KR102442450B1 - 미세조류에서 오메가-3 다중불포화 지방산 생산을 증가시키는 방법 - Google Patents

미세조류에서 오메가-3 다중불포화 지방산 생산을 증가시키는 방법 Download PDF

Info

Publication number
KR102442450B1
KR102442450B1 KR1020187035757A KR20187035757A KR102442450B1 KR 102442450 B1 KR102442450 B1 KR 102442450B1 KR 1020187035757 A KR1020187035757 A KR 1020187035757A KR 20187035757 A KR20187035757 A KR 20187035757A KR 102442450 B1 KR102442450 B1 KR 102442450B1
Authority
KR
South Korea
Prior art keywords
gene
microalgae
pfa1
pfa3
encoding
Prior art date
Application number
KR1020187035757A
Other languages
English (en)
Other versions
KR20190004798A (ko
Inventor
앤-세실 브이 베인
로스 이 저클
Original Assignee
디에스엠 아이피 어셋츠 비.브이.
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 디에스엠 아이피 어셋츠 비.브이. filed Critical 디에스엠 아이피 어셋츠 비.브이.
Publication of KR20190004798A publication Critical patent/KR20190004798A/ko
Application granted granted Critical
Publication of KR102442450B1 publication Critical patent/KR102442450B1/ko

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
    • C12N15/8241—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology
    • C12N15/8242—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with non-agronomic quality (output) traits, e.g. for industrial processing; Value added, non-agronomic traits
    • C12N15/8243—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with non-agronomic quality (output) traits, e.g. for industrial processing; Value added, non-agronomic traits involving biosynthetic or metabolic pathways, i.e. metabolic engineering, e.g. nicotine, caffeine
    • C12N15/8247—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with non-agronomic quality (output) traits, e.g. for industrial processing; Value added, non-agronomic traits involving biosynthetic or metabolic pathways, i.e. metabolic engineering, e.g. nicotine, caffeine involving modified lipid metabolism, e.g. seed oil composition
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01H—NEW PLANTS OR NON-TRANSGENIC PROCESSES FOR OBTAINING THEM; PLANT REPRODUCTION BY TISSUE CULTURE TECHNIQUES
    • A01H5/00—Angiosperms, i.e. flowering plants, characterised by their plant parts; Angiosperms characterised otherwise than by their botanic taxonomy
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/10—Transferases (2.)
    • C12N9/1025—Acyltransferases (2.3)
    • C12N9/1029—Acyltransferases (2.3) transferring groups other than amino-acyl groups (2.3.1)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P7/00—Preparation of oxygen-containing organic compounds
    • C12P7/64—Fats; Fatty oils; Ester-type waxes; Higher fatty acids, i.e. having at least seven carbon atoms in an unbroken chain bound to a carboxyl group; Oxidised oils or fats
    • C12P7/6409—Fatty acids
    • C12P7/6427—Polyunsaturated fatty acids [PUFA], i.e. having two or more double bonds in their backbone
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P7/00—Preparation of oxygen-containing organic compounds
    • C12P7/64—Fats; Fatty oils; Ester-type waxes; Higher fatty acids, i.e. having at least seven carbon atoms in an unbroken chain bound to a carboxyl group; Oxidised oils or fats
    • C12P7/6409—Fatty acids
    • C12P7/6427—Polyunsaturated fatty acids [PUFA], i.e. having two or more double bonds in their backbone
    • C12P7/6432—Eicosapentaenoic acids [EPA]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P7/00—Preparation of oxygen-containing organic compounds
    • C12P7/64—Fats; Fatty oils; Ester-type waxes; Higher fatty acids, i.e. having at least seven carbon atoms in an unbroken chain bound to a carboxyl group; Oxidised oils or fats
    • C12P7/6436—Fatty acid esters
    • C12P7/6445—Glycerides
    • C12P7/6472—Glycerides containing polyunsaturated fatty acid [PUFA] residues, i.e. having two or more double bonds in their backbone
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y203/00—Acyltransferases (2.3)
    • C12Y203/01—Acyltransferases (2.3) transferring groups other than amino-acyl groups (2.3.1)
    • C12Y203/01085—Fatty-acid synthase (2.3.1.85)

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Oil, Petroleum & Natural Gas (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Nutrition Science (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Physiology (AREA)
  • Botany (AREA)
  • Developmental Biology & Embryology (AREA)
  • Environmental Sciences (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
  • Fats And Perfumes (AREA)
  • Breeding Of Plants And Reproduction By Means Of Culturing (AREA)

Abstract

본 발명은, 한 양상에서, 미세조류를 변형시켜 PFA1 및/또는 PFA3의 발현을 증가시키는 단계, 및 PFA1 및/또는 PFA3의 발현을 가능하게 하는 조건 하에 변형된 미세조류를 배양하여 EPA가 강화된 지질을 생산하는 단계를 포함하는, EPA가 강화된 지질의 생산 방법에 관한 것이다. 본 발명은 또한 PFA1 및/또는 PFA3이 과발현되는 재조합 미세조류에 관한 것이다. 이러한 재조합 미세조류는 매우 바람직한 지방산 지질 프로파일(예컨대, 증가된 수순의 EPA, 증가된 비의 EPA:DHA, 감소된 수준의 DPA n-6 등)을 생성하는 것으로 본원에서 증명된다.

