TWI582235B

TWI582235B - 生產二十碳五烯酸之微生物、脂肪酸組成物及其製作方法與用途

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Publication number: TWI582235B
Application number: TW101126317A
Authority: TW
Inventors: 卡克Ｅ阿普特; 保羅Ｗ貝倫斯; 瓊Ｍ漢森; 喬瑟夫Ｗ普菲佛三世; 崔西Ｌ史泰爾; 羅斯札可
Original assignee: Ｄｓｍ智慧財產有限公司
Priority date: 2011-07-21
Filing date: 2012-07-20
Publication date: 2017-05-11
Also published as: EP2734197A4; HK1198515A1; MX342216B; BR122015020126A2; EA201400152A1; BR112014001126A2; US9611488B2; US9649287B2; KR20190104633A; US20180169049A1; TW201311904A; US10272060B2; CN103930104A; AU2012285806B2; EA035287B1; KR102149116B1; BR122015020126B1; US20130190520A1; JP6208125B2; WO2013013211A1

Description

生產二十碳五烯酸之微生物、脂肪酸組成物及其製作方法與用途

與本申請案一起提出申請及由電子方式提交的序列表內容(於2011年7月20日創建之5,136位元的“sequence listing.txt”檔案)係在此完整地併入本案以為參考資料。

本發明係有關於分離微生物以及其菌株與突變株、生質、微生物油、組成物及培養物；生產微生物油、生質及突變株之方法；及使用分離微生物、生質及微生物油之方法。

脂肪酸之分類係基於碳鏈的長度與飽和度特性。脂肪酸係基於鏈中所存在的碳數而稱作短鏈、中鏈或長鏈脂肪酸，當碳原子之間並無雙鍵存在時稱作飽和脂肪酸，當雙鍵存在時稱作不飽和脂肪酸。當僅存在一個雙鍵時，不飽和的長鏈脂肪酸為單元不飽和；當存在一個以上的雙鍵時，則為多元不飽和。

多元不飽和脂肪酸(PUFA)之分類係基於自脂肪酸甲基端開始的第一個雙鍵之位置：ω-3(n-3)脂肪酸在第三個碳具有第一個雙鍵，而ω-6(n-6)脂肪酸則在第六個碳具有第一個雙鍵。例如，二十二碳六烯酸(“DHA”)係一種鏈長為22個碳及具有6個雙鍵之ω-3長鏈多元不飽和脂肪酸(LC-PUFA)，通常命名為“22：6 n-3”。其他ω-3 LC-PUFA包括經命名為“20：5 n-3”之二十碳五烯酸(“EPA”)，及經命名為“22：5 n-3”之ω-3二十二碳五烯酸(“DPA n-3”)。DHA及EPA 已被稱作“必需”脂肪酸。ω-6 LC-PUFA係包括經命名為“20：4 n-6”之二十碳四烯酸(“ARA”)及經命名為“22：5 n-6”之ω-6二十二碳五烯酸(“DPAn-6”)。

ω-3脂肪酸係生物學上的重要分子，其等因位於細胞膜中而影響細胞生理、調節生物活性化合物之生產與基因表現及作為生物合成受質。Roche,H.M.於期刊“Proc.Nutr.Soc.”第58期第397-401頁乙文(1999年)。例如，DHA構成人類大腦皮層中之約15%至20%的脂質，構成視網膜中之30%至60%的脂質，以高濃度存在於睪丸與精子中，及為母乳中的一重要組分。Bergé,J.P.與Barnathan,G.於期刊“Adv.Biochem.Eng.Biotechnol.”第96期第49-125頁乙文(2005年)。DHA構成腦中之高達97%的ω-3脂肪酸，及視網膜中之高達93%的ω-3脂肪酸。此外，DHA係胎兒與嬰兒發育以及成人認知功能之維護所必需。同上。因為在人體中無法重新合成ω-3脂肪酸，而必需自營養來源獲得該等脂肪酸。

亞麻仁油與魚油被認為是良好的ω-3脂肪酸膳食來源。亞麻仁油不含有EPA、DHA、DPA或ARA，但卻含有十八碳三烯酸(C18：3 n-3)，其係使身體能夠製造EPA之一結構單元。然而有證據顯示代謝轉換作用的速率可能緩慢與不定，特別在健康不佳的個體中。魚油則依特定的物種與其等的飲食，而在脂肪酸組成的類型與水平方面有顯著的差異。例如，相較於野生魚類，水產養殖所飼養的魚之ω-3脂肪酸水平較低。而且，魚油具有含環境污染物之風險，及可能伴隨著安定性問題與魚的腥臭或味道。

破囊壺菌係破囊壺菌目(Thraustochytriales)的微生物。破囊壺菌包括裂殖壺菌屬(Schizochytrium)與破囊壺菌屬(Thraustochytrium)之成員，及經確認係包括DHA與EPA在內的ω-3脂肪酸之一種替代來源。見第5,130,242號美國專利。相較於對應的魚油或微型藻油，自該等海生異營性微生物所生產的油通常具有較單純的多元不飽和脂肪酸廓型。Lewis,T.E.於期刊“Mar.Biotechnol.”第1期第580-587頁乙文(1999年)。已報導破囊壺菌物種的菌株所生產之ω-3脂肪酸，係在該生物體所生產的總脂肪酸中佔了高百分比。第5,130,242號美國專利；Huang,J.等人於期刊“J.Am.Oil.Chem.Soc.”第78期第605-610頁乙文(2001年)；Huang,J.等人於期刊“Mar.Biotechnol.”第5期第450-457頁乙文(2003年)。然而，分離出的破囊壺菌在其身分與所生產的LC-PUFA量方面有所不同，藉此一些先前所述的菌株在培養中所具有的ω-6脂肪酸水平可能不佳及/或可能展現低的生產力。有鑒於此，對於展現高生產力與適合需要的LC-PUFA廓型之微生物分離作用之需求，仍持續存在。

本發明係有關於在ATCC登錄號PTA-10212所寄存物種之一種分離微生物。

本發明係有關於具有在ATCC登錄號PTA-10212所寄存物種的特性之一種分離微生物。

本發明係有關於一種分離微生物，其所包含之一種18s rRNA係含有序列辨識編號1的一種聚核苷酸序列或與序列辨識編號1的一致性至少94%之一種聚核苷酸序列。

本發明係有關於一種分離微生物，其包含的一種18s rRNA聚核苷酸序列與在ATCC登錄號PTA-10212所寄存微生物的一種18s rRNA聚核苷酸序列之一致性係至少94%。

本發明係有關於在ATCC登錄號PTA-10208所寄存物種之一種分離微生物，其中該微生物所生產的總脂肪酸包含超過約10重量%的二十碳五烯酸。

本發明係有關於具有在ATCC登錄號PTA-10208所寄存物種的特性之一種分離微生物，其中該微生物所生產的總脂肪酸包含超過約10重量%的二十碳五烯酸。

本發明係有關於生產一個三醯甘油部分之一種分離微生物，其中該三醯甘油部分中的二十碳五烯酸含量係至少約12重量%。

在一些實施例中，本發明之分離微生物係一種突變型菌株。

本發明係有關於在ATCC登錄號PTA-10212、PTA-10213、PTA-10214、PTA-10215、PTA-10208、PTA-10209、PTA-10210或PTA-10211所寄存之一種分離微生物。

本發明係有關於包含本發明的任一微生物或其混合物之一種生質。

本發明係有關於一種分離生質，其中該生質的細胞乾重中之至少約20重量%為脂肪酸，其中超過約10重量% 的脂肪酸為二十碳五烯酸，及其中該脂肪酸包含各低於約5重量%的二十碳四烯酸與二十二碳五烯酸n-6。在一些實施例中，至少約25重量%的脂肪酸為二十二碳六烯酸。

在一些實施例中，本發明係有關於包含三醯甘油之一種分離生質，其中至少約12重量%的三醯甘油為二十碳五烯酸。

在一些實施例中，本發明係有關於本發明之任一分離生質，其中該脂肪酸進一步包含各低於約5重量%的油酸、亞麻油酸、十八碳三烯酸、二十烯酸及芥子酸。

發明係有關於包含本發明的任一微生物或其混合物之一種分離培養物。

本發明係有關於供非人類動物或人類用之一種食用產品、化妝品或藥學組成物，其包含本發明的任一微生物或生質或其混合物。

本發明係有關於一種微生物油，其包含至少約20重量%的二十碳五烯酸與各低於約5重量%的二十碳四烯酸、二十二碳五烯酸n-6、油酸、亞麻油酸、十八碳三烯酸、二十烯酸、芥子酸及十八碳四烯酸。在一些實施例中，該微生物油進一步包含至少約25重量%的二十二碳六烯酸。

本發明係有關於包含至少約10重量%的三醯甘油部分之一種微生物油，其中該三醯甘油部分中之至少約12重量%的脂肪酸為二十碳五烯酸，其中該三醯甘油部分中之至少約25重量%的脂肪酸為二十二碳六烯酸，及其中該三醯甘油部分中之低於約5重量%的脂肪酸為二十碳四烯酸。

本發明係有關於供非人類動物或人類用之一種食用產品、化妝品或藥學組成物，其包含本發明的任一微生物油。在一些實施例中，該食用產品係一種嬰兒奶粉。在一些實施例中，該嬰兒奶粉係適合早產嬰兒使用。在一些實施例中，該食用產品係一種乳、一種飲料、一種治療用飲品、一種營養飲品或其組合物。在一些實施例中，該食用產品係用於非人類動物或人類食品中之一種添加劑。在一些實施例中，該食用產品係一種營養增補劑。在一些實施例中，該食用產品係一種動物飼料。在一些實施例中，該動物飼料係一種水產養殖用飼料。在一些實施例中，該動物飼料係一種家畜飼料、一種動物園動物飼料、一種役畜飼料、一種牲畜飼料或其組合物。

本發明係有關於用於生產含有ω-3脂肪酸的一種微生物油之一種方法，該方法包括：在一培養中培育本發明之任一分離微生物或其混合物，以生產一種含有ω-3脂肪酸的油。在一些實施例中，該方法進一步包括萃取該油。

本發明係有關於用於生產含有ω-3脂肪酸的一種微生物油之一種方法，該方法包含自本發明之任一生質萃取一種含有ω-3脂肪酸的油。在一些實施例中，該微生物油係使用一種有機溶劑萃取製程萃取，例如己烷萃取作用。在一些實施例中，該微生物油係使用一種無溶劑萃取製程萃取。

本發明係有關於藉由本發明的一種方法所生產之一種微生物油。

本發明係有關於用於生產本發明的一種生質之一種方法，其包括：在一培養中培育本發明之任一分離微生物或其混合物，以生產一種生質。

本發明係有關於藉由本發明的一種方法所生產之一種生質。

本發明係有關於用於生產本發明的一種突變型菌株之一種方法，其包括：誘發本發明的任一微生物之突變，及分離該突變型菌株。

本發明係有關於本發明之任一分離微生物、生質或微生物油或其混合物在製造用於治療發炎或一相關病況的一藥劑之用途。

本發明係有關於本發明之任一分離微生物、生質或微生物油或其混合物用於治療發炎或一相關病況之用途。

本發明係有關於用於治療發炎或一相關病況之本發明之任一分離微生物、生質或微生物油或其混合物。

本發明係有關於在需要的一個體中用於治療發炎或一相關病況之一種方法，其包括對於該個體投予本發明之任一分離微生物、生質或微生物油或其混合物及一種藥學上可接受的載劑。

本發明係有關於分離微生物以及其菌株與突變株，以及其生質、微生物油、組成物及培養物。本發明係有關於生產來自本發明的微生物之微生物油、生質及突變株之方法，及使用該生物、生質及微生物油之方法。此述的微生物係非常高產的及產生獨特的脂肪酸廓型，其特徵係部分在於高水平的ω-3脂肪酸，特別是高水平的EPA。

本發明係有關於分離微生物及自其所衍生的菌株。自本發明之一種分離微生物所“衍生”的一菌株，可為一種天然或人工衍生物諸如例如一突變株、變異株或重組菌株。如在此所用的“分離”一詞並不一定反映一分離物經純化的程度，而是指自天然形式或天然環境之分離作用或隔離作用。一分離物可包括但不限於一種分離微生物、一種分離生質、一種分離培養物、一種分離微生物油及一種分離序列(諸如在此所揭露之一種分離出的聚核苷酸序列)。如在此所用的“微生物”一詞，包括但不限於“微型藻”、“破囊壺菌”等詞及與此述的任一寄存微生物相關聯之分類學分類。本發明所及的任一微生物及包括此述的寄存微生物所用之“破囊壺菌目(Thraustochytriales)”、“破囊壺菌”、“裂殖壺菌屬(Schizochytrium)”及“破囊壺菌屬(Thraustochytrium)”等詞，係以目前的分類學分類及包括可取得的系譜資訊為基礎，及無意受限於分類學分類在本申請案申請日之後修訂之情事。

在一些實施例中，本發明係有關於在ATCC登錄號PTA-10212所寄存物種之一種分離微生物。與ATCC登錄號PTA-10212相關聯之分離微生物，在此稱作破囊壺菌屬物種(Thraustochytrium sp.)ATCCPTA-10212。與ATCC登錄號PTA-10212相關聯之分離微生物，係依據布達佩斯條約(Budapest Treaty)於2009年7月14日寄存於美國維吉尼亞州 20110-2209馬納沙斯(Manassas)大學大道10801號的美國菌種保存中心(American Type Culture Collection)之專利寄存庫(Patent Depository)。在一些實施例中，本發明係有關於在ATCC登錄號PTA-10212所寄存之一種分離菌株。

一些實施例中，本發明係有關於具有在ATCC登錄號PTA-10212所寄存物種的特性之一種分離微生物或自其所衍生之一菌株。在ATCC登錄號PTA-10212所寄存物種之特性可包括其生長與表現型性質(表現型性質的實例包括形態學與繁殖性質)、其物理與化學性質(諸如乾重與脂質廓型)、其基因序列及其組合，其中該等特性可區別該物種與先前鑒定的物種。在一些實施例中，本發明係有關於具有在ATCC登錄號PTA-10212所寄存物種的特性之一種分離微生物，其中該特性包括一種含有序列辨識編號1的一聚核苷酸序列或與序列辨識編號1的一致性至少94%、95%、96%、97%、98%或99%的一種聚核苷酸序列之18s rRNA、在ATCC登錄號PTA-10212所寄存物種之形態學與繁殖性質及在ATCC登錄號PTA-10212所寄存物種之脂肪酸廓型。在一些實施例中，本發明之分離微生物具有與在ATCC登錄號PTA-10212所寄存微生物實質上相同的表現型性質。在一些實施例中，本發明之分離微生物具有與在ATCC登錄號PTA-10212所寄存微生物實質上相同的生長性質。在一些實施例中，本發明係有關於一種分離微生物，其所包含的一種18s rRNA係含有序列辨識編號1之一聚核苷酸序列或與序列辨識編號1的一致性至少94%、95%、96%、97%、98% 或99%之一種聚核苷酸序列。在一些實施例中，本發明係有關於一種分離微生物，其所包含之一種18s rRNA聚核苷酸序列與在ATCC登錄號PTA-10212所寄存微生物之18s rRNA聚核苷酸序列的一致性係至少94%。

在一些實施例中，本發明係有關於在ATCC登錄號PTA-10212所寄存微生物之一種突變型菌株。在其他實施例中，該突變型菌株係在ATCC登錄號PTA-10213、PTA-10214或PTA-10215所寄存之一菌株。與ATCC登錄號PTA-10213、PTA-10214及PTA-10215相關聯之微生物，係依據布達佩斯條約(Budapest Treaty)於2009年7月14日寄存於美國維吉尼亞州20110-2209馬納沙斯(Manassas)大學大道10801號的美國菌種保存中心(American Type Culture Collection)之專利寄存庫(Patent Depository)。

在一些實施例中，本發明係有關於在ATCC登錄號PTA-10208所寄存物種之一種分離微生物。與ATCC登錄號PTA-10208相關聯之分離微生物在此稱作裂殖壺菌屬(Schizochytrium sp)ATCCPTA-10208。與ATCC登錄號PTA-10208相關聯之微生物，係依據布達佩斯條約(Budapest Treaty)於2009年7月14日寄存於美國維吉尼亞州20110-2209馬納沙斯(Manassas)大學大道10801號的美國菌種保存中心(American Type Culture Collection)之專利寄存庫(Patent Depository)。在一些實施例中，本發明係有關於在ATCC登錄號PTA-10208所寄存之一種分離菌株。

在一些實施例中，本發明係有關於在ATCC登錄號PTA-10208所寄存物種之一種分離微生物，其中該微生物所生產的總脂肪酸包含超過約10重量%、超過約11重量%、超過約12重量%、超過約13重量%、超過約14重量%、超過約15重量%、超過約16重量%、超過約17重量%、超過約18重量%、超過約19重量%或超過約20重量%的EPA。在一些實施例中，本發明係有關於在ATCC登錄號PTA-10208所寄存物種之一種分離微生物，其中該微生物所生產的總脂肪酸包含約10重量%至約55重量%、約10重量%至約50重量%、約10重量%至約45重量%、約10重量%至約40重量%、約10重量%至約35重量%、約10重量%至約30重量%、約15重量%至約55重量%、約15重量%至約50重量%、約15重量%至約45重量%、約15重量%至約40重量%、約15重量%至約35重量%、約15重量%至約30重量%、約20重量%至約55重量%、約20重量%至約50重量%、約20重量%至約45重量%、約20重量%至約40重量%、約20重量%至約35重量%或約20重量%至約30重量%的EPA。

