BRPI0812489B1

BRPI0812489B1 - gene quimérico, dna, usos dos mesmos, processo para obtenção de uma planta de arroz resistente, métodos para controlar pragas de inseto lepidóptero de planta, e para produção de plantas ou sementes resistentes a insetos lepidópteros, bem como microorganismo

Info

Publication number: BRPI0812489B1
Application number: BRPI0812489A
Authority: BR
Inventors: Saey Bernadette; Meulewaeter Frank; Jansens Stefan; Gossele Véronique
Original assignee: Bayer Bioscience Nv; Bayer Cropscience Nv
Priority date: 2007-06-01
Filing date: 2008-05-28
Publication date: 2018-07-17
Also published as: BRPI0812489A2; WO2008145406A1; US20100180351A1; CN101688216B; US9994621B2; AR066772A1; CN101688216A

Description

(54) Título: GENE QUIMÉRICO, DNA, USOS DOS MESMOS, PROCESSO PARA OBTENÇÃO DE UMA PLANTA DE ARROZ RESISTENTE, MÉTODOS PARA CONTROLAR PRAGAS DE INSETO LEPIDÓPTERO DE PLANTA, E PARA PRODUÇÃO DE PLANTAS OU SEMENTES RESISTENTES A INSETOS LEPIDÓPTEROS, BEM COMO MICROORGANISMO (51) Int.CI.: C12N 15/84; C12N 15/32; A01H 5/00; A01H 5/10; C12R 1/01; C12R 1/07; C12R 1/185 (30) Prioridade Unionista: 01/06/2007 EP 07 010872.5, 13/06/2007 US 60/934,367 (73) Titular(es): BAYER CROPSCIENCE N.V.

(72) Inventor(es): VÉRONIQUE GOSSELE; BERNADETTE SAEY; FRANK MEULEWAETER; STEFAN JANSENS

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Relatório Descritivo da Patente de Invenção para GENE QUIMÉRICO, DNA, USOS DOS MESMOS, PROCESSO PARA OBTENÇÃO DE UMA PLANTA DE ARROZ RESISTENTE, MÉTODOS PARA CONTROLAR PRAGAS DE INSETO LEPIDÓPTERO DE PLANTA, E PARA PRODUÇÃO DE PLANTAS OU SEMENTES RESISTENTES A INSETOS LEPIDÓPTEROS, BEM COMO MICROORGANISMO.

Introdução [001] A presente invenção refere-se a novas sequências de DNA que codificam proteínas inseticidas produzidas por linhagens de Bacillus thuringiensis. Particularmente, novos genes quiméricos que codificam uma proteína Cry1C são fornecidos, os quais são úteis para proteger plantas de dano por inseto. Também incluídas neste pedido são células vegetais ou plantas, particularmente células vegetais ou plantas de arroz, compreendendo tais genes e métodos de criação ou utilização delas, bem como células vegetais ou plantas compreendendo um gene quimérico crylC e pelo menos outro gene que codifica uma proteína inseticida, tal como um gene quimérico que codifica uma proteína Cry1A.

Antecedentes da Invenção [002] Linhagens e proteínas derivadas de Bacillus thuringiensis (abreviado neste pedido como Bt) são bem-conhecidas pela sua toxicidade específica a pragas de inseto, e têm sido usadas há quase um século para controlar pragas de inseto. Algumas espécies vegetais transgênicas que expressam proteínas de Bt estão atualmente disponíveis, e com sucesso limitam o dano por inseto em plantas. Apesar do isolamento de um grande número de proteínas inseticidas de Bt, somente poucas proteínas de Bt foram expressas em plantas transgênicas que foram comercializadas, e isto somente em algumas culturas. [003] Pragas de inseto são limitações importantes na produção

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2/68 de arroz e ocorrem em todos ambientes de crescimento de arroz. Insetos reduzem as safras de arroz substancialmente e perdas devido a insetos na Ásia (excluindo a China) foram relatadas sendo aproximadamente 31,5% (Heinrichs, 1994). Resistência a inseto em arroz tem sido relatada pela expressão de genes que codificam proteínas inseticidas Cry1Ab ou Cry1Ac de Bacillus thuringiensis (por exemplo, Fujimoto et al., 1993; Wunn et al., 1996; Wu et al. 1997; Ghareyazie et al., 1997; Nayak et al., 1997; e Cheng et al., 1998) em plantas de arroz. Toxicidade de proteínas cristalinas isoladas a partir do Bacillus thuringiensis para algumas pragas de inseto Lepidóptero de arroz foi avaliada para algumas proteínas da classe das proteínas de Bt Cry1Aa, Cry1Ab, Cry1Ac, Cry1B, Cry1C, Cry1D, Cry1E, Cry1F, Cry1G e Cry2A (Karim et al., 1997; Lee et al., 1997), mas várias formas diferentes de cada uma destas classes de proteínas existem (por exemplo, hoje aproximadamente 14 Cry1C diferentes e aproximadamente 20 formas de Cry1Ab diferentes foram relatadas em Crickmore et al. (1998) e em Crickmore et al. (2005)), e somente uma ou algumas destas foram testadas contra pragas de inseto de arroz. Acredita-se que nenhuma publicação científica descreve a atividade da proteína Cry1Ca4 para pragas específicas de inseto de arroz.

[004] Além disso, Strizhov et al. (1998) descrevem o desenho de um gene sintético que codifica uma proteína Cry1Ca5. Após analisar e comparar com as proteínas conhecidas (Cry1Ca1, 2, 3, e 4; na página 18, linha 3 à página 19, linha 6) concluem que a sequência da proteína Cry1Ca5 se diferencia pela substituição de aminoácido A124E da proteína Cry1Ca4. Strizhov et al. (1998) concluem que a ocorrência de ácido glutâmico na posição 124 em Cry1Ca4 foi claramente devido a um erro. Strizhov et al. (1998) também acredita-se que então sequências Cry1C conhecidas, incluindo Cry1Ca4, contêm erros críticos com consequências negativas para função ou estabilidade da proteína

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CrylC, tinha sido desenhado um gene sintético correspondente com base nas sequências de DNA de tipo selvagem conhecidas. Ainda, os correntes inventores tiveram sucesso na produção de genes crylC sintéticos úteis que codificam uma proteína inseticida Cry1C que tem um aminoácido ácido glutâmico (Glu) na posição 124, e na obtenção de plantas resistentes a insetos usando tais genes.

[005] Nenhuma planta de arroz contendo um gene crylC está comercialmente disponível. Tang et al. (2006) descrevem o desenvolvimento de arroz indica transgênico resistente a inseto com um gene sintético que codifica uma proteína Cry1Ca5, mas não revelam a sequência de DNA do gene. O gene usado em Tang et al. (2006) é dito ser 84% idêntico ao DNA de cry1Ca5 nativo, enquanto a sequência de codificação de crylC desta invenção é 69,7% idêntica ao DNA de cry1Ca5 nativo do mesmo tamanho quando medido usando algoritmo de Needleman e Wunsch em EMBOSS com configurações padrão da matriz EDNAFULL, e por isso é bastante diferente do gene cry1Ca5 de Tang et al. (2006) (para a sequência de DNA de crylC da SEQ ID N° 1, a identidade de sequência com o mesmo tamanho de DNA natural de cry1Ca5 é somente 55%, sob as mesmas configurações). Além disso, o conjunto de iniciadores de PCR fornecidos em Tang et al. (2006) não permitirá a detecção da região de codificação de crylC da invenção, ilustrando a clara diferença entre aquele gene e os genes cry1C da invenção.

[006] Strizhov et al. (1996) relatam a expressão de um gene cry1Ca5 em alfafa e tabaco. Cao et al. (1999) e Zhao et al. (2003) descreveram plantas de brócolis transgênicas que expressam uma toxina de Bt Cry1Ca5, bem como cruzamentos com plantas de brócolis que expressam uma toxina Cry1Ac, para que ambas toxinas Cry1Ac e Cry1Ca5 sejam expressas nas mesmas plantas. A sequência de codificação de crylC desta invenção é somente 78% idêntica à sequência

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4/68 de codificação do gene cry1Ca5 sintético de Strizhov et al. (1996, número de acesso no Genbank X99103) quando medida usando o algoritmo Needleman e Wunsch em EMBOSS com configurações padrão da matriz EDNAFULL (o DNA da SEQ ID N° 1 somente tem identidade de sequência de 61,1% ao gene cry1Ca5 sintético de Strizhov que usa as mesmas configurações padrão em EMBOSS).

[007] A presente invenção fornece novos genes sintéticos que codificam uma proteína derivada da proteína de Bt Cry1Ca4, que pode ser combinada com um gene que codifica uma proteína Cry de Bt, tal como proteína Cry1Ab, para expressão em plantas, particularmente arroz. As sequências de DNA dos genes crylC da invenção não ocorrem na natureza, e são diferentes de quaisquer sequências de DNA conhecidas.

Objetivos e Sumário da Invenção [008] Na presente invenção, vários novos genes de controle de inseto que codificam proteínas derivadas de Bt são fornecidos para uso em plantas. Especificamente, tais genes são úteis em arroz, particularmente plantas das espécies Oryza sativa. As plantas ou sementes compreendendo pelo menos um dos novos genes da invenção podem ser obtidas por transformação de células vegetais e produção de plantas ou sementes das mesmas compreendendo os genes da invenção. Também estão incluídas neste pedido plantas ou sementes obtidas pelo cruzamento de uma planta transformada para conter pelo menos um dos genes da invenção com outras plantas, e pela seleção daquelas plantas ou sementes compreendendo os genes da invenção. Obviamente, qualquer espécie vegetal a ser protegida de espécies de inseto que são eliminadas ou controladas pelas proteínas de Bt codificadas pelos novos genes desta invenção pode ser transformada com os genes da invenção para obter plantas e sementes transgênicas com resistência aumentada a tais insetos.

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5/68 [009] Além disso, a presente invenção fornece novos genes de CrylC que codificam uma proteína inseticida compreendendo um íntron vegetal funcional em sua sequência de codificação. A presença do íntron permite alta expressão em células vegetais, e ao mesmo tempo assegura que o gene não expresse a proteína inseticida quando o gene estiver contido em um (micro) organismo procariótico, tal como durante etapas de clonagem. Também está incluído nesta invenção um DNA que codifica um peptídeo de trânsito de cloroplasto, particularmente um DNA compreendendo a sequência da SEQ ID N° 3 da posição do nucleotídeo 7 à posição do nucleotídeo 372, particularmente a sequência de SEQ ID N° 3.

[0010] Em uma modalidade desta invenção, é fornecido o uso de uma sequência de DNA sintética, otimizada pelo códon que codifica uma proteína Cry1C ou uma proteína compreendendo uma porção inseticida da mesma, tal como qualquer proteína inseticida com pelo menos 85%, particularmente pelo menos 90 ou 95%, identidade de sequência à proteína da SEQ ID N° 2 da posição do aminoácido 28 a 627, com um ácido glutâmico na posição do aminoácido correspondente à posição 124 na SEQ ID N° 2 (como pode ser determinado usando um alinhamento de sequência de aminoácido), para controlar pragas de inseto lepidóptero de arroz, particularmente dobradores de folha de arroz ou brocas de colmo, bem como processos para controlar tais insetos compreendendo a etapa de transformação de uma planta com um gene quimérico compreendendo uma região promotora expressável pela planta operacionalmente ligada a tal sequência de DNA e disseminação, plantação ou crescimento de tais plantas no campo, ou compreendendo a etapa de expressão de tal proteína em plantas, particularmente plantas de arroz.

[0011] A presente invenção também fornece uma planta transformada com um gene crylC da invenção, que também compreende em

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6/68 seu genoma um DNA que codifica uma proteína selecionada a partir do grupo composto de: Cry1Ab, Cry1B, Cry1D, Cry1E, Cry1Aa, Cry1Ac, Cry1I, Cry1J, Cry2A, Cry6B, Cry9C, Cry3A, uma toxina VIP3A, um inibidor de protease, tal como inibidor de tripsina de feijãocaupi, inibidor de protease II, ou uma cistatina (por exemplo, os inibidores de protease de Xu et al., 1996 ou Duan et al., 1996), a lectina GNA, ou proteína inseticida a partir de linhagens de espécies de Xhenorhabdus, Serratia ou Photorhabdus (por exemplo, Waterfield et al., 2001; Ffrench-Constant and Bowen, 2000)), ou híbrido ou fusão de proteínas Cry de Bt, tais como uma toxina híbrida Cry1A, por exemplo, a proteína de fusão Cry1Ab-Cry1Ac no arroz evento TT51 (pedido de patente chinesa 200510062980, número de publicação 1840655) ou a proteína de fusão Cry1Ab/Cry1B em Ho et al. (2006).

[0012] Também estão incluídos neste pedido métodos para controle de insetos, compreendendo a etapa de plantação ou disseminação em um campo, plantas compreendendo alguns dos genes quiméricos ou DNAs desta invenção; bem como métodos de controle de insetos em plantas da espécie Oryza, compreendendo a etapa de expressão de qualquer um dos genes ou DNA quiméricos acima em plantas; ou métodos de produção de plantas ou sementes resistentes a insetos, compreendendo as etapas de: a) obtenção de uma planta transformada com um gene quimérico crylC da invenção, ou transformada com um gene quimérico crylC e crylAb da invenção, e b) seleção de progênie da dita planta ou sementes da mesma, contendo o dito gene ou DNA.

[0013] Também é fornecido de acordo com esta invenção um gene quimérico compreendendo as seguintes sequências operacionalmente ligadas: a) um primeiro fragmento de uma sequência de codificação que codifica uma proteína inseticida, particularmente uma proteína inseticida derivada de Bt ou um fragmento inseticida ou variante da

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7/68 mesma, b) uma sequência intrônica vegetal de monocotiledônea, particularmente derivada de um gene vegetal de monocotiledônea no qual tal íntron é combinado, c) um segundo fragmento da dita sequência de codificação, d) uma região promotora capaz de dirigir a expressão em células vegetais, e em que o primeiro e o segundo fragmentos proteicos não são inseticidas por si só, e em que após splicing do dito íntron em uma célula vegetal alvo, uma proteína inseticida funcional pode ser produzida quando o dito gene quimérico é transcrito e traduzido. Também são fornecidas neste pedido células vegetais de arroz e plantas de arroz compreendendo tal gene quimérico. Particularmente, a partir de tal gene quimérico nenhuma proteína inseticida pode ser produzida em uma dada célula hospedeira na qual o íntron não está combinado, tal como em um organismo procariótico. Em uma modalidade, o íntron é um íntron de arroz ou milho, tal como um íntron do gene da álcool desidrogenase-1 de Zea mays. É fornecido neste pedido um gene crylC quimérico, compreendendo as seguintes sequências operacionalmente ligadas:

a) uma região promotora capaz de dirigir a expressão em células vegetais;

b) um DNA que codifica uma proteína inseticida Cry1C, compreendendo uma sequência de DNA com identidade de sequência de pelo menos 95% à sequência de DNA ou a sequência de codificação da SEQ ID N° 1 da posição do nucleotídeo 82 à posição do nucleotídeo 2415, ou à sequência de DNA ou à sequência de codificação da SEQ ID N° 5 a partir da posição do nucleotídeo 7 à posição do nucleotídeo 2784; e

c) uma região 3' de poliadenilação e terminação de transcrito; particularmente tal gene quimérico, em que a proteína inseticida Cry1C compreende a sequência de aminoácido da SEQ ID N° 2 da posição do aminoácido 28 à posição do aminoácido 627, ou comprePetição 870170072777, de 27/09/2017, pág. 10/162

8/68 ende a sequência de aminoácido da SEQ ID N° 6 da posição do aminoácido 3 à posição do aminoácido 750, ou compreende a sequência de aminoácido de uma proteína Cry1C, ou uma proteína compreendendo uma porção inseticida da mesma, com um ácido glutâmico na posição do aminoácido correspondente à posição 124 na SEQ ID N° 2.

