KR20140007430A - 에이코사펜타엔산 농축물 - Google Patents

에이코사펜타엔산 농축물 Download PDF

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KR20140007430A
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슈-치엔 리앙
로버트 디. 올랜디
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이 아이 듀폰 디 네모아 앤드 캄파니
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Abstract

오일의 중량 퍼센트로 측정하여, 적어도 70 중량 퍼센트의 에이코사펜타엔산을 포함하고, 도코사헥사엔산은 실질적으로 없는 오메가-3 오일 농축물로 ["EPA"; 시스-5, 8, 11, 14, 17-에이코사펜타엔산; 오메가-3], 상기 농축물은 총 지방산의 중량 퍼센트로 측정하여, 30 내지 70중량 퍼센트의 에이코사펜타엔산을 갖고, 도코사헥사엔산은 실질적으로 없는 미생물 오일로부터 수득되고, 여기에서 상기 미생물 오일은 25% 초과의 건조 세포를 오일로서 축적하는 미생물로부터 수득된다. 이러한 에이코사펜타엔산 농축물의 제조방법도 개시된다.

Description

에이코사펜타엔산 농축물{AN EICOSAPENTAENOIC ACID CONCENTRATE}
본 출원은 2011년 2월 11일 출원된 미국 가출원 제 61/441,854호, 및 2011년 5월 17일 출원된 미국 가출원 제 61/487,019호의 이익을 주장하며, 이들은 그 전체로서 본 명세서에 참고문헌으로서 통합된다.
본 발명은 장쇄 다중불포화 지방산 시스-5, 8, 11, 14, 17-에이코사펜타엔산 ["EPA"]을 포함하는 오메가-3 오일 농축물에 관한 것으로, 더욱 구체적으로는, 오일의 퍼센트(percent)로서 측정되어, 적어도 70 중량 퍼센트의 EPA를 포함하고, 시스-4, 7, 10, 13, 16, 19-도코사헥사엔산 ["DHA"]은 실질적으로 없는 EPA 농축물에 관한 것이다.
알파-리놀렌산 ["ALA"] (18:3), 스테아리돈산 ["STA"] (18:4), 에이코사테트라엔산 ["ETrA"] (20:3), 에이코사트라이엔산 ["ETA"] (20:4), 에이코사펜타엔산 ["EPA"] (20:5), 도코사펜타엔산 ["DPA"] (22:5) 및 도코사헥사엔산 ["DHA"] (22:6)과 같은 오메가-3 지방산을 이용한 식사 보충물로부터 유래되는 건강상의 장점들은, 많은 임상적 연구 및 기타 간행된 공공 문서 및 특허 문서에 의하여 잘 인식 및 뒷받침된다. 예로서, 오메가-3 지방산은 심혈관 질환, 특히 경증 고혈압, 고중성지방 혈증에 대한 위험 인자 및 응고 인자 VII 인지질 복합 활성에 유리한 효과를 갖는 것으로 알려져 있다.
에이코사펜타엔산 ["EPA"; 시스-5, 8, 11, 14, 17-에이코사펜타엔산; 오메가-3]과 관련하여, 이 특정 지방산의 임상적 및 제약학적 가치는 잘 확립되어 있다 (미국 특허 출원 공개 번호 제 2009-0093543-A1호 및 제 2010-0317072-A1호). EPA는 생물학적으로 활성인 프로스타글란딘의 생합성에서 중요한 중간체이다. 추가적으로, EPA의 하기 약물학적 작용이 알려져 있다: 1) 혈소판 응고 저해 작용 (혈전용해 작용); 2) 혈액 중성 지방-저하 작용; 3) 혈액 극저밀도 지단백질 ["VLDL"]-콜레스테롤 및 저밀도 지단백질 ["LDL"]-콜레스테롤 저하 작용 및 혈액 고밀도 지단백질 ["HDL"]-콜레스테롤 (항-동맥 경화 작용) 상승 작용; 4) 혈액 점도-저하 작용; 5) 혈압 저하 작용; 6) 소염 작용; 및 7) 항-종양 작용. 이와 같이, EPA는 혈액 콜레스테롤 및 트라이글리세라이드를 저하시키는 자연적인 시도를 제공한다.
EPA 섭취의 증가는 관상동맥 심장질환, 고혈압, 염증성 장애 (예로서, 류마티스 관절염), 폐 및 신장 질환, II형 당뇨병, 비만, 궤양성 대장염, 크론병(Crohn's disease), 신경성 식욕 감퇴증, 화상, 골관절염, 골다공증, 집중력 결핍/과잉행동 장애, 및 대장암 초기 단계에 유리한 또는 긍정적인 효과를 갖는 것으로 나타난다. 예로서, McColl, J., NutraCos, 2(4):35-40 (2003), 및 Sinclair, A., 등, Healthful Lipids, C. C. Akoh 및 O.-M. Lai, Eds, AOCS: Champaign, IL, 2005, Chapter 16의 리뷰 참조. 최근의 발견들 또한 정신 장애, 예컨대 정신분열증의 치료에서 EPA의 이용을 확인시켜주었다 (미국특허 제 6,331,568호 및 미국특허 제 6,624,195호). 그 결과, EPA는 기능성 식품 (영양기능식품(nutraceuticals)), 의약 식품, 유아 영양제, 벌크(bulk) 영양제, 화장품 및 동물 건강에 관련된 제품에 사용된다.
오메가-3 지방산 영역에서의 많은 연구에도 불구하고, 많은 과거의 연구는 개별적인 장쇄 오메가-3 지방산 (예로서, EPA 및 DHA)이 대사적 및 기능적으로 서로 상이하며,이에 따라 각각 특이적인 생리학적 기능 및 생물학적 활성을 가질 수 있다는 것을 인지하지 못하여 왔다.
이러한 기계론적인 명확성의 결여는, 주로 임상 연구에서 순수한 EPA 또는 순수한 DHA를 사용하지 않고, 오메가-3 지방산의 변화가많은 혼합물을 포함하는 어유(fish oil)를 이용한 결과이다 [멘헤이든(menhaden), 대구 간, 정어리 및 앤초비(anchovies)로부터의 오일의 지방산 조성은, 예로서 EPA:DHA 비율 약 0.9:1 내지 1.6:1을 갖는 오일을 포함한다 (The Lipid Handbook, 2nd ed.; F.D. Gunstone, J.L. Harwood and F.B. Padley, Eds; Chapman and Hall, 1994에서 설명된 데이터에 근거함)]. 추가적으로, 어유는 상당량의 콜레스테롤도 포함하는데, 이에 따라 어유의 매일 소비는 콜레스테롤 섭취를 증가시킬 수 있어서 혈액 지질 수준의 임의의 감소를 방해할 수 있다.
상표명 OMACOR®하에 판매되고, 현재 LOVAZA™ [미국특허 제 5,502,077호, 미국특허 제 5,656,667호 및 미국특허 제 5,698,594호] (Pronova Biocare A.S., Lysaker, Norway)로서 알려진, DHA와 EPA의 에틸 에스테르의 조합인 약학 조성물이 있다. 각 캡슐은 약 430 mg/g - 495 mg/g EPA 및 347 mg/g - 403 mg/g DHA를 포함하며, 90% (중량/중량) ["중량 대 중량"] 총 오메가-3 지방산을 갖는다.
오메가-3 지방산은 높은 투여량에서 현저한 트라이글리세라이드 저하 성능을 갖는 것으로 알려져 있다. 공복 트라이글리세라이드가 500 mg/dl이 넘는 환자에서 트라이글리세라이드 저하를 위하여, 하루 당 오메가-3 에틸 에스테르의 농축 조제물 4 캡슐이 미국 식품의약국에 의해 승인되어 있다. 이들 1g 캡슐 각각은 465 mg의 EPA 및 375 mg의 DHA를 포함하여, 4 캡슐 내에, 1,860 mg의 EPA 및 1,500 mg의 DHA인, 총 1일 투여량을 포함한다. 이러한 투여량의 이 조제물은, 일 당 40 mg의 심바스타틴에 대하여 트라이글리세라이드 수준이 200 내지 500 mg/dl 사이인 실험대상에서, 위약에 비하여 트라이글리세라이드 수준을 29.5%까지 감소시키고, HDL 콜레스테롤은 3.4%로 증가시키는 것으로 보고되었다(이들 둘 모두 p<0.05) (Davidson, M.H. 등, Clin. Ther., 29:1354-1367 (2007)). 심지어는 더욱 큰 트라이글리세라이드 감소가, 500 mg/dl가 넘는 트라이글리세라이드 수준을 갖는 실험대상들에서 관찰되었다. 약 1200 mg/일 투여량의 DHA가 트라이글리세라이드 수준을 약 25%까지 현저히 저하시킬 것이라는 것도 증명되었다 (Davidson, M.H. 등, J. Am. Coll. Nutr., 16(3):236-243 (1997); Berson, E.L. 등, Arch. Opthalmol., 122:1297-1305 (2004)).
LOVAZA™ 및 순수한 EPA 모두 트라이글리세라이드를 저하시키는 것으로 나타났으나, LOVAZA™는 증가된 LDL-콜레스테롤이라는 바람직하지 않은 결과와 관련된 한편, 순수한 EPA를 이용한 보충은 이러한 효과를 초래하지 않는다. 이러한 차이는 LOVAZA™에서 DHA의 존재로 인한 것일 수 있다고 여겨진다. 결과적으로, EPA를 단독 이용하여 심혈관에 대한 이득이 달성될 수 있으며, EPA를 포함하고, DHA는 실질적으로 없는 오메가-3 치료가 바람직하다.
몇몇 연구들은 실질적으로 순수한 EPA를 이용하고, 별도로 실질적으로 순수한 DHA를 이용하여 수행되어, 각각의 개별적인 지방산의 약리학적 효과를 구분할 수 있도록 하였다. 한가지 예외는 일본 EPA 지방 간섭 연구["JELIS"]로, 이는 >98% 정제된 EPA-에틸 에스테르 [EPA-EE"] (Mochida Pharmaceutical, Ltd.)를 스타틴과 조합하여 사용하는 거대-규모 랜덤화 제어된 시도를 포함하였다 (Yokoyama, M. and H. Origasa, Amer. Heart J., 146:613-620 (2003); Yokoyama, M. 등, Lancet, 369:1090-1098 (2007)). EPA에 더하여 스타틴을 수령받는 환자에서의 심혈관성 문제들은 스타틴만을 단독으로 수령받는 환자들에 비하여 19%까지 감소된다는는 것이 발견되었다. 이는 EPA, 그 자체가, 심혈관보호성이라는 것에 대한 강한 뒷받침을 제공하는 것으로; DHA를 이용한 유사한 연구들은 보고된 바 없다.
몇몇 인용문헌들은 각종 제약학적 목적을 위하여 고도로 정제된 EPA 조성물들의 이용을 기재한다. 예를 들면, i) 영국 특허 출원 제 1,604,554호(1981년 12월 9일 공개)는 혈전-색전성 증상의 치료에서 EPA의 이용을 기재하고 있으며, 여기에서 지방산 조성물의 적어도 50중량%는 EPA이어야만 하고; ii) 미국 특허 출원 공개 번호 제 2008-0200547호는 적어도 90% EPA 및 바람직하게는 95% EPA, 및 5% 미만, 더욱 바람직하게는 3% 미만의 DHA 형태를 포함하는 약학 제제를 개시하고 있으며; iii) 미국 특허 제7,498,359호 (Mochida Pharmaceutical, Ltd.)는, 3-히드록실-3-메틸글루타릴 조효소 A ["HMG-CoA"] 리덕타제 억제제와 병용하여 투여시, 뇌졸중의 재발 감소에 유용한 고순도 EPA-EE [일본에서 상표명 Epadel® 및 Epadel® S로 판매됨]의 투여를 기재하고 있으며; iv) 국제 특허 공개 번호 제 WO 2010/093634 A1호 (2010년 8월 19일 공개)는 고중성지방 혈증의 치료를 위한 EPA-EE의 이용을 기재하고 있으며; v) 국제 출원 공개 번호 제 WO 2010/147994 A1호 (2010. 12.23일 공개)은 스타틴 치료시 적어도 96중량%를 포함하는 초순수 EPA를 투여함에 의한, 실험대상에서 트라이글리세라이드의 저하 방법을 기재하고 있고; 그리고, vi) 미국 특허 공개번호 제 2011-0178105-A1호는 인간에서 ＥＰＡ의 투여에 의하여， 지단백질-관련 포스포리파제 A2 ["Lp-PLA2"] 수준을 유지 또는 저하시키고, 파열 경향-죽상판경화증성 병변을 안정화시키고， 염증지수를 감소시키고，총오메가-3 점수™ 이 증가된다는 것을 기재하고 있다.
EPA 및 기타 장쇄 다중불포화 지방산은 매우 유사한 물성들을 갖기 때문에 (예로서, 유사 증기압, 용해도 및 흡수 특성), EPA의 고순도로의 분리 및 정제는 복잡하다. 각종 천연 공급원으로부터의 지방산 혼합물의 EPA 함량을 풍부화(enriching)하는 각종 방법들이 알려져 있다 (예로서, 저온 결정화, 우레아 부가물 형성, 분별 증류, 고압 액체 크로마토그래피, 은 염 처리, 초임계 이산화탄소 ["CO2"] 크로마토그래피, 향류 컬럼을 이용한 초임계 CO2 분별화, 유사 이동층 크로마토그래피, 실질 이동층 크로마토그래피 등 및 이의 조합).
예로서, 몇몇 유형의 적조류와 녹조류 및 해양 규조류로부터 EPA를 풍부화하기 위한 다운스트림 가공 방법이 설명되어 왔으며, 하기 설명되는 바와 같다.
(i) Cohen 등 (J. Amer . Chem . Soc., 68(1):16-19 (1991))은 적색 미세조류인 포르피리듐 크루엔텀( Porphyridium cruentum )으로부터의 정제를 기재하고 있다.
(ii) Medina 등 (Biotechnology Advances, 16(3):517-580 (1998))은 다중불포화 지방산 ["PUFAs"], 예로서 EPA를 미세조류로부터 정제하는 방법의 검토를 제공한다.
(iii) 미국 특허 제4,615,839호는 해양 클로렐라의 추출 공정을 개시하고 있으며, 여기에서 결과의 지질 조성물은 용매 분별화에 의하여 중성 지방이 제거되고, 이에 의하여 극성 지질 조성물을 제공한다. 극성 지질 조성물은 가수분해 처리되어, 회복된 지방산을 유리시키며, 이에 따라 적어도 60중량%의 EPA를 갖는 지방산 조성물을 제공한다. 이러한 지방산 조성물의 우레아 처리는 EPA 함량을 93.0%로 풍부화시킨다. DHA 함량은 개시되지 않았다.
(iv) 미국 특허 출원 공개번호 제 2010/0069492호는 규조류인 니츠시아 래비스( Nitzschia laevis ), 의 효소 가수분해된 지질로부터 EPA 조성물의 회수를 기재하고 있으며, 이에 의하여 지방산 함량은 50~60% EPA, 5.5% 미만의 아라키돈산 ["ARA", 오메가-6] 및 DHA는 실질적으로 없는 것으로 구성된다. 예시되지는 않았지만, EPA가 95% 내지 99%, 1%의 ARA 및 0.1% 미만의 DHA로 더욱 정제될 수 있음이 제안되었다.
유사하게, 다양한 참고문헌들은 어유 (또는 어유로부터 수득된 지방산 에틸 에스테르의 혼합물)로부터의 EPA 정제를 설명하고 있다. 예를 들면,
(i) Beebe 등(J. Chromatography , 459:369-378 (1988))은 오메가-3 PUFA 에스테르의 제조 규모(preparative scale)의 고성능 액체 크로마토그래피 ["HPLC"]를 기재한다.
(ii) 미국 특허 제 4,377,526호는 에틸 에스테르의 에스테르 교환반응에 이어, 우레아 처리 및 분별 증류를 기재한다. 결과의 생성물은 92.9%의 EPA 및 2.0%의 DHA를 포함하는 것으로 보고되었다.
(iii) 미국 특허 제 5,215,630호는 적어도 3개의 증류 컬럼의 시스템을 이용하는, 저압에서의 분별 증류를 개시한다. 생성물은 C2 0 ["C20"]의 사슬 길이를 갖는, 99.9%의 지방산으로 구성되었으며, 여기에 C20 분획물의 88%는 EPA였다. C20 분획물의 우레아 처리는 EPA 함량을 93%로 증가시켰다.
(iv) 미국특허 제 5,719,302호는, 지방산 에틸 에스테르 혼합물을 (1) 고정층 크로마토그래피 또는 (2) 초임계 압에서 용매가 유체인 다단계 향류 컬럼 분획화 중 어느 하나에 의하여 처리하고, 적어도 하나의 PUFA-풍부화 분획물을 회수하는, 단계 (a)를 포함하는 정제 공정을 개시한다. 이 공정은 처리 단계에서 회수된 분획물을 유사 연속 향류 이동층 크로마토그래피에 의하여 더욱 분획화하고, 정제된 PUFA 또는 PUFA 혼합물을 포함하는 적어도 하나의 분획물을 회수하는, 단계 (b)도 포함한다. 88%의 EPA 및 0.8%의 DHA, 및 >93%의 EPA (DHA 함량은 개시되 않았음)를 갖는 분획물이 수득되었다.
(v) 미국 특허 제 5,840,944호는 고압 하에서의 정밀 증류로 99.9%의 C20을 포함하는 에스테르의 농축 혼합물로, 그의 82.77%는 EPA인 혼합물을 생산하는 것을 개시한다. EPA 풍부화된 혼합물의, 고속 액체 크로마토그래피로의 투입은 99.5%의 EPA (DHA는 구체적으로 보고되지 않았으며, 총 산, >C20은 0.30%였다)를 갖는 오일을 산출하였다.
(vi) 일본 미심사 출원 공개 평성9- 310089호 (JP1997310089)는 다중 추출 컬럼을 이용한 초임계 CO2 추출에 의한 어유 에틸 에스테르의 정제를 개시한다. 90.8%의 EPA 및 0.35%의 DHA를 포함하는 생성물이 41.1%의 EPA 및 17.3%의 DHA를 포함하는 지방산 에스테르 출발 혼합물로부터 수득되었다.
(vii) 일본 미심사 특허 공개 평성9-302380호 (JP1997302380)는 3개 컬럼 증류에 의하여 어유 유래의 지방산 에스테르들을 분획화하여, 82% EPA를 갖는 주 분획물을 생성하는 것을 개시한다. 주 분획물은 은 염(silver salt) 처리에 의하여 더욱 정제되어 98.5% EPA-EE가 수득되었다.
(viii) 국제 출원 공개 번호 제 WO 01/36369 A1호는 50%의 EPA-EE 함량 및 최대 함량 1.2%의 아라키돈산을 갖는 지방산 에스테르의 혼합물로부터 출발하여, 초임계 CO2를 이동상으로서 이용하는 컬럼 크로마토그래피에 의하여, 적어도 95% 순도의 EPA-EE를 제조하는 방법을 개시한다.
(ix) 국제 특허 공개 번호 제 WO 2011/080503 A2호는 공급(feed) 혼합물로부터 PUFA 생성물을 회수하기 위한 크로마토그래피 분리 공정을 개시하고 있으며, 이는, 용리액으로서 수성 알코올을 함유한 다수의 연결된 크로마토그래피 컬럼을 갖는 유사 또는 실질 이동층 크로마토그래피 장치에 공급 혼합물을 도입하는 것을 포함하고, 여기에서 장치는 적어도 제 1 영역 및 제 2 영역을 포함하는 다수의 영역을 가지며, 각 영역은, 그로부터 액체가 상기 다수의 연결된 크로마토그래피 컬럼들로부터 모일 수 있는 추출 스트림 및 라피네이트 스트림을 갖고, 여기에서 (a) PUFA 생성물을 더욱 극성인 성분들과 함께 포함하는 라피네이트 스트림은 제 1 영역의 컬럼으로부터 수집되고, 제 2 영역 내의 비인접 컬럼으로 도입 및/또는 (b) PUFA 생성물을 덜 극성인 성분들 함께 포함하는 추출 스트림은 제 2 영역의 컬럼으로부터 수집되고, 제 1 영역 내의 비인접 컬럼에 도입되며, 상기 PUFA 생성물은 각 영역에서 공급 혼합물의 다른 성분들로부터 분리된다. 각종 어유 유래의 공급 원료는 정제되어 85 내지 98% 초과의 EPA EE를 생산하였다. 국제 특허 출원 공개 번호 제 WO 2001/080503 A2호는 어유로부터 고순도로 EPA 및 DHA를 회수하는 공정을 예증하고 있지만, 그 개시 내용은 또한 분획화에 적당한 공급 혼합물은 "유전적으로 변경된 식물, 동물 및 효모를 포함한 미생물로부터 수득되는 오일을 포함한 합성 공급원"으로부터 수득될 수 있다고 언급하고 있다. 나아가, "원하는 PUFA 생성물의 EPA인 경우, 유전적으로 변경된 효모가 특히 적당하다".
마지막으로, 미국특허 제 5,189,189호는, 은 염 처리에 의해 60% EPA를 포함하는 지방산 혼합물의 풍부화를 개시하며, 그 결과로서 96.0% EPA를 포함하는 생성물을 개시하고 있다. 은 염 처리의 반복은 EPA 함량을 98.5%로 더욱 증가시켰다. 다른 구성 지방산의 동정이나 60% EPA 출발 화합물의 공급원 중 어떤 것도 개시되지 않았다.
천연 해양 공급원 (예로서, 물고기, 해조류)으로부터의 EPA 정제시 일어나는 한 고려사항은, 생체 축적의 결과로 인하여, 이들 생물 내에서 환경 오염물질이 비교적 높은 농도로 공존한다는 것이다. 이들 환경 오염물질은 독성 성분으로, 예컨대 폴리염화 바이페닐["PCB"] (CAS 번호 1336-36-3), 브롬화 난연제 , 살충제 (예로서, 톡사펜(toxaphene) 및 다이클로로다이페닐트라이클로로에탄 ["DDT"] 및 이의 대사산물), 및 잠재적으로 유해 및/독성인, 바다 환경에서 발견되는 기타 유기 화합물들이다. 미국특허 제 7,732,488호는 지방 또는 어유와 같은 오일을 포함하는 혼합물에서 환경 오염물질의 양을 감소시키는 방법을 개시한다.
그런, 오염물질에 대한 염려는 무시하여도, 천연 해양 공급원으로부터 EPA 정제의 환경적인 영향도 또한 전세계 물고기 남획의 견지에서 고려되어야만 한다. 현재, 수산양식을 위한 공급 조성물은, 지질 공급원으로서 어유의 전세계적 공급의 약 87%를 이용하는 것으로 추산된다. 일년 어유 생산은 년간 1.36 테라그램(teragram)(년간 1500만 톤)을 초과하여 증가되지 않았기 때문에, 산업체들은 - 수산양식 중 급속히 성장하는 것 포함 - 어유의 공급원으로서 해양 유영어 (pelagic fish)의 유한한 저장고에 계속 의존해 올 수 없다. 많은 기관들이, 어유 이용가능성 및 지속성과 관련하여 상기 나타낸 한계들을 인식하고 있으며, 그가 사용되는 제품 및 산업에서 성분의 중요한 장점들은 유지하는 한편, 어유 의존성은 감소시키는 대체 성분을 구하고 있다. 해양 공급원에 대하여, 지속가능한 공급원으로부터 인간 소비를 위한 EPA 농축물의 생산은 따라서, 환경에 긍정적인 영향을 미칠 수 있을 것이다.
