CN113749255B - 一种磷脂组合物在修复肌肉损伤的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种磷脂组合物在修复肌肉损伤中的应用，属于肌肉修复技术领域，所述磷脂组合物包含：磷虾磷脂10～40份，紫苏磷脂10～40份，大豆磷脂10～40份，蛋黄磷脂10～40份，其中，各组分按重量份计；所述磷脂组合物中，ω‑3长链多不饱和脂肪酸占总脂肪酸含量的5wt％～30wt％，磷脂酸占总磷脂含量的5wt％～20wt％。本发明对肌肉损伤的斑马鱼进行给药处理，根据双折射分析实验、触控逃避反应实验、氧化应激评估实验和切片染色结果分析，给药组肌肉组织的损伤得到恢复，肌肉组织结构得到改善。组合物水溶性好，生物利用度高，对肌肉损伤病人具有显著的改善和增强作用。
Description
技术领域
本发明涉及一种磷脂组合物在修复肌肉损伤的应用，属于肌肉修复技术领域。
背景技术
随着年龄的增加、过度运动、药物滥用等因素，都加剧了肌肉的损伤。对于普通人群而言，低肌肉力量普遍存在，且比例较高。肌肉质量与全因性死亡率紧密相连。肌肉损伤的外源性病因主要有外伤、剧烈运动、过度饮酒、药物和毒物、癫痫等疾病以及毒素作用。除了适当的运动和药物支持外，饮食营养也越来越受到重视。
磷脂是一种广泛存在的两性功能脂类。根据磷脂的极性头，磷脂可分为磷脂酰胆碱(PC)、磷脂酰乙醇胺(PE)、磷脂酰丝氨酸(PS)、磷脂酰肌醇(PI)、磷脂酰甘油和磷脂酸(PA)。磷脂在生物膜的形成和信号通路的调控中起着重要的作用。
磷脂酸作为机体蛋白质合成的调控因子，同时也是合成前提磷脂的前提物质，具有修复骨骼肌损伤的功效。而ω-3长链多不饱和脂肪酸作为公认的具有抗炎、促进合成代谢的功能性脂肪酸，被广泛接受。然而目前的产品中，磷脂酸和ω-3长链多不饱和脂肪酸并不同时大量存在，所以在现有的产品中磷脂很难同时获得较高含量的这两种功能性脂质。另外，考虑到这两种功能性脂质在促进骨骼肌损伤修复的协同增效作用，确定科学配比同样具有重要意义。因此，如何开发一种磷脂组合物在修复肌肉损伤的应用，以便能同时获取一定量的磷脂酸和ω-3长链多不饱和脂肪酸，并使其发挥最大的协同增效作用，显得十分必要。
发明内容
为解决上述问题，本发明提供了一种磷脂组合物在修复肌肉损伤的应用，通过磷脂组合物的形式，通过优选磷脂酸和ω-3长链多不饱和脂肪酸两者的比例，促进两者在肌肉组织中的协同增效作用，可以扩大功能性脂质在修复肌肉损伤中的应用范围和效果。
具体技术方案：
本发明提供一种磷脂组合物的应用，在修复肌肉损伤中的应用，所述磷脂组合物包含：磷虾磷脂10～40份，紫苏磷脂10～40份，大豆磷脂10～40份，蛋黄磷脂10～40份，其中，各组分按重量份计；所述磷脂组合物中，ω-3长链多不饱和脂肪酸占总脂肪酸含量的5wt％～35wt％，磷脂酸占总磷脂含量的5wt％～20wt％。
在一种可实现的优选方式中，所述ω-3长链多不饱和脂肪酸占总脂肪酸含量的10wt％-30wt％。
在一种可选的实施例中，所述ω-3长链多不饱和脂肪酸是由ALA(C18：3)、DHA(C22：6)、EPA(C20：5)和DPA(C22：5)组成。
在一种可选的实施例中，所述的ω-3长链多不饱和脂肪酸中DHA(C22：6)、EPA(C20：5)、DPA(C22：5)占总脂肪酸含量的5％～20％。
本发明实施例中，所述肌肉损伤的模型包含：入口型肌肉损伤模型、时间型肌肉损伤模型或受力型肌肉损伤模型。
本发明实施例中，所述的磷脂组合物应用在入口型肌肉损伤模型中，具体步骤包括：
