DE69826596T2

DE69826596T2 - Verbesserte methode zur transformation von pflanzen

Info

Publication number: DE69826596T2
Application number: DE69826596T
Authority: DE
Inventors: Kathleen D'halluin
Original assignee: Bayer Bioscience NV
Current assignee: Bayer CropScience NV
Priority date: 1997-02-20
Filing date: 1998-02-20
Publication date: 2006-02-09
Anticipated expiration: 2018-02-21
Also published as: CN1222939A; CN1155715C; AU6002798A; WO1998037212A1; DK0900279T3; AU727570B2; BR9805900A; US6140553A; JP4199312B2; ES2229472T3; JP2000509612A; US6372963B1; ATE278026T1; EP0900279B1; DE69826596D1; CA2252612C; PT900279E; CA2252612A1; EP0900279A1; BR9805900B1

Description

ALLGEMEINER STAND DER TECHNIK
Gebiet der Erfindung
Die vorliegende Erfindung betrifft Gewebekulturen von Pflanzenzellen, insbesondere von Monokotyledonen-Pflanzenzellen, ganz besonders Mais-, Reis-, Weizen- und Gerstenzellen, und verbesserte Techniken zur Gewinnung von genetisch transformierten Pflanzenzellen und Pflanzen.
Beschreibung des Stands der Technik
Im Lauf der Zeit wurden viele Techniken für die genetische Transformation von Pflanzen entwickelt. Das schlussendliche Ziel dieser Verfahren besteht in der Gewinnung einer transgenen Pflanze, in der alle Zellen eine Fremd-DNA mit einem interessierenden Gen (dem sogenannten Transgen) stabil in ihr Genom, insbesondere ihr Zellkerngenom integriert, enthalten.
Bei der Transformation handelt es sich um ein komplexes Verfahren, das immer den Schritt des Inkontaktbringens von Ausgangszellen mit einer DNA, üblicherweise einer DNA mit einem interessierenden Fremdgen bzw. mit interessierenden Fremdgenen, beinhaltet. Das Inkontaktbringen der Zellen mit der DNA wird unter Bedingungen durchgeführt, die die Aufnahme der DNA durch die Zellen und die Integration der DNA inklusive dem interessierenden Gen bzw. den interessierenden Genen in das Genom der Zelle fördern.
Bei den Ausgangszellen für die Transformation handelt es sich üblicherweise um Zellen, die eine gewisse Zeit lang in vitro kultiviert worden sind. Nach dem Inkontaktbringen der Zellen mit der DNA müssen die transformierten Zellen im Allgemeinen eine gewisse Zeit lang in vitro kultiviert werden, um die transformierten Zellen von den nicht-transformierten Zellen abzutrennen und um transformierte Pflanzen aus den transformierten Zellen zu regenerieren.
Es wurden unterschiedliche Pflanzentransformationsmethoden beschrieben; diese können in Methoden für den direkten DNA-Transfer (z. B. Elektroporation, PEG-vermittelte DNA-Aufnahme, Genkanone) oder in Agrobacterium-vermittelten DNA-Transfer eingeteilt werden. Vasil (1994) und Christou (1994) haben sich in einem Übersichtsartikel mit den für Getreide verfügbaren Pflanzentransformationsmethoden befaßt. Beim Agrobacterium-vermittelten DNA-Transfer handelt es sich um einen der wirksamsten Wege, DNA in Pflanzenzellen einzubringen, der vermutlich von allen unterschiedlichen Transformationsmethoden gerätemäßig den geringsten technischen Aufwand erfordert. Auch quantitativ sind die durch Agrobacterium-vermittelten DNA-Transfer erhaltenen transformierten Pflanzen überlegen, und zwar dadurch, dass sie weniger Transgene an unterschiedlichen Positionen im Chromosom intertiert enthalten und dass fehlerhafte Transgene weniger häufig auftreten. Die Agrobacterium-vermittelte DNA-Transformation von Pflanzen beruht auf der Fähigkeit von gewissen Agrobakteriumstämmen, einen Teil ihres Ti-Plasmids, also die T-DNA, in Pflanzenzellen einzubringen und diese T-DNA in das Zellkerngenom der Zellen zu integrieren. Es wurde gefunden, dass der Teil des Ti-Plasmids, der übertragen und integriert wird, von spezifischen DNA-Sequenzen, den sogenannten linken und rechten T-DNA-Border-Sequenzen, begrenzt wird und dass die natürlichen T-DNA-Sequenzen zwischen diesen Border-Sequenzen durch Fremd-DNA ersetzt werden können (European Patent Publication „EP" 116718; Deblaere et al., 1987).
Über die Agrobacterium-vermittelte Transformation von monokotylen Pflanzen wurde mehrmals berichtet (siehe oben). Die Anwendbarkeit der Methoden, über die berichtet wurde, war jedoch auf spezifische Arten oder Genotypen beschränkt oder erforderte die Verwendung von spezifischen Geweben oder spezialisierten Agrobakterienstämmen. Bei den meisten beschriebenen Methoden kann die Transformationseffizienz noch beträchtlich verbessert werden.
Hooykaas-Van Slogteren et al. (1984) beschreibt den Nachweis der Ti-Plasmid-Genexpression in zwei Monokotyledonen-Arten (Chlorophytum capense und Narcissus cv ,Paperwhite'), die mit tumorerzeugenden Agrobakterienstämmen infiziert wurden.
Hernalsteens et al. (1984) und Bytebier et al (1987) beschreiben die Transformation von Asparagus officinalis mit natürlichen Agrobacterium tumefaciens-Isolaten sowie Agrobacterium tumefaciens-Stämmen, die eine nichtonkogene T-DNA enthalten.
US-Patent Nr. 5,164,310 beschreibt ein Verfahren für die Transformation von Pflanzen (darunter auch Mais und Weizen) durch Inokulieren von herauspräparierten, in Kultur befindlichen Sprossspitzen der Pflanzen mit Agrobacterium tumefaciens.
US-Patente Nr. 5,187,073 und 5,177,010 beschreiben ein Verfahren zur Herstellung von transformierten Graminaea (Mais), bei dem einem Keimling an einer Stelle des Keimlings, die Zellen, die sich rasch teilen, enthält, eine Wunde zugefügt wird und die Wunde mit vir+ Agrobacterium tumefaciens inokuliert wird.
Die PCT-Patentveröffentlichung WO 92/09696 beschreibt die Verwendung von festem embryogenem Kallus (d. h. Typ I-Kallus bei Mais) und unreifen Embryonen (die entweder mechanisch oder enzymatisch verwundet wurden) von monokotylen Pflanzen (z. B. Mais und Reis) als Ausgangsmaterial für Transformationsvorgänge.
EP 0604662 A1 beschreibt ein Verfahren zur Transformation von in Kultur befindlichen Geweben einer monokotylen Pflanze während oder nach Entdifferenzierung mit einem Bakterium der Gattung Agrobacterium, das erwünschte Gene enthält. EP 0672752 beschreibt ein Verfahren zur Transformation eines Scutellums eines nicht-entdifferenzierten unreifen Embryos einer monokotylen Pflanze mit einem Agrobacterium. In beiden Anmeldungen wird die Verwendung von Agrobakterienstämmen, die zusätzlich zu dem Ti- oder Ri-Plasmid ein Plasmid enthalten, das ein DNA-Fragment aus der Virulenzregion des Ti-Plasmids pTiBo542 enthält, beschrieben.
Raineri et al. (1990) beschreibt die Transformation von aus Embryonen entstandenen Kulturen von zwei Reissorten, die in der Scutellum-Region verwundet wurden, wobei ein Agrobacterium-vermitteltes Gentransfersystem verwendet wurde.
Chan et al. (1993) beschreibt ein Verfahren für die Transformation von unreifen Reisembryonen, die 2 Tage lang in Gegenwart von 2,4-Dichlorphenoxyessigsäure („2,4-D") kultiviert worden waren, durch Inokulation mit Agrobakterienstämmen auf einem Medium, das Kartoffelsuspensionskulturzellen enthält.
Mooney et al., (1991) beschreibt ein Verfahren für die Agrobacterium-vermittelte Einbringung eines Kanamycinresistenzgens in enzymbehandelte Weizenembryonen.
Über die Induktion der vir-Gene von Ti-Plasmiden oder Helferplasmiden von Agrobakterienstämmen durch Inkubation der Bakterien mit Acetosyringon vor der Co-Kultivierung zur Förderung der Transformation und Zugabe von Acetosyringon während der Co-Kultivierung der Pflanzenzellen mit den Bakterien wurde berichtet (Van Wordragen und Dons, 1992; Jacq et al., 1993; James et al., 1993).
Guivarc'h et al. (1993) beschreibt die Verbesserung der transienten Agrobacterium-vermittelten Transformation von Karottenwurzelscheibchen durch eine zehnminütige Kurzvorbehandlung dieser Scheibchen mit Acetosyringon.
DARSTELLUNG UND ZIELE DER ERFINDUNG
Es wird ein Verfahren zum Integrieren eines DNA-Fragments in das Genom einer Zelle einer monokotylen Pflanze, insbesondere Mais, Reis, Weizen oder Gerste, bereitgestellt, das die folgenden Schritte umfasst:

1) Inkubieren einer Zellkultur nicht-transformierter Monokotyledonen-Pflanzenzellen auf einem Medium, das eine pflanzliche phenolische Verbindung, insbesondere eine pflanzliche phenolische Verbindung aus der Gruppe Acetosyringon, α-Hydroxyacetosyringon, Sinapinsäure, Syringasäure, Ferulasäure, Brenzkatechin, Parahydroxybenzoesäure, β-Resorcylsäure, Protocatechusäure, Pyrogallol, Gallussäure und Vanillin für eine Zeitdauer, die ausreicht, um die Zellteilung zu stimulieren und die Kompetenz für die Integration von Fremd-DNA zu erhöhen, vorzugsweise ungefähr 1 bis 10 Tage, insbesondere ungefähr 4 bis 5 Tage, bevor die Zellkultur mit dem DNA-Fragment in Kontakt gebracht wird; und
2) Inkontaktbringen der nicht-transformierten Zellen mit dem DNA-Fragment unter Bedingungen, bei denen das DNA-Fragment von den nicht-transformierten Zellen aufgenommen und stabil in das Genom der nicht-transformierten Zellen integriert wird, um transformierte Zellen zu erzeugen, insbesondere mittels Elektroporation, direktem Gentransfer unter Verwendung von Polyethylenglycol, Beschuss mit DNA-beschichteten Mikroprojektilen oder durch Co-Kultivierung mit einem Agrobakteriumstamm, der das DNA-Fragment enthält.