EPA의 늘어가는 장점들 및 치료제로서의 수요 증가 면에서, EPA의 개선된 공급원 및 적절한 약학적 농도로 EPA를 풍부화시키는 제조 방법에 대한 필요가 존재한다. 바람직하게는, 인간 소비용으로 의도된 농축된 EPA 오일은 DHA 및 어떤 환경 오염물질도 실질적으로 갖지 않을 것이다.
제 1 실시양태에서, 본 발명은, 오일의 중량 퍼센트로 측정하여, 적어도 70 중량 퍼센트의 에이코사펜타엔산 ["EPA"]을 포함하고, 도코사펜타엔산 ["DHA"]은 실질적으로 없는 에이코사펜타엔산 농축물에 관한 것으로, 상기 농축물은 총 지방산의 중량 퍼센트로 측정하여 30 내지 70 중량 퍼센트의 에이코사펜타엔산을 포함하고, 도코사헥사엔산은 실질적으로 없는 미생물 오일로부터 수득되며, 여기에서 상기 미생물 오일은 그의 건조 세포 중량 중 25% 초과를 오일로서 축적하는 미생물로부터 수득된다.
제 2 실시양태에서, 미생물 오일은:
a) 총 지방산의 중량 퍼센트로 측정하여, 약 1 내지 25 중량 퍼센트의 리놀레산을 포함하고; 및
b) 총 지방산의 중량 퍼센트로 측정된 리놀레산에 대하여, 총 지방산의 중량 퍼센트로 측정하여, 적어도 1.2 의 에이코사펜타엔산 비를 갖는다.
제 3 실시양태에서, 미생물 오일은 에이코사펜타엔산의 생산을 위하여 조작된, 재조합 야로위아 세포들의 미생물 바이오매스로부터 수득된 것이다.
제 4 실시양태에서, 본 발명은 본 발명의 에이코사펜타엔산 농축물을 포함하는 약학 제품에 관한 것이다. 제 5 실시양태에서, 본 발명은, 오일의 중량 퍼센트로 측정하여, 적어도 70 중량 퍼센트의 에이코사펜타엔산을 포함하고, 도코사헥사엔산은 실질적으로 없는 에이코사펜타엔산 농축물의 제조방법에 관한 것으로, 상기 방법은:
a) 총 지방산의 중량 퍼센트로 측정하여, 30 내지 70 중량 퍼센트의 에이코사펜타엔산을 포함하고 DHA는 실질적으로 없는 미생물 오일을 에스테르 교환반응시키고, 여기에서 상기 미생물 오일은 그의 건조 세포 중량 중 25% 초과를 오일로서 축적하는 미생물로부터 수득한 것인 단계; 및
b) 단계 (a)의 에스테르 교환반응된 오일을 풍부화하여, 오일의 중량 퍼센트로 측정하여 적어도 70 중량 퍼센트의 에이코사펜타엔산을 포함하고, 도코사헥사엔산은 실질적으로 없는 에이코사펜타엔산 농축물을 수득하는 단계를 포함한다.
단계 (b)의 에스테르 교환반응된 오일은: 우레아 부가물 형성, 액체 크로마토그래피, 초임계 유체 크로마토그래피, 분별 증류, 유사 이동층 크로마토그래피, 실질 이동층 크로마토그래피 및 이들의 조합으로 이루어지는 군으로부터 선택된 공정에 의하여 풍부화될 수 있다.
제 6 실시양태에서, 본 발명의 방법은, 총 지방산의 중량 퍼센트로 측정된 리놀레산에 대하여, 총 지방산의 중량 퍼센트로 측정하여 적어도 1.2의 에이코사펜타엔산 비를 갖는 미생물 오일의 이용에 관한 것이다. 나아가, 미생물 오일은 에이코사펜타엔산의 생산을 위하여 조작된, 재조합 야로위아 세포들의 미생물 바이오매스로부터 수득된 미생물 오일이다.
제 7 실시양태에 있어서, 본 발명의 에이코사펜타엔산 농축물은 환경 오염물질이 실질적으로 없다.
제 8 실시양태에 있어서, 본 발명은 총 지방산의 중량 퍼센트로 측정하여, 30 내지 70 중량 퍼센트의 에이코사펜타엔산을 갖고, 도코사헥사엔산은 실질적으로 없는 미생물 오일의, 오일의 중량 퍼센트로 측정하여 적어도 70 중량 퍼센트의 에이코사펜타엔산을 포함하고, 도코사헥사엔산은 실질적으로 없는 에이코사펜타엔산 농축물 제조에서의 용도에 관한 것으로,
여기에서 상기 미생물 오일은 그의 건조 세포 중량의 약 25% 초과를 오일로서 축적하는 미생물로부터 수득된다.
제 9 실시양태에 있어서, 상기 실시양태 중 어느 하나에 있어서, 미생물 오일은 비농축된 것이다.
제 10 실시양태에 있어서, 상기 실시양태 중 어느 하나의 미생물 오일은 노나데카펜타엔산 및 헨에이코사펜타엔산으로 이루어지는 군으로부터 선택된 지방산은 실질적으로 없는 것이다.
제 11 실시양태에 있어서, 본 발명의 에이코사펜타엔산 농축물은 노나데카펜타엔산 및 헨에이코사펜타엔산으로 이루어지는 군으로부터 선택된 지방산은 실질적으로 없는 것이다.
생물학적 기탁
하기 생물학적 재료는 미국 균주보관소 (ATCC)(10801 University Boulevard, Manassas, VA 20110-2209 소재)에 기탁하였으며, 하기 명명, 수탁 번호 및 기탁일자를 갖는다.
Figure pct00001
상기 열거된 생물학적 재료는 특허 절차 상의 미생물 기탁의 국제적 승인에 관한 부다페스트 조약 하에 기탁되었다. 열거된 기탁물은 나타낸 국제 기탁소에서 적어도 30년 동안 유지될 것이며, 그를 개시하는 특허 승인에 따라 공개적으로 입수가능하게 될 것이다. 기탁물의 입수가능성은 정부 법령에 의해 허여된 특허권을 침해하는 방식으로 대상 발명을 실시할 허가를 구성하는 것은 아니다.
야로위아 리폴리티카 Y9502는 미국 특허 출원 공개 번호 제 2010-0317072-A1호에 설명된 방법론에 따라, Y. 리폴리티카 Y8412로부터 유도될 수 있다. 유사하게, 야로위아 리폴리티카 Y8672는, 미국 특허 출원 공개 번호 제 2010-0317072-A1호에 설명된 방법론에 따라, Y. 리폴리티카 Y8259로부터 유도되었다.
서열 목록 및 도면의 간단한 설명
<도 1>
도 1은 본 발명의 공정의 개요를 순서도 형식으로 제공한다. 구체적으로, 미생물 발효는 미처리된 미생물 바이오매스를 생산하며, 이는 선택적으로 기계적으로 가공될 수 있다. 미처리된 미생물 바이오매스의 오일 추출 결과 잔류 바이오매스 및 추출된 오일이 생성된다. 추출된 오일은 직접적으로 에스테르 교환반응되고 풍부화되어 오일의 중량%로 측정하여 적어도 70 중량 퍼센트 ["중량%"]의 EPA를 포함하고, DHA는 실질적으로 없는 EPA 농축물을 생산할 수 있거나; 또는, 추출된 용액은, 먼저: i) 탈검화, 정제, 표백, 탈취, 등을 통하여 정제되거나; 또는, ii) 짧은 경로 증류 (SPD)를 이용하여 증류될 수 있다.
<도 2>
도 2 는 야로위아 리폴리티카 ATCC #20362로부터 유래된 각종 야로위아 리폴리티카 균주의 개발을 도시한다.
<도 3>
도 3은 (a) pZKUM; 및 (b) pZKL3-9DP9N에 대한 플라스미드 맵을 제공한다.
하기의 서열들은 37 C.F.R. §1.821-1.825("뉴클레오티드 서열 및/또는 아미노산 서열 개시를 포함하는 특허출원에 관한 요건 - 서열 규정")를 따르며 세계지적재산권기구(World Intellectual Property Organization, WIPO) 표준 ST.25(1998), 및 EPO 및 PCT의 서열 목록 요건(규정 5.2 및 49.5(a-bis), 및 시행세칙의 섹션 208 및 부칙 C)에 부합한다. 뉴클레오티드 및 아미노산 서열 데이터에 사용된 기호 및 체제는 37 C.F.R. §1.822에 제시된 규정을 준수한다.
서열번호 1~8 은 유전자를 암호화하는 오픈 리딩 프레임(open reading frame), 단백질 (또는 이의 일부), 또는 플라스미드로, 이는 표 1에 나타낸 바와 같다.
Figure pct00002
[발명의 상세한 설명]
본 명세서에 개시된 모든 특허, 특허 출원서 및 공개문헌은 그들 전문이 본 명세서에 참고로서 통합된다.
하기의 정의가 제공된다.
"에이코사펜타엔산"은 "EPA"로 약칭된다.
"미국 균주 보관소(American Type Culture Collection)"는 "ATCC"로 약칭된다.
"다중불포화 지방산(들)"은 "PUFA(s)"로 약칭된다.
"트라이아실글리세롤"은 "TAG"로 약칭된다.
"전체 지방산"은 "TFA"로 약칭된다.
"지방산 메틸 에스테르"는 "FAME"로 약칭된다.
"에틸 에스테르"는 "EE"로 약칭된다.
"건조 세포 중량"은 "DCW"로 약칭된다.
"중량 퍼센트"는 "중량%"로 약칭된다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "발명" 또는 "본 발명"은 본 명세서의 특허청구범위 및 상세한 설명에 기재된 본 발명의 모든 측면 및 실시양태를 지칭하고자 하며, 임의의 특정 실시양태 또는 측면에 제한되는 것으로 해석되어서는 안된다.
본 명세서에서 사용된 바와 같은 "약제"는 미국 내에서 판매되는 경우, 연방 식품 의약 및 화장품 법령의 섹션 503 또는 505에 의해 통제되는 화합물 또는 물질을 의미한다.
"에이코사펜타엔산 농축물" 또는 "EPA 농축물"이라는 용어는, 오일 중량%로 측정하여, 적어도 70중량%의 EPA를 포함하고, DHA는 실질적으로 없는 오메가-3 오일을 지칭한다. 오일 농축물은, 총 지방산 중량%로 측정하여, 30 내지 70 중량%의 EPA를 포함하고, DHA는 실질적으로 없는 미생물 오일로부터 수득되며, 여기에서 상기 미생물 오일은 그의 건조 세포 중량 중 25% 초과를 오일로서 축적하는 미생물로부터 수득되며, 이는 하기에서 더욱 상세히 설명될 것이다. 적어도 70 중량%의 EPA는, 유리 지방산, 트라이글리세라이드 (예로서, TAG), 에스테르, 및 이들의 조합물 형태일 것이다. 에스테르는 가장 바람직하게는 에틸 에스테르 형태이다.
"미생물 바이오매스"라는 용어는 미생물 발효로부터의 미생물 세포 물질인, EPA를 포함하는 세포 물질을 지칭한다. 미생물 바이오매스는 전(whole) 세포, 전 세포 용해물, 균질화된 세포, 부분 가수분해된 세포 물질, 및/또는 부분적으로 정제된 세포 물질 (예로서, 미생물 생산된 오일)의 형태일 수 있다. 바람직한 실시양태에 있어서, 미생물 바이오매스는 상업적으로 유의한 양으로 EPA를 생산하는 생산 숙주, 예컨대 유지성 효모, 야로위아 리폴리티카의 재조합 조작된 균주의 발효로부터 사용된 또는 이용된 미생물 세포 물질을 지칭한다.
"미처리된 미생물 바이오매스"는 용매 추출 전의 미생물 바이오매스를 지칭한다. 선택적으로, 미처리된 미생물 바이오매스는 용매 추출 전에 기계 가공 (예로서, 바이오매스를 건조, 바이오매스를 분쇄, 또는 이들의 조합)에 투입될 수 있다.
본 명세서에서 사용된 바와 같은, "잔류 바이오매스"라는 용어는, 용매 (예로서, 무기 또는 유기 용매)로 적어도 한번 추출된, EPA를 포함하는 미생물 발효물로부터의 미생물 세포 물질을 지칭한다.
"오일"이라는 용어는 25℃에서 액체이고, 일반적으로 다중불포화인 지질 성분을 지칭한다. 유지성 생물에서, 오일은 총 지질의 주요한 부분을 구성하며, 일차적으로 트라이글리세롤 ["TAGs"]로 구성되지만, 기타 중성 지질, 인지질 및 유리 지방산도 포함할 수 있다. 이러한 오일 중 특정 지방산의 정제 또는 풍부화 후, 오일은 다양한 화학적 형태로 존재할 수 있다 (예로서, 트라이아실글리세롤, 알킬 에스테르, 염 또는 유리 지방산의 형태). 오일 중의 지방산 조성 및 전체 지질의 지방산 조성은 일반적으로 유사하며; 이에 따라, 전체 지질 중의 PUFA의 농도의 증가 또는 감소는 오일 중의 PUFA의 농도의 증가 또는 감소와 부합할 것이며, 그 역도 또한 그러하다.
"추출된 오일" 또는 "조생의 오일" (이 용어들은 본 명세서 내에서 서로 교환가능하게 사용될 수 있다)이라는 용어는, 그 오일이 합성된 생물과 같은, 다른 세포 물질로부터 분리된 오일을 지칭한다. 추출된 오일은 매우 다양한 방법을 통해 수득되며, 그 중 가장 간단한 것에는 단독의 물리적 수단이 포함된다. 예를 들어, 다양한 압착 구성(press configuration)(예컨대, 스크(screw), 익스펠러(expeller), 피스톤, 비드 비터(bead beaters) 등)을 사용한 기계적 분쇄(mechanical crushing)에 의해, 세포 물질로부터 오일을 분리할 수 있다. 다르게는, 오일 추출은 각종 유기 용매 (예로서, 헥산), 효소 추출, 삼투압 충격(osmotic shock), 초음파 추출, 초임계 유체 추출 (예로서, CO2 추출), 비누화 및 이들 방법의 조합을 이용한 처리를 통하여 일어날 수 있다. 추출된 오일의 추가 정제 또는 농축은 선택적이다.
"미생물 오일"이라는 용어는 일반 용어이며, 따라서 비농축된 미생물 오일 또는 농축된 미생물 오일 중 어느 하나를 지칭할 수 있으며, 이는 하기에서 더욱 상술되는 바와 같다.
"비농축된 미생물 오일"이라는 용어는 추출을 통하여 수득된 미생물 오일이 하나 이상의 지방산에 있어서 실질적으로 풍부화되지 않았음을 의미한다. 다시 말하면, 미생물의 세포 물질로부터 분리될 수 있는 "비농축된 미생물 오일"의 지방산 조성은 미생물에 의하여 생산되는 바와 같은 오일의 지방산 조성에 실질적으로 유사하다. 따라서, 본 명세서에서 이용된 비농축된 미생물 오일은 적어도 30 내지 70 EPA % TFA를 포함하며, 이는 이들 오일을 생산하는 미생물이 적어도 30 내지 70 EPA % TFA를 포함하는 지방산 조성을 갖기 때문이다. 비농축된 미생물 오일은 비농축된 추출 오일 또는 비농축된 정제 오일일 수 있다.
당업자가 이해하는 바와 같이, 미생물 오일이 본 발명의 EPA 농축물 제조에의 이용에 충분한 양의 EPA % TFA를 포함하도록, 30 미만의 EPA % TFA를 갖는 미생물 오일로 시작하여 그를 가공하는 것이 가능하다.
"정제 오일"이라는 용어는, 추출된 오일 중 불순물들의 농도에 비교하여, 인지질, 미량 금속, 유리 지방산, 안료 화합물, 소량의 산화 생성물, 휘발성 및/또는 향 화합물, 및 스테롤(예로서, 에르고스테롤, 브라시카스테롤, 스티그마스테롤, 콜레스테롤)과 같은 불순물들의 농도가 감소된 미생물 오일을 지칭한다. 정제 과정은, 특정 지방산(들)이 실질적으로 풍부화되도록, 미생물 오일을 농축 또는 풍부화하지 않는 것이 전형적이고, 이에 따라 정제된 오일은 매우 종종 비농축이다.
"증류"라는 용어는 비등 액체 혼합물 중 이들의 휘발성에서의 차이에 기초한 혼합물의 분리 방법을 지칭한다. 증류는 단위 공정 또는 물리적 분리 공정이다.
"짧은 경로 증류" ["SPD"]라는 용어는 극히 높은 진공 하에서 작동되는 분리 방법으로, 여기에서 SPD 장치는 증발기에 근접한 내부 응축기가 장착되어, 증류될 재료로부터의 휘발성 화합물들이 증발 후 응축 표면까지 단지 짧은 거리만을 이동하게 되는 방법을 지칭한다. 그 결과, 이 분리 방법으로부터는 열 분해가 최소로 일어난다.
"SPD-정제된 오일"이라는 용어는 하나 이상의 PUFA를 포함하는 트라아실글리세롤-분획물을 포함하는 미생물 오일을 지칭하며, 상기 오일은 SPD 조건 하에서 적어도 한번의 증류 공정을 거친 것이다. 증류 공정은, SPD 전의 오일 중 스테롤 함량에 비하여, SPD 정제된 오일 중 스테롤 양을 감소시킨다. SPD는 에틸 에스테르, 메틸 에스테르 및 유리 지방산은 농축시킬 수 있지만, 이 공정은 (예로서, TAG의 분해를 일으키는 극히 높은 온도에서 작동되지 않는다면) 전형적으로 TAG는 농축시키지 않는다. 추출된 오일 중 PUFA의 대부분은 TAG 형태이고, SPD 공정은 특정 지방산(들)이 실질적으로 풍부화되도록 하는 방식으로 전형적으로 TAG를 농축하지 않기 때문에, SPD-정제된 오일은 본 명세서에 기재된 목적을 위해서는 가장 빈번하게 비농축된 것으로 여겨진다.
"에스테르 교환반응"이라는 용어는, 산 또는 염기 촉매에 의하여 촉매화되는 화학 반응으로, 여기에서 지방산의 에스테르는 지방산의 상이한 에스테르로 전환되는 반응을 지칭한다.
"풍부화(enrichment)"라는 표현은, 비농축된 미생물 오일 중 하나 이상의 지방산의 농도에 비하여, 미생물 오일 중 하나 이상의 지방산의 농도를 증가시키는 공정을 지칭한다. 따라서, 본 명세서에서 논의된 바와 같이, TFA의 중량%로 측정하여30 내지 70 중량%의 EPA를 포함하는 미생물 오일은 풍부화 또는 농축되어, 오일의 중량%로 측정하여 적어도 70중량%의 EPA를 포함하는 EPA 농축물을 생성한다.
"지방산"이라는 용어는, 더 긴 사슬 길이 및 더 짧은 사슬 길이의 산들이 알려져 있지만, 약 C12 내지 C22 (또는 C12 내지 C22, 여기에서 숫자는 사슬 중 탄소 ["C"] 원자의 총 수를 지칭한다)의 다양한 사슬 길이의, 장쇄 지방족 산 (알카논산)을 지칭한다. 주요 사슬 길이는 C16 내지 C22이다. 지방산의 구조는 "X:Y"의 간단한 표기 체계로 표현되며, 여기서, X는 특정 지방산에서의 전체 탄소 원자["C"]의 개수이고, Y는 이중 결합의 갯수이다. "포화 지방산" 대 "불포화 지방산", "단일불포화 지방산" 대 "다중불포화 지방산"["PUFA"] 및 "오메가-6 지방산"["ω-6" 또는 "n-6"] 대 "오메가-3 지방산"["ω-3" 또는 "n-3"] 간의 구분에 관한 추가의 상세사항은 본 명세서에 참고로 포함되는 미국 특허 제7,238,482호에 제공되어 있다.
본 명세서에서 PUFA를 기재하는데 사용되는 명명법은 표 2에 제공되어 있다. "약칭 표기"라는 표제의 열에서, 오메가-참조 체계는 탄소의 갯수, 이중 결합의 갯수 및 오메가 탄소와 가장 가까운 이중 결합의 위치를 오메가 탄소(이러한 목적을 위해 1로 번호를 매김)로부터 계수하여, 표시하기 위해 사용된다. 표의 나머지는 오메가-3 및 오메가-6 지방산의 일반명 및 그들의 전구체, 본 명세서에서 사용될 약어 및 각 화합물의 화학명을 요약한 것이다.
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따라서, "에이코사펜타엔산" ["EPA"]이라는 용어는 시스-5, 8, 11, 14, 17-에이코사펜타엔산에 대한 일반명이다. 이 지방산은 20:5 오메가-3 지방산이다. 본 개시내용에 사용된 바와 같은, EPA라는 용어는, 특별히 달리 언급되지 않는다면, 산 또는 그 산의 유도체 (예로서, 글리세라이드, 에스테르, 인지질, 아미드, 락톤, 염 등)를 지칭한다. 예로서, "EPA-EE"는 구체적으로 EPA 에틸 에스테르를 지칭한다.
"도코사헥사엔산" ["DHA"]은 시스-4, 7, 10, 13, 16, 19-도코사헥사엔산에 대한 일반명이고; 이 지방산은 22:6 오메가-3 지방산이다. 본 명세서에서 사용된 바와 같은 DHA라는 용어는, 특별히 달리 언급되지 않는다면, 산 또는 그 산의 유도체 (예로서, 글리세라이드, 에스테르, 인지질, 아미드, 락톤, 염 등)를 지칭한다.
"노나데카펜타엔산" ["NDPA"]은 시스-5, 8, 11, 14, 17-노나데카펜타엔산의 일반명이고; 이 지방산은 19:5 오메가-2 지방산이다. "헨에이코사펜타엔산" ["HPA"] 는 시스-6, 9, 12, 15, 18-헨에이코사펜타엔산의 일반명이고; 이 지방산은 21:5 오메가-3 지방산이다. 이 두 지방산은 모두 어유에서 흔히 발견된다. 어유로부터 생산된 농축된 EPA는 최종 EPA 조성물 중 이들 지방산을 불순물들로서 종종 포함할 것이다 (예로서, 미국 특허 출원 공개 번호 제 2010-0278879호 및 국제 출원 공개 번호 제 WO 2010/147994 A1호 참조). 본 개시 내용에서 사용된 바와 같은 NDPA 및 HPA는 특별히 달리 언급되지 않는 한, 각각의 산 또는 그 산의 유도체를 지칭한다 (예로서, 글리세라이드, 에스테르, 인지질, 아미드, 락톤, 염 등).
