JP6397556B1 - 多価不飽和脂肪酸生産用微細藻類培養培地組成物及び方法 - Google Patents
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Abstract
【課題】微細藻類を利用した多価不飽和脂肪酸生産の向上のための微細藻類培養培地組成物の提供。【解決手段】微細藻類で多価不飽和脂肪酸生産能向上のための、アンフィディニウムカルテレ（Ａｍｐｈｉｄｉｎｉｕｍ ｃａｒｔｅｒａｅ）、ヘテロシグマアカシオ（Ｈｅｔｅｒｏｓｉｇｍａ ａｋａｓｈｉｗｏ）、又はテレオラクス種（Ｔｅｌｅａｕｌａｘ ｓｐ．）から選択された一つ以上の餌種を含む、混合栄養性渦鞭毛藻類微細藻類であるパラギムノディニウムシファエンス（Ｐａｒａｇｙｍｎｏｄｉｎｉｕｍ ｓｈｉｗｈａｅｎｓｅ）培養培地組成物、及び、該培養培地組成物を利用して培養する微細藻類を利用した多価不飽和脂肪酸を生産する方法。オメガ−３脂肪酸等の多価不飽和脂肪酸を高濃度で生産することができる。【選択図】図３
Description
本願は、微細藻類を利用した多価不飽和脂肪酸生産の向上のための微細藻類培養培地組成物に関する。
多価不飽和脂肪酸(Polyunsaturased fattyacids, PUFAs)は、真核生物に必須の成分である。この中で特に、オメガ−３脂肪酸と知られているＥＰＡ(eicosapentaenoicacid)及びＤＨＡ(Docosahexaenoic acid)は、人類健康に核心的な要素である。この二種類の脂肪酸は、胎児発達に重要に作用すると知られている。さらに、これらの物質は、様々な心血管疾患、体重、アルツハイマー病に係る認知作用などに関与すると知られている。
しかし、ヒトに十分な量のオメガ−３を提供するためには他の生物からの獲得が必要である。なぜなら、これらのオメガ−３脂肪酸は、ヒト自ら効率よく合成できないためである。従って、オメガ−３脂肪酸が豊富な魚類など生物の消費量が世界的に増加している。
魚類のオイルに前記ＥＰＡ及びＤＨＡが豊富なことが知らされていて、限られた種類のいくつかの植物油などが他の多価不飽和脂肪酸の良いソースと知られている。現在多くのＥＰＡ及びＤＨＡの供給が魚類のオイルから行われているが、魚類の場合に人類食糧資源及び生物枯渇、そして海洋汚染物質濃縮などの問題によってオメガ−３脂肪代替資源が必要な実情である。
一部の海洋原生生物は、高い量のＥＰＡまたはＤＨＡを含有していると知られている。Ｅｕｓｔｉｍａｔｏｐｈｙｔｅに属するnANNOCHLOROPSIS SPP.、硅藻類に属するpHAEODACTYLUMSPP.、tHALASSIOSIRA SPP.などは、高含有量のＥＰＡを有していると知られていて、tHRAUSTOCHYTRIDSに属するtHRAUSTOCHYTRIUM SPP.とsCHIZOCHYTRIUM SPP.、そして渦鞭毛藻類cRYPTHECODINIUMSPP.は、高含有量のＤＨＡを有していると知られている。cRYPTHECODINIUM COHNIIの場合、実際の大量規模でＤＨＡ商業的生産が行われている状態にある。
このような商業的利用の可能性のために、オメガ−３脂肪酸含有量を増加させようと、これらの生合成経路に対する研究も盛んに行われている状況である。ＥＰＡとＤＨＡを含む多価不飽和脂肪酸合成には、脂肪酸鎖の連続的な不飽和(desaturation)及び伸長(elongation)が求められる。ＥＰＡは、一般にデルタ−５、デルタ−６不飽和酵素(desaturase)及びデルタ−６伸長酵素(elongase)を使用して、ＡＬＡ前駆物質からＳＤＡ及びＥＴＡを経て転換されると知られている。またはＬＡからＧＬＡ及びＤＧＬＡ、ＡＲＡを経て生産される機序も知られている。
微細藻類の場合、ＤＨＡはデルタ−５伸長酵素及びデルタ−４伸長酵素遺伝子を利用してＥＰＡからＤＰＡを経てすぐ生産できるとの事実が知られている。渦鞭毛藻類でもまたＤＨＡ含有量を増やそうと、このような遺伝的特性把握及び生物工学に対する研究の関心が高まっている傾向にある。しかし、次のようなＥＰＡ及びＤＨＡ合成関与遺伝子は、まだ渦鞭毛藻類種株から発見されたことがない状態にある。したがって、生物工学で様々な多価不飽和脂肪酸の合成に関与する遺伝子を商業的に利用するためにも、これらの遺伝子の発見のための研究は大変重要な価値を有する。
渦鞭毛藻類パラギムノディニウムシファエンス(Paragymnodiniumshiwhaense)は、２０１０年に新しく命名された新種渦鞭毛藻類であり、クロロフィルを有してはいるが、光合成だけでは分裂できず、餌から有機物を獲得して成長する特徴を有する混合栄養性渦鞭毛藻類である。
特許文献１は、「ＦＡＢ２遺伝子を過発現する形質転換微細藻類で総脂肪酸含有量及び有用脂肪酸割合を増加させる方法」に関するものとして、ＦＡＢ２遺伝子過発現させる微細藻類形質転換によって総脂肪酸及び有用脂肪酸であるオレイン酸などの割合を増加させる方法が開示されている。
特許文献２は、「微細藻類から高度不飽和脂肪酸を生産する方法」に関するものとして、培地にせん断応力保護剤を添加させて微細藻類培養速度を増加させて、培養時間を短縮させることによって脂肪酸を生産する方法が開示されている。
しかし、餌種の添加によって微細藻類内脂肪酸含有量を増加させることについては知られていない。
本発明は、餌種を含む多価不飽和脂肪酸生産用微細藻類培養培地組成物を利用して微細藻類である渦鞭毛藻類の脂肪酸生成を促進する技術に関する。