Gegebenenfalls können die transformierten Zellen zu einer transgenen monokotylen Pflanze regeneriert werden.
Weiterhin wird ein Verfahren zum Integrieren eines DNA-Fragments in das Genom einer Zelle einer Maispflanze bereitgestellt, das die folgenden Schritte umfasst:
Inkubieren eines Typ I-Kallus, vorzugsweise eines Typ I-Kallus, der in Fragmente geschnitten wurde, insbesondere Fragmente mit einer maximalen Länge von 0,5 bis 5 mm, mit einer pflanzlichen phenolischen Verbindung, insbesondere einer pflanzlichen phenolischen Verbindung aus der Gruppe Acetosyringon, α-Hydroxyacetosyringon, Sinapinsäure, Syringasäure, Ferulasäure, Brenzkatechin, Parahydroxybenzoesäure, β-Resorcylsäure, Protocatechusäure, Pyrogallol, Gallussäure und Vanillin für eine Zeitdauer, die ausreicht, um die Zellteilung zu stimulieren und die Kompetenz für die Integration von Fremd-DNA zu erhöhen, vorzugsweise ungefähr 1 bis 10 Tage, insbesondere ungefähr 4 bis 5 Tage, bevor der Kallus mit dem DNA-Fragment in Kontakt gebracht wird; oder
Inkubieren eines Typ I-Kallus auf einem Medium, das eine pflanzliche phenolische Verbindung enthält, für eine Zeitdauer, die ausreicht, um die Zellteilung zu stimulieren und die Kompetenz für die Integration von Fremd-DNA zu fördern, bevor der Typ I-Kallus in Fragmente, insbesondere Fragmente mit einer Maximallänge von 0,5 bis 5 mm geschnitten wird, bevor der Kallus mit dem DNA-Fragment in Kontakt gebracht wird; sowie
2) Inkontaktbringen der nicht-transformierten Zellen mit dem DNA-Fragment unter Bedingungen, bei denen das DNA-Fragment von den nicht-transformierten Zellen aufgenommen und stabil in das Genom der nicht-transformierten Zellen integriert wird, um transformierte Zellen zu erzeugen, insbesondere mittels Elektroporation, direktem Gentransfer unter Verwendung von Polyethylenglycol, Beschuss mit DNA-beschichteten Mikroprojektilen oder durch Co-Kultivierung mit einem Agrobakteriumstamm, der das DNA-Fragment enthält.
Ebenfalls bereitgestellt wird ein Verfahren zur Erhöhung der stabilen Transformationshäufigkeit in monokotylen Pflanzen in Gegenwart einer pflanzlichen phenolischen Verbindung, wobei die pflanzliche phenolische Verbindung in das Medium, in dem Pflanzenzellen kultiviert werden, eingearbeitet wird, bevor das in Kultur befindliche Gewebe mit der Fremd-DNA in Kontakt gebracht wird.
Weiterhin werden Pflanzenmedienzusammensetzungen, die mindestens zwei pflanzliche phenolische Verbindungen umfassen, bereitgestellt.
DETAILLIERTE BESCHREIBUNG VON BEVORZUGTEN AUSFÜHRUNGSFORMEN
Die Erfindung beruht auf der ursprünglichen Beobachtung, dass die Kultivierung von Pflanzenkalli, insbesondere Maiskalli, ganz besonders fein zerschnittene Stücke von Typ I-Maiskalli, auf einem Kulturmedium, das pflanzliche phenolische Verbindungen wie Acetosyringon enthält, über einen Zeitraum von ungefähr 5 Tagen die Zellteilung stark stimulierte und reproduzierbar Kalli mit erhöhter Kompetenz für die Integration von Fremd-DNA, die in die Zelle mittels Agrobakterium-vermittelter Transformation eingebracht wurde, in das Genom ergab, wie dies aus der Anzahl von transformierten Zellen und Pflanzen, die unter standardisierten Bedingungen gewonnen wurden, ersichtlich war.
„Nicht-transformierte Zellen" bedeuten im vorliegenden Zusammenhang Zellen, die nicht mit dem jeweiligen DNA-Fragment, das bei Anwendung des erfindungsgemäßen Verfahrens verwendet werden wird, in Kontakt gebracht wurden. Natürlich können solche Zellen auch von einer transgenen Pflanze bzw. von transgenem Pflanzengewebe, die bzw. das zuvor mit einem unterschiedlichen oder ähnlichen DNA-Fragment transformiert wurde, stammen.
Die „Transformationseffizienz" oder „Transformationshäufigkeit" kann im vorliegenden Zusammenhang durch die Anzahl der transformierten Zellen (oder der transgenen Organismen, die aus einzelnen transformierten Zellen herangezogen wurden), die unter Standardversuchsbedingungen (d. h. in Bezug auf die Anzahl Zellen, die mit Fremd-DNA in Kontakt gebracht wurden, Menge der abgegebenen DNA, Art und Bedingungen der DNA-Abgabe, allgemeinen Kulturbedingungen usw. standardisiert bzw. normalisiert) gewonnen werden. So kann z. B., wenn Kallusstücke als Ausgangsmaterial für die Transformation verwendet werden, die Transformationshäufigkeit als Anzahl transgener Pflanzenlinien, die pro 100 transformierte Kallusstücke erhalten werden, ausgedrückt werden. Mit dem erfindungsgemäßen Verfahren wurden Transformationshäufigkeiten von ungefähr 1% oder darüber erhalten.
Eine transgene „Pflanzenlinie" besteht im vorliegenden Zusammenhang aus einer Gruppe von transgenen Pflanzen, die von einer Einheit in Kultur befindlicher Zellen, z. B. einem transformierten Kallusstück, stammen und während der Regeneration erhalten wurden. Im Allgemeinen sind Pflanzen von einer Pflanzenlinie genetisch identisch und stammen von einem Transformationsereignis; sie umfassen daher die gleichen Transgene an den gleichen Genompositionen. Einzelne Pflanzen von einer Pflanzenlinie, wie sie im vorliegenden Text definiert ist, können jedoch aus unabhängigen Transformationsereignissen stammen, insbesondere wenn der Agrobacterium-vermittelte DNA-Transfer verwendet wird, und können sich so voneinander unterscheiden. Werden Transformationshäufigkeiten durch die Anzahl Pflanzenlinien/100 ursprüngliche Kallusstücke ausgedrückt, so kann es vorkommen, dass die tatsächlichen Transformationshäufigkeiten (Transformationsereignisse/100 ursprünglich verwendete Kallusstücke) sogar noch höher liegen.
„Pflanzliche phenolische Verbindungen" oder „pflanzliche Phenole", die sich für die Erfindung eignen, sind solche isolierten substituierten Phenolmoleküle, die eine positive chemotaktische Reaktion induzieren können, insbesondere solche, die eine verstärkte vir-Genexpression in einer Ti-Plasmid-haltigen Agrobacterium Spezies, insbesondere einem Ti-Plasmid-haltigen Agrobacterium tumefaciens, induzieren können. Verfahren zur Messung von chemotaktischen Reaktionen auf pflanzliche phenolische Verbindungen sind von Ashby et al. (1988) beschrieben worden, und Verfahren zur Messung der vir-Genexpression sind ebenfalls gut bekannt (Stachel et al., 1985; Bolton et al. 1986).
Es wird angenommen, dass die positive Auswirkung auf die Transformationseffizienz, die durch Inkubation der pflanzlichen Gewebe auf einem eine pflanzliche phenolische Verbindung enthaltenden Medium erzielt wird, größtenteils auf der Einleitung der Zellteilung und der Förderung der Kompetenz für den Einbau von Fremd-DNA in das Genom der Pflanzenzelle beruht. Es ist bekannt, dass die meisten monokotylen Pflanzen, insbesondere die Getreidearten, bei Verwundung anders reagieren, als dies bei den meisten dikotylen Pflanzen beobachtet wird (Potrykus, 1991). Es wird angenommen, dass die äußerliche Anwendung von pflanzlichen phenolischen Verbindungen eine wundartige Reaktion auslösen kann, insbesondere dann, wenn diese Verbindungen auf monokotyle Pflanzen aufgebracht werden. Die Induktion von vir-Genen durch Restkonzentrationen an pflanzlichen phenolischen Verbindungen, die von den vorbehandelten pflanzlichen Geweben aufgenommen wurden, können bei der Verwendung des Agrobacterium-vermittelten DNA-Transfers ebenfalls die Transformationseffizienz beeinflussen, es wird jedoch angenommen, dass diese Wirkung weniger ausgeprägt ist. Tatsächlich wurde eine ähnliche Verbesserung der Transformation auch dann beobachtet, wenn direkte DNA-Transfermethoden verwendet wurden.
Bei bevorzugten pflanzlichen phenolischen Verbindungen handelt es sich um diejenigen, die in Wundexsudaten von pflanzlichen Zellen auftreten. Eine der am besten bekannten pflanzlichen phenolischen Verbindungen ist Acetosyringon, das in verschiedenen verwundeten und intakten Zellen verschiedener Pflanzen auftritt, jedoch in unterschiedlichen Konzentrationen. Acetosyringon (3,5-Dimethoxy-4-hydroxyacetophenon) ist jedoch nicht das einzige pflanzliche Phenol, das die Expression von vir-Genen induzieren vermag. Weitere Beispiele sind α-Hydroxyacetosyringon, Sinapinsäure (3,5-Dimethoxy-4-hydroxyzimtsäure), Syringasäure (4-Hydroxy-3,5-dimethoxybenzoesäure), Ferulasäure (4-Hydroxy-3-methoxyzimtsäure), Brenzkatechin (1,2-Dihydroxybenzol), Parahydroxybenzoesäure (4-Hydroxybenzoesäure), β-Resorcylsäure (2,4-Dihydroxybenzoesäure), Protokatechusäure (3,4-Dihydroxybenzoesäure), Pyrogallol (2,3,4-Trihydroxybenzoesäure), Gallussäure (3,4,5-Trihydroxybenzoesäure) und Vanillin (3-Methoxy-4-hydroxybenzaldehyd), und von diesen phenolischen Verbindungen ist bekannt, bzw. wird erwartet, dass sie Acetosyringon in den Kulturmedien mit ähnlichen Ergebnissen ersetzen können. Im vorliegenden Text werden die obengenannten Moleküle als pflanzliche phenolische Verbindungen bezeichnet.
