养物取样时间点而发生变化(参见例如美国专利申请公布2009-0093543-A1)。
下游加工：任选地在加工之前将抗氧化剂加到发酵液中以确保EPA油的氧化稳定性。酵母生物质进行脱水和洗涤以除去盐和残余培养基、以及最小化脂肪酶活性。然后进行滚筒干燥(通常用80psig的蒸汽)或喷雾干燥以将含水量降低至小于5％，从而确保短期贮藏和运输期间的油稳定性。滚筒干燥薄片或具有在约10至100微米范围内的粒度分布的喷雾干燥粉末作为初始的“包含含油微生物的微生物生物质”在下列比较例和实例中使用。
研磨剂：硅藻土209D-earth购自Celite Corporation，Lompoc，CA.Celatom MN-4D-earth购自EP Minerals，An Eagle Pitcher Company，Reno，NV。
其它材料：所有商购试剂均按原样使用。所有使用的溶剂是HPLC级。乙酰氯是99+％。TLC板和溶剂获得自VWR(West Chester，PA)。HPLC或SCF级二氧化碳获得自MGIndustries(Malvem，PA)。
双螺杆挤出方法
在破碎干燥酵母生物质并用研磨剂制备破碎的生物质混合物过程中使用双螺杆挤出。
将干酵母进料到挤出机中，优选地双螺杆挤出机具有通常21-39L／D的长度，其适于完成下文所述的操作。挤出机的第一部分用于进料并传送材料。第二部分是压实区，其设计用于使用具有逐渐缩短的节线长度的轴衬元件压实并压缩进料。在压实区后是压缩区，其用于提供破碎细胞所需的大部分机械能量。这个区使用流量限制形成，流量限制为反向螺杆元件、约束环／起泡环元件或捏合元件形式。当制备破碎生物质时，研磨剂(例如D-earth)通常与微生物生物质一起进料，使得两者均通过压缩／压实区，从而提高破碎水平。在压缩区后，通过液体注射端口加入粘合剂(例如水／蔗糖溶液)并在后续的混合部分混合，所述混合部分由多个混合元件的组合构成。将最终混合物(即，“可固化混合物”)通过最后的滚筒排出，其在末端开口，从而在挤出机中产生极小的回压或不产生回压。然后将可固化混合物进料到圆顶制粒机和振动或流化床干燥机中。这产生适于下游的油提取的粒化材料(即，固体粒料)。
使用CO 2 的SCF提取
一般将干燥并机械破碎的酵母细胞充入包在玻璃棉塞之间的提取容器中，用CO2冲洗，然后在CO2流下加热并加压到期望的运行条件。从配有排放管的商业滚筒中直接进料CO2，并且用高压泵定量。使用限定器在容器的流出侧保持对提取容器的压力，并且在样品容器中收集油样品，同时将CO2溶剂排放到大气。可使用共溶剂泵(Isco Model100D注射器泵)将共溶剂(例如乙醇)任选地加到进料于提取容器的提取溶剂中。
除非另外指明，在下列例子中的酵母样品的超临界CO2提取在定制高压提取设备(图1)中进行。一般来讲，将干燥并机械破碎的酵母细胞(自由流动的或粒状)充入包在玻璃棉塞之间的提取容器1中，用CO2冲洗，然后在CO2流下加热并加压到期望的运行条件。89-mL的提取容器用316SS管材(2.54cm外径×1.93cm内径×30.5cm长度)加工制成，并且在容器的流出端部上配有2-微米的烧结金属过滤器。提取容器安装在定制的机器铝块内部，其配有四个calrod加热元件，所述元件受自动化温度控制器的控制。从配有排放管的商业滚筒2中直接进料液体形式的CO2，并且用配有冷冻头部组件的高压正位移泵3(Jasco Model PU-1580-CO2)定量。用自动回压调节器4(Jasco Model BP-1580-81)保持提取压力，其在容器的流出侧提供流量限制，并且在样品容器中收集提取油样品，同时将CO2溶剂排放到大气中。
报道的从酵母样品中的油提取收率通过测量样品在提取期间的质量损失进行重量分析确定。因此，报道的提取油包含微生物油和与固体粒料相关联的水分。
实例
比较例C1、C2A、C2B、实例1、实例2以及比较例C3和C4：从解脂耶氏酵母滚筒干燥薄 片中制备破碎的生物质混合物的方法比较
比较例C1、C2A、C2B、C3和C4以及实例1和2描述了一系列对比测试，其用于优化酵母(即，解脂耶氏酵母菌株Y8672)滚筒干燥薄片的破碎。具体地，检查加入和不加入研磨剂、以及使用单螺杆或双螺杆挤出机的锤磨。比较基于总游离微生物油和微生物细胞的破碎效率、以及总提取收率(基于超临界CO2提取)的结果。
比较例C1：没有研磨剂的锤磨酵母粉末
酵母(解脂耶氏酵母菌株Y8672)生物质的滚筒干燥薄片包含24.2％的总油(干重)，在环境温度下，使用跳动-空隙分离器以16,000rpm将其锤磨(Mikropul Bantam磨，进料速率为12kg／h)，使用三个锤以提供研磨粉末。研磨粉末的粒度是d10=3μm；d50=16μm并且d90=108μm，使用Frauenhofer激光衍射分析在水中悬浮的粉末。
比较例C2A：有研磨剂并且气流磨混合的锤磨酵母粉末
在环境温度下，由比较例C1提供的锤磨酵母粉末(833g)与硅藻土209硅藻土(D-earth)(167g)在气流粉碎磨(Fluid Energy Jet-o-mizer0101，进料速率为6kg／h)中混合约20min。
比较例C2B：有研磨剂并且人工混合的锤磨酵母粉末
由比较例C1提供的锤磨酵母粉末(833g)与硅藻土209D-earth(167g)在塑料袋中手动混合。
实例1：有研磨剂、人工混合、和单螺杆挤出机的锤磨酵母粉末
来自比较例C2B的与D-earth一起锤磨的酵母粉末(1000g)与17.6重量％蔗糖水溶液(62.5g蔗糖溶解在291.6g水中)在Hobart混合器中混合约2.5min，随后通过单螺杆圆顶制粒机挤出(50-200psi，扭矩不超过550in-lbs；40℃或更低的挤出物温度)，其具有1mm的孔。挤出物在流化床烘干机中干燥，床温度为50℃，使用控制在65℃的流态化空气以提供不发粘的粒料(815g，具有2至8mm的长度和约1mm的直径)，其在约14min后具有3.9％的剩余水。
实例2：有研磨剂、气流磨混合、和单螺杆挤出机的锤磨酵母粉末
来自比较例C2A的与D-earth一起锤磨的酵母粉末(1000g)根据实例1进行加工以提供粒料(855g，其具有2至8mm的长度和约1mm的直径)，其在约10min后具有6.9％的剩余水。
比较例C3：没有研磨剂并用双螺杆挤出机的锤磨酵母粉末
将比较例C1提供的锤磨酵母粉末以2.3kg／hr进料到18mm的双螺杆挤出机(Coperion Werner Pfleiderer ZSK-18mm MC，Stuttgart，Germany)中，该机器利用10KW马达和150rpm的高扭矩轴运行，并且％扭矩范围为66-68，从而提供在最终的水冷滚筒中冷却至26℃的破碎酵母粉末。
比较例C4：没有研磨剂并用双螺杆挤出机的酵母粉末
酵母(解脂耶氏酵母菌株Y8672)生物质的滚筒干燥薄片包含24.2％的总油，将其以2.3kg／hr进料到18mm的双螺杆挤出机(Coperion Werner Pfleiderer ZSK-18mm MC)中，该机器利用10KW马达和150rpm的高扭矩轴运行，并且％扭矩范围为71-73，从而提供在最终的水冷滚筒中冷却至23℃的破碎酵母粉末。
破碎的酵母粉末中游离微生物油和破碎效率的比较
根据下列方法测定在实例1和2和比较例C1-C4的破碎酵母粉末中的游离微生物油和破碎效率。具体地，挤出生物质样品的游离油和总油含量使用由(J.Amer.OilChemists Soc.，32：124-126(1955))报道的方法的修改版本进行测定。在这个方法中，将挤出生物质的样品称重到不锈钢离心管中，其中具有测量体积的己烷。如果将测定总油，加入多个铬钢滚珠。如果将测定游离油，不使用滚珠。然后将管封端并置于振动器上2hr。离心振荡样品，收集上清液并测量体积。首先通过旋转式薄膜蒸发从上清液中蒸发己烷，随后在干燥氮气流下蒸发直至恒重。然后使用这一重量计算初始样品中的游离油或总油百分比。通过测量样品含水量并适当修正，基于干重百分比表达油含量。
通过光学可视化定量破碎效率百分比(即，在加工期间已经破碎的细胞壁百分比)。
表7概述了实例1和2和比较例C1-C4的酵母细胞破碎效率数据，并且示出下列结果：
比较例C1表明在不存在研磨剂的情况下锤磨产生33％破碎的酵母细胞。
比较例C2A表明在存在研磨剂的情况下锤磨酵母的气流粉碎将酵母细胞的破碎效率提高至62％。
实例1表明在Hobart单螺杆混合器中，在研磨剂的存在下进一步混合锤磨酵母(来自比较例C1)将酵母细胞的破碎效率提高至38％。
实例2表明在Hobart单螺杆混合器中，与研磨剂一起进一步混合气流磨并锤磨的酵母(来自比较例C2A)将酵母细胞的破碎效率提高至57％。
比较例C3和C4表明在不存在研磨剂并且使用或不使用锤磨(分别地)的情况下，使用具有压缩区的双螺杆挤出，酵母细胞破碎效率大于80％。
表7：酵母细胞破碎效率比较
*使用实例1、实例2和比较例C2A中的粒料中的生物质实际重量分数归一化释放的游离油。
SCF提取
提取容器装入大约25g(基于酵母)破碎的酵母生物质，其分别来自比较例C1，C2A和C4。用CO2冲洗酵母，然后加热至约40℃并加压至大约311巴。在这些条件下，以4.3g/min的CO2流量提取酵母大约6.7hr，提供大约75g CO2／g酵母的最终溶剂对进料(S／F)比率。在下表中报告提取收率。
数据表明按提取原油重量％计，较高的细胞破碎导致显著较高的提取收率。
表8：细胞破碎效率和油提取比较
比较例C5A、C5B、C5C、C6A、C6B和C6C：从解脂耶氏酵母中制备破碎的生物质混合物 的方法比较
比较例C5A、C5B、C5C、C6A、C6B和C6C描述了用于制备破碎酵母粉末的一系列对比测试，其中初始微生物生物质是滚筒干燥薄片或喷雾干燥的酵母粉末，其在双螺杆挤出机中混有或不混有研磨剂。
在每个比较例C5A、C5B、C5C、C6A、C6B和C6C中，初始的酵母生物质来自解脂耶氏酵母菌株Y9502，其具有2.8％的水分含量并包含大约36％的总油。将干燥酵母薄片或粉末(具有或不具有研磨剂)进料到18mm双螺杆挤出机(Coperion Werner Pfleiderer ZSK-18mmMC)中，其利用10KW马达和150rpm的高扭矩轴运行。在最终的水冷滚筒中将所得的破碎酵母粉末冷却。
在比较例C5A、C5B、C5C、C6A、C6B和C6C中制备的破碎酵母粉末随后经受超临界CO2提取并比较总提取收率。
比较例C5A：没有研磨剂的滚筒干燥酵母薄片
以2.3kg／hr将酵母生物质的滚筒干燥薄片进料到以％扭矩范围34-35运行的双螺杆挤出机中。将破碎的酵母粉末冷却至27℃。
比较例C5B：有研磨剂的滚筒干燥酵母薄片
92.5份酵母生物质的滚筒干燥薄片在袋中与7.5份硅藻土209D-earth预混。以2.3kg／hr将所得干燥混合物进料到以％扭矩范围44-47运行的双螺杆挤出机中。将破碎的酵母粉末冷却至29℃。
比较例C5C：有研磨剂的滚筒干燥酵母薄片
85份酵母生物质的滚筒干燥薄片在袋中与15份硅藻土209D-earth预混。以2.3kg／hr将所得干燥混合物进料到以％扭矩范围48-51运行的双螺杆挤出机中。将破碎的酵母粉末冷却至29℃。
比较例C6A：没有研磨剂的喷雾干燥酵母粉末
以1.8kg／hr将酵母生物质的喷雾干燥粉末进料到以％扭矩范围33-34运行的双螺杆挤出机中。将破碎的酵母粉末冷却至26℃。
比较例C6B：有研磨剂的喷雾干燥酵母粉末
92.5份酵母生物质的喷雾干燥的粉末在袋中与7.5份硅藻土209D-earth预混。以1.8kg／hr将所得干燥混合物进料到以％扭矩范围37-38运行的双螺杆挤出机中。将破碎的酵母粉末冷却至26℃。
比较例C6C：有研磨剂的喷雾干燥酵母粉末
85份酵母生物质的喷雾干燥的粉末在袋中与15份D-earth(硅藻土209)预混。以1.8kg／hr将所得干燥混合物进料到以％扭矩范围38-39运行的双螺杆挤出机中。将破碎的酵母粉末冷却至27℃。
SCF提取
提取容器装入11.7g(基于酵母)破碎的酵母生物质，其分别来自比较例C5A、C5B、C5C、C6A、C6B和C6C。用CO2冲洗酵母，然后加热至大约40℃并加压至大约311巴。在这些条件下，以4.3g／min的CO2流量提取酵母样品3.2hr，提供大约75g CO2／g酵母的最终溶剂对进料(S／F)比率。不同制剂的提取收率在表9中报道。
数据表明具有D-earth作为研磨剂的样品(即，比较例C5B、C5C、C6B和C6C)产生比其中不存在D-earth的那些(即，比较例C5A和C6A)更高的提取收率。
表9：有和没有研磨剂的破碎酵母的油提取比较
实例3、4、5、6、7、8、9和10由解脂耶氏酵母产生固体粒料的方法比较
实例3-10描述了用于混合酵母生物质的喷雾干燥的粉末或滚筒干燥的薄片与研磨剂和粘合剂以提供包含破碎的微生物生物质的固体粒料的一系列对比测试。
在每个比较例3-10中，初始的酵母生物质来自解脂耶氏酵母菌株Y9502，其具有2.8％的水分含量并包含大约36％的总油。在制备固体粒料后，大约1mm直径×2至8mm长度的粒料经受超临界CO2提取并比较总提取收率。也分析固体粒料的机械压实特性和耐磨损性。
实例3：85份酵母生物质的喷雾干燥的粉末在袋中与15份Celatom MN-4D-earth预混。所得干燥混合物以2.3kg／hr进料到18mm双螺杆挤出机(Coperion Werner PfleidererZSK-18mm MC)中。与干燥进料一起，以8.2mL／min的流量将由14份水和5.1份糖制成的水／糖溶液注入挤出机的破碎区后。挤出机用10KW马达和150rpm的高扭矩轴以及58-60的％扭矩范围运行以提供破碎的酵母粉末，其在最终水冷滚筒中冷却至24℃。
然后将可固化混合物进料到MG-55LCI Dome Granulator中，其配有1mm孔径、1mm厚度的筛网并设为70rpm。以67.5kg／hr和稳定的2.7安培电流形成挤出物。在SherwoodDryer中干燥样品10min以提供固体粒料，其具有7.1％的最终水分含量。
实例4：根据实例3制备的可固化混合物通过45rpm的制粒机。以31.7kg／hr形成挤出物并在Sherwood Dryer中干燥10min以提供固体粒料，其具有8.15％的最终水分含量。
实例5：根据实例3制备的可固化混合物通过90rpm的制粒机。挤出物粒料在MDB-400Fluid Bed Dryer中干燥15min以提供固体粒料，其具有4.53％的最终水分含量。
实例6：85份酵母生物质的喷雾干燥的粉末在袋中与15份Celatom MN-4D-earth预混。将所得干燥混合物以2.3kg／hr进料到18mm的双螺杆挤出机(Coperion WernerPfleiderer ZSK-18mm MC)中，该机器利用10KW马达和150rpm的高扭矩轴运行，并且％扭矩范围为70-74，从而提供在最终的水冷滚筒中冷却至31℃的破碎酵母粉末。
破碎的酵母粉末随后在Kitchen Aid混合器中与22.6％的蔗糖水溶液(即，17.5份水和5.1份糖)混合。总混合时间为4.5min，并且在头2min内加入溶液。
将可固化混合物进料到MG-55LCI Dome Granulator中，其配有1mm孔径、1mm厚度的筛网并设为70rpm。以71.4kg／hr和稳定的2.7安培电流形成 挤出物。在Sherwood Dryer中干燥样品总计20min以提供固体粒料，其具有6.5％的最终水分含量。
实例7：将根据实例6制备的破碎酵母粉末置于KDHJ-20Batch Sigma BladeKneader中，其中具有22.6％的蔗糖水溶液(即，17.5份水和5.1份糖)。总混合时间为3.5min，并且在头2min内加入溶液。
将可固化混合物进料到MG-55LCI Dome Granulator中，其配有1mm孔径、1mm厚度的筛网并设为90rpm。以47.5kg／hr和稳定的2.3安培电流形成挤出物。在Sherwood Dryer中干燥样品总计15min以提供固体粒料，其具有7.4％的最终水分含量。
实例8：酵母生物质的滚筒干燥薄片以1.8kg／hr进料到18mm的双螺杆挤出机(Coperion Werner Pfleiderer ZSK-18mm MC)中，该机器利用10KW马达和150rpm的高扭矩轴运行，并且％扭矩范围为38-40，从而提供在最终的水冷滚筒中冷却至30℃的破碎酵母粉末。
破碎的酵母粉末(69.5份)在Kitchen Aid混合器中与12.2％硅藻土209D-earth(12.2份)和由3.3的水：糖比率制成的蔗糖水溶液(18.3份)混合。总混合时间为4.5min，并且在头2min内加入溶液。
将可固化混合物进料到MG-55LCI Dome Granulator中，其配有1mm孔径、1mm厚度的筛网并设为90rpm。以68.2kg／hr和稳定的2.5安培电流形成挤出物。在Sherwood Dryer中干燥样品总计15min以提供固体粒料，其具有6.83％的最终水分含量。
实例9：酵母生物质的滚筒干燥薄片(85份)在袋中与15份硅藻土209D-earth预混。所得干燥混合物以2.3kg／hr进料到18mm双螺杆挤出机(Coperion Werner PfleidererZSK-18mm MC)中。与干燥进料一起，以8.2mL／min的流量将由14份水和5.1份糖制成的水／糖溶液注入挤出机的破碎区后。挤出机用10KW马达和150rpm的高扭矩轴以及61-65的％扭矩范围运行以提供破碎的酵母粉末，其在最终水冷滚筒中冷却至25℃。
然后将可固化混合物进料到MG-55LCI Dome Granulator中，其配有1mm孔径、1mm厚度的筛网并设为90rpm。以81.4kg／hr和稳定的2.5安培电流形成挤出物。在SherwoodDryer中干燥样品15min以提供固体粒料，其具有8.3％的最终水分含量。
实例10：酵母生物质的滚筒干燥薄片(85份)在袋中与15份Celatom NM-4D-earth预混。所得干燥混合物以4.6kg／hr进料到18mm双螺杆挤出机(Coperion WernerPfieiderer ZSK-18mm MC)中。与干燥进料一起，以8.2mL／min的流量将由14份水和5.1份糖制成的水／糖溶液注入挤出机的破碎区后。挤出机用10KW马达和300rpm的高扭矩轴以及约34的％扭矩运行以提供破碎的酵母粉末。
然后将可固化混合物进料到MG-55LCI Dome Granulator中，其配有1mm孔径、1mm厚度的筛网并设为90rpm。以81.4kg／hr和稳定的2.5安培电流形成挤出物。在SherwoodDryer中干燥样品15min以提供固体粒料。
固体粒料的压缩测试和耐磨损性
如下进行压缩测试。使用在ASTM标准D-6683中描述的测试设备和方案评估固体粒料对外部负荷的响应，例如由气体压力梯度施加的负荷。在测试中，测量已知质量的体积作为机械施加的压实应力的函数。结果的半对数图通常是具有斜率、β的直线，反映样品的压缩。较高的β值反映较大的压缩。这种压缩可指示颗粒破损，其将导致不可取的离析和加工中的气流限制。
在ASTM测试结束时，保持粒料上的负荷附加的2hr，模拟延长的加工时间。在2hr后测量的蠕变进一步指示固体粒料变形的可能性。较低的蠕变指示较少的变形。
然后倒置包含样品的测试单元，并倾出粒料样品。如果需要，轻敲单元以释放内容物。记录倒空单元的方便性和所得粒料的质感(即，松散的或团聚的)。
测试后的质感是对将之前测量中使用的测试单元倒空困难程度的定性观察。最期望的样品立即被倾出，然而一些样品需要更多的敲击，并且可能大块地掉出来(即，较低期望的样品)。