[0014] Também é fornecido o gene crylC quimérico acima, em que o dito DNA que codifica uma proteína inseticida Cry1C compreende a sequência de DNA ou a sequência de codificação da SEQ ID N° a partir da posição do nucleotídeo 82 à posição do nucleotídeo 2415, a sequência de DNA ou a sequência de codificação da SEQ ID N° 5 da posição do nucleotídeo 7 à posição do nucleotídeo 2784, ou compreende SEQ ID N° 1 ou SEQ ID N° 5 ou a sequência de codificação de SEQ ID N° 1 ou SEQ ID N° 5; particularmente ta is genes quiméricos, em que a dita proteína inseticida Cry1C compreende a sequência de aminoácido da SEQ ID N° 2 ou SEQ ID N° 6. Em u ma modalidade, a região promotora em qualquer um dos genes crylC quiméricos acima compreende a sequência de qualquer uma das SEQ ID N° 9, 10, 13 ou 14 ou compreende a sequência da SEQ ID N° 9 da posição do nucleotídeo 1 à posição do nucleotídeo 1997, ou sequência equivalente que se diferencia em menos de 1 a 5%, particularmente menos de 2%, de seus nucleotídeos com quaisquer tais sequências. Em uma modalidade, a região 3' de poliadenilação e terminação do transcrito em um gene crylC quimérico da invenção é do gene de octopina sintase de Agrobacterium tumefaciens.

[0015] Também é fornecido neste pedido um DNA compreendendo qualquer um dos genes crylC quiméricos acima, compreendendo ainda um segundo gene quimérico, o dito segundo gene quimérico compreendendo as seguintes sequências operacionalmente ligadas:

a) uma segunda região promotora capaz de dirigir a exPetição 870170072777, de 27/09/2017, pág. 11/162

9/68 pressão em células vegetais;

b) uma segunda região de codificação que codifica uma proteína inseticida Cry1Ab, tal como uma região de codificação compreendendo uma sequência de DNA com identidade de sequência de pelo menos 95% à sequência de DNA da SEQ ID N° 11 da posição do nucleotídeo 88 à posição do nucleotídeo 1851, e

c) uma região 3' de poliadenilação e terminação de transcrito; particularmente tal DNA compreendendo como segunda região de codificação uma sequência de DNA com identidade de sequência de pelo menos 95% à sequência de DNA da SEQ ID N° 11 da posição do nucleotídeo 7 à posição do nucleotídeo 1851, ligado a jusante (3') da sequência de codificação de peptídeo de trânsito da SEQ ID N° 3 para que uma região de codificação fusionada que codifica uma proteína de fusão seja produzida. Em uma modalidade, a proteína Cry1Ab em tal DNA compreendendo um gene quimérico crylC e crylAb, compreende uma sequência de aminoácido com identidade de sequência de pelo menos 99% à sequência da SEQ ID N° 12 da posição do aminoácido 30 à posição do aminoácido 617, à sequência de SEQ ID N° 12 da posição do aminoácido 3 à posição do aminoácido 617, ou à sequência de SEQ ID N° 12, ou é uma proteína inseticida codificada por um DNA compreendendo a sequência nucleotídica da SEQ ID N° 11 da posição do nucleotídeo 7 à posição do nucleotídeo 1851, ou compreendendo a sequência nucleotídica da SEQ ID N° 11 da posição do nucleotídeo 88 à posição do nucleotídeo 1851, ou compreendendo a sequência da SEQ ID N° 11 operacionalmente ligada (a jusante de) à sequência da SEQ ID N°: 3.

[0016] Também é fornecido neste pedido tal DNA acima, em que a dita segunda região promotora é diferente da região promotora do gene quimérico crylC, e em que o dito segundo promotor compreende a sequência de qualquer uma das SEQ ID N° 9, 10, 13 ou 14, ou comPetição 870170072777, de 27/09/2017, pág. 12/162

10/68 preende a sequência da SEQ ID N° 9 da posição do nucleotídeo 1 à posição do nucleotídeo 1997, ou uma sequência equivalente que se diferencia em menos de 1 a 5%, particularmente menos de 2%, de seus nucleotídeos com qualquer uma de tais sequências.

[0017] Ainda é fornecida nesta invenção uma célula vegetal ou planta transgênica, compreendendo qualquer um dos genes crylC quiméricos acima ou qualquer um dos DNAs acima compreendendo um gene quimérico crylC e crylAb estavelmente incorporado em seu genoma; bem como uma célula vegetal ou planta transgênica, compreendendo qualquer um dos genes crylC quiméricos acima, e um segundo gene quimérico compreendendo as seguintes sequências operacionalmente ligadas:

a) uma segunda região promotora capaz de dirigir a expressão em células vegetais;

b) uma segunda região de codificação que codifica uma proteína inseticida Cry1Ab, tal como uma região de codificação compreendendo uma sequência de DNA com identidade de sequência de pelo menos 95% à sequência de DNA da SEQ ID N° 11 da posição do nucleotídeo 88 a posição do nucleotídeo 1851, ou identidade de sequência de pelo menos 95% à sequência de DNA da SEQ ID N° 11 da posição do nucleotídeo 7 à posição do nucleotídeo 1851, ou identidade de sequência de pelo menos 95% à sequência de DNA da SEQ ID N° 11, e

c) uma segunda região 3' de poliadenilação e terminação do transcrito.

[0018] Também é fornecida neste pedido tal célula vegetal, compreendendo como segunda região de codificação uma sequência de DNA com identidade de sequência de pelo menos 95% à sequência de DNA compreendendo a sequência nucleotídica da SEQ ID N° 11 da posição do nucleotídeo 7 à posição do nucleotídeo 1851, ligada a juPetição 870170072777, de 27/09/2017, pág. 13/162

11/68 sante (3') da sequência de codificação de peptídeo de trânsito da SEQ ID N° 3, ou um DNA compreendendo a sequência nucleotídica da SEQ ID N° 3 da posição do nucleotídeo 7 à posição do nucleotídeo 372, para que uma região de codificação fusionada que codifica uma proteína de fusão seja produzida; particularmente tal célula vegetal, em que a dita proteína Cry1Ab compreende uma sequência de aminoácido idêntica ou com identidade de sequência de pelo menos 99% à sequência da SEQ ID N° 12 da posição do aminoácido 30 à posição do aminoácido 617, à sequência de SEQ ID N° 12 da posição do aminoácido 3 à posição do aminoácido 617, ou à sequência da SEQ ID N: 12.

[0019] Em uma modalidade, qualquer uma destas células vegetais acima tem uma segunda região promotora que é diferente da região promotora do gene quimérico crylC, e compreende a sequência de qualquer uma das SEQ ID N°: 9 (ou a sequência da SE Q ID N°: 9 do nucleotídeo 1 ao nucleotídeo 1997), 10, 13 ou 14, particularmente SEQ ID N° 13 ou 14, ou uma sequência equivalente q ue se diferencia em menos de 1 a 5%, particularmente menos de 2%, dos seus nucleotídeos com qualquer uma de tais sequências. Em outra modalidade, o dito gene quimérico crylAb compreende a região 3' de poliadenilação e terminação de transcrito do gene de octopina sintase de Agrobacterium tumefaciens (por exemplo, como descrito por De Greve et al., 1983).

[0020] Também são fornecidas neste pedido planta ou semente compreendendo qualquer uma das células vegetais acima, particularmente células vegetais de arroz, bem como plantas de arroz compreendendo tais células vegetais, particularmente plantas ou sementes selecionadas a partir do grupo consistindo em uma planta ou semente de: milho, algodão, soja, trigo, canola, cana-de-açúcar, soja, couveflor, repolho, repolho chinês, nabo, mostarda, canola, couve galega e

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12/68 brócolis.

[0021] Em uma modalidade desta invenção, semente, grão, ou grão processado a partir de tais plantas, particularmente plantas de arroz, compreendendo qualquer um dos genes crylC quiméricos acima, ou compreendendo qualquer um dos genes crylC quiméricos acima e um gene crylAb quimérico (tal como o segundo gene quimérico acima) são fornecidos. Também é fornecido neste pedido uma planta, tal como uma planta de arroz, resistente a pragas de inseto Lepidóptero de planta, tal como brocas do colmo de arroz ou dobradores de folha de arroz, compreendendo estavelmente integrado em seu genoma, qualquer um dos genes crylC quiméricos acima ou qualquer um dos genes crylC quiméricos acima e um gene crylAb quimérico (tal como o segundo gene quimérico acima), particularmente tal planta é uma planta de arroz que é resistente a Chilo suppressalis, Marasmia patnalis, Scirpophaga incertulas, Sesamia inferens, Spodoptera litura ou Cnaphalocrocis medinalis.

[0022] Ainda é fornecido neste pedido um método para controlar pragas de inseto Lepidóptero de planta, particularmente brocas do colmo de arroz ou dobradores de folha de arroz, compreendendo: plantação ou semeadura em um campo, plantas, particularmente plantas de arroz, compreendendo qualquer um dos genes quiméricos cry1C acima ou qualquer um dos genes cry1C quiméricos acima e um gene quimérico cry1Ab (tal como o segundo gene quimérico acima), ou um método para controle de brocas do colmo de arroz ou dobradores de folha de arroz, compreendendo: expressão de qualquer um dos genes quiméricos cry1C acima, ou qualquer um dos genes cry1C quiméricos acima e um gene quimérico cry1Ab (tal como o segundo gene quimérico acima) em uma planta, tal como uma planta de arroz.

Também de acordo com a presente invenção é fornecido um processo para obtenção de uma planta de arroz e progênie da

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13/68 mesma resistente a Chilo suppressalis, Marasmia patnalis, Cnaphalocrocis medinalis, Sesamia inferens, Spodoptera litura ou Scirpophaga incertulas, compreendendo transformação de uma planta de arroz com qualquer um dos genes cry1C quiméricos acima ou qualquer um dos genes cry1C quiméricos acima e um gene quimérico cry1Ab (tal como o segundo gene quimérico acima), e obtenção da progênie da mesma compreendendo tal gene ou genes. Um método de produção de plantas ou sementes resistentes a insetos também é fornecido neste pedido, compreendendo as etapas de: a) obtenção de uma planta transformada com qualquer um dos genes cry1C quiméricos acima ou qualquer um dos genes cry1C quiméricos acima e um gene cry1Ab quimérico (tal como o segundo gene quimérico acima), e b) seleção da progênie da dita planta, ou semente da mesma contendo o dito gene ou genes, tal como pelo uso de iniciadores ou sondas específicos. [0023] Também é fornecido neste pedido um micro-organismo compreendendo qualquer um dos genes cry1C quiméricos acima, ou a sequência de codificação do mesmo, ou qualquer um dos DNAs acima compreendendo um gene cry1C quimérico e um gene cry1Ab quimérico (tal como o segundo gene quimérico acima), ou as sequências de codificação do mesmo, particularmente do gênero Escherichia, Bacillus ou Agrobacterium.

[0024] Também é fornecido neste pedido o uso de qualquer um dos genes cry1C quiméricos acima ou qualquer um dos genes cry1C quiméricos acima e um gene cry1Ab quimérico (tal como o segundo gene quimérico acima), para controlar pragas de inseto, bem como o uso de qualquer um dos genes cry1C quiméricos acima ou qualquer um dos genes cry1C quiméricos acima e um gene cry1Ab quimérico (tal como o segundo gene quimérico acima) para obter plantas, particularmente plantas de arroz, protegidas de pragas de inseto Lepidóptero de planta, particularmente Chilo suppressalis, Marasmia patnalis,

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Cnaphalocrocis medinalis, Sesamia inferens, Spodoptera litura ou

Scirpophaga incertulas.

[0025] Além disso, de acordo com esta invenção são fornecidos métodos para detecção da presença da sequência de codificação de crylC da invenção em material biológico, tal como planta, por exemplo, em grão ou sementes de arroz, ou produtos de arroz, compreendendo a etapa de uso de iniciadores oligonucleotídicos ou sondas específicos, tais como iniciadores de PCR específicos para a região de codificação de cry1C da invenção, tais como iniciadores compreendendo a sequência da SEQ ID N° 7 ou 8. Além disso, é fornecido neste pedido um conjunto, compreendendo dois iniciadores que especificamente reconhecem a sequência da SEQ ID N° 1, tal como um conjunto compreendendo um primeiro iniciador compreendendo a sequência da SEQ ID N° 7 e um segundo iniciador compreendendo a sequência da SEQ ID N°: 8.

[0026] Ainda é fornecido neste pedido um método para controle de pragas de inseto Lepidóptero de arroz, compreendendo: expressão em plantas de arroz de uma proteína inseticida Cry1C e uma proteína inseticida Cry1Ab, em que a dita proteína Cry1C compreende a sequência de aminoácido da SEQ ID N°: 2 da posição do ami noácido 28 à posição do aminoácido 627, particularmente em que a dita proteína Cry1Ab compreende uma sequência de aminoácido com identidade de sequência de pelo menos 99% à sequência da SEQ ID N° 12 da posição do aminoácido 30 à posição do aminoácido 617. Particularmente é fornecido neste pedido tal método em que os ditos insetos de arroz são Chilo suppressalis, Marasmia patnalis, Cnaphalocrocis medinalis, Sesamia inferens, Spodoptera litura ou Scirpophaga incertulas, e em que a dita proteína Cry1Ab compreende a sequência de aminoácido da SEQ ID N° 12 da posição do aminoácido 30 à posi ção do aminoácido 617. Também é fornecido neste pedido o uso de um DNA que

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15/68 codifica uma proteína inseticida CrylC compreendendo a sequência de aminoácido da SEQ ID N° 2 da posição do aminoácido 28 à posição do aminoácido 627, para obter plantas de arroz protegidas de Chilo suppressalis, Marasmia patnalis, Cnaphalocrocis medinalis, Sesamia inferens, Spodoptera litura ou Scirpophaga incertulas.

Descrição [0027] De acordo com esta invenção, uma sequência de ácido nucleico refere-se a uma molécula de DNA ou RNA na forma de fita única ou dupla, preferencialmente uma molécula de DNA. Um DNA isolado, como usado neste pedido, refere-se a um DNA que não ocorre naturalmente ou não mais no ambiente natural em que esteve presente originalmente, por exemplo, uma sequência de codificação de DNA associada com outros elementos regulatórios em um gene quimérico, um DNA transferido em outra célula hospedeira, tal como uma célula vegetal, ou uma sequência de DNA artificial, sintética que tem uma sequência nucleotídica diferente comparada com qualquer sequência de DNA conhecida que ocorre naturalmente.