一様態で、本願は、高度多価不飽和脂肪酸生産能向上のための、アンフィディニウムカルテレ(Amphidinium carterae)、ヘテロシグマアカシオ(Heterosigmaakashiwo)またはテレオラクス種(Teleaulax sp.)の中の一つ以上の餌種を含む渦鞭毛藻類微細藻類培養培地組成物を提供する。
本願に係る組成物は、渦鞭毛藻類微細藻類、特に混合栄養性渦鞭毛藻類微細藻類の培養に使用されて高度多価不飽和脂肪酸の生産能を向上させることができる。
本願に係る組成物は、混合栄養性渦鞭毛藻類微細藻類としてパラギムノディニウムシファエンス(Paragymnodinium shiwhaense)、ギムノディニウムスメイデ(Gymnodinium smaydae)または、ジャイロディニエルームシファエンス(Gyrodiniellum shiwhaense)の培養に使用されて高度多価不飽和脂肪酸の生産能を向上させることができる。
本願に係る組成物を使用する場合、微細藻類で高度多価不飽和脂肪酸、特にオメガ−３不飽和脂肪酸、さらにはドコサヘキサエン酸（Docosahexaenoic acid：ＤＨＡ）、エイコサペンタエン酸（Eicosapentaenoicacid：ＥＰＡ）、ドコサペンタエン酸（Docosapentaenoic acid：ＤＰＡ）及びα−リノレン酸（ＡＬＡ）で構成された群から選択された１種以上の多価不飽和脂肪酸の生産能が向上される。
本願に係る組成物に含まれる餌種はアンフィディニウムカルテレ、ヘテロシグマアカシオまたはテレオラクス種対前記パラギムノディニウムシファエンスの個体数基準濃度比は５〜２０：１の比で含まれる。
本願に係る組成物に含まれる餌種は、一実現例で前記アンフィディニウムカルテレ対パラギムノディニウムシファエンスの個体数基準濃度比は８：１で、前記ヘテロシグマアカシオ対パラギムノディニウムシファエンスの個体数基準濃度比は９：１で、前記テレオラクス種対パラギムノディニウムシファエンスの個体数基準濃度比は１４：１であって、高度不飽和脂肪酸生産のための培養体が汚染されず、高効率で高度不飽和脂肪酸を収得することができる。
さらに他の様態で、本願は本願に係る培養培地組成物を利用して微細藻類としてパラギムノディニウムシファエンスを培養する段階を含む微細藻類を利用した多価不飽和脂肪酸を生産する方法を提供する。
さらに他の様態で、本願は本願に係る培養培地組成物を利用して微細藻類としてパラギムノディニウムシファエンスを培養する段階を含む前記微細藻類を利用して多価不飽和脂肪酸生産能を向上させる方法を提供する。
本願に係るアンフィディニウムカルテレ(Amphidiniumcarterae)、ヘテロシグマアカシオ(Heterosigma akashiwo)またはテレオラクス種(Teleaulax sp.)を含む微細藻類培養用組成物は、特にパラギムノディニウムシファエンス(Paragymnodinium shiwhaense)培養時、これに含まれた高度多価不飽和脂肪酸、特にオメガ−３脂肪酸であるＥＰＡ及びＤＨＡの含有量及び／または割合をより増加させることができる。したがって、本願に係る組成物を利用すると、微細藻類でオメガ−３脂肪酸などの多価不飽和脂肪酸を効率よく高濃度で生産することができる。
具体的に、パラギムノディニウムシファエンスの高度多価不飽和脂肪酸組成を他の市販のまたは開発中の脂肪酸を有する微細藻類種株と比較した結果、パラギムノディニウムシファエンスは、ＥＰＡ及びＤＨＡの含有量及び／または割合が高く、同時に関連した遺伝子を有していて、多価不飽和脂肪酸生産のための商業的開発が可能であることが分かった。
本願は、微細藻類である混合栄養性渦鞭毛藻類（dinoflagellate）、特にパラギムノディニウムシファエンス（Paragymnodinium shiwhaense）の培養培地に特定餌種を供給すると、Ｐ．シファエンスの総脂肪酸生産が増加して、特にオメガ３の生産が増加することの発見に基づいたものである。
本願では、渦鞭毛藻類アンフィディニウムカルテレ（Amphidiniumcarterae）、ラフィド藻類（Raphidophyte）ヘテロシグマアカシオ（Heterosigma akashiwo）、クリプト藻類（Cryptophte）テレオラクス種（Teleaulax sp.）が前記Ｐ．シファエンスの餌種として使用されて、多価不飽和脂肪酸の含有量を高めて、さらに、これに微細藻類のデルタ−５及びデルタ−６不飽和酵素(desaturase)とデルタ−６伸長酵素(elongase)が関与することを明らかにした。
一様態で本願は、微細藻類を利用した多価不飽和脂肪酸生産能向上のための、アンフィディニウムカルテレ（Amphidinium carterae)、ヘテロシグマアカシオ(Heterosigmaakashiwo)またはテレオラクス種(Teleaulax sp.)の中の一つ以上の餌種を含む、混合栄養性渦鞭毛藻類微細藻類培養培地組成物に関する。
本願に係る培養培地組成物は、微細藻類の培養に使用される。微細藻類(microalgae)は、顕微鏡で観察できる単細胞性藻類であって、多くの植物性プランクトンがこれに属する。微細藻類は、健康食品及び代替エネルギー源として良く知られていて、水産養殖用飼料、医薬原料物質の生産、生化学物質の生産などにその利用性が拡大されている。
