CN112553283B - 利用复合微藻发酵山桐子废液制备山桐子棕榈烯酸的方法 - Google Patents

利用复合微藻发酵山桐子废液制备山桐子棕榈烯酸的方法 Download PDF

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Abstract

本发明提供了一种利用复合微藻发酵山桐子废液制备山桐子棕榈烯酸的方法，解决了现有技术中棕榈烯酸来源受到限制，难以满足市场的需求的技术问题。它包括下述步骤：（1）以山桐子废液制备发酵用培养液；（2）复合微藻发酵；（3）破壁萃取；（4）油脂分离纯化，得到山桐子棕榈烯酸和山桐子二十二碳六烯酸。本发明利用高产油的绿球微藻为出发菌，以山桐子废液制备利于绿球微藻菌生长的培养液，通过自养、异样结合发酵，将培养后的菌体干燥提取后进行分离纯化得到高纯度的山桐子棕榈烯酸和山桐子二十二碳六烯酸，弥补了棕榈烯酸产量的不足，扩大了棕榈烯酸的来源，能更好的满足市场的需求。

Description

利用复合微藻发酵山桐子废液制备山桐子棕榈烯酸的方法
技术领域
本发明涉及一种利用复合微藻发酵山桐子废液制备山桐子棕榈烯酸的方法。
背景技术
近年来，由于棕榈烯酸（palmitoleic acid）在一些慢性疾病如代谢综合症、糖尿病和炎症中具有治疗作用，已经引起人们广泛关注。棕榈烯酸是一种16碳的单不饱和脂肪酸(monounsaturated fatty acid, MUFA,双键位于碳端的第7个碳原子上(16:1n-7)(21它的密度为0.905(g/mL，25/4℃)，熔点为0.5～1℃。棕榈烯酸难溶于水，易溶于碱溶液和乙醚、氯仿、正己烷、乙酸乙酯等有机溶液，在常温下为无色透明液体。
目前，棕榈烯酸主要来源于深海鱼等。但由于国际上禁捕鲸鱼和渔业资源匮乏，棕榈烯酸来源受到限制，难以满足市场的需求，因此对其原料的开发和功能特性进行研究将会产生良好的经济价值和社会效益。
棕榈烯酸的分子式为CH3（CH2）5CH=CH（CH2）7COOH，棕榈烯酸在大多数动植物种均有分布，但含量较高的物种稀少。山桐子棕榈烯酸在一般油料作物中含量较少，但在一些特殊植物中也有很高的含量，因此寻找植物性来源并加以提取可以较好的弥补棕榈烯酸产量的不足。
发明内容
本发明的目的在于提供一种利用复合微藻发酵山桐子废液制备山桐子棕榈烯酸的方法，以解决现有技术中的棕榈烯酸来源受到限制，难以满足市场的需求的技术问题。本发明提供的诸多技术方案中的优选技术方案所能产生的诸多技术效果详见下文阐述。
为实现上述目的，本发明提供了以下技术方案：
本发明提供的一种利用复合微藻发酵山桐子废液制备山桐子棕榈烯酸的方法，包括下述步骤：
（1）以山桐子废液制备发酵用培养液
向山桐子废液中加入KH2PO4 、MgSO4‧7H2O、CaCO3、Na2SO4 、FeSO4‧7H2O 、吲哚丁酸（IBA）、葡萄糖、麦芽糖、牛肉浸膏和氨基酸，得到发酵用培养液；
（2）复合微藻发酵
以裂殖壶菌和绿球微藻菌在步骤（1）得到的培养液中协同自养异样结合发酵，得到发酵后的菌体；
（3）破壁萃取
将步骤（2）得到的发酵后的菌体依次经过离心脱水、浓缩、干燥、破壁和有机溶剂萃取方式提取，得到山桐子油脂肪酸乙酯；
（4）油脂分离纯化
将得到的山桐子油脂肪酸乙酯通过尿素包埋、分子蒸馏分离纯化得到山桐子棕榈烯酸和山桐子二十二碳六烯酸。
进一步的，所述步骤（1）中，所述山桐子废液的制备是以山桐子鲜果为原料，经液压压榨后得到液态料和固体料，将得到的液态料经一次离心除杂、酶解脱胶、二次离心脱水得到山桐子初榨油和山桐子废液。
进一步的，所述液压压榨是在压力为45～55Mpa压榨1.5～2h；
所述一次离心除杂是在转速为2600～3000r/mim离心时间12～18min；
所述酶解脱胶采用的酶解剂为浓度为7800～8200U/ml的磷脂酶A1，使用量为90～110U/L或者450～550ml/1000L，处理时间为1.8～2.2h,处理温度为50～60℃，剪切压力为15～25Mpa；