[0028] De acordo com esta invenção, sequência de ácidos nucleicos, particularmente sequências de DNA, codificando toxinas Cry de Bt ou variantes da mesma foram construídas. As novas sequências de DNA são indicadas neste pedido como cry1C, e suas proteínas codificadas são indicadas neste pedido como proteínas Cry1C (por exemplo, Cry1C1 ou Cry1C2). Também uma nova sequência de DNA que codifica um peptídeo de trânsito de cloroplasto otimizado é fornecida neste pedido, por exemplo, um DNA compreendendo a sequência da SEQ ID N° 3 da posição do nucleotídeo 7 à posição do nucleotídeo 371, particularmente a sequência da SEQ ID N° 3. C omo usado neste pedido, o termo proteína Cry1C da invenção refere-se a qualquer proteína inseticida compreendendo o menor fragmento da sequência de aminoácido da SEQ ID N° 2 que conserva atividade insetiPetição 870170072777, de 27/09/2017, pág. 18/162

16/68 cida (a seguir mencionada como o menor fragmento tóxico), particularmente qualquer proteína compreendendo uma sequência de aminoácido com pelo menos 99% de identidade de sequência, ou idêntica à sequência de aminoácido do aminoácido na posição 28 ao aminoácido na posição 627 na SEQ ID N° 2, preferencialmente q ualquer proteína inseticida compreendendo uma sequência de aminoácido com pelo menos 99% de identidade de sequência, ou idêntica à sequência de aminoácido da SEQ ID N° 2 da posição do aminoácido 2 à posição do aminoácido 627, particularmente tais proteínas (ou qualquer proteína Cry1C, tal como qualquer proteína inseticida compreendendo pelo menos 85%, particularmente pelo menos 90 ou 95% de identidade de sequência à sequência da SEQ ID N° 2 da posição do aminoácido 28 a 627) que contêm um aminoácido Glu na posição do aminoácido 124 na SEQ ID N° 2, ou na posição equivalente em uma sequência mais curta ou mais longa (como pode ser determinado em um alinhamento de sequência de aminoácido). Também está incluída nesta definição uma proteína inseticida compreendendo a sequência de aminoácido da SEQ ID N° 2 da posição do aminoácido 1 à posição do aminoácido 627, ou compreendendo a sequência de aminoácido da SEQ ID N°: 2 (denominada proteína Cry1C1 neste pedido), bem como uma proteína inseticida compreendendo a sequência de aminoácido da SEQ ID N°: 5 da posição do aminoácido 3 à posição do aminoácido 627, ou compreendendo a sequência de aminoácido da SEQ ID N° 5 (também denominada proteína Cry1C2 neste pedido), bem como tais proteínas inseticidas em que de 1 a 5 aminoácidos foram deletados ou substituídos por outros aminoácidos, sem modificar o aminoácido Glu na posição do aminoácido 124 na SEQ ID N° 2 ou em uma posição equivalente em uma proteína mais curta ou mais longa.

[0029] Também estão incluídos neste pedido como uma proteína

Cry1C da invenção adições de aminoácido menores, tais como a inPetição 870170072777, de 27/09/2017, pág. 19/162

17/68 serção de um aminoácido Ala ou Asp entre o primeiro e o segundo aminoácidos de uma proteína Cry1C da invenção, para fornecer Met Ala ou Met Asp como os primeiros dois aminoácidos, ou fusão de uma proteína Cry1C da invenção à outra proteína ou peptídeo, tal como uma proteína de fusão Cry1C-peptídeo de trânsito.

[0030] Uma vez que algumas modificações à sequência de aminoácido Cry1C são possíveis sem modificar sua atividade inseticida (tal como, por exemplo, a introdução de sítios de clivagem de enzima de restrição de DNA para produção do gene que codifica a proteína Cry1C), também incluída na invenção como uma proteína Cry1C como usado neste pedido é qualquer proteína compreendendo um equivalente da sequência de aminoácido do aminoácido na posição 28 ao aminoácido na posição 627 na SEQ ID N°: 2, mas em q ue menos de 10, preferencialmente de 1 a 5, aminoácidos são substituídos por outros aminoácidos nesta região na SEQ ID N°: 2, sem afetar negativamente a atividade inseticida da proteína. Preferencialmente, o aminoácido na posição 124 na SEQ ID N° 2 ou na posição 2 47 na SEQ ID N° 5 (ou em uma posição equivalente em uma sequência mais curta ou mais longa) é o ácido glutâmico (Glu) em tal proteína.

[0031] Também são úteis nesta invenção são variantes da proteína Cry1C da SEQ ID N°: 2 compreendendo uma sequênci a que tem uma identidade de sequência de pelo menos 95%, particularmente pelo menos 96%, 97%, 98% ou pelo menos 99% ao nível de sequência de aminoácido com a região do aminoácido na posição 28 ao aminoácido na posição 627 de SEQ ID N° 2, como determinado usando algoritmo de alinhamento global Needleman-Wunsch em EMBOSS (Rice et al., 2000) para encontrar alinhamento ótimo acima do tamanho completo das sequências, usando configurações predeterminadas (penalidade 10 de lacuna inicial, penalidade 0,5 de extensão de lacuna; para comparações de sequência de aminoácido, a matriz EBLOSUM62 é

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18/68 usada). Variantes preferenciais da proteína CrylC da invenção incluem uma proteína compreendendo a sequência de SEQ ID N° 2 da posição do aminoácido 28 à posição do aminoácido 627, mas em que um, alguns ou todos dos seguintes aminoácidos nas seguintes posições comparadas com as posições na SEQ ID N° 2 são modificados: o aminoácido na posição 183 é Valina, o aminoácido na posição 294 é Arginina, o aminoácido na posição 453 é o ácido Aspártico, ou o aminoácido na posição 592 é Arginina. Particularmente, as variantes da proteína Cry1C desta invenção têm não mais do que 5 diferenças de aminoácido com a proteína Cry1C de SEQ ID N° 2 da posição do aminoácido 28 à posição do aminoácido 627, e conservam o aminoácido Glu na posição 124 em SEQ ID N°: 2 (ou em uma posição equivalente em uma sequência mais curta ou mais longa).

[0032] Uma proteína Cry1C compreendendo a sequência de aminoácido do aminoácido na posição 28 ao aminoácido na posição 627 na SEQ ID N° 2 conserva toda ou a maior parte da atividade inseticida para seus insetos-alvo que são eliminados ou quem tem seu crescimento inibido pela proteína inteira como produzida pelo Bacillus thuringiensis na natureza, e adição de aminoácidos ou sequências de proteína na parte de N- ou C-terminal da mesma não interrompe esta atividade inseticida. Por isso, qualquer proteína caracterizada por uma sequência de aminoácido contendo ou incluindo esta região é útil e é parte desta invenção. A terminologia de DNA ou proteína compreendendo certa sequência X, como usado neste pedido, refere-se a um DNA ou proteína incluindo ou contendo pelo menos a sequência X, para que outras sequências nucleotídicas ou de aminoácido possam ser incluídas nas extremidade 5' (ou N-terminal) e/ou 3' (ou C-terminal), por exemplo, (a sequência nucleotídica de) uma proteína marcadora selecionável como descrito na EP 0193259, (a sequência nucleotídica de) um peptídeo de trânsito, e/ou uma sequência líder 5'

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19/68 ou uma sequência trailer 3'. Similarmente, o uso do termo compreender, compreendendo ou compreende em todas as partes do texto e as reivindicações deste pedido de patente seriam entendidos por significar a inclusão de um determinado objeto completo em si ou etapa ou grupo de objetos completos em si ou etapas mas não a exclusão de qualquer outro objeto completo em si ou etapa ou grupo de objetos completos em si ou etapas.

[0033] Para o objetivo desta invenção, a identidade de sequência de duas sequências nucleotídicas ou de aminoácido relacionadas, expressas como uma porcentagem, refere-se ao número de posições nas duas sequências otimamente alinhadas que têm resíduos idênticos (x100) dividido pelo número de posições comparadas. Uma lacuna, isto é, uma posição em um alinhamento onde um resíduo está presente em uma sequência mas não na outra, é considerada como uma posição com resíduos não-idênticos. O alinhamento das duas sequências é executado pelo algoritmo Needleman e Wunsch (Needleman and Wunsch 1970) em EMBOSS (Rice et al., 2000) para encontrar o alinhamento ótimo sobre o tamanho total das sequências, usando configurações predeterminadas (penalidade 10 de abertura de lacuna, penalidade 0,5 de extensão de lacuna).

[0034] O menor fragmento tóxico de uma proteína Cry1C da invenção, como usado neste pedido, é aquele menor fragmento ou porção de uma proteína Cry1C que conserva atividade inseticida que pode ser obtida por digestão enzimática, tais como tripsina ou quimiotripsina, da proteína Cry de tamanho total, ou aquele menor fragmento ou porção de uma proteína Cry conservando atividade inseticida que pode ser obtida pela produção de deleções nucleotídicas no DNA que codifica uma proteína Cry1C. Tal menor fragmento tóxico também pode ser obtido pelo tratamento de uma proteína Cry1C com suco entérico de inseto, preferencialmente suco mesentérico, de uma espécie de

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20/68 inseto suscetível a (isto é, eliminado ou de outra maneira afetado negativamente em seu crescimento ou alimentação por) tal proteína

Cry1C.

[0035] Como usado neste pedido, os termos DNA de crylC ou gene crylC, referem-se a qualquer sequência de DNA que codifica a proteína Cry1C da invenção. Isto inclui sequências de DNA que ocorrem naturalmente, artificiais ou sintéticas que codificam a proteína Cry1C da invenção, tais como um DNA idêntico ou com identidade de sequência de pelo menos 95%, 97%, 98%, ou 99% ao DNA ou sequência de codificação da SEQ ID N° 1 da posição d o nucleotídeo 82 à posição do nucleotídeo 2415, ou à sequência de DNA ou sequência de codificação da SEQ ID N° 1 da posição do nucleotídeo 4 a 2415, ou ao DNA ou sequência de codificação da SEQ ID N° 1, ou ao DNA ou sequência de codificação da SEQ ID N°: 5 da posi ção do nucleotídeo 7 à posição do nucleotídeo 2784, ou ao DNA ou sequência de codificação da SEQ ID N°: 5 da posição do nucleotídeo 1 à posição do nucleotídeo 2784, ou ao DNA ou sequência de codificação da SEQ ID N°: 5. Também estão incluídas neste pedido sequênci as de DNA que codificam proteínas inseticidas que são bastante similares a qualquer uma das sequências de DNA das SEQ ID N°^s. 1 ou 5 para que possam (isto é, ter a capacidade de) hibridizar a estas sequências de DNA sob condições de hibridização estringentes. Condições de hibridização estringentes, como usado neste pedido, referem-se particularmente às seguintes condições: imobilização das sequências de DNA relevantes em um filtro, e pré-hibridização dos filtros por 1 a 2 horas em formamida 50%, SSPE 5%, reagente de Denhardt 2x e SDS 0,1% a 42°C, ou por 1 a 2 horas em SSC 6x, reagente de Den hardt 2x e SDS 0,1% a 68°C. A sonda desnaturada dig- ou rádio-marcada então é adicionada diretamente ao fluido de pré-hibridização e a incubação é realizada por 16 a 24 horas na temperatura apropriada acima mencionaPetição 870170072777, de 27/09/2017, pág. 23/162

21/68 da. Após incubação, os filtros então são lavados por 30 minutos à temperatura ambiente em SSC 2X, SDS 0,1%, seguido por 2 lavagens de 30 minutos cada uma a 68°C em SSC 0,5x e SDS 0,1 %. Uma autorradiografia é estabelecida pela exposição dos filtros por 24 a 48 horas ao filme de raio x (Kodak XAR-2 ou equivalente) a -70°C com uma tela intensificadora. Naturalmente, condições equivalentes e parâmetros podem ser usados neste processo conservando ainda as condições de hibridização estringentes desejadas. Também estão incluídas neste pedido como genes crylC da invenção sequências de DNA que codificam uma proteína inseticida com identidade de sequência de pelo menos 80% ou 90%, preferencialmente pelo menos 93 a 97%, particularmente pelo menos 95, pelo menos 98 ou pelo menos 99%, à sequência de DNA da SEQ ID N°: 1 da posição do nucl eotídeo 82 à posição do nucleotídeo 2415, ou à sequência de DNA da SEQ ID N°: 1 da posição do nucleotídeo 4 a 2415, ou à sequência de DNA da SEQ ID N°: 1, ou à sequência de DNA da SEQ ID N°: 5 da posição do nucleotídeo 7 à posição do nucleotídeo 2784, ou à sequência de DNA da SEQ ID N°: 5, particularmente um DNA que codifica u ma proteína Cry1C compreendendo uma sequência de aminoácido com pelo menos identidade de sequência de 95%, 97%, 98%, ou 99% com a sequência de aminoácido da posição do aminoácido 2 ou 28 ao aminoácido na posição 627 na SEQ ID N°: 2, ou com a sequê ncia de aminoácido da SEQ ID N° 2 ou 5, particularmente tal proteína Cry1C em que o aminoácido na posição 124 na SEQ ID N° 2 (ou em uma posição equivalente em outra sequência) é Glu. As identidades de sequência de DNA mencionadas neste pedido são calculadas usando o algoritmo de alinhamento global Needleman-Wunsch em EMBOSS (Rice et al., 2000) para encontrar o alinhamento ótimo sobre o tamanho total das sequências, usando configurações predeterminadas (penalidade 10 de abertura de lacuna, penalidade 0,5 de extensão de lacuna; para comPetição 870170072777, de 27/09/2017, pág. 24/162

22/68 parações de sequência de DNA, a matriz EDNAFULL é usada; para comparações de sequência de aminoácido, a matriz EBLOSUM62 é usada).

[0036] Em uma modalidade, o termo DNA (ou gene) de crylC da invenção, refere-se a qualquer DNA (ou gene) da sequência que codifica uma proteína inseticida, particularmente uma proteína inseticida Cry1C, compreendendo: a) a sequência nucleotídica da SEQ ID N° 1 da posição do nucleotídeo 82 à posição do nucleotídeo 2415, b) a sequência nucleotídica da SEQ ID N° 5 da posição do nucleotídeo 7 à posição do nucleotídeo 2784, c) a sequência nucleotídica da SEQ ID N°: 1 da posição do nucleotídeo 4 a posição do nucl eotídeo 2415, d) a sequência nucleotídica da SEQ ID N° 1 da posição do nucleotídeo 82 à posição do nucleotídeo 590 ligada à sequência nucleotídica da posição do nucleotídeo 1125 à posição do nucleotídeo 2415 em SEQ ID N°: 1, ou e) a sequência nucleotídica da SEQ ID N°: 5 da posição do nucleotídeo 7 à posição do nucleotídeo 959 ligada à sequência nucleotídica da posição do nucleotídeo 1794 à posição do nucleotídeo 2784 na SEQ ID N°: 5, ou f) a sequência de codificação d e qualquer uma das sequências nucleotídicas de a) a c) acima. Em uma modalidade, um DNA de crylC da invenção é o DNA de cry1C1 da SEQ ID N° 1 ou sequência de DNA de cry1C2 da SEQ ID N° 5.

[0037] Em outra modalidade, um DNA de crylC da invenção refere-se a qualquer DNA que codifica uma proteína inseticida, particularmente uma proteína inseticida Cry1C, que hibridiza sob condições de hibridização estringentes a um DNA compreendendo: a) a sequência nucleotídica da SEQ ID N° 1 da posição do nucleotídeo 82 à posição do nucleotídeo 2415, b) a sequência nucleotídica da SEQ ID N°: 5 da posição do nucleotídeo 7 à posição do nucleotídeo 2784, c) a sequência nucleotídica da SEQ ID N°: 1 da posição do nucl eotídeo 4 a posição do nucleotídeo 2415, ou d) a sequência de codificação das sePetição 870170072777, de 27/09/2017, pág. 25/162

23/68 quências nucleotídicas de qualquer uma de a) a c), ou qualquer DNA com pelo menos identidade de sequência de 80% ou 90%, preferencialmente pelo menos 93 a 97%, particularmente pelo menos 95, pelo menos 98 ou pelo menos 99%, a um DNA compreendendo: a) a sequência nucleotídica da SEQ ID N° 1 da posição do nucleotídeo 82 à posição do nucleotídeo 2415, b) a sequência nucleotídica da SEQ ID N°: 5 da posição do nucleotídeo 7 à posição do nucl eotídeo 2784, c) a sequência nucleotídica da SEQ ID N° 1 da posição d o nucleotídeo 4 à posição do nucleotídeo 2415, ou d) a sequência de codificação das sequências nucleotídicas de qualquer uma de a) a c).