Description

미세조류에서 오메가-3 다중불포화 지방산 생산을 증가시키는 방법
관련 출원에 대한 상호 참조
본원은 2016년 5월 12일자 출원된 미국 가출원 제62/335,498호(이의 개시내용은 본원에 참조로서 혼입됨)를 우선권 주장한다.
기술분야
본 개시내용은 다중불포화 지방산 신타제의 아단위를 코딩하는 유전자의 발현 수준을 변경함으로써, 미세조류에서, 오메가-3 다중불포화 지방산, 예컨대 에이코사펜타엔산(EPA)의 생산을 증가시키는 방법에 관한 것이다. 예를 들어, 다중불포화 지방산 신타제 아단위 1(PFA1)을 코딩하는 PFA1, 및/또는 다중불포화 지방산 신타제 아단위 3(PFA3)을 코딩하는 PFA3의 발현 수준을 증가시킴으로써, EPA의 생산을 증가시키는 방법이 개시된다. 본 개시내용은 또한 다중불포화 지방산 신타제를 코딩하는 유전자, 예컨대 PFA1 및/또는 PFA3의 발현 수준을 변경시키도록 변형된 재조합 미세조류에 관한 것이다. 본 개시내용은 또한 오메가-6 다중불포화 지방산에 대한 오메가-3 다중불포화 지방산의 비의 조작 방법, 예컨대 미세조류에서 생산된 도코사헥사엔산(DHA)에 대한 EPA의 비의 조작 방법에 관한 것이다.
트라우스토키트리드(Thraustochytrid)는 트라우스토키트리움(Thraustochytrium) 속 및 쉬조키트리움(Schizochytrium) 속의 구성원을 비롯한 트라우스토키트라이알레스(Thraustochytriales) 목의 미생물이고, PUFA의 중요한 공급원으로 인식되어 왔다(예컨대, 미국 특허공보 제5,130,242호 참조). 해양 세균 및 트라우스토키트리드에서 폴리케티드 신타제(PKS)-유사 시스템은 아세틸-CoA 및 말론일-CoA로부터 다중불포화 지방산(PUFA)을 합성할 수 있다. 이러한 PKS-유사 시스템은 또한 본원에서 PUFA 신타제 시스템으로 지칭된다. 해양 세균 쉬와넬라(Shewanella) 및 비브리오 마리누스(Vibrio marinus)의 PUFA 신타제 시스템은 미국 특허공보 제6,140,486호에 기술되어 있다. 쉬조키트리움 속의 트라우스토키트리드의 PUFA 신타제 시스템은 미국 특허공보 제6,566,583호에 기술된다. 쉬조키트리움 속(ATCC 20888) 및 트라우스토키트리움 속(ATCC 20892)의 트라우스토키트리드의 PUFA 신타제 시스템은 또한 미국 특허공보 제7,247,461호 및 제7,256,022호에 기술된다. 미국 특허공보 제7,211,418호는 트라우스토키트리움 속의 트라우스토키트리드의 PUFA 신타제 시스템, 및 이러한 시스템을 사용하는 에이코사펜타엔산(C20:5, 오메가-3)(EPA) 및 다른 PUFA의 생산을 기술한다. 미국 특허공보 제7,217,856호는 쉬와넬라 올레야나(Shewanella olleyana) 및 쉬와넬라 자포니카(Shewanella japonica)의 PUFA 신타제 시스템을 기술한다. 국제 특허공개공보 제2005/097982호는 균주 SAM2179의 PUFA 신타제 시스템을 기술한다. 미국 특허공보 제7,208,590호 및 제7,368,552호 트라우스토키트리움 아우레움(Thraustochytrium aureum)으로부터의 PUFA 신타제 유전자 및 단백질을 기술한다.
최근에, 쉬조키트리움 종 ATCC PTA-9695로부터의 PUFA 신타제 시스템이 미국 특허공보 제8,940,884호에 기술된다. 발현될 때, 쉬조키트리움 종 ATCC PTA-9695로부터의 PUFA 신타제(PFA1, PFA2 및 PFA3)는 높은 수준의 오메가-3 지방산에 의해 부분적으로 특징지어지는 독특한 지방산 프로파일을 생성한다. 쉬조키트리움 종 ATCC PTA-9695로부터의 PUFA 신타제에 대한 유전자 아키텍쳐(PFA1, PFA2 및 PFA3)의 개략도가 도 1에 제공된다. 상기 언급된 여러 가지 트라우스토키트리드의 PUFA 신타제에 대한 도메인 아키텍쳐의 개략도가 도 2에 제공된다.
PKS 시스템은 3가지 기본 유형(전형적으로 유형 I(모듈 또는 반복), 유형 II 및 유형 III으로 지칭됨)에 속하는 것으로 전통적으로 문헌에 기술되었다. 유형 II 시스템은 각각 별개의 효소 반응을 수행하는 분리가능한 단백질에 의해 특징지어진다. 효소는 함께 작동하여 최종 생성물을 생성하고, 시스템의 각각의 개별 효소는 전형적으로 최종 생성물의 생산에 여러 번 참여한다. 이러한 유형의 시스템은 식물 및 세균에서 발견되는 유형 II 지방산 신타제(FAS) 시스템과 유사한 방식으로 작동한다. 유형 I 반복 PKS 시스템은 효소가 최종 생성물을 생산하기 위하여 반복적인 방식으로 사용되는 유형 II 시스템과 유사하다. 유형 I 반복 시스템은, 효소 활성이 분리가능한 단백질과 연관되는 대신에, 더 큰 단백질의 도메인으로서 발생하는 유형 II 시스템과 상이하다. 이러한 시스템은 동물 및 균류에서 발견되는 유형 I FAS 시스템과 유사하다.
유형 II 시스템과 달리, 유형 I 모듈 PKS 시스템에서 각각의 효소 도메인은 최종 생성물의 생산에서 단지 1회 사용된다. 상기 도메인은 매우 큰 단백질에서 발견되고, 각각의 반응 생성물은 PKS 단백질의 다른 도메인 상으로 통과한다.
유형 III 시스템은 더욱 최근에 개발되었고, 식물 칼콘 신타제 계열의 축합 효소에 속한다. 유형 III PKS 시스템은 유형 I 및 유형 II PKS 시스템과 구별되고, 반복적인 축합 반응에서 유리 CoA 기질을 이용하여 통상적으로 헤테로환형 최종 생성물을 생산한다.
PUFA 합성을 위한 통상적인 또는 표준 경로에서, 중간쇄-길이 포화 지방산(지방산 신타제(FAS) 시스템의 생성물)은 일련의 신장 및 탈포화 반응에 의해 변형된다. 신장 반응을 위한 기질은 지방 아실-CoA(신장된 지방산 쇄) 및 말론일-CoA(각각의 신장 반응 중에 첨가된 2개의 탄소의 공급원)이다. 신장효소 반응의 생성물은 선형 쇄에 2개의 추가적인 탄소를 갖는 지방 아실-CoA이다. 탈포화효소는 산소-의존적 반응에서 2개의 수소의 추출에 의해 기존 지방산 쇄에 시스 이중 결합을 생성한다. 탈포화효소에 대한 기질은 아실-CoA(일부 동물) 또는 인지질의 글리세롤 골격으로 에스터화된 지방산(예컨대, 포스파티딜콜린)이다.
지방산은 탄소 쇄의 길이 및 포화 특징을 기준으로 분류된다. 지방산은 쇄에 존재하는 탄소의 수를 기준으로 단쇄, 중간쇄 또는 장쇄 지방산으로 지칭되고, 탄소 원자 사이에 어떠한 이중 결합도 존재하지 않을 때 포화 지방산으로 지칭되고, 이중 결합이 존재할 때 불포화 지방산으로 지칭된다. 불포화 장쇄 지방산은 단지 하나의 이중 결합이 존재할 때 단일불포화되고, 1개 초과의 이중 결합이 존재할 때 다중불포화된다.
PUFA는 지방산의 메틸 단부로부터의 제1 이중 결합의 위치를 기준으로 분류된다: 오메가-3(n-3) 지방산은 제3 탄소에 제1 이중 결합을 함유하는 반면, 오메가-6(n-6) 지방산은 제6 탄소에 제1 이중 결합을 함유한다. 예를 들어, 도코사헥사엔산("DHA")은 22개 탄소의 쇄 길이 및 6개의 이중 결합을 갖는 오메가-3 PUFA이다(종종 "22:6 n-3"으로 지칭됨). 다른 오메가-3 PUFA는 에이코사펜타엔산("EPA")("20:5 n-3"으로 지칭됨) 및 오메가-3 도코사펜타엔산("DPA n-3")("22:5 n-3"으로 지칭됨)을 포함한다. DHA 및 EPA는 "필수" 지방산으로 지칭된다. 오메가-6 PUFA는 아라키돈산("ARA")("20:4 n-6"으로 지칭됨) 및 오메가-6 도코사펜타엔산("DPA n-6")("22:5 n-6"으로 지칭됨)을 포함한다.
오메가-3 지방산은 세포 막에서의 이의 존재에 기인하여 세포 생리학에 영향을 주고, 생물학적 활성 화합물의 생산 및 유전자 발현을 조정하고, 생합성 기질로서 역할을 하는 생물학적으로 중요한 분자이다(문헌[Roche, H. M., Proc. Nutr. Soc. 58: 397-401 (1999)]). DHA는, 예를 들어, 대략적으로 인간 대뇌 피질에서 지질의 약 15 내지 20% 및 망막에서 지질의 30 내지 60%를 차지하고, 고환 및 정액에서 농축되고, 모유의 중요한 성분이다(문헌[Berge, J.P., and Barnathan, G. Adv. Biochem. Eng. Biotechnol. 96:49-125 (2005)]). DHA는 뇌에서의 오메가-3 지방산의 97% 이하 및 망막에서 오메가-3 지방산의 93% 이하를 차지한다. 또한, DHA는 태아 및 유아 발달 둘 다, 및 성인의 인지 작용 유지에 필수적이다. 오메가-3 지방산이 인체에서 새로이 합성되지 않으므로, 이들 지방산은 영양원으로부터 유래하여야 한다.
아마씨유 및 어유는 오메가-3 지방산의 양호한 식이 공급원으로 간주된다. 아마씨유는 어떠한 EPA, DHA, DPA 또는 ARA도 함유하지 않지만, 신체에서 EPA의 제조를 가능하게 하는 빌딩 블록인 리놀렌산(C18:3 n-3)을 함유한다. 그러나, 대사 전환의 속도가, 특히 손상된 건강을 갖는 신체에서, 느리고 가변적일 수 있다는 증거가 존재한다. 어유는 구체적인 종 및 이의 식이에 따라서 지방산 조성물의 유형 및 수준에서 상당히 변한다. 예를 들어, 양식에 의해 성장한 물고기는 야생 물고기보다 낮은 수준의 오메가-3 지방산을 갖는 경향이 있다. 또한, 어유는 환경 오염물을 함유할 위험을 갖고, 안정성 문제 및 비린내 또는 비린맛과 관련될 수 있다.
내인성-생성된 지방산의 변형에 의해 지방종자 농작물에서 PUFA를 생산하려고 노력되었다. 지방산 신장효소 및 탈포화효소를 위한 다양한 개별적인 유전자를 갖는 이들 식물의 유전적 변형은 PUFA, 예컨대 EPA 및 DHA를 함유하는 잎 또는 종자를 생성하였다(문헌[Ruiz-Lopez et al., Appl. Microbiol. Biotechnol. 99:143-154 (2015)]; 문헌[Qi et al., Nature Biotech. 22:739 (2004)]; 국제 특허공개공보 제04/071467호; 문헌[Abbadi et al., Plant Cell 16:1 (2004)]; 문헌[Napier and Sayanova, Proc . Nutrition Society 64:387-393 (2005)]; 문헌[Robert et al., 작용성 Plant Biology 32:473-479 (2005)]; 및 미국 특허공개공보 제2004/0172682호).
트라우스토키트리드로부터 생산된 오일은 종종 상응하는 어유 또는 미세조류 오일보다 단순한 다중불포화 지방산 프로파일을 갖는다(문헌[Lewis, T.E., Mar. Biotechnol. 1: 580-587 (1999)]). 트라우스토키트리드 종의 균주는 유기체에 의해 생산된 높은 백분율의 총 지방산으로서 오메가-3 지방산을 생산하는 것으로 보고되었다(미국 특허공보 제5,130,242호; 문헌[Huang, J. et al., J. Am. Oil. Chem. Soc. 78: 605-610 (2001)]; 문헌[Huang, J. et al., Mar. Biotechnol. 5: 450-457 (2003)] 참고). 그러나, 단리된 트라우스토키트리드는 생산된 PUFA의 동일성 및 양이 변하고, 이에 따라 상기 기술된 일부 균주는 바람직하지 않은 PUFA 프로파일을 가질 수 있다.
따라서, 단일 세포 유기체의 재조합 변형을 통해 바람직한 PUFA 프로파일을 생성하기 위한 방법에 대해 계속되는 요구가 존재한다. 이러한 기술 문제를 위한 해법은 청구범위에 특징지어진 양태에 의해 제공된다.
본 개시내용은 미세조류를 변형시켜 다중불포화 지방산 신타제(PUFA 신타제)를 코딩하는 유전자의 발현 수준을 변경시키는 단계; 및 변형된 미세조류를 오메가-3 PUFA가 강화된 지질이 생산되는 조건 하에 배양하는 단계를 포함하는, 오메가-3 다중불포화 지방산(PUFA), 예컨대 EPA가 강화된 지질의 생산 방법을 제공한다. 예를 들어, 본 발명의 방법은 다중불포화 지방산 신타제 아단위 1(PFA1)을 코딩하는 PFA1의 발현 수준을 변경시킴, 및/또는 다중불포화 지방산 신타제 아단위 2(PFA2)을 코딩하는 PFA2의 발현 수준을 변경시킴, 및/또는 다중불포화 지방산 신타제 아단위 3(PFA3)을 코딩하는 PFA3의 발현 수준을 변경시킴을 포함한다. 한 양태에서, 미세조류는 PFA1 및/또는 PFA3의 발현 수준을 증가시키도록 변형된다. 일부 양태에서, 미세조류는 PFA1의 발현 수준을 증가시키도록 변형된다. 다른 양태에서, 미세조류는 PFA1 및 PFA3의 발현 수준을 증가시키도록 변형된다.
일부 양태에서, 변형될 미세조류는 라비린툴로미세테스(Labyrinthulomycetes)이다. 일부 양태에서, 변형될 미세조류는 트라우스토키트리드, 바람직하게는 쉬조키트리움 또는 트라우스토키트리움이다. 바람직한 양태에서, 변형될 미세조류는 쉬조키트리움이다. 특정 양태에서, 변형될 미세조류는 쉬조키트리움 종 ATCC 20888, 또는 이의 유도체이다.
한 양태에서, 미세조류는 PFA1을 코딩하는 유전자 및/또는 PFA3을 코딩하는 유전자의 다수의 카피를 함유하도록 변형된다. 바람직한 양태에서, 미세조류는 PFA1을 코딩하는 유전자의 다수의 카피를 함유하도록 변형된다. 한 양태에서, 미세조류는 PFA1을 코딩하는 유전자의 2 내지 10개의 카피를 함유한다. 다른 양태에서, 미세조류는 PFA1을 코딩하는 유전자의 3 내지 7개의 카피를 함유한다. 추가 양태에서, 미세조류는 PFA1을 코딩하는 유전자의 4 내지 6개의 카피를 함유한다.
다른 양태에서, 미세조류는 PFA1을 코딩하는 유전자 및 PFA3을 코딩하는 유전자 둘 다의 다수의 카피를 함유하도록 변형된다.
다른 양태에서, 미세조류는 PFA1을 코딩하는 유전자 및/또는 PFA3을 코딩하는 유전자를 프로모터 유전자조작에 의해 과발현하도록 변형된다. 예를 들어, 본 발명의 구축물은 PFA1을 코딩하는 유전자 및/또는 PFA3을 코딩하는 유전자의 발현을 구동하여 재조합 미세조류에서 이들 유전자의 발현 수준을 증가시키는 하나 이상의 프로모터를 삽입하고/거나 치환하도록 변형될 수 있다.
일부 양태에서, PFA1, PFA2 및/또는 PFA3을 코딩하는 유전자는 내인성으로 EPA-풍부 지질을 생산하는 라비린툴로미세테스로부터 유래한다. 한 양태에서, PFA1, PFA2 및/또는 PFA3을 코딩하는 유전자는 내인성으로 EPA-풍부 지질을 생산하는 쉬조키트리움으로부터 유래한다. 바람직한 양태에서, PFA1, PFA2 및/또는 PFA3을 코딩하는 유전자는 쉬조키트리움 종 ATCC PTA-9695 또는 이의 작용성 등가물로부터 유래한다. EPA-풍부 지질은 상당한 수준의 EPA를 갖는 지질, 예컨대 5% 이상의 EPA를 함유하는 지질로서 정의된다. 다른 양태에서, 상당한 수준의 EPA를 갖는 지질은 10% 이상의 EPA, 15% 이상의 EPA, 또는 20% 이상의 EPA를 함유하는 지질로서 정의된다.
바람직한 양태에서, 변형될 미세조류(즉, 숙주 미세조류)의 하나 이상의 내인성 PUFA 신타제 유전자가 돌연변이되거나 결실된다. 더욱 바람직한 양태에서, 변형될 미세조류의 모든 내인성 PUFA 신타제 유전자가 돌연변이되거나 결실된다.
놀랍게도, PFA1을 코딩하는 유전자 및/또는 PFA3을 코딩하는 유전자를 재조합 미세조류에서 과발현시킴으로써, EPA 생산이 숙주 미세조류에 의한 EPA 생산에 비해 2배 이상만큼 증가될 수 있음이 밝혀졌다. 일부 양태에서, 본 발명의 재조합 미세조류에 의한 EPA 생산은 숙주 미세조류에 의한 EPA 생산에 비해 5배 이상만큼 증가된다. 일부 양태에서, 본 발명의 재조합 미세조류에 의한 EPA 생산은 숙주 미세조류에 의한 EPA 생산에 비해 10배 이상만큼 증가된다. 추가 양태에서, 본 발명의 재조합 미세조류에 의한 EPA 생산은 숙주 미세조류에 의한 EPA 생산에 비해 20배 이상만큼 증가된다.
추가적으로, PFA1을 코딩하는 유전자 및/또는 PFA3을 코딩하는 유전자를 재조합 미세조류에서 과발현시킴으로써, EPA:도코사헥사엔산(DHA) 비가 숙주 미세조류에 의한 EPA 생산에 비해 2배 이상만큼 증가됨이 밝혀졌다. 일부 양태에서, 재조합 미세조류에서, EPA:도코사헥사엔산(DHA) 비는 숙주 미세조류에 의한 EPA 생산에 비해 10배 이상만큼 증가된다. 일부 양태에서, 본 발명의 재조합 미세조류에서, EPA:도코사헥사엔산(DHA) 비는 숙주 미세조류에 의한 EPA 생산에 비해 20배 이상만큼 증가된다. 추가 양태에서, 본 발명의 재조합 미세조류에서, EPA:도코사헥사엔산(DHA) 비는 숙주 미세조류에 의한 EPA 생산에 비해 50배 이상만큼 증가된다.
일부 양태에서, 본 발명에 따라 생산된 EPA가 강화된 지질은 DHA가 더욱 강화된다.
본 개시내용은 또한 미세조류를 변형시켜 유전자 PFA1, PFA2 및/또는 PFA3의 발현 수준을 변형시키는 단계; 및 변형된 미세조류를 배양하여 감소된 수준의 DPA n-6을 갖는 지질을 생산하는 단계를 포함하는, 감소된 수준의 DPA n-6을 갖는 지질의 생산 방법을 제공한다.
본원은 또한 다중불포화 지방산 신타제(PUFA 신타제)를 코딩하는 유전자의 발현 수준을 변형시키도록 변형된 재조합 유기체에 관한 것이다. 일부 양태에서, 본 발명의 유기체는 천연 PUFA 신타제 유전자를 함유할 수 있다. 천연 PUFA 신타제 유전자를 함유하는 유기체는, 비제한적으로, 미세조류를 포함한다. 예를 들어, 본 발명의 재조합 미세조류는 다중불포화 지방산 신타제 아단위 1(PFA1)을 코딩하는 PFA1의 발현 수준을 변경시키고/거나 다중불포화 지방산 신타제 아단위 2(PFA2)를 코딩하는 PFA2의 발현 수준을 변경시키고/거나 다중불포화 지방산 신타제 아단위 3(PFA3)을 코딩하는 PFA3의 발현 수준을 변경시키도록 변형된다. 한 양태에서, 미세조류는 PFA1 및/또는 PFA3의 발현 수준을 증가시키도록 변형된다. 일부 양태에서, 미세조류는 유전자 PFA1의 발현 수준을 증가시키도록 변형된다. 다른 양태에서, 미세조류는 PFA1 및 PFA3의 발현 수준을 증가시키도록 변형된다. 다른 양태에서, 본 발명의 유기체, 예컨대, 비제한적으로, 식물은 PUFA 신타제 유전자를 함유하지 않는다. 이러한 유기체는 먼저 TPUFA 신타제 시스템을 발현하도록 변형되어 다중불포화 지방산의 생산을 가능하게 하여야 한다. 이어서, 생성된 재조합 유기체, 예컨대 식물은 PUFA 신타제를 코딩하는 유전자의 발현 수준을 변경시키도록 추가로 변형된다.
본원은 또한 다중불포화 지방산 신타제를 코딩하는 유전자의 변형된 발현 수준을 야기하는 돌연변이 과정, 예컨대 선택적인 압력을 겪은 돌연변이 미세조류에 관한 것으로서, 돌연변이 미세조류는 야생형 비돌연변이 미세조류와 비교하여 증가된 수준의 EPA를 생산한다.
본원은 또한 상기 언급된 재조합 미세조류 균주의 제조 방법에 관한 것이다. 본원은 또한 상기 언급된 재조합 미세조류 균주에 의해 생산된 PUFA 오일에 관한 것이다.
본 개시내용의 성질, 목적 및 이점의 추가 이해를 위하여, 유사한 참조 번호가 유사한 요소를 나타내는 하기 도면과 함께 하기 상세한 설명을 참조해야만 한다.
도 1은 쉬조키트리움 종 ATCC PTA-9695 PUFA 신타제 아단위, PFA1, PFA2 및 PFA3의 유전자 아키텍쳐를 도시한다.
도 2는 쉬조키트리움 종 ATCC PTA-9695, 트라우스토키트리움 종 ATCC PTA-10212 및 쉬조키트리움 종 ATCC 20888 PUFA 신타제의 도메인 아키텍쳐를 도시한다.
도 3은 실시예 1에 추가로 기술되는 쉬조키트리움 종 ATCC PTA-9695로부터의 PUFA 신타제 아단위 유전자에 의한 쉬조키트리움 종 N230D의 천연 PUFA 신타제 아단위 유전자의 표적화된 치환에 의해 생산된 쉬조키트리움 균주 B156의 균주 계통을 도시한다.
도 4는 내인성 PFA1, PFA2 및 PFA3 유전자가 각각의 자리에서 쉬조키트리움 종 ATCC PTA-9695로부터의 PFA1, PFA2 및 PFA3 유전자에 의해 치환된 재조합 쉬조키트리움 종 N230D와 비교되는, 내인성 PFA1, PFA2 및 PFA3 PUFA 신타제 아단위 유전자를 함유하는 천연 쉬조키트리움 종 N230D에서 25℃(도 4A) 또는 30℃(도 4B)에서 배양한 후 지방산 메틸 에스터 프로파일(FAME)의 분석물을 도시한다(균주 B156-2). 특히 관심있게는, C20:5 n-3은 EPA이고, C22:5 n-6은 DPA n-6이고, C22:6 n-3은 DHA이다.
도 5는 내인성 PFA1, PFA2 및 PFA3 유전자가 제거되고 쉬조키트리움 종 ATCC PTA-9695로부터의 PFA1, PFA2 및 PFA3 유전자가 임의로 통합된 재조합 쉬조키트리움 종 ATCC 20888과 비교되는, 내인성 PFA1, PFA2 및 PFA3 PUFA 신타제 유전자를 함유하는 천연 쉬조키트리움 종 ATCC 20888에서 30℃에서 배양한 후 FAME 프로파일을 도시한다(균주 B149).
도 6은 쉬조키트리움 종 ATCC PTA-9695 PFA1 유전자의 표지된 부분에 의해 프로빙된 쉬조키트리움 균주 B145(B145-16 및 B145-33) 및 B149(E9, B149-3 및 B149-4)의 서던 블롯이다. 쉬조키트리움 균주 B145는 쉬조키트리움 종 ATCC PTA-9695로부터의 PFA1에 의한 쉬조키트리움 종 ATCC 20888의 천연 PFA1 PUFA 신타제 유전자의 표적화된 치환에 의해 생산되었다. 따라서, 재조합 균주 B145는 쉬조키트리움 종 ATCC PTA-9695 PFA1 유전자의 하나의 카피를 함유하고, 재조합 균주 B149의 PFA1의 카피 수를 측정하기 위한 비교에 사용되었다. 농도계 분석은 평균 참고 밴드(B145)가 7,165 단위와 동등하였음을 나타냈다. 대조적으로, 균주 B149로부터의 밴드("E9")는 42,747 단위(약 6개 카피의 PFA1)인 것으로 계산되었고; 균주 B149-3으로부터의 밴드는 37,897 단위(약 5 내지 6개 카피의 PFA1)인 것으로 계산되었고; 균주 B149-4로부터의 밴드는 33,928 단위(약 4 내지 5개 카피의 PFA1)인 것으로 계산되었다.
도 7은 B149의 쉬조키트리움 돌연변이 균주 내의 쉬조키트리움 종 ATCC PTA-9695로부터의 PFA1 유전자의 다중-카피 삽입에 대한 개략도를 도시한다.
도 8은 모 균주(재조합 균주 B156-2) 및 쉬조키트리움 종 ATCC 20888의 딸 균주(쉬조키트리움 종 N230D) 둘 다와 비교되는, 쉬조키트리움 ATCC PTA-9695로부터의 PFA1 유전자, PFA3 유전자, 및 PFA1 및 PFA3 유전자 둘 다를 과발현하는 재조합 쉬조키트리움 균주에서 EPA 및 DHA 생산을 도시한다.
도 9는 정량 PCR(qPCR)에 의해 측정된 쉬조키트리움 종 ATCC PTA-9695 및 ATCC PTA-10208에서의 PFA1, PFA2 및 PFA3 발현을 도시한다.
본 개시내용을 상세히 기술하기 전에, 특정 양태의 변형이 수행될 수 있고 여전히 첨부된 청구범위의 범주에 속하므로, 본 개시내용은 하기 기술된 개시내용의 특정 양태로 제한되지 않는다. 사용된 용어가 특정 양태를 기술할 목적이고, 제한하려는 의도가 아님이 또한 이해되어야 한다. 대신에, 본 개시내용의 범주는 첨부된 청구범위에 의해 확립될 것이.
본 명세서 및 첨부된 청구범위에서, 단수 형태는 문맥상 명백히 달리 지시되지 않는 한 복수 형태를 포함한다. 달리 정의되지 않는 한, 본원에 사용된 모든 기술 및 과학 용어는 본 개시내용이 속하는 분양의 당업자에게 통상적으로 이해되는 바와 동일한 의미를 갖는다.
본원에 사용된 "단리된" 생물학적 성분(예컨대, 핵산 또는 단백질)은, 성분의 화학적 또는 작용성 변화를 수행하면서, 성분이 자연적으로 발생하는 유기체의 세포(즉, 다른 염색체 및 비-염색체 DNA 및 RNA, 및 단백질) 내의 다른 생물학적 성분으로부터 실질적으로 분리되거나 별도로 생산되거나 정제되었다(예컨대, 핵산은 염색체에서 핵산을 잔류 DNA와 연결하는 화학적 결합을 파괴함으로써 염색체로부터 단리될 수 있음). "단리된" 핵산 분자 및 단백질은 표준 정제 방법에 의해 정제된 핵산 분자 및 단백질을 포함한다. 상기 용어는 또한 숙주 세포에서의 재조합 발현에 의해 제조된 핵산 및 단백질, 및 화학적으로 합성된 핵산 분자, 단백질 및 펩티드를 포괄한다.
본원에 사용된 용어 "핵산 분자"는 RNA의 센스 및 안티-센스 가닥 둘 다를 포함할 수 있는 뉴클레오티드의 중합체 형태, cDNA, 게놈 DNA, 및 합성 형태 및 이들의 혼합 중합체를 지칭할 수 있다. 뉴클레오티드는 리보뉴클레오티드, 데옥시리보뉴클레오티드, 또는 각각의 유형의 뉴클레오티드의 변형된 형태를 지칭할 수 있다. 본원에 사용된 "핵산 분자"는 "핵산" 및 "폴리뉴클레오티드"와 동의어이다. 핵산 분자는 달리 특정되지 않는 한 통상적으로 길이가 10개 이상의 염기이다. 상기 용어는 DNA의 단일- 및 이중-가닥 형태를 포함한다. 핵산 분자는 천연 발생 및/또는 비-천연 발생 뉴클레오티드 연결기에 의해 함께 연결된 천연 발생 및 변형된 뉴클레오티드 중 하나 또는 둘 다를 포함할 수 있다.
핵산 분자는, 당업자에 의해 즉시 인정될 수 있는 바와 같이 화학적으로 또는 생화학적으로 변형될 수 있거나, 비-천연 또는 유도체화된 뉴클레오티드 염기를 함유할 수 있다. 이러한 변형은, 예를 들어, 유사한 뉴클레오티드간 변형에 의한 하나 이상의 천연 발생 뉴클레오티드의 표지, 메틸화, 치환을 포함한다(예컨대, 비하전된 연결기, 예를 들어, 메틸 포스폰에이트, 포스포트라이에스터, 포스포르아미데이트, 카밤에이트 등; 하전된 연결기, 예를 들어, 포스포로티오에이트, 포스포로다이티오에이트 등; 매달린 모이어티, 예를 들어, 펩티드; 삽입제, 예를 들어, 아크리딘, 소랄렌 등; 킬레이터; 알킬화제; 및 변형된 연결기, 예를 들어, 알파 아노머 핵산 등). 용어 "핵산 분자"는 또한 임의의 위상적 형태, 예컨대 단일-가닥, 이중-가닥, 부분 중복, 삼중, 헤어핀형, 환형 및 패들락(padlock) 형태를 포함한다.
본원에 사용된 바와 같이, 제1 뉴클레오티드 서열은, 제1 핵산 서열이 제2 핵산 서열과 작용성으로 관련될 때, 제2 핵산 서열에 "작동적으로 연결된다". 재조합적으로 생산될 때, 작동적으로 연결된 핵산 서열은 일반적으로 인접하고, 2개의 단백질-코딩 영역에 결합될 필요가 있을 때, 동일한 판독 프레임(예컨대, 폴리시스트로닉 ORF)에 존재한다. 그러나, 핵산이 작동적으로 연결되도록 인접할 필요는 없다.
조절 서열 및 코딩 서열을 참고하여 사용될 때, 용어 "작동적으로 연결된"은 조절 서열이 연결된 코딩 서열의 발현에 영향을 줌을 의미한다. "조절 서열" 또는 "제어 요소"는 전사의 시점 및 수준/양, RNA 가공 또는 안정성, 또는 연관된 코딩 서열의 번역에 영향을 주는 뉴클레오티드 서열을 지칭한다. 조절 서열은 프로모터; 번역 리더 서열; 인트론; 인핸서; 스템-루프(stem-loop) 구조; 리프레서 결합 서열; 종결 서열; 및 폴리아데닐화 인식 서열을 포함할 수 있다. 특정 조절 서열은 작동적으로 연결된 코딩 서열의 상류 및/또는 하류에 위치할 수 있다. 또한, 코딩 서열에 작동적으로 연결된 특정 조절 서열은 이중-가닥 핵산 분자의 회합된 상보적 가닥에 위치할 수 있다.
본원에 사용된 용어 "프로모터"는 전사의 개시로부터 상류에 존재할 수 있고 전사를 개시하는 RNA 폴리머라제 및 다른 단백질의 인식 및 결합에 관여할 수 있는 DNA의 영역을 지칭한다. 프로모터는 세포에서의 발현을 위해 코딩 서열에 작동적으로 연결될 수 있거나, 프로모터는 세포에서의 발현을 위해 코딩 서열에 작동적으로 연결될 수 있는 신호 서열을 코딩하는 뉴클레오티드 서열에 작동적으로 연결될 수 있다. "유도성" 프로모터는 환경 조절 하에 존재할 수 있는 프로모터일 수 있다.
임의의 유도성 프로모터는 본 발명의 일부 양태에서 사용될 수 있다(문헌[Ward et al. (1993) Plant Mol. Biol. 22:361-366] 참고). 유도성 프로모터에 의해 , 전사 속도는 유도제에 응답하여 증가한다. 예시적인 유도성 프로모터는 비제한적으로, 구리에 응답하는 ACEI 시스템으로부터의 프로모터; 벤젠설폰아미드 제초제 완화제에 응답하는 옥수수로부터의 In2 유전자; Tn10으로부터의 Tet 리프레서; 및 스테로이드 호르몬 유전자로부터의 유도성 프로모터를 포함하고, 이들의 전사 활성은 글루코코르티코스테로이드 호르몬에 의해 유도될 수 있다(문헌[Schena et al. (1991) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88:0421]).
PFA1, PFA2 및 PFA3 유전자의 발현을 구동하는데 사용될 수 있는 프로모터의 예는 종래 특허(미국 특허공보 제8,945,875호 및 미국 특허공보 제8,637,651호)에 기술된다. 또한, 다양한 강도의 다른 프로모터가 전체 전사체 분석에 의해 생성된 데이터를 사용하여 선택될 수 있다. 예를 들어, 칼슘-수송 ATPase(EC 3.6.3.8) 유전자, NADP-특이적 글루타메이트 탈수소효소(EC 1.4.1.4) 유전자 또는 아세틸-CoA 아세틸전달효소(EC 2.3.1.9) 유전자의 프로모터가 쉬조키트리움 종 N230D 균주의 고 발현 처리 발효에 사용될 수 있다. 나트륨-의존적 포스페이트 수송체 유전자의 프로모터는 쉬조키트리움 종 N230D 균주 발효의 지질 축적 상 동안 고 발현을 유도하는데 사용될 수 있다. 히스톤 H2B 유전자 또는 아스파테이트-세미알데하이드 탈수소효소(EC 1.2.1.11)의 프로모터는 쉬조키트리움 종 N230D 균주의 성장 상에서 PFA1 및 PFA3의 고 발현을 촉진하는데 사용될 수 있다.
본원에 사용된 용어 "이종"은 상이한 기원을 의미한다. 예를 들어, 숙주 세포가 자연에서 형질전환되지 않는 숙주 세포에서 발생하지 않는 핵산에 의해 형질전환되는 경우, 상기 핵산은 숙주 세포에 대해 이종(및 외인성)이다. 또한, 형질전환 핵산의 상이한 요소(예컨대, 프로모터, 인핸서, 코딩 서열, 종결자 등)는 서로 및/또는 형질전환된 숙주에 대해 이종일 수 있다. 본원에 사용된 용어 "이종"은 또한 숙주 세포에 미리 존재하는 핵산에 대해 서열 동일성이 있는 하나 이상의 핵산에 적용될 수 있지만, 이제 상이한 추가 서열에 연결되고/거나 상이한 카피 수 등에 존재한다.
본원에 사용된 용어 "천연"은 유기체 내의 고유 위치 또는 자연에서 발견되는 유기체의 게놈 내에, 존재하는 경우, 고유한 조절 서열을 갖는 폴리뉴클레오티드 또는 유전자의 형태를 지칭한다.
본원에 사용된 용어 "내인성"은 통상적으로 자연에서 분자를 포함하는 유기체 또는 게놈에 위치하는 폴리뉴클레오티드, 유전자 또는 폴리펩티드를 지칭한다.
본원에 사용된 용어 "형질전환" 또는 "형질도입"은 세포 내로의 하나 이상의 핵산 분자의 전달을 지칭한다. 세포 게놈으로의 핵산 분자의 혼입 또는 에피솜 복제에 의해 핵산 분자가 세포에 의해 안정적으로 복제될 때, 세포는 세포 내로 형질도입된 핵산 분자에 의해 "형질전환"된다. 본원에 사용된 용어 "형질전환"은 핵산 분자가 상기 세포 내로 도입될 수 있는 모든 기술을 포괄한다. 예는, 비제한적으로, 바이러스 벡터에 의한 형질감염; 플라스미드 벡터에 의한 형질전환; 전기천공(문헌[Fromm et al. (1986) Nature 319:791-3]); 리포펙션(문헌[Felgner et al. (1987) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84:7413-7]); 현미주사(문헌[Mueller et al. (1978) Cell 15:579-85]); 아그로박테리움-매개된 전달(문헌[Fraley et al. (1983) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80:4803-7]); 직접적인 DNA 흡수; 및 마이크로프로젝타일 밤바드먼트(microprojectile bombardment)(문헌[Klein et al. (1987) Nature 327:70])를 포함한다.
본원에 사용된 "이식유전자"는 숙주의 게놈 내로 통합되는 외인성 핵산 서열이다. 일부 예에서, 이식유전자는 이식유전자의 코딩 서열에 작동적으로 연결된 조절 서열(예컨대, 프로모터)을 함유할 수 있다.
본원에 사용된 "벡터"는 세포 내로 도입되어, 예를 들어, 형질전환된 세포를 생성하는 핵산 분자이다. 벡터는 숙주 세포에서 복제를 가능하게 하는 핵산 서열(예컨대, 복제의 기원)을 포함할 수 있다. 벡터의 예는, 비제한적으로, 플라스미드; 코스미드; 박테리오파지; 또는 외인성 DNA를 세포 내로 운반하는 바이러스를 포함한다. 벡터는 또한 하나 이상의 유전자, 안티-센스 분자, 및/또는 선택가능한 마커 유전자 및 당업계에 공지된 다른 유전 요소를 포함할 수 있다. 벡터는 세포를 형질도입하거나 형질전환하거나 감염시킬 수 있고, 이에 따라 벡터에 의해 코딩된 핵산 분자 및/또는 단백질을 세포가 발현하도록 한다. 벡터는 임의적으로 세포 내로의 핵산 분자의 도입을 달성하는데 도움을 주는 물질(예컨대, 리포좀, 및 단백질 코팅)을 포함한다.
본원에 사용된 용어 "발현"은 폴리뉴클레오티드에 의해 코딩된 mRNA의 전사 및 안정한 축적, 또는 폴리펩티드로의 이러한 mRNA의 번역을 지칭할 수 있다. 본원에 사용된 용어 "과발현"은 동일하거나 밀접하게 관련된 유전자의 내인성 발현보다 큰 발현을 지칭한다. 이종 유전자는 이의 발현이 밀접하게 관련된 내인성 유전자(예컨대, 동족체)의 발현보다 큰 경우 과발현된다.
본원에 사용된 용어 "외인성"은 특정 환경 또는 상황 내에 통상적으로 존재하지 않는 하나 이상의 핵산을 지칭한다. 예를 들어, 숙주 세포가 자연에서 형질전환되지 않은 숙주 세포에서 발생하지 않는 핵산에 의해 형질전환되는 경우, 상기 핵산은 숙주 세포에 대해 외인성이다. 본원에 사용된 용어 "외인성"은 또한 숙주 세포에 이미 존재하는 핵산에 대해 서열 동일성을 갖지만, 숙주 세포에 이미 존재하는 핵산에 대해 동일한 서열을 갖는 핵산과 상이한 세포 또는 게놈 상황에 위치하는 하나 이상의 핵산을 지칭한다. 예를 들어, 동일한 서열을 갖는 핵산과 상이한 위치의 숙주 세포의 게놈에 통합된 핵산은 숙주 세포의 게놈에 통상적으로 통합된다. 또한, 동일한 서열을 갖는 핵산이 단지 통상적으로 숙주 세포의 게놈에 존재할 때, 숙주 세포의 플라스미드 또는 벡터에 존재하는 핵산(예컨대, DNA 분자)은 숙주 세포에 대해 외인성이다.
2개의 핵산 또는 폴리펩티드 서열의 상황에서 본원에 사용된 용어 "서열 동일성" 또는 "동일성"은 특정된 비교 윈도우에 걸쳐 최대 상응성을 위해 정렬될 때 동일한 2개의 서열 내의 잔사를 지칭할 수 있다.
본원에 사용된 용어 "서열 동일성의 백분율"은 비교 윈도우에 걸쳐 2개의 최적 정렬된 서열(예컨대, 핵산 서열 및 아미노산 서열)을 비교함으로써 측정된 값을 지칭할 수 있고, 이때 비교 윈도우 내의 서열의 부분을 2개의 서열의 최적 정렬을 위해 참고 서열(첨가 또는 결실을 포함하지 않음)과 비교되는 첨가 또는 결실(즉, 갭)을 포함할 수 있다. 백분율은, 동일한 뉴클레오티드 또는 아미노산 잔기가 서열 둘 다에서 발생하여 부합된 위치의 수를 산출하는 위치의 수를 측정하고, 부합된 위치의 수를 비교 윈도우 내의 위치의 총 수로 나누고, 결과에 100을 곱해서 서열 동일성의 백분율을 산출함으로써, 계산될 수 있다.
비교를 위해 서열을 정렬하는 방법은 당업계에 널리 공지되어 있다. 다양한 프로그램 및 정렬 알고리즘이, 예를 들어 문헌[Smith and Waterman (1981) Adv. Appl. Math. 2:482]; 문헌[Needleman and Wunsch (1970) J. Mol . Biol. 48:443]; 문헌[Pearson and Lipman (1988) Proc . Natl . Acad . Sci . U.S.A. 85:2444]; 문헌[Higgins and Sharp (1988) Gene 73:237-44]; 문헌[Higgins and Sharp (1989) CABIOS 5:151-3]; 문헌[Corpet et al. (1988) Nucleic Acids Res. 16:10881-90]; 문헌[Huang et al. (1992) Comp. Appl . Biosci. 8:155-65]; 문헌[Pearson et al. (1994) Methods Mol . Biol. 24:307-31]; 문헌[Tatiana et al. (1999) FEMS Microbiol. Lett . 174:247-50]에 기술된다. 서열 정렬 방법 및 상동성 계산의 상세한 고려사항은, 예컨대, 문헌[Altschul et al. (1990) J. Mol. Biol. 215:403-10]에서 발견될 수 있다.
미국 국립생물정보센터(The National Center for Biotechnology Information: NCBI) 기본 국소 정렬 검색 도구(Basic Local Alignment Search Tool: BLAST(상표); 문헌[Altschul et al. (1990)])가 여러 서열 분석 프로그램과 함께 사용하기 위해 여러 공급원, 예컨대 미국 국립생물정보센터(미국 메릴랜드주 베테스다 소재) 및 인터넷으로부터 이용가능하다. 이러한 프로그램을 사용하여 서열 동일성을 측정하는 방법의 기술은 BLAST(상표)에 대한 "help" 섹션 하에 인터넷 상에서 이용가능하다. 핵산 서열의 비교를 위하여, BLAST(상표)(Blastn) 프로그램의 "Blast 2 sequences" 함수가 기정 변수를 사용하여 이용될 수 있다. 참고 서열에 대한 더욱 더 큰 유사성을 갖는 핵산 서열은 이러한 방법에 의해 평가될 때 증가하는 백분율 동일성을 나타낼 것이다.
본원에 사용된 용어 "실질적으로 동일한"은 80% 초과로 동일한 뉴클레오티드 서열을 지칭할 수 있다. 예를 들어, 실질적으로 동일한 뉴클레오티드 서열은 참고 서열과 81% 이상, 82% 이상, 83% 이상, 84% 이상, 85% 이상, 86% 이상, 87% 이상, 88% 이상, 89% 이상, 90% 이상, 91% 이상, 92% 이상, 93% 이상, 94% 이상, 95% 이상, 96% 이상, 97% 이상, 98% 이상, 99% 이상 또는 99.5% 이상 동일할 수 있다.
단백질을 코딩하는 핵산의 상황에서 본원에 사용된 용어 "최적화된"은 이종 뉴클레오티드 서열이 표적 숙주 유기체의 코돈 바이어스를 반영하도록 변형된 핵산을 지칭한다. 일부 양태에서, 뉴클레오티드 서열은 유전자 발현을 간섭할 수 있는 유전 요소를 제거하도록 추가로 변화될 수 있다.
유전 코드의 반복에 기인하여, 다수의 DNA 서열이 단일 아미노산 서열을 코딩하도록 디자인될 수 있음이 이해될 것이다. 따라서, 코돈 조성이 DNA가 발현되는 숙주의 전체 코돈 조성을 닮도록 코딩 영역의 뉴클레오티드 서열을 최적화시키면서, 최적화된 DNA 서열은, 예를 들어, 과잉 제한 부위 및 바람직하지 않은 RNA 2차 구조를 제거하도록 디자인될 수 있다. 합성 DNA 서열의 디자인 및 생산에 관한 지침은, 예를 들어, 국제 특허공개공보 제2013/016546호, 제2011/146524호 및 제1997/013402호; 및 미국 특허공보 제6,166,302호 및 제5,380,831호에서 발견될 수 있다.
본원에 사용된 용어 "보존적 치환"은 아미노산 잔기가 동일한 부류의 다른 아미노산을 치환하는 치환을 지칭한다. 비-보존적 아미노산 치환은 잔사가 동일한 부류에 속하지 않는 치환, 예를 들어, 중성 또는 비-극성 아미노산에 대한 염기성 아미노산의 치환이다. 보존적 치환을 수행할 목적으로 정의될 수 있는 아미노산의 부류는 당업계에 공지되어 있다.
일부 양태에서, 보존적 치환은 상이한 제2 지방족 아미노산에 대한 제1 지방족 아미노산의 치환을 포함한다. 예를 들어, 제1 아미노산이 Gly; Ala; Pro; Ile; Leu; Val; 및 Met 중 하나인 경우, 제1 아미노산은 Gly; Ala; Pro; Ile; Leu; Val; 및 Met로부터 선택되는 상이한 제2 아미노산으로 치환될 수 있다. 특정 예에서, 제1 아미노산이 Gly; Ala; Pro; Ile; Leu; 및 Val 중 하나인 경우, 제1 아미노산은 Gly; Ala; Pro; Ile; Leu; 및 Val로부터 선택되는 상이한 제2 아미노산으로 치환될 수 있다. 소수성 지방족 아미노산의 치환을 포함하는 특정 예에서, 제1 아미노산이 Ala; Pro; Ile; Leu; 및 Val 중 하나인 경우, 제1 아미노산은 Ala; Pro; Ile; Leu; 및 Val로부터 선택되는 상이한 제2 아미노산으로 치환될 수 있다.
일부 양태에서, 보존적 치환은 상이한 제2 방향족 아미노산에 대한 제1 방향족 아미노산의 치환을 포함한다. 예를 들어, 제1 아미노산이 His; Phe; Trp; 및 Tyr 중 하나인 경우, 제1 아미노산은 His; Phe; Trp; 및 Tyr로부터 선택되는 상이한 제2 아미노산으로 치환될 수 있다. 비하전된 방향족 아미노산의 치환을 포함하는 특정 예에서, 제1 아미노산이 Phe; Trp; 및 Tyr 중 하나인 경우, 제1 아미노산은 Phe; Trp; 및 Tyr로부터 선택되는 상이한 제2 아미노산으로 치환될 수 있다.
일부 양태에서, 보존적 치환은 상이한 제2 소수성 아미노산에 대한 제1 소수성 아미노산의 치환을 포함한다. 예를 들어, 제1 아미노산이 Ala; Val; Ile; Leu; Met; Phe; Tyr; 및 Trp 중 하나인 경우, 제1 아미노산은 Ala; Val; Ile; Leu; Met; Phe; Tyr; 및 Trp로부터 선택되는 상이한 제2 아미노산으로 치환될 수 있다. 비-방향족 소수성 아미노산의 치환을 포함하는 특정 예에서, 제1 아미노산이 Ala; Val; Ile; Leu; 및 Met 중 하나인 경우, 제1 아미노산은 Ala; Val; Ile; Leu; 및 Met로부터 선택되는 상이한 제2 아미노산으로 치환될 수 있다.
일부 양태에서, 보존적 치환은 상이한 제2 극성 아미노산에 대한 제1 극성 아미노산의 치환을 포함한다. 예를 들어, 제1 아미노산이 Ser; Thr; Asn; Gln; Cys; Gly; Pro; Arg; His; Lys; Asp; 및 Glu 중 하나인 경우, 제1 아미노산은 Ser; Thr; Asn; Gln; Cys; Gly; Pro; Arg; His; Lys; Asp; 및 Glu로부터 선택되는 상이한 제2 아미노산으로 치환될 수 있다. 비하전된 극성 아미노산의 치환을 포함하는 특정 예에서, 제1 아미노산이 Ser; Thr; Asn; Gln; Cys; Gly; 및 Pro 중 하나인 경우, 제1 아미노산은 Ser; Thr; Asn; Gln; Cys; Gly; 및 Pro로부터 선택되는 상이한 제2 아미노산으로 치환될 수 있다. 하전된 극성 아미노산의 치환을 포함하는 특정 예에서, 제1 아미노산이 His; Arg; Lys; Asp; 및 Glu 중 하나인 경우, 제1 아미노산은 His; Arg; Lys; Asp; 및 Glu로부터 선택되는 상이한 제2 아미노산으로 치환될 수 있다. 하전된 극성 아미노산의 치환을 포함하는 추가 예에서, 제1 아미노산이 Arg; Lys; Asp; 및 Glu 중 하나인 경우, 제1 아미노산은 Arg; Lys; Asp; 및 Glu로부터 선택되는 상이한 제2 아미노산으로 치환될 수 있다. 양으로 하전된(염기성) 극성 아미노산의 치환을 포함하는 특정 예에서, 제1 아미노산이 His; Arg; 및 Lys 중 하나인 경우, 제1 아미노산은 His; Arg; 및 Lys로부터 선택되는 상이한 제2 아미노산으로 치환될 수 있다. 양으로 하전된 극성 아미노산의 치환을 포함하는 추가 예에서, 제1 아미노산이 Arg 또는 Lys인 경우, 제1 아미노산은 Arg 및 Lys의 다른 아미노산으로 치환될 수 있다. 음으로 하전된(산성) 극성 아미노산의 치환을 포함하는 특정 예에서, 제1 아미노산이 Asp 또는 Glu인 경우, 제1 아미노산은 Asp 및 Glu의 다른 아미노산으로 치환될 수 있다.
일부 양태에서, 보존적 치환은 상이한 제2 전기적 중성 아미노산에 대한 제1 전기적 중성 아미노산의 치환을 포함한다. 예를 들어, 제1 아미노산이 Gly; Ser; Thr; Cys; Asn; Gln; 및 Tyr 중 하나인 경우, 제1 아미노산은 Gly; Ser; Thr; Cys; Asn; Gln; 및 Tyr로부터 선택되는 상이한 제2 아미노산으로 치환될 수 있다.
일부 양태에서, 보존적 치환은 상이한 제2 비-극성 아미노산에 대한 제1 비-극성 아미노산의 치환을 포함한다. 예를 들어, 제1 아미노산이 Ala; Val; Leu; Ile; Phe; Trp; Pro; 및 Met 중 하나인 경우, 제1 아미노산은 Ala; Val; Leu; Ile; Phe; Trp; Pro; 및 Met로부터 선택되는 상이한 제2 아미노산으로 치환될 수 있다.
많은 예에서, 제1 아미노산을 치환하는 보존적 치환에 사용되는 특정 제2 아미노산의 선택은 제1 및 제2 아미노산이 둘 다 속하는 상기 부류의 수를 최대화시키도록 수행될 수 있다. 따라서, 제1 아미노산이 Ser(극성 비-방향족 및 전기적 중성 아미노산)인 경우, 제2 아미노산은 다른 극성 아미노산(즉, Thr; Asn; Gln; Cys; Gly; Pro; Arg; His; Lys; Asp; 또는 Glu); 다른 비-방향족 아미노산(즉, Thr; Asn; Gln; Cys; Gly; Pro; Arg; His; Lys; Asp; Glu; Ala; Ile; Leu; Val; 또는 Met); 또는 다른 전기적 중성 아미노산(즉, Gly; Thr; Cys; Asn; Gln; 또는 Tyr)일 수 있다. 그러나, 이러한 경우에, 제2 아미노산이 Thr; Asn; Gln; Cys; 및 Gly 중 하나인 것이 바람직할 수 있는데, 이들 아미노산이 극성, 비-방향성 및 전기적 중성에 따른 모든 분류를 공유하기 때문이다. 임의적으로 보존적 치환에 사용되는 특정 제2 아미노산을 선택하는데 사용될 수 있는 추가 기준은 당업계에 공지되어 있다. 예를 들어, Thr; Asn; Gln; Cys; 및 Gly가 Ser에 대한 보존적 치환에 사용하는데 이용가능한 경우, Cys는 바람직하지 않은 가교-연결기 및/또는 다이설파이드 결합의 형성을 피하기 위해 선택에서 제외될 수 있다. 마찬가지로, Gly는, 알킬 측쇄가 없으므로, 선택에서 제외될 수 있다. 이러한 경우에, Thr이, 예컨대, 측쇄 하이드록실 기의 작용성을 보유하도록 선택될 수 있다. 그러나, 보존적 치환에 사용되는 특정 제2 아미노산의 선택은 궁극적으로 당업자의 재량에 속한다.
본원에 사용된 용어 "다중불포화 지방산" 또는 "PUFA"는 16개 이상의 탄소(예컨대, 18개 이상의 탄소, 20개 이상의 탄소, 및 22개 이상의 탄소)의 탄소 쇄 길이와 3개 이상의 탄소-탄소 이중 결합(이하, PUFA에 관해 논의된 "이중 결합"은 탄소-탄소 결합을 지칭함)(예컨대, 4개 이상의 이중 결합, 5개 이상의 이중 결합, 및 6개 이상의 이중 결합)을 갖는 지방산을 지칭하고, 이때 모든 이중 결합은 시스 배열이다.
본원에 사용된 용어 "장쇄 다중불포화 지방산" 또는 "LC-PUFA"는 3개 이상의 이중 결합을 함유하는 20개 이상의 탄소, 또는 3개 이상의 이중 결합(예컨대, 4개 이상의 이중 결합, 5개 이상의 이중 결합, 및 6개 이상의 이중 결합)을 함유하는 22개 이상의 탄소의 탄소 쇄 길이를 갖는 지방산을 지칭한다. ω-6 시리즈의 LC-PUFA는, 예를 들어, 비제한적으로, 다이-호모-감마-리놀렌산(C20:3 n-6), 아라키돈산(ARA; C20:4 n-6), 아드렌산(또한, 도코사테트라엔산 또는 DTA로 지칭됨; C22:4 n-6), 및 도코사펜타엔산(DPA n-6; C22:5 n-6)을 포함한다. ω-3 시리즈의 LC-PUFA는, 예를 들어, 비제한적으로, 에이코사트라이엔산(C20:3 n-3), 에이코사테트라엔산(C20:4 n-3), 에이코사펜타엔산(EPA; C20:5 n-3), 도코사펜타엔산(DPA n-3; C22:5 n-3), 및 도코사헥사엔산(DHA; C22:6 n-3)을 포함한다. LC-PUFA는 또한 22개 초과의 탄소 및 4개 이상의 이중 결합을 갖는 지방산, 예를 들어, 비제한적으로, C28:8(n-3)을 포함한다.
본원에 사용된 용어 "PUFA 신타제"는 PUFA의 새로운 합성을 촉진하는 효소(예컨대, LC-PUFA)를 지칭한다. 대부분의 트라우스토키트리드 PUFA 신타제는 PFA1, PFA2 및 PFA3(또는 Pfa1, PFA2 및 PFA3)으로 본원에 지정된 3개의 아단위로 구성된다. 이러한 아단위는 종래에 OrfA, OrfB, 및 OrfC(또는 ORFA, ORFB, 및 ORFC)로 지칭되었다. 세균으로부터의 PUFA 신타제는 통상적으로 PfaA, PfaB, PfaC, 및 PfaD로 지정된 4개의 아단위로 구성된다. 용어 "PUFA 신타제"는, 예를 들어, 비제한적으로, PUFA 생산을 위한 PUFA 신타제 시스템 또는 PUFA 신타제-유사 시스템을 포함한다. 일부 특정 PUFA 신타제는, 예컨대, 쉬조키트리움 종 ATCC 수탁번호 PTA-9695로부터의 PUFA 신타제와 같은 추가 표시에 의해 본원에서 지정된다. 용어 "PUFA 신타제 시스템"은 하나 이상의 PUFA 신타제, 및 PUFA 신타제(예컨대, 4'-포스포판테테인일 전달효소(PPTase) 또는 아실-CoA 합성효소(ACS))의 작용에 영향을 줄 수 있는 임의의 이종 부속 효소를 지칭한다.
본원에 사용된 용어 "작용성 등가물"은 PUFA의 생산을 촉진하는 임의의 PUFA 신타제, 또는 PUFA의 생산을 촉진하는 임의의 PUFA 신타제를 코딩하는 임의의 유전자 및/또는 뉴클레오티드 서열을 포함한다. PFA1의 작용성 등가물은 PFA1과 동일하거나 유사한 효소 활성을 갖는 임의의 폴리펩티드(또는 폴리펩티드를 코딩하는 임의의 유전자 및/또는 뉴클레오티드 서열)를 포함한다. 유사하게, PFA2의 작용성 등가물은 PFA2와 동일하거나 유사한 효소 활성을 갖는 임의의 폴리펩티드(또는 폴리펩티드를 코딩하는 임의의 유전자 및/또는 뉴클레오티드 서열)를 포함하고, PFA3의 작용성 등가물은 PFA3과 동일하거나 유사한 효소 활성을 갖는 임의의 폴리펩티드(또는 폴리펩티드를 코딩하는 임의의 유전자 및/또는 뉴클레오티드 서열)를 포함한다. 일부 양태에서, PUFA 신타제 아단위의 작용성 등가물은 PUFA 신타제 아단위에 존재하는 하나 이상의 도메인을 포함한다. 예를 들어, PFA1의 작용성 등가물은 KS 도메인, MAT 도메인, ACP 도메인, 2개 이상의 ACP 도메인, 예컨대 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10개의 ACP 도메인의 조합, 예컨대 직렬 도메인, KR 도메인, DH 도메인, 및 이들의 조합을 포함할 수 있다. PFA2의 작용성 등가물은 KS 도메인, CLF 도메인, AT 도메인, ER 도메인, 및 이들의 조합을 포함할 수 있다. PFA3의 작용성 등가물은 DH 도메인, ER 도메인, 및 이들의 조합을 포함할 수 있다. 다른 양태에서, 작용성 등가물은, 비제한적으로, 참고 아미노산 서열(즉, 서열번호 2; 서열번호 4; 서열번호 6) 내의 아미노산 잔기의 첨가 및 치환을 포함하지만, 침묵 변화를 야기하고, 이에 따라 작용성 등가물인 유전자 생성물을 생성한다. 예를 들어, 보존적 아미노산 치환은 포함된 잔기의 극성, 전하, 용해도, 소수성, 친수성, 및/또는 양극성에서의 유사성을 기준으로 수행될 수 있다.
본 개시내용은 미세조류를 변형시켜 PFA1을 코딩하는 PFA1 및/또는 PFA3을 코딩하는 PFA3의 발현 수준을 증가시키는 단계; 및 변형된 미세조류를 배양하여 EPA가 강화된 지질을 생산하는 단계를 포함하는, EPA가 강화된 지질의 생산 방법을 특징으로 한다. PFA1을 코딩하는 유전자 및/또는 PFA3을 코딩하는 유전자가 과발현된 재조합 미세조류를 또한 특징으로 한다. 이러한 재조합 미세조류는 매우 바람직한 지방산 지질 프로파일(예컨대, 증가된 수순의 EPA, 증가된 비의 EPA:DHA, 감소된 수준의 DPA n-6 등)을 생산하는 것으로 본원에서 증명되었다. 본 발명의 특정 비제한적인 양태가 이하 더욱 상세히 기술된다.
해양 트라우스토키트리드 쉬조키트리움 조류(ATCC 수탁번호 PTA-9695로 표시됨)는 작물 형질전환을 위한 PUFA 신타제 유전자의 공급원으로서도 사용될 수 있는 높은 ω-3/ω-6 비를 갖는 오일을 생산한다(국제 특허공개공보 제2015/081270호 참조). 추가적으로, 이러한 쉬조키트리움은 DHA 외에 충분한 수준의 EPA를 함유하는 오일을 생산할 수 있다. 상당한 양의 EPA를 생산하는 능력은 일부 다른 트라우스토키트리움 균주(예를 들어, 쉬조키트리움 종 ATCC 수탁번호 20888)와 비교된다(미국 특허공개공보 제2013/0150599A1호; 국제 특허공개공보 제2013/016546호 참조). 일부 양태에서, 쉬조키트리움 종 ATCC PTA-9695로부터 유도된 하나 이상의 PUFA 신타제 아단위, 또는 이의 작용성 등가물은 미세조류에서 재조합적으로 발현된다. 바람직한 양태에서, 쉬조키트리움 종 ATCC PTA-9695로부터의 하나 이상의 PUFA 신타제 아단위를 코딩하는 유전자는 미세조류에서 재조합적으로 과발현된다. 특히, 쉬조키트리움 종 ATCC PTA-9695로부터의 하나 이상의 PUFA 신타제 아단위를 코딩하는 유전자(과발현됨)는 PFA1을 코딩하는 유전자 및 PFA3을 코딩하는 유전자, 바람직하게는 PFA1을 코딩하는 유전자, 및 임의적으로 PFA3을 코딩하는 유전자로부터 선택된다.
재조합 숙주 세포를 사용하는 지질의 생산 방법
본 발명은 PUFA 신타제 시스템을, PUFA를 생산하기에 효과적인 조건 하에 숙주 세포에서 발현하는 단계를 포함하는 하나 이상의 PUFA의 생산 방법에 관한 것으로서, 상기 PUFA 신타제 시스템은 본원에 기술된 단리된 핵산 분자 및 재조합 핵산 분자, 및 이들의 조합 중 어느 하나를 포함하고, 하나 이상의 PUFA가 생산된다. 일부 양태에서, 하나 이상의 PUFA는 EPA, DHA, 또는 이들의 조합을 포함한다. 일부 양태에서, 숙주 세포는 식물 세포, 단리된 동물 세포, 또는 미생물 세포이다. 일부 양태에서, 숙주 세포는 트라우스토키트리드이다.
본 발명은 하나 이상의 PUFA 신타제 유전자를, 지질을 생산하기에 효과적인 조건 하에 숙주 세포에서 발현시키는 단계를 포함하는, EPA, DHA, 또는 이들의 조합이 강화된 지질의 생산 방법에 관한 것으로서, 하나 이상의 PUFA 신타제 유전자는 본원에 기술된 단리된 핵산 분자 및 재조합 핵산 분자, 및 이들의 조합 중 어느 하나를 포함하고, EPA, DHA 또는 이들의 조합이 강화된 지질이 생산된다.
본 발명은 또한 하나 이상의 PUFA 신타제 유전자를, 지질을 생산하기에 효과적인 조건 하에 숙주 세포에서 발현시키는 단계; 및 지질을 숙주 세포로부터 단리하는 단계를 포함하는, 지질을 숙주 세포로부터 단리하는 방법에 관한 것으로서, 상기 숙주 세포 내의 PUFA 신타제 시스템은 본원에 기술된 단리된 핵산 분자 및 재조합 핵산 분자, 및 이들의 조합 중 어느 하나를 포함한다.
일부 양태에서, PUFA를 함유하는 하나 이상의 지질 분획은 숙주 세포로부터 단리된다. 일부 양태에서, 숙주 세포로부터 단리된 하나 이상의 분획은 총 지방산 분획, 스테롤 에스터 분획, 트라이글리세리드 분획, 유리 지방산 분획, 스테롤 분획, 다이아실글리세롤 분획, 인지질 분획, 또는 이들의 조합을 포함한다. 일부 양태에서, PUFA는 숙주 세포로부터 단리되고, PUFA는, 숙주 세포로 도입된 PUFA 신타제 시스템의 조성을 기준으로, 오메가-3 지방산, 또는 오메가-6 지방산, 또는 이들의 조합이 강화된다. 일부 양태에서, PUFA는, 숙주 세포로 도입된 PUFA 신타제 시스템의 조성을 기준으로, DHA, EPA, 또는 이들의 조합이 강화된다. 일부 양태에서, PUFA는 DHA, EPA, 또는 이들의 조합이 강화된다. 일부 양태에서, 숙주 세포로부터 단리된 PUFA의 PUFA 프로파일은 고 농도의 EPA 및 저 농도의 DHA, ARA, DPA n-6, 또는 이들의 조합을 포함한다. 일부 양태에서, 숙주 세포로부터 단리된 PUFA의 PUFA 프로파일은 고 농도의 DHA 및 EPA, 및 저 농도의 ARA, DPA n-6, 또는 이들의 조합을 포함한다. 일부 양태에서, 숙주 세포로부터 단리된 PUFA의 PUFA 프로파일은 고 농도의 EPA 및 저 농도의 DHA, ARA, DPA n-6, 또는 이들의 조합을 포함한다.
본 발명은 PUFA 신타제 활성을 발현시키는데 효과적인 조건 하에 유기물에서 본원에 기술된 단리된 핵산 분자 및 재조합 핵산 분자, 및 이들의 조합을 발현시키는 단계를 포함하는, 불활성 또는 결실된 PUFA 신타제 활성을 치환하거나, 신규한 PUFA 신타제 활성을 도입하거나, PUFA 신타제 활성을 갖는 유기물에 존재하는 PUFA 신타제 활성을 강화하는 방법에 관한 것이다. 일부 양태에서, 핵산 분자는 하나 이상의 PUFA 신타제 아단위(PFA1, PFA2 또는 PFA3)를 코딩하는 하나 이상의 폴리뉴클레오티드 서열을 포함한다. 바람직한 양태에서, 핵산 분자는 PFA1 및/또는 PFA3을 코딩하는 본원에 기술된 하나 이상의 폴리뉴클레오티드 서열을 포함한다. 일부 양태에서, 유기체의 PUFA 프로파일은 본 발명의 하나 이상의 핵산 분자의 도입에 의해 변경된다.
일부 양태에서, PFA1을 코딩하는 유전자 및/또는 PFA3을 코딩하는 유전자의 발현 수준은 본원에 기술된 재조합 숙주 세포에서 증가되거나 강화된다. 바람직한 양태에서, 재조합 숙주 세포는 미세조류, 예컨대 트라우스토키트리드이다. 하기 실시예에서 더욱 상세히 논의된 바와 같이, 높은 수준의 지질을 생산하는 쉬조키트리움 종에서 EPA-풍부 지질을 생산하는 쉬조키트리움로부터의 PFA1을 코딩하는 유전자 및/또는 PFA3을 코딩하는 유전자의 과발현은 야생형 쉬조키트리움에 존재하는 것보다 더욱 바람직한 PUFA 프로파일을 야기한다.
일부 양태에서, 변경된 PUFA 프로파일은 오메가-3 지방산의 증가 및 오메가-6 지방산의 감소를 포함한다. 일부 양태에서, DHA의 양은 증가하는 반면, 하나 이상의 EPA, ARA, DPA n-6, 또는 이들의 조합의 양은 유지되거나 감소한다. 일부 양태에서, EPA 및 DHA의 양은 증가하는 반면, ARA, DPA n-6, 또는 이들의 조합의 양은 유지되거나 감소한다. 일부 양태에서, EPA의 양은 증가하는 반면, 하나 이상의 DHA, ARA, DPA n-6, 또는 이들의 조합의 양은 유지되거나 감소한다. 일부 양태에서, 핵산 분자는 PFA1 코딩 서열 또는 이의 하나 이상의 도메인으로부터의 폴리뉴클레오티드 서열을 포함한다. 일부 양태에서, 핵산 분자는 PFA1 또는 이의 하나 이상의 도메인을 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하고, 유기체에서 오메가-3 지방산의 양은 증가하는 반면, 오메가-6 지방산의 양은 감소한다. 일부 양태에서, 핵산 분자는 PFA3 코딩 서열 또는 이의 하나 이상의 도메인으로부터의 폴리뉴클레오티드 서열을 포함한다. 일부 양태에서, 핵산 분자는 PFA3 또는 이의 하나 이상의 도메인을 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하고, 유기체에서 오메가-3 지방산의 양은 증가하는 반면, 오메가-6 지방산의 양은 감소한다.
본 발명은 본원에 기술된 단리된 핵산 분자 및 재조합 핵산 분자, 및 이들의 조합 중 어느 하나를 EPA, DHA, 또는 이들의 조합을 생산하기에 효과적인 조건 하에 유기체에서 발현시키는 단계를 포함하는, PUFA 신타제 활성을 갖는 유기체에서 EPA, DHA, 또는 이들의 조합의 생산을 증가시키는 방법에 관한 것으로서, PUFA 신타제 활성은 불활성 또는 결실된 활성을 치환하고 신규한 활성을 도입하거나, 유기체에 존재하는 활성을 강화시키고, 유기체에서 DHA, EPA, 또는 이들의 조합의 생산은 증가한다.
바람직한 양태에서, 본 발명은 유기체에서 PFA1을 코딩하는 유전자 및/또는 PFA3을 코딩하는 유전자의 도입 및/또는 발현 수준의 증가를 포함하는, PUFA 신타제 활성을 갖는 유기체에서 EPA, DHA, 또는 이들의 조합의 생산을 증가시키는 방법에 관한 것이다. 일부 양태에서, 유기체에서 PFA1을 코딩하는 유전자 및/또는 PFA3을 코딩하는 유전자의 발현 수준은 유기체로의 PFA1을 코딩하는 뉴클레오티드 서열 및/또는 PFA3을 코딩하는 뉴클레오티드 서열의 다수의 카피의 도입에 의해 증가된다. 유기체로의 PFA1을 코딩하는 뉴클레오티드 서열, 및 임의적으로 PFA3을 코딩하는 뉴클레오티드 서열의 다수의 카피의 도입은 표적화되거나 임의적일 수 있다. 다른 양태에서, 유기체에서 PFA1을 코딩하는 뉴클레오티드 서열 및/또는 PFA3을 코딩하는 뉴클레오티드 서열의 발현 수준은 PFA1을 코딩하는 뉴클레오티드 서열 및/또는 PFA3을 코딩하는 뉴클레오티드 서열과 강한 프로모터, 예컨대 신장 인자-1(EF-1) 프로모터의 커플링에 의해 증가된다.
PUFA 신타제
본원의 양태는 PUFA 신타제를 발현하도록 유전적으로 변형된 숙주 유기체(예컨대, 미세조류)를 포함한다. 일부 양태에서, 유기체는 이종 PUFA 신타제 시스템, 예를 들어, PUFA 신타제 및 이의 하나 이상의 부속 단백질을 포함하는 작용성 이종 단백질 시스템을 발현하도록 유전적으로 변형된다. 본원의 유전적 변형은 또한 PUFA 신타제를 내인성으로 발현하는 숙주 유기체의 PUFA 생산을 개선하는 일부 양태에서 사용될 수 있다.
PUFA 신타제 시스템은 함께 작용하여 지방산 쇄의 반복적인 가공 및 비-반복적인 가공, 예컨대 트랜스-시스 이성질화 및 엔오일 환원 반응을 선택된 주기로 수행할 수 있는 다작용성 단백질을 포함할 수 있다(그리고, 단일 작용 단백질을 포함할 수 있음). 이러한 단백질은 코어 PUFA 신타제 효소 시스템 또는 코어 PUFA 신타제로서 본원에 지칭된다. 이러한 단백질에 함유된 도메인 및 모티프에 대한 일반적인 정보 및 세부사항은, 예를 들어 미국 특허공보 제6,140,486호 및 제6,566,583호; 미국 특허공개공보 제2002/0194641호, 제2004/0235127호 및 제2005/0100995호; 국제 특허공개공보 제2006/135866호; 및 문헌[Metz et al. (2001) Science 293:290-3]에서 발견될 수 있다. 작용성 PUFA 신타제 도메인은 단일 단백질(예컨대, 도메인 및 단백질은 동의어임)로서 또는 단일 단백질 내의 2개 이상의 도메인 중 하나로서 발견될 수 있다.
PUFA 신타제 활성을 갖는 효소, 이의 아단위 및/또는 도메인(및 폴리뉴클레오티드 및 이를 코딩하는 유전자)의 수많은 예는 당업계에 공지되어 있고, 본원에 개시된 이종 PUFA 신타제를 포함하는 유전적으로 변형된 숙주에서 조합될 수 있다. 이러한 PUFA 신타제 효소(또는 이의 아단위 또는 도메인)는 세균성 및 비-세균성 PUFA 신타제를 둘 다 포함한다. 비-세균성 PUFA 신타제는 진핵생물 PUFA 신타제일 수 있다. 특정한 세균성 PUFA 신타제는, 예를 들어, 미국 특허공개공보 제2008/0050505호에 기술된다.
일부 양태에서, 이종 PUFA 신타제는 하나 이상의 엔오일-ACP 환원효소(ER) 도메인(및, 일부 양태에서, 2개의 ER 도메인); 다수의 아실 담체 단백질(ACP) 도메인(예컨대, 적어도 1 내지 4개 또는 5개 이상의 ACP 도메인, 일부 양태에서 최대 6, 7, 8, 9, 10개 또는 10개 초과의 ACP 도메인); 2개 이상의 β-케토아실-ACP 신타제(KS) 도메인; 하나 이상의 아실전달효소(AT) 도메인(하기 열거된 말론일-CoA:ACP 아실전달효소 도메인에 추가하여); 하나 이상의 β-케토아실-ACP 환원효소(KR) 도메인; 2개 이상의 FabA-유사 β-하이드록시아실-ACP 탈수효소(DH) 도메인; 하나 이상의 쇄 길이 인자(CLF) 도메인; 하나 이상의 말론일-CoA:ACP 아실전달효소(MAT) 도메인; 및 FabA-유사 DH 계열의 DH가 아닌 하나 이상의 DH 도메인으로 이루어진 군으로부터 선택되는 생물학적 활성 도메인을 포함한다. 특정 양태에서, 이종 PUFA 신타제는 또한 탈수효소 보존된 활성 부위 모티프를 함유하고 Pfam 단백질 계열 데이터베이스와 비교하여 DH 도메인으로 확인된 하나 이상의 영역을 포함한다(문헌[Finn et al., Nucleic Acids Res. Database Issue 44:D279-D285 (2016)]).
일부 양태에서, 이종 PUFA 신타제는 쉬조키트리움 종 ATCC PTA-9695로부터의 아단위 PFA1(서열번호 2), PFA2(서열번호 4), 및 PFA3(서열번호 6), 또는 이의 작용성 등가물을 포함한다(미국 특허공보 제8,940,884호 참조). 다른 트라우스토키트리드의 PUFA 신타제는 또한 각각 ORF 1, ORF 2, 및 ORF 3으로서, 또는 각각 OrfA, OrfB, 및 OrfC로서 지정된다(예컨대, orfA, orfB, 및 orfC 유전자 및 상응하는 OrfA, OrfB, 및 OrfC 단백질로 지칭되는 미국 특허공보 제7,247,461호 및 제7,256,022호의 쉬조키트리움 종(ATCC-20888) 및 트라우스토키트리움 종(ATCC-20892), 및 ORF A, ORF B, 및 ORF C 유전자 및 단백질로 지칭되는 미국 특허공보 제7,368,552호의 트라우스토키트리움 아우레움(ATCC-34304))(또한, ORF 1, ORF 2, 및 ORF 3 유전자 및 단백질로 지칭되는 국제 특허공개공보 제2005/097982호의 균주 SAM2179).
예를 들어, 본원의 양태에 따른 이종 PUFA 신타제 시스템은, 예를 들어, 비제한적으로, 서열번호 2, 서열번호 4 및/또는 서열번호 6과 80% 이상(예컨대, 81% 이상, 82% 이상, 83% 이상, 84% 이상, 85% 이상, 86% 이상, 87% 이상, 88% 이상, 89% 이상, 90% 이상, 91% 이상, 92% 이상, 93% 이상, 94% 이상, 95% 이상, 96% 이상, 97% 이상, 98% 이상, 99% 이상)의 동일성을 갖는 아미노산 서열를 포함하는 하나 이상의 단백질을 포함한다. 특정 예에서, 이종 PUFA 신타제 시스템은 서열번호 2, 서열번호 4 및/또는 서열번호 6을 포함하는 하나 이상의 단백질을 포함한다. 특정 예에서, 이종 PUFA 신타제 시스템은 서열번호 2, 서열번호 4 및/또는 서열번호 6으로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 갖는 하나 이상의 단백질을 포함한다.
일부 양태는 서열번호 2, 서열번호 4 및/또는 서열번호 6의 하나 이상의 작용성 등가물 및 하나 이상의 부속 효소를 포함하는 이종 PUFA 신타제 시스템을 포함한다. 예를 들어, 시스템은 서열번호 2, 서열번호 4 및/또는 서열번호 6의 변이체, 부분, 단편 또는 유도체를 포함할 수 있고, 이러한 시스템은 PUFA 신타제 활성을 갖는다. 예를 들어, 다른 PUFA 신타제 또는 이의 아단위 또는 개별 도메인(및 이를 코딩하는 유전자 또는 폴리뉴클레오티드)의 폴리펩티드 서열은 당업계에서 이용가능한 문헌 및 생물정보학 데이터베이스에서 확인될 수 있다. 이러한 서열은, 예를 들어, 공지된 PUFA 신타제 유전자 또는 폴리펩티드 서열을 갖는 공중 이용가능한 데이터베이스의 BLAST 검색을 통해 확인될 수 있다. 이러한 방법에서, 동일성은 GAP PENALTY=10, GAP LENGTH PENALTY=0.1, 및 고넷(Gonnet) 250 시리즈의 단백질 중량 매트릭스의 기정 변수를 사용하는 정렬의 ClustalW 방법을 기준으로 할 수 있다.
추가적으로, 본원에 개시된 PUFA 신타제 유전자 또는 폴리펩티드 서열은 자연에서 다른 PUFA 신타제 동족체를 확인하는데 사용될 수 있다. 예를 들어, 본원에 개시된 각각의 PUFA 신타제 핵산 단편은 동종 단백질을 코딩하는 유전자를 단리하는데 사용될 수 있다. 서열-의존적 프로토콜을 사용하는 동종 유전자의 단리는 당업계에 널리 공지되어 있다. 서열-의존적 프로토콜의 예는, 예를 들어, 비제한적으로, 핵산 혼성화 방법; 핵산 증폭 기술의 다양한 사용(예컨대, 폴리머라제 쇄 반응(PCR), 리가제 쇄 반응(LCR), 및 가닥 치환 증폭(SDA))에 의해 예시되는 DNA 및 RNA 증폭 방법; 및 상보성에 의한 라이브러리 구축 및 선별 방법을 포함한다.
일부 양태에서, 이종 PUFA 신타제는 쉬조키트리움 PUFA 신타제 도메인(예컨대, ER 도메인, ACP 도메인, KS 도메인, AT 도메인, KR 도메인, FabA-유사 DH 도메인, CLF 도메인, MAT 도메인, 및 비-FabA-유사 DH 도메인)을 포함하고, 상기 도메인은 상이한 PUFA 신타제로부터의 하나 이상의 도메인과 조합되어 PUFA 신타제 활성을 갖는 완전한 PUFA 신타제를 형성한다.
일부 양태에서, 이종 PUFA 신타제를 포함하는 유전적으로 변형된 유기체는 다른 PUFA 신타제의 하나 이상의 도메인 또는 이의 생물학적 활성 단편에 의해 추가로 변형될 수 있다. 특정 양태에서, PUFA 신타제의 임의의 도메인은 이의 천연 구조로부터 변형되어 PUFA 신타제 시스템에서 이러한 도메인의 작용을 변형시키거나 조절할 수 있다(예컨대, 시스템에 의해 생산된 PUFA 유형 또는 이의 비를 변형시킴, 미국 특허공보 제8,003,772호 참고).
핵산 분자
본원에 사용된 "폴리뉴클레오티드"는 전통적인 포스포다이에스터 결합 또는 비-전통적인 결합(예컨대, 아미드 결합(예컨대, 펩티드 핵산(PNA)에서 발견됨))을 포함할 수 있다. 폴리뉴클레오티드는 전장 cDNA 서열의 뉴클레오티드 서열, 예컨대 비번역된 5' 및 3' 서열, 코딩 서열, 및 단편, 에피토프, 도메인, 및 핵산 서열의 변이체를 함유할 수 있다. 폴리뉴클레오티드는 임의의 폴리리보뉴클레오티드 또는 폴리데옥시리보뉴클레오티드(비변형된 RNA 또는 DNA 또는 변형된 RNA 또는 DNA일 수 있음)로 구성될 수 있다. 예를 들어, 폴리뉴클레오티드는 단일- 및 이중-가닥 DNA, 단일- 및 이중-가닥 영역의 혼합물인 DNA, 단일- 및 이중-가닥 RNA, 및 단일- 및 이중-가닥 영역의 혼합물인 RNA, 단일-가닥, 또는, 더욱 전형적으로, 이중-가닥 또는 단일- 및 이중-가닥 영역의 혼합물일 수 있는 DNA 및 RNA를 포함하는 혼성 분자로 이루어질 수 있다. 또한, 폴리뉴클레오티드는 RNA 또는 DNA, 또는 RNA 및 DNA 둘 다를 포함하는 삼중-가닥 영역으로 이루어질 수 있다. 폴리뉴클레오티드는 리보뉴클레오시드(아데노신, 구아노신, 우리딘 또는 시티딘; "RNA 분자") 또는 데옥시리보뉴클레오시드(데옥시아데노신, 데옥시구아노신, 데옥시티미딘 또는 데옥시시티딘; "DNA 분자"), 또는 이의 임의의 포스포에스터 유사체, 예컨대 포스포로티오에이트 및 티오에스터를 함유할 수 있다. 폴리뉴클레오티드는 또한 하나 이상의 변형된 염기, 또는 안정성 또는 다른 이유로 변형된 DNA 또는 RNA 골격을 함유할 수 있다. "변형된" 염기는, 예를 들어, 트라이틸화된 염기, 및 이노신과 같은 특이한 염기를 포함한다. 다양한 변형이 DNA 및 RNA에 대해 수행될 수 있고, 이에 따라, "폴리뉴클레오티드"는 화학적으로, 효소적으로 또는 대사적으로 변형된 형태를 포괄한다. 용어 "핵산 분자"는 단지 분자의 1차 및 2차 구조를 지칭하고, 임의의 특정 3차 형태로 제한되지 않는다. 따라서, 이러한 용어는 특히 선형 또는 환형 DNA 분자(예컨대, 제한 단편), 플라스미드 및 염색체에서 발견되는 이중-가닥 DNA를 포함한다. 특정 이중-가닥 DNA 분자의 구조의 논의에서, 서열은 DNA의 비-전사된 가닥(즉, mRNA에 서열 상동성을 갖는 가닥)에 따라 5'에서 3'방향으로 서열만을 제공하는 통상적인 전통에 따라 본원에 기술될 수 있다.
용어 "단리된" 핵산 분자는 천연 환경으로부터 제거될 수 있는 핵산 분자, DNA 또는 RNA를 지칭한다. 단리된 핵산 분자의 추가 예는 용액 중에서 이종 숙주 세포 또는 (부분적으로 또는 실질적으로) 정제된 폴리뉴클레오티드에 유지된 재조합 폴리뉴클레오티드를 포함하는 핵산 분자를 포함한다. 단리된 RNA 분자는 본 발명의 폴리뉴클레오티드의 생체내 또는 시험관내 RNA 전사를 포함한다. 본 발명에 따른 단리된 핵산 분자는 합성적으로 생산된 분자를 추가로 포함한다. 또한, 핵산 분자 또는 폴리뉴클레오티드는 조절 요소, 예컨대 프로모터, 리보솜 결합 부위, 또는 전사 종결자를 포함할 수 있다.
"유전자"는 폴리펩티드를 코딩하는 뉴클레오티드의 어셈블리를 지칭하고, cDNA 및 게놈 DNA 핵산을 포함한다. "유전자"는 또한 특정 단백질, 예컨대 개별 코딩 분절(엑손) 사이의 개재 서열(인트론), 및 코딩 서열을 선행하는(5' 비-코딩 서열) 및 후행하는(3' 비-코딩 서열) 조절 서열을 발현하는 핵산 단편을 지칭한다. "천연 유전자"는 이의 고유 조절 서열을 갖는 자연에서 발견되는 유전자를 지칭한다.
일부 양태에서, 본 발명은 쉬조키트리움 종 ATCC PTA-9695 PFA1(서열번호 1), 쉬조키트리움 종 ATCC PTA-9695 PFA2(서열번호 3), 쉬조키트리움 종 ATCC PTA-9695 PFA3(서열번호 5), 및 이들의 조합의 폴리뉴클레오티드 서열과 80% 이상 동일한 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하는 단리된 핵산 분자에 관한 것으로서, 폴리뉴클레오티드는 PUFA 신타제에 의한 PUFA 합성에 의해 연관된 하나 이상의 활성을 포함하는 폴리펩티드를 코딩한다.
PUFA 신타제 도메인은 이의 서열, 및 확립된 생화학적 활성을 갖는 효소 또는 도메인에 대한 구조적 상동성에 의해 동정될 수 있다. 보존된 활성 부위 모티프의 존재는 도메인이 효소적 활성을 가질 수 있는 추가적인 증거를 제공할 수 있다(예컨대, 미국 특허공보 제8.940,884호(이의 전문은 본원에 참조로 혼입됨) 참조). PUFA 신타제 도메인의 예는 PFA1 내의 베타-케토아실-ACP 신타제(KS) 도메인, 말론일-CoA:ACP 아실전달효소(MAT) 도메인, 아실 담체 단백질(ACP) 도메인, 케토환원효소(KR) 도메인, 및 베타-하이드록시아실-ACP 탈수효소(DH) 도메인; PFA2 내의 KS 도메인, 쇄 길이 인자(CLF) 도메인, 아실전달효소(AT) 도메인, 및 엔오일-ACP 환원효소(ER) 도메인; 및 PFA3 내의 DH 도메인 및 ER 도메인을 포함한다.
베타-케토아실-ACP 신타제(KS) 생물학적 활성(작용)을 갖는 폴리펩티드의 폴리펩티드 또는 도메인은 지방산 신장 반응 주기의 개시 단계를 수행할 수 있는 것으로 종래 나타났다. 용어 "베타-케토아실-ACP 신타제"는 용어 "3-케토 아실-ACP 신타제", "베타-케토아실-ACP 신타제" 및 "케토-아실 ACP 신타제"와 상호교환적으로 사용되었다. 다른 시스템에서, 신장을 위한 아실 기가 티오에스터 결합에 의해 KS의 활성 부위에서 시스테인 잔사에 연결되고, 아실-KS는 말론일-ACP와 축합되어 -케토아실-ACP, CO2, 및 비결합된("유리") KS를 형성하는 것으로 나타났다. 이러한 시스템에서, KS는 반응 주기의 다른 폴리펩티드보다 큰 기질 특이성을 갖는 것으로 나타났다. 폴리펩티드(또는 폴리펩티드의 도메인)는 공지된 KS 서열에 대한 상동성에 의해 KS 계열에 속하는 것으로 용이하게 동정될 수 있다.
말론일-CoA:ACP 아실전달효소(MAT) 활성을 갖는 폴리펩티드 또는 폴리펩티드의 도메인은 말론일 모이어티를 말론일-CoA로부터 ACP로 전달할 수 있는 것으로 종래 나타났다. 용어 "말론일-CoA:ACP 아실전달효소"는 "말론일 아실전달효소"와 상호교환적으로 사용되었다. 활성 부위 모티프(GxSxG) 이외에, MAT는 연장된 모티프(핵심 위치의 R 및 Q 아미노산)를 갖는 것으로 나타났다. 폴리펩티드(또는 폴리펩티드의 도메인)는 공지된 MAT 서열에 대한 이의 상동성 및 이의 연장된 모티프 구조에 의해 MAT 계열에 속하는 것으로 용이하게 동정될 수 있다.
아실 담체 단백질(ACP) 활성을 갖는 폴리펩티드 또는 폴리펩티드의 도메인은 티오에스터 연결기를 통해 공유 결합된 보조-인자로 지방 아실 쇄를 성장시키기 위한 담체로서 작용할 수 있는 것으로 종래 나타났다. ACP는 전형적으로 약 80 내지 약 100개 아미노산 길이이고, ACP의 고도로 보존된 세린 잔사로의 CoA의 포스포판테테인일 모이어티의 전달에 의해 불활성 아포-형태로부터 작용성 홀로-형태로 전환되는 것으로 나타났다. 아실 기가 포스포판테테인일 모이어티의 유리 말단에서 티오에스터 연결기에 의해 ACP에 부착되는 것으로 또한 나타났다. 활성 부위 모티프(LGIDS*)의 변형의 존재는 또한 ACP의 서명으로 인식되었다. 활성 부위 세린(S*)의 작용성은 세균성 PUFA 신타제에서 증명되었다(문헌[Jiang et al., J. Am. Chem. Soc. 130:6336-7 (2008)]). 폴리펩티드(또는 폴리펩티드의 도메인)는 방사성 판테테인에 의한 표지 및 공지된 ACP에 대한 서열 상동성에 의해 ACP 계열에 속하는 것으로 용이하게 동정될 수 있다.
탈수효소 또는 탈수효소(DH) 활성을 갖는 폴리펩티드 또는 폴리펩티드의 도메인은 탈수 반응을 촉진할 수 있는 것으로 종래 나타났다. PUFA 신타제 시스템의 2개 이상의 도메인은 (다른 PKS 시스템의 DH 도메인보다는) 일부 세균의 유형 II FAS 시스템과 회합된 FabA DH/이소머라제 효소에 대한 상동성을 나타내는 것으로 종래 증명되었다(예컨대, 미국 특허공보 제7,217,856호(이의 전문은 본원에 참조로 혼입됨) 참조). FabA-유사 효소는 탄소 쇄에서 트랜스 이중 결합을 초기에 생성하는 베타-하이드록시아실-ACP 탈수효소 생물학적 활성을 갖는다. DH 활성 이외에, FabA-유사 효소는 또한 시스-트랜스 이소머라제 활성을 갖는다(문헌[Heath et al., J. Biol. Chem. 271:27795 (1996)]). 용어 "FabA-유사 베타-하이드록시아실-ACP 탈수효소"는 용어 "FabA-유사 베타-하이드록시 아실-ACP 탈수효소", "베타-하이드록시아실-ACP 탈수효소" 및 "탈수효소"와 상호교환적으로 사용되었다. FabA-유사 DH/이소머라제 단백질의 증명된 활성에 근거하여, 상기 단백질에 대한 상동성을 갖는 PUFA 신타제 시스템의 도메인은 PUFA 신타제 생성물에서 시스 이중 결합을 생성할 수 있다. 폴리펩티드 또는 도메인은 또한 비-FabA-유사 DH 활성, 또는 비-FabA-유사 베타-하이드록시아실-ACP 탈수효소(DH) 활성을 가질 수 있다. 더욱 구체적으로, 길이가 약 13개 아미노산인 보존된 활성 부위 모티프는 PUFA 신타제 DH 도메인으로 종래 동정되었다: LxxHxxxGxxxxP(L 위치는 또한 모티프에서 I일 수 있다(예컨대, 미국 특허공보 제7,217,856호, 및 문헌[Donadio S, Katz L., Gene 111(1):51-60 (1992)](이들 각각의 전문은 본원에 참조로 혼입됨). 이러한 보존된 모티프는 모든 공지된 PUFA 신타제 서열의 유사한 영역에서 발견되고, 비-FabA 유사 탈수 반응과 연관될 수 있다. 추가적으로, 보존된 모티프는 Pfam 단백질 계열 데이터베이스와의 비교에 의해 DH 도메인으로 동정된 영역에서 발견된다(문헌[Finn et al., Nucleic Acids Res. Database Issue 44:D279-D285 (2016)]).
베타-케토아실-ACP 환원효소(KR) 활성을 갖는 폴리펩티드 또는 폴리펩티드의 도메인은 ACP의 3-케토아실 형태의 피리딘-뉴클레오티드-의존적 환원을 촉진할 수 있는 것으로 종래 나타났다. 용어 "베타-케토아실-ACP 환원효소"는 용어 "케토환원효소", "3-케토아실-ACP 환원효소" 및 "케토-아실 ACP 환원효소"와 상호교환적으로 사용되었다. 새로운 지방산 생합성 신장 주기에서 제1 환원 단계와 관련됨이 다른 시스템에서 증명되었다. 폴리펩티드(또는 폴리펩티드의 도메인)는 공지된 PUFA 신타제 KR에 대한 서열 상동성에 의해 KR 계열에 속하는 것으로 용이하게 동정될 수 있다.
쇄 길이 인자(CLF) 특징을 갖는 폴리펩티드 또는 폴리펩티드의 도메인은 하기 활성 또는 특징 중 하나 이상을 갖는 것으로 종래 정의되었다: (1) 신장 주기의 수 및 이에 따라 유형 II PUFA 신타제 시스템에서 최종 생성물의 쇄 길이의 측정에 관여함, (2) KS에 대해 상동성이지만, 활성 부위 시스테인이 결핌됨, 및 (3) KS에 의해 헤테로이량체화될 수 있음. CLF의 서열 특징을 갖는 도메인은 모든 현재 동정된 PUFA 신타제 시스템에서 발견되고, 각각의 경우, 다중도메인 단백질의 부분으로서 발견된다.
아실전달효소(AT) 활성을 갖는 폴리펩티드 또는 폴리펩티드의 도메인은 하기 활성 또는 특징 중 하나 이상을 갖는 것으로 종래 정의되었다: (1) 지방 아실 기를 ACP 도메인으로부터 물로 전달할 수 있고(즉, 티오에스터라제), 지방 아실 기를 유리 지방산으로서 방출함, (2) 지방 아실 기를 CoA와 같은 수용체에게 전달할 수 있음, (3) 다양한 ACP 도메인 중에 아실 기를 전달할 수 있음, 또는 (4) 지방 아실 기를 친지성 수용체 분자(예컨대, 리소포스파드산)에 전달할 수 있음. 폴리펩티드(또는 폴리펩티드의 도메인)는 공지된 AT에 대한 서열 동일성에 의해 AT 계열에 속하는 것으로 용이하게 동정될 수 있다.
엔오일-ACP 환원효소(ER) 생물학적 활성을 갖는 폴리펩티드 또는 폴리펩티드의 도메인은 지방 아실-ACP에서 트랜스-이중 결합(DH 활성에 의해 도입됨)을 환원시켜 회합된 탄소의 포화를 야기할 수 있는 것으로 종래 나타났다. PUFA 신타제 시스템의 ER 도메인은 ER 효소의 계열에 대한 상동성을 갖는 것으로 종래 나타났고(문헌[Heath et al., Nature 406: 145-146 (2000)], 이의 전문은 본원에 참조로 혼입됨), ER 동족체는 시험관 내에서 엔오일-ACP 환원효소로서 작용하는 것으로 나타났다(문헌[Bumpus et al. J. Am. Chem. Soc., 130: 11614-11616 (2008)], 이의 전문은 본원에 참조로 혼입됨)). 용어 "엔오일-ACP 환원효소"는 "엔오일 환원효소", "엔오일 ACP-환원효소" 및 "엔오일 아실-ACP 환원효소"와 상호교환적으로 사용되었다. 폴리펩티드(또는 폴리펩티드의 도메인)는 공지된 ER에 대한 서열 상동성에 의해 ER 계열에 속하는 것으로 용이하게 동정될 수 있다.
일부 양태에서, 본 발명은 하나 이상의 PUFA 신타제 도메인을 코딩하는 PFA1(서열번호 1) 내의 폴리뉴클레오티드 서열과 80% 이상 동일한 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하는 핵산 분자에 관한 것이다. 일부 양태에서, 핵산 분자는 하나 이상의 PUFA 신타제 도메인, 예컨대 KS 도메인(서열번호 7), MAT 도메인(서열번호 9), ACP 도메인(예컨대, 서열번호 13, 15, 17, 19, 21 및 23 중 어느 하나), 2개 이상의 ACP 도메인, 예컨대 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10개의 ACP 도메인의 조합, 예컨대 직렬 도메인(서열번호 11 및 이의 부분), KR 도메인(서열번호 25), DH 도메인(서열번호 27), 및 이들의 조합을 코딩하는 PFA1(서열번호 1) 내의 폴리뉴클레오티드 서열과 80% 이상 동일한 폴리뉴클레오티드 서열을 포함한다. 일부 양태에서, 핵산 분자는 하나 이상의 PUFA 신타제 도메인, 예컨대 임의의 다른 개별 도메인의 하나 이상의 카피와 조합되는 임의의 개별 도메인의 하나 이상의 카피를 코딩하는 PFA1(서열번호 1) 내의 하나 이상의 폴리뉴클레오티드 서열을 포함한다.
일부 양태에서, 본 발명은 하나 이상의 PUFA 신타제 도메인을 코딩하는 PFA2(서열번호 3) 내의 폴리뉴클레오티드 서열과 80% 이상 동일한 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하는 핵산 분자에 관한 것이다. 일부 양태에서, 핵산 분자는 하나 이상의 PUFA 신타제 도메인, 예컨대 KS 도메인(서열번호 29), CLF 도메인(서열번호 31), AT 도메인(서열번호 33), ER 도메인(서열번호 35), 및 이들의 조합을 코딩하는 PFA2(서열번호 3) 내의 폴리뉴클레오티드 서열과 80% 이상 동일한 폴리뉴클레오티드 서열을 포함한다. 일부 양태에서, 핵산 분자는 하나 이상의 PUFA 신타제 도메인, 예컨대 임의의 다른 개별 도메인의 하나 이상의 카피와 조합되는 임의의 개별 도메인의 하나 이상의 카피를 코딩하는 PFA2(서열번호 3) 내의 하나 이상의 폴리뉴클레오티드 서열을 포함한다.
일부 양태에서, 본 발명은 하나 이상의 PUFA 신타제 도메인을 코딩하는 PFA3(서열번호 5) 내의 폴리뉴클레오티드 서열과 80% 이상 동일한 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하는 핵산 분자에 관한 것이다. 일부 양태에서, 핵산 분자는 하나 이상의 PUFA 신타제 도메인, 예컨대 DH 도메인(예컨대, 서열번호 37 및 서열번호 39), ER 도메인(서열번호 41), 및 이들의 조합을 코딩하는 PFA3(서열번호 5) 내의 폴리뉴클레오티드 서열과 80% 이상 동일한 폴리뉴클레오티드 서열을 포함한다. 일부 양태에서, 핵산 분자는 하나 이상의 PUFA 신타제 도메인, 예컨대 임의의 다른 개별 도메인의 하나 이상의 카피와 조합되는 임의의 개별 도메인의 하나 이상의 카피를 코딩하는 PFA3(서열번호 5) 내의 하나 이상의 폴리뉴클레오티드 서열을 포함한다.
일부 양태에서, 본 발명은 서열번호 1과 80% 이상 동일한 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하는 핵산 분자에 관한 것으로서, 폴리뉴클레오티드 서열은 KS 활성, MAT 활성, ACP 활성, KR 활성, DH 활성, 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 PUFA 신타제 활성을 포함하는 폴리펩티드를 코딩한다.
일부 양태에서, 본 발명은 서열번호 3과 80% 이상 동일한 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하는 핵산 분자에 관한 것으로서, 폴리뉴클레오티드 서열은 KS 활성, CLF 활성, AT 활성, ER 활성, 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 PUFA 신타제 활성을 포함하는 폴리펩티드를 코딩한다.
일부 양태에서, 본 발명은 서열번호 5와 80% 이상 동일한 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하는 핵산 분자에 관한 것으로서, 폴리뉴클레오티드 서열은 DH 활성, ER 활성, 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 PUFA 신타제 활성을 포함하는 폴리펩티드를 코딩한다.
일부 양태에서, 본 발명은 서열번호 2에 따른 PFA1의 작용성 등가물을 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하는 핵산 분자에 관한 것이다.
일부 양태에서, 본 발명은 서열번호 4에 따른 PFA2의 작용성 등가물을 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하는 핵산 분자에 관한 것이다.
일부 양태에서, 본 발명은 서열번호 6에 따른 PFA3의 작용성 등가물을 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하는 핵산 분자에 관한 것이다.
본 발명은 PFA1(서열번호 2), PFA2(서열번호 4) 또는 PFA3(서열번호 6)의 아미노산 서열과 80% 이상 동일한 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하는 단리된 핵산 분자에 관한 것으로서, 폴리뉴클레오티드는 하나 이상의 PUFA 신타제 활성을 포함하는 폴리펩티드를 코딩한다.