微細藻類は、生物学的特徴により、藍色細菌(Cyanobacteria)、灰色藻類(Glaucophyte)、クロララクニオン藻類(Chlororarachniophte)、ユーグレナ類(Euglenoid)、クリプト藻類(Cryptomonad)、ハプト藻類(Haptophyte)、渦鞭毛藻類(Dinoflagellate)、ラフィド藻類を含む光合成ストラメノパイル(Photosynthetic stramenopiles)、紅藻類(redalage)、緑藻類(green algae)等に分類される。
このような微細藻類は、さらに栄養を取得する方法により、光合成を行う植物性の独立栄養性、他の生物体を摂食する動物性の従属栄養性、他の生物体に寄生する寄生性または植物性と動物性が混合された混合栄養性微細藻類に区分され得る。
本願に係る培養組成物は、餌種を含むため、餌種の摂食が可能な微細藻類、すなわち従属栄養性である動物性微細藻類、または従属及び独立栄養性が混合された混合栄養性微細藻類の培養に使用され得る。本願の一実現例で本願に係る組成物は、渦鞭毛藻類、特に従属栄養性または混合栄養性渦鞭毛藻類の培養に使用されて、これは例えばパラギムノディニウムシファエンス(Paragymnodinium shiwhaense)、ギムノディニウムスメイデ(Gymnodinium smaydae)、またはジャイロディニエルームシファエンス(Gyrodiniellum shiwhaense)を含むが、これらに制限されない。
本願に係る一実現例で本願に係る組成物は、混合栄養性渦鞭毛藻類であって、パラギムノディニウムシファエンス(Paragymnodinium shiwhaense)の培養に使用される。前記Ｐ．シファエンスは、２０１０年に新しく命名された迅速新種渦鞭毛藻類であって、葉緑体を有してはいるが光合成だけでは分裂できず、餌から有機物を獲得して成長する特徴を持つ混合栄養性である。
本願に係る組成物を利用して微細藻類で生産されて、生産能が向上される“高度多価不飽和脂肪酸”は、炭素数１８個以上の二つ以上の二重結合（π）を含む不飽和脂肪酸を意味する。
特に本願に係る実現例で、高度多価不飽和脂肪酸は、オメガ−３不飽和脂肪酸であり、より好ましくはドコサヘキサエン酸（ＤＨＡ）、エイコサペンタエン酸（ＥＰＡ）、ドコサペンタエン酸（ＤＰＡ）またはα−リノレン酸（ＡＬＡ）であり、より好ましくはＤＨＡまたはＥＰＡである。
本願に係る培養培地組成物は、従属または従属／混合栄養性微細藻類の高度多価不飽和脂肪酸生産能を増加させる。
本願で生産能とは、微細藻類単位個体数または単位重量当たり総脂肪酸量の増加、高度不飽和脂肪酸の量の増加、オメガ−３量の増加、ＤＨＡまたはＥＰＡ量の増加、または生産された脂肪酸のうち高度不飽和脂肪酸の相対的割合の増加、生産された総脂肪酸または高度不飽和脂肪酸のうちオメガ−３の相対的割合の増加、生産されたオメガ−３中のＤＨＡ及びＥＰＡの相対的割合の増加を含む。上述した中からいずれか一つでも目的する脂肪酸の生産増加に繋がることができ、例えば相対的割合が増加する場合には目的する脂肪酸量の増加はもちろん、濃度が高まるようになり、分離し易くなる。
本願に係る培地組成物は餌種として、アンフィディニウムカルテレ(Amphidinium carterae)、ヘテロシグマアカシオ（Heterosigmaakashiwo)、またはテレオラクス種(Teleaulax sp.)の中の一つ以上の餌種を含む。
本願に係る組成物は、このような餌種を使用することで、生産能が増加される。
一実現例よると、アンフィディニウムカルテレは総脂肪量の増加、総脂肪のうち高度多価不飽和脂肪酸割合の増加、オメガ−３量の増加、そしてＥＰＡ及びＤＨＡの増加を可能とする。
他の実現例によると、ヘテロシグマアカシオが使用されて、総脂肪、または高度多重不飽和脂肪のうちオメガ３の割合の増加、オメガ−３中のＥＰＡ及びＤＨＡの増加を可能とする。
さらに他の実現例によると、テレオラクス種が使用されて総脂肪量の増加及びオメガ−３中のＤＨＡ及びＥＰＡの割合が増加する。テレオラクス種は単一種であるが、種までは解明されていない状態であるが、本願の実施例を含む明細書の記載から明確な把握が可能である。
本願に係る餌種として使用される微細藻類は、単独または組み合わせで使用され得る。本願によると、餌種として使用される各微細藻類間に互いに摂食したり、または死滅を誘導しないことが明らかになり、様々な組み合わせで使用でき、組み合わせで使用時、その効果が互いに補完的にまたは相乗的に作用することができる。
本発明の好ましい実現例によると、本発明によって培養培地組成物に含まれ得る餌種は、アンフィディニウムカルテレ、またはこれと他の二種類の餌種の組み合わせである。
本発明の培地組成物に添加される餌種は、微細藻類から多価不飽和脂肪酸を高効率で収得できるように培養に適した形態で添加される得る。前記餌種の形態は培養条件に応じて当業者により最適な形態で添加され、本願の一実現例では指数成長状態あるいは早い定常状態(stationary state)の培養物を含むことができる。
本発明は、微細藻類培地に前記餌種を添加して培養することによって、多価不飽和脂肪酸生産能を向上させて微細藻類から多価不飽和脂肪酸を高効率で収得することを特徴とし、微細藻類培地に添加する餌種の濃度は制限されない。しかし、微細藻類の培養培地に添加される餌種は培養条件に応じて当業者によって最適な濃度を選択して培地に添加されることが好ましい。
