CN111718858A - 基于限氮培养和植物激素调控的破囊壶菌脂肪酸生产方法 - Google Patents

基于限氮培养和植物激素调控的破囊壶菌脂肪酸生产方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了基于限氮培养和植物激素调控的破囊壶菌脂肪酸生产方法，该方法包括：(1)配制限氮培养基；(2)加入植物激素；(3)将破囊壶菌Aurantiochytrium sp.PKU#SW8 CGMCC No.20069接种到步骤(2)获得的培养基中，培养，离心、水洗、冻干收获生物质，提取脂肪酸。本发明的方法提升破囊壶菌Aurantiochytrium sp.PKU#SW8 CGMCC No.20069的脂肪酸生产效率。本发明的方法具有简单、易操作、低成本等特点，相比于标准的培养条件，改进后的培养条件对脂肪酸特别是多不饱和脂肪酸产量的提升具有明显的效果。

Description

基于限氮培养和植物激素调控的破囊壶菌脂肪酸生产方法
技术领域
本发明涉及海洋生物资源的开发利用及产业化技术领域，特别涉及基于限氮培养和植物激素调控的破囊壶菌脂肪酸生产方法。
背景技术
脂肪酸是维护人体健康的重要营养物质，在能量供应、激素和细胞膜物质的合成以及维生素A、D、E、K的吸收等方面起到重要作用。相比于饱和脂肪酸，不饱和脂肪酸对人体健康更为有益，其中omega-3、omega-6等多不饱和脂肪酸是降低血液胆固醇水平、维护心血管健康的必需脂肪酸，但人体自身无法合成，必须从食物中直接摄取。Omega-6常见于葵花、大豆、玉米等植物油中，而亚麻籽、大麻籽和深海多脂鱼类则是富含omega-3的主要食物。Omega-3和omega-6都对人体有益，但后者会阻碍前者的利用，因此最好摄入更多的Omega-3。目前，多不饱和脂肪酸已被广泛应用于心血管疾病的预防，成为越来越受欢迎的保健产品。然而，传统的商业来源将无法满足其日益增长的市场需求，因此迫切需要找到生产多不饱和脂肪酸的替代来源。
破囊壶菌是一类广泛分布于海洋的单细胞异养原生生物，已被发现具有高产脂肪酸特别是多不饱和脂肪酸的潜力，被看作是该类天然活性化合物商业化生产的重要替代来源。目前已有不同的方法用于提高破囊壶菌的脂肪酸积累水平，包括针对不同菌株优化其碳源、氮源、温度、溶解氧等发酵参数，但尚未有结合限氮培养和植物激素调控来促进破囊壶菌脂肪酸积累的报道。
发明内容
本发明的目的是克服现有技术的不足，提供一种破囊壶菌菌株Aurantiochytriumsp.PKU#SW8。
本发明的第二个目的是提供基于限氮培养和植物激素调控的破囊壶菌脂肪酸生产方法。
本发明的技术方案概述如下：
破囊壶菌Aurantiochytrium sp.PKU#SW8 CGMCC No.20069，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心。
基于限氮培养和植物激素调控的破囊壶菌脂肪酸生产方法，包括如下步骤：
(1)配制限氮培养基：15-25g/L葡萄糖，0.2-0.3g/L KH2PO4，0.7-0.8g/L蛋白胨，0.4-0.6g/L酵母提取物，30-36g/L海盐，余量为蒸馏水；
(2)向限氮培养基中加入终浓度为8-12mg/L吲哚乙酸、终浓度为4-6mg/L激动素、终浓度为0.1-4mg/L赤霉酸或终浓度为0.5-5mg/L水杨酸；
(3)将权利要求1的破囊壶菌Aurantiochytrium sp.PKU#SW8 CGMCC No.20069接种到步骤(2)获得的培养基中，在25-30℃恒温、140-200rpm恒定转速下连续摇床培养4-6天，离心、水洗、冻干收获生物质，利用酸热法提取脂肪酸。