在一些實施例中，本發明係有關於具有在ATCC登錄號PTA-10208所寄存物種的特性之一種分離微生物，其中該微生物所生產的總脂肪酸包含超過約10重量%的二十碳五烯酸。在ATCC登錄號PTA-10208所寄存微生物的特性包括其生長與表現型性質(表現型性質的實例包括形態學與繁殖性質)、其物理與化學性質(諸如乾重與脂質廓型)、其基因序列及其組合，其中該等特性可區別該物種與先前鑒定的物種。在一些實施例中，本發明係有關於具有在 ATCC登錄號PTA-10212所寄存物種的特性之一種分離微生物，其中該特性包括一種含有序列辨識編號2的聚核苷酸序列之18s rRNA、在ATCC登錄號PTA-10208所寄存物種之形態學與繁殖性質及在ATCC登錄號PTA-10208所寄存物種之脂肪酸廓型。在一些實施例中，本發明之分離微生物所具有的物理與化學性質，係與在ATCC登錄號PTA-10208所寄存的微生物實質上相同。

在一些實施例中，本發明係有關於在ATCC登錄號PTA-10208所寄存微生物之一種突變型菌株。在其他實施例中，該突變型菌株係在ATCC登錄號PTA-10209、PTA-10210或PTA-10211所寄存之一菌株。與ATCC登錄號PTA-10209、PTA-10210及PTA-10211相關聯之微生物，係依據布達佩斯條約(Budapest Treaty)在2009年9月25日寄存於於美國維吉尼亞州20110-2209馬納沙斯(Manassas)大學大道10801號的美國菌種保存中心(American Type Culture Collection)之專利寄存庫(Patent Depository)。

在一些實施例中，本發明係有關於本發明之生產一個三醯甘油部分的一種分離微生物，其中該三醯甘油部分的EPA含量係至少約12重量%、至少約13重量%、至少約14重量%、至少約15重量%、至少約16重量%、至少約17重量%、至少約18重量%、至少約19重量%或至少約20重量%。在一些實施例中，本發明係有關於生產一個三醯甘油部分之一種分離微生物，其中該三醯甘油部分的EPA含量係約12重量%至約55重量%、約12重量%至約50重量%、約12重量%至約45重量%、約12重量%至約40重量%、約12重量%至約35重量%、約12重量%至約30重量%、約15重量%至約4重量5%、約15重量%至約40重量%、約15重量%至約35重量%、約15重量%至約30重量%或約20重量%至約30重量%。

在一些實施例中，本發明係有關於本發明之生產一個三醯甘油部分的一種分離微生物之一突變株、變異株或重組體，其中該三醯甘油部分的EPA含量係至少約10重量%、至少約11重量%、至少約12重量%、至少約13重量%、至少約14重量%、至少約15重量%、至少約16重量%、至少約17重量%、至少約18重量%、至少約19重量%或至少約20重量%。在一些實施例中，本發明係有關於本發明之生產一個三醯甘油部分的一種分離微生物之一突變株、變異株或重組體，其中該三醯甘油部分的EPA含量係約12重量%至約55重量%、約12重量%至約50重量%、約12重量%至約45重量%、約12重量%至約40重量%、約12重量%至約35重量%、約12重量%至約30重量%、約15重量%至約55重量%、約15重量%至約50重量%、約15重量%至約45重量%、約15重量%至約40重量%、約15重量%至約35重量%、約15重量%至約30重量%、約20重量%至約55重量%、約20重量%至約50重量%、約20重量%至約45重量%、約20重量%至約40重量%、約20重量%至約35重量%或約20重量%至約30重量%。可藉由眾所周知的程序產生突變型菌株。常用的程序包括輻射、高溫處理及以誘突變劑處理。變異型菌株可為此述物種之其他天然存在的分離株及/或亞分離株。可藉由分子生物學中用於表現外源基因或改變內源基因的功能或表現之任何眾所周知的方法，產生重組型菌株。在一些實施例中，該突變株、變異株或重組型菌株所生產的ω-3脂肪酸及尤其EPA的量，係高於野生型菌株。在一些實施例中，該突變株、變異株或重組型菌株生產較低量的一或多種脂肪酸，諸如較低量的DHA、ARA、DPAn-6或其組合。在一些實施例中，該突變株、變異株或重組型菌株所生產之每公升培養液的細胞乾重，係高於野生型菌株。該等突變株、變異株或重組型菌株係自本發明之一種分離微生物所衍生之菌株實例。

在一些實施例中，本發明之一種分離微生物及包括其突變株、變異株及重組體，係包含自該微生物所分離出的一或多個部分中之一脂肪酸廓型。自該微生物所分離出的一或多個部分係包括總脂肪酸部分、固醇酯部分、三醯甘油部分、游離脂肪酸部分、固醇部分、二醯甘油部分、極性部分(包括磷脂部分)及其組合。一特定部分的脂肪酸廓型可包括與在此所揭露之該特定部分相關聯的脂肪酸廓型中之任一者。

本發明係有關於產生一突變株之一種方法，其包括誘發本發明的任一微生物之突變及分離該突變型菌株。

本發明係有關於包含本發明之一或多種分離微生物之培養。用於接種、生長及回收微生物叢諸如微型藻與破囊壺菌之各種發酵作用參數，係技藝中所知。如見第5,130,242號美國專利，其在此併入本案以為參考資料。液態或固態培養基可含有天然或人造海水。供異營性生長之碳源包括但不限於葡萄糖、果糖、木糖、蔗糖、麥芽糖、可溶性澱粉、糖蜜、海藻糖、葡萄糖胺、葡聚糖、脂肪類、油類、甘油、乙酸鈉及甘露糖醇。氮源包括但不限於蛋白腖、酵母萃取物、聚蛋白腖、麥芽萃取物、肉萃取物、酪蛋白胺基酸、玉米浸液、有機氮源、麩胺酸鈉、尿素、無機氮源、乙酸銨、硫酸銨、氯化銨及硝酸銨。

供在ATCC登錄號PTA-10212所寄存微生物生長之一種典型的培養基，係示於第1表中：

在一些實施例中，在ATCC登錄號PTA-10212所寄存之微生物或其突變株、變異株或重組體，當以甘油作為碳源時係以異營性方式生長，但當以葡萄糖作為碳源時則不生長。

供在ATCC登錄號PTA-10208所寄存微生物生長之一種典型的培養基，係示於第2表中：

在一些實施例中，該培養基所包含以飽和度水平的百分比形式顯示之溶氧係至少約0.1%、至少約0.5%、至少約1%、至少約1.5%、至少約2%、至少約5%、至少約7%、至少約10%、至少約20%、至少約30%、至少約40%、至少約50%、至少約60%、至少約70%、至少約80%或至少約90%。在一些實施例中，該培養基所包含之以飽和度水平的百分比形式顯示之溶氧係約0.1%至約2%、約0.1%至約5%、約0.1%至約10%、約0.1%至約20%、約0.1%至約30%、約0.1%至約50%、約0.1%至約100%、約5%至約10%、約5%至約20%、約5%至約30%、約5%至約50%、約5%至約100%、約7%至約10%、約7%至約20%、約7%至約30%、約7%至約50%、約7%至約100%、約10%至約20%、約10%至約30%、約10%至約50%、約10%至約100%、約20%至約30%、約20%至約50%或約20%至約100%。

本發明係有關於本發明之一種微生物的分離生質。本發明之一種分離生質，係藉由諸如第5,130,242號美國專利與第2002/0001833號美國申請公開案中所述用於分離一種生質的任一習用方法獲得之一種所採集的細胞生質，該等專利與公開案中之各者在此併入本案以為參考資料。

在一些實施例中，在包含碳、氮與營養素的來源及約950 ppm至約8500 ppm的氯離子之pH值約6.5至約9.5的一培養基中，在約15℃至約30℃生長約6日至約8日之後，自每公升培養液所分離出之生質的細胞乾重係至少約10克、至少約15克、至少約20克、至少約25克、至少約30克、至少約50克、至少約60克、至少約70克、至少約80克、至少約100克、至少約120克、至少約140克、至少約160克、至少約180克或至少約200克。在一些實施例中，在包含碳、氮與營養素的來源及約950 ppm至約8500 ppm的氯離子之約pH 6.5、約pH 7、約pH 7.5、約pH 8.0、約pH 8.5、約pH 9或約pH 9.5的一培養基中，在約15℃、約16℃、約17℃、在約18℃、在約19℃、在約20℃、在約21℃、在約22℃、在約23℃、在約24℃、在約25℃、在約26℃、在約27℃、在約28℃、在約29℃或在約30℃生長約6日、約7日或約8日之後，自每公升培養液所分離出之生質的細胞乾重係至少約10克、至少約15克、至少約20克、至少約25克、至少約30克、至少約50克、至少約60克、至少約70克、至少約80克、至少約100克、至少約120克、至少約140克、至少約160克、至少約180克或至少約200克。在一些實施例中，在包含碳、氮與營養素的來源及約950 ppm至約8500 ppm的氯離子之約pH 6.5至約pH 9.5的一培養基中，在約15℃至約30℃生長約6日至約8日之後，自每公升培養液所分離出之生質的細胞乾重係約10克至約200克。在一些實施例中，在包含碳、氮與營養素的來源及約950 ppm至約8500 ppm的氯離子之約pH 6.5、約pH 7、約pH 7.5、約pH 8.0、約pH 8.5、約pH 9 或約pH 9.5的一培養基中，在約15℃、約16℃、約17℃、在約18℃、在約19℃、在約20℃、在約21℃、在約22℃、在約23℃、在約24℃、在約25℃、在約26℃、在約27℃、在約28℃、在約29℃，或在約30℃生長約6日、約7日或約8日之後，自每公升培養液所分離出之生質的細胞乾重係約10克至約200克、約10克至約100克、約10克至約50克、約15克至約200克、約15克至約100克、約15克至約50克、約20克至約200克、約20克至約100克、約20克至約50克、約50克至約200克或約50克至約100克。在一些實施例中，所分離出的培養物並未含有聚乙烯吡咯啶酮。

在一些實施例中，在包含碳、氮與營養素的來源及約950 ppm至約8500 ppm的氯離子之pH值約6.5至約8.5或pH值約6.5至約9.5的一培養基中，在約15℃至約30℃生長約6日、約7日或約8日之後，分離出的培養物所具有的ω-3脂肪酸生產力係至少約0.2克/公升/日、至少約0.3克/公升/日、至少約0.4克/公升/日、至少約0.5克/公升/日、至少約1克/公升/日、至少約1.2克/公升/日、至少約1.5克/公升/日、至少約1.7克/公升/日、至少約2克/公升/日、至少約3克/公升/日、至少約3.5克/公升/日、至少約4克/公升/日、至少約4.5克/公升/日、至少約5克/公升/日、至少約6克/公升/日或至少約8克/公升/日。在一些實施例中，在包含碳、氮與營養素的來源及約950 ppm至約8500 ppm的氯離子之pH值約6.5至約9.5的一培養基中，在約15℃至約30℃生長約6日、約7日或約8日之後，分離出的培養物所具有的ω-3脂肪酸生產力係約0.2克/公升/日至約20克/公升/日、約0.4克/公升/日至約20克/公升/日、約0.4克/公升/日至約2克/公升/日、約1克/公升/日至約2克/公升/日、約1克/公升/日至約20克/公升/日、約2克/公升/日至約15克/公升/日、約2克/公升/日至約10克/公升/日、約3克/公升/日至約10克/公升/日、約4克/公升/日至約9克/公升/日、約4克/公升/日至約8克/公升/日、約4克/公升/日至約7克/公升/日或約4克/公升/日至約6克/公升/日。

在一些實施例中，在包含碳、氮與營養素的來源及約950 ppm至約8500 ppm的氯離子之pH值約6.5至約8.5或pH值約6.5至約9.5的一培養基中，在約15℃至約30℃生長約6日、約7日或約8日之後，分離出的培養物所包含之EPA生產力係至少約0.2克/公升/日、至少約0.3克/公升/日、至少約0.4克/公升/日、至少約0.5克/公升/日、至少約0.6克/公升/日、至少約0.7克/公升/日、至少約0.8克/公升/日、至少約0.9克/公升/日、至少約1克/公升/日、至少約1.2克/公升/日、至少約1.5克/公升/日、至少約1.7克/公升/日、至少約2克/公升/日、至少約3克/公升/日、至少約4克/公升/日或至少約5克/公升/日。在一些實施例中，在包含碳、氮與營養素的來源及約950 ppm至約8500 ppm的氯離子之pH值約6.5至約8.5或pH值約6.5至約9.5的一培養基中，在約15℃至約30℃生長約6日、約7日或約8日之後，EPA生產力係約0.2克/公升/日至約5克/公升/日、約0.2克/公升/日至約4克/公升/日、約0.2克/公升/日至約3克/公升/日、約0.2克/公升/日至約2克 /公升/日、約0.2克/公升/日至約1克/公升/日、約0.2克/公升/日至約0.8克/公升/日、約0.2克/公升/日至約0.7克/公升/日、約1克/公升/日至約5克/公升/日、約1克/公升/日至約4克/公升/日、約1克/公升/日至約3克/公升/日或約1克/公升/日至約2克/公升/日。在一些實施例中，前述的任一EPA生產力係與前述的任一ω-3脂肪酸生產力相關聯。在一些實施例中，該培養物進一步包含的DHA生產力係約0克/公升/日至約5克/公升/日、約0克/公升/日至約4克/公升/日、約0克/公升/日至約3克/公升/日、約0克/公升/日至約2克/公升/日、約0克/公升/日至約1克/公升/日、約0.2克/公升/日至約5克/公升/日、約0.2克/公升/日至約4克/公升/日、約0.2克/公升/日至約3克/公升/日、約0.2克/公升/日至約2克/公升/日、約0.2克/公升/日至約1克/公升/日、約1克/公升/日至約5克/公升/日、約2克/公升/日至約5克/公升/日、約2克/公升/日至約4克/公升/日或約2克/公升/日至約3克/公升/日。在一些實施例中，DHA生產力係低於約5克/公升/日、低於約4克/公升/日、低於約3克/公升/日、低於約2克/公升/日、低於約1克/公升/日、低於約0.5克/公升/日、低於約0.2克/公升/日或約0克/公升/日。

在一些實施例中，發酵體積(培養體積)係至少約2公升、至少約10公升、至少約50公升、至少約100公升、至少約200公升、至少約500公升、至少約1000公升、至少約10,000公升、至少約20,000公升、至少約50,000公升、至少約100,000公升、至少約150,000公升、至少約200,000公升或至少約250,000公升。在一些實施例中，發酵體積係約2公升至約300,000公升、約2公升、約10公升、約50公升、約100公升、約200公升、約500公升、約1000公升、約10,000公升、約20,000公升、約50,000公升、約100,000公升、約150,000公升、約200,000公升、約250,000公升或約300,000公升。

在一些實施例中，本發明係有關於包含本發明的一脂肪酸廓型之一種分離生質。在一些實施例中，生質的細胞乾重中之至少約20%、至少約25%、至少約30%、至少約35%、至少約40%、至少約45%、至少約50%、至少約55%、至少約60%、至少約65%、至少約70%、至少約75%或至少約80%為脂肪酸。在一些實施例中，生質的細胞乾重中之超過約20%、超過約25%、超過約30%、超過約35%、超過約40%、超過約45%、超過約50%、超過約55%或超過約60%為脂肪酸。在一些實施例中，生質的細胞乾重中之約20重量%至約55重量%、約20重量%至約60重量%、約20重量%至約70重量%、約20重量%至約80重量%、約30重量%至約55重量%、約30重量%至約70重量%、約30重量%至約80重量%、約40重量%至約60重量%、約40重量%至約70重量%、約40重量%至約80重量%、約50重量%至約60重量%、約50重量%至約70重量%、約50重量%至約80重量%、約55重量%至約70重量%、約55重量%至約80重量%、約60重量%至約70重量%或約60重量%至約80重量%為脂肪酸。在一些實施例中，該生質所包含的脂肪酸重量中之超過約10%、至少約12%、至少約15%、至少約20%、至少約25%、至少約30%、至少約35%、至少約40%或至少約45%為EPA。在一些實施例中，該生質所包含的脂肪酸重量中之約10%至約55%、約12%至約55%、約15%至約55%、約20%至約55%、約20%至約40%或約20%至約30%為EPA。在一些實施例中，該生質包含一個三醯甘油部分，其中該三醯甘油部分的重量中之至少約12%、至少約13%、至少約14%、至少約15%、至少約16%、至少約17%、至少約18%、至少約19%或至少約20%為EPA。在一些實施例中，該生質包含一個三醯甘油部分，其中該三醯甘油部分中的EPA含量係自至少約12重量%至約55重量%、約12重量%至約50重量%、約12重量%至約45重量%、至少約12重量%至約40重量%、至少約12重量%至約35重量%或至少約12重量%至約30重量%、約15重量%至約55重量%、約15重量%至約50重量%、約15重量%至約45重量%、約15重量%至約40重量%、約15重量%至約35重量%、約15重量%至約30重量%、約20重量%至約55重量%、約20重量%至約50重量%、約20重量%至約45重量%、至少約20重量%至約40重量%、至少約20重量%至約35重量%或約20重量%至約30重量%。在一些實施例中，生質的細胞乾重之至少約20重量%、至少約25重量%、至少約30重量%、至少約35重量%、至少約40重量%、至少約50重量%或至少約60重量%為DHA。在一些實施例中，生質的細胞乾重中之約20重量%至約60重量%、約25重量%至約60重量%、約25重量%至約50重量%、約25重量%至約45重量 %、約30重量%至約50重量%或約35重量%至約50重量%為DHA。在一些實施例中，該生質所包含的脂肪酸重量中之約10%以下、約9%以下、約8%以下、約7%以下、約6%以下、約5%以下、約4%以下、約3%以下、約2%以下或約1%以下為DHA。在一些實施例中，該生質所包含的脂肪酸重量中之約1%至約10%、約1%至約5%、約2%至約5%、約3%至約5%或約3%至約10%為DHA。在一些實施例中，該生質實質上不含DHA。在一些實施例中，該生質所包含的脂肪酸重量中之約0.1%至約5%以下、約0.1%至約4%、約0.1%至約3%、約0.1%至約2%、約0.2%至約5%以下、約0.2%至約4%、約0.2%至約3%、約0.2%至約2%、約0.3%至約2%、約0.1%至約0.5%、約0.2%至約0.5%、約0.1%至約0.4%、約0.2%至約0.4%、約0.5%至約2%、約1%至約2%、約0.5%至約1.5%或約1%至約1.5%為ARA。在一些實施例中，該生質所包含的脂肪酸重量中之低於約5%、約4%以下、約3%以下、約2%以下、約1.5%以下、約1%以下、約0.5%以下、約0.4%以下、約0.3%以下、約0.2%以下或約0.1%以下為ARA。在一些實施例中，該生質實質上不含ARA。在一些實施例中，該生質所包含的脂肪酸重量中之約0.4%至約2%、約0.4%至約3%、約0.4%至約4%、約0.4%至約5%、約0.4%至約5%以下、約0.5%至約1%、約0.5%至約2%、約0.5%至約3%、約0.5%至約4%、約0.5%至約5%、約0.5%至約5%以下、約1%至約2%、約1%至約3%、約1%至約4%、約1%至約5%或約1%至約5%以下為DPA n-6。在一些實施例中，該生質所包含的脂肪酸重量中之約5%以下、低於約5%、約4%以下、約3%以下、約2%以下、約1%以下、約0.75%以下、約0.6%以下或約0.5%以下為DPA n-6。在一些實施例中，該生質實質上不含DPA n-6。在一些實施例中，該生質所包含之脂肪酸係具有約5重量%以下、低於約5重量%、約4重量%以下、約3重量%以下或約2重量%以下的油酸(18：1 n-9)、亞麻油酸(18：2 n-6)、十八碳三烯酸(18：3 n-3)、二十烯酸(20：1 n-9)、芥子酸(22：1 n-9)或其組合。

