JP2014511406A - エイコサペンタエン酸濃縮物 - Google Patents
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Abstract
油の重量パーセントとして計測して少なくとも70重量パーセントのエイコサペンタエン酸[「EPA」;シス−5,8,11,14,17−エイコサペンタエン酸;ω−3]を含み、且つドコサヘキサエン酸を実質的に含まないω−3油濃縮物であって、前記濃縮物は、全脂肪酸の重量パーセントとして計測して30〜70重量パーセントのエイコサペンタエン酸を有し、且つドコサヘキサエン酸を実質的に含まない微生物油から得られ、及び前記微生物油は、乾燥細胞重量の25%超を油として蓄積する微生物から得られる。また、かかるエイコサペンタエン酸濃縮物の作製方法も開示される。
Description
本願は、2011年2月11日に出願された米国仮特許出願第61/441,854号明細書、及び2011年5月17日に出願された米国仮特許出願第61/487,019号明細書の利益を主張し、これらの出願は、本明細書によって全体として参照により援用される。
本発明は、長鎖多価不飽和脂肪酸シス−5,8,11,14,17−エイコサペンタエン酸[「EPA」]を含むω−3油濃縮物に関し、より詳細には、油の重量パーセントとして計測して少なくとも70重量パーセントのEPAを含み、且つシス−4,7,10,13,16,19−ドコサヘキサエン酸[「DHA」]を実質的に含まないEPA濃縮物に関する。
ω−3脂肪酸、例えば、α−リノレン酸[「ALA」](18:3)、ステアリドン酸[「STA」](18:4)、エイコサテトラエン酸[「ETrA」](20:3)、エイコサトリエン酸[「ETA」](20:4)、エイコサペンタエン酸[「EPA」](20:5)、ドコサペンタエン酸[「DPA」](22:5)及びドコサヘキサエン酸[「DHA」](22:6)などで食事を補うことにより得られる健康上の利益は広く認識されており、多くの臨床研究並びに他の既発表の一般文献及び特許文献によって裏付けられている。例えば、ω−3脂肪酸は、心血管疾患のリスク要因、特に軽度の高血圧症、高トリグリセリド血症に対して、及び凝固第VII因子リン脂質複合体活性に対して、有益な作用があることが見出されている。
エイコサペンタエン酸[「EPA」;シス−5,8,11,14,17−エイコサペンタエン酸;ω−3]に関して、この特定の脂肪酸の臨床的及び薬学的価値は十分に確立されている(特許文献1及び2)。EPAは、生物学的に活性なプロスタグランジンの生合成において重要な中間体である。加えて、EPAの以下の薬理作用が知られている:1)血小板凝固阻害作用(血栓溶解作用);2)血中中性脂肪降下作用;3)血中超低密度リポタンパク質[「VLDL」]コレステロール及び低密度リポタンパク質[「LDL」]コレステロール降下作用並びに血中高密度リポタンパク質[「HDL」]コレステロール(抗動脈硬化作用)上昇作用;4)血液粘性降下作用;5)血圧降下作用;6)抗炎症作用;及び、7)抗腫瘍作用。このように、EPAは、血中コレステロール及びトリグリセリドを降下させるための自然な手法を提供する。
EPA摂取量の増加は、冠動脈心疾患、高血圧、炎症性障害(例えば関節リウマチ)、肺疾患及び腎疾患、II型糖尿病、肥満症、潰瘍性大腸炎、クローン病、神経性食欲不振症、火傷、変形性関節症、骨粗鬆症、注意欠陥多動障害、及び結腸直腸癌の初期において有益である、又は好ましい効果があることが示されている。例えば、非特許文献1のレビュー、及び非特許文献2を参照のこと。最近の知見では、統合失調症などの精神障害の治療におけるEPAの使用も確認されている(特許文献3及び4)。結果として、EPAは、機能性食品(ニュートラシューティカルズ)、医療食品、乳幼児栄養、バルク栄養、化粧品及び動物の健康に関連する製品に用いられている。
ω−3脂肪酸の分野における研究は豊富にあるが、しかしながら多くの先行研究は、個々の長鎖ω−3脂肪酸(例えば、EPA及びDHA)が代謝的及び機能的に互いに異なり、従って各々が特異的な生理学的機能及び生物学的活性を有し得るという認識を欠いている。
この機構的明確さの欠如は、主として、臨床研究では純粋EPA又は純粋DHAを使用するのに対し、種々のω−3脂肪酸混合物を含有する魚油を使用する結果である[例えばメンヘーデン、タラ肝臓、イワシ及びカタクチイワシ由来の油の脂肪酸組成は、約0.9:1〜1.6:1のEPA:DHA比を有する油を含む(非特許文献3内のデータに基づく)]。加えて、魚油は相当量のコレステロールも含有し、従って魚油を日常的に摂取するとコレステロールの取込みが増加するため、血中脂質値のいかなる低下も相殺される。
OMACOR(登録商標)の商標で販売され、現在はLOVAZA(商標)として知られる医薬組成物があり[特許文献5〜7](Pronova Biocare A.S.,Lysaker,ノルウェー)、これは、DHA及びEPAのエチルエステルの組み合わせである。各カプセルが約430mg/g〜495mg/gのEPAと、347mg/g〜403mg/gのDHAとを含有し、総ω−3脂肪酸は90%(w/w)[「重量比」]である。
高用量のω−3脂肪酸には有意なトリグリセリド降下特性があることが知られている。米国では、空腹時トリグリセリドが500mg/dlを超える患者におけるトリグリセリドの降下に対し、1日4カプセルのω−3エチルエステル濃縮製剤が食品医薬品局(Food and Drug Administration)により承認されている。これらの1グラムカプセルは、各々が465mgのEPAと375mgのDHAとを含有し、4カプセル以内で合計1日量は1,860mgのEPA及び1,500mgのDHAとなる。この用量のこの製剤は、1日40mgのシンバスタチンを服用中のトリグリセリド値が200〜500mg/dlの対象で、プラセボと比べてトリグリセリド値を29.5%低下させ、HDLコレステロールを3.4%上昇させる(両方ともp<0.05)ことが報告されている(非特許文献4)。トリグリセリド値が500mg/dlを超える対象では、さらに大幅なトリグリセリドの低下が観察される。また、約1200mg/日の用量のDHAによりトリグリセリド値が約25%有意に降下し得ることも実証されている(非特許文献5;6)。
LOVAZA(商標)及び純粋EPAのいずれもがトリグリセリドを降下させることが示されているが、LOVAZA(商標)は、LDLコレステロールが上昇するという好ましくない結果と関連付けられており、一方、純粋EPAの補給がこの効果をもたらすことはない。この違いは、LOVAZA(商標)におけるDHAの存在に起因し得ると考えられる。従って、EPAを単独で用いて心血管に関する利益を実現できるものと思われるため、EPAを含み、且つDHAを実質的に含まないω−3治療法が好ましい。
個別の脂肪酸それぞれの薬理効果の区別を可能にする、実質的に純粋なEPAを用いた研究、及びそれとは別に実質的に純粋なDHAを用いた研究は、ほとんど実施されていない。一つの例外は日本EPA脂質介入試験(Japanese EPA Lipid Intervention Study)[「JELIS」]であり、これには、98%超精製EPAエチルエステル[EPA−EE」](持田製薬株式会社)をスタチンと併用した大規模無作為化比較試験が含まれた(非特許文献7;8)。EPA+スタチンの投与を受けている患者の心血管イベントが、スタチン単独の投与を受けている患者に対して19%低下したことが見出された。これは、EPAそれ自体が心保護的であるという強力な裏付けを提供する;DHAを用いた同様の試験は報告されていない。
いくつかの引用文献が、様々な製薬目的で高度に精製されたEPA組成物の使用を記載している。例えば:i)1981年12月9日に公開された特許文献8は、血栓塞栓性病態の治療におけるEPAの使用を記載し、ここでは脂肪酸組成の少なくとも50重量%がEPAでなければならない;ii)特許文献9は、少なくとも90%のEPA、好ましくは95%のEPAを含み、且つ5%未満、より好ましくは3%未満がDHAの形態である医薬調製物を開示している;iii)特許文献10(持田製薬株式会社)は、3−ヒドロキシ−3−メチルグルタリル補酵素A[「HMG−CoA」]レダクターゼ阻害薬との併用投与時に脳卒中の再発低下に有用な高純度EPA−EE[日本で商標エパデール(登録商標)及びエパデール(登録商標)Sとして販売されている]の投与について記載している;iv)2010年8月19日に公開された特許文献11は、高トリグリセリド血症を治療するためのEPA−EEの使用を記載している;v)2010年12月23日に公開された特許文献12は、少なくとも96重量%を含む超高純度EPAの投与による、スタチン療法中の対象においてトリグリセリドを降下させる方法を記載している;及び、vi)特許文献13は、EPAの投与により、リポタンパク質関連ホスホリパーゼA2[「Lp−PLA2」]値を維持し又は降下させ、易破裂性アテローム硬化性病変を安定化させ、炎症の指標を下げ、及びヒトにおけるTotal Omega−3 score(商標)を上昇させる方法について記載している。
EPA及び他の長鎖多価不飽和(polyunsatured)脂肪酸は、極めて類似した物理的特性(例えば、類似の蒸気圧、溶解度、及び吸着特性)を有するため、EPAを高純度に分離及び精製することは複雑である。様々な天然の供給源由来の脂肪酸混合物のEPA含有分を高濃度化する様々な方法(例えば、低温結晶化、尿素アダクト形成、分留、高圧液体クロマトグラフィー、銀塩処理、超臨界二酸化炭素[「CO2」]クロマトグラフィー、向流カラムによる超臨界CO2分画、疑似移動床式クロマトグラフィー、実際の移動床式クロマトグラフィー等及びそれらの組み合わせ)が公知である。
例えば、数種の紅藻類及び緑藻類並びに海洋性珪藻類由来のEPAを高濃度化する下流処理方法が、以下に示すとおり記載されている。
(i)非特許文献9は、微細紅藻類ポルフィリディウム・クルエンツム(Porphyridium cruentum)からの精製を記載している。
(ii)非特許文献10は、微細藻類からの多価不飽和脂肪酸[「PUFA」]、例えばEPAの精製手段のレビューを提供している。
(iii)特許文献14は海洋性クロレラ属(Chlorella)の抽出法を開示し、ここでは得られた脂質組成物を溶媒分画に供することで中性脂肪が除去され、それにより極性脂質組成物が提供された。この極性脂質組成物を加水分解に供して遊離させた脂肪酸が回収され、それにより少なくとも60重量%のEPAを有する脂肪酸組成物が提供された。この脂肪酸組成物が尿素処理され、EPA含有量が93.0%まで高濃度化された。DHA含有量は開示されなかった。
(iv)特許文献15は、珪藻ニッチア・レビス(Nitzschia laevis)の酵素加水分解脂質からのEPA組成物の回収について記載し、これにより脂肪酸含有量は50〜60%のEPAを含み、アラキドン酸[「ARA」、ω−6]は5.5%未満で、DHAは実質的に含まなかった。例証はされていないが、EPAを95%〜99%までさらに精製し、ARAを1%未満及びDHAを0.1%未満とし得ることが示唆された。
(i)非特許文献9は、微細紅藻類ポルフィリディウム・クルエンツム(Porphyridium cruentum)からの精製を記載している。
(ii)非特許文献10は、微細藻類からの多価不飽和脂肪酸[「PUFA」]、例えばEPAの精製手段のレビューを提供している。
(iii)特許文献14は海洋性クロレラ属(Chlorella)の抽出法を開示し、ここでは得られた脂質組成物を溶媒分画に供することで中性脂肪が除去され、それにより極性脂質組成物が提供された。この極性脂質組成物を加水分解に供して遊離させた脂肪酸が回収され、それにより少なくとも60重量%のEPAを有する脂肪酸組成物が提供された。この脂肪酸組成物が尿素処理され、EPA含有量が93.0%まで高濃度化された。DHA含有量は開示されなかった。
(iv)特許文献15は、珪藻ニッチア・レビス(Nitzschia laevis)の酵素加水分解脂質からのEPA組成物の回収について記載し、これにより脂肪酸含有量は50〜60%のEPAを含み、アラキドン酸[「ARA」、ω−6]は5.5%未満で、DHAは実質的に含まなかった。例証はされていないが、EPAを95%〜99%までさらに精製し、ARAを1%未満及びDHAを0.1%未満とし得ることが示唆された。
同様に、多くの参考文献が魚油由来の(又は魚油から得られた脂肪酸エチルエステルの混合物由来の)EPAの精製について記載している。例えば:
(i)非特許文献11は、ω−3 PUFAエステルの実験規模の高速液体クロマトグラフィー[「HPLC」]を記載している。
(ii)特許文献16は、エチルエステルへのエステル交換と、続く尿素処理及び分留を記載している。得られた生成物は、92.9%のEPA及び2.0%のDHAを含むことが報告された。
(iii)特許文献17は、少なくとも3つの蒸留塔のシステムを用いる低圧分留を開示している。この生成物は、C20の鎖長を有する脂肪酸[「C20」]を99.9%含
み、ここでC20画分の88%はEPAであった。C20画分の尿素処理によりEPA含有量は93%に増加した。
(iv)特許文献18は、(a)脂肪酸エチルエステル混合物を、(1)固定床式クロマトグラフィー又は(2)溶媒が超臨界圧で流体である多段階向流カラム分画のいずれかによって処理するステップ、及び少なくとも1つのPUFA高濃度化画分を回収するステップを含む精製方法を開示している。この方法はまた、(b)処理ステップで回収された画分を、疑似移動床式連続向流クロマトグラフィーによるさらなる分画に供するステップ、及び精製されたPUFA又はPUFA混合物が含まれる少なくとも1つの画分を回収するステップも含む。88%EPA及び0.8%DHA、及び>93%EPAの画分(DHA含有量は開示されなかった)が得られた。
(v)特許文献19は、99.9%のC20を含み、そのうち82.77%がEPAであった濃縮エステル混合物を生成するための高真空下での精密蒸留を開示している。EPA高濃度化混合物を高速液体クロマトグラフィーに供すると、99.5%のEPAを有する油が得られた(DHAは具体的には報告されなかったが、>C20の酸合計は0.30%であった)。
(vi)特許文献20は、複数の抽出カラムを用いた超臨界CO2抽出による魚油エチルエステルの精製を開示している。41.1%EPA及び17.3%DHAを含む脂肪酸エステル出発混合物から、90.8%EPA及び0.35%DHAを含む生成物が得られた。
(vii)特許文献21は、魚油に由来する脂肪酸エステルを3塔蒸留法で分画することによる82%EPAの主画分の生成を開示している。この主画分が銀塩処理によってさらに精製され、98.5%のEPA−EEが得られた。
(viii)特許文献22は、50%のEPA−EE含有量及び1.2%の最大アラキドン酸含有量を有する脂肪酸エステルの混合物から出発して、超臨界CO2を移動相として用いるカラムクロマトグラフィーにより少なくとも95%純度のEPA−EEを調製する方法を開示している。
(ix)特許文献23は、供給混合物からPUFA生成物を回収するためのクロマトグラフ分離方法を開示し、これは、アルコール水溶液を溶離液として含む複数の連結されたクロマトグラフィーカラムを有する疑似移動床式又は実際の移動床式クロマトグラフィー装置に供給混合物を導入するステップを含み、ここでこの装置は、少なくとも第1のゾーンと第2のゾーンとを含む複数のゾーンを有し、各ゾーンが抽出物の流れと抽残物の流れとを有して、ここから前記複数の連結されたクロマトグラフィーカラムからの液体を収集することができ、及びここで(a)極性がより高い成分と共にPUFA生成物を含む抽残物の流れが第1のゾーンのカラムから収集されて、第2のゾーンの隣接しないカラムに導入され、及び/又は(b)極性がそれほど高くない成分と共にPUFA生成物を含む抽出物の流れが第2のゾーンのカラムから収集されて、第1のゾーンの隣接しないカラムに導入され、前記PUFA生成物は各ゾーンにおいて供給混合物の種々の成分から分離される。様々な魚油由来の供給原料の精製により、85〜98%超のEPA EEが生成された。特許文献24は、魚油から高純度でEPA及びDHAを回収する方法を実証したが、この開示はまた、「遺伝子修飾された植物、動物及び酵母を含む微生物から得られた油を含めた合成供給源」から分画に好適な供給混合物を得ることができるとも述べている。さらに、「所望のPUFA生成物がEPAである場合、遺伝子修飾された酵母が特に好適である」。
(i)非特許文献11は、ω−3 PUFAエステルの実験規模の高速液体クロマトグラフィー[「HPLC」]を記載している。
(ii)特許文献16は、エチルエステルへのエステル交換と、続く尿素処理及び分留を記載している。得られた生成物は、92.9%のEPA及び2.0%のDHAを含むことが報告された。
(iii)特許文献17は、少なくとも3つの蒸留塔のシステムを用いる低圧分留を開示している。この生成物は、C20の鎖長を有する脂肪酸[「C20」]を99.9%含
み、ここでC20画分の88%はEPAであった。C20画分の尿素処理によりEPA含有量は93%に増加した。
(iv)特許文献18は、(a)脂肪酸エチルエステル混合物を、(1)固定床式クロマトグラフィー又は(2)溶媒が超臨界圧で流体である多段階向流カラム分画のいずれかによって処理するステップ、及び少なくとも1つのPUFA高濃度化画分を回収するステップを含む精製方法を開示している。この方法はまた、(b)処理ステップで回収された画分を、疑似移動床式連続向流クロマトグラフィーによるさらなる分画に供するステップ、及び精製されたPUFA又はPUFA混合物が含まれる少なくとも1つの画分を回収するステップも含む。88%EPA及び0.8%DHA、及び>93%EPAの画分(DHA含有量は開示されなかった)が得られた。
(v)特許文献19は、99.9%のC20を含み、そのうち82.77%がEPAであった濃縮エステル混合物を生成するための高真空下での精密蒸留を開示している。EPA高濃度化混合物を高速液体クロマトグラフィーに供すると、99.5%のEPAを有する油が得られた(DHAは具体的には報告されなかったが、>C20の酸合計は0.30%であった)。
(vi)特許文献20は、複数の抽出カラムを用いた超臨界CO2抽出による魚油エチルエステルの精製を開示している。41.1%EPA及び17.3%DHAを含む脂肪酸エステル出発混合物から、90.8%EPA及び0.35%DHAを含む生成物が得られた。
(vii)特許文献21は、魚油に由来する脂肪酸エステルを3塔蒸留法で分画することによる82%EPAの主画分の生成を開示している。この主画分が銀塩処理によってさらに精製され、98.5%のEPA−EEが得られた。
(viii)特許文献22は、50%のEPA−EE含有量及び1.2%の最大アラキドン酸含有量を有する脂肪酸エステルの混合物から出発して、超臨界CO2を移動相として用いるカラムクロマトグラフィーにより少なくとも95%純度のEPA−EEを調製する方法を開示している。