恒温培养箱中，在28±0.5℃温度条件下，采用含有氯化钠、氯化钾、氯化钙、N-苯基硫脲的培养基，光照和黑暗交替培养3-7dpf的斑马鱼；将培养好的斑马鱼随机分为空白组、对照组、和给药组；
其中，空白组不做任何处理，对照组和给药组分别使用氯化钡溶液处理；
给药组至少包含2组，分别使用相同浓度的不同磷脂组合物的培养基继续培养；
对照组和给药组继续培养24小时以后，对空白组、对照组和给药组分别采用双折射分析实验、触控逃避反应实验、氧化应激评估实验进行分析评价。
在一种可选的实施例中，所述氯化钠、氯化钾、氯化钙、N-苯基硫脲的浓度分别依次为：5mM、0.17mM、0.33mM、30mg/L。
本发明实施例中，所述的磷脂组合物应用在时间型肌肉损伤模型或受力型肌肉损伤模型中，具体步骤包括：
恒温培养箱中，在28±0.5℃温度条件下，将斑马鱼在光照和黑暗交替环境下，置于除去氯气的自来水中，培养7天后随机分组，分为对照组和给药组；
对照组继续用除去氯气的自来水培养，给药组使用含有磷脂组合物的除去氯气的自来水继续培养；
对照组和给药组均培养至少一周后，采用切片染色实验分析评价。
在一种可选的实施例中，所述切片染色实验使用苏木精和伊红染色。
在本发明的实施例中，所述光照时间为4小时，黑暗时间为10小时。
在本发明的实施例中，所述磷脂组合物培养基所含磷脂组合物的浓度为50μg/mL。
在实际应用中，ω-3长链多不饱和脂肪酸可以由天然来源分离制备得到、合成获得、或者直接使用含有磷脂型ω-3长链多不饱和脂肪酸的天然成分中的一种或多种。
ω-3长链多不饱和脂肪酸的天然来源包括南极磷虾、罗非鱼、裂殖壶菌、微藻、海参、海胆、贻贝类、鱼籽、蛤类、鳟鱼、鲑鱼、鱿鱼中的一种或多种；合成获得包括：化学合成、酶法合成中的一种或多种。
磷脂组合物还包括富含油酸C18∶1的磷脂、富含亚油酸C18∶2的磷脂或富含亚麻酸C18∶3的磷脂中的一种或多种。
本发明提供的磷脂组合物还可以用于普通食品、功能性食品、特殊医学用途的配方食品中，具体地，可以将磷脂组合物与营养物质复配在配方食品中使用，营养物质可以是碳水化合物、蛋白质或其他脂质。一般地，磷脂组合物在配方食品中质量浓度为5％～30％。
另外，本发明中提供的磷脂组合物还可以作为膳食补充剂或添加剂，用于健康人群和/或肌肉疾病人群。
本发明的有益效果：
通过优选磷脂酸和ω-3长链多不饱和脂肪酸两者的比例，促进两者在肌肉组织中的协同增效作用，可以扩大功能性脂质在修复肌肉损伤中的应用范围和效果。本发明优选的磷脂组合物中，采用磷虾磷脂10～40份，紫苏磷脂10~40份，大豆磷脂10～40份，蛋黄磷脂10～40份，ω-3长链多不饱和脂肪酸占总脂肪酸含量的5wt％-35wt％，磷脂酸占总磷脂含量的5wt％～20wt％，对肌肉损伤有明显的恢复效果；更优选的ω-3长链多不饱和脂肪酸中DHA(C22∶6)、EPA(C20：5)、DPA(C22：5)占总脂肪酸含量的5％～20％。本发明提供的磷脂组合物的应用，主要是应用在入口型肌肉损伤模型、时间型肌肉损伤模型或受力型导致肌肉损伤模型中，并以斑马鱼为研究样本，提供了磷脂组合物的应用及评价方法，利用该方法能够有效验证本发明提供的磷脂组合物在所述三种肌肉损伤模型中能够起到良好的修复效果。
附图说明
图1为不同组合物的斑马鱼双折射分析结果图；
图2为不同组合物的斑马鱼氧化应激水平图；
图3为不同组合物的斑马鱼触控逃避反应时间图；
图4为磷脂组合物A应用到时间型肌肉损伤模型的斑马鱼的组织切片图；