本發明之一種分離生質的特性係與分離生質的內源或原有性質相關聯，而非與外部引入物質的性質相關聯。在一些實施例中，分離生質並未含有聚乙烯吡咯啶酮，或並非自含有聚乙烯吡咯啶酮之一培養中分離。

本發明係有關於生產一生質之一種方法。在一些實施例中，用於產生本發明的一種生質之方法包含在一培養中培育本發明之任一分離微生物或其混合物，以生產一種生質。本發明係有關於藉由該方法所生產之一種生質。

本發明係有關於包含本發明的一脂肪酸廓型之一種微生物油。本發明的一種微生物油係一種“粗製油”或一種“精製油”，其包含至少約35重量%的一個三醯甘油部分。“粗製油”係自微生物的生質萃取及未經進一步加工處理之油。“精製油”係藉由精製、脫色及/或除臭的標準製程處理一粗製油而製得之油。如見第5,130,242號美國專利，其在此併入本案以為參考資料。一種微生物油亦包括如此述之一種“最終油”，其係經植物油稀釋之一種精製油。在一些實施例中，最終油係經高油酸的葵花籽油稀釋之一種精製油。如在此所用的“微生物”一詞，係包括但不限於“微型藻”、“破囊壺菌”及與此述的任一寄存微生物相關聯之分類學分類。參照此述寄存微生物的任一微生物油所用之“破囊壺菌目(Thraustochytriales)”、“破囊壺菌”、“裂殖壺菌屬(Schizochytrium)”及“破囊壺菌屬(Thraustochytrium)”等詞，係基於目前的分類學分類及包括可取得的系譜資訊，及無意受限於分類學分類在本申請案申請日之後修訂之情事。

在一些實施例中，如此述之脂肪酸可為一脂肪酸酯。在一些實施例中，一脂肪酸酯係包括一種ω-3脂肪酸、ω-6脂肪酸及其組合之一酯類。在一些實施例中，該脂肪酸酯係一種DHA酯類、一種EPA酯類或其組合物。在一些實施例中，如此述之一油或其部分係酯化產生包含脂肪酸酯之一油或其部分。“酯”一詞係指脂肪酸分子之羧酸基中的氫係經另一個取代基置換。典型的酯類係該等技藝專業人士所知，其相關論述係提供於培格曼(Pergamon Press)出版公司於1987年出版之美國藥事協會(American Pharmaceutical Association)由Edward B.Roche所編輯之A.C.S.研討會系列第14冊(Bioreversible Carriers in Drug Design)之Higuchi,T.與V.Stella所著“作為新穎輸送系統之前驅藥(Pro-drugs as Novel Delivery Systems)”乙文及美國紐約的普列南(Plenum Press)出版公司於1973年出版及由McOmie編輯之“有機化學中之保護基(Protective Groups in Organic Chemistry)”乙書。酯類之實例包括甲基、乙基、丙基、丁基、戊基、特-丁基、苄基、硝苄基、甲氧基苄基、二苯甲基、及三氯乙基。在一些實施例中，該酯係一種羧酸保護性酯基、具有芳烷基之酯基(如苄基、苯乙基)、具有低級烯基之酯基(如烯丙基、2-丁烯基)、具有低級烷氧基-低級烷基之酯類(如甲氧基甲基、2-甲氧基乙基、2-乙氧基乙基)、具有低級烷醯氧基-低級烷基之酯類(如乙醯氧基甲基、三甲基乙醯氧基甲基、1-三甲基乙醯氧基乙基)、具有低級烷氧羰基-低級烷基之酯類(如甲氧羰基甲基、異丙氧羰基甲基)、具有羧基-低級烷基之酯類(如羧基甲基)、具有低級烷氧基羰氧基-低級烷基之酯類(如1-(乙氧基羰氧基)乙基、1-(環己氧基羰氧基)乙基)、具有胺甲醯氧基-低級烷基之酯類(如胺甲醯氧基甲基)等。在一些實施例中，所添加的取代基係一直鏈或環狀烴基，如一個C1-C6烷基、C1-C6環烷基、C1-C6烯基或C1-C6芳基酯。在一些實施例中，該酯係一種烷基酯，如一種甲基酯、乙基酯或丙基酯。在一些實施例中，在脂肪酸處於純化或半純化狀態時，將酯取代基添加至游離脂肪酸分子中。任擇地，在三醯甘油轉換為一酯之際，形成該脂肪酸酯。

本發明係有關於生產微生物油之方法。在一些實施例中，該方法包括在一培養中培育本發明之任一分離微生物或其混合物，以生產包含ω-3脂肪酸之一種微生物油。在一些實施例中，該方法進一步包括萃取該微生物油。在一些實施例中，該方法包括自本發明的任一生質或其混合物中萃取一種包含ω-3脂肪酸的微生物油。在一些實施例中，該方法包括以異營性方式培養分離微生物，其中該培養包含如此述之一碳源。該微生物油可萃取自剛採集的生質，或可萃取自存放在防損壞條件下之先前所採集的生質。可使用已知方法以培養本發明的微生物，以自培養中分離一種生質，以自該生質中萃取一種微生物油，及分析自該生質所萃取出的油之脂肪酸廓型。如見第5,130,242號美國專利，其在此併入本案以為參考資料。本發明係有關於藉由本發明的任一方法所生產之一種微生物油。

在一些實施例中，係藉由一種酵素萃取方法萃取微生物油。在一些實施例中，係藉由一種機械萃取方法萃取微生物油。在一些實施例中，該機械萃取方法包括下列一或多者：(1)將一種經巴氏殺菌的發酵液處理通過一均質機，以助於細胞分解及自細胞釋出油；(2)在均質化之後，在發酵液中添加異丙醇，以破壞油與水的乳化液；(3)將混合物離心，以回收油相；及(4)添加抗氧化劑及在真空中乾燥。在一些實施例中，將粗製油純化。在一些實施例中，粗製油的純化作用包括下列一或多者：(1)將粗製油泵送至一精製槽中及加熱該油，接著在混合作用下添加一種酸溶液；(2)在酸處理之後，在該油中添加一種苛性鹼溶液；(3)將粗製油再加熱然後離心，以將重相與精製油分離；(4)藉由使用例如酸、TriSyl®、黏土及/或過濾作用，移除剩餘的極性化合物、微量金屬及來自精製油的氧化產物；(5)脫色後的油進行冷過濾，以自該油中進一步移除高熔點組分而達到所欲的澄清度水平；(6)加熱該油，之後將油冷卻及放置一段時間，造成高熔融的三酸甘油酯與蠟結晶；(7)在冷卻後的油中添加一種助濾劑，然後藉由過濾作用移除結晶的固體物；(8)在冷過濾之後，使用在高溫與真空中運作之一種除臭器，以移除例如可造成變味與敗味之過氧化物與剩餘的任何低分子量化合物；(9)將該油轉移至除臭器進料槽中，例如在一種填充柱除臭器中脫氣與除臭；及(10)例如在除臭循環結束時，在一氮封裝置下進行冷卻，及在除臭後的油中添加適宜的抗氧化劑，以提供氧化安定性。

在一些實施例中，該微生物油所包含之固醇酯部分係約0重量%、至少約0.1重量%、至少約0.2重量%、至少約0.5重量%、至少約1重量%、至少約1.5重量%、至少約2重量%或至少約5重量%。在一些實施例中，該微生物油所包含之固醇酯部分係約0重量%至約1.5重量%、約0重量%至約2重量%、約0重量%至約5重量%、約1重量%至約1.5重量%、約0.2重量%至約1.5重量%、約0.2重量%至約2重量%或約0.2重量%至約5重量%。在一些實施例中，該微生物油所包含之固醇酯部分係約5重量%以下、約4重量%以下、約3重量%以下、約2重量%以下、約1重量%以下、約0.5重量%以下、約0.3重量%以下、約0.2重量%以下、約0.5重量%以下、約0.4重量%以下、約0.3重量%以下或約0.2重量%以下。

在一些實施例中，該微生物油所包含之三醯甘油部分係至少約35重量%、至少約40重量%、至少約45重量%、至少約50重量%、至少約55重量%、至少約60重量%、至少約65重量%、至少約70重量%、至少約75重量%、至少約80重量%、至少約85重量%或至少約90重量%。在一些實施例中，該微生物油所包含之三醯甘油部分係約35重量%至約98重量%、約35重量%至約90重量%、約35重量%至約80重量%、約35重量%至約70重量%、約35重量%至約70重量%、約35重量%至約65重量%、約40重量%至約70重量%、約40重量%至約65重量%、約40重量%至約55重量%、約40重量%至約50重量%、約65重量%至約95重量%、約75重量%至約95重量%、約75重量%至約98重量%、約80重量%至約95重量%、約80重量%至約98重量%、約90重量%至約96重量%、約90重量%至約97重量%、約90重量%至約98重量%、約90重量%、約95重量%、約97重量%或約98重量%。

在一些實施例中，該微生物油所包含之二醯甘油部分係至少約10重量%、至少約11重量%、至少約12重量%、至少約13重量%、至少約14重量%、至少約15重量%、至少約16重量%、至少約17重量%、至少約18重量%、至少約19重量%或至少約20重量%。在一些實施例中，該微生物油所包含之二醯甘油部分係約10重量%至約45重量%、約10重量%至約40重量%、約10重量%至約35重量%、約10重量%至約30重量%、約15重量%至約40重量%、約15重量%至約35重量%或約15重量%至約30重量%。在一些實施例中，該微生物油所包含之1,2-二醯甘油部分係至少約0.2重量%、至少約0.3重量%、至少約0.4重量%、至少約0.5重量%、至少約1重量%、至少約5重量%、至少約10重量%、至少約11重量%、至少約12重量%、至少約13重量%、至少約14重量%、至少約15重量%、至少約16重量%、至少約17重量%、至少約18重量%、至少約19重量%或至少約20重量%。在一些實施例中，該微生物油所包含之二醯甘油部分係約0.2重量%至約45重量%、約0.2重量%至約30重量%、約0.2重量%至約20重量%、約0.2重量%至約10重量%、約0.2重量%至約5重量%、約0.2重量%至約1重量%、約0.2重量%至約0.8重量%、約0.4重量%至約45重量%、約0.4重量%至約30重量%、約0.4重量%至約20重量%、約0.4重量%至約10重量%、約0.4重量%至約5重量%、約0.4重量%至約1重量%、約0.4重量%至約0.8重量%、約0.5重量%至約1重量%、約0.5重量%至約0.8重量%、約10重量%至約45重量%、約10重量%至約40重量%、約10重量%至約35重量%、約10重量%至約30重量%、約15重量%至約40重量%、約15重量%至約35重量%、約15重量%至約30重量%或約15重量%至約25重量%。在一些實施例中，該微生物油所包含之1,3-二醯甘油部分係至少約0.1重量%、至少約0.2重量%、至少約0.5重量%、至少約1重量%、至少約2重量%、至少約2.5重量%或至少約3重量%。在一些實施例中，該微生物油所包含之固醇部分係至少約0.3重量%、至少約0.4重量%、至少約0.5重量%、至少約1重量%、至少約1.5重量%、至少約2重量%或至少約5重量%。

在一些實施例中，該微生物油所包含之固醇部分係約0.3重量%至約5重量%、約0.3重量%至約2重量%、約0.3重量%至約1.5重量%、約0.5重量%至約1.5重量%、約1重量 %至約1.5重量%、約0.5重量%至約2重量%、約0.5重量%至約5重量%、約1重量%至約2重量%或約1重量%至約5重量%。在一些實施例中，該微生物油所包含之固醇部分係約5重量%以下、約4重量%以下、約3重量%以下、約2重量%以下、約1.5重量%以下或約1重量%以下。

在一些實施例中，該微生物油所包含之磷脂部分係至少約2重量%、至少約5重量%或至少約8重量%。在一些實施例中，該微生物油所包含之磷脂部分係約2重量%至約25重量%、約2重量%至約20重量%、約2重量%至約15重量%、約2重量%至約10重量%、約5重量%至約25重量%、約5重量%至約20重量%、約5重量%至約20重量%、約5重量%至約10重量%或約7重量%至約9重量%。在一些實施例中，該微生物油所包含之磷脂部分係低於約20重量%、低於約15重量%、低於約10重量%、低於約9重量%或低於約8重量%。在一些實施例中，該微生物油實質上不含磷脂。在一些實施例中，該微生物油所包含的不皂化物係低於約2%、低於約1.5%、低於約1%，或低於約0.5%的油重量。該微生物油中所存在的脂質類型，諸如三醯甘油部分，可藉由急驟層析法分離及藉由薄層層析法(TLC)分析，或藉由技藝中已知的其他方法分離與分析。