(ix)特許文献23は、供給混合物からPUFA生成物を回収するためのクロマトグラフ分離方法を開示し、これは、アルコール水溶液を溶離液として含む複数の連結されたクロマトグラフィーカラムを有する疑似移動床式又は実際の移動床式クロマトグラフィー装置に供給混合物を導入するステップを含み、ここでこの装置は、少なくとも第1のゾーンと第2のゾーンとを含む複数のゾーンを有し、各ゾーンが抽出物の流れと抽残物の流れとを有して、ここから前記複数の連結されたクロマトグラフィーカラムからの液体を収集することができ、及びここで(a)極性がより高い成分と共にPUFA生成物を含む抽残物の流れが第1のゾーンのカラムから収集されて、第2のゾーンの隣接しないカラムに導入され、及び/又は(b)極性がそれほど高くない成分と共にPUFA生成物を含む抽出物の流れが第2のゾーンのカラムから収集されて、第1のゾーンの隣接しないカラムに導入され、前記PUFA生成物は各ゾーンにおいて供給混合物の種々の成分から分離される。様々な魚油由来の供給原料の精製により、85〜98%超のEPA EEが生成された。特許文献24は、魚油から高純度でEPA及びDHAを回収する方法を実証したが、この開示はまた、「遺伝子修飾された植物、動物及び酵母を含む微生物から得られた油を含めた合成供給源」から分画に好適な供給混合物を得ることができるとも述べている。さらに、「所望のPUFA生成物がEPAである場合、遺伝子修飾された酵母が特に好適である」。
最後に、特許文献25が、60%のEPAを含有する脂肪酸混合物を銀塩処理により高濃度化して96.0%のEPAを含む生成物がもたらされることを開示している。銀塩処理を繰り返すと、EPA含有量は98.5%までさらに増加した。他の構成脂肪酸のアイデンティティも、60%EPA出発混合物の供給源も開示されなかった。
天然の海洋性供給源(例えば、魚、藻類)からEPAを精製するときに生じる一つの懸念は、これらの微生物中に、生物濃縮の結果として比較的高濃度の環境汚染物質が同時に存在することである。こうした環境汚染物質は、ポリ塩化ビフェニル[「PCB」](CAS番号1336−36−3)、臭素化難燃剤、農薬(例えば、トキサフェン及びジクロロジフェニルトリクロロエタン[「DDT」]及びその代謝物)、及び海洋環境に存在する潜在的に有害及び/又は有毒な他の有機化合物などの有毒成分である。特許文献26は、脂肪又は魚油などの油を含む混合物中の環境汚染物質の量を低減する方法を開示している。
しかしながら、汚染物質の懸念とは別に、地球規模の乱獲という点で見て、天然の海洋性供給源からEPAを精製する環境影響もまた考慮しなければならない。現在、水産養殖用の飼料組成物は全世界の魚油供給量の約87%を脂質供給源として使用していると推定される。年間の魚油生産量は1年あたり150万トンを超えては増加していないため、各産業は(急成長する水産養殖業を含め)、魚油の供給材料として有限の原料である遠洋性魚類に頼り続けることはできない。多くの組織が、魚油の利用可能性及び持続可能性に関する上記に指摘した限界を認識し、生成物及びそれが用いられる各産業におけるこの成分の重要な利益を維持しながらも魚油への依存を減らす代替的な成分を探している。従って、持続可能な供給源からの食用EPA濃縮物の生成は、海洋性供給源に比べ、肯定的な環境影響を有し得る。
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治療剤としてのEPAの高まる有益性及び増大する需要に鑑みて、改良されたEPA供給源、並びに適切な薬学的濃度にEPAを高濃度化する調製方法が必要とされている。好ましくは、食用とすることが意図される濃縮EPA油は、実質的にDHAを含まず、且つ実質的に環境汚染物質を含まない。
一実施形態において、本発明は、油の重量パーセントとして計測して少なくとも70重量パーセントのエイコサペンタエン酸[「EPA」]を含み、且つドコサヘキサエン酸[「DHA」]を実質的に含まないエイコサペンタエン酸濃縮物に関し、前記濃縮物は、全脂肪酸の重量パーセントとして計測して30〜70重量パーセントのエイコサペンタエン酸を含み、且つドコサヘキサエン酸を実質的に含まない微生物油から得られ、ここで前記微生物油は、乾燥細胞重量の25%超を油として蓄積する微生物から得られる。
第2の実施形態において、微生物油は:
a)全脂肪酸の重量パーセントとして計測して約1〜約25重量パーセントのリノール酸を含み;及び、
b)全脂肪酸の重量パーセントとして計測したエイコサペンタエン酸の、全脂肪酸の重量パーセントとして計測したリノール酸に対する比が、少なくとも1.2である。
a)全脂肪酸の重量パーセントとして計測して約1〜約25重量パーセントのリノール酸を含み;及び、
b)全脂肪酸の重量パーセントとして計測したエイコサペンタエン酸の、全脂肪酸の重量パーセントとして計測したリノール酸に対する比が、少なくとも1.2である。
第3の実施形態において、微生物油は、エイコサペンタエン酸の生成用に操作された、組換えヤロウイア属(Yarrowia)細胞の微生物バイオマスから得られる微生物油である。
第4の実施形態において、本発明は、本発明のエイコサペンタエン酸濃縮物を含む医薬生成物に関する。
第5の実施形態において、本発明は、油の重量パーセントとして計測して少なくとも70重量パーセントのエイコサペンタエン酸を含み、且つドコサヘキサエン酸を実質的に含まないエイコサペンタエン酸濃縮物の作製方法に関し、前記方法は、
a)全脂肪酸の重量パーセントとして計測して30〜70重量パーセントのエイコサペンタエン酸を含み、且つDHAを実質的に含まない微生物油であって、乾燥細胞重量の25%超を油として蓄積する微生物から得られる微生物油をエステル交換するステップ;及び、
b)ステップ(a)のエステル交換した油を高濃度化するステップであって、それにより油の重量パーセントとして計測して少なくとも70重量パーセントのエイコサペンタエン酸を含み、且つドコサヘキサエン酸を実質的に含まないエイコサペンタエン酸濃縮物を得るステップ
を含む。
a)全脂肪酸の重量パーセントとして計測して30〜70重量パーセントのエイコサペンタエン酸を含み、且つDHAを実質的に含まない微生物油であって、乾燥細胞重量の25%超を油として蓄積する微生物から得られる微生物油をエステル交換するステップ;及び、
b)ステップ(a)のエステル交換した油を高濃度化するステップであって、それにより油の重量パーセントとして計測して少なくとも70重量パーセントのエイコサペンタエン酸を含み、且つドコサヘキサエン酸を実質的に含まないエイコサペンタエン酸濃縮物を得るステップ
を含む。
ステップ(b)のエステル交換した油は、尿素アダクト形成、液体クロマトグラフィー、超臨界流体クロマトグラフィー、分留、疑似移動床式クロマトグラフィー、実際の移動床式クロマトグラフィー及びそれらの組み合わせからなる群から選択される方法により高濃度化され得る。
第6の実施形態において、本発明の方法は、全脂肪酸の重量パーセントとして計測したエイコサペンタエン酸の、全脂肪酸の重量パーセントとして計測したリノール酸に対する比が少なくとも1.2である微生物油の使用に関する。さらに、微生物油は、エイコサペンタエン酸の生成用に操作された、組換えヤロウイア属(Yarrowia)細胞の微生物バイオマスから得られる微生物油であってもよい。
第7の実施形態において、本発明のエイコサペンタエン酸濃縮物は、環境汚染物質を実質的に含まない。
第8の実施形態において、本発明は、油の重量パーセントとして計測して少なくとも70重量パーセントのエイコサペンタエン酸を含み、且つドコサヘキサエン酸を実質的に含まないエイコサペンタエン酸濃縮物を作製するための、全脂肪酸の重量パーセントとして計測して30〜70重量パーセントのエイコサペンタエン酸を有し、且つドコサヘキサエン酸を実質的に含まない微生物油の使用に関し、
ここで前記微生物油は、乾燥細胞重量の約25%超を油として蓄積する微生物から得られる。
ここで前記微生物油は、乾燥細胞重量の約25%超を油として蓄積する微生物から得られる。
第9の実施形態において、上記の実施形態のいずれかにおける微生物油は、濃縮されていない。
第10の実施形態において、上記の実施形態のいずれかにおける微生物油は、ノナデカペンタエン酸及びヘネイコサペンタエン酸からなる群から選択される脂肪酸を実質的に含まない。
第11の実施形態において、本発明のエイコサペンタエン酸濃縮物は、ノナデカペンタエン酸及びヘネイコサペンタエン酸からなる群から選択される脂肪酸を実質的に含まない。
生物寄託物
以下の生物材料は、米国培養細胞系統保存機関(American Type Culture Collection:ATCC)、10801 University Boulevard,Manassas,VA 20110−2209に寄託されており、以下の名称、受託番号及び寄託日を有する。
以下の生物材料は、米国培養細胞系統保存機関(American Type Culture Collection:ATCC)、10801 University Boulevard,Manassas,VA 20110−2209に寄託されており、以下の名称、受託番号及び寄託日を有する。
上掲の生物材料は、特許手続きのための微生物寄託の国際認識に関するブダペスト条約(Budapest Treaty on the International Recognition of the Deposit of Microorganisms for the Purposes of Patent Procedure)の条項に基づき寄託された。掲載される寄託物は、指示される国際寄託機関に少なくとも30年間維持され、それを開示する特許の付与に伴い一般に利用可能となる。寄託物が利用可能かどうかは、政府の行為によって付与される特許権を逸脱して本発明の実施許可をなすものではない。
ヤロウイア・リポリティカ(Yarrowia lipolytica)Y9502は、米国特許出願公開第2010−0317072−A1号明細書に記載される方法に係るY.リポリティカ(Y.lipolytica)Y8412に由来した。同様に、ヤロウイア・リポリティカ(Yarrowia lipolytica)Y8672は、米国特許出願公開第2010−0317072−A1号明細書に記載される方法に係るY.リポリティカ(Y.lipolytica)Y8259に由来した。
配列表
以下の配列は、米国特許法施行規則第1.821〜1.825条(「ヌクレオチド配列及び/又はアミノ酸配列の開示を含む特許出願に関する要件−配列規則(Requirements for Patent Applications Containing
Nucleotide Sequences and/or Amino Acid
Sequence Disclosures−the Sequence Rules)」)に準拠し、世界知的所有権機関(World Intellectual Property Organization:WIPO)標準ST.25(1998)並びにEPO及びPCTの配列表要件(規則第5.2条及び第49.5条(aの2)、及び実施細則第208条及び付録C)に従う。ヌクレオチド配列及びアミノ酸配列データに使用する記号及び形式は、米国特許法施行規則第1.822条に定められる規則に準拠する。
以下の配列は、米国特許法施行規則第1.821〜1.825条(「ヌクレオチド配列及び/又はアミノ酸配列の開示を含む特許出願に関する要件−配列規則(Requirements for Patent Applications Containing
Nucleotide Sequences and/or Amino Acid
Sequence Disclosures−the Sequence Rules)」)に準拠し、世界知的所有権機関(World Intellectual Property Organization:WIPO)標準ST.25(1998)並びにEPO及びPCTの配列表要件(規則第5.2条及び第49.5条(aの2)、及び実施細則第208条及び付録C)に従う。ヌクレオチド配列及びアミノ酸配列データに使用する記号及び形式は、米国特許法施行規則第1.822条に定められる規則に準拠する。
配列番号1〜8は、表1に特定されるとおり、遺伝子をコードするオープンリーディングフレーム、タンパク質(又はその一部分)、又はプラスミドである。
本明細書に引用される全ての特許、特許出願、及び刊行物は、全体として参照により援用される。
以下の定義を提供する。
「エイコサペンタエン酸」は「EPA」と略記される。
「米国培養細胞系統保存機関(American Type Culture Collection)」は「ATCC」と略記される。
「多価不飽和脂肪酸」は「PUFA」と略記される。
「トリアシルグリセロール」は「TAG」と略記される。
「全脂肪酸」は「TFA」と略記される。
「脂肪酸メチルエステル」は「FAME」と略記される。
「エチルエステル」は「EE」と略記される。
「乾燥細胞重量」は「DCW」と略記される。
「重量パーセント」は「wt%」と略記される。
本明細書で使用されるとき、用語「発明」又は「本発明」は、特許請求の範囲及び本明細書に記載されるとおりの本発明の全ての態様及び実施形態を指すよう意図され、任意の特定の実施形態又は態様に限定されるものとして読まれてはならない。
用語「医薬品」は、本明細書で使用されるとき、米国内で販売される場合に連邦食品・医薬品・化粧品法(Federal Food,Drug and Cosmetic Act)の第503条又は第505条によって規制されることになる化合物又は物質を意味する。
用語「エイコサペンタエン酸濃縮物」又は「EPA濃縮物」は、油のwt%として計測して少なくとも70wt%のEPAを含み、且つDHAを実質的に含まないω−3油を指す。油濃縮物は、全脂肪酸のwt%として計測して30〜70wt%のEPAを含み、且つDHAを実質的に含まない微生物油から得られ、ここで前記微生物油は、以下に詳述するとおり、乾燥細胞重量の25%超を油として蓄積する微生物から得られる。少なくとも70wt%のEPAは、遊離脂肪酸、トリグリセリド(例えばTAG)、エステル、及びそれらの組み合わせの形態であり得る。エステルは、最も好ましくはエチルエステルの形態である。
用語「微生物バイオマス」は、微生物発酵からの微生物細胞材料を指し、この細胞材料はEPAを含む。微生物バイオマスは、全細胞、全細胞溶解物、ホモジナイズした細胞、部分的に加水分解した細胞材料、及び/又は部分的に精製した細胞材料(例えば、微生物によって生成された油)の形態であってもよい。好ましい実施形態では、微生物バイオマスは、油性酵母ヤロウイア・リポリティカ(Yarrowia lipolytica)の組換え操作された株など、商業的に相当な量でEPAを生成する生成宿主の発酵からの消費後の又は使用済みの微生物細胞材料を指す。
用語「未処理微生物バイオマス」は、溶媒による抽出前の微生物バイオマスを指す。場合により、未処理微生物バイオマスは、溶媒で抽出する前に、機械的処理(mechnical processing)(例えば、バイオマスの乾燥、バイオマスの破壊、又はそれらの組み合わせによる)に供されてもよい。
本明細書で使用されるとき、用語「残渣バイオマス」は、溶媒(例えば、無機又は有機溶媒)で少なくとも1回抽出された、EPAを含む微生物発酵からの微生物細胞材料を指す。
用語「油」は、25℃で液体の、通常は多価不飽和の脂質物質を指す。油性生物では、油が全脂質の大部分をなし、主にトリアシルグリセロール[「TAG」]から構成されるが、他の中性脂質、リン脂質及び遊離脂肪酸もまた含有し得る。かかる油の中の特定の脂肪酸を精製又は高濃度化した後、その油は様々な化学的形態で(例えば、トリアシルグリセロール、アルキルエステル、塩又は遊離脂肪酸の形態で)存在し得る。油の脂肪酸組成及び全脂質の脂肪酸組成は、概して類似している;従って、全脂質におけるPUFA濃度の増加又は低下が、油におけるPUFA濃度の増加又は低下に対応することとなり、及び逆もまた同じである。
用語「抽出油」又は「粗製油」は(本明細書ではこれらの用語を同義的に使用することができるとおり)、油を合成した生物などの他の細胞材料から分離されている油を指す。抽出油は多種多様な方法によって得られ、そのうち最も単純なものは、物理的手段のみを伴う。例えば、様々なプレス構成(例えば、スクリュー、エキスペラー、ピストン、ビーズビーター等)を使用する機械的な破砕により、油を細胞材料と分離することができる。或いは、油の抽出は、様々な有機溶媒(例えばヘキサン)による処理、酵素抽出、浸透圧ショック、超音波抽出、超臨界流体抽出(例えば、CO2抽出)、鹸化及びこれらの方法の組み合わせによって行うこともできる。抽出油のさらなる精製又は濃縮は任意選択である。
用語「微生物油」は総称であり、従って、以下にさらに定義するとおり、非濃縮微生物油又は濃縮微生物油のいずれも指し得る。
用語「非濃縮微生物油」は、抽出によって得られた微生物油において1つ以上の脂肪酸が実質的に高濃度化されていないことを意味する。換言すれば、微生物の細胞材料から分離されていてもよい「非濃縮微生物油」の脂肪酸組成は、微生物によって生成されたままの油の脂肪酸組成と実質的に同様である。従って、本明細書で利用される非濃縮微生物油は、これらの油を生成する微生物が少なくとも30〜70EPA%TFAを含む脂肪酸組成を有するため、少なくとも30〜70EPA%TFAを含む。非濃縮微生物油は、非濃縮抽出油又は非濃縮精製油であってもよい。
当業者は理解し得るとおり、30EPA%TFA未満の微生物油から出発して、その微生物油が本発明のEPA濃縮物の作製に用いるのに十分な量のEPA%TFAを含むようにそれを処理することが可能である。
用語「精製油」は、リン脂質、微量金属、遊離脂肪酸、有色化合物、微量の酸化生成物、揮発性化合物及び/又は臭気化合物、及びステロール(例えば、エルゴステロール、ブラシカステロール、スチグマステロール、コレステロール)などの不純物の濃度が、抽出油中の不純物の濃度と比較して低下した微生物油を指す。精製プロセスは、典型的には、特定の1つ又は複数の脂肪酸が実質的に高濃度化されるようには微生物油を濃縮又は高濃度化せず、従って精製油はほとんどの場合に濃縮されていない。
用語「蒸留」は、沸騰液体混合物のその揮発度の差に基づく混合物の分離方法を指す。蒸留は単位操作であり、すなわち物理的分離プロセスである。
用語「短行程蒸留」[「SPD」]は、極高真空下で操作する分離方法を指し、ここでSPD装置は蒸発器に近接して内部凝縮器を備え、従って蒸発後の蒸留しようとする材料からの揮発性化合物が短い距離しか移動せずに表面に凝縮する。結果として、この分離方法による熱分解は最小限である。
用語「SPD精製油」は、1つ以上のPUFAを含むトリアシルグリセロール画分を含有する微生物油であって、SPD条件下で少なくとも1回蒸留プロセスを受けた油を指す。この蒸留プロセスにより、SPD前の油中のステロール含有量と比較して、SPD精製油中のステロールの量が低下する。SPDはエチルエステル、メチルエステル及び遊離脂肪酸を濃縮し得るが、このプロセスは典型的にはTAGを濃縮しない(例えば、超高温で操作して、ひいてはそれがTAGの分解をもたらさない限り)。抽出油中のPUFAの大部分はTAGの形態であり、且つSPDプロセスは典型的には、特定の1つ又は複数の脂肪酸が実質的に高濃度化されるようにはTAGを濃縮せず、SPD精製油は、本明細書に記載される目的上、ほとんどの場合に濃縮されていないと考えられる。
用語「エステル交換」は、酸性又は塩基性触媒によって触媒される化学反応を指し、ここでは脂肪酸のあるエステルが、その脂肪酸の別のエステルに変換される。
用語「高濃度化」は、非濃縮微生物油中の1つ以上の脂肪酸の濃度と比べて、微生物油中のその1つ以上の脂肪酸の濃度を増加させるプロセスを指す。従って、本明細書において考察されるとおり、TFAのwt%として計測して30〜70wt%のEPAを含む微生物油を高濃度化又は濃縮することで、油のwt%として計測して少なくとも70wt%のEPAを含むEPA濃縮物が生成される。