为了测定耐磨损性，之前在Compression Testing ASTM测试中压缩的固体粒料(10g)随后被转移到3″直径，500微米的筛上。用手敲击筛以除去任何小于500微米的初始粒料碎块。记录剩余粒料的净重。然后将三个圆柱形的碾磨介质珠(每个有0.50"的直径和0.50"的厚度，重5.3克)加到筛上。将筛置于自动筛振动器(Gilson Model SS-3，设置为“8”，自动敲击 “开启”)中并振动2、5或10min。碾磨介质珠从随机的角度反复撞击粒料。在振动后，称重在筛下的盘以测定已经磨损并掉落通过筛的材料量。这一测试旨在模拟在油提取方法后非常粗糙的粒料处理。
分别分析来自实例3-10的固体粒料以测定它们的压缩特性和耐磨损性。结果在下表10中列出。
表10：固体粒料的机械压实和磨损
SCF提取
将来自实例3-9的固体粒料分别装入提取容器中(基于干重计，如表11中所列)。用CO2冲洗粒料，然后加热至约40℃并加压至大约311巴。在这些条件下，以4.3g／min的CO2流量提取粒料约6.8hr，提供大约150gCO2／g酵母的最终溶剂对进料(S／F)比率。在一些实例中，进行第二运行附加的4.8hr，使得总提取时间为11.6hr。油提取收率和用于提取的具体参数在表11中列出。
表11：固体粒料的油提取比较
a两次运行的平均结果
b两次运行的总和
残余粒料的压缩测试和耐磨损性(后提取)
在SCF提取后，分析分别来自实例3-9的残余粒料以测定它们的压缩特性和耐磨损性。结果在下表12中列出。
表12：残余粒料的机械压缩和磨损(后提取)
*-通过插值2分钟测试和6.5分钟测试的结果来评价筛分5min的预期磨损。
基于上文，结论是可成功地利用本文所述的方法[即，所述方法包括下列步骤：(a)将具有水分含量并包含含油微生物的微生物生物质和至少一种能够吸收油的研磨剂混合以提供破碎的生物质混合物；(b)将至少一种粘合剂与所述破碎的生物质混合物共混以提供能够形成固体粒料的可固化混合物；以及(c)由可固化混合物形成所述固体粒料]产生固体粒料，所述固体粒料包含来自解脂耶氏酵母的破碎的微生物生物质。此外，本实例展示可用溶剂提取固体解脂耶氏酵母粒料(即，SCF提取)以提供包含微生物油的提取物。
实例11
A.用于测定酵母细胞生物质、油、和残余生物质样品的脂质分布的方法
酵母细胞样品和残余生物质样品(即，在用CO2提取后的酵母细胞)用Bligh&Dyer(基于在Lipid Analysis，W.W.Christie2003中列出的方法)用薄层色谱法(TLC)分离并使用盐酸甲醇直接酯化／酯交换。油样品溶解在氯仿／甲醇中，然后用TLC分离并直接酯化／酯交换。通过气相色谱法分析酯化／酯交换的样品。
收到的酵母细胞和残余生物质样品为干粉。预设部分(100-200mg或更少，取决于PUFA浓度)的样品称重后置于具有TeflonTM顶盖的13x100mm玻璃测试管中，其中加入3mL体积的2：1(体积：体积)甲醇／氯仿溶液。充分地涡旋处理样品并在室温下孵育一小时，同时进行轻柔的搅拌和翻转。在孵育规定的时间后，加入1mL氯仿和1.8mL去离子水，搅拌混合物，然后离心以分离形成的两层。使用巴氏吸管将底层移入第二个配衡的13mm玻璃小瓶中，并用第二个1mL氯仿部分再提取含水顶层30min。混合两种提取物并认为它是“第一提取物”。使用TurboVapTM在50℃下用干燥氮气除去溶剂并将剩余的油重悬在适量的6：1(体积：体积)氯仿／甲醇中以获得100mg／mL的溶液。
如上所述获得的油(酵母细胞和残余生物质样品)以及通过CO2提取酵母细胞获取的油样品通过TLC进行分析。TLC通常使用一个槽完成，但是当将鉴定单个PL时也可使用两个槽的方法。在一个槽的TLC方法中，5×20cm的硅胶60平板(EMD5724-3，得自VWR)通过从底部画一条轻铅 笔线一直越过平板2cm进行制备。将适量样品(～60μL)点在铅笔线顶部完全越过平板的位置，在点之间不留任何空隙。将已知标准物点在第二平板上，并且样品用量为1-2μL。平板风干5-10min并用己烷-乙醚-乙酸混合物(体积比70∶30∶1)显影，所述混合物在用于平板之前已经用一张吸墨纸在槽中平衡至少30min。
在平板已经显影至顶部1/4英寸范围内之后，它们在N2环境中干燥15min。具有标准物和小样品点的第二平板然后在槽中显影，所述槽已经用碘晶体饱和过，用作制备性平板的基准。在制备性平板上的条带通过用碘给条带的边缘非常轻微地染色并使用铅笔勾勒出每个级份(即，PL级份、FFA级份、TAG级份和DAG级份)的条带进行鉴定。DAG条带能够显示出在1，2-DAG、1,3-DAG和MAG条带之间的一些分离，并且通常将这个完整区域切出作为DAG条带。将条带切出凝胶并转移到13mm的玻璃小瓶中。平板的剩余部分在碘槽中显影以确认完全移除了受关注的条带。
将适量甘油三酯内标加到包含每个条带的玻璃小瓶中。取决于每个条带的可见浓度，通常使用100μL的0.1至5mg／mL的内标。共溶剂(在这种情况下为甲苯)与内标一起加入。如果不使用内标，加入附加的共溶剂以完成较长链脂质的酯化／反式酯化。加入1mL1％氯化氢的甲醇溶液(通过缓慢加入5mL乙酰氯到50mL冷却干燥的甲醇中进行制备)，样品盖上封盖，轻柔混合，并置于80℃的加热区中一小时。在一小时后，移出样品并冷却。加入1mL iN的氯化钠溶液和400μL己烷，然后涡旋处理样品至少12秒并离心分离两个层。然后仔细地除去顶层，避免它受到任何含水(底)层的污染。将顶层置于GC小瓶中，小瓶配有插入件并盖上封盖。
使用Agilent Model6890气相色谱仪(Agilent Technologies，Santa Clara，CA)分析样品，该仪器配有火焰离子化检测器(FID)和Omegawax320柱(30m×0.32mm ID×25μm薄膜厚度，由Supelco(Bellfonte，PA)制造)。氦气载气恒定地保持在1-3mL／min范围内，分流比为20：1或30：1。炉内条件如下：初始温度为160℃，初始时间为0min并且平衡时间为0.5min。温度以5度／min的速度升至200℃，最终保持时间为0min，然后以10度／min的速度升至240℃，保持时间为4min，总计16min。将入口设为 260℃。也将FID检测器设为260℃。运行Nu-Chek Prep GLC参考标准物(461)以确认保留时间。
使用Agilent's Custom Reports收集GC结果并将每个脂肪酸的面积转化成Excel电子表格以计算它们的百分比。然后可使用校正因子以转化脂质类物质中的脂肪酸总量。各个组分的总百分比与TLC之前的固定化初始提取物相比较。
B.提取方法
根据一般方法进行提取。如下文实例12-20中所报道的那样，酵母和提取油中的多种脂质组分的分析使用如上所述的薄层和气相色谱方法进行测定。对于酵母样品，这一概述反映使用分析程序从样品中提取的脂质分析。通过这一程序对提取酵母样品分析的脂质量在与可比较的进料酵母和油提取物样品(通常在起始进料酵母中<3％的可提取油)的脂质量进行比较时是相对小的。结果概述表示出每个样品的脂质组分的相对分布。对于在横跨表顶部横排中的每个鉴定的脂质级份，磷脂(PL)、二酰基甘油(DAG)、游离脂肪酸(FFA)和三酰基甘油(TAG)组分的相对分配沿着表的列垂直显示。每个样品的第一行示出在TLC前的衍生化初始提取物的分析。随后的行提供通过TLC和GC对每个组分的分析，在最后一行中给出该样品的每个组分的总百分比。
在下文实例12-20中，报道的微生物油的提取收率通过提取前的酵母样品和提取后的残余生物质之间的重量差异进行计算，将其表达为百分比。假定重量差异是由于通过与CO2接触提取的油量而引起。一般发现获得的油的实际重量基于质量差异在约85％的期望重量范围内。
实例12
在311巴和40℃下的提取曲线
这个实例的目的是展示提取曲线的生成。用316SS管材(0.95cm外径×0.62cm内径×26.7cm长度)加工成的8mL提取容器反复装入标定2.7g的干燥并机械破碎的酵母细胞(即，解脂耶氏酵母(Yarrowia lipolytica)菌株Y8672)，进行一系列提取以测定这种酵母样品在40℃和311巴下的提取曲线。对于每次提取，用CO2冲洗提取容器和酵母并且随后用CO2在40℃加压至311巴。在这些条件下并在1.5g／min的CO2流量下提取酵母样品不同的 时间以提供产生相应的提取收率的溶剂对进料比范围，如表13所示。图4在提取曲线上图示了这些数据。在曲线约40g CO2／g酵母的溶剂对进料比率处的转折点指示至少这个溶剂比率是在选定温度和压力下有效提取这一特定酵母样品中的可用油所需的。
可在不同温度和／或压力条件下重复进行系列提取以产生特定微生物生物质样品的一系列提取曲线，使得人们能够基于例如经济性、期望的提取收率、或者使用的CO2总量选择最佳的提取条件。
表13：在311巴和40℃下的溶剂对进料比率和提取收率数据
比较例C7
在不分馏获取的提取物的情况下提取酵母细胞
这个比较例的目的是为了展示在不分级提取物或不连续提取残余生物质的情况下用CO2提取微生物生物质，并且如此获得提取物的脂质组合物。用316SS管材(1.27cm外径×0.94cm内径×26.0cm长度)加工成的18mL的提取容器装入4.99g的干燥并机械破碎的酵母细胞(即，解脂耶氏酵母菌株Y8672)。用CO2冲洗酵母样品，然后加热至40℃并加压至222巴。在这些条件下，以2.3g／min的CO2流量提取酵母样品5.5hr，提供149gCO2／g酵母的最终溶剂对进料比率。提取物收率为18.2重量％。
下表概述了起始进料酵母(微生物生物质)、提取后的酵母(残余生物质)、和获得的提取物的脂质分析。对于酵母细胞，发现50重量％(重 量％)的FFA和59.8重量％的TAG含有EPA，其相应地计算为3／6百分比[在进料酵母中包含EPA的FFA重量％除以进料酵母中的FFA总重量％，以百分比表示，并且两个百分比值取自TLC分析]，并且计算为49／82百分比[在进料酵母中包含EPA的TAG重量％除以进料酵母中的TAG总重量％，以百分比表示，并且两个百分比值取自TLC分析]。在提取物中不含(0重量％)PL表明在起始进料酵母中存在的脂质的PL级份保留在残余生物质中并且不随着CO2分配到提取物中。结果也表明提取物包含90重量％的TAG，4重量％的FFA，和6重量％的DAG。对于提取物，发现50％的FFA和58.9％的TAG含有EPA，其相应地计算为2／4百分比[在提取物中包含EPA的FFA重量％除以提取物中的FFA总重量％，以百分比表示，并且两个百分比值取自TLC分析]，并且计算为53／90百分比(在提取物中包含EPA的TAG重量％除以提取物中的TAG总重量％，以百分比表示，并且两个百分比值取自TLC分析)。
实例13
通过连续加压提取分级脂质
这个实例的目的是为了展示连续加压提取酵母样品和获得提取物的脂质组合物。用316SS管材(1.27cm外径×0.94cm内径×26.0cm长度)加工成的18mL的提取容器装入3.50g的干燥并机械破碎的酵母细胞(即，解脂耶氏酵母菌株Y8672)。
提取物A：用CO2冲洗酵母样品，然后加热至40℃并加压至125巴。在这些条件下，以2.3g／min的CO2流量提取酵母样品5hr，在此时压力提高到150巴。继续提取附加的1.2hr，提供238g CO2／g酵母的最终溶剂对进料比率。提取物A收率为11.7重量％。
提取物B：通过升压至222巴并继续保持2.3g／min的CO2流量4.0hr，继续用相同的部分提取酵母样品进行提取，提供该级份153g CO2／g酵母的最终溶剂对进料比率。提取物B收率为6.2重量％的初始酵母，所述初始微生物生物质被充入提取容器中。
下表概述起始进料酵母和两种提取物的脂质分析。结果表明在使用的提取条件下，微生物生物质油的FFA和DAG选择性地分配到提取物A(其各包含9重量％)中，而提取物B富含TAG(并且仅包含1重量％的DAG且不含测量到的FFA)。更具体地，提取物B为约99％的TAG，并且发现约62.6％的TAG含有EPA(计算为62／99百分比[在提取物B中包含EPA的TAG重量％除以提取物B中的TAG总重量％，以百分比表示，并且两个百分比值取自TLC分析]。与之相反，发现酵母细胞的约59.8％的TAG含有EPA，计算为49／82百分比(在进料酵母中包含EPA的TAG重量％除以进料酵母中的TAG总重量％，以百分比表示，并且两个百分比值取自TLC分析)。期望这些结果与可通过SCF CO2-提取酵母样品以提供提取物获得的结果相似，该提取物随后经由逐步减压进行分馏。
实例14
通过连续加压提取分级脂质
这个实例的目的是为了展示在不同提取条件下连续加压提取酵母样品和获得提取物的脂质组合物。用316SS管材(2.54cm外径×1.93cm内径×30.5cm长度)加工成的89mL的提取容器装入15.0g的干燥并机械破碎的酵母细胞(即，解脂耶氏酵母菌株Y8672)。
提取物A：用CO2冲洗酵母样品，然后加热至40℃并加压至125巴。在这些条件下，以2.3g／min的CO2流量提取酵母样品3.9hr，在此时将流量提高到4.7g／min CO2并继续提取附加的2.3hr。然后加压至141巴。在4.7g／min的CO2流量下继续提取附加的4.1hr，提供154gCO2／g酵母的最终溶剂对进料比率。提取物A收率为8.7重量％。
提取物B：通过升压至222巴并继续保持4.7g／min的CO2流量8.0hr，继续用相同的部分提取酵母样品进行提取，提供该提取物150g CO2／g酵母的最终溶剂对进料比率。提取物B收率为15.4重量％的初始酵母，所述初始微生物生物质被充入提取容器中。
下表概述起始进料酵母、在两次提取后的残余生物质、和两个提取物的脂质分析。结果表明在起始进料酵母中存在的脂质的PL级份保留在残余生物质中。在使用的提取条件下，微生物生物质的FFA和DAG选择性地分配到提取物A中，而提取物B富含TAG。更具体地，提取物B为约97％的TAG，不含测量到的FFA，并且发现约61.9％的TAG包含EPA。与之相反，发现酵母细胞约59.8％的TAG含有EPA。期望这些结果与可通过SCFCO2-提取酵母样品以提供提取物获得的结果相似，该提取物随后经由逐步减压进行分馏。
实例15
通过连续加压提取分级脂质
这个实例的目的是为了展示在不同提取条件下连续加压提取酵母样品和获得提取物的脂质组合物。用316SS管材(2.54cm外径×1.93cm内径×30.5cm长度)加工成的89mL的提取容器装入20.0g的干燥并机械破碎的酵母细胞(即，解脂耶氏酵母菌株Y8672)。
提取物A：用CO2冲洗酵母样品，然后加热至40℃并加压至110巴。在这些条件下，以4.7g/min的CO2流量提取酵母样品7.1hr，提供100gCO2／g酵母的最终溶剂对进料比率。提取物A收率为4.1重量％。
提取物B：通过升压至222巴并继续保持4.7g／min的CO2流量15.0hr，继续用相同的部分提取酵母样品进行提取，提供该提取物212g CO2／g酵母的最终溶剂对进料比率。提取物B收率为14.6重量％的初始酵母，所述初始微生物生物质被充入提取容器中。
下表概述起始进料酵母、在两次提取后的残余生物质、和两个提取物的脂质分析。结果表明在起始进料酵母中存在的脂质的PL级份保留在残余生物质中。在使用的提取条件下，微生物生物质的FFA和DAG选择性地分配到提取物A中，而提取物B富含TAG(即，油级份B为约95％的TAG)。期望这些结果与可通过SCF CO2-提取酵母样品以提供提取物获得的结果相似，该提取物随后经由逐步减压进行分馏。
本文实例13至15共同示出了提取物的脂质组分分配可能受到多步骤提取中所选提取条件的影响。此类分配将同样地由通过如图3所示方法获得的提取物的连续减压导致。
实例16
在500巴的SCF提取
这个实例的目的是为了展示用CO2作为超临界流体在500巴下提取酵母样品，并且获得提取物的组合物。可在方法的第一步骤中使用此类提取条件，所述方法用于获得包含至少一种PUFA的精制组合物，其中所述方法包括用CO2在合适的提取条件下接触包含至少一种PUFA的微生物生物质，并且随后例如通过连续减压分级所述提取物。
10-mL的提取容器填充有2.01g干燥的和机械破碎的酵母细胞(即，解脂耶氏酵母菌株Y4305-F1B1)，并且将容器安装在可商购获得的自动化超临界流体提取装置中，即，Isco Model SFX3560提取器。这个仪器利用10mL的塑料提取容器，该容器在提取容器的每个端部配有2-微米的烧结金属过滤器。这个容器充入了拟提取的底物，然后将其载入高压提取室，所述提取室平衡了提取容器内侧和外侧的压力。用注射器泵(ISCO Model260D)测量CO2溶剂，将其预热到特定的提取温度，然后通过提取容器。用电阻加热器加热提取室，达到期望的提取温度。用自动化的可变限定器保持对容器的压力，该限定器是所述仪器的整体部分。
用CO2冲洗酵母样品，然后加热至40℃并加压至500巴。在这些条件下，以0.86g／min的CO2流量提取酵母样品5.8hr，提供150g CO2／g酵母的最终溶剂对进料比率。提取油收率为32.8重量％。下表概述了起始进料酵母、提取后的残余生物质、和通过提取获得的油的脂质分析。结果表明在起始进料酵母中存在的脂质的PL级份保留在残余生物质中并且不分配到CO2-提取油中，其包含FFA、DAG、和TAG。
实例17
在310巴的SCF提取
这个实例的目的是为了展示用CO2作为超临界流体在310巴下提取酵母样品，并且获得提取物的组合物。可在方法的第一步骤中使用此类提取条件，所述方法用于获得包含至少一种PUFA的精制组合物，其中所述方法包括用CO2在合适的提取条件下接触包含至少一种PUFA的微生物生物质，并且随后例如通过连续减压分级所述提取物。
用316SS管材(2.54cm外径×1.93cm内径×30.5cm长度)加工成的89mL的提取容器装入25.1g的干燥并机械破碎的酵母细胞(即，解脂耶氏酵母菌株Y9502)。用CO2冲洗酵母样品，然后加热至40℃并加压至310巴。在这些条件下，以5.0mL／min的CO2流量提取酵母样品4.4hr，提供50gCO2／g酵母的最终溶剂对进料比率。提取油收率为28.8重量％。下表概述了起始进料酵母、提取后的残余生物质、和通过提取获得的油的脂质分析。结果表明在起始进料酵母中存在的脂质的PL级份保留在残余生物质中并且不分配到CO2-提取油中，其包含FFA、DAG、和TAG。
实例18
在222巴的SCF提取
这个实例的目的是为了展示用CO2作为超临界流体在222巴下提取酵母样品，并且获得提取物的组合物。可在方法的第一步骤中使用此类提取条件，所述方法用于获得包含至少一种PUFA的精制组合物，其中所述方法包括用CO2在合适的提取条件下接触包含至少一种PUFA的微生物生物质，并且随后例如通过连续减压分级所述提取物。
用316SS管材(2.54cm外径×1.93cm内径×30.5cm长度)加工成的89mL的提取容器装入25.1g的干燥并机械破碎的酵母细胞(即，解脂耶氏酵母菌株Y8672)。用CO2冲洗酵母样品，然后加热至40℃并加压至222巴。在这些条件下，以4.7g／min的CO2流量提取酵母样品13.7hr，提供154g CO2／g酵母的最终溶剂对进料比率。提取油收率为18.1重量％。重复这种提取附加的四次，每次用新制的酵母样品进行，并且合并五个提取物。也每次合并并混合残余生物质样品和提取油样品以提供来自五次提取的复合样品。下表概述了起始进料酵母、合并的残余生物质、和通过提取获得的合并的油的脂质分析。发现油包含7重量％的FFA，7重量％的DAG，和86重量％的TAG。
实例19
在85巴下的液体CO 2 提取