在一些實施例中，該微生物油及/或其選自三醯甘油部分、游離脂肪酸部分、固醇部分、二醯甘油部分中之一或多個部分及其組合，係包含至少約5重量%、至少約10重量%、超過約10重量%、至少約12重量%、至少約13重量%、至少約14重量%、至少約15重量%、至少約16重量%、至少約17重量%、至少約18重量%、至少約19重量%、至少約20重量%、至少約25重量%、至少約30重量%、至少約35重量%、至少約40重量%或至少約45重量%的EPA。在一些實施例中，該微生物油及/或其選自三醯甘油部分、游離脂肪酸部分、固醇部分、二醯甘油部分中之一或多個部分及其組合，係包含約5重量%至約55重量%、約5重量%至約50重量%、約5重量%至約45重量%、約5重量%至約40重量%、約5重量%至約35重量%、約5重量%至約30重量%、約10重量%至約55重量%、約10重量%至約50重量%、約10重量%至約45重量%、約10重量%至約40重量%、約10重量%至約35重量%、約10重量%至約30重量%、至少約12重量%至約55重量%、至少約12重量%至約50重量%、至少約12重量%至約45重量%、至少約12重量%至約40重量%、至少約12重量%至約35重量%或至少約12重量%至約30重量%、約15重量%至約55重量%、約15重量%至約50重量%、約15重量%至約45重量%、約15重量%至約40重量%、約15重量%至約35重量%、約15重量%至約30重量%、約15重量%至約25重量%、約15重量%至約20重量%、約20重量%至約55重量%、約20重量%至約50重量%、約20重量%至約45重量%、約20重量%至約40重量%或約20重量%至約30重量%的EPA。在一些實施例中，該微生物油及/或其選自三醯甘油部分、二醯甘油部分、固醇部分、固醇酯部分、游離脂肪酸部分、磷脂部分中之一或多個部分及其組合，係包含至少約5重量 %、至少約10重量%、至少約15重量%、至少約20重量%、至少約25重量%、至少約30重量%、至少約35重量%、至少約40重量%、至少約50重量%或至少約60重量%的DHA。在一些實施例中，該微生物油及/或其選自三醯甘油部分、二醯甘油部分、固醇部分、固醇酯部分、游離脂肪酸部分、磷脂部分中之一或多個部分及其組合，係包含約5重量%至約60重量%、約5重量%至約55重量%、約5重量%至約50重量%、約5重量%至約40重量%、約10重量%至約60重量%、約10重量%至約50重量%、約10重量%至約40重量%、約20重量%至約60重量%、約25重量%至約60重量%、約25重量%至約50重量%、約25重量%至約45重量%、約30重量%至約50重量%、約35重量%至約50重量%或約30重量%至約40重量%的DHA。在一些實施例中，該微生物油及/或其選自三醯甘油部分、二醯甘油部分、固醇部分、固醇酯部分、游離脂肪酸部分、磷脂部分中之一或多個部分及其組合，係包含約10重量%以下、約9重量%以下、約8重量%以下、約7重量%以下、約6重量%以下、約5重量%以下、約4重量%以下、約3重量%以下、約2重量%以下或約1重量%以下的DHA。在一些實施例中，該微生物油及/或其選自三醯甘油部分、二醯甘油部分、固醇部分、固醇酯部分、游離脂肪酸部分、磷脂部分中之一或多個部分及其組合，其所包含的脂肪酸重量中之約1%至約10%、約1%至約5%、約2%至約5%、約3%至約5%或約3%至約10%為DHA。在一些實施例中，該微生物油及/或其選自三醯甘油部分、二醯甘油部分、固醇部分、固醇酯部分、游離脂肪酸部分、磷脂部分中之一或多個部分及其組合，係實質上不含DHA。在一些實施例中，該微生物油及/或其選自三醯甘油部分、二醯甘油部分、固醇部分、固醇酯部分、游離脂肪酸部分、磷脂部分中之一或多個部分及其組合，係包含約0.1重量%至約5重量%、約0.1重量%至約5重量%以下、約0.1重量%至約4重量%、約0.1重量%至約3重量%、約0.1重量%至約2重量%、約0.2重量%至約5重量%、約0.2重量%至約5重量%以下、約0.2重量%至約4重量%、約0.2重量%至約3重量%、約0.2重量%至約2重量%、約0.3重量%至約2重量%、約0.1重量%至約0.5重量%、約0.2重量%至約0.5重量%、約0.1重量%至約0.4重量%、約0.2重量%至約0.4重量%、約0.5重量%至約2重量%、約1重量%至約2重量%、約0.5重量%至約1.5重量%或約1重量%至約1.5重量%的ARA。在一些實施例中，該微生物油及/或其選自三醯甘油部分、二醯甘油部分、固醇部分、固醇酯部分、游離脂肪酸部分、磷脂部分中之一或多個部分及其組合，係包含約5重量%以下，低於約5重量%、約4重量%以下、約3重量%以下、約2重量%以下、約1.5重量%以下、約1重量%以下、約0.5重量%以下、約0.4重量%以下、約0.3重量%以下、約0.2重量%以下或約0.1重量%以下的ARA。在一些實施例中，該微生物油及/或其選自三醯甘油部分、二醯甘油部分、固醇部分、固醇酯部分、游離脂肪酸部分、磷脂部分中之一或多個部分及其組合，係實質上不含ARA。在一些實施例中，該微生物油及/或其選自三醯甘油部分、二醯甘油部分、固醇部分、固醇酯部分、游離脂肪酸部分、磷脂部分中之一或多個部分及其組合，係包含約0.4重量%至約2重量%、約0.4重量%至約3重量%、約0.4重量%至約4重量%、約0.4重量%至約5重量%、約0.4重量%至約5重量%以下、約0.5重量%至約1重量%、約0.5重量%至約2重量%、約0.5重量%至約3重量%、約0.5重量%至約4重量%、約0.5重量%至約5重量%、約0.5重量%至約5重量%以下、約1重量%至約2重量%、約1重量%至約3重量%、約1重量%至約4重量%、約1重量%至約5重量%或約1重量%至約5重量%以下的DPA n-6。在一些實施例中，該微生物油及/或其選自三醯甘油部分、二醯甘油部分、固醇部分、固醇酯部分、游離脂肪酸部分、磷脂部分中之一或多個部分及其組合，係包含約5重量%、低於約5重量%、約4重量%以下、約3重量%以下、約2重量%以下、約1重量%以下、約0.75重量%以下、約0.6重量%以下或約0.5重量%以下的DPA n-6。在一些實施例中，該微生物油及/或其選自三醯甘油部分、二醯甘油部分、固醇部分、固醇酯部分、游離脂肪酸部分、磷脂部分中之一或多個部分及其組合，係實質上不含DPA n-6。在一些實施例中，該微生物油及/或其選自三醯甘油部分、二醯甘油部分、固醇部分、固醇酯部分、游離脂肪酸部分、磷脂部分中之一或多個部分及其組合，其所包含的脂肪酸係具有約5重量%以下，低於約5重量%、約4重量%以下、約3重量%以下或約2重量%以下的油酸(18：1 n-9)、亞麻油酸(18：2 n-6)、十八碳三烯酸(18：3 n-3)、二十烯酸(20：1 n-9)、芥子酸(22：1 n-9)、十八碳四烯酸(18：4 n-3)或其組合物。

三醯甘油分子含有3個中心碳原子(C(sn-1)H₂R1-(sn-2)H₂R2-C(sn-3)H₂R3)，而容許形成不同的位置異構物。在一些實施例中，該微生物油包含一個三醯甘油部分，其中該三醯甘油部分中之至少約2%、至少約3%、至少約5%、至少約10%、至少約15%、至少約20%、至少約30%、至少約35%或至少約40%的三醯甘油，係在三醯甘油之選自sn-1、sn-2及sn-3位置中的任二者之二個位置上含有DHA(雙取代DHA)，以HPLC層析上之峰的相對面積百分比為基礎。在一些實施例中，該微生物油包含一個三醯甘油部分，其中該三醯甘油部分中之約2%至約55%、約2%至約50%、約2%至約45%、約2%至約40%、約2%至約35%、約2%至約30%、約2%至約25%、約5%至約55%、約5%至約50%、約5%至約45%、約5%至約40%、約5%至約35%、約5%至約30%、約5%至約25%、約10%至約55%、約10%至約50%、約10%至約45%、約10%至約40%、約10%至約35%、約10%至約30%、約10%至約25%、約10%至約20%、約20%至約40%、約20%至約35%或約20%至約25%的三醯甘油，係在三醯甘油之選自sn-1、sn-2及sn-3位置中的任二者之二個位置上含有EPA，以HPLC層析上之峰的相對面積百分比為基礎。在一些實施例中，該微生物油包含一個三醯甘油部分，其中該三醯甘油部分中之至少約0.5%、至少約1%、至少約1.5%或至少約2%的三醯甘油，係在sn-1、sn-2及sn-3位置皆含有DHA(三取代DHA)，以HPLC層析上之峰的相對面積百分比為基礎。在一些實施例中，該微生物油包含一個三醯甘油部分，其中該三醯甘油部分中之約0.5%至約5%、約0.5%至約3%、約0.5%至約2.5%、約0.5%至約2%、約1%至約5%、約1%至約3%或約1%至約2%的三醯甘油，係在sn-1、sn-2及sn-3位置皆含有DHA，以HPLC層析上之峰的相對面積百分比為基礎。在一些實施例中，該微生物油包含一個三醯甘油部分，其中該三醯甘油部分中之至少約10%、至少約15%、至少約20%、至少約25%、至少約30%、至少約35%、至少約40%、至少約45%、至少約50%、至少約55%或至少約60%的三醯甘油，係在三醯甘油之選自sn-1、sn-2及sn-3位置中的任一者之一個位置上含有DHA，以HPLC層析上之峰的相對面積百分比為基礎。在一些實施例中，該微生物油包含一個三醯甘油部分，其中該三醯甘油部分中之約10%至約80%、約10%至約70%、約10%至約60%、約15%至約80%、約15%至約75%、約15%至約70%、約15%至約65%、約15%至約60%、約35%至約80%、約35%至約75%、約35%至約65%、約35%至約60%、約40%至約80%、約40%至約75%、約40%至約70%、約40%至約65%、約40%至約60%或約40%至約55%的三醯甘油，係在三醯甘油之選自sn-1、sn-2及sn-3位置中的任一者之一個位置上含有DHA，以HPLC層析上之峰的相對面積百分比為基礎。

在一些實施例中，該微生物油係包含脂肪酸，其中該等脂肪酸進一步包含ω-3多元不飽和脂肪酸，其中該等 ω-3多元不飽和脂肪酸的DHA與EPA含量係約大於或等於ω-3多元不飽和脂肪酸總量之90重量%，而EPA的量係DHA與EPA總量之約28重量%至約36重量%，及DHA的量係DHA與EPA總量之約54重量%至約62重量%。

在另一實施例中，該微生物油係包含ω-3多元不飽和脂肪酸，而該等ω-3多元不飽和脂肪酸的DHA與EPA含量係約大於或等於ω-3多元不飽和脂肪酸總量之90重量%，其中EPA的量係DHA與EPA總量之約19重量%至約55重量%，而DHA的量係DHA與EPA總量之約35重量%至約71重量%。

在其他實施例中，該微生物油係包含ω-3多元不飽和脂肪酸，而該ω-3多元不飽和脂肪酸的DHA與EPA含量係約大於或等於ω-3多元不飽和脂肪酸總量之90重量%，其中EPA的量係DHA與EPA總量之約19重量%至約43重量%，而DHA的量係DHA與EPA總量之約35重量%至約47重量%。

在另一實施例中，該微生物油係包含ω-3多元不飽和脂肪酸，而該ω-3多元不飽和脂肪酸的DHA與EPA含量係約大於或等於ω-3多元不飽和脂肪酸總量之90重量%，其中EPA的量係DHA與EPA總量之約27重量%至約54重量%，而DHA的量係DHA與EPA總量之約36重量%至約63重量%。

在又一實施例中，該微生物油係包含ω-3多元不飽和脂肪酸，而該ω-3多元不飽和脂肪酸的DHA與EPA含量係約大於或等於ω-3多元不飽和脂肪酸總量之90重量%，其中EPA的量係DHA與EPA總量之約26重量%至約38重量%，而DHA的量係DHA與EPA總量之約52重量%至約64重量%。

在又一實施例中，該微生物油係包含ω-3多元不飽和脂肪酸，而該ω-3多元不飽和脂肪酸的DHA與EPA含量係約大於或等於ω-3多元不飽和脂肪酸總量之90重量%，而DPA n-3的量係ω-3多元不飽和脂肪酸總量之約0重量%至約10重量%，其中EPA的量係DHA與EPA總量之約19重量%至約55重量%，而DHA的量係DHA與EPA總量之約35重量%至約71重量%。

在又一實施例中，該微生物油係包含ω-3多元不飽和脂肪酸，而該ω-3多元不飽和脂肪酸的DHA與EPA含量係約大於或等於ω-3多元不飽和脂肪酸總量之90重量%，而DPA n-3的量係ω-3多元不飽和脂肪酸總量之約0重量%至約10重量%，其中EPA的量係DHA與EPA總量之約19重量%至約43重量%，而DHA的量係DHA與EPA總量之約35重量%至約47重量%。

在再一實施例中，該微生物油係包含ω-3多元不飽和脂肪酸，而該ω-3多元不飽和脂肪酸的DHA與EPA含量係約大於或等於ω-3多元不飽和脂肪酸總量之90重量%，而DPA n-3的量係ω-3多元不飽和脂肪酸總量之約0重量%至約10重量%，其中EPA的量係DHA與EPA總量之約27重量%至約54重量%，而DHA的量係DHA與EPA總量之約36重量%至約63重量%。

在另一實施例中，該微生物油係包含ω-3多元不飽和脂肪酸，而該ω-3多元不飽和脂肪酸的DHA與EPA含量係約大於或等於ω-3多元不飽和脂肪酸總量之90重量%，而DPA n-3的量係ω-3多元不飽和脂肪酸總量之約0重量%至約10重量%，其中EPA的量係DHA與EPA總量之約26重量%至約38重量%，而DHA的量係DHA與EPA總量之約52重量%至約64重量%。

在另一實施例中，該微生物油係包含ω-3多元不飽和脂肪酸，而該ω-3多元不飽和脂肪酸的DHA與EPA含量係約大於或等於ω-3多元不飽和脂肪酸總量之90重量%，而DPA n-3的量係ω-3多元不飽和脂肪酸總量之約0重量%至約10重量%，其中EPA的量係DHA與EPA總量之約28重量%至約36重量%，而DHA的量係DHA與EPA總量之約54重量%至約62重量%。

在又一實施例中，該微生物油係包含ω-3多元不飽和脂肪酸，而該ω-3多元不飽和脂肪酸的DHA與EPA含量係約大於或等於ω-3多元不飽和脂肪酸總量之90重量%而DPA n-3的量係ω-3多元不飽和脂肪酸總量之約0重量%至約2重量%，其中EPA的量係DHA與EPA總量之約10重量%至約25重量%，而DHA的量係DHA與EPA總量之約75重量%至約90重量%。

在一些實施例中，該微生物油在每克油中的ω-3多元不飽和脂肪酸總量係至少約400毫克。

在其他實施例中，該微生物油在每克油中的ω-3多元不飽和脂肪酸總量係至少約500毫克。

在又一些實施例中，該微生物油在每克油中的 ω-3多元不飽和脂肪酸總量係約400毫克至約750毫克。

在一些實施例中，該微生物油在每克油中包含約120毫克至約220毫克的EPA，及在每克油中包含約240毫克至約450毫克的DHA。

在其他實施例中，該微生物油在每克油中包含約130毫克至約195毫克的EPA，及在每克油中包含約320毫克至約480毫克的DHA。

在另一實施例中，該微生物油在每克油中包含約150毫克至約300毫克的EPA；在每克油中包含約200毫克至約400毫克的DHA；及在每克油中包含約0至約55毫克的DPA n-3。

在又一實施例中，該微生物油在每克油中包含約50毫克至約150毫克的EPA；在每克油中包含約410毫克至約540毫克的DHA；及在每克油中包含約0至約12毫克的DPA n-3。

在一些實施例中，該微生物油所包含之總ω-3多元不飽和脂肪酸中的EPA：DHA重量比例係1：1至1：30或1：1至1：3。

在一些實施例中，該微生物油所包含之總ω-3多元不飽和脂肪酸中的EPA：DHA重量比例係1：1至1：2.5。

在另一實施例中，該微生物油所包含之總ω-3多元不飽和脂肪酸中的EPA：DHA重量比例係1：4至1：7。

在一些實施例中，該微生物油所包含之總ω-3多元不飽和脂肪酸中的EPA：DHA重量比例係至少1：1、至少1：1.5、至少1：2、至少1：2.5、至少1：3或至少1：4。適宜範圍可選自該等數值之任一者之間，例如總ω-3多元不飽和脂肪酸中之EPA：DHA重量比例可為1：1至1：1.5、1：1至1：2、1：1.5至1：2、1：1至1：2.5、1：2至1：2.5及1：4至1：7。

在又一實施例中，該微生物油係由裂殖壺菌屬物種(Schizochytrium sp.)所產生。

本發明係有關於包含本發明的一種微生物、本發明之一種分離生質、本發明之一種微生物油或其組合物之組成物。

基於該組成物的需求，本發明之一種微生物、生質或微生物油可藉由任一已知技術而進一步進行化學或物理改質或加工處理。

在微生物細胞或生質用於一組成物中之前，可藉由包括但不限於冷凍乾燥、風乾、噴霧乾燥、隧道式乾燥、真空乾燥(冷凍真空乾燥)及一種類似製程之方法而加以乾燥。任擇地，所採集與清洗的生質未經乾燥即可直接用於一組成物中。如見第5,130,242號美國專利與第6,812,009號美國專利，其中各者在此併入本案以為參考資料。

可使用本發明的微生物油作為起始原料，以更有效率地生產富含一種脂肪酸諸如EPA之一產物。例如，本發明的微生物油可進行技藝中已知的各種純化技術，諸如蒸餾作用或尿素包合作用，以生產具有更高濃度的EPA或另一種脂肪酸之一種效能更高的產物。本發明的微生物油亦可用於化學反應中，以生產自該油中的脂肪酸所衍生之化合物，諸如EPA或另一種脂肪酸之酯類與鹽類。

本發明的一組成物可包括一或多種賦形劑。如在此所用之“賦形劑”，係指用於本發明的一組成物中以賦予該組成物所欲特性之一組分或組分混合物，該組成物包括食品以及藥學、化妝品及工業用組成物。本發明之一賦形劑當添加至一藥學組成物時，可被述為一種“藥學上可接受的”賦形劑，其係指在正確的醫學判斷範圍內，該賦形劑係適於與人類及非人類動物的組織接觸之一化合物、物質、組成物、鹽及/或劑型，及在所欲的接觸期間並無過度的毒性、刺激、過敏性反應或其他有問題的併發症及匹配一合理的效益/風險比。在一些實施例中，“藥學上可接受的”一詞，係指經聯邦或州政府的主管機關核准或在美國藥典或其他一般所認可的國際藥典中列為用於動物及特別是人類。可使用各種的賦形劑。在一些實施例中，該賦形劑可為但不限於鹼劑、安定劑、抗氧化劑、黏著劑、分離劑、塗佈劑、外相組分、控制釋出型組分、溶劑、表面活性劑、保濕劑、緩衝劑、填料、軟化劑或其組合物。除了在此所論及之該等賦形劑之外，還可包括列於但不受限於“雷明頓：藥劑學之科學與應用(Remington：The Science and Practice of Pharmacy)”乙書第21版(2005年)之賦形劑。在此將一賦形劑納入一特定類別(如“溶劑”)中，係意欲說明而非限制賦形劑的角色。一特定的賦形劑可歸屬於多個類別。

本發明的組成物包括但不限於食用產品、藥學組成物、化妝品及工業用組成物。

在一些實施例中，該組成物係一種食用產品。一種食用產品係供非人類動物或人類食用之任一食品，及包括固態與液態組成物。一種食用產品可為動物或人類食品中之一種添加劑。食品包括但不限於一般食品；液體產品包括乳類、飲料、治療用飲品及營養飲品；機能性食品；增補劑；保健食品；嬰兒奶粉，包括早產嬰兒用奶粉；供懷孕或哺乳婦女用之食品；成人食品；老人食品；及動物飼料。