用語「脂肪酸」は、約C12〜C22(又はC12〜C22、ここで数字は鎖中の炭素[「C」]原子の総数を指す)の様々な鎖長の長鎖脂肪族系酸(アルカン酸)を指し、しかしながらより長い鎖長の酸及びより短い鎖長の酸のいずれも知らている。主な鎖長はC16〜C22である。脂肪酸の構造は「X:Y」の単純な表記法で表され、ここでXは特定の脂肪酸中の炭素[「C」]原子の総数であり、Yは二重結合の数である。「飽和脂肪酸」と「不飽和脂肪酸」、「一価不飽和脂肪酸」と「多価不飽和脂肪酸」[「PUFA」]、及び「ω−6脂肪酸」[「ω−6」又は「n−6」]と「ω−3脂肪酸」[「ω−3」又は「n−3」]の区別に関するさらなる詳細は、米国特許第7,238,482号明細書(これは本明細書によって参照により本明細書に援用される)に提供される。
本明細書でPUFAを記載するのに用いられる命名法を表2に示す。「略記法」と題される欄には、ω基準系を使用して炭素の数、二重結合の数及びω炭素に最も近い二重結合の、ω炭素(本目的上、これが1と付番される)から数えた位置を示す。表中の残りは、ω−3及びω−6脂肪酸及びそれらの前駆物質の一般名、本明細書全体を通じて用いられる略称及び各化合物の化学名を要約する。
従って、用語「エイコサペンタエン酸」[「EPA」]は、シス−5,8,11,14,17−エイコサペンタエン酸の一般名である。この脂肪酸は20:5 ω−3脂肪酸である。用語EPAは、本開示で使用されるとき、特に具体的に言及されない限り、酸又は酸の誘導体(例えば、グリセリド、エステル、リン脂質、アミド、ラクトン、塩など)を指し得る。例えば「EPA−EE」は、具体的にはEPAエチルエステルを指し得る。
「ドコサヘキサエン酸」[「DHA」]は、シス−4,7,10,13,16,19−ドコサヘキサエン酸の一般名である;この脂肪酸は22:6 ω−3脂肪酸である。用語DHAは、本開示で使用されるとき、特に具体的に言及されない限り、酸又は酸の誘導体(例えば、グリセリド、エステル、リン脂質、アミド、ラクトン、塩など)を指し得る。
「ノナデカペンタエン酸」[「NDPA」]は、シス−5,8,11,14,17−ノナデカペンタエン酸の一般名である;この脂肪酸は19:5 ω−2脂肪酸である。「ヘネイコサペンタエン酸」[「HPA」]は、シス−6,9,12,15,18−ヘネイコサペンタエン酸の一般名である;この脂肪酸は21:5 ω−3脂肪酸である。これらの脂肪酸はいずれも魚油によく見られる。魚油から生成された濃縮EPAは、最終的なEPA組成にこれらの脂肪酸を不純物として含有することが多い(例えば、米国特許出願公開第2010−0278879号明細書及び国際公開第2010/147994 A1号パンフレットを参照のこと)。用語NDPA及びHPAは、本開示で使用されるとき、特に具体的に言及されない限り、それぞれの酸又は酸の誘導体(例えば、グリセリド、エステル、リン脂質、アミド、ラクトン、塩など)を指し得る。
用語「脂質」は、任意の脂溶性(すなわち親油性)の天然に存在する分子を指す。脂質の全般的な概説が、米国特許出願公開第2009−0093543−A1号明細書に提供される(そのなかの表2を参照のこと)。
用語「トリアシルグリセロール」[「TAG」]は、グリセロール分子にエステル結合した3つの脂肪酸アシル残基から構成される中性脂質を指す。TAGは、長鎖PUFA及び飽和脂肪酸、並びにそれより短鎖の飽和及び不飽和脂肪酸を含み得る。生体では、グリセロール骨格がPUFA分子の貯蔵のための又は輸送中の安定化を促進するため、TAGは主要な脂肪酸貯蔵単位である。対照的に、遊離脂肪酸は急速に酸化される。
「脂肪酸エチルエステル」[「FAEE」]は、概して、エステル化又はエステル交換のプロセスで遊離脂肪酸又はその誘導体をエタノールと反応させることにより合成的に誘導される脂質の化学的形態を指す。
用語「全脂肪酸」[「TFA」]は、本明細書では、例えば微生物バイオマス又は油であってよい所与の試料中の、塩基性エステル交換法(当該技術分野において公知のとおりの)により脂肪酸メチルエステル[「FAME」]に誘導体化することのできるあらゆる細胞脂肪酸の合計を指す。従って、TFAには、中性脂質画分(ジアシルグリセロール、モノアシルグリセロール及びTAGを含む)及び極性脂質画分(例えば、ホスファチジルコリン及びホスファチジルエタノールアミン画分を含む)からの脂肪酸が含まれ、しかし遊離脂肪酸は含まれない。
細胞の「全脂質含有量」という用語は、乾燥細胞重量[「DCW」]の百分率としてのTFAの尺度であるが、しかしながら全脂質含有量は、DCWの百分率としてのFAME[「FAME%DCW」]の尺度として近似することができる。従って、全脂質含有量[「TFA%DCW」]は、例えば、DCW100ミリグラムあたりの全脂肪酸のミリグラム数と等価である。
全脂質中の脂肪酸の濃度は、本明細書では、TFAの重量パーセント[「%TFA」]、例えば、TFA100ミリグラムあたりの所与の脂肪酸のミリグラム数として表される。この計測単位は、微生物細胞中及び微生物油中における例えばEPAの濃度を記載するために用いられる。
油中の脂肪酸エステル(及び/又はそれぞれ脂肪酸及び/又はトリグリセリド)の濃度は、油の重量パーセント[「%油」]、例えば油100ミリグラムあたりの所与の脂肪酸エステル(及び/又はそれぞれ脂肪酸及び/又はトリグリセリド)のミリグラム数として表される。この計測単位は、EPA濃縮物中におけるEPAの濃度を記載するために用いられる。
ある場合には、細胞中における所与の1つ又は複数の脂肪酸の含有量を、その乾燥細胞重量の重量パーセント[「%DCW」]として表すことが有用である。従って、例えば、EPA%DCWは、以下の式に従い決定され得る:(EPA%TFA)*(TFA%DCW)]/100。しかしながら、その乾燥細胞重量の重量パーセント[「%DCW」]としての細胞中における所与の1つ又は複数の脂肪酸の含有量は、(EPA%TFA)*(FAME%DCW)]/100として近似することができる。
用語「脂質プロファイル」及び「脂質組成」は同義に扱うことができ、特定の脂質画分、例えば全脂質又は油に含まれる個々の脂肪酸の量を指し、ここでその量は、TFAの重量パーセントとして表される。混合物中に存在する個別の脂肪酸それぞれの合計は100でなければならない。
用語「油性」は、そのエネルギー源を脂質の形態で貯蔵する傾向をもつ生物を指す(Weete,所収:Fungal Lipid Biochemistry,第2版,Plenum,1980)。油性微生物は、その乾燥細胞重量の約25%超を油として蓄積することも珍しくない。油性微生物中の細胞性の油又はTAGの含有量は概してS字形曲線に従い、ここでは脂質の濃度が、後期対数増殖期又は初期定常増殖期に最大に達するまで増加し、次に後期定常期及び死滅期の間に徐々に低下する(Yongmanitchai及びWard,Appl.Environ.Microbiol.57:419−25(1991))。
用語「油性酵母」は、油を作る酵母に分類される微生物を指す。油性酵母の例としては、何ら限定されるものではないが、以下の属が挙げられる:ヤロウイア属(Yarrowia)、カンジダ属(Candida)、ロドトルラ属(Rhodotorula)、ロドスポリジウム属(Rhodosporidium)、クリプトコッカス属(Cryptococcus)、トリコスポロン属(Trichosporon)及びリポマイセス属(Lipomyces)。
用語「DHAを実質的に含まない」は、約0.05重量パーセント以下のDHAを含むことを意味する。従って、EPA濃縮物は、油のwt%として計測してDHA(遊離脂肪酸、トリアシルグリセロール、エステル、及びそれらの組み合わせの形態)の濃度が約0.05wt%以下のDHAである場合、DHAを実質的に含まない。同様に、微生物油は、TFAのwt%として計測してDHAの濃度が約0.05wt%以下のDHAである場合、DHA(遊離脂肪酸、トリアシルグリセロール、エステル、及びそれらの組み合わせの形態)を実質的に含まない。
用語「NDPAを実質的に含まない」及び「HPAを実質的に含まない」は、用語「DHAを実質的に含まない」について上記に提供されるが、但しそれぞれ脂肪酸NDPA又はHPAをDHAに代用した定義と同様である。
用語「環境汚染物質を実質的に含まない」は、油又はEPA濃縮物が、それぞれ、環境汚染物質を含まないか、又は環境汚染物質を含んでいても高々痕跡量に過ぎないことを意味し、ここで環境汚染物質には、ポリ塩化ビフェニル[「PCB」](CAS番号1336−36−3)、ダイオキシン、臭素化難燃剤及び農薬(例えば、トキサフェン及びジクロロジフェニルトリクロロエタン[「DDT」]及びその代謝物)などの化合物が含まれる。
本発明は、油のwt%として計測して少なくとも70wt%のEPAを含み、且つDHAを実質的に含まないEPA濃縮物に関し、前記濃縮物は、TFAのwt%として計測して30〜70wt%のEPAを含み、且つDHAを実質的に含まない微生物油から得られ、ここで前記微生物油は、乾燥細胞重量の25%超を油として蓄積する微生物から得られる。EPA濃縮物は、好ましくは環境汚染物質を実質的に含まない及び/又は好ましくはNDPA及びHPAからなる群から選択される少なくとも1つの脂肪酸を実質的に含まない。
本発明は上記に関連するが、微生物油それ自体を得るために有用であり得る関連プロセスの概要は理解されるであろう(但しこれは、本明細書における発明を限定するものとして解釈されてはならない)。図1にフローチャートの形式で図示するとおり、ほとんどのプロセスは微生物発酵から開始され、ここでは特定の微生物が、成長及びPUFA生成を可能にする条件下で培養される。適切なタイミングで微生物細胞が発酵槽から回収される。少なくとも30〜70wt%のEPAを含み、且つDHAを実質的に含まないこの未処理微生物バイオマスは、乾燥、破壊、ペレット化等の様々な機械的な処理に供されてもよい。次に未処理微生物バイオマスの油抽出が実施され、残渣バイオマス(例えば細胞残屑)と抽出油とが生じる。次に抽出油を直接エステル交換して高濃度化すると、油のwt%として計測して少なくとも70wt%のEPAを含み、且つDHAを実質的に含まないEPA濃縮物が生成され得る;又は抽出油は、初めに精製し、次にエステル交換及び高濃度化に供してもよい。例えば精製油は、i)脱ガム、リファイニング、脱色、及び/又は脱臭等により;又は、ii)短行程蒸留(SPD)条件を用いる蒸留によって精製TAG画分(すなわちSPD精製微生物油)とステロールを含む留出画分とを生じさせることにより、生成することができる。図1のこれらの態様の各々を、以下でさらに詳細に考察する。
本明細書の発明において有用な微生物油は、典型的には微生物発酵により提供される微生物バイオマスに由来する。様々な油性微生物(真菌、藻類、ユーグレナ藻、ストラメノパイル、酵母又は任意の他の単細胞生物など)を微生物発酵で成長させて、TFAのwt%として計測して少なくとも30wt%のEPAを含有する脂質を生成することができる。従って、天然に存在するものか、又は組換えかに関わらず、その乾燥細胞重量の25%超を油として蓄積する任意の微生物であって、TFAのwt%として計測して少なくとも30wt%のEPAを生成する能力を有する微生物が、本明細書に記載される高濃度化プロセスで用いるのに好適な微生物油供給源を提供し得る。好ましくは、微生物は高度なEPA生成能力を有し、ここで前記生成は、好ましくは微生物宿主の少なくとも約30〜50EPA%TFA、より好ましくは少なくとも約50〜60EPA%TFA、及び最も好ましくは少なくとも約60〜70EPA%TFAである。
他方で、TFAのwt%として計測して少なくとも30wt%未満のEPAの生成能力である油性微生物もまた、好適な非濃縮微生物油供給源を提供することができ、この非濃縮微生物油は、本発明のEPA濃縮物の作製に用いるため、TFAのwt%として計測して少なくとも30wt%のEPAを含むように処理/濃縮され得る。
微生物は必ず、少なくともEPAを含まなければならないが、生物中にはまた、例えば、リノール酸、γ−リノレン酸、エイコサジエン酸、ジホモγリノレン酸、アラキドン酸、ドコサテトラエン酸、ω−6ドコサペンタエン酸、α−リノレン酸、ステアリドン酸、エイコサトリエン酸、エイコサテトラエン酸、ω−3ドコサペンタエン酸、及びこれらの混合物などの、様々な他の多価不飽和脂肪酸も存在し得る。
EPAは、従属栄養珪藻類のキクロテラ・エスピー(Cyclotella sp.)及びニッチア・エスピー(Nitzschia sp.)(米国特許第5,244,921号明細書)、シュードモナス属(Pseudomonas)、アルテロモナス属(Alteromonas)及びシュワネラ属(Shewanella)の種(米国特許第5,246,841号明細書)、ピシウム属(Pythium)の糸状菌類(米国特許第5,246,842号明細書)、モルティエレラ・エロンガタ(Mortierella elongata)、M.エクシグア(M.exigua)、及びM.ヒグロフィラ(M.hygrophila)(米国特許第5,401,646号明細書)、及びナンノクロロプシス属(Nannochloropsis)の真正眼点藻類(Krienitz,L.及びM.Wirth,Limnologica,36:204−210(2006))を含めた様々な非油性及び油性微生物で自然に生成されるが、組換え手段を用いた微生物EPA生成には、天然の微生物供給源からの生成と比べていくつかの利点があるものと予想される。
組換え微生物は、宿主における新しい生合成経路の導入、望ましい経路の過剰発現により、及び/又は望ましくない経路の抑制により、宿主の天然に存在する微生物脂肪酸プロファイルを変化させて、それにより所望のPUFA(又はそのコンジュゲート形態)の生成レベルの増加、及び望ましくないPUFAの生成の低下をもたらすことができるため、油の生成に好ましい特性を有し得る。第二に、組換え微生物は、特別な用途を有し得る特定の形態のPUFAを提供することができる。加えて、培養条件を制御することにより、特に、微生物が発現する酵素用の特定の基質供給源を提供することによるか、又は化合物を添加する/望ましくない生化学的経路が抑制されるように遺伝子操作することにより、微生物油の生成を操作することができる。従って、例えば、そのように生成されたω−3脂肪酸のω−6脂肪酸に対する比を改良したり、又は他のPUFA下流又は上流生成物(例えばDHA)の多量の蓄積なしに特定のPUFA(例えばEPA)の生成を操作したりすることが可能である。高度に制御された培養条件はまた、このような組換え微生物から得られる微生物油が環境汚染物質を含まないことを確実にする。
従って、例えば、EPAを作る天然の能力を欠いている微生物を、適切なPUFA生合成経路遺伝子、例えばΔ5デサチュラーゼ、Δ6デサチュラーゼ、Δ12デサチュラーゼ、Δ15デサチュラーゼ、Δ17デサチュラーゼ、Δ9デサチュラーゼ、Δ8デサチュラーゼ、Δ9エロンガーゼ、C14/16エロンガーゼ、C16/18エロンガーゼ及びC18/20エロンガーゼの導入により、PUFA生合成経路を発現するように操作することができ、しかしながら、導入される具体的な酵素(及びそれらの酵素をコードする遺伝子)は、決して本明細書の本発明を限定するものではないことが認識されなければならない。
例として、数種の酵母が、EPAを生成するように組換え操作されている。例えば、非油性酵母のサッカロミセス・セレビシエ(Saccharomyces cerevisiae)(米国特許第7,736,884号明細書)及び油性酵母のヤロウイア・リポリティカ(Yarrowia lipolytica)(米国特許第7,238,482号明細書;米国特許第7,932,077号明細書;米国特許出願公開第2009−0093543−A1号明細書;米国特許出願公開第2010−0317072−A1号明細書)における研究を参照のこと。これらの例は、本明細書における限定として解釈されてはならない。
一部の実施形態では、微生物宿主細胞が油性である場合に利点が認められる。油性酵母は、天然で油を合成及び蓄積する能力を有し、ここでは細胞乾燥重量の約25%より高く、より好ましくは細胞乾燥重量の約30%より高く、及び最も好ましくは細胞乾燥重量の約40%より高い総油含有量が含まれ得る。代替的実施形態において、非油性酵母、例えばサッカロミセス・セレビシエ(Saccharomyces cerevisiae)などの酵母を油性になるよう遺伝子修飾することで、細胞乾燥重量の25%超の油を生成できるようにし得る(国際公開第2006/102342号パンフレット)。
典型的に油性酵母と特定される属としては、限定はされないが、ヤロウイア属(Yarrowia)、カンジダ属(Candida)、ロドトルラ属(Rhodotorula)、ロドスポリジウム属(Rhodosporidium)、クリプトコッカス属(Cryptococcus)、トリコスポロン属(Trichosporon)及びリポマイセス属(Lipomyces)が挙げられる。より具体的には、例示的な油合成酵母として、ロドスポリジウム・トルロイデス(Rhodosporidium toruloides)、リポマイセス・スタルケイ(Lipomyces starkeyii)、L.リポフェルス(L.lipoferus)、カンジダ・レブカウフィ(Candida revkaufi)、C.プルケリマ(C.pulcherrima)、C.トロピカリス(C.tropicalis)、C.ウチリス(C.utilis)、トリコスポロン・プルランス(Trichosporon pullans)、T.クタネウム(T.cutaneum)、ロドトルラ・グルチニス(Rhodotorula glutinus)、R.グラミニス(R.graminis)、及びヤロウイア・リポリティカ(Yarrowia lipolytica)(以前はカンジダ・リポリティカ(Candida lipolytica)に分類されていた)が挙げられる。
例として、本明細書における好ましい実施形態では、TFAのwt%として計測して少なくとも30wt%のEPAを含む微生物油の供給源は、油性酵母ヤロウイア・リポリティカ(Yarrowia lipolytica)の操作された株由来である。より好ましくは、例えば、米国特許出願公開第2009−0093543−A1号明細書(この一部は、少なくとも約43.3wt%のEPAを含み、且つDHAを実質的に含まない非濃縮微生物油を生成する)及び米国特許出願公開第2010−0317072−A1号明細書(この一部は、少なくとも50wt%のEPAを含み、且つDHAを実質的に含まない非濃縮微生物油を生成する)に記載される株から得られる微生物油である。また、本明細書では、これらの組換えY.リポリティカ(Y.lipolytica)株のいずれかがさらなる遺伝子操作改良(本明細書の実施例5に記載されるものなど)に供されてもよく、ひいては本明細書に記載される組成物及び方法に好適な微生物油供給源となり得ることも企図される。従って、好ましい微生物油は、EPAの生成用に操作された、組換えヤロウイア属(Yarrowia)細胞の微生物バイオマスから得られ、ここで微生物油は:
a)TFAのwt%として計測して30〜70wt%のEPAを含み、且つDHAを実質的に含まず;
b)TFAのwt%として計測して約1〜約25wt%のリノール酸を含み;
c)TFAのwt%として計測したEPAの、TFAのwt%として計測したリノール酸に対する比が少なくとも1.2であり;及び、
d)好ましくはNDPA及び/又はHPAを実質的に含まない。
a)TFAのwt%として計測して30〜70wt%のEPAを含み、且つDHAを実質的に含まず;
b)TFAのwt%として計測して約1〜約25wt%のリノール酸を含み;
c)TFAのwt%として計測したEPAの、TFAのwt%として計測したリノール酸に対する比が少なくとも1.2であり;及び、
d)好ましくはNDPA及び/又はHPAを実質的に含まない。