这个实例的目的是为了展示用CO2作为液体在85巴下提取酵母样品，并且获得提取物的组合物。可在方法的第一步骤中使用此类提取条件，所述方法用于获得包含至少一种PUFA的精制组合物，其中所述方法包括用CO2在合适的提取条件下接触包含至少一种PUFA的微生物生物质，并且随后例如通过连续减压分级所述提取物。
用316SS管材(0.95cm外径×0.62cm内径×26.7cm长度)加工成的8mL的提取容器装入0.966g的干燥并机械破碎的酵母细胞(即，解脂耶氏酵母菌株Y8672)。酵母样品用CO2冲洗，然后用液体CO2在22℃下加压至85巴。在这些条件下，以0.69g／min的CO2流量提取酵母样品8.5hr，得到361gCO2／g酵母的最终溶剂对进料比率。提取油收率为21.4重量％。下表概述了起始进料酵母、残余生物质、和通过提取获得的油的脂质分析。结果表明在起始进料酵母中存在的脂质的PL级份保留在残余生物质中并且不分配到CO2-提取油中。油包含8重量％FFA，5重量％DAG和86重量％TAG。
实例20
用SCF CO 2 ／EtOH提取残余磷脂
这个实例的目的是为了展示用超临界CO2和乙醇的混合物作为提取剂提取第一残余生物质样品以获得PL级份和第二残余生物质样品。
用316SS管材(1.27cm外径×0.94cm内径×26.0cm长度)加工成的18mL提取容器装入来自实例13的6.39g残余生物质(提取的解脂耶氏酵母菌株Y8672)，其此处称为第一残余生物质。该材料用CO2冲洗，并且随后用CO2／乙醇混合物(提取剂)在40℃下加压至222巴。CO2流量为2.3g／min并且乙醇流量为0.12g／min，使得进料到提取容器内的溶剂中的乙醇浓度为5.0重量％。在这些条件下提取第一残余生物质5.3hr，提供120gCO2／乙醇每g残余生物质的最终溶剂对进料比率。油的提取收率为之前提取的这种材料的2.4重量％。下表概述了对第一残余生物质(这个实例的初始样品)、第二残余生物质(在这个实例中提取后的第一残余生物质)和通过提取第一残余生物质获得的油的脂质分析。从下表数据中可看出油基本上包含纯PL。在上文实例13中进行的提取已经从酵母细胞中除去了中性脂质和游离脂肪酸。
实例21
这个实例的目的是为了提供包含至少一种多不饱和脂肪酸的备选微生物生物质，其在本文所述方法中可用作粒化、提取、分馏和蒸馏方法中的微生物生物质。
虽然根据本专利申请中所述的发明，多个经遗传工程化以生产ω-3／ω-6PUFA的含油酵母是合适的微生物生物质，含油酵母解脂耶氏酵母的代表性菌株在表5中进行了描述。这些包括下列菌株，它们已经被保藏为ATCC：解脂耶氏酵母(Y.lipolytica)菌株Y2047(生产ARA；ATCC保藏号PTA-7186)；解脂耶氏酵母(Y.lipolytica)菌株Y2096(生产EPA；ATCC保藏号PTA-7184)；解脂耶氏酵母(Y.lipolytica)菌株Y2201(生产EPA；ATCC保藏号PTA-7185)；解脂耶氏酵母(Y.lipolytica)菌株Y3000(生产DHA；ATCC保藏号PTA-7187)；解脂耶氏酵母(y.lipolytica)菌株Y4128(生产EPA；ATCC保藏号PTA-8614)；解脂耶氏酵母(Y.lipolytica)菌株Y4127(生产EPA；ATCC保藏号PTA-8802)；解脂耶氏酵母(Y.lipolytica)菌株Y8406(生产EPA；ATCC保藏号PTA-10025)；解脂耶氏酵母(Y.lipolytica)菌株Y8412(生产EPA；ATCC保藏号PTA-10026)；和解脂耶氏酵母(Y.lipolytica)菌株Y8259(生产EPA；ATCC保藏号PTA-10027)。
因此例如表5显示了产生占总脂肪酸25.9％至34％的GLA，占总脂肪酸10.9％至14％的ARA，占总脂肪酸9％至61.8％的EPA和占总脂肪酸5.6％的DHA的微生物宿主。
本领域的技术人员将会知道本发明的方法不限于展示高EPA生产水平的微生物生物质，而是同样适用于展示高替代ω-3/ω-6PUFA或组合或它们的PUFA生产水平的微生物生物质。
实例22A
从解脂耶氏酵母菌株Z1978中制备包含EPA的未处理微生物生物质
这个实例描述了经工程化以生产EPA的重组解脂耶氏酵母菌株Z1978和使用2-阶段分批补料方法培养这种菌株的方法。预处理微生物生物质以产生干燥的、未处理的微生物生物质，其具有56.1的EPA％TFA。
解脂耶氏酵母菌株Z1978从菌株Y9502的生成
从菌株中开发菌株Z1978描述于美国专利申请13／218,591(E.I.duPont deNemours&Co.，Inc.，代理人档案号CL4783USNA，提交于2011年8月26日)中，该文献以引用方式并入本文。
具体地，为了破碎菌株Y9502中的Ura3基因(参见MATERIALS，参见上文)，构建体pZKUM(图6A；SEQ ID NO：1；描述于美国专利申请公布2009-0093543-A1的表15中)以将Ura3突变基因整合进菌株Y9502的Ura3基因中。转化根据美国专利申请公布2009-0093543-A1的方法进行，其以引用方式并入本文。总计27个转化体(选自包含8个转化体的第一组、包含8个转化体的第二组、和包含11个转化体的第三组)在5-氟乳清酸[“FOA”]平板上生长(FOA平板每升包括：20g葡萄糖、6.7g酵母氮源、75mg尿嘧啶、75mg尿苷，并且基于对一系列从100mg／L至1000mg／L的浓度的FOA活性试验(因为供应商提供的每批料中会发生改变)，选用适量的FOA(Zymo Research Corp.，Orange，CA))。进一步的实验确定了仅第三组转化体拥有真正的Ura-表型。
为了进行脂肪酸[“FA”]分析，将细胞通过离心收集并提取脂质，如Bligh，E.G.&Dyer，W.J.(Can.J.Biochem.Physiol.，37：911-917(1959))所述。通过将脂质提取物与甲醇钠进行酯交换反应而制备脂肪酸甲酯[“FAME”](Roughan，G.和Nishida I.，Arch BiochemBiophys.，276(1)：38-46(1990))并随后将其用配有30m×0.25mm(内径)HP-INNOWAX(Hewlett-Packard)柱的Hewlett-Packard6890气相色谱仪(GC)进行分析。炉温以3.5℃／min从170℃(保持25min)升到185℃。
为了进行直接的碱催化酯交换反应，收获耶氏酵母细胞(0.5mL培养物)，在蒸馏水中洗涤一次，并在Speed-Vac中在真空下干燥5-10min。将甲醇钠(100μl，1％)和已知量的C15：0三酰基甘油(C15：0TAG；目录号T-145，Nu-Check Prep，Elysian，MN)加入样品，然后涡旋振荡并于50℃振动样品30min。加入3滴1M NaCl和400μl己烷，然后涡旋振荡并旋转样品。移除上层并用GC进行分析(参见上文)。
作为另外一种选择，Lipid Analysis，William W.Christie，2003中描述的修改的碱催化酯交换方法被用于对来自发酵或烧瓶样品的肉汤样品的常规 分析。具体地，将培养液体样品在室温下快速融化，随后称量(至0.1mg)进入油化的2mL微量离心管中，其具有0.22μm离心管滤器(目录号8161)。根据先前测定的DCW，使用了样品(75-800μl)。用Eppendorf5430离心机，以14,000rpm离心样品5-7min或移除肉汤所需的时间长度。移除过滤器，倒出液体，加入～500μl去离子水至过滤器中洗涤样品。离心除去水后，再次移出过滤器，倒出液体并重新插入过滤器。然后将管子重新插入离心机中，这一次保持盖子打开，离心～3-5min进行干燥。然后在管子上方大约1/2处切开过滤器，并插入新的2mL圆底Eppendorf管(目录号2236335-2)。
用仅接触切开的过滤器容器边缘而不接触样品或过滤材料的适当的工具将过滤器推至管子的底部。加入溶于甲苯的已知量的C15：0TAG(参见上文)以及500μl新鲜制备的1％甲醇钠溶于甲醇的溶液。用适当的工具将样品沉淀块用力捣碎，盖上管子并置于50℃加热块(VWR目录号12621-088)中30min。然后使管子冷却至少5min。然后，加入400μl己烷和500μl1M NaCl水溶液，涡旋振荡管子2×6秒并离心1min。将大约150μl的顶层(有机层)置于具有插入件的GC小瓶中并通过GC进行分析。
经由GC分析记录的FAME峰值在与已知脂肪酸进行比较时通过它们的保留时间进行鉴定，并且通过比较FAME与已知量的内部标准物(C15：0TAG)的峰面积进行定量。因此，根据下式计算任何脂肪酸FAME的近似量(μg)[“μg FAME”]：(特定脂肪酸的FAME峰的面积／标准物FAME峰的面积)*(标准物C15：0TAG的μg数)，而任何脂肪酸的量(μg)[“μgFA”]根据下式计算：(特定脂肪酸的FAME峰的面积／标准物FAME峰的面积)*(标准物C15：0TAG的μg数)*0.9503，因为1μg的C15：0TAG等于0.9503μg脂肪酸。注意：0.9503的转换因子是大多数脂肪酸测定的近似值，其范围介于0.95和0.96之间。
概述每种单个脂肪酸以TFA％重量表示的量的脂质特征通过用单个FAME峰面积除以所有FAME峰面积的总数并乘以100进行计算。
用这种方法，GC分析显示分别有TFA的28.5％、28.5％、27.4％、28.6％、29.2％、30.3％和29.6％EPA在第3组的pZKUM-转化体1、3、6、7、8、10和11中。这七个菌株分别被命名为菌株Y9502U12、Y9502U14、 Y9502U17、Y9502U18、Y9502U19、Y9502U21和Y9502U22(统称为Y9502U)。
然后，构建了构建体pZKL3-9DP9N(图6B；SEQ ID NO：2)，以将一种△9去饱和酶基因、一种磷酸胆碱胞苷酰转移酶基因和一种△9延伸酶突变基因整合进菌株Y9502U的耶氏酵母YALI0F32131p基因座(GenBank登录号XM_506121)。pZKL3-9DP9N质粒包含下列组分：
表23：质粒pZKL3-9DP9N(SEQ ID NO：2)的描述
用AscI／SphI消化pZKL3-9DP9N质粒，然后用于转化菌株Y9502U17。将转化细胞接种到基本培养基[“MM”]平板上并保持在30℃下3至4天(基本培养基每升包含：20g葡萄糖、1.7g不含氨基酸的酵母氮源、1.0g脯氨酸、和pH6.1(不需要调节)。将单菌落再次划线至MM平板上，随后将其在30℃下接种至液体MM中并以250rpm／min振动2天。离心收集细胞，重悬浮在高糖培养基[“HGM”]中，随后在250rpm/min下振荡培养5天(高糖培养基每升包含：80葡萄糖，2.58g KH2PO4和5.36g K2HPO4，pH7.5(不需要调节))。对上述细胞进行脂肪酸分析，参见上文。
GC分析显示，所选择的96个用pZKL3-9DP9N产生的Y9502U17菌株中大多数产生占TFA50-56％的EPA。将生产了TFA的约59.0％、56.6％、58.9％、56.5％和57.6％EPA的五个菌株(即，31、32、35、70和80)分别命名为菌株Z1977、Z1978、Z1979、Z1980和Z1981。
这些pZKL3-9DP9N转化体菌株相对于野生型解脂耶氏酵母ATCC20362的最终基因型是Ura+，Pex3-，未知1-，未知2-，未知3-，未知4-，未知5-，未知6-，未知7-，未知8-，未知9-，未知10-，未知11-，YAT1：：ME3S：：Pex16，GPD：：ME3S：：Pex20，YAT1：：ME3S：：Lip1，FBAINm：：EgD9eS：：Lip2，EXP1：：EgD9eS：：Lip1，GPAT：：EgD9e：：Lip2，YAT1：：EgD9eS：：Lip2，YAT：：EgD9eS-L35G：：Pex20，FBAINm：：EgD8M：：Pex20，EXP1：：EgD8M：：Pex16，FBAIN：：EgD8M：：Lip1，GPD：：EaD8S：：Pex16(2个拷贝)，YAT1：：E389D9eS／EgD8M：：Lip1，YAT1：：EgD9eS／EgD8M：：Aco，FBAINm：：EaD9eS／EaD8S：：Lip2，GPDIN：：YlD9：：Lipl，GPD：：FmD12：：Pex20，YAT1：：FmD12：：Oct，EXP1：：FmD12S：：Aco，GPDIN：：FmD12：：Pex16，EXP1：：EgD5M：：Pex16，FBAIN：：EgD5SM：：Pex20，GPDIN：：EgD5SM：：Aco，GPM：：EgD5SM：：Oct，EXP1：：EgD5SM：：Lip1，YAT1：：EaD5SM：：Oct，FBAINm：：PaD17：：Aco，EXP1：：PaD17：：Pex16，YAT1：：PaD17S：：Lip1，YAT1：：YlCPT：：Aco，YAT1：：MCS：：Lip1，FBA：：MCS：：Lip1，YAT1：：MaLPAAT1S：：Pex16，EXP1：：YlPCT：：Pex16。
在任何这些通过用pZKL3-9DP9N转化产生的EPA菌株中，YALI0F32131p基因座(GenBank登录号XM_50612)在菌株Z1977、Z1978、Z1979、Z1980和Z1981中的敲除未被确认。
培养了来自YPD平板的菌株Z1977、Z1978、Z1979、Z1980和Z1981的细胞并按照下文方法部分就总脂质含量和组成对它们进行了分析。
为了详细分析在解脂耶氏酵母的特定菌株中的总脂质含量和组成，如下进行了烧瓶测定。具体地，将一接种环新制细胞划线接种到3mL发酵液体培养基[“FM”]中并在250rpm和30℃下生长过夜(发酵液体培养基每升包含：6.70g／L酵母氮源基础、6.00g KH2PO4、2.00gK2HPO4、1.50gMgSO4*7H2O、20g葡萄糖、和5.00g酵母提取物(BBL)。测量OD600nm，在125mL烧瓶中，加入一个等分试样的细胞，使得25mL FM培养基中最终的OD600nm为0.3。在30℃振荡培养箱中以250rpm培养2天后，通过离心收集6mL培养物，并在125mL烧瓶中重悬于25mL HGM中。30℃振荡培养箱中以250rpm培养5天后，使用1mL等分试样进行脂肪酸分析(参见上文)，并且干燥10mL用于干细胞重量[“DCW”]测定。
就DCW测定而言，通过在Beckman GS-6R离心机的Beckman GH-3.8转子中以4000rpm离心5min，收集了10mL培养物。沉淀被重悬于25mL水中，并如上文所述重新收集。将洗涤后的沉淀物重悬在20mL水中并转移到预先称过重的铝盘上。在80℃的真空炉中干燥上述细胞悬浮液过夜。测定细胞的重量。
计算细胞总脂质含量[“TFA％DCW”]，并且将其与列表显示以TFA％重量[“％TFA”]表示的每种脂肪酸浓度和以干细胞重量百分比表示的EPA含量[“EPA％DCW”]的数据综合考虑。
从而，下表24概述了菌株Z1977、Z1978、Z1979、Z1980和Z1981的总脂质含量和组合物，其通过烧瓶测定法进行测定。具体地，该表概述细胞的干细胞总重量[“DCW”]、细胞的总脂质含量[“TFA％DCW”]、以TFA％重量[“％TFA”]表示的每种脂肪酸浓度和以干细胞重量百分比表示的EPA含量[“EPA％DCW”]。
菌株Z1978随后进行部分基因组测序(美国专利申请13／218591)。这一工作测定出四个(不是六个)△5去饱和酶基因被整合进耶氏酵母属基因组中(即，EXP1：：EgD5M：：Pex16、FBAIN：：EgD5SM：：Pex20、EXP1：：EgD5SM：：Lip1、和YAT1：：EaD5SM：：Oct)。
解脂耶氏酵母菌株Z1978的发酵
解脂耶氏酵母菌株Z1978以2-阶段分批补料方法生长，该方法在材料(MATERIALS)部分中进行了描述，参见上文。
在发酵后，酵母生物质进行脱水和洗涤以除去盐和残余培养基、以及最小化脂肪酶活性。随后进行滚筒干燥以减少含水量至小于5％，确保在短期储存和运输期间的油稳定性。
表征干燥的和未处理的解脂耶氏酵母菌株Z1978生物质
干燥的和未处理的酵母生物质的脂肪酸组合物使用下列气相色谱法[“GC”]进行分析。具体地，通过使用甲醇钠在甲醇中的酯交换将甘油三酯转化成脂肪酸甲酯[“FAME”]。使用配有30-m×0.25mm(内直径)的OMEGAWAX(Supelco)柱的Agilent7890GC，在稀释于甲苯／己烷(2：3)之后，分析了所得到的FAME。炉温以5℃／min的速度从160℃升高至200℃，然后以10℃／min的速度从200℃升高至250℃(保持10min)。
在与已知甲酯[“ME”]进行比较时，经由GC分析记录的FAME峰通过它们的保留时间进行鉴定，并且通过比较FAME峰面积与已知量内标(C15：0甘油三酯，通过酯交换方法与样品一起取出)的峰面积进行定量。因此，大约的量(mg)的任何脂肪酸FAME[“mg FAME”]按照下式被计算：(特定脂肪酸的FAME峰的面积／15：0FAME峰的面积)*(内部标准物C15：0FAME的mg数)。然后可通过除以合适的分子量转换因子1.042-1.052将FAME结果修正至对应脂肪酸mg。
概述每种单个脂肪酸以TFA％重量表示的量的脂质特征通过用单个FAME峰面积除以所有FAME峰面积的总数并乘以100进行近似计算(在±0.1重量％内)。
来自解脂耶氏酵母菌株Z1978的干燥的和未处理的酵母生物质包含56.1EPA％TFA，如下表所示。
表25：干燥的和未处理的Z1978生物质的脂肪酸组合物
脂肪酸 占总脂肪酸的重量百分比
C18：2(ω-6) 14.2
C20：5EPA 56.1
C22：6DHA 不可检测(<0.05)
其它组分 29.7
实例22B
从未处理的解脂耶氏酵母菌株Z1978生物质中制备具有减少甾醇含量的SPD-纯化 的微生物油
本发明实例描述了经由挤出和粒化用于破碎实例22A的干燥的和未处理的解脂耶氏酵母菌株Z1978生物质、使用超临界流体提取[“SCFE”]提取油、并且使用短程蒸馏条件通过蒸馏减少油的甾醇含量以产生含脂质级份(即，SPD-纯化的微生物油)的方法。
经由挤出干燥的、未处理的酵母生物质进行破碎和粒化
将实例22A的干燥的和未处理的解脂耶氏酵母菌株Z1978生物质进料于双螺杆挤出机。具体地，将84重量％酵母(包含大约39％的总微生物油)和16％硅藻土(Celatom MN-4；EP Minerals，LLC，Reno，NV)的混合物进料于40mm双螺杆挤出机(Coperion WernerPfleiderer ZSK-40mm MC，Stuttgart，Germany)，进料速率为23kg／hr。在挤出机破碎区后以70mL／min的流速注入由26.5％的蔗糖制成的水／蔗糖溶液。挤出机以37kW马达和140rpm的高轴扭矩运行。％扭矩范围是17-22。在最终的水冷滚筒中将所得的破碎酵母粉末冷却至35℃。将含水的挤出粉末进料到LCI Multi-Granulator Model No.MG-55(LCICorporation，Charlotte，NC)中，其配有1mm孔直径、1mm厚度的筛网，并设置在80rpm。用稳态2.2安培的最大电流，以27kg／hr的速度形成挤出物，并且使用常规的干燥设备进行干燥。干燥的粒料有大约1mm的直径×6至10mm的长度，其具有1.7％的最终含水量，这在Sartorius MA35水分分析仪(Sartorius AG，Goettingen，Germany)上测量。
提取挤出的酵母生物质