在一些實施例中，本發明之一種微生物、生質或微生物油可直接使用作為下列一或多者或包括在其中作為一種添加劑：一種油、酥油、塗醬、其他脂肪成分、飲料、醬料、乳製或黃豆製食品(諸如乳、優酪乳、乳酪與冰淇淋)、一種烘焙物、一種營養品如作為一種營養增補劑(膠囊或錠劑形式)、一種維生素增補劑、一種膳食增補劑、一種粉狀飲品及一種粉狀食用產品之製品或半製品。在一些實施例中，該營養增補劑係一種素食用膠囊形式，及並非由動物來源的任一組分形成及亦不含有該等組分。

可包括本發明的一種微生物油之食品組成物的部份清單，係包括但不限於黃豆製產物(乳、冰淇淋、優酪乳、飲品、鮮乳油、塗醬、奶精)；湯與湯粉；麵糰、麵糊及烘培食品包括例如精緻糕點製品、早餐穀片、蛋糕、乳酪蛋糕、派、杯子蛋糕、餅乾、棒、麵包、捲、比司克麵包(biscuit)、鬆糕、糕餅、司康(scone)、脆麵包丁、脆餅乾、甜點、點心蛋糕、派、果諾力(granola)/點心棒及烘烤糕餅；糖果；硬質糖果甜點；巧克力與其他糖果甜點；口香糖；液態食用產品例如乳類、能量飲品、嬰兒奶粉、碳酸飲品、茶、液體膳食、果汁、水果製飲品、蔬菜製飲品；多種維生素糖漿、代用餐、藥用食品及糖漿；粉狀飲料配料；麵食；加工魚產品；加工肉產品；加工家禽產品；肉汁醬與醬料；調味料(番茄醬、美乃滋等)；植物油式塗醬；乳製品；優酪乳；奶油；冷凍乳製品；冰淇淋；冷凍甜點；霜凍優酪乳；半固態食用產品諸如嬰兒食品；布丁與明膠甜點；加工或未加工的乳酪；鬆餅配料；食物棒包括能量補給棒；華夫脆餅(waffle)配料；沙拉醬；代用蛋配料；堅果與堅果式塗醬；加鹽零食諸如洋芋片與其他脆片或脆物、玉米片、墨西哥玉米片、擠製零食、爆米花、捲條脆餅、炸馬鈴薯片及堅果；及特種零食諸如沾醬、乾果零食、肉類零食、豬皮、健康食物棒及米/玉米糕。

在一些實施例中，本發明之一種微生物油可用於增補嬰兒奶粉。可單獨以本發明的一種微生物油或組合自一種生產二十碳四烯酸(ARA)的微生物例如高山被孢黴(Mortierella alpina)或舒馬克氏孢黴(Mortierella sect.schmuckeri)所衍生之一種物理精製油，而增補嬰兒奶粉。任擇地，能以本發明的一種微生物油組合富含ARA的一種油，包括ARASCO®(美國馬里蘭州哥倫比亞的馬泰克生物科學(Martek Biosciences)公司)，而增補嬰兒奶粉。

在一些實施例中，該組成物係一種動物飼料。“動物”係包括屬於動物界之非人類生物體，及包括而不限於水生動物與陸生動物。“動物飼料”或“動物飼料”一詞係指預定供非人類動物用之任一食品，不論是用於魚類；經濟魚類；觀賞魚類；仔魚；二枚貝類；軟體動物；甲殼動物；貝介類；蝦；蝦苗；豐年蝦；輪蟲；鹵蟲；濾食性生物；兩棲動物；爬蟲類動物；哺乳類動物；家畜；農場動物；動物園動物；運動用動物；種畜；競賽用動物；表演用動物；傳承用動物；稀有或瀕臨絕種的動物；同伴動物；寵物諸如狗、貓、天竺鼠、兔、大鼠、小鼠或馬；靈長類動物諸如猴(如捲尾猴、恆河猴、非洲綠猴、赤猴、食蟹猴及草原猴)、猿、紅毛猩猩、狒狒、長臂猿及黑猩猩；犬科動物諸如狗與狼；貓科動物諸如貓、獅及虎；馬科動物諸如馬、驢及斑馬；供食用之動物諸如母牛、牛、豬與羊；有蹄動物諸如鹿與長頸鹿；或囓齒動物諸如小鼠、大鼠、倉鼠及天竺鼠等。動物飼料包括但不限於水產養殖用飼料、包括寵物飼料之家畜飼料、動物園動物飼料、役畜飼料、牲畜飼料及其組合。

在一些實施例中，該組成物係用於其肉或產物供人類食用的任一動物之一種飼料或飼料增補劑，諸如取其肉、蛋或乳供人類食用之任一動物。當餵食至該等動物時，營養素諸如LC-PUFA可被納入該等動物的肉、乳、蛋或其他產物中，以增加該等營養素的含量。

在一些實施例中，該組成物係一種噴霧乾燥式物質，其可碎裂形成供浮游動物、豐年蝦、輪蟲及濾食性生物食用的適合顆粒尺寸。在一些實施例中，餵食該組成物之浮游動物、豐年蝦或輪蟲，係進而用於餵食仔魚、魚、貝介類、二枚貝類或甲殼動物。

在一些實施例中，該組成物係一種藥學組成物。適宜的藥學組成物包括但不限於一種消炎組成物、用於治療冠狀動脈心臟病之一藥物、用於治療動脈硬化之一藥物、一種化學治療劑、一種活性賦形劑、一種骨質疏鬆症藥物、一種抗憂鬱藥物、一種抗痙攣藥物、一種抗幽門螺旋桿菌(Helicobacter pylori)藥物、用於治療神經退化性疾病之一藥物、用於治療肝臟退化性疾病之一藥物、一種抗生素、一種降膽固醇組成物及一種降三酸甘油酯組成物。在一些實施例中，該組成物係一種藥用食品。一藥用食品包括在醫師視導下服用或外部投藥之一組成物中的一食品及係預定用於一病況的膳食管理，而該病況的獨特營養需求係以公認的科學原理為基礎及藉由醫學評估而建立之。

在一些實施例中，可將微生物油配製於一劑型中。該劑型可包括但不限於包含一有效量的微生物油之錠劑、膠囊、扁囊劑、小丸劑、丸劑、散劑及顆粒劑；及非經腸劑型，其包括但不限於液劑、懸液劑、乳劑及乾粉劑。技藝中亦已知該等配方亦可含有藥學上可接受的稀釋劑、填料、崩散劑、黏合劑、潤滑劑、表面活性劑、疏水性載劑、水溶性載劑、乳化劑、緩衝液、保濕劑、增濕劑、助溶劑、防腐劑等。投藥形式可包括但不限於含有微生物油及一或多種適宜的藥學上可接受的載劑之錠劑、糖衣錠、膠囊、膠囊錠及丸劑。就口服而言，微生物油可與技藝中所熟知之藥學上可接受的載劑組合。該等載劑有助於將本發明的微生物油配製為錠劑、丸劑、糖衣錠、膠囊、液體、凝膠體、糖漿、漿劑、懸液劑等，以供待治療的一個體口服使用。在一些實施例中，該劑型係一錠劑、丸劑或膠囊錠。可藉由添加一種固態賦形劑而製得供口服使用的藥學製劑，選擇性地將所產生的混合物研磨，及在若為所欲的適宜助劑之添加作用後，加工處理顆粒劑的混合物，以製得錠劑或糖衣錠核心。適宜的賦形劑包括但不限於填料，諸如糖類，其包括但不限於乳糖、蔗糖、甘露糖醇及山梨糖醇；纖維素製劑諸如但不限於玉米澱粉、小麥澱粉、米澱粉、馬鈴薯澱粉、明膠、黃蓍膠、甲基纖維素、羥基丙基甲基纖維素、羧基甲基纖維素鈉及聚乙烯吡咯啶酮(PVP)。若為所欲者，可添加破碎劑，諸如但不限於交聯聚乙烯吡咯啶酮、洋菜或褐藻酸或其鹽類諸如褐藻酸鈉。可供口服使用的藥學製劑，包括但不限於由明膠製成的推合式膠囊以及由明膠與一種塑化劑諸如甘油或山梨糖醇製成的軟式密封膠囊。在一些實施例中，該劑型係一種素食用劑型，其中該劑型並非自動物來源的任一組分形成及亦不含有該等組分。在一些實施例中，該素食用劑型係一種素食用膠囊。

在一些實施例中，該口服劑型係一種素食用凝膠膠囊劑，其包含改質玉米澱粉、鹿角菜膠、甘油、山梨糖醇、純化水、β胡蘿蔔素及焦糖粉。

在一些實施例中，該口服劑型係與一油一起配製，而每克油中的DHA與EPA含量係約100毫克、約200毫克、約300毫克、約400毫克、約500毫克、約550毫克或約600毫克。

在一些實施例中，該口服劑型係與一油一起配製，而每克油中的DHA與EPA含量係約300毫克至約700毫克。

在另一實施例中，該口服劑型係與一油一起配製，而每克油中的DHA與EPA含量係約360毫克至約670毫克。

在一些實施例中，該凝膠膠囊劑可與一油一起配製，而每克油中的DHA與EPA總含量係100毫克、約200毫克、約300毫克、約400毫克、約500毫克、約550毫克或約600毫克。

在一些實施例中，該凝膠膠囊劑可與一油一起配製，而每克油中的DHA與EPA含量係約300毫克至約700毫克。

在另一實施例中，該凝膠膠囊劑可與一油一起配製，而每克油中的DHA與EPA含量係約360毫克至約670毫克。

在又一實施例中，每克油中的DHA與EPA總量係至少約400毫克。

在再一實施例中，每克油中的ω-3多元不飽和脂肪酸總量係至少約400毫克。

在又一實施例中，每克油中的DHA與EPA總量係約400毫克。

在再一實施例中，每克油中的DHA與EPA總量係至少約500毫克。

在再一實施例中，每克油中的ω-3多元不飽和脂肪酸總量係至少約500毫克。

在另一實施例中，每克油中的DHA與EPA總量係約500毫克。

在一些實施例中，該組成物係一種化妝品。化妝品包括但不限於乳液、乳霜、洗劑、面膜、肥皂、洗髮精、洗滌劑、面霜、潤髮乳、彩妝、沐浴劑及乳濁液。化妝品用劑可為藥用或非藥用。

在一些實施例中，該組成物係一種工業用組成物。在一些實施例中，該組成物係用於一或多種製品中之一種起始原料。一製品包括但不限於一種聚合物；一種攝影感光材料；一種清潔劑；一種工業用油；或一種工業用清潔劑。例如，第7,259,006號美國專利述及含DHA的脂肪與油在二十二酸的生產作用及使用二十二酸之攝影敏感性材料的生產作用之用途。

在一些實施例中，該組成物可用於治療人類或非人類動物中之一病況。在一些實施例中，該組成物可供人類或非人類動物的營養之用。

“治療”與“治療作用”等詞係指治療性治療與預防性或防止性措施，其中之目標係預防或減緩(減輕)一種非所欲的生理狀況、疾病或失調，或獲得有益或所欲的臨床結果。就本發明之目的而言，有益的或所欲的臨床結果包括但不限於減輕或消除與一病況、疾病或失調相關聯之症狀或徵象；降低一病況、疾病或失調之程度；穩定一病況、疾病或失調(亦即該病況、疾病或失調不再惡化)；延遲該病況、疾病或失調之初發或惡化；改善該病況、疾病或失調；緩解該病況、疾病或失調(不論部分或全面及不論可偵測或不可偵測)；或增進或改善一病況、疾病或失調。治療作用包括引發一臨床上顯著的反應，而無過度的副作用。治療作用亦包括延長存活，相較於未接受治療之預期存活時間而言。

在一些實施例中，該組成物係用於治療一病況、疾病或失調諸如青春痘、急性發炎、年齡相關性黃斑部病變、過敏症、阿滋海默氏(Alzheimer)症、關節炎、氣喘、動脈粥狀硬化、自體免疫疾病、血脂異常、乳房囊腫、惡病質、癌症、心臟血管再狹窄化、心血管疾病、慢性發炎、冠狀動脈心臟病、囊腫纖維症、肝臟之退化性疾患、糖尿病、濕疹、胃腸疾患、心臟病、高三酸甘油酯水平、高血壓、過動症、免疫疾病、抑制腫瘤生長、發炎性病症、腸胃疾病、腎功能障礙、白血病、重鬱症、多發性硬化症、神經退化性疾病、骨關節炎、骨質疏鬆症、過氧化體疾病、子癲前症、早產、牛皮癬、肺部疾病、類風濕性關節炎、心臟病風險或血栓症。

在一些實施例中，該組成物係用於增加第三孕期胎兒之妊娠期長度。

在一些實施例中，該組成物係用於控制血壓。

在一些實施例中，該組成物係用於增進或維護認知功能。

在一些實施例中，該組成物係用於增進或維護記憶力。

在一些實施例中，該組成物係用於維護心臟健康。

該組成物可藉由與該組成物或劑型相容的任一途徑或劑型投藥至一個體的體內。若一物質係由該個體導入個體的體內，或若該物質係由他人、一機器或一裝置導入個體的體內，則該物質係視為“投藥”。因此，“投藥”包括如自我投藥、由他人投藥及間接投藥作用。如在此參照“投藥作用”所用之“連續的”或“接連的”等詞，係指投藥頻率係至少每日一次。然而，應察知投藥頻率可高於每日一次及仍為“連續的”或“接連的”，如每日二次或甚至三次，只要未超過在此所指定的劑量水平即可。用於投藥之方式與方法係技藝中所知，及技術人員可參考各種的藥理學參考書以尋求導引。例如可查閱美國保健資訊(Informa Healthcare)出版公司之由Banker與Rhodes所著的“現代藥劑學(Modern Pharmaceutics)”乙書第4版(2002年)；及美國紐約的麥格羅-希爾(McGraw-Hill)有限公司之“古德曼與吉爾曼之治療學的藥學基礎(Goodman & Gilman’s The Pharmaceutical Basis of Therapeutics)”乙書第10版(2001年)。

“個體(subject)”、“個體(individual)”或“病患”，係指人類或非人類之任一個體，而診斷、預後、療法或組成物的投藥作用或劑型係其等所欲者。哺乳類動物個體包括但不限於人類；家畜；農場動物；動物園動物；運動用動物；寵物諸如狗、貓、天竺鼠、兔、大鼠、小鼠或馬；靈長類動物諸如猴(如捲尾猴、恆河猴、非洲綠猴、赤猴、食蟹猴及草原猴)、猿、紅毛猩猩、狒狒、長臂猿及黑猩猩；犬科動物諸如狗與狼；貓科動物諸如貓、獅及虎；馬科動物諸如馬、驢及斑馬；供食用之動物諸如母牛、牛、豬與羊；有蹄動物諸如鹿與長頸鹿；囓齒動物諸如小鼠、大鼠、倉鼠及天竺鼠等。個體一詞亦涵蓋模式動物，如疾病模式動物。在一些實施例中，個體一詞包括在經濟上或其他方面有價值的動物，如經濟上重要的種畜、競賽用動物、展示用動物、傳承用動物、稀有或瀕臨絕種的動物或同伴動物。在特定的實施例中，該個體係一人類個體。在特定的實施例中，該個體係一非人類個體。

該組成物可依一“營養量”、一“治療有效量”、一“預防有效量”、一“治療性劑量”或一“預防性劑量”投藥。一“營養量”係指在所需的劑量與時間長度有效達成一所欲的營養結果之一量。一營養結果可為如一個體所欲的脂肪酸組分水平之增加。一“治療有效量”或“治療性劑量”係指在所需的劑量與時間長度有效達成一所欲的治療結果之一量。一治療結果可為如減輕症狀、延長存活、改善活動性等。一治療結果不必定為“治癒”。一“預防有效量”或“預防性劑量”係指在所需的劑量與時間長度有效達成所欲的預防結果之一量。典型地，因一預防性劑量係在疾病之前或在較早期階段用於一個體中，一預防有效量將低於用於治療晚期疾病之一治療有效量。

可基於待投藥至一個體之該微生物、生質或微生物油的EPA或其他脂肪酸組分的量，而將該組成物的各種劑量、劑型或藥學組成物投藥至該個體。“每日劑量”、“每日劑量水平”及“每日給藥量”等詞，在此係指每日(每24小時期間)投予的EPA或其他脂肪酸組分之總量。因此，例如，以2毫克的每日劑量將EPA投藥至一個體，係指該個體每日領受總共2毫克的EPA，不論EPA係以一個包含2毫克EPA的單一劑型投藥，或任擇地以各包含0.5毫克EPA的四個劑型(總共為2毫克EPA)投藥。在一些實施例中，每日的EPA量係以一個單一劑型或以二個劑型投藥。可單次服用或分多次服用本發明之劑型。例如，若每日服用四個錠劑，各錠劑包含0.5毫克的EPA，則可每日一次服用所有四個錠劑，或每日二次各服用2個錠劑，或每6小時服用1個錠劑。在一些實施例中，每日劑量係約100毫克至約15克的EPA。在一些實施例中，每日劑量係約0.5毫克至約250毫克、約100毫克至約250毫克、約100毫克至約500毫克、約100毫克至約1克、約1克至約2.5克、約1克至約5克、約1克至約10克、約1克至約15克、約5克至約10克、約5克至約15克、約10克至約15克、約100毫克至約10克、約100毫克至約5克或約100毫克至約2.5克的EPA、DHA或其組合物。在一些實施例中，該組成物係每個劑型包含約0.5毫克至約250毫克、100毫克至約250毫克、約0.5毫克至約500毫克、約100毫克至約500毫克、約0.5毫克至約1克或約100毫克至約1克的EPA、DHA 或其組合物之一種劑型。

