CN107529783A

CN107529783A - 用于宠物食品中的补充物质

Info

Publication number: CN107529783A
Application number: CN201680003901.3A
Authority: CN
Inventors: 乔纳森·W·威尔逊; 于世光
Original assignee: Evonik Degussa GmbH; DSM IP Assets BV
Current assignee: Evonik Operations GmbH; DSM IP Assets BV
Priority date: 2015-10-01
Filing date: 2016-09-22
Publication date: 2018-01-02
Also published as: BR112017017672A2; WO2017055169A1; JP6897917B2; JP2018530990A; EP3370542A1; JP7207760B2; AU2016333440A1; AU2021201571A1; AU2021201571B2; CA2948245A1; US20180192669A1; KR20180061081A; JP2021045165A; US20200383353A1

Abstract

本发明涉及可持续性生产宠物食品或产品的方法，所述方法包括以下步骤：通过用单一微生物来源的二十碳五烯酸(“EPA”)和二十二碳六烯酸(“DHA”)代替组合物中的全部或部分鱼油来配制宠物食品。在一个优选的实施方式中，包含DHA和EPA的微生物来源源自Schizochytrium属或Thraustochytrium属的微生物。

Description

用于宠物食品中的补充物质

本发明涉及宠物营养领域。在一个特定的方面，本发明涉及可持续性生产宠物食品的方法，所述宠物食品包含至少减少量的鱼油或鱼粉。

所有脊椎动物物种(包括宠物)均具有对ω-6和ω-3多不饱和脂肪酸[“PUFA”]的饮食需求。二十碳五烯酸[“EPA”；顺式-5,8,11,14,17-二十碳五烯酸；ω-3]和二十二碳六烯酸[“DHA”；顺式-4,7,10,13,16,19-二十二碳六烯酸；22:6ω-3]是正常生长、健康、繁殖和身体功能所必需的。

海洋鱼油和鱼粉传统上被用作商业动物饲料(包括宠物食品)中DHA和EPA的唯一膳食脂质来源，这是由于它们具有随时可用性、有竞争力的价格以及该产品中所含的丰富的必需脂肪酸。

通常，宠物食品包含源自野生捕获的小浮游动物物种(主要是鳀鱼、真鲹、蓝鳕、毛鳞鱼、玉筋鱼和鲱鱼(menhaden))的鱼粉和/或鱼油。

由于年鱼油产量不超过150万吨/年，故迅速增长的全球动物饲养业不能继续依赖有限的海洋浮游动物库作为鱼油供给。因此，迫切需要找到和实现可持续性鱼油替代物，所述替代物能够适应日益增长的全球对动物饲料产品(包括宠物食品)的需求。

许多组织认识到了上述关于鱼油可用性和动物饲料生产可持续性的限制。例如，在美国，国家海洋和大气管理局正在与农业部合作开展替代宠物食品倡议以“……鉴定替代饮食成分，其将减少水产养殖饲料中含有的鱼粉和鱼油的量，同时保持养殖海产品的重要人体健康益处”。

美国专利号7,932,077提示，重组改造的Yarrowia lipolytica可以是大多数动物饲料(包括宠物食品)的有用添加剂以提供必需的ω-3和/或ω-6PUFA，这基于其独特的蛋白质：脂质：碳水化合物组成，以及独特的复合碳水化合物谱(包含约1:4:4.6比率的甘露聚糖:β-葡聚糖:几丁质)。

美国专利申请公开号2007/0226814公开了含有至少一种获自发酵微生物的生物质的鱼饲料制剂，其中所述生物质含有相对于总脂肪酸含量至少20％的DHA。用作DHA来源的优选微生物是属于Stramenopiles属的生物。

发明概述

在一种实施方式中，本发明涉及生产含有二十碳五烯酸(EPA)和二十二碳六烯酸(DHA)的宠物食品的方法，所述方法包括以下步骤：用含有单一微生物来源的二十碳五烯酸(“EPA”)和二十二碳六烯酸(“DHA”)的添加剂组合物配制所述宠物食品。

在另一种实施方式中，本发明涉及可持续性生产宠物食品的方法，所述方法包括以下步骤：通过用单一微生物来源的二十碳五烯酸(“EPA”)和二十二碳六烯酸(“DHA”)代替组合物中的全部或部分鱼油来配制宠物食品。

在一个优选的实施方式中，使用基于Schizochytrium种的天然微生物的自然能力的方法来生产包含DHA和EPA的微生物来源。

在第三种实施方式中，本发明涉及用于宠物食品的饲料添加剂组合物，所述添加剂组合物包含单一微生物来源的二十碳五烯酸(“EPA”)和二十二碳六烯酸(“DHA”)。

在第四种实施方式中，本发明涉及宠物食品，其包含以所述宠物食品的重量百分比测量的总量为至少约0.04％的源自微生物来源的EPA和DHA。

在第五种实施方式中，本发明涉及具有含EPA和DHA的微生物添加剂组合物的宠物食品，其中所述微生物添加剂获自单一微生物。

在第六种实施方式中，本发明涉及可持续性生产宠物食品的方法，所述方法包括以下步骤：通过用单一微生物来源的二十碳五烯酸(“EPA”)和二十二碳六烯酸(“DHA”)代替组合物中的全部或部分鱼油来配制所述宠物食品，其中所述微生物是经遗传工程改造以用于生产含多不饱和脂肪酸的微生物油的转基因微生物，所述微生物油包含EPA和DHA。