优选地，限氮培养基为：20g/L葡萄糖，0.25g/L KH2PO4，0.75g/L蛋白胨，0.5g/L酵母提取物，33g/L海盐，余量为蒸馏水。
优选地，所述步骤(2)为：向所述限氮培养基中加入终浓度为10mg/L吲哚乙酸、终浓度为5mg/L激动素、终浓度为0.1mg/L赤霉酸或终浓度为1mg/L水杨酸。
本发明的优点：
本发明借助外源植物激素的调控作用，在限氮培养的基础上进一步提升破囊壶菌Aurantiochytrium sp.PKU#SW8 CGMCC No.20069的脂肪酸生产效率。本发明的方法具有简单、易操作、低成本等特点，相比于标准的培养条件，改进后的培养条件对脂肪酸特别是多不饱和脂肪酸产量的提升具有明显的效果。
具体实施方式
下面通过具体实施例对本发明作进一步的说明。
实施例1
破囊壶菌Aurantiochytrium sp.PKU#SW8 CGMCC No.20069。
(1)获得途径：通过松花粉垂钓和抗生素平板培养法，于2012年7月从深圳近岸海水中分离获得菌株。
(2)细胞特征：与其它破囊壶菌类似，经吖啶黄特异性染色后，在蓝紫光激发下，含硫化多糖的细胞壁发射红色荧光，细胞质发射黄绿色荧光，属于单细胞异养的真核微生物；
(3)物种分类：根据其细胞特征，结合18S rRNA基因测序(NCBI GenBank序列号：JX847378.1)和系统发育分析，鉴定为网粘菌纲、破囊壶菌科、Aurantiochytrium属；
(4)应用价值：具有生产二十二碳六烯酸(DHA)、二十碳五烯酸(EPA)等高价值多不饱和脂肪酸以及二十二烷酸、十六烷酸等饱和脂肪酸的潜力(见实施例3和实施例4)；
(5)命名保藏：生物材料名称为破囊壶菌Aurantiochytrium sp.菌株代号为PKU#SW8，并已于2020年6月11日将该菌株提交至中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，进行生物材料保存，保藏编号为CGMCC No.20069。
对照例1
破囊壶菌脂肪酸生产方法，包括如下步骤：
(1)配制标准M4培养基：20g/L葡萄糖，0.25g/L KH2PO4，1.5g/L蛋白胨，1g/L酵母提取物，33g/L海盐，余量为蒸馏水；
(2)将破囊壶菌菌株Aurantiochytrium sp.PKU#SW8 CGMCC No.20069种子液按5％的稀释度接种到步骤(1)获得的培养基中，在28℃恒温、170rpm恒定转速下连续摇床培养4天，离心、水洗、冻干收获生物质，利用酸热法提取脂肪酸。
获得的总脂肪酸产量为3312mg/L，其中多不饱和脂肪酸产量为2098mg/L。
对照例2
基于限氮培养的破囊壶菌脂肪酸生产方法，包括如下步骤：
(1)配制限氮培养基：20g/L葡萄糖，0.25g/L KH2PO4，0.75g/L蛋白胨，0.5g/L酵母提取物，33g/L海盐，余量为蒸馏水；
(2)将破囊壶菌菌株Aurantiochytrium sp.PKU#SW8 CGMCC No.20069种子液按5％的稀释度接种到步骤(1)获得的培养基中，在28℃恒温、170rpm恒定转速下连续摇床培养4天，离心、水洗、冻干收获生物质，利用酸热法提取脂肪酸。
获得的总脂肪酸产量为3659mg/L，比对照例1提升10.5％；其中多不饱和脂肪酸产量为2297mg/L，比对照例1提升9.5％。
实施例2
基于限氮培养和植物激素调控的破囊壶菌脂肪酸生产方法，包括如下步骤：
(1)配制限氮培养基：15g/L葡萄糖，0.2g/L KH2PO4，0.7g/L蛋白胨，0.4g/L酵母提取物，30g/L海盐，余量为蒸馏水；
(2)向限氮培养基中加入终浓度为10mg/L吲哚乙酸；(将吲哚乙酸溶于二甲基亚砜，过滤除菌后，加入)