본 발명은 본 발명의 PUFA 신타제의 하나 이상의 PUFA 신타제 도메인의 아미노산 서열과 80% 이상 동일한 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하는 핵산 분자에 관한 것이다.
일부 양태에서, 본 발명은 하나 이상의 PUFA 신타제 도메인을 포함하는 PFA1(서열번호 2) 내의 아미노산 서열과 80% 이상 동일한 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하는 핵산 분자에 관한 것이다. 일부 양태에서, 폴리펩티드는 하나 이상의 PUFA 신타제 도메인, 예컨대 KS 도메인(서열번호 8), MAT 도메인(서열번호 10), ACP 도메인(예컨대, 서열번호 14, 16, 18, 20, 22 및 24 중 어느 하나), 2개 이상의 ACP 도메인, 예컨대 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10개의 ACP 도메인의 조합, 예컨대 직렬 도메인(서열번호 12, 및 이의 부분), KR 도메인(서열번호 26), DH 도메인(서열번호 28), 및 이들의 조합을 포함하는 PFA1(서열번호 2) 내의 아미노산 서열과 80% 이상 동일한 아미노산 서열을 포함한다. 일부 양태에서, 폴리펩티드는 하나 이상의 PUFA 신타제 도메인, 예컨대 임의의 다른 개별 도메인의 하나 이상의 카피와 조합되는 임의의 개별 도메인의 하나 이상의 카피를 코딩하는 PFA1(서열번호 2) 내의 하나 이상의 아미노산 서열을 포함한다.
일부 양태에서, 본 발명은 하나 이상의 PUFA 신타제 도메인을 포함하는 PFA2(서열번호 4) 내의 아미노산 서열과 80% 이상 동일한 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하는 핵산 분자에 관한 것이다. 일부 양태에서, 폴리펩티드는 하나 이상의 PUFA 신타제 도메인, 예컨대 KS 도메인(서열번호 30), CLF 도메인(서열번호 32), AT 도메인(서열번호 34), ER 도메인(서열번호 36), 및 이들의 조합을 포함하는 PFA2(서열번호 4) 내의 아미노산 서열과 80% 이상 동일한 아미노산 서열을 포함한다. 일부 양태에서, 폴리펩티드는 하나 이상의 PUFA 신타제 도메인, 예컨대 임의의 다른 개별 도메인의 하나 이상의 카피와 조합되는 임의의 개별 도메인의 하나 이상의 카피를 코딩하는 PFA2(서열번호 4) 내의 하나 이상의 아미노산 서열을 포함한다.
일부 양태에서, 본 발명은 하나 이상의 PUFA 신타제 도메인을 포함하는 PFA3(서열번호 6) 내의 아미노산 서열과 80% 이상 동일한 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하는 핵산 분자에 관한 것이다. 일부 양태에서, 폴리펩티드는 하나 이상의 PUFA 신타제 도메인, 예컨대 DH 도메인(예컨대, 서열번호 38 또는 서열번호 40), ER 도메인(서열번호 42), 및 이들의 조합을 포함하는 PFA3(서열번호 6) 내의 아미노산 서열과 80% 이상 동일한 아미노산 서열을 포함한다. 일부 양태에서, 폴리펩티드는 하나 이상의 PUFA 신타제 도메인, 예컨대 임의의 다른 개별 도메인의 하나 이상의 카피와 조합되는 임의의 개별 도메인의 하나 이상의 카피를 코딩하는 PFA3(서열번호 6) 내의 하나 이상의 아미노산 서열을 포함한다.
일부 양태에서, 본 발명은 서열번호 2와 80% 이상 동일한 아미노산 서열을 포함하고, KS 활성, MAT 활성, ACP 활성, KR 활성, DH 활성, 및 이들의 조합으로부터 선택되는 PUFA 신타제 활성을 포함하는 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하는 핵산 분자에 관한 것이다.
일부 양태에서, 본 발명은 서열번호 4와 80% 이상 동일한 아미노산 서열을 포함하고, KS 활성, CLF 활성, AT 활성, ER 활성, 및 이들의 조합으로부터 선택되는 PUFA 신타제 활성을 포함하는 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하는 핵산 분자에 관한 것이다.
일부 양태에서, 본 발명은 서열번호 6과 80% 이상 동일한 아미노산 서열을 포함하고, DH 활성, ER 활성, 및 이들의 조합으로부터 선택되는 PUFA 신타제 활성을 포함하는 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하는 핵산 분자에 관한 것이다.
일부 양태에서, 핵산 분자는 본원에 보고된 폴리뉴클레오티드 서열과 적어도 약 80%, 85% 또는 90% 동일하거나, 본원에 보고된 폴리뉴클레오티드 서열과 적어도 약 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 폴리뉴클레오티드 서열을 포함한다. 용어 "% 동일성"은, 당업계에 공지된 바와 같이, 서열을 비교함으로써 측정된, 2개 이상의 아미노산 서열 또는 2개 이상의 폴리뉴클레오티드 서열 사이의 관계이다. 당업계에서, "동일성"은 또한, 사건이 서열의 스트링 사이의 부합에 의해 측정된 바와 같을 수 있으므로, 아미노산 또는 폴리뉴클레오티드 서열 사이의 서열 관련도를 의미한다.
본 발명의 참고 폴리뉴클레오티드 서열과, 예를 들어, 95% 이상 "동일한" 폴리뉴클레오티드 서열을 갖는 핵산 분자에 의해 , 핵산 분자의 폴리뉴클레오티드 서열이 참고 폴리뉴클레오티드 서열의 각각 100개의 뉴클레오티드 당 5개 이하의 뉴클레오티드 차이를 포함할 수 있는 것을 제외하고는, 폴리뉴클레오티드 서열이 참고 서열과 동일한 것이 의도된다. 즉, 참고 폴리뉴클레오티드 서열과 95% 이상 동일한 폴리뉴클레오티드 서열을 갖는 핵산 분자를 수득하기 위하여, 참고 서열 내의 5% 이하의 뉴클레오티드가 결실되거나 다른 뉴클레오티드로 치환될 수 있거나, 참고 서열 내의 총 뉴클레오티드의 5% 이하의 수의 뉴클레오티드가 참고 서열에 삽입될 수 있다.
실무적인 문제로서, 임의의 특정 폴리뉴클레오티드 서열 또는 아미노산 서열이 본 발명의 폴리뉴클레오티드 서열 또는 아미노산 서열과 적어도 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일한지 여부는 통상적으로 공지된 컴퓨터 프로그램을 사용하여 측정될 수 있다. 질의 서열(본 발명의 서열)과 주제 서열 사이의 최선의 전반적인 부합을 측정하는 방법은 서열의 정렬 및 동일성 점수의 계산을 사용하여 측정될 수 있다. 정렬은 인비트로겐(Invitrogen)(www.invitrogen.com)으로부터의 벡터(Vector) NTI 스위트(Suite) 10.0 패키지의 컴포넌트인 컴퓨터 프로그램 AlignX를 사용하여 수행되었다. 아미노산 및 폴리뉴클레오티드 서열 정렬 둘 다를 위해 ClustalW 정렬을 사용하여 정렬을 수행하였다(문헌[Thompson, J.D., et al. Nucl. Acids Res. 22: 4673-4680 (1994)]). 기정 점수화 매트릭스 Blosum62mt2 및 swgapdnamt를 각각 아미노산 및 폴리뉴클레오티드 서열 정렬을 위해 사용하였다. 아미노산 서열의 경우, 기정 갭 오프닝 페널티(gap opening penalty)는 10이고, 갭 익스텐션 페널티(gap extension penalty)는 0.1이다. 폴리뉴클레오티드 서열의 경우, 기정 갭 오프닝 페널티는 15이고, 갭 익스텐션 페널티는 6.66이다.
본 발명은 KS 활성, MAT 활성, ACP 활성, KR 활성, CLF 활성, AT 활성, ER 활성, DH 활성, 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 PUFA 신타제 활성을 포함하는 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하는 단리된 핵산 분자에 관한 것으로서, 폴리뉴클레오티드는 상기 기술된 임의의 폴리뉴클레오티드 서열의 보충에 대한 엄격한 조건 하에 혼성화된다.
핵산 분자는, 핵산 분자의 단일 가닥 형태가 온도 및 용액 이온 강도의 적절한 조건 하에 다른 핵산 분자에 어닐링될 수 있을 때, 다른 핵산 분자, 예컨대 cDNA, 게놈 DNA 또는 RNA에 "혼성화가능"하다. 혼성화 및 세척 조건은 널리 공지되고 예시된다(예컨대, 문헌[Sambrook J. and Russell D. 2001. Molecular Cloning: A laboratory manual, 3rd edition. Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York] 참조). 온도 및 이온 강도 조건은 혼성화의 "엄격성"을 결정한다. 엄격성 조건은 적당히 유사한 단편(예컨대, 멀리 관련된 유기체로부터의 동종 서열)을 매우 유사한 단편(예컨대, 밀접하게 관련된 유기체로부터의 작용성 효소를 복제하는 유전자)에 대해 선별하기 위해 조정될 수 있다. 혼성화 후 세척은 엄격성 조건을 결정한다. 하나의 집합의 조건은 실온에서 15분 동안 6X SSC, 0.5% SDS에서 출발하여, 이어서 45℃에서 30분 동안 2X SSC, 0.5% SDS로 반복되고, 50℃에서 30분 동안 0.2X SSC, 0.5% SDS로 2회 반복되는 일련의 세척을 사용한다. 더욱 엄격한 조건을 위하여, 세척은, 0.2X SSC, 0.5% SDS에서 최종 2회의 30분 세척의 온도가 60℃로 증가되는 것을 제외하고는 상기한 바와 동일한 보다 높은 온도에서 수행된다. 다른 집합의 매우 엄격한 조건은 65℃에서 0.1X SSC, 0.1% SDS에서 2회의 최종 세척을 사용한다. 추가적인 집합의 매우 엄격한 조건은 65℃에서 0.1X SSC, 0.1% SDS에서의 혼성화에 의해 정의되고, 2X SSC, 0.1% SDS 및 이어서 0.1X SSC, 0.1% SDS로 세척된다.
본 발명은 상기 기술된 임의의 폴리뉴클레오티드 서열에 완전 상보성인 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하는 단리된 핵산 분자에 관한 것이다. 용어 "상보성"은 서로 혼성화될 수 있는 뉴클레오티드 염기 사이의 관계를 기술한다. 예를 들어, DNA에 관하여, 아데노신은 티민에 대해 상보성이고, 시토신은 구아닌에 대해 상보성이다.
특정 양태에서, 폴리뉴클레오티드 또는 핵산은 DNA이다. DNA의 경우, 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하는 핵산 분자는 통상적으로 하나 이상의 코딩 영역에 작동적으로 회합된 다른 프로모터 및/또는 다른 전사 또는 번역 조절 요소를 포함한다. 작동가능한 회합물은 유전자 생성물, 예컨대, 폴리펩티드를 위한 코딩 영역이 유전자 생성물의 발현을 조절 서열의 영향 또는 조절 하에 위치시키는 방식으로 하나 이상의 조절 서열과 회합될 때 존재한다. 2개의 DNA 단편(예컨대, 폴리펩티드 코딩 영역 및 이와 회합된 프로모터)은 프로모터 작용의 유도가 바람직한 유전자 생성물을 코딩하는 mRNA의 전사를 야기하고, 2개의 DNA 단편 사이의 연결기의 성질이 유전자 생성물의 발현을 지향하는 발현 조절 서열의 능력을 방해하지 않거나 전사되는 DNA 주형의 능력을 방해하지 않는 경우 작동적으로 회합"된다. 따라서, 프로모터 영역은 프로모터가 폴리뉴클레오티드 서열의 전사를 수행할 수 있는 경우 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열과 회합될 수 있다. 프로모터는 소정 세포에서 DNA만의 실질적인 전사를 지향하는 세포-특이적 프로모터일 수 있다. 일반적으로, 코딩 영역은 프로모터에 대해 3'에 위치한다. 프로모터는 천연 유전자로부터 이의 전체가 유도될 수 있거나, 자연에서 발견되는 상이한 프로모터로부터 유도된 상이한 요소로 구성될 수 있거나, 심지어 합성 DNA 분절을 포함할 수 있다. 상이한 프로모터가 상이한 조직 또는 세포 유형에서, 상이한 발달 단계에서 또는 상이한 환경 또는 생리학 조건에 응답하여 유전자의 발현을 지향할 수 있음이 당업자에 의해 이해된다. 유전자가 대부분의 시간에 대부분의 세포 유형에서 발현되도록 하는 프로모터는 통상적으로 "구성 프로모터"로서 지칭된다. 대부분의 경우 조절 서열의 정확한 경계가 완전히 한정되지 않으므로, 상이한 길이의 DNA 단편이 동일한 프로모터 활성을 가질 수 있음이 또한 인정된다. 프로모터는 일반적으로 이의 3' 말단에서 전사 개시 부위에 의해 결합되고, 전사를 배경보다 큰 검출가능한 수준으로 개시하는데 필수적인 염기 또는 요소의 최소 수를 포함하도록 상류(5' 방향)로 연장된다. RNA 폴리머라제의 결합의 원인이 되는 전사 개시 부위(예를 들어, 뉴클레아제 S1을 사용하는 매핑에 의해 적절히 한정됨), 및 단백질 결합 도메인(컨센서스 서열)은 프로모터 내에서 발견될 수 있다.
적합한 조절 영역은 코딩 영역의 상류(5' 비-코딩 서열), 코딩 영역내 또는 코딩 영역의 하류(3' 비-코딩 서열)에 위치하고 회합된 코딩 영역의 전사, RNA 가공 또는 안정성 또는 번역에 영향을 주는 핵산 영역을 포함한다. 조절 영역은 프로모터, 번역 리더 서열, RNA 가공 부위, 효과기 결합 부위 및 스템-루프 구조를 포함할 수 있다. 프로모터 이외의 다른 전사 조절 요소, 예를 들어 인핸서, 작동자, 리프레서 및 전사 종결 신호는 세포-특이적 전사를 지향하는 폴리뉴클레오티드와 작동적으로 회합될 수 있다. 코딩 영역의 경계는 5' (아미노) 말단의 개시 코돈 및 3' (카복실) 말단의 번역 중단 코돈에 의해 결정된다. 코딩 영역은 비제한적으로 원핵 영역, mRNA로부터의 cDNA, 게놈 DNA 분자, 합성 DNA 분자, 또는 RNA 분자를 포함할 수 있다. 코딩 영역이 진핵 세포에서의 발현을 위해 의도되는 경우, 폴리아데닐화 신호 및 전사 종결 서열은 통상적으로 코딩 영역에 대해 3'에 위치할 것이다.
본 발명의 특정 양상에서, 20개 이상의 염기, 30개 이상의 염기 또는 50개 이상의 염기를 갖고 본 발명의 폴리뉴클레오티드 서열로 혼성화되는 폴리뉴클레오티드 서열이 PCR 프라이머로서 사용될 수 있다. 전형적으로, PCR-형 증폭 기술에서, 프라이머는 상이한 서열을 갖고 서로 상보성이 아니다. 바람직한 시험 조건에 따라서, 프라이머의 서열은 표적 핵산의 효율적인 및 정확한 복제 둘 다를 제공하도록 디자인되어야 한다. PCR 프라이머 디자인의 방법은 당업계에 통상적이고 널리 공지된다. 일반적으로, 본 서열의 2개의 짧은 분절은 DNA 또는 RNA로부터의 동종 유전자를 코딩하는 더 긴 핵산 단편을 증폭시키기 위해 폴리머라제 쇄 반응(PCR) 프로토콜에 사용될 수 있다. 폴리머라제 쇄 반응은 또한 하나의 프라이머의 서열이 본 핵산 단편으로부터 유도되고, 다른 프라이머의 서열이 미생물 유전자를 코딩하는 mRNA 전구체의 3' 단부에 대한 폴리아데닐산 트랙의 존재를 이용하는 클로닝된 핵산 단편의 라이브러리 상에서 수행될 수 있다. 다르게는, 제2 프라이머 서열은 클로닝 벡터로부터 유래하는 서열에 기초할 수 있다.
또한, 특정 프라이머가 디자인될 수 있고, 본 서열의 부분 또는 전장을 증폭시키는데 사용될 수 있다. 생성된 증폭 생성물은 증폭 반응 동안 직접 표지될 수 있거나, 증폭 반응 후에 표지될 수 있고, 적절한 엄격성 조건 하에 전장 DNA 단편을 단리시키는 프로브로서 사용될 수 있다.
따라서, 본 발명의 핵산 분자는 동일하거나 다른 종 또는 세균성 종으로부터 동종 단백질을 코딩하는 유전자를 단리하는데 사용될 수 있다. 서열-의존적 프로토콜을 사용하는 동종 유전자의 단리는 당업계에 널리 공지된다. 서열-의존적 프로토콜의 예는 비제한적으로 핵산 혼성화 방법, 및 핵산 증폭 기술의 다양한 사용에 의해 예시되는 DNA 및 RNA 증폭 방법을 포함한다(예컨대, 폴리머라제 쇄 반응, 물리스(Mullis) 등의 미국 특허공보 제4,683,202호; 리가제 쇄 반응(LCR)(문헌[Tabor, S. et al., Proc . Acad . Sci . USA 82: 1074 (1985)]); 또는 가닥 치환 증폭(SDA; 문헌[Walker, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 89: 392 (1992)]).
일부 양태에서, 본 발명의 단리된 핵산 분자는 유사하거나 개선된 PUFA 프로파일을 생성하는 PUFA 신타제를 동정하기 위하여 다른 유기체로부터 동종 핵산 분자를 단리하는데 사용된다. 일부 양태에서, 본 발명의 단리된 핵산 분자는 높은 양의 DHA 및/또는 EPA를 생산하는데 관여하는 다른 유기체로부터 동종 핵산 분자를 단리하는데 사용된다.
본 발명의 핵산 분자는 또한 본 발명의 폴리펩티드의 검출을 가능하게 하는 마커 서열에 대한 골격에 융합된 PUFA 신타제, PUFA 신타제의 도메인, 또는 PUFA 신타제의 단편을 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열을 포함한다. 마커 서열은 당업자에게 공지된 영양요구성 또는 우성 마커, 예컨대 ZEO(제오신), NEO(G418), 하이그로마이신, 아세나이트, HPH, NAT 등을 포함한다.
본 발명은 또한 PUFA 신타제 유전자의 변이체를 포함한다. 변이체는 코딩 영역, 비-코딩 영역, 또는 둘 다에서 변성을 함유할 수 있다. 예는 침묵 치환, 첨가 또는 결실을 생성하지만, 코딩된 폴리펩티드의 특성 또는 활성을 변경하지 않는 변성을 함유하는 폴리뉴클레오티드 서열 변이체이다. 특정 양태에서, 폴리뉴클레오티드 서열 변이체는 유전 코드의 축퇴에 기인한 침묵 치환에 의해 생산된다. 추가 양태에서, 폴리뉴클레오티드 서열 변이체는 특정 이유를 위해, 예컨대, 특정 숙주를 위한 코돈 발현을 최적화시키기 위해(예컨대, 트라우스토키트리드 mRNA 내의 코돈의 대장균(Escherichia coli) 또는 사카로미세스 세레비시아에(Saccharomyces cerevisiae)와 같은 다른 유기체에 의해 선호되는 것으로의 변화를 위해) 생산된다.
대립형질 변이체, 오르토로그(ortholog), 및/또는 종 동족체가 또한 본 발명에 제공된다. 본원에 개시된 서열로부터의 정보를 사용하는 당업계에 공지된 과정이 사용되어 본원에 기술된 유전자의 전장 유전자, 대립형질 변이체, 스플라이스 변이체, 전장 코딩 부분, 오르토로그, 및/또는 종 동족체를 수득할 수 있다. 예를 들어, 대립형질 변이체 및/또는 종 동족체가 본원에 제공된 서열로부터 적합한 프로브 또는 프라이머를 제조하고 대립형질 변이체 및/또는 목적 동족체를 위한 적합한 핵산 공급원을 선별함으로써 단리되고 동정될 수 있다.
벡터
본 발명은 임의의 상기 핵산 분자 또는 이들의 조합 및 전사 조절 서열을 포함하는 재조합 핵산 분자에 관한 것이다. 일부 양태에서, 재조합 핵산 분자는 재조합 벡터이다.
본 발명은 본원에 기술된 하나 이상의 단리된 핵산 분자를 벡터에 삽입하는 단계를 포함하는, 재조합 벡터의 제조 방법에 관한 것이다.
본 발명의 벡터는, 예를 들어, 클로닝 벡터 또는 발현 벡터일 수 있다. 벡터는, 예를 들어, 플라스미드, 바이러스 입자, 파지 등의 형태일 수 있다.
본 발명의 폴리뉴클레오티드 서열은 폴리펩티드를 발현하기 위한 다양한 발현 벡터 중 어느 하나에 포함될 수 있다. 이러한 벡터는 염색체, 비-염색체, 및 합성 DNA 또는 RNA 서열, 예컨대, SV40의 유도체; 세균성 플라스미드; 및 효모 플라스미드를 포함한다. 그러나, 당업자에게 공지된 임의의 다른 적절한 벡터가 사용될 수 있다.
적절한 DNA 서열은 다양한 과정에 의해 벡터에 삽입될 수 있다. 예를 들어, DNA 서열은 전통적인 클로닝 방법(제한 효소 클로닝) 또는 더욱 현대적인 유전자조작 기술, 예컨대 PCR 클로닝, 심리스 클로닝(seamless cloning) 등에 의해 삽입된다. 이러한 과정 및 다른 과정은 당업자의 범주에 속하는 것으로 간주된다.
본 발명은 또한 하나 이상의 상기 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하는 재조합 구축물을 포함한다. 구축물은 본 발명의 하나 이상의 서열이 정 또는 역 배향으로 삽입된 벡터, 예컨대 플라스미드 또는 바이러스 벡터를 포함한다. 이러한 양태의 한 양상에서, 구축물은 서열에 작동적으로 회합된 조절 서열, 예를 들어, 프로모터를 추가로 포함한다. 다수의 적합한 벡터 및 프로모터는 당업자에게 공지되고 시판 중이다.
일부 양태는 PUFA 신타제 시스템의 성분을 코딩하는 하나 이상의 이종 폴리뉴클레오티드를 포함하는 재조합 벡터(예컨대, 플라스미드)를 포함한다. 재조합 벡터는 선택된 핵산 서열의 조작 및/또는 숙주 세포 내로의 상기 핵산 서열의 도입을 위한 도구로서 사용되는 유전자조작된(예컨대, 인공적으로 생산된) 핵산 분자이다. 따라서, 재조합 벡터는, 예컨대 폴리뉴클레오티드를 발현시키고/거나 숙주 세포로 전달하여 재조합 세포를 형성함으로써, 클로닝, 서열분석, 및/또는 다른 본원의 폴리뉴클레오티드의 조작에 사용하기에 적합할 수 있다. 벡터는 클로닝되거나 전달되는 폴리뉴클레오티드에 인접한 것으로 자연에서 발견되지 않는 뉴클레오티드 서열을 함유할 수 있다. 벡터는 또한 폴리뉴클레오티드에 인접한 것으로 자연에서 발견되거나 폴리뉴클레오티드의 발현에 유용한 조절 핵산 서열(예컨대, 프로모터, 비번역된 영역)을 함유할 수 있다. 통합된 폴리뉴클레오티드는 염색체 프로모터 조절 하에, 천연 또는 플라스미드 프로모터 조절 하에, 또는 여러 프로모터 조절의 조합 하에 존재할 수 있다. 벡터는 RNA 또는 DNA일 수 있고, 원핵 또는 진핵생물일 수 있다. 벡터는 비-염색체 요소(예컨대, 플라스미드)로서 유지될 수 있거나, 재조합 유기체(예컨대, 미생물 및 식물 세포)의 염색체에 통합될 수 있다. 전체 벡터는 숙주 세포 내의 위치에 잔류할 수 있거나, 특정 조건 하에, 외인성 DNA(예컨대, 불필요한 플라스미드 서열)는 절제되어 PUFA 신타제 시스템의 성분을 코딩하는 하나 이상의 이종 폴리뉴클레오티드 뒤에 잔류할 수 있다. 이종 폴리뉴클레오티드의 단일 또는 다중 카피는 숙주 게놈에 통합될 수 있다. 본 발명의 재조합 벡터는 하나 이상의 선택가능한 마커를 함유할 수 있다.
한 양태에서, 본 발명에 사용된 재조합 벡터는 발현 벡터이다. 본원에 사용된 어구 "발현 벡터"는 코딩된 생성물(예컨대, 관심 단백질)의 생산에 적합한 벡터를 지칭하는데 사용된다. 이러한 양태에서, 생산된 생성물(예컨대, 하나 이상의 PUFA 신타제)을 코딩하는 핵산 서열이 재조합 벡터에 삽입되어 재조합 핵산 분자를 생성한다. 생산될 단백질을 코딩하는 핵산 서열은, 핵산 서열을 벡터(재조합 숙주 세포 내의 핵산 서열의 전사 및 번역을 가능하게 함) 내의 조절 서열에 작동적으로 연결하는 방식으로 벡터 내로 삽입된다.
다른 양태에서, 본 발명의 재조합 핵산 분자에 사용된 재조합 벡터는 표적 벡터이다. 본원에 사용된 어구 "표적 벡터"는 특정 핵산 분자를 재조합 숙주 세포에 전달하는데 사용되는 벡터를 지칭하는데 사용되고, 이때 핵산 분자는 숙주 세포 또는 미생물 내의 내인성 유전자 또는 유전자의 부분을 결실시키거나 불활성화시키거나 치환하는데 사용된다(즉, 표적화된 유전자 분열 또는 녹-아웃(knock-out) 기술에 사용됨). 이러한 벡터는 또한 당업계에서 "녹-아웃" 벡터로 공지될 수 있다. 이러한 양태의 한 양상에서, 벡터의 부분, 더욱 전형적으로, 벡터에 삽입된 핵산 분자(즉, 삽입체)는 숙주 세포 내의 표적 유전자(즉, 결실되거나 불활성화되도록 표적화된 유전자)의 핵산 서열에 상동성인 핵산 서열을 갖는다. 벡터 삽입체의 핵산 서열은, 표적 유전자 및 삽입체가 상동성 재조합을 겪고 이에 의해 내인성 표적 유전자가 결실되거나, 불활성화되거나, 약독화되거나(즉, 돌연변이되거나 결실되는 내인성 표적 유전자의 적어도 일부에 의해 ), 치환되도록, 표적 유전자와 회합되게 디자인된다. 내인성 쉬조키트리움 유전자를, 예를 들어, 재조합 유전자로 치환하는 이러한 유형의 재조합 벡터의 사용은 실시예 섹션에 기술되고, 트라우스토키트리드의 유전적 형질전환의 일반적인 기술은 2003년 9월 4일자 공개된 미국 특허공개공보 제2003/0166207호에 상세히 기술된다. 미세조류에 대한 유전적 형질전환 기술은 당업계에 널리 공지된다. 본 발명의 한 양태에서, 본원에 기술된 PUFA 신타제 유전자가 식물 또는 미생물, 예컨대 트라우스토키트리드를 형질전환시켜 이러한 식물 또는 미생물의 PUFA 신타제 생산 능력을 개선하고/거나 변경(변형, 변화)하도록 사용될 수 있다.
숙주 세포
본 발명은 임의의 상기 핵산 분자 및 재조합 핵산 분자 및 이들의 조합을 발현하는 숙주 세포에 관한 것이다.
본원에 사용된 용어 "발현"은 유전자가 생화학물, 예를 들어, RNA 또는 폴리펩티드를 생산하는 과정을 지칭한다. 상기 과정은 세포 내의 유전자의 작용성 존재의 임의의 표시, 예컨대 비제한적으로, 유전자 녹-다운, 및 일시적인 발현 및 안정한 발현 둘 다를 포함한다. 이것은 비제한적으로 메신저 RNA(mRNA), 전달 RNA(tRNA), 작은 헤어핀 RNA(shRNA), 작은 간섭 RNA(siRNA), 또는 임의의 다른 RNA 생성물로의 유전자의 전사, 및 폴리펩티드로의 상기 mRNA의 번역을 포함한다. 목적하는 최종 생성물이 생화학물인 경우, 발현은 이러한 생화학물 및 임의의 전구체의 생성을 포함한다.
목적하는 하나 이상의 다중불포화 지방산을 생산하기 위하여, 숙주 세포는 본원에 개시된 하나 이상의 PUFA 신타제 또는 이의 아단위를 숙주 세포에 도입하도록 유전적으로 변형될 수 있다.
본 발명에 따른 PUFA 신타제 시스템을 발현하도록 유기체를 유전적으로 변형할 때, 일부 숙주 유기체는 PUFA를 생산하기 위하여 PUFA 신타제 시스템과 함께 요구되는 부속 단백질을 내인성으로 발현할 수 있다. 그러나, 유기체가 동종 부속 단백질을 내인성으로 생산하더라도, 유기체에 의한 PUFA의 생산을 가능하게 하거나 강화시키기 위하여 일부 유기체를 하나 이상의 부속 단백질을 코딩하는 핵산 분자로 형질전환시키는 것이 필수적일 수 있다. 일부 이종 부속 단백질은 숙주 세포의 내인성 부속 단백질보다는 형질전환된 PUFA 신타제 단백질에 의해 더욱 효과적으로 또는 효율적으로 작동할 수 있다.
부속 단백질은, 코어 PUFA 신타제 시스템의 부분으로 간주되지 않지만(즉, PUFA 신타제 효소 복합체 자체의 부분은 아니지만), PUFA 생산, 또는 본 발명의 코어 PUFA 신타제 효소 복합체를 사용하는 효율적인 PUFA 생산에 필수적일 수 있는 단백질로서 본원에 정의된다. 예를 들어, PUFA를 생산하기 위하여, PUFA 신타제 시스템은 4'-포스포판테테인일 모이어티를 조효소 A로부터 아실 담체 단백질(ACP) 도메인으로 전달하는 부속 단백질에 의해 작동하여야 한다. 따라서, PUFA 신타제 시스템은 하나 이상의 4'-포스포판테테인일 전달효소(PPTase) 도메인을 포함하는 것으로 간주될 수 있거나, 이러한 도메인은 PUFA 신타제 시스템에 대한 부속 도메인 또는 단백질인 것으로 간주될 수 있다. PPTase의 구조적 및 작용적 특징은, 예컨대, 미국 특허공개공보 제2002/0194641호; 제2004/0235127호; 및 제2005/0100995호에 상세히 기술되었다.
4'-포스포판테테인일 전달효소(PPTase) 생물학적 활성(작용)을 갖는 도메인 또는 단백질은 4'-포스포판테테인일 모이어티를 조효소 A로부터 아실 담체 단백질(ACP)로 전달하는 효소로서 특징지어진다. ACP의 불변 세린 잔기로의 이러한 전달은 불활성 아포-형태를 홀로-형태로 활성화시킨다. 폴리케티드 및 지방산 합성 둘 다에서, 포스포판테테인 기는 성장하는 아실 쇄를 갖는 티오에스터를 형성한다. PPTase는 지방산 합성, 폴리케티드 합성, 및 비-리보솜 펩티드 합성에서 잘 특징지어지는 효소의 계열이다. 많은 PPTase의 서열은 공지되었고, 결정 구조는 증명되었고(예컨대, 문헌[Reuter K., et al., EMBO J. 18(23):6823-31 (1999)]), 돌연변이 분석은 활성에 중요한 아미노산 잔기를 동정하였다(문헌[Mofid M.R., et al., Biochemistry 43(14):4128-36 (2004)]).
기질로서 쉬조키트리움 PUFA 신타제 ACP 도메인을 인식하는 것으로 종래 증명된 하나의 이종 PPTase는 노스톡(Nostoc) 종 PCC 7120(종전에 아나바에나(Anabaena) 종 PCC 7120으로 지칭됨)의 Het I 단백질이다. Het I은 이러한 유기체의 이형세포에 존재하는 당-지질 층의 성분인 장쇄 하이드록시-지방산을 합성하는 것으로 공지된 노스톡의 유전자의 클러스터에 존재한다(문헌[Black and Wolk, J. Bacteriol. 176: 2282-2292 (1994)]; 문헌[Campbell et al., Arch. Microbiol. 167: 251-258 (1997)]). Het I은 아마 클러스터에 존재하는 단백질, Hgl E의 ACP 도메인을 활성화시킨다. Het I을 함유하는 서열 및 구축물은, 예컨대, 미국 특허공개공보 제2007/0244192호(이의 전문은 본원에 참조로 혼입됨)에 기술되었다.
쉬조키트리움 PUFA 신타제 ACP 도메인을 인식하는 것으로 종래 증명되었던 다른 이종 PPTase는 바실루스 서브틸리스(Bacillus subtilis)로부터 유래하는 Sfp이다. Sfp는 잘 특징규명되었고, 넓은 범위의 기질을 인식하는 능력에 기인하여 널리 사용된다. 공개된 서열 정보(문헌[Nakana, et al., Molecular and General Genetics 232: 313-321 (1992)])를 기준으로, 한정된 상류 및 하류 플랭킹(flanking) DNA 서열과 함께 코딩 영역을 pACYC-184 클로닝 벡터로 클로닝함으로써, 발현 벡터는 Sfp를 위해 종래 생산되었다. 적절한 조건 하에 세포 내의 DHA의 축적을 야기하는 대장균 내의 쉬조키트리움 PUFA 신타제와 공동-발현되는 이의 능력에 의해 증명되는 바와 같이, 상기 구축물은 작용성 PPTase를 코딩한다(미국 특허공개공보 제2004/0235127호(이의 전문은 본원에 참조로 혼입됨) 참조).
숙주 세포는 미생물 세포; 동물 세포; 식물 세포; 및 곤충 세포를 포함할 수 있다. 적절한 숙주의 대표적인 예는 세균성 세포; 호열성 또는 중온성 세균; 해양 세균; 트라우스토키트리드; 균류 세포, 예컨대 효모; 식물 세포; 곤충 세포; 및 단리된 동물 세포를 포함한다. 숙주 세포는 비형질감염된 세포, 또는 하나 이상의 다른 재조합 핵산 분자로 이미 형질감염된 세포일 수 있다. 숙주 세포는 또한 PUFA 신타제를 발현하도록 유전자조작된 유전자이식 세포를 포함할 수 있다. 적절한 숙주의 선택은 본원의 교시로부터 당업자의 범주에 속하는 것으로 간주된다.
숙주 세포는 라비린툴로미세테스 강의 임의의 미생물, 예컨대 트라우스토키트리알레스(Thraustochytriales) 목으로부터의 미생물을 포함한다. 이러한 적용례에서, 용어 "트라우스토키트리알레스" 및 "트라우스토키트리드"는 상호교환적으로 사용된다. 일부 양태에서, 숙주 세포는 트라우스토키트리아세아에(Thraustochytriaceae) 과의 임의의 미생물이다. 본 발명의 숙주 세포는 비제한적으로 트라우스토키트리움, 라비린툴로이데스(Labyrinthuloides), 자포노키트리움(Japonochytrium), 및 쉬조키트리움을 비롯한 속의 임의의 미생물일 수 있다. 이러한 속 내의 종은 비제한적으로 임의의 쉬조키트리움 종, 예컨대 쉬조키트리움 아그레가툼(Schizochytrium aggregatum), 쉬조키트리움 리마시눔(Schizochytrium limacinum), 쉬조키트리움 미누툼(Schizochytrium minutum); 임의의 트라우스토키트리움 종(예컨대, 종전 울케니아(Ulkenia) 종, 예컨대 울케니아 비수르겐시스(Ulkenia visurgensis), 울케니아 아모에보이다(Ulkenia amoeboida), 울케니아 사르카리아나(Ulkenia sarkariana), 울케니아 프로푼다(Ulkenia profunda), 울케니아 라디아타(Ulkenia radiata), 울케니아 미누타(Ulkenia minuta) 및 울케니아 종 BP-5601), 및 트라우스토키트리움 스트리아툼(Thraustochytrium striatum), 트라우스토키트리움 아우레움, 트라우스토키트리움 로제움(Thraustochytrium roseum); 및 임의의 자포노키트리움 종을 포함한다. 트라우스토키트리알레스의 균주는 비제한적으로 쉬조키트리움 종(S31)(ATCC 20888); 쉬조키트리움 종(S8)(ATCC 20889); 쉬조키트리움 종(LC-RM)(ATCC 18915); 쉬조키트리움 종(SR21); 쉬조키트리움 아그레가툼(Goldstein et Belsky)(ATCC 28209); 쉬조키트리움 리마시눔(Honda et Yokochi)(IFO 32693); 트라우스토키트리움 종(23B)(ATCC 20891); 트라우스토키트리움 스트리아툼(Schneider)(ATCC 24473); 트라우스토키트리움 아우레움(Goldstein) (ATCC 34304); 트라우스토키트리움 로제움(Goldstein)(ATCC 28210); 및 자포노키트리움 종(L1)(ATCC 28207)을 포함한다. 유전적 변형에 적합한 숙주 미생물의 다른 예는 비제한적으로 사카로미세스 세레비시아에, 사카로미세스 칼스베르겐시스(Saccharomyces carlsbergensis)를 비롯한 효모, 또는 캔디다(Candida), 클루이베로미세스(Kluyveromyces)와 같은 다른 효모, 또는 다른 균류, 예를 들어, 섬유성 균류, 예컨대 아스퍼길루스(Aspergillus), 뉴로스포라(Neurospora), 페니실리움(Penicillium) 등을 포함한다. 세균성 세포가 또한 숙주로서 사용될 수 있다. 이것은 발효 과정에 유용할 수 있는 대장균을 포함한다. 다르게는, 락토바실루스(Lactobacillus) 종 또는 바실루스 종과 같은 숙주가 숙주로서 사용될 수 있다.
식물 숙주 세포는 비제한적으로 임의의 고등 식물, 예컨대 쌍자엽 및 단자엽 식물 둘 다, 및 소비가능한 식물, 예컨대 농작물, 및 이의 오일을 위해 사용되는 식물을 포함한다. 이러한 식물은, 예를 들어 캐놀라, 지방종자, 대두, 평지씨, 아마씨, 옥수수, 잇꽃, 해바라기, 땅콩 및 담배를 포함할 수 있다. 다른 식물은 약학 제제, 향미제, 영양약학 제제, 기능성 식료품 성분, 미용 활성 성분으로서 사용되는 화합물을 생산하는 것으로 공지된 식물, 또는 이러한 화합물/제제를 생산하도록 유전자조작된 식물을 포함한다. 따라서, 임의의 식물 종 또는 식물 세포가 선택될 수 있다. 식물 및 식물 세포, 및 이로부터 성장하거나 유도된 식물의 예는 비제한적으로 캐놀라(브라시카 라파 엘(Brassica rapa L.)); 캐놀라 품종 NQC02CNX12(ATCC PTA-6011), NQC02CNX21(ATCC PTA-6644) 및 NQC02CNX25(ATCC PTA-6012), 및 캐놀라 품종 NQC02CNX12, NQC02CNX21, 및 NQC02CNX25로부터 유래하는 품종, 개량 품종 및 식물 부분(각각 미국 특허공보 제7,355,100호, 제7,456,340호, 및 제7,348,473호 참조); 파바세아에(Fabaceae) 과의 식물; 글리신(Glycine) 속의 식물; 통상의 콩(파세올루스 불가리스(Phaseolus vulgaris)); 잠두(비시아 파바(Vicia faba)); 통상의 완두(피숨 사티붐(Pisum sativum)); 대두(글리신 맥스(Glycine max)); 평지씨(브라시카 스피시스(Brassica species); 아마씨/아마(리눔 우시타티시문(Linum usitatissimum)); 옥수수(제아 메이스(Zea mays)); 잇꽃(카르타무스 틴크토리우스(Carthamus tinctorius)); 해바라기(헬리안투스 안누스(Helianthus annuus)); 담배(니코티아나 타바쿰(Nicotiana tabacum)); 아라비도프시스 탈리아나(Arabidopsis thaliana), 브라질 넛(베톨레티아 엑셀사(Betholettia excelsa)); 아주까리 열매(리시누스 코무니스(Riccinus communis)); 코코넛(코쿠스 누시페라(Cocus nucifera)); 고수풀(코리아드룸 사티붐(Coriandrum sativum)); 면(고시피움 스피시스(Gossypium species)); 그라운드넛(아라키스 히포가에아(Arachis hypogaea)); 호호바(시몬드시아 키넨시스(Simmondsia chinensis)); 겨자(브라시카 스피시스 및 시나피스 알바(Sinapis alba)); 기름야자나무(엘라에이스 구이네이스(Elaeis guineeis)); 올리브(올레아 유르파에아(Olea eurpaea)); 벼(오리자 사티바(Oryza sativa)); 스쿼시(쿠쿠르비타 막시마(Cucurbita maxima)); 보리(호르듐 불가레(Hordeum vulgare)); 밀(트라에티쿰 아에스티붐((Traeticum aestivum)); 및 좀개구리밥(렘나세아에 스피시스(Lemnaceae species))으로부터 수득가능한 식물 및 식물 세포을 포함한다. 이러한 식물 라인 및 다른 식물이 비제한적으로 종자 수율, 도복저항성, 모상체, 질병 내성 또는 저항성, 성숙, 만기 식물 무손상, 식물 높이, 탈립 내성, 식물 형질전환의 용이함, 오일 함량 또는 오일 프로파일과 같은 또는 이와 관련된 바람직한 특징을 위해 생산되거나 선택되거나 최적화될 수 있다. 식물 라인은 혈통 육종(pedigree breeding), 재발 선택 육종(recurrent selection breeding), 이종교배 및 역교배 육종과 같은 식물 육종, 및 마커 보조된 육종 및 틸링(tilling)과 같은 방법을 통해 선택될 수 있다(예컨대, 미국 특허공보 제7,348,473호 참조).
동물 세포는 임의의 단리된 동물 세포를 포함할 수 있다.
본 발명은 본 발명의 하나 이상의 핵산 분자 또는 재조합 핵산 분자, 예컨대 벡터를 발현하는 숙주 세포에 관한 것이다.
본 발명은 재조합 벡터를 숙주 세포에 도입하는 단계를 포함하는 재조합 숙주 세포의 제조 방법에 관한 것이다.
숙주 세포는, 예를 들어, 클로닝 벡터 또는 발현 벡터일 수 있는 본 발명의 벡터에 의해 유전자조작(형질도입 또는 형질전환 또는 형질감염)될 수 있다. 벡터는, 예를 들어, 플라스미드, 바이러스 입자, 파지 등의 형태일 수 있다. 본원에 기술된 폴리뉴클레오티드 서열을 함유하는 벡터, 및 적절한 프로모터 또는 조절 서열은 폴리뉴클레오티드 서열에 의해 코딩되는 폴리펩티드의 발현을 허용하도록 적절한 숙주를 형질전환시키는데 사용될 수 있다. 숙주 세포의 유전적 변형은 또한 바람직한 또는 최적 숙주 코돈 용례를 위한 유전자의 최적화를 포함할 수 있다.
유전자조작된 숙주 세포는 프로모터를 활성화시키거나, 형질전환체를 선택하거나, 본 발명의 유전자를 증폭하는데 적절하게 변형된 통상적인 영양 매질에서 배양될 수 있다. 온도, pH 등과 같은 배양 조건은 발현을 위해 선택된 숙주 세포에서 종래 사용된 것이고, 당업자에게 명백할 것이다.
일부 양태에서, 숙주 세포는 천연 PUFA 신타제 시스템이 결실된 트라우스토키트리드이다. 본 발명은 쉬조키트리움에서 PFA1, PFA2 및 PFA3의 녹-아웃을 생성하였다(미국 특허공보 제7,217,856호 참조; OrfA, OrfB, 및 OrfC로 본원에 지칭됨). 녹-아웃 전략은 쉬조키트리움에서 발생하는 것으로 증명된 동종 재조합에 의존한다(미국 특허공보 제7,001,772호 참조). 여러 전략이 녹-아웃 구축물의 디자인에 사용될 수 있다. 이러한 3개의 유전자를 불활성화시키는데 사용된 특정 전략은 튜불린 프로모터(pMON50000로부터 유도됨, 미국 특허공보 제7,001,772호 참조)에 커플링된 제오신(상표) 내성 유전자의 Orf의 클로닝된 부분으로의 삽입을 이용하였다. 이어서, 중단된 코딩 영역을 함유하는 새로운 구축물을 입자 충격을 통한 야생형 쉬조키트리움 세포의 형질전환에 사용하였다(미국 특허공보 제7,001,772호 참조). 충격받은 세포를 제오신(상표) 및 PUFA의 공급물을 둘 다 함유하는 플레이트 상에 펼쳤다. 이어서, 이러한 플레이트에서 성장한 콜로니를 PUFA가 보충되지 않은 제오신(상표) 플레이트 상으로 스트리킹(streaking)하였다. 성장을 위해 PUFA 보충을 요구하는 콜로리는 동종 재조합에 의해 불활성화된 PUFA 신타제 Orf를 갖는 후보군이었다. 3개의 모든 경우에, 이러한 가정을 각각의 쉬조키트리움 PFA 신타제 유전자의 전장 게놈 DNA 클론으로 세포를 형질전환시킴으로써 녹-아웃을 보호하여 확인하였다. 또한, 일부 경우에, 보호된 형질전환체에서, 제오신(상표) 내성 유전자가 제거되었음이 밝혀졌고(미국 특허공보 제7,217,856호 참조), 이는 도입된 작용성 유전자가 이중 동종 재조합(즉, 내성 마커의 결실)에 의해 원래 부위에 통합되었음을 나타낸다. 이러한 전략의 성공을 위한 하나의 핵심은 PUFA에 의한 성장 매질의 보충이었다. 보충의 효과적인 수단은, 성잘 매질에 첨가하기 전에 부분적으로 메틸화된 베타-사이클로덱스트린과 혼합함에 의한 PUFA의 봉쇄인 것으로 밝혀졌다(미국 특허공보 제7,217,856호 참조). 또한, 이러한 실험은 본원에 제공된 지침에 따라 당업자가 PUFA 신타제-함유 미생물, 예컨대 쉬조키트리움 내의 하나 이상의 PUFA 신타제 유전자를 불활성화시킬 수 있고, 이어서 (예컨대, 재조합 유기체의 지방산 프로파일을 변경하기 위하여) 본 발명에 따른 추가 유전적 변형(예컨대, 다른 PUFA 신타제 유전자의 도입에 의한)에 사용될 수 있는 PUFA 영양요구체를 생성할 수 있음을 증명하였다.
본 발명의 유기체의 유전적 변형의 하나의 요소는 트라우스토키트리드 게놈을 직접 형질전환하는 능력이다. 상기 미국 특허공보 제7,001,772호에서, 단일 교차 동종 재조합을 통한 쉬조키트리움의 형질전환 및 이중 교차 동종 재조합을 통한 표적화된 유전자 치환이 증명되었다. 상기 논의된 바와 같이, 본 발명은 쉬조키트리움에서 PUFA 신타제 시스템의 PFA1, PFA2 및 PFA3을 불활성화시키기 위한 동종 재조합을 위한 기술을 사용하였다(미국 특허공보 제7,217,856호 참조). 생성된 돌연변이체는 PUFA에 의한 매질의 보충에 따라 변한다. 형질전환의 여러 마커, 도입된 유전자의 높은 수준의 발현을 위한 프로모터 요소, 및 외인성 유전 물질의 전달을 위한 방법이 개발되었고 이용가능하다. 따라서, 상기 도구는, 본원에 제시된 바와 같이, 트라우스토키트리드, 및 유사한 PUFA 신타제 시스템을 갖는 다른 진핵생물에서 내인성 PUFA 신타제 유전자를 녹-아웃시키고, 이들을 다른 유기체로부터의 유전자, 예컨대 쉬조키트리움 종 ATCC PTA-9695로부터의 유전자로 치환하기 위한 위치에 존재한다.
재조합 숙주 세포의 제조 방법
본 발명은 재조합 벡터를 숙주 세포에 도입하는 단계를 포함하는, 재조합 숙주 세포의 제조 방법에 관한 것이다.
숙주 세포는, 예를 들어, 클로닝 벡터 또는 발현 벡터일 수 있는 본 발명의 벡터에 의해 유전자조작(형질도입 또는 형질전환 또는 형질감염)될 수 있다. 벡터는, 예를 들어, 플라스미드, 바이러스 입자, 파지 등의 형태일 수 있다. 본원에 폴리뉴클레오티드 서열을 함유하는 벡터, 및 적절한 프로모터 또는 조절 서열은 폴리뉴클레오티드 서열에 의해 코딩된 폴리펩티드의 발현을 허용하도록 적절한 숙주를 형질전환하는데 사용될 수 있다. 숙주 세포의 유전적 변형은 바람직하거나 최적의 숙주 코돈 용례를 위한 유전자의 최적화를 포함할 수 있다.
본 발명에 따라서, 용어 "형질감염"은 외인성 핵산 분자(즉, 재조합 핵산 분자)가 세포에 삽입될 수 있는 임의의 방법을 지칭하는데 사용된다. 용어 "형질전환"은, 이러한 용어가 미생물 세포, 예컨대 조류, 세균 및 효모, 또는 식물 세포로의 핵산 분자의 도입을 지칭하는데 사용될 때, 용어 "형질감염"과 상호교환적으로 사용될 수 있다. 미생물 및 식물 시스템에서, 용어 "형질전환"은 미생물 또는 식물에 의한 외인성 핵산의 획득에 기인하여 유전된 변화를 기술하는데 사용되고, 용어 "형질감염"과 본질적으로 동의어이다. 그러나, 동물 세포에서, 형질전환은, 예를 들어 암성이 된 후 배지 내의 세포의 성장 특성에서의 변화를 지칭할 수 있는 제2 의미를 획득하였다. 따라서, 혼란을 피하기 위하여, 용어 "형질감염"은 바람직하게는 동물 세포로의 외인성 핵산의 도입에 관해 사용되고, 용어 "형질감염"은 일반적으로 이러한 용어가 세포로의 외인성 핵산의 도입에 적절한 정도까지 동물 세포의 형질감염, 및 미생물 세포 또는 식물 세포의 형질전환을 포괄하도록 본원에 사용될 것이다. 따라서, 형질감염 기술은 비제한적으로 형질전환, 입자 충격, 확산, 활성 수송, 욕 초음파처리, 전기천공, 현미주사, 리포펙션, 흡착, 감염 및 원형질체 융합을 포함한다.
재조합 DNA 기술의 사용이, 예를 들어, 숙주 세포 내의 핵산 분자의 카피의 수, 핵산 분자가 전사되는 효율, 생성된 전사체가 번역되는 효율, 및 번역 후 변형의 효율을 조작함으로써, 형질감염된 핵산 분자의 발현의 조절을 개선할 수 있음이 당업자에게 인정될 것이다. 추가적으로, 프로모터 서열은 천연 프로모터에 비해 발현 수준을 개선하도록 유전자조작될 수 있다. 핵산 분자의 발현을 조절하는데 유용한 재조합 기술은 비제한적으로, 하나 이상의 숙주 세포 염색체로의 핵산 분자의 통합, 플라스미드로의 벡터 안정성 서열의 첨가, 전사 조절 신호(예컨대, 프로모터, 작동자, 인핸서)의 치환 또는 변형, 번역 조절 신호(예컨대, 리보솜 결합 부위, 샤인-달가노(Shine-Dalgarno) 서열)의 치환 또는 변형, 숙주 세포의 코돈 용례에 상응하는 핵산 분자의 변형, 및 전사체를 불안정화시키는 서열의 결실을 포함한다.
유전자조작된 숙주 세포는 프로모터를 활성화시키거나, 형질전환체를 선택하거나, 본 발명의 유전자를 증폭하는데 적절하게 변형된 통상적인 영양 매질에서 배양될 수 있다. 온도, pH 등과 같은 배양 조건은 발현을 위해 선택된 숙주 세포에서 종래 사용된 것이고, 당업자에게 명백할 것이다.
본 발명에 따라서, 유전적으로 변형된 미생물 또는 식물은 재조합 기술을 사용하여 또는 전통적인 돌연변이유발 및 선별 기술에 의해 변형된 미생물 또는 식물을 포함한다. 본원에 사용된 바와 같이, 유전자 발현, 유전자의 작용 또는 유전자 생성물(즉, 유전자에 의해 코딩된 단백질)의 작용의 감소를 야기하는 유전적 변형은 유전자의 불활성화(완전한 또는 부분적인), 결실, 방해, 봉쇄 또는 하향조절로서 지칭될 수 있다. 예를 들어, 상기 유전자에 의해 코딩된 단백질의 작용의 감소를 야기하는 유전자에서 유전적 변형은 유전자의 완전한 결실(즉, 유전자는 존재하지 않고, 이에 따라 단백질은 존재하지 않음), 단백질의 불완전한 번역을 야기하거나 번역이 없는 유전자의 돌연변이(예컨대, 단백질은 발현되지 않음), 또는 단백질의 천연 작용을 감소시키거나 폐지하는 유전자의 돌연변이(예컨대, 효소 활성 또는 작용이 감소되거나 전혀 없는 단백질이 발현됨)의 결과일 수 있다. 유전자 발현 또는 작용의 증가를 야기하는 유전적 변형은 유전자의 증폭, 과다생산, 과발현, 활성화, 강화, 첨가 또는 상향조절로서 지칭될 수 있다.
PUFA 신타제 시스템이 내인성이고 유전적으로 변형되거나, 내인성이고 재조합 핵산 분자가 유기체에 도입되거나(내인성 시스템을 변형시키는지 여부의 옵션을 가짐), 재조합 기술에 의해 완전히 제공되든지, 본 발명에 따른 미생물 또는 식물의 유전적 변형은 바람직하게는 미생물 또는 식물에 의해 발현된 PUFA 신타제 시스템의 활성에 영향을 준다. PUFA 신타제 시스템 또는 이러한 시스템을 발현하는 유기체를 변경하는 것은, 유전적 변형의 부재와 비교하여(즉, 비변형된, 야생형 미생물 또는 식물, 또는 적어도 PUFA 합성에 관하여 비변형된 생물 또는 식물(즉, 유기체는 PUFA 합성과 관련되지 않은 다른 변형을 가질 수 있음)과 비교하여), 숙주 미생물 또는 식물에 의한 임의의 하나 이상의 PUFA(또는 PUFA 신타제 시스템에 의해 생산된 다른 생체활성 분자)의 생산에서의 임의의 검출가능하거나 측정가능한 변화를 야기하는 것이다. PUFA 신타제 시스템의 활성에 영향을 주는 것은 유전적 변형의 부재와 비교하여, 유기체에 의해 발현된 PUFA 신타제 시스템에서의 임의의 검출가능하거나 측정가능한 변화 또는 변형을 야기하는 임의의 유전적 변형을 포함한다. PUFA 신타제 시스템에서의 검출가능한 변화 또는 변형은 비제한적으로 유전적 변형의 부재 하의 내인성 PUFA 신타제 시스템과 비교되는, 변형된 PUFA 신타제 시스템 내의 임의의 하나 이상의 도메인 발현 및/또는 생물학적 활성의 변화 또는 변형(도입, 증가 또는 감소); 유기체가 이제 측정가능한/검출가능한 PUFA 신타제 시스템 활성, 예컨대 PUFA 신타제 시스템의 생성물의 생산을 갖도록 하는 유기체로의 PUFA 신타제 시스템 활성의 도입(즉, 유기체는 유전적 변형 전에 PUFA 신타제 시스템을 함유하지 않음); PUFA 신타제 시스템 활성이 변형되도록, 유기체에 의해 내인성으로 발현된 PUFA 신타제 시스템보다는 상이한 PUFA 신타제 시스템으로부터의 작용성 도메인의 유기체로의 도입(예컨대, PUFA 신타제 도메인 또는 단백질은 PUFA 신타제 시스템을 내인성으로 발현하는 유기체, 예컨대 트라우스토키트리드로 도입됨); PUFA 신타제 시스템에 의해 생산된 생체활성 분자(예컨대, PUFA)의 양의 변화(예컨대, 시스템은 유전적 변형의 부재와 비교하여 많거나(증가된 양) 적은(감소된 양) 소정 생성물을 생산함); PUFA 신타제 시스템에 의해 생산된 생체활성 분자의 유형의 변화(예컨대, PUFA의 유형의 변화)(예컨대, 시스템은 부가적인 또는 상이한 PUFA, 신규한 또는 상이한 생성물, 또는 PUFA, 또는 시스템에 의해 자연적으로 생산되는 다른 생산물의 변이체를 생산함); 및/또는 PUFA 신타제 시스템에 의해 생산된 다수의 생체활성 분자의 비의 변화(예컨대, 시스템은 다른 PUFA에 대한 하나의 PUFA의 상이한 비를 생성하거나, 유전적 변형의 부재와 비교하여 완전히 상이한 지질 프로파일을 생성하거나, 다양한 PUFA를, 자연적인 배열과 비교하여, 트라이아실글리세롤의 상이한 위치에 위치시킴)를 포함할 수 있다. 이러한 유전적 변형은 임의의 유형의 유전적 변형을 포함하고, 구체적으로 재조합 기술 및/또는 전통적인 돌연변이유발에 의해 생성된 변형을 포함한다.
PUFA 신타제 시스템에서 작용성 도메인 또는 단백질의 활성의 증가에 대한 언급이 도메인 또는 단백질 시스템의 증가된 작용성을 야기할 수 있고, 도메인 또는 단백질의 더욱 높은 활성(예컨대, 특정 활성 또는 생체내 효소 활성), 도메인 또는 단백질 시스템의 감소된 억제 또는 열화, 및 도메인 또는 단백질의 과발현을 포함할 수 있는 도메인 또는 단백질을 함유하는 유기체(또는 도메인 또는 단백질이 도입되는 유기체)에서의 임의의 유전적 변형을 지칭함에 유의하여야 한다. 예를 들어, 유전자 카피 수가 증가될 수 있거나, 발현 수준이 천연 프로모터의 수준보다 큰 수준의 발현을 제공하는 프로모터의 사용에 의해 증가될 수 있거나, 유전자가 유전자에 의해 코딩된 도메인 또는 단백질의 활성을 증가시키도록 유전자조작 또는 전통적인 돌연변이유발에 의해 변경될 수 있다.
유사하게, PUFA 신타제 시스템에서 작용성 도메인 또는 단백질의 감소에 대한 언급은 도메인 또는 단백질의 감소된 작용성을 야기하고, 도메인 또는 단백질의 감소된 활성, 도메인 또는 단백질의 증가된 억제 또는 열화, 및 도메인 또는 단백질의 발현의 감소 또는 제거를 포함하는 도메인 또는 단백질을 함유하는 유기체(또는 도메인 또는 단백질이 도입되는 유기체)에서의 임의의 유전적 변형을 지칭한다. 예를 들어, 본 발명의 도메인 또는 단백질의 작용은 도메인 또는 단백질의 생산의 봉쇄하거나 감소시키거나, 도메인 또는 단백질을 코딩하는 유전자 또는 이의 부분을 "녹-아웃"시키거나, 도메인 또는 단백질 활성을 감소시키거나, 도메인 또는 단백질의 활성을 억제함으로써 감소될 수 있다. 도메인 또는 단백질의 생산의 봉쇄 또는 감소는 성장 매질에서 유도 화합물의 존재를 요구하는 프로모터의 제어 하에 도메인 또는 단백질을 코딩하는 유전자를 위치시킴을 포함할 수 있다. 유도자가 매질에서 고갈되도록 조건을 확립함으로써, 도메인 또는 단백질을 코딩하는 유전자의 발현(및, 이에 따라, 단백질 합성)이 중단될 수 있다. 본 발명은 미국 특허공보 제7,217,856호에서의 트라우스토키트리드 미생물에서 표적화된 유전자를 결실(녹-아웃)시키는 능력을 증명하였다. 도메인 또는 단백질의 활성의 봉쇄 또는 감소는 미국 특허공보 제4,743,546호(본원에 참조로 혼입됨)에 기술된 바와 유사한 절제 기술 접근법의 사용을 포함할 수 있다. 이러한 접근법을 사용하기 위하여, 해당 단백질을 코딩하는 유전자는 게놈으로부터 유전자의 특이적이고 제어된 절제를 가능하게 하는 특정 유전 서열 사이에서 클로닝된다. 절제는, 예를 들어, 미국 특허공보 제4,743,546호에서와 같이 배양물의 배양 온도에서의 이동, 또는 일부 다른 물리적 또는 영양적 신호에 의해 촉진될 수 있다.
본 발명의 특정 양태에서, 내인성 트라우스토키트리드 PUFA 신타제 유전자, 예컨대 통상적으로 DHA 및 DPA n-6을 생산하는 PUFA 신타제 효소를 코딩하는 쉬조키트리움 유전자는 임의의 또는 표적화된 돌연변이유발에 의해 변형되고/거나, 동종 PUFA 신타제 단백질을 코딩하는 다른 유기체(예컨대, 세균 또는 다른 공급원)로부터의 유전자로 치환되고/거나, 유전적으로 변형된 쉬조키트리움, 트라우스토키트리움 또는 다른 트라우스토키트리드 PUFA 신타제 유전자로 치환된다. 본원에 논의된 바와 같이, 쉬조키트리움 종 ATCC PTA-9695로부터의 하나 이상의 PUFA 신타제 유전자를 코딩하는 핵산 분자의 조합은 목적 PUFA 또는 다른 생체활성 분자의 생산을 야기할 것이다. 이들 유도된 및/또는 변형된 유전자에 의해 코딩된 효소의 생성물은, 예를 들어 EPA일 수 있거나, 일부 다른 관련 분자, 예컨대 다른 PUFA일 수 있다. 이러한 방법의 하나의 특징은, 쉬조키트리움 종 ATCC PTA-9695로부터, 예를 들어, EPA를 생산하는 PUFA 신타제의 능력을 더욱 이용하면서, 트라우스토키트리드 PUFA 합성의 내인성 성분, 및 인지질(PL) 및 트라이아실글리세롤(TAG)로의 PUFA의 효율적인 혼입 및 생산에 필수적인 축적 기계를 이용하는 것이다. 특히, 본 발명의 이러한 양태는 모 균주의 높은 생산성을 유지하면서, 유기체에 의해 생산된 PUFA의 유형의 변형에 관한 것이다.
일부 하기 논의가 예시적인 숙주 유기체로서 유기체 쉬조키트리움을 사용하지만, 임의의 트라우스토키트리드, 예컨대 트라우스토키트리움, 라비린툴로이데스 및 자포노키트리움 속의 구성원이 본 발명에 따라 변형될 수 있다. 또한, 미국 특허공보 제7,247,461호에 제시된 유기체 선별 방법을 사용하여, 본 방법에 유용한 다른 유기체를 확인할 수 있고, 이러한 모든 유기체는 본원에 포함된다. 또한, PUFA 신타제 시스템은 본원에 제공된 예시적인 정보를 사용하여 구축될 수 있고, 다른 미생물, 예컨대 세균 또는 효모에서 생산될 수 있고, 식물 세포로 형질전환되어 유전적으로 변형된 식물을 생산할 수 있다. 본원에 논의된 개념은 필요에 따라 다양한 시스템에 적용될 수 있다.
재조합 핵산 분자 및 숙주 세포의 형질감염에 관한 상기 일반적인 논의는 본원에 논의된 임의의 재조합 핵산 분자, 예컨대 PUFA 신타제 시스템으로부터의 하나 이상의 도메인의 생물학적 활성을 갖는 임의의 아미노산 서열을 코딩하는 것, 다른 PUFA 신타제 시스템으로부터의 아미노산 서열을 코딩하는 것, 및 다른 단백질 또는 도메인을 코딩하는 것에 적용되도록 의도된다.
배양물 및 단리된 바이오매스
본 발명은 본 발명의 하나 이상의 단리된 재조합 숙주 세포를 포함하는 배양물에 관한 것이다. 미생물총, 예컨대 미세조류 및 트라우스토키트리드를 접종하고 성장시키고 회수하기 위한 다양한 발효 변수는 당업계에 공지된다(예컨대, 미국 특허공보 제5,130,242호(이의 전문은 본원에 참조로 혼입됨) 참조). 액체 또는 고체 매질은 천연 또는 인공 해수를 함유할 수 있다. 종속영양 성장을 위한 탄소 공급원은 비제한적으로 글루코스, 프룩토스, 자일로서, 사카로스, 말토스, 가용성 전분, 몰라시스, 푸코스, 글루코사민, 덱스트란, 지방, 오일, 글리세롤, 나트륨 아세테이트, 및 만니톨을 포함한다. 질소 공급원은 비제한적으로 펩톤, 효모 추출물, 폴리펩톤, 맥아 추출물, 육류 추출물, 카스아미노산, 옥수수 침지액, 유기 질소 공급원, 나트륨 글루타메이트, 우레아, 무기 질소 공급원, 암모늄 아세테이트, 암모늄 설페이트, 암모늄 클로라이드, 및 암모늄 니트레이트를 포함한다.
본 발명은 본 발명의 재조합 숙주 세포의 단리된 바이오매스에 관한 것이다. 본 발명의 단리된 바이오매스는 미국 특허공보 제5,130,242호 및 미국 특허공개공보 제2002/0001833호(이들 각각의 전문은 본원에 참조로 혼입됨)에 기술된 바와 같은, 바이오매스의 단리를 위한 임의의 전통적인 방법에 의해 수득된 수확된 세포 바이오매스이다. 일부 양태에서, 1 L의 배양물로부터 단리된 바이오매스의 무수 세포 중량은, 탄소, 질소 및 영양소의 공급원 및 약 950 내지 약 8,500 ppm 클로라이드 이온을 포함하는 약 pH 6.5 내지 약 9.5의 배양 매질에서 약 15 내지 약 30℃에서 약 6 내지 약 8일 동안 성장시킨 후, 약 10 g 이상, 약 15 g 이상, 약 20 g 이상, 약 25 g 이상, 약 30 g 이상, 약 50 g 이상, 약 60 g 이상, 약 70 g 이상, 약 80 g 이상, 약 100 g 이상, 약 120 g 이상, 약 140 g 이상, 약 160 g 이상, 약 180 g 이상 또는 약 200 g 이상이다. 일부 양태에서, 1 L의 배양물로부터 단리된 바이오매스의 무수 세포 중량은, 탄소, 질소 및 영양소의 공급원, 및 약 950 ppm 내지 약 8,500 ppm 클로라이드 이온을 포함하는 약 pH 6.5, 약 pH 7, 약 pH 7.5, 약 pH 8.0, 약 pH 8.5, 약 pH 9, 또는 약 pH 9.5의 배양 매질에서 약 15℃, 약 16℃, 약 17℃, 약 18℃, 약 19℃, 약 20℃, 약 21℃, 약 22℃, 약 23℃, 약 24℃, 약 25℃, 약 26℃, 약 27℃, 약 28℃, 약 29℃ 또는 약 30℃에서 약 6일, 약 7일 또는 약 8일 동안 성장시킨 후, 약 10 g 이상, 약 15 g 이상, 약 20 g 이상, 약 25 g 이상, 약 30 g 이상, 약 50 g 이상, 약 60 g 이상, 약 70 g 이상, 약 80 g 이상, 약 100 g 이상, 약 120 g 이상, 약 140 g 이상, 약 160 g 이상, 약 180 g 이상 또는 약 200 g 이상이다. 일부 양태에서, 1 L의 배양물로부터 단리된 바이오매스의 무수 세포 중량은, 탄소, 질소 및 영양소의 공급원, 및 약 950 ppm 내지 약 8,500 ppm 클로라이드 이온을 포함하는 약 pH 6.5 내지 약 pH 9.5의 배양 매질에서 약 15 내지 약 30℃에서 약 6 내지 약 8일 동안 성장시킨 후, 약 10 내지 약 200 g이다. 일부 양태에서, 1 L의 배양물로부터 단리된 바이오매스의 무수 세포 중량은, 탄소, 질소 및 영양소의 공급원, 및 약 950 ppm 내지 약 8,500 ppm 클로라이드 이온을 포함하는 약 pH 6.5, 약 pH 7, 약 pH 7.5, 약 pH 8.0, 약 pH 8.5, 약 pH 9 또는 약 pH 9.5의 배양 매질에서 약 15℃, 약 16℃, 약 17℃, 약 18℃, 약 19℃, 약 20℃, 약 21℃, 약 22℃, 약 23℃, 약 24℃, 약 25℃, 약 26℃, 약 27℃, 약 28℃, 약 29℃ 또는 약 30℃에서 약 6일, 약 7일 또는 약 8일 동안 성장시킨 후, 약 10 내지 약 200 g, 약 10 내지 약 100 g, 약 10 내지 약 50 g, 약 15 내지 약 200 g, 약 15 내지 약 100 g, 약 15 내지 약 50 g, 약 20 내지 약 200 g, 약 20 내지 약 100 g, 약 20 내지 약 50 g, 약 50 내지 약 200 g 또는 약 50 내지 약 100 g이다. 일부 양태에서, 단리된 배양물은 폴리비닐피롤리돈을 함유하지 않는다.
일부 양태에서, 단리된 배양물은, 탄소, 질소 및 영양소의 공급원, 및 약 950 ppm 내지 약 8,500 ppm 클로라이드 이온을 포함하는 pH 6.5 내지 약 pH 8.5 또는 약 pH 6.5 내지 약 pH 9.5의 배양 매질에서 약 15 내지 약 30℃에서 약 6일, 약 7일 또는 약 8일 동안 성장시킨 후, 약 0.2 g/L/일 이상, 약 0.3 g/L/일 이상, 약 0.4 g/L/일 이상, 약 0.5 g/L/일 이상, 약 1 g/L/일 이상, 약 1.2 g/L/일 이상, 약 1.5 g/L/일 이상, 약 1.7 g/L/일 이상, 약 2 g/L/일 이상, 약 3 g/L/일 이상, 약 3.5 g/L/일 이상, 약 4 g/L/일 이상, 약 4.5 g/L/일 이상, 약 5 g/L/일 이상, 약 6 g/L/일 이상 또는 약 8 g/L/일 이상의 오메가-3 지방산 생산성을 갖는다. 일부 양태에서, 단리된 배양물은, 탄소, 질소 및 영양소의 공급원, 및 약 950 ppm 내지 약 8,500 ppm 클로라이드 이온을 포함하는 약 pH 6.5 내지 약 pH 9.5의 배양 매질에서 약 15 내지 약 30℃에서 약 6일, 약 7일 또는 약 8일 동안 성장시킨 후, 약 0.2 내지 약 20 g/L/일, 약 0.4 내지 약 20 g/L/일, 약 0.4 내지 약 2 g/L/일, 약 1 내지 약 2 g/L/일, 약 1 내지 약 20 g/L/일, 약 2 내지 약 15 g/L/일, 약 2 내지 약 10 g/L/일, 약 3 내지 약 10 g/L/일, 약 4 내지 약 9 g/L/일, 약 4 내지 약 8 g/L/일, 약 4 내지 약 7 g/L/일 또는 약 4 내지 약 6 g/L/일의 오메가-3 지방산 생산성을 갖는다.
일부 양태에서, 단리된 배양물은 탄소, 질소 및 영양소의 공급원, 및 약 950 ppm 내지 약 8,500 ppm 클로라이드 이온을 포함하는 약 pH 6.5 내지 약 pH 8.5 또는 약 pH 6.5 내지 약 pH 9.5의 배양 매질에서 약 15 내지 약 30℃에서 약 6일, 약 7일 또는 약 8일 동안 성장시킨 후, 약 0.2 g/L/일 이상, 약 0.3 g/L/일 이상, 약 0.4 g/L/일 이상, 약 0.5 g/L/일 이상, 약 0.6 g/L/일 이상, 약 0.7 g/L/일 이상, 약 0.8 g/L/일 이상, 약 0.9 g/L/일 이상, 약 1 g/L/일 이상, 약 1.2 g/L/일 이상, 약 1.5 g/L/일 이상, 약 1.7 g/L/일 이상, 약 2 g/L/일 이상, 약 3 g/L/일 이상, 약 4 g/L/일 이상 또는 약 5 g/L/일 이상의 EPA 생산성을 갖는다. 일부 양태에서, EPA 생산성은, 탄소, 질소 및 영양소의 공급원, 및 약 950 ppm 내지 약 8,500 ppm 클로라이드 이온을 포함하는 약 pH 6.5 내지 약 pH 8.5 또는 약 pH 6.5 내지 약 pH 9.5의 배양 매질에서 약 15 내지 약 30℃에서 약 6일, 약 7일 또는 약 8일 동안 성장시킨 후, 약 0.2 내지 약 5 g/L/일, 약 0.2 내지 약 4 g/L/일, 약 0.2 내지 약 3 g/L/일, 약 0.2 내지 약 2 g/L/일, 약 0.2 내지 약 1 g/L/일, 약 0.2 내지 약 0.8 g/L/일, 약 0.2 내지 약 0.7 g/L/일, 약 1 내지 약 5 g/L/일, 약 1 내지 약 4 g/L/일, 약 1 내지 약 3 g/L/일 또는 약 1 내지 약 2 g/L/일이다. 일부 양태에서, 임의의 상기 EPA 생산성은 임의의 상기 오메가-3 지방산 생산성과 연관된다. 일부 양태에서, 배양물은 약 0 내지 약 5 g/L/일, 약 0 내지 약 4 g/L/일, 약 0 내지 약 3 g/L/일, 약 0 내지 약 2 g/L/일, 약 0 내지 약 1 g/L/일, 약 0.2 내지 약 5 g/L/일, 약 0.2 내지 약 4 g/L/일, 약 0.2 내지 약 3 g/L/일, 약 0.2 내지 약 2 g/L/일, 약 0.2 내지 약 1 g/L/일, 약 1 내지 약 5 g/L/일, 약 2 내지 약 5 g/L/일, 약 2 내지 약 4 g/L/일 또는 약 2 내지 약 3 g/L/일의 DHA 생산성을 추가로 포함한다. 일부 양태에서, DHA 생산성은 약 5 g/L/일 미만, 약 4 g/L/일 미만, 약 3 g/L/일 미만, 약 2 g/L/일 미만, 약 1 g/L/일 미만, 약 0.5 g/L/일 미만, 약 0.2 g/L/일 미만 또는 약 0 g/L/일이다.
일부 양태에서, 발효 부피(배양물의 부피)는 약 2 L 이상, 약 10 L 이상, 약 50 L 이상, 약 100 L 이상, 약 200 L 이상, 약 500 L 이상, 약 1,000 L 이상, 약 10,000 L 이상, 약 20,000 L 이상, 약 50,000 L 이상, 약 100,000 L 이상, 약 150,000 L 이상, 약 200,000 L 이상 또는 약 250,000 L 이상이다. 일부 양태에서, 발효 부피는 약 2 내지 약 300,000 L, 약 2 L, 약 10 L, 약 50 L, 약 100 L, 약 200 L, 약 500 L, 약 1,000 L, 약 10,000 L, 약 20,000 L, 약 50,000 L, 약 100,000 L, 약 150,000 L, 약 200,000 L, 약 250,000 L 또는 약 300,000 L이다.
일부 양태에서, 본 발명은 본 발명의 지방산 프로파일을 포함하는 단리된 바이오매스에 관한 것이다. 일부 양태에서, 바이오매스의 무수 세포 중량의 약 20% 이상, 약 25% 이상, 약 30% 이상, 약 35% 이상, 약 40% 이상, 약 45% 이상, 약 50% 이상, 약 55% 이상, 약 60% 이상, 약 65% 이상, 약 70% 이상, 약 75% 이상 또는 약 80% 이상은 지방산이다. 일부 양태에서, 바이오매스의 무수 세포 중량의 약 20% 초과, 약 25% 초과, 약 30% 초과, 약 35% 초과, 약 40% 초과, 약 45% 초과, 약 50% 초과, 약 55% 초과 또는 약 60% 초과는 지방산이다. 일부 양태에서, 바이오매스의 무수 세포 중량의 약 20 내지 약 55%, 약 20 내지 약 60%, 약 20 내지 약 70%, 약 20 내지 약 80%, 약 30 내지 약 55%, 약 30 내지 약 70%, 약 30 내지 약 80%, 약 40 내지 약 60%, 약 40 내지 약 70%, 약 40 내지 약 80%, 약 50 내지 약 60%, 약 50 내지 약 70%, 약 50 내지 약 80%, 약 55 내지 약 70%, 약 55 내지 약 80%, 약 60 내지 약 70% 또는 약 60 내지 약 80%는 지방산이다. 일부 양태에서, 바이오매스는 중량 단위로 약 10% 초과, 약 12% 이상, 약 15% 이상, 약 20% 이상, 약 25% 이상, 약 30% 이상, 약 35% 이상, 약 40% 이상 또는 약 45%의 지방산을 EPA로 포함한다. 일부 양태에서, 바이오매스는 중량 단위로 약 10 내지 약 55%, 약 12 내지 약 55%, 약 15 내지 약 55%, 약 20 내지 약 55%, 약 20 내지 약 40% 또는 약 20 내지 약 30%의 지방산을 EPA로서 포함한다. 일부 양태에서, 바이오매스는 트라이아실글리세롤 분획을 포함하고, 이때 중량 단위로 트라이아실글리세롤 분획의 약 12% 이상, 약 13% 이상, 약 14% 이상, 약 15% 이상, 약 16% 이상, 약 17% 이상, 약 18% 이상, 약 19% 이상 또는 약 20% 이상은 EPA이다. 일부 양태에서, 바이오매스는 트라이아실글리세롤 분획을 포함하고, 이때 트라이아실글리세롤 분획의 EPA 함량은 중량 단위로 적어도 약 12 내지 약 55%, 약 12 내지 약 50%, 약 12 내지 약 45%, 적어도 약 12 내지 약 40%, 적어도 약 12 내지 약 35%, 적어도 약 12 내지 약 30%, 약 15 내지 약 55%, 약 15 내지 약 50%, 약 15 내지 약 45%, 약 15 내지 약 40%, 약 15 내지 약 35%, 약 15 내지 약 30%, 약 20 내지 약 55%, 약 20 내지 약 50%, 약 20 내지 약 45%, 적어도 약 20 내지 약 40%, 적어도 약 20 내지 약 35% 또는 약 20 내지 약 30%이다. 일부 양태에서, 중량 단위로 바이오매스의 무수 세포 중량의 약 20% 이상, 약 25% 이상, 약 30% 이상, 약 35% 이상, 약 40% 이상, 약 50% 이상 또는 약 60% 이상은 DHA이다. 일부 양태에서, 중량 단위로 바이오매스의 무수 세포 중량의 약 20 내지 약 60%, 약 25 내지 약 60%, 약 25 내지 약 50%, 약 25 내지 약 45%, 약 30 내지 약 50% 또는 약 35 내지 약 50%는 DHA이다. 일부 양태에서, 바이오매스는 중량 단위로 약 10% 이하, 약 9% 이하, 약 8% 이하, 약 7% 이하, 약 6% 이하, 약 5% 이하, 약 4% 이하, 약 3% 이하, 약 2% 이하 또는 약 1% 이하의 지방산을 DHA로서 포함한다. 일부 양태에서, 바이오매스는 중량 단위로 약 1 내지 약 10%, 약 1 내지 약 5%, 약 2 내지 약 5%, 약 3 내지 약 5% 또는 약 3 내지 약 10%의 지방산을 DHA로서 포함한다. 일부 양태에서, 바이오매스는 DHA가 실질적으로 부재한다. 일부 양태에서, 바이오매스는 중량 단위로 약 0.1 내지 약 5% 미만, 약 0.1 내지 약 4%, 약 0.1 내지 약 3%, 약 0.1 내지 약 2%, 약 0.2 내지 약 5% 미만, 약 0.2 내지 약 4%, 약 0.2 내지 약 3%, 약 0.2 내지 약 2%, 약 0.3 내지 약 2%, 약 0.1 내지 약 0.5%, 약 0.2 내지 약 0.5%, 약 0.1 내지 약 0.4%, 약 0.2 내지 약 0.4%, 약 0.5 내지 약 2%, 약 1 내지 약 2%, 약 0.5 내지 약 1.5% 또는 약 1 내지 약 1.5%의 지방산을 ARA로서 포함한다. 일부 양태에서, 바이오매스는 중량 단위로 약 5% 미만, 약 4% 이하, 약 3% 이하, 약 2% 이하, 약 1.5% 이하, 약 1% 이하, 약 0.5% 이하, 약 0.4% 이하, 약 0.3% 이하, 약 0.2% 이하 또는 약 0.1% 이하의 지방산을 ARA로서 포함한다. 일부 양태에서, 바이오매스는 ARA가 실질적으로 부재한다. 일부 양태에서, 바이오매스는 중량 단위로 약 0.4 내지 약 2%, 약 0.4 내지 약 3%, 약 0.4 내지 약 4%, 약 0.4 내지 약 5%, 약 0.4 내지 약 5% 미만, 약 0.5 내지 약 1%, 약 0.5 내지 약 2%, 약 0.5 내지 약 3%, 약 0.5 내지 약 4%, 약 0.5 내지 약 5%, 약 0.5 내지 약 5% 미만, 약 1 내지 약 2%, 약 1 내지 약 3%, 약 1 내지 약 4%, 약 1 내지 약 5% 또는 약 1 내지 약 5% 미만의 지방산을 DPA n-6으로서 포함한다. 일부 양태에서, 바이오매스는 중량 단위로 약 5% 이하, 약 5% 미만, 약 4% 이하, 약 3% 이하, 약 2% 이하, 약 1% 이하, 약 0.75% 이하, 약 0.6% 이하 또는 약 0.5% 이하의 지방산을 DPA n-6으로서 포함한다. 일부 양태에서, 바이오매스는 DPA n-6이 실질적으로 부재한다. 일부 양태에서, 바이오매스는 지방산을 중량 단위로 약 5% 이하, 약 5% 미만, 약 4% 이하, 약 3% 이하 또는 약 2% 이하의 올레산(18:1 n-9), 리놀레산(18:2 n-6), 리놀렌산(18:3 n-3), 에이코센산(20:1 n-9), 에루크산(22:1 n-9) 또는 이들의 조합과 함께 포함한다. 본 발명의 단리된 바이오매스의 특징은 외인성으로 도입된 물질보다 단리된 바이오매스의 내인성 또는 천연 특성과 연관된다. 일부 양태에서, 단리된 바이오매스는 폴리비닐피롤리돈을 함유하지 않거나 폴리비닐피롤리돈을 함유하는 배양물로부터 단리되지 않는다.
본 발명은 바이오매스의 생산 방법에 관한 것이다. 일부 양태에서, 본 발명의 바이오매스의 생산 방법은 임의의 본 발명의 단리된 재조합 숙주 세포 또는 이들의 혼합물을 배양물에서 성장시켜 바이오매스를 생산하는 단계를 포함한다. 본 발명은 상기 방법에 의해 생산된 바이오매스에 관한 것이다.
미생물 오일
본 발명은 본 발명의 지방산 프로파일을 포함하는 미생물 오일에 관한 것이다. 본 발명의 미생물 오일은 약 35 중량% 이상의 트라이아실글리세롤 분획을 포함하는 "원유" 또는 "정유"이다. "원유"는 추가 가공 없이 재조합 숙주 세포의 바이오매스로부터 추출된 오일이다. "정유"는 원유를 정련, 표백 및/또는 탈취의 표준 가공에 의해 처리함으로써 수득된 오일이다(예컨대, 미국 특허공보 제5,130,242호(이의 전문은 본원에 참조로 혼입됨) 참조). 미생물 오일은 또한 본원에 기술된 "최종 오일"을 포함하고, 이는 식물성 오일로 희석된 정유이다. 일부 양태에서, 최종 오일은 고올레산 해바라기 오일로 희석된 정유이다. 본원에 사용된 용어 "미생물"은 비제한적으로 용어 "미세조류", "트라우스토키트리드", 및 본원에 기술된 임의의 숙주 세포와 연관된 분류학적 분류를 포함한다. 본원에 기술된 숙주 세포의 임의의 미생물 오일과 관련하여 사용된 용어 "트라우스토키트리알레스", "트라우스토키트리드", "쉬조키트리움" 및 "트라우스토키트리움"은 이용가능한 계통발생 정보를 비롯한 현재의 분류학적 분류를 기준으로 하고, 분류학적 분류가 본원의 출원일 후에 개정되는 경우에 제한하려는 의도가 아니다.
일부 양태에서, 본원에 기술된 지방산은 지방산 에스터일 수 있다. 일부 양태에서, 지방산 에스터는 오메가-3 지방산, 오메가-6 지방산 및 이들의 조합의 에스터를 포함한다. 일부 양태에서, 지방산 에스터는 DHA 에스터, EPA 에스터 또는 이들의 조합이다. 일부 양태에서, 본원에 기술된 오일 또는 이의 분획은 에스터화되어 지방산 에스터를 포함하는 오일 또는 이의 분획을 생산한다. 용어 "에스터"는 다른 치환기에 의한 지방산 분자의 카복실산 기의 수소의 대체를 지칭한다. 전형적인 에스터는 당업자에게 공지되고, 이의 논의는 문헌[Higuchi, T. and V. Stella in Pro-drugs as Novel Delivery Syetems, Vol. 14, A.C.S. Symposium Series, Bioreversible Carriers in Drug Design, Ed. Edward B. Roche, American Pharmaceutical Association, Pergamon Press, 1987] 및 문헌[Protective Groups in Organic Chemistry, McOmie ed., Plenum Press, New York, 1973]에 제공된다. 에스터의 예는 메틸, 에틸, 프로필, 부틸, 펜틸, t-부틸, 벤질, 니트로벤질, 메톡시벤질, 벤즈하이드릴 및 트라이클로로에틸을 포함한다. 일부 양태에서, 에스터는 카복실산 보호성 에스터 기, 아르알킬(예컨대, 벤질, 페네틸)에 의한 에스터, 저급 알켄일(예컨대, 알릴, 2-부텐일)에 의한 에스터, 저급-알콕시-저급-알킬(예컨대, 메톡시메틸, 2-메톡시에틸, 2-에톡시에틸)에 의한 에스터, 저급-알칸오일옥시-저급-알킬(예컨대, 아세톡시메틸, 피발로일옥시메틸, 1-피발로일옥시에틸)에 의한 에스터, 저급-알콕시카보닐-저급-알킬(예컨대, 메톡시카보닐메틸, 이소프로폭시카보닐메틸)에 의한 에스터, 카복시-저급 알킬(예컨대, 카복시메틸)에 의한 에스터, 저급-알콕시카보닐옥시-저급-알킬(예컨대, 1-(에톡시카보닐옥시)에틸, 1-(사이클로헥실옥시카보닐옥시)에틸)에 의한 에스터, 카바모일옥시-저급 알킬(예컨대, 카바모일옥시메틸)에 의한 에스터 등이다. 일부 양태에서, 첨가된 치환기는 선형 또는 환형 탄화수소 기, 예컨대, C1-C6 알킬, C1-C6 사이클로알킬, C1-C6 알켄일 또는 C1-C6 아릴 에스터이다. 일부 양태에서, 에스터는 알킬 에스터, 예컨대, 메틸 에스터, 에틸 에스터 또는 프로필 에스터이다. 일부 양태에서, 에스터 치환기는 지방산이 정제되거나 반-정제된 상태일 때 유리 지방산 분자에 첨가된다. 다르게는, 지방산 에스터는 에스터로의 트라이아실글리세롤의 전환 시 형성된다.
본 발명은 미생물 오일의 생산 방법에 관한 것이다. 일부 양태에서, 상기 방법은 본 발명의 임의의 단리된 재조합 숙주 세포 또는 이들의 혼합물을 배지에서 성장시켜 오메가-3 지방산을 포함하는 미생물 오일을 생산하는 단계를 포함한다. 일부 양태에서, 상기 방법은 미생물 오일을 추출하는 단계를 추가로 포함한다. 일부 양태에서, 상기 방법은 오메가-3 지방산을 포함하는 미생물 오일을 본 발명의 임의의 바이오매스 또는 이들의 혼합물로부터 추출하는 단계를 포함한다. 일부 양태에서, 상기 방법은 단리된 재조합 숙주 세포를 종속영양적으로 성장시키는 단계를 포함하고, 이때 배지는 본원에 기술된 탄소 공급원을 포함한다. 미생물 오일은 새로 수확된 바이오매스로부터 추출될 수 있거나, 손상을 방지하는 조건 하에 저장된 종전에 수확된 바이오매스로부터 추출될 수 있다. 공지된 방법은 본 발명의 재조합 숙주 세포를 배양하고, 배지로부터 바이오매스를 단리시키고, 미생물 오일을 바이오매스로부터 추출하고, 바이오매스로부터 추출된 오일의 지방산 프로파일을 분석하는데 사용될 수 있다(예컨대, 미국 특허공보 제5,130,242호(이의 전문은 본원에 참조로 혼입됨) 참조). 본 발명은 본 발명의 임의의 방법에 의해 생산된 미생물 오일에 관한 것이다.
일부 양태에서, 미생물 오일은 중량 단위로 약 0% 이상, 약 0.1% 이상, 약 0.2% 이상, 약 0.5% 이상, 약 1% 이상, 약 1.5% 이상, 약 2% 이상 또는 약 5% 이상의 스테롤 에스터 분획을 포함한다. 일부 양태에서, 미생물 오일은 중량 단위로 약 0 내지 약 1.5%, 약 0 내지 약 2%, 약 0 내지 약 5%, 약 1 내지 약 1.5%, 약 0.2 내지 약 1.5%, 약 0.2 내지 약 2%, 또는 약 0.2 내지 약 5%의 스테롤 에스터 분획을 포함한다 일부 양태에서, 미생물 오일은 중량 단위로 약 5% 이하, 약 4% 이하, 약 3% 이하, 약 2% 이하, 약 1% 이하, 약 0.5% 이하, 약 0.3% 이하, 약 0.2% 이하, 약 0.5% 이하, 약 0.4% 이하, 약 0.3% 이하 또는 약 0.2% 이하의 스테롤 에스터 분획을 포함한다.
일부 양태에서, 미생물 오일은 중량 단위로 약 35% 이상, 약 40% 이상, 약 45% 이상, 약 50% 이상, 약 55% 이상, 약 60% 이상, 약 65% 이상, 약 70% 이상, 약 75% 이상, 약 80% 이상, 약 85% 이상 또는 약 90%의 트라이아실글리세롤 분획을 포함한다. 일부 양태에서, 미생물 오일은 중량 단위로 약 35 내지 약 98%, 약 35 내지 약 90%, 약 35 내지 약 80%, 약 35 내지 약 70%, 약 35 내지 약 70%, 약 35 내지 약 65%, 약 40 내지 약 70%, 약 40 내지 약 65%, 약 40 내지 약 55%, 약 40 내지 약 50%, 약 65 내지 약 95%, 약 75 내지 약 95%, 약 75 내지 약 98%, 약 80 내지 약 95%, 약 80 내지 약 98%, 약 90 내지 약 96%, 약 90 내지 약 97%, 약 90 내지 약 98%, 약 90%, 약 95%, 약 97%, 또는 약 98%의 트라이아실글리세롤 분획을 포함한다.
일부 양태에서, 미생물 오일은 중량 단위로 약 10% 이상, 약 11% 이상, 약 12% 이상, 약 13% 이상, 약 14% 이상, 약 15% 이상, 약 16% 이상, 약 17% 이상, 약 18% 이상, 약 19% 이상 또는 약 20%의 다이아실글리세롤 분획을 포함한다. 일부 양태에서, 미생물 오일은 중량 단위로 약 10 내지 약 45%, 약 10 내지 약 40%, 약 10 내지 약 35%, 약 10 내지 약 30%, 약 15 내지 약 40%, 약 15 내지 약 35%, 또는 약 15 내지 약 30%의 다이아실글리세롤 분획을 포함한다. 일부 양태에서, 미생물 오일은 중량 단위로 약 0.2% 이상, 약 0.3% 이상, 약 0.4% 이상, 약 0.5% 이상, 약 1% 이상, 약 5% 이상, 약 10% 이상, 약 11% 이상, 약 12% 이상, 약 13% 이상, 약 14% 이상, 약 15% 이상, 약 16% 이상, 약 17% 이상, 약 18% 이상, 약 19% 이상 또는 약 20% 이상의 1,2-다이아실글리세롤 분획을 포함한다. 일부 양태에서, 미생물 오일은 중량 단위로 약 0.2 내지 약 45%, 약 0.2 내지 약 30%, 약 0.2 내지 약 20%, 약 0.2 내지 약 10%, 약 0.2 내지 약 5%, 약 0.2 내지 약 1%, 약 0.2 내지 약 0.8%, 약 0.4 내지 약 45%, 약 0.4 내지 약 30%, 약 0.4 내지 약 20%, 약 0.4 내지 약 10%, 약 0.4 내지 약 5%, 약 0.4 내지 약 1%, 약 0.4 내지 약 0.8%, 약 0.5 내지 약 1%, 약 0.5 내지 약 0.8%, 약 10 내지 약 45%, 약 10 내지 약 40%, 약 10 내지 약 35%, 약 10 내지 약 30%, 약 15 내지 약 40%, 약 15 내지 약 35%, 약 15 내지 약 30%, 또는 약 15 내지 약 25%의 다이아실글리세롤 분획을 포함한다. 일부 양태에서, 미생물 오일은 중량 단위로 약 0.1% 이상, 약 0.2% 이상, 약 0.5% 이상, 약 1% 이상, 약 2% 이상, 약 2.5 % 이상 또는 약 3% 이상의 1,3-다이아실글리세롤 분획을 포함한다. 일부 양태에서, 미생물 오일은 중량 단위로 약 0.3% 이상, 약 0.4% 이상, 약 0.5% 이상, 약 1% 이상, 약 1.5% 이상, 약 2% 이상 또는 약 5% 이상의 스테롤 분획을 포함한다.
일부 양태에서, 미생물 오일은 중량 단위로 약 0.3 내지 약 5%, 약 0.3 내지 약 2%, 약 0.3 내지 약 1.5%, 약 0.5 내지 약 1.5%, 약 1 내지 약 1.5%, 약 0.5 내지 약 2%, 약 0.5 내지 약 5%, 약 1 내지 약 2%, 또는 약 1 내지 약 5%의 스테롤 분획을 포함한다. 일부 양태에서, 미생물 오일은 중량 단위로 약 5% 이하, 약 4% 이하, 약 3% 이하, 약 2% 이하, 약 1.5% 이하 또는 약 1% 이하의 스테롤 분획을 포함한다.
일부 양태에서, 미생물 오일은 중량 단위로 약 2% 이상, 약 5% 이상 또는 약 8% 이상의 인지질 분획을 포함한다. 일부 양태에서, 미생물 오일은 중량 단위로 약 2 내지 약 25%, 약 2 내지 약 20%, 약 2 내지 약 15%, 약 2 내지 약 10%, 약 5 내지 약 25%, 약 5 내지 약 20%, 약 5 내지 약 20%, 약 5 내지 약 10%, 또는 약 7 내지 약 9%의 인지질 분획을 포함한다. 일부 양태에서, 미생물 오일은 중량 단위로 약 20% 미만, 약 15% 미만, 약 10% 미만, 약 9% 미만 또는 약 8% 미만의 인지질 분획을 포함한다. 일부 양태에서, 미생물 오일은 인지질이 실질적으로 부재한다. 일부 양태에서, 미생물 오일은 오일의 중량을 기준으로 약 2% 미만, 약 1.5% 미만, 약 1% 미만 또는 약 0.5% 미만의 부검화물을 포함한다. 미생물 오일에 존재하는 지질 부류, 예컨대 트라이아실글리세롤 분획은 플래시 크로마토그래피에 의해 분리될 수 있고 박층 크로마토그래피(TLC)에 의해 분석되거나, 당업계에 공지된 다른 방법에 의해 분리되고 분석된다.
일부 양태에서, 미생물 오일, 및/또는 트라이아실글리세롤 분획, 유리 지방산 분획, 스테롤 분획, 다이아실글리세롤 분획, 및 이들의 조합으로부터 선택되는 하나 이상의 분획은 중량을 기준으로 약 5% 이상, 약 10% 이상, 약 10% 초과, 약 12% 이상, 약 13% 이상, 약 14% 이상, 약 15% 이상, 약 16% 이상, 약 17% 이상, 약 18% 이상, 약 19% 이상, 약 20% 이상, 약 25% 이상, 약 30% 이상, 약 35% 이상, 약 40% 이상 또는 약 45% 이상의 EPA를 포함한다. 일부 양태에서, 미생물 오일 및/또는 트라이아실글리세롤 분획, 유리 지방산 분획, 스테롤 분획, 다이아실글리세롤 분획, 및 이들의 조합으로부터 선택되는 하나 이상의 분획은 중량을 기준으로 약 5 내지 약 55%, 약 5 내지 약 50%, 약 5 내지 약 45%, 약 5 내지 약 40%, 약 5 내지 약 35%, 약 5 내지 약 30%, 약 10 내지 약 55%, 약 10 내지 약 50%, 약 10 내지 약 45%, 약 10 내지 약 40%, 약 10 내지 약 35%, 약 10 내지 약 30%, 적어도 약 12 내지 약 55%, 적어도 약 12 내지 약 50%, 적어도 약 12 내지 약 45%, 적어도 약 12 내지 약 40%, 적어도 약 12 내지 약 35% 또는 적어도 약 12 내지 약 30%, 약 15 내지 약 55%, 약 15 내지 약 50%, 약 15 내지 약 45%, 약 15 내지 약 40%, 약 15 내지 약 35%, 약 15 내지 약 30%, 약 15 내지 약 25%, 약 15 내지 약 20%, 약 20 내지 약 55%, 약 20 내지 약 50%, 약 20 내지 약 45%, 약 20 내지 약 40%, 또는 약 20 내지 약 30%의 EPA를 포함한다. 일부 양태에서, 미생물 오일, 및/또는 트라이아실글리세롤 분획, 다이아실글리세롤 분획, 스테롤 분획, 스테롤 에스터 분획, 유리 지방산 분획, 인지질 분획, 및 이들의 조합으로부터 선택되는 하나 이상의 분획은 중량을 기준으로 약 5% 이상, 약 10% 이상, 약 15% 이상, 약 20% 이상, 약 25% 이상, 약 30% 이상, 약 35% 이상, 약 40% 이상, 약 50% 이상 또는 약 60% 이상의 DHA를 포함한다. 일부 양태에서, 미생물 오일, 및/또는 트라이아실글리세롤 분획, 다이아실글리세롤 분획, 스테롤 분획, 스테롤 에스터 분획, 유리 지방산 분획, 인지질 분획, 및 이들의 조합으로부터 선택되는 하나 이상의 분획은 중량을 기준으로 약 5 내지 약 60%, 약 5 내지 약 55%, 약 5 내지 약 50%, 약 5 내지 약 40%, 약 10 내지 약 60%, 약 10 내지 약 50%, 약 10 내지 약 40%, 약 20 내지 약 60%, 약 25 내지 약 60%, 약 25 내지 약 50%, 약 25 내지 약 45%, 약 30 내지 약 50%, 약 35 내지 약 50%, 또는 약 30 내지 약 40%의 DHA를 포함한다. 일부 양태에서, 미생물 오일, 및/또는 트라이아실글리세롤 분획, 다이아실글리세롤 분획, 스테롤 분획, 스테롤 에스터 분획, 유리 지방산 분획, 인지질 분획, 및 이들의 조합으로부터 선택되는 하나 이상의 분획은 중량을 기준으로 약 10% 이하, 약 9% 이하, 약 8% 이하, 약 7% 이하, 약 6% 이하, 약 5% 이하, 약 4% 이하, 약 3% 이하, 약 2% 이하, 또는 약 1% 이하의 DHA를 포함한다. 일부 양태에서, 미생물 오일, 및/또는 트라이아실글리세롤 분획, 다이아실글리세롤 분획, 스테롤 분획, 스테롤 에스터 분획, 유리 지방산 분획, 인지질 분획, 및 이들의 조합으로부터 선택되는 하나 이상의 분획은 중량을 기준으로 약 1 내지 약 10%, 약 1 내지 약 5%, 약 2 내지 약 5%, 약 3 내지 약 5%, 또는 약 3 내지 약 10%의 지방산을 DHA로서 포함한다. 일부 양태에서, 미생물 오일, 및/또는 트라이아실글리세롤 분획, 다이아실글리세롤 분획, 스테롤 분획, 스테롤 에스터 분획, 유리 지방산 분획, 인지질 분획, 및 이들의 조합으로부터 선택되는 하나 이상의 분획은 DHA가 실질적으로 부재한다. 일부 양태에서, 미생물 오일, 및/또는 트라이아실글리세롤 분획, 다이아실글리세롤 분획, 스테롤 분획, 스테롤 에스터 분획, 유리 지방산 분획, 인지질 분획, 및 이들의 조합으로부터 선택되는 하나 이상의 분획은 중량을 기준으로 약 0.1 내지 약 5%, 약 0.1 내지 약 5% 미만, 약 0.1 내지 약 4%, 약 0.1 내지 약 3%, 약 0.1 내지 약 2%, 약 0.2 내지 약 5%, 약 0.2 내지 약 5% 미만, 약 0.2 내지 약 4%, 약 0.2 내지 약 3%, 약 0.2 내지 약 2%, 약 0.3 내지 약 2%, 약 0.1 내지 약 0.5%, 약 0.2 내지 약 0.5%, 약 0.1 내지 약 0.4%, 약 0.2 내지 약 0.4%, 약 0.5 내지 약 2%, 약 1 내지 약 2%, 약 0.5 내지 약 1.5% 또는 약 1 내지 약 1.5%의 ARA를 포함한다. 일부 양태에서, 미생물 오일, 및/또는 트라이아실글리세롤 분획, 다이아실글리세롤 분획, 스테롤 분획, 스테롤 에스터 분획, 유리 지방산 분획, 인지질 분획, 및 이들의 조합으로부터 선택되는 하나 이상의 분획은 중량을 기준으로 약 5% 이하 미만, 약 5%, 약 4% 이하, 약 3% 이하, 약 2% 이하, 약 1.5% 이하, 약 1% 이하, 약 0.5% 이하, 약 0.4% 이하, 약 0.3% 이하, 약 0.2% 이하 또는 약 0.1% 이하의 ARA를 포함한다. 일부 양태에서, 미생물 오일, 및/또는 트라이아실글리세롤 분획, 다이아실글리세롤 분획, 스테롤 분획, 스테롤 에스터 분획, 유리 지방산 분획, 인지질 분획, 및 이들의 조합으로부터 선택되는 하나 이상의 분획은 ARA이 실질적으로 부재한다. 일부 양태에서, 미생물 오일, 및/또는 트라이아실글리세롤 분획, 다이아실글리세롤 분획, 스테롤 분획, 스테롤 에스터 분획, 유리 지방산 분획, 인지질 분획, 및 이들의 조합으로부터 선택되는 하나 이상의 분획은 중량을 기준으로 약 0.4 내지 약 2%, 약 0.4 내지 약 3%, 약 0.4 내지 약 4%, 약 0.4 내지 약 5%, 약 0.4 내지 약 5% 미만, 약 0.5 내지 약 1%, 약 0.5 내지 약 2%, 약 0.5 내지 약 3%, 약 0.5 내지 약 4%, 약 0.5 내지 약 5%, 약 0.5 내지 약 5% 미만, 약 1 내지 약 2%, 약 1 내지 약 3%, 약 1 내지 약 4%, 약 1 내지 약 5%, 또는 약 1 내지 약 5% 미만의 DPA n-6을 포함한다. 일부 양태에서, 미생물 오일, 및/또는 트라이아실글리세롤 분획, 다이아실글리세롤 분획, 스테롤 분획, 스테롤 에스터 분획, 유리 지방산 분획, 인지질 분획, 및 이들의 조합으로부터 선택되는 하나 이상의 분획은 중량을 기준으로 약 5%, 약 5% 미만, 약 4% 이하, 약 3% 이하, 약 2% 이하, 약 1% 이하, 약 0.75% 이하, 약 0.6% 이하, 또는 약 0.5% 이하의 DPA n-6을 포함한다. 일부 양태에서, 미생물 오일, 및/또는 트라이아실글리세롤 분획, 다이아실글리세롤 분획, 스테롤 분획, 스테롤 에스터 분획, 유리 지방산 분획, 인지질 분획, 및 이들의 조합으로부터 선택되는 하나 이상의 분획은 DPA n-6이 실질적으로 부재한다. 일부 양태에서, 미생물 오일, 및/또는 트라이아실글리세롤 분획, 다이아실글리세롤 분획, 스테롤 분획, 스테롤 에스터 분획, 유리 지방산 분획, 인지질 분획, 및 이들의 조합으로부터 선택되는 하나 이상의 분획은 중량을 기준으로 약 5% 이하, 약 5% 미만, 약 4% 이하, 약 3% 이하 또는 약 2% 이하의 올레산(18:1 n-9), 리놀레산(18:2 n-6), 리놀렌산(18:3 n-3), 에이코센산(20:1 n-9), 에루크산(22:1 n-9), 스테아리돈산(18:4 n-3), 또는 이들의 조합과 함께 지방산을 포함한다.