挤出的酵母粒料使用超临界流体相二氧化碳(CO2)作为提取溶剂进行提取，从而产生富含甘油三酯的提取油，其包含EPA。具体地，将酵母粒料填充到320L的不锈钢提取容器中并包裹在聚酯泡沫过滤垫塞(Aero-Flo Industries，Kingsbury，IN)之间。密封容器，随后利用商业压缩机(Pressure Products Industries)通过换热器(预加热器)定量CO2并进料到立式提取容器中以从破碎酵母的粒料中提取富含甘油三酯的油。提取温度通过预加热器进行控制，并且用位于提取容器和分离容器之间的自动化控制阀(Kammer)保持提取压力。CO2和油提取物通过这一控制阀膨胀至较低压力。从膨胀溶液中收集提取油，它是在分离容器中的沉淀。分离容器中膨胀的CO2相的温度通过使用位于分离容器上游的附加换热器进行控制。这种较低压力的CO2流流出分离容器顶部并通过过滤器、冷凝器、和质量流量计再循环返回压缩机。提取油定期从分离容器中排出并收集作为产物。
提取容器初始填充有150kg挤出的酵母粒料。随后通过超临界流体CO2从粒料中提取富含甘油三酯的油，提取条件为5000psig(345巴)、55℃、以及32kg CO2／kg起始酵母粒料的溶剂对进料比率。从分离容器中收集总计39.6kg的提取油，向其加入约1000ppm的两种抗氧化剂：Covi-ox T70(Cognis，Ontario，Canada)和Dadex RM(Nealanders，Ontario，Canada)。提取油包含661mg的麦角固醇／100g油，这通过GC分析进行测定(参见下文)。
具体地，通过高效液相色谱法(HPLC)与紫外(UV)检测测定麦角固醇含量。提取油样品(100mg)用14mL9：102-丙醇：1-庚醇稀释并充分混合。制备在2-丙醇中的10至300μg／mL范围内的96％纯度的麦角固醇校正标准物(Alfa Aesar，Inc.，Ward Hill，MA)。在XDB-C8HPLC柱(4.6mm内径，150mm长度，5μm粒度，Agilent Technologies，Inc.，Wilmington，DE)上进行样品和标准物的色谱分析，使用0.02％碳酸铵水溶液-乙腈梯度(在12.5min内从65至100％乙腈)。注射体积是5μL，流量为1.2mL／min并且柱温是50℃。麦角固醇峰的UV(282nm)响应与在相同条件下分析的校正标准物的那些峰进行比较。
在SPD条件下蒸馏
提取油脱气并且虽然通过6″不锈钢分子蒸馏器(POPE Scientific，Saukville，WI)，使用12kg／hr的进料速率以除去残余的水。蒸发器和冷凝器的表面温度分别设为140℃和15℃。真空度保持在15torr。大约3重量％的提取油随着馏出液中的水被除去。脱水的提取油基本上不含磷脂，包含0.5ppm的磷。在目测时，脱水的提取油在室温下是浑浊的。
脱水的提取油以12kg／hr的进料速率二次通过6″的分子蒸馏器。将真空度降低至1mtorr，并且蒸发器和冷凝器的表面温度分别保持在240℃和50℃。大约7重量％的脱水提取油随着馏出液被除去；这一级份主要包含游离脂肪酸和麦角固醇。也获得包含三酰基甘油的级份(即，含脂质级份或SPD-纯化油)，其包含284mg的麦角固醇／100g油(麦角固醇含量在与提取油中的麦角固醇含量进行比较时减少了～57％)。SPD-纯化油在储存在10℃下多天后是澄清的。
实例23
从未处理的解脂耶氏酵母菌株Y9502生物质中制备具有减少甾醇含量的SPD-纯化 的微生物油
本文实例描述了经由挤出用于破碎干燥的和未处理的解脂耶氏酵母菌株Y9502生物质、使用超临界流体提取[“SCFE”]提取油、并且使用短程蒸馏条件通过蒸馏减少油的甾醇含量以产生含脂质级份(即，SPD-纯化的微生物油)的方法。
制备干燥的和未处理的解脂耶氏酵母菌株Y9502生物质
解脂耶氏酵母菌株Y9502根据实例22A所示的方法以2-阶段分批补料方法培养并且将所得微生物生物质脱水、洗涤并干燥。
经由挤出干燥的、未处理的酵母生物质进行破碎
将干燥的和未处理的解脂耶氏酵母菌株Y9502生物质进料于双螺杆挤出机。具体地，酵母生物质(包含大约37％的总微生物油)在不含硅藻土的情况下以270kg／hr的速率进料于70mm的双螺杆挤出机(Coperion Werner Pfleiderer ZSK-70mm SCD，Stuttgart，Germany)。
挤出机以150kW马达和150rpm的高轴扭矩以及33％的总安培范围运行。在最终的水冷滚筒中将所得的破碎酵母生物质冷却至81℃。破碎生物 质的含水量为2.8重量％，这在Sartorius MA35水分分析仪(Sartorius AG，Goettingen，Germany)上测量。
提取挤出的酵母生物质
挤出的酵母生物质与硅藻土混合以防止床压实并使用超临界流体相CO2作为提取溶剂来提取，产生粗制甘油三酯油，其包含EPA(即，“提取油”)。具体地，总计82.7kg的挤出酵母生物质与41kg的硅藻土(Celatom MN-4；EP Minerals，LLC，Reno，NV)混合并填充到320L的不锈钢提取容器中，其方式与实例22B中所述的方式相同，不同的是：(i)通过预加热器将提取温度控制在40℃；(ii)将提取压力保持在4500psig(310巴)；(iii)使用44kg CO2／kg起始酵母的溶剂对进料比进行提取。用这种方法，从破碎酵母中提取23.2kg的油。提取油包含774mg的麦角固醇／100g油，这通过根据实例22B方法的GC分析进行测定。
在SPD条件下蒸馏
提取油通过2″玻璃分子蒸馏器以提供脱水的提取油。将流量保持在大约480g／hr。真空度、蒸发器和冷凝器温度分别为0.2mm汞柱、130℃和60℃。然后脱水的提取油在1mtorr的真空度下通过不同温度的蒸馏器三次，如下表所示。在每次通过后，如前文所述测定包含三酰基甘油的级份(即，含脂质级份或SPD-纯化油)中的麦角固醇含量、EPA含量(以重量％TFA表示)和总ω-3含量(以重量％TFA表示)。
表26：SPD-纯化油中的麦角固醇和PUFA含量
通过1 通过2 通过3
温度(℃) 210 240 270
麦角固醇(mg／100g) 110 52.8 1.21
C20：5EPA(重量％TFA) 54.9 55.2 55.4
总ω-3(重量％TFA) 57.51 57.92 57.18
因此，在210℃下，SPD纯化油中的麦角固醇含量是110mg/100g油并且它在240℃下降低至约53mg/100g油。当温度进一步提高到270℃时麦角固醇几乎完全转移到1mg／100g油中。这分别对应于在与提取油中的麦角固醇含量进行比较时，在通过1、通过2和通过3中的～57％、～86％和～99.8％的麦角固醇含量减少。
相对于SPD-纯化油中的PUFA含量，表26的数据说明未发生显著的EPA或总ω-3内容物降解，甚至当油在270℃下通过SPD蒸馏器时依然如此。
使用色谱分离表达谱进一步分析通过3的SPD-纯化油的非期望组分和污染物的外观。具体地，测试如下完成：(i)配有火焰离子化检测器(GC／FID)的气相色谱；(ii)薄层色谱法(TLC)；以及，(iii)带有质谱仪、光散射和紫外检测器(HPLC／MS／ELSD／UV)的液相色谱。SPD-纯化油样品的甲酯运行GC／FID表达谱。TLC和HPLC／MS／ELSD／UV表达谱直接对SPD-纯化油运行。在所有情况下，SPD-纯化油的表达谱与用解脂耶氏酵母菌株Y4305生物质制备的基准油进行比较(MATERIALS，参见上文)。
具体地，根据实例22A所示的方法从干燥的和未处理的解脂耶氏酵母菌株Y4305生物质中制备基准油。干燥的和未处理的生物质使用磨机，利用1对7的油对异己烷溶剂比率进行机械破碎。使用滗析离心机除去残余的生物质(即，细胞碎片)并且蒸发溶剂以产生包含甘油三酯的提取油。提取油使用冷丙酮，利用1对1.5的提取油对溶剂比率来脱胶，随后用50％的含水柠檬酸进行酸脱胶。然后用酸活化的粘土漂白脱胶的油并在210℃下脱臭30min以产生基准油样品。
通过3的SPD-纯化油色谱分离表达谱不包含在参照样品表达谱中未见的任何峰。两个样品均在同一天在相同条件下运行。另外，在SPD-纯化油中无未鉴定的峰，所述纯化油具有比参照样品表达谱中的对应峰显著更高的响应。在通过3的SPD-纯化油中也没有峰具有比通过1或通过2的SPD-纯化油中的相应峰更高的响应，其在较低温度(即，分别在210℃和240℃)下产生。这些分析表明在高温下使用SPD除去麦角固醇不产生油中降解产物的外观；因此，假设实施这种加工技术不显著降解PUFA。
实例24
从未处理的解脂耶氏酵母菌株Y8672生物质中制备具有减少甾醇含量的SPD-纯化 的微生物油
本文实例描述了经由使用磨机的机械破碎用于破碎干燥的和未处理的解脂耶氏酵母菌株Y8672生物质、使用异己烷溶剂提取原油、并且使用短 程蒸馏条件通过蒸馏减少丙酮脱胶的油的甾醇含量以产生含脂质级份(即，SPD-纯化的微生物油)的方法。
制备干燥的和未处理的解脂耶氏酵母菌株Y8672生物质
解脂耶氏酵母菌株Y8672根据实例22A所示的方法以2-阶段分批补料方法培养并且将所得微生物生物质脱水、洗涤并干燥。
经由磨机和异己烷溶剂破碎并提取干燥的未处理酵母生物质以生产提取油
干燥的和未处理的解脂耶氏酵母菌株Y8672生物质使用磨机，利用异己烷溶剂进行机械破碎。使用滗析离心机除去残余的生物质(即，细胞碎片)并且蒸发溶剂以产生包含甘油三酯的提取油。
提取油使用实例22B的方法进行分析。微生物油包含58.1的EPA％TFA，如下表所示。
表27：提取的Y8672微生物油的脂肪酸组合物
脂肪酸 占总脂肪酸的重量百分比
C18：2(ω-6) 15.6
C20：5EPA 58.1
C22：6DHA 不可检测
其它组分 26.3
一部分提取油使用冷丙酮，利用1对1.5的提取油对溶剂比率进行脱胶。丙酮脱胶的油包含880mg麦角固醇／100g油和74.5ppm的磷。
在SPD条件下蒸馏
根据实例22B的方法(不同的是蒸发器温度设为255℃)，丙酮脱胶的油经受短程蒸馏。在第一次通过期间几乎收集不到馏出液，因为在丙酮脱胶的油中有非常少量的水。在第二次通过期间，收集到大约12重量％的馏出液。在包含三酰基甘油的级份(即，含脂质级份或SPD-纯化油)中的最终麦角固醇含量是106mg／100g(麦角固醇含量在与丙酮脱胶的油中的麦角固醇含量进行比较时减少了～88％)。SPD-纯化油包含66ppm的磷。
实例25
制备包含占总脂肪酸[“TFA”]56.1％的EPA的非浓缩微生物油
本文实例描述了从重组解脂耶氏酵母菌株Z1978细胞的微生物生物质中获取的非浓缩微生物油的分离，该菌株经工程化以生产EPA。
具体地，使用2-阶段分批补料方法培养解脂耶氏酵母菌株Z1978。微生物油然后经由干燥从生物质中分离、提取(经由挤出物、粒化和超临界流体提取的组合)、并经由短程蒸馏进行纯化，产生非浓缩的富含甘油三酯的SPD-纯化油，其包含56.1EPA％TFA(即，含脂质级份)。
发酵并经由挤出和粒化破碎干燥的未处理解脂耶氏酵母菌株Z1978生物质
发酵解脂耶氏酵母菌株Z1978培养物并且收获微生物生物质并干燥，如上文材料(MATERIALS)所述。然后将干燥的和未处理的生物质进料到双螺杆挤出机中。具体地，预混生物质和15％硅藻土(Celatom MN-4或硅藻土209，EP Minerals，LLC，Reno，NV)的混合物并且随后进料到ZSK-40mm MC双螺杆挤出(Coperion Werner&Pfleiderer，Stuttgart，Germany)中，进料速率为45.5kg／hr。在挤出机破碎区后以147mL／min的流速注入由26.5％的蔗糖制成的水／蔗糖溶液。挤出机在280rpm下运行，具有的％扭矩范围为20-23。在最终的水冷滚筒中将所得的破碎酵母粉末冷却至35℃。然后将润湿的挤出粉末进料到LCI DomeGranulator Model No.TDG-80(LCI Corporation，Charlotte，NC)中，其配有1mm直径的多孔凸圆模具与1mm厚度的筛网并设为82rpm。挤出物以455-600kg／hr(作为干燥速率)形成。样品在振动流化床烘干机(FBP-75，Carman Industries，Inc.，Jeffersonville，IN)中干燥，该烘干机具有0.50m2的干燥区与保持在100℃的1150标准立方英尺／分钟[“scfm”]的气流和0.24m2的冷却区，在18℃以估计为500-600scfm的气流运行。大约1mm直径×6至10mm长度的干燥粒料在25-30℃范围内排出烘干机，其具有在O'Haus水分分析仪(Parsippany，NJ)上测得的5-6％的最终含水量。
挤出酵母生物质的油提取
使用如实例22B所述的320L不锈钢提取容器，挤出的酵母粒料使用超临界流体相CO2作为提取溶剂提取以产生非浓缩的富含甘油三酯的提取油。
提取容器初始填充有大约150kg挤出的酵母粒料。随后通过超临界流体CO2从粒料中提取未浓缩的提取油，提取条件为5000psig(345巴)、55℃、以及范围介于40至50kg之间的CO2／kg起始酵母粒料的溶剂对进料比率。从分离容器中收集大约37.5kg的非浓缩提取油，向其加入约1000ppm的两种抗氧化剂，即，Covi-ox T70(Cognis，Mississauga，Cahada)和Dadex RM(Nealanders，Mississauga，Canada)。
在SPD条件下蒸馏
未浓缩的提取油脱气并且虽然通过6″分子蒸馏器(POPE Scientific，Saukville，WI)，使用12kg／hr的进料速率以除去残余的水。蒸发器和冷凝器的表面温度分别设为140℃和15℃。真空度保持在15torr。
脱水的提取油以12kg／hr的进料速率二次通过分子蒸馏器以除去非期望的低分子量化合物如馏出液中的麦角固醇和游离脂肪酸。将真空度降低至1mtorr，并且将蒸发器的表面温度保持在240℃和270℃之间。获得包含三酰基甘油的级份(即，SPD-纯化油)，其具有相对于非浓缩提取油中的甾醇含量减少的甾醇。在包装前将非浓缩的SPD-纯化油冷却到低于40℃。
表征非浓缩的SPD-纯化油，其得自解脂耶氏酵母菌株Z1978
根据实例27所述的方法，在酯交换后分析得自菌株Z1978的非浓缩SPD-纯化油的脂肪酸组合物(即，含脂质级份)。SPD-纯化油包含56.1EPA％TFA并且DHA是不可检测(即，<0.05％)，如下表28所示。
表28：非浓缩的解脂耶氏酵母(Yarrowia lipolytica)Z1978SPD-纯化油的脂肪酸 组合物
脂肪酸 占总脂肪酸的重量百分比
C18：2(ω-6) 14.2
C20：5EPA 56.1
C22：6DHA 不可检测(<0.05％)
其它组分 29.7
实例26
从微拟球藻(Nannochloropsis)藻类及其提取油中制备固体粒料
本文实例描述了用于展示本文所公开方法应用于除耶氏酵母属之外的微生物生物质的测试。具体地，微拟球藻(Nannochloropsis)生物质与研磨剂和粘合剂混合以提供固体粒料。这些粒料经受超临界CO2提取并比较总提取收率。
Kuehmle Agrosystems，Inc.(Honolulu，HI)提供了多种无菌的单种藻原液用于售卖。在需要时，他们建议包括微拟球藻(Nannochloropsis)物类的藻类菌株KAS604作为适当的微生物生物质，其具有至少20％的脂质含量。该生物质在标准条件下生长(不优化油含量条件)并且由Kuehnle Agrosystems，Inc.干燥，并且随后购买微藻粉末如下使用。
91.7份微藻粉末在袋中与8.3份Celatom MN-4D-earth预混。所得干燥混合物以0.91kg／hr进料到18mm双螺杆挤出机(Coperion Werner Pfleiderer ZSK-18mm MC)中。与干燥进料一起，以2.5mL／min的流量将由10.9份水和5.0份糖制成的31％的糖水溶液注入挤出机的破碎区后。挤出机用10KW马达和200rpm的高扭矩轴以及46-81的％扭矩范围运行以提供破碎的酵母粉末，其在最终水冷滚筒中冷却至31℃。
然后将可固化混合物进料到MG-55LCI Dome Granulator中，其配有1.2mm孔径、1.2mm厚度的筛网并设为20rpm。以20kg／hr和6-7安培电流形成挤出物。在70℃的SherwoodDryer中干燥样品总计20min以提供固体粒料，其具有4.9％的最终水分含量。大约1.2mm直径×2至8mm长度的固体粒料为82.1％的藻类，残留的组合物为粒化助剂。然后测定在固体微拟球藻(Nannochloropsis)粒料中的总油量和游离油量并与通过SCF从固体微拟球藻(Nannochloropsis)粒料中提取的油量进行比较。
测定固体微拟球藻(Nannochloropsis)粒料中的总油含量
具体地，通过使用研钵和研杵将油轻柔碾磨到细粉中测定粒化样品上的总油，并且随后称重等分试样(一式三份地)进行分析。通过在80℃下与乙酰氯／甲醇的反应将样品中的脂肪酸(主要以甘油三酯形式存在)转化成对应的甲酯。向每个样品加入已知量的C15：0内标用于校正目的。各个脂 肪酸的测定通过配有火焰离子化检测器毛细管气相色谱(GC／FID)进行。总脂肪酸(以甘油三酯形式表达)为6.1％；取这个值为样品的总油含量。在归一化后，因为粒料中的藻类仅占总质量的82.1％，在藻类中的总油含量经测定为7.4％(即，6.1％除以0.821)。
在总油样品中的各个脂肪酸的分布在下表中示出。
表29：在固体微拟球藻(Nannochloropsis)粒料中的脂肪酸分配
脂肪酸 存在百分比(w／w)(以游离脂肪酸形式)
饱和脂肪酸 1.4
C16：0棕榈酸 1.3
C18：0硬脂酸 0.06
单不饱和脂肪酸 0.8
C16：1棕榈油酸 0.4
C18：1，n-9油酸 0.2
C18：1十八酸 0.04
多不饱和的脂肪酸 2.7
C18：2，n-6亚油酸 0.8
C18：3，n-3α-亚麻酸 1.2
C20：4，n-6花生四烯酸 0.1
C20：5，n-3二十碳五烯酸 0.6
未知脂肪酸 1.2
测定固体微拟球藻(Nannochloropsis)粒料中的游离油含量
游离油通常通过与正-庚烷一起搅拌样品、离心、并且随后蒸发上清液至干燥来进行测定。所得的残余油随后进行重量分析确定并表达为初始样品的重量百分比。发现这种方法对于粒化藻类样品来说并不令人满意，因为所得残余包含显著含量的颜料。因此，通过如上收集残余修改上述方法，加入已知量的C15：0内标，并且随后使用与用于总油测定相同的参数，通过GC／FID进行分析。用这种方法，样品的游离油含量经测定为3.7％。在归一化后，在藻类中的游离油含量经测定为4.5％(即，3.7％除以0.821)。
固体微拟球藻(Nannochloropsis)粒料的SCF提取
提取容器填充有24.60g固体粒料(基于干重)，在对研磨剂和粘合剂进行校正后产生约21.24g的藻类。用CO2冲洗粒料，然后加热至约40℃并加压至大约311巴。在这些条件下，以3.8g／min的CO2流量提取粒料约 6.7hr，提供大约71g CO2／g藻类的最终溶剂对进料(S／F)比率。提取收率为6.2％的填充藻类。
基于上文，推断出本文所述方法[即，包括下列步骤(a)将具有水分含量并包含含油微生物和至少一种能够吸收油的研磨剂的微生物生物质混合以提供破碎的生物质混合物，其包含破碎的微生物生物质；(b)将至少一种粘合剂与所述破碎的生物质混合物共混以提供能够形成固体粒料的可固化混合物；以及(c)由可固化混合物形成所述固体粒料]可被成功地用于从微拟球藻(Nannochloropsis)中制备包含破碎的微生物生物质的固体粒料。假设该方法将证明适用于多种其它含油微生物，但是期望针对各种特定微生物优化该方法，这将导致破碎效率提高。