용어 "지질" 임의의 지방-용해성(즉, 지방 친화성), 자연-발생 분자를 지칭한다. 지질에 대한 일반적인 개요는 미국 특허 출원 공개 번호 제 2009-0093543-A1호에 제공되어 있다(이 명세서의 표 2 참조).
용어 "트라이아실글리세롤"["TAG"]은 글리세롤 분자에 에스테르화된 3개의 지방 아실 잔기로 구성된 중성 지질을 지칭한다. TAG는 긴 사슬의 PUFA 및 포화 지방산뿐 아니라 보다 짧은 사슬의 포화 및 불포화 지방산을 포함할 수 있다. 살아있는 생물에서, TAG는 지방산에 대한 일차적인 저장 단위인데, 이는 글리세롤 골격이 저장 및 운송 동안 PUFA 분자를 안정화시키는 것을 돕기 때문이다. 대조적으로, 유리 지방산은 빠르게 산화된다.
"지방산 에틸 에스테르" ["FAEEs"]는, 에스테르화 또는 에스테르 교환반응 과정에서, 유리 지방산 또는 그의 유도체를 에탄올과 반응시킴으로써 일반적으로 합성적으로 유도되는 지질의 화학적 형태를 지칭한다.
본 명세서에서 "총 지방산" ["TFAs"]이라는 용어는, 예로서 미생물 바이오매스 또는 오일일 수 있는, 소정의 샘플에서, 기본 에스테르 교환반응 방법 (당 기술분야에서 알려진 바와 같음)에 의하여 지방산 메틸 에스테르 ["FAME"]로 유도체화될 수 있는 모든 세포성 지방산들의 합을 지칭한다. 이에 따라, TFA는 중성 지질 분획물(다이아실글리세롤, 모노아실글리세롤 및 TAG를 포함)로부터 및 극성 지질 분획물 (예로서, 포스파티딜콜린 및 포스파티딜에탄올아민 분획물 포함)로부터의 지방산은 포함하지만, 유리 지방산은 포함하지 않는다.
용어 세포의 "전체 지질 함량"은 건조 세포 중량["DCW"]의 퍼센트로서의 TFA의 측정치이지만, 전체 지질 함량은 DCW의 퍼센트로서의 FAME["FAME % DCW"]의 측정치로 근사치를 계산할 수 있다. 따라서, 전체 지질 함량["TFA % DCW"]은 예를 들어, 100 밀리그램의 DCW당 전체 지방산의 밀리그램과 등가이다.
전체 지질 중의 지방산의 농도는 본 명세서에서 TFA의 중량 퍼센트["% TFA"], 예컨대, 100 밀리그램의 TFA당 주어진 지방산의 밀리그램으로 표현된다. 이러한 측정 단위는 미생물 세포 및 미생물 오일 중, 예로서 EPA의 농도를 기재하는데 사용된다.
오일 중 지방산 에스테르 (및/또는 지방산 및/또는 트라이글리세라이드, 각각)의 농도는 오일의 중량 퍼센트 ["% 오일"], 예로서, 100 밀리그램의 오일 당 소정의 지방산 에스테르 (및/또는 지방산 및/또는 트라이글리세라이드, 각각)의 밀리그램으로 표현된다. 이러한 측정 단위는 EPA 농축물 중 EPA의 농도를 기재하는데 사용된다.
일부 경우에, 건조 세포 중량 중 그의 중량 퍼센트["% DCW"]로서 세포 중의 주어진 지방산(들)의 함량을 표현하는 것이 유용하다. 따라서, 예를 들어, EPA % DCW는 하기의 식에 따라 결정할 것이다: (EPA % TFA) * (TFA % DCW)]/100. 그러나, 세포 중의 주어진 지방산(들)의 함량은 건조 세포 중량 중 그의 중량 퍼센트["% DCW"]로서 하기의 식으로 근사치를 계산할 수 있다: (EPA % TFA) * (FAME % DCW)]/100.
용어 "지질 프로파일" 및 "지질 조성"은 상호교환가능하며, 특정 지질 분획물, 예컨대 전체 지질 또는 오일에 함유되는 개별 지방산의 양을 지칭하며, 여기서 이러한 양은 TFA의 중량 퍼센트로 표현된다. 혼합물에 존재하는 각 개별 지방산의 합은 100이어야 한다.
"유지성(oleaginous)"이라는 용어는, 그 에너지 공급원을 지질 형태로 저장하는 경향이 있는 생물을 지칭한다(Weete, In: Fungal Lipid Biochemistry, 2nd Ed., Plenum, 1980). 유지성 미생물이 그의 건조 중량의 약 25% 초과를 오일로서 축적하는 것은 보기드문 것은 아니다. 유지성 미생물 내에서, 세포성 오일 또는 TAG 함량은 일반적으로 S자형 곡선을 따르며, 여기에서 지질 농도는, 후반 대수 성장기 또는 초반 정지 성장기에서 최대치에 도달할때까지 증가하고, 그 후 후반 정지 성장기 및 사멸기 동안 점진적으로 감소한다 (Yongmanitchai and Ward, Appl. Environ. Microbiol. 57:419-25 (1991)).
"유지성 효모"라는 용어는 오일을 만드는 효모로서 분류되는 미생물류를 지칭한다. 유지성 효모의 예에는 하기의 속이 포함되나, 이에 제한되는 것을 의미하는 것은 아니다: 야로위아, 칸디다(Candida), 로도토룰라(Rhodotorula), 로도스포리듐(Rhodosporidium), 크립토코커스(Cryptococcus), 트리코스포론(Trichosporon) 및 리포마이세스(Lipomyces).
"DHA가 실질적으로 없는"이라는 표현은 약 0.05 중량 퍼센트 이하의 DHA를 포함하는 것을 의미한다. 따라서, EPA 농축물은, (유리 지방산, 트리아실글리세롤, 에스테르 및 이들의 조합물 형태의) DHA 농도가 오일의 중량%로서 측정하여, 약 0.05 중량% DHA 이하인 경우, DHA가 실질적으로 없는 것이다. 유사하게, 미생물 오일은, (유리 지방산, 트리아실글리세롤, 에스테르 및 이들의 조합물 형태의) DHA 농도가 TFA의 중량%로서 측정하여, 약 0.05 중량% DHA 이하인 경우, DHA가 실질적으로 없는 것이다.
"NDPA가 실질적으로 없는" 및 "HPA가 실질적으로 없는"이라는 표현은, 지방산 NDPA 또는 HPA가 각각 DHA에 대하여 치환되기는 하였지만, "DHA가 실질적으로 없는"이라는 표현에 대해 상기 제공된 정의에 필적한다.
"환경 오염물질이 실질적으로 없는"이라는 표현은 오일 또는 EPA 농축물이 각각, 환경 오염물질이 없거나 또는 많아도 단지 미량의 환경 오염물질을 포함한다는 것을 의미하며, 여기에서 이들은 폴리염화 바이페닐 ["PCB"] (CAS 번호 1336-36-3), 다이옥신, 브롬화 난연제 및 살충제 (예로서, 톡사펜 및 다이클로로다이페닐트리클로로에탄 ["DDT"] 및 이의 대사산물)와 같은 화합물들을 포함한다.
본 발명은 오일 중량%로 측정하여, 적어도 70 중량%의 EPA를 포함하고, DHA는 실질적으로 없는 EPA 농축물에 관한 것으로, 상기 농축물은 TFA 중량으로 측정하여 30 내지 70 중량%의 EPA를 포함하고, DHA는 실질적으로 없는 미생물 오일로부터 수득되며, 여기에서 상기 미생물 오일은 그의 건조 세포 중량 중 25% 초과를 오일로서 축적하는 미생물로부터 수득된다. EPA 농축물은 바람직하게는 환경 오염물질이 실질적으로 없고/없거나 바람직하게는 NDPA 및 HPA로 이루어지는 군으로부터 선택된 적어도 하나의 지방산이 실질적으로 없다.
본 발명은 상기 내용에 관한 것이지만, 미생물 오일 자체를 수득하는데 유용할 수 있는 관련 공정들의 개요는 이해할 것이다 (이는 본 명세서의 발명에 대한 제한으로서 해석되어서는 안된다). 흐름도 형태로 도 1에 도시된 바와 같이, 대부분의 공정들은 미생물 발효로 시작될 것이며, 여기에서 특정 미생물은 성장 및 PUFA의 생산을 허용하는 조건들 하에서 배양된다. 적절한 시기에, 미생물 세포는 발효기로부터 수확된다. 이러한 미처리된 미생물 바이오매스는, 적어도 30-70 중량%의 EPA를 포함하고 DHA는 실질적으로 없으며, 건조, 분쇄, 펠렛화 등과 같은 다양한 기계 가공처리될 수 있다. 미처리된 미생물 바이오매스의 오일 추출을 그 후 수행하여, 잔류 바이오매스 (예로서, 세포 파편) 및 추출된 오일을 생산한다. 추출된 오일은 그 후 직접 에스테르 교환반응되고 풍부화되어, 오일의 중량%로서 측정하여, 적어도 70중량%의 EPA를 포함하고, DHA는 실질적으로 없는 EPA 농축물을 생산할 수 있거나; 또는, 추출된 오일은 먼저 정제되고, 그 후 에스테르 교환반응 및 풍부화 처리될 수 있다. 예로서, 정제된 오일은 i) 탈검화, 정제, 표백, 및/또는 탈취, 등; 또는, ii) 짧은 경로 증류 (SPD) 조건을 이용하는 증류에 의하여 생산될 수 있으며, 이에 의하여 정제된 TAG-분획물 (즉, SPD-정제된 미생물 오일) 및 스테롤을 포함하는 증류액 분획물을 생산한다. 도 1의 이러한 각각의 측면들이 아래에서 더욱 상세히 논의될 것이다.
본 발명에 유용한 미생물 오일은 전형적으로 미생물 발효에 의해 제공된 미생물 바이오매스로부터 유도된다. 각종 유지성 미생물 (예컨대, 균류, 해조류, 유글레나류(euglenoid), 스트라메노파일(stramenopile), 효모 또는 임의의 기타 단세포 생물)은 미생물 발효 중에 성장하여, TFA의 중량%로 측정하여, 적어도 30 중량%의 EPA를 포함하는 지질을 생산할 수 있다. 따라서, 그의 건조 세포 중량 중 25% 초과를 오일로서 축적하는 임의의 미생물은, 자연에 존재하는 것이거나 또는 재조합물인지의 여부에 관계없이, TFA의 중량%로 측정하여, 적어도 30중량%의 EPA를 생산할 수 있는 것으로, 이는 본 명세서에 설명된 풍부화 과정에서의 용도를 위한 미생물 오일의 적합한 공급원을 제공할 수 있다. 바람직하게는, 미생물은 높은 수준의 EPA를 생산할 수 있을 것이며, 여기에서 상기 생산은 바람직하게는 적어도 약 30-50 EPA % TFA의 미생물 숙주, 보다 바람직하게는 적어도 약 50-60 EPA % TFA, 및 가장 바람직하게는 적어도 약 60-70 EPA % TFA이다.
한편, TFA의 중량%로 측정하여, 적어도 30 중량% 미만의 EPA를 생산할 수 있는 유지성 미생물은, 가공/농축되어 TFA의 중량%로 측정하여, 적어도 30중량%의 EPA를 포함할 수 있는 비농축된 미생물 오일의 적당한 공급원을, 본 발명의 EPA 농축물 제조에서의 이용을 위하여 제공할 수도 있다.
미생물은 반드시 적어도 EPA를 필수적으로 포함하여야만 하지만, 각종 다른 다중불포화 지방산, 예컨대 리놀레산, 감마-리놀렌산, 에이코사다이에논산, 다이호모-감마-리놀렌산, 아라키돈산, 도코사테트라에논산, 오메가-6 도코사펜타엔산, 알파-리놀렌산, 스테아리돈산, 에이코사트라이엔산, 에이코사테트라엔산, 오메가-3 도코사펜타엔산, 및 이들의 혼합물 또한 그 생물에 존재할 수 있다.
EPA는, 종속영양 규조류
Figure pct00004
사이클로텔라 종( Cyclotella sp.) 및 니츠시아 종 (미국 특허 제5,244,921호), 슈도모나스, 알테로모나스( Alteromonas 및
Figure pct00005
(슈와넬라( Shewanella ) 종 (미국 특허 제5,246,841호), 피시움(Pythium) 속의 곰팡이 (미국 특허 제5,246,842호), 모르티에렐라 엘롱가타(Mortierella elongata), M. 엑시구아(exigua), 및 M. 하이그로필라(hygrophila) (미국 특허 제5,401,646호), 및 나노클로롭시스(Nannochloropsis)속의 유스티그마토파이시안(eustigmatophycean) 해조류 (Krienitz, L. 및 M. Wirth, Limnologica, 36:204-210 (2006))를 포함한, 다양한 비-유지성 및 유지성 미생물에서 천연적으로 생산될 수 있지만, 재조합 수단을 이용한 EPA의 미생물 생산은 천연 미생물 공급원으로부터의 생산에 비해 몇몇 장점들을 갖는 것으로 예측된다.
재조합 미생물은 오일 생산에 바람직한 특징을 가질 것이며, 이는 숙주 중 자연에 존재하는 미생물 지방산 프로파일은 숙주에서 새로운 생합성 경로의 도입, 바람직한 경로의 과잉 발현 및/또는 바람직하지 않은 경로의 억제에 의하여 변경될 수 있고, 이에 따라 원하는 PUFA (또는 이의 공액 형태) 생산의 증가된 수준 및 원하지 않는 PUFA의 감소된 생산을 결과로서 생성할 수 있다. 두번째로, 재조합 미생물은 특이적 용도를 가질 수 있는 특정 형태의 PUFA를 제공할 수 있다. 추가적으로, 미생물 오일 생산은 배양 조건을 제어함으로써 조정될 수 있으며, 특히 미생물 발현된 효소에 대한 특정 기질 공급원을 제공함에 의하여, 또는 원하지 않는 생화학적 경로를 억제하기 위하여 화합물/유전적 조작의 부가에 의하여 조정될 수 있다. 따라서, 예로서, 이렇게 생산된 오메가-3 대 오메가-6 지방산의 비의 변경, 또는 다른 PUFA 다운스트림 또는 업스트림 생성물(예로서, DHA)의 현저한 축적 없이 특정 PUFA (예로서, EPA)의 생산을 조작하는 것이 가능하다. 고도로 제어된 배양 조건은 이들 재조합 미생물들로부터 수득된 미생물 오일이 환경 오염물질이 실질적으로 없다는 것도 보장한다.
이에 따라, 예로서, EPA를 만드는 자연적 능력을 결여한 미생물은, 델타-5 불포화효소, 델타-6 불포화효소, 델타-12 불포화효소, 델타-15 불포화효소, 델타-17 불포화효소, 델타-9 불포화효소, 델타-8 불포화효소, 델타-9 연장효소, C14/16 연장효소, C16/18 연장효소 및 C18/20 연장효소와 같은, 적절한 PUFA 생합성 경로 유전자들의 도입함에 의하여 PUFA 생합성 경로를 발현하도록 조작될 수 있으며, 다만 도입된 특정 효소 (및 이들 효소를 암호화하는 유전자)는 본 발명을 제한하고자 하는 것은 아님을 이해하여야 한다.
예로서, 몇몇 유형의 효모는 EPA를 생산하도록 재조합적으로 조작되었다. 예로서, 비-유지성 효모 사카로마이세스 세레비시에(미국 특허 제 7,736,884호) 및 유지성 효모, 야로위아 리폴리티카 (미국 특허 제7,238,482호; 미국 특허 제 7,932,077호 미국 특허 출원 공개 번호 제 2009-0093543-A1호; 미국 특허 출원 공개 번호 제 2010-0317072-A1호)에서의 작업 참조. 이들 실시예들은 본 발명을 제한하는 것으로 해석되어서는 안된다.
일부 실시양태에 있어서, 미생물 숙주 세포가 유지성인 경우 장점들이 인지된다. 유지성 효모는 천연적으로 오일 합성 및 축적이 가능하며, 여기에서 총 오일 함량은 세포 건조 중량의 약 25% 초과, 더욱 바람직하게는 세포 건조 중량의 약 30% 초과, 및 가장 바람직하게는 세포 건조 중량의 약 40% 초과를 차지한다. 다른 실시양태에 있어서, 비-유지성 효모는, 세포 건조 중량의 25% 초과의 오일을 생산할 수 있도록, 유지성이 되도록 유전적으로 변경될 수 있으며, 예로서 예로서 사카 로마이세스 세레비시에(Saccharomyces cerevisiae)와 같은 효모가 있다 (국제 특허 출원 공개 번호 제 WO 2006/102342호).
전형적으로 유지성 효모로 동정되는 속에는, 이에 제한되지는 않지만,야로위아 , 칸디다( Candida ), 로도토룰라 ( Rhodotorula ), 로도스포리듐 ( Rhodosporidium), 크립토코커스(Cryptococcus), 트리코스포론(Trichosporon) 및 리포마이세스(Lipomyces)가 포함된다. 더욱 구체적으로, 예시적인 오일-합성 효모에는 로도스포리듐 토룰로이데스(Rhodosporidium toruloides), 리포마이세스 스타케이이(Lipomyces starkeyii), L. 리포페러스(L. lipoferus), 칸디다 레브카우피(Candida revkaufi), C. 풀케리마(C. pulcherrima), C. 트로피칼리스(C. tropicalis), C. 유틸리스(C. utilis), 트리코스포론 풀란스(Trichosporon pullans), T. 쿠타네움(T. cutaneum), 로도토룰라 글루티누스(Rhodotorula glutinus), R. 그라미니스(R. graminis) 및 야로위아 리폴리티카(Yarrowia lipolytica)(이전에 칸디다 리폴리티카로 분류)가 포함된다. 예로서, 본 발명의 바람직한 실시양태에 있어서, TFA의 중량%로 측정하여 적어도 30 중량%의 EPA를 포함하는 미생물 오일의 공급원은, 유지성 효모 야로위아 리폴리티카의 조작된 균주로부터의 것이다 더욱 바람직한 것들은 예로서, 미국 특허 출원 공개 번호 제 2009-0093543-A1호 (이들 중 일부는 적어도 약 43.3 중량% 의 EPA를 포함하고, DHA는 실질적으로 없는 비농축된 미생물 오일을 생산한다) 및 미국 특허 출원 번호 제 2010-0317072-A1호 (이들 중 일부는 적어도 50 중량%의 EPA 를 포함하고, DHA는 실질적으로 없는 비농축된 미생물 오일을 생산한다)에 기재된 균주들로부터 수득된 미생물 오일이다. 이들 재조합물들 중 Y. 리폴리티카 균주는 추가의 유전자 조작 개선에 투입될 수 있으며 (본 명세서에서 실시예 5에서 기재된 것과 같은 것들), 따라서 본 명세서에 기재된 조성물 및 방법을 위한 미생물 오일에 적합한 공급원이 될 수 있다는 것이 본 명세서에서 또한 고려된다. 따라서, 바람직한 미생물 오일은 EPA의 생산을 위하여 조작된, 재조합 야로위아 세포들의 미생물 바이오매스로부터 수득된 것으로, 여기에서 미생물 오일은:
a) TFA의 중량%로서 측정하여, 30 내지 70 중량%의 EPA를 포함하고, DHA는 실질적으로 없으며;
b) TFA의 중량%로서 측정하여, 약 1 내지 약 25중량%의 리놀레산을 포함하고;
c) TFA의 중량%로서 측정된 리놀레산에 대하여, TFA의 중량%로서 측정하여, 적어도 1.2의 EPA 비를 갖고; 그리고
d) 바람직하게는 NDPA 및/또는 HPA가 실질적으로 없는 것이다.
더욱 구체적으로, 미국특허 공개 번호 제 2009-0093543-A1호는 재조합 야로위아 리폴리티카 균주에 최적화된 고농도 EPA 생산을 설명한다.. 적어도 약 43.3의 EPA % TFA, 약 23.6 미만의 LA % TFA (EPA:LA 비 1.83) 및 약 9.4 미만의 올레산 % TFA를 생산하는 능력을 갖는 균주가 개시된다. 바람직한 균주는 Y4305로, 이는 발효를 통하여 중간에 1.25의 EPA:LA 비로 33.2 EPA % TFA를 생산할 수 있으며, 그의 최대 생산은 55.6 EPA % TFA, EPA:LA의 비 3.03이다. 일반적으로, 미국 특허 출원 공개 번호 제 2009-0093543-A1호의 EPA-생산 균주는, 오메가-3/오메가-6 지방산 생합성 경로의 하기 유전자들로 구성되었다: a) 델타-9 연장효소를 암호화하는 적어도 하나의 유전자; b) 델타-8 불포화효소를 암호화하는 적어도 하나의 유전자; c) 델타-5 불포화효소를 암호화하는 적어도 하나의 유전자; d) 델타-17 불포화효소를 암호화하는 적어도 하나의 유전자; e) 델타-12 불포화효소를 암호화하는 적어도 하나의 유전자; f) C16/18 연장효소를 암호화하는 적어도 하나의 유전자; 및, g) 선택적으로, 다이아실글리세롤 콜린포스포트랜스퍼라제["CPT1"]를 암호화하는 적어도 하나의 유전자. 이 경로는 숙주 세포 내로 유전적으로 조작되기 때문에, EPA의 DPA로의 신장에 대한 적절한 효소 활성(C20/22 연장효소에 의하여 촉매됨)의 결여 및 DPA의 DHA로의 탈포화(델타-4 불포화효소에 의하여 촉매됨)로 인하여 부수적으로 생산된 DHA는 없다. 본 개시 내용은 이들 조작된 효모 균주 및 그의 오일 농축물들로부터 수득된 미생물 오일을 일반적으로 설명하였다.
야로위아 리폴리티카 균주 Y4305의 유도체가 미국 특허 출원 번호 제 12/854449호 (변호사 일람 번호 "CL5143USNA", 2010년 8월 11일 출원되었으며, 이는 본 명세서에 참고문헌으로서 통합되었다)에 기재되어 있으며, 이는 Y. 리폴리티카 균주Y4305 F1B1로 알려져 있다. 2리터 발효 중에서 배양시 (미국 특허 출원 공개 번호 제 2009-009354-A1호, 실시예 10의 파라미터들과 유사), 균주 Y4305에 대한 평균 EPA 생산성 ["EPA % DCW"]은 50-56이었으며, 이에 비하여 균주 Y4305-F1B1의 경우는 50-52이었다. 균주 Y4305에 대한 평균 지질 함량 ["TFA % DCW"]은 20-25이었으며, 이에 비하여 균주 Y4305-F1B1의 경우는 28-32이었다. 따라서, 지질 함량은 균주 Y4503-F1B1에서 29-38% 증가되었으며, EPA 생산성에는 최소의 영향을 미쳤다.