트라이아실글리세롤 분자는 3개의 중심 탄소 원자를 함유하여(C(sn-1)H2R1-(sn-2)H2R2-C(sn-3)H2R3), 상이한 위치의 이성질체의 형성을 가능하게 한다. 일부 양태에서, 미생물 오일은 트라이아실글리세롤 분획에서 약 2% 이상, 약 3% 이상, 약 5% 이상, 약 10% 이상, 약 15% 이상, 약 20% 이상, 약 30% 이상, 약 35% 이상 또는 약 40% 이상의 트라이아실글리세롤이 HPLC 크로마토그래프 상의 피크의 상대적인 면적 백분율을 기준으로 sn-1, sn-2, 및 sn-3 위치 중 임의의 2개로부터 선택되는 트라이아실글리세롤 내의 2개의 위치에서 DHA(이-치환된 DHA)를 함유하는 트라이아실글리세롤 분획을 포함한다. 일부 양태에서, 미생물 오일은 트라이아실글리세롤 분획에서 약 2 내지 약 55%, 약 2 내지 약 50%, 약 2 내지 약 45%, 약 2 내지 약 40%, 약 2 내지 약 35%, 약 2 내지 약 30%, 약 2 내지 약 25%, 약 5 내지 약 55%, 약 5 내지 약 50%, 약 5 내지 약 45%, 약 5 내지 약 40%, 약 5 내지 약 35%, 약 5 내지 약 30%, 약 5 내지 약 25%, 약 10 내지 약 55%, 약 10 내지 약 50%, 약 10 내지 약 45%, 약 10 내지 약 40%, 약 10 내지 약 35%, 약 10 내지 약 30%, 약 10 내지 약 25%, 약 10 내지 약 20%, 약 20 내지 약 40%, 약 20 내지 약 35%, 또는 약 20 내지 약 25%의 트라이아실글리세롤이 HPLC 크로마토그래프 상의 피크의 상대적인 면적 백분율을 기준으로 sn-1, sn-2, 및 sn-3 위치 중 임의의 2개로부터 선택되는 트라이아실글리세롤 내의 2개의 위치에서 EPA를 함유하는 트라이아실글리세롤 분획을 포함한다. 일부 양태에서, 미생물 오일은 트라이아실글리세롤 분획에서 약 0.5% 이상, 약 1% 이상, 약 1.5% 이상 또는 약 2% 이상의 트라이아실글리세롤이 HPLC 크로마토그래프 상의 피크의 상대적인 면적 백분율을 기준으로 sn-1, sn-2, 및 sn-3 위치 모두에서 DHA(3-치환된 DHA)를 함유하는 트라이아실글리세롤 분획을 포함한다. 일부 양태에서, 미생물 오일은 트라이아실글리세롤 분획에서 약 0.5 내지 약 5%, 약 0.5 내지 약 3%, 약 0.5 내지 약 2.5%, 약 0.5 내지 약 2%, 약 1 내지 약 5%, 약 1 내지 약 3%, 또는 약 1 내지 약 2%의 트라이아실글리세롤이 HPLC 크로마토그래프 상의 피크의 상대적인 면적 백분율을 기준으로 sn-1, sn-2, 및 sn-3 위치 모두에서 DHA를 함유하는 트라이아실글리세롤 분획을 포함한다. 일부 양태에서, 미생물 오일은 트라이아실글리세롤 분획에서 약 10% 이상, 약 15% 이상, 약 20% 이상, 약 25% 이상, 약 30% 이상, 약 35% 이상, 약 40% 이상, 약 45% 이상, 약 50% 이상, 약 55% 이상 또는 약 60% 이상의 트라이아실글리세롤이 HPLC 크로마토그래프 상의 피크의 상대적인 면적 백분율을 기준으로 sn-1, sn-2, 및 sn-3 위치 중 어느 하나로부터 선택되는 트라이아실글리세롤 내의 하나의 위치에서 DHA를 함유하는 트라이아실글리세롤 분획을 포함한다. 일부 양태에서, 미생물 오일은 트라이아실글리세롤 분획에서 약 10 내지 약 80%, 약 10 내지 약 70%, 약 10 내지 약 60%, 약 15 내지 약 80%, 약 15 내지 약 75%, 약 15 내지 약 70%, 약 15 내지 약 65%, 약 15 내지 약 60%, 약 35 내지 약 80%, 약 35 내지 약 75%, 약 35 내지 약 65%, 약 35 내지 약 60%, 약 40 내지 약 80%, 약 40 내지 약 75%, 약 40 내지 약 70%, 약 40 내지 약 65%, 약 40 내지 약 60%, 또는 약 40 내지 약 55%의 트라이아실글리세롤이 HPLC 크로마토그래프 상의 피크의 상대적인 면적 백분율을 기준으로 sn-1, sn-2, 및 sn-3 위치 중 어느 하나로부터 선택되는 트라이아실글리세롤 내의 하나의 위치에서 DHA를 함유하는 트라이아실글리세롤 분획을 포함한다.
조성물
본 발명은 본 발명의 재조합 숙주 세포, 본 발명의 단리된 바이오매스, 본 발명의 미생물 오일 또는 이들의 조합을 포함하는 조성물에 관한 것이다.
본 발명의 재조합 숙주 세포, 바이오매스 또는 미생물 오일은 조성물의 요건을 기준으로 임의의 공지된 기술에 의해 추가로 화학적으로 또는 물질적으로 변형되거나 가공될 수 있다.
재조합 숙주 세포 또는 바이오매스는 조성물에서 사용하기 전에, 비제한적으로, 냉동건조, 공기건조, 분무건조, 터널건조, 진공건조(동결건조) 및 유사한 과정을 비롯한 방법에 의해 건조될 수 있다. 다르게는, 수확되고 세척된 바이오매스는 건조 없이 조성물에 직접 사용될 수 있다(예컨대, 미국 특허공보 제5,130,242호 및 제6,812,009호(이들 각각의 전문은 본원에 참조로 혼입됨) 참조).
본 발명의 미생물 오일은 EPA와 같은 지방산이 강화된 생성물을 더욱 효율적으로 생산하도록 출발 물질로서 사용될 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 미생물 오일은 당업계에 공지된 다양한 정제 기술, 예컨대 증류 또는 우레아 송입(urea adduction)을 거쳐 더욱 높은 농도의 EPA 또는 다른 지방산을 갖는 더욱 강력한 생성물을 생산할 수 있다. 본 발명의 미생물 오일은 또한 오일 내의 지방산으로부터 유래하는 화합물, 예컨대 EPA 또는 다른 지방산의 에스터 및 염을 생산하는 화학 반응에 사용될 수 있다.
본 발명의 조성물은 하나 이상의 부형제를 포함할 수 있다. 본원에 사용된 "부형제"는 본 발명의 조성물에 사용되어 식료품, 및 약학, 미용 및 산업용 조성물을 비롯한 조성물에 원하는 특징을 제공하는 성분 또는 성분의 혼합물을 지칭한다. 본 발명의 부형제는 약학 조성물에 첨가될 때 "약학적으로 허용되는" 부형제로 기술될 수 있고, 부형제가 건전한 의학적 판단의 범주 내에서, 합리적인 이익/위험 비에 적합한 원하는 접촉 기간에 걸쳐, 과도한 독성, 자극, 알러지 반응, 또는 다른 문제되는 합병증 없이, 인간 및 비-인간 동물과 접촉하기에 적합한 화합물, 물질, 조성물, 염 및/또는 투여 형태임을 의미한다. 일부 양태에서, 용어 "약학적으로 허용되는"은 동물, 더욱 특히 인간에서의 사용을 위해, 미국 연방 관리 기관 또는 연방 정부에 의해 승인되거나, 미국 약전(U.S. Pharmacopeia) 또는 다른 일반적으로 인정되는 국제적인 약전에 열거됨을 의미한다. 다양한 부형제가 사용될 수 있다. 일부 양태에서, 부형제는 비제한적으로 알칼리성 제제, 안정화제, 산화방지제, 접착 제제, 분리제, 코팅제, 외부 상 성분, 제어-방출 성분, 용매, 계면활성제, 습윤제, 완충제, 충전제, 연화제 또는 이들의 조합일 수 있다. 본원에 논의된 것 이외의 부형제는 비제한적으로 문헌[Remington: The Science and Practice of Pharmacy, 21st ed. (2005)]에 열거된 부형제를 포함할 수 있다. 본원의 특정 분류(예컨대, "용매")에서 부형제의 포함은 부형제의 역할을 제한하기 보다는 설명하려는 의도이다. 특정 부형제는 다수의 분류에 속할 수 있다.
본 발명의 조성물은 비제한적으로 식료품, 약학 조성물, 화장품 및 산업용 조성물을 포함한다.
일부 양태에서, 조성물은 식료품이다. 식료품은 비-인간 동물 또는 인간 소비를 위한 임의의 식료품이고, 고체 및 액체 조성물을 둘 다 포함한다. 식품은 동물 또는 인간 식품에 대한 첨가제일 수 있다. 식품은 비제한적으로 통상적인 식품; 액체 제품, 예컨대 우유, 음료, 치료용 드링크 및 영양 드링크; 기능성 식품; 보충제; 영약약학제; 유아용 조제식, 예컨대 조숙 유아용 조제식; 임산부 또는 수유모용 식품; 성인용 식품; 노인용 식품; 및 동물용 식품을 포함한다.
일부 양태에서, 본 발명의 재조합 숙주 세포, 바이오매스, 또는 미생물 오일은 하나 이상의 오일: 오일, 쇼트닝, 스프레드, 다른 지방 성분, 음료, 소스, 유제품-기반 또는 콩-기반 식품(예컨대, 우유, 요거트, 치즈 및 아이스크림), 제과제품, 영양 제품, 예컨대, 영양 보충제(캡슐 또는 정제 형태), 비타민 보충제, 식이 보충제, 분말 드링크, 마감처리되거나 반-마감처리된 분말 식료품 중 하나 이상의 첨가제로서 직접 사용되거나 포함될 수 있다. 일부 양태에서, 영양 보충제는 동물 공급원으로부터의 임의의 성분으로부터 형성되지 않고 이를 함유하지 않는 식물성 캡슐의 형태이다.
본 발명의 미생물 오일을 포함할 수 있는 부분적인 목록은 비제한적으로 콩-기반 제품(우유, 아이스크림, 요거트, 드링크, 크림, 스프레드, 화이트닝제); 수프 및 수프 믹스; 도우, 배터 및 구운 제품 품목, 예를 들어, 파인 베이커리 웨어, 아침 시리얼, 케이크, 치즈케이크, 파이, 컵케이크, 쿠키, 바, 빵, 롤, 비스킷, 머핀, 패스트리, 스콘, 크루통, 크래커, 스위트 제품, 스낵 케이크, 파이, 그래놀라/스낵바, 토스터 패스트리; 사탕; 하드 제과; 초콜릿 및 다른 제과; 츄잉 껌; 액체 식료품, 예를 들어 우유, 에너지 드링크, 유아용 조제식, 탄산음료, 차, 유액체 음식, 과일 주스, 주스-기반 드링크, 야채-기반 드링크; 종합 비타민 시럽, 식사 대체품, 약용 식품 및 시럽; 분말 음료 믹스; 파스타; 가공 생선 제품; 가공 육류 제품; 가공된 가금류 제품; 그레비 및 소스; 조미료(케첩, 마요네즈 등); 식물성 오일-기반 스프레드; 유제품; 요거트; 버터; 냉동 유제품; 아이스크림; 냉동 디저트; 냉동 요거트; 아기 식품과 같은 반-고체 식품; 푸딩 및 젤라틴 디저트; 가공 및 미가공 치즈; 팬케이크 믹스; 에너지 바를 비롯한 식품 바; 와플 믹스; 샐러드 드레싱; 대체 계란 믹스; 견과 및 견과-기반 스프레드; 가염 스낵, 예컨대 감자 칩 및 기타 칩 또는 크리스프, 옥수수 칩, 토틸라 칩, 압출 스낵, 팝콘, 프레첼, 감자 크리스프 및 견과; 전문 스낵, 예컨대 딥, 말린 과일 스낵, 육류 스낵, 돼지 껍질, 건강 식품 바, 쌀/옥수수 케이크를 포함한다.
일부 양태에서, 본 발명의 미생물 오일은 유아용 조제식을 보충하는데 사용될 수 있다. 유아용 조제식은 아라키돈산(ARA)-생산 미생물로부터 유래하는 물리적으로 정련된 오일과 조합으로 또는 단독으로 본 발명의 미생물 오일에 의해 보충될 수 있다. ARA-생산 미생물은, 예를 들어, 모티에렐라 알피나(Mortierella alpina) 또는 모티에렐라 섹트 슈무커리(Mortierella sect. schmuckeri)이다. 다르게는, 유아 조제식은 ARA가 풍부한 오일, 예컨대 아라스코(ARASCO, 등록상표)(마텍 바이오사이언시스(Martek Biosciences), 미국 메릴랜드주 콜롬비아 소재)와 조합으로 본 발명의 미생물 오일로 보충될 수 있다.
일부 양태에서, 조성물은 동물 사료이다. "동물"은 동물계에 속하는 비-인간 유기체를 포함하고, 비제한적으로 수생 동물 및 육생 동물을 포함한다. 용어 "동물 사료" 또는 "동물 식품"은 어류; 상업용 어류; 관상용 어류; 어류 유충; 쌍각류; 연체 동물; 갑각류; 조개; 새우; 새우 유충; 아르테미아; 윤충; 브라인 슈림프; 여과 섭식 동물; 양서류; 파충류; 포유류; 가축 동물; 농장 동물; 동물원 동물; 스포츠 동물; 종축; 경주용 동물; 쇼 동물; 에어룸 동물; 희귀 또는 멸종 위기 동물; 반려 동물; 애완 동물, 예컨대 개, 고양이, 기니아 피그, 토끼, 래트, 마우스 또는 말; 영장류, 예컨대 원숭이(예컨대, 세부스, 레수스, 아프리칸 그린, 파타스, 사이노몰거스 및 세르코피테쿠스), 유인원, 오랑우탄, 비비, 긴팔원숭이 및 침팬지; 갯과 동물, 예컨대 개 및 늑대; 고양잇과 동물, 예컨대, 고양이, 사자 및 호랑이; 말과 동물, 예컨대, 말, 당나귀 및 얼룩말; 식용 동물, 암소, 소, 돼지 및 양; 유제류, 예컨대 사슴 및 기린; 또는 설치류, 예컨대 마우스, 래트, 햄스터 및 기니아 피그 등이건 간에 비-인간 동물을 위해 의도되는 임의의 식품을 지칭한다. 동물 사료는 비제한적으로 양어 사료, 가축 동물 사료, 예컨대 애완동물 사료, 동물원 동물 사료, 작업 동물 사료, 가축 사료 및 이들의 조합을 포함한다.
일부 양태에서, 조성물은 고기 또는 제품이 인간에 의해 소비되는 임의의 동물, 예컨대 고기, 알 또는 유즙이 인간 소비를 위해 유도되는 임의의 동물을 위한 사료 또는 사료 보충제이다. 이러한 동물에게 공급될 때, LC-PUFA와 같은 영양소는 영양소의 함량을 증가시키기 위해 상기 동물의 살, 유즙, 알 또는 다른 생산물에 혼입될 수 있다.
일부 양태에서, 조성물은 동물성 플랑크톤, 아르테미아, 윤충, 및 여과 섭식 동물에 의한 소비에 적절한 크기의 입자를 형성하도록 부서질 수 있는 분무건조된 물질이다. 일부 양태에서, 조성물에 의해 공급된 동물성 플랑크톤, 아르테미아 또는 윤충은 다시 어류 유충, 조개, 쌍각류 또는 갑각류에 공급된다.
일부 양태에서, 조성물은 약학 조성물이다. 적합한 약학 조성물은 비제한적으로, 항염증성 조성물, 관상동맥 심장 질환의 치료용 약물, 동맥경화증의 치료용 약물, 화학요법제, 활성 부형제, 골다공증약, 항우울제, 항경련제, 항-헬리코박터 파일로리 약물, 신경퇴행성 질병의 치료용 약물, 퇴행성 간 질병의 치료용 약물, 항생제, 콜레스테롤 저하 조성물, 및 트라이아실글리세롤 저하 조성물을 포함한다. 일부 양태에서, 조성물은 약용 식품이다. 약용 식품은 전문 의료진의 감독 하에 소비되거나 외부에서 투여되는 조성물에 존재하거나 병태의 특정 식이 관리를 위해 의도되는 조성물로서, 독특한 영양 요건이 인정된 과학 원리를 기준으로 의학적 평가에 확립된 조성물을 포함한다.
일부 양태에서, 미생물 오일은 투여 형태로 제형화될 수 있다. 투여 형태는 비제한적으로, 정제, 캡슐, 교갑, 펠릿, 환제, 분말 및 과립, 및 비경구 투여 형태를 포함할 수 있고, 이는 비제한적으로 효과량의 미생물 오일을 포함하는 용액, 현탁액, 에멀젼 및 경구 분말을 포함한다. 상기 제형이 약학적으로 허용되는 희석제, 충전제, 붕해제, 결합제, 윤활제, 계면활성제, 소수성 비히클, 수용성 비히클, 에멀젼화제, 완충제, 습윤제, 보습제, 가용화제, 보존제 등을 함유할 수 있음이 또한 공지된다. 투여 형태는 비제한적으로 미생물 오일 및 하나 이상의 적합한 약학적으로 허용되는 담체를 함유하는 정제, 당의정, 캡슐, 캐플릿 및 환제를 포함할 수 있다.
경구 투여를 위해, 미생물 오일은 당업계에 널리 공지된 약학적으로 허용되는 담체와 조합될 수 있다. 이러한 담체는 본 발명의 미생물 오일이 치료될 대상에 의한 경구 섭취를 위해 정제, 환제, 당의정, 캡슐, 액체, 겔, 시럽, 슬러리, 현탁액 등으로 제형화되는 것을 가능하게 한다. 일부 양태에서, 투여 형태는 정제, 환제 또는 캐플릿이다. 경구 용도를 위한 약학 제제는, 정제 또는 당의정 코어를 수득하기 위하여 필요에 따라 적합한 보조제를 첨가한 후, 고체 부형제를 첨가하고, 임의적으로 생성된 혼합물을 분쇄하고, 과립의 혼합물을 가공함으로써 수득될 수 있다. 적합한 부형제는 비제한적으로 충전제, 예컨대 당, 예컨대 비제한적으로 락토스, 수크로스, 만니톨 및 소르비톨; 셀룰로스 제제, 예컨대 비제한적으로 옥수수 전분, 밀 전분, 쌀 전분, 감자 전분, 젤라틴, 검 트라가칸트, 메틸 셀룰로스, 하이드록시프로필메틸 셀룰로스, 나트륨 카복시메틸 셀룰로스, 및 폴리비닐피롤리돈(PVP)을 포함한다. 필요에 따라, 붕해제는, 예컨대 비제한적으로, 가교결합된 폴리비닐피롤리돈, 한천 또는 알긴산, 또는 이의 염, 예컨대 나트륨 알긴에이트로서 첨가될 수 있다. 경구적으로 사용될 수 있는 약학 제제는 비제한적으로 젤라틴으로 제조된 푸쉬-핏(push-fit) 캡슐, 및 젤라틴 및 가소제, 예컨대 글리세롤 또는 소르피톨로 제조된 연질, 밀봉된 캡슐을 포함한다. 일부 양태에서, 투여 형태는 식물성 투여 형태이고, 이때 투여 형태는 동물 공급원으로부터의 임의의 성분으로부터 형성되지 않고 이를 함유하지 않는다. 일부 양태에서, 식물성 투여 형태는 식물성 캡슐이다.
일부 양태에서, 조성물은 화장품이다. 화장품은, 비제한적으로, 에멀젼, 크림, 로션, 마스크, 비누, 샴푸, 워시, 안면 크림, 컨디셔너, 메이크-업(make-ups), 욕실 제제 및 분산 액체를 포함한다. 화장품 제제는 의약성 또는 비-의약성일 수 있다.
일부 양태에서, 조성물은 산업용 조성물이다. 일부 양태에서, 조성물은 하나 이상의 제품을 위한 출발 물질이다. 제조는, 비제한적으로, 중합체; 사진 감광성 물질; 세제; 산업용 오일; 또는 산업용 세제를 포함한다. 예를 들어, 미국 특허공보 제7,259,006호는 베헨산의 생산, 및 베헨산을 사용하는 사진 감광성 물질의 생산을 위한 DHA-함유 지방 및 오일의 용도를 기술한다.
조성물의 사용 방법
일부 양태에서, 조성물은 인간 또는 비-인간 동물에서 병태의 치료에 사용될 수 있다. 일부 양태에서, 조성물은 인간 또는 비-인간 동물에서 영양을 위해 사용될 수 있다.
용어 "치료하다" 및 "치료"는 치료적 처치 및 예방적 또는 방지적 조정을 둘 다 지칭하고, 이때 목적은 원치 않는 생리학적 병태, 질병 또는 질환을 방지하거나 늦추거나(줄이거나), 이로운 또는 원하는 임상 결과를 수득하는 것이다. 본 발명의 목적을 위하여, 이로운 또는 원하는 임상 결과, 비제한적으로, 병태, 질병 또는 질환과 관련된 증상 또는 징후의 경감 또는 제거; 병태, 질병 또는 질환의 정도의 축소; 병태, 질병 또는 질환의 안정화(즉, 병태, 질병 또는 질환이 악화되지 않는 것); 병태, 질병 또는 질환의 발병 또는 진행의 지연; 병태, 질병 또는 질환의 개선; 병태, 질병 또는 질환의 완화(부분적 또는 전체적, 및 검출가능한 또는 검출불가능한); 또는 병태, 질병 또는 질환의 향상 또는 개선을 포함한다. 치료는 과도한 부작용 없이 임상적으로 중요한 반응을 유도하는 것을 포함한다. 치료는 또한 치료를 받지 않는 경우 기대되는 생존에 비해 생존을 연장하는 것을 포함한다.
일부 양태에서, 조성물은 여드름, 급성 염증, 연령-관련 황반변증, 알러지, 알츠하이머병, 관절염, 천식, 동맥경화증, 자가면역 질환, 혈액 지질 질환, 유방 낭종, 악액질, 암, 심장 재협착증, 심혈관 질환, 만성 염증, 관상동맥 심장 질환, 낭포성 섬유증, 간의 퇴행성 질환, 당뇨병, 습진, 위장 질환, 심장 질병, 고 트라이아실글리세롤 수준, 고혈압, 과다활동, 면역 질환, 억제성 종양 성장, 염증성 병태, 장 질환, 신장 기능장애, 백혈병, 주요 우울증, 다발성 경화증, 신경퇴행성 질환, 골관절염, 퍼옥시좀 질환, 자간전증, 조산, 건선, 폐 질환, 류마티스성 관절염, 심장 질환의 위험 또는 혈전증과 같은 병태, 질병 또는 질환의 치료에 사용된다.
일부 양태에서, 조성물은 임신 후기에 태아의 임신 길이를 증가시키는데 사용된다.
일부 양태에서, 조성물은 혈압을 조절하는데 사용된다.
일부 양태에서, 조성물은 인지 기능을 개선하거나 유지하는데 사용된다.
일부 양태에서, 조성물은 기억을 개선하거나 유지하는데 사용된다.
조성물 또는 투여 형태는 조성물 또는 투여 형태와 상용성인 임의의 경로에 의해 대상의 신체에 투여될 수 있다. 물질이 대상에 의해 대상의 신체에 도입되거나, 다른 인간, 기계 또는 장치가 물질을 대상의 신체에 도입하는 경우, 물질은 "투여되는" 것으로 간주된다. 따라서, "투여"는, 예컨대, 자가-투여, 타인에 의한 투여, 및 간접 투여를 포함한다. "투여"와 관련하여 본원에 사용된 용어 "계속적" 또는 "연속적"은 투여의 빈도가 적어도 1일 1회임을 의미한다. 그러나, 투여의 빈도가 1일 1회보다 클 수 있고, 본원에 특정된 복용량 수준이 초과되지 않는 한, 예컨대 1일 2회 또는 심지어 3회도 여전히 "계속적" 또는 "연속적"임에 유의한다. 투여를 위한 수단 및 방법은 당업계에 공지되어 있고, 당업자는 지침을 위한 다양한 약리학적 문헌을 언급할 수 있다. 예를 들어, 문헌["Modern Pharmaceutics," Banker & Rhodes, Informa Healthcare, USA, 4th ed. (2002)]; 및 문헌["Goodman & Gilman's The Pharmaceutical Basis of Therapeutics," McGraw-Hill Companies, Inc., New York, 10th ed. (2001)]이 참고될 수 있다.
"대상", "개체" 또는 "환자"는 조성물 또는 투여 형태의 진단, 예후, 치료법 또는 투여가 요구되는 인간 또는 비-인간의 임의의 대상을 의미한다. 포유류 대상은, 비제한적으로, 인간; 가축 동물; 농장 동물; 동물원 동물; 스포츠 동물; 애완 동물, 예컨대 개, 고양이, 기니아 피그, 토끼, 래트, 마우스 또는 말; 영장류, 예컨대 원숭이(예컨대, 세부스, 레수스, 아프리칸 그린, 파타스, 사이노몰거스 및 세르코피테쿠스), 영장류, 오랑우탄, 비비, 긴팔원숭이 및 침팬지; 갯과 동물, 개 및 늑대; 고양잇과 동물, 예컨대 고양이, 사자 및 호랑이; 말과 동물, 예컨대 말, 당나귀 및 얼룩말; 식용 동물, 예컨대 암소, 소, 돼지 및 양; 유제류, 사슴 및 기린; 설치류, 예컨대 마우스, 래트, 햄스터 및 기니아 피그 등을 포함한다. 용어 "대상"은 또한 모델 동물, 예컨대, 질병 모델 동물을 포함한다. 일부 양태에서, 용어 "대상"은 경제적으로 또는 달리 귀중한 동물, 예컨대, 경제적으로 중요한 종축, 경주용 동물, 쇼 동물, 에어룸 동물, 희귀 또는 멸종 위기 동물 또는 반려 동물을 포함한다. 특정 양태에서, 대상은 인간 대상이다. 특정 양태에서, 대상은 비-인간 대상이다.
조성물은 "영양학적 양", "치료 효과량", "예방 효과량", "치료 투약량" 또는 "예방 투약량"으로 투여될 수 있다. "영양학적 양"은 원하는 영양학적 결과를 달성하는데 필요한 복용량 및 시간 동안 효과적인 양을 지칭한다. 영양학적 결과는, 예컨대, 대상에서 원하는 지방산 성분의 증가된 수준이다. "치료 효과량" 또는 "치료 투약량"은 원하는 치료 결과를 달성하는데 필요한 복용량 및 시간 동안 효과적인 양을 지칭한다. 치료 결과는, 예컨대, 증상의 경감, 연장된 생존, 개선된 운동성 등일 수 있다. 치료 결과는 "치유"일 필요가 없다. "예방 효과량" 또는 "예방 투약량"은 원하는 예방 결과를 달성하는데 필요한 복용량 및 시간 동안 효과적인 양을 지칭한다. 전형적으로, 예방 투약량이 질병의 조기 단계 전에 또는 이러한 단계에 사용되므로, 예방 효과량은 질병의 진행된 단계의 치료를 위한 치료 효과량보다 작을 것이다.
조성물, 투여 형태 또는 약학 조성물의 다양한 투여량이 대상에게 투여되는 미생물, 바이오매스 또는 미생물 오일의 EPA 또는 다른 지방산 성분의 양을 기준으로 대상에게 투여될 수 있다. 용어 "일일 투여량", "일일 투여량 수준" 및 "일일 투여량"은 본원에서 1일(24-시간 기간) 당 투여되는 EPA 또는 다른 지방산 성분의 총량을 지칭한다. 따라서, 예를 들어, 2 mg의 1일 투여량으로 대상에의 EPA의 투여는 대상이 1일 기준으로, 2 mg EPA를 포함하는 단일 투여 형태든지, 또는 다르게는, 각각 0.5 mg EPA를 포함하는 4개의 투여 형태(총 2 mg EPA)든지, 총 2 mg의 EPA를 수용함을 의미한다. 일부 양태에서, EPA의 일일 양은 단일 투여 형태 또는 2개의 투여 형태일 수 있다. 본 발명의 투여 형태는 단일 적용 또는 다수 적용으로 섭취될 수 있다. 예를 들어, 각각의 정제가 0.5 mg EPA를 포함하는 4개의 정제가 매일 섭취되는 경우, 모든 4개의 정제는 1일에 1회 섭취될 수 있거나, 2개의 정제가 1일에 2회 섭취될 수 있거나, 1개의 정제가 6시간마다 섭취될 수 있다. 일부 양태에서, 1일 투여량은 약 100 mg 내지 약 15 g의 EPA다. 일부 양태에서, 1일 투여량은 약 0.5 내지 약 250 mg, 약 100 내지 약 250 mg, 약 100 내지 약 500 mg, 약 100 mg 내지 약 1 g, 약 1 내지 약 2.5 g, 약 1 내지 약 5 g, 약 1 내지 약 10 g, 약 1 내지 약 15 g, 약 5 내지 약 10 g, 약 5 내지 약 15 g, 약 10 내지 약 15 g, 약 100 mg 내지 약 10 g, 약 100 mg 내지 약 5 g, 또는 약 100 mg 내지 약 2.5 g의 EPA, DHA, 또는 이들의 조합이다. 일부 양태에서, 조성물은 투여 형태 당 약 0.5 내지 약 250 mg, 100 내지 약 250 mg, 약 0.5 내지 약 500 mg, 약 100 내지 약 500 mg, 약 0.5 mg 내지 약 1 g, 또는 약 100 mg 내지 약 1 g의 EPA, DHA, 또는 이들의 조합을 포함하는 투여 형태이다.
본 발명의 조성물 또는 투여 형태의 투여는 다양한 섭생법을 사용하여 달성될 수 있다. 예를 들어, 일부 양태에서, 투여는 연속적인 날들에 매일 발생하거나, 다르게는, 하루 걸러(격일에) 발생한다. 투여는 하루 이상의 날들에 발생할 수 있다.
조성물 및 투여 형태의 투여는 병태의 치료에 사용되는 다른 섭생법과 조합될 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 발명은 식이 섭생법(예컨대, 저 탄수화물 식이, 고 단백질 식이, 고 지방 식이 등), 운동 섭생법, 감량 섭생법, 금연 섭생법 또는 이들의 조합과 조합될 수 있다. 본 발명의 방법은 또한 병태의 치료에서 다른 약학 제품과 조합으로 사용될 수 있다. 본 발명의 조성물 또는 투여 형태는 다른 섭생법 또는 약학 제품 전에 또는 후에 투여될 수 있다.
조성물을 포함하는 키트
본 발명은 본 발명의 조성물의 하나 이상의 유닛을 함유하는 키트 또는 패키지에 관한 것이다. 키트 또는 패키지는 본 발명의 재조합 숙주 세포, 바이오매스 또는 미생물 오일, 또는 이들의 조합을 포함하는 식료품, 약학 조성물, 화장품 또는 산업용 조성물의 유닛을 포함할 수 있다. 키트 또는 패키지는 또한 식품, 화장품, 약학 조성물, 또는 산업용 조성물의 제조를 위한 본 발명의 재조합 숙주 세포, 바이오매스 또는 미생물 오일, 또는 이들의 조합을 포함하는 첨가제를 포함할 수 있다.
일부 양태에서, 키트 또는 패키지는 본 발명의 방법에 따라 투여되는 약학 조성물의 하나 이상의 유닛을 함유한다. 키트 또는 패키지는 하나의 투여 유닛, 또는 1개 초과의 투여 유닛(즉, 다수의 투여 유닛)을 함유할 수 있다. 다수의 투여 유닛이 키트 또는 패키지에 존재하는 경우, 다수의 투여 유닛은 임의적으로 순차적인 투여를 위해 배열될 수 있다.
본 발명의 키트는 임의적으로 키트의 유닛 또는 투여 형태와 연관된 설명서를 함유할 수 있다. 이러한 설명서는 약학 제품의 제조, 사용 또는 판매를 규제하는 정부 기관에 의해 규제된 형태일 수 있고, 통지는 병태 또는 질환을 치료하기 위한 인간 투여에 대한 제조사, 사용 또는 판매의 기관에 의한 승인을 나타낸다. 설명서는 본 발명의 발명에 따라서 키트의 유닛 또는 투여 형태의 사용에 대한 정보를 전달하는 임의의 형태일 수 있다. 예를 들어, 설명서는 인쇄된 물체의 형태 또는 사전-녹음된 미디어 장치의 형태일 수 있다.
환자의 검사 중에, 전문 의료진은 본 발명의 방법 중 하나의 투여가 환자에게 적절한 지를 결정할 수 있거나, 의사는 환자의 병태가 본 발명의 방법 중 하나의 투여에 의해 개선될 수 있음을 결정할 수 있다. 임의의 섭생법을 지시하기 전에, 의사는, 예를 들어, 섭생법과 연관된 다양한 위험 및 이점에 대해 환자와 의논할 수 있다. 환자는 섭생법과 연관된 모든 공지되고 의심되는 위험의 완전한 개시를 제공받을 수 있다. 이러한 의논은 서면 형태뿐만 아니라 말로 제공될 수 있다. 일부 양태에서, 의사는 환자에게 섭생법에 대한 문헌 자료, 예컨대 제품 정보, 교육 자료 등을 제공할 수 있다.
본 발명은 투여 형태를 판매 시점에 소비자에게 배급함을 포함하는, 치료 방법에 대해 소비자를 교육하는 방법에 관한 것이다. 일부 양태에서, 배급은 약사 또는 건강관리 제공자에 의해 판매 시점에 발생할 것이다.
용어 "소비자 정보"는, 비제한적으로, 영어 텍스트, 비-영어 텍스트, 시각 이미지, 차트, 전화 기록, 웹사이트, 및 실시간 고객 서비스 상담원을 포함할 수 있다. 일부 양태에서, 소비자 정보는 본 발명의 방법에 따른 투여 형태의 사용을 위한 설명, 적절한 사용 연령, 지시, 금기, 적절한 투약법, 경고, 전화번호 또는 웹사이트 주소를 제공할 것이다. 일부 양태에서, 상기 방법은 본 발명의 방법에 따라 개시된 섭생법의 사용에 관한 소비자의 질문에 응답할 위치에 있는 관련인에게 전문 정보를 제공함을 추가로 포함한다. 용어 "전문 정보"는, 비제한적으로, 전문 의료진이 소비자 질문에 응답하도록 디자인된, 본 발명의 방법에 따라 투여되는 섭생법에 관한 정보를 포함한다.
"전문 의료진"은, 예를 들어, 의사, 의료 보조자, 간호사, 임상 간호사, 약사 및 고객 서비스 상담원을 포함한다.
본 발명을 일반적으로 기술하였지만, 본원에 제공된 실시예를 참고하여 더욱 이해될 수 있다. 이러한 실시예는 단지 설명의 목적이고, 제한하는 것으로 의도되지 않는다.
실시예
일반적인 프로토콜
달리 지시되지 않는 한, 후속 실시예에 기술된 분자의 생물학적 및 생화학적 조작은, 예를 들어, 문헌[Ausubel et al. (1995) Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons]; 및 문헌[Sambrook et al. (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press] 등에 개시된 표준 방법론에 의해 수행되었다.
효소 전처리에 의한 전기천공
세포를 200 rpm으로 2일 동안 30℃에서 진탕기 상의 50 mL의 M50-20 매질(미국 특허공보 제8,859,855호, 문헌[Weaver et al. 2014] 참조)에서 성장시켰다. 세포를 M2B 매질(미국 특허공보 제8,859,855호, 문헌[Weaver et al. 2014] 참조) 내로 1:100으로 희석하고, 밤새(16 내지 24시간) 성장시키고, 미드-로그 상 성장(1.5 내지 2.5의 OD600)을 시도하였다. 세포를 50 mL 원뿔형 튜브에서 5분 동안 약 3,000 x g로 원심분리하였다. 상청액을 제거하고, 세포를 1 M 만니톨(pH 5.5)에서 적합한 부피로 재현탁하여 2 OD600 단위의 최종 농도에 도달시켰다. 5 mL의 세포를 25 mL 진탕기 플라스크로 분취하고, 10 mM CaCl2(1.0 M 저장액, 필터 멸균됨) 및 0.25 mg/mL 프로테아제 XIV(10 mg/mL 저장액, 필터 멸균됨; 시그마-알드리치(Sigma-Aldrich), 미국 미주리주 세인트루이스 소재). 플라스크를 진탕기 상에서 30℃에서 약 100 rpm으로 4시간 동안 항온처리하였다. 세포를 현미경으로 모니터링하여 목적 단일 세포에 의해 원형질체화의 정도를 측정하였다. 세포를 환저 튜브(즉, 14 mL 팔콘(Falcon, 상표) 튜브, 비디 바이오사이언시스(BD Biosciences), 미국 캘리포니아주 산 호세 소재)에서 약 2,500 x g로 5분 동안 원심분리하였다. 상청액을 제거하고, 세포를 5 mL의 빙랭 10% 글리세롤에 의해 적절히 재현탁하였다. 세포를 환저 튜브에서 약 2,500 x g로 5분 동안 다시 원심분리하였다. 상청액을 제거하고, 와이드-보어(wide-bore) 피펫 팁을 사용하여 세포를 500 μL의 빙랭 10% 글리세롤로 적절히 재현탁하였다. 90 μL의 세포를 사전-냉각된 전기-큐벳(젠 펄서(Gene Pulser, 등록상표) 큐벳 - 0.1 cm 갭 또는 0.2 cm 갭, 바이오-라드(Bio-Rad), 미국 캘리포니아주 허큘러스 소재)으로 분획하였다. 1 내지 5 μg의 DNA(10 μL 이하의 부피)를 큐벳에 첨가하고, 피펫 팁으로 적절히 혼합하고, 얼음 위에 5분 동안 위치시켰다. 세포를 200 ohm(내성), 25 μF(용량), 및 250 V(0.1 cm 갭의 경우) 또는 500 V(0.2 cm 갭)에서 전기천공하였다. 0.5 mL의 M50-20 매질을 큐벳에 즉시 첨가하였다. 이어서, 세포를 25 mL 진탕기 플라스크 중 4.5 mL의 M50-20 매질에 전달하고, 진탕기 상에서 30℃에서 2 내지 3시간 동안 약 100 rpm으로 항온처리하였다. 세포를 환저 튜브에서 5분 동안 약 2,500 x g로 원심분리하였다. 상청액을 제거하고, 세포 펠릿을 0.5 mL의 M50-20 매질에서 재현탁하였다. 세포를 적절히 선택된 적절한 수(2 내지 5)의 M2B 플레이트 상으로 평판배양하고, 30℃에서 항온처리하였다.
총 지방산 메틸 에스터(FAME) 생산
간략하게, 세포를 200 rpm으로 3일 동안 진탕하면서 30℃의 M2B 액체 매질(미국 특허공보 제8,637,651호 참조)에서 성장시켰다. 다르게는, 세포를 또한 M50-20 액체 매질에서 1 내지 2일 동안 성장시키고, 2 OD 단위를 50 mL 신선한 SSFM 액체 매질(미국 특허공보 제8,637,651호 참조)에 전달하고, 200 rpm으로 진탕하면서 정류된 250 mL 진탕 플라스크에서 27℃에서 약 4일 동안 성장시켰다. 세포를 수확하고, 표준 기술을 사용하여 지방산을 메틸-에스터로 전환시켰다. 지방산 프로파일은 불꽃 이온화 검출에 의한 기체 크로마토그래피(GC-FID)를 사용하여 지방산 메틸 에스터(FAME)로서 결정되었다.
실시예 1
쉬조키트리움 종 ATCC PTA-9695로부터의 PUFA 신타제 유전자에 의한 쉬조키트리움 종 N230D 내의 천연 PUFA 신타제 유전자의 표적화된 치환
쉬조키트리움 종 N230D는 쉬조키트리움 종 ATCC 20888의 딸이고; 쉬조키트리움 종 ATCC 20888의 세포를 화학적으로 돌연변이유발시키고, 이러한 과정으로부터의 클론을 목적 성장 특징에 대해 분석하여, 쉬조키트리움 종 N230D를 동정하였다. 쉬조키트리움 종 ATCC 20888과 마찬가지로, 쉬조키트리움 종 N230D는 반수성이고, PUFA 생합성에 대한 완전한 전통적인 경로를 하버링(harboring)하지 않는다. 이것은 Δ 12 탈포화효소를 놓치고, 상기 경로의 다른 효소에 대한 매우 제한된 활성을 나타낸다(문헌[Metz et al., Plant Physiol . Biochem. 47(6):472-478 (2009)]; 문헌[Lippmeier et al. Lipids. 44:621-630 (2009)]). 이러한 유기체의 천연 PUFA 신타제는 쉬조키트리움 종 ATCC 20888에 관찰된 바와 유사한 비로 DHA 및 도코사펜타엔산(DPA n-6)을 생산한다.
쉬조키트리움 종 ATCC 20888 및 쉬조키트리움 종 N230D의 PFA1, PFA2 및 PFA3의 코딩 영역의 뉴클레오티드 서열은 동일하다. PFA1, PFA2 및 PFA3을 재조합적으로 발현하는 벡터의 생성은 종래 증명되고 기술되었다(예컨대, 미국 특허공보 제8,940,884호 참조(이의 전문은 본원에 참조로 혼입됨)).
쉬조키트리움 종 N230D의 천연 PFA3 유전자를 PFA3 플랭킹 영역(플라스미드 pDS97)으로부터의 서열에 의해 둘러싸인 파로모마이신 내성 마커를 함유하는 선형화된 벡터로 형질전환에 따른 동종 재조합에 의해 치환하였다. 작용성 PFA3 유전자(B142)가 결핍된 돌연변이체 균주를 생성하였다. 돌연변이체 균주는 영양요구성이었고, 성장을 위해 PUFA 보충을 필요로 하였다.
쉬조키트리움 종 ATCC PTA-9695 PFA3(서열번호 5)을 발현 벡터 pREZ22 내로 클로닝하여 pREZ324를 생성하였다. 발현 벡터는 쉬조키트리움 종 ATCC 20888로부터의 천연 PFA3 유전자 자리의 플랭킹 영역으로부터의 약 2 kb의 DNA를 함유하였다.
작용성 PFA3이 결핍된 쉬조키트리움 종 N230D 돌연변이체는 쉬조키트리움 종 ATCC PTA-9695 PFA3을 함유하는 선형화된 pREZ324에 의해 형질전환되었다. 돌연변이체 내의 파로모마이신 내성 마커를 플랭킹하고 pREZ324 내의 쉬조키트리움 종 ATCC PTA-9695 PFA3 유전자를 플랭킹하는 동종 영역을 기준으로, 쉬조키트리움 종 ATCC PTA-9695 PFA3이 천연 PFA3 자리에 삽입되도록 재조합이 발생하였다. 이러한 돌연변이체 균주는 B154로 지칭되었다.
PFA3 유전자 치환에 대해 기술된 바와 유사한 전략을 사용하여, 쉬조키트리움 돌연변이체 균주 B154 내의 천연 PFA1 및 PFA2 유전자를 쉬조키트리움 종 ATCC PTA-9695로부터의 PFA1 및 PFA2 유전자로 치환하였다. 이들 2개 유전자의 치환은 헤드 투 헤드(head to head) 배열에 의해 촉진된다(도 1 참조). PFA1 및 PFA2 하류 플랭킹 영역(플라스미드 pCX023)으로부터의 서열에 의해 둘러싸인 파로모마이신 내성 마커를 함유하는 벡터에 의한 균주 B154의 형질전환은 PFA1 및 PFA2 자리의 내성 마커에 의한 치환을 야기하였다. 이러한 영양요구성 돌연변이체 균주는 B155로 지칭된다. 유전자 사이의 천연 쉬조키트리움 종 ATCC 20888 유전자간 영역 및 약 2 kb의 쉬조키트리움 종 ATCC 20888 PFA1 및 PFA2 하류 플랭킹 영역과 헤드 투 헤드 배열된 쉬조키트리움 종 ATCC PTA-9695 PFA1(서열번호 1) 및 쉬조키트리움 종 ATCC PTA-9695 PFA2(서열번호 3)를 함유하는 pLP112로 균주 B155를 형질전환시켰다. 쉬조키트리움 종 ATCC PTA-9695 PFA1이 천연 PFA1 자리에 삽입되고, 쉬조키트리움 종 ATCC PTA-9695 PFA2가 균주의 천연 PFA2 자리에 삽입되도록 재조합이 발생하였다. 생성된 재조합 균주(B156)는 천연 PFA1, PFA2 및 PFA3 코딩 서열이 결핍되고, 각각 PFA1, PFA2 및 PFA3 자리에 삽입된 쉬조키트리움 종 ATCC PTA-9695 PFA1, PFA2 및 PFA3을 함유하였다. 유전자를 각각 천연 PFA1 /2 및 PFA3 프로모터로 구동하였다. B156은 PUFA 원영양체를 회수하였고, 어떠한 내성 마커도 함유하지 않았다. 모든 해당 유전자이식 균주의 게놈 구조를 PCR 및 서던 블로팅으로 확인하였다. 본 방법의 개략도는 도 3에 제공된다.
도 4A에 도시된 바와 같이, 천연 PFA1, PFA2 및 PFA3 유전자를 함유하는 쉬조키트리움 종 N230D 균주는 25℃에서의 성장 후 0.39% EPA(생산된 총 FAME의 %), 8.20% DPA n-6, 및 28.39% DHA를 생산하였다. 결실된 천연 PFA1, PFA2 및 PFA3 코딩 영역 대신에 쉬조키트리움 종 ATCC PTA-9695 PFA1(서열번호 1), PFA2(서열번호 3), 및 PFA3(서열번호 5)을 함유하는 재조합 균주 B156-2는 25℃에서 배양 후 1.12% EPA, 1.78% DPA n-6, 및 28.56% DHA를 생산하였다.
균주의 FAME 조성물은 또한, 도 4B에 도시된 바와 같이, 30℃에서 성장 후 측정되었다. 천연 PFA1, PFA2 및 PFA3 유전자를 함유하는 쉬조키트리움 종 N230D 균주는 30℃에서 배양 후 0.60% EPA(생산된 총 FAME의 %), 13.16% DPA n-6, 및 32.34% DHA를 생산하였다. 불활성화된 PFA1, PFA2 및 PFA3 유전자 대신에 쉬조키트리움 종 ATCC PTA-9695 PFA1(서열번호 1), PFA2(서열번호 3) 및 PFA3(서열번호 5)을 함유하는 재조합 균주 B156은 30℃에서 배양 후 1.17% EPA, 3.03% DPA n-6, 및 28.46% DHA를 생산하였다.
실시예 2
임의 방식으로 게놈에 통합된 쉬조키트리움 종 ATCC PTA-9695로부터의 PUFA 신타제 아단위 유전자에 의한 쉬조키트리움 종 ATCC 20888 내의 천연 PUFA 신타제 아단위 유전자의 치환
PUFA 영양요구체를 생성하기 위한 쉬조키트리움 종 ATCC 20888 내의 천연 PUFA 신타제 유전자의 불활성화, 및 PUFA 합성을 회복하는 외인성으로 도입된 동종 유전자에 의해 불활성화된 유전자의 치환은 종래 증명되고 기술되었다(예컨대, 미국 특허공보 제7,217,856호(이의 전문은 본원에 참조로 혼입됨), 및 상기 실시예 1 참조).
약 2 kb의 PFA1 및 PFA2 하류 플랭킹 DNA 사이에 위치하는 제오신(상표) 내성 카세트를 함유하는 플라스미드에 의해 형질전환에 따라서 동종 재조합에 의해 쉬조키트리움 종 ATCC 20888의 천연 PFA1 및 PFA2 코딩 영역을 녹-아웃시켰다. 유사하게, DNA의 상류 및 하류의 천연 PFA3에 의해 플랭킹된 파로모마이신 내성 카세트를 함유하는 플라스미드에 의한 형질전환에 의해 PFA3 코딩 영역을 결실시켰다. 생성된 균주는 B122-17로 지칭된다(쉬조키트리움 종 ATCC 20888 ΔPFA1,2,3 - 또한 ΔorfA,B,C로 지칭됨). B122-17은 영양요구성이고, PUFA 보충을 필요로 한다.
쉬조키트리움 균주 B122-17을, 쉬조키트리움 종 ATCC PTA-9695로부터의 PFA1, PFA2 및 PFA3에 대한 유전자 Orf를 함유하는 환형 벡터 pREZ345, pREZ331, 및 pREZ324로 동시에 형질전환시켰다(벡터에 관한 상세사항에 대해 미국 특허공보 제8,940,884호, 실시예 7 및 9 참조). 간략하게, pREZ345는 천연 PFA1의 플랭킹 영역으로부터의 약 2 kb의 DNA에 의해 둘러싸인 쉬조키트리움 종 ATCC PTA-9695 PFA1의 서열을 함유한다. pREZ331은 천연 PFA2의 플랭킹 영역으로부터의 약 2 kb의 DNA에 의해 둘러싸인 쉬조키트리움 종 ATCC PTA-9695 PFA2의 서열을 함유한다. pREZ324는 천연 PFA3의 플랭킹 영역으로부터의 약 2 kb의 DNA에 의해 둘러싸인 쉬조키트리움 종 ATCC PTA-9695 PFA3의 서열을 함유한다. 형질전환체를 PUFA 보충 없이 매질 상에서의 성장을 기준으로 선택하였고, 이는 모든 3개의 PUFA 신타제 아단위 유전자의 기능적 통합이 발생하였음을 나타낸다. 이러한 형질전환으로부터 발생한 원영양체 균주는 B149로 지칭되고, 개별적인 단리물은 대시 #로 표시된다(예컨대, B149-E1 또는 B149-3). 형질전환에 사용된 균주(B122-17)는 PFA1/PFA2 유전자간 DNA가 결핍되고, PFA1 및 PFA2 유전자에 대한 동종 이중 교차 사건 이외의 기전은 아마도 이의 통합 사건을 설명한다. 새롭게 도입된 PFA3 유전자는 PFA3 자리(동종 이중 교차 재조합을 통해) 등에서 통합될 수 있다. 또한, 환형 벡터의 사용은 단일 교차 사건 또는 이소성 사건을 선호할 수 있다.
생성된 원영양체성 형질전환체의 지방산 프로파일을 30℃에서 M2B 매질에서 성장시킨 후 측정하였고, 여러 생성된 균주는 EPA의 생산을 강화시키는 것으로 확인되었다. 도 5에 도시된 바와 같이, 천연 PFA1, PFA2 및 PFA3 유전자를 함유하는 쉬조키트리움 종 ATCC 20888 균주는 30℃에서 배양 후 0.98% EPA(생산된 총 FAME의 %), 13.75% DPA n-6, 및 34.95% DHA를 생산하였다. 3개의 재조합 B149 균주[B149-E1("B9"로 지칭됨), B149-3 및 B149-4]는 30℃에서 배양 후 10.06 내지 21.06% EPA, 0.70 내지 1.98% DPA n-6, 및 15.01 내지 20.17% DHA를 생산하였다.
PFA1 프로브를 사용하는 서던 블롯에 의해 강화된 EPA 균주의 추가 분석은 PFA1 유전자의 다수의 카피를 함유함을 나타냈다(도 6 참조). 쉬조키트리움 종 ATCC 20888의 천연 PFA1 유전자가 표적화된 방식으로 쉬조키트리움 종 ATCC PTA-9695로부터의 PFA1 유전자로 치환된 균주로부터의 DNA 샘플이 참고를 위해 포함된다(즉, 균주 B145-16 및 B145-33). 이러한 균주는 PFA1 유전자의 단일 카피를 갖는다(상기 실시예 1 참조). 이러한 결과의 농도계 계산은 B149-E1(B9) 균주가 PFA1 유전자의 약 6개의 카피를 함유하고, B149-3 균주가 약 5 내지 6개의 카피를 함유하고, B-149-4가 PFA1의 약 4 내지 5개의 카피를 함유함을 시사한다. 도 6의 데이터는 PFA1 유전자의 다수의 카피가 게놈 내의 하나의 부위에서 통합됨을 시사한다. 이는 도 7에 개략적으로 도시된다.
실시예 3
유전자이식 쉬조키트리움 균주 B156-2 내의 PFA1 및/또는 PFA3 유전자의 카피의 첨가
상기 실시예 1에 기술된 쉬조키트리움 균주 B156-2는 작용성 천연 PFA1, PFA2 및 PFA3 유전자가 결핍되고, 각각 PFA1, PFA2 및 PFA3 자리에 삽입된 쉬조키트리움 종 ATCC PTA-9695 PFA1, PFA2 및 PFA3 유전자를 함유한다.
이러한 균주는 PFA1 유전자 또는 PFA3 유전자 및 천연 orfC 유전자의 종결자에 대한 판독 프레임 5'에 결합된 신장 인자 1(EF1)에 관한 천연 강한 프로모터를 함유하는 발현 카세트를 갖는 환형 플라스미드에 의해 형질전환되었다(미국 특허공보 제8,637,651호 참조). 구체적으로, 플라스미드 pTH049는 쉬조키트리움 종 ATCC PTA-9695 PFA3 유전자를 함유하고, 플라스미드 pTH050은 쉬조키트리움 종 ATCC PTA-9695 PFA1 유전자를 함유한다. pTH049 및 pTH050은 또한 각각 파로모마이신 및 제오신에 의한 선택을 위한 내성 마커를 함유한다. 이러한 유전자는 아마 게놈에 임의적으로 통합된다. 생성된 유전자이식 균주는 PFA2의 하나의 카피 및 PFA1 및/또는 PFA3 유전자의 2개 이상의 카피를 함유하였다.
생성된 형질전환체의 선별(도 8 참조)은 쉬조키트리움 종 균주 N230D 또는 쉬조키트리움 종 균주 B156-2와 비교하여, PFA1(T195)의 추가적인 카피가 EPA의 강화된 생산(총 FAME의 약 2 내지 3%)을 야기하였음을 나타냈다. 대조적으로, DHA 생산은 PFA1 단독의 과발현에 의해 영향을 받지 않았다.
PFA3(T194)의 추가적인 카피는 EPA의 약간의 강화(총 FAME의 약 1.6 내지 2.6%)를 야기하였지만, DHA의 상당한 강화(총 FAME의 약 35 내지 41%)를 야기하였다.
PFA1 및 PFA3(T196) 둘 다의 추가적인 카피는 EPA 및 DHA 생산 둘 다의 상당한 강화를 야기하였다. EPA 생산은 총 FAME의 약 2.6 내지 5.6%까지 증가되었고(균주 N230D 및 B156-2에서의 약 1.3 내지 1.5%와 비교됨), DHA 생산은 총 FAME의 약 33.5 내지 44.5%까지 증가되었다(균주 N230D 및 B156.2에서의 약 33.0 내지 35.5%와 비교됨). 또한, 게놈 내의 삽입 부위 및 삽입된 카피의 가능한 수에 따라, EPA 및 DHA 함량은 유전자이식 쉬조키트리움 균주 중에서 약간 변하였다.
실시예 4
상이한 양의 DHA 및 EPA를 축적하는 쉬조키트리움 종 ATCC PTA-9695 및 상대적인 ATCC PTA-10208 균주 내의 PUFA 신타제 아단위 유전자 PFA1, PFA2 및 PFA3의 발현
쉬조키트리움 종 ATCC PTA-9695 균주 및 관련된 쉬조키트리움 종 ATCC PTA-10208 균주는 둘 다 동일한 유전자 PFA1, PFA2 및 PFA3의 동일한 카피를 함유한다. 그러나, 이러한 사실에도 불구하고, 이들은 상이한 양의 EPA 및 DHA를 생산한다. 구체적으로, 쉬조키트리움 종 ATCC PTA-10208은 "표준" 조건에서 10 L 규모의 90시간 발효 후 총 FAME의 약 24%의 EPA 및 총 FAME의 약 31%의 DHA를 함유한다. 쉬조키트리움 종 ATCC PTA-9695는 동일한 PUFA 신타제 아단위 유전자 집합을 하버링하지만, 10 L 규모의 90시간 발효 후 총 FAME의 약 9%의 EPA 및 총 FAME의 약 55%의 DHA를 함유한다. PFA1, PFA2 및 PFA3의 qPCR 분석은 "표준" 진탕 플라스크 조건에서 성장한 균주 둘 다에서 수행되었다. 결과는 PFA1 및 PFA3이 균주 PTA-9695보다 균주 PTA-10208에서 더욱 높은 수준으로 발현되었음을 나타냈다(도 9 참조).
실시예 5
쉬조키트리움 종 ATCC PTA-9695의 PFA1 및 PFA3 유전자의 PUFA 신타제 유전자 및 추가적인 카피는 당업계의 표준 실무를 사용하는 형질전환을 위한 아그로박테리움-기반 플라스미드 벡터를 사용하여 캐놀라 식물에 설치되었다. 또한, 노스톡 종의 HetI 유전자 또는 다른 적절한 PPTase가 또한 아실-CoA로의 장쇄 다중불포화 유리 지방산(FFA)의 전환을 촉진하는 아실-CoA 합성효소와 함께 식물에 설치되었다.
간략하게, 프로모터 및 3'-UTR에 작동적으로 연결된 천연 또는 코돈-최적화된 PUFA 신타제 유전자(PFA1, PFA2 및 PFA3) 또는 다른 관심 유전자(PPTase 및 ACS 유전자)를 포함하는 식물 전사 단위(PTU)를 함유한 이원 벡터를 구축하였다. 상이한 프로모터 및 3'-UTR 서열 조합을 이원 벡터에 혼입하여 PUFA 신타제 유전자 및 다른 유전자의 발현을 구동하였다. 이러한 상이한 조절 유전자 요소의 사용은 PTU의 디자인에 혼입되어 이식유전자의 발현 수준을 변경하고 변화시킨다. PTU는 PTU의 배향이 이식유전자의 발현 수준을 변형하는지 여부를 시험하기 위해 상이한 배향으로 이원 벡터 내에 위치된다. 생성된 구축물을 표준 프로토콜에 따라 아그로박테리움 투메파시엔스(Agrobacterium tumefaciens)로 형질전환시키고, 제한 효소 소화 및 서열분석에 의해 확인하였다.
캐놀라의 형질전환을 위해, 당업계의 표준 프로토콜에 따라 종자를 먼저 발아시킨다. 간략하게, 관심 캐놀라 종자를 10% 클로록스(Clorox)에서 10분 동안 표면-멸균시키고, 멸균 증류수로 3회 세정한다. 종자를, 예를 들어, 피타트레이에 함유된 1/2 MS 캐놀라 매질(1/2X MS, 2% 수크로스, 0.8% 한천)(피타트레이 당 25개의 종자) 상에 발아를 위해 심고, 퍼시발 그로스 챔버(Percival Growth Chamber: 상표)(25℃로 설정된 성장 섭생법, 16시간 광 및 8시간 암의 광주기)에 위치시키고, 5일 동안 발아시켰다.
이어서, 발아된 종자를 당업계의 표준 프로토콜에 따라 사전-처리한다. 간략하게, 제5일에, 길이가 약 3 mm인 배축 분절을 무균 절제하여 뿌리 및 새싹 부분을 폐기한다(배축의 건조는 절제 과정 중에 배축 분절을 10 mL의 멸균 ILLIQ(등록상표) 물에 위치시킴으로써 방지됨). 퍼시발 그로스 챔버(상표)(22 내지 23℃로 설정된 성장 섭생법, 8시간 광 및 8시간 암의 광주기)에서 3일 사전-처리 동안, 배축 분절을 유합조직 유도 매질 MSK1D1(1X MS, 1 mg/L 키네틴(Kinetin), 1 mg/L 2,4-D, 3% 수크로스, 0.7% 피타가르(PHYTAGAR: 등록상표)) 상의 멸균 여과지 위에 수평으로 위치시킨다.
이어서, 관심 구축물을 함유하는 아그로박테리움과의 공동-배양을 개시한다. 아그로박테리움 처리 전날, 적절한 항생제를 함유하는 YEP 매질의 플라스크를 접종하였다. 배축 분절을 여과지로부터 10 mL 액체 M 매질을 함유하는 빈 100 x 25 mm 페트리 접시로 옮겨 배축 분절의 건조를 방지하였다. 이 단계에서 스패툴라를 사용하여 분절을 뜨고 옮긴다. 액체 M 매질을 피펫으로 제거하고, 40 mL 아그로박테리움 현탁액을 페트리 접시(40 mL 아그로박테리움 용액과 함께 500개의 분절)에 첨가하였다. 페트리 접시를 주기적으로 소용돌이치게 하면서 분절을 30분 동안 처리하여 배축이 아그로박테리움 용액에 함침된 채로 있게 할 수 있다.
처리 기간의 종료 시, 아그로박테리움 용액을 물 비이커에 피펫팅하고, 오토클레이빙하고, 폐기한다(아그로박테리움 용액은 완전히 제거되어 아그로박테리움 과다성장을 방지함). 처리된 배축을 여과지와 함께 MSK1D1을 함유하는 원래 플레이트로 핀셋을 사용하여 다시 옮긴다(분절이 건조되지 않도록 주의함). 대조군 분절과 함께 배축 분절을 (플레이트를 알루미늄 포일로 덮음으로써) 감소된 광 강도 하에 다시 퍼시발 그로스 챔버(상표)로 옮기고, 처리된 배축을 3일 동안 아그로박테리움과 함께 공동-배양한다.
3일 공동-배양 후, 선택 매질을 사용하여 유합조직 형성을 유도한다. 배축 분절을 핀셋을 사용하여 개별적으로 유합조직 유도 매질 MSK1D1H1(1X MS, 1 mg/L 키네틴, 1 mg/L 2,4-D, 0.5 gm/L MES, 5 mg/L AgNo3, 300 mg/L 티멘틴(TIMENTIN: 등록상표), 200 mg/L 카베니실린(Carbenicillin: 상표), 1 mg/L 허비아세(Herbiace: 상표), 3% 수크로스, 0.7% 피타가르(등록상표)) 상으로 옮긴다. 배축 분절을 매질 상에 앵커링(anchoring) 하지만, 매질에 매립하지는 않는다.
유합조직 유도 매질 상에서 7일 후, 유합조직화 배축 분절을 선택 MSB3Z1H1(1X MS, 3 mg/L BAP, 1 mg/L 제아틴, 0.5 gm/L MES, 5 mg/L AgN<3/4, 300 mg/L 티멘틴(등록상표), 200 mg/L 카베니실린(상표), 1 mg/L 허비아세(상표), 3% 수크로스, 0.7% 피타가르(등록상표))을 갖는 새싹 재생 매질(Shoot Regeneration Medium) 1에 옮긴다. 14일 후, 새싹을 갖는 배축을 증가된 선택 MSB3Z1H3(IX MS, 3 mg/L BAP, 1 mg/L 제아틴, 0.5 gm/L MES, 5 mg/L AgN03, 300 mg/L 티멘틴(등록상표), 200 mg/L 카베니실린(상표), 3 mg/L 허비아세(상표), 3% 수크로스, 0.7% 피타가르(등록상표))을 갖는 재생 매질 2로 옮긴다.
14일 후, 새싹을 갖는 분절을 새싹 신장 매질 MSMESH5(1X MS, 300 mg/L 티멘틴(등록상표), 5 mg/L 허비아세(상표), 2% 수크로스, 0.7% TC 아가르(Agar: 상표))로 옮긴다. 이미 신장된 새싹을 단리하고 MSMESH5로 옮긴다. 14일 후, 제1 라운드에서 신장된 남아있는 새싹을 MSMESH5에 위치시키고, 동일한 조성의 새로운 선택 매질로 옮긴다. 이러한 단계에서, 남아있는 모든 배축 분절을 폐기한다. 2주 후 MSB3Z1H3 매질 상에서 신장된 새싹을 단리하고, MSMESH5 매질로 옮긴다. MSMESH5 상의 제1 라운드에서 신장한 남아있는 새싹을 단리하고, 동일한 조성의 새로운 선택 매질로 옮긴다. 이러한 단계에서, 남아있는 모든 배축 분절을 폐기한다.
추가로 14일 후, 뿌리 유도를 위해 새싹을 MSMEST 매질(IX MS, 0.5 g/L MES, 300 mg/L 티멘틴(등록상표), 2% 수크로스, 0.7% TC 아가르(상표))로 옮긴다. MSMEST 매질 상의 제1 전달에서 뿌리내리지 못한 새싹을 뿌리내린 식물이 수득될 때까지 제2 또는 제3 주기를 위해 MSMEST 매질에 옮긴다.
새싹이 MSMESH5 매질 상에서 14일 이상 동안 배양된 후, PCR을 위한 샘플을 단리한다. 녹색 새싹으로부터의 잎 조직을 선택가능한 마커 유전자의 존재에 대해 PCR에 의해 시험한다. 모든 백화된 새싹을 폐기하고, PCR 검정을 수행하지 않는다. PCR 반응에 대해 양성인 샘플을 유지하고, 새싹을 MSMEST 매질 상에 두어 신장하고 뿌리내리게 한다. PCR 검정에 따라 음성인 새싹을 폐기한다. MSMESH5 또는 MSMEST 상에서 뿌리내리고 PCR-양성인 식물을 토양으로의 이식을 위해 보낸다. 경화 후, 모든 이식유전자 PTU 카세트를 함유하는 사건에 대해 유전자이식 캐놀라 식물을 추가로 분석하고, 이들 식물을 온실에 옮기고, 완전히 성장시키고, Ti 종자를 지방산 조성물 분석을 위해 수확한다. 이식유전자 존재 및 카피 수는 또한 정량적인 PCR에 의해 분석하고, 단백질 양을 면역블롯 분석에 의해 분석한다.
LC-PUFA 생산(특히, EPA 및 DHA)을 캐놀라 종자에서 검출한다. PFA1 및 PFA3, 및/또는 PFA2에 비해 증가된 PFA1 및 PFA3 발현을 촉진하는 조절 서열의 추가적인 카피의 존재는 더욱 큰 EPA 축적을 야기한다.
본원에 인용된 모든 참조문헌은, 각각의 참조문헌이 참조로 혼입되도록 구체적으로 및 개별적으로 지시된 것처럼, 본원에 참조로 혼입된다. 임의의 참조문헌의 인용은 출원일 전의 이의 개시를 위한 것이고, 본 개시내용이 종래 발명에 의해 이러한 참조문헌에 선행하지 못함을 인정하는 것으로 간주되어서는 안 된다.
상기 기술된 각각의 요소 또는 2개 이상의 요소의 조합이 또한 상기 기술된 유형과는 상이한 다른 유형의 방법에서 유용한 적용례를 발견할 수 있음이 이해될 것이다. 추가 분석 없이, 종래 기술의 견지에서, 첨부된 청구범위에 제시된 본 개시내용의 일반적인 또는 특정한 양상의 필수적인 특징을 적절하게 구성하는 특징을 생략하지 않으면서, 다른 사람들이 현재의 지식을 적용함으로써 다양한 적용례에 용이하게 적용할 수 있는 본 개시내용의 요지를 상기 내용은 충분히 나타낼 것이다. 상기 양태는 단지 예로서 제공되고, 본 개시내용의 범주는 단지 하기 청구범위에 의해 제한되어야 한다.
SEQUENCE LISTING <110> DSM IP ASSETS B.V. <120> Method of Increasing Omega-3 Polyunsaturated Fatty Acids Production in MicroAlgae <130> 32068-US-PSP <140> PCT/EP2017/061347 <141> 2017-05-11 <150> US 62/335,498 <151> 2016-05-12 <160> 42 <170> PatentIn version 3.3 <210> 1 <211> 7824 <212> DNA <213> Schizochytrium sp. <400> 1 atggatactc gcatcgcgat cgtggggatg tcggcgatcc tgccgagcgg ggagaacgtg 60 cgcgagagct gggaggcgat ccgcgatggg ctggattgcc tgagcgatct gccggcggac 120 cgcgtggacg tgacggccta ctacaacccg gagaagacga ccaaggacaa gatctactgc 180 aagcgcggcg ggttcatccc ggagtacgac ttcgacgcgc gtgagttcgg gctcaacatg 240 ttccagatgg aggactcgga cgccaaccag acgatctcgc tgctcaaggt gaaggaggcg 300 ctgacggacg ccaacatccc ggcgttctcg agcggtaaga agaacatcgg ctgcgtgctg 360 ggcatcggcg gcggccagaa ggcgagccac gagttctact cgcggctcaa ctacgtggtc 420 gtggacaagg tgctgcgcaa gatgggcctg ccggaggaag acgtggcggc ggcggtggac 480 aagtacaagg cgagtttccc cgagtggcgc ctcgactctt tccccgggtt cctgggcaac 540 gtcacggcgg ggcgctgctg caataccttc aacatggagg gcatgaactg cgtcgtggac 600 gcggcctgcg cgtcgtcgct gatcgcggtc aaagtggcga tcgaggagct gctctacggc 660 gactgcgatg cgatgatcgc gggtgccacc tgcacggaca actcgatcgg gatgtacatg 720 gccttctcca agacgcccgt gttttccacg gacccgagcg tcaaggcgta cgacgccgcc 780 accaaaggca tgctcatcgg cgagggctcg gcgatgctcg tgctgaagcg ctacgcggac 840 gccgtgcgcg acggcgacac cgtgcacgcc gtcatcaagg ggtgcgcgtc ctcgagcgac 900 ggcaaggcgg cgggcatcta cacgccgaca atctcgggcc aggaggaggc cctgcgccgc 960 gcctacgccc gcgccaatgt cgacccggcc actgtgacgc tggtggaggg ccacggcacg 1020 ggtacgccgg tgggcgacaa gatcgagctg acggcgctga gcaacctctt ctccaaggcg 1080 ttttctgcca acggtggcgg cgcggaggaa gcagagcagg tggcggtggg cagcatcaag 1140 tcgcagatcg ggcacctcaa ggcggtggcc gggctggccg ggctggtcaa ggtggtgctg 1200 gcgctcaagc acaagacgct gccgcagacg atcaacgtcg acaagccgcc gtcgctggtg 1260 gacgggaccc cgatccagca gtcgccgctg tacgtcaaca cgatgaaccg cccctggttc 1320 acgcccgtag gggtgccgcg ccgcgccggc gtgtcgtcgt ttgggtttgg cggtgccaac 1380 taccacgccg tgctggagga gtttgagccc gagcacgaga gcgcgtaccg gtacaacaac 1440 ctgccgcagg tggcgctgct gcacgcgggg gacgtcgcga ccttggcggc gacggttcgc 1500 gccaagctgg cgctggccac cgccgagcag gaagaggcgc gtgtggtgaa gaacgcggac 1560 tacatcgcgt accaccggtt cctggacgag tgcaagttgc gcggcgctgt gccgcaggcg 1620 cacgcgcggg tgggactgct cgtacgggac ctgagctcgc tcatcgccgt gctcgaggcc 1680 gctgccgcca agctcgcggg cgaagagagc gcgacggagt ggacggtcag cgttgctacg 1740 ggcgaggcgg ccttccgcgt gcgcggtgtg gctacggagg ccaacgtggc ggcgctgttc 1800 tcgggccagg gcgcgcagta cacgcacatg ttcagcgacg tggcgatgaa ctggcccccg 1860 ttccgcgaga gcgtcgccgc catggaccgc gcccagcgcg agcgcttcgg gcggcctgcc 1920 aagcgcgtga gcagcgtgct gtacccgcgc aagccgtacg gcgacgaacc gcggcaggac 1980 cacaaggaga tctcgcaaac gcgctactcg cagcccgcaa cgctcgcgtg ctcggtcggc 2040 gcctttgaca tcttcaaagc ggcgggactg gcgccgagct ttgcggcggg ccactcgctg 2100 ggcgagtttg cggcgctcta cgcggccggg tcgctcgatc gcgacgccgt cttcgacctg 2160 gtctgcgcgc gcgccaaggc catgagcgac ttcacggccc aggccagcag cagcggtggc 2220 gccatggcgg ccgtgattgg cgccaaggcg gaccagctct cgctgggtgg cgcgcccgac 2280 gtgtggctcg ccaacagcaa ctcgccctcg cagaccgtga tcacgggaac cgccgaagca 2340 gtggctgcgg cctctgacaa gttgcgctgc agcggcaact tccgcgtcgt gcctctggcc 2400 tgcgaggcgg ccttccactc gccgcacatg cgcggcgcgg agcagacgtt tgcgtcggcg 2460 ctcgcgcagg cgcccgtgtc ggcaccggcg gctgctcggt tctactctaa cgtgacgggg 2520 ggcgccgcgg taacctcgcc cgcggacgtc aaaacgaacc tgggcaagca catgacgagc 2580 cctgtgcagt tcgtgcagca ggtgcgagcc atgcacgcgg cgggcgcgcg tgtgtttgtg 2640 gagtttgggc ccaagcaggt cctgtcgcgc ctcgtcaagg agacccttgg cgaggccggc 2700 gacgtggtca cggtcgccgt caacccagac tcggccaagg acagcgacac gcagctgcgc 2760 caggcggcgc tcacgttggc ggtcgccggc gtgccgctca aggactttga ccgctggcag 2820 ctgccggatg ccacgcgcct cgagcctgtc aagaagaaga agaccacgtt gcggctctcg 2880 gcagccacct acgtctccgc caagacgttg cgccagcgcg aggccgtgct caacgacggc 2940 tacactgtca gtggtgccac ggcggtagtc aaggaagtgg acacggccaa cgaggagcgt 3000 ctcgtccgcc aagcccagga tctccagcgc cagctcgcgg aggcctcgac ggcagcccag 3060 gcggcgcagt ccaaggtcgc ggagctcgag cgcacgatcc aggacttgga gcgcaaggtg 3120 cagcagcagc agcaagagaa gggtgagaac tcagacagca acgctgccgc cgaagtgctg 3180 cggcgccaca aggagctgct ccagcgcatg ctgcaggact gtgacgagca ggcagtgccc 3240 gtagccacgg tggttccgac acctacgtcc tccccgacgc ctacatcctc acccgtatcc 3300 ggcaacagca agagcactcg tggcagtgct gatctgcaag cgctgctggc caaggcggag 3360 actgtggtga tggctgtgct ggctgccaag actggctacg aggccgacat ggttgaggcg 3420 gacatggacc tggaggccga gctcggcatc gactcgatca agcgcgtgga gatcctttcc 3480 gaggtgcagg gccagctggg cgtcgaggcc aaggacgtgg atgcgctgag ccgcacgcgc 3540 acggtcggtg aggttgtgga cgccatgaag gcggagatcg tggctgcctc tggtggtagt 3600 gctcctgcgg ttccttcggc gcccgctgct tctgcagctc cgactcccgc tgcttcgact 3660 gcgccttctg ctgatctgca agcgctgctg tccaaggcgg agactgtggt gatggctgtg 3720 ctggcggcca agactggcta cgaggccgac atggtcgagg cggacatgga cctggaggcc 3780 gagctcggca tcgactcgat caagcgcgtg gagatcctct cggaggtgca gggccagctg 3840 ggcgtcgagg ccaaggacgt ggatgcgctg agccgcacgc gcacggtcgg tgaggttgtg 3900 gatgccatga aggcggaaat cgtggctgcc tctgctggta gtgctcctgc tcctgctgtt 3960 ccttcggcgc ccgctgcttc tgcagctccg actcccgctg cttcgactgc gccttctgct 4020 gatctgcaag cgctgctgtc caaggcggag acggtggtga tggctgtgct ggcggccaag 4080 actggctacg aggccgacat ggtcgaggcg gacatggacc tggaggccga gctcggcatc 4140 gactcgatca agcgcgtgga gatcctctcg gaggtgcagg gccagctggg cgtcgaggcc 4200 aaggacgtgg atgcgctgag ccgcacgcgc acggtcggtg aggttgtgga tgccatgaag 4260 gcggaaatcg tggctgcctc tggtggtagt gctcctgctc ctgcggttcc ttcggcgccc 4320 gctgcttctg cagctccgac tcccgcggct gcgacagcgc cttctgctga tctgcaagcg 4380 ctgctggcca aggcggagac tgtggtgatg gctgtgctgg cggccaagac tggctacgag 4440 gccgacatgg tcgaggcgga catggacctg gaggccgagc tcggcatcga ctcgatcaag 4500 cgcgtggaga tcctttccga ggtgcagggc cagctgggcg tcgaggccaa ggacgtagat 4560 gcgctgagcc gcacgcgcac ggtcggtgag gttgtggatg ccatgaaggc ggagatcgtg 4620 gctgcctctg ctggtagtgc tcctgctcct gctgttcctt cggcgcccgc tgcttctgca 4680 gctccgactc ccgctgcttc gactgcgcct tctgctgatc tgcaagcgct gctgtccaag 4740 gcggagactg tggtgatggc tgtgctggcg gccaagactg gctacgaggc cgacatggtc 4800 gaggcggaca tggacctgga ggccgagctc ggcatcgact cgatcaagcg cgtggagatc 4860 ctctcggagg tgcagggcca gctgggcgtc gaggccaagg acgtggatgc gctgagccgc 4920 acgcgcacgg tcggtgaggt tgtggatgcc atgaaggcgg aaatcgtggc tgcctctggt 4980 ggtagtgctc ctgctgctgc tgttccttcg gcgcccgctg cttctgcagc tccgactcct 5040 gcgactgcgc cttctgctga tctgcaagcg ctgctgtcca aggcggagac tgtggtgatg 5100 gctgtgctgg cggccaagac tggctacgag gccgacatgg tcgaggcgga catggacctg 5160 gaggccgagc tcggcatcga ctcgatcaag cgcgtggaga tcctttccga ggtgcagggc 5220 cagctgggcg tcgaggccaa ggacgtagat gcgctgagcc gcacgcgcac ggtcggtgaa 5280 gtggtggacg ccatgaaggc ggagatcgtg gctgcctctg gtggtagtgc tcctgctgct 5340 ccttcggcgc ccgcgcttct tccaacgctg tttggttccg agtgcgagga cctgtctctg 5400 acctttcccg tgataacgac cctgccgctt cctgcagagc ttgtgctggc cgagggcggc 5460 gctcgccctg tagtcgtggt ggatgatgga tctgcactca cctcgtcgct ggtgtcctcg 5520 ctcggcgatc gtgcggtgct gctgcaggtg cagtcttcct ctgcctgctc gccgcgctcg 5580 accacgcaca agttggtgac cgtagcagac cgctctgaag cggcgctaca ggcggcgctc 5640 acgtccgtcg aggcgcagtt cggcaaggtg ggtggctttg tgttccagtt cggcgacgac 5700 gacgtgcaag cgcagctcgg ctgggcgctg ctcgcggcca agcacctcaa aacttcgctg 5760 tcagaacaga tcgagggcgg tcgcaccttt ttcgtggccg tcgcgcggct cgacggccag 5820 ctggggctct ccggcaagtc gacgaccgct accgttgatc tctcccgcgc gcagcagggc 5880 agcgtgttcg gcctgtgcaa gacactcgac ctggagtggc ccgctgtctt ctgccgcgga 5940 atcgacctgg ccgccgacct cgacgccgca caggccgcgc ggtgcctgct gggcgagctg 6000 tcagaccccg acgtggccgt gcgcgagtct ggttactccg cctcgggcca gcgctgcacg 6060 acaactacga agtcgctgac tacgggcaag ccgcaccagc cgatctcctc gtcggacctc 6120 tttctggtgt cgggcggcgc gcgcggcatc accccgctgt gcgtgcgcga gctggcgcag 6180 cgcgtgggcg gcggcacgta cgtgctcatc ggccgctcgg agctgcccac gacggagcct 6240 gcctgggcgg tcggcgtgga gtctggcaag ccgctggaga aggccgcgct ggcgttcctg 6300 aaggcggagt ttgcagcggg ccgcggggcc aagccgacgc cgatgctgca caagaagctc 6360 gtgggcgccg tggtcggagc gcgcgaggtg cgagcctcgc tcgccgagat cactgcacag 6420 ggcgccacgg ctgtgtacga gtcgtgcgac gtgagctctg ccgccaaggt gcgtgagatg 6480 gtagagcgcg tgcagcagca gggcgggcgg cgcgtgtcgg gcgtgttcca cgcgtcgggc 6540 gtgctgcgcg acaagctcgt ggagaacaag tcgctggcgg acttcagcgc cgtgtacgac 6600 accaaggtgg gcggcctcat caacctgctg gcctgcgtgg acctggcgca gctgcgtcac 6660 ctcgtgctct tcagctcgct cgcgggcttc cacggcaacg tcgggcagtc ggactacgca 6720 atggccaacg aggcgctcaa caagctggcg gcgcacctgt cggcggtgca cccgcagctg 6780 tgcgcgcgct cgatctgctt cggaccgtgg gacggcggca tggtgacccc cgcgctcaag 6840 gccaacttca tccgcatggg catccagatc atcccgcgcc aaggcggcgc gcagaccgtc 6900 gccaacatgc tcgtcagtag ctcccccggt cagctgctcg tgggcaactg gggcgtgcca 6960 cccgtcgtgc cgagtgccac cgagcacacc gtgctgcaga cgctccgcca gagcgacaac 7020 cccttcctcg actcgcacgt gatccagggc cgccgcgtgc tgcccatgac cctggccgtg 7080 ggctacatgg cgcaccaggc gcagagcatc tacgcgggcc accagctgtg ggccgtcgag 7140 gacgcccagc tcttcaaggg catcgccatc gacaatggcg ccgacgtgcc cgtgcgcgtg 7200 gagctgtcgc gccgcaagga ggagcaggag gacgccggca aggtcaaggt caaggtgcag 7260 gtgctgctca aatcgcaggt caacggcaag tcggtgcccg cgtacaaggc gaccgtcgtg 7320 ctgtcccctg cgccgcgccc cagcgtcatc acgcgtgact tcgacctcac cccggacccg 7380 gcctgcacgg agcacgacct ctacgacggc aagacgctct tccacggcaa ggccttccag 7440 ggcatcgagc aggtgctctc ggcgacgccc aagcagctca ccgccaagtg ccgcaatttg 7500 cccctcacgc ccgagcagcg cggccagttc gtcgttaacc tcagccagca ggacccgttc 7560 caggcggaca ttgcgttcca ggcgatgctc gtctgggcgc gcatgctgcg ccaatcggcg 7620 gccctgccca acaactgcga gcgcttcgac ttttacaagc cgatggcccc gggcgccacc 7680 tactacacgt cggtcaagct ggcctcggcc tcacccttgg tggactctgt gtgcaagtgc 7740 accgtggcga tgcacgatga gcaaggtgag gtgtactttt ctgctcgtgc cagcgtcgtc 7800 ctcaacaaga ccctcacgta ctaa 7824 <210> 2 <211> 2607 <212> PRT <213> Schizochytrium sp. <400> 2 Met Asp Thr Arg Ile Ala Ile Val Gly Met Ser Ala Ile Leu Pro Ser 1 5 10 15 Gly Glu Asn Val Arg Glu Ser Trp Glu Ala Ile Arg Asp Gly Leu Asp 20 25 30 Cys Leu Ser Asp Leu Pro Ala Asp Arg Val Asp Val Thr Ala Tyr Tyr 35 40 45 Asn Pro Glu Lys Thr Thr Lys Asp Lys Ile Tyr Cys Lys Arg Gly Gly 50 55 60 Phe Ile Pro Glu Tyr Asp Phe Asp Ala Arg Glu Phe Gly Leu Asn Met 65 70 75 80 Phe Gln Met Glu Asp Ser Asp Ala Asn Gln Thr Ile Ser Leu Leu Lys 85 90 95 Val Lys Glu Ala Leu Thr Asp Ala Asn Ile Pro Ala Phe Ser Ser Gly 100 105 110 Lys Lys Asn Ile Gly Cys Val Leu Gly Ile Gly Gly Gly Gln Lys Ala 115 120 125 Ser His Glu Phe Tyr Ser Arg Leu Asn Tyr Val Val Val Asp Lys Val 130 135 140 Leu Arg Lys Met Gly Leu Pro Glu Glu Asp Val Ala Ala Ala Val Asp 145 150 155 160 Lys Tyr Lys Ala Ser Phe Pro Glu Trp Arg Leu Asp Ser Phe Pro Gly 165 170 175 Phe Leu Gly Asn Val Thr Ala Gly Arg Cys Cys Asn Thr Phe Asn Met 180 185 190 Glu Gly Met Asn Cys Val Val Asp Ala Ala Cys Ala Ser Ser Leu Ile 195 200 205 Ala Val Lys Val Ala Ile Glu Glu Leu Leu Tyr Gly Asp Cys Asp Ala 210 215 220 Met Ile Ala Gly Ala Thr Cys Thr Asp Asn Ser Ile Gly Met Tyr Met 225 230 235 240 Ala Phe Ser Lys Thr Pro Val Phe Ser Thr Asp Pro Ser Val Lys Ala 245 250 255 Tyr Asp Ala Ala Thr Lys Gly Met Leu Ile Gly Glu Gly Ser Ala Met 260 265 270 Leu Val Leu Lys Arg Tyr Ala Asp Ala Val Arg Asp Gly Asp Thr Val 275 280 285 His Ala Val Ile Lys Gly Cys Ala Ser Ser Ser Asp Gly Lys Ala Ala 290 295 300 Gly Ile Tyr Thr Pro Thr Ile Ser Gly Gln Glu Glu Ala Leu Arg Arg 305 310 315 320 Ala Tyr Ala Arg Ala Asn Val Asp Pro Ala Thr Val Thr Leu Val Glu 325 330 335 Gly His Gly Thr Gly Thr Pro Val Gly Asp Lys Ile Glu Leu Thr Ala 340 345 350 Leu Ser Asn Leu Phe Ser Lys Ala Phe Ser Ala Asn Gly Gly Gly Ala 355 360 365 Glu Glu Ala Glu Gln Val Ala Val Gly Ser Ile Lys Ser Gln Ile Gly 370 375 380 His Leu Lys Ala Val Ala Gly Leu Ala Gly Leu Val Lys Val Val Leu 385 390 395 400 Ala Leu Lys His Lys Thr Leu Pro Gln Thr Ile Asn Val Asp Lys Pro 405 410 415 Pro Ser Leu Val Asp Gly Thr Pro Ile Gln Gln Ser Pro Leu Tyr Val 420 425 430 Asn Thr Met Asn Arg Pro Trp Phe Thr Pro Val Gly Val Pro Arg Arg 435 440 445 Ala Gly Val Ser Ser Phe Gly Phe Gly Gly Ala Asn Tyr His Ala Val 450 455 460 Leu Glu Glu Phe Glu Pro Glu His Glu Ser Ala Tyr Arg Tyr Asn Asn 465 470 475 480 Leu Pro Gln Val Ala Leu Leu His Ala Gly Asp Val Ala Thr Leu Ala 485 490 495 Ala Thr Val Arg Ala Lys Leu Ala Leu Ala Thr Ala Glu Gln Glu Glu 500 505 510 Ala Arg Val Val Lys Asn Ala Asp Tyr Ile Ala Tyr His Arg Phe Leu 515 520 525 Asp Glu Cys Lys Leu Arg Gly Ala Val Pro Gln Ala His Ala Arg Val 530 535 540 Gly Leu Leu Val Arg Asp Leu Ser Ser Leu Ile Ala Val Leu Glu Ala 545 550 555 560 Ala Ala Ala Lys Leu Ala Gly Glu Glu Ser Ala Thr Glu Trp Thr Val 565 570 575 Ser Val Ala Thr Gly Glu Ala Ala Phe Arg Val Arg Gly Val Ala Thr 580 585 590 Glu Ala Asn Val Ala Ala Leu Phe Ser Gly Gln Gly Ala Gln Tyr Thr 595 600 605 His Met Phe Ser Asp Val Ala Met Asn Trp Pro Pro Phe Arg Glu Ser 610 615 620 Val Ala Ala Met Asp Arg Ala Gln Arg Glu Arg Phe Gly Arg Pro Ala 625 630 635 640 Lys Arg Val Ser Ser Val Leu Tyr Pro Arg Lys Pro Tyr Gly Asp Glu 645 650 655 Pro Arg Gln Asp His Lys Glu Ile Ser Gln Thr Arg Tyr Ser Gln Pro 660 665 670 Ala Thr Leu Ala Cys Ser Val Gly Ala Phe Asp Ile Phe Lys Ala Ala 675 680 685 Gly Leu Ala Pro Ser Phe Ala Ala Gly His Ser Leu Gly Glu Phe Ala 690 695 700 Ala Leu Tyr Ala Ala Gly Ser Leu Asp Arg Asp Ala Val Phe Asp Leu 705 710 715 720 Val Cys Ala Arg Ala Lys Ala Met Ser Asp Phe Thr Ala Gln Ala Ser 725 730 735 Ser Ser Gly Gly Ala Met Ala Ala Val Ile Gly Ala Lys Ala Asp Gln 740 745 750 Leu Ser Leu Gly Gly Ala Pro Asp Val Trp Leu Ala Asn Ser Asn Ser 755 760 765 Pro Ser Gln Thr Val Ile Thr Gly Thr Ala Glu Ala Val Ala Ala Ala 770 775 780 Ser Asp Lys Leu Arg Cys Ser Gly Asn Phe Arg Val Val Pro Leu Ala 785 790 795 800 Cys Glu Ala Ala Phe His Ser Pro His Met Arg Gly Ala Glu Gln Thr 805 810 815 Phe Ala Ser Ala Leu Ala Gln Ala Pro Val