可使用各種方式，達成本發明的組成物或劑型之投藥作用。例如，在一些實施例中，接連地每日進行投藥，或任擇地隔日進行投藥(每二日一次)。投藥作用可在一或多日進行。

組成物與劑型之投藥作用可與用於治療該病況的其他方法組合。例如，本發明的方法可組合飲食療法(如低碳水化合物飲食、高蛋白質飲食、高纖維飲食等)、運動療法、減重療法、戒煙療法或其組合。本發明的方法亦可與治療該病況的其他藥學產物組合使用。本發明的組成物或劑型可在其他療法或藥學產物之前或之後投藥。

本發明係有關於含有一或多個單位之本發明的一組成物之套組或包裝。該套組或包裝可包括一種含有本發明的微生物、生質或微生物油或其組合物之食用產品、藥學組成物、化妝品或工業用組成物單元。該套組或包裝亦可包括一種包含本發明的微生物、生質或微生物油或其組合物之添加劑，其係用於製備一種食品、化妝品、藥學組成物或工業用組成物。

在一些實施例中，該套組或包裝含有待依據本發明的方法投藥之一或多個單位的一種藥學組成物。該套組或包裝可含有一劑量單位或超過一劑量單位(亦即多個劑量單位)。若在該套組或包裝中具有多個劑量單位，則可選擇性地配置該多個劑量單位以供循序投藥之用。

本發明的套組可選擇性地包含與該套組的單位或劑型相關之說明。該等說明可為管理藥學產品的製造、使用或銷售之政府機關所指定之形式，該通知亦反映該機關核准其製造、使用或銷售以供投藥至人類治療一病況或疾患。該說明可為傳遞依據本發明的方法使用該套組中的單位或劑型之相關資訊之任一形式。例如，該等說明可為印刷品之形式，或為一種預錄的媒體裝置之形式。

在檢查一病患之期間，醫學專業人員可判定施用本發明的方法中之一者係適於該病患，或醫師可判定藉由施用本發明的方法中之一者可改善病患的狀況。在指定任一療法之前，醫師可就例如與該療法相關聯的各種風險與效益方面輔導病患。可對病患全盤揭露與該療法相關聯的所有已知與疑似風險。該項輔導能以口頭方式以及以書面方式提供。在一些實施例中，醫師可提供病患有關該療法的文獻資料，諸如產品資訊、教育材料等。

本發明係有關於教育消費者有關該等治療方法之方法，該方法包括在銷售點分發該劑型與消費者資訊。在一些實施例中，係在具有藥劑師或健康照護提供者之銷售點進行分發。

“消費者資訊”一詞可包括但不限於英語本文、非英語本文、視覺圖像、圖表、電話錄音、網站及與現場消費者服務代表聯絡之方式。在一些實施例中，消費者資訊將提供有關依據本發明的方法使用該等劑型、適當的使用年齡、適應症、禁忌、適當的劑量、警語、電話號碼或網址之說明。在一些實施例中，該方法進一步包括提供專業資訊給相關人員，該等人員係負責回答消費者有關依據本發明方法使用所揭露療法之問題。“專業資訊”一詞包括但不限於有關依據本發明方法投藥的療法之資訊，其設計有助於醫學專業人員回答消費者的問題。

“醫學專業人員”包括例如醫師、醫師助理、護士、執業護理師、藥劑師及消費者服務代表。

在整體地說明本發明之後，可藉由參考在此提供之實例而獲得進一步的瞭解。該等實例僅為了說明之目的，及並非意欲作為限制。

第1例 微生物之分離

在低潮期間，自包括沿著北美洲西海岸(加州、俄勒崗州及華盛頓州)及夏威夷的海灣與潮口之潮間棲息地收集試樣。將水、沈積物、活的植物物質及腐敗的植物/動物碎屑置於無菌的50毫升管中。將各試樣的一部分以及水塗抹在分離用培養基之固態洋菜平皿上。分離用培養基包含：500毫升的人工海水、500毫升的蒸餾水、1克的葡萄糖、1克的甘油、13克的洋菜、1克的麩胺酸鹽、0.5克的酵母萃取物、0.5克酪蛋白水解物、1毫升的維生素溶液(100毫克/公升的硫胺素、0.5毫克/公升的生物素、0.5毫克的B₁₂)、1毫升的微量礦物質溶液(每公升含有6.0克FeCl₃6H₂O、6.84克H₃BO₃、0.86克MnCl₂4H₂O、0.06克ZnCl₂、0.026CoCl₂6H₂0、0.052克NiSO₄H₂O、0.002克CuSO₄5H₂O及0.005克Na₂MoO₄2H₂O之PII金屬)及各500毫克的盤尼西林G與硫酸鏈黴素。洋菜平皿於20至25℃的黑暗中培養。在2至4日後，在放大後檢視洋菜平皿，以無菌的牙籤挑取細胞菌落及再畫線接種在新的培養基平皿上。將細胞重複地畫線接種在新的培養基上直至移除受污染的生物體為止。分離微生物中之二種係寄存在ATCC登錄號PTA-10212與PTA-10208。

在ATCC登錄號PTA-10212所寄存的分離微生物之分類特徵

在ATCC登錄號PTA-10212所寄存的分離微生物(“PTA-10212”)之培養呈現為白色、濕的塗抹菌落形式，而無可見的分離孢子囊群。

在固態與液態FFM、固態KMV、KMV泥(1%)、KMV肉汁及MH肉汁中培養PTA-10212，以進一步檢視生長特性。觀察到PTA-10212在KMV與MH生長快速。如見美國波士頓的瓊斯與巴雷特(Jones and Bartlett)出版社之Margulis,L.、Corliss,J.O.、Melkonian,M.、Chapman，D.J.(編輯)之“原生生物界手冊(Handbook of Protoctista)”乙書第388-398頁之Porter D.於1989年的“網黏菌門(Phylum Labyrinthulomycota)”乙文(KMV)；Honda等人於期刊“Mycol.Res.”第102期第439-448頁乙文(1998年)(MH)；及第5,130,242號美國專利(FFM)，其中各者在此完整地併入本案以為參考資料。

PTA-10212在固態FFM培養基生長數日之後、在KMV培養基與MH肉汁中生長72小時之後，進行下列觀察。孢子囊並未群集在任一培養基之中或之上，及孢子囊非常地小(5至10微米)。PTA-10212並未展現裂殖壺菌屬(Schizochytrium)分裂型所特有之大量的四分子。在轉移至新的固態培養基約24小時之後，出現變形蟲狀細胞。該等變形蟲狀細胞在數日之後消失，及在液態或泥狀培養基中不明顯。不同於Yokoyama,R.等人於期刊“Mycoscience”第48(6)期第329-341頁乙文(2007年)所述之當生長於液態培養基時具有“位於燒瓶底部的小型沙粒”外觀之Aurantiochytrium，PTA-10212並不沉降至燒瓶底部而是懸浮於KMV與MH液態培養基中。孢子囊的稠密度係不如裂殖壺菌屬(Schizochytrium)或Oligochytrium典型所具有者，其等亦具有PTA-10212中所缺乏之強健的外質網絡。當大部分的物種在數小時期間藉由較大型孢子囊的分裂而進行小孢子囊或同化細胞之營養分裂時，PTA-10212形成啞鈴狀的拉長型同化細胞，其然後形成一薄的峽部及當啞鈴的終端分開時被拉斷。所產生的細胞似乎是小型同化細胞。未觀察到一變形蟲狀細胞直接轉形成為啞鈴狀的同化細胞。觀察到典型的二鞭毛遊走孢子游動，但相當地少。PTA-10212並無繁殖力，其藉由營養分裂而分裂。雖然觀察到遊走孢子游動，但未觀察到直接釋出遊走孢子。營養細胞係非常小(2微米至5微米)。

使用流通技術進一步檢視PTA-10212，其中藉由將一小部分之生長於洋菜的生長菌落懸浮於一滴的半強度海水中而製備載玻片。藉由該技術，觀察到初生孢子囊為球狀及直徑約10微米。壁非常薄，及當原生質體的均體分裂起始時並未觀察到殘跡。重複的均體分裂產生8至16個較小(直徑4至5微米)的次生孢子囊。次生孢子囊維持靜息達數小時，然後再度釋出一種無定形的原生質體。無定形原生質體藉由收聚與牽引作用分裂，最初產生典型的啞鈴狀中間階段，及最後產生4至8個直徑2.5至2.8微米的小型球體。後者休止數分鐘至1至2小時，然後改變形狀(拉長)及變成二鞭毛的遊走孢子，2.3至2.5 x 3.7至3.9微米。遊走孢子的數量眾多，及當其等休止時可精確測量。遊走孢子然後圓滿完成及開始一個新的發育週期。遊走孢子係比Sicyoidochytrium minutum大及比威瑟氏吾肯氏壺菌(Ulkenia visurgensis)小。

以其18s rRNA基因與已知物種的相似性為基礎，進一步分析PTA-10212的特性。藉由標準程序，自PTA-10212製備基因體DNA。如見美國紐約冷泉港(Cold Spring Harbor)之冷泉港實驗室出版(Cold Spring Harbor Laboratory Press)公司於2001年出版之Sambrook J.與Russell D.的“分子選殖：實驗室手冊”(Molecular Cloning：A Laboratory Manual)乙書第三版。簡述為：(1)將來自對數中期培養的500微升細胞離心。將細胞再度離心，及以小孔徑的管頭自細胞片狀沉澱物移除所有的水；(2)將片狀沉澱物再懸浮於200微升的分解緩衝液(20 mM Tris pH 8.0、125微克/毫升的蛋白酶K、50 mM氯化鈉、10 mM EDTA pH 8.0、0.5% SDS)中；(3)細胞在50℃進行分解1小時；(4)將分解作用混合物量吸至2毫升的鎖相凝膠管(PLG-Eppendorf)中；(5) 添加等體積的P：C：I及讓其混合1.5小時；(6)該管於12,000 x g離心5分鐘；(7)自PLG管內將凝膠上方的含水相移除，及在含水相中添加等體積的氯仿，及混合30分鐘；(8)該管於14,000 x g離心約5分鐘；(9)自氯仿將頂層(含水相)吸出，及置於一個新的管中；(10)添加0.1體積的3M NaOAC及加以混合(倒置數次)；(11)添加2體積的100%乙醇及加以混合(倒置數次)，而基因體DNA沉澱物在本時期形成；(12)在微量離心機中，該管於4℃及14,000 x g離心約15分鐘；(13)將液體平緩地倒除，及基因體DNA剩餘在該管的底部；(14)以0.5毫升的70%乙醇清洗片狀沉澱物；(15)在微量離心機中，該管於4℃及14,000 x g離心約5分鐘；(16)將乙醇平緩地倒除，及乾燥基因體DNA的片狀沉澱物；及(17)在基因體DNA的片狀沉澱物中直接添加一適宜體積的水與核糖核酸酶。以先前所述的引子(Honda等人於期刊“J.Euk.Micro.”第46(6)期第637-647頁乙文(1999年)進行18s rRNA基因之聚合酶鏈反應擴增作用。用於染色體DNA模板之聚合酶鏈反應條件如下：位於50微升的總體積中之0.2 μM dNTP、0.1 μM的各引子、8% DMSO、200奈克的染色體DNA、2.5 U Herculase®II融合DNA聚合酶(史崔塔基因(Stratagene)公司)及Herculase®緩衝液(史崔塔基因(Stratagene)公司)。聚合酶鏈反應的操作程序包括下列步驟：(1)95℃達2分鐘；(2)95℃達35秒；(3)55℃達35秒；(4)72℃達1分鐘又30秒；(5)重複步驟2至4達30個循環；(6)72℃達5分鐘；及(7)保持在4℃。

聚合酶鏈反應擴增作用使用上述的染色體模板而產生具有預期大小之一種獨特的DNA產物。依據廠商之說明書，將聚合酶鏈反應產物植入載體pJET1.2/平整(弗曼塔斯(Fermentas)公司)中，及使用所提供之標準引子測定插入序列。

系譜分析在中等的證明之下，將PTA-10212置於包括厚皮破囊壺菌屬(Thraustochytrium pachydermum)與聚合破囊壺菌(Thraustochytrium aggregatum)之譜系內。厚皮破囊壺菌屬(T.pachydermum)的孢子囊具有非常厚的細胞壁。聚合破囊壺菌(T.aggregatum)形成明顯可見的不透明孢子囊群之群集。PTA-10212並未顯示該等特性中之任一者。在其他分類群諸如吾肯氏壺菌屬(Ulkenia)、T.gaertnerium、A.limiacinum及紅樹林裂殖壺菌(S.mangrovei)中，曾述及存在眾多的變形蟲狀細胞；然而，與該等分類群相關聯之敘述說明，係與分離微生物所觀察到的特性不同。此外，PTA-10212並未顯現對於該等分類群中任一者之系譜親和性。

第3表顯示來自在ATCC登錄號PTA-10212所寄存微生物之18s rRNA序列與國家生物科技資訊中心(National Center for Biotechnology Information)(NCBI)電子資料庫中的DNA序列之比較。使用二種不同的計算，測定一致性百分比。“計算#1”將出現在序列中之來自非同源區域或部份序列的任一“間隔”納入考量(AlignX-載體NTI預設設定)。“計算#2”並不包括間隔之計算罰分(AlignX-載體NTI“一致性”矩陣設定)。

如第3表所示，發現就一致性%而言，來自在ATCC登錄號PTA-10212所寄存微生物之18s rRNA基因序列(序列辨識編號1)，係與NCBI資料庫可取得之18s rRNA基因序列相近，雖然並非一致。一般認為在生物體屬於不同的屬或種之際，仍可具有非常相近的18s rRNA基因序列。

基於上述的特性分析，在ATCC登錄號PTA-10212所寄存之分離微生物據信代表一種新的破囊壺菌屬(Thraustochytrium)物種，及因此亦命名為破囊壺菌屬物種(Thraustochytrium sp.)ATCCPTA-10212。

在ATCC登錄號PTA-10208所寄存的分離微生物之分類特徵

在ATCC登錄號PTA-10208所寄存的微生物(“PTA-10208”)，係經認定為在ATCC登錄號PTA-9695所寄存微生物(“PTA-9695”)之一種亞分離株(自一培養分離出之一個別細胞及保有一種分離與獨特的培養株形式)， “PTA-9695”係述於第12/407,687號美國專利申請案與PCT/US2009/001720，其中各者在此完整地併入本案以為參考資料。

PTA-10208具有PTA-9695的分類特徵。發現PTA-9695在釋出時具有活躍地游動離開成熟孢子囊之二鞭毛遊走孢子，其壁殘跡在釋出孢子之後仍清楚可見(在位相差)。測得PTA-9695孢子囊的直徑為12.5微米至25微米，而遊走孢子的尺寸為2.5微米至2.8微米x4.5微米至4.8微米。每個PTA-9695孢子囊具有8至24個孢子。穩定後的PTA-9695遊走孢子增大，及迅速進行均體分裂而形成四分體、八分體，及最後形成孢子囊聚簇。四分體形成作用係在孢子囊成熟前之非常早期的階段開始。該等特性係與裂殖壺菌屬(Schizochytrium)相符。就一致性%而言，發現PTA-10208亦具有PTA-9695的18s rRNA基因序列(序列辨識編號2)，其係與Honda等人於期刊“J.Euk.Micro.”第46(6)期第637-647頁乙文(1999年)中所提供之聚合破囊壺菌(T.aggregatum)的18s rRNA基因序列非常相近的，雖然並非一致。所發表之聚合破囊壺菌(Thraustochytrium aggregatum)的18s rRNA序列係一種部份序列，在序列中間具有約71個DNA核苷酸之一個間隔。PTA-9695據信代表一種新的裂殖壺菌屬(Schizochytrium)物種。因此，亞分離株PTA-10208亦命名為裂殖壺菌屬物種(Schizochytrium sp.)ATCCPTA-10208。

第2例 在ATCC登錄號PTA-10212所寄存的分離微生物之生長特性

在如後述的個別發酵操作中，檢視在ATCC登錄號PTA-10212所寄存的分離微生物之生長特性。典型的培養基與培養條件係示於第1表。

在添加碳(甘油)與氮之具有1000 ppm的氯離子與20%溶氧之22.5℃與pH 7.3的培養中，PTA-10212在體積為10公升的發酵槽中培養138小時之後，產生26.2克/公升的細胞乾重。脂質產率為7.9克/公升；ω-3產率為5.3克/公升；EPA產率為3.3克/公升；及DHA產率為1.8克/公升。脂肪酸含量為30.3重量%；EPA含量為41.4%的脂肪酸甲基酯類(FAME)；及DHA含量為26.2%的FAME。脂質生產力為1.38克/公升/日，及在該等條件下之ω-3生產力為0.92克/公升/日，而EPA生產力為0.57克/公升/日及DHA生產力為0.31克/公升/日。

在添加碳(甘油)與氮之具有1000 ppm的氯離子與20%溶氧之22.5℃與pH 7.3的培養中，PTA-10212在體積為10公升的發酵槽中培養189小時之後，產生38.4克/公升的細胞乾重。脂質產率為18克/公升；ω-3產率為12克/公升；EPA產率為5克/公升；及DHA產率為6.8克/公升。脂肪酸含量為45重量%；EPA含量為27.8%的FAME；及DHA含量為37.9%的FAME。脂質生產力為2.3克/公升/日，及在該等條件下之ω-3生產力為1.5克/公升/日，EPA生產力為0.63克/公升/日及DHA生產力為0.86克/公升/日。

在添加碳(甘油)與氮之具有1000 ppm的氯離子與20%溶氧之22.5℃與pH 6.8-7.7的培養中，PTA-10212在體積為10公升的發酵槽中培養189小時之後，產生13克/公升的細胞乾重。脂質產率為5.6克/公升；ω-3產率為3.5克/公升；EPA產率為1.55克/公升；及DHA產率為1.9克/公升。脂肪酸含量為38重量%；EPA含量為29.5%的FAME；及DHA含量為36%的FAME。脂質生產力為0.67克/公升/日，及在該等條件下之ω-3生產力為0.4克/公升/日，EPA生產力為0.20克/公升/日及DHA生產力為0.24克/公升/日。