优选地，所述转基因微生物是Thraustochytriales目的微生物。

详细描述

本公开中使用了一些术语和缩写。提供以下定义：

“多不饱和脂肪酸”缩写为“PUFA”。

“三酰基甘油”缩写为“TAG”。

“总脂肪酸”缩写为“TFA”。

“脂肪酸甲酯”缩写为“FAME”。

“细胞干重”缩写为“DCW”。

在本文中使用时，术语“发明”或“本发明”旨在表示在本文的权利要求和说明书中描述的本发明的所有方面和实施方式，并且不应被理解为限于任何特定实施方式或方面。

术语“宠物食品”、“宠物食品制剂”和“宠物食品组合物”在本文中可互换使用。宠物食品最常以薄片、干或湿的形式生产。

“二十碳五烯酸”[“EPA”]是顺式-5,8,11,14,17-二十碳五烯酸的通用名。这种脂肪酸是20:5ω-3脂肪酸。除非另有特别说明，本公开中使用的术语EPA是指酸或酸的衍生物(例如甘油酯、酯、磷脂、酰胺、内酯、盐等)。

“二十二碳六烯酸”[“DHA”]是顺式-4,7,10,13,16,19-二十二碳六烯酸的通用名。这种脂肪酸是22:6ω-3脂肪酸。除非另有特别说明，本公开中使用的术语DHA是指酸或酸的衍生物(例如甘油酯、酯、磷脂、酰胺、内酯、盐等)。

在本文中使用时，术语“添加剂组合物”是指源自微生物来源的物质，其以选自以下的形式提供：生物质、经处理的生物质、部分纯化的油和纯化油，其中任何一种均获自单一的微生物。

在本文中使用时，术语“生物质”是指微生物细胞物质。生物质可以自然产生，或者可以由天然宿主或突变菌株或重组生产宿主的发酵产生。生物质可以呈全细胞、全细胞裂解物、均化细胞、部分水解的细胞物质和/或部分纯化的细胞物质(例如微生物产生的油)的形式。术语“经处理的生物质”是指已进行额外处理的生物质，所述额外处理例如干燥、巴氏杀菌、破裂等，其中每种均在下文详细讨论。

术语“脂质”是指任何脂溶性(即亲脂性)的自然存在的分子。美国专利申请公开号2009-0093543-A1中提供了脂质的总体概述。术语“油”是指在25℃下为液体且通常为多不饱和的脂质物质。

术语“提取油”是指已经从细胞物质(例如，其中合成油的微生物)中分离的油。提取油通过多种方法获得，其中最简单的方法仅涉及物理手段。例如，使用多种压力配置(例如，螺杆，推进器，活塞，珠式搅拌器等)的机械破碎能够从细胞物质中分离油。或者，可以通过用多种有机溶剂(例如己烷)处理、通过酶促提取、通过渗压震扰、通过超声提取、通过超临界流体提取(例如，CO₂提取)、通过皂化和通过这些方法的组合进行油提取。可以进一步纯化或浓缩提取油。

“鱼油”指源自油性鱼类组织的油。油性鱼类的实例包括但不限于：鲱鱼、鳀鱼、青鱼(herring)、毛鳞鱼、鳕鱼等。鱼油是宠物食品的典型组分。

“植物油”是指从植物获得的任何食用油。通常，从植物的种子或谷粒中提取植物油。

术语“三酰基甘油”[“TAG”]是指由三个脂肪酰基残基酯化到甘油分子构成的中性脂质。

TAG可以含有长链PUFA和饱和脂肪酸，以及较短链的饱和脂肪酸和不饱和脂肪酸。“中性脂质”是指那些通常作为贮存脂肪存在于细胞中的脂质体中的脂质，它们之所以被称为“中性脂质”是因为在细胞PH下，所述脂质无带电基团。它们一般是完全非极性的，对水无亲和力。中性脂类一般是指甘油与脂肪酸的单酯、二酯和/或三酯，也分别称为单酰基甘油、二酰基甘油或三酰基甘油，或统称为酰基甘油。

为了从酰基甘油中释放游离脂肪酸，必须发生水解反应。

术语“总脂肪酸”[“TFA”]在本文指给定样品中能通过碱酯交换方法(本领域已知的方法)被衍生化成脂肪酸甲酯[“FAME”]的所有细胞脂肪酸的总和，所述样品可以是例如生物质或油。因此，总脂肪酸包括来自中性脂类级分(包括二酰基甘油、单酰基甘油和TAG)的脂肪酸和来自极性脂质级分(包括，例如磷脂酰胆碱和磷脂酰乙醇胺级分)的脂肪酸，但是不包括游离脂肪酸。

术语细胞的“总脂质含量”是TFA的量度，以细胞干重[“DeW”]百分比的形式表示，但总脂质含量可以近似为FAME的量度，以DeW的百分比[“FAME％DeW”]的形式表示。因此，总脂质含量[“TFA％DeW”]等同于例如每100毫克DeW的总脂肪酸的毫克数。

总脂质中脂肪酸的浓度在本文中表示为TFA的重量百分比(％TFA)，例如每100毫克TFA中给定脂肪酸的毫克数。除非在本文的公开内容中另有特别说明，否则提及给定脂肪酸相对于总脂质的百分比等同于以％TFA计的脂肪酸浓度(例如，总脂质的％EPA等同于EPA％TFA)。

在某些情况下，将细胞中给定脂肪酸的含量表示为其在细胞干重中的重量百分比(％DCW)是有用的。因此，例如，根据下式来确定二十碳五烯酸％DCW：(二十碳五烯酸％TFA)*(TFA％DCW)]/100。然而，可以将细胞中给定脂肪酸的含量(以其在细胞干重中的重量百分比(％DCW)计)近似为：(二十碳五烯酸％TFA)*(FAME％DCW)]/100。

术语“脂质谱”和“脂质组成”是可互换的，其是指特定脂质级分中(例如总脂质或油中)所含的各种脂肪酸的量，其中所述量表示为TFA的重量百分比。混合物中存在的各种脂肪酸的总和应为100。

术语“混合油”是指通过以下获得的油：将本文所述的提取油与任意组合的油或单独的油混合或共混以获得期望的组合物。因此，例如，可以将来自不同微生物的各种类型的油混合在一起以获得期望的PUFA组合物。或者或另外，可以将本文公开的含PUFA的油与鱼油、植物油或两者的混合物混合以获得期望的组合物。