[0038] Atividade inseticida de uma proteína, como usada neste pedido, significa a capacidade de uma proteína de eliminar insetos, inibir seu crescimento ou causar uma redução da alimentação de inseto quando tal proteína é ingerida por insetos. Nesta invenção, tal ingestão é preferencialmente através da ingestão de células hospedeiras recombinantes, tais como uma célula vegetal, semente ou planta, expressando uma proteína da invenção, por tal inseto. É entendido que a atividade para insetos de uma espécie de inseto, preferencialmente larvas dos mesmos, é suficiente para uma proteína ter atividade inseticida como usado neste pedido, embora muitas vezes os insetos de espécies diferentes de inseto sejam afetados pela proteína da invenção. Os hospedeiros recombinantes expressando uma proteína Cry1C da invenção são tipicamente desenvolvidos ou direcionados a espécies de pragas de inseto principais específicas de certa cultura ou região onde tal espécie de inseto é uma praga, por exemplo, brocas de colmo de arroz e dobradores de folha Lepidópteros que são pragas de inseto em culturas de arroz na China, Índia, Indonésia, Vietnã, Paquistão, Bangladesh, Mianmar e Tailândia, mas outros insetos também podem ser controlados pelos hospedeiros recombinantes da invenção, tal como pelas células vegetais ou plantas transgênicas, por exemplo,

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24/68 as células vegetais ou plantas de arroz transgênicas da invenção compreendendo qualquer um dos genes crylC quiméricos da invenção.

[0039] As plantas da invenção contendo um gene crylC da invenção permitem que novos métodos de agricultura sejam usados, em que menos ou nenhum inseticida seja usado em plantas, tais como arroz para controlar pragas de inseto de planta, tal como brocas do colmo de arroz ou dobradores de folha de arroz, e uma modalidade da invenção por isso inclui uso das plantas ou células vegetais da invenção, tais como plantas de arroz ou células vegetais, compreendendo um gene crylC da invenção para controlar insetos de praga de planta, tais como insetos de praga de arroz, particularmente brocas do colmo de arroz e dobradores de folha de arroz, bem como métodos de controle de pragas de inseto de planta, tais como pragas de inseto de arroz, por exemplo, brocas do colmo de arroz e dobradores de folha de arroz, pela expressão da proteína Cry1C da invenção em células vegetais, sementes ou plantas, particularmente células vegetais, sementes ou plantas de arroz, ou pelo crescimento, semeadura ou cultivo de plantas, tais como plantas de arroz, compreendendo o gene crylC da invenção.

[0040] Quantidades de controle do (Inseto) de ou controle de uma proteína Cry1C, ou de um hospedeiro recombinante expressando uma proteína Cry1C desta invenção, como usado neste pedido, referese a uma quantidade da proteína que é suficiente para limitar o dano a uma planta por insetos que se alimentam de tal planta, por exemplo, pela eliminação dos insetos ou inibição do desenvolvimento, fertilidade ou crescimento do inseto de tal maneira que uma espécie de inseto forneça menos dano a uma planta. Isto não significa que o tratamento de plantas com inseticidas químicos não será mais necessário (por exemplo, para controlar espécies de inseto não afetadas pela proteína

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25/68 da invenção, tal como pragas de inseto Coleóptero ou Dípteros (secundárias)), mas aquele tratamento por inseticidas químicos para os insetos visados pela proteína da invenção pode ser significativamente reduzido ou evitado, obtendo ainda desempenho vegetal aceitável no campo e rendimento aceitável.

[0041] Os genes crylC da invenção são preferencialmente usados em células, plantas, ou sementes de arroz para controlar pragas de inseto de arroz. Arroz, como usado neste pedido, refere-se a um cereal gramíneo do gênero Oryza que é cultivado por seu grão comestível, preferencialmente Oryza sativa e Oryza glaberrima, particularmente Oryza sativa. Grão de arroz, como usado neste pedido, inclui grão de arroz integral ou não-polido, grão de arroz polido ou branco, bem como o grão cozido no vapor, frito ou cozido, quebrado ou parboilizado bem como grão de arroz pré-germinado. Arroz como usado neste pedido inclui qualquer maneira de produção ou crescimento de arroz, tal como arroz irrigado ou não irrigado, arroz de longo curso ou alagado, arroz com casca, arroz de sequeiro, arroz de polinização aberta ou híbrido, e inclui o arroz de cultivares de indica, japonica ou javonica. Arroz híbrido, particularmente arroz híbrido Arize®, é uma modalidade preferencial desta invenção, por causa de seu maior rendimento de grão, e qualidade ótima de grão e semente. Arroz, quando usado neste pedido em geral, também refere-se a sementes, células, protoplastos, pólen, ou quaisquer partes ou tecidos de uma planta de arroz. [0042] Como usado neste pedido, grão de arroz processado se refere a grão moído, polido, descascado, parboilizado, convertido, quebrado, cozido no vapor ou cozido. Incluído neste pedido como o grão de arroz processado também é (parcialmente) arroz integral cozido ou cozido no vapor, tal como arroz integral rápido ou instantâneo e qualquer tipo de grão de arroz não mais contendo um embrião viável que possa germinar uma planta de arroz.

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26/68 [0043] Produtos de arroz, como usado neste pedido, referem-se a produtos contendo ou feito a partir de plantas, sementes, células ou grão de arroz da invenção, incluindo farinha de arroz, macarrões, mingau de cereal, bebidas, pratos de arroz e similares.

[0044] De acordo com esta invenção, insetos suscetíveis as proteínas Cry1C da invenção são contatados com estas proteínas em quantidades que controlam inseto, preferencialmente quantidades de eliminação do inseto. Em uma modalidade desta invenção, hospedeiros recombinantes da invenção, tais como células vegetais ou plantas transgênicas da invenção, expressam uma proteína ou uma combinação de proteínas da invenção em altos níveis, tais que um nível de alta dose é obtido. Uma expressão alto nível de dose, alta resistência do inseto à dose ou alta dose, como usada neste pedido referindose a uma célula vegetal ou planta recombinante, referem-se a uma concentração da proteína inseticida em uma célula vegetal ou planta (medido por ELISA como uma porcentagem da proteína solúvel total, proteína solúvel total a qual é medida após extração de proteínas solúveis em um tampão de extração (por exemplo, o tampão de extração descrito em Jansens et al., 1997) usando análise de Bradford (BioRad, Richmond, CA; Bradford, 1976)) que elimina uma etapa de desenvolvimento do inseto-alvo que é significativamente menos suscetível, preferencialmente pelo menos 25 vezes menos suscetível à toxina do que a primeira etapa larval do inseto, e, dessa forma, pode ser esperado assegurar o controle total do inseto-alvo. Em uma modalidade, isto refere-se à obtenção de pelo menos 97 por cento, preferencialmente pelo menos 99 por cento, ainda mais preferencialmente 100 por cento, mortalidade do quarto ínstar larval (para insetos que têm 5 ínstares larvais) ou o último ínstar larval (para insetos que têm 4 ou menos ínstares larvais) de um inseto-alvo, como medido de 10 a 14 dias após infestação de inseto de tais células vegetais ou plantas, ou partes

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27/68 das mesmas, no bioensaio de inseto regular (usando uma colônia de inseto suscetível normal (insetos não-selecionados para a resistência as proteína de Bt)), preferencialmente bioensaios de inseto de planta inteiro, usando controles adequados.

[0045] A existência de uma espécie de inseto-alvo (isto é, uma espécie de inseto, preferencialmente as larvas do mesmo, que pode causar o dano significativo a uma espécie de planta, e que é tipicamente um inseto para o qual uma planta transgênica é desenhada e desenvolvida) para a qual células vegetais ou plantas transformadas de acordo com esta invenção fornecem uma resistência a inseto de nível de alta dose é suficiente para uma planta a ser indicada como fornecendo expressão de alta dose, de acordo com esta invenção. [0046] Insetos-alvo preferenciais das plantas e células vegetais desta invenção são pragas de inseto Lepidóptero economicamente prejudiciais a plantas, que se alimentam ou de outra maneira danificam plantas e por meio disso reduzem safras vegetais (neste pedido mencionado como pragas de inseto Lepidóptero de planta), particularmente brocas Lepidóptero do colmo de arroz e dobradores de folha de arroz, preferencialmente insetos selecionados do grupo composto de: a broca-do-colmo listrado Chilo suppressalis, a broca-do-colmo amarelo Scirpophaga incertulas (também denominado Tryporyza incertulas), a broca-do-colmo branco Scirpophaga innotata (também denominado Tryporyza innotata), a broca-do-colmo de cabeça escura Chilo polychrysa, a broca-do-colmo rosa Sesamia inferens, a broca de canade-açúcar Diatraea saccharalis, a broca de talo de arroz Chilo plejadellus, o dobrador de folha de arroz Marasmia patnalis, o dobrador de folha de arroz Cnaphalocrocis medinalis, e insetos, tais como Hereitogramma licarisalis, Naranga aenescens, Mycalesis gotama, Marasmia exigua, Marasmia ruralis, Nymphula depunctalis, Spodoptera litura, Rupela albinella, Spodoptera frugiperda, Mythimna unipuncta, Chilo

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28/68 zacconius e Parnara guttata. Insetos-alvo mais particularmente de plantas, células ou sementes Cry1C desta invenção são espécies de pragas de inseto de arroz dos seguintes gêneros: Chilo, Scirpophaga, Marasmia, Cnaphalocrocis, Diatraea, e Spodoptera, preferencialmente insetos Chilo suppressalis, Scirpophaga incertulas, Marasmia patnalis, Cnaphalocrocis medinalis e Spodoptera litura. Obviamente, em países ou regiões diferentes, diferentes nomes locais podem ser usados para o inseto da mesma espécie. Um gene quimérico, como usado neste pedido, é usado para referir-se a um DNA compreendendo pelo menos dois fragmentos de DNA diferentes (tais como um promotor, um líder 5' não-traduzido, uma região de codificação que codifica um peptídeo de trânsito de cloroplasto, uma região de codificação de cry1C, um íntron, um trailer 3' não-traduzido, e uma região de formação de transcrito da extremidade 3' e poliadenilação) que são operacionalmente ligados e que não são associados naturalmente um com outro ou que se originam de fontes diferentes, preferencialmente este termo refere-se a um DNA compreendendo uma região promotora expressável pela planta operacionalmente ligada a uma sequência de DNA que codifica uma proteína Cry1C desta invenção, tal como o DNA ou sequência de codificação da SEQ ID N° 1 ou 5. Uma sequência de codificação ou região de codificação como usado neste pedido, referindo-se ao gene cry1C da invenção, refere-se àquela sequência de DNA que codifica uma sequência de aminoácido e exclui quaisquer sequências líder ou trailer 5' ou 3' não-traduzidas, ou sequências não-traduzidas, tais como íntrons. Por isso, a sequência de codificação da SEQ ID N° 1 é a sequência de DNA da posição do nucleotídeo 1 a 590 na SEQ ID N° 1 ligada à sequênci a de DNA da posição do nucleotídeo 1125 a 2415, que forma uma fase de leitura contínua que codifica uma proteína, não interrompida por partes nãotraduzidas, tais como íntrons ou códons de parada. Uma sequência de

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29/68 codificação, como usada neste pedido, exclui um códon de parada, mas inclui o códon de início de tradução (Met). O termo codificação, como usado neste pedido, como na terminologia um gene ou DNA que codifica proteína X, refere-se à capacidade de tal gene de produzir uma proteína na transcrição e tradução da sequência de codificação contida em tal gene em uma célula hospedeira-alvo. Por isso, o gene quimérico cry1C1 da invenção codifica a proteína Cry1C1 da invenção, embora este gene quimérico contenha duas sequências de codificação (ou éxons) interrompidas por uma sequência intrônica não-codificante. Os DNAs que codificam a proteína Cry1C da invenção podem ser quimicamente sintetizados usando técnicas de rotina, e podem ser inseridos em vetores de expressão para produzir altas quantidades das proteínas Cry1C. As proteínas Cry1C da invenção podem ser usadas para preparar anticorpos monoclonais ou policlonais específicos de uma maneira convencional (Hofte et al., 1988) para desenvolver imunoensaios (por exemplo, ELISA, Western blotting, sondas recobertas com anticorpo) para detectar a presença da ausência destas proteínas em qualquer material, tal como material vegetal.

[0047] As ferramentas desenvolvidas para identificar células vegetais transgênicas, plantas, ou materiais derivados de planta, tais como folhas, sementes, grão, ou produtos de arroz compreendendo qualquer um dos genes crylC da invenção, ou produtos contendo DNA que compreendem ou são derivados do material vegetal compreendendo um gene crylC da invenção são baseados nas características de sequência específicas dos novos genes da invenção, tal como, um mapa de restrição específico da região genômica compreendendo o gene crylC introduzido (estranho), ou marcadores moleculares específicos baseados na sequência do DNA estranho integrado no genoma da planta.

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30/68 [0048] Uma vez que a sequência de um DNA estranho, tal como os genes crylC da invenção é conhecida, os iniciadores e as sondas podem ser desenvolvidos que especificamente reconhecem estas sequências no ácido nucleico (DNA ou RNA) de uma amostra por meio de uma técnica de biologia molecular. Por exemplo, um método de PCR pode ser desenvolvido para identificar os genes da invenção em amostras biológicas (tais como amostras de plantas, material vegetal ou produtos compreendendo material vegetal, tais como grão ou semente de arroz ou produtos de arroz como definido neste pedido). Tal PCR é baseada em pelo menos dois iniciadores específicos, por exemplo, ambos reconhecendo uma sequência dentro do DNA de crylC ou da região de codificação de crylC da invenção (tal como o DNA da SEQ ID N° 1 ou 5, ou a região de codificação da SEQ ID N° ou 5), ou um reconhecimento de uma sequência dentro do DNA de crylC e outro reconhecimento de uma sequência dentro da sequência de peptídeo de trânsito associada ou dentro das regiões reguladoras, tais como o promotor ou extremidade 3' do gene quimérico compreendendo um DNA de crylC da invenção. Os iniciadores preferencialmente têm ou compreendem uma sequência entre 15 e 35 nucleotídeos que sob condições de PCR otimizadas especificamente reconhecem uma sequência dentro do gene quimérico crylC ou região de codificação da invenção, para que um fragmento específico (fragmento de integração ou amplicon de discriminação) seja amplificado a partir de uma amostra de ácido nucleico compreendendo um gene crylC da invenção. Isto significa que somente o fragmento de integração visado, e não outra sequência no genoma de planta ou DNA estranho, é amplificado sob condições de PCR otimizadas.

[0049] Iniciadores de PCR adequados para a invenção são oligonucleotídeos variando no tamanho de 17 nucleotídeos a aproximadamente 200 nucleotídeos, compreendendo uma sequência nucleotídica

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31/68 de pelo menos 17 nucleotídeos consecutivos, preferencialmente 20 nucleotídeos consecutivos, selecionados a partir do DNA de crylC ou sequência do gene quimérico crylC como transferida para células vegetais ou plantas da invenção. Os iniciadores podem ser naturalmente mais longos do que 17 nucleotídeos consecutivos, e podem ser, por exemplo, 20, 21, 22, 30, 35, 50, 75, 100, 150, 200 nt de comprimento ou até mais longos. Os iniciadores podem compor-se inteiramente de sequências nucleotídicas selecionadas a partir das sequências nucleotídicas de crylC. Entretanto, a sequência nucleotídica dos iniciadores em sua extremidade 5' (isto é, fora dos 17 nucleotídeos consecutivos localizados em 3') é menos crítica. Dessa forma, a sequência 5' dos iniciadores pode compor-se de uma sequência nucleotídica selecionada a partir da sequência do gene quimérico crylC, como apropriado, mas pode conter várias incompatibilidades (por exemplo, 1, 2, 5, 10). A sequência 5' dos iniciadores pode até compor-se inteiramente de uma sequência nucleotídica não-relacionada com os genes crylC da invenção, tal como uma sequência nucleotídica representando um ou mais sítios de reconhecimento enzimático de restrição. Tais sequências não-relacionadas ou sequências de DNA flanqueadoras com incompatibilidades preferencialmente não devem ser maiores do que 100, mais preferencialmente não maiores do que 50 ou não maiores do que 25 nucleotídeos. Além disso, iniciadores adequados podem compreender ou compor-se de uma sequência nucleotídica em sua extremidade 3' transpondo a região de junção entre a sequência de codificação de crylC da invenção e a sequência de peptídeo de trânsito associada ou elementos reguladores no gene quimérico crylC integrado no DNA vegetal, tais como uma sequência promotora, uma sequência líder, uma sequência trailer ou uma sequência de terminação 3' de transcrito e de poliadenilação. Também será imediatamente claro para o versado que pares de iniciadores de

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PCR selecionados corretamente também não devem compreender sequências complementares umas as outras.