所述二次离心脱水是在转速为4300～4700r/mim离心12～18min。
进一步的，所述步骤（1）中，所述氨基酸包括甘氨酸、谷氨酸、色氨酸和赖氨酸；得到的培养液中，所述KH2PO4 、MgSO4‧7H2O、CaCO3、Na2SO4 、FeSO4‧7H2O 、吲哚丁酸（IBA）、葡萄糖、麦芽糖、牛肉浸膏和氨基酸的浓度分别为：KH2PO4 2.0～5.0 g/L，MgSO4‧7H2O 0.4～0.6g/L, CaCO3 4.0～6.0 g/L，Na2SO4 2.5～3.5g/L，FeSO4‧7H2O 18～22mg/L，吲哚丁酸（IBA）0.4～0.6g/L,葡萄糖48～52g/L麦芽糖9～11g/L，牛肉浸膏4～6g/L；为甘氨酸0.8～1.2g/L,谷氨酸1.2～1.8g/L，色氨酸0.8～1.2g/L，赖氨酸0.2～0.4g/L。
进一步的，得到的培养液中，所述KH2PO4 、MgSO4‧7H2O、CaCO3、Na2SO4 、FeSO4‧7H2O 、吲哚丁酸（IBA）、葡萄糖、麦芽糖、牛肉浸膏和氨基酸的浓度分别为：KH2PO4 4.0 g/L，MgSO4‧7H2O 0.5 g/L, CaCO3 5.0 g/L，Na2SO4 3.0g/L，FeSO4‧7H2O 20mg/L，吲哚丁酸（IBA）0.5g/L,葡萄糖50g/L麦芽糖10g/L，牛肉浸膏5g/L；为甘氨酸1g/L,谷氨酸1.5g/L，色氨酸１g/L，赖氨酸0.3g/L。
进一步的，所述步骤（2）中，采用前期自养发酵、后期异养发酵的混养发酵方式培养绿球微藻菌。
进一步的，所述自养发酵为：培养液温度为24～26℃；pH值为6.1～6.5；搅拌速率18～22r/min；接种量：裂殖壶菌5.3%～5.7%，绿球微藻菌3.8%～4.2%；自养发酵时长为69～75h ，蓝光光照23～25h，避光23～25h，红光光照23～25h；
所述异养发酵为：培养液温度为24～26℃；pH值为6.1～6.5；搅拌速率18～22r/min；接种量：裂殖壶菌5.3%～5.7%，绿球微藻菌3.8%～4.2%；采取补料分批发酵方式使培养液内的葡萄糖浓度<24g/L，异养发酵时长为69～75h。
进一步的，所述步骤（3）中，所述离心脱水是在转速为1700～1900r/min离心4～6min；
所述浓缩采用真空压缩，是在压力为0.05～0.15Pa、温度为52～58℃浓缩18～22min；
所述干燥采用热风干燥，采用三段干燥方式，一段为65～75℃干燥28～32min，二段为75～85℃干燥28～32min，三段为60～70℃干燥28～32min；
所述破壁采用超微破壁，超微破壁时间为0.8～1.2h，粒度达到5µm；
所述有机溶剂萃取采用正己烷在温度为45-50℃萃取13-18min。
进一步的，所述步骤（4）中，所述尿素包埋法包括下述步骤：
①在反应釜中，加入尿素和95%乙醇，保持温度为70～80℃回流搅拌直至尿素全部溶解；
②将山桐子油脂肪酸乙酯加入反应釜中，在温度为70～80℃继续回流搅拌，回流0.8～1.2h使脂肪酸和尿素充分混匀后停止反应，将混合液在室温下冷却40-50min；
③将步骤②冷却后的混合液转移至温度为78-82℃继续结晶，结晶结束后压力过滤，收集滤液和固相物；加入乙醇洗涤结晶物继续抽滤，继续收集滤液和固相物；
④将步骤③收集的滤液混合并用旋转蒸发仪除去乙醇，倒入分液漏斗分液，用等体积热水水洗至少3次，静置分层除去残留的尿素，从分液漏斗上端倒出含有山桐子棕榈烯酸的山桐子油脂肪酸乙酯，称重后0-4℃避光保存；
⑤步骤③收集的固相物加入热水破坏尿素结晶，经分液漏斗分液得到固相物中的脂肪酸乙酯。
进一步的，所述步骤（4）①中，尿素和95%乙醇的质量比为1:4.5-5.5，所述尿素的加入量为山桐子油脂肪酸乙酯质量的18-22%。