Pflanzliche phenolische Verbindungen können dem Pflanzenkulturmedium entweder allein oder in Kombination mit anderen pflanzlichen phenolischen Verbindungen zugegeben werden. Eine besonders bevorzugte Kombination von pflanzlichen phenolischen Verbindungen umfasst mindestens Acetosyringon und Parahydroxybenzoesäure, es wird jedoch erwartet, dass andere Kombinationen von zwei oder mehr pflanzlichen phenolischen Verbindungen bei der Erhöhung der Transformationseffizienz ebenfalls synergistisch wirken.
Weiterhin wird erwartet, dass gewisse Verbindungen wie osmotische Schutzmittel (z. B. L-Prolin, vorzugsweise in einer Konzentration von ungefähr 700 mg/l oder Betain), Pflanzenhormone (unter anderen NES), Opine oder Zucker in Kombination mit pflanzlichen phenolischen Verbindungen synergistisch wirken.
Obwohl sich die Erfindung besonders für den verbesserten Agrobacterium-vermittelten DNA-Transfer auf Pflanzenzellen, insbesondere Maiszellen, Pflanzenzellkulturen, insbesondere von monokotylen Pflanzen, die mit pflanzlichen Phenolen vorbehandelt wurden, können auch für eine verbesserte Transformationseffizienz bei direkten DNA-Transferverfahren, wie dem PEG-vermittelten DNA-Transfer, der Beschuss mit Partikeln oder die Elektroporation verwendet werden. Im Prinzip stellt die vorliegende Erfindung daher eine Verbesserung von bereits vorhandenen Vorgehensweisen für die genetische Transformation von Pflanzenzellen, insbesondere Monokotyledonenpflanzenzellen, ganz besonders Maiszellen, bereit, bei der bei dem Medium, in dem diese Zellen kultiviert werden, eine pflanzliche phenolische Verbindung wie Acetosyringon für eine gewisse Zeitdauer mitverwendet wird. Insbesondere werden die Pflanzenzellen oder Pflanzengewebe 5 Tage auf einem Kulturmedium, das Acetosyringon (100–200 μM) enthält, bevor die Zellen mit der Fremd-DNA, die in die Zellen entweder direkt mittels Elektroporation, PEG-vermitteltem DNA-Transfer oder Beschuss mit Partikeln, oder vorzugsweise über den Agrobacterium-vermittelten DNA-Transfer eingebracht wird, in Kontakt gebracht werden.
In einer bevorzugten Ausführungsform wird das erfindungsgemäße Verfahren zur Verbesserung der Transformationshäufigkeit bei dem Agrobacterium-vermittelten DNA-Transfer in Pflanzenzellen, insbesondere Maiszellen, verwendet.
Bei vielen traditionellen Vorgehensweisen für die genetische Transformation von Pflanzenzellen, insbesondere Monokotyledonen-Pflanzenzellen, werden in Kultur befindliche Zellen, Gewebe oder Explantate als Ausgangsmaterialien verwendet, und Zellen in solchen Kulturen werden mit Fremd-DNA, die mindestens ein interessierendes Gen (d. h. das Transgen) umfasst, unter Bedingungen, die die Aufnahme von Fremd-DNA in das Genom der Zellen fördert, in Kontakt gebracht. Geeignete Medien für die Kultivierung von pflanzlichen Zellen, Geweben, Organen oder Explantaten sind allgemein fachbekannt. Bevorzugte Pflanzenkulturmedien sind definierte Kulturmedien, deren chemische Zusammensetzung bekannt ist.
In einer Ausführungsform der Erfindung wird bevorzugt, dass die pflanzliche phenolische Verbindung, insbesondere Acetosyringon, dem Medium für eine Zeitdauer von ungefähr 4 bis 5 oder 6 Tagen, vorzugsweise mindestens ungefähr 5 Tage, zugegeben wird, bevor die Zellen mit der Fremd-DNA in Kontakt gebracht werden. Es wird angenommen, dass die genaue Zeitdauer, über die in Kultur befindliche Zellen in dem die pflanzliche phenolische Verbindung, wie Acetosyringon, enthaltenden Medium kultiviert werden, nicht kritisch ist, sie sollte jedoch vermutlich 2 Wochen nicht überschreiten. Es scheint, dass die optimale Zeitdauer 1–10 Tage, insbesondere 3–7 Tage, beträgt, und dass die besten Ergebnisse mit einer Inkubationszeitdauer von ungefähr 4 bis 5 oder 6 Tagen vor dem Zeitpunkt des Inkontaktbringens erzielt wurden. Im Allgemeinen wird angenommen, dass ungefähr 5 Tage eine nützliche Zeitdauer ist, über die die pflanzliche phenolische Verbindung dem Kulturmedium vor dem Zeitpunkt des Inkontaktbringens zugegeben werden soll.
Es ist anzumerken, dass das in Kultur befindliche Gewebe nach der Inkubation auf dem das pflanzliche Phenol umfassende Medium Bräunungserscheinungen, ja sogar in gewissem Ausmaß Nekrosen aufweisen kann, insbesondere dann, wenn bei dem Kulturmedium Gallussäure mitverwendet wird. Trotzdem kann mit diesen in Kultur befindlichen Zellen, Geweben oder Explantaten eine verbesserte Transforamtionseffizienz erzielt werden.
Weiterhin wird angenommen, dass die Konzentration der pflanzlichen phenolischen Verbindung in dem Medium eine Auswirkung auf die Entwicklung einer Kompetenz für die integrative Transformation, die vom Zelltyp (Spezies, Gewebeexplantat, allgemeine Kulturbedingungen usw.) abhängt, hat. Innerhalb gewisser Konzentrationsbereiche ist die Auswirkung jedoch minimal, insbesondere dann, wenn die in Kultur befindlichen Zellen nicht länger als 7 Tage inkubiert werden. Der optimale Konzentrationsbereich der pflanzlichen phenolischen Verbindungen in dem Medium kann je nach der Spezies, von der das Gewebe, die Zelle oder die Zellkultur abstammt, oder der verwendeten Gewebeart abhängen, es wird jedoch angenommen, dass 100 μM–200 μM eine geeignete Konzentration für viele Zwecke (z. B. für Material, das von Mais stammt) darstellt. Die optimale Konzentration kann auch von der Art der jeweiligen verwendeten pflanzlichen phenolischen Verbindung, insbesondere von seiner Fähigkeit, die Zellteilung zu fördern, abhängen.
So wurde z. B. gefunden, dass die optimale Acetosyringonkonzentration ungefähr 200 μM beträgt, dass jedoch Konzentrationen von nur ungefähr 25 μM verwendet werden können, um eine gute Auswirkung auf die Transformationseffizienz zu erzielen. Es wird auch angenommen, dass höhere Konzentrationen bis zu ungefähr 400 μM ähnliche Auswirkungen haben werden.
Vergleichbare Konzentrationen treffen auch bei anderen pflanzlichen phenolischen Verbindungen zu, und Optimalkonzentrationen können erfindungsgemäß leicht durch Versuchstätigkeit ermittelt werden.
Wie oben erwähnt beinhalten Vorgehensweisen bei der Transformation von Pflanzen im Allgemeinen die Kultivierung von Zellen, Zellkulturen, Geweben oder Explantaten, bevor das in Kultur befindliche Gewebe mit der Fremd-DNA in Kontakt gebracht wird. Als Ausgangsmaterialien für die Vorgehensweisen bei der Transformation wurden verschiedene Gewebe beschrieben, darunter trockene Samen, unreife Embryonen, unreife Blüten, Antheren, Mikrosporen, Scutella, Nodien, junge Blattbasen, Hypokotylexplantate, Wurzeln (insbesondere Wurzelspitzen), feste embryogene Kalli (z. B. Typ I bei Mais), lockere embryogene Kalli (z. B. Typ II bei Mais), Suspensionskulturen, Kulturen suspendierter Zellaggregate, somatische Embryonen und Sproßspitzen. Es wird erwartet, dass die Mitverwendung von pflanzlichen phenolischen Verbindungen, insbesondere Acetosyringon, in dem Medium, auf dem diese Gewebe, Zellen, Zellkulturen oder Explantate vor dem Inkontaktbringen mit der Fremd-DNA inkubiert werden, die Transformationseffizienz verbessern, insbesondere dann, wenn die Agrobacterium-vermittelte Transformation verwendet wird.
Es ist klar, dass, wenn der Begriff „Inkubieren auf einem (Pflanzen-)Medium" verwendet wird, dieses Medium entweder flüssig oder fest sein kann. Im Zusammenhang mit den Erfindungen umfassen die Pflanzenmedien mindestens eine pflanzliche phenolische Verbindung.
Es ist selbstverständlich, dass in Fällen, wo das schlußendliche Ziel des Transformationsverfahrens die Regeneration von transgenen Pflanzen, insbesondere von phänotypisch normalen Pflanzen, darstellt, das Ausgangsmaterial regenerationsfähig sein sollte, wie dies im Stand der Technik allgemein beschrieben ist.
In einer besonders bevorzugten Ausführungsform werden für die Transformation kompetente Pflanzenzellen, vorzugsweise für die Transformation mit Agrobacterium kompetente Pflanzenzellen, dadurch erzeugt, dass man festen regenerationsfähigen Kallus, wie Typ I-Maiskallus, auf einem Medium, das ein pflanzliches Phenol, vorzugsweise Acetosyringon, umfasst, inkubiert. Zu diesem Zweck wird der feste Kallus dadurch geteilt, dass man ihn in kleinere Fragmente schneidet. Der erhaltene Kallus sollte ganz oder zumindest teilweise die regenierbaren (z. B. die embryogenen) Abschnitte oder Teile des Kallus umfassen. Die Kallusfragmente weisen vorzugsweise auch eine durchschnittliche Maximallänge von 0,5 bis 5 mm, insbesondere 1 bis 2 mm, stärker bevorzugt 1,25 bis 1,75 mm und vorzugsweise eine Minimallänge von ungefähr 0,1 mm auf. Es ist jedoch trotzdem denkbar, größere Fragmente von Typ I-Kallus von bis zu ungefähr 1 cm zu verwenden. Nach der Kultivierung auf den Medien, die pflanzliche Phenole umfassen, können die Kalli mit der Fremd-DNA, vorzugsweise mit den Agrobakterien, die Fremd-DNA umfassen, ohne weitere Verwundung oder Enzymvorbehandlung in Kontakt gebracht werden.
Der feste Kallus kann jedoch auch ohne Verwundung (z. B. Schneiden) auf einem Medium, das eine pflanzliche phenolische Verbindung umfasst, inkubiert und anschließend verwundet, d. h. in kleinere Fragmente, insbesondere Fragmente, die die obengenannten Abmessungen aufweisen, geschnitten werden, bevor der Schritt des Inkontaktbringens durchgeführt wird.