[0050] O termo iniciador como usado neste pedido engloba qualquer ácido nucleico que é capaz de iniciar a síntese de um ácido nucleico nascente em um processo dependente do molde, tal como PCR. Tipicamente, os iniciadores são oligonucleotídeos de 10 a 30 nucleotídeos, mas sequências mais longas podem ser empregadas. Iniciadores podem ser fornecidos na forma de dupla fita, embora a forma de fita simples seja preferida. Sondas podem ser usadas como iniciadores, mas são desenhadas para se ligar ao DNA ou RNA alvo e não precisam ser usadas em um processo de amplificação.

[0051] O termo reconhecimento como usado neste pedido quando se refere a iniciadores específicos, refere-se ao fato que os iniciadores específicos especificamente hibridizam a uma sequência de ácido nucleico nos genes crylC da invenção sob um protocolo de identificação de PCR padrão, pelo qual a especificidade é determinada pela presença de controles positivos e negativos como é bem-conhecido na técnica.

[0052] Também está incluído neste pedido um conjunto para detectar os genes crylC da invenção no material biológico, bem como o uso de tal conjunto para classificar o material biológico. Um conjunto como usado neste pedido refere-se ao grupo de reagentes com o objetivo de realizar a identificação dos genes crylC da invenção em amostras biológicas. Mais particularmente, uma modalidade preferencial do conjunto da invenção compreende pelo menos um ou dois iniciadores específicos, como descrito acima. Opcionalmente, o conjunto pode compreender ainda qualquer outro reagente descrito neste pedido no protocolo de identificação de PCR. Altemativamente, de acordo com outra modalidade desta invenção, o conjunto pode compreender uma sonda específica, como descrito acima, que especificamente hibridiza

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33/68 com o ácido nucleico de amostras biológicas para identificar a presença dos genes crylC nestas. Opcionalmente, o conjunto pode compreender ainda qualquer outro reagente (tal como, mas não limitado a ,tampão de hibridização, marcação) para a identificação dos genes crylC em amostras biológicas, usando a sonda específica.

[0053] Protocolos de PCR padrão são descritos na técnica, tais como em PCR Applications Manual (Roche Molecular Biochemicals, 2nd Edition, 1999). As condições ótimas para PCR, incluindo a sequência dos iniciadores específicos, são especificadas em um protocolo de identificação de PCR de cada espécie vegetal contendo o gene crylC. Entretanto, entende-se que vários parâmetros no protocolo de identificação de PCR podem precisar ser ajustados a condições de laboratório específicas, e podem ser modificados ligeiramente para obter resultados similares. Por exemplo, o uso de um método diferente da preparação do DNA pode, por exemplo, necessitar de ajuste da quantidade de iniciadores, polimerase e condições de anelamento usadas. Similarmente, a seleção de outros iniciadores pode ditar outras condições ótimas para o protocolo de identificação de PCR. Estes ajustes serão, entretanto, evidentes para um versado na técnica, e são detalhados ainda em manuais de aplicação de PCR atuais, tais como aquele citado acima. Exemplos de combinações de iniciadores adequadas de acordo com a invenção para detectar o DNA de crylC da invenção são um iniciador compreendendo a sequência da SEQ ID N° 7 (iniciador P1C203) e um iniciador compreendendo a sequência da SEQ ID N° 8 (iniciador P1C204). Por isso, qualq uer DNA que codifica uma proteína inseticida Cry1C que é especificamente reconhecida por estes iniciadores está incluído nesta invenção, bem como quaisquer métodos ou quaisquer conjuntos para detectar tal DNA usando estes ou outros iniciadores específicos. Os iniciadores P1C203 e P1C204, ou iniciadores compreendendo a sequência da SEQ ID N° 7

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34/68 ou 9, também podem ser usados como sondas para detectar a presença de um gene crylC da invenção.

[0054] Marcadores específicos ou sondas marcadas também podem ser desenhados para detectar as sequências de DNA desta invenção, e qualquer uso de marcadores específicos ou sondas dirigidas a qualquer um dos genes crylC da invenção está incluído neste pedido. Em uma modalidade desta invenção, os marcadores específicos, iniciadores ou sondas marcadas não detectam ou reconhecem qualquer planta, preferencialmente qualquer planta das mesma espécie que a planta teste, não contendo uma sequência de DNA de crylC da invenção, particularmente quaisquer marcadores, iniciadores ou sondas marcadas não detectam ou reconhecem qualquer planta expressando uma proteína Cry1C em que tal planta não contenha uma sequência de DNA da invenção (tal como um DNA de crylC como definido neste pedido, por exemplo, um DNA compreendendo a sequência nucleotídica de qualquer uma das SEQ ID N°: 1 ou 5, ou sequência de codificação das SEQ ID N°: 1 ou 5).

[0055] As sequências de DNA desta invenção podem ser ligeiramente modificadas para permitir sítios enzimáticos de restrição mais adequados, ou fazer pequenas modificações sem modificar a eficácia e em que tal DNA codifica uma proteína com a mesma ou substancialmente a mesma atividade inseticida que a proteína Cry1C da invenção. De fato, por causa da degeneração do código genético, é bemconhecido que a maior parte dos códons de aminoácido podem ser substituídos por outros sem modificar a sequência de aminoácido da proteína. Além disso, alguns aminoácidos podem ser substituídos por outros aminoácidos equivalentes ou podem ser adicionados sem modificar significativamente a atividade inseticida da proteína. Equivalentes das sequências de DNA da invenção incluem sequências de DNA com menos de 20, preferencialmente 5 a 10, diferenças nucleotídicas comPetição 870170072777, de 27/09/2017, pág. 37/162

35/68 parada com os genes crylC ou sequências de codificação desta invenção como definido neste pedido, mas que codificam uma proteína inseticida Cry1C da invenção, como definido neste pedido.

[0056] Com o termo substancialmente o mesmo, quando referese à sequência de aminoácido de uma proteína Cry1C desta invenção, é pretendido incluir uma sequência de aminoácido que se diferencia em não mais do que 5%, preferencialmente não mais do que 2%, particularmente não mais do que 1% à sequência de aminoácido da proteína comparada a; e quando refere-se a toxicidade ou atividade inseticida de uma proteína Cry1C, é pretendido incluir uma proteína cujo valor de LC50 obtido sob as mesmas condições do bioensaio (preferencialmente nos mesmos bioensaios usando insetos da mesma população e controles adequados) se diferencia não mais do que 2 vezes, preferencialmente não mais do que 50%, do valor de LC50 obtido para a proteína comparada.

[0057] Micro-organismo, como usado neste pedido, refere-se a qualquer organismo vivo que pode ser observado somente com o auxílio de um microscópio, tal como bactérias, células de levedura, células vegetais, vírus, fungos. Isto inclui todos os organismos em geral unicelulares com dimensões abaixo dos limites da visão que podem ser propagados e manipulados em um laboratório, tipicamente procariontes ou formas de vida eucarióticas unicelulares, incluindo culturas teciduais e plasmídeos.

[0058] Por uma parte eficaz inseticidamente (ou porção ou fragmento) de uma sequência de DNA que codifica uma proteína Cry1C, é pretendida uma sequência de DNA que codifica um polipeptídeo que tem menos aminoácidos do que a pró-toxina Cry1C como produzida na natureza por Bt mas que é ainda inseticida.

[0059] A fim de expressar todos ou uma parte eficaz inseticidamente da sequência de DNA que codifica uma proteína Cry desta inPetição 870170072777, de 27/09/2017, pág. 38/162

36/68 venção em um micro-organismo ou um hospedeiro recombinante, por exemplo, E. coli, uma linhagem de Bt, uma planta ou células vegetais, sítios de restrição adequados podem ser introduzidos, flanqueando a sequência de DNA. Isto pode ser feito por mutagênese sítio-dirigida, usando procedimentos bem-conhecidos (Stanssens et al., 1989; White et al., 1989).

[0060] Para obter a expressão aumentada em plantas e/ou prevenir a expressão de uma proteína inseticida quando não presente em uma célula hospedeira vegetal (tal como em uma bactéria ou outra célula hospedeira procarionte), em uma modalidade da invenção, um íntron vegetal, preferencialmente um íntron vegetal de monocotiledônea, é inserido nos genes crylC quiméricos da invenção, preferencialmente na sequência de codificação. Qualquer um dos íntrons vegetais conhecidos, preferencialmente íntrons vegetais de monocotiledônea, (por exemplo, Brown, 1986, Brown and Simpson, 1998, Brown et al., 1996) podem ser usados neste pedido, já que o íntron está operacionalmente ligado aos fragmentos de sequência de codificação para assegurar o splicing próprio em células vegetais. Ligação operável do íntron e o splicing próprio resultante são convenientemente verificados na espécie vegetal do hospedeiro-alvo ou células do mesmo pela verificação da produção de uma proteína ativa, por RT-PCR, Northern blot, ou por qualquer outro meio disponível na técnica. Em uma modalidade preferencial, o íntron da invenção é um íntron de monocotiledônea, tal como o íntron Adh1 descrito por Dennis et al. (1984), por exemplo, a sequência nucleotídica da SEQ ID N° 1 da posição do nucleotídeo 591 a posição do nucleotídeo 1124. Em outra modalidade da invenção, o íntron contido na sequência de codificação da proteína inseticida, particularmente a sequência de codificação de Cry1C, é o segundo íntron do gene ST-LS1 tecido específico e induzível por luz de Solanum tuberosum (batata) como descrito por Eckes et al. (1986). Em

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37/68 uma modalidade desta invenção, um íntron vegetal é operacionalmente ligado a partes das sequências de codificação de qualquer sequência de codificação de proteína inseticida de Bt a ser expressa em uma célula vegetal, para que seja efetivamente combinado em células vegetais e uma proteína inseticida de Bt é produzida. O splicing eficaz em células vegetais pode ser medido usando técnicas de rotina, tais como RT-PCR, Northern blotting, ou a detecção de uma proteína funcional produzida em células vegetais. Naturalmente, para splicing eficaz o íntron precisa ser inserido na posição correta da sequência de codificação para que os sítios funcionais de junção 5' e 3' sejam obtidos na sequência. O íntron nos genes quiméricos crylC da invenção, tal como nos genes quiméricos cry1C1 ou cry1C2, é efetivamente combinado em células vegetais de arroz, uma vez que alta mortalidade de inseto é vista nos bioensaios de inseto em plantas que expressam tais genes quiméricos crylC. RT-PCR também mostra que as plantas compreendendo o gene crylC da invenção produzem um mRNA que codifica a proteína Cry esperada.

[0061] De acordo com uma modalidade desta invenção, a proteína Cry1C é dirigida a organelas intracelulares, tais como plastídeos, preferencialmente cloroplastos, ou mitocôndria. Com esta finalidade, os genes quiméricos da invenção compreendem uma região de codificação que codifica um peptídeo sinal ou alvo, ligado ao DNA que codifica a proteína Cry1C da invenção. Peptídeos particularmente preferenciais que estão incluídos nas proteínas desta invenção são os peptídeos de trânsito de cloroplasto ou outro direcionamento de plastídeo, regiões de peptídeo de trânsito especialmente duplicadas de genes vegetais cujo produto gênico é dirigido ao plastídeo, tal como o peptídeo de trânsito otimizado da SEQ ID N° 4, o peptídeo de trânsito otimizado descrito por Lebrun et al. (1996), ou Capellades et al. (U.S. 5.635.618), o peptídeo de trânsito de ferredoxina-NADP+oxidorredutase de espinaPetição 870170072777, de 27/09/2017, pág. 40/162

38/68 fre (Oelmuller et al., 1993), o peptídeo de trânsito descrito em Wong et al. (1992) ou os peptídeos de direcionamento no pedido de patente publicada PCT WO 00/26371. Em uma modalidade da invenção, o peptídeo de trânsito de cloroplasto compreende a sequência da SEQ ID N° 4 da posição do aminoácido 3 à posição do am inoácido 124 ou variante da mesma, tal como um peptídeo de trânsito de cloroplasto compreendendo a sequência da SEQ ID N° 4 da posição do aminoácido 3 à posição do aminoácido 124, em que o aminoácido Cys na posição 55 é substituído por Tyr na SEQ ID N° 4 e/ou em que um aminoácido Gly é adicionado após aminoácido Gly na posição 51 na SEQ ID N°: 4.

[0062] DNAs particularmente úteis que codificam peptídeos sinal de acordo com a invenção, para se combinarem com um DNA de crylC da invenção, incluem os DNAs que codificam qualquer uma das seguintes proteínas, ou combinações das mesmas: os peptídeos de trânsito de cloroplasto descritos por Van Den Broeck et al. (1985), ou o peptídeo de trânsito de cloroplasto otimizado da Patente U. S. 5.510.471 e Patente U. S. 5.635.618 causando transporte da proteína aos cloroplastos, um peptídeo de sinal secretório ou um peptídeo direcionando a proteína a outro plastídeos, mitocôndria, RE ou outra organela. Um DNA preferencial que codifica um peptídeo de trânsito da invenção é um DNA compreendendo a sequência da SEQ ID N° 3 da posição do nucleotídeo 7 à posição do nucleotídeo 372, particularmente a sequência da SEQ ID N° 3, ou uma sequência eq uivalente com pelo menos identidade de sequência de 95%, particularmente pelo menos 97 ou 99%, à sequência da SEQ ID N° 3 da posição do nucleotídeo 7 à posição do nucleotídeo 372.

[0063] Além disso, para qualquer inseto de praga-alvo, as propriedades de ligação das proteínas Cry da invenção podem ser avaliadas, usando métodos conhecidos na técnica (por exemplo, Van Rie et al.,

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1990, EP 408403), para determinar se as proteínas Cry1 da invenção se ligam a sítios em um mesentério de inseto-alvo que não são reconhecidos (ou competem por) por outras proteínas não Cry ou Cry. Outras proteínas cristalinas de Bt de ligação a sítios de ligação diferentes em insetos suscetíveis relevantes, ou outras toxinas derivadas de linhagens de Bt ou outras fontes (tais como toxinas VIP (por exemplo, as toxinas VIP3A listadas em http://www.lifesci.sussex.ac.uk/home/Neil Crickmore/Bt/vip.html, ou toxina VIP3Aa de Estruch et al. 1996) ou inibidores de proteinase de inseto (intestino)) com um modo diferente de ação pode ser muito valioso para expressar também em uma planta além de qualquer um dos genes crylC da invenção, para prevenir ou retardar o desenvolvimento de resistência a inseto a uma planta que expressa toxinas inseticidas, e aumentar o espectro de insetos controlados por uma planta da invenção. Em um método, uma proteína tendo um modo diferente de ação da proteína Cry1C da invenção pode ser encontrada pela classificação de proteínas para seu efeito inseticida sobre insetos resistentes a Cry1C, ou alternativamente quando o mecanismo ou via bioquímica pela qual tal proteína atua é encontrado ser diferente daquele usado pela proteína Cry1C, tal que uma mutação no inseto que causa resistência a Cry1C está provavelmente não afetando a toxicidade de outra proteína. Por causa das características dos novos genes crylC, eles são extremamente úteis para transformar plantas, por exemplo plantas de monocotiledônea, tais como milho, cana-de-açúcar, arroz ou trigo e plantas dicotiledôneas, tais como algodão, soja, berinjela e plantas de espécies Brassica, para proteger estas plantas do dano por inseto.