进一步的，所述步骤（4）①中，尿素和95%乙醇的质量比为1:5，所述尿素的加入量为山桐子油脂肪酸乙酯质量的20%。
进一步的，所述步骤（4）中，进行分子蒸馏时，将步骤（4）④中得到的含山桐子棕榈烯酸的山桐子油脂肪酸乙酯进行分子蒸馏，蒸馏温度为115～125℃、转速150～170 r/min，进料速率为1.4～1.6mL/min，蒸馏后得到山桐子棕榈烯酸；将步骤（4）⑤中得到的脂肪酸乙酯进行分子蒸馏，蒸馏温度为115～125℃、转速150～170 r/min，进料速率为1.4～1.6mL/min，蒸馏后得到山桐子二十二碳六烯酸。
基于上述技术方案，本发明实施例至少可以产生如下技术效果：
（1）本发明提供的利用复合微藻发酵山桐子废液制备山桐子棕榈烯酸的方法，利用高产油的绿球微藻为出发菌，以山桐子废液制备利于绿球微藻菌生长的培养液，通过自养、异样结合发酵，将培养后的菌体干燥提取后进行分离纯化得到高纯度的山桐子棕榈烯酸和山桐子二十二碳六烯酸，本发明中绿球微藻菌主要负责产棕榈烯酸，裂殖壶菌产山桐子二十二碳六烯酸，相互之间有协同作用，避免了高产物浓度抑制发酵作用，起到了1+1≥2的效果，并且棕榈烯酸与二十二碳六烯酸分子量差异大，容易分离；制备出的山桐子棕榈烯酸纯度能达到99.8%，山桐子二十二碳六烯酸的纯度能达到99.3%，弥补了棕榈烯酸产量的不足，扩大了棕榈烯酸的来源，能更好的满足市场的需求。
（2）本发明提供的利用复合微藻发酵山桐子废液制备山桐子棕榈烯酸的方法，在制备山桐子棕榈烯酸的过程中，收获藻体、细胞干燥、裂解和抽提油脂的花费占山桐子棕榈烯酸生产总成本的40%～60%，与现有脂肪酸分离技术相比，本发明通过技术集成化繁为简；用有机溶剂与培养液共混，使细胞内油脂连续被抽提至有机相，而藻细胞仍能保持良好的生长趋势，经蒸馏分离有机溶剂和油脂，有机溶剂还可重复利用以降低成本。
具体实施方式
为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本发明的技术方案进行详细的描述。显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动的前提下所得到的所有其它实施方式，都属于本发明所保护的范围。
菌种说明：
裂殖壶菌(Schizochytrium limacinum OUC88，滨州港正海生态科技有限公司) ；
绿球微藻菌（微拟球藻，GY-H14 Nannochloropsis sp，上海光语生物科技有限公司）。
实施例1：
一种利用复合微藻发酵山桐子废液制备山桐子棕榈烯酸的方法，包括下述步骤：
（1）以山桐子废液制备发酵用培养液
A1、山桐子废液的制备：
是以山桐子鲜果为原料，经液压压榨后得到液态料和固体料，将得到的液态料经一次离心除杂、酶解脱胶、二次离心脱水得到山桐子初榨油和山桐子废液。
所述液压压榨是在压力为50Mpa压榨1.5～2h；
所述一次离心除杂是在转速为2800r/mim离心时间15min；
所述酶解脱胶采用的酶解剂为浓度为8000U/ml的磷脂酶A1，使用量为500ml/1000L，处理时间为2h,处理温度为55℃，剪切压力为20Mpa；
所述二次离心脱水是在转速为4500r/mim离心15min；
A2、向山桐子废液中加入KH2PO4 、MgSO4‧7H2O、CaCO3、Na2SO4 、FeSO4‧7H2O 、吲哚丁酸（IBA）、葡萄糖、麦芽糖、牛肉浸膏和氨基酸，得到发酵用培养液；
所述氨基酸包括甘氨酸、谷氨酸、色氨酸和赖氨酸；得到的培养液中，所述KH2PO4 、MgSO4‧7H2O、CaCO3、Na2SO4 、FeSO4‧7H2O 、吲哚丁酸（IBA）、葡萄糖、麦芽糖、牛肉浸膏和氨基酸的浓度分别为：KH2PO4 4.0 g/L，MgSO4‧7H2O 0.5 g/L, CaCO3 5.0 g/L，Na2SO4 3.0g/L，FeSO4‧7H2O 20mg/L，吲哚丁酸（IBA）0.5g/L,葡萄糖50g/L麦芽糖10g/L，牛肉浸膏5g/L，甘氨酸1g/L，谷氨酸1.5g/L，色氨酸１g/L，赖氨酸0.3g/L；