图5为磷脂组合物A应用到受力型肌肉损伤模型的斑马鱼的组织切片图。
具体实施方式
本发明中所涉及的名词解释如下：
功能性脂质，是指一类具有特殊生理功能的脂质，它是指那些为人类营养、健康所需要，并对人体一些相应营养素缺乏症和内源性疾病，特别是现代社会文明病如高血压、心脏病、癌症、糖尿病等有积极防治作用的一大类脂溶性物质。
膳食补充剂，是以现代营养学、预防医学和循证医学等为其理论基础，通过调整人们饮食中各项营养元素或生物活性物质的摄入量，借助在膳食补充剂中添加符合要求的磷脂组合物，起到膳食营养干预作用达到增强体质、改善机能、平衡代谢和降低肌肉损伤疾病发生风险的目的。
入口型肌肉损伤模型，是指药物、毒素、重金属等从饮食或其他入口食物、药物等方式进入人体内，而导致肌肉损伤。
时间型肌肉损伤模型，是指因不可抗拒的自然规律，使机体衰老而导致的肌肉损伤。
受力型肌肉损伤模型，是指因运动损伤、外力损伤而导致的肌肉损伤。
下面结合具体实施例对本发明作进一步阐释，本发明根据发明技术方案进行实施，给出了详细的实施方式和操作步骤，但本发明的保护范围并不限于下述的实施例。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件。
实施例1
1、四种磷脂组合物的制备
按照四种天然来源的磷脂，即磷虾磷脂、紫苏磷脂、大豆磷脂、蛋黄磷脂，按照不同比例复配而来的，通过复配以后再去分析这些组合物的脂肪酸组成和磷脂组成，进行后续的实验比较，紫苏磷脂主要是为了提供磷脂酸，磷虾磷脂是为了提供ω-3长链多不饱和脂肪酸，而蛋黄磷脂和大豆磷脂是为了调节磷脂、脂肪酸组成比例，使其合理均衡，因为紫苏籽和磷虾中含有的不饱和脂肪酸比例很高，需要通过调节脂肪酸比例使其氧化稳定性更高。
按照表1的组分配比，取质量浓度为10％的各种磷脂溶液加入到混合设备中，磁力搅拌后混合均匀，经冷冻干燥处理，即得到磷脂组合物A～D。
表1不同磷脂组合物成分表(重量份)
| 成分 | 磷脂组合物A | 磷脂组合物B | 磷脂组合物C | 磷脂组合物D |
| 磷虾磷脂 | 20 | 40 | 10 | 30 |
| 紫苏磷脂 | 30 | 40 | 10 | 35 |
| 大豆磷脂 | 25 | 10 | 40 | 17.5 |
| 蛋黄磷脂 | 25 | 10 | 40 | 17.5 |
2、磷脂组合物的脂肪酸组成分析和磷脂组成分析
(1)脂肪酸组成分析
本发明的脂肪酸组成分析采用三氟化硼甲酯化法，具体参考《GB5009.168-2016食品安全国家标准食品中脂肪酸的测定》进行。上述磷脂组合物A～D的脂肪酸组成如下表2所示：
表2磷脂组合物的脂肪酸组成(％)
备注：ω-3长链多不饱和脂肪酸是由ALA-C18∶3，DHA-C22∶6，EPA-C20：5和DPA-C22∶5组成。
(2)磷脂组成分析
本发明的磷脂组成分析采用液相色谱分析，检测方法具体参考专利CN201910361172.4。上述磷脂组合物A～D的脂肪酸组成如下表3所示：
表3磷脂组合物的磷脂组成(％)
| 磷脂类型 | 磷脂组合物A | 磷脂组合物B | 磷脂组合物C | 磷脂组合物D |
| PA | 8.73±0.67 | 10.61±1.63 | 4.30±0.45 | 9.67±0.85 |
| PC | 66.70±5.85 | 62.48±5.96 | 76.54±7.53 | 64.59±6.12 |
| PE | 20.44±2.63 | 22.72±2.35 | 14.95±1.53 | 21.58±2.23 |