In einer weiteren Ausführungsform werden für die Transformation kompetente Zellen, insbesondere für die Transformation mit Agrobacterium kompetente Zellen, dadurch erzeugt, dass man unreife Embryonen, vorzugsweise unreife Maisembryonen, auf einem Medium, das ein pflanzliches Phenol, vorzugsweise Acetosyringon, umfasst, inkubiert. Diesbezüglich ist es bei Pflanzen wie Mais bevorzugt, dass die unreifen Embryonen eine Maximallänge von etwa 0,5 bis 2 mm, vorzugsweise 0,5 bis 1,5 mm, aufweisen, obwohl auch kleinere Embryonen mit einer Länge von 0,5 bis 1 mm verwendet werden können. Nach der Kultivierung auf dem Medium, das pflanzliche Phenole umfasst, können die unreifen Embryonen mit der Fremd-DNA, vorzugsweise mit den Agrobakterien, die die Fremd-DNA umfassen, ohne weitere Verwundung oder Enzymvorbehandlung in Kontakt gebracht werden.
Es wurde gefunden, dass bei Verwendung der vorliegenden Erfindung verschiedene Maisgenotypen dem Agrobacterium-vermittelten DNA-Transfer zugänglich sind, insbesondere Mais, PHH [(Pa91xH99)xH99], Pa91 HE89 oder PHP[(Pa91xH99)xPa91]. Es wird daher erwartet, dass sich die Erfindung ohne Einschränkungen durch den Genotyp anwenden lassen kann, insbesondere für die Transformation von Mais.
Eine Vorkultivierung der erfindungsgemäßen Pflanzenzellen, insbesondere Maiszellen, erhöht die Transformationseffizienz des Agrobacterium-vermittelten DNA-Transfers, und es wird erwartet, dass dieser Effekt unabhängig vom chromosomalen Hintergrund des verwendeten Agrobacterium-Wirts, des verwendeten Ti-Plasmid-Typs, des verwendeten Helferplasmids oder des verwendeten T-DNA-Vektors ist. Das erfindungsgemäße Verfahren erweitert daher die Reihe der Agrobakteriumstämme, die wirksam verwendet werden können.
Besonders bevorzugte bakterielle chromosomale Hintergründe werden von A. tumefaciens C58C1 bereitgestellt (Van Larebeke et al., 1974), A136 (Watson et al., 1975) oder LBA4011 (Klapwijk et al., 1980).
In einer bevorzugten Ausführungsform enthält der für die Transformation des mit der pflanzlichen phenolischen Verbindung vorkultivierten pflanzlichen Gewebes verwendete Agrobakteriumstamm ein Ti-Plasmid des L,L-Succinamophin-Typs, das vorzugsweise „disarmed" ist, wie pEHA101.
In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform enthält der für die Transformation des mit der pflanzlichen phenolischen Verbindung vorkultivierten pflanzlichen Gewebes verwendete Agrobakteriumstamm ein Ti-Plasmid des Octopin-Typs, das vorzugsweise „disarmed" ist, wie pAL4404. Im Allgemeinen wird bei der Verwendung von Ti-Plasmiden des Octopin-Typs oder von Helferplasmiden bevorzugt, dass das virF-Gen deletiert oder inaktiviert wird (Jarschow et al., 1991).
Das erfindungsgemäße Verfahren kann auch in Kombination mit bestimmten Agrobakteriumstämmen verwendet werden, um die Transformationseffizienz weiter zu erhöhen, wie Agrobakteriumstämmen, bei denen die vir-Genexpression und/oder deren Induktion aufgrund des Vorhandenseins von mutierten oder chimären virA- oder virG-Genen (z. B. Hansen et al., 1994; Chen und Winans 1991; Scheeren-Groot et al., 1994) geändert wird.
In einer weiteren Ausführungsform können zur weiteren Erhöhung der Transformationseffizienz Agrobakteriumstämme verwendet werden, die zusätzliche Kopien des virG-Gens, insbesondere des sogenannten, von pTiBo542 abgeleiteten super-virG-Gens, umfassen, vorzugsweise solche, die mit einem Mehrfachkopieplasmid verbunden sind.
In einer noch weiteren Ausführungsform der Erfindung umfassen die verwendeten Agrobakteriumstämme eine zusätzliche Kopie des virB11-Gens, insbesondere das von p-TiBo542 abgeleitete virB11-Gen, das in Agrobacterium exprimiert wird. Dies kann so durchgeführt werden, dass man vorzugsweise ein chimäres Gen, das die virB11-Kodierregion in operativer Verbindung mit einem Promotor, der in Agrobacterium exprimiert werden kann, wie einem isolierten virB-Promotor, ohne sonstige dazwischenliegende Kodierregionen des virB-Operons umfasst.
Agrobacterium-Zellen, die mit den Pflanzenzellen, insbesondere den Maiszellen, cokultiviert werden sollen, können entweder auf fachbekannte Weise mit Acetosyringon oder einer anderen pflanzlichen phenolischen Verbindung vorinkubiert werden, oder direkt nach Isolation aus ihrem Kulturmedium verwendet werden. Besonders geeignete Induktionsbedingungen für Agrobacterium tumefaciens sind von Vernade et al. (1988) beschrieben worden.
Das erfindungsgemäße Verfahren kann im Prinzip zur Transformation von Pflanzenzellen, insbesondere Maiszellen, mit einer beliebigen Fremd-DNR verwendet werden. Im Allgemeinen umfasst die Fremd-DNA zumindest ein interessierendes Gen, das 1) eine Promotorregion, mit einem Promotor, der in Zellen der zu transformierenden eukaryontischen Spezies, z. B. der Pflanzenspezies, die Transkription der DNA in eine RNA steuern kann, und 2) eine für eine RNA (z. B. eine antisense-RNA oder ein Ribozym) oder für ein Protein kodierende Kodierregion umfasst. Am häufigsten umfasst das interessierende Gen auch 3) eine 3'-untranslatierte Region eines eukaryontischen Gens, die ein Polyadenylierungssignal enthält. Der Promotor kann so ausgewählt werden, dass er die Expression des eukaryontischen Organismus in ausgewählten Geweben steuert. So sind z. B. Promotor bekannt, die die Expression selektiv in Staubblattzellen einer Pflanze (z. B. im Tapetum) steuern, und solche Promotoren wurden zur Verwendung von pollensterilen Pflanzen und anderen Pflanzen, die sich für die Produktion von Hybriden eignen, verwendet ( EP 344029 ; EP 412911 ; WO 9213956; WO 9213957; Mariani et al., 1990; Mariani et al 1992).
Die bei dem erfindungsgemäßen Verfahren verwendete Fremd-DNA umfasst vorzugsweise auch ein selektierbares Markergen, dessen Expression die Selektion von transformierten Zellen (bzw. Organismen) von nicht-transformierten Zellen (bzw. Organismen) gestattet. Solch ein selektierbares Markergen kodiert im Allgemeinen für ein Protein, das der Zelle Resistenz gegen ein Antibiotikum oder eine andere Chemikalie, die normalerweise für die Zellen toxisch ist, verleiht. Bei Pflanzen kann das selektierbare Markergen daher auch für ein Protein kodieren, das Resistenz gegen ein Herbizid, wie ein Herbizid, das einen Glutaminsynthetase-Hemmer (z. B. Phosphinotricin) als Wirkstoff enthält, verleiht. Solche Gene sind z. B. Gene, die für die Phosphinotricin-Acetyltransferase kodieren, z. B. die sfr- oder sfrv-Gene ( EP 242236 ; EP 242246 ; De Block et al., 1987).
Die vorliegende Erfindung stellt daher ein schnelles, wirksames und reproduzierbares Verfahren für die Erhöhung der Transformationseffizienz des DNA-Transfers, insbesondere des Agrobacterium-vermittelten DNA-Transfers bei Pflanzenzellen, insbesondere Monokotyledonen-Pflanzenzellen, ganz besonders Maiszellen, jedoch auch Reis-, Weizen- oder Gerstenzellen, bereit. Außerdem werden mit Agrobacterium-vermittelten Transformationsverfahren mehr transgene Pflanzen, insbesondere Maispflanzen, mit einer begrenzten Anzahl Kopien des Transgens, insbesondere mit einer Kopie des Transgens, die in das Genom ihrer Zellen integriert ist, als bei direkten Gentransferverfahren erzielt. Außerdem führen transgene Pflanzen, insbesondere transgene Maispflanzen, die mit der Agrobacterium-vermittelten Transformation erzielt werden, und die mehr als eine Kopie des Transgens in ihrem Genom enthalten, häufig zu Nachkommenschaftspflanzen, bei denen die unterschiedlichen Kopien des Transgens unabhängig vererbt werden, wodurch eine Aufspaltung der unterschiedlichen Transgen-Kopien bei den Nachkommenschaftspflanzen auftritt. Es wird daher erwartet, dass in einer Population von transgenen Pflanzen, die mit den erfindungsgemäßen Transformationsverfahren erhalten wurden, ein höherer Anteil von transgenen „Elite"-Pflanzen mit den erwünschten Eigenschaften auftritt als in einer Population von transgenen Pflanzen, die mit direkten Gentransfermethoden erhalten werden. Obwohl sich die Erfindung besonders für monokotyle Pflanzen eignet, wird erwartet, dass ähnliche Ergebnisse erzielt werden, wenn in Kultur befindliche Zellen von dikotylen Pflanzen als Ausgangsmaterial für das erfindungsgemäße Verfahren verwendet werden.
In den folgenden Beispielen werden die erfindungsgemäßen Methoden genau beschrieben. Falls nicht anders in den Beispielen erwähnt, werden alle DNA-Rekombinationstechniken nach Standardprotokollen, wie sie bei Sambrook et al. (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Zweite Ausgabe, Cold Spring Harbor Laboratory Press, NY und in den Bändern 1 und 2 von Ausubel et al. (1994) Current Protocols in Molecular Biology, Current Protocols, USA, beschrieben sind, durchgeführt. Standardmaterial und -verfahren für pflanzenmolekularbiologische Arbeiten sind in Plant Molecular Biology Labfax (1993) von R. D. D. Croy, gemeinsam von BIOS Scientific Publications Ltd (UK) und Blackwell Scientific Publications, UK, verlegt, beschrieben.