本願の培養培地組成物には、前記餌種とＰ．シファエンスの濃度比（個体数基準）が特定割合となるように混合される。前記餌種は、培養培地組成物で実質的に成長（分裂）せず、実質的とは、培地に接種後個体数が入れた個体数よりも約１０％以上増加しないことである。前記餌種提供後、培地内に数時間乃至数日以内に餌種が摂食によって除去できるようにした。餌種が除去されずそのまま維持あるいは成長する場合、全培養体の量で餌種が占める割合が一定以上維持されるか増加されて、餌種による培養液の汚染及びこれによる生産能が低下されることがあり、本願ではこのような点も解決した。すなわち、摂食されない餌種で培養体が汚染されると、これらは、Ｐ．シファエンスに比べて総脂肪量やｏｍｅｇｅ−３、またはＥＰＡ＋ＤＨＡの量が少ないため、混ざっている場合、脂肪酸生産量が低下され得る。一実現例では、餌種対Ｐ．シファエンスは濃度比が、約５〜２０：１になるべく含まれる、他の実現例で、前記濃度比は、アンフィディニウムカルテレ対Ｐ．シファエンスは、約８：１で、ヘテロシグマアカシオ対Ｐ．シファエンスは、約９：１で、テレオラクス種対Ｐ．シファエンスは、約１４：１である。
本発明の微細藻類の多価不飽和脂肪酸生産能向上のために使用される微細藻類(microalgae)培養培地組成物は、本願に係る効果を達成する限り、微細藻類の培養に使用される様々な培地と共に使用され得る。
好ましくは、本発明で利用される培地は、炭素原及び窒素原を含み海水及び塩化ナトリウムを含む培地で行われることが好ましく、前記炭素原としてはブドウ糖、果糖、ガラクトース、グルコース、グリセロールまたはこれらの混合物からなる群で選択されることができ、前記窒素原としてはグルタミン酸ナトリウム、ペプトン、トリプトン、酵母抽出物、とうもろこし浸漬液、硝酸ナトリウム、硫酸アンモニウム、クエン酸アンモニウムまたはこれらの混合物からなる群で選択されることができる。
好ましくは、前記培地に含まれた炭素原は２〜２０（重量／体積）％、より好ましくは９〜１５（重量／体積）％の濃度で含まれる。また、前記培地に含まれた窒素原は、０．１〜５（重量／体積）％で含まれることが好ましく、より好ましくは１〜２．５（重量／体積）％の濃度で含まれる。
本願の一実現例に利用され得る培地は、海洋性渦鞭毛藻類の培養に使用されるｆ／２培地が使用される(Guillard,R.R.L. 1975. Culture of phytoplankton for feeding marineinvertebrates. pp 26-60. In Smith W.L. and Chanley M.H(Eds.) Culture of MarineInvertebrate Animals. Plenum Press, New York，ＵＳＡ参照)。
本願の前記培養培地組成物が含まれた培地でＰ．シファエンスを培養した時、多価不飽和脂肪酸の生産能が向上され、これは本理論に限定するものではないが、Ｐ．シファエンスのＥＰＡ及びＤＨＡ生合成経路(biosynthetic pathway)における不飽和酵素及び伸長酵素遺伝子、デルタ−５、デルタ−６不飽和酵素及びデルタ−６伸長酵素によるものである。
本願の前記培養培地組成物は、Ｐ．シファエンスから多価不飽和脂肪酸を生産する方法に利用できる。
このような側面で、他の様態で本願は、本願に係る組成物を利用した混合栄養性渦鞭毛藻類微細藻類を利用した多価不飽和脂肪酸、特に高度多価不飽和脂肪酸、さらに特にオメガ−３生産方法または前記微細藻類で前記脂肪酸の生産能を向上させる方法に関する。
このような方法は、本願に開示されたいずれか一つの培養培地組成物に混合栄養性渦鞭毛藻類微細藻類を接種して培養する段階を含む。
本願に係る方法に使用される組成物、培養培地、及び条件は、前記の内容及び本願実施例に記載された方法を参考にすることができる。
以下、本発明の理解を助けるために実施例を提示する。しかし、下記の実施例は、本発明をより理解し易くするために提供されるだけで、本発明が下記の実施例に限定されるものではない。
（実施例１：渦鞭毛藻類混合栄養性微細藻類Ｐ．シファエンス(shiwhaense)）
渦鞭毛藻類Ｐ．シファエンスは、２００６年５月韓国の始華湖（シファホ）沿岸で単一分離されたが(N.S.Kang et al Description of a new planktonic mixotrophicdinoflagellate Paragymnodinium shiwhaense n.gen., n.sp. from the coastal watersoff western Korea:morphology, pigments, and ribosomal, DNA gene sequence, J.Eukaryot.Microbiol.57(2)(2010)121144)、当時の温度及び塩分条件は、各１８．８度及び３０．４であった。Ｐ．シファエンス細胞は、連続する単一分離を介して確保した。下記の表１は、P.shiwhaense及びＥＰＡまたはＤＨＡに対する商業的生産が進行されるか準備中の他の微細藻類のＥＰＡ、ＤＨＡ、そしてＥＰＡ＋ＤＨＡの各々の量的情報（ｍｇ／ｇ）を示しており、下記の表２は、P.shiwhaense及び他の各微細藻類の全脂肪酸対比ＡＬＡ、ＥＰＡ、ＤＨＡ、ＥＰＡ＋ＤＨＡ、オメガ−３脂肪酸、オメガ−６脂肪酸の組成情報（％）を示している。下記の表に記載されたＲｅｆｅｒｅｎｃｅ情報は本願明細書の最後に表示されている。