（2）复合微藻发酵
以裂殖壶菌和绿球微藻菌在步骤（1）得到的培养液中协同自养异样结合发酵，采用前期自养发酵、后期异养发酵的混养发酵方式培养绿球微藻菌，得到发酵后的菌体；具体的：
B1、自养发酵：培养液温度为25℃；pH值为6.3；搅拌速率20r/min；接种量：裂殖壶菌5.5%，绿球微藻菌4%；自养发酵时长为72h ，蓝光光照24h，避光24h，红光光照24h；
B2、异养发酵：培养液温度为25℃；pH值为6.3；搅拌速率20r/min；接种量：裂殖壶菌5.5%，绿球微藻菌4%；采取补料分批发酵方式使培养液内的葡萄糖浓度<24g/L，异养发酵时长为72h，得到发酵后的菌体；
将步骤（2）得到的发酵后的菌体进行检测，检测发酵产物脂肪酸组成和发酵产物生物产量：
①发酵产物脂肪酸组成：
发酵产物脂肪酸组成如下：棕榈烯酸45.6%，二十二碳六烯酸28.4%，花生四烯酸15%，棕榈酸8%，其他3%；
②发酵产物生物产量
菌体生物量可达198.06 g/L，油脂含量为细胞干重的52%；
（3）破壁萃取
将步骤（2）得到的发酵后的菌体依次经过离心脱水、浓缩、干燥、破壁和有机溶剂萃取方式提取，得到山桐子油脂肪酸乙酯；具体的：
C1、离心脱水是在转速为1800r/min离心4～6min；
C2、浓缩采用真空压缩，是在压力为0.12Pa、温度为55℃浓缩20min；
C3、干燥采用热风干燥，采用三段干燥方式，一段为70℃干燥30min，二段为80℃干燥30min，三段为65℃干燥30min；
C4、破壁采用超微破壁，超微破壁时间为1h，粒度达到5µm；
C5、有机溶剂萃取采用正己烷在温度为48℃萃取15min；
（4）油脂分离纯化
将得到的山桐子油脂肪酸乙酯经过尿素包埋、分子蒸馏分离纯化得到山桐子棕榈烯酸和山桐子二十二碳六烯酸；具体的：
D1、尿素包埋，包括下述步骤：
①在反应釜中，加入尿素和95%乙醇，尿素和95%乙醇的质量比为1:5，所述尿素的加入量为山桐子油脂肪酸乙酯质量的20%；保持温度为75℃回流搅拌直至尿素全部溶解；
②将山桐子油脂肪酸乙酯加入反应釜中，在温度为75℃继续回流搅拌，回流1h使脂肪酸和尿素充分混匀后停止反应，将混合液在室温下冷却45min；
③将步骤②冷却后的混合液转移至温度为80℃继续结晶，结晶结束后压力过滤，收集滤液和固相物；加入乙醇洗涤结晶物继续抽滤，继续收集滤液和固相物；
④将步骤③收集的滤液混合并用旋转蒸发仪除去乙醇，倒入分液漏斗分液，用等体积热水(热水温度为50℃)水洗3次，静置分层除去残留的尿素，从分液漏斗上端倒出含有山桐子棕榈烯酸的山桐子油脂肪酸乙酯，称重后0-4℃避光保存；
⑤步骤③收集的固相物加入热水(热水温度为50℃)破坏尿素结晶，经分液漏斗分液得到固相物中的脂肪酸乙酯；
D2、进行分子蒸馏时，将步骤（4）④中得到的含山桐子棕榈烯酸的山桐子油脂肪酸乙酯进行分子蒸馏，蒸馏温度为120℃、转速160 r/min，进料速率为1.5mL/min，蒸馏后得到山桐子棕榈烯酸，纯度为99.8%；
将步骤（4）⑤中得到的脂肪酸乙酯进行分子蒸馏，蒸馏温度为120℃、转速160 r/min，进料速率为1.5mL/min，蒸馏后得到山桐子二十二碳六烯酸，纯度为99.3%。
本实施例中，1000L的山桐子废液产棕榈烯酸1.68kg和二十二碳六烯酸1.45kg。
实施例2：
一种利用复合微藻发酵山桐子废液制备山桐子棕榈烯酸的方法，包括下述步骤：
（1）以山桐子废液制备发酵用培养液
A1、山桐子废液的制备：
是以山桐子鲜果为原料，经液压压榨后得到液态料和固体料，将得到的液态料经一次离心除杂、酶解脱胶、二次离心脱水得到山桐子初榨油和山桐子废液。
所述液压压榨是在压力为55Mpa压榨1.5h；
所述一次离心除杂是在转速为3000r/mim离心时间12min；