미국 특허 출원 공개 번호 제 2010-0317072-A1호 및 미국 특허 출원 공개 번호 제 2010-0317735-A1호는, EPA% TFAs 및 EPA:LA 비에 기초하여, 미국 특허 출원 공개 번호 제 2009-0093543-A1호에 기재된 균주들에 비하여 더욱 개선된 미생물 오일을 생산하는 능력을 갖는 재조합 Y. 리폴리티카의 최적화된 균주를 교시하고 있다. 미국 특허 출원 공개 번호 제 2009-0093543-A1에서 상세히 설명된 바와 같은 오메가-3/오메가-6 지방산 생합성 경로의 발현 유전자에 추가하여, 이들 개선된 균주들은 하기에 의하여 구별된다: a) 적어도 하나의 다중효소(multizyme)를 포함하며, 여기에서 상기 다중효소는 적어도 하나의 지방산 델타-8 불포화효소에 연결된 적어도 하나의 지방산 델타-9 연장효소를 갖는 폴리펩티드를 포함 ["DGLA 생성효소(synthase) "]; b) 말로닐 CoA 합성효소 또는 아실-CoA 라이소인지질(lysophospholipid) 아실트랜스퍼라아제 ["LPLAT"]로 이루어지는 군으로부터 선택되는 효소를 암호화하는 적어도 하나의 폴리뉴클레오티드를 선택적으로 포함; c) 그의 발현이 하향-조절된 적어도 하나의 페록시좀 바이오제네시스(biogenesis) 인자 단백질을 포함; d) 적어도 약 50 EPA % TFA를 생산; 및, e) 적어도 약 3.1의 EPA:LA 비를 가짐.
구체적으로, 적어도 약 50 EPA%의 가공에 추가하여, 미국 특허 출원 공개 번호 제 2010-0317072-A1 호 및 미국 특허 출원 공개 번호 제 2010-0317735-A1호의 Y. 리폴리티카의 개선된 최적화된 균주 내, 또는 그로부터 추출된 오일 내의 지질 프로파일은, EPA % TFAs 대 LA % TFAs가 적어도 약 3.1일 것이다. 개선된 최적화된 재조합Y. 리폴리티카 균주에 의하여 생산된 지질은 0.05% 미만의 GLA, NDPA, HPA 또는 DHA를 갖고, 약 8% 미만의 포화 지방산 함량을 갖는 것으로서 구분된다. 이러한 낮은 퍼센트의 포화 지방산 (즉, 16:0 및 18:0)은 인간 및 동물 모두에서 이익이다.
더욱 최근에는, 미국 특허 출원번호 제 13/218708호 (2011년 8월 26일 출원된, 변호사 일람 번호 CL5411USNA로, 본 명세서에 참고문헌으로서 통합됨)는, 미국 특허 출원 공개 번호 제 2009-0093543-A1호 및 미국 특허 출원 공개 번호 제 2010-0317072-A1호에 설명된 균주들에 비하여, 증가된 EPA 생산성에 근거하여 (즉, 증가된 EPA% DCW 로서 측정시), 개선된 미생물 오일을 생산하는 능력을 갖는 개선된 최적화된 재조합 미생물 숙주 세포를 더욱 설명한다. 오메가-3/오메가-6 지방산 생합성 경로의 유전자의 발현에 추가하여, 상기 유전자는 적어도 하나의 다중효소 (여기에서 상기 다중효소는 적어도 하나의 지방산 델타-8 불포화효소 ["DGLA 생성효소"]에 연결된 적어도 하나의 지방산 델타-9 연장효소를 갖는 폴리펩티드를 포함하며, 이는 미국 특허 출원 공개 번호 제 2010-0317072-A1호에 기재된 바와 같음)를 포함하고, 그 발현이 하향-조절된 적어도 하나의 페록시좀 바이오제네시스 인자 단백질을 포함하고 (미국 특허 출원 공개 번호 제 2009-0117253-A1호 및 제 2010-0317072-A1호에 기재된 바와 같음), 거기 개시된 개선된 재조합 미생물 숙주 세포는 하기 1)-4)에 의하여 더욱 구별된다:
1) 적어도 라이소포스파티드산 아실트랜스퍼라제["LPAAT"] 활성을 갖는 적어도 2개의 폴리펩티드의 포함;
2) 적어도 인지질:다이아실글리세롤 아실트랜스퍼라제["PDAT"] 활성을 갖는 적어도 하나의 폴리펩티드의 포함;
3) 선택적으로, 유글레나 그라실리스(Euglena gracilis)로부터 유래된 적어도 하나의 합성 돌연변이 델타-9 연장효소 폴리펩티드 및
4) DCW의 중량%로 측정하여 적어도 25중량%의 EPA를 포함하는 미생물 오일의 생산.
PUFA 생합성 경로를 유지성 효모 내로 도입시키는 수단은 공지이므로, 당업자는 본 발명의 방법이 상기 기재된, 본 발명이 실험되는, Y. 리폴리티카 균주에 제한되지 않고, 종 (즉, Y. 리폴리티카) 또는 속 (즉, 야로위아) 에도 제한되지 않는다는 것을 이해할 것이다. 이 대신, TFA의 중량%로 측정하여 적어도 30%의 EPA를 생산할 수 있는, 임의의 유지성 효모 또는 임의의 기타 적당한 유지성 미생물 예컨대, 균류, 해조류, 유글레나류, 스트라메노파일류, 또는 임의의 기타 단세포 생물은 본 발명의 방법에 균등하게 유용할 것이며, 여기에서 이로부터 수득된 미생물 오일은 그 건조 세포 중량 중 25% 초과를 오일로서 축적하는 미생물로부터 수득된다.
TFA의 중량%로 측정하여, 30 내지 70 중량%의 EPA를 포함하고 DHA가 실질적으로 없는 미생물 오일을 생산하기 위하여, 오일 생산 미생물은 미생물학 또는 발효 과학 분야의 당업자에게 EPA의 생산을 최적화하기 위하여 공지된 표준 조건 하에서 배양될 것이다. 유전적으로 조작된 미생물에 관하여, 미생물은 (예로서, 불포화효소, 연장효소, DGLA 합성효소, CPT1 단백질, 말로닐 CoA 합성효소, 아실트랜스퍼라제, 등을 암호화하는) 키메라 유전자의 발현을 최적화하는 조건 하에서 배양될 것이며 최대 및 가장 경제적 수율의 EPA를 생산할 것이다. 전형적으로, 미생물은, 그 미생물의 성장 및/또는 EPA 생산을 가능하게 하는 다수의 추가적인 화학물질 또는 성분들과 더불어 탄소 및 질소원을 공급받는다. 발효 조건은 상기 인용에 기재된 것과 같이, 사용된 미생물에 따라 다를 것이며, 결과의 바이오매스에서 PUFA의 높은 함량에 대하여 최적화될 수 있다.
일반적으로, 탄소원의 유형 및 양, 질소원의 유형 및 양, 탄소-대-질소 비, 상이한 미네랄 이온의 양, 산소 수준, 성장 온도, pH, 바이오매스 생성 단계의 기간, 오일 축적 단계의 기간 및 세포 수집 시간 및 방법을 변경함으로써 배지 조건을 최적화시킬 수 있다.
더욱 구체적으로, 발효 매질은 미국 특허 제 7,238,482호 및 미국 특허 출원 공개 번호 제 2011-0059204-A1호에서 교시되는 바와 같이, 적절한 탄소원을 포함하여야만 한다. 조작된 EPA-생산 미생물의 성장에 이용되는 탄소원은 광범위한 종류의 탄소 함유 공급원을 포함할 수 있는 것으로 생각되지만, 바람직한 탄소원은 당, 글리세롤 및/또는 지방산이다. 포도당, 수크로스, 전화당, 과당 및/또는 10-22개의 탄소를 함유하는 지방산이 가장 바람직하다. 예로서, 발효가능한 탄소원은 전화 수크로스 (즉, 수크로스의 가수분해 결과로 인해 동일한 부의 과당 및 포도당을 포함하는 혼합물), 포도당, 과당 및 이들의 조합으로부터 선택될 수 있으며, 단 포도당은 전화 수크로스 및/또는 과당과 조합되어 사용된다.
질소는 무기 공급원(예컨대, (NH4 )2 SO4) 또는 유기 공급원(예컨대, 우레아 또는 글루타메이트) 공급원으로부터 공급될 수 있다. 적절한 탄소 및 질소 공급원에 추가적으로, 발효 매질은 유지성 효모의 성장 및 EPA 생산에 필요한 효소 경로의 촉진에 적당한, 당업자에게 알려진 적당한 무기물, 염, 보조인자, 버퍼, 비타민, 및 기타 성분 또한 포함하여야 한다. 지질 및 PUFA 합성을 촉진하는 몇몇 금속 이온 (예로서, Fe+2, Cu+2, Mn+2, Co+2, Zn+2 및 Mg+2)이 특히 주목된다 (Nakahara, T. 등, Ind. Appl . Single Cell Oils , D. J. Kyle and R. Colin, eds. pp 61-97 (1992)]).
바람직한 배양 매질은 효모 질소 베이스 (Yeast Nitrogen Base) (DIFCO Laboratories, Detroit, MI)와 같이, 일반적으로 상업적으로 제조된 매질이다. 기타 규정된 또는 합성 배양 매질도 사용될 수 있으며, 야로위아 리폴리티카의 배양에 적절한 매질은 미생물학 또는 발효 과학의 당업자에게 알려져 있을 것이다. 전형적으로, 발효에 적절한 pH 범위는 약 pH 4.0 내지 pH 8.0이며, pH 5.5 내지 pH 7.5가 초기 성장 조건의 범위로서 바람직하다. 발효는 호기성 또는 혐기성 조건 하에서 수행될 수 있다.
전형적으로, 높은 수준의 PUFA가 유지성 효모 세포에 축적되기 위해서는 2-단계 공정이 필요한데, 이는 대사 상태가 성장과 지방의 합성/저장 간에 "균형을 이루어야" 하기 때문이다. 따라서, 가장 바람직하게는, 2단계 발효 공정이 Y. 리폴리티카에서의 EPA 생산에 필요하다. 이러한 접근법은 다양한 적합한 발효 공정 설계(즉, 회분식, 유가식(fed-batch) 및 연속식) 및 성장 동안의 고려사항으로서, 미국 특허 제7,238,482호에 기재되어 있다.
원하는 양의 EPA가 미생물에 의하여 생산되면, 발효 매질은 PUFA를 포함하는 미생물 바이오매스를 수득하도록 처리될 수 있다. 예로서, 발효 매질은 여과되거나 또 다르게는 수성 성분의 적어도 일부를 제거하도록 처리될 수 있다. 발효 매질 및/또는 미생물 바이오매스는 더욱 가공될 수 있으며; 예로서, 미생물 바이오매스는 저온살균 또는 다른 방법을 통하여 처리되어 미생물 오일 및/또는 PUFA 생성물에 해를 미칠 수 있는 내생의 미생물 효소의 활성을 감소시킬 수 있다. 미생물 바이오매스는 예로서 바이오매스의 건조, 바이오매스의 분쇄 (예로서, 세포 용해를 통하여), 바이오매스의 펠렛화, 또는 이들의 조합에 의하여 기계적으로 가공될 수 있다. 미생물 바이오매스는, 예로서 원하는 수분 함량으로 건조되고, 취급 용이성을 위해 과립화 또는 펠렛화, 및/또는 예로서 비드 비터(bead beater), 스크류 압출 등과 같은 물리적 수단을 통하여 기계적으로 분쇄되어 세포 내용물에 대한 더욱 큰 접근성을 제공할 수 있다. 미생물 바이오매스는, 이들 임의의 기계 가공 단계 후에도, 오일 추출이 아직 일어나지 않았기 때문에, 미처리된 미생물 바이오매스로서 지칭된다.
미생물 바이오매스의 기계적 가공을 위한 한 바람직한 방법이 미국 가출원 제 61/441,836호 (변호사 일람 번호 CL5053USPRV, 2011년 2월 11일 출원됨) 및 미국 특허 출원 번호 제 XX/XXX,XXX (변호사 일람 번호 CL5053USNA (본 명세서와 함께 출원됨) (이들 각각은 본 명세서에 참고로서 통합됨)에 기재되어 있다. 구체적으로, 이 방법은 오일을 흡수할 수 있는 연마제(예로서, 실리카, 실리케이트)와 함께 건조된 효모를 이축 압출하여 분쇄된 바이오매스 혼합물을 제공하고, 이어서 상기 분쇄된 바이오매스와 결합제(예로서, 수크로스, 락토스, 포도당, 가용성 전분)의 블렌딩으로 고체 펠렛을 형성할 수 있는 고정가능한(fixable) 혼합물을 제공하고, 이후 고정가능한 혼합물로부터 고체 펠렛의 형성 (예로서, ~1 ㎜ 직경 X 6-10 ㎜ 길이) ("펠렛화")을 포함한다.
선택적 기계 가공에 따라, 미생물 오일은 일반적으로(필수는 아님), 오일 추출을 통해 오일을 생산한 미생물 중에 존재할 수 있는 기타 세포 물질로부터 분리된다.
오일 추출은 각종 유기 용매 (예로서, 헥산, 아이소-헥산) 처리, 효소적 추출, 삼투압 충격, 초음파 추출, 초임계 유체 추출 (예로서, CO2 추출), 비누화 및 이들 방법의 조합을 통하여 일어날 수 있다. 이들 공정은 잔류 바이오매스 (즉, 세포 파편, 등) 및 TFA 중량%로 측정하여, 바람직하게는 30 내지 70중량%의 EPA를 포함하고 DHA는 실질적으로 없는 추출된 오일을 결과로서 생성할 수 있다.
초임계 유체 추출 이용시, 임의의 적합한 초임계 유체 또는 액체 용매를 사용하여 바이오매스 (예로서, CO2, 테트라플루오로메탄, 에칸, 에틸렌, 프로판, 프로필렌, 부탄, 아이소부탄, 아이소부텐, 펜탄, 헥산, 사이클로핵산, 벤젠, 톨루엔, 자일렌, 및 이들의 혼합물, 단 초임계 유체는 모든 시약 및 생산물에 불활성이다)로부터 EPA-함유 오일을 분리하는데 사용할 수 있고; 더욱 바람직한 용매는 CO2 또는 C3-C6 알칸 (예로서, 펜탄, 부탄, 및 프로판)을 포함한다. 가장 바람직한 용매는 CO2를 포함하는 초임계 유체 용매이다. 추출은 지방산 조성물을 농축하지 않고, 회수된 추출 오일은 따라서 비농축 미생물 오일이다.
바람직한 실시양태에 있어서, 초임계 이산화탄소 추출은 미국특허 출원 공개 번호 제 2011-0263709-A1호 (본 명세서에 참고문헌으로서 통합됨)에 개시된 바와 같이, 수행하였다. 이 특정 방법은 미처리된 분쇄 미생물 바이오매스를 오일 추출시켜 인지질을 포함하는 잔류 바이오매스를 제거하고, 그 후 결과의 추출물을 적어도 1회 분획화하여, 적어도 하나의 PUFA를 포함하는 정제된 지질 조성물을 갖는 추출된 오일을 수득하며, 여기에서 정제된 지질 조성물은 미처리된 분쇄 미생물 바이오매스의 오일 조성물에 비하여 TAG가 풍부하다.
일부 실시양태에 있어서,TFA의 중량%로 측정하여, 30 내지 70 중량%의 EPA를 포함하고, DHA는 실질적으로 없는 추출된 오일은 임의로 추가의 정제 단계를 거칠 수 있다. 예로서, 당업자는 탈검화 (예로서, 인지질을, 미량 금속 및 유리 지방산을 제거하기 위함), 정제, 표백 (예로서, 안료 화합물, 소량의 산화 생성물을 흡착하기 위함), 및/또는 탈취 (예로서, 휘발성, 방향성 및/또는 추가적인 안료 화합물을 제거하기 위함) 절차에 친숙할 것이다. 이들 방법들 중 어떤 것도 미생물 오일 내에서 EPA 농도를 실질적으로 풍부하게 하지는 않기 때문에, 이들 과정의 생성물은 정제된 형태에도 불구하고, 여전히 전형적으로 비농축된 미생물 오일로 여겨진다. 이 오일 중 EPA 및 기타 PUFA는 일차적으로 그들의 천연 트라이글리세라이드 형태로 잔류한다.
다르게는, TFA 중량%로 측정하여, 30 내지 70 중량%의 EPA를 포함하고, DHA는 실질적으로 없는 추출된 오일을 증류시켜 수분 및 예로서, 스테롤을 제거하는 것이 바람직할 수 있다. 스테롤은, 세포의 막 투과성에대해 기능하는 것으로, 분리된 주 스테롤은 차이가 있지만, 모든 주요한 군의 살아있는 생물체로부터 분리된다. 보다 고등 동물에서 주 스테롤은 콜레스테롤인 한편, (캄페스테롤 및 스티그마스테롤이 종종 수반되기도 함) β-시토스테롤은 보다 고등 식물에서 일반적으로 주요한 스테롤이다. 미생물들에서 발견되는 주요 스테롤(들)에 관한 일반화는, 특정 미생물 종에 따라 그 조성이 달라지기 때문에 더욱 어렵다. 예로서, 유지성 효모인 야로위아 리폴리티카 는 주로 에르고스테롤을 주로 포함하고, 모르테리엘라( Morteriella ) 속의 균류는 우선적으로 콜레스테롤 및 데스모스테롤을 주로 포함하고, 스키조카이트리움( Schizochytrium ) 속의 스트라메노파일은 브라시카스테롤 및 스티그마스테롤을 주로 포함한다. 스테롤 (예로서, 에르고스테롤)은, 특히 저온 저장 온도에서, TAG로부터 상 분리된 것으로 관찰되며, 이에 따라 미생물 오일에서 바람직하지 않은 혼탁함(cloudiness)이 결과로서 일어난다.
미국 가출원 번호 제 61/441,842호 (변호사 일람 번호 CL5077USPRV, 2011년 2월 11일 출원됨) 및 미국 특허 출원 번호 제 XX/XXX,XXX호 (변호사 일람 번호 CL5077USNA (본 명세서와 동시에 출원됨) (이들 각각은 본 명세서에 참고문헌으로서 통합됨) 는 스테롤-함유 추출 오일 중에서 스테롤 함량을 감소시키는 공정을 기재하고 있으며, 이 공정은 스테롤-함유 미생물 오일의 짧은 경로 증류 (SPD) 증류기를 통한 적어도 1회의 통과를 포함한다. 상업적 SPD 증류기는 화학공학 분야에서 공지이다. 적당한 증류기는 예로서, Pope Scientific (Saukville, WI)로부터 입수가능하다. SPD 증류기는 증발기 및 내부 응축기를 포함한다. 전형적인 증류는 증발기 온도, 농축기 온도, 오일의 증류기 내로의 공급 속도, 및 증류기의 진공 수준에 의하여 제어된다.
당업자는 알 것이지만, SPD 증류기를 통한 통과 횟수는 스테롤-함유 미생물 오일 중 수분 수준에 따라 달라질 것이다. 수분 함량이 낮은 경우에는, SPD 증류기를 통한 일회 통과는 충분할 것이다. 그러나, 바람직하게는, 증류는 SPD 증류기를 통한 스테롤-함유 추출 오일의 2회 이상의 연속적인 통과를 포함하는 다회-통과이다. 첫번째 통과는 약 133.3 내지 6666.1 Pa (1 내지 50 토르(torr)) 압력, 및 바람직하게는 약 666.6 내지 3999.7 Pa (5 내지 30 토르) 하에서, 비교적 낮은 증발기 표면 온도, 예로서 약 100 내지 150℃에서 전형적으로 수행된다. 남아있는 물 및 저분자량 유기 물질이 증류됨에 따라, 이는 탈수된(dewatered) 오일을 결과로서 생성한다. 탈수된 오일을 그 후 증발기의 보다 높은 온도 및 더욱 낮은 압력에서 증류기를 통해 통과시켜 SPD에 투입되지 않은 오일에 비교하여, 스테롤이 풍부화된 증류액 분획물 및 감소된 양의 스테롤을 갖는 TAG-함유 분획물을 제공하였다. 스테롤을 더 제거하기 위하여, TAG-함유 분획물의 증류기로의 추가적인 통과가 이루어질 수 있다. 바람직하게는, 스테롤-함유 미생물 오일 중의 스테롤 분획물에 비교시, 스테롤 분획물의 양에서의 감소가 적어도 약 40%-70%, 바람직하게는 적어도 약 70%-80%, 및 더욱 바람직하게는 80% 초과가 되도록 충분한 통과가 수행된다.
더욱 바람직하게는: i) SPD 조건은 4.0 Pa (30 밀리토르(mTorr))이하, 및 바람직하게는 0.67 Pa (5 mTorr)이하의 진공 수준에서 스테롤-함유 미생물 오일의 적어도 1회 통과를 포함하고; ii) SPD 조건은 약 220 내지 300℃, 및바람직하게는 약 240 내지 280℃에서 적어도 1회 통과를 포함하고; 그리고, iii) SPD 조건은 300℃ 이하, 및 보다 바람직하게는 280℃이하의 증발기 온도를 갖는다.
SPD 공정은 SPD에 투입되지 않은 스테롤-함유 미생물 오일 조성물에 비하여, 투명도가 개선된 감소된 스테롤 분획물을 갖는 TAG-함유 분획물 (즉, SPD-정제된 오일)을 결과로서 생성한다. 개선된 투명도는 오일에서 혼탁 또는 불투명함의 결여를 지칭한다. 스테롤-함유 미생물 오일은, 오일 중 스테롤의 증가된 수준으로 인하여, 약 10℃ 미만의 온도에서 저장시, 혼탁하게 된다. 증류 공정은 스테롤 분획물의 실질적인 상당 부분을 제거하는 작용을 하여, 생성된 TAG-함유 분획물이 존재하는 스테롤의 감소된 양을 갖고, 이에 따라 약 10℃에서 저장시에 투명하게 잔류하거나 또는 실질적으로 투명하도록 한다. 오일의 투명도를 평가하는데 사용될 수 있는 시험 방법은 미국 오일 화학자 협회(American Oil Chemists' Society: AOCS) 공식 방법 Cc 11-53 으로, "냉각 시험(Cold Test)"으로 명명된다 (Official Methods and Recommended Practices of the AOCS, 6th ed., Urbana, IL, AOCS Press, 2009, 본 명세서에 참고문헌으로서 통합됨).
놀랍게도, 증류 공정에서 스테롤의 제거는, 공정 전과 공정 후의 PUFA 함량 평가에 근거시, 오일의 현저한 분해 없이 달성되었다.
TFA의 중량%로 측정하여, 30 내지 70 중량%의 EPA를 포함하고, DHA는 실질적으로 없는 정제된 미생물 오일인, TAG-함유 분획물의 회수는, 증발기 통과 완료 후, 적합한 용기로 분획물 흐름을 전환시킴으로써 달성될 수 있다.
미생물 오일 (즉, 추출된 오일 또는 정제된 오일) 중 지방산은 전형적으로, 트라이글리세라이드 또는 인지질과 같은 생물학적 형태이다. 이들 형태의 지방산 프로파일을 풍부화하는 것은 어렵기 때문에, 미생물 오일의 개별적인 지방산은, 당업자에게 잘 알려진 기술을 이용하여 에스테르 교환반응에 의하여 일반적으로 유리될 것이다. 지방산 에스테르 혼합물은 에스테르 교환반응 전에 미생물 오일과 동일한 지방산 프로파일을 갖기 때문에, 에스테르 교환반응 공정의 생성물은 여전히 비농축된 미생물 오일 (즉, 에스테르 형태)로 여겨지는 것이 전형적이다.