术语“脂肪酸”是指不同链长(约C12至C22)的长链脂族酸(链烷酸)，但更长和更短链长的酸都是已知的。主要链长介于C16和C22之间。脂肪酸的结构由简单的符号系统“X:Y”表示，其中X是特定脂肪酸中碳[“C”]原子的总数，Y是双键数。美国专利7,238,482中提供了关于“饱和脂肪酸”与“不饱和脂肪酸”、“单不饱和脂肪酸”与“多不饱和脂肪酸”["PUFAs"]以及“ω-6脂肪酸”[“00-6”或“n-6”]与“ω-3脂肪酸”[“00-3”或“n-3”]之间区别的额外详细信息，该专利通过引用并入本文。

“鱼粉”是指宠物食品的蛋白质来源。鱼粉通常由与用于人类消费的鱼(例如鲑鱼、金枪鱼)的加工相关的渔业废物产生，或者由专门为了生产鱼粉而收集的特定动物(即青鱼、鲱鱼)产生。

典型鱼油中提供的EPA(总脂肪酸的百分比[“％TFA”])和DHA％TFA的量不同，EPA与DHA的比率也不同。基于Turchini、Torstensen和Ng的工作(Reviews in Aquaculture 1:10-57(2009))，在表1中总结了典型值：

表1.多种鱼油中典型的EPA含量和DHA含量

通常，由于成本较低，所以宠物食品中使用来自具有较低EPA:DHA比率的鱼的油。

在第四方面，宠物食品可以包含总量为至少约0.04％的源自单一微生物来源的EPA和DHA，所述量以所述宠物食品的重量百分比计。该量(即，0.04％)通常是适合于支持各种宠物动物生长的恰当的最低浓度。

本发明的宠物食品包含一种来源的DHA和EPA，其中组合物中EPA:DHA的比率为0.2:1至1:1，EPA和DHA各自以微生物来源或宠物食品中总脂肪酸的重量百分比计。

制造根据本发明的添加剂组合物的大多数方法开始于微生物发酵，其中在允许微生物生长并产生包含EPA和DHA的微生物油的条件下培养特定微生物。在适当的时间，从发酵容器收获微生物细胞。可以使用多种方法机械处理这种微生物生物质，例如脱水、干燥、机械破碎、造粒等。然后，将生物质(或从其中提取的油)用作宠物食品中的饲料添加剂(优选地用作标准宠物食品中使用的至少部分鱼油的的替代物)。然后至少在动物的一部分寿命期间向其饲喂宠物食品，以使宠物食品中的EPA和DHA在动物体内积累。

根据本发明的包含EPA和DHA的微生物添加剂组合物可以以适用于本文的宠物食品中的多种形式提供，其中DHA和EPA通常包含在微生物生物质或经处理的生物质内，或包含在部分纯化的油形式或纯化油内。在一些情况下，将微生物生物质或经处理的生物质掺入动物饲料组合物中是最具成本效益的。在另一些情况下，将微生物油(部分纯化形式或纯化形式)掺入动物饲料组合物中、优选地掺入宠物食品中是有利的。

根据本发明的微生物是藻类、真菌或酵母。优选的微生物是破囊壶菌(Thraustochytrids)，它们是Thraustochytriales目的微生物。破囊壶菌包括Schizochytrium属和Thraustochytrium属的成员，并被认为是ω-3脂肪酸(包括DHA和EPA)的替代来源。参见美国专利号5,130,242。

在一个优选的实施方式中，微生物是Schizochytrium种的突变菌株。Schizochytrium菌株是PUFA(例如DHA)的自然来源，并且可以通过诱变进行优化，以用作根据本发明的微生物来源。

可以通过下述方法获得产DHA和EPA的Schizochytrium菌株：连续诱变，然后适当地选择显示优异的EPA和DHA生产和特定的EPA:DHA比率的突变菌株。起始野生型菌株包括保藏在世界各地的各种培养物保藏中心的那些，例如ATCC和荷兰真菌菌种保藏中心(CBS)。通常需要进行两次或更多次连续的诱变循环以获得期望的突变菌株。

可以使用能够诱导酵母细胞遗传变化的任何化学试剂或非化学(例如紫外线(UV)辐射)试剂作为诱变剂。这些试剂可以单独使用或者彼此组合使用，并且化学试剂可以纯粹地(neat)使用或与溶剂一起使用。

例如，可以诱变和选择菌株，以使得其产生的EPA和DHA的量具有商业利益且具有特定的EPA:DHA比率。

或者，可以通过被遗传转化以生产PUFA的微生物来生产根据本发明的微生物来源。任选地，可以通过下述方法对微生物进行工程改造以生产DHA和EPA：在宿主生物体中表达编码例如δ-6去饱和酶/δ-6延伸酶通路或δ-9延伸酶/δ-8去饱和酶通路的延伸酶和去饱和酶的合适的异源基因。

表达盒中的异源基因通常整合到宿主细胞基因组中。包含在特定表达盒内的特定基因取决于宿主生物体、其PUFA谱和/或去饱和酶/延伸酶谱、底物的可用性和期望的终产物。产生EPA的PUFA聚酮合成酶[“PKS”]体系，例如如Shewanella putrefaciens(美国专利6,140,486)、Shewanella olleyana(美国专利7,217,856)、Shewanella japonica(美国专利7,217,856)和Vibrio marinus(美国专利6,140,486)中所述的那些，也可以引入合适的产DHA的微生物中以使得能够产生EPA和DHA。也可以对具有天然产生DHA的其它PKS体系的宿主生物体进行工程改造，以使得能够生产PUFA的合适组合，从而产生高达以及高于2:1的EPA:DHA比率。

本领域技术人员熟悉将一种或多种编码用于EPA和DHA生物合成的合适酶的表达盒引入所选择的微生物宿主生物体中所必需的注意事项和技术，并且文献对技术人员提供了许多教导。包含来自这些遗传改造生物体的EPA和DHA的微生物油也可适用于本文的宠物食品中，其中油可以包含在微生物生物质或经处理的生物质中，或者油可以是部分纯化的油或纯化的油。