所述酶解脱胶采用的酶解剂为浓度为8200U/ml的磷脂酶A1，使用量为110U/L，处理时间为1.8h,处理温度为60℃，剪切压力为15Mpa；
所述二次离心脱水是在转速为4700r/mim离心12min；
A2、向山桐子废液中加入KH2PO4 、MgSO4‧7H2O、CaCO3、Na2SO4 、FeSO4‧7H2O 、吲哚丁酸（IBA）、葡萄糖、麦芽糖、牛肉浸膏和氨基酸，得到发酵用培养液；
所述氨基酸包括甘氨酸、谷氨酸、色氨酸和赖氨酸；得到的培养液中，所述KH2PO4 、MgSO4‧7H2O、CaCO3、Na2SO4 、FeSO4‧7H2O 、吲哚丁酸（IBA）、葡萄糖、麦芽糖、牛肉浸膏和氨基酸的浓度分别为：KH2PO4 5.0 g/L，MgSO4‧7H2O 0.4g/L, CaCO3 6.0 g/L，Na2SO4 3.5g/L，FeSO4‧7H2O 22mg/L，吲哚丁酸（IBA）0.4g/L,葡萄糖52g/L麦芽糖9g/L，牛肉浸膏6g/L；为甘氨酸0.8g/L,谷氨酸1.8g/L，色氨酸0.8g/L，赖氨酸0.4g/L；
（2）复合微藻发酵
以裂殖壶菌和绿球微藻菌在步骤（1）得到的培养液中协同自养异样结合发酵，采用前期自养发酵、后期异养发酵的混养发酵方式培养绿球微藻菌，得到发酵后的菌体；具体的：
B1、自养发酵：培养液温度为26℃；pH值为6.1；搅拌速率22r/min；接种量：裂殖壶菌5.3%，绿球微藻菌4.2%；自养发酵时长为75h ，蓝光光照25h，避光25h，红光光照25h；
B2、异养发酵：培养液温度为26℃；pH值为6.1；搅拌速率22r/min；接种量：裂殖壶菌5.3%，绿球微藻菌4.2%；采取补料分批发酵方式使培养液内的葡萄糖浓度<24g/L，异养发酵时长为69h，得到发酵后的菌体；
将步骤（2）得到的发酵后的菌体进行检测，检测发酵产物脂肪酸组成和发酵产物生物产量：
①发酵产物脂肪酸组成：
发酵产物脂肪酸组成如下：棕榈烯酸44.2%，二十二碳六烯酸28.1%，花生四烯酸15.1%，棕榈酸8.2%，其他4.4%；
②发酵产物生物产量
菌体生物量可达197.89g/L，油脂含量为细胞干重的52%；
（3）破壁萃取
将步骤（2）得到的发酵后的菌体依次经过离心脱水、浓缩、干燥、破壁和有机溶剂萃取方式提取，得到山桐子油脂肪酸乙酯；具体的：
C1、离心脱水是在转速为1900r/min离心4min；
C2、浓缩采用真空压缩，是在压力为0.15Pa、温度为52℃浓缩22min；
C3、干燥采用热风干燥，采用三段干燥方式，一段为75℃干燥28min，二段为85℃干燥28min，三段为70℃干燥28min；
C4、破壁采用超微破壁，超微破壁时间为1.2h，粒度达到5µm；
C5、有机溶剂萃取采用正己烷在温度为50℃萃取13min。
（4）油脂分离纯化
将得到的山桐子油脂肪酸乙酯经过尿素包埋、分子蒸馏分离纯化得到山桐子棕榈烯酸和山桐子二十二碳六烯酸；具体的：
D1、尿素包埋，包括下述步骤：
①在反应釜中，加入尿素和95%乙醇，尿素和95%乙醇的质量比为1:5，所述尿素的加入量为山桐子油脂肪酸乙酯质量的20%；保持温度为80℃回流搅拌直至尿素全部溶解；
②将山桐子油脂肪酸乙酯加入反应釜中，在温度为80℃继续回流搅拌，回流0.8h使脂肪酸和尿素充分混匀后停止反应，将混合液在室温下冷却50min；
③将步骤②冷却后的混合液转移至温度为82℃继续结晶，结晶结束后压力过滤，收集滤液和固相物；加入乙醇洗涤结晶物继续抽滤，继续收集滤液和固相物；
④将步骤③收集的滤液混合并用旋转蒸发仪除去乙醇，倒入分液漏斗分液，用等体积热水(热水温度为55℃)水洗3次，静置分层除去残留的尿素，从分液漏斗上端倒出含有山桐子棕榈烯酸的山桐子油脂肪酸乙酯，称重后0-4℃避光保存；
⑤步骤③收集的固相物加入热水(热水温度为55℃)破坏尿素结晶，经分液漏斗分液得到固相物中的脂肪酸乙酯；