此外，本文实例展示可以多种方法，用溶剂提取固体微拟球藻(Nannochloropsis)粒料以提供包含微生物油的提取物。本领域熟知的是不同的提取方法将产生不同量的提取油；期望在优化提取方法时可针对特定固体粒料提高提取收率。此外，期望提取油可根据本文公开在短程蒸馏条件下经受蒸馏。
实例27
制备包含占总脂肪酸[“TFA”]58.2％的EPA的微生物油
本文实例描述了从重组解脂耶氏酵母细胞的微生物生物质中获取的微生物油的分离，该菌株经工程化以生产EPA。然后通过多种方法富集这种微生物油，如下文实例28-30所述。
从解脂耶氏酵母菌株Y8672微生物生物质中经由异己烷溶剂分离微生物油并纯化，产生非浓缩的富含甘油三酯的纯化油，其包含58.2EPA％TFA。
发酵并提取来自解脂耶氏酵母菌株Y8672生物质的微生物油
解脂耶氏酵母菌株Y8672在2-阶段分批补料方法中生长，根据材料(MATERIALS)所述进行脱水和洗涤。随后进行滚筒干燥以减少水分至小于5％，从而确保未处理微生物生物质在短期储存和运输期间的油稳定性。
微生物生物质随后经受机械破碎，用异己烷溶剂从生物质中提取富含EPA的微生物油。除去残余的生物质(即，细胞碎片)并且蒸发溶剂以产生提取油。提取油使用磷酸脱胶并用苛性20°Baume精制以去除磷脂、痕量 金属和游离脂肪酸。用二氧化硅和粘土漂白，它们用于吸附颜色化合物和微量氧化产物。最后的脱臭步骤汽提出挥发性的、臭味的和附加的颜色化合物以产生非浓缩的纯化微生物油，其包含以它们的天然甘油三酯形式存在的PUFA。
表征来自解脂耶氏酵母菌株Y8672的微生物油
使用如实例22A所示的GC方法分析非浓缩的纯化油的脂肪酸组合物。
得自对非浓缩Y8672纯化油的GC分析结果在下表30中示出。纯化油包含58.2EPA％TFA并且DHA是不可检测(即，<0.05％)。
表30：非浓缩的Y8672纯化油的脂肪酸组合物
脂肪酸 占总脂肪酸的重量百分比
C18：2(ω-6) 16.6
C20：5EPA 58.2
C22：6DHA 不可检测(<0.05％)
其它组分 25.2
如果生物质经受粒化、提取和随后在短程蒸馏条件下的蒸馏，本领域的技术人员将期望相似组成的微生物油可获取自解脂耶氏酵母菌株Y8672。
实例28
经由尿素加合物形成富集微生物油
这个实例展示包含按油重量％计至多78％的EPA乙酯且基本上不含DHA的EPA浓缩物可经由尿素加合物形成在富集来自实例27的非浓缩纯化油时获得。
KOH(20g)首先溶解在320g无水乙醇中。然后该溶液与实例27的1kg非浓缩纯化油混合并加热至大约60℃，保持4hr。将反应混合物留在Sep漏斗中过夜以发生完全相分离。在除去底部的甘油级份后，将小量二氧化硅加到上部的乙酯级份中以除去过多的皂。在约90℃，在真空下旋转蒸发除去乙醇，产生澄清的但是呈棕色的乙酯。
乙酯(20g)与40g尿素和100g乙醇(90％含水量)在大约65℃混合。将混合物保持在这一温度直至它变为澄清溶液。然后冷却混合物至室温 并保持大约20hr以使尿素晶体和加合物形成。然后通过过滤除去固体并通过旋转蒸发液体级份除去乙醇。回收的乙酯级份用200mL温水进行第一次和随后的第二次洗涤。在滗析含水级份前首先将溶液pH调节至3-4。然后干燥乙酯级份以除去残余的水。
为了测定乙酯级份中的脂肪酸乙酯[“FAEE”]浓度，在甲苯／己烷(2：3)中稀释后直接分析FAEE，使用与前文实例22A所述相同的GC条件和计算以测定FAME浓度。方法中仅有的修改是：i)使用C23：0EE而非C15：0作为内标；以及，ii)不需要1.042-1.052的分子量转换因子。
然而EPA乙酯[“EPA-EE”]经受与上述方法相比稍微修改过的方法。具体地，制备已知浓度和纯度的基准EPA-EE标准物以包含大约与分析样品相同量的EPA-EE，以及相同量的C23：0EE内标。样品中的EPA-EE(mg)精确含量根据下式计算：(EPA-EE峰面积／C23：0EE峰面积)×(校准标准物中的C23：0EE峰面积／校准标准物中的EPA-EE峰面积)×(校准标准物中的mg EPA-EE)。全部的内部和参考标准物均得自Nu-Chek Prep，Inc。
用这种方法，测定富集油的级份，即，EPA浓缩物中的FAEE浓度。具体地，经由尿素加合物形成富集非浓缩的纯化油产生EPA浓缩物，其具有按油重量％计77％的EPA乙酯且基本上不含DHA，如表31所示。
表31：利用尿素加合物方法的EPA乙酯浓缩物
脂肪酸乙酯 占油的重量百分比
C18：2(ω-6) 3.9
C20：5EPA 76.5
C22：6DHA 不可检测(<0.05％)
其它组分 19.6
本领域的普通技术人员将会知道包含按油重量％计77％的EPA乙酯且基本上不含DHA的EPA浓缩物可使用本领域技术人员熟知的方法被容易地转化以产生备选形式的EPA浓缩物(即，可将EPA乙酯转化成游离脂肪酸、三酰基甘油、甲酯、以及它们的组合)。因此，例如可经由甘油解将77％的EPA乙酯再酯化成甘油三酯，从而产生甘油三酯形式的EPA浓缩物，其包含按油重量％计至少70重量％EPA且基本上不含DHA。
实例29
经由液相色谱富集微生物油
这个实例展示包含按油重量％计至多95.4％的EPA乙酯且基本上不含DHA的EPA浓缩物可使用液相色谱方法在富集来自实例27的非浓缩纯化油时获得。
使用与实例28所述方法相似的方法将实例27的非浓缩的纯化油酯交换成乙酯，该方法有一些微小的改变(即，使用乙醇钠作为碱催化剂，而非氢氧化钾)。
然后使用他们的液相色谱纯化技术，通过Equateq(Isle of Lewis，Scotland)富集乙酯。获得不同程度的富集度(例如参见样品#1和样品#2的示例性数据，参见下文)。因此，经由液相色谱富集非浓缩的纯化油产生EPA浓缩物，其具有按油重量％计至多95.4％的EPA乙酯且基本上不含DHA，如表32所示。
表32：利用液相色谱富集方法的EPA乙酯浓缩物
本领域的技术人员将会知道包含按油重量％计82.8％EPA乙酯或95.4％EPA乙酯且基本上不含DHA的EPA浓缩物可使用本领域技术人员熟知的方法被容易地转化以产生备选形式的EPA浓缩物(即，可将EPA乙酯转化成游离脂肪酸、三酰基甘油、甲酯、以及它们的组合)。因此，例如可经由甘油解将82.8％EPA乙酯或95.4％EPA乙酯再酯化成甘油三酯，从而产生甘油三酯形式的EPA浓缩物，其包含按油重量％计至少70重量％EPA且基本上不含DHA。
实例30
经由超临界流体色谱富集微生物油
这个实例展示包含按油重量％计至多89.8％的EPA乙酯且基本上不含DHA的EPA浓缩物可使用超临界流体色谱[“SFC”]方法在富集来自实例27的非浓缩纯化油时获得。
使用乙醇钠作为碱催化剂将来自实例27非浓缩的纯化油酯交换成乙酯，并且随后通过吸附柱除去不溶于超临界CO2的化合物。然后通过K.D.Pharma(Bexbach，Germany)，使用它们的超临界色谱分离技术纯化加工的乙酯油。获得不同程度的富集度(例如参见样品1和样品2的示例性数据，参见下文)。因此，经由SFC富集非浓缩的纯化油产生EPA浓缩物，其具有按油重量％计85％和89.8％的EPA乙酯且基本上不含DHA，如表33所示。
表33：利用SFC富集方法的EPA乙酯浓缩物
本领域的技术人员将会知道包含按油重量％计85％EPA乙酯或89.8％EPA乙酯且基本上不含DHA的EPA浓缩物可使用本领域技术人员熟知的方法被容易地转化以产生备选形式的EPA浓缩物(即，可将EPA乙酯转化成游离脂肪酸、三酰基甘油、甲酯、以及它们的组合)。因此，例如可经由甘油解将85％EPA乙酯或89.8％EPA乙酯再酯化成甘油三酯，从而产生甘油三酯形式的EPA浓缩物，其包含按油重量％计至少70重量％EPA且基本上不含DHA。
实例31
制备包含占总脂肪酸[“TFA”]56.1％的EPA的微生物油
本文实例描述了从重组解脂耶氏酵母细胞的微生物生物质中获取的微生物油的分离，该菌株经工程化以生产EPA。然后通过分馏富集这种微生物油，如下文实例32所述。
具体地，解脂耶氏酵母菌株Z1978经重组工程化以生产约58.7EPA％TFA并使用2-阶段分批补料方法培养。微生物油然后经由干燥从生物质中分离、提取(经由挤出物、粒化和超临界流体提取的组合)、并经由短程蒸馏进行纯化，产生非浓缩的富含甘油三酯的SPD-纯化油，其包含56.1EPA％TFA(即，含脂质级份)。
发酵并经由挤出和粒化破碎干燥的未处理解脂耶氏酵母菌株Z1978生物质
发酵解脂耶氏酵母菌株Z1978培养物并且收获微生物生物质并干燥，如上文材料(MATERIALS)部分所述。
然后将干燥的和未处理的生物质进料到双螺杆挤出机中。具体地，预混生物质和15％硅藻土(Celatom MN-4或硅藻土209，EP Minerals，LLC，Reno，NV)的混合物并且随后进料到ZSK-40mm MC双螺杆挤出(Coperion Werner&Pfleiderer，Stuttgart，Germany)中，进料速率为45.5kg／hr。在挤出机破碎区后以147mL/min的流速注入由26.5％的蔗糖制成的水／蔗糖溶液。挤出机在280rpm下运行，具有的％扭矩范围为20-23。在最终的水冷滚筒中将所得的破碎酵母粉末冷却至35℃。然后将润湿的挤出粉末进料到LCI Dome GranulatorModel No.TDG-80(LCI Corporation，Charlotte，NC)中，其配有1mm直径的多孔凸圆模具与1mm厚度的筛网并设为82rpm。挤出物以455-600kg／hr(作为干燥速率)形成。样品在振动流化床烘干机(FBP-75，Carman Industries，Inc.，Jeffersonville，IN)中干燥，该烘干机具有0.50m2的干燥区与保持在100℃的1150标准立方英尺／分钟[“scfm”]的气流和0.24m2的冷却区，在18℃以估计为500-600scfm的气流运行。大约1mm直径×6至10mm长度的干燥粒料在25-30℃范围内排出烘干机，其具有在O'Haus水分分析仪(Parsippany，NJ)上测得的5-6％的最终含水量。
挤出的酵母生物质的油提取
使用如实例22B所述的320L不锈钢提取容器和构造，挤出的酵母粒料使用超临界流体相CO2作为提取溶剂提取以产生非浓缩的提取油。提取油定期从分离容器中排出并收集作为产物。
提取容器初始填充有大约150kg挤出的酵母粒料。随后通过超临界流体CO2从粒料中提取未浓缩的提取油，提取条件为5000psig(345巴)、55℃、以及范围介于40至50kg之间的CO2／kg起始酵母粒料的溶剂对进料比率。从分离容器中收集大约37.5kg的非浓缩提取油，向其加入约1000ppm的两种抗氧化剂，即，Covi-ox T70(Cognis，Mississauga，Canada)和Dadex RM(Nealanders，Mississauga，Canada)。
在SPD条件下蒸馏
未浓缩的提取油脱气并且虽然通过6″分子蒸馏器(POPE Scientific，Saukville，WI)，使用12kg／hr的进料速率以除去残余的水。蒸发器和冷凝器的表面温度分别设为140℃和15℃。真空度保持在15torr。
脱水的提取油以12kg／hr的进料速率二次通过分子蒸馏器以除去非期望的低分子量化合物如馏出液中的麦角固醇和游离脂肪酸。将真空度降低至1mtorr，并且将蒸发器的表面温度保持在240℃和270℃之间。获得包含三酰基甘油的级份(即，包含脂质级份或SPD-纯化油)，其具有相对于非浓缩提取油中的甾醇含量减少的甾醇。在包装前将非浓缩的SPD-纯化油冷却到低于40℃。
表征SPD-纯化油，其得自解脂耶氏酵母菌株Z1978
根据实例27所述的方法，在酯交换后分析得自菌株Z1978的非浓缩SPD-纯化油的脂肪酸组合物。SPD-纯化油包含56.1EPA％TFA并且DHA是不可检测(即，<0.05％)，如下表34所示。
表34：非浓缩的Z1978SPD-纯化油的脂肪酸组合物
脂肪酸 占总脂肪酸的重量百分比
C18：2(ω-6) 14.2
C20：5EPA 56.1
C22：6DHA 不可检测(<0.05％)
其它组分 29.7
实例32
经由分馏富集微生物油
这个实例展示包含按油重量％计至多74％的EPA乙酯且基本上不含DHA的EPA浓缩物可使用分馏方法在富集来自实例31的非浓缩SPD纯化油时获得。
将来自实例31的二十五(25)kg非浓缩的微生物油加到50L玻璃烧瓶中。然后将7.9kg无水乙醇和580g乙醇钠(21％乙醇溶液)加到烧瓶中。将混合物在～85℃加热回流最少30min。通过薄层色谱法监测反应，其中将油稀释样品成斑点状加到二氧化硅板上并使用乙酸／己烷／乙醚溶剂混合物分离。通过碘染色检测由未反应的TAG组成的斑点。认为未检出斑点或几乎不检出斑点代表反应完成。在到达反应终点后，将混合物冷却至低于50℃并实现相分离。分离并弃去包含甘油的底层。用2.5L5％柠檬酸洗涤上部有机层，随后用5L15％含水硫酸钠洗涤回收的有机层。将水相再次弃去，并在～60℃旋转蒸发仪中用乙醇蒸馏乙酯相以去除残余的水。回收大约25kg乙酯形式的油。
然后以5kg／hr的进料速率将乙酯进料到4″混合刮膜和分馏系统(POPEScientific，Saukville，WI)以富集EPA乙酯。将蒸发器温度设为大约275℃，真空度为0.47torr。填充柱的头部温度为约146℃。以轻镏分形式从顶部除去主要是C18的低分子量乙酯。以重馏分形式回收的提取EPA乙酯并经受二次蒸馏，主要用于除去颜色并聚合。以20kg／hr的进料速率在6″分子蒸馏器(POPE Scientific，Saukville，WI)中进行二次蒸馏。蒸发器在约205℃下运行，将内部冷凝器温度设为约10℃并将真空度设为0.01torr。除去大约7-10重量％的乙酯，产生澄清的和淡色的EPA浓缩物。最终的EPA浓缩物包含按油重量％计74％的EPA乙酯且基本上不含DHA。
本领域的技术人员将会知道包含按油重量％计74％的EPA乙酯且基本上不含DHA的EPA浓缩物可使用本领域技术人员熟知的方法被容易地转化以产生备选形式的EPA浓缩物(即，可将EPA乙酯转化成游离脂肪酸、三酰基甘油、甲酯、以及它们的组合)。因此，例如可经由甘油解将74％的 EPA乙酯再酯化成甘油三酯，从而产生甘油三酯形式的EPA浓缩物，其包含按油重量％计至少70重量％EPA且基本上不含DHA。
实例33
EPA浓缩物基本上不含环境污染物
这个实例展示包含按油重量％计至少70重量％的EPA且基本上不含DHA的EPA浓缩物、和包含按TFA重量％计30-70重量％的EPA且基本上不含DHA的微生物油基本上不含环境污染物。
如实例27所述制备来自解脂耶氏酵母菌株Y8672的非浓缩纯化油的比较例。在非浓缩的提取油中的多氯联苯[“PCB”](CAS No.1336-36-3)、多氯代二苯并二恶英[“PCDD”]和氯代二苯并呋喃[“PCDF”]的按mg/g World Health Organization InternationalToxicity Equivalent[“WHO TEQ”]计的浓度根据EPA方法1668Rev A进行测定。检测极低或未检出水平的环境污染物。
基于上述结果，本文假设在实例27的非浓缩提取油中和在实例31的非浓缩SPD-纯化油中的PCB、PCDD、和PCDF浓度也将含有极低的或未检出水平的环境污染物。相似地，本文假设在实例28、29、30和32中分别经由尿素加合物形成、液相色谱、SFC和分馏富集的EPA乙酯浓缩物也将含有极低的或未检出水平的环境污染物，因为它们产自自身基本上不含环境污染物的非浓缩油。
更具体地，表35描述了在实例28、29、30和32的EPA浓缩物中的PCB、PCDD、和PCDF的期望TEQ水平。为了进行比较，也包括在美国专利7,732,488中描述的去除污染物的鱼油中的相同化合物的浓度。注意到美国专利7,732,488提供了用于将这些环境污染物降低到可接受水平的特定加工方法。
表35：EPA污染物中期望的环境污染物浓度(pg/g WHO TEQ)
如上所示，实例28、29、30和32中的EPA乙酯浓缩物将具有比美国专利7，732，488中的去除污染物的鱼油更低的PCB、PCDD和PCDF水平。事实上，期望PCDF的污染物水平低于使用分析方法的检测限。
实例34
经由分馏和液相色谱富集微生物油
这个实例展示包含按油重量％计至多97.4％EPA乙酯且基本上不含DHA、NDPA和HPA的EPA浓缩物可在富集非浓缩纯化油时使用分馏和液相色谱方法的组合获得。
含脂质级份获取自解脂耶氏酵母菌株Y9502(参见上文，实例31；还可参见美国专利申请公布2010-0317072-A1)。具体地，如实例31所述培养、收获、经由挤出和粒化破碎、并使用超临界流体相CO2提取菌株。然后在SPD条件下(实例31)纯化非浓缩的提取油。
表征SPD-纯化油，其得自解脂耶氏酵母菌株Y9502
根据实例27所述的方法，分析得自菌株Y9502的非浓缩SPD-纯化油的脂肪酸组合物。SPD-纯化油包含54.7EPA％TFA，并且DHA、NDPA和HPA是不可检测(即，<0.05％)，如下表36所示。
表36：非浓缩的Y9502SPD-纯化油的脂肪酸组合物
脂肪酸 占总脂肪酸的重量百分比
C18：2(ω-6) 15
C19：5(ω-2) 不可检测(<0.05％)
C20：5EPA 54.7
C21：5HPA 不可检测(<0.05％)
C22：6DHA 不可检测(<0.05％)
其它组分 30.3
富集SPD-纯化油，其得自解脂耶氏酵母菌株Y9502
使用与实例29所述方法相似的方法将SPD-纯化油酯交换成乙酯并如实例31所述进一步经受分馏。分馏的EPA浓缩物包含按油重量％计71.9％的EPA乙酯且基本上不含DHA、NDPA和HPA(参见下表37中题目为“分馏所得”的列)。
然后使用他们的液相色谱纯化技术，通过Equateq(Isle of Lewis，Scotland)富集分馏的乙酯。经由液相色谱富集分馏的EPA浓缩物产生具有按油重量％计至多97.4％的EPA乙酯且基本上不含DHA、NDPA和HPA的最终EPA浓缩物(参见下表37中题目为“液相色谱富集”的列)
表37：利用液相色谱富集方法的EPA乙酯浓缩物
本领域的技术人员将会知道包含按油重量％计97.4％的EPA乙酯且基本上不含DHA、NPDA和HPA的EPA浓缩物可使用本领域技术人员熟知的方法被容易地转化以产生备选形式的EPA浓缩物(即，可将EPA乙酯转化成游离脂肪酸、三酰基甘油、甲酯、以及它们的组合)。因此，例如可经由甘油解将97.4％的EPA乙酯再酯化成甘油三酯，从而产生甘油三酯形式的EPA浓缩物，其包含按油重量％计至少70重量％EPA且基本上不含DHA、NPDA和HPA。
另外，注意到期望根据本发明方法从经工程化以生产EPA的重组耶氏酵母属细胞的任何微生物生物质中制备的EPA浓缩物基本上不含DHA、NDPA和HPA。上文基于获取自解脂耶氏酵母菌株Y9502的微生物油(其中最终的EPA浓缩物基本上不含DHA、NDPA和HPA)获得的结果将期望得自EPA浓缩物，其从获取自实例27和实例31的微生物油中制备。因为DHA、NDPA和HPA杂质不存在于包含按TFA重量％计30至70重量％的EPA的初始微生物油中，其获取自积累超过其干细胞重量25％的油的耶氏酵母属，脂肪酸杂质也将不存在于由此产生的EPA浓缩物中。
序列表
<110> E.I. duPont de Nemours & Company, Inc.