可用于本发明的典型的微生物种以ATCC登记号PTA-10208、PTA-10209、PTA-10210或PTA-10211、PTA-10212、PTA-10213、PTA-10214、PTA--10215保藏。

在一些实施方式中，本发明涉及分离的微生物，其具有以ATCC登记号PTA-10212保藏的种或源自其的菌株的特征。以ATCC登记号PTA-10212保藏的种的特征可以包括其生长和表型性质(表型性质的实例包括形态学性质和繁殖性质)、其物理性质和化学性质(例如干重和脂质谱)、其基因序列，以及它们的组合，其中所述特征将所述种与以前鉴定的种区分开。在一些实施方式中，本发明涉及分离的微生物，其具有以ATCC登记号PTA-10212保藏的种的特征，其中所述特征包括：包含SEQ ID NO1的多核苷酸序列或者与SEQ ID NO1具有至少94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的多核苷酸序列的18s rRNA，以ATCC登记号PTA-10212保藏的种的形态学性质和繁殖性质，以及以ATCC登记号PTA-10212保藏的种的脂肪酸谱。

在另一些实施方式中，突变菌株是以ATCC登记号PTA-10213、PTA-10214或PTA-10215保藏的菌株。与ATCC登记号PTA-10213、PTA-10214和PTA-10215相关的微生物于2009年7月14日根据布达佩斯条约保藏在美国典型培养物保藏中心专利保藏库(American TypeCulture Collection,Patent Depository),10801University Boulevard,马纳萨斯,VA201 10-2209。

在一些实施方式中，本发明涉及以ATCC登记号PTA-10208保藏的种的分离的微生物。与ATCC登记号PTA-10208相关的分离的微生物在本文中也称为Schizochytriumsp.ATCC PTA-10208。与ATCC登记号PTA-10208相关的微生物于2009年7月14日根据布达佩斯条约保藏在美国典型培养物保藏中心专利保藏库,10801University Boulevard,马纳萨斯,VA 201 10-2209。

在一些实施方式中，本发明涉及以ATCC保藏号PTA-10208保藏的微生物的突变菌株。在另一些实施方式中，突变菌株是以ATCC登记号PTA-10209、PTA-10210或PTA-10211保藏的菌株。与ATCC登记号PTA-10209、PTA-10210和PTA-1021 1相关的微生物于2009年9月25日根据布达佩斯条约保藏在美国典型培养物保藏中心专利保藏库,10801UniversityBoulevard,马纳萨斯,VA 201 10-2209。

根据本发明的微生物可以在发酵培养基中并在微生物产生PUFA的条件下培养和生长。通常，向微生物供应碳源和氮源，以及一些允许微生物生长和/或产生EPA和DHA的额外化学品或物质。发酵条件取决于所用微生物，并且可以针对所得生物质中高含量的期望PUFA进行优化。

通常，可以通过改变碳源的类型和量、氮源的类型和量、碳氮比、不同矿物离子的量、氧水平、生长温度、pH、生物质生产期的长度、油积累期的长度以及细胞收获的时间和方法来优化培养基条件。

当微生物已产生期望量的EPA和DHA时，可以处理发酵培养基以获得包含PUFA的微生物生物质。例如，可以过滤或以其它方式处理发酵培养基以除去至少部分水性组分。可以进一步处理发酵培养基和/或微生物生物质，例如可以对微生物生物质进行巴氏杀菌或通过其它方式处理，以降低可损害微生物油和/或PUFA的内源性微生物酶的活性。可以使微生物生物质经受干燥(例如，达到期望的水含量)或机械破碎方法(例如，通过物理方法，例如珠磨器、螺杆挤出等，以提供对细胞内容物更多的接近)，或这些的组合。可以对微生物生物质进行粒化或造粒以便于处理。由任何上述方法获得的微生物生物质还可用作包含EPA和DHA的部分纯化或纯化的微生物油形式的来源。然后可将这种微生物油来源用作宠物食品中的优选饲料添加剂。

根据本发明的微生物油的一个优选实例是来自Schizochytrium的油，其含有：

-至少40％w/w的DHA和EPA、优选地约50％w/w的DHA和EPA，

-约0.2:1至1:1、优选地0.4:1至0.8:1的EPA:DHA比率；和

-至少一种抗氧化剂，加入其是为了提供稳定性。

在本方法中，包含来自微生物来源的EPA和DHA的宠物食品以持续性的方式生产。基于本文的公开内容，显然可以利用鱼油的可再生替代物，作为持续性生产宠物食品的方法。

宠物食品包括微量组分和大组分(micro and macro components)。

具有营养功能的大组分为动物提供生长和行为所需的蛋白质和能量。对于宠物来说，宠物食品理想地应该为宠物提供：1)脂肪，其充当脂肪酸来源用于能量(特别是用于心脏和骨骼肌)；和2)氨基酸，其充当蛋白质的结构单元。脂肪还有助于维生素吸收；例如，维生素A、D、E和K是脂溶性的，或者只能与脂肪一起被消化、吸收和运输。虽然碳水化合物(通常为植物来源(例如小麦、向日葵粉、玉米麸质、豆粉))相较于蛋白质和脂肪不是更优的宠物能量来源，但它们往往也包含在宠物食品中。

通常通过将鱼粉(其含有少量鱼油)和鱼油掺入宠物食品中来提供脂肪。可用于宠物食品中的提取油包括鱼油(例如，来自油性鱼类鲱鱼、鳀鱼、青鱼、毛鳞鱼和鳕鱼肝)和植物油(例如，来自大豆、油菜籽、向日葵种子和亚麻籽)。通常，鱼油是优选的油，这是因为其含有长链ω-3多不饱和脂肪酸[“PUFA”](EPA和DHA)；相比之下，植物油不提供EPA和/或DHA来源。这些PUFA是宠物的生长和健康所需的。典型的宠物食品包含约15-30％的油(例如鱼、植物等)，以宠物食品的重量百分比计。