より具体的には、米国特許出願公開第2009−0093543−A1号明細書が、最適化された組換えヤロウイア・リポリティカ(Yarrowia lipolytica)株における高度EPA生成について記載している。少なくとも約43.3EPA%TFAを含み、約23.6LA%TFA未満(1.83のEPA:LA比)及び約9.4オレイン酸%TFA未満である微生物油を生成する能力を有する株が開示されている。好ましい株はY4305であり、これは33.2EPA%TFAを生成する能力を有し、発酵の途中のEPA:LA比は1.25で、その最大生成は55.6EPA%TFA、3.03のEPA:LA比であった。概して、米国特許出願公開第2009−0093543−A1号明細書のEPA生成株は、以下のω−3/ω−6脂肪酸生合成経路遺伝子を含んだ:a)Δ9エロンガーゼをコードする少なくとも1つの遺伝子;b)Δ8デサチュラーゼをコードする少なくとも1つの遺伝子;c)Δ5デサチュラーゼをコードする少なくとも1つの遺伝子;d)Δ17デサチュラーゼをコードする少なくとも1つの遺伝子;e)Δ12デサチュラーゼをコードする少なくとも1つの遺伝子;f)C16/18エロンガーゼをコードする少なくとも1つの遺伝子;及び、g)場合により、ジアシルグリセロールコリンホスホトランスフェラーゼ[「CPT1」]をコードする少なくとも1つの遺伝子。この経路は宿主細胞に遺伝子操作されるため、EPAのDPAへの伸長(C20/22エロンガーゼにより触媒される)及びDPAのDHAへの不飽和化(Δ4デサチュラーゼにより触媒される)のための適切な酵素活性を欠くことに起因して、DHAが同時に生成されることがない。この開示もまた、概して、これらの操作された酵母株から得られる微生物油及びその油濃縮物について記載した。
ヤロウイア・リポリティカ(Yarrowia lipolytica)Y4305株の誘導体が米国特許出願第12/854449号明細書(代理人整理番号「CL5143USNA」、2010年8月11日に出願され、且つ本明細書によって参照により本明細書に援用される)に記載され、Y.リポリティカ(Y.lipolytica)Y4305 F1B1株として知られる。2リットル発酵で成長させると(米国特許出願公開第2009−009354−A1号明細書の実施例10と同様のパラメータ)、Y4305株の平均EPA生成率[「EPA%DCW」]は、Y4305−F1B1株の50〜52と比較したとき、50〜56であった。Y4305株の平均脂質含有量[「TFA%DCW」]は、Y4305−F1B1株の28〜32と比較したとき、20〜25であった。従って、脂質含有量はY4503−F1B1株で29〜38%増加し、EPA生成率に対する影響は最小限であった。
米国特許出願公開第2010−0317072−A1号明細書及び米国特許出願公開第2010−0317735−A1号明細書は、米国特許出願公開第2009−0093543−A1号明細書に記載される株と比べて、EPA%TFA及びEPA:LA比に基づくとさらに改良された微生物油を生成する能力を有する最適化された組換えY.リポリティカ(Y.lipolytica)株を教示する。米国特許出願公開第2009−0093543−A1号明細書に詳述されるとおりω−3/ω−6脂肪酸生合成経路の遺伝子を発現することに加え、これらの改良株は、a)少なくとも1つのマルチザイムを含み、ここで前記マルチザイムは、少なくとも1つの脂肪酸Δ8デサチュラーゼに連結された少なくとも1つの脂肪酸Δ9エロンガーゼ[「DGLAシンターゼ」]を有するポリペプチドを含むこと;b)場合により、マロニルCoAシンテターゼ又はアシル−CoAリゾリン脂質アシルトランスフェラーゼ[「LPLAT」]からなる群から選択される酵素をコードする少なくとも1つのポリヌクレオチドを含むこと;c)発現が下方制御されている少なくとも1つのペルオキシソームバイオジェネシス因子タンパク質を含むこと;d)少なくとも約50EPA%TFAを生成すること;及び、e)少なくとも約3.1のEPA:LA比を有することによって区別される。
具体的には、少なくとも約50EPA%TFAを有することに加え、米国特許出願公開第2010−0317072−A1号明細書及び米国特許出願公開第2010−0317735−A1号明細書の改良された最適化Y.リポリティカ(Y.lipolytica)株中、又はそれからの抽出油中の脂質プロファイルは、EPA%TFAのLA%TFAに対する比が少なくとも約3.1であり得る。改良された最適化組換えY.リポリティカ(Y.lipolytica)株によって生成される脂質はまた、GLA、NDPA、HPA又はDHAが0.05%未満であり、且つ飽和脂肪酸含有量が約8%未満であることによっても区別される。飽和脂肪酸(すなわち16:0及び18:0)の割合がこのように低いことは、ヒト及び動物の双方に有益である。
最近になって、米国特許出願第13/218708号明細書(代理人整理番号CL5411USNA、2011年8月26日出願、本明細書によって参照により本明細書に援用される)が、米国特許出願公開第2009−0093543−A1号明細書及び米国特許出願公開第2010−0317072−A1号明細書に記載される株と比べて、EPA生成率の増加(すなわち、EPA%DCWの増加として計測される)に基づくと改良された微生物油を生成する能力を有するさらに改良された最適化組換え微生物宿主細胞を記載している。ω−3/ω−6脂肪酸生合成経路の遺伝子であって、少なくとも1つのマルチザイム(ここで前記マルチザイムは、米国特許出願公開第2010−0317072−A1号明細書に記載されるとおりの、少なくとも1つの脂肪酸Δ8デサチュラーゼに連結された少なくとも1つの脂肪酸Δ9エロンガーゼ[「DGLAシンターゼ」]を有するポリペプチドを含む)を含む遺伝子を発現し、且つ発現が下方制御されている少なくとも1つのペルオキシソームバイオジェネシス因子タンパク質(米国特許出願公開第2009−0117253−A1号明細書及び同第2010−0317072−A1号明細書に記載されるとおり)を含むことに加え、この出願に開示される改良された組換え微生物宿主細胞は、
1)少なくともリゾホスファチジン酸アシルトランスフェラーゼ[「LPAAT」]活性を有する少なくとも2つのポリペプチドを含むこと;
2)少なくともリン脂質:ジアシルグリセロールアシルトランスフェラーゼ[「PDAT」]活性を有する少なくとも1つのポリペプチドを含むこと;
3)場合により、ユーグレナ・グラシリス(Euglena gracilis)に由来する少なくとも1つの合成突然変異体Δ9エロンガーゼポリペプチドを含むこと;及び、
4)DCWのwt%として計測して少なくとも25wt%のEPAを含む微生物油を生成すること
によってさらに区別される。
1)少なくともリゾホスファチジン酸アシルトランスフェラーゼ[「LPAAT」]活性を有する少なくとも2つのポリペプチドを含むこと;
2)少なくともリン脂質:ジアシルグリセロールアシルトランスフェラーゼ[「PDAT」]活性を有する少なくとも1つのポリペプチドを含むこと;
3)場合により、ユーグレナ・グラシリス(Euglena gracilis)に由来する少なくとも1つの合成突然変異体Δ9エロンガーゼポリペプチドを含むこと;及び、
4)DCWのwt%として計測して少なくとも25wt%のEPAを含む微生物油を生成すること
によってさらに区別される。
PUFA生合成経路を油性酵母に導入する手段は公知であるため、当業者は本発明の方法が、上記に記載されるY.リポリティカ(Y.lipolytica)株にも、また本発明を実証している種(すなわち、Y.リポリティカ(Y.lipolytica))又は属(すなわち、ヤロウイア属(Yarrowia))にも限定されないことを理解するであろう。代わりに、TFAのwt%として計測して少なくとも30wt%のEPAを生成する能力を有する任意の油性酵母又は任意の他の好適な油性微生物、例えば、真菌、藻類、ユーグレナ藻、ストラメノパイル、又は任意の他の単細胞生物であって、そこから得られる微生物油が微生物の乾燥細胞重量の25%超を油として蓄積するものが、本方法において等しく有用であり得る。
TFAのwt%として計測して30〜70wt%のEPAを含み、且つDHAを実質的に含まない微生物油を生成するため、油を生成する微生物は、EPAの生成を最適化することが微生物学又は発酵科学の技術分野の当業者に公知の標準的な条件下で成長させ得る。遺伝子操作された微生物に関して、微生物は、キメラ遺伝子(例えば、デサチュラーゼ、エロンガーゼ、DGLAシンターゼ、CPT1タンパク質、マロニルCoAシンテターゼ、アシルトランスフェラーゼ等をコードするもの)の発現を最適化し、且つ最も高く最も経済的なEPA収率を生じる条件下で成長させ得る。典型的には微生物には、炭素及び窒素源が、微生物の成長及び/又はEPAの生成を可能にする数多くの追加的な化学薬品又は物質と共に与えられる。発酵条件は、上記の引用に記載されるとおり用いられる微生物に依存し得るとともに、得られるバイオマスにおいて高含量のPUFAとなるよう最適化され得る。
一般に、培地条件は、炭素源の種類及び量、窒素源の種類及び量、炭素対窒素比、種々のミネラルイオンの量、酸素レベル、増殖温度、pH、バイオマス生成段階の長さ、油蓄積段階の長さ並びに細胞を回収するタイミング及び方法を改良することにより最適化され得る。
より具体的には、発酵培地は、米国特許第7,238,482号明細書及び米国特許出願公開第2011−0059204−A1号明細書に教示されるものなどの、好適な炭素源を含まなければならない。操作されたEPA生成微生物の成長に利用される炭素の供給源は多種多様な炭素含有供給源を包含し得ることが企図されるが、好ましい炭素源は、糖類、グリセロール及び/又は脂肪酸である。最も好ましくは、グルコース、スクロース、転化スクロース、フルクトース及び/又は10〜22個の炭素を含有する脂肪酸である。例えば、発酵性炭素源は、転化スクロース(すなわち、スクロースの加水分解によって得られる等しい部数のフルクトースとグルコースとを含む混合物)、グルコース、フルクトース及びそれらの組み合わせからなる群から選択することができ、但しグルコースは転化スクロース及び/又はフルクトースとの組み合わせで用いられるものとする。
窒素は、無機供給源(例えば(NH4)2SO4)又は有機供給源(例えば、尿素又はグルタミン酸塩)から供給されてもよい。適切な炭素源及び窒素源に加え、発酵培地はまた、好適なミネラル、塩、補因子、緩衝剤、ビタミン及び油性酵母の成長及びEPA生成に必須の酵素経路の促進に好適な当業者に公知の他の成分も含有しなければならない。脂質及びPUFAの合成を促進するいくつかの金属イオン(例えば、Fe+2、Cu+2、Mn+2、Co+2、Zn+2及びMg+2)に特に注意が払われる(Nakahara,T.ら,Ind.Appl.Single Cell Oils,D.J.Kyle及びR.Colin編pp 61−97(1992))。
好ましい成長培地は、酵母窒素原基礎培地(DIFCO Laboratories,Detroit,MI)などの一般的な商業的に調製された培地である。他の限定又は合成成長培地もまた用いることができ、ヤロウイア・リポリティカ(Yarrowia lipolytica)の成長に適切な培地は、微生物学又は発酵科学の技術分野の当業者には公知であろう。発酵に好適なpH範囲は、典型的には約pH4.0〜pH8.0であり、ここではpH5.5〜pH7.5が初期成長条件の範囲として好ましい。発酵は好気性又は嫌気性条件下で行われてもよい。
典型的には、油性酵母細胞における高度のPUFAの蓄積には、成長と脂肪の合成/貯蔵との間の代謝状態が「平衡」しなければならないため、二段階プロセスが必要である。従って、最も好ましくは、Y.リポリティカ(Y.lipolytica)におけるEPAの生成には二段階発酵プロセスが必要である。この手法は、様々な好適な発酵プロセス設計(すなわち、バッチ、フェドバッチ及び連続)及び成長の間の考慮事項と同様に、米国特許第7,238,482号明細書に記載されている。
微生物によって所望の量のEPAが生成されると、発酵培地を処理してPUFAを含む微生物バイオマスを得ることができる。例えば、発酵培地をろ過又は他の方法で処理して、水性成分の少なくとも一部を除去してもよい。発酵培地及び/又は微生物バイオマスは、さらに処理し得る;例えば、微生物バイオマスは、低温殺菌するか、又は他の手段によって処理することにより、微生物油及び/又はPUFA生成物に害を及ぼし得る内因性の微生物酵素の活性を低下させてもよい。微生物バイオマスは、例えばバイオマスの乾燥、バイオマスの破壊(例えば細胞溶解による)、バイオマスのペレット化、又はそれらの組み合わせにより、機械的に処理してもよい。微生物バイオマスは、例えば所望の含水量まで乾燥させて粒状化又はペレット化することで容易に取り扱えるようにし、及び/又は例えば、ビーズビーター、スクリュー押出し等の物理的手段によって機械的に破壊して、細胞含有分とのより高い接触性を提供してもよい。この微生物バイオマスは、これらの機械的処理工程のいずれかの後であっても、油の抽出はまだ行われていないため、未処理微生物バイオマスと称され得る。
微生物バイオマスを機械的に処理する好ましい方法の一つが、米国仮特許出願第61/441,836号明細書(代理人整理番号CL5053USPRV、2011年2月11日に出願された)及び米国特許出願第XX/XXX,XXX号明細書(代理人整理番号CL5053USNA(本願と同時出願された)(各々、参照により本明細書に援用される)に記載されている。具体的には、この方法には、油を吸収することが可能な粉砕助剤(例えば、シリカ、ケイ酸塩)を伴う乾燥させた酵母の二軸スクリュー押出しによる破壊されたバイオマス混合物の提供と、続いて結合剤(例えば、スクロース、ラクトース、グルコース、可溶性デンプン)を前記破壊されたバイオマス混合物とブレンドすることによる、固体ペレットを形成することが可能な固化可能な混合物の提供、及びその後の固化可能な混合物からの固体ペレット(例えば、約1mm直径×6〜10mm長さのもの)の形成(「ペレット化」)が関わる。
任意選択の機械的処理(mechnical processing)の後、微生物油は概して(必須ではないが)、油の抽出により、油を生成した微生物中に存在し得る他の細胞材料と分離される。
油の抽出は、様々な有機溶媒(例えば、ヘキサン、イソヘキサン)、酵素抽出、浸透圧ショック、超音波抽出、超臨界流体抽出(例えば、CO2抽出)、鹸化及びこれらの方法の組み合わせで処理することによって行われ得る。これらのプロセスにより、残渣バイオマス(すなわち、細胞残屑等)と、好ましくはTFAのwt%として計測して30〜70wt%のEPAを含み、且つDHAを実質的に含まない抽出油とが生じ得る。
超臨界流体抽出を用いる場合、任意の好適な超臨界流体又は液体溶媒を用いてEPA含有油をバイオマスと分離し得る(例えば、CO2、テトラフルオロメタン(tetrafluromethane)、エタン、エチレン、プロパン、プロピレン、ブタン、イソブタン、イソブテン、ペンタン、ヘキサン、シクロヘキサン、ベンゼン、トルエン、キシレン、及びこれらの混合物、但し、超臨界流体は全ての試薬及び生成物に対して不活性であるものとする);より好ましい溶媒には、CO2又はC3〜C6アルカン(例えば、ペンタン、ブタン、及びプロパン)が含まれる。最も好ましい溶媒は、CO2を含む超臨界流体溶媒である。この抽出では脂肪酸組成は濃縮されず、従って回収される抽出油は非濃縮微生物油である。
好ましい実施形態では、米国特許出願公開第2011−0263709−A1号明細書(本明細書によって参照により本明細書に援用される)に開示されるとおりの超臨界二酸化炭素抽出が実施される。この特殊な方法は、未処理の破壊された微生物バイオマスを油抽出に供することにより、リン脂質を含む残渣バイオマスを除去し、次に得られた抽出物を少なくとも1回分画して、少なくとも1つのPUFAを含む精製された脂質組成を有する抽出油を得るもので、ここで精製された脂質組成は、未処理の破壊された微生物バイオマスの油組成と比べてTAGが高濃度化されている。
一部の実施形態では、TFAのwt%として計測して30〜70wt%のEPAを含み、且つDHAを実質的に含まない抽出油は、場合によりさらなる精製ステップを受ける。例えば、当業者は、脱ガム(例えば、それによりリン脂質、微量金属及び遊離脂肪酸を除去する)、リファイニング、脱色(例えば、それにより有色化合物及び微量の酸化生成物を吸着する)、及び/又は脱臭(例えば、それにより揮発性化合物、臭気化合物及び/又はさらなる有色化合物を除去する)の手順に精通しているであろう。これらの方法のいずれも、微生物油中のEPA濃度を実質的に高濃度化しないため、これらのプロセスの生成物は、たとえ精製された形態であっても、なお典型的には非濃縮微生物油と見なされる。この油中のEPA及び他のPUFAは、主としてその天然のトリグリセリド形態のままである。
或いは、TFAのwt%として計測して30〜70wt%のEPAを含み、且つDHAを実質的に含まない抽出油を蒸留して水分及び例えばステロールを除去することが望ましい場合もある。ステロールは、細胞の膜透過性において機能するもので、あらゆる主要な生物集団から単離されているが、単離される優勢なステロールには多様性がある。高等動物において優勢なステロールはコレステロールである一方、高等植物ではβ−シトステロールが一般に優勢なステロールである(しかしながらこれは多くの場合にカンペステロール及びスチグマステロールを伴う)。微生物に見られる1つ又は複数の優勢なステロールに関する一般化は、その組成が特定の微生物種に依存するため、さらに困難である。例えば、油性酵母ヤロウイア・リポリティカ(Yarrowia lipolytica)はエルゴステロールを優勢に含み、モルティエレラ属(Morteriella)の真菌はコレステロール及びデスモステロールを優勢に含み、及びシゾキトリウム属(Schizochytrium)のストラメノパイルはブラシカステロール及びスチグマステロールを優勢に含む。ステロール(例えばエルゴステロール)は、特に低い貯蔵温度ではTAGから相分離し、それにより微生物油に望ましくない混濁が生じることが観察されている。
米国仮特許出願第61/441,842号明細書(代理人整理番号CL5077USPRV、2011年2月11日に出願された)及び米国特許出願第XX/XXX,XXX号明細書(代理人整理番号CL5077USNA(本願と同時出願された)(各々、参照により本明細書に援用される)は、ステロール含有抽出油中のステロール含有量を低減する方法を記載し、この方法は、ステロール含有微生物油を短行程蒸留(SPD)の蒸留器に通す少なくとも1回のパスを含む。
市販のSPD蒸留器は、化学工業の技術分野で周知されている。好適な蒸留器は、例えばPope Scientific(Saukville,WI)から入手可能である。SPD蒸留器は蒸発器と内部凝縮器とを含む。典型的な蒸留は、蒸発器の温度、凝縮器の温度、蒸留器への油の供給速度及び蒸留器の真空レベルによって制御される。
当業者は理解し得るとおり、SPD蒸留器に通すパス回数は、ステロール含有微生物油の水分レベルに依存し得る。水分含有量が低い場合、シングルパスでSPD蒸留器に通せば十分であり得る。しかしながら好ましくは、蒸留は、2回以上の連続してステロール含有抽出油をSPD蒸留器に通すパスを含むマルチパスプロセスである。最初のパスは、典型的には約1〜50トル圧、及び好ましくは約5〜30トルのもと、比較的低い蒸発器の表面温度、例えば約100〜150℃で実施される。これにより、残留水及び低分子量有機材料が蒸留され、脱水された油が得られる。次に脱水した油を、蒸発器をより高温とし、及びより低圧で蒸留器に通すと、SPDに供されない油と比較したときステロールが高濃度化された留出画分と、ステロールの量が低下したTAG含有画分とがもたらされる。TAG含有画分のさらなるパスを行って蒸留器に通し、ステロールをさらに除去してもよい。好ましくは、ステロール含有微生物油中のステロール画分と比較したとき、ステロール画分の量の減少が少なくとも約40%〜70%、好ましくは少なくとも約70%〜80%、及びより好ましくは約80%超となるように、十分なパスが実施される。