Ser Ala Pro Ala Ala Ala 820 825 830 Arg Phe Tyr Ser Asn Val Thr Gly Gly Ala Ala Val Thr Ser Pro Ala 835 840 845 Asp Val Lys Thr Asn Leu Gly Lys His Met Thr Ser Pro Val Gln Phe 850 855 860 Val Gln Gln Val Arg Ala Met His Ala Ala Gly Ala Arg Val Phe Val 865 870 875 880 Glu Phe Gly Pro Lys Gln Val Leu Ser Arg Leu Val Lys Glu Thr Leu 885 890 895 Gly Glu Ala Gly Asp Val Val Thr Val Ala Val Asn Pro Asp Ser Ala 900 905 910 Lys Asp Ser Asp Thr Gln Leu Arg Gln Ala Ala Leu Thr Leu Ala Val 915 920 925 Ala Gly Val Pro Leu Lys Asp Phe Asp Arg Trp Gln Leu Pro Asp Ala 930 935 940 Thr Arg Leu Glu Pro Val Lys Lys Lys Lys Thr Thr Leu Arg Leu Ser 945 950 955 960 Ala Ala Thr Tyr Val Ser Ala Lys Thr Leu Arg Gln Arg Glu Ala Val 965 970 975 Leu Asn Asp Gly Tyr Thr Val Ser Gly Ala Thr Ala Val Val Lys Glu 980 985 990 Val Asp Thr Ala Asn Glu Glu Arg Leu Val Arg Gln Ala Gln Asp Leu 995 1000 1005 Gln Arg Gln Leu Ala Glu Ala Ser Thr Ala Ala Gln Ala Ala Gln 1010 1015 1020 Ser Lys Val Ala Glu Leu Glu Arg Thr Ile Gln Asp Leu Glu Arg 1025 1030 1035 Lys Val Gln Gln Gln Gln Gln Glu Lys Gly Glu Asn Ser Asp Ser 1040 1045 1050 Asn Ala Ala Ala Glu Val Leu Arg Arg His Lys Glu Leu Leu Gln 1055 1060 1065 Arg Met Leu Gln Asp Cys Asp Glu Gln Ala Val Pro Val Ala Thr 1070 1075 1080 Val Val Pro Thr Pro Thr Ser Ser Pro Thr Pro Thr Ser Ser Pro 1085 1090 1095 Val Ser Gly Asn Ser Lys Ser Thr Arg Gly Ser Ala Asp Leu Gln 1100 1105 1110 Ala Leu Leu Ala Lys Ala Glu Thr Val Val Met Ala Val Leu Ala 1115 1120 1125 Ala Lys Thr Gly Tyr Glu Ala Asp Met Val Glu Ala Asp Met Asp 1130 1135 1140 Leu Glu Ala Glu Leu Gly Ile Asp Ser Ile Lys Arg Val Glu Ile 1145 1150 1155 Leu Ser Glu Val Gln Gly Gln Leu Gly Val Glu Ala Lys Asp Val 1160 1165 1170 Asp Ala Leu Ser Arg Thr Arg Thr Val Gly Glu Val Val Asp Ala 1175 1180 1185 Met Lys Ala Glu Ile Val Ala Ala Ser Gly Gly Ser Ala Pro Ala 1190 1195 1200 Val Pro Ser Ala Pro Ala Ala Ser Ala Ala Pro Thr Pro Ala Ala 1205 1210 1215 Ser Thr Ala Pro Ser Ala Asp Leu Gln Ala Leu Leu Ser Lys Ala 1220 1225 1230 Glu Thr Val Val Met Ala Val Leu Ala Ala Lys Thr Gly Tyr Glu 1235 1240 1245 Ala Asp Met Val Glu Ala Asp Met Asp Leu Glu Ala Glu Leu Gly 1250 1255 1260 Ile Asp Ser Ile Lys Arg Val Glu Ile Leu Ser Glu Val Gln Gly 1265 1270 1275 Gln Leu Gly Val Glu Ala Lys Asp Val Asp Ala Leu Ser Arg Thr 1280 1285 1290 Arg Thr Val Gly Glu Val Val Asp Ala Met Lys Ala Glu Ile Val 1295 1300 1305 Ala Ala Ser Ala Gly Ser Ala Pro Ala Pro Ala Val Pro Ser Ala 1310 1315 1320 Pro Ala Ala Ser Ala Ala Pro Thr Pro Ala Ala Ser Thr Ala Pro 1325 1330 1335 Ser Ala Asp Leu Gln Ala Leu Leu Ser Lys Ala Glu Thr Val Val 1340 1345 1350 Met Ala Val Leu Ala Ala Lys Thr Gly Tyr Glu Ala Asp Met Val 1355 1360 1365 Glu Ala Asp Met Asp Leu Glu Ala Glu Leu Gly Ile Asp Ser Ile 1370 1375 1380 Lys Arg Val Glu Ile Leu Ser Glu Val Gln Gly Gln Leu Gly Val 1385 1390 1395 Glu Ala Lys Asp Val Asp Ala Leu Ser Arg Thr Arg Thr Val Gly 1400 1405 1410 Glu Val Val Asp Ala Met Lys Ala Glu Ile Val Ala Ala Ser Gly 1415 1420 1425 Gly Ser Ala Pro Ala Pro Ala Val Pro Ser Ala Pro Ala Ala Ser 1430 1435 1440 Ala Ala Pro Thr Pro Ala Ala Ala Thr Ala Pro Ser Ala Asp Leu 1445 1450 1455 Gln Ala Leu Leu Ala Lys Ala Glu Thr Val Val Met Ala Val Leu 1460 1465 1470 Ala Ala Lys Thr Gly Tyr Glu Ala Asp Met Val Glu Ala Asp Met 1475 1480 1485 Asp Leu Glu Ala Glu Leu Gly Ile Asp Ser Ile Lys Arg Val Glu 1490 1495 1500 Ile Leu Ser Glu Val Gln Gly Gln Leu Gly Val Glu Ala Lys Asp 1505 1510 1515 Val Asp Ala Leu Ser Arg Thr Arg Thr Val Gly Glu Val Val Asp 1520 1525 1530 Ala Met Lys Ala Glu Ile Val Ala Ala Ser Ala Gly Ser Ala Pro 1535 1540 1545 Ala Pro Ala Val Pro Ser Ala Pro Ala Ala Ser Ala Ala Pro Thr 1550 1555 1560 Pro Ala Ala Ser Thr Ala Pro Ser Ala Asp Leu Gln Ala Leu Leu 1565 1570 1575 Ser Lys Ala Glu Thr Val Val Met Ala Val Leu Ala Ala Lys Thr 1580 1585 1590 Gly Tyr Glu Ala Asp Met Val Glu Ala Asp Met Asp Leu Glu Ala 1595 1600 1605 Glu Leu Gly Ile Asp Ser Ile Lys Arg Val Glu Ile Leu Ser Glu 1610 1615 1620 Val Gln Gly Gln Leu Gly Val Glu Ala Lys Asp Val Asp Ala Leu 1625 1630 1635 Ser Arg Thr Arg Thr Val Gly Glu Val Val Asp Ala Met Lys Ala 1640 1645 1650 Glu Ile Val Ala Ala Ser Gly Gly Ser Ala Pro Ala Ala Ala Val 1655 1660 1665 Pro Ser Ala Pro Ala Ala Ser Ala Ala Pro Thr Pro Ala Thr Ala 1670 1675 1680 Pro Ser Ala Asp Leu Gln Ala Leu Leu Ser Lys Ala Glu Thr Val 1685 1690 1695 Val Met Ala Val Leu Ala Ala Lys Thr Gly Tyr Glu Ala Asp Met 1700 1705 1710 Val Glu Ala Asp Met Asp Leu Glu Ala Glu Leu Gly Ile Asp Ser 1715 1720 1725 Ile Lys Arg Val Glu Ile Leu Ser Glu Val Gln Gly Gln Leu Gly 1730 1735 1740 Val Glu Ala Lys Asp Val Asp Ala Leu Ser Arg Thr Arg Thr Val 1745 1750 1755 Gly Glu Val Val Asp Ala Met Lys Ala Glu Ile Val Ala Ala Ser 1760 1765 1770 Gly Gly Ser Ala Pro Ala Ala Pro Ser Ala Pro Ala Leu Leu Pro 1775 1780 1785 Thr Leu Phe Gly Ser Glu Cys Glu Asp Leu Ser Leu Thr Phe Pro 1790 1795 1800 Val Ile Thr Thr Leu Pro Leu Pro Ala Glu Leu Val Leu Ala Glu 1805 1810 1815 Gly Gly Ala Arg Pro Val Val Val Val Asp Asp Gly Ser Ala Leu 1820 1825 1830 Thr Ser Ser Leu Val Ser Ser Leu Gly Asp Arg Ala Val Leu Leu 1835 1840 1845 Gln Val Gln Ser Ser Ser Ala Cys Ser Pro Arg Ser Thr Thr His 1850 1855 1860 Lys Leu Val Thr Val Ala Asp Arg Ser Glu Ala Ala Leu Gln Ala 1865 1870 1875 Ala Leu Thr Ser Val Glu Ala Gln Phe Gly Lys Val Gly Gly Phe 1880 1885 1890 Val Phe Gln Phe Gly Asp Asp Asp Val Gln Ala Gln Leu Gly Trp 1895 1900 1905 Ala Leu Leu Ala Ala Lys His Leu Lys Thr Ser Leu Ser Glu Gln 1910 1915 1920 Ile Glu Gly Gly Arg Thr Phe Phe Val Ala Val Ala Arg Leu Asp 1925 1930 1935 Gly Gln Leu Gly Leu Ser Gly Lys Ser Thr Thr Ala Thr Val Asp 1940 1945 1950 Leu Ser Arg Ala Gln Gln Gly Ser Val Phe Gly Leu Cys Lys Thr 1955 1960 1965 Leu Asp Leu Glu Trp Pro Ala Val Phe Cys Arg Gly Ile Asp Leu 1970 1975 1980 Ala Ala Asp Leu Asp Ala Ala Gln Ala Ala Arg Cys Leu Leu Gly 1985 1990 1995 Glu Leu Ser Asp Pro Asp Val Ala Val Arg Glu Ser Gly Tyr Ser 2000 2005 2010 Ala Ser Gly Gln Arg Cys Thr Thr Thr Thr Lys Ser Leu Thr Thr 2015 2020 2025 Gly Lys Pro His Gln Pro Ile Ser Ser Ser Asp Leu Phe Leu Val 2030 2035 2040 Ser Gly Gly Ala Arg Gly Ile Thr Pro Leu Cys Val Arg Glu Leu 2045 2050 2055 Ala Gln Arg Val Gly Gly Gly Thr Tyr Val Leu Ile Gly Arg Ser 2060 2065 2070 Glu Leu Pro Thr Thr Glu Pro Ala Trp Ala Val Gly Val Glu Ser 2075 2080 2085 Gly Lys Pro Leu Glu Lys Ala Ala Leu Ala Phe Leu Lys Ala Glu 2090 2095 2100 Phe Ala Ala Gly Arg Gly Ala Lys Pro Thr Pro Met Leu His Lys 2105 2110 2115 Lys Leu Val Gly Ala Val Val Gly Ala Arg Glu Val Arg Ala Ser 2120 2125 2130 Leu Ala Glu Ile Thr Ala Gln Gly Ala Thr Ala Val Tyr Glu Ser 2135 2140 2145 Cys Asp Val Ser Ser Ala Ala Lys Val Arg Glu Met Val Glu Arg 2150 2155 2160 Val Gln Gln Gln Gly Gly Arg Arg Val Ser Gly Val Phe His Ala 2165 2170 2175 Ser Gly Val Leu Arg Asp Lys Leu Val Glu Asn Lys Ser Leu Ala 2180 2185 2190 Asp Phe Ser Ala Val Tyr Asp Thr Lys Val Gly Gly Leu Ile Asn 2195 2200 2205 Leu Leu Ala Cys Val Asp Leu Ala Gln Leu Arg His Leu Val Leu 2210 2215 2220 Phe Ser Ser Leu Ala Gly Phe His Gly Asn Val Gly Gln Ser Asp 2225 2230 2235 Tyr Ala Met Ala Asn Glu Ala Leu Asn Lys Leu Ala Ala His Leu 2240 2245 2250 Ser Ala Val His Pro Gln Leu Cys Ala Arg Ser Ile Cys Phe Gly 2255 2260 2265 Pro Trp Asp Gly Gly Met Val Thr Pro Ala Leu Lys Ala Asn Phe 2270 2275 2280 Ile Arg Met Gly Ile Gln Ile Ile Pro Arg Gln Gly Gly Ala Gln 2285 2290 2295 Thr Val Ala Asn Met Leu Val Ser Ser Ser Pro Gly Gln Leu Leu 2300 2305 2310 Val Gly Asn Trp Gly Val Pro Pro Val Val Pro Ser Ala Thr Glu 2315 2320 2325 His Thr Val Leu Gln Thr Leu Arg Gln Ser Asp Asn Pro Phe Leu 2330 2335 2340 Asp Ser His Val Ile Gln Gly Arg Arg Val Leu Pro Met Thr Leu 2345 2350 2355 Ala Val Gly Tyr Met Ala His Gln Ala Gln Ser Ile Tyr Ala Gly 2360 2365 2370 His Gln Leu Trp Ala Val Glu Asp Ala Gln Leu Phe Lys Gly Ile 2375 2380 2385 Ala Ile Asp Asn Gly Ala Asp Val Pro Val Arg Val Glu Leu Ser 2390 2395 2400 Arg Arg Lys Glu Glu Gln Glu Asp Ala Gly Lys Val Lys Val Lys 2405 2410 2415 Val Gln Val Leu Leu Lys Ser Gln Val Asn Gly Lys Ser Val Pro 2420 2425 2430 Ala Tyr Lys Ala Thr Val Val Leu Ser Pro Ala Pro Arg Pro Ser 2435 2440 2445 Val Ile Thr Arg Asp Phe Asp Leu Thr Pro Asp Pro Ala Cys Thr 2450 2455 2460 Glu His Asp Leu Tyr Asp Gly Lys Thr Leu Phe His Gly Lys Ala 2465 2470 2475 Phe Gln Gly Ile Glu Gln Val Leu Ser Ala Thr Pro Lys Gln Leu 2480 2485 2490 Thr Ala Lys Cys Arg Asn Leu Pro Leu Thr Pro Glu Gln Arg Gly 2495 2500 2505 Gln Phe Val Val Asn Leu Ser Gln Gln Asp Pro Phe Gln Ala Asp 2510 2515 2520 Ile Ala Phe Gln Ala Met Leu Val Trp Ala Arg Met Leu Arg Gln 2525 2530 2535 Ser Ala Ala Leu Pro Asn Asn Cys Glu Arg Phe Asp Phe Tyr Lys 2540 2545 2550 Pro Met Ala Pro Gly Ala Thr Tyr Tyr Thr Ser Val Lys Leu Ala 2555 2560 2565 Ser Ala Ser Pro Leu Val Asp Ser Val Cys Lys Cys Thr Val Ala 2570 2575 2580 Met His Asp Glu Gln Gly Glu Val Tyr Phe Ser Ala Arg Ala Ser 2585 2590 2595 Val Val Leu Asn Lys Thr Leu Thr Tyr 2600 2605 <210> 3 <211> 5778 <212> DNA <213> Schizochytrium sp. <400> 3 atgccgtgcg ataacattgc ggtcgtgggc atggcggtgc agtatgccgg atgcaagaac 60 caggacgagt tctgggatac gctgatgcgt aaggagatca actcgagccc gatctcggcg 120 gagcgcctcg gtacgcgcta ccgcgacctc cacttccacc cgcagcgcag caagtacgcc 180 gacaccttct gcaacgatcg ctacggctgc gtcgatgcca gcgtcgacaa cgagcacgac 240 ctcctcgccg acctggcccg gcgcgccctg ctcgacgccg gaattaacct cgacgacgcc 300 agcaccaccg ccaacctacg cgacttcggc atcgtgagcg gctgcctgtc gttccccatg 360 gacaatctgc agggcgagct gctcaatctg taccaagtgc atgtggagaa ccgcgtgggc 420 gcccagcgct tccgcgactc gcgcccctgg tcggagcgcc cgcgcgctgt ctcgcccgag 480 gccagcgacc cgcgcgtgta ctccgacccg gcgtccttcg tggccaacca gctcggcctg 540 gggcccgtgc gctacagcct cgatgcagcc tgcgcgtcgg cgctgtactg cctcaagctg 600 gcgtccgacc acttgctctc gcgcagcgcg gacgtgatgc tgtgcggcgc cacatgcttt 660 ccggacccgt tcttcattct ctcggggttc tccaccttcc aggcgatgcc gctgggcgga 720 ccggacgata acccactgtc cgtgccgctg cggcagggca gccagggcct gacgcccgga 780 gagggcggcg ccatcatggt gctgaagcgc ctcgaggacg ccgtgcgcga cggcgaccgc 840 atctacggca ccttgctcgg cacgagtctg agcaacgccg ggtgcggcct gccgctgagc 900 ccgcacctgc cgagcgagaa gtcgtgcatg gaggacctgt acacgagcgt cggcatcgac 960 ccaagcgagg tgcagtacgt ggagtgccac gccacgggca ctccgcaggg cgacgtcgtg 1020 gaggtagagg cgctgcgcca ctgctttcga ggtaacacgg accacccgcc gcgcatgggc 1080 tccaccaagg gcaactttgg ccacactctc gtggcggccg ggttcgcagg catggccaag 1140 gtgctgctgt cgatgcagca cggcacgatc ccgcccacgc ccggtgtcga ccgctccaac 1200 tgcatcgacc cgctcgtcgt ggacgaggcc atcccttggc cgtactcgtc ggcgcaggcg 1260 cgggcaggca aaccaggcga tgagctcaag tgcgcctcgc tctccgcctt tggctttggt 1320 ggaaccaacg cgcactgtgt cttccgtgag caccgccaaa ttgctgctac tgcgacagcc 1380 tcgccggtgc ttcccgaggt gactcctgga ccgattgcca tcatcgggat ggacgcgacg 1440 tttggtaccc tcaagggcct ggacgcgttt gagcaggcca tctacaaggg cacggacggc 1500 gccagcgacc tgccgagcaa gcgctggcgg ttcctgggcg ccgacacgga cttcttgacc 1560 gccatgggcc tcgacgccgt gccgcgcggg tgctacgtgc gcgacgtgga cgtggactac 1620 aagcggctgc ggtcgccgat gatccctgag gacgtcctgc gcccgcaaca gctgctggcg 1680 gtggctacga tggaccgcgc gctgcaggac gctggaatgg cgacgggagg caaggtggcg 1740 gtgctggtgg ggctcggcac ggacaccgag ctgtaccggc accgcgcgcg cgtgacactc 1800 aaggagcggc tcgacccggc cgcgttctcg cccgagcagg tgcaggagat gatggactac 1860 atcaacgact gcggcacctc gacgtcgtac acgtcgtaca tcggcaacct cgtggccacg 1920 cgcgtgtcct cgcagtgggg ctttacgggc ccgtccttca ccgtcaccga aggcgcaaac 1980 tcggtctacc gctgcctcga gctgggcaag ttcctgctcg acacgcacca ggtggacgcc 2040 gtcgtggtgg ccggcgtcga cctctgtgcc accgccgaga acctttacct caaggcgcgc 2100 cgctccgcca tcagccgaca ggaccaccct cgcgccaact ttgaggccag cgccgacggg 2160 tactttgccg gcgagggcag cggcgccctg gtcctcaagc gccaggccga cgttggctca 2220 gacgacaagg tctacgccag tgtcgcgggc ctcacgtgcg ccgcgcagcc cgctgaagcc 2280 gtgtcgccgc tactactcca agtccacaac gacgacaacg agaagagggt ggtggagatg 2340 gtggagctcg ccgccgactc gggtcgccat gcgccgcact tggccaactc gccgctgagc 2400 gccgagtcgc agctggagca agtgtccaag ttgctcgcgc accaggtgcc gggctcggtg 2460 gccatcggca gcgtgcgcgc caacgtggga gacgtcgggt acgcctcggg cgccgcgagc 2520 ctcatcaaga cggcgctgtg cctccacaac cgctacctcc cggccaaccc gcagtgggag 2580 cggccggtgg cgccggtctc cgaggcgctg tttacttgcc cgcgctcgcg tgcctggctg 2640 aagaacccgg gcgagtcgcg actggcggct gtcgccagtg cctccgagag cgggtcctgc 2700 tttggcgtgc tcctcacaga cgagtacgcc actcatgaga gcagcaaccg cctctcgctg 2760 gatgacgccg cccccaagct catcgcgatc cgtggcgaca ccgttgacga tatcatggcc 2820 aaggtcaacg ccgagctggc gctcctccga gcgcacgccg aaaccgggtc tgctactgac 2880 gacgacccag ctgctgctgt cgctttcact gctcatcgct tgcgcttttt gcggctcgta 2940 ggggagacgg tggctagtca cggtgccacg gcgaccttgt gtttggccct gctgacaacg 3000 ccggagaagc tggagaagga gttggagctg gcagccaagg gtgtaccgcg aagcgccaag 3060 gccgggcgca actggatgtc gccatcgggc agcgcctttg cgccgacacc tgtgaccagc 3120 gaccgcgtcg cgttcatgta cggcgagggc cgcagcccct actacggcgt cgggctcgac 3180 ctgcaccgcc tgtggccggc tttgcacgag cgcatcaacg acaagaccgc ggcgctgtgg 3240 gagaacggcg actcgtggct catgccgcgc gcggtggatg ccgactcgca gcgcgccgtg 3300 cagacggcct ttgacgcgga ccagatcgag atgttccgca cgggcatctt cgtgtccatc 3360 tgcctcaccg actacgcgcg cgacgtgctc ggggtgcagc ccaaggcgtg cttcggcctc 3420 agcctcggcg agatctccat gctctttgcg ctgtcgcgac gcaactgcgg cctgtcggac 3480 cagctcacgc agcgcctacg cacctcgccg gtgtggtcga cacagctggc ggtggagttc 3540 caggccttgc gcaagctatg gaacgtgccg gcggacgccc ccgtggagtc cttctggcag 3600 ggctacttgg ttcgcgccag ccgcgccgaa atcgagaagg cgatcgggcc cgacaaccgc 3660 ttcgtgcgcc tgctgatcgt caacgactcg agcagcgcgc tgatcgccgg caaacctgcc 3720 gagtgtctgc gcgtgctgga gcgcctgggc gggcggttgc cgccgatgcc cgtcaagcaa 3780 ggcatgattg ggcactgccc cgaagtggcg ccctacacgc cgggcatcgc gcacatccac 3840 gagattttgg agattccgga cagccccgtc aagatgtaca cctcggtcac caacgccgag 3900 ctgcgcgggg gcagcaacag cagcatcacc gagttcgtgc agaagttgta cacgcgcatc 3960 gccgactttc cgggcatcgt cgacaaggtc agccgtgacg gccacgatgt cttcgtcgag 4020 gtggggccga acaacatgcg ctccgccgcg gtcagtgaca ttcttggcaa ggctgccacc 4080 ccgcatgtct ccgtggcgct ggaccgcccc agtgagtcgg cgtggacgca gaccctcaag 4140 tcgctggcgc tgctgaccgc ccaccgcgtg cccctgcaca acccgactct gtttgcggac 4200 ctgtaccacc ccacgttcct gacggctatc gactctgcga tgcaggagcc cccgcccaag 4260 cccaaccgct tccttcgcag cgtagaggtc aacgggtact tttgccccga cggcatcagc 4320 aagcaggttg ctgctgcaag tgccaaaccc tcgacgcatt gcatggttcg tttgcaccca 4380 gccaaggcag ttgtggttgc tgctgctggt gctgtggttg ctgattcgac gcccgtggtc 4440 aaggccaagc agacgtcgtc gtcgttgttg gttggggatg acgcctttct gcgctgctac 4500 gacgtggact ggccgctcta catgggcgcc atggcggaag gcatctcgtc ggtagacctg 4560 gtggtcgctg ccgccgaggc ccgcatgctg gcatcattcg gagcggcccg cttgcctatg 4620 gaccaggtgg aactccagat ccgtgagatc cagcaacgca cctccaacgc ctttgctgtc 4680 aacctgatgc cgggtcctga cgaggccgcg acggtggacg cgctgctgcg cacgggcgtc 4740 tcaatcgtcg aggcatcggg ctacaccggc gcgctctctg cagacctggt gcgctaccgt 4800 gtcacgggtc tgcgacgaac tagttgcggt gcttctgtgt cggcgactca ccgtgtggtc 4860 gccaaggtgt cgcgcaccga ggtggccgag cactttctgc gcccggcgcc ggccgccgta 4920 ctagaggctt tggtcgccgc caaacagatt acgcccgagc aggccgcgct ggccagccgc 4980 gtcgccatgg ccgacgacgt cgcggtggag gccgactcgg gcgggcacac cgacaaccga 5040 ccgatccacg tgctgctgcc gctcgtggtg gcgcagcgca accgctggcg ccacctggtg 5100 gacacgccag tgcgcgtcgg cgccggcggc gggatcgcct gtccgcgcgc cgcgctgctc 5160 gccttttccc tgggcgccgc ctttgtggtc accgggtccg tcaaccaact ggcccgcgag 5220 gctggcacca gcgacgcggt ccgactactg ctggcgacgg ccacctactc ggacgtggcc 5280 atggcgccgg gcggcgtcca ggtgctcaag aagcagacca tgttcgccgc gcgggccacg 5340 atgctcgccc agctgcaggc caagttcggc tcctttgacg ccgtgccgga gccgcagctg 5400 cgcaagctcg agcgctccgt gttcaagcag tccgtggcgg acgtgtgggc tgctgcacgc 5460 gaaaagtttg gtgtcgacgc taccgctgca agtccgcagg agaggatggc gctctgtgtg 5520 cgctggtaca tgtcgcagtc gtcgcgatgg gctaccgagg cgacgtccgc gcgcaaggcg 5580 gactaccaga tctggtgcgg ccccgccatc ggcagcttca acgacttcgt tcgcggcacc 5640 aagctggacg cgaccgctgg caccggcgag tttccgcgcg tcgtggacat caaccagcac 5700 atcctcctcg gagcctcgca ctaccgccgc gtgcagcaac aacaacagga cgacgacgta 5760 gaatacatca tcgtataa 5778 <210> 4 <211> 1925 <212> PRT <213> Schizochytrium sp. <400> 4 Met Pro Cys Asp Asn Ile Ala Val Val Gly Met Ala Val Gln Tyr Ala 1 5 10 15 Gly Cys Lys Asn Gln Asp Glu Phe Trp Asp Thr Leu Met Arg Lys Glu 20 25 30 Ile Asn Ser Ser Pro Ile Ser Ala Glu Arg Leu Gly Thr Arg Tyr Arg 35 40 45 Asp Leu His Phe His Pro Gln Arg Ser Lys Tyr Ala Asp Thr Phe Cys 50 55 60 Asn Asp Arg Tyr Gly Cys Val Asp Ala Ser Val Asp Asn Glu His Asp 65 70 75 80 Leu Leu Ala Asp Leu Ala Arg Arg Ala Leu Leu Asp Ala Gly Ile Asn 85 90 95 Leu Asp Asp Ala Ser Thr Thr Ala Asn Leu Arg Asp Phe Gly Ile Val 100 105 110 Ser Gly Cys Leu Ser Phe Pro Met Asp Asn Leu Gln Gly Glu Leu Leu 115 120 125 Asn Leu Tyr Gln Val His Val Glu Asn Arg Val Gly Ala Gln Arg Phe 130 135 140 Arg Asp Ser Arg Pro Trp Ser Glu Arg Pro Arg Ala Val Ser Pro Glu 145 150 155 160 Ala Ser Asp Pro Arg Val Tyr Ser Asp Pro Ala Ser Phe Val Ala Asn 165 170 175 Gln Leu Gly Leu Gly Pro Val Arg Tyr Ser Leu Asp Ala Ala Cys Ala 180 185 190 Ser Ala Leu Tyr Cys Leu Lys Leu Ala Ser Asp His Leu Leu Ser Arg 195 200 205 Ser Ala Asp Val Met Leu Cys Gly Ala Thr Cys Phe Pro Asp Pro Phe 210 215 220 Phe Ile Leu Ser Gly Phe Ser Thr Phe Gln Ala Met Pro Leu Gly Gly 225 230 235 240 Pro Asp Asp Asn Pro Leu Ser Val Pro Leu Arg Gln Gly Ser Gln Gly 245 250 255 Leu Thr Pro Gly Glu Gly Gly Ala Ile Met Val Leu Lys Arg Leu Glu 260 265 270 Asp Ala Val Arg Asp Gly Asp Arg Ile Tyr Gly Thr Leu Leu Gly Thr 275 280 285 Ser Leu Ser Asn Ala Gly Cys Gly Leu Pro Leu Ser Pro His Leu Pro 290 295 300 Ser Glu Lys Ser Cys Met Glu Asp Leu Tyr Thr Ser Val Gly Ile Asp 305 310 315 320 Pro Ser Glu Val Gln Tyr Val Glu Cys His Ala Thr Gly Thr Pro Gln 325 330 335 Gly Asp Val Val Glu Val Glu Ala Leu Arg His Cys Phe Arg Gly Asn 340 345 350 Thr Asp His Pro Pro Arg Met Gly Ser Thr Lys Gly Asn Phe Gly His 355 360 365 Thr Leu Val Ala Ala Gly Phe Ala Gly Met Ala Lys Val Leu Leu Ser 370 375 380 Met Gln His Gly Thr Ile Pro Pro Thr Pro Gly Val Asp Arg Ser Asn 385 390 395 400 Cys Ile Asp Pro Leu Val Val Asp Glu Ala Ile Pro Trp Pro Tyr Ser 405 410 415 Ser Ala Gln Ala Arg Ala Gly Lys Pro Gly Asp Glu Leu Lys Cys Ala 420 425 430 Ser Leu Ser Ala Phe Gly Phe Gly Gly Thr Asn Ala His Cys Val Phe 435 440 445 Arg Glu His Arg Gln Ile Ala Ala Thr Ala Thr Ala Ser Pro Val Leu 450 455 460 Pro Glu Val Thr Pro Gly Pro Ile Ala Ile Ile Gly Met Asp Ala Thr 465 470 475 480 Phe Gly Thr Leu Lys Gly Leu Asp Ala Phe Glu Gln Ala Ile Tyr Lys 485 490 495 Gly Thr Asp Gly Ala Ser Asp Leu Pro Ser Lys Arg Trp Arg Phe Leu 500 505 510 Gly Ala Asp Thr Asp Phe Leu Thr Ala Met Gly Leu Asp Ala Val Pro 515 520 525 Arg Gly Cys Tyr Val Arg Asp Val Asp Val Asp Tyr Lys Arg Leu Arg 530 535 540 Ser Pro Met Ile Pro Glu Asp Val Leu Arg Pro Gln Gln Leu Leu Ala 545 550 555 560 Val Ala Thr Met Asp Arg Ala Leu Gln Asp Ala Gly Met Ala Thr Gly 565 570 575 Gly Lys Val Ala Val Leu Val Gly Leu Gly Thr Asp Thr Glu Leu Tyr 580 585 590 Arg His Arg Ala Arg Val Thr Leu Lys Glu Arg Leu Asp Pro Ala Ala 595 600 605 Phe Ser Pro Glu Gln Val Gln Glu Met Met Asp Tyr Ile Asn Asp Cys 610 615 620 Gly Thr Ser Thr Ser Tyr Thr Ser Tyr Ile Gly Asn Leu Val Ala Thr 625 630 635 640 Arg Val Ser Ser Gln Trp Gly Phe Thr Gly Pro Ser Phe Thr Val Thr 645 650 655 Glu Gly Ala Asn Ser Val Tyr Arg Cys Leu Glu Leu Gly Lys Phe Leu 660 665 670 Leu Asp Thr His Gln Val Asp Ala Val Val Val Ala Gly Val Asp Leu 675 680 685 Cys Ala Thr Ala Glu Asn Leu Tyr Leu Lys Ala Arg Arg Ser Ala Ile 690 695 700 Ser Arg Gln Asp His Pro Arg Ala Asn Phe Glu Ala Ser Ala Asp Gly 705 710 715 720 Tyr Phe Ala Gly Glu Gly Ser Gly Ala Leu Val Leu Lys Arg Gln Ala 725 730 735 Asp Val Gly Ser Asp Asp Lys Val Tyr Ala Ser Val Ala Gly Leu Thr 740 745 750 Cys Ala Ala Gln Pro Ala Glu Ala Val Ser Pro Leu Leu Leu Gln Val 755 760 765 His Asn Asp Asp Asn Glu Lys Arg Val Val Glu Met Val Glu Leu Ala 770 775 780 Ala Asp Ser Gly Arg His Ala Pro His Leu Ala Asn Ser Pro Leu Ser 785 790 795 800 Ala Glu Ser Gln Leu Glu Gln Val Ser Lys Leu Leu Ala His Gln Val 805 810 815 Pro Gly Ser Val Ala Ile Gly Ser Val Arg Ala Asn Val Gly Asp Val 820 825 830 Gly Tyr Ala Ser Gly Ala Ala Ser Leu Ile Lys Thr Ala Leu Cys Leu 835 840 845 His Asn Arg Tyr Leu Pro Ala Asn Pro Gln Trp Glu Arg Pro Val Ala 850 855 860 Pro Val Ser Glu Ala Leu Phe Thr Cys Pro Arg Ser Arg Ala Trp Leu 865 870 875 880 Lys Asn Pro Gly Glu Ser Arg Leu Ala Ala Val Ala Ser Ala Ser Glu 885 890 895 Ser Gly Ser Cys Phe Gly Val Leu Leu Thr Asp Glu Tyr Ala Thr His 900 905 910 Glu Ser Ser Asn Arg Leu Ser Leu Asp Asp Ala Ala Pro Lys Leu Ile 915 920 925 Ala Ile Arg Gly Asp Thr Val Asp Asp Ile Met Ala Lys Val Asn Ala 930 935 940 Glu Leu Ala Leu Leu Arg Ala His Ala Glu Thr Gly Ser Ala Thr Asp 945 950 955 960 Asp Asp Pro Ala Ala Ala Val Ala Phe Thr Ala His Arg Leu Arg Phe 965 970 975 Leu Arg Leu Val Gly Glu Thr Val Ala Ser His Gly Ala Thr Ala Thr 980 985 990 Leu Cys Leu Ala Leu Leu Thr Thr Pro Glu Lys Leu Glu Lys Glu Leu 995 1000 1005 Glu Leu Ala Ala Lys Gly Val Pro Arg Ser Ala Lys Ala Gly Arg 1010 1015 1020 Asn Trp Met Ser Pro Ser Gly Ser Ala Phe Ala Pro Thr Pro Val 1025 1030 1035 Thr Ser Asp Arg Val Ala Phe Met Tyr Gly Glu Gly Arg Ser Pro 1040 1045 1050 Tyr Tyr Gly Val Gly Leu Asp Leu His Arg Leu Trp Pro Ala Leu 1055 1060 1065 His Glu Arg Ile Asn Asp Lys Thr Ala Ala Leu Trp Glu Asn Gly 1070 1075 1080 Asp Ser Trp Leu Met Pro Arg Ala Val Asp Ala Asp Ser Gln Arg 1085 1090 1095 Ala Val Gln Thr Ala Phe Asp Ala Asp Gln Ile Glu Met Phe Arg 1100 1105 1110 Thr Gly Ile Phe Val Ser Ile Cys Leu Thr Asp Tyr Ala Arg Asp 1115 1120 1125 Val Leu Gly Val Gln Pro Lys Ala Cys Phe Gly Leu Ser Leu Gly 1130 1135 1140 Glu Ile Ser Met Leu Phe Ala Leu Ser Arg Arg Asn Cys Gly Leu 1145 1150 1155 Ser Asp Gln Leu Thr Gln Arg Leu Arg Thr Ser Pro Val Trp Ser 1160 1165 1170 Thr Gln Leu Ala Val Glu Phe Gln Ala Leu Arg Lys Leu Trp Asn 1175 1180 1185 Val Pro Ala Asp Ala Pro Val Glu Ser Phe Trp Gln Gly Tyr Leu 1190 1195 1200 Val Arg Ala Ser Arg Ala Glu Ile Glu Lys Ala Ile Gly Pro Asp 1205 1210 1215 Asn Arg Phe Val Arg Leu Leu Ile Val Asn Asp Ser Ser Ser Ala 1220 1225 1230 Leu Ile Ala Gly Lys Pro Ala Glu Cys Leu Arg Val Leu Glu Arg 1235 1240 1245 Leu Gly Gly Arg Leu Pro Pro Met Pro Val Lys Gln Gly Met Ile 1250 1255 1260 Gly His Cys Pro Glu Val Ala Pro Tyr Thr Pro Gly Ile Ala His 1265 1270 1275 Ile His Glu Ile Leu Glu Ile Pro Asp Ser Pro Val Lys Met Tyr 1280 1285 1290 Thr Ser Val Thr Asn Ala Glu Leu Arg Gly Gly Ser Asn Ser Ser 1295 1300 1305 Ile Thr Glu Phe Val Gln Lys Leu Tyr Thr Arg Ile Ala Asp Phe 1310 1315 1320 Pro Gly Ile Val Asp Lys Val Ser Arg Asp Gly His Asp Val Phe 1325 1330 1335 Val Glu Val Gly Pro Asn Asn Met Arg Ser Ala Ala Val Ser Asp 1340 1345 1350 Ile Leu Gly Lys Ala Ala Thr Pro His Val Ser Val Ala Leu Asp 1355 1360 1365 Arg Pro Ser Glu Ser Ala Trp Thr Gln Thr Leu Lys Ser Leu Ala 1370 1375 1380 Leu Leu Thr Ala His Arg Val Pro Leu His Asn Pro Thr Leu Phe 1385 1390 1395 Ala Asp Leu Tyr His Pro Thr Phe Leu Thr Ala Ile Asp Ser Ala 1400 1405 1410 Met Gln Glu Pro Pro Pro Lys Pro Asn Arg Phe Leu Arg Ser Val 1415 1420 1425 Glu Val Asn Gly Tyr Phe Cys Pro Asp Gly Ile Ser Lys Gln Val 1430 1435 1440 Ala Ala Ala Ser Ala Lys Pro Ser Thr His Cys Met Val Arg Leu 1445 1450 1455 His Pro Ala Lys Ala Val Val Val Ala Ala Ala Gly Ala Val Val 1460 1465 1470 Ala Asp Ser Thr Pro Val Val Lys Ala Lys Gln Thr Ser Ser Ser 1475 1480 1485 Leu Leu Val Gly Asp Asp Ala Phe Leu Arg Cys Tyr Asp Val Asp 1490 1495 1500 Trp Pro Leu Tyr Met Gly Ala Met Ala Glu Gly Ile Ser Ser Val 1505 1510 1515 Asp Leu Val Val Ala Ala Ala Glu Ala Arg Met Leu Ala Ser Phe 1520 1525 1530 Gly Ala Ala Arg Leu Pro Met Asp Gln Val Glu Leu Gln Ile Arg 1535 1540 1545 Glu Ile Gln Gln Arg Thr Ser Asn Ala Phe Ala Val Asn Leu Met 1550 1555 1560 Pro Gly Pro Asp Glu Ala Ala Thr Val Asp Ala Leu Leu Arg Thr 1565 1570 1575 Gly Val Ser Ile Val Glu Ala Ser Gly Tyr Thr Gly Ala Leu Ser 1580 1585 1590 Ala Asp Leu Val Arg Tyr Arg Val Thr Gly Leu Arg Arg Thr Ser 1595 1600 1605 Cys Gly Ala Ser Val Ser Ala Thr His Arg Val Val Ala Lys Val 1610 1615 1620 Ser Arg Thr Glu Val Ala Glu His Phe Leu Arg Pro Ala Pro Ala 1625 1630 1635 Ala Val Leu Glu Ala Leu Val Ala Ala Lys Gln Ile Thr Pro Glu 1640 1645 1650 Gln Ala Ala Leu Ala Ser Arg Val Ala Met Ala Asp Asp Val Ala 1655 1660 1665 Val Glu Ala Asp Ser Gly Gly His Thr Asp Asn Arg Pro Ile His 1670 1675 1680 Val Leu Leu Pro Leu Val Val Ala Gln Arg Asn Arg Trp Arg His 1685 1690 1695 Leu Val Asp Thr Pro Val Arg Val Gly Ala Gly Gly Gly Ile Ala 1700 1705 1710 Cys Pro Arg Ala Ala Leu Leu Ala Phe Ser Leu Gly Ala Ala Phe 1715 1720 1725 Val Val Thr Gly Ser Val Asn Gln Leu Ala Arg Glu Ala Gly Thr 1730 1735 1740 Ser Asp Ala Val Arg Leu Leu Leu Ala Thr Ala Thr Tyr Ser Asp 1745 1750 1755 Val Ala Met Ala Pro Gly Gly Val Gln Val Leu Lys Lys Gln Thr 1760 1765 1770 Met Phe Ala Ala Arg Ala Thr Met Leu Ala Gln Leu Gln Ala Lys 1775 1780 1785 Phe Gly Ser Phe Asp Ala Val Pro Glu Pro Gln Leu Arg Lys Leu 1790 1795 1800 Glu Arg Ser Val Phe Lys Gln Ser Val Ala Asp Val Trp Ala Ala 1805 1810 1815 Ala Arg Glu Lys Phe Gly Val Asp Ala Thr Ala Ala Ser Pro Gln 1820 1825 1830 Glu Arg Met Ala Leu Cys Val Arg Trp Tyr Met Ser Gln Ser Ser 1835 1840 1845 Arg Trp Ala Thr Glu Ala Thr Ser Ala Arg Lys Ala Asp Tyr Gln 1850 1855 1860 Ile Trp Cys Gly Pro Ala Ile Gly Ser Phe Asn Asp Phe Val Arg 1865 1870 1875 Gly Thr Lys Leu Asp Ala Thr Ala Gly Thr Gly Glu Phe Pro Arg 1880 1885 1890 Val Val Asp Ile Asn Gln His Ile Leu Leu Gly Ala Ser His Tyr 1895 1900 1905 Arg Arg Val Gln Gln Gln Gln Gln Asp Asp Asp Val Glu Tyr Ile 1910 1915 1920 Ile Val 1925 <210> 5 <211> 4308 <212> DNA <213> Schizochytrium sp. <400> 5 atgacatcat cgaagaagac tcccgtgtgg gagatgagca aggaggagct gctggacggc 60 aagacggtgg tcttcgacta caacgagctg ctcgaattcg ccgagggcga cgtgggccaa 120 gtgttcggac ccgagttcga catcatcgac aagtaccggc gtcgcgtgcg gctgccggcg 180 cgcgagtacc tgctcgtgtc gcgcgtgacg ctgatggacg ccgaggtgaa caacttccgc 240 gtcgggtcgc gcatggtgac cgagtacgac gtgcccgtga acggggagct gtcggagggc 300 ggggacgtgc cgtgggcggt gctggtggag tcggggcagt gcgacctgat gctcatctcg 360 tacatgggca tcgacttcca gtgcaagggc gaccgcgtgt accgcctgct caacacatcg 420 ctcaccttct tcggggtggc gcacgagggc gagacgctgg tgtacgacat ccgcgtcacg 480 gggttcgcca agggcgcggg cggggagatc tcgatgttct tcttcgagta cgactgcttc 540 gtggacggcc gcctgctgat cgagatgcgc gacgggtgcg ccgggttctt cacggacgcc 600 gagctggccg ccggcaaggg cgtgcttaag accaaggcgg agctggcggc gcgcgcgcag 660 atccagaagc aggacatcgc gccctttgcg ccggcgccgt gctcgcacaa gacctcgctg 720 gacgcgcgcg agatgcggct gctcgtggac cgccagtggg cgcgcgtctt cggcagcggc 780 atggcgggca tcgactacaa gttgtgcgct cgcaagatgc tcatgatcga ccgcgtcacg 840 cacctcgacc cgcgcggcgg cgcgcacggc ctcgggctgc tgatcgggga gaaggtgctg 900 gagcgcgacc actggtactt cccctgccac tttgtgcgcg acgaggtgat ggccgggtcg 960 ctggtcagcg acggctgctc gcagctcctc aaggtgtaca tgctgtggct cggcctgcac 1020 acgaccgtgg gcgcgttcga ctttcgtccc gtgagcgggc acgccaacaa ggtgcggtgc 1080 cgcgggcaga tctcaccgca caagggcaag ctcgtgtacg tgatggagat caaggaaatg 1140 ggctttgacg cgaagacggg cgatccgttt gcgatcgcgg acgtggacat catcgacgtc 1200 aacttcgagg agggacaggc gtttgcggga gtggaagacc tgcacagcta cggccagggc 1260 gacctccgca agaagatcgt cgtcgacttc aagggcatcg cgctctccct gcagaagcgg 1320 aaggagcagc agaaggaaag catgaccgtg actacgacga cgacgacgac gagccgggtg 1380 attgcgccgc ccagcgggtg cctcaagggc gacccgacgg cgccgacgag cgtgacgtgg 1440 cacccgatgg cggagggcaa cggcgggccc ggaccgacgc cgtcgttctc gccgtccgcg 1500 tacccgccgc gggcggtgtg cttctcgccg ttccccaaca acccgcttga caacgaccac 1560 acgccgggcc agatgccgtt gacctggttc aacatgtccg aattcatgtg cggcaaagtg 1620 tccaactgcc tgggccccga gtttgcgcgc ttcgacgcga gcaagacgag ccgcagcccg 1680 gcctttgacc tggcgctcgt gacgcgggtg acgagcgtgg cggacatgga gcacgggccg 1740 ttctacaacg tggacgtcaa cccgggccag ggcacgatgg tgggcgagtt cgactgtccc 1800 gcggacgcgt ggttcttcgg cgcctcgagc cgcgacgacc acatgccgta ctcgatcctg 1860 atggagatcg cgctgcagac gtcgggcgtc ctcacctcgg tgctcaaggc gccgctgacg 1920 atggacaagg acgacatcct cttccgcaac ctcgacgcag acgccgagct cgtgggcgac 1980 gccatgccgg acgtgcgcgg caagacgatc cgcaacttca ccaagtgcac aggctacagc 2040 atgctcggca agatgggcat ccaccgcttc acctttgagc tcagcgtcga cggcgccgtc 2100 ttctacaagg gcagcacctc gtttggctgg ttcgtccccg aggtcttcga gtcgcagacc 2160 ggtctcgaca acggcaagcc gcgcctgcct tggtaccgcg agaacaacgt cgccgtcgac 2220 acgctctccg cgcccgcctc cgcttcctcc gcgcaaggtc agctgcagct gcagcgacgc 2280 gggtcgcagg cgcagttcct ggacacaatc cacctggcgg gcagcggcgc cggcgtgcac 2340 ggccagggct acgcgcacgg ggagaaggcc gtgaacaagc aagattggtt cttctcgtgc 2400 cacttctggt tcgaccccgt gatgcccggg tccctgggca tcgagtcgat gttccagctc 2460 gtcgaggcgt ggtgcgtgaa gcagggactc gcggcgcggc acggcatcgc tcacccagtg 2520 ttcgcgcacg cgcccggggc cacgagctgg aagtaccgcg ggcagctaac ccccaagaac 2580 gaccgcatgg acagcgaggt gcacatcaag tcggtggcgg ccttctcctc ctgggtcgac 2640 gtcgtcgcgg acgggttcct cttcgtcgac ggcctccgcg tctactcggc agacaacctc 2700 cgcgtccgca tccagaccgg cgccggccac gttgaagagc aagaggttgc tgccaaggcc 2760 acaaccaaga acagcagtat tgctgatgtg gacgtggcgg acctgcaagc gctcaagcag 2820 gcgttgctga cgctggagcg accgctgcag ctggacgcgg ggagcgaggt gcccgcctgc 2880 gcggtgagcg acctgggcga taggggcttc atggagacgt acggggtggt ggcgccgctg 2940 tacagcgggg cgatggccaa gggcatcgcg tcggcggacc tggtgatcgc gatgggccag 3000 cgcaagatgc tggggtcgtt tggcgcgggc gggctcccga tgcacgtcgt gcgcgcgggg 3060 attgagaaga tccaggcagc gctgccagcg gggccatacg cggtcaacct gattcactcg 3120 ccttttgacg ccaacctgga gaagggcaac gtggacctct tcctggagaa gggcgtgcgc 3180 gtcgtggagg cgtcggcctt catggagctc acgccccagg tggtgcgcta ccgcgcgacg 3240 ggcctctctc gcgacgcgcg cggcggctcc gtgcgcacgg cccacaagat catcggcaag 3300 gtcagccgca ccgagctggc cgagatgttt atccggcccg cgccgcaagc cattctcgac 3360 aagcttgtgg cgtccggcga gatcaccccc gagcaggcgg cgctggcgct cgaggtgccc 3420 atggcggacg acatcgccgt cgaggccgat tcgggcgggc acaccgacaa ccgccccatc 3480 cacgtcatcc tgcccctcat cctcagcctg cgcaaccgcc tccagcgcga gctcaagtac 3540 cctgcgcgac accgcgtgcg cgtcggcgcc gggggcggca tcgggtgccc gcaagcggct 3600 ctgggcgcct tccacatggg cgccgcgttt gtggtgacgg gcacggtcaa ccagctgagc 3660 cggcaggccg ggacatgcga caatgtgcgg cggcagctgt cgcgcgcgac gtactcggac 3720 atcacgatgg cgccggcggc ggacatgttc gagcagggcg tcgagctgca ggtgctcaag 3780 aagggcacga tgtttccctc gcgcgccaag aagctgttcg agctgtttca caagtacgac 3840 tcgttcgagg cgatgccggc ggacgagctg gcgcgcgtcg agaagcgcat cttcagcaag 3900 tcactcgccg aggtgtgggc cgagaccaag gacttctaca tcacgcggct caacaacccg 3960 gagaagatcc gcaaggcgga gaacgaggac cccaagctca agatgtcact ctgcttccgc 4020 tggtacctcg ggctcagctc gttctgggcc aacaacggca tcgcggaccg cacgatggac 4080 taccagatct ggtgcggccc tgccatcggc gccttcaacg acttcatcgc cgactcgtac 4140 ctcgacgtgg ccgtctcggg cgagttcccc gacgtcgtgc agatcaacct gcagatcctg 4200 tcgggcgcag cctacctcca gcgcctcctc tccgtcaagc tcgcaccgcg gatcgacgtc 4260 gacaccgagg acgacctctt cacctaccgc cccgaccacg cactctaa 4308 <210> 6 <211> 1435 <212> PRT <213> Schizochytrium sp. <400> 6 Met Thr Ser Ser Lys Lys Thr Pro Val Trp Glu Met Ser Lys Glu Glu 1 5 10 15 Leu Leu Asp Gly Lys Thr Val Val Phe Asp Tyr Asn Glu Leu Leu Glu 20 25 30 Phe Ala Glu Gly Asp Val Gly Gln Val Phe Gly Pro Glu Phe Asp Ile 35 40 45 Ile Asp Lys Tyr Arg Arg Arg Val Arg Leu Pro Ala Arg Glu Tyr Leu 50 55 60 Leu Val Ser Arg Val Thr Leu Met Asp Ala Glu Val Asn Asn Phe Arg 65 70 75 80 Val Gly Ser Arg Met Val Thr Glu Tyr Asp Val Pro Val Asn Gly Glu 85 90 95 Leu Ser Glu Gly Gly Asp Val Pro Trp Ala Val Leu Val Glu Ser Gly 100 105 110 Gln Cys Asp Leu Met Leu Ile Ser Tyr Met Gly Ile Asp Phe Gln Cys 115 120 125 Lys Gly Asp Arg Val Tyr Arg Leu Leu Asn Thr Ser Leu Thr Phe Phe 130 135 140 Gly Val Ala His Glu Gly Glu Thr Leu Val Tyr Asp Ile Arg Val Thr 145 150 155 160 Gly Phe Ala Lys Gly Ala Gly Gly Glu Ile Ser Met Phe Phe Phe Glu 165 170 175 Tyr Asp Cys Phe Val Asp Gly Arg Leu Leu Ile Glu Met Arg Asp Gly 180 185 190 Cys Ala Gly Phe Phe Thr Asp Ala Glu Leu Ala Ala Gly Lys Gly Val 195 200 205 Leu Lys Thr Lys Ala Glu Leu Ala Ala Arg Ala Gln Ile Gln Lys Gln 210 215 220 Asp Ile Ala Pro Phe Ala Pro Ala Pro Cys Ser His Lys Thr Ser Leu 225 230 235 240 Asp Ala Arg Glu Met Arg Leu Leu Val Asp Arg Gln Trp Ala Arg Val 245 250 255 Phe Gly Ser Gly Met Ala Gly Ile Asp Tyr Lys Leu Cys Ala Arg Lys 260 265 270 Met Leu Met Ile Asp Arg Val Thr His Leu Asp Pro Arg Gly Gly Ala 275 280 285 His Gly Leu Gly Leu Leu Ile Gly Glu Lys Val Leu Glu Arg Asp His 290 295 300 Trp Tyr Phe Pro Cys His Phe Val Arg Asp Glu Val Met Ala Gly Ser 305 310 315 320 Leu Val Ser Asp Gly Cys Ser Gln Leu Leu Lys Val Tyr Met Leu Trp 325 330 335 Leu Gly Leu His Thr Thr Val Gly Ala Phe Asp Phe Arg Pro Val Ser 340 345 350 Gly His Ala Asn Lys Val Arg Cys Arg Gly Gln Ile Ser Pro His Lys 355 360 365 Gly Lys Leu Val Tyr Val Met Glu Ile Lys Glu Met Gly Phe Asp Ala 370 375 380 Lys Thr Gly Asp Pro Phe Ala Ile Ala Asp Val Asp Ile Ile Asp Val 385 390 395 400 Asn Phe Glu Glu Gly Gln Ala Phe Ala Gly Val Glu Asp Leu His Ser 405 410 415 Tyr Gly Gln Gly Asp Leu Arg Lys Lys Ile Val Val Asp Phe Lys Gly 420 425 430 Ile Ala Leu Ser Leu Gln Lys Arg Lys Glu Gln Gln Lys Glu Ser Met 435 440 445 Thr Val Thr Thr Thr Thr Thr Thr Thr Ser Arg Val Ile Ala Pro Pro 450 455 460 Ser Gly Cys Leu Lys Gly Asp Pro Thr Ala Pro Thr Ser Val Thr Trp 465 470 475 480 His Pro Met Ala Glu Gly Asn Gly Gly Pro Gly Pro Thr Pro Ser Phe 485 490 495 Ser Pro Ser Ala Tyr Pro Pro Arg Ala Val Cys Phe Ser Pro Phe Pro 500 505 510 Asn Asn Pro Leu Asp Asn Asp His Thr Pro Gly Gln Met Pro Leu Thr 515 520 525 Trp Phe Asn Met Ser Glu Phe Met Cys Gly Lys Val Ser Asn Cys Leu 530 535 540 Gly Pro Glu Phe Ala Arg Phe Asp Ala Ser Lys Thr Ser Arg Ser Pro 545 550 555 560 Ala Phe Asp Leu Ala Leu Val Thr Arg Val Thr Ser Val Ala Asp Met 565 570 575 Glu His Gly Pro Phe Tyr Asn Val Asp Val Asn Pro Gly Gln Gly Thr 580 585 590 Met Val Gly Glu Phe Asp Cys Pro Ala Asp Ala Trp Phe Phe Gly Ala 595 600 605 Ser Ser Arg Asp Asp His Met Pro Tyr Ser Ile Leu Met Glu Ile Ala 610 615 620 Leu Gln Thr Ser Gly Val Leu Thr Ser Val Leu Lys Ala Pro Leu Thr 625 630 635 640 Met Asp Lys Asp Asp Ile Leu Phe Arg Asn Leu Asp Ala Asp Ala Glu 645 650 655 Leu Val Gly Asp Ala Met Pro Asp Val Arg Gly Lys Thr Ile Arg Asn 660 665 670 Phe Thr Lys Cys Thr Gly Tyr Ser Met Leu Gly Lys Met Gly Ile His 675 680 685 Arg Phe Thr Phe Glu Leu Ser Val Asp Gly Ala Val Phe Tyr Lys Gly 690 695 700 Ser Thr Ser Phe Gly Trp Phe Val Pro Glu Val Phe Glu Ser Gln Thr 705 710 715 720 Gly Leu Asp Asn Gly Lys Pro Arg Leu Pro Trp Tyr Arg Glu Asn Asn 725 730 735 Val Ala Val Asp Thr Leu Ser Ala Pro Ala Ser Ala Ser Ser Ala Gln 740 745 750 Gly Gln Leu Gln Leu Gln Arg Arg Gly Ser Gln Ala Gln Phe Leu Asp 755 760 765 Thr Ile His Leu Ala Gly Ser Gly Ala Gly Val His Gly Gln Gly Tyr 770 775 780 Ala His Gly Glu Lys Ala Val Asn Lys Gln Asp Trp Phe Phe Ser Cys 785 790 795 800 His Phe Trp Phe Asp Pro Val Met Pro Gly Ser Leu Gly Ile Glu Ser 805 810 815 Met Phe Gln Leu Val Glu Ala Trp Cys Val Lys Gln Gly Leu Ala Ala 820 825 830 Arg His Gly Ile Ala His Pro Val Phe Ala His Ala Pro Gly Ala Thr 835 840 845 Ser Trp Lys Tyr Arg Gly Gln Leu Thr Pro Lys Asn Asp Arg Met Asp 850 855 860 Ser Glu Val His Ile Lys Ser Val Ala Ala Phe Ser Ser Trp Val Asp 865 870 875 880 Val Val Ala Asp Gly Phe Leu Phe Val Asp Gly Leu Arg Val Tyr Ser 885 890 895 Ala Asp Asn Leu Arg Val Arg Ile Gln Thr Gly Ala Gly His Val Glu 900 905 910 Glu Gln Glu Val Ala Ala Lys Ala Thr Thr Lys Asn Ser Ser Ile Ala 915 920 925 Asp Val Asp Val Ala Asp Leu Gln Ala Leu Lys Gln Ala Leu Leu Thr 930 935 940 Leu Glu Arg Pro Leu Gln Leu Asp Ala Gly Ser Glu Val Pro Ala Cys 945 950 955 960 Ala Val Ser Asp Leu Gly Asp Arg Gly Phe Met Glu Thr Tyr Gly Val 965 970 975 Val Ala Pro Leu Tyr Ser Gly Ala Met Ala Lys Gly Ile Ala Ser Ala 980 985 990 Asp Leu Val Ile Ala Met Gly Gln Arg Lys Met Leu Gly Ser Phe Gly 995 1000 1005 Ala Gly Gly Leu Pro Met His Val Val Arg Ala Gly Ile Glu Lys 1010 1015 1020 Ile Gln Ala Ala Leu Pro Ala Gly Pro Tyr Ala Val Asn Leu Ile 1025 1030 1035 His Ser Pro Phe Asp Ala Asn Leu Glu Lys Gly Asn Val Asp Leu 1040 1045 1050 Phe Leu Glu Lys Gly Val Arg Val Val Glu Ala Ser Ala Phe Met 1055 1060 1065 Glu Leu Thr Pro Gln Val Val Arg Tyr Arg Ala Thr Gly Leu Ser 1070 1075 1080 Arg Asp Ala Arg Gly Gly Ser Val Arg Thr Ala His Lys Ile Ile 1085 1090 1095 Gly Lys Val Ser Arg Thr Glu Leu Ala Glu Met Phe Ile Arg Pro 1100 1105 1110 Ala Pro Gln Ala Ile Leu Asp Lys Leu Val Ala Ser Gly Glu Ile 1115 1120 1125 Thr Pro Glu Gln Ala Ala Leu Ala Leu Glu Val Pro Met Ala Asp 1130 1135 1140 Asp Ile Ala Val Glu Ala Asp Ser Gly Gly His Thr Asp Asn Arg 1145 1150 1155 Pro Ile His Val Ile Leu Pro Leu Ile Leu Ser Leu Arg Asn Arg 1160 1165 1170 Leu Gln Arg Glu Leu Lys Tyr Pro Ala Arg His Arg Val Arg Val 1175 1180 1185 Gly Ala Gly Gly Gly Ile Gly Cys Pro Gln Ala Ala Leu Gly Ala 1190 1195 1200 Phe His Met Gly Ala Ala Phe Val Val Thr Gly Thr Val Asn Gln 1205 1210 1215 Leu Ser Arg Gln Ala Gly Thr Cys Asp Asn Val Arg Arg Gln Leu 1220 1225 1230 Ser Arg Ala Thr Tyr Ser Asp Ile Thr Met Ala Pro Ala Ala Asp 1235 1240 1245 Met Phe Glu Gln Gly Val Glu Leu Gln Val Leu Lys Lys Gly Thr 1250 1255 1260 Met Phe Pro Ser Arg Ala Lys Lys Leu Phe Glu Leu Phe His Lys 1265 1270 1275 Tyr Asp Ser Phe Glu Ala Met Pro Ala Asp Glu Leu Ala Arg Val 1280 1285 1290 Glu Lys Arg Ile Phe Ser Lys Ser Leu Ala Glu Val Trp Ala Glu 1295 1300 1305 Thr Lys Asp Phe Tyr Ile Thr Arg Leu Asn Asn Pro Glu Lys Ile 1310 1315 1320 Arg Lys Ala Glu Asn Glu Asp Pro Lys Leu Lys Met Ser Leu Cys 1325 1330 1335 Phe Arg Trp Tyr Leu Gly Leu Ser Ser Phe Trp Ala Asn Asn Gly 1340 1345 1350 Ile Ala Asp Arg Thr Met Asp Tyr Gln Ile Trp Cys Gly Pro Ala 1355 1360 1365 Ile Gly Ala Phe Asn Asp Phe Ile Ala Asp Ser Tyr Leu Asp Val 1370 1375 1380 Ala Val Ser Gly Glu Phe Pro Asp Val Val Gln Ile Asn Leu Gln 1385 1390 1395 Ile Leu Ser Gly Ala Ala Tyr Leu Gln Arg Leu Leu Ser Val Lys 1400 1405 1410 Leu Ala Pro Arg Ile Asp Val Asp Thr Glu Asp Asp Leu Phe Thr 1415 1420 1425 Tyr Arg Pro Asp His Ala Leu 1430 1435 <210> 7 <211> 1395 <212> DNA <213> Schizochytrium sp. <400> 7 actcgcatcg cgatcgtggg gatgtcggcg atcctgccga gcggggagaa cgtgcgcgag 60 agctgggagg cgatccgcga tgggctggat tgcctgagcg atctgccggc ggaccgcgtg 120 gacgtgacgg cctactacaa cccggagaag acgaccaagg acaagatcta ctgcaagcgc 180 ggcgggttca tcccggagta cgacttcgac gcgcgtgagt tcgggctcaa catgttccag 240 atggaggact cggacgccaa ccagacgatc tcgctgctca aggtgaagga ggcgctgacg 300 gacgccaaca tcccggcgtt ctcgagcggt aagaagaaca tcggctgcgt gctgggcatc 360 ggcggcggcc agaaggcgag ccacgagttc tactcgcggc tcaactacgt ggtcgtggac 420 aaggtgctgc gcaagatggg cctgccggag gaagacgtgg cggcggcggt ggacaagtac 480 aaggcgagtt tccccgagtg gcgcctcgac tctttccccg ggttcctggg caacgtcacg 540 gcggggcgct gctgcaatac cttcaacatg gagggcatga actgcgtcgt ggacgcggcc 600 tgcgcgtcgt cgctgatcgc ggtcaaagtg gcgatcgagg agctgctcta cggcgactgc 660 gatgcgatga tcgcgggtgc cacctgcacg gacaactcga tcgggatgta catggccttc 720 tccaagacgc ccgtgttttc cacggacccg agcgtcaagg cgtacgacgc cgccaccaaa 780 ggcatgctca tcggcgaggg ctcggcgatg ctcgtgctga agcgctacgc ggacgccgtg 840 cgcgacggcg acaccgtgca cgccgtcatc aaggggtgcg cgtcctcgag cgacggcaag 900 gcggcgggca tctacacgcc gacaatctcg ggccaggagg aggccctgcg ccgcgcctac 960 gcccgcgcca atgtcgaccc ggccactgtg acgctggtgg agggccacgg cacgggtacg 1020 ccggtgggcg acaagatcga gctgacggcg ctgagcaacc tcttctccaa ggcgttttct 1080 gccaacggtg gcggcgcgga ggaagcagag caggtggcgg tgggcagcat caagtcgcag 1140 atcgggcacc tcaaggcggt ggccgggctg gccgggctgg tcaaggtggt gctggcgctc 1200 aagcacaaga cgctgccgca gacgatcaac gtcgacaagc cgccgtcgct ggtggacggg 1260 accccgatcc agcagtcgcc gctgtacgtc aacacgatga accgcccctg gttcacgccc 1320 gtaggggtgc cgcgccgcgc cggcgtgtcg tcgtttgggt ttggcggtgc caactaccac 1380 gccgtgctgg aggag 1395 <210> 8 <211> 465 <212> PRT <213> Schizochytrium sp. <400> 8 Thr Arg Ile Ala Ile Val Gly Met Ser Ala Ile Leu Pro Ser Gly Glu 1 5 10 15 Asn Val Arg Glu Ser Trp Glu Ala Ile Arg Asp Gly Leu Asp Cys Leu 20 25 30 Ser Asp Leu Pro Ala Asp Arg Val Asp Val Thr Ala Tyr Tyr Asn Pro 35 40 45 Glu Lys Thr Thr Lys Asp Lys Ile Tyr Cys Lys Arg Gly Gly Phe Ile 50 55 60 Pro Glu Tyr Asp Phe Asp Ala Arg Glu Phe Gly Leu Asn Met Phe Gln 65 70 75 80 Met Glu Asp Ser Asp Ala Asn Gln Thr Ile Ser Leu Leu Lys Val Lys 85 90 95 Glu Ala Leu Thr Asp Ala Asn Ile Pro Ala Phe Ser Ser Gly Lys Lys 100 105 110 Asn Ile Gly Cys Val Leu Gly Ile Gly Gly Gly Gln Lys Ala Ser His 115 120 125 Glu Phe Tyr Ser Arg Leu Asn Tyr Val Val Val Asp Lys Val Leu Arg 130 135 140 Lys Met Gly Leu Pro Glu Glu Asp Val Ala Ala Ala Val Asp Lys Tyr 145 150 155 160 Lys Ala Ser Phe Pro Glu Trp Arg Leu Asp Ser Phe Pro Gly Phe Leu 165 170 175 Gly Asn Val Thr Ala Gly Arg Cys Cys Asn Thr Phe Asn Met Glu Gly 180 185 190 Met Asn Cys Val Val Asp Ala Ala Cys Ala Ser Ser Leu Ile Ala Val 195 200 205 Lys Val Ala Ile Glu Glu Leu Leu Tyr Gly Asp Cys Asp Ala Met Ile 210 215 220 Ala Gly Ala Thr Cys Thr Asp Asn Ser Ile Gly Met Tyr Met Ala Phe 225 230 235 240 Ser Lys Thr Pro Val Phe Ser Thr Asp Pro Ser Val Lys Ala Tyr Asp 245 250 255 Ala Ala Thr Lys Gly Met Leu Ile Gly Glu Gly Ser Ala Met Leu Val 260 265 270 Leu Lys Arg Tyr Ala Asp Ala Val Arg Asp Gly Asp Thr Val His Ala 275 280 285 Val Ile Lys Gly Cys Ala Ser Ser Ser Asp Gly Lys Ala Ala Gly Ile 290 295 300 Tyr Thr Pro Thr Ile Ser Gly Gln Glu Glu Ala Leu Arg Arg Ala Tyr 305 310 315 320 Ala Arg Ala Asn Val Asp Pro Ala Thr Val Thr Leu Val Glu Gly His 325 330 335 Gly Thr Gly Thr Pro Val Gly Asp Lys Ile Glu Leu Thr Ala Leu Ser 340 345 350 Asn Leu Phe Ser Lys Ala Phe Ser Ala Asn Gly Gly Gly Ala Glu Glu 355 360 365 Ala Glu Gln Val Ala Val Gly Ser Ile Lys Ser Gln Ile Gly His Leu 370 375 380 Lys Ala Val Ala Gly Leu Ala Gly Leu Val Lys Val Val Leu Ala Leu 385 390 395 400 Lys His Lys Thr Leu Pro Gln Thr Ile Asn Val Asp Lys Pro Pro Ser 405 410 415 Leu Val Asp Gly Thr Pro Ile Gln Gln Ser Pro Leu Tyr Val Asn Thr 420 425 430 Met Asn Arg Pro Trp Phe Thr Pro Val Gly Val Pro Arg Arg Ala Gly 435 440 445 Val Ser Ser Phe Gly Phe Gly Gly Ala Asn Tyr His Ala Val Leu Glu 450 455 460 Glu 465 <210> 9 <211> 903 <212> DNA <213> Schizochytrium sp. <400> 9 ttctcgggcc agggcgcgca gtacacgcac atgttcagcg acgtggcgat gaactggccc 60 ccgttccgcg agagcgtcgc cgccatggac cgcgcccagc gcgagcgctt cgggcggcct 120 gccaagcgcg tgagcagcgt gctgtacccg cgcaagccgt acggcgacga accgcggcag 180 gaccacaagg agatctcgca aacgcgctac tcgcagcccg caacgctcgc gtgctcggtc 240 ggcgcctttg acatcttcaa agcggcggga ctggcgccga gctttgcggc gggccactcg 300 ctgggcgagt ttgcggcgct ctacgcggcc gggtcgctcg atcgcgacgc cgtcttcgac 360 ctggtctgcg cgcgcgccaa ggccatgagc gacttcacgg cccaggccag cagcagcggt 420 ggcgccatgg cggccgtgat tggcgccaag gcggaccagc tctcgctggg tggcgcgccc 480 gacgtgtggc tcgccaacag caactcgccc tcgcagaccg tgatcacggg aaccgccgaa 540 gcagtggctg cggcctctga caagttgcgc tgcagcggca acttccgcgt cgtgcctctg 600 gcctgcgagg cggccttcca ctcgccgcac atgcgcggcg cggagcagac gtttgcgtcg 660 gcgctcgcgc aggcgcccgt gtcggcaccg gcggctgctc ggttctactc taacgtgacg 720 gggggcgccg cggtaacctc gcccgcggac gtcaaaacga acctgggcaa gcacatgacg 780 agccctgtgc agttcgtgca gcaggtgcga gccatgcacg cggcgggcgc gcgtgtgttt 840 gtggagtttg ggcccaagca ggtcctgtcg cgcctcgtca aggagaccct tggcgaggcc 900 ggc 903 <210> 10 <211> 301 <212> PRT <213> Schizochytrium sp. <400> 10 Phe Ser Gly Gln Gly Ala Gln Tyr Thr His Met Phe Ser Asp Val Ala 1 5 10 15 Met Asn Trp Pro Pro Phe Arg Glu Ser Val Ala Ala Met Asp Arg Ala 20 25 30 Gln Arg Glu Arg Phe Gly Arg Pro Ala Lys Arg Val Ser Ser Val Leu 35 40 45 Tyr Pro Arg Lys Pro Tyr Gly Asp Glu Pro Arg Gln Asp His Lys Glu 50 55 60 Ile Ser Gln Thr Arg Tyr Ser Gln Pro Ala Thr Leu Ala Cys Ser Val 65 70 75 80 Gly Ala Phe Asp Ile Phe Lys Ala Ala Gly Leu Ala Pro Ser Phe Ala 85 90 95 Ala Gly His Ser Leu Gly Glu Phe Ala Ala Leu Tyr Ala Ala Gly Ser 100 105 110 Leu Asp Arg Asp Ala Val Phe Asp Leu Val Cys Ala Arg Ala Lys Ala 115 120 125 Met Ser Asp Phe Thr Ala Gln Ala Ser Ser Ser Gly Gly Ala Met Ala 130 135 140 Ala Val Ile Gly Ala Lys Ala Asp Gln Leu Ser Leu Gly Gly Ala Pro 145 150 155 160 Asp Val Trp Leu Ala Asn Ser Asn Ser Pro Ser Gln Thr Val Ile Thr 165 170 175 Gly Thr Ala Glu Ala Val Ala Ala Ala Ser Asp Lys Leu Arg Cys Ser 180 185 190 Gly Asn Phe Arg Val Val Pro Leu Ala Cys Glu Ala Ala Phe His Ser 195 200 205 Pro His Met Arg Gly Ala Glu Gln Thr Phe Ala Ser Ala Leu