Liang, Shu-Chien
<120> 从微生物生物质中获取含脂质组合物的方法
<130> CL5369USNA
<150> US 61/441,849
<151> 2011-02-11
<160> 8
<170> PatentIn 版本 3.5
<210> 1
<211> 4313
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 质粒pZKUM
<400> 1
taatcgagct tggcgtaatc atggtcatag ctgtttcctg tgtgaaattg ttatccgctc 60
acaattccac acaacatacg agccggaagc ataaagtgta aagcctgggg tgcctaatga 120
gtgagctaac tcacattaat tgcgttgcgc tcactgcccg ctttccagtc gggaaacctg 180
tcgtgccagc tgcattaatg aatcggccaa cgcgcgggga gaggcggttt gcgtattggg 240
cgctcttccg cttcctcgct cactgactcg ctgcgctcgg tcgttcggct gcggcgagcg 300
gtatcagctc actcaaaggc ggtaatacgg ttatccacag aatcagggga taacgcagga 360
aagaacatgt gagcaaaagg ccagcaaaag gccaggaacc gtaaaaaggc cgcgttgctg 420
gcgtttttcc ataggctccg cccccctgac gagcatcaca aaaatcgacg ctcaagtcag 480
aggtggcgaa acccgacagg actataaaga taccaggcgt ttccccctgg aagctccctc 540
gtgcgctctc ctgttccgac cctgccgctt accggatacc tgtccgcctt tctcccttcg 600
ggaagcgtgg cgctttctca tagctcacgc tgtaggtatc tcagttcggt gtaggtcgtt 660
cgctccaagc tgggctgtgt gcacgaaccc cccgttcagc ccgaccgctg cgccttatcc 720
ggtaactatc gtcttgagtc caacccggta agacacgact tatcgccact ggcagcagcc 780
actggtaaca ggattagcag agcgaggtat gtaggcggtg ctacagagtt cttgaagtgg 840
tggcctaact acggctacac tagaaggaca gtatttggta tctgcgctct gctgaagcca 900
gttaccttcg gaaaaagagt tggtagctct tgatccggca aacaaaccac cgctggtagc 960
ggtggttttt ttgtttgcaa gcagcagatt acgcgcagaa aaaaaggatc tcaagaagat 1020
cctttgatct tttctacggg gtctgacgct cagtggaacg aaaactcacg ttaagggatt 1080
ttggtcatga gattatcaaa aaggatcttc acctagatcc ttttaaatta aaaatgaagt 1140
tttaaatcaa tctaaagtat atatgagtaa acttggtctg acagttacca atgcttaatc 1200
agtgaggcac ctatctcagc gatctgtcta tttcgttcat ccatagttgc ctgactcccc 1260
gtcgtgtaga taactacgat acgggagggc ttaccatctg gccccagtgc tgcaatgata 1320
ccgcgagacc cacgctcacc ggctccagat ttatcagcaa taaaccagcc agccggaagg 1380
gccgagcgca gaagtggtcc tgcaacttta tccgcctcca tccagtctat taattgttgc 1440
cgggaagcta gagtaagtag ttcgccagtt aatagtttgc gcaacgttgt tgccattgct 1500
acaggcatcg tggtgtcacg ctcgtcgttt ggtatggctt cattcagctc cggttcccaa 1560
cgatcaaggc gagttacatg atcccccatg ttgtgcaaaa aagcggttag ctccttcggt 1620
cctccgatcg ttgtcagaag taagttggcc gcagtgttat cactcatggt tatggcagca 1680
ctgcataatt ctcttactgt catgccatcc gtaagatgct tttctgtgac tggtgagtac 1740
tcaaccaagt cattctgaga atagtgtatg cggcgaccga gttgctcttg cccggcgtca 1800
atacgggata ataccgcgcc acatagcaga actttaaaag tgctcatcat tggaaaacgt 1860
tcttcggggc gaaaactctc aaggatctta ccgctgttga gatccagttc gatgtaaccc 1920
actcgtgcac ccaactgatc ttcagcatct tttactttca ccagcgtttc tgggtgagca 1980
aaaacaggaa ggcaaaatgc cgcaaaaaag ggaataaggg cgacacggaa atgttgaata 2040
ctcatactct tcctttttca atattattga agcatttatc agggttattg tctcatgagc 2100
ggatacatat ttgaatgtat ttagaaaaat aaacaaatag gggttccgcg cacatttccc 2160
cgaaaagtgc cacctgacgc gccctgtagc ggcgcattaa gcgcggcggg tgtggtggtt 2220
acgcgcagcg tgaccgctac acttgccagc gccctagcgc ccgctccttt cgctttcttc 2280
ccttcctttc tcgccacgtt cgccggcttt ccccgtcaag ctctaaatcg ggggctccct 2340
ttagggttcc gatttagtgc tttacggcac ctcgacccca aaaaacttga ttagggtgat 2400
ggttcacgta gtgggccatc gccctgatag acggtttttc gccctttgac gttggagtcc 2460
acgttcttta atagtggact cttgttccaa actggaacaa cactcaaccc tatctcggtc 2520
tattcttttg atttataagg gattttgccg atttcggcct attggttaaa aaatgagctg 2580
atttaacaaa aatttaacgc gaattttaac aaaatattaa cgcttacaat ttccattcgc 2640
cattcaggct gcgcaactgt tgggaagggc gatcggtgcg ggcctcttcg ctattacgcc 2700
agctggcgaa agggggatgt gctgcaaggc gattaagttg ggtaacgcca gggttttccc 2760
agtcacgacg ttgtaaaacg acggccagtg aattgtaata cgactcacta tagggcgaat 2820
tgggtaccgg gccccccctc gaggtcgacg agtatctgtc tgactcgtca ttgccgcctt 2880
tggagtacga ctccaactat gagtgtgctt ggatcacttt gacgatacat tcttcgttgg 2940
aggctgtggg tctgacagct gcgttttcgg cgcggttggc cgacaacaat atcagctgca 3000
acgtcattgc tggctttcat catgatcaca tttttgtcgg caaaggcgac gcccagagag 3060
ccattgacgt tctttctaat ttggaccgat agccgtatag tccagtctat ctataagttc 3120
aactaactcg taactattac cataacatat acttcactgc cccagataag gttccgataa 3180
aaagttctgc agactaaatt tatttcagtc tcctcttcac caccaaaatg ccctcctacg 3240
aagctcgagt gctcaagctc gtggcagcca agaaaaccaa cctgtgtgct tctctggatg 3300
ttaccaccac caaggagctc attgagcttg ccgataaggt cggaccttat gtgtgcatga 3360
tcaaaaccca tatcgacatc attgacgact tcacctacgc cggcactgtg ctccccctca 3420
aggaacttgc tcttaagcac ggtttcttcc tgttcgagga cagaaagttc gcagatattg 3480
gcaacactgt caagcaccag taccggtgtc accgaatcgc cgagtggtcc gatatcacca 3540
acgcccacgg tgtacccgga accggaatcg attgctggcc tgcgagctgg tgcgtacgag 3600
gaaactgtct ctgaacagaa gaaggaggac gtctctgact acgagaactc ccagtacaag 3660
gagttcctag tcccctctcc caacgagaag ctggccagag gtctgctcat gctggccgag 3720
ctgtcttgca agggctctct ggccactggc gagtactcca agcagaccat tgagcttgcc 3780
cgatccgacc ccgagtttgt ggttggcttc attgcccaga accgacctaa gggcgactct 3840
gaggactggc ttattctgac ccccggggtg ggtcttgacg acaagggaga cgctctcgga 3900
cagcagtacc gaactgttga ggatgtcatg tctaccggaa cggatatcat aattgtcggc 3960
cgaggtctgt acggccagaa ccgagatcct attgaggagg ccaagcgata ccagaaggct 4020
ggctgggagg cttaccagaa gattaactgt tagaggttag actatggata tgtaatttaa 4080
ctgtgtatat agagagcgtg caagtatgga gcgcttgttc agcttgtatg atggtcagac 4140
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atggggcatg ttgttgtgtt tctcgatacg gagatgctgg gtacagtgct aatacgttga 4260
actacttata cttatatgag gctcgaagaa agctgacttg tgtatgactt aat 4313
<210> 2
<211> 13565
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 质粒pZKL3-9DP9N
<400> 2
gtacggattg tgtatgtccc tgtacctgca tcttgatgga gagagctccg gaaagcggat 60
caggagctgt ccaattttaa ttttataaca tggaaacgag tccttggagc tagaagacca 120
ttttttcaac tgccctatcg actatattta tctactccaa aaccgactgc ttcccaagaa 180
tcttcagcca aggcttccaa agtaacccct cgcttcccga cacttaattg aaaccttaga 240
tgcagtcact gcgagtgaag tggactctaa catctccaac atagcgacga tattgcgagg 300
gtttgaatat aactaagatg catgatccat tacatttgta gaaatatcat aaacaacgaa 360
gcacatagac agaatgctgt tggttgttac atctgaagcc gaggtaccga tgtcattttc 420
agctgtcact gcagagacag gggtatgtca catttgaaga tcatacaacc gacgtttatg 480
aaaaccagag atatagagaa tgtattgacg gttgtggcta tgtcataagt gcagtgaagt 540
gcagtgatta taggtatagt acacttactg tagctacaag tacatactgc tacagtaata 600
ctcatgtatg caaaccgtat tctgtgtcta cagaaggcga tacggaagag tcaatctctt 660
atgtagagcc atttctataa tcgaaggggc cttgtaattt ccaaacgagt aattgagtaa 720
ttgaagagca tcgtagacat tacttatcat gtattgtgag agggaggaga tgcagctgta 780
gctactgcac atactgtact cgcccatgca gggataatgc atagcgagac ttggcagtag 840
gtgacagttg ctagctgcta cttgtagtcg ggtgggtgat agcatggcgc gccagctgca 900
ttaatgaatc ggccaacgcg cggggagagg cggtttgcgt attgggcgct cttccgcttc 960
ctcgctcact gactcgctgc gctcggtcgt tcggctgcgg cgagcggtat cagctcactc 1020
aaaggcggta atacggttat ccacagaatc aggggataac gcaggaaaga acatgtgagc 1080
aaaaggccag caaaaggcca ggaaccgtaa aaaggccgcg ttgctggcgt ttttccatag 1140
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tagcagagcg aggtatgtag gcggtgctac agagttcttg aagtggtggc ctaactacgg 1560
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aagtatatat gagtaaactt ggtctgacag ttaccaatgc ttaatcagtg aggcacctat 1920
ctcagcgatc tgtctatttc gttcatccat agttgcctga ctccccgtcg tgtagataac 1980
tacgatacgg gagggcttac catctggccc cagtgctgca atgataccgc gagacccacg 2040
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gtcacgctcg tcgtttggta tggcttcatt cagctccggt tcccaacgat caaggcgagt 2280
tacatgatcc cccatgttgt gcaaaaaagc ggttagctcc ttcggtcctc cgatcgttgt 2340
cagaagtaag ttggccgcag tgttatcact catggttatg gcagcactgc ataattctct 2400
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ctgagaatag tgtatgcggc gaccgagttg ctcttgcccg gcgtcaatac gggataatac 2520
cgcgccacat agcagaactt taaaagtgct catcattgga aaacgttctt cggggcgaaa 2580
actctcaagg atcttaccgc tgttgagatc cagttcgatg taacccactc gtgcacccaa 2640
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ttttcaatat tattgaagca tttatcaggg ttattgtctc atgagcggat acatatttga 2820
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tgatgcggtg tgaaataccg cacagatgcg taaggagaaa ataccgcatc aggaaattgt 2940
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ccaataggcc gaaatcggca aaatccctta taaatcaaaa gaatagaccg agatagggtt 3060
gagtgttgtt ccagtttgga acaagagtcc actattaaag aacgtggact ccaacgtcaa 3120
agggcgaaaa accgtctatc agggcgatgg cccactacgt gaaccatcac cctaatcaag 3180
ttttttgggg tcgaggtgcc gtaaagcact aaatcggaac cctaaaggga gcccccgatt 3240
tagagcttga cggggaaagc cggcgaacgt ggcgagaaag gaagggaaga aagcgaaagg 3300
agcgggcgct agggcgctgg caagtgtagc ggtcacgctg cgcgtaacca ccacacccgc 3360
cgcgcttaat gcgccgctac agggcgcgtc cattcgccat tcaggctgcg caactgttgg 3420
gaagggcgat cggtgcgggc ctcttcgcta ttacgccagc tggcgaaagg gggatgtgct 3480
gcaaggcgat taagttgggt aacgccaggg ttttcccagt cacgacgttg taaaacgacg 3540
gccagtgaat tgtaatacga ctcactatag ggcgaattgg gcccgacgtc gcatgcagga 3600
atagacatct tcaataggag cattaatacc tgtgggatca ctgatgtaaa cttctcccag 3660
agtatgtgaa taaccagcgg gccatccaac aaagaagtcg ttccagtgag tgactcggta 3720
catccgtctt tcggggttga tggtaagtcc gtcgtctcct tgcttaaaga acagagcgtc 3780
cacgtagtct gcaaaagcct tgtttccaag tcgaggctgc ccatagttga ttagcgttgg 3840
atcatatcca agattcttca ggttgatgcc catgaataga gcagtgacag ctcctagaga 3900
gtggccagtt acgatcaatt tgtagtcagt gttgtttcca aggaagtcga ccagacgatc 3960
ctgtacgttc accatagtct ctctgtatgc cttctgaaag ccatcatgaa cttggcagcc 4020
aggacaattg atactggcag aagggtttgt ggagtttatg tcagtagtgt taagaggagg 4080
gatactggtc atgtagggtt gttggatcgt ttggatgtca gtaatagcgt ctgcaatgga 4140
gaaagtgcct cggaaaacaa tatacttttc ctttttggtg tgatcgtggg ccaaaaatcc 4200
agtaactgaa gtcgagaaga aatttcctcc aaactggtag tcaagagtca catcgggaaa 4260
atgagcgcaa gagtttccac aggtaaaatc gctctgcagg gcaaatgggc caggggctct 4320
gacacaatag gccacgttag atagccatcc gtacttgaga acaaagtcgt atgtctcctg 4380
ggtgatagga gccgttaatt aagttgcgac acatgtcttg atagtatctt gaattctctc 4440
tcttgagctt ttccataaca agttcttctg cctccaggaa gtccatgggt ggtttgatca 4500
tggttttggt gtagtggtag tgcagtggtg gtattgtgac tggggatgta gttgagaata 4560
agtcatacac aagtcagctt tcttcgagcc tcatataagt ataagtagtt caacgtatta 4620
gcactgtacc cagcatctcc gtatcgagaa acacaacaac atgccccatt ggacagatca 4680
tgcggataca caggttgtgc agtatcatac atactcgatc agacaggtcg tctgaccatc 4740
atacaagctg aacaagcgct ccatacttgc acgctctcta tatacacagt taaattacat 4800
atccatagtc taacctctaa cagttaatct tctggtaagc ctcccagcca gccttctggt 4860
atcgcttggc ctcctcaata ggatctcggt tctggccgta cagacctcgg ccgacaatta 4920
tgatatccgt tccggtagac atgacatcct caacagttcg gtactgctgt ccgagagcgt 4980
ctcccttgtc gtcaagaccc accccggggg tcagaataag ccagtcctca gagtcgccct 5040
taggtcggtt ctgggcaatg aagccaacca caaactcggg gtcggatcgg gcaagctcaa 5100
tggtctgctt ggagtactcg ccagtggcca gagagccctt gcaagacagc tcggccagca 5160
tgagcagacc tctggccagc ttctcgttgg gagaggggac taggaactcc ttgtactggg 5220
agttctcgta gtcagagacg tcctccttct tctgttcaga gacagtttcc tcggcaccag 5280
ctcgcaggcc agcaatgatt ccggttccgg gtacaccgtg ggcgttggtg atatcggacc 5340
actcggcgat tcggtgacac cggtactggt gcttgacagt gttgccaata tctgcgaact 5400
ttctgtcctc gaacaggaag aaaccgtgct taagagcaag ttccttgagg gggagcacag 5460
tgccggcgta ggtgaagtcg tcaatgatgt cgatatgggt tttgatcatg cacacataag 5520
gtccgacctt atcggcaagc tcaatgagct ccttggtggt ggtaacatcc agagaagcac 5580
acaggttggt tttcttggct gccacgagct tgagcactcg agcggcaaag gcggacttgt 5640
ggacgttagc tcgagcttcg taggagggca ttttggtggt gaagaggaga ctgaaataaa 5700
tttagtctgc agaacttttt atcggaacct tatctggggc agtgaagtat atgttatggt 5760
aatagttacg agttagttga acttatagat agactggact atacggctat cggtccaaat 5820
tagaaagaac gtcaatggct ctctgggcgt cgcctttgcc gacaaaaatg tgatcatgat 5880
gaaagccagc aatgacgttg cagctgatat tgttgtcggc caaccgcgcc gaaaacgcag 5940
ctgtcagacc cacagcctcc aacgaagaat gtatcgtcaa agtgatccaa gcacactcat 6000
agttggagtc gtactccaaa ggcggcaatg acgagtcaga cagatactcg tcgacctttt 6060
ccttgggaac caccaccgtc agcccttctg actcacgtat tgtagccacc gacacaggca 6120
acagtccgtg gatagcagaa tatgtcttgt cggtccattt ctcaccaact ttaggcgtca 6180
agtgaatgtt gcagaagaag tatgtgcctt cattgagaat cggtgttgct gatttcaata 6240
aagtcttgag atcagtttgg ccagtcatgt tgtggggggt aattggattg agttatcgcc 6300
tacagtctgt acaggtatac tcgctgccca ctttatactt tttgattccg ctgcacttga 6360
agcaatgtcg tttaccaaaa gtgagaatgc tccacagaac acaccccagg gtatggttga 6420
gcaaaaaata aacactccga tacggggaat cgaaccccgg tctccacggt tctcaagaag 6480
tattcttgat gagagcgtat cgatggttaa tgctgctgtg tgctgtgtgt gtgtgttgtt 6540
tggcgctcat tgttgcgtta tgcagcgtac accacaatat tggaagctta ttagcctttc 6600
tattttttcg tttgcaaggc ttaacaacat tgctgtggag agggatgggg atatggaggc 6660
cgctggaggg agtcggagag gcgttttgga gcggcttggc ctggcgccca gctcgcgaaa 6720
cgcacctagg accctttggc acgccgaaat gtgccacttt tcagtctagt aacgccttac 6780
ctacgtcatt ccatgcgtgc atgtttgcgc cttttttccc ttgcccttga tcgccacaca 6840
gtacagtgca ctgtacagtg gaggttttgg gggggtctta gatgggagct aaaagcggcc 6900
tagcggtaca ctagtgggat tgtatggagt ggcatggagc ctaggtggag cctgacagga 6960
cgcacgaccg gctagcccgt gacagacgat gggtggctcc tgttgtccac cgcgtacaaa 7020
tgtttgggcc aaagtcttgt cagccttgct tgcgaaccta attcccaatt ttgtcacttc 7080
gcacccccat tgatcgagcc ctaacccctg cccatcaggc aatccaatta agctcgcatt 7140
gtctgccttg tttagtttgg ctcctgcccg tttcggcgtc cacttgcaca aacacaaaca 7200
agcattatat ataaggctcg tctctccctc ccaaccacac tcactttttt gcccgtcttc 7260