In den Beispielen und in der Beschreibung der Erfindung werden die folgenden Sequenzen der Sequenzbeschreibung erwähnt:

SEQ ID NR. 1:	Nukleotidsequenz der T-DNA von pGVS71
SEQ ID NR. 2:	Nukleotidsequenz der Kodierregion des bar-Gens mit dem adh1-Intron
SEQ ID NR. 3:	Nukleotidsequenz der T-DNA von pGVS8
SEQ ID NR. 4:	Nukleotidsequenz des Oligonukleotids VG40
SEQ ID NR. 5:	Nukleotidsequenz des Oligonukleotids VG41

Versuchsteil: In den Beispielen verwendete Medien, Plasmide und Bakterienstämme
1.1. Medien
In allen Beispielen wurden die folgenden Pflanzengewebekulturmedien verwendet:

– Mahi1VII: N6-Medium (Chu et al. 1975) mit Zusatz von 100 mg/l Caseinhydrolysat, 6 mM L-Prolin, 0,5 g/l 2-(N-Morpholino)ethansulfonsäure (MES), 0,2 M Mannit, 2% Saccharose, 1 mg/l 2,4-Dichlorphenoxyessigsäure (2,4-D), 2,5 g/l Gelrite, eingestellt auf pH 5,8.
– LSIDhy1.5VII: MS-Salze (Murashige und Skoog, 1968) mit Zusatz von 0,5 mg/l Nikotinsäure, 0,5 mg/l Pyridoxin.HCl, 1 mg/l Thiamin.HCl, 100 mg/l Myo-Inositol, 6 mM L-Prolin, 0,5 g/l MES, 20 g/l Saccharose, 10 g/l Glucose, 1,5 mg/l 2,4-D, 2,5 g/l Gelrite, eingestellt auf pH 5,2.
– LSI: MS-Salze mit Zusatz von Vitaminen wie bei LSIDhy 1.5 VII, 1 g/l Casaminosäuren, 0,2 M Saccharose, 0, 2 M Glucose, 1,5 mg/l 2,4-D, 2,5 g/l Gelrite, eingestellt auf pH 5,2.
– Ahx1.5VIIp500ino1000ppT10: MS-Salze mit Zusatz von 1000 mg/l Myo-Inositol, 0,5 g/l MES, 30 g/l Saccharose, 10 g/l Glucose, 1,5 mg/l 2,4-D, 2,5 g/l Phytagel, 10 mg/l Glufosinate-Ammonium, 500 mg/l Carbenicillin, eingestellt auf pH 5,8.
– Mh1VIIp500ppT5: N6-Medium mit Zusatz von 0,5 g/l MES, 20 g/l Saccharose, 1 mg/l 2,4-D, 5 mg/l Glufosinate-Ammonium, 500 mg/l Carbenicillin, eingestellt auf pH 5,8.
– A37VIIp500ppT2: MS-Medium mit Zusatz von 0,5 g/l MES, 30 g/l Saccharose, 5 mg/l Zeatin, 2,5 g/l Phytagel, 2 mg/l Glufosinate-Ammonium, 500 mg/l Carbenicillin, eingestellt auf pH 5,8.
– LSIIDhy1.5XI wie bei LSIDhy1.5VII-Medium, wobei jedoch die 6 mM L-Prolin durch 1 g/l Casaminosäuren und die 2,5 g/l Gelrite durch 0,5% BRL-Agarose (reinst) ersetzt wurden.
– A6%VII500ppT2 MS-Medium mit Zusatz von 0,5 g/l MES, 60 g/l Saccharose, 2,5 g/l Phytagel, 2 mg/l Glufosinate-Ammonium, 500 mg/l Carbenicillin, eingestellt auf pH 5,8.

1.2. T-DNA-Vektoren
In allen Beispielen wurden die folgenden T-DNA-Vektoren verwendet:

– pGSV71: hierbei handelt es sich um einen T-DNA-Vektor, der sich von pGSC1700 (Cornelissen und Vandewiele, 1989) ableitet, von dem er sich durch das Fehlen des β-Lactamase-Gens und das Vorhandensein der durch die Sequenz SEQ ID Nr. 1 charakterisierte T-DNA unterscheidet. pGVS71 umfasst das selektierbare chimäre bar-Marker-Gen, das operativ mit einem CaMV35S-Promotor und dem 3'-Ende des Nopalinsynthase-Gens verbunden ist.
– pTCO114: hierbei handelt es sich um einen T-DNA-Vektor, der pGSV71 ähnelt und eine T-DNA umfasst, bei der die Kodiersequenz des bar-Gens (Nukleotidsequenz von SEQ ID Nr. 1 von der Nukleotidposition 1437 bis zur Nukleotidposition 1988) durch die Sequenz eines bar-Gens, das ein Intron des adh1-Gens aus Mais (Nukleotidsegeunz von SEQ ID Nr. 2) umfasst, ersetzt wurde
– pTCO121: T-DNA-Vektor, der das zusätzliche virG-Gen aus pTiBo542, umfassend auf einem ungefähr 1,3 kb großen BglII-SphI-Fragment aus pTiBo542, trägt. Die T-DNA ist im Wesentlichen derjenigen von pTCO114 ähnlich. Der Vektor wurde folgendermaßen konstruiert: ein ungefähr 1,3 kb großes BglII-SphI-Fragment wurde aus pCNL2 (Liu et al. 1992) aufgereinigt. Dieses Fragment umfasst das 3'-Ende des virB-Operons, das vollständige virG-Gen und das 3'-Ende des virC-Operons aus pTiBo542. Das Fragment wurde durch Behandlung mit T4-Polymerase stumpfendig gemacht und mit dem mit XbaI linearisierten und mit Klenow behandelten pGSV8 ligiert, wodurch man pGSV15 erhielt. Bei pGSV8 handelt es sich um einen T-DNA-Vektor, der sich von pGSC1700 (Cornelissen und Vandewiele, 1989) ableitet, von dem er sich durch das Fehlen des β-Lactamase-Gens und das Vorhandensein der durch die Sequenz SEQ ID Nr. 3 charakterisierte T-DNA unterscheidet. In einem nächsten Schritt wurde eine T-DNA, die den chimären selektierbaren bar-Marker trug, in pGSV15 eingebracht. Zu diesem Zweck wurde das ungefähr 1,2 kb große EcoRI-BstEII-Fragment von pGSV15 (die EcoRI-Stelle befindet sich innerhalb der T-DNA von pGSV15) durch das ungefähr 4 kb große EcoRI-BstEII-Fragment aus pTCO114, das die T-DNA (mit Ausnahme der rechten Border) umfasst, ersetzt, wodurch man zu pTCO121 gelangte.
– pVE200: T-DNA-Vektor, der die gleiche T-DNA wie pTCO121 und ein ähnliches pTiBo542-Fragment, umfassend das 3'-Ende des virB-Operons (inklusive des offenen Leserasters von virB11), das vollständige virG-Gen und das 3'-Ende des virC-Operons umfasst, trägt, wobei jedoch das 3'-Ende des virB-Operons mit einem durch PCR amplifizierten virB-Promotorfragment operativ verbunden ist (d. h. diesem nachgeschaltet ist). Der Vektor wurde folgendermaßen konstruiert:
– ein virB-Promotorfragment wurde durch eine standardmäßige Polymerasekettenreaktion unter Verwendung der Primer VG40 (SEQ ID Nr. 4) und VG41 (SEQ ID Nr. 5) und Gesamt-DNA aus A348 (pSM30) (Stachel und Nester, 1986) als Matrize amplifiziert. Das erhaltene Fragment, das eine Größe von ungefähr 390 bp aufwies (und das im Wesentlichen der Sequenz der EMBL-Eingangs-Nr. J03216 von Nukleotid 475 bis Nukleotid 764 entspricht) aufweist, umfasst einen von Das et al. (1986) beschriebenen virB-Promotor, wurde mit XbaI und NheI verdaut und mit mit XbaI linearisiertem pCNL2 (Liu et al., 1992) ligiert, wodurch man pVE194 erhielt. In pVE194 befindet sich das 3'-Ende des virB-Operons unter der transkriptionellen Regulation des virB-Promotors.
– Das DNA-Fragment, das das 3'-Ende des virB-Operons von pTiBo542 unter der Kontrolle eines virB-Promotors und das virG-Gen von pTiBo542 umfasst, wurde anschließend durch dreifache Ligation zwischen dem ungefähr 1,6 kb großen xbaI-BglII-Fragment von pVE194, dem ungefähr 1,3 kb großen BglII-SphI-Fragment von pVE194 und dem ungefähr 7,2 kb großen XbaI-SphI-Fragment von pGSV8, das die T-DNA umfasst, in einen T-DNA-Vektor eingebracht. Das erhaltene Plasmid wurde mit der Bezeichnung pTVE197 versehen.
– Das selektierbare Markergen von pTCO114 wurde durch Ligation der folgenden drei Fragmente in pTVE197 eingeführt:
i) das ungefähr 5,3 kb große BanII-BstEII-Fragment von pTVE197, das das 3'-Ende des virB- und des virG-Gens umfasst;
ii) das ungefähr 3,7 kb große BanII-EcoRI-Fragment von pTVE197, das die rechte T-DNA-Border umfasst;
iii) das ungefähr 4 kb große EcoRI-BstEII-Fragment von pTCO114, das das chimäre selektierbare bar-Gen und die linke T-DNR-Border umfasst; wodurch man zu dem T-DNA-Vektor pVE200 gelangte.