Ala Gln 210 215 220 Ala Pro Val Ser Ala Pro Ala Ala Ala Arg Phe Tyr Ser Asn Val Thr 225 230 235 240 Gly Gly Ala Ala Val Thr Ser Pro Ala Asp Val Lys Thr Asn Leu Gly 245 250 255 Lys His Met Thr Ser Pro Val Gln Phe Val Gln Gln Val Arg Ala Met 260 265 270 His Ala Ala Gly Ala Arg Val Phe Val Glu Phe Gly Pro Lys Gln Val 275 280 285 Leu Ser Arg Leu Val Lys Glu Thr Leu Gly Glu Ala Gly 290 295 300 <210> 11 <211> 2103 <212> DNA <213> Schizochytrium sp. <400> 11 tccggcaaca gcaagagcac tcgtggcagt gctgatctgc aagcgctgct ggccaaggcg 60 gagactgtgg tgatggctgt gctggctgcc aagactggct acgaggccga catggttgag 120 gcggacatgg acctggaggc cgagctcggc atcgactcga tcaagcgcgt ggagatcctt 180 tccgaggtgc agggccagct gggcgtcgag gccaaggacg tggatgcgct gagccgcacg 240 cgcacggtcg gtgaggttgt ggacgccatg aaggcggaga tcgtggctgc ctctggtggt 300 agtgctcctg cggttccttc ggcgcccgct gcttctgcag ctccgactcc cgctgcttcg 360 actgcgcctt ctgctgatct gcaagcgctg ctgtccaagg cggagactgt ggtgatggct 420 gtgctggcgg ccaagactgg ctacgaggcc gacatggtcg aggcggacat ggacctggag 480 gccgagctcg gcatcgactc gatcaagcgc gtggagatcc tctcggaggt gcagggccag 540 ctgggcgtcg aggccaagga cgtggatgcg ctgagccgca cgcgcacggt cggtgaggtt 600 gtggatgcca tgaaggcgga aatcgtggct gcctctgctg gtagtgctcc tgctcctgct 660 gttccttcgg cgcccgctgc ttctgcagct ccgactcccg ctgcttcgac tgcgccttct 720 gctgatctgc aagcgctgct gtccaaggcg gagacggtgg tgatggctgt gctggcggcc 780 aagactggct acgaggccga catggtcgag gcggacatgg acctggaggc cgagctcggc 840 atcgactcga tcaagcgcgt ggagatcctc tcggaggtgc agggccagct gggcgtcgag 900 gccaaggacg tggatgcgct gagccgcacg cgcacggtcg gtgaggttgt ggatgccatg 960 aaggcggaaa tcgtggctgc ctctggtggt agtgctcctg ctcctgcggt tccttcggcg 1020 cccgctgctt ctgcagctcc gactcccgcg gctgcgacag cgccttctgc tgatctgcaa 1080 gcgctgctgg ccaaggcgga gactgtggtg atggctgtgc tggcggccaa gactggctac 1140 gaggccgaca tggtcgaggc ggacatggac ctggaggccg agctcggcat cgactcgatc 1200 aagcgcgtgg agatcctttc cgaggtgcag ggccagctgg gcgtcgaggc caaggacgta 1260 gatgcgctga gccgcacgcg cacggtcggt gaggttgtgg atgccatgaa ggcggagatc 1320 gtggctgcct ctgctggtag tgctcctgct cctgctgttc cttcggcgcc cgctgcttct 1380 gcagctccga ctcccgctgc ttcgactgcg ccttctgctg atctgcaagc gctgctgtcc 1440 aaggcggaga ctgtggtgat ggctgtgctg gcggccaaga ctggctacga ggccgacatg 1500 gtcgaggcgg acatggacct ggaggccgag ctcggcatcg actcgatcaa gcgcgtggag 1560 atcctctcgg aggtgcaggg ccagctgggc gtcgaggcca aggacgtgga tgcgctgagc 1620 cgcacgcgca cggtcggtga ggttgtggat gccatgaagg cggaaatcgt ggctgcctct 1680 ggtggtagtg ctcctgctgc tgctgttcct tcggcgcccg ctgcttctgc agctccgact 1740 cctgcgactg cgccttctgc tgatctgcaa gcgctgctgt ccaaggcgga gactgtggtg 1800 atggctgtgc tggcggccaa gactggctac gaggccgaca tggtcgaggc ggacatggac 1860 ctggaggccg agctcggcat cgactcgatc aagcgcgtgg agatcctttc cgaggtgcag 1920 ggccagctgg gcgtcgaggc caaggacgta gatgcgctga gccgcacgcg cacggtcggt 1980 gaagtggtgg acgccatgaa ggcggagatc gtggctgcct ctggtggtag tgctcctgct 2040 gctccttcgg cgcccgcgct tcttccaacg ctgtttggtt ccgagtgcga ggacctgtct 2100 ctg 2103 <210> 12 <211> 701 <212> PRT <213> Schizochytrium sp. <400> 12 Ser Gly Asn Ser Lys Ser Thr Arg Gly Ser Ala Asp Leu Gln Ala Leu 1 5 10 15 Leu Ala Lys Ala Glu Thr Val Val Met Ala Val Leu Ala Ala Lys Thr 20 25 30 Gly Tyr Glu Ala Asp Met Val Glu Ala Asp Met Asp Leu Glu Ala Glu 35 40 45 Leu Gly Ile Asp Ser Ile Lys Arg Val Glu Ile Leu Ser Glu Val Gln 50 55 60 Gly Gln Leu Gly Val Glu Ala Lys Asp Val Asp Ala Leu Ser Arg Thr 65 70 75 80 Arg Thr Val Gly Glu Val Val Asp Ala Met Lys Ala Glu Ile Val Ala 85 90 95 Ala Ser Gly Gly Ser Ala Pro Ala Val Pro Ser Ala Pro Ala Ala Ser 100 105 110 Ala Ala Pro Thr Pro Ala Ala Ser Thr Ala Pro Ser Ala Asp Leu Gln 115 120 125 Ala Leu Leu Ser Lys Ala Glu Thr Val Val Met Ala Val Leu Ala Ala 130 135 140 Lys Thr Gly Tyr Glu Ala Asp Met Val Glu Ala Asp Met Asp Leu Glu 145 150 155 160 Ala Glu Leu Gly Ile Asp Ser Ile Lys Arg Val Glu Ile Leu Ser Glu 165 170 175 Val Gln Gly Gln Leu Gly Val Glu Ala Lys Asp Val Asp Ala Leu Ser 180 185 190 Arg Thr Arg Thr Val Gly Glu Val Val Asp Ala Met Lys Ala Glu Ile 195 200 205 Val Ala Ala Ser Ala Gly Ser Ala Pro Ala Pro Ala Val Pro Ser Ala 210 215 220 Pro Ala Ala Ser Ala Ala Pro Thr Pro Ala Ala Ser Thr Ala Pro Ser 225 230 235 240 Ala Asp Leu Gln Ala Leu Leu Ser Lys Ala Glu Thr Val Val Met Ala 245 250 255 Val Leu Ala Ala Lys Thr Gly Tyr Glu Ala Asp Met Val Glu Ala Asp 260 265 270 Met Asp Leu Glu Ala Glu Leu Gly Ile Asp Ser Ile Lys Arg Val Glu 275 280 285 Ile Leu Ser Glu Val Gln Gly Gln Leu Gly Val Glu Ala Lys Asp Val 290 295 300 Asp Ala Leu Ser Arg Thr Arg Thr Val Gly Glu Val Val Asp Ala Met 305 310 315 320 Lys Ala Glu Ile Val Ala Ala Ser Gly Gly Ser Ala Pro Ala Pro Ala 325 330 335 Val Pro Ser Ala Pro Ala Ala Ser Ala Ala Pro Thr Pro Ala Ala Ala 340 345 350 Thr Ala Pro Ser Ala Asp Leu Gln Ala Leu Leu Ala Lys Ala Glu Thr 355 360 365 Val Val Met Ala Val Leu Ala Ala Lys Thr Gly Tyr Glu Ala Asp Met 370 375 380 Val Glu Ala Asp Met Asp Leu Glu Ala Glu Leu Gly Ile Asp Ser Ile 385 390 395 400 Lys Arg Val Glu Ile Leu Ser Glu Val Gln Gly Gln Leu Gly Val Glu 405 410 415 Ala Lys Asp Val Asp Ala Leu Ser Arg Thr Arg Thr Val Gly Glu Val 420 425 430 Val Asp Ala Met Lys Ala Glu Ile Val Ala Ala Ser Ala Gly Ser Ala 435 440 445 Pro Ala Pro Ala Val Pro Ser Ala Pro Ala Ala Ser Ala Ala Pro Thr 450 455 460 Pro Ala Ala Ser Thr Ala Pro Ser Ala Asp Leu Gln Ala Leu Leu Ser 465 470 475 480 Lys Ala Glu Thr Val Val Met Ala Val Leu Ala Ala Lys Thr Gly Tyr 485 490 495 Glu Ala Asp Met Val Glu Ala Asp Met Asp Leu Glu Ala Glu Leu Gly 500 505 510 Ile Asp Ser Ile Lys Arg Val Glu Ile Leu Ser Glu Val Gln Gly Gln 515 520 525 Leu Gly Val Glu Ala Lys Asp Val Asp Ala Leu Ser Arg Thr Arg Thr 530 535 540 Val Gly Glu Val Val Asp Ala Met Lys Ala Glu Ile Val Ala Ala Ser 545 550 555 560 Gly Gly Ser Ala Pro Ala Ala Ala Val Pro Ser Ala Pro Ala Ala Ser 565 570 575 Ala Ala Pro Thr Pro Ala Thr Ala Pro Ser Ala Asp Leu Gln Ala Leu 580 585 590 Leu Ser Lys Ala Glu Thr Val Val Met Ala Val Leu Ala Ala Lys Thr 595 600 605 Gly Tyr Glu Ala Asp Met Val Glu Ala Asp Met Asp Leu Glu Ala Glu 610 615 620 Leu Gly Ile Asp Ser Ile Lys Arg Val Glu Ile Leu Ser Glu Val Gln 625 630 635 640 Gly Gln Leu Gly Val Glu Ala Lys Asp Val Asp Ala Leu Ser Arg Thr 645 650 655 Arg Thr Val Gly Glu Val Val Asp Ala Met Lys Ala Glu Ile Val Ala 660 665 670 Ala Ser Gly Gly Ser Ala Pro Ala Ala Pro Ser Ala Pro Ala Leu Leu 675 680 685 Pro Thr Leu Phe Gly Ser Glu Cys Glu Asp Leu Ser Leu 690 695 700 <210> 13 <211> 276 <212> DNA <213> Schizochytrium sp. <400> 13 agtgctgatc tgcaagcgct gctggccaag gcggagactg tggtgatggc tgtgctggct 60 gccaagactg gctacgaggc cgacatggtt gaggcggaca tggacctgga ggccgagctc 120 ggcatcgact cgatcaagcg cgtggagatc ctttccgagg tgcagggcca gctgggcgtc 180 gaggccaagg acgtggatgc gctgagccgc acgcgcacgg tcggtgaggt tgtggacgcc 240 atgaaggcgg agatcgtggc tgcctctggt ggtagt 276 <210> 14 <211> 92 <212> PRT <213> Schizochytrium sp. <400> 14 Ser Ala Asp Leu Gln Ala Leu Leu Ala Lys Ala Glu Thr Val Val Met 1 5 10 15 Ala Val Leu Ala Ala Lys Thr Gly Tyr Glu Ala Asp Met Val Glu Ala 20 25 30 Asp Met Asp Leu Glu Ala Glu Leu Gly Ile Asp Ser Ile Lys Arg Val 35 40 45 Glu Ile Leu Ser Glu Val Gln Gly Gln Leu Gly Val Glu Ala Lys Asp 50 55 60 Val Asp Ala Leu Ser Arg Thr Arg Thr Val Gly Glu Val Val Asp Ala 65 70 75 80 Met Lys Ala Glu Ile Val Ala Ala Ser Gly Gly Ser 85 90 <210> 15 <211> 276 <212> DNA <213> Schizochytrium sp. <400> 15 tctgctgatc tgcaagcgct gctgtccaag gcggagactg tggtgatggc tgtgctggcg 60 gccaagactg gctacgaggc cgacatggtc gaggcggaca tggacctgga ggccgagctc 120 ggcatcgact cgatcaagcg cgtggagatc ctctcggagg tgcagggcca gctgggcgtc 180 gaggccaagg acgtggatgc gctgagccgc acgcgcacgg tcggtgaggt tgtggatgcc 240 atgaaggcgg aaatcgtggc tgcctctgct ggtagt 276 <210> 16 <211> 92 <212> PRT <213> Schizochytrium sp. <400> 16 Ser Ala Asp Leu Gln Ala Leu Leu Ser Lys Ala Glu Thr Val Val Met 1 5 10 15 Ala Val Leu Ala Ala Lys Thr Gly Tyr Glu Ala Asp Met Val Glu Ala 20 25 30 Asp Met Asp Leu Glu Ala Glu Leu Gly Ile Asp Ser Ile Lys Arg Val 35 40 45 Glu Ile Leu Ser Glu Val Gln Gly Gln Leu Gly Val Glu Ala Lys Asp 50 55 60 Val Asp Ala Leu Ser Arg Thr Arg Thr Val Gly Glu Val Val Asp Ala 65 70 75 80 Met Lys Ala Glu Ile Val Ala Ala Ser Ala Gly Ser 85 90 <210> 17 <211> 276 <212> DNA <213> Schizochytrium sp. <400> 17 tctgctgatc tgcaagcgct gctgtccaag gcggagacgg tggtgatggc tgtgctggcg 60 gccaagactg gctacgaggc cgacatggtc gaggcggaca tggacctgga ggccgagctc 120 ggcatcgact cgatcaagcg cgtggagatc ctctcggagg tgcagggcca gctgggcgtc 180 gaggccaagg acgtggatgc gctgagccgc acgcgcacgg tcggtgaggt tgtggatgcc 240 atgaaggcgg aaatcgtggc tgcctctggt ggtagt 276 <210> 18 <211> 92 <212> PRT <213> Schizochytrium sp. <400> 18 Ser Ala Asp Leu Gln Ala Leu Leu Ser Lys Ala Glu Thr Val Val Met 1 5 10 15 Ala Val Leu Ala Ala Lys Thr Gly Tyr Glu Ala Asp Met Val Glu Ala 20 25 30 Asp Met Asp Leu Glu Ala Glu Leu Gly Ile Asp Ser Ile Lys Arg Val 35 40 45 Glu Ile Leu Ser Glu Val Gln Gly Gln Leu Gly Val Glu Ala Lys Asp 50 55 60 Val Asp Ala Leu Ser Arg Thr Arg Thr Val Gly Glu Val Val Asp Ala 65 70 75 80 Met Lys Ala Glu Ile Val Ala Ala Ser Gly Gly Ser 85 90 <210> 19 <211> 276 <212> DNA <213> Schizochytrium sp. <400> 19 tctgctgatc tgcaagcgct gctggccaag gcggagactg tggtgatggc tgtgctggcg 60 gccaagactg gctacgaggc cgacatggtc gaggcggaca tggacctgga ggccgagctc 120 ggcatcgact cgatcaagcg cgtggagatc ctttccgagg tgcagggcca gctgggcgtc 180 gaggccaagg acgtagatgc gctgagccgc acgcgcacgg tcggtgaggt tgtggatgcc 240 atgaaggcgg agatcgtggc tgcctctgct ggtagt 276 <210> 20 <211> 92 <212> PRT <213> Schizochytrium sp. <400> 20 Ser Ala Asp Leu Gln Ala Leu Leu Ala Lys Ala Glu Thr Val Val Met 1 5 10 15 Ala Val Leu Ala Ala Lys Thr Gly Tyr Glu Ala Asp Met Val Glu Ala 20 25 30 Asp Met Asp Leu Glu Ala Glu Leu Gly Ile Asp Ser Ile Lys Arg Val 35 40 45 Glu Ile Leu Ser Glu Val Gln Gly Gln Leu Gly Val Glu Ala Lys Asp 50 55 60 Val Asp Ala Leu Ser Arg Thr Arg Thr Val Gly Glu Val Val Asp Ala 65 70 75 80 Met Lys Ala Glu Ile Val Ala Ala Ser Ala Gly Ser 85 90 <210> 21 <211> 276 <212> DNA <213> Schizochytrium sp. <400> 21 tctgctgatc tgcaagcgct gctgtccaag gcggagactg tggtgatggc tgtgctggcg 60 gccaagactg gctacgaggc cgacatggtc gaggcggaca tggacctgga ggccgagctc 120 ggcatcgact cgatcaagcg cgtggagatc ctctcggagg tgcagggcca gctgggcgtc 180 gaggccaagg acgtggatgc gctgagccgc acgcgcacgg tcggtgaggt tgtggatgcc 240 atgaaggcgg aaatcgtggc tgcctctggt ggtagt 276 <210> 22 <211> 92 <212> PRT <213> Schizochytrium sp. <400> 22 Ser Ala Asp Leu Gln Ala Leu Leu Ser Lys Ala Glu Thr Val Val Met 1 5 10 15 Ala Val Leu Ala Ala Lys Thr Gly Tyr Glu Ala Asp Met Val Glu Ala 20 25 30 Asp Met Asp Leu Glu Ala Glu Leu Gly Ile Asp Ser Ile Lys Arg Val 35 40 45 Glu Ile Leu Ser Glu Val Gln Gly Gln Leu Gly Val Glu Ala Lys Asp 50 55 60 Val Asp Ala Leu Ser Arg Thr Arg Thr Val Gly Glu Val Val Asp Ala 65 70 75 80 Met Lys Ala Glu Ile Val Ala Ala Ser Gly Gly Ser 85 90 <210> 23 <211> 276 <212> DNA <213> Schizochytrium sp. <400> 23 tctgctgatc tgcaagcgct gctgtccaag gcggagactg tggtgatggc tgtgctggcg 60 gccaagactg gctacgaggc cgacatggtc gaggcggaca tggacctgga ggccgagctc 120 ggcatcgact cgatcaagcg cgtggagatc ctttccgagg tgcagggcca gctgggcgtc 180 gaggccaagg acgtagatgc gctgagccgc acgcgcacgg tcggtgaagt ggtggacgcc 240 atgaaggcgg agatcgtggc tgcctctggt ggtagt 276 <210> 24 <211> 92 <212> PRT <213> Schizochytrium sp. <400> 24 Ser Ala Asp Leu Gln Ala Leu Leu Ser Lys Ala Glu Thr Val Val Met 1 5 10 15 Ala Val Leu Ala Ala Lys Thr Gly Tyr Glu Ala Asp Met Val Glu Ala 20 25 30 Asp Met Asp Leu Glu Ala Glu Leu Gly Ile Asp Ser Ile Lys Arg Val 35 40 45 Glu Ile Leu Ser Glu Val Gln Gly Gln Leu Gly Val Glu Ala Lys Asp 50 55 60 Val Asp Ala Leu Ser Arg Thr Arg Thr Val Gly Glu Val Val Asp Ala 65 70 75 80 Met Lys Ala Glu Ile Val Ala Ala Ser Gly Gly Ser 85 90 <210> 25 <211> 2178 <212> DNA <213> Schizochytrium sp. <400> 25 gcgctacagg cggcgctcac gtccgtcgag gcgcagttcg gcaaggtggg tggctttgtg 60 ttccagttcg gcgacgacga cgtgcaagcg cagctcggct gggcgctgct cgcggccaag 120 cacctcaaaa cttcgctgtc agaacagatc gagggcggtc gcaccttttt cgtggccgtc 180 gcgcggctcg acggccagct ggggctctcc ggcaagtcga cgaccgctac cgttgatctc 240 tcccgcgcgc agcagggcag cgtgttcggc ctgtgcaaga cactcgacct ggagtggccc 300 gctgtcttct gccgcggaat cgacctggcc gccgacctcg acgccgcaca ggccgcgcgg 360 tgcctgctgg gcgagctgtc agaccccgac gtggccgtgc gcgagtctgg ttactccgcc 420 tcgggccagc gctgcacgac aactacgaag tcgctgacta cgggcaagcc gcaccagccg 480 atctcctcgt cggacctctt tctggtgtcg ggcggcgcgc gcggcatcac cccgctgtgc 540 gtgcgcgagc tggcgcagcg cgtgggcggc ggcacgtacg tgctcatcgg ccgctcggag 600 ctgcccacga cggagcctgc ctgggcggtc ggcgtggagt ctggcaagcc gctggagaag 660 gccgcgctgg cgttcctgaa ggcggagttt gcagcgggcc gcggggccaa gccgacgccg 720 atgctgcaca agaagctcgt gggcgccgtg gtcggagcgc gcgaggtgcg agcctcgctc 780 gccgagatca ctgcacaggg cgccacggct gtgtacgagt cgtgcgacgt gagctctgcc 840 gccaaggtgc gtgagatggt agagcgcgtg cagcagcagg gcgggcggcg cgtgtcgggc 900 gtgttccacg cgtcgggcgt gctgcgcgac aagctcgtgg agaacaagtc gctggcggac 960 ttcagcgccg tgtacgacac caaggtgggc ggcctcatca acctgctggc ctgcgtggac 1020 ctggcgcagc tgcgtcacct cgtgctcttc agctcgctcg cgggcttcca cggcaacgtc 1080 gggcagtcgg actacgcaat ggccaacgag gcgctcaaca agctggcggc gcacctgtcg 1140 gcggtgcacc cgcagctgtg cgcgcgctcg atctgcttcg gaccgtggga cggcggcatg 1200 gtgacccccg cgctcaaggc caacttcatc cgcatgggca tccagatcat cccgcgccaa 1260 ggcggcgcgc agaccgtcgc caacatgctc gtcagtagct cccccggtca gctgctcgtg 1320 ggcaactggg gcgtgccacc cgtcgtgccg agtgccaccg agcacaccgt gctgcagacg 1380 ctccgccaga gcgacaaccc cttcctcgac tcgcacgtga tccagggccg ccgcgtgctg 1440 cccatgaccc tggccgtggg ctacatggcg caccaggcgc agagcatcta cgcgggccac 1500 cagctgtggg ccgtcgagga cgcccagctc ttcaagggca tcgccatcga caatggcgcc 1560 gacgtgcccg tgcgcgtgga gctgtcgcgc cgcaaggagg agcaggagga cgccggcaag 1620 gtcaaggtca aggtgcaggt gctgctcaaa tcgcaggtca acggcaagtc ggtgcccgcg 1680 tacaaggcga ccgtcgtgct gtcccctgcg ccgcgcccca gcgtcatcac gcgtgacttc 1740 gacctcaccc cggacccggc ctgcacggag cacgacctct acgacggcaa gacgctcttc 1800 cacggcaagg ccttccaggg catcgagcag gtgctctcgg cgacgcccaa gcagctcacc 1860 gccaagtgcc gcaatttgcc cctcacgccc gagcagcgcg gccagttcgt cgttaacctc 1920 agccagcagg acccgttcca ggcggacatt gcgttccagg cgatgctcgt ctgggcgcgc 1980 atgctgcgcc aatcggcggc cctgcccaac aactgcgagc gcttcgactt ttacaagccg 2040 atggccccgg gcgccaccta ctacacgtcg gtcaagctgg cctcggcctc acccttggtg 2100 gactctgtgt gcaagtgcac cgtggcgatg cacgatgagc aaggtgaggt gtacttttct 2160 gctcgtgcca gcgtcgtc 2178 <210> 26 <211> 726 <212> PRT <213> Schizochytrium sp. <400> 26 Ala Leu Gln Ala Ala Leu Thr Ser Val Glu Ala Gln Phe Gly Lys Val 1 5 10 15 Gly Gly Phe Val Phe Gln Phe Gly Asp Asp Asp Val Gln Ala Gln Leu 20 25 30 Gly Trp Ala Leu Leu Ala Ala Lys His Leu Lys Thr Ser Leu Ser Glu 35 40 45 Gln Ile Glu Gly Gly Arg Thr Phe Phe Val Ala Val Ala Arg Leu Asp 50 55 60 Gly Gln Leu Gly Leu Ser Gly Lys Ser Thr Thr Ala Thr Val Asp Leu 65 70 75 80 Ser Arg Ala Gln Gln Gly Ser Val Phe Gly Leu Cys Lys Thr Leu Asp 85 90 95 Leu Glu Trp Pro Ala Val Phe Cys Arg Gly Ile Asp Leu Ala Ala Asp 100 105 110 Leu Asp Ala Ala Gln Ala Ala Arg Cys Leu Leu Gly Glu Leu Ser Asp 115 120 125 Pro Asp Val Ala Val Arg Glu Ser Gly Tyr Ser Ala Ser Gly Gln Arg 130 135 140 Cys Thr Thr Thr Thr Lys Ser Leu Thr Thr Gly Lys Pro His Gln Pro 145 150 155 160 Ile Ser Ser Ser Asp Leu Phe Leu Val Ser Gly Gly Ala Arg Gly Ile 165 170 175 Thr Pro Leu Cys Val Arg Glu Leu Ala Gln Arg Val Gly Gly Gly Thr 180 185 190 Tyr Val Leu Ile Gly Arg Ser Glu Leu Pro Thr Thr Glu Pro Ala Trp 195 200 205 Ala Val Gly Val Glu Ser Gly Lys Pro Leu Glu Lys Ala Ala Leu Ala 210 215 220 Phe Leu Lys Ala Glu Phe Ala Ala Gly Arg Gly Ala Lys Pro Thr Pro 225 230 235 240 Met Leu His Lys Lys Leu Val Gly Ala Val Val Gly Ala Arg Glu Val 245 250 255 Arg Ala Ser Leu Ala Glu Ile Thr Ala Gln Gly Ala Thr Ala Val Tyr 260 265 270 Glu Ser Cys Asp Val Ser Ser Ala Ala Lys Val Arg Glu Met Val Glu 275 280 285 Arg Val Gln Gln Gln Gly Gly Arg Arg Val Ser Gly Val Phe His Ala 290 295 300 Ser Gly Val Leu Arg Asp Lys Leu Val Glu Asn Lys Ser Leu Ala Asp 305 310 315 320 Phe Ser Ala Val Tyr Asp Thr Lys Val Gly Gly Leu Ile Asn Leu Leu 325 330 335 Ala Cys Val Asp Leu Ala Gln Leu Arg His Leu Val Leu Phe Ser Ser 340 345 350 Leu Ala Gly Phe His Gly Asn Val Gly Gln Ser Asp Tyr Ala Met Ala 355 360 365 Asn Glu Ala Leu Asn Lys Leu Ala Ala His Leu Ser Ala Val His Pro 370 375 380 Gln Leu Cys Ala Arg Ser Ile Cys Phe Gly Pro Trp Asp Gly Gly Met 385 390 395 400 Val Thr Pro Ala Leu Lys Ala Asn Phe Ile Arg Met Gly Ile Gln Ile 405 410 415 Ile Pro Arg Gln Gly Gly Ala Gln Thr Val Ala Asn Met Leu Val Ser 420 425 430 Ser Ser Pro Gly Gln Leu Leu Val Gly Asn Trp Gly Val Pro Pro Val 435 440 445 Val Pro Ser Ala Thr Glu His Thr Val Leu Gln Thr Leu Arg Gln Ser 450 455 460 Asp Asn Pro Phe Leu Asp Ser His Val Ile Gln Gly Arg Arg Val Leu 465 470 475 480 Pro Met Thr Leu Ala Val Gly Tyr Met Ala His Gln Ala Gln Ser Ile 485 490 495 Tyr Ala Gly His Gln Leu Trp Ala Val Glu Asp Ala Gln Leu Phe Lys 500 505 510 Gly Ile Ala Ile Asp Asn Gly Ala Asp Val Pro Val Arg Val Glu Leu 515 520 525 Ser Arg Arg Lys Glu Glu Gln Glu Asp Ala Gly Lys Val Lys Val Lys 530 535 540 Val Gln Val Leu Leu Lys Ser Gln Val Asn Gly Lys Ser Val Pro Ala 545 550 555 560 Tyr Lys Ala Thr Val Val Leu Ser Pro Ala Pro Arg Pro Ser Val Ile 565 570 575 Thr Arg Asp Phe Asp Leu Thr Pro Asp Pro Ala Cys Thr Glu His Asp 580 585 590 Leu Tyr Asp Gly Lys Thr Leu Phe His Gly Lys Ala Phe Gln Gly Ile 595 600 605 Glu Gln Val Leu Ser Ala Thr Pro Lys Gln Leu Thr Ala Lys Cys Arg 610 615 620 Asn Leu Pro Leu Thr Pro Glu Gln Arg Gly Gln Phe Val Val Asn Leu 625 630 635 640 Ser Gln Gln Asp Pro Phe Gln Ala Asp Ile Ala Phe Gln Ala Met Leu 645 650 655 Val Trp Ala Arg Met Leu Arg Gln Ser Ala Ala Leu Pro Asn Asn Cys 660 665 670 Glu Arg Phe Asp Phe Tyr Lys Pro Met Ala Pro Gly Ala Thr Tyr Tyr 675 680 685 Thr Ser Val Lys Leu Ala Ser Ala Ser Pro Leu Val Asp Ser Val Cys 690 695 700 Lys Cys Thr Val Ala Met His Asp Glu Gln Gly Glu Val Tyr Phe Ser 705 710 715 720 Ala Arg Ala Ser Val Val 725 <210> 27 <211> 39 <212> DNA <213> Schizochytrium sp. <400> 27 ctcgactcgc acgtgatcca gggccgccgc gtgctgccc 39 <210> 28 <211> 13 <212> PRT <213> Schizochytrium sp. <400> 28 Leu Asp Ser His Val Ile Gln Gly Arg Arg Val Leu Pro 1 5 10 <210> 29 <211> 1341 <212> DNA <213> Schizochytrium sp. <400> 29 gataacattg cggtcgtggg catggcggtg cagtatgccg gatgcaagaa ccaggacgag 60 ttctgggata cgctgatgcg taaggagatc aactcgagcc cgatctcggc ggagcgcctc 120 ggtacgcgct accgcgacct ccacttccac ccgcagcgca gcaagtacgc cgacaccttc 180 tgcaacgatc gctacggctg cgtcgatgcc agcgtcgaca acgagcacga cctcctcgcc 240 gacctggccc ggcgcgccct gctcgacgcc ggaattaacc tcgacgacgc cagcaccacc 300 gccaacctac gcgacttcgg catcgtgagc ggctgcctgt cgttccccat ggacaatctg 360 cagggcgagc tgctcaatct gtaccaagtg catgtggaga accgcgtggg cgcccagcgc 420 ttccgcgact cgcgcccctg gtcggagcgc ccgcgcgctg tctcgcccga ggccagcgac 480 ccgcgcgtgt actccgaccc ggcgtccttc gtggccaacc agctcggcct ggggcccgtg 540 cgctacagcc tcgatgcagc ctgcgcgtcg gcgctgtact gcctcaagct ggcgtccgac 600 cacttgctct cgcgcagcgc ggacgtgatg ctgtgcggcg ccacatgctt tccggacccg 660 ttcttcattc tctcggggtt ctccaccttc caggcgatgc cgctgggcgg accggacgat 720 aacccactgt ccgtgccgct gcggcagggc agccagggcc tgacgcccgg agagggcggc 780 gccatcatgg tgctgaagcg cctcgaggac gccgtgcgcg acggcgaccg catctacggc 840 accttgctcg gcacgagtct gagcaacgcc gggtgcggcc tgccgctgag cccgcacctg 900 ccgagcgaga agtcgtgcat ggaggacctg tacacgagcg tcggcatcga cccaagcgag 960 gtgcagtacg tggagtgcca cgccacgggc actccgcagg gcgacgtcgt ggaggtagag 1020 gcgctgcgcc actgctttcg aggtaacacg gaccacccgc cgcgcatggg ctccaccaag 1080 ggcaactttg gccacactct cgtggcggcc gggttcgcag gcatggccaa ggtgctgctg 1140 tcgatgcagc acggcacgat cccgcccacg cccggtgtcg accgctccaa ctgcatcgac 1200 ccgctcgtcg tggacgaggc catcccttgg ccgtactcgt cggcgcaggc gcgggcaggc 1260 aaaccaggcg atgagctcaa gtgcgcctcg ctctccgcct ttggctttgg tggaaccaac 1320 gcgcactgtg tcttccgtga g 1341 <210> 30 <211> 447 <212> PRT <213> Schizochytrium sp. <400> 30 Asp Asn Ile Ala Val Val Gly Met Ala Val Gln Tyr Ala Gly Cys Lys 1 5 10 15 Asn Gln Asp Glu Phe Trp Asp Thr Leu Met Arg Lys Glu Ile Asn Ser 20 25 30 Ser Pro Ile Ser Ala Glu Arg Leu Gly Thr Arg Tyr Arg Asp Leu His 35 40 45 Phe His Pro Gln Arg Ser Lys Tyr Ala Asp Thr Phe Cys Asn Asp Arg 50 55 60 Tyr Gly Cys Val Asp Ala Ser Val Asp Asn Glu His Asp Leu Leu Ala 65 70 75 80 Asp Leu Ala Arg Arg Ala Leu Leu Asp Ala Gly Ile Asn Leu Asp Asp 85 90 95 Ala Ser Thr Thr Ala Asn Leu Arg Asp Phe Gly Ile Val Ser Gly Cys 100 105 110 Leu Ser Phe Pro Met Asp Asn Leu Gln Gly Glu Leu Leu Asn Leu Tyr 115 120 125 Gln Val His Val Glu Asn Arg Val Gly Ala Gln Arg Phe Arg Asp Ser 130 135 140 Arg Pro Trp Ser Glu Arg Pro Arg Ala Val Ser Pro Glu Ala Ser Asp 145 150 155 160 Pro Arg Val Tyr Ser Asp Pro Ala Ser Phe Val Ala Asn Gln Leu Gly 165 170 175 Leu Gly Pro Val Arg Tyr Ser Leu Asp Ala Ala Cys Ala Ser Ala Leu 180 185 190 Tyr Cys Leu Lys Leu Ala Ser Asp His Leu Leu Ser Arg Ser Ala Asp 195 200 205 Val Met Leu Cys Gly Ala Thr Cys Phe Pro Asp Pro Phe Phe Ile Leu 210 215 220 Ser Gly Phe Ser Thr Phe Gln Ala Met Pro Leu Gly Gly Pro Asp Asp 225 230 235 240 Asn Pro Leu Ser Val Pro Leu Arg Gln Gly Ser Gln Gly Leu Thr Pro 245 250 255 Gly Glu Gly Gly Ala Ile Met Val Leu Lys Arg Leu Glu Asp Ala Val 260 265 270 Arg Asp Gly Asp Arg Ile Tyr Gly Thr Leu Leu Gly Thr Ser Leu Ser 275 280 285 Asn Ala Gly Cys Gly Leu Pro Leu Ser Pro His Leu Pro Ser Glu Lys 290 295 300 Ser Cys Met Glu Asp Leu Tyr Thr Ser Val Gly Ile Asp Pro Ser Glu 305 310 315 320 Val Gln Tyr Val Glu Cys His Ala Thr Gly Thr Pro Gln Gly Asp Val 325 330 335 Val Glu Val Glu Ala Leu Arg His Cys Phe Arg Gly Asn Thr Asp His 340 345 350 Pro Pro Arg Met Gly Ser Thr Lys Gly Asn Phe Gly His Thr Leu Val 355 360 365 Ala Ala Gly Phe Ala Gly Met Ala Lys Val Leu Leu Ser Met Gln His 370 375 380 Gly Thr Ile Pro Pro Thr Pro Gly Val Asp Arg Ser Asn Cys Ile Asp 385 390 395 400 Pro Leu Val Val Asp Glu Ala Ile Pro Trp Pro Tyr Ser Ser Ala Gln 405 410 415 Ala Arg Ala Gly Lys Pro Gly Asp Glu Leu Lys Cys Ala Ser Leu Ser 420 425 430 Ala Phe Gly Phe Gly Gly Thr Asn Ala His Cys Val Phe Arg Glu 435 440 445 <210> 31 <211> 1293 <212> DNA <213> Schizochytrium sp. <400> 31 ggaccgattg ccatcatcgg gatggacgcg acgtttggta ccctcaaggg cctggacgcg 60 tttgagcagg ccatctacaa gggcacggac ggcgccagcg acctgccgag caagcgctgg 120 cggttcctgg gcgccgacac ggacttcttg accgccatgg gcctcgacgc cgtgccgcgc 180 gggtgctacg tgcgcgacgt ggacgtggac tacaagcggc tgcggtcgcc gatgatccct 240 gaggacgtcc tgcgcccgca acagctgctg gcggtggcta cgatggaccg cgcgctgcag 300 gacgctggaa tggcgacggg aggcaaggtg gcggtgctgg tggggctcgg cacggacacc 360 gagctgtacc ggcaccgcgc gcgcgtgaca ctcaaggagc ggctcgaccc ggccgcgttc 420 tcgcccgagc aggtgcagga gatgatggac tacatcaacg actgcggcac ctcgacgtcg 480 tacacgtcgt acatcggcaa cctcgtggcc acgcgcgtgt cctcgcagtg gggctttacg 540 ggcccgtcct tcaccgtcac cgaaggcgca aactcggtct accgctgcct cgagctgggc 600 aagttcctgc tcgacacgca ccaggtggac gccgtcgtgg tggccggcgt cgacctctgt 660 gccaccgccg agaaccttta cctcaaggcg cgccgctccg ccatcagccg acaggaccac 720 cctcgcgcca actttgaggc cagcgccgac gggtactttg ccggcgaggg cagcggcgcc 780 ctggtcctca agcgccaggc cgacgttggc tcagacgaca aggtctacgc cagtgtcgcg 840 ggcctcacgt gcgccgcgca gcccgctgaa gccgtgtcgc cgctactact ccaagtccac 900 aacgacgaca acgagaagag ggtggtggag atggtggagc tcgccgccga ctcgggtcgc 960 catgcgccgc acttggccaa ctcgccgctg agcgccgagt cgcagctgga gcaagtgtcc 1020 aagttgctcg cgcaccaggt gccgggctcg gtggccatcg gcagcgtgcg cgccaacgtg 1080 ggagacgtcg ggtacgcctc gggcgccgcg agcctcatca agacggcgct gtgcctccac 1140 aaccgctacc tcccggccaa cccgcagtgg gagcggccgg tggcgccggt ctccgaggcg 1200 ctgtttactt gcccgcgctc gcgtgcctgg ctgaagaacc cgggcgagtc gcgactggcg 1260 gctgtcgcca gtgcctccga gagcgggtcc tgc 1293 <210> 32 <211> 431 <212> PRT <213> Schizochytrium sp. <400> 32 Gly Pro Ile Ala Ile Ile Gly Met Asp Ala Thr Phe Gly Thr Leu Lys 1 5 10 15 Gly Leu Asp Ala Phe Glu Gln Ala Ile Tyr Lys Gly Thr Asp Gly Ala 20 25 30 Ser Asp Leu Pro Ser Lys Arg Trp Arg Phe Leu Gly Ala Asp Thr Asp 35 40 45 Phe Leu Thr Ala Met Gly Leu Asp Ala Val Pro Arg Gly Cys Tyr Val 50 55 60 Arg Asp Val Asp Val Asp Tyr Lys Arg Leu Arg Ser Pro Met Ile Pro 65 70 75 80 Glu Asp Val Leu Arg Pro Gln Gln Leu Leu Ala Val Ala Thr Met Asp 85 90 95 Arg Ala Leu Gln Asp Ala Gly Met Ala Thr Gly Gly Lys Val Ala Val 100 105 110 Leu Val Gly Leu Gly Thr Asp Thr Glu Leu Tyr Arg His Arg Ala Arg 115 120 125 Val Thr Leu Lys Glu Arg Leu Asp Pro Ala Ala Phe Ser Pro Glu Gln 130 135 140 Val Gln Glu Met Met Asp Tyr Ile Asn Asp Cys Gly Thr Ser Thr Ser 145 150 155 160 Tyr Thr Ser Tyr Ile Gly Asn Leu Val Ala Thr Arg Val Ser Ser Gln 165 170 175 Trp Gly Phe Thr Gly Pro Ser Phe Thr Val Thr Glu Gly Ala Asn Ser 180 185 190 Val Tyr Arg Cys Leu Glu Leu Gly Lys Phe Leu Leu Asp Thr His Gln 195 200 205 Val Asp Ala Val Val Val Ala Gly Val Asp Leu Cys Ala Thr Ala Glu 210 215 220 Asn Leu Tyr Leu Lys Ala Arg Arg Ser Ala Ile Ser Arg Gln Asp His 225 230 235 240 Pro Arg Ala Asn Phe Glu Ala Ser Ala Asp Gly Tyr Phe Ala Gly Glu 245 250 255 Gly Ser Gly Ala Leu Val Leu Lys Arg Gln Ala Asp Val Gly Ser Asp 260 265 270 Asp Lys Val Tyr Ala Ser Val Ala Gly Leu Thr Cys Ala Ala Gln Pro 275 280 285 Ala Glu Ala Val Ser Pro Leu Leu Leu Gln Val His Asn Asp Asp Asn 290 295 300 Glu Lys Arg Val Val Glu Met Val Glu Leu Ala Ala Asp Ser Gly Arg 305 310 315 320 His Ala Pro His Leu Ala Asn Ser Pro Leu Ser Ala Glu Ser Gln Leu 325 330 335 Glu Gln Val Ser Lys Leu Leu Ala His Gln Val Pro Gly Ser Val Ala 340 345 350 Ile Gly Ser Val Arg Ala Asn Val Gly Asp Val Gly Tyr Ala Ser Gly 355 360 365 Ala Ala Ser Leu Ile Lys Thr Ala Leu Cys Leu His Asn Arg Tyr Leu 370 375 380 Pro Ala Asn Pro Gln Trp Glu Arg Pro Val Ala Pro Val Ser Glu Ala 385 390 395 400 Leu Phe Thr Cys Pro Arg Ser Arg Ala Trp Leu Lys Asn Pro Gly Glu 405 410 415 Ser Arg Leu Ala Ala Val Ala Ser Ala Ser Glu Ser Gly Ser Cys 420 425 430 <210> 33 <211> 1203 <212> DNA <213> Schizochytrium sp. <400> 33 acgccggaga agctggagaa ggagttggag ctggcagcca agggtgtacc gcgaagcgcc 60 aaggccgggc gcaactggat gtcgccatcg ggcagcgcct ttgcgccgac acctgtgacc 120 agcgaccgcg tcgcgttcat gtacggcgag ggccgcagcc cctactacgg cgtcgggctc 180 gacctgcacc gcctgtggcc ggctttgcac gagcgcatca acgacaagac cgcggcgctg 240 tgggagaacg gcgactcgtg gctcatgccg cgcgcggtgg atgccgactc gcagcgcgcc 300 gtgcagacgg cctttgacgc ggaccagatc gagatgttcc gcacgggcat cttcgtgtcc 360 atctgcctca ccgactacgc gcgcgacgtg ctcggggtgc agcccaaggc gtgcttcggc 420 ctcagcctcg gcgagatctc catgctcttt gcgctgtcgc gacgcaactg cggcctgtcg 480 gaccagctca cgcagcgcct acgcacctcg ccggtgtggt cgacacagct ggcggtggag 540 ttccaggcct tgcgcaagct atggaacgtg ccggcggacg cccccgtgga gtccttctgg 600 cagggctact tggttcgcgc cagccgcgcc gaaatcgaga aggcgatcgg gcccgacaac 660 cgcttcgtgc gcctgctgat cgtcaacgac tcgagcagcg cgctgatcgc cggcaaacct 720 gccgagtgtc tgcgcgtgct ggagcgcctg ggcgggcggt tgccgccgat gcccgtcaag 780 caaggcatga ttgggcactg ccccgaagtg gcgccctaca cgccgggcat cgcgcacatc 840 cacgagattt tggagattcc ggacagcccc gtcaagatgt acacctcggt caccaacgcc 900 gagctgcgcg ggggcagcaa cagcagcatc accgagttcg tgcagaagtt gtacacgcgc 960 atcgccgact ttccgggcat cgtcgacaag gtcagccgtg acggccacga tgtcttcgtc 1020 gaggtggggc cgaacaacat gcgctccgcc gcggtcagtg acattcttgg caaggctgcc 1080 accccgcatg tctccgtggc gctggaccgc cccagtgagt cggcgtggac gcagaccctc 1140 aagtcgctgg cgctgctgac cgcccaccgc gtgcccctgc acaacccgac tctgtttgcg 1200 gac 1203 <210> 34 <211> 401 <212> PRT <213> Schizochytrium sp. <400> 34 Thr Pro Glu Lys Leu Glu Lys Glu Leu Glu Leu Ala Ala Lys Gly Val 1 5 10 15 Pro Arg Ser Ala Lys Ala Gly Arg Asn Trp Met Ser Pro Ser Gly Ser 20 25 30 Ala Phe Ala Pro Thr Pro Val Thr Ser Asp Arg Val Ala Phe Met Tyr 35 40 45 Gly Glu Gly Arg Ser Pro Tyr Tyr Gly Val Gly Leu Asp Leu His Arg 50 55 60 Leu Trp Pro Ala Leu His Glu Arg Ile Asn Asp Lys Thr Ala Ala Leu 65 70 75 80 Trp Glu Asn Gly Asp Ser Trp Leu Met Pro Arg Ala Val Asp Ala Asp 85 90 95 Ser Gln Arg Ala Val Gln Thr Ala Phe Asp Ala Asp Gln Ile Glu Met 100 105 110 Phe Arg Thr Gly Ile Phe Val Ser Ile Cys Leu Thr Asp Tyr Ala Arg 115 120 125 Asp Val Leu Gly Val Gln Pro Lys Ala Cys Phe Gly Leu Ser Leu Gly 130 135 140 Glu Ile Ser Met Leu Phe Ala Leu Ser Arg Arg Asn Cys Gly Leu Ser 145 150 155 160 Asp Gln Leu Thr Gln Arg Leu Arg Thr Ser Pro Val Trp Ser Thr Gln 165 170 175 Leu Ala Val Glu Phe Gln Ala Leu Arg Lys Leu Trp Asn Val Pro Ala 180 185 190 Asp Ala Pro Val Glu Ser Phe Trp Gln Gly Tyr Leu Val Arg Ala Ser 195 200 205 Arg Ala Glu Ile Glu Lys Ala Ile Gly Pro Asp Asn Arg Phe Val Arg 210 215 220 Leu Leu Ile Val Asn Asp Ser Ser Ser Ala Leu Ile Ala Gly Lys Pro 225 230 235 240 Ala Glu Cys Leu Arg Val Leu Glu Arg Leu Gly Gly Arg Leu Pro Pro 245 250 255 Met Pro Val Lys Gln Gly Met Ile Gly His Cys Pro Glu Val Ala Pro 260 265 270 Tyr Thr Pro Gly Ile Ala His Ile His Glu Ile Leu Glu Ile Pro Asp 275 280 285 Ser Pro Val Lys Met Tyr Thr Ser Val Thr Asn Ala Glu Leu Arg Gly 290 295 300 Gly Ser Asn Ser Ser Ile Thr Glu Phe Val Gln Lys Leu Tyr Thr Arg 305 310 315 320 Ile Ala Asp Phe Pro Gly Ile Val Asp Lys Val Ser Arg Asp Gly His 325 330 335 Asp Val Phe Val Glu Val Gly Pro Asn Asn Met Arg Ser Ala Ala Val 340 345 350 Ser Asp Ile Leu Gly Lys Ala Ala Thr Pro His Val Ser Val Ala Leu 355 360 365 Asp Arg Pro Ser Glu Ser Ala Trp Thr Gln Thr Leu Lys Ser Leu Ala 370 375 380 Leu Leu Thr Ala His Arg Val Pro Leu His Asn Pro Thr Leu Phe Ala 385 390 395 400 Asp <210> 35 <211> 1273 <212> DNA <213> Schizochytrium sp. <400> 35 tacgacgtgg actggccgct ctacatgggc gccatggcgg aaggcatctc gtcggtagac 60 ctggtggtcg ctgccgccga ggcccgcatg ctggcatcat tcggagcggc ccgcttgcct 120 atggaccagg tggaactcca gatccgtgag atccagcaac gcacctccaa cgcctttgct 180 gtcaacctga tgccgggtcc tgacgaggcc gcgacggtgg acgcgctgct gcgcacgggc 240 gtctcaatcg tcgaggcatc gggctacacc ggcgcgctct ctgcagacct ggtgcgctac 300 cgtgtcacgg gtctgcgacg aactagttgc ggtgcttctg tgtcggcgac tcaccgtgtg 360 gtcgccaagg tgtcgcgcac cgaggtggcc gagcactttc tgcgcccggc gccggccgcc 420 gtactagagg ctttggtcgc cgccaaacag attacgcccg agcaggccgc gctggccagc 480 cgcgtcgcca tggccgacga cgtcgcggtg gaggccgact cgggcgggca caccgacaac 540 cgaccgatcc acgtgctgct gccgctcgtg gtggcgcagc gcaaccgctg gcgccacctg 600 gtggacacgc cagtgcgcgt cggcgccggc ggcgggatcg cctgtccgcg cgccgcgctg 660 ctcgcctttt ccctgggcgc cgcctttgtg gtcaccgggt ccgtcaacca actggcccgc 720 gaggctggca ccagcgacgc ggtccgacta ctgctggcga cggccaccta ctcggacgtg 780 gccatggcgc cgggcggcgt ccaggtgctc aagaagcaga ccatgttcgc cgcgcgggcc 840 acgatgctcg cccagctgca ggccaagttc ggctcctttg acgccgtgcc ggagccgcag 900 ctgcgcaagc tcgagcgctc cgtgttcaag cagtccgtgg cggacgtgtg ggctgctgca 960 cgcgaaaagt ttggtgtcga cgctaccgct gcaagtccgc aggagaggat ggcgctctgt 1020 gtgcgctggt acatgtcgca gtcgtcgcga tgggctaccg aggcgacgtc cgcgcgcaag 1080 gcggactacc agatctggtg cggccccgcc atcggcagct tcaacgactt cgttcgcggc 1140 accaagctgg acgcgaccgc tggcaccggc gagtttccgc gcgtcgtgga catcaaccag 1200 cacatcctcc tcggagcctc gcactaccgc cgcgtgcagc aacaacaaca ggacgacgac 1260 gtagaataca tca 1273 <210> 36 <211> 401 <212> PRT <213> Schizochytrium sp. <400> 36 Tyr Asp Val Asp Trp Pro Leu Tyr Met Gly Ala Met Ala Glu Gly Ile 1 5 10 15 Ser Ser Val Asp Leu Val Val Ala Ala Ala Glu Ala Arg Met Leu Ala 20 25 30 Ser Phe Gly Ala Ala Arg Leu Pro Met Asp Gln Val Glu Leu Gln Ile 35 40 45 Arg Glu Ile Gln Gln Arg Thr Ser Asn Ala Phe Ala Val Asn Leu Met 50 55 60 Pro Gly Pro Asp Glu Ala Ala Thr Val Asp Ala Leu Leu Arg Thr Gly 65 70 75 80 Val Ser Ile Val Glu Ala Ser Gly Tyr Thr Gly Ala Leu Ser Ala Asp 85 90 95 Leu Val Arg Tyr Arg Val Thr Gly Leu Arg Arg Thr Ser Cys Gly Ala 100 105 110 Ser Val Ser Ala Thr His Arg Val Val Ala Lys Val Ser Arg Thr Glu 115 120 125 Val Ala Glu His Phe Leu Arg Pro Ala Pro Ala Ala Val Leu Glu Ala 130 135 140 Leu Val Ala Ala Lys Gln Ile Thr Pro Glu Gln Ala Ala Leu Ala Ser 145 150 155 160 Arg Val Ala Met Ala Asp Asp Val Ala Val Glu Ala Asp Ser Gly Gly 165 170 175 His Thr Asp Asn Arg Pro Ile His Val Leu Leu Pro Leu Val Val Ala 180 185 190 Gln Arg Asn Arg Trp Arg His Leu Val Asp Thr Pro Val Arg Val Gly 195 200 205 Ala Gly Gly Gly Ile Ala Cys Pro Arg Ala Ala Leu Leu Ala Phe Ser 210 215 220 Leu Gly Ala Ala Phe Val Val Thr Gly Ser Val Asn Gln Leu Ala Arg 225 230 235 240 Glu Ala Gly Thr Ser Asp Ala Val Arg Leu Leu Leu Ala Thr Ala Thr 245 250 255 Tyr Ser Asp Val Ala Met Ala Pro Gly Gly Val Gln Val Leu Lys Lys 260 265 270 Gln Thr Met Phe Ala Ala Arg Ala Thr Met Leu Ala Gln Leu Gln Ala 275 280 285 Lys Phe Gly Ser Phe Asp Ala Val Pro Glu Pro Gln Leu Arg Lys Leu 290 295 300 Glu Arg Ser Val Phe Lys Gln Ser Val Ala Asp Val Trp Ala Ala Ala 305 310 315 320 Arg Glu Lys Phe Gly Val Asp Ala Thr Ala Ala Ser Pro Gln Glu Arg 325 330 335 Met Ala Leu Cys Val Arg Trp Tyr Met Ser Gln Ser Ser Arg Trp Ala 340 345 350 Thr Glu Ala Thr Ser Ala Arg Lys Ala Asp Tyr Gln Ile Trp Cys Gly 355 360 365 Pro Ala Ile Gly Ser Phe Asn Asp Phe Val Arg Gly Thr Lys Leu Asp 370 375 380 Ala Thr Ala Gly Thr Gly Glu Phe Pro Arg Val Val Asp Ile Asn Gln 385 390 395 400 His <210> 37 <211> 1350 <212> DNA <213> Schizochytrium sp. <400> 37 atgacatcat cgaagaagac tcccgtgtgg gagatgagca aggaggagct gctggacggc 60 aagacggtgg tcttcgacta caacgagctg ctcgaattcg ccgagggcga cgtgggccaa 120 gtgttcggac ccgagttcga catcatcgac aagtaccggc gtcgcgtgcg gctgccggcg 180 cgcgagtacc tgctcgtgtc gcgcgtgacg ctgatggacg ccgaggtgaa caacttccgc 240 gtcgggtcgc gcatggtgac cgagtacgac gtgcccgtga acggggagct gtcggagggc 300 ggggacgtgc cgtgggcggt gctggtggag tcggggcagt gcgacctgat gctcatctcg 360 tacatgggca tcgacttcca gtgcaagggc gaccgcgtgt accgcctgct caacacatcg 420 ctcaccttct tcggggtggc gcacgagggc gagacgctgg tgtacgacat ccgcgtcacg 480 gggttcgcca agggcgcggg cggggagatc tcgatgttct tcttcgagta cgactgcttc 540 gtggacggcc gcctgctgat cgagatgcgc gacgggtgcg ccgggttctt cacggacgcc 600 gagctggccg ccggcaaggg cgtgcttaag accaaggcgg agctggcggc gcgcgcgcag 660 atccagaagc aggacatcgc gccctttgcg ccggcgccgt gctcgcacaa gacctcgctg 720 gacgcgcgcg agatgcggct gctcgtggac cgccagtggg cgcgcgtctt cggcagcggc 780 atggcgggca tcgactacaa gttgtgcgct cgcaagatgc tcatgatcga ccgcgtcacg 840 cacctcgacc cgcgcggcgg cgcgcacggc ctcgggctgc tgatcgggga gaaggtgctg 900 gagcgcgacc actggtactt cccctgccac tttgtgcgcg acgaggtgat ggccgggtcg 960 ctggtcagcg acggctgctc gcagctcctc aaggtgtaca tgctgtggct cggcctgcac 1020 acgaccgtgg gcgcgttcga ctttcgtccc gtgagcgggc acgccaacaa ggtgcggtgc 1080 cgcgggcaga tctcaccgca caagggcaag ctcgtgtacg tgatggagat caaggaaatg 1140 ggctttgacg cgaagacggg cgatccgttt gcgatcgcgg acgtggacat catcgacgtc 1200 aacttcgagg agggacaggc gtttgcggga gtggaagacc tgcacagcta cggccagggc 1260 gacctccgca agaagatcgt cgtcgacttc aagggcatcg cgctctccct gcagaagcgg 1320 aaggagcagc agaaggaaag catgaccgtg 1350 <210> 38 <211> 450 <212> PRT <213> Schizochytrium sp. <400> 38 Met Thr Ser Ser Lys Lys Thr Pro Val Trp Glu Met Ser Lys Glu Glu 1 5 10 15 Leu Leu Asp Gly Lys Thr Val Val Phe Asp Tyr Asn Glu Leu Leu Glu 20 25 30 Phe Ala Glu Gly Asp Val Gly Gln Val Phe Gly Pro Glu Phe Asp Ile 35 40 45 Ile Asp Lys Tyr Arg Arg Arg Val Arg Leu Pro Ala Arg Glu Tyr Leu 50 55 60 Leu Val Ser Arg Val Thr Leu Met Asp Ala Glu Val Asn Asn Phe Arg 65 70 75 80 Val Gly Ser Arg Met Val Thr Glu Tyr Asp Val Pro Val Asn Gly Glu 85 90 95 Leu Ser Glu Gly Gly Asp Val Pro Trp Ala Val Leu Val Glu Ser Gly 100 105 110 Gln Cys Asp Leu Met Leu Ile Ser Tyr Met Gly Ile Asp Phe Gln Cys 115 120 125 Lys Gly Asp Arg Val Tyr Arg Leu Leu Asn Thr Ser Leu Thr Phe Phe 130 135 140 Gly Val Ala His Glu Gly Glu Thr Leu Val Tyr Asp Ile Arg Val Thr 145 150 155 160 Gly Phe Ala Lys Gly Ala Gly Gly Glu Ile Ser Met Phe Phe Phe Glu 165 170 175 Tyr Asp Cys Phe Val Asp Gly Arg Leu Leu Ile Glu Met Arg Asp Gly 180 185 190 Cys Ala Gly Phe Phe Thr Asp Ala Glu Leu Ala Ala Gly Lys Gly Val 195 200 205 Leu Lys Thr Lys Ala Glu Leu Ala Ala Arg Ala Gln Ile Gln Lys Gln 210 215 220 Asp Ile Ala Pro Phe Ala Pro Ala Pro Cys Ser His Lys Thr Ser Leu 225 230 235 240 Asp Ala Arg Glu Met Arg Leu Leu Val Asp Arg Gln Trp Ala Arg Val 245 250 255 Phe Gly Ser Gly Met Ala Gly Ile Asp Tyr Lys Leu Cys Ala Arg Lys 260 265 270 Met Leu Met Ile Asp Arg Val Thr His Leu Asp Pro Arg Gly Gly Ala 275 280 285 His Gly Leu Gly Leu Leu Ile Gly Glu Lys Val Leu Glu Arg Asp His 290 295 300 Trp Tyr Phe Pro Cys His Phe Val Arg Asp Glu Val Met Ala Gly Ser 305 310 315 320 Leu Val Ser Asp Gly Cys Ser Gln Leu Leu Lys Val Tyr Met Leu Trp 325 330 335 Leu Gly Leu His Thr Thr Val Gly Ala Phe Asp Phe Arg Pro Val Ser 340 345 350 Gly His Ala Asn Lys Val Arg Cys Arg Gly Gln Ile Ser Pro His Lys 355 360 365 Gly Lys Leu Val Tyr Val Met Glu Ile Lys Glu Met Gly Phe Asp Ala 370 375 380 Lys Thr Gly Asp Pro Phe Ala Ile Ala Asp Val Asp Ile Ile Asp Val 385 390 395 400 Asn Phe Glu Glu Gly Gln Ala Phe Ala Gly Val Glu Asp Leu His Ser 405 410 415 Tyr Gly Gln Gly Asp Leu Arg Lys Lys Ile Val Val Asp Phe Lys Gly 420 425 430 Ile Ala Leu Ser Leu Gln Lys Arg Lys Glu Gln Gln Lys Glu Ser Met 435 440 445 Thr Val 450 <210> 39 <211> 1200 <212> DNA <213> Schizochytrium sp. <400> 39 tacccgccgc gggcggtgtg cttctcgccg ttccccaaca acccgcttga caacgaccac 60 acgccgggcc agatgccgtt gacctggttc aacatgtccg aattcatgtg cggcaaagtg 120 tccaactgcc tgggccccga gtttgcgcgc ttcgacgcga gcaagacgag ccgcagcccg 180 gcctttgacc tggcgctcgt gacgcgggtg acgagcgtgg cggacatgga gcacgggccg 240 ttctacaacg tggacgtcaa cccgggccag ggcacgatgg tgggcgagtt cgactgtccc 300 gcggacgcgt ggttcttcgg cgcctcgagc cgcgacgacc acatgccgta ctcgatcctg 360 atggagatcg cgctgcagac gtcgggcgtc ctcacctcgg tgctcaaggc gccgctgacg 420 atggacaagg acgacatcct cttccgcaac ctcgacgcag acgccgagct cgtgggcgac 480 gccatgccgg acgtgcgcgg caagacgatc cgcaacttca ccaagtgcac aggctacagc 540 atgctcggca agatgggcat ccaccgcttc acctttgagc tcagcgtcga cggcgccgtc 600 ttctacaagg gcagcacctc gtttggctgg ttcgtccccg aggtcttcga gtcgcagacc 660 ggtctcgaca acggcaagcc gcgcctgcct tggtaccgcg agaacaacgt cgccgtcgac 720 acgctctccg cgcccgcctc cgcttcctcc gcgcaaggtc agctgcagct gcagcgacgc 780 gggtcgcagg cgcagttcct ggacacaatc cacctggcgg gcagcggcgc cggcgtgcac 840 ggccagggct acgcgcacgg ggagaaggcc gtgaacaagc aagattggtt cttctcgtgc 900 cacttctggt tcgaccccgt gatgcccggg tccctgggca tcgagtcgat gttccagctc 960 gtcgaggcgt ggtgcgtgaa gcagggactc gcggcgcggc acggcatcgc tcacccagtg 1020 ttcgcgcacg cgcccggggc cacgagctgg aagtaccgcg ggcagctaac ccccaagaac 1080 gaccgcatgg acagcgaggt gcacatcaag tcggtggcgg ccttctcctc ctgggtcgac 1140 gtcgtcgcgg acgggttcct cttcgtcgac ggcctccgcg tctactcggc agacaacctc 1200 <210> 40 <211> 400 <212> PRT <213> Schizochytrium sp. <400> 40 Tyr Pro Pro Arg Ala Val Cys Phe Ser Pro Phe Pro Asn Asn Pro Leu 1 5 10 15 Asp Asn Asp His Thr Pro Gly Gln Met Pro Leu Thr Trp Phe Asn Met 20 25 30 Ser Glu Phe Met Cys Gly Lys Val Ser Asn Cys Leu Gly Pro Glu Phe 35 40 45 Ala Arg Phe Asp Ala Ser Lys Thr Ser Arg Ser Pro Ala Phe Asp Leu 50 55 60 Ala Leu Val Thr Arg Val Thr Ser Val Ala Asp Met Glu His Gly Pro 65 70 75 80 Phe Tyr Asn Val Asp Val Asn Pro Gly Gln Gly Thr Met Val Gly Glu 85 90 95 Phe Asp Cys Pro Ala Asp Ala Trp Phe Phe Gly Ala Ser Ser Arg Asp 100 105 110 Asp His Met Pro Tyr Ser Ile Leu Met Glu Ile Ala Leu Gln Thr Ser 115 120 125 Gly Val Leu Thr Ser Val Leu Lys Ala Pro Leu Thr Met Asp Lys Asp 130 135 140 Asp Ile Leu Phe Arg Asn Leu Asp Ala Asp Ala Glu Leu Val Gly Asp 145 150 155 160 Ala Met Pro Asp Val Arg Gly Lys Thr Ile Arg Asn Phe Thr Lys Cys 165 170 175 Thr Gly Tyr Ser Met Leu Gly Lys Met Gly Ile His Arg Phe Thr Phe 180 185 190 Glu Leu Ser Val Asp Gly Ala Val Phe Tyr Lys Gly Ser Thr Ser Phe 195 200 205 Gly Trp Phe Val Pro Glu Val Phe Glu Ser Gln Thr Gly Leu Asp Asn 210 215 220 Gly Lys Pro Arg Leu Pro Trp Tyr Arg Glu Asn Asn Val Ala Val Asp 225 230 235 240 Thr Leu Ser Ala Pro Ala Ser Ala Ser Ser Ala Gln Gly Gln Leu Gln 245 250 255 Leu Gln Arg Arg Gly Ser Gln Ala Gln Phe Leu Asp Thr Ile His Leu 260 265 270 Ala Gly Ser Gly Ala Gly Val His Gly Gln Gly Tyr Ala His Gly Glu 275 280 285 Lys Ala Val Asn Lys Gln Asp Trp Phe Phe Ser Cys His Phe Trp Phe 290 295 300 Asp Pro Val Met Pro Gly Ser Leu Gly Ile Glu Ser Met Phe Gln Leu 305 310 315 320 Val Glu Ala Trp Cys Val Lys Gln Gly Leu Ala Ala Arg His Gly Ile 325 330 335 Ala His Pro Val Phe Ala His Ala Pro Gly Ala Thr Ser Trp Lys Tyr 340 345 350 Arg Gly Gln Leu Thr Pro Lys Asn Asp Arg Met Asp Ser Glu Val His 355 360 365 Ile Lys Ser Val Ala Ala Phe Ser Ser Trp Val Asp Val Val Ala Asp 370 375 380 Gly Phe Leu Phe Val Asp Gly Leu Arg Val Tyr Ser Ala Asp Asn Leu 385 390 395 400 <210> 41 <211> 1353 <212> DNA <213> Schizochytrium sp. <400> 41 cagctggacg cggggagcga ggtgcccgcc tgcgcggtga gcgacctggg cgataggggc 60 ttcatggaga cgtacggggt ggtggcgccg ctgtacagcg gggcgatggc caagggcatc 120 gcgtcggcgg acctggtgat cgcgatgggc cagcgcaaga tgctggggtc gtttggcgcg 180 ggcgggctcc cgatgcacgt cgtgcgcgcg gggattgaga agatccaggc agcgctgcca 240 gcggggccat acgcggtcaa cctgattcac tcgccttttg acgccaacct ggagaagggc 300 aacgtggacc tcttcctgga gaagggcgtg cgcgtcgtgg aggcgtcggc cttcatggag 360 ctcacgcccc aggtggtgcg ctaccgcgcg acgggcctct ctcgcgacgc gcgcggcggc 420 tccgtgcgca cggcccacaa gatcatcggc aaggtcagcc gcaccgagct ggccgagatg 480 tttatccggc ccgcgccgca agccattctc gacaagcttg tggcgtccgg cgagatcacc 540 cccgagcagg cggcgctggc gctcgaggtg cccatggcgg acgacatcgc cgtcgaggcc 600 gattcgggcg ggcacaccga caaccgcccc atccacgtca tcctgcccct catcctcagc 660 ctgcgcaacc gcctccagcg cgagctcaag taccctgcgc gacaccgcgt gcgcgtcggc 720 gccgggggcg gcatcgggtg cccgcaagcg gctctgggcg ccttccacat gggcgccgcg 780 tttgtggtga cgggcacggt caaccagctg agccggcagg ccgggacatg cgacaatgtg 840 cggcggcagc tgtcgcgcgc gacgtactcg gacatcacga tggcgccggc ggcggacatg 900 ttcgagcagg gcgtcgagct gcaggtgctc aagaagggca cgatgtttcc ctcgcgcgcc 960 aagaagctgt tcgagctgtt tcacaagtac gactcgttcg aggcgatgcc ggcggacgag 1020 ctggcgcgcg tcgagaagcg catcttcagc aagtcactcg ccgaggtgtg ggccgagacc 1080 aaggacttct acatcacgcg gctcaacaac ccggagaaga tccgcaaggc ggagaacgag 1140 gaccccaagc tcaagatgtc actctgcttc cgctggtacc tcgggctcag ctcgttctgg 1200 gccaacaacg gcatcgcgga ccgcacgatg gactaccaga tctggtgcgg ccctgccatc 1260 ggcgccttca acgacttcat cgccgactcg tacctcgacg tggccgtctc gggcgagttc 1320 cccgacgtcg tgcagatcaa cctgcagatc ctg 1353 <210> 42 <211> 451 <212> PRT <213> Schizochytrium sp. <400> 42 Gln Leu Asp Ala Gly Ser Glu Val Pro Ala Cys Ala Val Ser Asp Leu 1 5 10 15 Gly Asp Arg Gly Phe Met Glu Thr Tyr Gly Val Val Ala Pro Leu Tyr 20 25 30 Ser Gly Ala Met Ala Lys Gly Ile Ala Ser Ala Asp Leu Val Ile Ala 35 40 45 Met Gly Gln Arg Lys Met Leu Gly Ser Phe Gly Ala Gly Gly Leu Pro 50 55 60 Met His Val Val Arg Ala Gly Ile Glu Lys Ile Gln Ala Ala Leu Pro 65 70 75 80 Ala Gly Pro Tyr Ala Val Asn Leu Ile His Ser Pro Phe Asp Ala Asn 85 90 95 Leu Glu Lys Gly Asn Val Asp Leu Phe Leu Glu Lys Gly Val Arg Val 100 105 110 Val Glu Ala Ser Ala Phe Met Glu Leu Thr Pro Gln Val Val Arg Tyr 115 120 125 Arg Ala Thr Gly Leu Ser Arg Asp Ala Arg Gly Gly Ser Val Arg Thr 130 135 140 Ala His Lys Ile Ile Gly Lys Val Ser Arg Thr Glu Leu Ala Glu Met 145 150 155 160 Phe Ile Arg Pro Ala Pro Gln Ala Ile Leu Asp Lys Leu Val Ala Ser 165 170 175 Gly Glu Ile Thr Pro Glu Gln Ala Ala Leu Ala Leu Glu Val Pro Met 180 185 190 Ala Asp Asp Ile Ala Val Glu Ala Asp Ser Gly Gly His Thr Asp Asn 195 200 205 Arg Pro Ile His Val Ile Leu Pro Leu Ile Leu Ser Leu Arg Asn Arg 210 215 220 Leu Gln Arg Glu Leu Lys Tyr Pro Ala Arg His Arg Val Arg Val Gly 225 230 235 240 Ala Gly Gly Gly Ile Gly Cys Pro Gln Ala Ala Leu Gly Ala Phe His 245 250 255 Met Gly Ala Ala Phe Val Val Thr Gly Thr Val Asn Gln Leu Ser Arg 260 265 270 Gln Ala Gly Thr Cys Asp Asn Val Arg Arg Gln Leu Ser Arg Ala Thr 275 280 285 Tyr Ser Asp Ile Thr Met Ala Pro Ala Ala Asp Met Phe Glu Gln Gly 290 295 300 Val Glu Leu Gln Val Leu Lys Lys Gly Thr Met Phe Pro Ser Arg Ala 305 310 315 320 Lys Lys Leu Phe Glu Leu Phe His Lys Tyr Asp Ser Phe Glu Ala Met 325 330 335 Pro Ala Asp Glu Leu Ala Arg Val Glu Lys Arg Ile Phe Ser Lys Ser 340 345 350 Leu Ala Glu Val Trp Ala Glu Thr Lys Asp Phe Tyr Ile Thr Arg Leu 355 360 365 Asn Asn Pro Glu Lys Ile Arg Lys Ala Glu Asn Glu Asp Pro Lys Leu 370 375 380 Lys Met Ser Leu Cys Phe Arg Trp Tyr Leu Gly Leu Ser Ser Phe Trp 385 390 395 400 Ala Asn Asn Gly Ile Ala Asp Arg Thr Met Asp Tyr Gln Ile Trp Cys 405 410 415 Gly Pro Ala Ile Gly Ala Phe Asn Asp Phe Ile Ala Asp Ser Tyr Leu 420 425 430 Asp Val Ala Val Ser Gly Glu Phe Pro Asp Val Val Gln Ile Asn Leu 435 440 445 Gln Ile Leu 450