另一种主要的大组分是蛋白质来源。宠物食品中提供的蛋白质可以是植物来源或动物来源的。例如，动物来源的蛋白质可以来自海洋动物(例如宠物粉、鱼油、宠物蛋白质、磷虾粉、贻贝粉、虾皮、鱿鱼粉、鱿鱼油等)或陆栖动物(例如，血粉、蛋粉、肝粉、肉粉、肉骨粉、蚕、蛹粉、乳清粉等)。植物来源的蛋白质可以包括豆粕、玉米麸质粉、小麦麸质、棉籽粕、油菜籽粕、向日葵粉、稻等。

大组分的技术功能可以重叠，例如，小麦麸质可以用作造粒助剂，并且由于其蛋白质含量，其具有相对高的营养价值。还可以提及瓜尔胶和小麦粉。

微量组分包括添加剂，例如维生素、微量元素、宠物食品抗生素和其他生物制品。以低于100mg/kg(100ppm)的水平使用的矿物质被视为微量矿物质或微量元素。

具有营养功能的微量组分都是生物制品和微量元素。它们参与生物过程，并且为良好健康状态和高效能表现所需。可以提及维生素，例如维生素A、E、K3、D3、B1、B3、B6、B12、C，生物素，叶酸，泛酸，烟酸，氯化胆碱，肌醇和对氨基苯甲酸。可以提及矿物质，例如钙盐、钴盐、铜盐、铁盐、镁盐、磷盐、钾盐、硒盐和锌盐。其它组分可包括但不限于抗氧化剂、β-葡聚糖、胆汁盐、胆固醇、酶、谷氨酸钠、类胡萝卜素等。

微量组分的技术功能主要与造粒、解毒、防霉、抗氧化等有关。

为犬食品组合物提供成分的典型组分除“本发明成分”之外包含：例如，鸡肉/牛肉/火鸡肉、肝脏、碎珍珠麦、玉米粉、兽类脂肪(brute fat)、干燥全蛋、禽蛋白水解产物、植物油、碳酸钙、氯化胆碱、氯化钾、加碘盐、氧化铁、氧化锌、硫酸铜、氧化锰、亚硒酸钠、碘酸钙、维生素原D、维生素B1、烟酸、泛酸钙、盐酸吡哆醇、核黄素、叶酸、维生素B12。

为猫食品组合物提供成分的典型组分除“本发明成分”之外包含：牛肉、鸡肉、干燥鸡肝、羊肉、羊肝、猪肉、火鸡肉、火鸡肝、禽肉、鱼肉、禽蛋白水解产物、动物脂肪、植物油、大豆粉、豌豆麸(pea bran)、玉米麸、干燥全蛋、玉米粉(ground corn)、玉米面(corn flour)、稻米、大米粉、干甜菜糖蜜(dry sugar beet molasses)、低聚果糖(fructooligosaccharide)、可溶性纤维、植物胶、纤维素粉、黏土、面包酵母、加碘氯化钠、硫酸钙、三磷酸钠、磷酸二钙、碳酸钙、氯化钾、氯化胆碱、氧化镁、氧化锌、氧化铁、硫酸铜、硫酸铁、氧化锰、碘酸钙(calcium jodate)、亚硒酸钠、维生素原D、硫胺素、烟酸、泛酸钙、盐酸吡哆醇、核黄素、叶酸、维生素B12、牛磺酸、L-肉碱、酪蛋白、D-甲硫氨酸。

湿性宠物食品含有约70％至约85％的水分和约15％至约25％的干物质。

用于成年犬的典型湿性食品可以包含：例如，除根据本发明的DHA和EPA的微生物来源之外，最少24％的蛋白质、15％的脂肪、52％的淀粉、0.8％的纤维、3％的亚油酸、0.6％的钙、0.5％的磷、1:1的Ca:P比率、0.2％的钾、0.6％的钠、0.09％的氯、0.09％的镁、170mg/kg的铁、15mg/kg的铜、70mg/kg的锰、220mg/kg的锌、4mg/kg的碘、0.43mg/kg的硒、74000IU/kg的维生素A、1200IU/kg的维生素D、11mg/kg的维生素B1、6mg/kg的核黄素、30mg/kg的泛酸、20mg/kg的烟酸、4.3mg/kg的吡哆醇、0.9mg/kg的叶酸、0.2μg/kg的维生素B12、2500mg/kg的胆碱(choline)、2500mg/kg的胆素(cholin)，所有百分比都基于总的食品组合物的干重。

用于成年猫的典型湿性食品可以包含：例如，除根据本发明的DHA和EPA的微生物来源之外，最少44％的蛋白质、25％的脂肪、20％的淀粉、2.5％的纤维、0.8％的钙、0.6％的磷、0.8％的钾、0.3％的钠、0.09％的氯、0.08％的镁、0.25％的牛磺酸、170mg/kg的铁、15mg/kg的铜、70mg/kg的锰、220mg/kg的锌、4mg/kg的碘、0.43mg/kg的硒、74000IU/kg的维生素A、1200IU/kg的维生素D、11mg/kg的维生素B1、6mg/kg的核黄素、30mg/kg的泛酸、20mg/kg的烟酸、4.3mg/kg的吡哆醇、0.9mg/kg的叶酸、0.2μg/kg的维生素B12、2500mg/kg的胆碱、2500mg/kg的胆素，所有百分比都基于总的食品组合物的干重。