餌種として渦鞭毛藻類アンフィディニウムカルテレ（Amphidinium carterae（ｓｔｒａｉｎ：ＡＣＵＳＡ））は、米国のスクリップス海洋研究所で獲得した種株である。ラフィド藻類ヘテロシグマアカシオ（Heterosigma akashiwo（ＨＡＫＳ９９０５））は、１９９９年５月、韓国の群山（グンサン）沿岸で単一分離された種株である(Y.D.Yoo,et al.,Feeding by the newly described mixotrophicdinoflagellate Paragymnodinium shiwhaense:feeding mechanism,prey species,andeffect of prey concentration,J.Eukaryot.Microbiol.57(2)(2010)145158)。クリプト藻類テレオラクス種（Teleaulax sp.（ＴＳＧＳ０２０２））は、２００２年２月、韓国、済州道（チェジュド）、コムソ地域で単一分離された種株である(Y.D.Yoo et al., Ibid.)。
培養条件：一日に１４時間（光あり）：１０時間（光なし）周期の約２０μＥｍ−２ｓ−１、光、温度：２０度、培地：ｆ／２ medium条件で培養した。実験に使用された餌種株は指数成長状態あるいは早いstationary状態のカルチャーを使用した。
Ｐ．シファエンスに、Ａ．カルテレを餌として２〜３日毎に濃度に合う適正量を提供した。Ｐ．シファエンス細胞の濃度が上がると、カルチャーを３２、２７０、そして５００ｍＬボリュームのポリカーボネート瓶(ＰＣ bottle)に移して培養を進めた。各瓶は、２０度条件及び餌種培養と同じ条件で培養を進めた。
本実験で、餌別Ｐ．シファエンスに提供される細胞濃度は次のとおりである（Ａ．カルテレ：Ｐ．シファエンス＝８：１、Ｈ．アカシオ：Ｐ．シファエンス＝９：１、テレオラクス種：Ｐ．シファエンス＝１４：１）。次のような割合は、餌種の成長率及び炭素量を考慮して決定された(Y.D.Yoo et al., Ibid.)。この割合を介してＰ．シファエンスの適切な成長率（０．０３〜０．０４／ｈｏｕｒ）を維持し、２〜３日後のすべての餌が除去されるようにした。
下記の表３に捕食者Ｐ．シファエンス及び各餌種Ａ．カルテレ、Ｈ．アカシオ及びテレオラクス種の培養条件に対する情報を示した。下記の表に記載されたＲｅｆｅｒｅｎｃｅ情報は本願明細書の最後に表示されている。
（実施例３．餌種摂食により微細藻類内脂肪酸量の増加確認（脂肪酸の小粒観察））
本実験は、Ｐ．シファエンスが３種類の各餌を摂食した時、細胞質内脂肪酸の小粒を視覚的に確認しようと進行された。Ｐ．シファエンスが含まれたＰＣ瓶で約１〜２ｍｌの液体を取って、ガラスグラスの上に置いた。そして細胞が含まれた液体に約１０ｕｌの緑色の蛍光を帯びる脂肪酸染色試薬であるＢＯＤＩＰＹ５０５／５１５を混合させた。この時、このＢＯＤＩＰＹ溶液は２μg当たり、２０ｍｌの無水ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）に混合して予め製作された。ガラススライドグラス上に細胞液体を載せてカバーグラスで覆った状態で、１０分間暗状態で染色を進めた。この後、蛍光顕微鏡(Zeiss Axiovert 200 M;Carl Zeiss Ltd,Germany)を使用して観察を進めて、Ｐ．シファエンス細胞内の脂肪酸の小粒（粒）の写真をAxioVision Imaging v．８．０．を利用してイメージ撮影した。
ＢＯＤＩＰＹ５０５／５１５試薬を餌種Ａ．カルテレ、Ｈ．アカシオ、テレオラクス種．そしてＰ．シファエンスのカルチャーに投入した時、光学顕微鏡下で各々の脂肪酸微粒子（小粒）が明るい黄色で、そして蛍光顕微鏡下で緑色の蛍光色で細胞質内で観察された。特に、Ａ．カルテレの細胞質内で脂肪酸の小粒は規則なしにランダムに細胞質内に分布した。Ｈ．アカシオの細胞質内の脂肪酸の小粒は細胞の中央部分に集まっていた。しかし、テレオラクス種の場合にはただ１−２個の脂肪酸の小粒が細胞質内で観察された。全体的に、三つの餌種の細胞質内脂肪酸の小粒粒子の大きさには大差なかった。
各々の餌種を摂食後に、一日の飢えさせた状態に到達したＰ．シファエンスの場合、細胞質内で分布の規則なしに多量の脂肪酸の小粒が観察された。しかし、細胞の中央部分は核が位置していて、脂肪酸染色蛍光が観察されなかった。餌種Ａ．カルテレ、Ｈ．アカシオ、そしてテレオラクス種を各々摂食したＰ．シファエンスの細胞内脂肪酸の小粒の粒子径は各々、０．５〜３．０μｍ、０．５〜２．５μｍ、そして０．５〜２．０μｍと確認された。Ａ．カルテレを摂食した後飢えてから０日、１日、５日、２０日が過ぎた時点のＰ．シファエンス細胞質を観察した時、いずれの時期で大きい差なしに多量の脂肪酸の小粒を確認することができた。
（実施例４．餌種摂食により微細藻類内の総脂肪酸量の増加確認（脂肪酸抽出））
本実験は、Ｐ．シファエンスが他の種類の餌を摂食した時の、脂肪酸組成及び量を確認するために進行された。餌種Ａ．カルテレ、Ｈ．アカシオそしてテレオラクス種を各々提供した後に飢えてから一日が過ぎた濃い濃度のＰ．シファエンスカルチャーを遠心分離方法を使用（１９５２ｘｇ回転速度、５分）して収穫した。細胞を収穫する前にカルチャー内に餌種が残っている場合を仮定して顕微鏡観察により残っていないことを確認した。この後、収穫したペレット形態の細胞は乾燥されたバイオマスを取得するために、−１１０度で一日凍結乾燥を進めた。この後、凍結乾燥されたサンプルから獲得した全ＦＡＭＥ（Fatty Acid Methyl Esters）は加水分解、抽出及びメチレーション手順を進めた。