TFA의 중량%로 측정하여, 30 내지 70중량%의 EPA를 포함하고, DHA(여기에서, 미생물 오일은 그의 건조 세포 중량 중 25% 초과를 오일로서 축적하는 미생물로부터 수득된다)는 실질적으로 없는 미생물 오일의 풍부화는 오일 중량%로 측정하여, 적어도 70중량%의 EPA를 포함하고 DHA는 실질적으로 없는 오일 농축물을 결과로서 생성한다 (즉, "EPA 농축물"). 특히, 미생물 오일의 에틸 또는 기타 에스테르는 EPA로 풍부화될 수 있고, 당 분야에서 일반적으로 사용되는 방법, 예컨대: 분별 증류, 우레아 부가물 형성, 짧은 경로 증류, 향류 컬럼을 이용한 초임계 유체 분획화, 초임계 유체 크로마토그래피, 액체 크로마토그래피, 효소적 분리 및 은 염을 이용한 처리, 유사 이동층 크로마토그래피, 실질 이동층 크로마토그래피 및 이의 조합에 의하여 분리될 수 있다.
따라서, 본 명세서는, 오일의 중량%로서 측정하여, 적어도 70중량%의 EPA를 포함하고, DHA는 실질적으로 없는 EPA 농축물의 제조방법을 제공하며, 상기 방법은:
a) TFA의 중량%로 측정하여, 30 내지 70 중량 퍼센트의 EPA를 포함하고, DHA는 실질적으로 없는 미생물 오일을 에스테르 교환반응시키고, 여기에서 상기 미생물 오일은 그의 건조 세포 중량 중 25% 초과를 오일로서 축적하는 미생물로부터 수득되는 것인 단계; 및
b) 단계 (a)의 에스테르 교환반응된 오일을 풍부화하여, 오일의 중량%로 측정하여 적어도 70 중량%의 EPA를 포함하고, DHA는 실질적으로 없는 EPA 농축물을 수득하는 단계를 포함한다.
예로서, 야로위아 리폴리티카 로부터의, TFA의 중량%로 측정하여 58.2%의 EPA를 포함하고, DHA는 실질적으로 없는 비농축된 정제된 미생물 오일이 본 발명의 실시예에서 제공된다. 이러한 비농축된 미생물 오일은, 우레아 부가물 형성 방법을 통하여 실시예 2에서 풍부화되어, 생성된 EPA-EE 농축물이 오일의 중량%로 측정하여 76.5%의 EPA-EE를 포함하고, DHA는 실질적으로 없도록 한다. 유사하게, 실시예 3은 동일한 비농축된 미생물 오일의, 액체 크로마토그래피를 통한 풍부화를 예증하며, 여기에서 결과의 EPA-EE 농축물은 오일의 중량%로 측정하여 82.8% 또는 95.4%의 EPA-EE를 포함하고, DHA는 실질적으로 없다. 실시예 4는 초임계 유체 크로마토그래피를 통한 동일한 비농축된 미생물 오일의 풍부화를 예증하며, 오일 중량%로 측정하여 85% 또는 89.8%의 EPA-EE를 포함하고, DHA는 실질적으로 없는 EPA 농축물을 결과로서 생성한다.
야로위아 리폴리티카 로부터의, TFA의 중량%로 측정하여, 56.1%의 EPA를 포함하고, DHA는 실질적으로 없는 대안적인 비농축된 SPD-정제된 미생물 오일이 실시예 5에서 제공된다. 실시예 6에서 분별 증류를 통한 이 미생물 오일의 풍부화는, 이에 따라, 오일의 중량%로 측정하여, 73%의 EPA-EE를 포함하고, DHA는 실질적으로 없는 EPA 농축물을 생산한다. 분별 증류는, 오일 중에 존재하는 보다 저분자량의 에틸 에스테르(즉, 이에 제한되지는 않지만, 실시예 6의 미생물 오일 중 주로 C18)를 많이 제거하여, 유리하다.
야로위아 리폴리티카 로부터 유도된 TFA의 중량%로 측정하여, 54.7%의 EPA를 포함하고, DHA, NDPA 및 HPA 는 실질적으로 없는 대안적인 비농축된 SPD-정제된 미생물 오일이 실시예 8에 제공된다. 이 미생물 오일의 풍부화는 분별 증류 및 액체 크로마토그래피를 통하여 일어나며, 이에 따라, 오일의 중량%로 측정하여 97.4%의 EPA-EE를 포함하고, DHA, NDPA 및 HPA는 실질적으로 없는 EPA 농축물이 생성된다. 당업자는 풍부화 공정 (예로서, 분별 증류, 우레아 부가물 형성, 짧은 경로 증류, 향류 컬럼을 갖는 초임계 유체 분획화, 초임계 유체 크로마토그래피, 액체 크로마토그래피, 효소적 분리 및 은 염 처리, 유사 이동층 크로마토그래피, 실질 이동층 크로마토그래피)의 다른 조합을 사용하여 본 발명의 EPA 농축물을 생산할 수 있을 것임을, 당업자는 이해하여야 한다.
예로서, 본 발명은 오일의 중량%로 측정하여, 적어도 70 중량%의 EPA를 포함하고 DHA는 실질적으로 없는 EPA 농축물을 제조하는데 특히 유리하며, 상기 방법은 하기 단계 (a) 내지 (c)를 포함한다: (a) TFA의 중량%로 측정하여, 30 내지 70 중량%의 EPA를 포함하는 미생물 오일의 에스테르 교환반응; (b) 보다 낮은 분자량, 즉 C14, C16 및 C18 지방산을 포함하는 에틸 에스테르의 다수를 제거하기 위하여 분별증류를 포함하는 제 1 풍부화 공정; 및, (c) 우레아 부가물 형성, 액체 크로마토그래피, 초임계 유체 크로마토그래피, 유사 이동층 크로마토그래피, 실질 이동층 크로마토그래피 및 이들의 조합으로 이루어지는 군으로부터 선택된, 적어도 하나의 추가적인 풍부화 공정. 분별 증류 결과로 인하여, 미생물 오일 샘플에서 C14, C16 및 C18의 보다 낮은 농도는 이후의 풍부화 공정을 용이하게 할 수 있다.
당업자에게 인지되는 바와 같이, 상기 기재된, 에틸 에스테르 형태의, 임의의 EPA 농축물은, 바람직한 경우, 다른 형태, 예로서 메틸 에스테르, 산 또는 트라이아실글리세라이드, 또는 임의의 기타 적합한 형태 또는 이들의 조합으로 쉽게 전환될 수 있다. 한 유도체에서 또다른 유도체로의 PUFA의 화학적 전환을 위한 방법은 공지이다. 예로서, 트라이글리세라이드는 비누화에 의하여 분리된 산의 나트륨 염으로 전환되고, 산성화에 의하여 유리 지방산으로 더 전환될 수 있으며, 에틸 에스테르는 글리세롤 분해를 통하여 트라이글리세라이드로 재-에스테르화될 수 있다. 따라서, EPA 농축물은 초기에는 에틸 에스테르 형태일 것으로 예측되지만, 이는 결코 제한으로서 의도된 것은 아니다. 오일의 중량%로 측정하여, EPA 농축물 중 적어도 70 중량%의 EPA는, 따라서 유리 지방산, 트라이아실글리세롤, 에스테르 및 이들의 조합물 형태의 EPA를 지칭할 것이며, 여기에서 에스테르는 가장 바람직하게는 에틸 에스테르의 형태이다.
당업자는, 가공 조건은 미생물 오일 중 EPA 풍부화의 임의의 바람직한 수준을 결과로서 생성하도록 최적화되어, EPA 농축물이 오일의 중량%로 측정하여 적어도 70중량%의 EPA를 갖게 될 수 있음을 이해할 것이다 (증가된 EPA 순도는 종종 EPA 수율에 종종 역의 관계이다). 따라서, 당업자는 EPA의 중량%가, 오일의 중량%로 측정하여, 70% 내지 100%(100% 포함)의 임의의 정수 퍼센트 (또는 분수 퍼센트)로, 즉 구체적으로, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 및 100% EPA일 수 있다는 것을 이해할 것이다.
보다 구체적으로, 본 발명의 한 실시양태에 있어서, 오일의 중량%로 측정하여,적어도 80 중량%의 EPA를 포함하고, DHA는 실질적으로 없는 EPA 농축물이 제공된다. 또다른 실시양태에 있어서, 오일의 중량%로 측정하여,적어도 90 중량%의 EPA를 포함하고, DHA는 실질적으로 없는 EPA 농축물이 제공된다. 그리고, 여전히 또다른 실시양태에 있어서, 오일의 중량%로 측정하여, 적어도 95 중량%의 EPA를 포함하고, DHA는 실질적으로 없는 EPA 농축물이 제공된다.
바람직한 실시양태에 있어서, 상기 설명된, 오일의 중량%로 측정하여,적어도 70 중량%의 EPA를 포함하고, DHA는 실질적으로 없는 EPA 농축물은, NDPA가 실질적으로 없고, HPA가 실질적으로 없는 것으로 더욱 특징될 수 있다.
임의의 특정 적용에 제한되지 않지만, 본 발명의 EPA 농축물은 특히 약제로서의 이용에 적합하다. 당업자에게 공지된 바와 같이, EPA는 캡슐, 정제, 과립, 음료 중 분산될 수 있는 분말, 또는 또다른 고체 경구 제형, 액체 (예로서, 시럽), 연질 겔 캡슐, 코팅된 연질 겔 캡슐 또는 기타 캡슐 중 경구 액체와 같은 편리한 투약 형태로 투여될 수 있다. 캡슐은 단단한-껍질 또는 연한-껍질일 수 있으며, 젤라틴 또는 채소성 공급원일 수 있다. EPA는 주사 또는 주입에 적합한 액체 중에 포함될 수도 있다.
추가적으로, EPA는 하나 이상의 비-활성 약학 성분 (본 명세서에서 일반적으로 "부형제"로도 알려짐)과 조합되어 투여될 수도 있다. 비-활성 성분은, 활성성분을 안전하고, 편리하며, 그렇지 않으면 이용에 적합한, 적용가능하고 효과적인 제제 내로, 예로서, 용해, 현탁, 증점, 희석, 유화, 안정화, 보존, 보호, 색상, 풍미, 및 형태화시키는(fashion) 역할을 한다.
부형제는, 이에 제한되지는 않지만, 계면활성제, 예컨대 프로필렌 글리콜 모노카프릴레이트, 글리세롤과 장쇄 지방산의 폴리에틸렌 글리콜 에스테르의 혼합물, 폴리에톡실화된 피마자유, 글리세롤 에스테르, 올레일 매크로골 글리세라이드, 프로필렌 글리콜 다이카프릴레이트/다이카프레이트, 폴리에틸렌-폴리프로필렌 글리콜 공중합체 및 폴리옥시에틸렌 소르비탄 모노올리에이트; 공용매, 예컨대 에탄올, 글리세롤, 폴리에틸렌 글리콜, 및 프로필렌 글리콜; 및 오일류, 예컨대 코코넛, 올리브 또는 잇꽃 오일을 포함할 수 있다. 계면활성제, 공용매, 오일 또는 이들의 조합의 이용은 제약 분야에서 일반적으로 알려져 있으며, 이는 당업자에 의하여 이해되는 바와 같이, 임의의 적합한 계면활성제가 본 발명 및 그 실시양태와 함께 사용될 수 있다.
투약 농도, 투약 일정 및 조성물의 투여 기간은 의도되는 작용의 발현에 충분하여야만 하며, 예로서 제형, 투여 경로, 증상(들)의 심각성, 체중, 연령 등에 따라 적절하게 조절될 수 있다. 경구 투여되는 경우, 본 조성물은 일 당 3회로 나누어 투여될 수 있지만, 조성물은 다르게는 단일 투약량 또는 수회로 나눈 투약량으로 투여될 수 있다.
실시예
본 발명은 하기 실시예에서 추가로 정의된다. 이들 실시예는 본 발명의 바람직한 실시형태를 나타내면서도 단지 예로써만 주어지는 것으로 이해해야 할 것이다. 상기 논의 및 이러한 실시예로부터, 당업자는 본 발명의 본질적 특징을 확인할 수 있으며, 본 발명의 사상 및 범주를 벗어나지 않는 한 본 발명을 다양하게 변경하고 수정하여 다양한 용도 및 조건에 적합하게 할 수 있다.
실시예 1
총 지방산 ["TFAs"] 중 58.2% EPA를 포함하는 미생물 오일의 제조
본 실시예는 EPA의 생산을 위하여 조작된, 재조합 야로위아 리폴리티카 세포들의 미생물 바이오매스로부터 수득된 미생물 오일의 분리를 설명한다. 이 미생물 오일을 그 후, 하기 실시예 2-4에서 설명되는 바와 같은 각종 수단에 의하여 풍부화하였다.
구체적으로, Y. 리폴리티카 균주 Y8672는 약 61.8 EPA % TFA의 생산이 가능하도록 재조합적으로 조작되고, 2-단계 유가식 공정을 이용하여 배양되었다. 미생물 오일을 그 후 아이소-헥산 용매를 통하여 결과의 미생물 바이오매스로부터 분리하고 정제하여, 58.2 EPA % TFA를 포함하는 비농축된, 트라이글리세라이드-풍부 정제 오일을 생성하였다.
야로위아 리폴리티카 균주 Y8672 의 유전형
균주 Y8672의 생성은 미국 특허 출원 공개 번호 제 2010-0317072-A1호에 기재되어 있다. Y. 리폴리티카 ATCC #20362로 유래된 균주 Y8672는, 델타-9 연장효소/델타-8 불포화효소 경로의 발현을 통하여, 총 지질에 대하여 약 61.8%의 EPA를 생산할 수 있었다.
야생형 Y. 리폴리티카 ATCC #20362에 대한 균주 Y8672 의 최종 유전형은 다음과 같았다: Ura +, Pex3 -, 미지( unknown ) 1-, 미지 2-, 미지 3-, 미지 4-, 미지 5-, 미지 6-, 미지 7-, 미지 8-, Leu+, Lys+, YAT1::ME3S::Pex16, GPD::ME3S::Pex20, GPD::FmD12::Pex20, YAT1::FmD12::Oct, EXP1::FmD12S::ACO, GPAT::EgD9e::Lip2, FBAINm::EgD9eS::Lip2, EXP1::EgD9eS::Lip1, YAT1::EgD9eS::Lip2, FBAINm::EgD8M::Pex20, FBAIN::EgD8M::Lip1, EXP1::EgD8M::Pex16, GPD::EaD8S::Pex16 (2개 복제물) YAT1::E389D9eS/EgD8M::Lip1, YAT1::EgD9eS/EgD8M::Aco, FBAIN::EgD5SM::Pex20, YAT1::EgD5SM::Aco, GPM::EgD5SM::Oct, EXP1::EgD5M::Pex16, EXP1::EgD5SM::Lip1, YAT1::EaD5SM::Oct, YAT1::PaD17S::Lip1, EXP1::PaD17::Pex16, FBAINm::PaD17::Aco, GPD::YlCPT1::Aco, 및 YAT1::MCS::Lip1.
상기 발현 카세트의 구조는 간단 표기법"X::Y::Z"로 표시하였으며, 여기에서 X는 프로모터 단편, Y는 유전자 단편, 및 Z는 종료기 단편을 설명하며, 이는 모두 서로에게 작동적으로 연결되었다. 약어는 하기와 같다: FmD12는 푸사리움 모닐리포르메(Fusarium moniliforme) 델타-12 불포화효소 유전자이고[미국 특허 제7,504,259호]; FmD12S는 푸사리움 모닐리포르메 유래의 코돈-최적화된 델타-12 불포화효소 유전자이고[미국 특허 제7,504,259호]; ME3S는 모르티에렐라 알피나 유래의 코돈-최적화된 C16/18 연장효소 유전자이고[미국 특허 제7,470,532호]; EgD9e는 유글레나 그라실리스 델타-9 연장효소 유전자이고[미국 특허 제7,645,604호]; EgD9eS는 유글레나 그라실리스 유래의 코돈-최적화된 델타-9 연장효소 유전자이고[미국 특허 제7,645,604호]; EgD8M은 유글레나 그라실리스 유래의[미국 특허 제7,256,033호] 합성 돌연변이 델타-8 불포화효소 유전자[미국 특허 제7,709,239호]이고; EaD8S는 유글레나 아나바에나 유래의 코돈-최적화된 델타-8 불포화효소 유전자이고[미국 특허 제7,790,156호]; E389D9eS/EgD8M은 유트렙티엘라 종 CCMP389 델타-9 연장효소 (미국 특허 제7,645,604호) 유래의, 코돈-최적화된 델타-9 연장효소 유전자("E389D9eS")를 델타-8 불포화효소 "EgD8M" (상기 참조)에 연결함으로써 생성된 DGLA 합성 효소이고 [미국 특허 출원 공개 번호 제 2008-0254191-A1호]; EgD9ES/EgD8M는 델타-9 연장효소 "EgD9eS" (상기 참조)를 델타-8 불포화효소 "EgD8M" (상기 참조 )에 연결함으로써 생성된 DGLA 합성효소이고 [미국 특허 출원 공개 번호 제 2008-0254191-A1호]; EgD5M 및 EgD5SM는 합성 돌연변이 델타-5 불포화효소 유전자로[미국 특허 출원 공개 번호 제 2010-0075386-A1호], 유글레나 그라실리스로부터 유래되고 [미국 특허 제 7,678,560호]; EaD5SM는 합성 돌연변이 델타-5 불포화효소 유전자로[미국 특허 출원 공개 번호 제 2010-0075386-A1호], 유글레나 아나바에나로부터 유래되고 [미국 특허 제 7,943,365호]; PaD17은 피티움 아파니더마툼(Pythium aphanidermatum) 델타-17 불포화효소 유전자[미국 특허 제7,556,949호]이고; PaD17S는 피티움 아파니더마툼 유래의 코돈-최적화된 델타-17 불포화효소 유전자이고[미국 특허 제7,556,949호]; YlCPT1는 야로위아 리폴리티카 다이아실글리세롤 콜린포스포트랜스퍼라제 유전자이고 [미국 특허 제 7,932,077호]; 및, MCS는 코돈-최적화된 말로닐-CoA 합성효소 유전자이며, 라이조비움 레구미노사룸 bv. 비시에(Rhizobium leguminosarum bv. viciae)3841로부터 유래되고 [미국 특허 출원. 공개 번호 제 2010-0159558-A1호].
균주 Y8672 내의 총 지질 함량 및 조성의 상세한 분석을 위하여, 세포를 총 7일 동안 2단계로 성장시키는 플라스크 검정법을 수행하였다. 분석에 기초하여, 균주 Y8672는 3.3 g/L 건조 세포 중량 ["DCW"]을 생산하였으며, 세포의 총 지질 함량은 26.5 ["TFAs % DCW"]였고, 건조 세포 중량의 퍼센트로서 EPA 함량은 ["EPA % DCW"] 16.4였으며, 지질 프로파일은 하기와 같았고, 여기에서 각 지방산의 농도는 TFAs의 중량 퍼센트로서 ["% TFAs"] 다음과 같았다: 16:0 (팔미테이트)-2.3, 16:1 (팔미트올레산)-- 0.4, 18:0 (스테아르산)-- 2.0, 18:1 (올레산)-- 4.0, 18:2 (LA)-- 16.1, ALA--1.4, EDA--1.8, DGLA--1.6, ARA--0.7, ETrA--0.4, ETA--1.1, EPA--61.8, 기타--6.4.
Y. 리폴리티카 균주 Y8672 바이오매스로부터의 미생물 오일의 발효 및 추출
진탕 플라스크 내에서, 접종물을 Y. 리폴리티카 균주 Y8672 의 냉동 배양물로부터 제조하였다. 인큐베이션 기간 후, 배양물을 사용하여 종균(seed)을 발효기에 접종하였다. 종균 배양이 적절한 타겟 세포 밀도에 도달하면, 이를 그 후 보다 큰 발효기에 접종하는데 사용하였다. 발효는 2-단계 유가식 공정이었다. 제 1 단계에서, 높은 세포 밀도로의 신속한 성장을 촉진하는 조건 하에서, 효모를 배양하였다; 배양 매질은 포도당, 각종 질소 공급원, 미량 금속 및 비타민으로 구성되었다. 제 2 단계에서, 효모를 질소에 대하여 굶주리게 하고, 연속적으로 포도당을 공급하여 지질 및 PUFA 축적을 촉진하였다. 온도(30 내지 32℃로 조절), pH(5 내지 7로 조절), 용존 산소 농도 및 포도당 농도를 비롯한 공정 변수를 표준 운영 조건마다 감시하고 조절하여, 일관된 공정 성능 및 최종 PUFA 오일 품질을 보장하였다.
발효 분야에서의 당업자는 변형이 특이적 야로위아 균주의 오일 프로파일에서, 발효 가동 그 자체, 매질 조건, 가공 파라미터, 규모 증대 (scale-up) 및 배양이 샘플링되는 특정 시점에 따라 일어날 것임을 알 것이다 (예로서, 미국 특허 출원 공개 번호 제 2009-0093543-A1호, 참조).
발효 후, 효소 바이오매스를 탈수시키고 세척하여 염 및 잔류 매질을 제거하고, 리파제 활성을 최소화하였다. 드럼 건조에 따라 수분을 약 5% 미만으로 감소시켜, 미처리된 미생물 바이오매스의 단기간 저장 및 수송 동안 오일 안정성을 보장하였다.
미생물 바이오매스를 그 후 아이소-헥산 용매와 함께 기계적으로 분쇄시켜 바이오매스로부터 EPA-풍부 미생물 오일을 추출하였다. 잔류 바이오매스 (즉, 세포 파편)를 제거하고, 용매를 증발시켜 추출된 오일을 산출하였다. 추출된 오일을, 인산을 이용하여 탈검시키고, 인지질, 미량 금속 및 유리 지방산을 제거하기 위하여 20° 보메(Baume)의 부식제를 이용하여 정제하였다. 실리카 및 점토를 이용한 표백을 이용하여 안료 화합물 및 소량의 산화 생성물을 흡학하였다. 최종 탈취 단계는 휘발성, 향 및 추가 안료 화합물을 스트리핑하여, PUFA를 그의 천연 트라이글리세라이드 형태로 포함하는 비농축된 정제된 미생물 오일을 생성한다.