1.3 Agrobacterium tumefaciens-Stämme
Die T-DNA-Vektoren pGSV71, pTCO114, pTCO121 und pVE200 wurden mit dem Dreiwege-Kreuzungsprotokoll (Ditta et al., 1980) unter Selektion auf Resistenz gegen Streptomycin (300 μg/ml) und Spectinomycin (100 μg/ml) in die Agrobakteriumstämme LBA4404 mit dem Helfer-Ti-Plasmid pAL4404 oder EHA101, mit dem Helferplasmid pEHA101, eingeführt.
In allen Beispielen wurden die folgenden Stämme verwendet:
Stamm A3593: LBA4404 mit pGSV71
Stamm A3532: LBR4404 mit pTCO121
Stamm A3638: LBA4404 mit pVE200
Stamm A3460: EHA101 mit pTCO114
Stamm A3533: EHA101 mit pTCO121
Stamm A3637: EHA101 mit pVE200
BEISPIELE
Beispiel 1. Agrobacterium-vermittelte Transformation von mit Acetosyringon vorbehandeltem Typ I-Maiskallus
Fragmente des Typ I-Kallus wurden im Wesentlichen wie in WO 92/09696 beschrieben gewonnen. Unreife Embryonen der Maislinie (Pa91xH99)xH99 (PHH-line) wurden 9–12 Tage nach der Bestäubung aus dem Korn herausgeschnitten, die Oberfläche wurde steril gemacht und die Explantate wurden auf Mahi1VII-Medium ausplattiert, um Typ I-Kallus zu induzieren. Der Typ I-Kallus wurde auf dem gleichen Medium ungefähr zwei bis sechs Monate lang in einmonatigen Abständen subkultiviert. Anschließend wurde der Typ I-Kallus fein in Fragmente mit einer durchschnittlichen Länge von ungefähr 1,5 mm zerschnitten, und die erhaltenen Fragmente wurden 5 Tage auf LSIDhy1.5VII-Substrat mit Zusatz von 100–200 μM Acetosyringon inkubiert. Die vorinduzierten Kallusfragmente wurden entnommen und ohne weitere Verwundung ungefähr 3 bis ungefähr 20 Minuten lang in eine Suspension des entsprechenden Agrobakteriumstamms getaucht. Die Bakteriensuspension wurde folgendermaßen erhalten: die Bakterien wurden 3 bis 6 Tage auf MAG-Medium Minimal-A-Medium (Jeffrey Miller, 1972) mit Zusatz von 2 g/l Glucose] oder auf AB-Medium (Chilton et al., 1974) kultiviert. Die Bakterien wurden geerntet und in flüssigem LSI-Substrat mit Zusatz von 100–200 μM Acetosyringon in einer Konzentration von ungefähr 5 × 10⁹ Zellen/ml suspendiert.
Nach dem Eintauchen in die Bakteriensuspension wurden die Kallusfragmente auf LSIIDhy1.5XI-Medium mit Zusatz von 100–200 μM Acetosyringon ungefähr 3 bis 6 Tage lang (3 Tage für den LBA-Typ-Stamm, 6 Tage für den EHA-Typ-Stamm) bei ungefähr 25°C co-kultiviert.
Nach der Co-Kultivierung wurden die Gewebe auf Ahx1.5VIIp500ino1000ppT10 umgesetzt und 3 bis 4 Wochen lang kultiviert. Proliferierende Phosphinotricin (PPT)-resistente Kalli wurden entnommen und mindestens zweimal mit einem Subkulturabstand von 3 Wochen auf Mh1VIIp500ppT5 subkultiviert. Embryogene PPT-resistente Kalli wurden auf Regenerationsmedium (A37VIIp500ppT2.) ausplattiert, und das embryogene Gewebe wurde zweimal im Abstand von 10 bis 14 Tagen auf dem gleichen Medium subkultiviert. Pflänzchen wurden für das weitere Wachstum in Glasbehältnisse, die A6%VIIp500ppT2-Substrat enthielten, umgesetzt, und sich entwickelnde Sprosse wurden anschließend auf MS-Medium in halber Stärke mit Zusatz von 1,5% Saccharose umgesetzt, um ein weiteres Längenwachstum des Sprosses und eine Bewurzelung zu erzielen. Die Pflanzen wurden auf Phosphinotricin-Acetyltransferase (Patienten)-Aktivität geprüft, und PAT-positive Pflanzen wurden in das Gewächshaus umgesetzt. PAT-positive Pflanzen wurden mittels Southern-Hybridisierung auf das Vorhandensein des Transgens geprüft.
Tabelle I
Bei Kontrollversuchen, bei denen die Fragmente des Typ T-Kallus nicht durch Inkubation auf acetosyringonhaltigen Medien vorbehandelt wurden, bei Co-Kultivierung mit den im Versuchsteil beschriebenen Agrobacterienstämmen, übertraf die durchschnittliche Transformationshäufigkeit nie 0,1% (siehe Tabelle I), obwohl jeweils PAT-positive Pflanzen erhalten wurden.
Durch die Vorbehandlung mit Acetosyringon konnte die Transformationseffizienz von Typ I-Kallus durch Co-Kultivierung mit Agrobakterienstämmen um das mindestens Dreifache erhöht werden. Bei Co-Kultivierung von ungefähr 1700 Kallusfragmenten, die mit Acetosyringon vorbehandelt worden waren, mit dem Stamm A3460 erhielt man 5 PAT-positive Linien (durchschnittliche Transformationshäufigkeit von ungefähr 0,3%; siehe Tabelle I).
Die Co-Kultivierung von ungefähr 4000 vorbehandelten Kallusfragmenten (pro Versuchsserie) mit den Agrobakteriumstämmen A3638, A3533 und A3637 erhielt man 37, 30 bzw. 33 PAT-positive Pflanzenlinien (durchschnittliche Transformationshäufigkeit von ungefähr 1%). Bei diesen Versuchen war die Transformationseffizienz also um mindestens ungefähr das 7- bis 10-fache verbessert.
Eine Erhöhung der Transformationshäufigkeit durch Vorbehandlung mit Acetosyringon wurde auch bei der Co-Kultivierung vom Typ I-Kalli, die von den Maispflanzenlinien (Pa91xH99)xPa91 (PHP) und Pa91 stammten, erzielt.
Beispiel 2. Das Vorhandensein eines zusätzlichen chimären virB11-Gens verbessert die Agrobacterium-vermittelte Transformationshäufigkeit
Fragmente des Typ I-Kallus wurden wie in Beispiel 1 beschrieben gewonnen und 5 Tage auf LSIDhy1.5VII-Substrat mit Zusatz von 100 μM Acetosyringon inkubiert und anschließend mit dem Agrobakteriumstamm A3532 und A3638 co-kultiviert. Mit Stamm A3532 wurde nur 1 PAT-positive Pflanze erhalten, auch dann, wenn eine Vorbehandlung mit Acetosyringon durchgeführt wurde (Transformationshäufigkeit < 0,1%). Das Vorhandensein des funktionellen virB-Promotors vor dem offenen Leseraster von virB11 auf dem T-DNA-Vektor verbesserte jedoch die Transformationseffizienz (siehe Tabelle I) um das mindestens Zehnfache.
Beispiel 3. Agrobacterium-vermittelte Transformation von Typ I-Maiskallus, der mit unterschiedlichen pflanzlichen phenolischen Verbindungen vorbehandelt wurde
Fragmente des Typ I-Kallus wurden wie in Beispiel 1 beschrieben gewonnen und 5 Tage auf LSIDhy1.5VII-Substrat mit Zusatz von 100 μM der in Tabelle II angegebenen pflanzlichen phenolischen Verbindungen inkubiert. Ungefähr 200 vorinduzierte Kallusfragmente wurden mit dem Agrobakteriumstamm A3637 (oder A3638) co-kultiviert. Die Anzahl der PAT-positiven Linien und die erzielten Transformationshäufigkeiten sind in Tabelle II zusammengefasst.
Tabelle II
Beispiel 4. Die Vorbehandlung von Typ I-Maiskallus mit Acetosyringon verbessert die Transformationshäufigkeit durch Elektroporation
Mit fein zerschnittenen Kallusstücken vom Typ I-Kallus, die 5 Tage auf 100 μM acetosyringonhaltigem Medium wie in Beispiel 1 beschrieben vorinkubiert worden waren, wurde ohne weitere Verwundung eine Elektroporation wie in WO92/09696 beschrieben durchgeführt. Kurz gesagt wurden ungefähr 50 Kallusstücke in 100 μl EPM-KCl-Puffer resuspendiert und 3 Stunden bei Raumtemperatur vorplasmolysiert. Im Anschluß daran wurden die Kallusstücke in EPM + KCl-Puffer gewaschen und mit EPM + KCl-Puffer in eine Elektroküvette gegeben. Es wurde mit Plasmid-DNA (10 μg pDE110) versetzt, und die DNA wurde mit den Kallusfragmenten ungefähr 1 Stunde bei Raumtemperatur inkubiert. Die Elektroporation wurde unter Standardbedingungen durchgeführt (1 Impuls mit einer anfänglichen Feldstärke 375 V/cm von einem Kondensator mit 900 μF). Die Kalli wurden niemals auf Eis aufbewahrt. Es wurden phosphinotricinresistente Kalli selektiert und Pflanzen wie beschrieben (WO92/09696) regeneriert. Die Phosphinotricin-Acetyltransferaseaktivität wurde wie beschrieben (WO92/09696) nachgewiesen.
Während durch Kontrollelektroporation von ungefähr 5640 Kallusstücken, die nicht mit Acetosyringon vorbehandelt worden waren, 13 PAT-positive Pflanzen erhalten wurden (ungefähr 0,23%), wurden durch Elektroporation von ungefähr 530 Kallusstücken, die mit Acetosyringon vorbehandelt worden waren, 4 PAT-positive Pflanzen erhalten (ungefähr 0,75%). Die Transformationshäufigkeiten lagen also ungefähr dreimal höher, wenn die fein zerschnittenen Stücke vom Typ I-Kallus durch 5-tägige Inkubation auf 100 μM acetosyringonhaltigen Medien vorbehandelt wurden.
Beispiel 5. Die Kombination von pflanzlichen Phenolen erhöht die Transformationshäufigkeit weiter
Fragmente des Typ I-Kallus wurden wie in Beispiel 1 beschrieben gewonnen und 5 Tage auf LSIDhy1.5VII-Substrat mit einem Zusatz von entweder 200 μM Acetosyringon oder einer Kombination von 100 μM Acetosyringon und 100 μM Parahydroxybenzoesäure inkubiert. Ungefähr 250 Kallusstücke wurden mit dem Agrobakteriumstamm A3533 co-kultiviert. Während auf PPT-haltigen Medien nach Vordinduktion auf Acetosyringon 2 sprossregenierende Linien (darunter 1 PAT-positive Linie) erzielt wurden (Häufigkeit ungefähr 1%), wurden auf PPT-haltigen Medien nach Vordinduktion auf Acetosyringon und Parahydroxybenzoesäure 7 sprossregenerierende Linien (darunter 5 PAT-positive Linien) erhalten (Häufigkeit ungefähr 3%).
Beispiel 6. Analyse der durch Agrobacterium-vermittelte Transformation erhaltenen transgenen Maispflanzen aus den Beispielen 1 bis 5
Die transgenen Maispflanzen aus den obigen Beispielen wurden mittels Southern-Analyse untersucht.
Zuerst wurde überprüft, ob alle transgenen Pflanzen, die aus einer einzelnen transgenen Kalluslinie regeneriert wurden, identisch waren oder ob sie aus unabhängigen Transformationsereignissen hervorgegangen sein könnten. Alle regenerierten Pflanzen, die von 24 unabhängigen transgenen Kalluslinien stammten, wurden durch Southern-Analyse untersucht, und es wurden 37 unterschiedliche Arten der T-DNA-Integration identifiziert. Anders ausgedrückt, stellten die 24 Pflanzenlinien (wie in der Beschreibung definiert) mindestens 37 unabhängige Transformationsereignisse dar. Wird die Transformationshäufigkeit als Anzahl der pro 100 transformierte Kallusstücke erhaltenen transgenen Pflanzenlinien ausgedrückt, so wird die tatsächliche Transformationshäufigkeit also unterschätzt.
Im Anschluss daran wurden die Kopienzahlen der Transgene in den unterschiedlichen Maislinien mittels Southern-Hybridisierung analysiert. Die meisten analysierten transformierten Linien (T0) wiesen ein relativ einfaches T-DNA-Integrationsmuster auf (weniger als 4 Kopien). Bei ungefähr 1/3 der analysierten transgenen Linien (56/148) war eine einzelne T-DNA-Kopie integriert worden. Nur eine begrenzte Anzahl von Linien (< 10%) wies ein komplexeres T-DNA-Integrationsmuster auf (> 4 Kopien).
Die transgenen Maispflanzen der obigen Beispiele wurden auch auf das Abspaltungsmuster der Transgene in der Nachkommenschaft untersucht. Zur Kontrolle der Spaltung der PAT-Aktivität in 113 Pflanzen, die von 57 unabhängigen transgenen Kalluslinien regeneriert wurden, wurde ein Herbizidspritzung mit Basta verwendet. In der Nachkommenschaft von 74 Pflanzen, die von 32 unabhängigen transgenen Kalluslinien regeneriert worden waren, wurde eine 1 : 1-Spaltung der PAT-Aktivität beobachtet, was anzeigt, dass das Herbizidresistenz-Transgen in einer Kopie oder in mehreren eng gekoppelten Kopien vorlag. In der Nachkommenschaft von 31 Pflanzen die von 18 unabhängigen transgenen Kalluslinien regeneriert worden waren, waren alle Pflanzen gegenüber der Herbizidspritzung mit Basta tolerant, bzw. es waren signifikant mehr Pflanzen tolerant als anfällig, was anzeigt, dass bei den T0-Pflanzen 2 oder mehr nichtgekoppelte Kopien des Transgens vorlagen. In der Nachkommenschaft von 14 Pflanzen, die aus 7 unabhängigen transgenen Kalluslinien regeneriert worden waren, wurden schließlich keine toleranten Pflanzen beobachtet, bzw. es waren signifikant mehr Pflanzen anfällig als tolerant. Diese letztgenannten Pflanzen wurden nicht weiter untersucht.
Aus der Southern-Analyse der gegen das Basta-Herbizid resistenten T1-Nachkommenschaft von 53 unabhängig transformierten Maispflanzen (T0) geht hervor, dass bei ungefähr 70% der untersuchten Fälle (35/53) beide Nachkommenschaftspflanzen ein mit der T0-Elternpflanzenlinie identisches T-DNA-Integrationsmuster aufwiesen. Eine Spaltung wurde bei ungefähr 18% aller Fälle beobachtet (10/53).
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SEQUENZBESCHREIBUNG