ccttgctaac acaaaagtca agaacacaaa caaccacccc aaccccctta cacacaagac 7320
atatctacag caatggccat ggccaaaagc aaacgacggt cggaggctgt ggaagagcac 7380
gtgaccggct cggacgaggg cttgaccgat acttcgggtc acgtgagccc tgccgccaag 7440
aagcagaaga actcggagat tcatttcacc acccaggctg cccagcagtt ggatcgggag 7500
cgcaaggagg agtatctgga ctcgctgatc gacaacaagg actatctcaa gtaccgtcct 7560
cgaggctgga agctcaacaa cccgcctacc gaccgacctg tgcgaatcta cgccgatgga 7620
gtgtttgatt tgttccatct gggacacatg cgtcagctgg agcagtccaa gaaggccttc 7680
cccaacgcag tgttgattgt gggcattccc agcgacaagg agacccacaa gcggaaggga 7740
ttgaccgtgc tgagtgacgt ccagcggtac gagacggtgc gacactgcaa gtgggtggac 7800
gaggtggtgg aggatgctcc ctggtgtgtc accatggact ttctggaaaa acacaaaatc 7860
gactacgtgg cccatgacga tctgccctac gcttccggca acgacgatga tatctacaag 7920
cccatcaagg agaagggcat gtttctggcc acccagcgaa ccgagggcat ttccacctcg 7980
gacatcatca ccaagattat ccgagactac gacaagtatt taatgcgaaa ctttgcccgg 8040
ggtgctaacc gaaaggatct caacgtctcg tggctcaaga agaacgagct ggacttcaag 8100
cgtcatgtgg ccgagttccg aaactcgttc aagcgaaaga aggtcggtaa ggatctctac 8160
ggcgagattc gcggtctgct gcagaatgtg ctcatttgga acggcgacaa ctccggcact 8220
tccactcccc agcgaaagac gctgcagacc aacgccaaga agatgtacat gaacgtgctc 8280
aagactctgc aggctcctga cgctgttgac gtggactcct cggagaacgt gtctgagaac 8340
gtcactgatg aggaggagga agacgacgac gaggttgatg aggacgaaga agccgacgac 8400
gacgacgaag acgacgaaga cgaggaagac gacgagtagg cggccgcatt gatgattgga 8460
aacacacaca tgggttatat ctaggtgaga gttagttgga cagttatata ttaaatcagc 8520
tatgccaacg gtaacttcat tcatgtcaac gaggaaccag tgactgcaag taatatagaa 8580
tttgaccacc ttgccattct cttgcactcc tttactatat ctcatttatt tcttatatac 8640
aaatcacttc ttcttcccag catcgagctc ggaaacctca tgagcaataa catcgtggat 8700
ctcgtcaata gagggctttt tggactcctt gctgttggcc accttgtcct tgctgtttaa 8760
acacgcagta ggatgtcctg cacgggtctt tttgtggggt gtggagaaag gggtgcttgg 8820
agatggaagc cggtagaacc gggctgcttg tgcttggaga tggaagccgg tagaaccggg 8880
ctgcttgggg ggatttgggg ccgctgggct ccaaagaggg gtaggcattt cgttggggtt 8940
acgtaattgc ggcatttggg tcctgcgcgc atgtcccatt ggtcagaatt agtccggata 9000
ggagacttat cagccaatca cagcgccgga tccacctgta ggttgggttg ggtgggagca 9060
cccctccaca gagtagagtc aaacagcagc agcaacatga tagttggggg tgtgcgtgtt 9120
aaaggaaaaa aaagaagctt gggttatatt cccgctctat ttagaggttg cgggatagac 9180
gccgacggag ggcaatggcg ctatggaacc ttgcggatat ccatacgccg cggcggactg 9240
cgtccgaacc agctccagca gcgttttttc cgggccattg agccgactgc gaccccgcca 9300
acgtgtcttg gcccacgcac tcatgtcatg ttggtgttgg gaggccactt tttaagtagc 9360
acaaggcacc tagctcgcag caaggtgtcc gaaccaaaga agcggctgca gtggtgcaaa 9420
cggggcggaa acggcgggaa aaagccacgg gggcacgaat tgaggcacgc cctcgaattt 9480
gagacgagtc acggccccat tcgcccgcgc aatggctcgc caacgcccgg tcttttgcac 9540
cacatcaggt taccccaagc caaacctttg tgttaaaaag cttaacatat tataccgaac 9600
gtaggtttgg gcgggcttgc tccgtctgtc caaggcaaca tttatataag ggtctgcatc 9660
gccggctcaa ttgaatcttt tttcttcttc tcttctctat attcattctt gaattaaaca 9720
cacatcaaca tggccatcaa agtcggtatt aacggattcg ggcgaatcgg acgaattgtg 9780
agtaccatag aaggtgatgg aaacatgacc caacagaaac agatgacaag tgtcatcgac 9840
ccaccagagc ccaattgagc tcatactaac agtcgacaac ctgtcgaacc aattgatgac 9900
tccccgacaa tgtactaaca caggtcctgc ccatggtgaa aaacgtggac caagtggatc 9960
tctcgcaggt cgacaccatt gcctccggcc gagatgtcaa ctacaaggtc aagtacacct 10020
ccggcgttaa gatgagccag ggcgcctacg acgacaaggg ccgccacatt tccgagcagc 10080
ccttcacctg ggccaactgg caccagcaca tcaactggct caacttcatt ctggtgattg 10140
cgctgcctct gtcgtccttt gctgccgctc ccttcgtctc cttcaactgg aagaccgccg 10200
cgtttgctgt cggctattac atgtgcaccg gtctcggtat caccgccggc taccaccgaa 10260
tgtgggccca tcgagcctac aaggccgctc tgcccgttcg aatcatcctt gctctgtttg 10320
gaggaggagc tgtcgagggc tccatccgat ggtgggcctc gtctcaccga gtccaccacc 10380
gatggaccga ctccaacaag gacccttacg acgcccgaaa gggattctgg ttctcccact 10440
ttggctggat gctgcttgtg cccaacccca agaacaaggg ccgaactgac atttctgacc 10500
tcaacaacga ctgggttgtc cgactccagc acaagtacta cgtttacgtt ctcgtcttca 10560
tggccattgt tctgcccacc ctcgtctgtg gctttggctg gggcgactgg aagggaggtc 10620
ttgtctacgc cggtatcatg cgatacacct ttgtgcagca ggtgactttc tgtgtcaact 10680
cccttgccca ctggattgga gagcagccct tcgacgaccg acgaactccc cgagaccacg 10740
ctcttaccgc cctggtcacc tttggagagg gctaccacaa cttccaccac gagttcccct 10800
cggactaccg aaacgccctc atctggtacc agtacgaccc caccaagtgg ctcatctgga 10860
ccctcaagca ggttggtctc gcctgggacc tccagacctt ctcccagaac gccatcgagc 10920
agggtctcgt gcagcagcga cagaagaagc tggacaagtg gcgaaacaac ctcaactggg 10980
gtatccccat tgagcagctg cctgtcattg agtttgagga gttccaagag caggccaaga 11040
cccgagatct ggttctcatt tctggcattg tccacgacgt gtctgccttt gtcgagcacc 11100
accctggtgg aaaggccctc attatgagcg ccgtcggcaa ggacggtacc gctgtcttca 11160
acggaggtgt ctaccgacac tccaacgctg gccacaacct gcttgccacc atgcgagttt 11220
cggtcattcg aggcggcatg gaggttgagg tgtggaagac tgcccagaac gaaaagaagg 11280
accagaacat tgtctccgat gagagtggaa accgaatcca ccgagctggt ctccaggcca 11340
cccgggtcga gaaccccggt atgtctggca tggctgctta ggcggccgca tgagaagata 11400
aatatataaa tacattgaga tattaaatgc gctagattag agagcctcat actgctcgga 11460
gagaagccaa gacgagtact caaaggggat tacaccatcc atatccacag acacaagctg 11520
gggaaaggtt ctatatacac tttccggaat accgtagttt ccgatgttat caatgggggc 11580
agccaggatt tcaggcactt cggtgtctcg gggtgaaatg gcgttcttgg cctccatcaa 11640
gtcgtaccat gtcttcattt gcctgtcaaa gtaaaacaga agcagatgaa gaatgaactt 11700
gaagtgaagg aatttaaata gttggagcaa gggagaaatg tagagtgtga aagactcact 11760
atggtccggg cttatctcga ccaatagcca aagtctggag tttctgagag aaaaaggcaa 11820
gatacgtatg taacaaagcg acgcatggta caataatacc ggaggcatgt atcatagaga 11880
gttagtggtt cgatgatggc actggtgcct ggtatgactt tatacggctg actacatatt 11940
tgtcctcaga catacaatta cagtcaagca cttacccttg gacatctgta ggtacccccc 12000
ggccaagacg atctcagcgt gtcgtatgtc ggattggcgt agctccctcg ctcgtcaatt 12060
ggctcccatc tactttcttc tgcttggcta cacccagcat gtctgctatg gctcgttttc 12120
gtgccttatc tatcctccca gtattaccaa ctctaaatga catgatgtga ttgggtctac 12180
actttcatat cagagataag gagtagcaca gttgcataaa aagcccaact ctaatcagct 12240
tcttcctttc ttgtaattag tacaaaggtg attagcgaaa tctggaagct tagttggccc 12300
taaaaaaatc aaaaaaagca aaaaacgaaa aacgaaaaac cacagttttg agaacaggga 12360
ggtaacgaag gatcgtatat atatatatat atatatatac ccacggatcc cgagaccggc 12420
ctttgattct tccctacaac caaccattct caccacccta attcacaacc atggaggtcg 12480
tgaacgaaat cgtctccatt ggccaggagg ttcttcccaa ggtcgactat gctcagctct 12540
ggtctgatgc ctcgcactgc gaggtgctgt acctctccat cgccttcgtc atcctgaagt 12600
tcacccttgg tcctctcgga cccaagggtc agtctcgaat gaagtttgtg ttcaccaact 12660
acaacctgct catgtccatc tactcgctgg gctccttcct ctctatggcc tacgccatgt 12720
acaccattgg tgtcatgtcc gacaactgcg agaaggcttt cgacaacaat gtcttccgaa 12780
tcaccactca gctgttctac ctcagcaagt tcctcgagta cattgactcc ttctatctgc 12840
ccctcatggg caagcctctg acctggttgc agttctttca ccatctcgga gctcctatgg 12900
acatgtggct gttctacaac taccgaaacg aagccgtttg gatctttgtg ctgctcaacg 12960
gcttcattca ctggatcatg tacggctact attggacccg actgatcaag ctcaagttcc 13020
ctatgcccaa gtccctgatt acttctatgc agatcattca gttcaacgtt ggcttctaca 13080
tcgtctggaa gtaccggaac attccctgct accgacaaga tggaatgaga atgtttggct 13140
ggtttttcaa ctacttctac gttggtactg tcctgtgtct gttcctcaac ttctacgtgc 13200
agacctacat cgtccgaaag cacaagggag ccaaaaagat tcagtgagcg gccgcaagtg 13260
tggatgggga agtgagtgcc cggttctgtg tgcacaattg gcaatccaag atggatggat 13320
tcaacacagg gatatagcga gctacgtggt ggtgcgagga tatagcaacg gatatttatg 13380
tttgacactt gagaatgtac gatacaagca ctgtccaagt acaatactaa acatactgta 13440
catactcata ctcgtacccg gcaacggttt cacttgagtg cagtggctag tgctcttact 13500
cgtacagtgt gcaatactgc gtatcatagt ctttgatgta tatcgtattc attcatgtta 13560
gttgc 13565
<210> 3
<211> 777
<212> DNA
<213> 小眼虫（Euglena gracilis）
<220>
<221> CDS
<222> (1)..(777)
<223> 突变△9延伸酶“EgD9eS-L35G”
<400> 3
atg gag gtc gtg aac gaa atc gtc tcc att ggc cag gag gtt ctt ccc 48
Met Glu Val Val Asn Glu Ile Val Ser Ile Gly Gln Glu Val Leu Pro
1 5 10 15
aag gtc gac tat gct cag ctc tgg tct gat gcc tcg cac tgc gag gtg 96
Lys Val Asp Tyr Ala Gln Leu Trp Ser Asp Ala Ser His Cys Glu Val
20 25 30
ctg tac ggg tcc atc gcc ttc gtc atc ctg aag ttc acc ctt ggt cct 144
Leu Tyr Gly Ser Ile Ala Phe Val Ile Leu Lys Phe Thr Leu Gly Pro
35 40 45
ctc gga ccc aag ggt cag tct cga atg aag ttt gtg ttc acc aac tac 192
Leu Gly Pro Lys Gly Gln Ser Arg Met Lys Phe Val Phe Thr Asn Tyr
50 55 60
aac ctg ctc atg tcc atc tac tcg ctg ggc tcc ttc ctc tct atg gcc 240
Asn Leu Leu Met Ser Ile Tyr Ser Leu Gly Ser Phe Leu Ser Met Ala
65 70 75 80
tac gcc atg tac acc att ggt gtc atg tcc gac aac tgc gag aag gct 288
Tyr Ala Met Tyr Thr Ile Gly Val Met Ser Asp Asn Cys Glu Lys Ala
85 90 95
ttc gac aac aat gtc ttc cga atc acc act cag ctg ttc tac ctc agc 336
Phe Asp Asn Asn Val Phe Arg Ile Thr Thr Gln Leu Phe Tyr Leu Ser
100 105 110
aag ttc ctc gag tac att gac tcc ttc tat ctg ccc ctc atg ggc aag 384
Lys Phe Leu Glu Tyr Ile Asp Ser Phe Tyr Leu Pro Leu Met Gly Lys
115 120 125
cct ctg acc tgg ttg cag ttc ttt cac cat ctc gga gct cct atg gac 432
Pro Leu Thr Trp Leu Gln Phe Phe His His Leu Gly Ala Pro Met Asp
130 135 140
atg tgg ctg ttc tac aac tac cga aac gaa gcc gtt tgg atc ttt gtg 480
Met Trp Leu Phe Tyr Asn Tyr Arg Asn Glu Ala Val Trp Ile Phe Val
145 150 155 160
ctg ctc aac ggc ttc att cac tgg atc atg tac ggc tac tat tgg acc 528
Leu Leu Asn Gly Phe Ile His Trp Ile Met Tyr Gly Tyr Tyr Trp Thr
165 170 175
cga ctg atc aag ctc aag ttc cct atg ccc aag tcc ctg att act tct 576
Arg Leu Ile Lys Leu Lys Phe Pro Met Pro Lys Ser Leu Ile Thr Ser
180 185 190
atg cag atc att cag ttc aac gtt ggc ttc tac atc gtc tgg aag tac 624
Met Gln Ile Ile Gln Phe Asn Val Gly Phe Tyr Ile Val Trp Lys Tyr
195 200 205
cgg aac att ccc tgc tac cga caa gat gga atg aga atg ttt ggc tgg 672
Arg Asn Ile Pro Cys Tyr Arg Gln Asp Gly Met Arg Met Phe Gly Trp
210 215 220
ttt ttc aac tac ttc tac gtt ggt act gtc ctg tgt ctg ttc ctc aac 720
Phe Phe Asn Tyr Phe Tyr Val Gly Thr Val Leu Cys Leu Phe Leu Asn
225 230 235 240
ttc tac gtg cag acc tac atc gtc cga aag cac aag gga gcc aaa aag 768
Phe Tyr Val Gln Thr Tyr Ile Val Arg Lys His Lys Gly Ala Lys Lys
245 250 255
att cag tga 777
Ile Gln
<210> 4
<211> 258
<212> PRT
<213> 小眼虫（Euglena gracilis）
<400> 4
Met Glu Val Val Asn Glu Ile Val Ser Ile Gly Gln Glu Val Leu Pro
1 5 10 15
Lys Val Asp Tyr Ala Gln Leu Trp Ser Asp Ala Ser His Cys Glu Val
20 25 30
Leu Tyr Gly Ser Ile Ala Phe Val Ile Leu Lys Phe Thr Leu Gly Pro
35 40 45
Leu Gly Pro Lys Gly Gln Ser Arg Met Lys Phe Val Phe Thr Asn Tyr
50 55 60
Asn Leu Leu Met Ser Ile Tyr Ser Leu Gly Ser Phe Leu Ser Met Ala
65 70 75 80
Tyr Ala Met Tyr Thr Ile Gly Val Met Ser Asp Asn Cys Glu Lys Ala
85 90 95
Phe Asp Asn Asn Val Phe Arg Ile Thr Thr Gln Leu Phe Tyr Leu Ser
100 105 110
Lys Phe Leu Glu Tyr Ile Asp Ser Phe Tyr Leu Pro Leu Met Gly Lys
115 120 125
Pro Leu Thr Trp Leu Gln Phe Phe His His Leu Gly Ala Pro Met Asp
130 135 140
Met Trp Leu Phe Tyr Asn Tyr Arg Asn Glu Ala Val Trp Ile Phe Val
145 150 155 160
Leu Leu Asn Gly Phe Ile His Trp Ile Met Tyr Gly Tyr Tyr Trp Thr
165 170 175
Arg Leu Ile Lys Leu Lys Phe Pro Met Pro Lys Ser Leu Ile Thr Ser
180 185 190
Met Gln Ile Ile Gln Phe Asn Val Gly Phe Tyr Ile Val Trp Lys Tyr
195 200 205
Arg Asn Ile Pro Cys Tyr Arg Gln Asp Gly Met Arg Met Phe Gly Trp
210 215 220
Phe Phe Asn Tyr Phe Tyr Val Gly Thr Val Leu Cys Leu Phe Leu Asn
225 230 235 240
Phe Tyr Val Gln Thr Tyr Ile Val Arg Lys His Lys Gly Ala Lys Lys
245 250 255
Ile Gln
<210> 5
<211> 1449
<212> DNA
<213> 解脂耶氏酵母（Yarrowia lipolytica）
<220>
<221> CDS
<222> (1)..(1449)
<223> △9去饱和酶；GenBank登录号XM_501496
<400> 5
atg gtg aaa aac gtg gac caa gtg gat ctc tcg cag gtc gac acc att 48
Met Val Lys Asn Val Asp Gln Val Asp Leu Ser Gln Val Asp Thr Ile
1 5 10 15
gcc tcc ggc cga gat gtc aac tac aag gtc aag tac acc tcc ggc gtt 96
Ala Ser Gly Arg Asp Val Asn Tyr Lys Val Lys Tyr Thr Ser Gly Val
20 25 30
aag atg agc cag ggc gcc tac gac gac aag ggc cgc cac att tcc gag 144
Lys Met Ser Gln Gly Ala Tyr Asp Asp Lys Gly Arg His Ile Ser Glu
35 40 45
cag ccc ttc acc tgg gcc aac tgg cac cag cac atc aac tgg ctc aac 192
Gln Pro Phe Thr Trp Ala Asn Trp His Gln His Ile Asn Trp Leu Asn
50 55 60
ttc att ctg gtg att gcg ctg cct ctg tcg tcc ttt gct gcc gct ccc 240
Phe Ile Leu Val Ile Ala Leu Pro Leu Ser Ser Phe Ala Ala Ala Pro
65 70 75 80
ttc gtc tcc ttc aac tgg aag acc gcc gcg ttt gct gtc ggc tat tac 288
Phe Val Ser Phe Asn Trp Lys Thr Ala Ala Phe Ala Val Gly Tyr Tyr
85 90 95
atg tgc acc ggt ctc ggt atc acc gcc ggc tac cac cga atg tgg gcc 336
Met Cys Thr Gly Leu Gly Ile Thr Ala Gly Tyr His Arg Met Trp Ala
100 105 110
cat cga gcc tac aag gcc gct ctg ccc gtt cga atc atc ctt gct ctg 384
His Arg Ala Tyr Lys Ala Ala Leu Pro Val Arg Ile Ile Leu Ala Leu
115 120 125
ttt gga gga gga gct gtc gag ggc tcc atc cga tgg tgg gcc tcg tct 432
Phe Gly Gly Gly Ala Val Glu Gly Ser Ile Arg Trp Trp Ala Ser Ser
130 135 140
cac cga gtc cac cac cga tgg acc gac tcc aac aag gac cct tac gac 480
His Arg Val His His Arg Trp Thr Asp Ser Asn Lys Asp Pro Tyr Asp
145 150 155 160
gcc cga aag gga ttc tgg ttc tcc cac ttt ggc tgg atg ctg ctt gtg 528
Ala Arg Lys Gly Phe Trp Phe Ser His Phe Gly Trp Met Leu Leu Val