より好ましくは:i)SPD条件は、30mトル以下、及び好ましくは5mトル以下の真空レベルにおけるステロール含有微生物油の少なくとも1回のパスを含む;ii)SPD条件は、約220〜300℃、及び好ましくは約240〜280℃における少なくとも1回のパスを含む;及び、iii)SPD条件は、300℃以下、及びより好ましくは280℃以下の蒸発器温度を有する。
SPDプロセスにより、SPDに供されていないステロール含有微生物油組成と比較したときステロール画分が低下して透明度が向上したTAG含有画分(すなわちSPD精製油)が得られる。透明度の向上とは、油に混濁又は不透明性がないことを指す。ステロール含有微生物油は、約10℃を下回る温度で保存すると、油中のステロールレベルが上昇することに起因して濁るようになる。蒸留プロセスがステロール画分の大部分を除去する働きをし、従って得られるTAG含有画分は存在するステロールの量が減少しているため、約10℃で保存しても透明なまま、又は実質的に透明なまま保たれる。油の透明度の評価に用い得る試験方法は、米国油脂化学協会(American Oil Chemists’Society:AOCS)の「Cold Test」と題されるOfficial Method Cc 11−53である(Official Methods and Recommended Practices of the AOCS,第6,Urbana,IL,AOCS Press,2009、参照により本明細書に援用される)。
驚くことに、蒸留プロセスにおけるステロールの除去は、プロセス前後のPUFA含有分の評価に基づけば、顕著な油の分解なしに達成することができる。
TFAのwt%として計測して30〜70wt%のEPAを含み、且つDHAを実質的に含まない精製微生物油であるTAG含有画分の回収は、蒸発器を通るパスの完了後に、好適な容器に画分を分流することにより達成されてもよい。
微生物油(すなわち、抽出油又は精製油)の脂肪酸は、典型的にはトリグリセリド又はリン脂質などの生物学的形態である。これらの形態の脂肪酸プロファイルを高濃度化することは困難であるため、通常、微生物油の個々の脂肪酸は、当業者に公知の技術を用いたエステル交換によって遊離され得る。脂肪酸エステル混合物は、エステル交換前の微生物油と実質的に同じ脂肪酸プロファイルを有するため、エステル交換プロセスの生成物はなお、典型的に非濃縮微生物油(すなわち、エステル形態)と見なされる。
TFAのwt%として計測して30〜70wt%のEPAを含み、且つDHAを実質的に含まない微生物油の高濃度化により(ここで微生物油は、乾燥細胞重量の25%超を油として蓄積する微生物から得られる)、油のwt%として計測して少なくとも70wt%のEPAを含み、且つDHAを実質的に含まない油濃縮物(すなわち「EPA濃縮物」)が得られる。具体的には、微生物油のエチル又は他のエステルは、分留、尿素アダクト形成、短行程蒸留、向流カラムによる超臨界流体分画、超臨界流体クロマトグラフィー、液体クロマトグラフィー、酵素分離及び銀塩処理、疑似移動床式クロマトグラフィー、実際の移動床式クロマトグラフィー及びそれらの組み合わせなどの当該技術分野で一般的に用いられる方法により、EPAを高濃度化し、分離することができる。
従って、本明細書には、油のwt%として計測して少なくとも70wt%のEPAを含み、且つDHAを実質的に含まないEPA濃縮物を作製する方法も提供され、前記方法は、
a)TFAのwt%として計測して30〜70wt%のEPAを含み、且つDHAを実質的に含まない微生物油であって、乾燥細胞重量の25%超を油として蓄積する微生物から得られる微生物油をエステル交換するステップ;及び、
b)ステップ(a)のエステル交換した油を高濃度化するステップであって、それにより油のwt%として計測して少なくとも70wt%のEPAを含み、且つDHAを実質的に含まないEPA濃縮物を得るステップ
を含む。
a)TFAのwt%として計測して30〜70wt%のEPAを含み、且つDHAを実質的に含まない微生物油であって、乾燥細胞重量の25%超を油として蓄積する微生物から得られる微生物油をエステル交換するステップ;及び、
b)ステップ(a)のエステル交換した油を高濃度化するステップであって、それにより油のwt%として計測して少なくとも70wt%のEPAを含み、且つDHAを実質的に含まないEPA濃縮物を得るステップ
を含む。
例えば、本明細書の実施例には、ヤロウイア・リポリティカ(Yarrowia lipolytica)由来の、TFAのwt%として計測して58.2%のEPAを含み、且つDHAを実質的に含まない非濃縮精製微生物油が提供される。この非濃縮微生物油は、実施例2で尿素アダクト形成方法によって高濃度化され、その結果、得られるEPA−EE濃縮物は、油のwt%として計測して76.5%のEPA−EEを含み、且つDHAを実質的に含まないものとなる。同様に実施例3は、同じ非濃縮微生物油の液体クロマトグラフィーによる高濃度化を実証し、ここで得られるEPA−EE濃縮物は、油のwt%として計測して82.8%又は95.4%のEPA−EEを含み、且つDHAを実質的に含まないものとなる。実施例4は、同じ非濃縮微生物油の超臨界流体クロマトグラフィーによる高濃度化を実証し、油のwt%として計測して85%又は89.8%のEPA−EEを含む、DHAを実質的に含まないEPA濃縮物が得られる。
実施例5では、ヤロウイア・リポリティカ(Yarrowia lipolytica)由来の、TFAのwt%として計測して56.1%のEPAを含み、且つDHAを実質的に含まない代替的な非濃縮SPD精製微生物油が提供される。実施例6におけるこの微生物油の高濃度化は分留によって行われ、それにより、油のwt%として計測して73%のEPA−EEを含み、且つDHAを実質的に含まないEPA濃縮物が生じる。分留は、有利には、油中に存在するより低分子量のエチルエステルの多く(すなわち、限定はされないが、実施例6の微生物油中の優勢にはC18)を除去する。
実施例8では、ヤロウイア・リポリティカ(Yarrowia lipolytica)由来の、TFAのwt%として計測して54.7%のEPAを含み、且つDHA、NDPA及びHPAを実質的に含まない代替的な非濃縮SPD精製微生物油が提供される。この微生物油の高濃度化は、分留及び液体クロマトグラフィーによって行われ、それにより、油のwt%として計測して97.4%のEPA−EEを含み、且つDHA、NDPA及びHPAを実質的に含まないEPA濃縮物が生じる。当業者は、高濃度化プロセス(例えば、分留、尿素アダクト形成、短行程蒸留、向流カラムによる超臨界流体分画、超臨界流体クロマトグラフィー、液体クロマトグラフィー、酵素分離及び銀塩処理、疑似移動床式クロマトグラフィー、実際の移動床式クロマトグラフィー)の他の組み合わせを利用して本発明のEPA濃縮物を生じさせてもよいことを理解するはずである。
例えば、油のwt%として計測して少なくとも70wt%のEPAを含み、且つDHAを実質的に含まないEPA濃縮物を作製することが特に有利であってよく、前記方法は、(a)TFAのwt%として計測して30〜70wt%のEPAを含む微生物油のエステル交換反応;(b)より低分子量の、すなわちC14、C16及びC18脂肪酸を含むエチルエステルの多くを除去するための分留を含む最初の高濃度化プロセス;及び、(c)尿素アダクト形成、液体クロマトグラフィー、超臨界流体クロマトグラフィー、疑似移動床式クロマトグラフィー、実際の移動床式クロマトグラフィー及びそれらの組み合わせからなる群から選択される少なくとも1つのさらなる高濃度化プロセスを含む。微生物油試料中のC14、C16及びC18脂肪酸濃度が分留の結果として下がると、続く高濃度化プロセスが促進され得る。
当業者は認識するであろうとおり、エチルエステル形態の、上記に記載されるEPA濃縮物のいずれも、必要であれば他の形態、例えばメチルエステル、酸又はトリアシルグリセリド、又は任意の他の好適な形態又はそれらの組み合わせに容易に変換することができる。ある誘導体から別の誘導体へのPUFAの化学的変換手段については周知されている。例えば、トリグリセリドは、鹸化により開裂された酸のナトリウム塩に変換し、さらに酸性化により遊離脂肪酸に変換することができ、及びエチルエステルは、グリセロール分解によってトリグリセリドに再びエステル化することができる。従って、EPA濃縮物は最初はエチルエステルの形態であると予想されるが、これは決して限定を意図したものではない。従って、EPA濃縮物中の、油のwt%として計測して少なくとも70wt%のEPAは、遊離脂肪酸、トリアシルグリセロール、エステル、及びそれらの組み合わせの形態のEPAを指すことができ、ここでエステルは、最も好ましくはエチルエステルの形態である。
当業者は、微生物油の任意の好ましいEPA高濃度化レベルがもたらされ、それによりEPA濃縮物が、油のwt%として計測して少なくとも70wt%のEPAを有するように、プロセス条件を最適化し得ることを理解するであろう(しかしながらEPA純度の増加はEPAの収率に反比例することが多い)。従って、当業者は、EPAのwt%が、70%から100%以下の任意の整数の百分率(又はその分数)、すなわち、具体的には、油のwt%として計測して70%、71%、72%、73%、74%、75%、76%、77%、78%、79%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%及び100%のEPAであってよいことを理解するであろう。
より具体的には、本発明の一実施形態では、油のwt%として計測して少なくとも80wt%のEPAを含み、且つDHAを実質的に含まないEPA濃縮物が提供される。別の実施形態では、油のwt%として計測して少なくとも90wt%のEPAを含み、且つDHAを実質的に含まないEPA濃縮物が提供される。そして、さらに別の実施形態では、油のwt%として計測して少なくとも95wt%のEPAを含み、且つDHAを実質的に含まないEPA濃縮物が提供される。
好ましい実施形態では、油のwt%として計測して少なくとも70wt%のEPAを含み、且つDHAを実質的に含まない、上記に記載されるEPA濃縮物は、NDPAを実質的に含まず、且つHPAを実質的に含まないものとしてさらに特徴付けることができる。
いかなる特定の応用にも限定されないが、本発明のEPA濃縮物は医薬品としての使用に特に良好に適している。当業者に周知されているとおり、EPAは、カプセル、錠剤、顆粒、飲料中に分散させることができる散剤、又は別の固形経口剤形、液体(例えばシロップ)、ソフトゲルカプセル、コーティングされたソフトゲルカプセル又は他の好都合な剤形、例えばカプセル中の経口液体で投与されてもよい。カプセルは、ハードシェル又はソフトシェルであってよく、ゼラチン又は菜食主義者向けの供給源であってもよい。EPAはまた、注射又は注入に好適な液体中に含まれてもよい。
加えて、EPAはまた、1つ以上の不活性な医薬品成分(本明細書で一般に「賦形剤」としても知られる)と組み合わせて投与してもよい。非活性成分は、例えば、使用に際して安全、便利、及び他の形で許容可能な、適用可能で効果的な製剤となるよう有効成分を可溶化、懸濁、増粘、希釈、乳化、安定化、保存、保護、着色、香味付け、及び造形する働きをする。
賦形剤としては、限定はされないが、界面活性剤、例えばモノカプリル酸プロピレングリコール、長鎖脂肪酸のグリセロール及びポリエチレングリコールエステルの混合物、ポリエトキシ化ヒマシ油、グリセロールエステル、オレオイルマクロゴールグリセリド、プロピレングリコールモノラウレート、ジカプリル酸/ジカプリン酸プロピレングリコール、ポリエチレン−ポリプロピレングリコール共重合体及びポリオキシエチレンソルビタンモノオレアート、共溶媒、例えばエタノール、グリセロール、ポリエチレングリコール、及びプロピレングリコール、及び油、例えばヤシ油、オリーブ油又はベニバナ油を挙げることができる。界面活性剤、共溶媒、油又はそれらの組み合わせの使用は、概して製剤技術分野で公知であり、及び当業者であれば理解し得るとおり、任意の好適な界面活性剤を本発明及びその実施形態と併せて用いることができる。
組成物の用量濃度、用量スケジュール及び投与期間は、目的の作用を発現させるのに十分でなければならず、例えば、剤形、投与経路、1つ又は複数の症状の重症度、体重、年齢などに応じて適宜調整され得る。経口投与する場合、組成物は1日3回の分割用量で投与されてもよく、しかしながら組成物は、或いは単回用量又はいくつかの分割用量で投与されてもよい。
本発明は、以下の実施例においてさらに定義される。これらの実施例は、本発明の好ましい実施形態を示すものではあるが、例示として提供されるに過ぎないことが理解されなければならない。上記の考察及びこれらの実施例から、当業者は、本発明の本質的な特徴を確認することができ、且つその趣旨及び精神から逸脱することなく本発明の様々な変更及び改良を行って、それを様々な利用及び条件に適合させることができる。
実施例1
全脂肪酸[「TFA」]の58.2%のEPAを含む微生物油の調製
本実施例は、EPAの生成用に操作された、組換えヤロウイア・リポリティカ(Yarrowia lipolytica)細胞の微生物バイオマスから得られる微生物油の単離について記載する。その後この微生物油は、以下の実施例2〜4に記載するとおり、様々な手段によって高濃度化した。
全脂肪酸[「TFA」]の58.2%のEPAを含む微生物油の調製
本実施例は、EPAの生成用に操作された、組換えヤロウイア・リポリティカ(Yarrowia lipolytica)細胞の微生物バイオマスから得られる微生物油の単離について記載する。その後この微生物油は、以下の実施例2〜4に記載するとおり、様々な手段によって高濃度化した。
具体的には、Y.リポリティカ(Y.lipolytica)Y8672株を、約61.8EPA%TFAの生成が可能となるように組換え操作し、二段階フェドバッチ法を用いて培養した。次に得られた微生物バイオマスからイソヘキサン溶媒によって微生物油を単離し、精製すると、58.2EPA%TFAを含む濃縮されていないトリグリセリドリッチの精製油が得られた。
ヤロウイア・リポリティカ(Yarrowia lipolytica)Y8672株の遺伝子型
Y8672株の生成は、米国特許出願公開第2010−0317072−A1号明細書に記載されている。Y.リポリティカ(Y.lipolytica)ATCC番号20362に由来するY8672株は、Δ9エロンガーゼ/Δ8デサチュラーゼ経路の発現により、全脂質に対して約61.8%のEPAを生じる能力を有した。
Y8672株の生成は、米国特許出願公開第2010−0317072−A1号明細書に記載されている。Y.リポリティカ(Y.lipolytica)ATCC番号20362に由来するY8672株は、Δ9エロンガーゼ/Δ8デサチュラーゼ経路の発現により、全脂質に対して約61.8%のEPAを生じる能力を有した。
Y8672株の最終的な遺伝子型は、野生型Y.リポリティカ(Y.lipolytica)ATCC番号20362に対して、Ura+、Pex3−、不明1−、不明2−、不明3−、不明4−、不明5−、不明6−、不明7−、不明8−、Leu+、Lys+、YAT1::ME3S::Pex16、GPD::ME3S::Pex20、GPD::FmD12::Pex20、YAT1::FmD12::Oct、EXP1::FmD12S::ACO、GPAT::EgD9e::Lip2、FBAINm::EgD9eS::Lip2、EXP1::EgD9eS::Lip1、YAT1::EgD9eS::Lip2、FBAINm::EgD8M::Pex20、FBAIN::EgD8M::Lip1、EXP1::EgD8M::Pex16、GPD::EaD8S::Pex16(2コピー)、YAT1::E389D9eS/EgD8M::Lip1、YAT1::EgD9eS/EgD8M::Aco、FBAIN::EgD5SM::Pex20、YAT1::EgD5SM::Aco、GPM::EgD5SM::Oct、EXP1::EgD5M::Pex16、EXP1::EgD5SM::Lip1、YAT1::EaD5SM::Oct、YAT1::PaD17S::Lip1、EXP1::PaD17::Pex16、FBAINm::PaD17::Aco、GPD::YlCPT1::Aco、及びYAT1::MCS::Lip1であった。
上記の発現カセットの構造は「X::Y::Z」の単純な表記法により表され、ここでXはプロモーター断片を示し、Yは遺伝子断片を示し、及びZはターミネーター断片を示し、これらは全て、互いに作動可能に連結されている。略称は以下のとおりである:FmD12はフザリウム・モニリフォルメ(Fusarium moniliforme)Δ12デサチュラーゼ遺伝子であり[米国特許第7,504,259号明細書];FmD12Sは、F.モニリフォルメ(F.moniliforme)に由来するコドン最適化Δ12デサチュラーゼ遺伝子であり[米国特許第7,504,259号明細書];ME3Sは、モルティエレラ・アルピナ(Mortierella alpina)に由来するコドン最適化C16/18エロンガーゼ遺伝子であり[米国特許第7,470,532号明細書];EgD9eは、ユーグレナ・グラシリス(Euglena gracilis)Δ9エロンガーゼ遺伝子であり[米国特許第7,645,604号明細書];EgD9eSは、E.グラシリス(E.gracilis)に由来するコドン最適化Δ9エロンガーゼ遺伝子であり[米国特許第7,645,604号明細書];EgD8Mは、E.グラシリス(E.gracilis)に由来する合成突然変異体Δ8デサチュラーゼ遺伝子[米国特許第7,709,239号明細書]であり[米国特許第7,256,033号明細書];EaD8Sは、ユーグレナ・アナベナ(Euglena anabaena)に由来するコドン最適化Δ8デサチュラーゼ遺伝子であり[米国特許第7,790,156号明細書];E389D9eS/EgD8Mは、ユートレプティエラ・エスピー(Eutreptiella sp.)CCMP389 Δ9エロンガーゼに由来するコドン最適化Δ9エロンガーゼ遺伝子(「E389D9eS」)(米国特許第7,645,604号明細書)を、Δ8デサチュラーゼ「EgD8M」(前掲)に連結することにより作成されるDGLAシンターゼであり[米国特許出願公開第2008−0254191−A1号明細書];EgD9ES/EgD8Mは、Δ9エロンガーゼ「EgD9eS」(前掲)をΔ8デサチュラーゼ「EgD8M」(前掲)に連結することにより作成されるDGLAシンターゼであり[米国特許出願公開第2008−0254191−A1号明細書];EgD5M及びEgD5SMは、ユーグレナ・グラシリス(Euglena gracilis)に由来する合成突然変異体Δ5デサチュラーゼ遺伝子[米国特許出願公開第2010−0075386−A1号明細書]であり[米国特許第7,678,560号明細書];EaD5SMは、ユーグレナ・アナベナ(Euglena anabaena)に由来する合成突然変異体Δ5デサチュラーゼ遺伝子[米国特許出願公開第2010−0075386−A1号明細書]であり[米国特許第7,943,365号明細書];PaD17は、ピシウム・アファニデルマタム(Pythium aphanidermatum)Δ17デサチュラーゼ遺伝子であり[米国特許第7,556,949号明細書];PaD17Sは、P.アファニデルマタム(P.aphanidermatum)に由来するコドン最適化Δ17デサチュラーゼ遺伝子であり[米国特許第7,556,949号明細書];YlCPT1は、ヤロウイア・リポリティカ(Yarrowia lipolytica)ジアシルグリセロールコリンホスホトランスフェラーゼ遺伝子であり[米国特許第7,932,077号明細書];及びMCSは、リゾビウム・レグミノサルム・ビーブイ・ビシアエ(Rhizobium leguminosarum bv.viciae)3841に由来するコドン最適化マロニル−CoAシンテターゼ遺伝子である[米国特許出願公開第2010−0159558−A1号明細書]。