[0064] Especialmente com objetivos de manejo da resistência a inseto para uma praga de inseto específica, é preferencial combinar um gene crylC desta invenção com outro gene que codifica uma proPetição 870170072777, de 27/09/2017, pág. 42/162

40/68 teína-controle diferente de inseto, particularmente uma proteína cristalina de Bt. Uma proteína de controle de inseto preferencial para combinar com as proteínas Cry1C desta invenção, particularmente para expressão simultânea em plantas, preferencialmente plantas de arroz, é uma proteína Cry1Ab. Uma proteína Cry1Ab, como usada neste pedido, é qualquer proteína inseticida Cry1Ab, particularmente uma proteína inseticida compreendendo uma sequência de aminoácido idêntica a ou pelo menos 95%, 97%, 98%, ou 99% idêntica à sequência da SEQ ID N° 12 da posição do aminoácido 30 à posição do aminoácido 617, ou idêntica a ou pelo menos 95%, 97%, 98%, ou 99% idêntica à sequência da SEQ ID N° 12 da posição do aminoácido 3 à posição do aminoácido 617, ou uma proteína inseticida compreendendo uma sequência de aminoácido idêntica a ou pelo menos 95%, 97%, 98%, ou 99% idêntica à sequência da SEQ ID N° 12 da posição do aminoácido 3 à posição do aminoácido 617 que é fusionada em seu Nterminal à proteína da SEQ ID N°: 4. Em uma modalid ade, tal coexpressão é obtida pela transformação de uma planta com um plasmídeo compreendendo um gene quimérico crylC e crylAb, ou pela cotransformação de uma planta com um plasmídeo compreendendo um gene quimérico crylC e um plasmídeo compreendendo um gene quimérico crylAb, ou por transformação de uma planta já contendo um gene crylC quimérico da invenção, com um gene quimérico crylAb. Um gene quimérico crylAb, como usado neste pedido, é um gene quimérico que codifica uma proteína Cry1Ab como definida acima, por exemplo, um gene quimérico compreendendo as seguintes sequências operacionalmente ligadas: a) uma região de codificação que codifica uma proteína inseticida Cry1Ab, compreendendo uma sequência de DNA com pelo menos identidade de sequência de 95%, 97%, 98%, ou 99% à sequência de DNA da SEQ ID N° 11 da posição do nucleotídeo 88 à posição do nucleotídeo 1851, ou compreendendo uma sequência

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41/68 de DNA com pelo menos identidade de sequência de 95%, 97%, 98%, ou 99% à sequência de DNA da SEQ ID N° 11 da posição do nucleotídeo 7 à posição do nucleotídeo 1851, ou compreendendo a sequência de DNA da SEQ ID N° 11 da posição do nucleotíd eo 88 à posição do nucleotídeo 1851, ou compreendendo a sequência de DNA da SEQ ID N° 11 da posição do nucleotídeo 7 à posição do nucleotídeo 1851, ou compreendendo qualquer uma de tais sequências de DNA, tais como a sequência da SEQ ID N° 11 da posição do nucleotídeo 7 à posição do nucleotídeo 1851, ligado em sua extremidade 5' à sequência de codificação de peptídeo de trânsito da SEQ ID N° 3, e b) uma (segunda) região promotora capaz de dirigir expressão nas células vegetais. A proteína Cry1Ab codificada por tal gene quimérico compreende uma sequência de aminoácido pelo menos 99% idêntica à sequência de aminoácido da SEQ ID N° 12 da posição do aminoácido 30 à posição do aminoácido 617, ou compreende uma sequência de aminoácido pelo menos 99% idêntica à sequência de aminoácido da SEQ ID N° 12 da posição do aminoácido 3 à posição do aminoácido 617, ou compreende uma sequência de aminoácido pelo menos 99% idêntica à sequência de aminoácido da SEQ ID N° 12 , ou compreende a sequência de aminoácido da SEQ ID N° 12 da posição do aminoácido 30 à posição do aminoácido 617, ou compreende a sequência de aminoácido da SEQ ID N° 12 da posição do aminoácido 3 à posição do aminoácido 617, ou compreende a sequência de aminoácido da SEQ ID N: 12.

[0065] Plantas transformadas compreendendo ambos genes quiméricos crylC e crylAb também podem ser obtidas pelo cruzamento de plantas compreendendo qualquer um dos genes crylAb quiméricos como definido acima, com plantas compreendendo qualquer um dos genes quiméricos crylC quiméricos da invenção. Em uma modalidade, as plantas, células, sementes ou grãos da invenção, particularmente

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42/68 as plantas de arroz, células, sementes ou grãos da invenção, compreendem o gene crylC quimérico da invenção e um gene crylAb quimérico, como definido acima no mesmo locus genético, para que estes genes não segreguem na progênie de células vegetais, plantas, sementes ou grãos.

[0066] Métodos gerais para obtenção da expressão de genes quiméricos de Bt diferentes na mesma planta em um esforço para minimizar ou prevenir o desenvolvimento de resistência em plantas transgênicas resistentes a inseto são descritos na patente Europeia 0 408 403. Para objetivos de seleção mas também para aumentar as opções de controle de erva daninha, as plantas transgênicas da invenção também podem ser transformadas com um DNA que codifica uma proteína que inativa um herbicida de largo espectro ou codifica uma proteína que é uma variante da proteína alvo do herbicida mas variante proteica a qual é insensível a tal herbicida, por exemplo, herbicidas baseados em glufosinato ou glifosato. No caso de tais genes de resistência a herbicida são posteriormente removidos ou cruzados de plantas crylC da invenção, os genes de resistência a herbicida são preferencialmente localizados em outro locus do que os genes crylC ou crylC e cry1Ab da invenção. Um gene de resistência a herbicida preferencial de acordo com esta invenção é uma sequência de codificação de bar (Thompson et al., 1987) operacionalmente ligado a um promotor 35S (Odell et al., 1985) e uma região 3' nãotraduzida do gene de nopalina sintase de Agrobacterium (Depicker et al. 1982) tal que as plantas transformadas com tal gene bar quimérico sejam resistentes a herbicidas glufosinato.

[0067] O DNA de crylC eficaz inseticidamente desta invenção, preferencialmente o gene quimérico crylC desta invenção, pode ser estavelmente inserido em uma maneira convencional no genoma nuclear de uma célula vegetal, e a célula vegetal transformada dessa

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43/68 forma pode ser usada em uma maneira convencional para produzir plantas e sementes, compreendendo o gene crylC da invenção, que são resistentes ao inseto. Neste sentido, um plasmídeo Ti desarmado, contendo a parte genética crylC eficaz inseticidamente, em Agrobacterium, por exemplo, Agrobacterium tumefaciens, pode ser usado para transformar a célula vegetal, e após isso, uma planta transformada pode ser regenerada da célula vegetal transformada usando qualquer um dos procedimentos conhecidos, por exemplo, procedimentos descritos em EP 0 116 718, EP 0 270 822, publicação de PCT WO 84/02913 e Pedido de Patente europeia publicado (EP) 0 242 246 e em De Block et al. (1989). Vetores plasmidiais Ti preferenciais cada um contendo parte do gene Cry eficaz inseticidamente entre as sequências de borda, ou pelo menos localizado à esquerda da sequência de borda à direita, do T-DNA do plasmídeo Ti. Naturalmente, outros tipos de vetores podem ser usados para transformar a célula vegetal, usando procedimentos, tais como transferência gênica direta (como descrito, por exemplo, em EP 0 233 247), transformação mediada por pólen (como descrito, por exemplo, em EP 0 270 356, publicação de PCT WO 85/01856, e Patente U. S. 4.684.611), transformação mediada por vírus de RNA vegetal (como descrito, por exemplo, em EP 0 067 553 e Patente U. S. 4.407.956), transformação mediada por lipossoma (como descrito, por exemplo, na Patente U. S. 4.536.475), e outros métodos, tais como os métodos para transformar certas linhagens de milho (por exemplo, Patente U. S. 6.140.553; Fromm et al., 1990; GordonKamm et al., 1990) e o método para transformar monocotiledôneas em geral (publicação de PCT WO 92/09696). Para transformação de arroz, um método de transformação preferencial é descrito em WO 92/09696. Para transformação de algodão, especialmente preferencial é o método descrito na publicação de patente PCT WO 00/71733. Para a transformação de soja, a referência é feita a métodos conhecidos

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44/68 na técnica, por exemplo, Hinchee et al. (1988) e Christou et al. (1990), ou o método de WO 00/42207. A planta transformada resultante pode ser usada em um esquema de melhoramento vegetal convencional para produzir mais plantas transformadas com as mesmas características ou introduzir o gene crylC eficaz inseticidamente em outras variedades das mesmas espécies de planta ou relacionadas. Sementes, que são obtidas das plantas transformadas, contêm a parte do gene Cry eficaz inseticidamente como um inserto genômico estável.

[0068] O DNA de crylC eficaz inseticidamente desta invenção, preferencialmente um DNA compreendendo a sequência da SEQ ID N° 1 ou 5, é inserido em um genoma de célula vegetal para que o gene inserido seja a jusante (isto é, 3') de, e sob o controle de, um promotor que pode dirigir a expressão do gene em uma célula vegetal (neste pedido denominado um promotor expressável por planta). Isto é preferencialmente realizado pela inserção do gene quimérico crylC compreendendo um promotor expressável por planta no genoma de célula vegetal, particularmente no genoma nuclear ou plastídeo (por exemplo, cloroplasto). Promotores expressáveis por planta preferenciais incluem: os promotores 35S constitutivos fortes (promotores 35S) do vírus de mosaico de couve-flor (CaMV) de isolados de CM 1841 (Gardner et al., 1981), CabbB-S (Franck et al., 1980) e CabbB-JI (Hull and Howell, 1987); o promotor 35S descrito por Odell et al. (1985), promotores da família ubiquitina (por exemplo, promotor de ubiquitina de milho de Christensen et al., 1992, ver também Cornejo et al., 1993), o promotor gos2 (de Pater et al., 1992), o promotor emu (Last et al., 1990), promotores actina de Arabidopsis, tais como o promotor descrito por An et al. (1996), promotores actina de arroz, tais como o promotor descrito por Zhang et al. (1991) ou McElroy et al. (1990); promotores do vírus de mosaico do veio de Mandioca (WO 97/48819, VerdaPetição 870170072777, de 27/09/2017, pág. 47/162

45/68 guer et al. (1998)), a série pPLEX de promotores do Vírus do Nanismo do Trevo Subterrâneo (WO 96/06932), particularmente a região promotora duplicada derivada do segmento de genoma de vírus do nanismo do trevo subterrâneo 4 ou 7 (referidos como promotores S7S7 ou S4S4 neste pedido) descrito por Boevink et al. (1995) ou Schunmann et al. (2003), um promotor da álcool desidrogenase, por exemplo pAdh1S (números de acesso de GenBank X04049, X00581), e promotor TR1' e promotor TR2' (promotor TR1' e promotor TR2', respectivamente) que dirigem a expressão de genes 1' e 2', respectivamente, do T-DNA (Velten et al., 1984). Alternativamente, um promotor pode ser utilizado o qual não é constitutivo mas um é tanto específico para um ou mais tecidos ou órgãos vegetais (por exemplo, folhas e/ou raízes) pelo qual a parte do gene Cry inserido é expressa somente em células do tecido(s) específico ou órgão(s). Por exemplo, a parte do gene Cry eficaz inseticidamente pode ser seletivamente expressa nas folhas de uma planta (por exemplo, milho, algodão) colocando a parte do gene eficaz inseticidamente sob o controle de um promotor induzível por luz, tal como o promotor do gene da pequena subunidade de ribulose-1,5-bisfosfato carboxilase da própria planta ou de outra planta, tal como ervilha como revelado na Patente U. S. 5.254.799. Outra alternativa é usar um promotor cuja expressão é induzível, preferencialmente por injúria, tal como alimentação de inseto, por exemplo, o promotor MPI descrito por Cordero et al. (1994, acesso Genbank X78988), ou o promotor de Agrobacterium TR2' ou manopina sintase (Velten et al., 1984) ou um promotor induzível por fatores químicos. Em uma modalidade da invenção, se isto for desejado, a expressão de tais promotores induzíveis por injúria pode ser aumentada colocando uma região promotora CaMV 35S ou outro promotor ou pelo menos um elemento potencializador de promotor na proximidade de, e preferencialmente na mesma direção (5' a 3') como, o promotor induzível

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46/68 por injúria, para que os níveis de expressão basais sejam aumentados mas a indução sob injúria seja conservada.

[0069] Em uma modalidade da invenção, promotores preferenciais usados no gene quimérico crylC da invenção ou no gene quimérico crylAb da invenção incluem promotores compreendendo a sequência de DNA de qualquer uma das SEQ ID N°^s: 9 (ou compreendendo a sequência da posição do nucleotídeo 1 a 1997 na SEQ ID N° 9), 10, 13, 14, ou uma sequência equivalente que se diferencia em menos de 1 a 5%, particularmente menos de 2%, dos seus nucleotídeos com qualquer uma de tal sequência. Tais promotores podem incluir uma sequência líder não-traduzida, e também podem compreender um íntron. Em uma modalidade da invenção, o gene quimérico crylC compreende a sequência líder do gene ubiquitina de Zea mays entre o promotor e a região de codificação, por exemplo, como descrito por Christensen et al. (1992), e o gene quimérico crylAb compreende o íntron e sequência líder do gene de Actina 1 de arroz (McElroy et al., 1990) entre a região promotora e de codificação.

[0070] O DNA de crylC é preferencialmente inserido no genoma vegetal para que a sequência de codificação inserida esteja a montante (isto é, 5') de sinais de regulação de transcrição de extremidade 3' adequados (isto é, sinais de formação de transcrito e de poliadenilação). Isto pode ser realizado pela inserção do gene quimérico crylC no genoma da célula vegetal. Sinais de poliadenilação e de formação de transcrito preferenciais incluem aqueles da região 3' não-traduzida do gene da enzima NADP-málico de Flaveria bidentis (Marshall et al., 1996), gene de nopalina sintase (Depicker et al., 1982), o gene de octopina sintase (Gielen et al., 1984) e o gene de T-DNA 7 (Velten and Schell, 1985), que atuam como sequências de DNA 3' não-traduzidas em células vegetais transformadas. Em uma modalidade desta invenção, o gene cry1C da invenção é transformado em plantas selecionaPetição 870170072777, de 27/09/2017, pág. 49/162

47/68 das a partir do grupo composto de: milho, algodão, arroz, soja, canade-açúcar, trigo, canola, soja, verduras, espécies de planta Cruciferae, espécies de planta Brassica, tais como couve-flor, repolho, repolho chinês, nabo, mostarda, canola, couve galega, brócolis. Em uma modalidade desta invenção, as seguintes plantas de espécies Brassica são protegidas de insetos pelos genes crylC desta invenção: B. carinata, B. juncea, B. napus, B. nigra, B. oleracea e B. rapa.