| PI | 2.82±0.32 | 2.42±0.23 | 2.97±2.86 | 2.62±0.16 |
| PS | 1.31±0.16 | 1.77±0.18 | 1.24±0.13 | 1.54±0.21 |
实施例2
通过动物实验将磷脂组合物A、磷脂组合物B、磷脂组合物C和磷脂组合物D应用到入口型肌肉损伤模型，并采用双折射分析实验、触控逃避反应实验、氧化应激评估实验进行分析评价。
实验中所用为3-7dpf的斑马鱼，斑马鱼于恒温培养箱(28±0.5℃)，每天光照14小时、黑暗10小时，在培养基中培养，培养基各组分浓度：5mM氯化钠，0.17mM氯化钾，0.33mM氯化钙，30mg/L N-苯基硫脲。将培养好的斑马鱼随机分组，分为空白组、对照组和给药组。空白组不做处理，对照组和给药组分别使用30μM的氯化钡溶液处理一小时，然后用新鲜培养基清洗三次；对照组用新鲜培养基继续培养，给药组包含4组，分别各使用含有50μg/mL的磷脂组合物A、磷脂组合物B、磷脂组合物C、磷脂组合物D的4组培养基继续培养。对照组和4组给药组继续培养24小时以后，对空白组、对照组和给药组分别采用双折射分析实验、触控逃避反应实验、氧化应激评估实验进行分析评价。
其中，双折射分析实验方法为：将上述各组斑马鱼分别用0.03％的三卡因麻醉，用带有相机的偏光显微镜观察拍照。使用Images J软件量化双折射强度并通过斑马鱼表面积进行归一化处理。如图1所示，双折射分析实验结果显示，磷脂组合物增加斑马鱼在双折射下的肌肉面积，相比于对照组，给药组分别以磷脂组合物A、磷脂组合物B、磷脂组合物C、磷脂组合物D对斑马鱼给药后，斑马鱼肌肉组织相对面积从42.53％±8.22％提高到90.56％±9.46％、91.67％±10.63％、60.34％±7.71％、89.91％±9.43％，其中，使用磷脂组合物A、磷脂组合物B、磷脂组合物D的效果较使用磷脂组合物C更显著。
触控逃避反应实验方法为：用带有摄像机的体视显微镜记录斑马鱼的运动状态，用昆虫针触碰刺激斑马鱼的尾部，记录斑马鱼的运动时间，其中，斑马鱼的运动轨迹以斑马鱼开始运动到停止运动或离开视野为参考。如图2所示，触控逃避反应实验结果显示，磷脂组合物A、磷脂组合物B、磷脂组合物C、磷脂组合物D显著降低斑马鱼的反应时间，由0.099±0.015秒降低到0.041±0.009秒，0.045±0.006秒，0.082±0.009秒，0.047±0.008秒，其中磷脂组合物A、磷脂组合物B、磷脂组合物D效果较磷脂组合物C更显著。
氧化应激评估实验方法为：在2′，7′-二氯二氢荧光素(DCFH-DA)最终浓度为20μg/mL的斑马鱼培养液中进行荧光染色。斑马鱼幼虫在28℃黑暗孵育1h后，用新鲜培养基洗3次。采用倒置荧光显微镜对0.03％三卡因麻醉的斑马鱼幼虫进行荧光成像并拍照，使用Images J软件量化分析，定量分析荧光面积并与对照组比较。如图3所示，活性氧氧化应激ROS水平结果显示，相比于对照组，分别以磷脂组合物A、磷脂组合物B、磷脂组合物C、磷脂组合物D给药以后，斑马鱼ROS水平从105.20％±8.52％降低到36.31％±3.10％、35.30％±4.81％、78.99％±6.20％、40.03％±4.05％，其中磷脂组合物A、磷脂组合物B、磷脂组合物D的效果较磷脂组合物C更显著。
综上，双折射分析，实验结果越高表明骨骼肌越好；触控逃避反应，实验结果时间越长表明骨骼肌状态越差；氧化应激评估，实验结果越高，表明骨骼肌状态越差。