在添加碳(甘油)與氮之具有1000 ppm的氯離子與20%溶氧之22.5至28.5℃與pH 6.6-7.2的培養中，PTA-10212在體積為10公升的發酵槽中培養191小時之後，產生36.7克/公升至48.7克/公升的細胞乾重。脂質產率為15.2克/公升至25.3克/公升；ω-3產率為9.3克/公升至13.8克/公升；EPA產率為2.5克/公升至3.3克/公升；及DHA產率為5.8克/公升至11克/公升。脂肪酸含量為42.4%至53重量%；EPA含量為9.8%至22%的FAME；及DHA含量為38.1%至43.6%的FAME。脂質生產力為1.9克/公升/日至3.2克/公升/日，及在該等條件下之ω-3生產力為1.2克/公升/日至1.7克/公升/日，EPA生產力為0.31克/公升/日至0.41克/公升/日及DHA生產力為0.72克/公升/日至1.4克/公升/日。

在ATCC登錄號PTA-10208所寄存的分離微生物之生長特性

在如後述的個別發酵操作中，檢視在ATCC登錄號PTA-10208所寄存的分離微生物之生長特性。典型的培養基與培養條件係示於第2表。

在添加碳(葡萄糖)與氮之具有1000 ppm的氯離子及氮進料期間的20%溶氧與之後的10%溶氧之22.5℃與pH 7.0的培養中，PTA-10208在體積為10公升的發酵槽中培養200小時之後，產生95克/公升的細胞乾重。脂質產率為53.7克/公升；ω-3產率為37克/公升；EPA產率為14.3克/公升；及DHA產率為21克/公升。脂肪酸含量為57重量%；EPA含量為27.7%的FAME；及DHA含量為39.1%的FAME。脂質生產力為6.4克/公升/日，及在該等條件下之ω-3生產力為4.4克/公升/日，EPA生產力為1.7克/公升/日及DHA生產力為2.5克/公升/日。

在添加碳(葡萄糖)與氮之具有1000 ppm的氯離子及氮進料期間的20%溶氧與之後的10%溶氧之22.5℃與pH 7.5的培養中，PTA-10208在體積為10公升的發酵槽中培養139小時之後，產生56克/公升的細胞乾重。脂質產率為53克/公升；ω-3產率為34克/公升；EPA產率為11.5克/公升；及DHA產率為22克/公升。脂肪酸含量為58重量%；EPA含量為21.7%的FAME；及DHA含量為41.7%的FAME。脂質生產力為9.2克/公升/日，及在該等條件下之ω-3生產力為5.9克/公升/日，EPA生產力為2克/公升/日及DHA生產力為3.8克/公升/日。

在添加碳(葡萄糖)與氮之具有1000 ppm的氯離子及氮進料期間的20%溶氧與之後的10%溶氧之22.5℃與pH 7.0的培養中，PTA-10208在體積為2000公升的發酵槽中培養167小時之後，產生93.8克/公升的細胞乾重。脂質產率為47.2克/公升；ω-3產率為33.1克/公升；EPA產率為10.5克/ 公升；及DHA產率為20.4克/公升。脂肪酸含量為50.6重量%；EPA含量為23%的FAME；及DHA含量為42.6%的FAME。脂質生產力為6.8克/公升/日，及在該等條件下之ω-3生產力為4.7克/公升/日，EPA生產力為1.5克/公升/日及DHA生產力為2.9克/公升/日。

添加碳(葡萄糖)與氮之具有1000 ppm的氯離子及氮進料期間的20%溶氧與之後的10%溶氧之22.5℃與pH 7.0的培養中，PTA-10208在體積為2000公升的發酵槽中培養168小時之後，產生105克/公升的細胞乾重。脂質產率為46.4克/公升；ω-3產率為33克/公升；EPA產率為10.7克/公升；及DHA產率為20.3克/公升。脂肪酸含量為43.9重量%；EPA含量為24%的FAME；及DHA含量為43.7%的FAME。脂質生產力為6.6克/公升/日，及在該等條件下之ω-3生產力為4.7克/公升/日，EPA生產力為1.5克/公升/日及DHA生產力為2.9克/公升/日。

在添加碳(葡萄糖)與氮之具有1000 ppm的氯離子及氮進料期間的20%溶氧與之後的10%溶氧之22.5℃與pH 7.0的培養中，PTA-10208在體積為2000公升的發酵槽中培養168小時之後，產生64.8克/公升的細胞乾重。脂質產率為38.7克/公升；ω-3產率為29.9克/公升；EPA產率為8.5克/公升；及DHA產率為16.7克/公升。脂肪酸含量為59.6重量%；EPA含量為23%的FAME；及DHA含量為42.3%的FAME。脂質生產力為5.53克/公升/日，及在該等條件下之ω-3生產力為3.8克/公升/日，EPA生產力為1.2克/公升/日及 DHA生產力為2.3克/公升/日。

第3例 微生物菌株ATCC PTA-10208與PTA-10212之脂肪酸廓型

藉由溶劑萃取作用分析四個生質試樣(PTA-10208試樣#1；PTA-10208試樣#2；PTA-10212試樣#1；及PTA-10212試樣#2)的總粗製油含量，藉由高性能液相層析法/蒸發光散射檢測作用(HPLC/ELSD)測定脂質種類，藉由HPLC/質譜法(HPLC/MS)分析三醯甘油(TAG)，及藉由具有火焰離子化偵檢作用的氣相層析法(GC-FID)測定脂肪酸(FA)廓型。藉由使用己烷的溶劑研磨作用測定各冷凍乾燥生質的粗脂質含量，及與藉由直接轉酯化作用所產生的FAME總量(毫克/克)相比較，及藉由GC/FID分析將所產生的脂肪酸甲基酯類(FAME)量化。亦藉由轉酯化作用將所萃取的粗脂質中之脂肪酸量化，及使用GC/FID分析將所產生的FAME量化。使用具有ELSD與大氣壓力化學離子化-MS(APCI-MS)鑑定之正相HPLC，測定所萃取的粗脂質中之所有中性脂質(NL)與游離脂肪酸(FFA)的重量百分比。該方法分離與量化固醇酯(SE)、TAG、游離脂肪酸(FFA)、1,3-二醯甘油(1,3-DAG)、固醇、1,2-二醯甘油(1,2-DAG)及單醯甘油(MAG)。結果係示於下列第4與5表。

自四個生質試樣(PTA-10208試樣#1；PTA-10208試樣#2；PTA-10212試樣#1；及PTA-10212試樣#2)所萃取的粗製油中分離出TAG與磷脂(PL)。使用低壓急驟層析法分離TAG，及使用固相萃取作用(SPE)分離PL。藉由薄層層析法(TLC)確認各分離部分的身分。依循使用GC-FID的直接轉酯化作用，測定所分離出的TAG與PL部分之FAME形式的脂肪酸廓型。結果係示於下列第6與7表。

亦在來自微生物菌株ATCCPTA-10212之二個附加的生質試樣(PTA-10212試樣#3與PTA-10212試樣#4)，測定所分離出的脂質種類之總粗製油含量與脂肪酸廓型。藉由己烷萃取作用自各試樣製得粗製油，及使用低壓急驟層析法分離個別的脂質種類。使用GC-FID，測定生質、粗製油及分離部分之FAME形式的脂肪酸廓型。結果係示於下列第8至11表。

自先前使用FRIOLEX®方法所萃取之來自微生物菌株ATCCPTA-10212的一粗製油試樣(PTA-10212試樣#5)，分離個別的脂質種類，及使用GC-FID測定各種類之FAME形式的脂肪酸廓型。結果係示於下列第12與13表。

使用具有ELSD與APCI-MS鑑定之正相HPLC，自微生物菌株ATCCPTA-10208的一粗製油試樣(PTA-10208試樣#3)，分離個別的脂質種類。

實驗程序

粗製油萃取作用-使用溶劑研磨作用，自冷凍乾燥的生質試樣，萃取粗製油。例如，將約3克的生質稱重置入一瑞典式管中。在瑞典式管中添加3個滾珠軸承與30毫升的己烷，以氯丁二烯橡膠塞密封該管及置於振盪器中2小時。使用布赫納(Buchner)漏斗與惠特曼(Whatman)濾紙，將所產生的漿料過濾。收集過濾後的液體，在真空中移除溶劑，及以重量分析方式測定剩餘粗脂質的量。

脂肪酸分析-針對生質、所萃取的粗脂質及分離出的脂質種類之試樣分析FAME形式的脂肪酸組成。簡言之，將冷凍乾燥的生質與分離出的脂質種類直接稱重置入一螺旋蓋試管中，同時將粗製油的試樣溶於己烷中而得約2毫克/毫升的濃度。在各管中添加含有內標準的甲苯及位於甲醇中的1.5 N鹽酸。該等管進行渦漩，然後加蓋及加熱至100℃達2小時。然後讓該等管冷卻，及添加位於水中的飽和氯化鈉。該等管再度進行渦漩，及離心而使得各層分離。然後將一部分的有機層置入一個GC小瓶中，及藉由GC-FID分析。藉由使用Nu-Check-Prep GLC參考標準(美國明尼蘇達州伊利森(Elysian)的努伽克(NuCheck)公司)所產生的三點校正曲線，而量化FAME。存在於萃取物中的脂肪酸係以毫克/克的形式及以重量百分比的形式表示。假設藉由GC-FID分析時之反應係與內標準相當，而估算試樣中的脂肪含量。

HPLC/ELSD/MS方法-

固相萃取作用-使用置於一個Vac Elut裝置(美國加州帕洛阿爾托(Palo Alto)的瓦里安(Varian)公司)中之2克的胺丙基匣(瑞典烏普薩拉(Uppsala)的百特基(Biotage)公司)，藉由固相萃取作用(SPE)自粗脂質分離PL部分。以15毫升的己烷調節該匣，及將約60毫克的各試樣溶於1毫升的三氯甲烷及施用至該匣。以15毫升之2：1的三氯甲烷：異丙醇清洗該管柱，以洗提所有的中性脂質，及予以棄置。然後以15毫升之位於乙醚中的2%乙酸(HOAc)洗提脂肪酸，及予以棄置。以15毫升之6：1的甲醇：氯仿洗提PL部分，將其收集、在氮氣下乾燥及加以稱重。

急驟層析法-使用急驟層析法分離存在於粗製油中之脂質種類。將溶於己烷中之約200毫克的粗製油注入至管柱頂部。該層析法系統係採用矽膠(Silica Gel)60(美國紐澤西州吉布斯敦(Gibbstown)的EMD化學公司)，及移動相係由5毫升/分鐘(第6至7表)或3毫升/分鐘(第8至13表)的石油醚與乙酸乙酯所組成。使用一分階梯度，以選擇性地自該管柱洗提各脂質種類。該移動相梯度係自100%石油醚開始及以50%乙酸乙酯終結。使用一種吉爾森(Gilson)FC 204大床式分液收集器(美國威斯康辛州米德頓(Middleton)的吉爾森(Gilson)有限公司)，在10毫升試管中收集分液。藉由薄層層析法(TLC)分析各管，及將含有個別脂質種類的該等管(如藉由TLC板上之具有預期滯留因子(Rf)的單一點所判定)匯集、濃縮至乾及加以稱重。然後以重量分析方式測定總分液含量。

TLC分析-在矽膠板上進行薄層層析法。使用由石油醚：乙醚：乙酸(80：20：1)所組成之一溶劑系統洗提該等板，及使用碘蒸氣顯現。然後將各點的Rf值與文獻所報導的各脂質種類之數值相比較。

TAG與PL部分之分析-分析所分離出的TAG與PL部分之脂肪酸甲基酯(FAME)形式的脂肪酸組成。將TAG部分溶於己烷，而得約1至2毫克/毫升的濃度。在氮氣下，將溶液的1毫升等分試樣濃縮至乾。在各管中添加含有內標準的甲苯及位於甲醇中的1.5N鹽酸。該等管進行渦漩，然後加蓋及加熱至100℃達2小時。在含有PL部分的該等管中直接添加內標準與鹽酸甲醇，及予以加熱。然後讓該等管冷卻，及添加位於水中的飽和氯化鈉。該等管再度進行渦漩及離心而使得各層分離。然後將一部分的有機層置入一個GC小瓶中，及藉由GC-FID分析。藉由使用Nu-Check-Prep GLC 502B參考標準(美國明尼蘇達州伊利森(Elysian)的努伽克(NuCheck)公司)所產生的三點校正曲線，量化FAME。存在於萃取物中的脂肪酸係以毫克/克及以FAME的百分比表示。

結果 PTA-10208試樣#1

使用GC/FID測定PTA-10208試樣#1之生質與所萃取的粗脂質之脂肪酸廓型。藉由將28.6毫克的生質直接稱重置入一個FAME管中，而就地將生質中的脂肪酸轉酯化；藉由將55.0毫克的粗脂質稱重置入一個體積為50毫升的燒瓶中及將1毫升轉移至另一個FAME管中，而製備所萃取的粗脂質之一試樣。使用具FID檢測之GC，測定生質的估計粗脂質含量為53.2%(以FAME總和的形式)；同時自乾燥生質萃取52.0%(重量/重量)的脂質，而得97.8%的總脂質回收率。使用GC/FID，測定粗脂質為91.9%的脂肪酸(以FAME總和的形式)。粗脂質中所含有的主要脂肪酸為C16：0(182.5毫克/克)、C20：5 n-3(186.8毫克/克)及C22：6 n-3(423.1毫克/克)。

藉由將55.0毫克的粗脂質稱重置入一個體積為50毫升的燒瓶中及將一等分試樣轉移至一個HPLC小瓶中以進行HPLC/ELSD/MS分析，而測定所萃取的粗脂質之脂質種類廓型。依據HPLC/ELSD/MS分析，粗脂質含有0.2%的固醇酯(SE)、95.1%的TAG、0.4%的固醇及0.5%的1,2-二醯甘油(DAG)。TAG部分中的5%包括在TAG峰後直接洗提出之一峰，但並未產生一個可辨識的質譜。

藉由急驟層析法之測定，自該試樣所分離出之TAG構成約92.4%的粗製油。在SPE分離作用後，藉由重量或TLC並未檢測到PL。TAG中所含有的主要脂肪酸(>50毫克/克)為C16：0(189毫克/克)、C20：5 n-3(197毫克/克)及C22：6 n-3(441毫克/克)。

PTA-10208試樣#2

使用GC/FID測定PTA-10208試樣#2之生質與所萃取的粗脂質之脂肪酸廓型。藉由將32.0毫克的生質直接稱重置入一個FAME管中，而就地將生質中的脂肪酸轉酯化；藉由將60.1毫克的粗脂質稱重置入一個體積為50毫升的燒瓶中及將1毫升轉移至另一個FAME管中，而製備所萃取的粗脂質之一試樣。使用具FID檢測之GC，測定生質的估計粗脂質含量為52.4%(以FAME總和的形式)，同時自乾燥生質萃取48.0%(重量/重量)的脂質，而得91.7%的總脂質回收率。使用GC/FID，測定粗脂質為95.3%的脂肪酸(以FAME總和的形式)。粗脂質中所含有的主要脂肪酸為C16：0(217.5毫克/克)、C20：5 n-3(169.3毫克/克)及C22：6 n-3 (444.1毫克/克)。

藉由將60.1毫克的粗脂質稱重置入一個體積為50毫升的燒瓶中及將一等分試樣轉移至一個HPLC小瓶中以進行HPLC/ELSD/MS分析，而測定所萃取的粗脂質之脂質種類廓型。依據HPLC/ELSD/MS分析，粗脂質含有0.2%的SE、95.7%的TAG、0.3%的固醇及0.7%的1,2-DAG。TAG部分中的5.1%包括在TAG峰後直接洗提出之一峰，但並未產生一個可辨識的質譜。

自該試樣所分離出之TAG構成約93.9%的粗製油。在SPE分離作用後，藉由重量或TLC並未檢測到PL。TAG中所含有的主要脂肪酸(>50毫克/克)為C16：0(218毫克/克)、C20：5 n-3(167毫克/克)及C22：6 n-3(430毫克/克)。

PTA-10208試樣#3

使用HPLC/ELSD/MS，分析在ATCC登錄號PTA-10208所寄存微生物的粗製油之一試樣(試樣PTA-10208#3)。回收總共98.38%的脂質，其中固醇酯(SE)部分佔0.32%，TAG部分佔96.13%，1,3-二醯甘油(DAG)部分佔0.22%，1,2-DAG部分佔0.78%，及固醇部分佔0.93%。

PTA-10212試樣#1

使用GC/FID測定PTA-10212試樣#1之生質與所萃取的粗脂質之脂肪酸廓型。藉由將27.0毫克的生質直接稱重置入一個FAME管中，而就地將生質中的脂肪酸轉酯化；藉由將52.5毫克的粗脂質稱重置入一個體積為50毫升的燒瓶中及將1毫升轉移至另一個FAME管中，而製備所萃取的粗脂質之一試樣。使用具FID檢測之GC，測定生質的估計粗脂質含量為38.3%(以FAME總和的形式)，同時自乾燥生質萃取36.3%(重量/重量)的脂質，而得94.6%的總脂質回收率。使用GC/FID，測定粗脂質為83.2%的脂肪酸(以FAME總和的形式)。粗脂質中所含有的主要脂肪酸為C16：0(328.5毫克/克)、C20：5 n-3(90.08毫克/克)及C22：6 n-3(289.3毫克/克)。