D2、进行分子蒸馏时，将步骤（4）④中得到的含山桐子棕榈烯酸的山桐子油脂肪酸乙酯进行分子蒸馏，蒸馏温度为125℃、转速150 r/min，进料速率为1.6mL/min，蒸馏后得到山桐子棕榈烯酸，纯度为99.2%；
将步骤（4）⑤中得到的脂肪酸乙酯进行分子蒸馏，蒸馏温度为125℃、转速150 r/min，进料速率为1.6mL/min，蒸馏后得到山桐子二十二碳六烯酸，纯度为99.1%。
本实施例中，1000L的山桐子废液产棕榈烯酸1.61kg和二十二碳六烯酸1.42kg。
实施例3：
一种利用复合微藻发酵山桐子废液制备山桐子棕榈烯酸的方法，包括下述步骤：
（1）以山桐子废液制备发酵用培养液
A1、山桐子废液的制备：
是以山桐子鲜果为原料，经液压压榨后得到液态料和固体料，将得到的液态料经一次离心除杂、酶解脱胶、二次离心脱水得到山桐子初榨油和山桐子废液。
所述液压压榨是在压力为45Mpa压榨2h；
所述一次离心除杂是在转速为2600r/mim离心时间18min；
所述酶解脱胶采用的酶解剂为浓度为7800U/ml的磷脂酶A1，使用量为90U/L，处理时间为2.2h,处理温度为50℃，剪切压力为25Mpa；
所述二次离心脱水是在转速为4300r/mim离心18min；
A2、向山桐子废液中加入KH2PO4 、MgSO4‧7H2O、CaCO3、Na2SO4 、FeSO4‧7H2O 、吲哚丁酸（IBA）、葡萄糖、麦芽糖、牛肉浸膏和氨基酸，得到发酵用培养液；
所述氨基酸包括甘氨酸、谷氨酸、色氨酸和赖氨酸；得到的培养液中，所述KH2PO4 、MgSO4‧7H2O、CaCO3、Na2SO4 、FeSO4‧7H2O 、吲哚丁酸（IBA）、葡萄糖、麦芽糖、牛肉浸膏和氨基酸的浓度分别为：KH2PO4 2.0g/L，MgSO4‧7H2O 0.6 g/L, CaCO3 4.0g/L，Na2SO4 2.5g/L，FeSO4‧7H2O 18mg/L，吲哚丁酸（IBA）0.6g/L,葡萄糖48g/L麦芽糖11g/L，牛肉浸膏4g/L；为甘氨酸1.2g/L,谷氨酸1.2g/L，色氨酸1.2g/L，赖氨酸0.2g/L；
（2）复合微藻发酵
以裂殖壶菌和绿球微藻菌在步骤（1）得到的培养液中协同自养异样结合发酵，采用前期自养发酵、后期异养发酵的混养发酵方式培养绿球微藻菌，得到发酵后的菌体；具体的：
B1、自养发酵：培养液温度为24℃；pH值为6.5；搅拌速率18r/min；接种量：裂殖壶菌5.7%，绿球微藻菌3.8%；自养发酵时长为69h ，蓝光光照23h，避光23h，红光光照23h；
B2、异养发酵：培养液温度为24℃；pH值为6.5；搅拌速率18r/min；接种量：裂殖壶菌5.7%，绿球微藻菌3.8%；采取补料分批发酵方式使培养液内的葡萄糖浓度<24g/L，异养发酵时长为75h，得到发酵后的菌体；
将步骤（2）得到的发酵后的菌体进行检测，检测发酵产物脂肪酸组成和发酵产物生物产量：
①发酵产物脂肪酸组成：
发酵产物脂肪酸组成如下：棕榈烯酸44.6%，二十二碳六烯酸28.2%，花生四烯酸15.2%，棕榈酸8.2%，其他3.8%；
②发酵产物生物产量
菌体生物量可达197.72 g/L，油脂含量为细胞干重的52%；
（3）破壁萃取
将步骤（2）得到的发酵后的菌体依次经过离心脱水、浓缩、干燥、破壁和有机溶剂萃取方式提取，得到山桐子油脂肪酸乙酯；具体的：
C1、离心脱水是在转速为1700r/min离心6min；
C2、浓缩采用真空压缩，是在压力为0.05Pa、温度为58℃浓缩18min；
C3、干燥采用热风干燥，采用三段干燥方式，一段为65℃干燥32min，二段为75℃干燥32min，三段为60℃干燥32min；
C4、破壁采用超微破壁，超微破壁时间为0.8h，粒度达到5µm；
C5、有机溶剂萃取采用正己烷在温度为45℃萃取18min。
（4）油脂分离纯化
将得到的山桐子油脂肪酸乙酯经过尿素包埋、分子蒸馏分离纯化得到山桐子棕榈烯酸和山桐子二十二碳六烯酸；具体的：