干性宠物食品含有约6％至约14％的水分和约86％或更多的干物质。

用于成年犬的典型干性食品可以包含：例如，除根据本发明的DHA和EPA的微生物来源之外，最少25％的蛋白质、12％的脂肪、41.5％的淀粉、2.5％的纤维、1％的亚油酸、1％的钙、0.8％的磷、1:1的Ca:P比率、0.6％的钾、0.35％的钠、0.09％的氯、0.1％的镁、170mg/kg的铁、35mg/kg的铜、70mg/kg的锰、220mg/kg的锌、4mg/kg的碘、0.43mg/kg的硒、15000IU/kg的维生素A、1200IU/kg的维生素D、11mg/kg的维生素B1、6mg/kg的核黄素、30mg/kg的泛酸、20mg/kg的烟酸、4.3mg/kg的吡哆醇、0.9mg/kg的叶酸、0.2μg/kg的维生素B12、2500mg/kg的胆碱，所有百分比都基于总的食品组合物的干重。

用于成年猫的典型食品可以包含：例如，除根据本发明的DHA和EPA的微生物来源之外，最少32％的蛋白质、15％的脂肪、27.5％的淀粉、11％的膳食纤维、4.5％的纤维、3.4％的亚油酸、0.08％的花生四烯酸、0.15％的牛磺酸、50mg/kg的L-肉碱、5、1％的钙、0.8％的磷、至少1:1的Ca:P比率、0.6％的钾、0.4％的钠、0.6％的氯化物、0.08％的镁、190mg/kg的铁、30mg/kg的铜、60mg/kg的锰、205mg/kg的锌、2.5mg/kg的碘、0.2mg/kg的硒、25000IU/kg的维生素A、1500IU/kg的维生素D、20mg/kg的维生素B1、40mg/kg的核黄素、56mg/kg的泛酸、153mg/kg的烟酸、14mg/kg的吡哆醇、3.2mg/kg的叶酸、0.2mg/kg的维生素B12、3000mg/kg的胆碱，所有百分比都基于总的食品组合物的干重。

干性食品可以例如通过螺旋挤压来制备，包括在非常短的一段时间内烹制、成型和切割原料成分(raw ingredients)，使其成为特定的粗磨物(kibble)的形状及大小，同时破坏掉有害的微生物。可以将成分混合成均质可扩展的面团状物，并在(蒸汽/压力)挤压机中烹制且通过压力和高温下的板。烹制之后，使所述粗磨物冷却，然后任选地用包衣进行喷雾，所述包衣可以包括液体脂肪或消化物，所述消化物包括动物组织(例如来自例如鸡或兔的肝或肠)的液体或粉末化水解形式。然后热空气干燥将总的水分含量降低至10％或更少。

罐装(湿性)食品可以通过例如将原料成分共混在一起来制备，所述原料成分包括肉及蔬菜、胶凝剂、肉汁、维生素、矿物质和水。然后在生产线上将混合物装入罐内并封上盖，接着在约130℃的温度下对经填充的罐进行灭菌持续约50-100分钟。

犬饲料组合物的典型配方如下表所示。

已经一般性地描述了本发明，通过参考本文提供的实施例能够获得进一步的理解。这些实施例仅仅是为了说明的目的，而不是限制性的。

实施例1：以ATCC登记号PTA-10212保藏的分离的微生物的生长特征

如下文所述，在单独发酵运行中检测以ATCC登记号PTA-10212保藏的分离的微生物的生长特征。典型的培养基和培养条件如表3所示。

表3：PTA-10212容器培养基

典型的培养条件包括：

在22.5℃的pH 7.3下的含有20％溶解氧、含有1000ppm Cl的补充有碳(甘油)和氮的培养物中，PTA-10212在于10L发酵罐体积中培养138小时后产生26.2g/L的细胞干重。脂质产量为7.9g/L；ω-3产量为5.3g/L；EPA产量为3.3g/L，DHA产量为1.8g/L。脂肪酸含量为30.3重量％；EPA含量为脂肪酸甲酯(FAME)的41.4％；且DHA含量为FAME的26.2％。在这些条件下，脂质生产率为1.38g/L/天，ω-3生产率为0.92g/L/天，EPA生产率为0.57g/L/天，DHA生产率为0.31g/L/天。

在含有1000ppm Cl的补充有碳(甘油)和氮的培养物中，所述培养物在22.5℃和pH7.3下且含有20％溶解氧，PTA-10212在于10L发酵罐体积中培养189小时后产生38.4g/L的细胞干重。脂质产量为18g/L；ω-3产量为12g/L；EPA产量为5g/L，DHA产量为6.8g/L。脂肪酸含量为45重量％；EPA含量为FAME的27.8％；且DHA含量为FAME的37.9％。在这些条件下，脂质生产率为2.3g/L/天，ω-3生产率为1.5g/L/天，EPA生产率为0.63g/L/天，DHA生产率为0.86g/L/天。

在含有1000ppm Cl的补充有碳(甘油)和氮的培养物中，所述培养物在22.5℃和pH6.8-7.7下并含有20％溶解氧，PTA-10212在于10L发酵罐体积中培养189小时后产生13g/L的细胞干重。脂质产量为5.6g/L；ω-3产量为3.5g/L；EPA产量为1.55g/L，DHA产量为1.9g/L。脂肪酸含量为38重量％；EPA含量为FAME的29.5％；且DHA含量为FAME的36％。在这些条件下，脂质生产率为0.67g/L/天，ω-3生产率为0.4g/L/天，EPA生产率为0.20g/L/天，DHA生产率为0.24g/L/天。

在含有1000ppm Cl的补充有碳(甘油)和氮的培养物中，所述培养物在22.5-28.5℃和pH 6.6-7.2下且含有20％溶解氧，PTA-10212在于10L发酵罐体积中培养191小时后产生36.7g/L-48.7g/L的细胞干重。脂质产量为15.2g/L-25.3g/L；ω-3产量为9.3g/L-13.8g/L；EPA产量为2.5g/L-3.3g/L，DHA产量为5.8g/L-1 1g/L。脂肪酸含量为42.4重量％-53重量％；EPA含量为FAME的9.8％-22％；且DHA含量为FAME的38.1％-43.6％。在这些条件下，脂质生产率为1.9g/L/天-3.2g/L/天，ω-3生产率为1.2g/L/天-1.7g/L/天，EPA生产率为0.31g/L/天-0.41g/L/天，DHA生产率为0.72g/L/天-1.4g/L/天。