Y8672株における全脂質含有量及び組成の詳細な分析のため、フラスコアッセイを行い、ここでは細胞を二段階で合計7日間成長させた。分析に基づけば、Y8672株は3.3g/Lの乾燥細胞重量[「DCW」]を生じ、細胞の全脂質含有量は26.5[「TFA%DCW」]であり、乾燥細胞重量の百分率としてのEPA含有量[「EPA%DCW」]は16.4であり、及び脂質プロファイルは以下のとおりであった(各脂肪酸の濃度はTFAの重量パーセント[「%TFA」]とする):16:0(パルミテート)−2.3、16:1(パルミトオレイン酸)−0.4、18:0(ステアリン酸)−2.0、18:1(オレイン酸)−4.0、18:2(LA)−16.1、ALA−1.4、EDA−1.8、DGLA−1.6、ARA−0.7、ETrA−0.4、ETA−1.1、EPA−61.8、その他−6.4。
発酵及びY.リポリティカ(Y.lipolytica)Y8672株バイオマスからの微生物油の抽出
Y.リポリティカ(Y.lipolytica)Y8672株の凍結培養物から、振盪フラスコに接種材料を調製した。インキュベーション期間後、この培養物を使用してシード発酵槽に接種した。シード培養物が適切な目標細胞密度に達したところで、次にそれを使用してより大きい発酵槽に接種した。発酵は二段階フェドバッチ法であった。第1の段階では、高細胞密度に至る急速な成長を促進する条件下で酵母を培養した;培養培地は、グルコース、様々な窒素源、微量金属及びビタミンを含んだ。第2の段階では、酵母を窒素飢餓状態にしてグルコースを連続的に供給することにより、脂質及びPUFA蓄積を促進した。温度(30〜32℃で制御される)、pH(5〜7で制御される)、溶存酸素濃度及びグルコース濃度を含むプロセス変数を監視し、標準的な動作条件により制御して、一貫したプロセスパフォーマンス及び最終的なPUFA油品質を確保した。
Y.リポリティカ(Y.lipolytica)Y8672株の凍結培養物から、振盪フラスコに接種材料を調製した。インキュベーション期間後、この培養物を使用してシード発酵槽に接種した。シード培養物が適切な目標細胞密度に達したところで、次にそれを使用してより大きい発酵槽に接種した。発酵は二段階フェドバッチ法であった。第1の段階では、高細胞密度に至る急速な成長を促進する条件下で酵母を培養した;培養培地は、グルコース、様々な窒素源、微量金属及びビタミンを含んだ。第2の段階では、酵母を窒素飢餓状態にしてグルコースを連続的に供給することにより、脂質及びPUFA蓄積を促進した。温度(30〜32℃で制御される)、pH(5〜7で制御される)、溶存酸素濃度及びグルコース濃度を含むプロセス変数を監視し、標準的な動作条件により制御して、一貫したプロセスパフォーマンス及び最終的なPUFA油品質を確保した。
発酵技術分野の当業者は、発酵ランそれ自体、培地条件、プロセスパラメータ、スケールアップ等、並びに培養物をサンプリングする特定の時間点に応じて、特定のヤロウイア属(Yarrowia)株の油プロファイルにばらつきが起こり得ることを承知しているであろう(例えば、米国特許出願公開第2009−0093543−A1号明細書を参照のこと)。
発酵後、酵母バイオマスを脱水及び洗浄することにより塩及び残留培地を除去し、リパーゼ活性を最小限に抑えた。続くドラム乾燥により水分を5%未満に低下させ、未処理微生物バイオマスを短期間保管及び輸送する間の油の安定性を確保した。
次に微生物バイオマスを、イソヘキサン溶媒を伴う機械的破壊に供し、バイオマスからEPAリッチ微生物油を抽出した。残渣バイオマス(すなわち細胞残屑)を除去し、溶媒を蒸発させて、抽出油を得た。抽出油をリン酸を使用して脱ガムし、20ボーメ度の苛性剤で精製して、リン脂質、微量金属及び遊離脂肪酸を除去した。シリカ及び粘土による脱色を用いて、有色化合物及び微量の酸化生成物を吸着させた。最後の脱臭ステップで揮発性化合物、臭気化合物及びさらなる有色化合物をストリッピングして、その天然のトリグリセリド形態のPUFAを含む非濃縮精製微生物油を得た。
Y.リポリティカ(Y.lipolytica)Y8672株由来の微生物油の特徴付け
以下のガスクロマトグラフィー[「GC」]方法を用いて、非濃縮精製油の脂肪酸組成を分析した。具体的には、トリグリセリドを、メタノール中のナトリウムメトキシドを使用するエステル交換により脂肪酸メチルエステル[「FAME」]に変換した。得られたFAMEを、トルエン/ヘキサン(2:3)に希釈した後、30m×0.25mm(内径)のOMEGAWAX(Supelco)カラムを取り付けたAgilent 7890 GCを使用して分析した。オーブン温度は5℃/分で160℃から200℃に上昇させ、次に10℃/分で200℃から250℃(10分間維持)に上昇させた。
以下のガスクロマトグラフィー[「GC」]方法を用いて、非濃縮精製油の脂肪酸組成を分析した。具体的には、トリグリセリドを、メタノール中のナトリウムメトキシドを使用するエステル交換により脂肪酸メチルエステル[「FAME」]に変換した。得られたFAMEを、トルエン/ヘキサン(2:3)に希釈した後、30m×0.25mm(内径)のOMEGAWAX(Supelco)カラムを取り付けたAgilent 7890 GCを使用して分析した。オーブン温度は5℃/分で160℃から200℃に上昇させ、次に10℃/分で200℃から250℃(10分間維持)に上昇させた。
GC分析によって記録されたFAMEピークを、既知のメチルエステル[「ME」]と比較したときのそれらの保持時間により同定し、それらのFAMEピーク面積を既知量の内部標準(C15:0トリグリセリド、試料でのエステル交換手順を通じて取った)との比較により定量化した。従って、任意の脂肪酸FAMEの近似量(mg)[「mg FAME」]は、以下の式に従い計算される:(特定の脂肪酸のFAMEピークの面積/15:0 FAMEピークの面積)*(内部標準C15:0 FAMEのmg数)。次にFAMEの結果を、1.042〜1.052の適切な分子量変換係数で除すことにより、対応する脂肪酸のmg数に対して補正することができる。
個別の脂肪酸それぞれの量をTFAの重量パーセントとして要約する脂質プロファイルを、個々のFAMEピーク面積を全てのFAMEピーク面積の合計で除して100を乗じることにより決定した。
非濃縮Y8672精製油に関してGC分析から得られた結果を、以下の表3に示す。精製油は58.2EPA%TFAを含有し、DHAは検出不能であった(すなわち<0.05%)。
実施例2
尿素アダクト形成による微生物油の高濃度化
この例は、実施例1の非濃縮精製油を尿素アダクト形成によって高濃度化すると、油の重量パーセントとして計測して最大78%のEPAエチルエステルを含み、且つDHAを実質的に含まないEPA濃縮物が得られ得ることを実証する。
尿素アダクト形成による微生物油の高濃度化
この例は、実施例1の非濃縮精製油を尿素アダクト形成によって高濃度化すると、油の重量パーセントとして計測して最大78%のEPAエチルエステルを含み、且つDHAを実質的に含まないEPA濃縮物が得られ得ることを実証する。
KOH(20g)を、初めに320gの無水エタノールに溶解した。次に溶液を実施例1の非濃縮精製油1kgと混合し、約60℃に4時間加熱した。反応混合物を分液漏斗中に一晩放置しておき、完全に相分離させた。下側のグリセロール画分を除去した後、少量のシリカを上側のエチルエステル画分に添加して過剰な石ケンを除去した。エタノールを真空下約90℃で回転蒸発により除去すると、透明だが薄茶色のエチルエステルが得られた。
このエチルエステル(20g)を40gの尿素及び100gのエタノール(90%水溶液)と約65℃で混合した。混合物は、透明な溶液に変わるまでこの温度に維持した。次に混合物を室温に冷却して約20時間保ち、尿素結晶及びアダクトを形成させた。次に固形物をろ去し、液体画分を回転蒸発させてエタノールを除去した。回収されたエチルエステル画分を、1回目及び次に2回目の200mLの温水洗浄で洗浄した。溶液のpHを初めに3〜4に調整した後、水性画分をデカントで除去した。次にエチルエステル画分を乾燥させて残留水を除去した。
エチルエステル画分中の脂肪酸エチルエステル[「FAEE」]濃度を決定するため、実施例1に先述したものと同じGC条件及び計算を用いて、トルエン/ヘキサン(2:3)に希釈した直後にFAEEを分析し、FAME濃度を決定した。方法上、以下の点のみ変更した:i)内部標準としてC15:0の代わりにC23:0EEを使用した;及び、ii)1.042〜1.052の分子量変換係数は不要であった。
しかしながら、EPAエチルエステル[「EPA−EE」]は、上記のものから少し変更した手順に供した。具体的には、既知の濃度及び純度の参照EPA−EE標準を、分析試料において予想されるほぼ同量のEPA−EE、並びに同量のC23:0EE内部標準を含むように調製した。試料中のEPA−EEの正確な量(mg)は、以下の式に従い計算される:(EPA−EEピークの面積/C23:0EEピークの面積)×(較正標準におけるC23:0EEピークの面積/較正標準におけるEPA−EEピークの面積)×(較正標準におけるEPA−EE mg数)。全ての内部標準及び参照標準は、Nu−Chek Prep,Incから入手した。
このようにして、高濃度化された油画分、すなわちEPA濃縮物においてFAEE濃度を決定した。具体的には、尿素アダクト形成による非濃縮精製油の高濃度化により、表4に示されるとおりの、油の重量パーセントとして計測して77%のEPAエチルエステルを有し、且つDHAを実質的に含まないEPA濃縮物が得られた。
当業者は、油の重量パーセントとして計測して77%のEPAエチルエステルを含み、且つDHAを実質的に含まないこのEPA濃縮物を、当業者に公知の手段を用いて容易に変換し、代替的な形態のEPA濃縮物を生じさせ得る(すなわち、EPAエチルエステルを遊離脂肪酸、トリアシルグリセロール、メチルエステル、及びそれらの組み合わせに変換し得る)ことを理解するであろう。従って、例えば、77%のEPAエチルエステルをグリセロール分解によってトリグリセリドに再びエステル化することにより、油のwt%として計測して少なくとも70wt%のEPAを含み、且つDHAを実質的に含まない、トリグリセリド形態のEPA濃縮物を得ることができる。
実施例3
液体クロマトグラフィーによる微生物油の高濃度化
この例は、実施例1の非濃縮精製油を液体クロマトグラフィー方法を用いて高濃度化すると、油の重量パーセントとして計測して最大95.4%のEPAエチルエステルを含み、且つDHAを実質的に含まないEPA濃縮物が得られ得ることを実証する。
液体クロマトグラフィーによる微生物油の高濃度化
この例は、実施例1の非濃縮精製油を液体クロマトグラフィー方法を用いて高濃度化すると、油の重量パーセントとして計測して最大95.4%のEPAエチルエステルを含み、且つDHAを実質的に含まないEPA濃縮物が得られ得ることを実証する。
実施例1の非濃縮精製油を、実施例2に記載されるものと同様の方法を用いて、但しある小さい変更を伴い(すなわち、塩基性触媒として水酸化カリウムの代わりにナトリウムエトキシドを使用)、エチルエステルにエステル交換した。
次にこのエチルエステルを、Equateq(Isle of Lewis,スコットランド)により、その液体クロマトグラフ精製技術を用いて高濃度化した。様々な程度の高濃度化を達成した(例えば、以下の試料#1及び試料#2の例示的データを参照のこと)。従って、非濃縮精製油を液体クロマトグラフィーによって高濃度化すると、表5に示されるとおりの、油の重量パーセントとして計測して95.4%のEPAエチルエステルを有し、且つDHAを実質的に含まないEPA濃縮物が得られた。
当業者は、油の重量パーセントとして計測して82.8%のEPAエチルエステル又は95.4%のEPAエチルエステルのいずれかを含み、且つDHAを実質的に含まないこのEPA濃縮物を、当業者に公知の手段を用いて容易に変換し、代替的な形態のEPA濃縮物を生じさせ得る(すなわち、EPAエチルエステルを遊離脂肪酸、トリアシルグリセロール、メチルエステル、及びそれらの組み合わせに変換し得る)ことを理解するであろう。従って、例えば、82.8%のEPAエチルエステル又は95.4%のEPAエチルエステルをグリセロール分解によってトリグリセリドに再びエステル化することにより、油のwt%として計測して少なくとも70wt%のEPAを含み、且つDHAを実質的に含まない、トリグリセリド形態のEPA濃縮物を得ることができる。
実施例4
超臨界流体クロマトグラフィーによる微生物油の高濃度化
この例は、実施例1の非濃縮精製油を超臨界流体クロマトグラフ[「SFC」]法を用いて高濃度化すると、油の重量パーセントとして計測して最大89.8%のEPAエチルエステルを含み、且つDHAを実質的に含まないEPA濃縮物が得られ得ることを実証する。
超臨界流体クロマトグラフィーによる微生物油の高濃度化
この例は、実施例1の非濃縮精製油を超臨界流体クロマトグラフ[「SFC」]法を用いて高濃度化すると、油の重量パーセントとして計測して最大89.8%のEPAエチルエステルを含み、且つDHAを実質的に含まないEPA濃縮物が得られ得ることを実証する。
実施例1の非濃縮精製油を、ナトリウムエトキシドを塩基性触媒として用いてエチルエステルにエステル交換し、次に吸着カラムによって処理することにより超臨界CO2に不溶性であった化合物を除去した。次に処理したエチルエステル油をK.D.Pharma(Bexbach,ドイツ)により、その超臨界クロマトグラフ技術を用いて精製した。様々な程度の高濃度化を達成した(例えば、以下の試料#1及び試料#2の例示的データを参照のこと)。従って、非濃縮精製油をSFCにより高濃度化すると、表6に示されるとおりの、油の重量パーセントとして計測して85%及び89.8%のEPAエチルエステルを有し、且つDHAを実質的に含まないEPA濃縮物が得られた。
当業者は、油の重量パーセントとして計測して85%のEPAエチルエステル又は89.8%のEPAエチルエステルのいずれかを含み、且つDHAを実質的に含まないこのEPA濃縮物を、当業者に公知の手段を用いて容易に変換し、代替的な形態のEPA濃縮物を生じさせ得る(すなわち、EPAエチルエステルを遊離脂肪酸、トリアシルグリセロール、メチルエステル、及びそれらの組み合わせに変換し得る)ことを理解するであろう。従って、例えば、85%のEPAエチルエステル又は89.8%のEPAエチルエステルをグリセロール分解によってトリグリセリドに再びエステル化することにより、油のwt%として計測して少なくとも70wt%のEPAを含み、且つDHAを実質的に含まない、トリグリセリド形態のEPA濃縮物を得ることができる。
実施例5
全脂肪酸[「TFA」]の56.1%のEPAを含む微生物油の調製
本実施例は、EPAの生成用に操作された、組換えヤロウイア・リポリティカ(Yarrowia lipolytica)細胞の微生物バイオマスから得られる微生物油の単離について記載する。その後この微生物油は、以下の実施例6に記載するとおり、分留により高濃度化した。
全脂肪酸[「TFA」]の56.1%のEPAを含む微生物油の調製
本実施例は、EPAの生成用に操作された、組換えヤロウイア・リポリティカ(Yarrowia lipolytica)細胞の微生物バイオマスから得られる微生物油の単離について記載する。その後この微生物油は、以下の実施例6に記載するとおり、分留により高濃度化した。
具体的には、Y.リポリティカ(Y.lipolytica)Z1978株を、約58.7EPA%TFAの生成が可能となるように組換え操作し、二段階フェドバッチ法を用いて培養した。次に乾燥させることによってバイオマスから微生物油を単離し、抽出し(押出し、ペレット化及び超臨界流体抽出の組み合わせによる)、短行程蒸留によって精製すると、56.1EPA%TFAを含む濃縮されていないトリグリセリドリッチのSPD精製油が得られた。
ヤロウイア・リポリティカ(Yarrowia lipolytica)Y9502株の遺伝子型
Y9502株の生成は、米国特許出願公開第2010−0317072−A1号明細書に記載されている。ヤロウイア・リポリティカ(Yarrowia lipolytica)ATCC番号20362に由来するY9502株は、Δ9エロンガーゼ/Δ8デサチュラーゼ経路の発現により、全脂質に対して約57.0%のEPAを生成する能力を有した(図2)。
Y9502株の生成は、米国特許出願公開第2010−0317072−A1号明細書に記載されている。ヤロウイア・リポリティカ(Yarrowia lipolytica)ATCC番号20362に由来するY9502株は、Δ9エロンガーゼ/Δ8デサチュラーゼ経路の発現により、全脂質に対して約57.0%のEPAを生成する能力を有した(図2)。
Y9502株の最終的な遺伝子型は、野生型ヤロウイア・リポリティカ(Yarrowia lipolytica)ATCC番号20362に対して、Ura+、Pex3−、不明1−、不明2−、不明3−、不明4−、不明5−、不明6−、不明7−、不明8−、不明9−、不明10−、YAT1::ME3S::Pex16、GPD::ME3S::Pex20、YAT1::ME3S::Lip1、FBAINm::EgD9eS::Lip2、EXP1::EgD9eS::Lip1、GPAT::EgD9e::Lip2、YAT1::EgD9eS::Lip2、FBAINm::EgD8M::Pex20、EXP1::EgD8M::Pex16、FBAIN::EgD8M::Lip1、GPD::EaD8S::Pex16(2コピー)、YAT1::E389D9eS/EgD8M::Lip1、YAT1::EgD9eS/EgD8M::Aco、FBAINm::EaD9eS/EaD8S::Lip2、GPD::FmD12::Pex20、YAT1::FmD12::Oct、EXP1::FmD12S::Aco、GPDIN::FmD12::Pex16、EXP1::EgD5M::Pex16、FBAIN::EgD5SM::Pex20、GPDIN::EgD5SM::Aco、GPM::EgD5SM::Oct、EXP1::EgD5SM::Lip1、YAT1::EaD5SM::Oct、FBAINm::PaD17::Aco、EXP1::PaD17::Pex16、YAT1::PaD17S::Lip1、YAT1::YlCPT::Aco、YAT1::MCS::Lip1、FBA::MCS::Lip1、YAT1::MaLPAAT1S::Pex16であった。
実施例1で定義されていない略称は、以下のとおりである:EaD9eS/EgD8Mは、ユーグレナ・アナベナ(Euglena anabaena)Δ9エロンガーゼに由来するコドン最適化Δ9エロンガーゼ遺伝子(「EaD9eS」)[米国特許第7,794,701号明細書]をΔ8デサチュラーゼ「EgD8M」(前掲)に連結することにより作成されたDGLAシンターゼであり[米国特許出願公開第2008−0254191−A1号明細書];及び、MaLPAAT1Sは、モルティエレラ・アルピナ(Mortierella alpina)に由来するコドン最適化リゾホスファチジン酸アシルトランスフェラーゼ遺伝子である[米国特許第7,879,591号明細書]。