因此，从实施例1中，实验结果较好的磷脂组合物A、磷脂组合物B、磷脂组合物D中可以任一选择一种应用到斑马鱼肌肉损伤模型上，研究本发明中磷脂组合物对肌肉损伤恢复效果。下述实施例3～4选择磷脂组合物A，磷脂组合物B、磷脂组合物D与磷脂组合物A有相同的原理和效果，在此不再赘述，同样属于本发明的保护范围。
实施例3
通过动物实验将磷脂组合物A应用到时间型肌肉损伤模型，并采用切片染色实验分析评价。
采用实施例1所述获得磷脂组合物A作为给药组，实验中所用为20-25月龄的斑马鱼，斑马鱼于恒温条件下培养(28±0.5℃)，每天光照14小时、黑暗10小时，培养液为除去氯气的自来水。适应7天后随机分组，分为对照组、给药组。对照组用鱼水培养，给药组使用含有50μg/mL磷脂组合物A的鱼水继续培养。继续培养三周以后，使用苏木精和伊红染色，观察对照组、给药组的斑马鱼肌肉组织冰冻切片伊红情况，用倒置显微镜观察切片。如图4所示，以磷脂组合物A给药以后衰老的斑马鱼的肌肉组织得到较好的恢复。
实施例4
通过动物实验将磷脂组合物A应用到受力型肌肉损伤模型，并采用切片染色实验分析评价。
采用实施例1所述获得磷脂组合物A作为给药组，实验中所用为3-5月龄的斑马鱼，斑马鱼于恒温条件下培养(28±0.5℃)，每天光照14小时、黑暗10小时，鱼水为除去氯气的自来水。适应7天后随机分组，分为空白组、对照组、给药组。空白组不另做处理，对照组和给药组用高强度，5L/min的水流冲击，强迫斑马鱼运动1小时。对照组用鱼水培养，给药组使用含有50μg/mL磷脂组合物A的鱼水继续培养。继续培养一周以后，使用苏木精和伊红染色，观察空白组、对照组、给药组斑马鱼肌肉组织冰冻切片伊红情况，用倒置显微镜观察切片。如图5所示，以磷脂组合物A给药以后强迫运动下的斑马鱼的肌肉组织得到较好的恢复。
以上仅以较佳实施例对本发明的技术方案进行介绍，但是对于本领域的一般技术人员，依据本发明实施例的思想，应能在具体实施方式上及应用范围上进行改变，故而，综上所述，本说明书内容不应该理解为本发明的限制，凡在本发明的精神和原理之内所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的权利要求范围之内。
Claims (5)
1.一种磷脂组合物在制备修复肌肉损伤产品中的应用，其特征在于，所述磷脂组合物由磷虾磷脂20~40份，紫苏磷脂30~40份，大豆磷脂10~25份，蛋黄磷脂10~25份组成，其中，各组分按重量份计；所述磷脂组合物中，ω-3长链多不饱和脂肪酸占总脂肪酸含量的5wt%~35wt%，磷脂酸占总磷脂含量的5wt%~20wt%。
2.根据权利要求1所述的磷脂组合物在制备修复肌肉损伤产品中的应用，其特征在于，所述ω-3长链多不饱和脂肪酸占总脂肪酸含量的10wt%-30wt%。
3.根据权利要求2所述的磷脂组合物在制备修复肌肉损伤产品中的应用，其特征在于，所述ω-3长链多不饱和脂肪酸是由ALA（C18:3）、DHA（C22：6）、EPA（C20：5）和DPA（C22：5）组成。
4.根据权利要求1、2或3所述的磷脂组合物在制备修复肌肉损伤产品中的应用，其特征在于，所述的ω-3长链多不饱和脂肪酸中DHA（C22：6）、EPA（C20：5）、DPA（C22：5）占总脂肪酸含量的5%~20%。
5.根据权利要求1所述的磷脂组合物在制备修复肌肉损伤产品中的应用，其特征在于，所述肌肉损伤包含：入口型肌肉损伤、时间型肌肉损伤或受力型肌肉损伤。
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