Claims (91)

  1. 서열번호 1의 폴리뉴클레오티드 서열 또는 서열번호 2의 아미노산 서열로 이루어진 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열로 이루어진, 다중불포화 지방산 신타제 아단위 1(PFA1)을 코딩하는 유전자 PFA1,
    서열번호 3의 폴리뉴클레오티드 서열 또는 서열번호 4의 아미노산 서열로 이루어진 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열로 이루어진, 다중불포화 지방산 신타제 아단위 2(PFA2)을 코딩하는 유전자 PFA2, 및
    서열번호 5의 폴리뉴클레오티드 서열 또는 서열번호 6의 아미노산 서열로 이루어진 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열로 이루어진, 다중불포화 지방산 신타제 아단위 3(PFA3)을 코딩하는 유전자 PFA3
    을 포함하는 재조합 미세조류로서,
    숙주 미세조류와 비교하여 유전자 PFA1, 유전자 PFA3, 또는 유전자 PFA1 및 유전자 PFA3 둘다의 발현 수준을 증가시키도록 변형되고,
    숙주 미세조류와 비교하여 증가된 수준의 에이코사펜타엔산(EPA)의 양을 갖는 지질을 생산하는 재조합 미세조류.
  2. 삭제
  3. 제1항에 있어서,
    유전자 PFA1, 유전자 PFA3, 또는 유전자 PFA1 및 유전자 PFA3 둘다의 발현이 숙주 미세조류와 비교하여 1.5배 이상만큼 증가되는, 재조합 미세조류.
  4. 제1항에 있어서,
    미세조류가 라비린툴로미세테스(Labyrinthulomycetes)인, 재조합 미세조류.
  5. 제4항에 있어서,
    라비린툴로미세테스가 트라우스토키트리드(Thraustochytrid)인, 재조합 미세조류.
  6. 제5항에 있어서,
    트라우스토키트리드가 쉬조키트리움(Schizochytrium) 또는 트라우스토키트리움(Thraustochytrium)인, 재조합 미세조류.
  7. 제6항에 있어서,
    트라우스토키트리드가 쉬조키트리움인, 재조합 미세조류.
  8. 제1항에 있어서,
    PFA1의 발현을 증가시키도록 변형된 재조합 미세조류.
  9. 제1항에 있어서,
    PFA1 및 PFA3의 발현을 증가시키도록 변형된 재조합 미세조류.
  10. 삭제
  11. 제1항에 있어서,
    PFA1, PFA3, 또는 PFA1 및 PFA3 둘다의 발현이 숙주 미세조류에 고유한 프로모터에 의해 구동되는, 재조합 미세조류.
  12. 제1항에 있어서,
    PFA1을 코딩하는 유전자, PFA3을 코딩하는 유전자, 또는 PFA1을 코딩하는 유전자 및 PFA3을 코딩하는 유전자 둘다의 카피를 다수 함유하도록 변형된 재조합 미세조류.
  13. 삭제
  14. 제12항에 있어서,
    미세조류가 PFA1을 코딩하는 유전자의 2 내지 10개의 카피를 함유하는, 재조합 미세조류.
  15. 제12항에 있어서,
    미세조류가 PFA1을 코딩하는 유전자의 3 내지 7개의 카피를 함유하는, 재조합 미세조류.
  16. 제12항에 있어서,
    미세조류가 PFA1을 코딩하는 유전자의 4 내지 6개의 카피를 함유하는, 재조합 미세조류.
  17. 제1항에 있어서,
    하나 이상의 내인성 다중불포화 지방산(PUFA) 신타제 유전자가 결실되는, 재조합 미세조류.
  18. 삭제
  19. 제1항에 있어서,
    지질 내의 EPA가 숙주 미세조류와 비교하여 2배 이상만큼 증가되는, 재조합 미세조류.
  20. 제1항에 있어서,
    지질이 숙주 미세조류와 비교하여 도코사헥사엔산(DHA)의 양이 강화된 지질인, 재조합 미세조류.
  21. 제1항에 있어서,
    EPA:DHA 비가 숙주 미세조류와 비교하여 2배 이상만큼 증가되는, 재조합 미세조류.
  22. a) 서열번호 1의 폴리뉴클레오티드 서열 또는 서열번호 2의 아미노산 서열로 이루어진 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열로 이루어진, 다중불포화 지방산 신타제 아단위 1(PFA1)을 코딩하는 유전자 PFA1,
    서열번호 3의 폴리뉴클레오티드 서열 또는 서열번호 4의 아미노산 서열로 이루어진 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열로 이루어진, 다중불포화 지방산 신타제 아단위 2(PFA2)을 코딩하는 유전자 PFA2, 및
    서열번호 5의 폴리뉴클레오티드 서열 또는 서열번호 6의 아미노산 서열로 이루어진 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열로 이루어진, 다중불포화 지방산 신타제 아단위 3(PFA3)을 코딩하는 유전자 PFA3
    을 포함하도록 미세조류를 변형하여 숙주 미세조류와 비교하여 유전자 PFA1, 유전자 PFA3, 또는 유전자 PFA1 및 유전자 PFA3 둘다의 발현 수준을 증가시키는 단계; 및
    b) 변형된 미세조류를 배양하여 숙주 미세조류와 비교하여 오메가-3 PUFA의 양이 강화된 지질을 생산하는 단계
    를 포함하는, 미세조류에서 오메가-3 PUFA의 양이 강화된 지질의 생산 방법.
  23. 삭제
  24. 제22항에 있어서,
    유전자 PFA1, 유전자 PFA3 유전자, 또는 PFA1 및 유전자 PFA3 둘다의 발현이 숙주 미세조류와 비교하여 1.5배만큼 증가되는, 생산 방법.
  25. 제22항에 있어서,
    미세조류가 라비린툴로미세테스인, 생산 방법.
  26. 제25항에 있어서,
    라비린툴로미세테스가 트라우스토키트리드인, 생산 방법.
  27. 제26항에 있어서,
    트라우스토키트리드가 쉬조키트리움 또는 트라우스토키트리움인, 생산 방법.
  28. 제26항에 있어서,
    트라우스토키트리드가 쉬조키트리움인, 생산 방법.
  29. 제22항에 있어서,
    미세조류가 PFA1의 발현을 증가시키도록 변형되는, 생산 방법.
  30. 제22항에 있어서,
    미세조류가 PFA1 및 PFA3의 발현을 증가시키도록 변형되는, 생산 방법.
  31. 삭제
  32. 제22항에 있어서,
    PFA1, PFA3, 또는 PFA1 및 PFA3 둘다의 발현이 숙주 미세조류에 고유한 프로모터에 의해 구동되는, 생산 방법.
  33. 제22항에 있어서,
    미세조류가 PFA1을 코딩하는 유전자, PFA3을 코딩하는 유전자, 또는 PFA1을 코딩하는 유전자 및 PFA3을 코딩하는 유전자 둘다의 카피를 다수 함유하도록 변형되는, 생산 방법.
  34. 삭제
  35. 제33항에 있어서,
    미세조류가 PFA1을 코딩하는 유전자의 2 내지 10개의 카피를 함유하는, 생산 방법.
  36. 제33항에 있어서,
    미세조류가 PFA1을 코딩하는 유전자의 3 내지 7개의 카피를 함유하는, 생산 방법.
  37. 제33항에 있어서,
    미세조류가 PFA1을 코딩하는 유전자의 4 내지 6개의 카피를 함유하는, 생산 방법.
  38. 제22항에 있어서,
    하나 이상의 내인성 PUFA 신타제 유전자가 결실되는, 생산 방법.
  39. 삭제
  40. 제22항에 있어서,
    오메가-3 PUFA의 양이 강화된 지질이 EPA를 포함하는, 생산 방법.
  41. 제40항에 있어서,
    지질 내의 EPA가 숙주 미세조류와 비교하여 2배 이상만큼 증가되는, 생산 방법.
  42. 제22항에 있어서,
    오메가-3 PUFA의 양이 강화된 지질이 도코사헥사엔산(DHA)을 포함하는, 생산 방법.
  43. 제42항에 있어서,
    EPA:DHA 비가 숙주 미세조류와 비교하여 2배 이상만큼 증가되는, 생산 방법.
  44. 제22항에 있어서,
    지질 내의 오메가-3 PUFA:오메가-6 PUFA의 비가 숙주 미세조류와 비교하여 증가되는, 생산 방법.
  45. 서열번호 1의 폴리뉴클레오티드 서열 또는 서열번호 2의 아미노산 서열로 이루어진 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열로 이루어진, 다중불포화 지방산 신타제 아단위 1(PFA1)을 코딩하는 유전자 PFA1,
    서열번호 3의 폴리뉴클레오티드 서열 또는 서열번호 4의 아미노산 서열로 이루어진 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열로 이루어진, 다중불포화 지방산 신타제 아단위 2(PFA2)을 코딩하는 유전자 PFA2, 및
    서열번호 5의 폴리뉴클레오티드 서열 또는 서열번호 6의 아미노산 서열로 이루어진 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열로 이루어진, 다중불포화 지방산 신타제 아단위 3(PFA3)을 코딩하는 유전자 PFA3
    을 포함하는 재조합 미세조류로서,
    숙주 미세조류와 비교하여 유전자 PFA1, 유전자 PFA3, 또는 유전자 PFA1 및 유전자 PFA3 둘다의 발현 수준을 증가시키도록 변형되고,
    숙주 미세조류와 비교하여 오메가-3 PUFA의 양이 강화된 지질을 생산하는 재조합 미세조류.
  46. 제45항에 있어서,
    지질이 숙주 미세조류와 비교하여 증가된 오메가-3 PUFA:오메가-6 PUFA 비를 갖는, 재조합 미세조류.
  47. a) 서열번호 1의 폴리뉴클레오티드 서열 또는 서열번호 2의 아미노산 서열로 이루어진 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열로 이루어진, 다중불포화 지방산 신타제 아단위 1(PFA1)을 코딩하는 유전자 PFA1,
    서열번호 3의 폴리뉴클레오티드 서열 또는 서열번호 4의 아미노산 서열로 이루어진 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열로 이루어진, 다중불포화 지방산 신타제 아단위 2(PFA2)을 코딩하는 유전자 PFA2, 및
    서열번호 5의 폴리뉴클레오티드 서열 또는 서열번호 6의 아미노산 서열로 이루어진 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열로 이루어진, 다중불포화 지방산 신타제 아단위 3(PFA3)을 코딩하는 유전자 PFA3
    을 포함하도록 미세조류를 변형하여 숙주 미세조류와 비교하여 유전자 PFA1, 유전자 PFA3, 또는 유전자 PFA1 및 유전자 PFA3 둘다의 발현 수준을 증가시키는 단계; 및
    b) 변형된 미세조류를 배양하여 숙주 미세조류와 비교하여 감소된 수준의 오메가-6 PUFA의 양을 갖는 지질을 생산하는 단계
    를 포함하는, 미세조류에서 감소된 수준의 오메가-6 PUFA의 양을 갖는 지질의 생산 방법.
  48. 제47항에 있어서,
    지질 내의 오메가-6 PUFA:오메가-3 PUFA의 비가 숙주 미세조류와 비교하여 감소되는, 생산 방법.
  49. 제47항 또는 제48항에 있어서,
    지질 내의 도코사펜타엔산(DPA) n-6:EPA의 비가 숙주 미세조류와 비교하여 감소되는, 생산 방법.
  50. 제47항 또는 제48항에 있어서,
    지질 내의 DPA n-6:DHA의 비가 숙주 미세조류와 비교하여 감소되는, 생산 방법.
  51. a) 이종 다중불포화 지방산(PUFA) 신타제 아단위 1(PFA1)인 폴리펩티드를 코딩하는 유전자;
    b) 이종 PUFA 신타제 아단위 2(PFA2)인 폴리펩티드를 코딩하는 유전자; 및
    c) 이종 PUFA 신타제 아단위 3(PFA3)인 폴리펩티드를 코딩하는 유전자
    를 포함하고 PFA1, PFA3, 또는 PFA1 및 PFA3 둘다의 발현을 증가시키도록 변형된 재조합 미세조류로서,
    a), b) 및 c)의 유전자가 5 중량% 이상의 에이코사펜타엔산(C20:5, n-3)(EPA)을 함유하는 지질을 생산하는 라비린툴로미세테스로부터 유래하고,
    a)의 유전자가 서열번호 1의 폴리뉴클레오티드 서열 또는 서열번호 2의 아미노산 서열로 이루어진 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열로 이루어지고,
    b)의 유전자가 서열번호 3의 폴리뉴클레오티드 서열 또는 서열번호 4의 아미노산 서열로 이루어진 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열로 이루어지고,
    c)의 유전자가 서열번호 5의 폴리뉴클레오티드 서열 또는 서열번호 6의 아미노산 서열로 이루어진 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열로 이루어진
    재조합 미세조류.
  52. 제51항에 있어서,
    이종 PFA1, PFA2 및 PFA3이 유래되는 라비린툴로미세테스가 숙주 미세조류보다 많은 EPA를 생산하는, 재조합 미세조류.
  53. 제51항 또는 제52항에 있어서,
    미세조류가 하나 이상의 프로모터를 함유하도록 변형되고, 상기 프로모터가 PFA1을 코딩하는 유전자, PFA3을 코딩하는 유전자, 또는 PFA1을 코딩하는 유전자 및 PFA3을 코딩하는 유전자 둘다에 작동적으로 연결되는, 재조합 미세조류.
  54. 제51항 또는 제52항에 있어서,
    미세조류가 PFA1을 코딩하는 유전자, PFA3을 코딩하는 유전자, 또는 PFA1을 코딩하는 유전자 및 PFA3을 코딩하는 유전자 둘다의 카피를 2개 이상 함유하도록 변형되는, 재조합 미세조류.
  55. 삭제
  56. 제51항 또는 제52항에 있어서,
    하나 이상의 내인성 PUFA 신타제 유전자가 결실되는, 재조합 미세조류.
  57. 삭제
  58. 제51항 또는 제52항에 있어서,
    PFA1의 발현을 증가시키도록 변형된 재조합 미세조류.
  59. 제51항 또는 제52항에 있어서,
    PFA1 및 PFA3의 발현을 증가시키도록 변형된 재조합 미세조류.
  60. 제51항 또는 제52항에 있어서,
    미세조류가 라비린툴로미세테스인, 재조합 미세조류.
  61. 제60항에 있어서,
    라비린툴로미세테스가 트라우스토키트리드인, 재조합 미세조류.
  62. 제61항에 있어서,
    트라우스토키트리드가 쉬조키트리움 또는 트라우스토키트리움인, 재조합 미세조류.
  63. 제62항에 있어서,
    트라우스토키트리드가 쉬조키트리움인, 재조합 미세조류.
  64. 서열번호 1의 폴리뉴클레오티드 서열 또는 서열번호 2의 아미노산 서열로 이루어진 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열로 이루어진, 다중불포화 지방산 신타제 아단위 1(PFA1)을 코딩하는 유전자 PFA1,
    서열번호 3의 폴리뉴클레오티드 서열 또는 서열번호 4의 아미노산 서열로 이루어진 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열로 이루어진, 다중불포화 지방산 신타제 아단위 2(PFA2)을 코딩하는 유전자 PFA2, 및
    서열번호 5의 폴리뉴클레오티드 서열 또는 서열번호 6의 아미노산 서열로 이루어진 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열로 이루어진, 다중불포화 지방산 신타제 아단위 3(PFA3)을 코딩하는 유전자 PFA3
    을 포함하는 재조합 식물로서,
    숙주 식물과 비교하여 유전자 PFA1, 유전자 PFA3, 또는 유전자 PFA1 및 유전자 PFA3 둘다의 발현 수준을 증가시키도록 변형되고,
    재조합 식물이 하나 이상의 포스포판테테인일 전달효소(PPTase)를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 추가로 포함하고, 변형된 재조합 식물이 숙주 식물과 비교하여 증가된 수준의 에이코사펜타엔산(EPA)의 양을 갖는 지질을 생산하는, 재조합 식물.
  65. 제64항에 있어서,
    유전자 PFA1, 유전자 PFA2 및 유전자 PFA3이 재조합 식물로 형질전환되는, 재조합 식물.
  66. 삭제
  67. 제64항 또는 제65항에 있어서,
    유전자 PFA1, 유전자 PFA3, 또는 유전자 PFA1 및 유전자 PFA3 둘다의 발현 수준이 숙주 식물과 비교하여 1.5배만큼 증가되는, 재조합 식물.
  68. 제64항 또는 제65항에 있어서,
    PFA1의 발현을 증가시키도록 변형된 재조합 식물.
  69. 제64항 또는 제65항에 있어서,
    PFA1 및 PFA3의 발현을 증가시키도록 변형된 재조합 식물.
  70. 삭제
  71. 제64항 또는 제65항에 있어서,
    식물이 하나 이상의 식물-특이적 프로모터를 함유하도록 변형되고, 상기 프로모터가 PFA1을 코딩하는 유전자, PFA3을 코딩하는 유전자, 또는 PFA1을 코딩하는 유전자 및 PFA3을 코딩하는 유전자 둘다에 작동적으로 연결되는, 재조합 식물.
  72. 제64항 또는 제65항에 있어서,
    PFA1을 코딩하는 유전자, PFA3을 코딩하는 유전자, 또는 PFA1을 코딩하는 유전자 및 PFA3을 코딩하는 유전자 둘다의 카피를 다수 함유하도록 변형되는, 재조합 식물.
  73. 삭제
  74. 제64항 또는 제65항에 있어서,
    식물이 PFA1을 코딩하는 유전자의 2 내지 10개의 카피를 함유하는, 재조합 식물.
  75. 제64항 또는 제65항에 있어서,
    식물이 PFA1을 코딩하는 유전자의 3 내지 7개의 카피를 함유하는, 재조합 식물.
  76. 제64항 또는 제65항에 있어서,
    식물이 PFA1을 코딩하는 유전자의 4 내지 6개의 카피를 함유하는, 재조합 식물.
  77. 제64항 또는 제65항에 있어서,
    지질 내의 EPA가 숙주 식물과 비교하여 2배 이상만큼 증가되는, 재조합 식물.
  78. 제64항 또는 제65항에 있어서,
    지질 내의 EPA:도코사헥사엔산(DHA)의 비가 숙주 식물과 비교하여 2배 이상만큼 증가되는, 재조합 식물.
  79. 제64항 또는 제65항에 있어서,
    식물이 고등 식물(higher plant); 쌍자엽 식물; 단자엽 식물; 애기장대; 소비용 식물(consumable plant); 지방종자 식물(oilseed plant); 대두; 평지씨; 캐놀라; 아마씨; 옥수수; 잇꽃; 해바라기; 담배; 파바세아에(Fabaceae) 과의 식물; 글리신(Glycine) 속의 식물; 땅콩; 파세올루스 불가리스(Phaseolus vulgaris); 비시아 파바(Vicia faba); 및 피숨 사티붐(Pisum sativum)으로 이루어진 군으로부터 선택되는, 재조합 식물.
  80. 서열번호 1의 폴리뉴클레오티드 서열 또는 서열번호 2의 아미노산 서열로 이루어진 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열로 이루어진, 다중불포화 지방산 신타제 아단위 1(PFA1)을 코딩하는 유전자 PFA1,
    서열번호 3의 폴리뉴클레오티드 서열 또는 서열번호 4의 아미노산 서열로 이루어진 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열로 이루어진, 다중불포화 지방산 신타제 아단위 2(PFA2)을 코딩하는 유전자 PFA2, 및
    서열번호 5의 폴리뉴클레오티드 서열 또는 서열번호 6의 아미노산 서열로 이루어진 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열로 이루어진, 다중불포화 지방산 신타제 아단위 3(PFA3)을 코딩하는 유전자 PFA3
    을 포함하도록 돌연변이 과정을 겪은 돌연변이 미세조류로서,
    유전자 PFA1, 유전자 PFA3, 또는 유전자 PFA1 및 유전자 PFA3 둘다의 발현 수준이 야생형 미세조류의 유전자 PFA1, 유전자 PFA3, 또는 유전자 PFA1 및 유전자 PFA3 둘다의 발현 수준과 비교하여 증가되고,
    야생형 미세조류와 비교하여 증가된 수준의 에이코사펜타엔산(EPA)의 양을 갖는 지질을 생산하는
    돌연변이 미세조류.
  81. 삭제
  82. 제80항에 있어서,
    유전자 PFA1, 유전자 PFA3, 또는 유전자 PFA1 및 유전자 PFA3 둘다의 발현 수준이 야생형 미세조류와 비교하여 2배 이상만큼 증가되는, 돌연변이 미세조류.
  83. 제80항에 있어서,
    미세조류가 라비린툴로미세테스인, 돌연변이 미세조류.
  84. 제83항에 있어서,
    라비린툴로미세테스가 트라우스토키트리드인, 돌연변이 미세조류.
  85. 제84항에 있어서,
    트라우스토키트리드가 쉬조키트리움 또는 트라우스토키트리움인, 돌연변이 미세조류.
  86. 제85항에 있어서,
    트라우스토키트리드가 쉬조키트리움인, 돌연변이 미세조류.
  87. 제80항에 있어서,
    PFA1의 발현이 야생형 미세조류의 PFA1의 발현과 비교하여 증가되는, 돌연변이 미세조류.
  88. 제80항에 있어서,
    PFA1 및 PFA3의 발현이 야생형 미세조류의 PFA1 및 PFA3의 발현과 비교하여 증가되는, 돌연변이 미세조류.
  89. 제80항에 있어서,
    지질 내의 EPA가 야생형 미세조류와 비교하여 2배 이상만큼 증가되는, 돌연변이 미세조류.
  90. 제80항에 있어서,
    지질 내의 EPA:도코사헥사엔산(DHA)의 비가 야생형 미세조류와 비교하여 2배 이상만큼 증가되는, 돌연변이 미세조류.
  91. 제80항에 있어서,
    지질 내의 DHA가 야생형 미세조류와 비교하여 증가되는, 돌연변이 미세조류.
KR1020187035757A 2016-05-12 2017-05-11 미세조류에서 오메가-3 다중불포화 지방산 생산을 증가시키는 방법 KR102442450B1 (ko)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US201662335498P 2016-05-12 2016-05-12
US62/335,498 2016-05-12
PCT/EP2017/061347 WO2017194683A1 (en) 2016-05-12 2017-05-11 Method of increasing omega-3 polyunsaturated fatty acids production in microalgae