Y9502株における全脂質含有量及び組成の詳細な分析のため、フラスコアッセイを行い、ここでは細胞を二段階で合計7日間成長させた。分析に基づけば、Y9502株は3.8g/Lの乾燥細胞重量[「DCW」]を生じ、細胞の全脂質含有量は37.1[「TFA%DCW」]であり、乾燥細胞重量の百分率としてのEPA含有量[「EPA%DCW」]は21.3であり、及び脂質プロファイルは以下のとおりであった(各脂肪酸の濃度はTFAの重量パーセント[「%TFA」]とする):16:0(パルミテート)−2.5、16:1(パルミトオレイン酸)−0.5、18:0(ステアリン酸)−2.9、18:1(オレイン酸)−5.0、18:2(LA)−12.7、ALA−0.9、EDA−3.5、DGLA−3.3、ARA−0.8、ETrA−0.7、ETA−2.4、EPA−57.0、その他−7.5。
Y9502株からのヤロウイア・リポリティカ(Yarrowia lipolytica)Z1978株の生成
Y9502株からのZ1978株の展開については、本明細書によって参照により本明細書に援用される米国特許出願第13/218591号明細書(代理人整理番号CL4783USNA、2011年8月26日に出願された)及び同第13/218708号明細書(代理人整理番号CL5411USNA、2011年8月26日に出願された)に記載されている(本明細書の図2もまた参照のこと)。
Y9502株からのZ1978株の展開については、本明細書によって参照により本明細書に援用される米国特許出願第13/218591号明細書(代理人整理番号CL4783USNA、2011年8月26日に出願された)及び同第13/218708号明細書(代理人整理番号CL5411USNA、2011年8月26日に出願された)に記載されている(本明細書の図2もまた参照のこと)。
具体的には、Y9502株のUra3遺伝子を破壊するため、コンストラクトpZKUM(図3A;配列番号1;米国特許出願公開第2009−0093543−A1号明細書の表15に記載される)を使用して、Ura3突然変異遺伝子をY9502株のUra3遺伝子に組み込んだ。本明細書によって参照により本明細書に援用される米国特許出願公開第2009−0093543−A1号明細書の方法に従い形質転換を実施した。合計27個の形質転換体(8個の形質転換体を含む第1の群、8個の形質転換体を含む第2の群、及び11個の形質転換体を含む第3の群から選択された)を、5−フルオロオロチン酸[「FOA」]プレート上で成長させた(FOAプレートは、リットルあたり以下を含む:20gグルコース、6.7g酵母窒素原基礎培地、75mgウラシル、75mgウリジン及び100mg/L〜1000mg/Lの濃度範囲に対するFOA活性試験(供給業者から受け取った各バッチ内で変動が起こるため)に基づく適量のFOA(Zymo Research Corp.,Orange,CA))。さらなる実験から、第3の群の形質転換体のみが実質的なUra−表現型を有することが決定された。
脂肪酸[「FA」]分析のため、細胞を遠心によって収集し、Bligh,E.G.& Dyer,W.J.(Can.J.Biochem.Physiol.,37:911−917(1959))に記載されるとおり脂質を抽出した。脂肪酸メチルエステル[「FAME」]を、脂質抽出物のナトリウムメトキシドによるエステル交換により調製し(Roughan,G.及びNishida I.,Arch Biochem Biophys.,276(1):38−46(1990))、続いて30m×0.25mm(内径)HP−INNOWAX(Hewlett−Packard)カラムを取り付けたHewlett−Packard 6890 GCで分析した。オーブン温度は3.5℃/分で170℃(25分間維持)から185℃であった。
直接の塩基性エステル交換のため、ヤロウイア属(Yarrowia)細胞(0.5mL培養物)を回収し、1回蒸留水で洗浄し、Speed−Vacで5〜10分間真空乾燥した。ナトリウムメトキシド(1%の100μl)及び既知量のC15:0トリアシルグリセロール(C15:0TAG;カタログ番号T−145、Nu−Check Prep,Elysian,MN)を試料に添加し、次に試料をボルテックス処理し、50℃で30分間揺動させた。3滴の1M NaCl及び400μlヘキサンを添加した後、試料をボルテックス処理及びスピンにかけた。上側の層を取り出し、GCにより分析した(上記)。GC分析によって記録されたFAMEピークを同定して実施例1の方法に従い定量化し、脂質プロファイルも同様にした。
或いは、Lipid Analysis,William W.Christie,2003に記載される塩基触媒エステル交換法の変法を用いて、発酵又はフラスコ試料のいずれかからのブロス試料をルーチン分析した。具体的には、ブロス試料を室温の水で急速解凍し、次に0.22μmのCorning(登録商標)Costar(登録商標)Spin−X(登録商標)遠心管フィルタ(カタログ番号8161)を備える風袋を量った(tarred)2mL微量遠心管に(0.1mgとなるように)量り取った。予め決定されたDCWに応じて試料(75〜800μl)を使用した。Eppendorf 5430遠心機を使用して、試料を14,000rpmで5〜7分間又はブロスの除去に必要な長さだけ遠心する。フィルタを取り出し、液体を抜き、及び約500μlの脱イオン水をフィルタに添加して試料を洗浄した。遠心により水を除去した後、フィルタを再び取り出し、液体を抜き、そのフィルタを再び挿入した。次に管を遠心機に再び挿入し、このときは上蓋を開放したまま約3〜5分乾燥させた。次にフィルタを管のほぼ2分の1のところまでで切断し、新しい2mL丸底エッペンドルフ試験管(カタログ番号22 36 335−2)に挿入した。
切断したフィルタ容器の周縁部のみと接触し、試料又はフィルタ材料とは接触しない適切な道具で、フィルタを管の底まで押し込んだ。トルエン中の既知量のC15:0TAG(上記)を添加し、及び新しく作製したメタノール溶液中1%ナトリウムメトキシド500μlを添加した。試料ペレットを適切な道具で強く砕き、管を閉じて50℃の熱ブロック(VWRカタログ番号12621−088)に30分間置いた。次に管を少なくとも5分間放冷した。次に、水溶液中の400μlのヘキサン及び500μlの1M NaClを添加し、管を2回×6秒間ボルテックスし、1分間遠心した。約150μlの上層(有機層)を、インサートを備えるGCバイアルに入れ、GCによって分析した。
GC分析によって記録されたFAMEピークを、既知の脂肪酸と比較したときのその保持時間により同定し、そのFAMEピーク面積を既知量の内部標準(C15:0TAG)と比較することにより定量化した。このように、任意の脂肪酸FAME[「μg FAME」]の近似量(μg)は以下の式に従い計算され:(特定の脂肪酸のFAMEピークの面積/標準FAMEピークの面積)*(標準C15:0TAGのμg数)、一方、任意の脂肪酸の量(μg)[「μg FA」]は、以下の式に従い計算される:(特定の脂肪酸のFAMEピークの面積/標準FAMEピークの面積)*(標準C15:0TAGのμg数)*0.9503(C15:0TAGの1μgは0.9503μgの脂肪酸に等しいため)。0.9503の変換係数は、ほとんどの脂肪酸について決定される値(これは0.95〜0.96の範囲である)の近似値であることに留意されたい。
TFAのwt%としての個別の脂肪酸それぞれの量を要約する脂質プロファイルを、個々のFAMEピーク面積を全てのFAMEピーク面積の合計で除して100を乗じることにより決定した。
このようにして、GC分析から、群3のpZKUM形質転換体#1、#3、#6、#7、#8、#10及び#11にそれぞれ、TFAの28.5%、28.5%、27.4%、28.6%、29.2%、30.3%及び29.6%のEPAがあったことが示された。これらの7株を、それぞれ、Y9502U12株、Y9502U14株、Y9502U17株、Y9502U18株、Y9502U19株、Y9502U21株及びY9502U22株(まとめて、Y9502U株)と命名した。
次に、1つのΔ9デサチュラーゼ遺伝子、1つのコリンリン酸シチジリルトランスフェラーゼ遺伝子、及び1つのΔ9エロンガーゼ突然変異遺伝子を、Y9502U株のヤロウイア属(Yarrowia)YALI0F32131p遺伝子座(GenBank受託番号XM_506121)に組み込んで、コンストラクトpZKL3−9DP9N(図3B;配列番号2)を生成した。pZKL3−9DP9Nプラスミドは以下の成分を含んだ:
pZKL3−9DP9NプラスミドをAscI/SphIで消化し、次にY9502U17株の形質転換に使用した。形質転換細胞を最少培地[「MM」]プレートに置き、30℃で3〜4日間維持した(最少培地はリットルあたり以下を含む:20gグルコース、1.7gアミノ酸不含酵母窒素原基礎培地、1.0gプロリン、及びpH6.1(調整不要))。単一コロニーをMMプレートに再びストリークし、次に30℃で液体MMに接種し、250rpm/分で2日間振盪した。細胞を遠心により収集し、高グルコース培地[「HGM」]に懸濁し、次に250rpm/分で5日間振盪した(高グルコース培地はリットルあたり以下を含む:80グルコース、2.58g KH2PO4及び5.36g K2HPO4、pH7.5(調整不要))。細胞を上記の脂肪酸分析に供した。
GC分析から、pZKL3−9DP9Nを含む選択された96個のY9502U17株のほとんどが、TFAの50〜56%のEPAを生じたことが示された。TFAの約59.0%、56.6%、58.9%、56.5%、及び57.6%のEPAを生じた5株(すなわち、#31、#32、#35、#70及び#80)を、それぞれZ1977、Z1978、Z1979、Z1980及びZ1981と命名した。
これらのpZKL3−9DP9N形質転換株の最終的な遺伝子型は、野生型ヤロウイア・リポリティカ(Yarrowia lipolytica)ATCC番号20362に対して、Ura+、Pex3−、不明1−、不明2−、不明3−、不明4−、不明5−、不明6−、不明7−、不明8−、不明9−、不明10−、不明11−、YAT1::ME3S::Pex16、GPD::ME3S::Pex20、YAT1::ME3S::Lip1、FBAINm::EgD9eS::Lip2、EXP1::EgD9eS::Lip1、GPAT::EgD9e::Lip2、YAT1::EgD9eS::Lip2、YAT::EgD9eS−L35G::Pex20、FBAINm::EgD8M::Pex20、EXP1::EgD8M::Pex16、FBAIN::EgD8M::Lip1、GPD::EaD8S::Pex16(2コピー)、YAT1::E389D9eS/EgD8M::Lip1、YAT1::EgD9eS/EgD8M::Aco、FBAINm::EaD9eS/EaD8S::Lip2、GPDIN::YlD9::Lip1、GPD::FmD12::Pex20、YAT1::FmD12::Oct、EXP1::FmD12S::Aco、GPDIN::FmD12::Pex16、EXP1::EgD5M::Pex16、FBAIN::EgD5SM::Pex20、GPDIN::EgD5SM::Aco、GPM::EgD5SM::Oct、EXP1::EgD5SM::Lip1、YAT1::EaD5SM::Oct、FBAINm::PaD17::Aco、EXP1::PaD17::Pex16、YAT1::PaD17S::Lip1、YAT1::YlCPT::Aco、YAT1::MCS::Lip1、FBA::MCS::Lip1、YAT1::MaLPAAT1S::Pex16、EXP1::YlPCT::Pex16であった。
Z1977株、Z1978株、Z1979株、Z1980株及びZ1981株におけるYALI0F32131p遺伝子座(GenBank受託番号XM_50612)のノックアウトは、pZKL3−9DP9Nによる形質転換で作製されたこれらのEPA株のいずれにおいても確認されなかった。
Z1977株、Z1978株、Z1979株、Z1980株及びZ1981株のYPDプレートからの細胞を成長させて、以下の方法に従い全脂質含有量及び組成について分析した。
特定のY.リポリティカ(Y.lipolytica)株における全脂質含有量及び組成の詳細な分析のため、以下のとおりフラスコアッセイを実施した。具体的には、新しくストリークした細胞の1ループを3mL発酵培地[「FM」]の培地に接種し、250rpm及び30℃で一晩成長させた(発酵培地はリットルあたり以下を含む:6.70g/L酵母窒素原基礎培地、6.00g KH2PO4、2.00g K2HPO4、1.50g MgSO4*7H2O、20gグルコース及び5.00g酵母エキス(BBL))。OD600nmを計測し、細胞のアリコートを、最終OD600nmが0.3になるまで、125mLフラスコ内の25mLのFM培地に添加した。振盪インキュベーターにおいて250rpm及び30℃で2日後、培養物の6mLを遠心により回収し、125mLフラスコ内の25mLのHGMに再懸濁した。振盪インキュベーターにおいて250rpm及び30℃で5日後、1mLのアリコートを使用して脂肪酸分析(上記)を行い、乾燥細胞重量[「DCW」]を測定するため10mLを乾燥させた。
DCWの測定のため、10mLの培養物を、Beckman GS−6R遠心機のBeckman GH−3.8ロータにおいて4000rpmで5分間遠心することにより回収した。ペレットを25mLの水に再懸濁し、再び上記のとおり回収した。洗浄したペレットを20mLの水に再懸濁し、予め秤量したアルミニウムパンに移した。細胞懸濁液を真空オーブンにおいて80℃で一晩乾燥させた。細胞の重量を決定した。
細胞の全脂質含有量[「TFA%DCW」]が計算され、TFAの重量パーセントとしての各脂肪酸の濃度[「%TFA」]及び乾燥細胞重量の百分率としてのEPA含有量[「EPA%DCW」]を集計するデータと併せて考慮される。
従って、以下の表8は、フラスコアッセイにより決定するときの、Z1977株、Z1978株、Z1979株、Z1980株及びZ1981株の全脂質含有量及び組成を要約する。具体的には、この表は、細胞の総乾燥細胞重量[「DCW」]、細胞の全脂質含有量[「TFA%DCW」]、TFAの重量パーセントとしての各脂肪酸の濃度[「%TFA」]及び乾燥細胞重量の百分率としてのEPA含有量[「EPA%DCW」]を要約する。
続いてZ1978株を部分的ゲノムシーケンス(米国特許出願第13/218591号明細書)に供した。この研究により、ヤロウイア属(Yarrowia)ゲノムに4個の
(6個でない)Δ5デサチュラーゼ遺伝子が組み込まれたことが決定された(すなわち、EXP1::EgD5M::Pex16、FBAIN::EgD5SM::Pex20、EXP1::EgD5SM::Lip1、及びYAT1::EaD5SM::Oct)。
(6個でない)Δ5デサチュラーゼ遺伝子が組み込まれたことが決定された(すなわち、EXP1::EgD5M::Pex16、FBAIN::EgD5SM::Pex20、EXP1::EgD5SM::Lip1、及びYAT1::EaD5SM::Oct)。
発酵並びに乾燥させた未処理Y.リポリティカ(Y.lipolytica)Z1978株バイオマスの押出し及びペレット化による破壊
実施例1に記載されるとおり、Y.リポリティカ(Y.lipolytica)Z1978株培養物を発酵させ、微生物バイオマスを回収して乾燥させた。次に乾燥した未処理バイオマスを二軸スクリュー押出機に供給した。具体的には、バイオマスと15%の珪藻土(Celatom MN−4又はCelite 209、EP Minerals,LLC,Reno,NV)との混合物を予備混合し、次にZSK−40mm MC二軸スクリュー押出機(Coperion Werner & Pfleiderer,Stuttgart,ドイツ)に45.5kg/時の速度で供給した。26.5%スクロースで作製した水/スクロース溶液を、押出機の破壊ゾーンの後に147mL/分の流量で注入した。押出機は20〜23%トルク範囲で280rpmで動作させた。得られた破壊酵母粉末を最終水冷却バレルで35℃に冷却した。次に、多孔ドームダイ1mm径×1mm厚スクリーンと共に組み立て、且つ82RPMに設定したLCIドーム型造粒機 モデル番号TDG−80(LCI Corporation,Charlotte,NC)に、押し出された湿潤粉末を供給した。455〜600kg/時(乾燥時速度)で押出物を形成した。試料を、100℃に維持される1150標準立方フィート毎分[「scfm」]の空気流量の0.50m2の乾燥ゾーンと、18℃で推定500〜600scfmの空気流量で動作する0.24m2の冷却ゾーンとを備える振動流動層乾燥機(FBP−75、Carman Industries,Inc.,Jeffersonville,IN)で乾燥させた。約1mm径×6〜10mm長さの乾燥したペレットは、25〜30℃の範囲で乾燥機を出て、O’Haus含水量分析器(Parsippany,NJ)で測定した最終的な水分含有量は5〜6%であった。
実施例1に記載されるとおり、Y.リポリティカ(Y.lipolytica)Z1978株培養物を発酵させ、微生物バイオマスを回収して乾燥させた。次に乾燥した未処理バイオマスを二軸スクリュー押出機に供給した。具体的には、バイオマスと15%の珪藻土(Celatom MN−4又はCelite 209、EP Minerals,LLC,Reno,NV)との混合物を予備混合し、次にZSK−40mm MC二軸スクリュー押出機(Coperion Werner & Pfleiderer,Stuttgart,ドイツ)に45.5kg/時の速度で供給した。26.5%スクロースで作製した水/スクロース溶液を、押出機の破壊ゾーンの後に147mL/分の流量で注入した。押出機は20〜23%トルク範囲で280rpmで動作させた。得られた破壊酵母粉末を最終水冷却バレルで35℃に冷却した。次に、多孔ドームダイ1mm径×1mm厚スクリーンと共に組み立て、且つ82RPMに設定したLCIドーム型造粒機 モデル番号TDG−80(LCI Corporation,Charlotte,NC)に、押し出された湿潤粉末を供給した。455〜600kg/時(乾燥時速度)で押出物を形成した。試料を、100℃に維持される1150標準立方フィート毎分[「scfm」]の空気流量の0.50m2の乾燥ゾーンと、18℃で推定500〜600scfmの空気流量で動作する0.24m2の冷却ゾーンとを備える振動流動層乾燥機(FBP−75、Carman Industries,Inc.,Jeffersonville,IN)で乾燥させた。約1mm径×6〜10mm長さの乾燥したペレットは、25〜30℃の範囲で乾燥機を出て、O’Haus含水量分析器(Parsippany,NJ)で測定した最終的な水分含有量は5〜6%であった。
押し出された酵母バイオマスの油抽出
押し出された酵母ペレットを、超臨界流体相二酸化炭素(CO2)を抽出溶媒として使用して抽出し、非濃縮抽出油を生じさせた。具体的には、酵母ペレットを320Lステンレス鋼抽出槽に装入し、ポリエステル発泡体ろ過マット材(Aero−Flo Industries,Kingsbury,IN)のプラグ間に充填した。槽を密閉し、次に熱交換器(予熱器)を通して市販の圧縮機(Pressure Products Industries,Warminster,PA)でCO2を計り、縦型抽出槽に供給して、破壊された酵母のペレットから非濃縮抽出油を抽出した。抽出温度は予熱器によって制御し、抽出圧力は、抽出槽と分離槽との間に位置する自動制御弁(Kammer)により維持した。CO2及び油抽出物をこの制御弁を介してより低圧に膨張させた。膨張した溶液から、分離器内の沈殿物として油抽出物を収集した。分離器における膨張したCO2相の温度は、分離器の上流に位置するさらなる熱交換器の使用により制御した。このより低圧のCO2流は分離槽の上から出て、フィルタ、凝縮器、及び質量流量計を通って圧縮機に戻り、再利用される。油抽出物は分離器から定期的に排出し、生成物として収集した。