ガスクロマトグラフィーを使用してＦＡＭＥを分析した。抽出されたＦＡＭＥ約１ｕlを、ガスクロマトグラフィー機械内の毛細管カラムに水素炎イオン化検出器(flameionization detector)と共に、２０：１割合のsplit ratioで噴射した。温度プログラムは次のとおりである；開始温度＝５０度、１分；１３０度まで分当り１５度速度で増加；１７０度まで分当り８度速度で増加；２１５度まで分当り２度速度で増加；以後１０分維持。インジェクターと検出器温度は各２５０度、２８０度である。様々なＦＡＭＥピークの同定はSupelco 37-component FAME mixのreferencestandardのretention timeと比較して行われた。いずれの脂肪酸量は、二回のサンプル測定及び平均を介して進行された。
下記の表４は、餌種渦鞭毛藻類アンフィディニウムカルテレ(Amphidiniumcarterae)、ラフィド藻類ヘテロシグマアカシオ(Heterosigma akashiwo)、そしてクリプト藻類テレオラクス種(Teleaulax sp.)の全脂肪酸対比各脂肪酸の割合（％）及び量（ｍｇ／ｇ）を示したものである。各実験は２回繰り返して平均±標準偏差で示した。
餌種Ａ．カルテレの全脂肪酸（Total fattyacid：ＴＦＡ）は５６．６ｍｇ／ｇで、これは細胞乾重量の約５．７％を占める。Ａ．カルテレが含有している最も多い組成の脂肪酸は順に、ＥＰＡ（１８．６ｍｇ／ｇ、３２．９％）、ＤＨＡ（１８．１ｍｇ／ｇ、３２．０％）、そしてパルミチン酸（palmitic acid）（１２．３ｍｇ／ｇ、２１．８％）であった。
餌種Ｈ．アカシオの全脂肪酸（ＴＦＡ）は８６．１ｍｇ／ｇで、これは細胞乾重量の約８．６％を占める。Ｈ．アカシオが含有している最も多い組成の脂肪酸は順に、パルミチン酸（palmitic acid）（２５．０ｍｇ／ｇ、２７．２％）、ＥＰＡ（２５．０ｍｇ／ｇ、２７．１％）、そしてパルミトレイン酸（palmitoleic acid）（１５．６ｍｇ／ｇ、１６．９％）であった。
餌種テレオラクス種の全脂肪酸（ＴＦＡ）は４１．２ｍｇ／ｇで、これは細胞乾重量の約４．１％を占める。テレオラクス種が含有している最も多い組成の脂肪酸は順に、ＡＬＡ（１３．０ｍｇ／ｇ、３１．５％）、ＥＰＡ（１０．３ｍｇ／ｇ、２５．０％）、そしてパルミチン酸（７．８ｍｇ／ｇ、１９．０％）であった。
下記の表５はＰ．シファエンスが各餌種を摂食した時の、全脂肪酸対比各脂肪酸の割合（％）及び量（ｍｇ／ｇ）を示したものである。各実験は２回繰り返して平均±標準偏差で示した。
Ａ．カルテレを摂食した後一日絶食した状態でのＰ．シファエンスの全脂肪酸量は９６．０ｍｇ／ｇで、これは細胞乾重量の９．６％を占める。この時のＰ．シファエンスが含有している最も多い組成の脂肪酸は順にＤＨＡ（３４．３ｍｇ／ｇ、３５．７％）、パルミチン酸（３０．５ｍｇ／ｇ、３１．８％）、そしてＥＰＡ（１８．１ｍｇ／ｇ、１８．８％）であった。
Ｈ．アカシオを摂食した後一日絶食した状態でのＰ．シファエンスの全脂肪酸量は４５．３ｍｇ／ｇで、これは細胞乾重量の４．５％を占める。この時のＰ．シファエンスが含有している最も多い組成の脂肪酸は順にＤＨＡ（１９．４ｍｇ／ｇ、４２．９％）、パルミチン酸（１４．９ｍｇ／ｇ、３３．０％）、そしてＥＰＡ（３．１ｍｇ／ｇ、６．９％）であった。
テレオラクス種を摂食した後一日絶食した状態でのＰ．シファエンスの全脂肪酸量は５３．４ｍｇ／ｇで、これは細胞乾重量の５．３％を占める。この時のＰ．シファエンスが含有している最も多い組成の脂肪酸は順にパルミチン酸（２１．２ｍｇ／ｇ、３９．７％）、ＤＨＡ（１６．３ｍｇ／ｇ、３０．５％）、そしてＡＬＡ（５．３ｍｇ／ｇ、９．８％）であった。
オメガ−３生合成経路でＥＰＡはＡＬＡから合成でき、オメガ−６生合成経路でＥＰＡはＬＡから合成できる。Ａ．カルテレのＡＬＡ及びＬＡ脂肪酸含有量は各（０．０４ｍｇ／ｇ、０．１％）、（０．４ｍｇ／ｇ、０．７％）と低かった。これと似ているように、Ａ．カルテレを摂食したＰ．シファエンスのＡＬＡ及びＬＡ脂肪酸含有量も（０．４ｍｇ／ｇ、０．５％）、（１．７ｍｇ／ｇ、１．７％）と低かった。
Ｈ．アカシオのＡＬＡ及びＬＡ脂肪酸含有量は各（４．５ｍｇ／ｇ、４．９％）、（０．７ｍｇ／ｇ、０．８％）と低かった。しかし、ＡＬＡからＥＰＡが合成される別のオメガ−３生合成代替経路の中間物質に該当するエイコサトリエン酸(eicosatrienoic acid)（ＥＴｒＡ）の場合は発見されなかった。Ｈ．アカシオを摂食したＰ．シファエンスのＡＬＡ及びＬＡ脂肪酸含有量も（１．１ｍｇ／ｇ、２．５％）、（０．３ｍｇ／ｇ、０．７％）と低かった。
テレオラクス種のＡＬＡ及びＬＡ脂肪酸含有量は各（１３．０ｍｇ／ｇ、３１．５％）、（０．８ｍｇ／ｇ、２．０％）と低かった。しかし、ＡＬＡからＥＰＡが合成される別のオメガ−３生合成代替経路の中間物質に該当するエイコサトリエン酸（ＥＴｒＡ）の場合は発見されなかった。Ｔｅｌｅａｕｌａｘｓｐ．を摂食したＰ．シファエンスのＡＬＡ及びＬＡ脂肪酸含有量も（５．３ｍｇ／ｇ、９．８％）、（１．６ｍｇ／ｇ、３．１％）と低かった。