实施例2

关于DHA的实验数据由Kuno添加。

实施例3

用足以向对象施用4mg-120mg总DHA&EPA/kg体重的日剂量的量的微生物油喷雾/搀入(drugged)商业干性犬食品(Hill’s Pet Nutrition GmbH,Liebigstrasse 2-20,D-22113提供的犬用Hill’s Science diet“Canine Maintenance dry”)，所述微生物油含有45％w/w的DHA和EPA且EPA:DHA比率为0.4:1至0.8:1。以足以在最终的食物组合物中提供30mg维生素C/kg、300IU维生素E/kg和280mgβ-胡萝卜素/kg的量掺入另外的维生素C和E和β-胡萝卜素，然后挤出全部共混物。将食物组合物干燥至含有约90重量％的干物质。

实施例4

用足以向对象施用4mg-120mg DHA&EPA/kg体重的日剂量的量的实施例3的微生物油喷雾/搀入商业湿性犬食品(Hill’s Pet Nutrition GmbH,Liebigstrasse 2-20,D-22113提供的犬用Hill’s Science diet“Canine Maintenance wet”)。以足以在最终的食物组合物中提供30mg维生素C/kg、300IU维生素E/kg和280mgβ-胡萝卜素/kg的量掺入另外的维生素C和E和β-胡萝卜素，然后烹制全部共混物。将食物组合物干燥至含有约90重量％的干物质。

实施例5

用足以向对象施用4mg-120mg DHA&EPA/kg体重的日剂量的量的实施例3的微生物油喷雾/搀入商业犬小食(dog treats)(德国的Mera Tiernahrung GmbH,Marienstrasse80-84,47625Kevelaer-Wetten提供的犬用Mera狗“饼干”)。以足以在最终的食物组合物中提供30mg维生素C/kg、300IU维生素E/kg和280mgβ-胡萝卜素/kg的量掺入另外的维生素C和E和β-胡萝卜素，然后挤出全部共混物。将食物组合物干燥至含有约90重量％的干物质。

实施例6

用足以向对象施用4mg-120mg DHA&EPA/kg体重的日剂量的量的实施例3的微生物油喷雾/搀入商业干性猫食品(Hill’s Pet Nutrition GmbH,Liebigstrasse 2-20,D-22113提供的猫用Hill’s Science diet“Feline Maintenance dry”)。以足以在最终的食物组合物中提供30mg维生素C/kg、300IU维生素E/kg和280mgβ-胡萝卜素/kg的量掺入另外的维生素C和E和β-胡萝卜素，然后挤出全部共混物。将食物组合物干燥至含有约90重量％的干物质。

实施例7

用足以向对象施用4mg-120mg DHA&EPA/kg体重的日剂量的量的实施例3的微生物油喷雾/搀入商业湿性猫食品(Hill’s Pet Nutrition GmbH,Liebigstrasse 2-20,D-22113提供的猫用Hill’s Science diet“Feline Maintenance wet”)。以足以在最终的食物组合物中提供30mg维生素C/kg、300IU维生素E/kg和280mgβ-胡萝卜素/kg的量掺入另外的维生素C和E和β-胡萝卜素，然后烹制全部共混物。将食物组合物干燥至含有约90重量％的干物质。

实施例8

用足以向对象施用4mg-120mg DHA&EPA/kg体重的日剂量的量的实施例3的微生物油喷雾/搀入商业猫小食(德国的Whiskas,Masterfoods GmbH,Eitzer Str.215,27283Verden/Aller提供的猫用Whiskas Dentabits)。以足以在最终的食物组合物中提供30mg维生素C/kg、300IU维生素E/kg和280mgβ-胡萝卜素/kg的量掺入另外的维生素C和E和β-胡萝卜素，然后挤出全部共混物。将食物组合物干燥至含有约90重量％的干物质。

实施例9

富含DHA和EPA的藻油显著增加了犬中的血浆DHA和EPA浓度

目标：本研究的目标是检测如上所述的藻油产品中的DHA和EPA在犬中是否具有生物利用性。

研究设计

犬：使用30只小猎犬：14只雄性和16只雌性，年龄为1-11岁。

饮食：干性挤出犬食品被用作对照饮食。其被配制成满足用于生长和繁殖的AAFCO犬食品营养谱。通过下述方法制备两种试验饮食：向干燥的对照饮食粗磨物中掺入1.7％(试验饮食1)或5.1％(试验饮食2)的藻油(DSM；批号：VY00010672；货号：5015816)，这是以对照饮食中的鸡脂肪为代价的。对照饮食和试验饮食中分析的DHA和EPA浓度如表4所示。

表4.饮食DHA和EPA浓度

程序：给予犬对照饮食28天之后，基于性别和年龄将它们分为三组，每组10只，并给予一种实验饮食：对照、试验1或试验2，持续另外28天。每天测量食物摄取量，每周测量体重。在第28、42和56天，通过颈静脉穿刺收集血样用于血浆DHA和EPA测量。在第28和56天，兽医评估被给予试验饮食2的犬的皮肤和毛发的任何异常。在研究期间，犬一直可以获取新鲜的自来水。

结果：在喂食试验饮食1或2的犬中，血浆DHA和EPA浓度以剂量响应方式显著增加(p<0.05；图1)。在研究期间，各组之间的食物摄入量和体重变化相似。在喂食试验饮食2的犬中，没有观察到对皮肤和毛发的不利影响。