Y. 리폴리티카 균주 Y8672 로부터의 미생물 오일의 특징화
비농축된 정제된 오일의 지방산 조성을 하기 가스 크로마토그래피 ["GC"] 방법을 이용하여 분석하였다. 구체적으로, 트라이글리세라이드를, 메탄올 중 나트륨 메톡사이드를 이용하여 에스테르 교환반응에 의하여 지방산 메틸 에스테르 ["FAME"]로 전환시켰다. 결과로서 생성된 FAME을, 30-m X 0.25 ㎜ (내경)의 톨루엔/헥산 중에서 희석 (2:3) 후 OMEGAWAX (Supelco) 컬럼이 장착된 Agilent 7890 GC를 이용하여 분석하였다. 오븐 온도를 160℃에서 200℃로, 5℃/분의 속도로, 그 후 200℃에서 250℃로 (10분간 유지), 10℃/분의 속도로 증가시켰다.
GC 분석을 통하여 기록된 FAME 피크는, 알려진 메틸 에스테르 ["ME"]의 체류시간에 비교해서, 그 체류 시간에 의하여 확인되었으며, FAME 피크 면적을, 알고 있는 양의 내부 표준의 면적에 비교하여 정량화하였다 (샘플과 함께 에스테르 교환반응을 통하여 취해진, C15:0 트라이글리세라이드). 따라서, 임의의 지방산 FAME ["mg FAME"]의 근사량(mg)은 하기 식에 따라 계산하였다: (특정 지방산에 대한 FAME 피크의 면적/ 15:0 FAME 피크의 면적) * (내부 표준 C15:0 FAME의 mg). FAME 결과는 그 후, 1.042-1.052의 적당한 분자량 전환 인자로 나눔으로써 대응 지방산의 mg으로 수정될 수 있다.
TFA의 중량 퍼센트로서 각각의 개별 지방산의 양을 요약하는 지질 프로파일을 개별 FAME 피크 면적을 모든 FAME 피크 면적의 합으로 나누고 이에 100을 곱함으로써 결정하였다.
비농축된 Y8672 정제된 오일에 대하여 얻은 GC 분석 결과는 표 3에 나타내었다. 정제된 오일은 58.2 EPA % TFA를 포함하였며, DHA는 검출불가능하였다 (즉, < 0.05%).
Figure pct00006
실시예 2
우레아 부가물 형성을 통한 미생물 오일의 풍부화
본 실시예는, 오일의 중량 퍼센트로 측정하여 78% 이하의 EPA 에틸 에스테르를 포함하고, DHA는 실질적으로 없는 EPA 농축물이, 우레아 부가물 형성을 통하여, 실시예 1로부터의 비농축된 정제된 오일의 풍부화에 따라 수득될 수 있음을 증명하였다.
KOH (20 g)를 320 g의 순수 에탄올 중에 먼저 용해시켰다. 이 용액을 그 후 실시예 1로부터의 1 ㎏의 비농축된 정제된 오일과 혼합하고, 약 60℃에서 4시간 동안 가열하였다. 반응 혼합물을, 완전한 상 분리를 위하여, 분리(Sep) 깔대기 중에서 하룻밤 동안 방해하지 않고 방치하였다. 바닥의 글리세롤 분획물을 제거한 후, 소량의 실리카를 상부 에틸 에스테르 분획물에 첨가하여 과량의 비누를 제거하였다. 에탄올을 진공 하에 약 90℃에서 회전증발시켜, 투명하지만 연갈색의 에틸 에스테르를 수득하였다.
에틸 에스테르 (20 g)를 약 65℃에서 40 g 의 우레아 및 100 g의 에탄올 (90% 수성)과 혼합하였다. 이 혼합물이 투명한 용액으로 될 때까지 이 온도에서 유지시켰다. 이 혼합물을 그 후 냉각시키고 실온에서 약 20시간 동안 유지하여 우레아 결정 및 부가생성물이 형성되도록 하였다. 고형분을 여과하여 없애고, 액체 분획물을 회전 증발시켜서 에탄올 제거하였다. 회수된 에틸 에스테르 분획물을, 200 mL의 더운물로 먼저 세척하고, 그 후 두번째 세척하였다. 수성 분획물을 먼저 따라내기 전에 용액의 pH를 3-4로 조절하였다. 에틸 에스테르 분획물을 그 후 건조시켜 남아있는 물을 제거하였다.
에틸 에스테르 분획물 중 지방산 에틸 에스테르 ["FAEE"] 농도를 결정하기 위하여, 톨루엔/헥산 (2:3) 중에 희석한 직후, FAME 농도를 결정하기 위하여 실시예 1에서 앞서 기재된 것과 같이 동일한 GC 조건 및 계산을 이용하여, FAEE를 분석하였다. 방법에서 변경은 단지: i) C23:0 EE를 C15:0 대신 내부 표준물로서 이용하였다는 것; 및, ii) 분자량 전환 인자 1.042-1.052가 필요하지 않았다는 것이었다.
그러나, EPA 에틸 에스테르는 ["EPA-EE"] 상기에서 약간 변경된 절차에 투입되었다. 구체적으로, 알고 있는 농도 및 순도의 참조 EPA-EE 표준을, 분석 샘플 중에서 예측되는 것과 대략적으로 동일한 양의 EPA-EE 및 동량의 C23:0 EE 내부 표준을 포함하도록 제조하였다. 샘플 중 EPA-EE (mg)의 정확한 양을 식에 따라 계산하였다: (EPA-EE 피크의 면적/ C23:0 EE 피크의 면적) x (보정 표준 중 C23:0 EE 피크의 면적/보정 표준 중 EPA-EE 피크의 면적) x (보정 표준 중 mg EPA-EE ). 모든 내부 및 참조 표준은 Nu-Chek Prep, Inc.로부터 수득하였다.
이러한 방식으로, FAEE 농도를 풍부화된 오일 분획물, 즉 EPA 농축물 중에서 결정하였다. 구체적으로, 우레아 부가물 형성을 통한 비농축된 정제된 오일의 풍부화는, 오일의 중량 퍼센트로 측정하여, 77% EPA 에틸 에스테르를 포함하고, DHA는 실질적으로 없는 EPA 농축물을 생성하였으며, 이는 표 4에 나타낸 바와 같다.
Figure pct00007
당업자는, 오일의 중량 퍼센트로 측정하여 77% EPA 에틸 에스테르를 포함하고, DHA는 실질적으로 없는 EPA 농축물이, 당업자에게 공지된 수단을 이용하여, 쉽게 전환되어 대체적인 형태의 EPA 농축물(즉, EPA 에틸 에스테르는 유리 지방산, 트라이아실글리세롤, 메틸 에스테르, 및 이의 조합으로 전환될 수 있을 것이다)을 산출할 수 있을 것임을 이해할 것이다). 따라서, 77% EPA 에틸 에스테르가 글리세롤 분해를 통하여 트라이글리세라이드로 재-에스테르화될 수 있어서,그 결과 오일의 중량 퍼센트로 측정하여, 적어도 70중량% EPA 에틸 에스테르를 포함하고, DHA는 실질적으로 없는 트라이글리세라이드 형태의 EPA 농축물이 결과로서 생성된다.
실시예 3
액체 크로마토그래피를 통한 미생물 오일의 풍부화
본 실시예는 오일의 중량 퍼센트로 측정하여, 95.4%의 EPA 에틸 에스테르를 포함하고, DHA는 실질적으로 없는 EPA 농축물이, 액체 크로마토그래피 법을 이용하여, 실시예 1로부터의 비농축된 정제된 오일의 풍부화에 따라 수득될 수 있을 것임을 증명한다.
실시예 1로부터의 비농축된 정제된 오일을, 일부 적은 변경을 하여 (즉, 기본 촉매로서 수산화칼륨대신 나트륨 에톡사이드를 사용) 실시예 2에 기재된 것과 유사한 방법을 이용하여 에틸 에스테르로 에스테르 교환반응시켰다.
에틸 에스테르를 그 후 Equateq (Isle of Lewis, Scotland)에 의하여, 그의 액체 크로마토그래피 정제 기술을 이용하여 풍부화하였다. 다양한 정도의 풍부화를 달성하였다 (예로서, 하기, 샘플 #1 및 샘플 #2의 예시적인 데이터 참조). 이에 따라, 액체 크로마토그래피를 통한 비농축된 정제된 오일의 풍부화로, 오일의 중량 퍼센트로 측정하여, 95.4% 이하의 EPA 에틸 에스테르를 포함하고, DHA는 실질적으로 없는 EPA 농축물을 산출하였으며, 이는 표 5에 나타낸 바와 같다.
Figure pct00008
당업자는, 오일의 중량 퍼센트로 측정하여, 82.8%의 EPA 에틸 에스테르 또는 95.4%의 EPA 에틸 에스테르를 포함하고, DHA는 실질적으로 없는 EPA 농축물이, 당업자에게 공지된 수단을 이용하여, 쉽게 전환되어 대체적인 형태의 EPA 농축물(즉, EPA 에틸 에스테르는 유리 지방산, 트라이아실글리세롤, 메틸 에스테르, 및 이의 조합으로 전환될 수 있을 것이다)을 산출할 수 있을 것임을 이해할 것이다. 따라서,예로서, 82.8%의 EPA 에틸 에스테르 또는 95.4%의 EPA 에틸 에스테르는 글리세롤 분해를 통하여 트라이글리세라이드로 재-에스테르화될 수 있어서, 그 결과 오일의 중량 퍼센트로 측정하여, 적어도 70중량% EPA 에틸 에스테르를 포함하고, DHA는 실질적으로 없는 트라이글리세라이드 형태의 EPA 농축물이 결과로서 생성된다.
실시예 4
초임계 유체 크로마토그래피를 통한 미생물 오일의 풍부화
본 실시예는 오일의 중량 퍼센트로 측정하여, 89.8% 이하의 EPA 에틸 에스테르를 포함하고, DHA는 실질적으로 없는 EPA 농축물이, 초임계 유체 크로마토그래피 ["SFC"] 방법을 이용하여, 실시예 1로부터의 비농축된 정제된 오일의 풍부화하는 경우 수득될 수 있을 것임을 증명한다.
실시예 1로부터의 비농축된 정제된 오일을, 기본 촉매로서 나트륨 에톡사이드를 사용하여 에틸 에스테르로 에스테르교환 반응시키고, 그 후 초임계 CO2 중에 불용성인 화합물들을 제거하기 위하여 흡착 컬럼을 통하여 가공하였다. 가공된 에틸 에스테르 오일을 그 후 K.D. Pharma (Bexbach, Germany)의 초임계 크로마토그래피 기술을 이용하여 정제하였다. 다양한 정도의 풍부화를 달성하였다 (예로서, 하기, 샘플 #1 및 샘플 #2의 예시적인 데이터 참조). 이에 따라, SFC를 통한 비농축된 정제된 오일의 풍부화로, 오일의 중량 퍼센트로 측정하여, 85% 및 89.8% 의 EPA 에틸 에스테르를 갖고, DHA는 실질적으로 없는 EPA 농축물을 산출하였으며, 이는 표 6에 나타낸 바와 같다.
Figure pct00009
당업자는, 오일의 중량 퍼센트로 측정하여, 85% EPA 에틸 에스테르 또는 89.8%의 EPA 에틸 에스테르를 포함하고, DHA는 실질적으로 없는 EPA 농축물이, 당업자에게 공지된 수단을 이용하여, 쉽게 전환되어 대체적인 형태의 EPA 농축물(즉, EPA 에틸 에스테르는 유리 지방산, 트라이아실글리세롤, 메틸 에스테르, 및 이의 조합으로 전환될 수 있을 것이다)을 산출할 수 있을 것임을 이해할 것이다). 따라서, 예로서, 85%의 EPA 에틸 에스테르 또는 89.8%의 EPA 에틸 에스테르는 글리세롤 분해를 통하여 트라이글리세라이드로 재-에스테르화될 수 있어서, 그 결과 오일의 중량 퍼센트로 측정하여, 적어도 70중량% EPA 에틸 에스테르를 포함하고, DHA는 실질적으로 없는 트라이글리세라이드 형태의 EPA 농축물이 결과로서 생성된다.
실시예 5
총 지방산 [" TFA "] 중 56.1%의 EPA 를 포함하는 미생물 오일의 제조
본 실시예는 EPA의 생산을 위하여 조작된, 재조합 야로위아 리폴리티카 세포들의 미생물 바이오매스로부터 수득된 미생물 오일의 분리를 기재한다. 이 미생물 오일을 그 후 실시예 6에서 하기 기재되는 바와 같이, 분별 증류에 의하여 풍부화하였다.
구체적으로, Y. 리폴리티카 균주 Z1978을, 약 58.7 EPA % TFA의 생산이 가능하게 되도록 재조합적으로 조작하고, 2-단계 유가식 공정을 이용하여 배양하였다. 미생물 오일을 그 후 건조를 통하여 바이오매스로부터 단리시키고, 추출 (압출, 펠렛화 및 초임계 유체 추출의 조합을 통한), 및 짧은 경로 증류를 통하여 정제하여, 56.1 EPA % TFA를 포함하는 비농축된, 트라이글리세라이드-풍부 SPD-정제 오일을 산출하였다.
야로위아 리폴리티카 균주 Y9502의 유전형
균주 Y9502의 생성은 미국 특허 출원 공개 제 2010-0317072-A1호에 기재되어 있다. 야로위아 리폴리티카 ATCC #20362로부터 유래된 균주 Y9502는 델타-9 연장효소/델타-8 불포화효소 경로의 발현을 통한 총 지질에 비하여 57.0%의 EPA를 생산할 수 있다 (도 2).
야생형 야로위아 리폴리티카 ATCC #20362에 비하여 균주 Y9502의 최종 유전형은 Ura +, Pex3 -, 미지 1-, 미지 2-, 미지 3-, 미지 4-, 미지 5-, 미지 6-, 미지 7-, 미지 8-, 미지 9-, 미지 10-, YAT1::ME3S::Pex16, GPD::ME3S::Pex20, YAT1::ME3S::Lip1, FBAINm::EgD9eS::Lip2, EXP1::EgD9eS::Lip1, GPAT::EgD9e::Lip2, YAT1::EgD9eS::Lip2, FBAINm::EgD8M::Pex20, EXP1::EgD8M::Pex16, FBAIN::EgD8M::Lip1, GPD::EaD8S::Pex16 (2개 복제물), YAT1::E389D9eS/EgD8M::Lip1, YAT1::EgD9eS/EgD8M::Aco, FBAINm::EaD9eS/EaD8S::Lip2, GPD::FmD12::Pex20, YAT1::FmD12::Oct, EXP1::FmD12S::Aco, GPDIN::FmD12::Pex16, EXP1::EgD5M::Pex16, FBAIN::EgD5SM::Pex20, GPDIN::EgD5SM::Aco, GPM::EgD5SM::Oct, EXP1::EgD5SM::Lip1, YAT1::EaD5SM::Oct, FBAINm::PaD17::Aco, EXP1::PaD17::Pex16, YAT1::PaD17S::Lip1, YAT1::YlCPT::Aco, YAT1::MCS::Lip1, FBA::MCS::Lip1, YAT1::MaLPAAT1S::Pex16.
실시예 1에서 정의되지 않은 약어들은 다음과 같았다: EaD9eS/EgD8M은, 유글레나 아나바에나 델타-9 연장효소로부터 유래된, 코돈-최적화된 델타-9 연장효소 유전자 ("EaD9eS")를 [미국 특허 제7,794,701호] 델타-8 불포화효소 "EgD8M" (상기 참조) [미국 특허 출원 공개 번호 제 2008-0254191-A1호]에 연결하여 생성된 DGLA 생성효소; 및 MaLPAAT1S는, 모르티에렐라 알피나 [미국 특허 제 7,879,591호]로부터 유래된, 코돈-최적화된 라이소포스파티드산 아실트랜스퍼라제 유전자이다.
균주 Y9502 내의 전체 지질 함량 및 조성의 상세한 분석을 위하여, 세포를 총 7일 동안 2단계로 성장시키는 플라스크 검정법을 행하였다. 분석에 기초하여, 균주 Y9502는 3.8 g/L 건조 세포 중량 ["DCW"]을 생산하였으며, 세포의 총 지질 함량은 37.1 ["TFAs % DCW"]였고, EPA 함량은 건조 세포 중량의 퍼센트로서 ["EPA % DCW"] 21.3이었고, 지질 프로파일은 하기와 같았으며, 여기에서 각 지방산의 농도는 TFA 의 중량 퍼센트이다["% TFAs"]: 16:0(팔미테이트)-2.5, 16:1(팔미톨레산)-0.5, 18:0(스테아르산)-2.9, 18:1(올레산)-5.0, 18:2(LA)-12.7, ALA-0.9, EDA-3.5, DGLA-3.3, ARA-0.8, ETrA-0.7, ETA-2.4, EPA-57.0, 기타-7.5.
균주 Y9502로부터의 야로위아 리폴리티카 균주 Z1978의 생성
균주 Y9502로부터의 균주 Z1978의 개발은 본 명세서에 참고문헌으로서 통합된, 미국 특허 출원 번호 제 13/218591호 (변호사 일람 번호 CL4783USNA, 2011년 8월 26일 출원됨) 및 제 13/218708호 (변호사 일람 번호 CL5411USNA, 2011년 8월 26일)에 기재되어 있다(본 명세서 중 도 2 참조).
구체적으로, Y9502 균주 중 Ura3유전자를 분쇄하기 위하여, 작제물 pZKUM (도 3A; 서열번호 1; 표 15, 미국 특허 출원 공개 번호 제 2009-0093543-A1호 중)이, Ura3 돌연변이 유전자를 균주 Y9502의 Ura3 유전자 내로 통합시키는데 사용되었다. 형질전환은 본 명세서에 참고문헌으로서 통합된, 미국 특허 출원 공개 번호 제2009-0093543-A1호의 방법에 따라 수행되었다. 총 27개의 형질전환체 (8개의 형질전환체를 포함하는 제 1군, 8개의 형질전환체를 포함하는 제 2군 및 11개의 형질전환체를 포함하는 제 3군)를 5-플루오로오로트산 (fluoroorotic acid) ["FOA"] 플레이트 (FOA 플레이트는 리터 당 20 g의 포도당, 6.7 g의 효모 질소 베이스, 75 mg의 우라실, 75 mg의 유리딘 및 (공급자로부터 받은 각 배치내에 변동이 있으므로) 100 mg/L 내지 1000 mg/L 범위의 농도에 대한 FOA 활성 실험에 근거한, 적량의 FOA (Zymo Research Corp., Orange, CA)를 포함한다) 상에서 배양하였다. 추가의 실험에 의해, 오직 제3군의 형질전환체만이 실제 Ura- 표현형을 갖는 것으로 결정되었다.
지방산["FA"] 분석을 위하여, 세포를 원심분리에 의해 수집하고, 지질을 문헌[Bligh, E. G. & Dyer, W. J. (Can . J. Biochem . Physiol., 37:911-917 (1959))]에 기재된 바와 같이 추출하였다. 지방산 메틸 에스테르["FAME"]를 소듐 메톡시드를 사용한 지질 추출물의 에스테르 교환에 의해 제조하고(문헌[Roughan, G., and Nishida I., Arch Biochem Biophys., 276(1):38-46 (1990)]), 이어서 30-m X 0.25 ㎜(내경) HP-INNOWAX(Hewlett-Packard) 컬럼이 장착된 Hewlett-Packard 6890 GC로 분석하였다. 오븐 온도는 170℃분 내지 (25분 유지) 185℃로 3.5℃/분의 속도였다.
직접적인 염기 에스테르 교환을 위하여, 야로위아 세포(0.5 mL 배양물)를 수집하고, 증류수에 1회 세정하고, 스피드-백(Speed-Vac)에서 5 내지 10분 동안 진공 하에 건조시켰다. 소듐 메톡시드(1%의 100 ㎕) 및 알고 있는 양의 C15:0 트라이아실글리세롤(C15:0 TAG; 카탈로그 번호 T-145, Nu-Check Prep, Elysian, MN)을 샘플에 첨가하고, 그 후 샘플을 50℃에서 30분 동안 와동(vortexed) 및 진동시켰다. 3 방울의 1 M NaCl 및 400 ㎕ 헥산을 첨가한 후, 샘플을 와동 및 스핀시켰다. 상부층을 제거하고 GC 분석하였다 (상기 참조). GC 분석을 통해 기록된 FAME 피크를, 지질 프로파일이었던 실시예 1의 방법에 따라 확인하고 정량화하였다.
다르게는, 문헌 [Lipid Analysis, William W. Christie, 2003]에 기재된, 기본-촉매화된 에스테르 교환반응 방법의 변형을 이용하여, 발효 또는 플라스크 샘플로부터의 브로쓰(broth) 샘플의 일상적 분석에 사용하였다. 구체적으로, 브로쓰 샘플을 실온의 물에서 빠르게 해동시킨 다음, 0.22 ㎛ Corning(등록 상표) Costar(등록 상표) Spin-X(등록 상표) 원심분리용 튜브 필터(카달로그 번호 8161)가 있는 타르를 칠한 2 mL 미량 원심분리용 튜브에 칭량해 넣었다(0.1 mg으로). 이전에 결정된 DCW에 따라 시료(75 - 800 ㎕)를 사용하였다. 에펜도르프(Eppendorf) 5430 원심분리기를 사용하여, 시료를 14,000 rpm에서 5 내지 7분 동안 또는 브로쓰를 제거하는데 필요한 만큼 원심분리하였다. 필터를 제거하고, 액체를 빼내고, 약 500 ㎕의 탈이온수를 필터에 첨가하여 시료를 세정하였다. 물을 제거하기 위한 원심분리 후에, 필터를 다시 제거하고, 액체를 빼내고, 필터를 다시 삽입하였다. 그 다음, 튜브를 원심분리기에 다시 삽입하고, 이번에는 상측을 개방하여 약 3 내지 5분 동안 건조시켰다. 이어서, 필터를 튜브의 대략 절반에서 절단하고, 새로운 2 mL 둥근 바닥 에펜도르프 튜브(카달로그 번호 22 36 335-2)에 삽입하였다.
필터를 오직 절단된 필터 용기의 가장자리와 접촉하며 시료 또는 필터 물질과는 접촉하지 않는 적절한 도구를 사용하여 튜브의 바닥으로 압축시켰다. 톨루엔 중의 공지되어 있는 양의 C15:0 TAG(상기)를 첨가하고, 새로 제조한 메탄올 용액 중의 1% 소듐 메톡시드 500 ㎕를 첨가하였다. 시료 펠렛을 적절한 도구를 사용하여 철저히 부수고, 튜브를 닫고, 30분 동안 50℃ 히트 블록(heat block)(VWR 카달로그 번호 12621-088)에 배치하였다. 이어서, 튜브가 적어도 5분 동안 냉각되게 하였다. 이어서, 헥산 400 ㎕ 및 수용액 중의 1 M NaCl 500 ㎕를 첨가하고, 튜브를 6초 동안 2회 와동시키고, 1분 동안 원심분리하였다. 대략 150 ㎕의 상(유기)층을 인서트(insert)가 있는 GC 바이얼에 두고, GC로 분석하였다.