(3)将破囊壶菌菌株Aurantiochytrium sp.PKU#SW8 CGMCC No.20069种子液按5％的稀释度接种到步骤(2)获得的培养基中，在25℃恒温、140rpm恒定转速下连续摇床培养6天，离心、水洗、冻干收获生物质，利用酸热法提取脂肪酸。
获得的总脂肪酸产量为3881mg/L，比对照例1和对照例2分别提升17.2％和6.1％；其中多不饱和脂肪酸产量为2734mg/L，比对照例1和对照例2分别提升30.3％和19.0％。
实验证明，用终浓度8mg/L或12mg/L吲哚乙酸替代本实施例的终浓度为10mg/L吲哚乙酸，其它同本实施例，获得的总脂肪酸产量和多不饱和脂肪酸产量与本实施例相似。
实施例3
基于限氮培养和植物激素调控的破囊壶菌脂肪酸生产方法，包括如下步骤：
(1)限氮培养基：20g/L葡萄糖，0.25g/L KH2PO4，0.75g/L蛋白胨，0.5g/L酵母提取物，33g/L海盐，余量为蒸馏水；
(2)向所述限氮培养基中加入终浓度为5mg/L激动素；(将激动素溶于二甲基亚砜，过滤除菌后，加入)
(3)将破囊壶菌菌株Aurantiochytrium sp.PKU#SW8 CGMCC No.20069种子液按5％的稀释度接种到步骤(2)获得的培养基中，在28℃恒温、170rpm恒定转速下连续摇床培养4天，离心、水洗、冻干收获生物质，利用酸热法提取脂肪酸。
获得的总脂肪酸产量为4625mg/L，比对照例1和对照例2分别提升39.6％和26.4％；其中多不饱和脂肪酸产量为2779mg/L，比对照例1和对照例2分别提升32.4％和21.0％。
获得的脂肪酸中，DHA和EPA为主要的多不饱和脂肪酸组分，占生物量干重的比例分别为397mg/g和46mg/g；二十二烷酸和十六烷酸为主要的饱和脂肪酸组分，占生物量干重的比例分别为254mg/g和50mg/g。
实验证明，用终浓度4mg/L或6mg/L激动素替代本实施例的终浓度为5mg/L激动素，其它同本实施例，获得的总脂肪酸产量和多不饱和脂肪酸产量与本实施例相似。
实施例4
基于限氮培养和植物激素调控的破囊壶菌脂肪酸生产方法，包括如下步骤：
(1)限氮培养基：20g/L葡萄糖，0.25g/L KH2PO4，0.75g/L蛋白胨，0.5g/L酵母提取物，33g/L海盐，余量为蒸馏水；
(2)向所述限氮培养基中加入终浓度为0.1mg/L赤霉酸；(将赤霉酸溶于二甲基亚砜，过滤除菌后，加入)
(3)将破囊壶菌菌株Aurantiochytrium sp.PKU#SW8 CGMCC No.20069种子液按5％的稀释度接种到步骤(2)获得的培养基中，在28℃恒温、170rpm恒定转速下连续摇床培养4天，离心、水洗、冻干收获生物质，利用酸热法提取脂肪酸。
获得的总脂肪酸产量为4506mg/L，比对照例1和对照例2分别提升36.1％和23.2％；其中多不饱和脂肪酸产量为2784mg/L，比对照例1和对照例2分别提升32.7％和21.2％。
获得的脂肪酸中，DHA和EPA为主要的多不饱和脂肪酸组分，占生物量干重的比例分别为410mg/g和38mg/g；二十二烷酸和十六烷酸为主要的饱和脂肪酸组分，占生物量干重的比例分别为191mg/g和46mg/g。
实验证明，用终浓度4mg/L赤霉酸替代本实施例的终浓度为0.1mg/L赤霉酸，其它同本实施例，获得的总脂肪酸产量和多不饱和脂肪酸产量与本实施例相似。
实施例5
基于限氮培养和植物激素调控的破囊壶菌脂肪酸生产方法，包括如下步骤：
(1)限氮培养基：25g/L葡萄糖，0.3g/L KH2PO4，0.8g/L蛋白胨，0.6g/L酵母提取物，36g/L海盐，余量为蒸馏水；