结论：富含DHA和EPA的藻油显著增加了犬中的血浆DHA和EPA浓度。藻油中的DHA和EPA在犬中是生物可利用的。

实施例10

富含DHA和EPA的藻油显著增加了猫中的血浆DHA和EPA浓度

目标：本研究的目标是检测如上所述的藻油产品中的DHA和EPA在猫中是否具有生物利用性。

研究设计

猫：使用30只长毛或短毛家猫：4只雄性和25只雌性，年龄为2-12岁。

饮食：干性挤出猫食品被用作对照饮食。其被配制成满足用于生长和繁殖的AAFCO猫食品营养谱。通过下述方法制备两种试验饮食：向干燥的对照饮食粗磨物中掺入1.7％(试验饮食1)或5.1％(试验饮食2)的藻油(DSM；批号：VY00010672；货号：5015816)，这是以对照饮食中的鸡脂肪为代价的。对照饮食和试验饮食中分析的DHA和EPA浓度如表5所示。

表5.饮食DHA和EPA浓度

程序：给予猫对照饮食26天之后，基于性别和年龄将它们分为三组，每组10只猫，并给予一种实验饮食：对照、试验1或试验2，持续另外28天。每天测量食物摄取量，每周测量体重。在第26、40和54天，通过颈静脉穿刺收集血样用于血浆DHA和EPA测量。在第26和54天，兽医评估被给予试验饮食2的猫的皮肤和毛发的任何异常。在研究期间，猫一直可以获取新鲜的自来水。

结果：在喂食试验饮食1或2的猫中，血浆DHA和EPA浓度以剂量响应方式显著增加(p<0.05；图1)。在研究期间，各组之间的食物摄入量和体重变化相似。在喂食试验饮食2的猫中，没有观察到对皮肤和毛发的不利影响。

结论：富含DHA和EPA的藻油显著增加了猫中的血浆DHA和EPA浓度。藻油中的DHA和EPA在猫中是生物可利用的。

Claims

1.一种生产含有二十碳五烯酸(EPA)和二十二碳六烯酸(DHA)的宠物食品或组合物的方法，所述方法包括以下步骤：用单一微生物来源的二十碳五烯酸(“EPA”)和二十二碳六烯酸(“DHA”)的添加剂组合物配制所述宠物食品。

2.一种可持续性生产宠物食品的方法，所述方法包括以下步骤：通过用单一微生物来源的二十碳五烯酸(“EPA”)和二十二碳六烯酸(“DHA”)的添加剂组合物代替所述食品中的全部或部分鱼油来配制所述宠物食品。

3.权利要求1或2所述的方法，其中所述宠物食品包含总量为至少约0.04％的EPA和DHA，所述量以所述宠物食品的重量百分比计。

4.权利要求1-3中任一项所述的方法，其中基于所述微生物来源或所述宠物食品中EPA和DHA各自的浓度，EPA的浓度与DHA的浓度之比为至少0.2:1。

5.权利要求1-4中任一项所述的方法，其中所述添加剂组合物以选自以下的形式提供：生物质、经处理的生物质、部分纯化的油和纯化油，其中任何一种均获自所述微生物来源。

6.权利要求1-5中任一项所述的方法，其中所述微生物来源所源自的微生物是藻类、真菌或酵母。

7.权利要求6所述的方法，其中所述微生物是Schizochytrium属或Thraustochytrium属的成员。

8.权利要求7所述的方法，其中所述微生物具有以ATCC登记号PTA-10208或PTA-10209或PTA-10210或PTA-10211或PTA-10212或PTA-10213或PTA-10214或PTA-10215保藏的种的特征。

9.权利要求6-8中任一项所述的方法，其中所述微生物是突变菌株。

10.权利要求6-8中任一项所述的方法，其中所述微生物是经遗传工程改造用于生产含多不饱和脂肪酸的微生物油的转基因微生物，所述微生物油含有EPA和DHA。

11.用于宠物食品的饲料添加剂组合物，其包含源自单一微生物来源的二十碳五烯酸(“EPA”)和二十二碳六烯酸(“DHA”)。

12.权利要求11所述的添加剂组合物，其以选自以下的形式提供：生物质、经处理的生物质、部分纯化的油和纯化油，其中任何一种均获自所述微生物来源。

13.权利要求11或12所述的添加剂组合物，其中所述微生物来源所源自的微生物是藻类、真菌或酵母。

14.权利要求13所述的添加剂组合物，其中所述微生物是Schizochytrium属或Thraustochytrium属的成员。

15.权利要求14所述的添加剂组合物，其中所述微生物具有以ATCC登记号PTA-10208或PTA-10209或PTA-10210或PTA-10211或PTA-10212或PTA-10213或PTA-10214或PTA-10215保藏的种的特征。

16.权利要求11-15中任一项所述的添加剂组合物，其是含有至少40％w/w的DHA和EPA、优选地约50％w/w的DHA和EPA的纯化微生物油形式。

17.宠物食品，其包含单一微生物来源的二十碳五烯酸(“EPA”)和二十二碳六烯酸(“DHA”)。

18.权利要求17所述的宠物食品，其包含总量为至少约0.04％的EPA和DHA，所述量以所述宠物食品的重量百分比计。

19.权利要求17或18所述的宠物食品，其中基于所述微生物来源或所述宠物食品中EPA和DHA各自的浓度，EPA的浓度与DHA的浓度之比为至少0.2:1。

20.权利要求17-19中任一项所述的宠物食品，其中所述微生物来源是微生物油，并且其中所述微生物油以选自以下的形式提供：生物质、经处理的生物质、部分纯化的油和纯化油，其中任何一种均获自所述微生物来源。

21.权利要求17-20中任一项所述的宠物食品，其中所述微生物来源所源自的微生物是藻类、真菌或酵母。

22.权利要求21所述的宠物食品，其中所述微生物是Schizochytrium属或Thraustochytrium属的成员。

23.权利要求22所述的宠物食品，其中所述微生物具有以ATCC登记号PTA-10208或PTA-10209或PTA-10210或PTA-10211或PTA-10212或PTA-10213或PTA-10214或PTA-10215保藏的种的特征。