押し出された酵母ペレットを、超臨界流体相二酸化炭素(CO2)を抽出溶媒として使用して抽出し、非濃縮抽出油を生じさせた。具体的には、酵母ペレットを320Lステンレス鋼抽出槽に装入し、ポリエステル発泡体ろ過マット材(Aero−Flo Industries,Kingsbury,IN)のプラグ間に充填した。槽を密閉し、次に熱交換器(予熱器)を通して市販の圧縮機(Pressure Products Industries,Warminster,PA)でCO2を計り、縦型抽出槽に供給して、破壊された酵母のペレットから非濃縮抽出油を抽出した。抽出温度は予熱器によって制御し、抽出圧力は、抽出槽と分離槽との間に位置する自動制御弁(Kammer)により維持した。CO2及び油抽出物をこの制御弁を介してより低圧に膨張させた。膨張した溶液から、分離器内の沈殿物として油抽出物を収集した。分離器における膨張したCO2相の温度は、分離器の上流に位置するさらなる熱交換器の使用により制御した。このより低圧のCO2流は分離槽の上から出て、フィルタ、凝縮器、及び質量流量計を通って圧縮機に戻り、再利用される。油抽出物は分離器から定期的に排出し、生成物として収集した。
抽出槽には、初めに約150kgの押し出された酵母ペレットを装入した。次にペレットから超臨界流体CO2により、5000psig(345バール)、55℃、及び出発酵母ペレット1kgあたり40〜50kgのCO2の範囲の溶媒対供給量比で、非濃縮抽出油が抽出された。分離槽から約37.5kgの非濃縮抽出油が収集され、そこに各約1000ppmの2つの抗酸化剤、すなわちCovi−ox T70(Cognis,Mississauga,カナダ)及びDadex RM(Nealanders,Mississauga,カナダ)を添加した。
SPD条件下での蒸留
非濃縮抽出油を脱ガスし、次に12kg/時の供給量を用いて6インチ分子蒸留器(POPE Scientific,Saukville,WI)に通して残留水を除去した。蒸発器及び凝縮器の表面温度は、それぞれ140℃及び15℃に設定した。真空は15トルに維持した。
非濃縮抽出油を脱ガスし、次に12kg/時の供給量を用いて6インチ分子蒸留器(POPE Scientific,Saukville,WI)に通して残留水を除去した。蒸発器及び凝縮器の表面温度は、それぞれ140℃及び15℃に設定した。真空は15トルに維持した。
脱水した抽出油を12kg/時の供給量で2回目の分子蒸留器に通し、留出物中の望ましくない低分子量化合物、例えばエルゴステロール及び遊離脂肪酸を除去した。真空を1mトルに下げ、蒸発器の表面温度は240℃〜270℃に維持した。トリアシルグリセロール含有画分(すなわちSPD精製油)が得られ、そのステロールは、非濃縮抽出油中のステロール含有量と比べて減少していた。この非濃縮SPD精製油を、40℃未満に冷却してから包装した。
ヤロウイア・リポリティカ(Yarrowia lipolytica)Z1978株由来のSPD精製油の特徴付け
エステル交換後、実施例1の方法に従いZ1978株由来の非濃縮SPD精製油の脂肪酸組成を分析した。SPD精製油は、以下の表9に示すとおり、56.1EPA%TFAを含み、DHAは検出不能であった(すなわち<0.05%)。
エステル交換後、実施例1の方法に従いZ1978株由来の非濃縮SPD精製油の脂肪酸組成を分析した。SPD精製油は、以下の表9に示すとおり、56.1EPA%TFAを含み、DHAは検出不能であった(すなわち<0.05%)。
実施例6
微生物油の分留による高濃度化
この例は、実施例5の非濃縮SPD精製油を分留法を用いて高濃度化すると、油の重量パーセントとして計測して最大74%のEPAエチルエステルを含み、且つDHAを実質的に含まないEPA濃縮物が得られ得ることを実証する。
微生物油の分留による高濃度化
この例は、実施例5の非濃縮SPD精製油を分留法を用いて高濃度化すると、油の重量パーセントとして計測して最大74%のEPAエチルエステルを含み、且つDHAを実質的に含まないEPA濃縮物が得られ得ることを実証する。
実施例5の非濃縮微生物油25kgを50Lガラスフラスコに添加した。次に7.9kgの無水エタノール及び580gのナトリウムエトキシド(エタノール中21%)をフラスコに添加した。この混合物を約85℃で最低30分間加熱還流した。薄層クロマトグラフィー法により反応を監視し、ここでは油の希釈試料をシリカプレートにスポッティングし、酢酸/ヘキサン/エチルエーテル溶媒混合物を使用して分離した。未反応TAGからなるスポットをヨウ素染色で検出した。検出可能なスポットが全くない、又は僅かしかないことが、反応の完了を表すと見なした。反応のエンドポイントに達した後、混合物を50℃未満に冷却し、相分離させた。グリセロールを含有する下層を分離し、廃棄した。上側の有機層を2.5Lの5%クエン酸で洗浄し、次に回収した有機層を5Lの15%硫酸ナトリウム水溶液で洗浄した。水相を再び廃棄し、エチルエステル相をエタノールと共に回転蒸発器において約60℃で蒸留して、残留水を除去した。エチルエステル形態の約25kgの油を回収した。
次にエチルエステルを4インチハイブリッドワイプトフィルム及び分画システム(POPE Scientific,Saukville,WI)に5kg/時の供給量で供給し、EPAエチルエステルを高濃度化した。蒸発器温度は0.47トルの真空下、約275℃に設定した。充填カラムの加熱温度は約146℃であった。低分子量エチルエステル、主にC18を、塔頂部からの軽量画分として除去した。抽出されたEPAエチルエステルを重量画分として回収し、主に色及び重合物を取り除くため2回目の蒸留にかけた。2回目の蒸留は、6インチ分子蒸留器(POPE Scientific,Saukville,WI)において20kg/時の供給量で実施した。蒸発器は約205℃で動作させ、内部凝縮器温度は約10℃、且つ真空は0.01トルに設定した。約7〜10wt%のエチルエステルが除去され、透明な淡色のEPA濃縮物が得られた。最終的なEPA濃縮物は、油の重量パーセントとして計測して74%EPAエチルエステルを含み、且つDHAを実質的に含まなかった。
当業者は、油の重量パーセントとして計測して74%のEPAエチルエステルを含み、且つDHAを実質的に含まないこのEPA濃縮物を、当業者に公知の手段を用いて容易に変換し、代替的な形態のEPA濃縮物を生じさせ得る(すなわち、EPAエチルエステルを遊離脂肪酸、トリアシルグリセロール、メチルエステル、及びそれらの組み合わせに変換し得る)ことを理解するであろう。従って、例えば、74%のEPAエチルエステルをグリセロール分解によってトリグリセリドに再びエステル化することにより、油のwt%として計測して少なくとも70wt%のEPAを含み、且つDHAを実質的に含まない、トリグリセリド形態のEPA濃縮物を得ることができる。
実施例7
EPA濃縮物は環境汚染物質を実質的に含まない
この例は、油のwt%として計測して少なくとも70wt%のEPAを含み、且つDHAを実質的に含まないEPA濃縮物、及びTFAのwt%として計測して30〜70wt%のEPAを含み、且つDHAを実質的に含まない微生物油のいずれも、環境汚染物質を実質的に含まないことを実証する。
EPA濃縮物は環境汚染物質を実質的に含まない
この例は、油のwt%として計測して少なくとも70wt%のEPAを含み、且つDHAを実質的に含まないEPA濃縮物、及びTFAのwt%として計測して30〜70wt%のEPAを含み、且つDHAを実質的に含まない微生物油のいずれも、環境汚染物質を実質的に含まないことを実証する。
実施例1に記載されるとおり、ヤロウイア・リポリティカ(Yarrowia lipolytica)Y8672株由来の同等の非濃縮精製油試料を調製した。非濃縮抽出油中のポリ塩化ビフェニル[「PCB」](CAS番号1336−36−3)、ポリ塩化ジベンゾジオキシン[「PCDD」]及びポリ塩化ジベンゾフラン[「PCDF」]の、mg/g数の世界保健機関国際毒性当量(World Health Organization International Toxicity Equivalent)[「WHO TEQ」]として測定した濃度を、EPA法 1668 Rev Aに従い決定した。極めて低い又は検出不能レベルの環境汚染物質が検出された。
上記の結果に基づけば、本明細書では、実施例1の非濃縮抽出油及び実施例5の非濃縮SPD精製油のPCB、PCDD、及びPCDFの濃度もまた、極めて低い又は検出不能レベルの環境汚染物質を含むものと思われる。同様に、本明細書では、実施例2、3、4及び6の、それぞれ尿素アダクト形成、液体クロマトグラフィー、SFC及び分留によって高濃度化されたEPAエチルエステル濃縮物もまた、それら自体が環境汚染物質を実質的に含まない非濃縮油から生成されたものであるため、極めて低い又は検出不能レベルの環境汚染物質を含むはずであると仮定される。
より具体的には、表10は、実施例2、3、4及び6のEPA濃縮物中のPCB、PCDD、及びPCDFの予想TEQレベルを記載する。比較のため、米国特許第7,732,488号明細書に記載される汚染物質がストリッピングされた魚油中の同じ化合物の濃度もまた掲載する。米国特許第7,732,488号明細書は、これらの環境(enviormental)汚染物質を許容レベルに低減する特別な処理方法を提供していることが注記される。
上記に示すとおり、実施例2、3、4及び6のEPAエチルエステル濃縮物は、米国特許第7,732,488号明細書の汚染物質がストリッピングされた魚油と比べて、PCB、PCDD及びPCDFのレベルが低い。実際に、PCDFの汚染物質レベルは、用いられる分析方法の検出限界未満になることが予想される。
実施例8
微生物油の分留及び液体クロマトグラフィーによる高濃度化
この例は、非濃縮精製油を分留法と液体クロマトグラフィー法との組み合わせを用いて高濃度化すると、油の重量パーセントとして計測して最大97.4%のEPAエチルエステルを含み、且つDHA、NDPA及びHPAを実質的に含まないEPA濃縮物が得られ得ることを実証する。
微生物油の分留及び液体クロマトグラフィーによる高濃度化
この例は、非濃縮精製油を分留法と液体クロマトグラフィー法との組み合わせを用いて高濃度化すると、油の重量パーセントとして計測して最大97.4%のEPAエチルエステルを含み、且つDHA、NDPA及びHPAを実質的に含まないEPA濃縮物が得られ得ることを実証する。
ヤロウイア・リポリティカ(Yarrowia lipolytica)Y9502株から非濃縮精製油を得た(上記実施例5;米国特許出願公開第2010−0317072−A1号明細書もまた参照のこと)。具体的には、実施例5に記載されるとおり、この株を培養し、回収し、押出し及びペレット化により破壊し、超臨界流体相CO2を用いて抽出した。次に非濃縮抽出油をSPD条件下で精製した(実施例5)。
ヤロウイア・リポリティカ(Yarrowia lipolytica)Y9502株由来のSPD精製油の特徴付け
Y9502株由来の非濃縮SPD精製油の脂肪酸組成を、実施例1の方法に従い分析した。SPD精製油は、以下の表11に示すとおり、54.7EPA%TFAを含み、且つDHA、NDPA及びHPAは検出不能であった(すなわち、<0.05%)。
Y9502株由来の非濃縮SPD精製油の脂肪酸組成を、実施例1の方法に従い分析した。SPD精製油は、以下の表11に示すとおり、54.7EPA%TFAを含み、且つDHA、NDPA及びHPAは検出不能であった(すなわち、<0.05%)。
ヤロウイア・リポリティカ(Yarrowia lipolytica)Y9502株由来のSPD精製油の高濃度化
SPD精製油を、実施例3に記載されるのと同様の方法を用いてエチルエステルにエステル交換し、さらに実施例5に記載されるとおり分留に供した。分留したEPA濃縮物は、油の重量パーセントとして計測して71.9%のEPAエチルエステルを含み、且つDHA、NDPA及びHPAを実質的に含まなかった(以下の表12の「分留後」と題される欄を参照のこと)。
SPD精製油を、実施例3に記載されるのと同様の方法を用いてエチルエステルにエステル交換し、さらに実施例5に記載されるとおり分留に供した。分留したEPA濃縮物は、油の重量パーセントとして計測して71.9%のEPAエチルエステルを含み、且つDHA、NDPA及びHPAを実質的に含まなかった(以下の表12の「分留後」と題される欄を参照のこと)。
次に分留したエチルエステルを、Equateq(Isle of Lewis,スコットランド)により、その液体クロマトグラフ精製技術を用いて高濃度化した。分留したEPA濃縮物の液体クロマトグラフィー(liquid chromotography)による高濃度化から、油の重量パーセントとして計測して最大97.4%のEPAエチルエステルを有し、且つDHA、NDPA及びHPAを実質的に含まない最終EPA濃縮物が得られた(以下の表12の「液体クロマトグラフィー高濃度化後」と題される欄を参照のこと)。
当業者は、油の重量パーセントとして計測して97.4%のEPAエチルエステルを含み、且つDHA、NPDA及びHPAを実質的に含まないこのEPA濃縮物を、当業者に公知の手段を用いて容易に変換し、代替的な形態のEPA濃縮物を生じさせ得る(すなわち、EPAエチルエステルを遊離脂肪酸、トリアシルグリセロール、メチルエステル、及びそれらの組み合わせに変換し得る)ことを理解するであろう。従って、例えば、97.4%のEPAエチルエステルをグリセロール分解によってトリグリセリドに再びエステル化することにより、油のwt%として計測して少なくとも70wt%のEPAを含み、且つDHA、NPDA及びHPAを実質的に含まない、トリグリセリド形態のEPA濃縮物を得ることができる。
加えて、EPAの生成用に操作された組換えヤロウイア属(Yarrowia)細胞の任意の微生物バイオマスから、本明細書の発明の方法により調製されるEPA濃縮物は、DHA、NDPA及びHPAを実質的に含まないものと予想されることが注記される。Y.リポリティカ(Y.lipolytica)Y9502株から得られた微生物油に基づく上記で得られた結果は(ここでは最終EPA濃縮物が、DHA、NDPA及びHPAを実質的に含まない)、実施例1及び実施例5から得られた微生物油から調製されるEPA濃縮物から予想し得る。乾燥細胞重量の25%超を油として蓄積するヤロウイア属(Yarrowia)から得られた、TFAのwt%として計測して30〜70wt%のEPAを含む初期微生物油中にDHA、NDPA及びHPA不純物が存在しないため、そこから生成されるEPA濃縮物中にもまた、脂肪酸不純物は存在しないであろう。
Claims (16)
- 油の質量パーセントとして計測して少なくとも70質量パーセントのエイコサペンタエン酸を含み、且つドコサヘキサエン酸を実質的に含まないエイコサペンタエン酸濃縮物であり、前記濃縮物は全脂肪酸の質量パーセントとして計測して30〜70質量パーセントのエイコサペンタエン酸を含み、且つドコサヘキサエン酸を実質的に含まない微生物油から得られる濃縮物であって、
前記微生物油が、乾燥細胞質量の25%超を油として蓄積する微生物から得られる、エイコサペンタエン酸濃縮物。 - 前記油の質量パーセントとして計測して少なくとも70質量パーセントのエイコサペンタエン酸が、
a)酸、トリグリセリド、エステル又はそれらの組み合わせ;及び、
b)エチルエステル
からなる群から選択される形態である、請求項1に記載のエイコサペンタエン酸濃縮物。 - 前記微生物油が、
a)全脂肪酸の質量パーセントとして計測して約1〜約25質量パーセントのリノール酸を含み;及び、
b)全脂肪酸の質量パーセントとして計測したエイコサペンタエン酸の、全脂肪酸の質量パーセントとして計測したリノール酸に対する比が、少なくとも1.2である、
請求項1に記載のエイコサペンタエン酸濃縮物。 - 前記微生物油が、エイコサペンタエン酸の生成用に操作された、組換えヤロウイア属(Yarrowia)細胞の微生物バイオマスから得られる、請求項1に記載のエイコサペンタエン酸濃縮物。
- 請求項1に記載のエイコサペンタエン酸濃縮物又はその誘導体を含む医薬生成物。
- 油の質量パーセントとして計測して少なくとも70質量パーセントのエイコサペンタエン酸を含み、且つドコサヘキサエン酸を実質的に含まないエイコサペンタエン酸濃縮物の作製方法であって、
a)全脂肪酸の質量パーセントとして計測して30〜70質量パーセントのエイコサペンタエン酸を含み、且つドコサヘキサエン酸を実質的に含まない微生物油であって、乾燥細胞質量の25%超を油として蓄積する微生物から得られる微生物油をエステル交換するステップ;及び、
b)ステップ(a)の前記エステル交換した油を高濃度化するステップであって、それにより油の質量パーセントとして計測して少なくとも70質量パーセントのエイコサペンタエン酸を含み、且つドコサヘキサエン酸を実質的に含まないエイコサペンタエン酸濃縮物を得るステップ
を含む方法。 - 前記油の質量パーセントとして計測して少なくとも70質量パーセントのエイコサペンタエン酸を含むエイコサペンタエン酸濃縮物が、
a)酸、トリグリセリド、エステル又はそれらの組み合わせ;及び、
b)エチルエステル
からなる群から選択される形態である、請求項6に記載の方法。 - 前記微生物油は、全脂肪酸の質量パーセントとして計測したエイコサペンタエン酸の、全脂肪酸の質量パーセントとして計測したリノール酸に対する比が、少なくとも1.2である、請求項6に記載の方法。
- 前記微生物油が、エイコサペンタエン酸の生成用に操作された、組換えヤロウイア属(Yarrowia)細胞の微生物バイオマスから得られる、請求項6に記載の方法。
- 前記ステップ(a)のエステル交換した油が、尿素アダクト形成、液体クロマトグラフィー、超臨界流体クロマトグラフィー、分留、疑似移動床式クロマトグラフィー、実際の移動床式クロマトグラフィー及びそれらの組み合わせからなる群から選択される方法により高濃度化される、請求項6に記載の方法。
- 前記ステップ(a)のエステル交換した油が、少なくとも2つの方法の組み合わせによって高濃度化され、前記第1の方法が分留を含む、請求項10に記載の方法。
- 環境汚染物質を実質的に含まない、請求項1に記載のエイコサペンタエン酸濃縮物。
- 油の質量パーセントとして計測して少なくとも70質量パーセントのエイコサペンタエン酸を含み、且つドコサヘキサエン酸を実質的に含まないエイコサペンタエン酸濃縮物を作製するための、乾燥細胞質量の約25%超を油として蓄積する微生物から得られる微生物油であって、全脂肪酸の質量パーセントとして計測して30〜70質量パーセントのエイコサペンタエン酸を有し、且つドコサヘキサエン酸を実質的に含まない微生物油の使用。
- 前記微生物油が濃縮されていない、請求項1〜4のいずれか一項に記載の微生物油。
- 前記微生物油が、ノナデカペンタエン酸及びヘネイコサペンタエン酸からなる群から選択される脂肪酸を実質的に含まない、請求項1〜4のいずれか一項に記載の微生物油。
- 前記エイコサペンタエン酸濃縮物が、ノナデカペンタエン酸及びヘネイコサペンタエン酸からなる群から選択される脂肪酸を実質的に含まない、請求項15に記載のエイコサペンタエン酸濃縮物。
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