Publications (2)

Publication Number Publication Date
KR20190004798A KR20190004798A (ko) 2019-01-14
KR102442450B1 true KR102442450B1 (ko) 2022-09-14

Family

ID=58800789

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
KR1020187035757A KR102442450B1 (ko) 2016-05-12 2017-05-11 미세조류에서 오메가-3 다중불포화 지방산 생산을 증가시키는 방법

Country Status (9)

Country Link
US (1) US20190144838A1 (ko)
EP (1) EP3455351B1 (ko)
JP (1) JP6966040B2 (ko)
KR (1) KR102442450B1 (ko)
CN (1) CN109477079A (ko)
BR (1) BR112018073164A2 (ko)
ES (1) ES2930078T3 (ko)
PL (1) PL3455351T3 (ko)
WO (1) WO2017194683A1 (ko)

Families Citing this family (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2023070027A2 (en) * 2021-10-20 2023-04-27 University Of Puerto Rico Fatty acid production in escherichia coli

Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2010108114A2 (en) * 2009-03-19 2010-09-23 Martek Biosciences Corporation Polyunsaturated fatty acid synthase nucleic acid molecules and polypeptides, compositions, and methods of making and uses thereof
WO2015081270A1 (en) * 2013-11-26 2015-06-04 Dow Agrosciences Llc Production of omega-3 long-chain polyunsaturated fatty acids in oilseed crops by a thraustochytrid pufa synthase

Family Cites Families (30)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5380831A (en) 1986-04-04 1995-01-10 Mycogen Plant Science, Inc. Synthetic insecticidal crystal protein gene
US4743546A (en) 1985-02-13 1988-05-10 Biotechnica International, Inc. Controlled gene excision
US4683202A (en) 1985-03-28 1987-07-28 Cetus Corporation Process for amplifying nucleic acid sequences
US5130242A (en) 1988-09-07 1992-07-14 Phycotech, Inc. Process for the heterotrophic production of microbial products with high concentrations of omega-3 highly unsaturated fatty acids
WO1997013402A1 (en) 1995-10-13 1997-04-17 Dow Agrosciences Llc Modified bacillus thuringiensis gene for lepidopteran control in plants
WO1998055625A1 (en) 1997-06-04 1998-12-10 Calgene, Llc Production of polyunsaturated fatty acids by expression of polyketide-like synthesis genes in plants
US6566583B1 (en) 1997-06-04 2003-05-20 Daniel Facciotti Schizochytrium PKS genes
ATE305048T1 (de) 1997-08-01 2005-10-15 Martek Biosciences Corp Dha-enthaltende naehrzusammensetzungen und verfahren zu deren herstellung
US7217856B2 (en) 1999-01-14 2007-05-15 Martek Biosciences Corporation PUFA polyketide synthase systems and uses thereof
US7211418B2 (en) 1999-01-14 2007-05-01 Martek Biosciences Corporation PUFA polyketide synthase systems and uses thereof
US7247461B2 (en) 1999-01-14 2007-07-24 Martek Biosciences Corporation Nucleic acid molecule encoding ORFA of a PUFA polyketide synthase system and uses thereof
US20070244192A1 (en) 1999-01-14 2007-10-18 Martek Biosciences Corporation Plant seed oils containing polyunsaturated fatty acids
US8003772B2 (en) 1999-01-14 2011-08-23 Martek Biosciences Corporation Chimeric PUFA polyketide synthase systems and uses thereof
CN100460513C (zh) 2000-01-19 2009-02-11 马泰克生物科学公司 无溶剂的提取方法
TWI324181B (en) 2001-04-16 2010-05-01 Martek Biosciences Corp Product and process for transformation of thraustochytriales microorganisms
JP4280158B2 (ja) 2002-12-27 2009-06-17 富士フイルム株式会社 ドコサヘキサエン酸生産能を有する微生物及びその利用
US20040172682A1 (en) 2003-02-12 2004-09-02 Kinney Anthony J. Production of very long chain polyunsaturated fatty acids in oilseed plants
CA2520396C (en) * 2003-03-26 2016-08-09 Martek Biosciences Corporation Pufa polyketide synthase systems and uses thereof
US7208590B2 (en) 2003-07-15 2007-04-24 Abbott Laboratories Genes involved in polyketide synthase pathways and uses thereof
DE102004017370A1 (de) 2004-04-08 2005-10-27 Nutrinova Nutrition Specialties & Food Ingredients Gmbh PUFA-PKS Gene aus Ulkenia
US7348473B2 (en) 2004-09-30 2008-03-25 Dow Agrosciences Llc Canola cultivar NQC02CNX25
US7355100B2 (en) 2004-09-30 2008-04-08 Dow Agrosciences Llc Canola cultivar NQC02CNX12
US7456340B2 (en) 2005-04-04 2008-11-25 Dow Agrosciences Llc Canola cultivar NQC02CNX21
WO2006135866A2 (en) 2005-06-10 2006-12-21 Martek Biosciences Corporation Pufa polyketide synthase systems and uses thereof
US7868228B2 (en) 2006-01-31 2011-01-11 Monsanto Technology Llc Phosphopantetheinyl transferases from bacteria
CN104263729B (zh) 2009-03-16 2020-09-15 帝斯曼知识产权资产有限公司 在网粘菌门微生物中产生蛋白质
KR20150013667A (ko) * 2010-01-19 2015-02-05 디에스엠 아이피 어셋츠 비.브이. 에이코사펜타엔산 생산 미생물, 지방산 조성물 및 이의 제조방법 및 용도
TW201144442A (en) 2010-05-17 2011-12-16 Dow Agrosciences Llc Production of DHA and other LC-PUFAs in plants
EP2576801B1 (en) * 2010-06-01 2019-10-02 DSM IP Assets B.V. Extraction of lipid from cells and products therefrom
TW201307553A (zh) 2011-07-26 2013-02-16 Dow Agrosciences Llc 在植物中生產二十二碳六烯酸（ｄｈａ）及其他長鏈多元不飽和脂肪酸（ｌｃ－ｐｕｆａ）之技術

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2010108114A2 (en) * 2009-03-19 2010-09-23 Martek Biosciences Corporation Polyunsaturated fatty acid synthase nucleic acid molecules and polypeptides, compositions, and methods of making and uses thereof
WO2015081270A1 (en) * 2013-11-26 2015-06-04 Dow Agrosciences Llc Production of omega-3 long-chain polyunsaturated fatty acids in oilseed crops by a thraustochytrid pufa synthase

Also Published As

Publication number Publication date
PL3455351T3 (pl) 2022-11-21
JP2019514382A (ja) 2019-06-06
ES2930078T3 (es) 2022-12-07
CN109477079A (zh) 2019-03-15
KR20190004798A (ko) 2019-01-14
EP3455351A1 (en) 2019-03-20
JP6966040B2 (ja) 2021-11-10
US20190144838A1 (en) 2019-05-16
EP3455351B1 (en) 2022-08-24
WO2017194683A1 (en) 2017-11-16
BR112018073164A2 (pt) 2019-04-30

Similar Documents

Publication Publication Date Title
KR101539470B1 (ko) 키메라 ｐｕｆａ 폴리케타이드 신테이즈 시스템 및 이의 용도
US11053511B2 (en) Production of DHA and other LC PUFAs in plants
CA2421267C (en) Fad4, fad5, fad5-2, and fad6, novel fatty acid desaturase family members and uses thereof
TWI337619B (en) Pufa polyketide synthase systems and uses thereof
TW200806792A (en) Polyunsaturated fatty acid production in heterologous organisms using pufa polyketide synthase systems
US7208590B2 (en) Genes involved in polyketide synthase pathways and uses thereof
KR102442450B1 (ko) 미세조류에서 오메가-3 다중불포화 지방산 생산을 증가시키는 방법
EP3040415A1 (en) Omega-3 UNSATURATED FATTY ACID ENZYME AND METHOD FOR PRODUCING EICOSAPENTAENOIC ACID
US20140359900A1 (en) Production of dha and other lc pufas in plants
US10538793B2 (en) ω3 fatty-acid desaturase and method for producing eicosapentaenoic acid

Legal Events

Date Code Title Description
A201 Request for examination
E902 Notification of reason for refusal
E701 Decision to grant or registration of patent right
GRNT Written decision to grant