すなわち、本研究でＰ．シファエンスの絶対的ＥＰＡ及びＤＨＡ含有量が、特にＡ．カルテレを摂食した場合、Ａ．カルテレの絶対的ＥＰＡ及びＤＨＡ含有量に比べて４３％も増加したことを確認した。さらに、テレオラクス種を摂食することで、テレオラクス種の絶対的ＥＰＡ及びＤＨＡ含有量に比べてもＰ．シファエンスのそれは約１６％程度増加したことを確認した。しかし、Ｈ．アカシオを摂食した時は、Ｈ．アカシオのそれと比較した時Ｐ．シファエンスの場合、２０％程度減少したことを確認した。このような証拠は、Ｐ．シファエンスのＥＰＡ及びＤＨＡ含有量は摂食した餌の種類に影響を受け得ることを意味する。また、Ｐ．シファエンスを介したＥＰＡ及びＤＨＡ生産のために、テレオラクス種及び／またはＡ．カルテレ、特にＡ．カルテレが最適な餌として使用され得ることを意味する。Ｐ．シファエンスが、Ａ．カルテレを摂食した時の最大成長率はテレオラクス種とＨ．アカシオを摂食した時より明らかに高い。これは、餌種Ａ．カルテレがＰ．シファエンスのＥＰＡ及びＤＨＡ生成のための物質及び成長に関与する最適な物質を供給することが言える。Ａ．カルテレを摂食した時のＰ．シファエンスのＥＰＡ及びＤＨＡ量は、ＤＨＡ生産商業的利用が進行している渦鞭毛藻類であるCrypthecodinium cohniiのＥＰＡ及びＤＨＡ量（３１〜７８ｍｇ／ｇ）、そして他の従属栄養性渦鞭毛藻類であるoxyrrhis marina（４７〜８９ｍｇ／ｇ）のＥＰＡ及びＤＨＡ量にも匹敵するほどである。しかし、渦鞭毛藻類Gyrodinium dominans（１９〜２７ｍｇ／ｇ）に比べてははるかに多い方である。さらに、Ｐ．シファエンスのＥＰＡ及びＤＨＡ量を渦鞭毛藻類の他に別の微細藻類と比較すると、ＤＨＡ商業化が完了した従属栄養性thraustochytridsであるTraustochytrium spp.（２７．４〜７９．７ｍｇ／ｇ）と匹敵するほどで、Schizochytrium spp.（４５．０〜２０１．５ｍｇ／ｇ）よりは低い方であった。
上述した表１と共に高い含有量のＤＨＡを有する種株のｔｏｐ−４はいずれも従属栄養性種株である。Ｐ．シファエンスが５番目で、この種株も混合栄養性ではあるが、成長に餌が必須的に必要なことによって従属栄養性に近い種株であるといえる。
また、Ｐ．シファエンスのＥＰＡ及びＤＨＡ含有量は、ＥＰＡ商業的生産に使用されている種株Nannochloropsis spp.（２．６〜６２．５ｍｇ／ｇ）及びPhaeodactylumspp.（１０．２〜６２．３ｍｇ／ｇ）にも匹敵するほどであった。Ｐ．シファエンスの全脂肪酸（ＴＦＡ）含有量対比ＥＰＡ及びＤＨＡ脂肪酸組成の割合（５５％）はdinoflagellate（渦鞭毛藻類）のA.carterae、C.cohnii、そしてthraustochytridsのAurantiochytrium spp.を除くと最も高かった。したがって、Ｐ．シファエンスは、ＥＰＡ及びＤＨＡ生産商業化のための潜在的強い候補群であると評価できる。
まとめると、A.carteraeを摂食したＰ．シファエンスの場合、全脂肪酸組成（ＴＦＡ）中ＥＰＡの含有量が１８．８％と最も高く、H.akashiwoを摂食したP.shiwhaenseの場合、６．９％、そしてTeleaulax sp.を摂食したＰ．シファエンスの場合は２．９％と低かった。しかし、A.carterae、H.akashiwo、そしてteleaulax sp.の３種の餌自体はいずれも２５．０〜３２．９％と高い含有量のＥＰＡを有している。すなわち、餌種のＥＰＡ含有量は、Ｐ．シファエンスに摂食されると減る傾向を示すが、具体的にTeleaulax sp.は２５．０％から２．９％に、H.akashiwoは２７．１％から６．９％に、A.carteraeは３２．９％から１８．８％に減った。対照的に、ＤＨＡの含有量は餌種でＰ．シファエンスを比較した時いずれも増加した。具体的に、Ｈ．ａｋａｓｈｉｗｏ餌種のＤＨＡ割合は３．４％からこれを摂食したＰ．シファエンスは４２．９％に、Teleaulax sp.餌種のＤＨＡ割合は１２．４％からこれを摂食したＰ．シファエンスは３０．５％に、A.carterae餌種のＤＨＡ割合は３２．０％からこれを摂食したＰ．シファエンスは３５．７％に増加した。このような資料は餌種のＥＰＡがＰ．シファエンス体内で吸収されてＤＨＡに転換されたことを示している。しかし、ＤＨＡへの転換度は餌種毎に異なることもあることを示している。
（実施例５．微細藻類内にオメガ−３脂肪酸合成に関連した遺伝子同定）
Ｐ．シファエンスの発現シーケンスは、４５４ ＧＳ−ＦＬＸ titanium pyrosequencingプラットホームを使用して進行された。シーケンシングに関する詳しい内容及び関連データは、ＮＣＢＩデータベースに、Bio Project accession number：ＰＲＪＮＡ３５７５１１、登録された。他の微細藻類の類似の遺伝子からＰ．シファエンスの脂肪酸不飽和酵素及び伸長酵素アミノ酸シーケンスを同定するために、Ｐ．シファエンスの転写体データをｔＢＬＡＳＴｎ方法でマッチングさせた。この時、ＣＬＣ genomic workbench(version ９．０）プログラムを使用して過程が進行された。ＢＬＡＳＴ方法で獲得したＰ．シファエンスの関連遺伝子は、ＣＬＣ genomic workbenchプログラムのＢＬＯＳＵＭ−６２substitution matrix及びデフォルト条件下、ＮＣＢＩデータベースにＢＬＡＳＴｘして再確認した。
下記の表６はＰ．シファエンスから発掘されたＥＰＡ及びＤＨＡ生合成に関与するオメガ−３脂肪酸不飽和酵素(desaturase)及び伸長酵素(elongase)遺伝子情報を示したものである。