165 170 175
ccc aac ccc aag aac aag ggc cga act gac att tct gac ctc aac aac 576
Pro Asn Pro Lys Asn Lys Gly Arg Thr Asp Ile Ser Asp Leu Asn Asn
180 185 190
gac tgg gtt gtc cga ctc cag cac aag tac tac gtt tac gtt ctc gtc 624
Asp Trp Val Val Arg Leu Gln His Lys Tyr Tyr Val Tyr Val Leu Val
195 200 205
ttc atg gcc att gtt ctg ccc acc ctc gtc tgt ggc ttt ggc tgg ggc 672
Phe Met Ala Ile Val Leu Pro Thr Leu Val Cys Gly Phe Gly Trp Gly
210 215 220
gac tgg aag gga ggt ctt gtc tac gcc ggt atc atg cga tac acc ttt 720
Asp Trp Lys Gly Gly Leu Val Tyr Ala Gly Ile Met Arg Tyr Thr Phe
225 230 235 240
gtg cag cag gtg act ttc tgt gtc aac tcc ctt gcc cac tgg att gga 768
Val Gln Gln Val Thr Phe Cys Val Asn Ser Leu Ala His Trp Ile Gly
245 250 255
gag cag ccc ttc gac gac cga cga act ccc cga gac cac gct ctt acc 816
Glu Gln Pro Phe Asp Asp Arg Arg Thr Pro Arg Asp His Ala Leu Thr
260 265 270
gcc ctg gtc acc ttt gga gag ggc tac cac aac ttc cac cac gag ttc 864
Ala Leu Val Thr Phe Gly Glu Gly Tyr His Asn Phe His His Glu Phe
275 280 285
ccc tcg gac tac cga aac gcc ctc atc tgg tac cag tac gac ccc acc 912
Pro Ser Asp Tyr Arg Asn Ala Leu Ile Trp Tyr Gln Tyr Asp Pro Thr
290 295 300
aag tgg ctc atc tgg acc ctc aag cag gtt ggt ctc gcc tgg gac ctc 960
Lys Trp Leu Ile Trp Thr Leu Lys Gln Val Gly Leu Ala Trp Asp Leu
305 310 315 320
cag acc ttc tcc cag aac gcc atc gag cag ggt ctc gtg cag cag cga 1008
Gln Thr Phe Ser Gln Asn Ala Ile Glu Gln Gly Leu Val Gln Gln Arg
325 330 335
cag aag aag ctg gac aag tgg cga aac aac ctc aac tgg ggt atc ccc 1056
Gln Lys Lys Leu Asp Lys Trp Arg Asn Asn Leu Asn Trp Gly Ile Pro
340 345 350
att gag cag ctg cct gtc att gag ttt gag gag ttc caa gag cag gcc 1104
Ile Glu Gln Leu Pro Val Ile Glu Phe Glu Glu Phe Gln Glu Gln Ala
355 360 365
aag acc cga gat ctg gtt ctc att tct ggc att gtc cac gac gtg tct 1152
Lys Thr Arg Asp Leu Val Leu Ile Ser Gly Ile Val His Asp Val Ser
370 375 380
gcc ttt gtc gag cac cac cct ggt gga aag gcc ctc att atg agc gcc 1200
Ala Phe Val Glu His His Pro Gly Gly Lys Ala Leu Ile Met Ser Ala
385 390 395 400
gtc ggc aag gac ggt acc gct gtc ttc aac gga ggt gtc tac cga cac 1248
Val Gly Lys Asp Gly Thr Ala Val Phe Asn Gly Gly Val Tyr Arg His
405 410 415
tcc aac gct ggc cac aac ctg ctt gcc acc atg cga gtt tcg gtc att 1296
Ser Asn Ala Gly His Asn Leu Leu Ala Thr Met Arg Val Ser Val Ile
420 425 430
cga ggc ggc atg gag gtt gag gtg tgg aag act gcc cag aac gaa aag 1344
Arg Gly Gly Met Glu Val Glu Val Trp Lys Thr Ala Gln Asn Glu Lys
435 440 445
aag gac cag aac att gtc tcc gat gag agt gga aac cga atc cac cga 1392
Lys Asp Gln Asn Ile Val Ser Asp Glu Ser Gly Asn Arg Ile His Arg
450 455 460
gct ggt ctc cag gcc acc cgg gtc gag aac ccc ggt atg tct ggc atg 1440
Ala Gly Leu Gln Ala Thr Arg Val Glu Asn Pro Gly Met Ser Gly Met
465 470 475 480
gct gct tag 1449
Ala Ala
<210> 6
<211> 482
<212> PRT
<213> 解脂耶氏酵母（Yarrowia lipolytica）
<400> 6
Met Val Lys Asn Val Asp Gln Val Asp Leu Ser Gln Val Asp Thr Ile
1 5 10 15
Ala Ser Gly Arg Asp Val Asn Tyr Lys Val Lys Tyr Thr Ser Gly Val
20 25 30
Lys Met Ser Gln Gly Ala Tyr Asp Asp Lys Gly Arg His Ile Ser Glu
35 40 45
Gln Pro Phe Thr Trp Ala Asn Trp His Gln His Ile Asn Trp Leu Asn
50 55 60
Phe Ile Leu Val Ile Ala Leu Pro Leu Ser Ser Phe Ala Ala Ala Pro
65 70 75 80
Phe Val Ser Phe Asn Trp Lys Thr Ala Ala Phe Ala Val Gly Tyr Tyr
85 90 95
Met Cys Thr Gly Leu Gly Ile Thr Ala Gly Tyr His Arg Met Trp Ala
100 105 110
His Arg Ala Tyr Lys Ala Ala Leu Pro Val Arg Ile Ile Leu Ala Leu
115 120 125
Phe Gly Gly Gly Ala Val Glu Gly Ser Ile Arg Trp Trp Ala Ser Ser
130 135 140
His Arg Val His His Arg Trp Thr Asp Ser Asn Lys Asp Pro Tyr Asp
145 150 155 160
Ala Arg Lys Gly Phe Trp Phe Ser His Phe Gly Trp Met Leu Leu Val
165 170 175
Pro Asn Pro Lys Asn Lys Gly Arg Thr Asp Ile Ser Asp Leu Asn Asn
180 185 190
Asp Trp Val Val Arg Leu Gln His Lys Tyr Tyr Val Tyr Val Leu Val
195 200 205
Phe Met Ala Ile Val Leu Pro Thr Leu Val Cys Gly Phe Gly Trp Gly
210 215 220
Asp Trp Lys Gly Gly Leu Val Tyr Ala Gly Ile Met Arg Tyr Thr Phe
225 230 235 240
Val Gln Gln Val Thr Phe Cys Val Asn Ser Leu Ala His Trp Ile Gly
245 250 255
Glu Gln Pro Phe Asp Asp Arg Arg Thr Pro Arg Asp His Ala Leu Thr
260 265 270
Ala Leu Val Thr Phe Gly Glu Gly Tyr His Asn Phe His His Glu Phe
275 280 285
Pro Ser Asp Tyr Arg Asn Ala Leu Ile Trp Tyr Gln Tyr Asp Pro Thr
290 295 300
Lys Trp Leu Ile Trp Thr Leu Lys Gln Val Gly Leu Ala Trp Asp Leu
305 310 315 320
Gln Thr Phe Ser Gln Asn Ala Ile Glu Gln Gly Leu Val Gln Gln Arg
325 330 335
Gln Lys Lys Leu Asp Lys Trp Arg Asn Asn Leu Asn Trp Gly Ile Pro
340 345 350
Ile Glu Gln Leu Pro Val Ile Glu Phe Glu Glu Phe Gln Glu Gln Ala
355 360 365
Lys Thr Arg Asp Leu Val Leu Ile Ser Gly Ile Val His Asp Val Ser
370 375 380
Ala Phe Val Glu His His Pro Gly Gly Lys Ala Leu Ile Met Ser Ala
385 390 395 400
Val Gly Lys Asp Gly Thr Ala Val Phe Asn Gly Gly Val Tyr Arg His
405 410 415
Ser Asn Ala Gly His Asn Leu Leu Ala Thr Met Arg Val Ser Val Ile
420 425 430
Arg Gly Gly Met Glu Val Glu Val Trp Lys Thr Ala Gln Asn Glu Lys
435 440 445
Lys Asp Gln Asn Ile Val Ser Asp Glu Ser Gly Asn Arg Ile His Arg
450 455 460
Ala Gly Leu Gln Ala Thr Arg Val Glu Asn Pro Gly Met Ser Gly Met
465 470 475 480
Ala Ala
<210> 7
<211> 1101
<212> DNA
<213> 解脂耶氏酵母（Yarrowia lipolytica）
<220>
<221> CDS
<222> (1)..(1101)
<223> 磷酸胆碱胞苷酰转移酶；GenBank登录号
XM_502978
<400> 7
atg gcc aaa agc aaa cga cgg tcg gag gct gtg gaa gag cac gtg acc 48
Met Ala Lys Ser Lys Arg Arg Ser Glu Ala Val Glu Glu His Val Thr
1 5 10 15
ggc tcg gac gag ggc ttg acc gat act tcg ggt cac gtg agc cct gcc 96
Gly Ser Asp Glu Gly Leu Thr Asp Thr Ser Gly His Val Ser Pro Ala
20 25 30
gcc aag aag cag aag aac tcg gag att cat ttc acc acc cag gct gcc 144
Ala Lys Lys Gln Lys Asn Ser Glu Ile His Phe Thr Thr Gln Ala Ala
35 40 45
cag cag ttg gat cgg gag cgc aag gag gag tat ctg gac tcg ctg atc 192
Gln Gln Leu Asp Arg Glu Arg Lys Glu Glu Tyr Leu Asp Ser Leu Ile
50 55 60
gac aac aag gac tat ctc aag tac cgt cct cga ggc tgg aag ctc aac 240
Asp Asn Lys Asp Tyr Leu Lys Tyr Arg Pro Arg Gly Trp Lys Leu Asn
65 70 75 80
aac ccg cct acc gac cga cct gtg cga atc tac gcc gat gga gtg ttt 288
Asn Pro Pro Thr Asp Arg Pro Val Arg Ile Tyr Ala Asp Gly Val Phe
85 90 95
gat ttg ttc cat ctg gga cac atg cgt cag ctg gag cag tcc aag aag 336
Asp Leu Phe His Leu Gly His Met Arg Gln Leu Glu Gln Ser Lys Lys
100 105 110
gcc ttc ccc aac gca gtg ttg att gtg ggc att ccc agc gac aag gag 384
Ala Phe Pro Asn Ala Val Leu Ile Val Gly Ile Pro Ser Asp Lys Glu
115 120 125
acc cac aag cgg aag gga ttg acc gtg ctg agt gac gtc cag cgg tac 432
Thr His Lys Arg Lys Gly Leu Thr Val Leu Ser Asp Val Gln Arg Tyr
130 135 140
gag acg gtg cga cac tgc aag tgg gtg gac gag gtg gtg gag gat gct 480
Glu Thr Val Arg His Cys Lys Trp Val Asp Glu Val Val Glu Asp Ala
145 150 155 160
ccc tgg tgt gtc acc atg gac ttt ctg gaa aaa cac aaa atc gac tac 528
Pro Trp Cys Val Thr Met Asp Phe Leu Glu Lys His Lys Ile Asp Tyr
165 170 175
gtg gcc cat gac gat ctg ccc tac gct tcc ggc aac gac gat gat atc 576
Val Ala His Asp Asp Leu Pro Tyr Ala Ser Gly Asn Asp Asp Asp Ile
180 185 190
tac aag ccc atc aag gag aag ggc atg ttt ctg gcc acc cag cga acc 624
Tyr Lys Pro Ile Lys Glu Lys Gly Met Phe Leu Ala Thr Gln Arg Thr
195 200 205
gag ggc att tcc acc tcg gac atc atc acc aag att atc cga gac tac 672
Glu Gly Ile Ser Thr Ser Asp Ile Ile Thr Lys Ile Ile Arg Asp Tyr
210 215 220
gac aag tat tta atg cga aac ttt gcc cgg ggt gct aac cga aag gat 720
Asp Lys Tyr Leu Met Arg Asn Phe Ala Arg Gly Ala Asn Arg Lys Asp
225 230 235 240
ctc aac gtc tcg tgg ctc aag aag aac gag ctg gac ttc aag cgt cat 768
Leu Asn Val Ser Trp Leu Lys Lys Asn Glu Leu Asp Phe Lys Arg His
245 250 255
gtg gcc gag ttc cga aac tcg ttc aag cga aag aag gtc ggt aag gat 816
Val Ala Glu Phe Arg Asn Ser Phe Lys Arg Lys Lys Val Gly Lys Asp
260 265 270
ctc tac ggc gag att cgc ggt ctg ctg cag aat gtg ctc att tgg aac 864
Leu Tyr Gly Glu Ile Arg Gly Leu Leu Gln Asn Val Leu Ile Trp Asn
275 280 285
ggc gac aac tcc ggc act tcc act ccc cag cga aag acg ctg cag acc 912
Gly Asp Asn Ser Gly Thr Ser Thr Pro Gln Arg Lys Thr Leu Gln Thr
290 295 300
aac gcc aag aag atg tac atg aac gtg ctc aag act ctg cag gct cct 960
Asn Ala Lys Lys Met Tyr Met Asn Val Leu Lys Thr Leu Gln Ala Pro
305 310 315 320
gac gct gtt gac gtg gac tcc tcg gag aac gtg tct gag aac gtc act 1008
Asp Ala Val Asp Val Asp Ser Ser Glu Asn Val Ser Glu Asn Val Thr
325 330 335
gat gag gag gag gaa gac gac gac gag gtt gat gag gac gaa gaa gcc 1056
Asp Glu Glu Glu Glu Asp Asp Asp Glu Val Asp Glu Asp Glu Glu Ala
340 345 350
gac gac gac gac gaa gac gac gaa gac gag gaa gac gac gag tag 1101
Asp Asp Asp Asp Glu Asp Asp Glu Asp Glu Glu Asp Asp Glu
355 360 365
<210> 8
<211> 366
<212> PRT
<213> 解脂耶氏酵母（Yarrowia lipolytica）
<400> 8
Met Ala Lys Ser Lys Arg Arg Ser Glu Ala Val Glu Glu His Val Thr
1 5 10 15
Gly Ser Asp Glu Gly Leu Thr Asp Thr Ser Gly His Val Ser Pro Ala
20 25 30
Ala Lys Lys Gln Lys Asn Ser Glu Ile His Phe Thr Thr Gln Ala Ala
35 40 45
Gln Gln Leu Asp Arg Glu Arg Lys Glu Glu Tyr Leu Asp Ser Leu Ile
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Asp Asn Lys Asp Tyr Leu Lys Tyr Arg Pro Arg Gly Trp Lys Leu Asn
65 70 75 80
Asn Pro Pro Thr Asp Arg Pro Val Arg Ile Tyr Ala Asp Gly Val Phe
85 90 95
Asp Leu Phe His Leu Gly His Met Arg Gln Leu Glu Gln Ser Lys Lys
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Ala Phe Pro Asn Ala Val Leu Ile Val Gly Ile Pro Ser Asp Lys Glu
115 120 125
Thr His Lys Arg Lys Gly Leu Thr Val Leu Ser Asp Val Gln Arg Tyr
130 135 140
Glu Thr Val Arg His Cys Lys Trp Val Asp Glu Val Val Glu Asp Ala
145 150 155 160
Pro Trp Cys Val Thr Met Asp Phe Leu Glu Lys His Lys Ile Asp Tyr
165 170 175
Val Ala His Asp Asp Leu Pro Tyr Ala Ser Gly Asn Asp Asp Asp Ile
180 185 190
Tyr Lys Pro Ile Lys Glu Lys Gly Met Phe Leu Ala Thr Gln Arg Thr
195 200 205
Glu Gly Ile Ser Thr Ser Asp Ile Ile Thr Lys Ile Ile Arg Asp Tyr
210 215 220
Asp Lys Tyr Leu Met Arg Asn Phe Ala Arg Gly Ala Asn Arg Lys Asp
225 230 235 240
Leu Asn Val Ser Trp Leu Lys Lys Asn Glu Leu Asp Phe Lys Arg His
245 250 255
Val Ala Glu Phe Arg Asn Ser Phe Lys Arg Lys Lys Val Gly Lys Asp
260 265 270
Leu Tyr Gly Glu Ile Arg Gly Leu Leu Gln Asn Val Leu Ile Trp Asn
275 280 285
Gly Asp Asn Ser Gly Thr Ser Thr Pro Gln Arg Lys Thr Leu Gln Thr
290 295 300
Asn Ala Lys Lys Met Tyr Met Asn Val Leu Lys Thr Leu Gln Ala Pro
305 310 315 320
Asp Ala Val Asp Val Asp Ser Ser Glu Asn Val Ser Glu Asn Val Thr
325 330 335
Asp Glu Glu Glu Glu Asp Asp Asp Glu Val Asp Glu Asp Glu Glu Ala
340 345 350
Asp Asp Asp Asp Glu Asp Asp Glu Asp Glu Glu Asp Asp Glu
355 360 365

Claims (15)

1.方法，包括：
(a)粒化具有在1至10重量％的范围内的水分含量并包含含油微生物的微生物生物质，其中所述含油微生物包含至少一种在所述油中的多不饱和脂肪酸，并且其中粒化所述微生物生物质包括：
(1)将所述微生物生物质和至少一种能够吸收油的研磨剂混合以提供破碎的生物质混合物，所述破碎的生物质混合物包含破碎的微生物生物质；
(2)将所述破碎的生物质混合物与至少一种粘合剂共混以提供能够形成固体粒料的可固化混合物；以及
(3)使所述可固化混合物形成固体粒料以提供粒状微生物生物质；
其中所述破碎的微生物生物质在双螺杆挤出机中产生，所述双螺杆挤出机包括：
(A)0.04至0.4KW/(kg/hr)的总比能量输入(SEI)；
(B)使用具有逐渐缩短的节线长度的轴衬元件的压实区；和
(C)使用流量限制的压缩区；
其中在所述挤出机内，所述压实区在所述压缩区之前；
(b)提取步骤(a)的粒状微生物生物质以产生提取油，其中所述提取油包含甾醇级份；以及
(c)在短程蒸馏条件下蒸馏步骤(b)的提取油至少一次，其中所述蒸馏产生馏出液级份和含脂质级份；所述馏出液级份包含所述甾醇，所述含脂质级份在与尚未经受短程蒸馏的提取油中甾醇量进行比较时包含减少的甾醇量，并且其中所述蒸馏步骤包括使提取的微生物油在不超过30mTorr的真空水平和220至300℃下通过短程蒸馏至少一次。
2.根据权利要求1所述的方法，其中所述含油微生物选自藻类、真菌、细菌、类眼虫和原生藻菌。
3.根据权利要求1所述的方法，其中所述含油微生物选自酵母和卵菌。
4.根据权利要求1所述的方法，其中：
(a)所述至少一种研磨剂具有选自下列的特性：
(i)所述至少一种研磨剂为具有2.0至6.0的莫氏硬度和根据ASTM方法D1483-60测定的0.8或更高的吸油系数的颗粒；
(ii)所述至少一种研磨剂选自二氧化硅和硅酸盐；并且
(iii)所述至少一种研磨剂以所述固体粒料中的微生物生物质、研磨剂和粘合剂的总重量计1至20重量％存在；和/或
(b)所述至少一种粘合剂具有选自下列的特性：
(iv)所述至少一种粘合剂选自水和碳水化合物，所述碳水化合物选自蔗糖、乳糖、果糖、葡萄糖和可溶性淀粉；并且
(v)所述至少一种粘合剂以所述固体粒料中的微生物生物质、研磨剂和粘合剂的总重量计0.5至10重量％存在。
5.根据权利要求1所述的方法，其中：
(a)步骤(1)和(2)同时进行；并且
(b)步骤(3)包括选自下列的步骤：
(i)通过模具挤出所述可固化混合物以形成股线；
(ii)使所述股线干燥并破裂；以及
(iii)将步骤(i)和步骤(ii)组合。
6.根据权利要求1所述的方法，其中：
(a)所述固体粒料具有0.5至1.5mm的平均直径和2.0至8.0mm的平均长度；
(b)所述固体粒料具有0.1至5.0重量％的水分含量；或
(c)所述固体粒料包含以所述固体粒料中的微生物生物质、研磨剂和粘合剂的总重量计70至98.5重量％的包含含油微生物的微生物生物质，1至20重量％的至少一种能够吸收油的研磨剂和0.5至10重量％的至少一种粘合剂。
7.根据权利要求1所述的方法，其中用有机溶剂进行步骤(b)的所述提取以产生提取油，并且所述提取油在步骤(c)的所述蒸馏之前被脱胶和任选地漂白。
8.根据权利要求1所述的方法，其中步骤(b)的所述提取包括：
(1)用溶剂处理所述粒状微生物生物质，所述溶剂包括液体或超临界流体二氧化碳，从而获取：
(i)包含基本上不含磷脂的脂质级份的提取物；和
(ii)包含磷脂的残余生物质；以及
(2)分馏步骤(1)中获取的提取物至少一次以获取具有精制的脂质组合物的提取油，所述脂质组合物包含至少一种多不饱和脂肪酸，其中所述精制的脂质组合物相对于未用溶剂处理的粒状微生物生物质的油组合物富含三酰基甘油。
9.根据权利要求1所述的方法，其中所述甾醇级份包含一种或多种甾醇，所述甾醇选自：豆甾醇、麦角固醇、芸苔甾醇、菜油甾醇、β-谷甾醇和链甾醇。
10.根据权利要求8所述的方法，其中所述具有精制的脂质组合物的提取油还包含至少300mg/100g的甾醇级份，所述脂质组合物包含至少一种多不饱和脂肪酸并且相对于未用溶剂处理的粒状微生物生物质的油组合物富含三酰基甘油。
11.根据权利要求2或3所述的方法，其中所述含油微生物是耶氏酵母(Yarrowia)。
12.根据权利要求11所述的方法，其中所述耶氏酵母经重组工程化以产生多不饱和脂肪酸，所述多不饱和脂肪酸选自：亚油酸、γ-亚麻酸、二十碳二烯酸、二高-γ-亚麻酸、花生四烯酸、二十二碳四烯酸、ω-6二十二碳五烯酸、α-亚麻酸、十八碳四烯酸、二十碳三烯酸、二十碳四烯酸、二十碳五烯酸、ω-3二十二碳五烯酸和二十二碳六烯酸。
13.根据权利要求1所述的方法，还包括：
(d)对步骤(c)的含脂质级份进行酯交换，从而提供经酯交换的含脂质级份；以及
(e)对步骤(d)的经酯交换的含脂质级份进行富集以获取油浓缩物。
14.根据权利要求13所述的方法，其中：
(i)所述含油微生物积累微生物油超过其干细胞重量25％；并且
(ii)所述微生物油包含按总脂肪酸的重量％计30至70重量％的二十碳五烯酸且基本上不含二十二碳六烯酸；并且
(iii)步骤(e)的富集通过至少第一和第二方法的组合进行，所述第一方法包括分馏并且所述第二方法选自：尿素加合物形成、液相色谱、超临界流体色谱、模拟移动床色谱、实际移动床色谱、以及它们的组合；并且
(iv)所述油浓缩物是包含按油的重量％计至少70重量％的二十碳五烯酸且基本上不含二十二碳六烯酸的二十碳五烯酸浓缩物。
15.根据权利要求8所述的方法，其中进一步提取所述包含磷脂的残余生物质以分离所述磷脂。
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