藉由將52.5毫克的粗脂質稱重置入一個體積為50毫升的燒瓶中及將一等分試樣轉移至一個HPLC小瓶中以進行HPLC/ELSD/MS分析，而測定所萃取的粗脂質之脂質種類廓型。依據HPLC/ELSD/MS分析，粗脂質含有0.2%的SE、64.2%的TAG、1.9%的FFA、2.8%的1,3-DAG、1.4%的固醇、18.8%的1,2-DAG及0.5%MAG。TAG部分中的3.4%包括在TAG峰後直接洗提出之一峰，但並未產生一個可辨識的質譜。

自該試樣所分離出之TAG構成約49.8%的粗製油。所分離出之PL構成約8.1%的粗製油。在TAG部分中所含有的主要脂肪酸(>50毫克/克)為C16：0(400毫克/克)、C20：5 n-3(91毫克/克)及C22：6 n-3(273毫克/克)。在PL部分中所含有的主要脂肪酸(>50毫克/克)為C16：0(98毫克/克)、C20：5 n-3(33毫克/克)及C22：6 n-3(227毫克/克)。

PTA-10212試樣#2

使用GC/FID測定PTA-10212試樣#2之生質與所萃取的粗脂質之脂肪酸廓型。藉由將29.5毫克的生質直接稱重置入一個FAME管中，而就地將生質中的脂肪酸轉酯化；藉由將56.5毫克的粗脂質稱重置入一個體積為50毫升的燒瓶中及將1毫升轉移至另一個FAME管中，而製備所萃取的粗脂質之一試樣。使用具FID檢測之GC，測定生質的估計粗脂質含量為40.0%(以FAME總和的形式)，同時自乾燥生質萃取41.3%(重量/重量)的脂質，而得106.1%的總脂質回收率。使用GC/FID，測定粗脂質為82.8%的脂肪酸(以FAME總和的形式)。粗脂質中所含有的主要脂肪酸為C16：0(327.3毫克/克)、C20：5 n-3(92.5毫克/克)及C22：6 n-3(277.6毫克/克)。

藉由將56.5毫克的粗脂質稱重置入一個體積為50毫升的燒瓶中及將一等分試樣轉移至一個HPLC小瓶中以進行HPLC/ELSD/MS分析，而測定所萃取的粗脂質之脂質種類廓型。依據HPLC/ELSD/MS分析，粗脂質含有0.2%的SE、58.2%的TAG、2.3%的FFA、3.4%的1,3-DAG、1.7%的固醇、23.4%的1,2-DAG及0.6%的MAG。TAG部分中的3.3%包括在TAG峰後直接洗提出之一峰，但並未產生一個可辨識的質譜。

自該試樣所分離出之TAG構成約51.9%的粗製油。所分離出之PL構成約8.8%的粗製油。在TAG部分中所含有的主要脂肪酸(>50毫克/克)為C16：0(402毫克/克)、C20：5 n-3(92毫克/克)及C22：6 n-3(245毫克/克)。在PL部分中所含有的主要脂肪酸(>50毫克/克)為C16：0(121毫克/克)、C20：5 n-3(48毫克/克)及C22：6 n-3(246毫克/克)。

PTA-10212試樣#3

PTA-10212試樣#3之生質中之FAME總和形式的脂質含量經估算為34%，及在溶劑萃取作用後所得的粗製油量為37重量%，而得生質中所存在的脂肪之回收率為109%。在使用急驟層析法之份化作用後，約46%的粗製油被分離為TAG，28%被分離為DAG，該粗製油含有309毫克/克的DHA與264毫克/克的EPA。所分離出的TAG含有341毫克/克的DHA與274毫克/克的EPA。所分離出的DAG部分含有262毫克/克的DHA與237毫克/克的EPA。該生質、所萃取的粗製油及分離部分之總脂肪酸廓型，係分別以毫克/克與% FAME的形式計算而示於第8表與第9表。

PTA-10212試樣#4

PTA-10212試樣#4含有以FAME總和形式所測定之約23%的脂質，使用己烷萃取作用回收其中的107%。在使用急驟層析法之份化作用後，約42%的粗製油被分離為TAG，18%被分離為DAG。該粗製油含有275毫克/克的DHA與209毫克/克的EPA。所分離出的TAG含有296毫克/克的DHA與205毫克/克的EPA。所分離出的DAG部分含有245毫克/克的DHA與219毫克/克的EPA。該生質、所萃取的粗製油及分離出的部分之總脂肪酸廓型，係示於第10表(毫克/克)與第11表(FAME%)。

PTA-10212試樣#5

使用FRIOLEX®方法(英國米爾頓凱恩斯(Milton Keynes)的英國GEA威斯伐里亞分離器(GEA Westfalia Separator UK)有限公司)，自PTA-10212的生質萃取一粗製油試樣，以產生微生物油PTA-10212試樣#5。使用低壓急驟層析法，自PTA-10212試樣#5分離個別的脂質種類，及測定各種類的重量百分比。使用GC-FID測定各種類的脂肪酸廓型。

簡言之，藉由將240毫克的粗製油溶於600微升的己烷中及施用於管柱頂部，而製備試樣。在使用急驟層析法之試樣份化作用後，所有部分的合併重量為240毫克，而得100%的回收率。固醇酯部分佔0.9%，TAG部分佔42.6%，游離脂肪酸(FFA)部分佔1.3%，固醇部分佔2.2%，DAG部分佔41.6%。FRIOLEX®粗製油與分離部分之總脂肪酸廓型，係分別以毫克/克與% FAME的形式計算及示於第12表與第13表。

第4例

使用非水逆相HPLC分離作用與APCI-MS檢測作用，針對來自第3例之PTA-10208試樣#1、PTA-10208試樣#2、PTA-10212試樣#1、PTA-10212試樣#2及PTA-10212試樣#3、PTA-10212試樣#4及PTA-10212試樣#5中之各試樣，測定存在於所萃取的粗脂質中之各TAG異構物的相對量與脂肪酸組成。

TAG方法-

PTA-10208試樣#1

藉由將5.5毫克的油稱重置入一個HPLC小瓶中及以1毫升的己烷稀釋，而製備用於TAG分析之自PTA-10208試樣#1所分離的粗脂質。

PTA-10208試樣#2

藉由將5.3毫克的油稱重置入一個HPLC小瓶中及以1毫升的己烷稀釋，而製備用於TAG分析之自PTA-10208試樣#2所分離的粗脂質。

PTA-10212試樣#1

藉由將稱重5.3毫克的油稱重置入一個HPLC小瓶中及以1毫升的己烷稀釋，而製備用於TAG分析之自PTA-10212試樣#1所分離的粗脂質。

PTA-10212試樣#2

藉由將稱重3.6毫克的油稱重置入一個HPLC小瓶中及以1毫升的己烷稀釋，而製備用於TAG分析之自PTA-10212試樣#2所分離的粗脂質。

PTA-10212試樣#3

在己烷中製備PTA-10212試樣#3的TAG部分之一試樣，及藉由HPLC/APCI/MS分析以測定個別TAG異構物之身分。

PTA-10212試樣#4

在己烷中製備PTA-10212試樣#4的TAG部分之一試樣，及藉由HPLC/APCI/MS分析以測定個別TAG異構物之身分。

PTA-10212試樣#5

在己烷中製備PTA-10212試樣#5的TAG部分之一試樣，及藉由HPLC/APCI/MS分析以測定個別TAG異構物之身分。

第5例

經由精製、脫色及除臭而進一步加工處理粗製油，以製得精製油。以高油酸的葵花籽油稀釋該精製油，以製得DHA含量約400毫克/克之最終油。分離個別的脂質種類，及使用GC-FID測定各種類之FAME形式的脂肪酸廓型。

PTA-10208最終油

PTA-10208最終油#1至5的脂肪酸廓型係彙總於第21至22表，包括與所分離的TAG部分相關聯(第23至24表)及與所分離的固醇/DAG部分相關聯(第24至26表)之廓型。

亦使用急驟層析法(第27表)及具有ELSD與APCI-MS驗證的正相HPLC(第28表)，測定最終油中之個別脂質種類。

PTA-10212最終油

DHA係以41.63%與366.9毫克/克存在於PTA-10212最終油中，而EPA係以16.52%存在。測定個別脂肪酸廓型及彙總於第29表。

第6例

使用第4例所述之技術，進行第5例所述之PTA-10208最終油的三醯甘油(TAG)之分析。進行各脂肪酸部分的鑑定作用，及彙總於下列第30表。

第7例

在如第1與2表之培養基中，以添加碳與氮的培養形式，製備在ATCC登錄號PTA-10208與10212所寄存的分離微生物之一個已二天的接種體燒瓶。

依據下列程序進行誘突變作用：將一個已T=2日的無菌燒瓶中之約50毫升，倒入一個無菌的40毫升玻璃均質機中。該培養物在均質機中領受50次傾沒型攪拌。將該培養物吸量出，及過濾通過置於一個50毫升的無菌管中之一個無菌的50微米篩網過濾器(該篩網係作為留住菌落的較大型群集及同時讓較小的聚簇與單細胞通過該50微米篩網之一構件)。在一個無菌的50毫升管中收集全部的濃縮浸出物。浸漬過的培養物進行渦漩，及以1：100倍的水平稀釋。稀釋後的浸出試樣進行渦漩，然後將200微升的接種體添加至一個100 x 15毫米、含有4至5個玻璃珠(3毫米玻璃珠)的培養基洋菜平皿上。將各平皿平緩地攪拌，以使得玻璃珠將接種體均勻地塗佈在平皿上。自平皿上移除玻璃珠，及讓平皿加蓋靜置約5分鐘而乾燥。當該程序在暗光中進行時，將無菌通風櫥與鄰近區域的燈光關閉。僅存在使該程序得以進行之間接與微弱之極少量的光。

當照射該等試樣時，將五重複的平皿的蓋移開，及將平皿置於XL交聯器(美國紐約的斯貝克(Spectronics Corporation)公司)的底板上。該交聯器所輸送的功率係以微焦耳為單位，及其水平係尋求達到90%至95%的殺死率。五重複的對照組平皿係使用相同的操作程序接種未經誘發突變的細胞。使用細胞數目計算殺死%。一旦照射完成後，將平皿取出及加蓋，及依序以封口膜(parafilm)與鋁箔包裹平皿。該平皿在第一週務必在黑暗中生長，藉此其等無法修補受損的基因。

將平皿置於22.5℃房中約10日，然後計數菌落。當進行最終計數之後，以一個無菌的接種環挑取菌落及再畫線接種在新的培養基平皿上。將各菌落分植在個別的平皿上。當平皿生長稠密時，使用一接種環採集一試樣，及接種至含有50毫升的培養基之一個無菌的250毫升搖瓶中。將該燒瓶置於22.5℃房中的一個200 rpm振盪器上。在T=7日，將該搖瓶的培養物採集置入一個50毫升的無菌管中。測定pH值，及將試樣離心以收集生質的片狀沉澱物。將各試樣沖洗及再懸浮於異丙醇與蒸餾水的50：50混合物中，然後再度離心。將所收集的片狀沉澱物冷凍乾燥、稱重及進行FAME分析。第31與32表的數據分別代表以上述方法自菌株PTA-10208與PTA-10212所產生的突變株。

第8例

依據第5例所述之方法製備一油，其中用高油酸葵花籽油稀釋該油，使得DHA+EPA的合併含量係至少約500毫克/每克油。依據本實例所進行之油的典型分析與產品規格，係列於第33表。

油中所含有的其他成分包括少於2%的葵花卵磷脂、迷迭香萃取物、生育酚類及抗壞血酸棕櫚酸酯(作為抗氧化劑)。

第9例

依據第5例所述之方法製備一油，其中用高油酸葵花籽油稀釋該油，使得DHA+EPA的合併含量係至少約 400毫克/每克油。依據本實例所進行之油的典型分析與產品規格，係列於第34表。

在一些實施例中，上述第8或9例係以20號尺寸的素食用凝膠膠囊劑提供，油的填充重量係約999毫克至約1105毫克，及膠囊毛重係約1463毫克至約1789毫克，其中膠囊的破裂時間不超過15分鐘及儲架壽命約為24個月。

能以任一與所有變化形式組合此述所有不同方面、實施例及選項。

<110> DSM智慧財產有限公司

<120> 產生二十碳五烯酸之微生物、脂肪酸組成物及其製作方法與用途

<130> 2715.270TW01/JUK/KPQ

<140> 待指派

<141> 2010年03月22日

<150> 61/510,441

<151> 2011年07月21日

<160> 2

<170> PatentIn第3.3版

<210> 1

<211> 1705

<212> DNA

<213> 破囊壺菌屬物種(Thraustochytrium sp.)

<400> 1

<210> 2

<211> 1713

<212> DNA

<213> 裂殖壺菌屬物種(Schizochytrium sp.)

<400> 2

Claims

一種微生物油，其包含至少35重量%的一三醯甘油部分，且該微生物油包含ω-3多元不飽和脂肪酸，該等ω-3多元不飽和脂肪酸的二十二碳六烯酸與二十碳五烯酸含量係大於或等於ω-3多元不飽和脂肪酸總量之90重量%，其中二十碳五烯酸的量係二十二碳六烯酸與二十碳五烯酸總量之19重量%至55重量%，而二十二碳六烯酸的量係二十二碳六烯酸與二十碳五烯酸總量之35重量%至71重量%。
如申請專利範圍第1項之油，其中二十碳五烯酸的量係二十二碳六烯酸與二十碳五烯酸總量之19重量%至43重量%，而二十二碳六烯酸的量係二十二碳六烯酸與二十碳五烯酸總量之35重量%至47重量%。
如申請專利範圍第1項之油，其中二十碳五烯酸的量係二十二碳六烯酸與二十碳五烯酸總量之27重量%至54重量%，而二十二碳六烯酸的量係二十二碳六烯酸與二十碳五烯酸總量之36重量%至63重量%。
如申請專利範圍第1項之油，其中二十碳五烯酸的量係二十二碳六烯酸與二十碳五烯酸總量之26重量%至38重量%，而二十二碳六烯酸的量係二十二碳六烯酸與二十碳五烯酸總量之52重量%至64重量%。
如申請專利範圍第1項之油，其中二十碳五烯酸的量係二十二碳六烯酸與二十碳五烯酸總量之28重量%至36重量%，而二十二碳六烯酸的量係二十二碳六烯酸與二十碳五烯酸總量之54重量%至62重量%。
如申請專利範圍第1至5項中任一項之油，其中該油的每克油中係包含120毫克至220毫克的二十碳五烯酸，及每克油中包含240毫克至450毫克的二十二碳六烯酸。
如申請專利範圍第1至5項中任一項之油，其中該油的每克油中係包含130毫克至195毫克的二十碳五烯酸，及每克油中包含320毫克至480毫克的二十二碳六烯酸。
如申請專利範圍第1至5項中任一項之油，其中該等ω-3多元不飽和脂肪酸進一步包含二十二碳五烯酸，其量係ω-3多元不飽和脂肪酸總量之0%至10重量%。
如申請專利範圍第8項之油，其中該油的每克油中係包含150毫克至300毫克的二十碳五烯酸；每克油中包含200毫克至400毫克的二十二碳六烯酸；及每克油中包含0至55毫克的二十二碳五烯酸。
如申請專利範圍第1至5項中任一項之油，其中該油係由裂殖壺菌屬物種(Schizochytrium sp.)所產生。
如申請專利範圍第1至5項中任一項之油，其中該油包含各低於5重量%的二十碳四烯酸、二十二碳五烯酸n-6、油酸、亞麻油酸、十八碳三烯酸、二十烯酸、芥子酸及十八碳四烯酸。
如申請專利範圍第1至5項中任一項之油，其中該三醯甘油部分中之至少12重量%的脂肪酸為二十碳五烯酸，其中該三醯甘油部分中之至少25重量%的脂肪酸為二十二碳六烯酸，及其中該三醯甘油部分中之低於5重量% 的脂肪酸為二十碳四烯酸。
一種微生物油，其包含至少35重量%的一三醯甘油部分，且該微生物油包含ω-3多元不飽和脂肪酸，該等ω-3多元不飽和脂肪酸的二十二碳六烯酸與二十碳五烯酸含量係大於或等於ω-3多元不飽和脂肪酸總量之90重量%；而二十二碳五烯酸的量係ω-3多元不飽和脂肪酸總量之0%至2重量%，其中二十碳五烯酸的量係二十二碳六烯酸與二十碳五烯酸總量之10重量%至25重量%，二十二碳六烯酸的量係二十二碳六烯酸與二十碳五烯酸總量之75重量%至90重量%。
如申請專利範圍第13項之油，其中該油的每克油中係包含55毫克至150毫克的二十碳五烯酸；每克油中包含410毫克至540毫克的二十二碳六烯酸；及每克油中包含0至12毫克的二十二碳五烯酸。
如申請專利範圍第1至5項及第13項中任一項之油，其中每克油中的ω-3多元不飽和脂肪酸總量係至少400毫克。
如申請專利範圍第1至5項及第13項中任一項之油，其中每克油中的二十二碳六烯酸與二十碳五烯酸總量係400毫克。
如申請專利範圍第1至5項及第13項中任一項之油，其中每克油中的ω-3多元不飽和脂肪酸總量係400毫克至750毫克。
如申請專利範圍第1至5項及第13項中任一項之油，其中每克油中的ω-3多元不飽和脂肪酸總量係至少500毫克。
如申請專利範圍第1至5項及第13項中任一項之油，其中每克油中的二十二碳六烯酸與二十碳五烯酸總量係500毫克。
如申請專利範圍第1至5項及第13項中任一項之油，其中該油所包含之總ω-3多元不飽和脂肪酸中的EPA：DHA重量比例為1：1至1：2.5。
一種口服劑型，其包含如申請專利範圍第1至20項中任一項之油。