GC 분석을 통해 기록된 FAME 피크를 공지되어 있는 지방산의 피크와 비교시 그들의 정체 시간에 의해 확인하고, FAME 피크 면적을 공지되어 있는 양의 내부 표준물질(C15:0 TAG)의 피크 면적과 비교함으로써 정량화하였다. 따라서, 임의의 지방산 FAME의 근사량(㎍)["FAME ㎍"]은 식:(특정 지방산에 대한 FAME 피크의 면적/표준물질 FAME 피크의 면적) * (표준물질 C15:0 TAG의 ㎍)에 따라 계산하고, 임의의 지방산의 양(㎍)["FA ㎍"]은 식: (특정 지방산에 대한 FAME 피크의 면적/표준물질 FAME 피크의 면적) * (표준물질 C15:0 TAG의 ㎍) * 0.9503에 따라 계산하는데, 이는 1 ㎍의 C15:0 TAG가 0.9503 ㎍의 지방산에 균등하기 때문이다. 0.9503 전환 인자가 0.95 내지 0.96 범위인 대부분의 지방산에 대하여 결정된 값의 근사치임을 주목해야 한다.
TFA의 중량%로서 각각의 개별 지방산의 양을 요약하는 지질 프로파일을 개별 FAME 피크 면적을 모든 FAME 피크 면적의 합으로 나누고 이에 100을 곱함으로써 결정하였다.
이러한 방식으로, GC 분석은 3개 군의 pZKUM-형질전환체 #1, #3, #6, #7, #8, #10 및 #11에서 TFAs 중, 각각 28.5%, 28.5%, 27.4%, 28.6%, 29.2%, 30.3% 및 29.6%의 EPA가 존재함을 나타내었다. 이들 7개의 균주를 각각 균주 Y9502U12, Y9502U14, Y9502U17, Y9502U18, Y9502U19, Y9502U21 및 Y9502U22(종합적으로, Y9502U)로 명명하였다.
하나의 델타-9 불포화효소 유전자, 하나의 콜린-포스페이트 시티딜릴-트랜스퍼라제 유전자 및 하나의 델타-9 연장효소 돌연변이 유전자가 균주 Y9502U의 야로위아 YALI0F32131p 유전자좌(GenBank 수탁 번호 XM_506121) 내로 통합되도록 작제물 pZKL3-9DP9N(도 3B, 서열 번호 2)을 생성하였다. pZKL3-9DP9N 플라스미드에는 하기의 성분이 포함되어 있다:
Figure pct00010
pZKL3-9DP9N 플라스미드를 AscI/SphI로 분해한 다음, 균주 Y9502U17의 형질전환을 위해 사용하였다. 형질전환체 세포들을 최소 배지 ["MM"]상에 플레이트하고, 3 내지 4일 동안 30℃에서 유지하였다 (최소 배지는 리터 당: 20 g의 포도당, 1.7 g의 효모 질소 베이스(아미노산 없음), 1.0 g의 프롤린을 포함하였으며, pH는 6.1 (조정 필요 없음)). 단일의 콜로니를 MM 플레이트 상으로 다시 스트리킹한 다음, 30℃에서 액체 MM으로 접종하고, 250 rpm/분으로 2일 동안 진탕하였다. 세포를 원심분리하여 채집하고, 고 포도당 매질 ["HGM"] 중에 재현탁시킨 후, 250 rpm/분에서 5 일 동안 진탕시켰다 (고 포도당 매질은: 80 포도당, 2.58 g KH2PO4 및 5.36 g K2HPO4을 포함하였으며, pH 7.5 (조정 필요 없음)). 세포를 상기 지방산 분석으로 처리하였다.
GC 분석에 의해, pZKL3-9DP9N을 갖는 선택된 96개의 Y9502U17 균주의 대부분이 TFA 중 50 내지 56% EPA를 생성하는 것으로 나타났다. TFA 중 약 59.0%, 56.6%, 58.9%, 56.5%, 및 57.6%의 EPA를 생산한 5개 균주 (즉, #31, #32, #35, #70 및 #80)를 각각, Z1977, Z1978, Z1979, Z1980 및 Z1981로 명명하였다.
야생형 야로위아 리폴리티카 ATCC #20362에 대하여 이들 pZKL3-9DP9N 형질전환체 균주의 최종 유전형은 다음과 같았다: Ura +, Pex3 -, 미지 1-, 미지 2-, 미지 3-, 미지 4-, 미지 5-, 미지 6-, 미지 7-, 미지 8-, 미지 9-, 미지 10-, 미지 11-, YAT1::ME3S::Pex16, GPD::ME3S::Pex20, YAT1::ME3S::Lip1, FBAINm::EgD9eS::Lip2, EXP1::EgD9eS::Lip1, GPAT::EgD9e::Lip2, YAT1::EgD9eS::Lip2, YAT::EgD9eS-L35G::Pex20, FBAINm::EgD8M::Pex20, EXP1::EgD8M::Pex16, FBAIN::EgD8M::Lip1, GPD::EaD8S::Pex16 (2개 복제물), YAT1::E389D9eS/EgD8M::Lip1, YAT1::EgD9eS/EgD8M::Aco, FBAINm::EaD9eS/EaD8S::Lip2, GPDIN::YlD9::Lip1, GPD::FmD12::Pex20, YAT1::FmD12::Oct, EXP1::FmD12S::Aco, GPDIN::FmD12::Pex16, EXP1::EgD5M::Pex16, FBAIN::EgD5SM::Pex20, GPDIN::EgD5SM::Aco, GPM::EgD5SM::Oct, EXP1::EgD5SM::Lip1, YAT1::EaD5SM::Oct, FBAINm::PaD17::Aco, EXP1::PaD17::Pex16, YAT1::PaD17S::Lip1, YAT1::YlCPT::Aco, YAT1::MCS::Lip1, FBA::MCS::Lip1, YAT1::MaLPAAT1S::Pex16, EXP1::YlPCT::Pex16.
균주 Z1977, Z1978, Z1979, Z1980 및 Z1981에서의 YALI0F32131p 유전자좌(GenBank 수탁 번호 XM_50612)의 넉아웃(knockout)은 pZKL3-9DP9N을 이용한 형질전환에 의해 생성되는 이들 임의의 EPA 균주에서 확인되지 않았다.
균주 Z1977, Z1978, Z1979, Z1980 및 Z1981의 YPD 플레이트로부터의 세포들을 배양하고, 하기 방법에 따라, 총 지질 함량 및 조성에 대하여 분석하였다.
Y. 리폴리티카의 특정 균주 내의 총 지질 함량 및 조성의 구체적인 분석을 위하여, 플라스크 분석을 다음과 같이 수행하였다. 구체적으로, 새로 스트리크된 세포의 한 원을 3 mL 발효 매질 ["FM"] 매질 내로 접종하고 30℃ 및 250 rpm에서 하룻밤 동안 배양하였다(발효 매질은 리터 당: 6.70 g/L 효모 질소 베이스, 6.00 g KH2PO4, 2.00 g K2HPO4, 1.50 g MgSO4*7H2O, 20 g 포도당 및 5.00 g 효모 추출물 (BBL)을 포함하였다). OD600nm를 측정하고, 세포의 분취물을 125 mL 플라스크에서 25 mL FM 배지 중에 최종 0.3의 OD600nm로 첨가하였다. 250 rpm 및 30℃의 진탕기 인큐베이터에서 2일 후에, 6 mL의 배양물을 원심분리에 의해 수집하고, 125 mL 플라스크 내의 25 mL HGM에 재현탁시켰다. 250 rpm 및 30℃의 진탕기 인큐베이터에서 5일 후에, 1 mL 분취물을 지방산 분석(상기 참조)을 위해 사용하고, 건조 세포 중량["DCW"] 결정을 위하여 10 mL을 건조시켰다.
DCW 결정을 위하여, 10 mL 배양물을 베크만(Beckman) GS-6R 원심분리기 내의 베크만 GH-3.8 로터에서 4000 rpm에서 5분 동안 원심분리함으로써 수집하였다. 펠렛을 25 mL의 물에 재현탁시키고, 상술된 바와 같이 다시 수집하였다. 세정된 펠렛을 20 mL의 물에 재현탁시키고, 사전-칭량된 알루미늄 팬으로 옮겼다. 세포 현탁액을 80℃의 진공 오븐에서 하룻밤 건조시켰다. 세포의 중량 을 결정하였다.
세포의 전체 지질 함량["TFA % DCW"]을 계산하고, TFA의 중량 퍼센트["% TFA"]로서의 각각의 지방산의 농도 및 건조 세포 중량의 퍼센트로서의 EPA 함량["EPA % DCW"]을 표로 만든 데이터와 함께 고려하였다.
이에 따라, 하기 표 8에, 플라스크 분석에 의하여 결정되는 바와 같이, 균주 Z1977, Z1978, Z1979, Z1980 및 Z1981의 총 지질 함량 및 조성을 요약하였다. 구체적으로, 이 표에서 세포의 총 건조 세포 중량 ["DCW"], 세포의 총 지질 함량 ["TFAs % DCW"], TFA 중량 퍼센트로서 각 지방산의 농도 ["% TFAs"] 및 건조 세포 중량의 퍼센트로서 EPA 함량 ["EPA % DCW"]을 요약하였다.
Figure pct00011
균주 Z1978 을 이후 부분 게놈 서열분석에 투입하였다(미국 특허 출원 번호 제13/218591호). 이 작업은 4개 (6개 아님) 델타-5 불포화효소 유전자가 야로위아 게놈 내로 통합되었음을 결정하였다 (즉, EXP1::EgD5M::Pex16, FBAIN::EgD5SM::Pex20, EXP1::EgD5SM::Lip1, 및YAT1::EaD5SM::Oct).
건조, 미처리된 Y. 리폴리티카 균주 Z1978 바이오매스의 압출 및 펠렛화를 통한 발효 및 분쇄
실시예 1에 기재된 바와 같이, Y. 리폴리티카 균주 Z1978 배양물을 발효시키고, 미생물 바이오매스를 수확 및 건조하였다. 건조 및 미처리된 바이오매스를 그 후 이축 압출기로 공급하였다. 구체적으로, 바이오매스 및 15% 의 규조토(Celatom MN-4 또는 Celite 209, EP Minerals, LLC, Reno, NV)의 혼합물을 예비혼합한 후, SK-40㎜ MC 이축 압출기(Coperion Werner & Pfleiderer, Stuttgart, Germany)에 45.5 ㎏/시간의 속도로 공급하였다. 26.5% 수크로스로 제조된 물/수크로스 용액을 그 후 압출기의 분쇄 영역에 147 mL/분의 속도로 주입하였다. 압출기를 20-23의 % 토르크(torque) 범위에서 280 rpm에서 조작하였다. 결과의 분쇄된 효모 분말을 최종 수냉된 배럴통(barrel) 내에서 35℃에서 냉각시켰다. 그 후, 축축한 압출된 분말을, 직경 1㎜ 및 두께 1㎜ 스크린 다중-구경돔 다이(multi-bore dome die)로 조립되고 82 RPM으로 설정된 LCI 돔 과립화기(Dome Granulator) 모델명 TDG-80 (LCI Corporation, Charlotte, NC) 내로 공급하였다. 압출물은 455-600 ㎏/시간 (건조된 속도로서)에서 형성되었다. 100℃로 유지되고, 분당 32564L의 공기흐름을 갖는 0.50 ㎡의 건조 영역 및 (1150 입방피트/분 ["scfm"]) 및 18℃에서, 14158-16990 L/분 (500-600 scfm)으로 추정되는 공기 흐름으로 작동하는 0.24 ㎡의 냉각 영역이 있는 진동 유체층 건조기(FBP-75, Carman Industries, Inc., Jeffersonville, IN) 내에서 샘플을 건조시켰다. 약 1 ㎜ 직경 X 6 내지 10 ㎜ 길이의 건조된 펠렛은 25-30℃ 범위에서, O'Haus 수분 분석기(Parsippany, NJ) 상에서 측정시 최종 수분 함량 5-6%로, 건조기에서 배출되었다.
압출된 효모 바이오매스의 오일 추출
추출된 효모 펠렛을, 비농축된 추출된 오일을 생산하기 위하여, 추출 용매로서 초임계 유체 상 이산화탄소 (CO2)를 이용하여 추출하였다. 구체적으로, 효모 펠렛을 320 L 스테인레스강 추출 용기에 채워넣고, 폴리에스테르 폼(foam) 여과 매팅(matting)의 플러그들 (Aero-Flo Industries, Kingsbury, IN) 사이에 충전시켰다. 용기를 밀봉한 후, CO2를 열교환기(예열기)를 통하여 상용 압축기 (Pressure Products Industries, Warminster, PA)에 의하여 계량하고, 분쇄된 효모의 펠렛으로부터의 비농축된 추출된 오일을 추출하기 위하여 수직 추출 용기 내로 공급하였다. 추출 온도는 예열기에 의하여 제어되었으며, 추출 압력은 추출 용기 및 분리기 용기 사이에 위치된 자동화 제어 밸브 (Kammer)를 이용하여 유지시켰다. CO2 및 오일 추출물은 이 제어 밸브를 통하여 더욱 낮은 압력으로 팽창되었다. 오일 추출물은, 분리기 내 침전물로서, 팽창된 용액으로부터 수집되었다. 분리기 내 팽창된 CO2 상의 온도는, 분리기의 업스트림에 위치된 추가의 열 교환기의 이용에 의하여 제어되었다. 이러한 보다 저압의 CO2 스트림은 분리기 용기의 최상부에서 배출되고, 여과기, 응축기 및 질량 유량계를 통과하여 압축기로 재순환되었다. 오일 추출물은 분리기로부터 주기적으로 배출되고 생산물로서 수집되었다.
추출 용기를 먼저, 약 150 ㎏의 추출된 효모 펠렛들로 충전시켰다. 그 후 초임계 유체 CO2를 34.5 MPa (5000 psig (345바)), 55℃에서, 출발 효모 펠렛의 ㎏당 40 내지 50 ㎏ CO2 범위의 용매-대-공급물 비를 이용하여 비농축된 추출된 오일을 펠렛으로부터 추출하였다. 대략적으로 37.5 ㎏의 비농축된 추출된 오일을, 2개의 산화방지제, 즉 Covi-ox T70 (Cognis, Mississauga, Canada) 및 Dadex RM (Nealanders, Mississauga, Canada)가 각각 약 1000 ppm 첨가된, 분리기 용기로부터 수집하였다.
SPD 조건 하에서 증류
비농축된 추출된 오일을 탈기시키고, 그 후, 잔류수를 제거하기 위하여 12 ㎏/시간의 공급 속도를 이용하여 15.2 ㎝ (6")의 분자 증류기(POPE Scientific, Saukville, WI) 를 통과시켰다. 증발기 및 응축기의 표면 온도를 140℃ 및 15℃로 각각 설정하였다. 진공을1999.8 Pa (15 토르)에서 유지하였다.
탈수된 추출된 오일을 두번째로 12 ㎏/시간의 공급 속도로 분자 증류기로 통과시켜, 원하지 않는 보다 낮은 분자량의 화합물들, 예컨대 증류액 중 에르고스테롤 및 유리 지방산을 제거하였다. 진공을 0.13 Pa (1 밀리토르)로 낮추고, 증발기의 표면 온도를 240℃ 내지 270℃에서 유지하였다. 비농축된 추출된 오일 중 스테롤에 비하여 감소된 스테롤을 갖는 트라이아실글리세롤-함유 분획물(즉, SPD-정제된 오일)이 수득되었다. 비농축된 SPD-정제된 오일을 포장 전 40℃ 미만으로 냉각시켰다.
야로위아 리폴리티카 균주 Z1978 로부터의 SPD -정제된 오일의 특징화
균주 Z1978로부터의 비농축된 SPD-정제된 오일의 지방산 조성을 분석하고, 이어서 에스테르 교환반응을 실행하였으며, 이는 실시예 1의 방법에 따랐다. SPD-정제된 오일은 56.1 EPA % TFA를 포함하였으며, DHA는 검출불가능하였으며 (즉, < 0.05%), 이는 하기 표 9에 나타낸 바와 같았다.
Figure pct00012
실시예 6
분별 증류를 통한 미생물 오일의 풍부화
본 실시예는 오일의 중량 퍼센트로 측정하여, 74%의 EPA 에틸 에스테르를 포함하고, DHA는 실질적으로 없는 EPA 농축물이, 분별 증류법을 이용하여, 실시예 5로부터의 비농축된 SPD-정제된 오일의 풍부화에 따라 수득될 수 있을 것임을 증명한다.
실시예 5로부터의 이십오 (25) ㎏ 의 비농축된 미생물 오일을 50 L 유리 플라스크에 첨가하였다. 7.9 ㎏의 절대 에탄올 및 580 g의 나트륨 에톡사이드 (에탄올 중 21%)를 그 후 플라스크에 첨가하였다. 혼합물을 ~85℃에서 최소 30분 동안 가열하여 환류시켰다. 반응을 박층 크로마토그래피 방법에 의하여 모니터링하고, 오일의 희석된 샘플로 실리카 플레이트 상에 점을 찍고, 아세트산/헥산/에틸 에테르 용매 혼합물을 이용하여 분리하였다. 미반응된 TAG로 이루어진 점을 요오드 색소로 검출하였다. 부재 또는 거의 검출불가능한 점은 반응의 완료를 나타내는 것으로 여겨졌다. 반응 종료점에 도달된 후, 혼합물을 50℃ 미만으로 냉각시키고, 상분리시켰다. 글리세롤-함유 바닥층을 분리시키고 폐기하였다. 상부 유기층을 2.5 L의 5% 시트르산으로 세척하고, 회수된 유기층을 그 후 5 L의 15% 수성 황산나트륨으로 세척하였다. 수성상을 다시 폐기하고, 에틸 에스테르 상을 ~60℃의 회전증발기에서 에탄올과 함께 증류시켜 잔류수를 제거하였다. 약 25 ㎏ 의 에틸 에스테르 형태의 오일을 회수하였다.
에틸 에스테르를 그 후 10.2 ㎝ (4")의 하이브리드 와입드-필름(wiped-film) 및 분획화 시스템 (POPE Scientific, Saukville, WI)에, 5 ㎏/시간의 공급 속도로 공급하여 EPA 에틸 에스테르를 풍부화하였다. 증발기 온도를 62.7 Pa (0.47 토르) 진공 하에서, 약 275℃로 설정하였다. 충전된 컬럼의 헤드(head) 온도는 약 146℃이었다. 보다 저분자량의 에틸 에스테르, 주로 C18은 오버헤드(overhead)로부터의 경질 분획물로서 제거되었다. 추출된 EPA 에틸 에스테르는 중질 분획물로서 회수되었으며, 주로 착색 및 중합된 것을 제거하기 위하여 두번째 증류하였다. 제 2 증류는 20 ㎏/시간의 공급 속도로 15.2 ㎝ (6") 분자 증류기 (POPE Scientific, Saukville, WI)에서 수행하였다. 증발기를, 내부 응축기 온도 세팅을 약 10℃로 하고, 진공은 1.33 Pa (0.01 토르)로 하여, 약 205℃에서 작동시켰다. 약 7-10 중량%의 에틸 에스테르를 제거하여, 투명하고 밝은 색상의 EPA 농축물을 산출하였다. 최종 EPA 농축물은 오일의 중량 퍼센트로 측정하여 74%의 EPA 에틸 에스테르를 포함하였으며, 실질적으로 DHA는 없었다.
당업자는, 오일의 중량 퍼센트로 측정하여, 74%의 EPA 에틸 에스테르를 포함하고, DHA는 실질적으로 없는 EPA 농축물이, 당업자에게 공지된 수단을 이용하여, 쉽게 전환되어 대체적인 형태의 EPA 농축물(즉, EPA 에틸 에스테르는 유리 지방산, 트라이아실글리세롤, 메틸 에스테르, 및 이의 조합으로 전환될 수 있을 것이다)을 산출할 수 있을 것임을 이해할 것이다. 따라서, 예로서, 74%의 EPA 에틸 에스테르는 글리세롤 분해를 통하여 트라이글리세라이드로 재-에스테르화될 수 있어서, 그 결과 오일의 중량 퍼센트로 측정하여, 적어도 70중량% EPA 에틸 에스테르를 포함하고, DHA는 실질적으로 없는 트라이글리세라이드 형태의 EPA 농축물이 결과로서 생성된다.
실시예 7
EPA 농축물은 환경 오염물질이 실질적으로 없다
본 실시예는, 오일의 중량%로 측정하여, 적어도 70중량%의 EPA를 포함하고, DHA가 실질적으로 없는 EPA 농축물, 및 TFA의 중량%로 측정하여, 30-70중량%의 EPA를 포함하고, DHA가 실질적으로 없는 미생물 오일 모두에서, 환경 오염물질이 실질적으로 없다는 것을 증명한다.
야로위아 리폴리티카 균주 Y8672로부터의 비농축된 정제된 오일에 필적하는 샘플을 실시예 1에 기재된 바와 같이, 제조하였다. 세계 보건기구 국제 독성 균등물 (World Health Organization International Toxicity Equivalent) ["WHO TEQ"] g 당 mg로 측정, 비농축된 추출된 오일 중의 폴리염화 바이페닐 ["PCB"] (CAS 번호 1336-36-3), 폴리염화 다이벤조다이옥신 ["PCDD"] 및 폴리염화 다이벤조푸란 ["PCDF"]의 농도(mg/g)는, EPA 방법 1668 Rev A에 따라 결정되었다. 극히 낮은 또는 검출불가능한 수준의 환경 오염물질이 검출되었다.
상기 결과에 기초하여, 실시예 1의 비농축된 추출된 오일 중 및 실시예 5의 비농축된 SPD-정제된 오일 중의 PCB, PCDD, 및 PCDF의 농도 또한 극히 낮은 또는 검출불가능한 수준의 환경 오염물질을 포함할 것이라는 것이 추정되었다. 유사하게, 각각 우레아 부가물 형성, 액체 크로마토그래피, SFC 및 분별 증류를 통하여 풍부화된, 실시예 2, 3, 4 및 6의 EPA 에틸 에스테르 농축물은 또한 환경 오염물질을 극히 낮은 수준 또는 검출불가능한 수준으로 포함하여야만 한다는 것도 본 명세서에서 가정되며, 이는 그들 자신이 환경 오염물질이 실질적으로 없는 비농축된 오일로부터 생산되었기 때문이다.
보다 구체적으로, 표 10에 실시예 2, 3, 4 및 6에서 EPA 농축물 내의 예상되는 TEQ 수준의 PCB, PCDD, 및 PCDF를 기재하였다. 비교를 위하여, 미국 특허 제 7,732,488호에 기재된 오염물질-스트리핑된 해양 오일 중의 동일한 화합물의 농도도 포함시켰다. 미국 특허 제 7,732,488호는 이들 환경 오염물질을 허용가능한 수준으로 감소시키는 특수 가공 방법을 제공한다는 것에 유의하여야 한다.
Figure pct00013
상기 나타낸 것과 같이, 실시예 2, 3, 4 및 6의 EPA 에틸 에스테르 농축물은 미국 특허 제 7,732,488호 중의 오염물질 제거된 해양 오일보다 더 낮은 수준의 PCB, PCDD 및 PCDF를 가질 것이다. 실제로, PCDF의 오염물질 수준은 사용된 분석 방법의 검출 한계 미만인 것으로 예측된다.