Claims

Verfahren zum Integrieren eines DNA-Fragmentes in das Genom einer Zelle einer Maispflanze, wobei das Verfahren die folgenden Schritte umfasst: 1) Inkubieren einer Zellkultur nicht-transformierter Maispflanzenzellen, die ein Typ 1-Kallus ist, auf einem Medium, das eine pflanzliche phenolische Verbindung enthält, für eine Zeitdauer von ungefähr 1 bis 10 Tagen bevor die Zellkultur mit dem DNA-Fragment in Kontakt gebracht wird; und 2) Inkontaktbringen der nicht-transformierten Zellen mit DNA-Fragment unter Bedingungen, bei denen das DNA-Fragment von den nicht-transformierten Zellen aufgenommen und stabil in das Genom der nicht-transformierten Zellen integriert wird, um transformierte Zellen zu erzeugen; und 3) Regenerieren einer transgenen Maispflanze aus den transformierten Zellen.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei die pflanzliche phenolische Verbindung Acetosyringon, α-Hydroxyacetosyringon, Sinapinsäure, Syringasäure, Ferulasäure, Brenzkatechin, Parahydroxybenzoesäure, β-Resorcylsäure, Protocatechusäure, Pyrogallol, Gallussäure oder Vanillin ist.
Verfahren nach Anspruch 2, wobei die pflanzliche phenolische Verbindung Acetosiringon ist.
Verfahren nach Anspruch 2, wobei die pflanzliche phenolische Verbindung eine Mischung ist, die wenigstens zwei pflanzliche phenolische Verbindungen aus der Gruppe von Acetosyringon, α-Hydroxyacetosyringon, Sinapinsäure, Syringasäure, Ferulasäure, Brenzkatechin, Parahydroxybenzoesäure, β-Resorcylsäure, Protocatechusäure, Pyrogallol, Gallussäure und Vanillin umfasst.
Verfahren nach Anspruch 4, wobei die pflanzliche phenolische Verbindung wenigstens Acetosyringon und Parahydroxybenzoesäure umfasst.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei der Typ 1-Kallus vor dem Schritt des Inkontaktbringens in Fragmente zerschnitten wurde.
Verfahren nach Anspruch 6, wobei die Fragmente des Typ 1-Kallus eine maximale Länge von 0,5 bis 5 mm aufweisen.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei die nicht-transformierten Zellen vor dem Inkontaktbringen mit dem DNA-Fragment für eine Zeitdauer von ungefähr 4 bis 5 Tagen auf einem Medium, das die pflanzliche phenolische Verbindung enthält, inkubiert werden.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei die nicht-transformierten Zellen mit dem DNA-Fragment mittels Elektroporation, direktem Gentransfer unter Verwendung von Polyethylenglycol, oder Beschuss mit DNA-beschichteten Mikroprojektilen in Kontakt gebracht werden.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei die nicht-transformierten Zellen mit dem DNA-Fragment durch Co-Kultivierung mit einem Agrobakteriumstamm, der das DNA-Fragment enthält, in Kontakt gebracht werden.
Verfahren nach Anspruch 10, wobei der Agrobakteriumstamm des Weiteren eine zusätzliche Kopie des virG-Gens enthält.
Verfahren nach Anspruch 11, wobei das virG-Gen aus pTiBo542 stammt.
Verfahren nach Anspruch 12, wobei der Agrobakteriumstamm des Weiteren eine zusätzliche Kopie eines chimären Gens enthält, das eine virB11-kodierende Region in funktioneller Verbindung zu einem virB-Promotor umfasst.