[0071] A invenção inclui plantas, células ou sementes, particularmente plantas, células ou sementes de arroz, transformadas com um gene crylC da invenção, bem como plantas, células ou sementes, particularmente plantas, células ou sementes de arroz, contendo os genes da invenção obtidos após cruzamento ou melhoramento com tais plantas, células ou sementes transformadas. Tal cruzamento ou melhoramento podem ser feitos usando técnicas de melhoramento tradicionais conhecidas na técnica, mas também podem incluir trabalho conhecido in vitro, tal como produção de haploide dobrado, resgate de embrião, fusão de protoplasto e similares. Como tal, a invenção também se relaciona a plantas, células ou sementes de arroz japonica, e a progênie do mesmo que contém o gene cry1C da invenção, obtido de cruzamentos com uma planta, célula ou semente transformadas com cry1C de arroz indica, e a qualquer uso de tais plantas, células ou sementes. Incluído neste pedido estão cruzamentos de plantas de arroz compreendendo algum dos genes quiméricos cry1C e/ou cry1Ab da invenção com outras plantas compreendendo eventos de transformação de arroz conferindo controle de inseto ou outro traço benéfico (por exemplo, tolerância a herbicida, aumento de rendimento, tolerância aumentada, etc.), tal como cruzamentos com o evento de arroz Bt TT51 que expressa uma proteína de fusão Cry1Ab/Cry1Ac (pedido de patente chinesa 200510062980, número de publicação 1840655), ou cruzamentos com eventos de arroz expressando uma proteína Cry1Ca5 (tais

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48/68 como evento T1C-19, ver Tang et al. 2006), uma proteína CrylB (ver, por exemplo, Breitler et al. (2001), ou uma proteína Cry2A (ver, por exemplo, Maqbool et al. (1998)), ou expressão de uma proteína de fusão Cry1Ab-Cry1B (Ho et al., 2006), bem como plantas de arroz compreendendo os genes de controle de inseto empilhados ou uso dos mesmos para controlar insetos, particularmente brocas do colmo de arroz ou dobradores de folha de arroz.

[0072] A transformação de células vegetais também pode ser usada para produzir as proteínas de crylC da invenção em culturas de célula vegetal, por exemplo, para produzir uma proteína Cry1C que então pode ser aplicada para culturas após formulação própria. Quando referência a uma célula vegetal transgênica é feita neste pedido, esta refere-se a uma célula vegetal (ou também um protoplasto vegetal) como tal no isolamento ou na cultura de tecido, ou a uma célula vegetal (ou protoplasto) contido em uma planta ou em um órgão ou tecido diferenciado, e ambas as possibilidades estão especificamente incluídas neste pedido. Por isso, uma referência a uma célula vegetal no relatório descritivo ou reivindicações não pretende referir-se somente a células isoladas em cultura, mas refere-se a qualquer célula vegetal, onde quer que possa ser localizada ou em qualquer tipo de tecido ou órgão vegetal possa estar presente. Célula vegetal, como usada neste pedido, também se refere a protoplastos ou pólen.

[0073] A sequência de codificação dos genes crylC da invenção também pode ser usada para transformar micro-organismos, tais como uma linhagem de B. thuringiensis que tem atividade inseticida contra Lepidóptera ou Coleóptera. Por meio disso, um micro-organismo transformado, tal como uma linhagem de Bt pode ser produzido o qual é útil para combater um largo espectro de pragas de inseto lepidóptero e coleóptero ou para combater pragas de inseto lepidóptero adicionais. Transformação do micro-organismo, tal como bactérias do gênero

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Pseudomonas, Agrobacterium, Bacillus ou Escherichia, com a sequência de codificação dos genes cry1C desta invenção, incorporada em um veículo de clonagem adequado, pode ser realizada em uma maneira convencional, preferencialmente usando técnicas de eletroporação convencionais como descritas em Mahillon et al. (1989) e em publicação de Patente PCT WO 90/06999.

[0074] Linhagens de espécies Bacillus transformadas contendo uma sequência de codificação de cry1C podem ser fermentadas por métodos convencionais (Dulmage, 1981; Bernhard and Utz, 1993) para fornecer altos rendimentos de células. Sob condições apropriadas que são bem entendidas (Dulmage, 1981), estas linhagens cada qual esporulam para produzir proteínas cristalinas contendo a proteína Cry1C.

[0075] Uma composição inseticida, particularmente antilepidóptera, desta invenção pode ser formulada de uma maneira convencional usando os micro-organismos expressando a toxina Cry1C como um ingrediente ativo, em conjunto com veículos adequados, diluentes, emulsificadores e/ou dispersantes (por exemplo, como descrito por Bernhard and Utz, 1993). Esta composição inseticida pode ser formulada como um pó umidificável, pílulas, grânulos ou pó ou como uma formulação líquida com solventes aquosos ou não-aquosos como uma espuma, gel, suspensão, concentrado, etc. Um método para controle de insetos, particularmente Lepidóptera, preferencialmente insetos Lepidóptero de arroz, tais como brocas de colmo e dobradores de folha, de acordo com esta invenção pode compreender a aplicação (por exemplo, pulverização), em um local (área) a ser protegido, uma quantidade de inseticida da proteína Cry1C ou células hospedeiras transformadas com o gene cry1C desta invenção. O local a ser protegido pode incluir, por exemplo, o habitat de pragas de inseto ou vegetação crescente, tal como um campo de arroz, ou área onde a vegetaPetição 870170072777, de 27/09/2017, pág. 52/162

50/68 ção deve ser cultivada.

[0076] Em uma modalidade desta invenção, insetos contra os quais os genes crylC ou as proteínas Cry1C da invenção podem ser usados incluem insetos selecionados a partir do grupo composto de: Plutella xylostella, Spodoptera exigua, Spodoptera littoralis, Spodoptera frugiperda, Trichoplusia ni, Heliothis virescens, Mamestra brassicae, Pieris brassicae, Manduca sexta, Choristoneura fumiferana, Choristoneura occidentalis, Choristoneura rosaceana, Pandemis pyrusana, Platynota stultana, Lymantria dispar, Orgyia leucostigma, Malacosoma disstria, Lambina fiscellaria, Chilo suppressalis, Chilo plejadellus, Chilo polychrysa, Chilo partellus, Scirpophaga incertulas, Scirpophaga innotata, Sesamia inferens, Cnaphalocrocis medinalis, Marasmia patnalis, Argyrotaenia citrana, Artogeia rapa, Chrysomela scripta, Ostrinia nubilalis, Diatraea saccharalis, Pseudoplusia includens, Thaumetopoea pityocampa, Hereitogramma licarisalis, Naranga aenescens, Mycalesis gotama, Marasmia exigua, Marasmia ruralis, Nymphula depunctalis, Spodoptera litura, Rupela albinella, Spodoptera frugiperda, Mythimna unipuncta, Chilo zacconius e Parnara guttata.

[0077] Em uma modalidade, pragas de inseto-alvo preferenciais são pragas de inseto Lepidóptero de arroz, tais como brocas do colmo de arroz ou dobradores de folha de arroz, ou pragas de inseto Lepidóptero de arroz, tal como broca-do-colmo listrado Chilo suppressalis, broca-do-colmo amarelo Scirpophaga incertulas (também denominado Tryporyza incertulas), broca-do-colmo branco Scirpophaga innotata (também denominado Tryporyza innotata), broca-do-colmo de cabeça escura Chilo polychrysa, broca-do-colmo rosa Sesamia inferens, a broca de cana-de-açúcar Diatraea saccharalis, a broca de talo de arroz Chilo plejadellus, o dobrador de folha de arroz Marasmia patnalis, o dobrador de folha de arroz Cnaphalocrocis medinalis, e insetos, tais como Hereitogramma licarisalis, Naranga aenescens, Mycalesis gotaPetição 870170072777, de 27/09/2017, pág. 53/162

51/68 ma, Marasmia exigua, Marasmia ruralis, Nymphula depunctalis, Spodoptera litura, Rupela albinella, Spodoptera frugiperda, Mythimna unipuncta, Chilo zacconius e Parnara guttata. As proteínas codificadas pelo genes cry1C ou cry1C e cry1Ab desta invenção são particularmente úteis para controlar estes insetos, por exemplo, pela expressão dos genes cry1C e/ou cry1Ab da invenção em células de uma planta, particularmente em células de planta de arroz.

[0078] Tais insetos podem ser controlados pela semeadura, plantação, ou cultivo de plantas compreendendo qualquer um dos genes quiméricos cry1C da invenção em um campo, ou assegurando a presença de uma proteína Cry1C da invenção ou em plantas que podem ser infestadas por tais insetos (por exemplo, pela semeadura ou plantação de uma planta de arroz transformada com um gene quimérico cry1C da invenção, tal como os genes quiméricos cry1C1 ou cry1C2). A invenção também se relaciona ao uso dos genes quiméricos cry1C desta invenção, pelo menos os genes quiméricos cry1C1 ou cry1C2, em plantas, células ou sementes, particularmente plantas, células ou sementes de arroz, para protegê-las contra pragas de inseto Lepidóptero, preferencialmente em combinação com outro gene Cry, tal como um gene quimérico cry1Ab, preferencialmente os genes quiméricos cry1Ab1 ou cry1Ab2.

[0079] Na presente invenção, também uma sequência de codificação modificada que codifica um peptídeo de trânsito de cloroplasto otimizado é fornecida, bem como o uso da mesma para direcionar uma proteína ao cloroplasto. Em uma modalidade da invenção, a sequência de codificação do peptídeo de trânsito otimizado compreende uma sequência nucleotídica idêntica ou com pelo menos identidade de sequência de 95%, 97%, 98%, ou 99% à sequência nucleotídica da SEQ ID N° 3 da posição do nucleotídeo 7 à posição do n ucleotídeo 372, particularmente à sequência da SEQ ID N° 3, ou um DNA que codifica

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52/68 uma proteína compreendendo uma sequência de aminoácido idêntica ou com pelo menos identidade de sequência de 95%, 97%, 98%, ou 99% à sequência da SEQ ID N° 4. Também células vegetais, plantas ou sementes, particularmente células vegetais, plantas ou sementes de arroz, compreendendo a sequência de codificação de peptídeo de trânsito modificada da invenção, bem como o uso desta sequência de codificação de peptídeo de trânsito para direcionar qualquer proteína ao cloroplasto, particularmente ao cloroplasto de plantas de arroz, estão incluídas nesta invenção. Em uma modalidade da invenção, a sequência de codificação do peptídeo de trânsito otimizado compreendendo a sequência nucleotídica da SEQ ID N° 3 da posição do nucleotídeo 7 à posição do nucleotídeo 372, particularmente a sequência da SEQ ID N°: 3, é operacionalmente ligada ao DNA que codifica uma proteína Cry1C da invenção, tal como os genes cry1C1 ou cry1C2, e/ou é operacionalmente ligada à sequência de codificação do gene crylAb, tal como as sequências de codificação de crylAbl ou cry1Ab2, para assegurar direcionamento ao cloroplasto nas células vegetais, plantas ou sementes da invenção, particularmente células vegetais, plantas ou sementes de arroz.

[0080] Estas e/ou outras modalidades desta invenção são refletidas nas passagens das reivindicações, que são parte do relatório descritivo da invenção.

[0081] Os seguintes Exemplos ilustram a invenção, e não são fornecidos para limitar a invenção ou a proteção buscada. A menos que de outra maneira afirmado, todas as técnicas de DNA recombinante são realizadas de acordo com protocolos-padrão como descrito em Sambrook et al. (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Second Edition, Cold Spring Harbour Laboratory Press, NY e nos Volumes 1 e 2 de Ausubel et al. (1994) Current Protocols in Molecular Biology, Current Protocols, USA. Materiais-padrão e métodos para trabalho moPetição 870170072777, de 27/09/2017, pág. 55/162

53/68 lecular vegetal são descritos em Plant Molecular Biology Labfax (1993) por R.D.D. Croy publicado por BIOS Scientific Publications Ltd (Reino

Unido) e Blackwell Scientific Publications, Reino Unido.

[0082] A listagem de sequência delimitada referida nos Exemplos, nas Reivindicações e no Relatório Descritivo é como se segue: Listagem de Sequência:

SEQ ID N° 1: sequência de DNA de cry1C1, otimizada para expressão em plantas

SEQ ID N° 2: sequência de aminoácido da proteína Cry1C1 codificada pela SEQ ID N°: 1

SEQ ID N°: 3: sequência de codificação que codifica um peptídeo de trânsito de cloroplasto

SEQ ID N° 4: sequência de aminoácido do peptídeo de trânsito de cloroplasto codificado pela sequência da SEQ ID N°: 3

SEQ ID N° 5: sequência de DNA de cry1C1 otimizada operacionalmente ligada à sequência da SEQ ID N° 3, codificando a proteína Cry1C2

SEQ ID N°: 6: sequência de aminoácido da proteína Cry1C2 codificada por SEQ ID N°: 5

SEQ ID N° 7: iniciador de cry1C P1C203

SEQ ID N° 8: iniciador de cry1C P1C204

SEQ ID N°: 9: promotor ubiquitina de Zea mays, incl uindo a sequência líder 5' não-traduzida e intrônica de ubiquitina de Zea mays (pUbi)

SEQ ID N° 10: promotor (pMPI(2K)) de inibidor de p rotease de Zea mays (mpi(2K))

SEQ ID N° 11: sequência de codificação de cry1Ab otimizada

SEQ ID N° 12: sequência de aminoácido da proteína

Cry1Ab codificada pela sequência da SEQ ID N° 11

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SEQ ID N° 13: promotor Actina 1 de Oryza sativa compreendendo sequência intrônica (pAct1)

SEQ ID N° 14: promotor (pMPI (C1)) de inibidor de protease de Zea mays (mpi (C1))

EXEMPLOS

1. Construção de genes quiméricos e vetores de transformação.

[0083] Vários genes quiméricos crylC para transformação de plantas, particularmente plantas de arroz, foram desenhados. O uso de uma diversidade de genes e elementos reguladores permite a seleção de plantas com objetivos ou usos diferentes. Bioensaios com a proteína Cry1C da SEQ ID N° 2 (Cry1Ca4) mostram que esta proteína é tóxica aos insetos Lepidópteros Scirpophaga incertulas, Sesamia inferens, Spodoptera litura, Spodoptera exigua, Marasmia patnalis e Cnaphalocrocis medinalis, e por isso é uma proteína útil para expressar em plantas transgênicas.

[0084] O DNA de cry1C1 que foi desenhado para expressão ótima em células vegetais, particularmente arroz, é representado na SEQ ID N° 1. Este DNA de cry1C1 tem o íntron I de Adh1 de milho (Dennis et al., 1984) inserido na sequência de codificação de cry1C. Este DNA codifica a proteína inseticida Cry1C1 da invenção (SEQ ID N° 2). Para a transformação de plantas, vários genes quiméricos foram construídos (os genes quiméricos cry1C1) compreendendo os seguintes elementos operacionalmente ligados (5' a 3'): um promotor compreendendo a região promotora da SEQ ID N° 9 (pUbi) ou 10 (pMPI(2K)), o DNA de cry1C1 da SEQ ID N° 1, e a sequência incluindo a região 3' não-traduzida do gene de octopina sintase de Agrobacterium (De Greve et al., 1983).

[0085] Para assegurar o direcionamento da proteína Cry1C ao cloroplasto de célula vegetal, uma variante do gene quimérico cry1C1 foi também construída a qual compreende uma sequência modificada que

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55/68 codifica um peptídeo de trânsito otimizado (SEQ ID N° 4) essencialmente como descrito por Lebrun et al. (1996), operacionalmente ligado ao DNA que codifica a proteína Cry1C1 para que uma proteína de fusão de peptídeo de trânsito (a proteína Cry1C2) seja expressa em células vegetais. Para a transformação de plantas, vários genes quiméricos foram construídos (os genes quiméricos cry1C2) compreendendo os seguintes elementos operacionalmente ligados (5' a 3'): um promotor compreendendo a região promotora da SEQ ID N° 9 ou 10, o DNA de cry1C2 da SEQ ID N° 5, e a sequência incluindo a região 3' nãotraduzida do gene de octopina sintase de Agrobacterium (De Greve et al., 1983).