실시예 8
분별 증류 및 액체 크로마토그래피를 통한 미생물 오일의 풍부화
본 실시예는 오일의 중량 퍼센트로 측정하여, 97.4%의 EPA 에틸 에스테르를 포함하고, DHA, NDPA 및 HPA 는 실질적으로 없는 EPA 농축물이, 분별 증류와 액체 크로마토그래피 방법의 조합을 이용하여, 실시예 1로부터의 비농축된 정제된 오일의 풍부화에 따라 수득될 수 있을 것임을 증명한다.
비농축된 정제된 오일은, 야로위아 리폴리티카 균주 Y9502로부터 수득되었다 (상기 참조, 실시예 5; 또한, 미국 특허 출원 공개 번호 제 2010-0317072-A1호 참조). 구체적으로, 균주를 배양, 수확, 압출 및 펠렛화를 통한 분쇄, 및 초임계 유체 상 CO2를 이용하여 추출하였으며, 이는 실시예 5에 기재된 바와 같았다. 비농축된 추출된 오일을 그 후 SPD 조건 하에서 정제하였다(실시예 5).
야로위아 리폴리티카 균주 Y9502 로부터의 SPD -정제된 오일의 특징화
균주 Y9502로부터의 비농축된 SPD-정제된 오일의 지방산 조성을 실시예 1의 방법에 따라 분석하였다. SPD-정제된 오일은 54.7 EPA % TFA를 포함하였으며, DHA, NDPA 및 HPA는 검출불가능하였으며(즉, < 0.05%), 이는 표 11에 나타낸 바와 같다.
Figure pct00014
야로위아 리폴리티카 균주 Y9502 로부터의 SPD -정제된 오일의 풍부화
SPD-정제된 오일을, 실시예 3에 기재된 것과 유사한 방법을 이용하여 에틸 에스테르로 에스테르 교환반응시키고, 나아가 실시예 5에 기재된 것과 같이 분별증류시켰다. 분별 증류된 EPA 농축물은, 오일의 중량 퍼센트로 측정하여 71.9% EPA 에틸 에스테르를 포함하고, DHA, NDPA 및 HPA는 실질적으로 없었다 (하기 표 12에서 "분별 증류됨"이라고 명명된 컬럼 참조).
분별 증류된 에틸 에스테르를, 이들의 액체 크로마토그래피 정제 기술을 이용하여 그 후 Equateq (Isle of Lewis, Scotland)에 의하여 풍부화시켰다. 액체 크로마토그래피를 통하여 분별 증류된 EPA 농축물의 풍부화는, 오일의 중량 퍼센트로서 측정하여 최종 97.4%에 달하는 EPA 에틸 에스테르를 갖고, DHA, NDPA 및 HPA 는 실질적으로 없는 EPA 농축물을 산출하였다(하기 표 12에 "액체 크로마토그래피 풍부화됨"으로 명명된 컬럼 참조).
Figure pct00015
당업자는, 오일의 중량 퍼센트로 측정하여, 97.4%의 EPA 에틸 에스테르를 포함하고, DHA, NPDA 및 HPA는 실질적으로 없는 EPA 농축물이, 당업자에게 공지된 수단을 이용하여, 쉽게 전환되어 대체적인 형태의 EPA 농축물(즉, EPA 에틸 에스테르는 유리 지방산, 트라이아실글리세롤, 메틸 에스테르, 및 이의 조합으로 전환될 수 있을 것이다)을 산출할 수 있을 것임을 이해할 것이다. 따라서, 예로서, 97.4%의 EPA 에틸 에스테르는 글리세롤 분해를 통하여 트라이글리세라이드로 재-에스테르화될 수 있어서, 그 결과 오일의 중량 퍼센트로 측정하여, 적어도 70중량% EPA 에틸 에스테르를 포함하고, DHA, NPDA 및 HPA가 실질적으로 없는 트라이글리세라이드 형태의 EPA 농축물이 결과로서 생성된다.
추가적으로, EPA의 생산을 위해 조작된, 재조합 야로위아 세포의 임의의 미생물 바이오매스로부터 본 명세서의 발명의 방법에 따라 생산된 EPA 농축물은 DHA, NDPA 및 HPA가 실질적으로 없는 것으로 예상된다는 것에 유의하여야 한다. Y. 리폴리티카 균주 Y9502로부터 수득된 미생물 오일에 근거하여 상기 수득된 결과는 [여기에서 최종 EPA 농축물이 DHA, NDPA 및 HPA가 실질적으로 없음] 실시예 1 및 및 실시예 5로부터 수득된 미생물 오일로부터 제조된 EPA 농축물로부터 예측될 수 있다. 그의 건조 세포 중량 중 25% 초과를 오일로서 축적하는 야로위아 로부터 수득된 TFA의 중량%로 측정하여, 30 내지 70 중량%의 EPA를 포함하는 최초 미생물 오일 중에는 DHA, NDPA 및 HPA 불순물이 존재하지 않으므로, 그로부터 생산된 EPA 농축물 중에 지방산 불순물은 존재하지 않을 것이다.
ATCC PTA-10026 20090514 ATCC PTA-10027 20090514
SEQUENCE LISTING <110> E.I. duPont de Nemours & Company, Inc. Liang, Shu-Chien <120> AN EICOSAPENTAENOIC ACID CONCENTRATE <130> CL5340USNA <150> US 61/441,854 <151> 2011-02-11 <150> US 61/487,019 <151> 2011-05-17 <160> 8 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 4313 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Plasmid pZKUM <400> 1 taatcgagct tggcgtaatc atggtcatag ctgtttcctg tgtgaaattg ttatccgctc 60 acaattccac acaacatacg agccggaagc ataaagtgta aagcctgggg tgcctaatga 120 gtgagctaac tcacattaat tgcgttgcgc tcactgcccg ctttccagtc gggaaacctg 180 tcgtgccagc tgcattaatg aatcggccaa cgcgcgggga gaggcggttt gcgtattggg 240 cgctcttccg cttcctcgct cactgactcg ctgcgctcgg tcgttcggct gcggcgagcg 300 gtatcagctc actcaaaggc ggtaatacgg ttatccacag aatcagggga taacgcagga 360 aagaacatgt gagcaaaagg ccagcaaaag gccaggaacc gtaaaaaggc cgcgttgctg 420 gcgtttttcc ataggctccg cccccctgac gagcatcaca aaaatcgacg ctcaagtcag 480 aggtggcgaa acccgacagg actataaaga taccaggcgt ttccccctgg aagctccctc 540 gtgcgctctc ctgttccgac cctgccgctt accggatacc tgtccgcctt tctcccttcg 600 ggaagcgtgg cgctttctca 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Asn Val Asp Gln Val Asp Leu Ser Gln Val Asp Thr Ile 1 5 10 15 Ala Ser Gly Arg Asp Val Asn Tyr Lys Val Lys Tyr Thr Ser Gly Val 20 25 30 Lys Met Ser Gln Gly Ala Tyr Asp Asp Lys Gly Arg His Ile Ser Glu 35 40 45 Gln Pro Phe Thr Trp Ala Asn Trp His Gln His Ile Asn Trp Leu Asn 50 55 60 Phe Ile Leu Val Ile Ala Leu Pro Leu Ser Ser Phe Ala Ala Ala Pro 65 70 75 80 Phe Val Ser Phe Asn Trp Lys Thr Ala Ala Phe Ala Val Gly Tyr Tyr 85 90 95 Met Cys Thr Gly Leu Gly Ile Thr Ala Gly Tyr His Arg Met Trp Ala 100 105 110 His Arg Ala Tyr Lys Ala Ala Leu Pro Val Arg Ile Ile Leu Ala Leu 115 120 125 Phe Gly Gly Gly Ala Val Glu Gly Ser Ile Arg Trp Trp Ala Ser Ser 130 135 140 His Arg Val His His Arg Trp Thr Asp Ser Asn Lys Asp Pro Tyr Asp 145 150 155 160 Ala Arg Lys Gly Phe Trp Phe Ser His Phe Gly Trp Met Leu Leu Val 165 170 175 Pro Asn Pro Lys Asn Lys Gly Arg Thr Asp Ile Ser Asp Leu Asn Asn 180 185 190 Asp Trp Val Val Arg Leu Gln His Lys Tyr Tyr Val Tyr Val Leu Val 195 200 205 Phe Met Ala Ile Val Leu Pro Thr Leu Val Cys Gly Phe Gly Trp Gly 210 215 220 Asp Trp Lys Gly Gly Leu Val Tyr Ala Gly Ile Met Arg Tyr Thr Phe 225 230 235 240 Val Gln Gln Val Thr Phe Cys Val Asn Ser Leu Ala His Trp Ile Gly 245 250 255 Glu Gln Pro Phe Asp Asp Arg Arg Thr Pro Arg Asp His Ala Leu Thr 260 265 270 Ala Leu Val Thr Phe Gly Glu Gly Tyr His Asn Phe His His Glu Phe 275 280 285 Pro Ser Asp Tyr Arg Asn Ala Leu Ile Trp Tyr Gln Tyr Asp Pro Thr 290 295 300 Lys Trp Leu Ile Trp Thr Leu Lys Gln Val Gly Leu Ala Trp Asp Leu 305 310 315 320 Gln Thr Phe Ser Gln Asn Ala Ile Glu Gln Gly Leu Val Gln Gln Arg 325 330 335 Gln Lys Lys Leu Asp Lys Trp Arg Asn Asn Leu Asn Trp Gly Ile Pro 340 345 350 Ile Glu Gln Leu Pro Val Ile Glu Phe Glu Glu Phe Gln Glu Gln Ala 355 360 365 Lys Thr Arg Asp Leu Val Leu Ile Ser Gly Ile Val His Asp Val Ser 370 375 380 Ala Phe Val Glu His His Pro Gly Gly Lys Ala Leu Ile Met Ser Ala 385 390 395 400 Val Gly Lys Asp Gly Thr Ala Val Phe Asn Gly Gly Val Tyr Arg His 405 410 415 Ser Asn Ala Gly His Asn Leu Leu Ala Thr Met Arg Val Ser Val Ile 420 425 430 Arg Gly Gly Met Glu Val Glu Val Trp Lys Thr Ala Gln Asn Glu Lys 435 440 445 Lys Asp Gln Asn Ile Val Ser Asp Glu Ser Gly Asn Arg Ile His Arg 450 455 460 Ala Gly Leu Gln Ala Thr Arg Val Glu Asn Pro Gly Met Ser Gly Met 465 470 475 480 Ala Ala <210> 7 <211> 1101 <212> DNA <213> Yarrowia lipolytica <220> <221> CDS <222> (1)..(1101) <223> choline-phosphate cytidylyl-transferase; GenBank Accession No. XM_502978 <400> 7 atg gcc aaa agc aaa cga cgg tcg gag gct gtg gaa gag cac gtg acc 48 Met Ala Lys Ser Lys Arg Arg Ser Glu Ala Val Glu Glu His Val Thr 1 5 10 15 ggc tcg gac gag ggc ttg acc gat act tcg ggt cac gtg agc cct gcc 96 Gly Ser Asp Glu Gly Leu Thr Asp Thr Ser Gly His Val Ser Pro Ala 20 25 30 gcc aag aag cag aag aac tcg gag att cat ttc acc acc cag gct gcc 144 Ala Lys Lys Gln Lys Asn Ser Glu Ile His Phe Thr Thr Gln Ala Ala 35 40 45 cag cag ttg gat cgg gag cgc aag gag gag tat ctg gac tcg ctg atc 192 Gln Gln Leu Asp Arg Glu Arg Lys Glu Glu Tyr Leu Asp Ser Leu Ile 50 55 60 gac aac aag gac tat ctc aag tac cgt cct cga ggc tgg aag ctc aac 240 Asp Asn Lys Asp Tyr Leu Lys Tyr Arg Pro Arg Gly Trp Lys Leu Asn 65 70 75 80 aac ccg cct acc gac cga cct gtg cga atc tac gcc gat gga gtg ttt 288 Asn Pro Pro Thr Asp Arg Pro Val Arg Ile Tyr Ala Asp Gly Val Phe 85 90 95 gat ttg ttc cat ctg gga cac atg cgt cag ctg gag cag tcc aag aag 336 Asp Leu Phe His Leu Gly His Met Arg Gln Leu Glu Gln Ser Lys Lys 100 105 110 gcc ttc ccc aac gca gtg ttg att gtg ggc att ccc agc gac aag gag 384 Ala Phe Pro Asn Ala Val Leu Ile Val Gly Ile Pro Ser Asp Lys Glu 115 120 125 acc cac aag cgg aag gga ttg acc gtg ctg agt gac gtc cag cgg tac 432 Thr His Lys Arg Lys Gly Leu Thr Val Leu Ser Asp Val Gln Arg Tyr 130 135 140 gag acg gtg cga cac tgc aag tgg gtg gac gag gtg gtg gag gat gct 480 Glu Thr Val Arg His Cys Lys Trp Val Asp Glu Val Val Glu Asp Ala 145 150 155 160 ccc tgg tgt gtc acc atg gac ttt ctg gaa aaa cac aaa atc gac tac 528 Pro Trp Cys Val Thr Met Asp Phe Leu Glu Lys His Lys Ile Asp Tyr 165 170 175 gtg gcc cat gac gat ctg ccc tac gct tcc ggc aac gac gat gat atc 576 Val Ala His Asp Asp Leu Pro Tyr Ala Ser Gly Asn Asp Asp Asp Ile 180 185 190 tac aag ccc atc aag gag aag ggc atg ttt ctg gcc acc cag cga acc 624 Tyr Lys Pro Ile Lys Glu Lys Gly Met Phe Leu Ala Thr Gln Arg Thr 195 200 205 gag ggc att tcc acc tcg gac atc atc acc aag att atc cga gac tac 672 Glu Gly Ile Ser Thr Ser Asp Ile Ile Thr Lys Ile Ile Arg Asp Tyr 210 215 220 gac aag tat tta atg cga aac ttt gcc cgg ggt gct aac cga aag gat 720 Asp Lys Tyr Leu Met Arg Asn Phe Ala Arg Gly Ala Asn Arg Lys Asp 225 230 235 240 ctc aac gtc tcg tgg ctc aag aag aac gag ctg gac ttc aag cgt cat 768 Leu Asn Val Ser Trp Leu Lys Lys Asn Glu Leu Asp Phe Lys Arg His 245 250 255 gtg gcc gag ttc cga aac tcg ttc aag cga aag aag gtc ggt aag gat 816 Val Ala Glu Phe Arg Asn Ser Phe Lys Arg Lys Lys Val Gly Lys Asp 260 265 270 ctc tac ggc gag att cgc ggt ctg ctg cag aat gtg ctc att tgg aac 864 Leu Tyr Gly Glu Ile Arg Gly 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Glu Ile His Phe Thr Thr Gln Ala Ala 35 40 45 Gln Gln Leu Asp Arg Glu Arg Lys Glu Glu Tyr Leu Asp Ser Leu Ile 50 55 60 Asp Asn Lys Asp Tyr Leu Lys Tyr Arg Pro Arg Gly Trp Lys Leu Asn 65 70 75 80 Asn Pro Pro Thr Asp Arg Pro Val Arg Ile Tyr Ala Asp Gly Val Phe 85 90 95 Asp Leu Phe His Leu Gly His Met Arg Gln Leu Glu Gln Ser Lys Lys 100 105 110 Ala Phe Pro Asn Ala Val Leu Ile Val Gly Ile Pro Ser Asp Lys Glu 115 120 125 Thr His Lys Arg Lys Gly Leu Thr Val Leu Ser Asp Val Gln Arg Tyr 130 135 140 Glu Thr Val Arg His Cys Lys Trp Val Asp Glu Val Val Glu Asp Ala 145 150 155 160 Pro Trp Cys Val Thr Met Asp Phe Leu Glu Lys His Lys Ile Asp Tyr 165 170 175 Val Ala His Asp Asp Leu Pro Tyr Ala Ser Gly Asn Asp Asp Asp Ile 180 185 190 Tyr Lys Pro Ile Lys Glu Lys Gly Met Phe Leu Ala Thr Gln Arg Thr 195 200 205 Glu Gly Ile Ser Thr Ser Asp Ile Ile Thr Lys Ile Ile Arg Asp Tyr 210 215 220 Asp Lys Tyr Leu Met Arg Asn Phe Ala Arg Gly Ala Asn Arg Lys Asp 225 230 235 240 Leu Asn Val Ser Trp Leu Lys Lys Asn Glu Leu Asp Phe Lys Arg His 245 250 255 Val Ala Glu Phe Arg Asn Ser Phe Lys Arg Lys Lys Val Gly Lys Asp 260 265 270 Leu Tyr Gly Glu Ile Arg Gly Leu Leu Gln Asn Val Leu Ile Trp Asn 275 280 285 Gly Asp Asn Ser Gly Thr Ser Thr Pro Gln Arg Lys Thr Leu Gln Thr 290 295 300 Asn Ala Lys Lys Met Tyr Met Asn Val Leu Lys Thr Leu Gln Ala Pro 305 310 315 320 Asp Ala Val Asp Val Asp Ser Ser Glu Asn Val Ser Glu Asn Val Thr 325 330 335 Asp Glu Glu Glu Glu Asp Asp Asp Glu Val Asp Glu Asp Glu Glu Ala 340 345 350 Asp Asp Asp Asp Glu Asp Asp Glu Asp Glu Glu Asp Asp Glu 355 360 365

Claims (16)

  1. 총 지방산의 중량 퍼센트로 측정하여 30 내지 70 중량 퍼센트의 에이코사펜타엔산을 포함하고, 도코사헥사엔산은 실질적으로 없는 미생물 오일로부터 수득되고;
    여기에서 상기 미생물 오일은 그의 건조 세포 중량 중 25% 초과를 오일로서 축적하는 미생물로부터 수득된 것으로, 오일의 중량 퍼센트로 측정하여, 적어도 70 중량 퍼센트의 에이코사펜타엔산을 포함하고, 도코사헥사엔산은 실질적으로 없는, 에이코사펜타엔산 농축물.
  2. 제 1항에 있어서, 오일의 중량 퍼센트로 측정하여, 적어도 70 중량 퍼센트의 에이코사펜타엔산이:
    a) 산, 트라이글리세라이드, 에스테르 또는 이들의 조합; 및
    b) 에틸 에스테르로 이루어지는 군으로부터 선택된 형태인 것인 에이코사펜타엔산 농축물.
  3. 제 1항에 있어서, 미생물 오일이:
    a) 총 지방산의 중량 퍼센트로 측정하여, 약 1 내지 약 25 중량 퍼센트의 리놀레산을 포함하고; 및
    b) 총 지방산의 중량 퍼센트로 측정된, 리놀레산에 대하여, 총 지방산의 중량 퍼센트로 측정하여, 적어도 1.2의 에이코사펜타엔산 비를 갖는 것인 에이코사펜타엔산 농축물.
  4. 제 1항에 있어서, 미생물 오일은 에이코사펜타엔산의 생산을 위하여 조작된, 재조합 야로위아 세포들의 미생물 바이오매스로부터 수득된 것인 에이코사펜타엔산 농축물.
  5. 제 1항에 따른 에이코사펜타엔산 농축물 또는 그의 유도체를 포함하는 약학 생성물.
  6. a) 총 지방산의 중량 퍼센트로 측정하여, 30 내지 70 중량 퍼센트의 에이코사펜타엔산을 포함하고 도코사헥사엔산은 실질적으로 없는 미생물 오일을 에스테르 교환반응시키고, 여기에서 상기 미생물 오일은 그의 건조 세포 중량 중 25% 초과를 오일로서 축적하는 미생물로부터 수득한 것인 단계; 및
    b) 단계 (a)의 에스테르 교환반응된 오일을 풍부화하여, 오일의 중량 퍼센트로 측정하여, 적어도 70 중량 퍼센트의 에이코사펜타엔산을 포함하고, 도코사헥사엔산은 실질적으로 없는 에이코사펜타엔산 농축물을 수득하는 단계를 포함하는, 오일의 중량 퍼센트로 측정하여, 적어도 70 중량 퍼센트의 에이코사펜타엔산을 포함하고, 도코사헥사엔산은 실질적으로 없는 에이코사펜타엔산 농축물의 제조방법.
  7. 제 6항에 있어서, 오일의 중량 퍼센트로 측정하여, 적어도 70 중량 퍼센트의 에이코사펜타엔산을 포함하는 에이코사펜타엔산 농축물은:
    a) 산, 트라이글리세라이드, 에스테르 또는 이들의 조합; 및
    b) 에틸 에스테르로 이루어지는 군으로부터 선택된 형태인 것인 방법.
  8. 제 6항에 있어서, 미생물 오일은 총 지방산의 중량 퍼센트로 측정된 리놀레산에 대하여, 총 지방산의 중량 퍼센트로 측정하여, 적어도 1.2의 에이코사펜타엔산 비를 갖는 것인 방법.
  9. 제 6항에 있어서, 미생물 오일은 에이코사펜타엔산의 생산을 위하여 조작된, 재조합 야로위아 세포들의 미생물 바이오매스로부터 수득된 것인 방법.
  10. 제 6항에 있어서, 단계 (a)의 에스테르 교환반응된 오일은: 우레아 부가물 형성, 액체 크로마토그래피, 초임계 유체 크로마토그래피, 분별 증류, 유사 이동층 크로마토그래피, 실질 이동층 크로마토그래피 및 이의 조합으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 공정에 의하여 풍부화되는 것인 방법.
  11. 제 10항에 있어서, 단계 (a)의 에스테르 교환반응된 오일은 적어도 두가지 공정의 조합에 의하여 풍부화되며, 상기 첫번째 공정은 분별 증류를 포함하는 것인 방법.
  12. 제 1항에 있어서, 환경 오염물질이 실질적으로 없는 에이코사펜타엔산 농축물.
  13. 그의 건조 세포 중량 중 25% 초과를 오일로서 축적하는 미생물로부터 수득된 미생물 오일의 용도로서, 상기 미생물 오일은 총 지방산의 중량 퍼센트로서 측정하여, 30 내지 70 중량 퍼센트의 에이코사펜타엔산을 갖고, 도코사헥사엔산은 실질적으로 없어서, 오일의 중량 퍼센트로서 측정하여, 적어도 70 중량 퍼센트의 에이코사펜타엔산을 포함하고, 도코사헥사엔산은 실질적으로 없는 에이코사펜타엔산 농축물을 생성하는 것인 용도.
  14. 제 1항 내지 제 4항 중 어느 한 항에 있어서, 미생물 오일은 비농축된 것인 미생물 오일.
  15. 제 1항 내지 제 4항 중 어느 한 항에 있어서, 미생물 오일이 노나데카펜타엔산 및 헨에이코사펜타엔산으로 이루어지는 군으로부터 선택된 지방산은 실질적으로 없는 것인 미생물 오일.
  16. 제 15항에 있어서, 상기 에이코사펜타엔산 농축물은 노나데카펜타엔산 및 헨에이코사펜타엔산으로 이루어지는 군으로부터 선택된 지방산은 실질적으로 없는 것인 에이코사펜타엔산 농축물.
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