D1、尿素包埋，包括下述步骤：
①在反应釜中，加入尿素和95%乙醇，尿素和95%乙醇的质量比为1:5，所述尿素的加入量为山桐子油脂肪酸乙酯质量的20%；保持温度为70℃回流搅拌直至尿素全部溶解；
②将山桐子油脂肪酸乙酯加入反应釜中，在温度为70℃继续回流搅拌，回流1.2h使脂肪酸和尿素充分混匀后停止反应，将混合液在室温下冷却40min；
③将步骤②冷却后的混合液转移至温度为78℃继续结晶，结晶结束后压力过滤，收集滤液和固相物；加入乙醇洗涤结晶物继续抽滤，继续收集滤液和固相物；
④将步骤③收集的滤液混合并用旋转蒸发仪除去乙醇，倒入分液漏斗分液，用等体积热水(热水温度为45℃)水洗4次，静置分层除去残留的尿素，从分液漏斗上端倒出含有山桐子棕榈烯酸的山桐子油脂肪酸乙酯，称重后0-4℃避光保存；
⑤步骤③收集的固相物加入热水(热水温度为45℃)破坏尿素结晶，经分液漏斗分液得到固相物中的脂肪酸乙酯；
D2、进行分子蒸馏时，将步骤（4）④中得到的含山桐子棕榈烯酸的山桐子油脂肪酸乙酯进行分子蒸馏，蒸馏温度为115℃、转速170 r/min，进料速率为1.4mL/min，蒸馏后得到山桐子棕榈烯酸，纯度为99.6%；
将步骤（4）⑤中得到的脂肪酸乙酯进行分子蒸馏，蒸馏温度为115℃、转速170 r/min，进料速率为1.4mL/min，蒸馏后得到山桐子二十二碳六烯酸，纯度为99.0%。
本实施例中，1000L的山桐子废液产棕榈烯酸1.63kg和二十二碳六烯酸1.44kg。
以上所述，仅为本发明的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，可轻易想到变化或替换，都应涵盖在本发明的保护范围之内。

Claims (5)

1.一种利用复合微藻发酵山桐子废液制备山桐子棕榈烯酸的方法，其特征在于：包括下述步骤：
（1）以山桐子废液制备发酵用培养液
向山桐子废液中加入KH2PO4 、MgSO4‧7H2O、CaCO3、Na2SO4 、FeSO4‧7H2O 、吲哚丁酸（IBA）、葡萄糖、麦芽糖、牛肉浸膏和氨基酸，得到发酵用培养液；
（2）复合微藻发酵
以裂殖壶菌和绿球微藻菌在步骤（1）得到的培养液中协同自养异养结合发酵，得到发酵后的菌体；
（3）破壁萃取
将步骤（2）得到的发酵后的菌体依次经过离心脱水、浓缩、干燥、破壁和有机溶剂萃取方式提取，得到山桐子油脂肪酸乙酯；
（4）油脂分离纯化
将得到的山桐子油脂肪酸乙酯通过尿素包埋、分子蒸馏分离纯化得到山桐子棕榈烯酸和山桐子二十二碳六烯酸；
所述步骤（1）中，所述山桐子废液的制备是以山桐子鲜果为原料，经液压压榨后得到液态料和固体料，将得到的液态料经一次离心除杂、酶解脱胶、二次离心脱水得到山桐子初榨油和山桐子废液；所述酶解脱胶采用的酶解剂为浓度为7800～8200U/ml的磷脂酶A1；
所述步骤（2）中，采用前期自养发酵、后期异养发酵的混养发酵方式培养绿球微藻菌；
所述自养发酵为：培养液温度为24～26℃；pH值为6.1～6.5；搅拌速率18～22r/min；接种量：裂殖壶菌5.3%～5.7%，绿球微藻菌3.8%～4.2%；自养发酵时长为69～75h ，蓝光光照23～25h，避光23～25h，红光光照23～25h；
所述异养发酵为：培养液温度为24～26℃；pH值为6.1～6.5；搅拌速率18～22r/min；接种量：裂殖壶菌5.3%～5.7%，绿球微藻菌3.8%～4.2%；采取补料分批发酵方式使培养液内的葡萄糖浓度<24g/L，异养发酵时长为69～75h；
所述步骤（4）中，所述尿素包埋包括下述步骤：
①在反应釜中，加入尿素和95%乙醇，保持温度为70～80℃回流搅拌直至尿素全部溶解；
②将山桐子油脂肪酸乙酯加入反应釜中，在温度为70～80℃继续回流搅拌，回流0.8～1.2h使脂肪酸和尿素充分混匀后停止反应，将混合液在室温下冷却40-50min；