(2)向所述限氮培养基中加入终浓度为1mg/L水杨酸；(将水杨酸溶于乙醇，过滤除菌后，加入)
(3)将破囊壶菌菌株Aurantiochytrium sp.PKU#SW8 CGMCC No.20069种子液按5％的稀释度接种到步骤(2)获得的培养基中，在30℃恒温、200rpm恒定转速下连续摇床培养5天，离心、水洗、冻干收获生物质，利用酸热法提取脂肪酸。
获得的总脂肪酸产量为4077mg/L，比对照例1和对照例2分别提升23.1％和11.4％；其中多不饱和脂肪酸产量为2764mg/L，比对照例1和对照例2分别提升31.7％和20.3％。
实验证明，用终浓度0.5mg/L或5mg/L水杨酸替代本实施例的终浓度为1mg/L水杨酸，其它同本实施例，获得的总脂肪酸产量和多不饱和脂肪酸产量与本实施例相似。
破囊壶菌菌株Aurantiochytrium sp.PKU#SW8
(1)菌株传代保藏：制备MV琼脂培养基(10g/L葡萄糖，0.25g/L KH2 PO4，1.5g/L蛋白胨，0.1g/L酵母提取物，33g/L海盐，20g/L琼脂，余量为水，115℃高压蒸汽灭菌21min)，28℃下培养保存破囊壶菌菌株，每月转接一次；
(2)种子液培养：从MV琼脂培养基中挑取单菌落，接种到M4标准液体培养基(20g/L葡萄糖，0.25g/L KH2 PO4，1.5g/L蛋白胨，1g/L酵母提取物，33g/L海盐，余量为水，115℃高压蒸汽灭菌21min)中，然后在28℃恒温、170rpm恒定转速下摇床培养24h；
(3)细胞干重测定：将含有生物质的培养液转移到已称重的空离心管内，在4℃下以4000rpm转速离心10min，用蒸馏水洗2次，然后冻干24h，通过重量法测定细胞干重；
(4)脂肪酸分析：将2mL体积浓度4％的硫酸甲醇溶液和100μL含有1mg/mL正己烷的十九烷酸加入到装有30-50mg冻干细胞的离心管中，涡旋振荡20sec，然后在80℃下水浴孵育1h，冷却至室温后加入1mL正己烷和1mL蒸馏水，涡旋振荡20sec，4000rpm离心2min，收集正己烷层的脂肪酸甲酯，通过气相色谱法分析脂肪酸含量及组分。

Claims (4)

1.破囊壶菌Aurantiochytrium sp.PKU#SW8 CGMCC No.20069，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心。
2.基于限氮培养和植物激素调控的破囊壶菌脂肪酸生产方法，其特征是包括如下步骤：
(1)配制限氮培养基：15-25g/L葡萄糖，0.2-0.3g/L KH2PO4，0.7-0.8g/L蛋白胨，0.4-0.6g/L酵母提取物，30-36g/L海盐，余量为蒸馏水；
(2)向限氮培养基中加入终浓度为8-12mg/L吲哚乙酸、终浓度为4-6mg/L激动素、终浓度为0.1-4mg/L赤霉酸或终浓度为0.5-5mg/L水杨酸；
(3)将权利要求1的破囊壶菌Aurantiochytrium sp.PKU#SW8 CGMCC No.20069接种到步骤(2)获得的培养基中，在25-30℃恒温、140-200rpm恒定转速下连续摇床培养4-6天，离心、水洗、冻干收获生物质，利用酸热法提取脂肪酸。
3.根据权利要求2所述的方法，其特征是所述限氮培养基为：20g/L葡萄糖，0.25g/LKH2PO4，0.75g/L蛋白胨，0.5g/L酵母提取物，33g/L海盐，余量为蒸馏水。
4.根据权利要求2所述的方法，其特征是所述步骤(2)为：向所述限氮培养基中加入终浓度为10mg/L吲哚乙酸、终浓度为5mg/L激动素、终浓度为0.1mg/L赤霉酸或终浓度为1mg/L水杨酸。
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