ＮＣＢＩ non-redundant(nr)データベースでシーケンス類似性を基づいて、Ｐ．シファエンスから６個の脂肪酸不飽和酵素及び５個の脂肪酸伸長酵素遺伝子を見つけた。６個の不飽和酵素遺伝子のうち、３個のコンティグは他の生物の周知の不飽和酵素遺伝子とシーケンス類似性が略同じであった。残りの３個の不飽和酵素遺伝子もデルタ−５及びデルタ−６不飽和酵素遺伝子と非常に類似のシーケンスを有していた。５個の伸長酵素遺伝子のうち、２個のコンティグは周知の他の伸長酵素遺伝子と略同じであった。しかし、Ｐ．シファエンスからオメガ−３生合成代替経路に関与する不飽和酵素及び伸長酵素遺伝子は見つからなかった。
（実施例６．遺伝子の系統樹分析を介して、微細藻類内にオメガ−３脂肪酸合成に関連してデルタ−５及びデルタ−６−不飽和酵素及びデルタ−６伸長酵素関与解明）
Ｐ．シファエンスの不飽和酵素及び伸長酵素遺伝子の存在をより確実に確認するために、ＮＣＢＩで提供されたＯＲＦ finderを使用してopen reading frames（ＯＲＦｓ）を予測して、ＭＥＧＡ（ｖｅｒ．７．０）プログラムを使用して類似種とのアミノ酸シーケンスアラインメントを進めた。アラインメントが完了された遺伝子は、ＷＡＧ＋Ｇツリーモデル下、maximum-likelihood（ＭＬ）及びBayesian analysis分析を介して系統樹作成を進めた。ＭＬ分析のためには、ＲａｘＭＬ７．０．３．プログラムを使用して、Bayesian分析のためには、MrBayes（ｖｅｒ．３．１）プログラムを使用した。
シーケンス類似性に基づいて発掘したＰ．シファエンスの不飽和酵素及び伸長酵素遺伝子のさらに高い水準の確認のために、系統樹分析を進めた。不飽和酵素遺伝子を基づいて作成した系統樹で、Ｐ．シファエンスのデルタ−４不飽和酵素遺伝子の場合他の原生生物のデルタ−４不飽和酵素と束ねられて、Ｐ．シファエンスのデルタ−５不飽和酵素遺伝子の場合にも他のそれらのデルタ−５不飽和酵素と束ねられることを確認することで、Ｐ．シファエンスの遺伝子の正確性を再度確認した。
伸長酵素遺伝子基盤系統樹で、Ｐ．シファエンスから発掘された２個のデルタ−５伸長酵素遺伝子の場合、８種の原生生物のデルタ−５伸長酵素遺伝子とグループを成した。この２個のデルタ−５伸長酵素遺伝子の場合互いに共に束ねられたが、これは多分互いが各々isoformの同じ遺伝子であり得ることを示唆する。しかし、系統樹作成でＰ．シファエンスから発掘された遺伝子のうち、オメガ−３生合成代替経路の中間物質に属するデルタ−９伸長酵素とグループを成す遺伝子は存在しなかった。
本願の表に記載されたReference情報は次のとおりである。
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[72] N.V.Zhukova etal., Fatty acid composition of 15 species of marine microalgae, Phytochemistry39 (2) (1995) 351-356.
以上で本願の例示的な実施例に対し詳細に説明したが、本願の権利範囲はこれに限定されず次の請求範囲で定義している本願の基本概念を利用した当業者の種々の変形及び改良形態も本願の権利範囲に属する。
本発明で使用されるいずれの技術用語は、特に定義されない限り、本発明の関連分野で通常の当業者が一般的に理解しているような意味で使用される。本明細書に参考文献と記載されるいずれの刊行物の内容は本発明に取り込まれる。
Claims (6)
- 餌種としてアンフィディニウム・カルテレ(Amphidinium carterae)を含む、混合栄養性渦鞭毛藻類微細藻類であるパラギムノディニウム・シファエンス(Paragymnodinium shiwhaense) 内でオメガ−３不飽和脂肪酸を生産するための組成物。
- 前記オメガ−３不飽和脂肪酸は、ドコサヘキサエン酸（Docosahexaenoicacid：ＤＨＡ）、エイコサペンタエン酸（Eicosapentaenoicacid：ＥＰＡ）、ドコサペンタエン酸（Docosapentaenoic acid：ＤＰＡ）及びα−リノレン酸（ＡＬＡ）で構成された群から選択された１種以上の多価不飽和脂肪酸である、請求項１に記載の組成物。
- 前記オメガ−３不飽和脂肪酸は、ＤＨＡまたはＥＰＡである、請求項２に記載の組成物。
- 前記餌種である前記アンフィディニウム・カルテレ対前記パラギムノディニウム・シファエンスの個体数基準濃度比は５〜２０：１である、請求項１に記載の組成物。
- 前記アンフィディニウム・カルテレ対前記パラギムノディニウム・シファエンスの個体数基準濃度比は８：１である、請求項４に記載の組成物。
- 請求項１乃至請求項５のうちいずれか一つに記載の組成物を含む培養培地で微細藻類としてパラギムノディニウム・シファエンスを培養する段階と、
前記培養培地から前記微細藻類を回収する段階と、
前記微細藻類からオメガ−３不飽和脂肪酸を抽出する段階とを含む微細藻類内でオメガ−３不飽和脂肪酸を生産する方法。
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| 極域科学・宙空圏・気水圏・生物・地学シンポジウム講演要旨集, 2011, VOL.2011, ROMBUNNO.16-T-22, JPN6018010290 * |
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