③将步骤②冷却后的混合液转移至温度为78-82℃继续结晶，结晶结束后压力过滤，收集滤液和固相物；加入乙醇洗涤结晶物继续抽滤，继续收集滤液和固相物；
④将步骤③收集的滤液混合并用旋转蒸发仪除去乙醇，倒入分液漏斗分液，用等体积热水水洗至少3次，静置分层除去残留的尿素，从分液漏斗上端倒出含有山桐子棕榈烯酸的山桐子油脂肪酸乙酯，称重后0-4℃避光保存；
⑤步骤③收集的固相物加入热水破坏尿素结晶，经分液漏斗分液得到固相物中的脂肪酸乙酯；
所述步骤（4）中，进行分子蒸馏时，将步骤（4）④中得到的含山桐子棕榈烯酸的山桐子油脂肪酸乙酯进行分子蒸馏，蒸馏温度为115～125℃、转速150～170 r/min，进料速率为1.4～1.6mL/min，蒸馏后得到山桐子棕榈烯酸；将步骤（4）⑤中得到的脂肪酸乙酯进行分子蒸馏，蒸馏温度为115～125℃、转速150～170 r/min，进料速率为1.4～1.6mL/min，蒸馏后得到山桐子二十二碳六烯酸。
2.根据权利要求1所述的利用复合微藻发酵山桐子废液制备山桐子棕榈烯酸的方法，其特征在于：所述液压压榨是在压力为45～55Mpa压榨1.5～2h；
所述一次离心除杂是在转速为2600～3000r/mim离心时间12～18min；
所述酶解脱胶采用的酶解剂为浓度为7800～8200U/ml的磷脂酶A1，使用量为90～110U/L或者450～550ml/1000L，处理时间为1.8～2.2h,处理温度为50～60℃，剪切压力为15～25Mpa；
所述二次离心脱水是在转速为4300～4700r/mim离心12～18min。
3.根据权利要求1所述的利用复合微藻发酵山桐子废液制备山桐子棕榈烯酸的方法，其特征在于：所述步骤（1）中，所述氨基酸包括甘氨酸、谷氨酸、色氨酸和赖氨酸；得到的培养液中，所述KH2PO4 、MgSO4‧7H2O、CaCO3、Na2SO4 、FeSO4‧7H2O 、吲哚丁酸（IBA）、葡萄糖、麦芽糖、牛肉浸膏和氨基酸的浓度分别为：KH2PO4 2.0～5.0 g/L，MgSO4‧7H2O 0.4～0.6 g/L,CaCO3 4.0～6.0 g/L，Na2SO4 2.5～3.5g/L，FeSO4‧7H2O 18～22mg/L，吲哚丁酸（IBA）0.4～0.6g/L，葡萄糖48～52g/L，麦芽糖9～11g/L，牛肉浸膏4～6g/L；为甘氨酸0.8～1.2g/L,谷氨酸1.2～1.8g/L，色氨酸0.8～1.2g/L，赖氨酸0.2～0.4g/L。
4.根据权利要求3所述的利用复合微藻发酵山桐子废液制备山桐子棕榈烯酸的方法，其特征在于：得到的培养液中，所述KH2PO4 、MgSO4‧7H2O、CaCO3、Na2SO4 、FeSO4‧7H2O 、吲哚丁酸（IBA）、葡萄糖、麦芽糖、牛肉浸膏和氨基酸的浓度分别为：KH2PO4 4.0 g/L，MgSO4‧7H2O0.5 g/L, CaCO3 5.0 g/L，Na2SO4 3.0g/L，FeSO4‧7H2O 20mg/L，吲哚丁酸（IBA）0.5g/L,葡萄糖50g/L麦芽糖10g/L，牛肉浸膏5g/L；为甘氨酸1g/L,谷氨酸1.5g/L，色氨酸1g/L，赖氨酸0.3g/L。
5.根据权利要求1所述的利用复合微藻发酵山桐子废液制备山桐子棕榈烯酸的方法，其特征在于：所述步骤（3）中，所述离心脱水是在转速为1700～1900r/min离心4～6min；
所述浓缩采用真空压缩，是在压力为0.05～0.15Pa、温度为52～58℃浓缩18～22min；
所述干燥采用热风干燥，采用三段干燥方式，一段为65～75℃干燥28～32min，二段为75～85℃干燥28～32min，三段为60～70℃干燥28～32min；
所述破壁采用超微破壁，超微破壁时间为0.8～1.2h，粒度达到5µm；
所述有机溶剂萃取采用正己烷在温度为45-50℃萃取13-18min。
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