[0086] Para obter plantas que expressam duas proteínas Cry diferente, genes crylAb quiméricos também foram desenhados e montados para alcançar o grupo de genes quiméricos crylAb a ser usado em plantas, particularmente plantas de arroz. Aqui também diferentes genes e elementos regulatórios foram usados para permitir a seleção de plantas com objetivos ou usos diferentes.

[0087] O DNA de cry1Ab1 que foi desenhado para expressão ótima em células vegetais é representado na SEQ ID N° 11. Este DNA codifica a proteína inseticida Cry1Ab1 (SEQ ID N° 12). Para a transformação de plantas, vários genes quiméricos são construídos (os genes quiméricos cry1Ab1) compreendendo os seguintes elementos operacionalmente ligados (5' a 3'): um promotor compreendendo a região promotora da SEQ ID N° 9, 10, 13 ou 14, o DNA de cry1Ab1 da SEQ ID N° 11, e a sequência incluindo região 3' de pol iadenilação e terminação de transcrito do gene de octopina sintase de Agrobacterium (De Greve et al., 1983).

[0088] Para assegurar o direcionamento da proteína Cry1Ab ao cloroplasto da célula vegetal, uma variante do gene quimérico cry1Ab1 é construída a qual compreende uma sequência modificada que codifiPetição 870170072777, de 27/09/2017, pág. 58/162

56/68 ca um peptídeo de trânsito otimizado (SEQ ID N° 4) essencialmente como descrito por Lebrun et al. (1996), operacionalmente ligado à região de codificação de cry1Ab1 para que uma proteína de fusão de peptídeo de trânsito (a proteína Cry1Ab2) seja expressa em células vegetais. Para transformação de plantas, vários genes quiméricos são construídos (os genes quiméricos cry1Ab2) compreendendo os seguintes elementos operacionalmente ligados (5' a 3'): um promotor compreendendo a região promotora da SEQ ID N° 9, 10, 13 ou 14, o DNA de peptídeo de trânsito da SEQ ID N° 3 ligado a montante (5') do DNA de cry1Ab1 da SEQ ID N° 5 da posição de nucleotídeo 7 à posição de nucleotídeo 1854, e a sequência incluindo a região 3' nãotraduzida do gene de octopina sintase de Agrobacterium (De Greve et al., 1983).

[0089] Em alguns genes quiméricos, também uma região promotora CaMV 35S é usada para controlar a transcrição das sequências de codificação de crylC (1 ou 2) ou crylAb (1 ou 2) operacionalmente ligadas descritas acima.

[0090] Os vetores de transformação (vetores de clonagem intermediária) contendo os genes da invenção foram derivados de pGSC1700 (Cornelissen and Vandewiele, 1989). O esqueleto do vetor contém os seguintes elementos genéticos:

a) o núcleo de plasmídeo compreendendo a origem de replicação do plasmídeo pBR322 (Bolívar et al., 1977) para replicação em Escherichia coli e um fragmento de restrição compreendendo a origem de replicação do plasmídeo pVS1 de Pseudomonas (Itoh et al., 1984) para replicação em Agrobacterium tumefaciens;

b) um gene marcador selecionável conferindo resistência à estreptomicina e espectinomicina (aadA) para propagação e seleção do plasmídeo em Escherichia coli e Agrobacterium tumefaciens.

c) uma região de DNA composta de um fragmento da sePetição 870170072777, de 27/09/2017, pág. 59/162

57/68 quência de codificação de neomicina fosfotransferase do gene nptl a partir do transposon Tn903 (Oka et al., 1981).

[0091] A região de T-DNA de cada vetor de transformação também pode conter ainda - além de um dos genes Cry acima - um gene bar quimérico que serve como gene marcador selecionável. Expressão do gene bar permite a produção de uma enzima, fosfinotricina-acetil transferase, que metaboliza o herbicida glufosinato-amônio, dessa forma tornando-o não-herbicida na planta. O gene bar quimérico compreende a região promotora 35S3 do transcrito do Vírus de Mosaico de Couve-flor 35S (Odell et al., 1985), a sequência de codificação do gene de fosfinotricina acetiltransferase de Streptomyces hygroscopicus como descrito por Thompson et al. (1987), e uma terminação 3' de transcrito e sequência de poliadenilação da região 3' não-traduzida do gene de nopalina sintase de T-DNA de pTiT37 (Depicker et al., 1982). Em algumas transformações, dois plasmídeos de clonagem intermediários são usados para transformação: um plasmídeo contendo o gene quimérico crylC ou contendo ambos genes quiméricos crylC e crylAb, ou outro plasmídeo contendo o gene bar quimérico; em outras transformações um plasmídeo compreende o gene quimérico crylC e outro plasmídeo compreende o gene quimérico crylAb (um de cada ou ambos tais plasmídeos também podem compreender um gene bar quimérico). Esta abordagem permite obtenção de tipos diferentes de transformantes de arroz com os genes diferentes em loci diferentes ou no mesmo locus no genoma das plantas de arroz, para que em algumas plantas um gene quimérico (por exemplo, o gene bar, ou um dos genes Cry) possa ser removido de outro(s) gene(s) quimérico(s) nas plantas por melhoramento, por exemplo, no caso de que a tolerância a herbicida nas plantas de arroz final a serem vendidas não é necessária, ou no caso em que somente o gene crylC deve ser cruzado em plantas de arroz contendo outro gene Cry (tais como uma pilha do gePetição 870170072777, de 27/09/2017, pág. 60/162

58/68 ne crylC da invenção com o gene crylA no evento de arroz TT51 (Pedido de Patente Chinesa 200510062980, número de publicação

1840655)).

[0092] Todos os plasmídeos construídos são confirmados para serem exatos pela análise de digestão de enzima de restrição e pelo sequenciamento de DNA, antes que sejam usados para transformação vegetal.

2. Transformação e regeneração vegetal.

[0093] A linhagem aceptora Agrobacterium transporta o plasmídeo Ti não-oncogênico (desarmado) da qual a região T foi deletada. Este plasmídeo Ti transporta as funções do gene vir necessárias que são requeridas para a transferência da região de T-DNA (contendo os genes quiméricos crylC e/ou crylAb acima) do vetor de clonagem intermediário ao genoma vegetal. Também tem uma região de homologia que permite a formação cointegrada com o vetor de clonagem intermediário.

[0094] O vetor de clonagem intermediário é construído em Escherichia coli. É transferido para a linhagem aceptora Agrobacterium tumefaciens através de um cruzamento triparental envolvendo uma linhagem de E. coli que transporta um plasmídeo auxiliar de mobilização. A estrutura do T-DNA na linhagem de Agrobacterium resultante é confirmada pela hibridização de Southern blot (Deblaere et al., 1985). [0095] A transferência gênica mediada por Agrobacterium do(s) vetor(es) de clonagem intermediário resulta na transferência do fragmento de DNA entre as repetições de borda de T-DNA ao genoma vegetal.

[0096] Como tecido-alvo para transformação, embrião imaturo ou calo derivado a partir do embrião derivado de cultivares de arroz japonica e indica foram usados os quais foram cortados em pequenas partes, essencialmente usando a técnica descrita na publicação de patenPetição 870170072777, de 27/09/2017, pág. 61/162

59/68 te PCT WO 92/09696. Agrobacterium foi cocultivada com os tecidos de arroz por alguns dias, e então removida por antibióticos adequados. Células de arroz transformadas foram selecionadas pela adição de glufosinato de amônio (com fosfinotricina a 5 mg/L) ao meio de cultura de tecido de arroz. Os calos crescendo em meios com glufosinato de amônio foram transferidos para o meio de regeneração. Quando plântulas com raízes e brotos se desenvolvem, foram transferidos para o solo e colocados na estufa.

[0097] Quando floresceram, plantas de arroz transformadas selecionadas foram autopolinizadas, e sementes compreendendo os genes quiméricos introduzidos foram coletadas quando amadureceram. [0098] Plantas de canola também são transformadas com genes quiméricos crylC e/ou crylAb da invenção usando Agrobacterium tumefaciens. Explantes de hipocotila de Brassica napus são usados em métodos de regeneração e transformação regulares, por exemplo, o método descrito por De Block et al. (1989).

3. Análise de transformantes.

[0099] Uma vez que as plantas de arroz transformadas foram regeneradas, análises por PCR e Southern são usadas para confirmar a integração dos transgenes. Iniciadores específicos para detectar a presença da região de codificação cry1C da invenção foram preparados, foram indicados PS1203 e P1C204 (SEQ ID N° 7 e 8, respectivamente). Plantas de arroz e canola que têm uma cópia única do gene quimérico cry1C integrado em seu genoma são selecionadas por meio de Southern blot. Análise imunológica, tal como ensaios ELISA ou Western blots específicos para Cry1C (ou cry1Ab) são usados para selecionar aquelas plantas transformadas mostrando os níveis ótimos de expressão da proteína Cry1C ou da proteína Cry1C e Cry1Ab. Ensaios de ELISA iniciais em 12 plantas T0 compreendendo eventos de transformação diferentes obtidos após transformação de plantas de

Petição 870170072777, de 27/09/2017, pág. 62/162

60/68 arroz com um plasmídeo compreendendo o gene quimérico PUbicry1C1-3'ocs (além de um gene quimérico nos P35S-bar-3' e um gene quimérico PAct1-cry1Ab1-3'ocs) mostraram valores de proteína Cry1Ca4 variando entre 8,4 e 47,9 microgramas/grama por peso de folha fresca, confirmando boa expressão da proteína Cry1Ca nestas plantas de arroz transformadas.

[00100] Experimentos de RT-PCR no RNA coletado a partir de plantas de arroz mostradas sendo transformadas com os genes cry1C da SEQ ID N°: 1 ou 3, compreendendo um íntron vegetal, mostraram que o splicing ocorre corretamente e que uma proteína Cry1C funcional é produzida. Ensaios de inseto usando larvas neonatas de Spodoptera exigua sob condições de bioensaio de inseto padrão em plantas de arroz transformadas selecionadas contendo o gene cry1C2 da invenção no controle do promotor mpi da SEQ ID N°: 10 (p MPI), mostraram que as plantas transformadas têm alta atividade inseticida. Após 3 dias, em todas as plantas de arroz mostrando expressão significante da proteína Cry1C em ensaios ELISA, mortalidade de 100% foi encontrada para as larvas de S. exigua, com algumas plantas não mostrando nenhum dano de folha visível, enquanto as plantas de controle ou as plantas sem níveis de expressão detectáveis de Cry1C, mostraram o dano de folha severo ou não tinham folhas remanescentes. Estes ensaios de inseto confirmam que o íntron contido na região de codificação do gene quimérico cry1C2 da invenção está corretamente combinado nas plantas de arroz transgênicas. Splicing eficaz em plantas de canola é visto nos claros efeitos inseticidas nos bioensaios de inseto em plantas transformadas com os genes quiméricos cry1C da invenção.

[00101] Também, nas plantas de arroz expressando uma proteína Cry1C ou Cry1Ab sob controle de um promotor MPI, um aumento significante na expressão da proteína Cry1C ou Cry1Ab foi demonstrado

Petição 870170072777, de 27/09/2017, pág. 63/162

61/68 nas plantas que foram injuriadas.

[00102] Testes de estufa iniciais com plantas de arroz transformadas em cópia única dos genes crylC, crylAb, e crylC + crylAb (representando vários eventos de transformação diferentes onde os genes quiméricos estavam sob o controle do pMPI(2K) ou pUbi descritos acima, alguns genes quiméricos contendo o peptídeo de trânsito da SEQ ID N° 4 operacionalmente ligado à região de codificação de Cry (vide Tabela 1 inclusa)) usando infestação de inseto broca-do-colmo rosa (Sesamia inferens) (60 larvas/planta aplicadas em datas diferentes) confirmou a alta atividade inseticida de ambas as plantas de arroz com gene único e gene dual (plantas T1, 10 plantas analisadas por evento de transformação). Enquanto em plantas de arroz de controle não-transformadas houve um alto número de coração morto, o número de brotos por planta foi baixo (aproximadamente 6 por planta), a bainha foliar completa foi danificada, e as maiores larvas ou pupa de inseto foram encontradas nas plantas; nas plantas de arroz transformadas Cry1C, Cry1Ab e em Bt dual (Cry1C + Cry1Ab), nenhum coração morto foi visto, o número de brotos por planta foi mais alto (entre aproximadamente 7 a aproximadamente 13 brotos por planta, acima de mais de 10 brotos por planta), não ou somente alguns buracos de entrada de inseto foram encontrados enquanto a bainha foliar não mostrou nenhum dano maior, e nenhum inseto vivo foi encontrado na maior parte das plantas. A maior parte das plantas de arroz transgênicas mostrou uma ausência de túneis de inseto, enquanto os colmos das plantas de controle foram completamente tunelados. Ensaios de ELISA confirmam que estas plantas têm níveis significantes e claramente detectáveis de proteína Cry1C e Cry1Ab. Um excerto dos dados iniciais de ensaio de inseto após infestação de broca-do-colmo rosa (para eventos de transformação de arroz selecionado) é mostrado na Tabela 1 inclusa abaixo, que mostra os valores médios para os dados obtidos

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62/68 de 10 plantas por evento de transformação.

[00103] Testes de estufa iniciais de broca-do-colmo amarelo (Scirpophaga incertulas) também mostraram a boa resistência de plantas T1 transgênicas (2 plantas por evento foram testadas, os eventos foram transformados com o(s) mesmo(s) gene(s) quimérico(s) como mencionado na coluna 1 da Tabela 1) para este inseto (10 a 15 larvas foram aplicadas por planta). Para este inseto, nenhuma larva viva foi encontrada (aproximadamente um mês depois que os insetos foram aplicados) nas plantas de arroz contendo os genes Cry quiméricos, enquanto nas plantas de controle não-transformadas foram encontradas vários ínstares de larvas e pupas tardias (também após aproximadamente um mês). Nenhuma das plantas de arroz contendo os genes Cry quiméricos da invenção (crylC, crylAb ou crylC + crylAb) mostrou sintomas de coração morto, ou mostrou quaisquer túneis, enquanto as plantas de controle foram pesadamente danificadas (alto nível de coração morto e muitos túneis)

Gene(s) cry quimérico	Cora- ção morto	Bro- tos por planta	Buracos de entrada (1^a bainha foliar)	Buracos de entrada (2a bainha foliar)	Insetos/ planta	Túneis
pMPI(2k)-cry1Ab1- 3'ocs	0	10,3	5,7	0,6	0
pUbi-cry1Ab1-3'ocs	0	10	6,5	0	0
pMPI(2k)-cry1Ab2- 3'ocs	0	12,2	6,6	0,1	0
pMPI(2k)-cry1C1-3'ocs	0	11,1	3,9	0	0
pMPI(2k)-cry1C2-3'ocs	0	11,3	7,7	0	0
pUbi-cry1C1-3'ocs	0	12,7	8	0	0
pUbi-cry1C2-3'ocs	0	9,4	3	0	0

pMPI(2k)-cry1Ab1- 3'ocs + pMPI(2k)- cry1C1-3'ocs	0	10,7	7,6	0,1	0	1 planta, túnel de 1cm
pMPI(2k)-cry1Ab2- 3'ocs + pMPI(2k)- cry1C2-3'ocs	0	10	8,6	0,2	0,1 (4° ínstar)	1 planta, 5cm e 1 planta,

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Gene(s) cry quimérico	Cora- ção morto	Bro- tos por planta	Buracos de entrada (1^a bainha foliar)	Buracos de entrada (2a bainha foliar)	Insetos/ planta	Túneis
pMPI(2k)-cry1Ab1- 3'ocs	0	10,3	5,7	0,6	0
						túnel de 2cm
pMPI(2k)-cry1Ab2- 3'ocs + pMPI(2k)- cry1C2-3'ocs	0	13,4	6,5	0	0
pUbi-cry1C1-3'ocs + pUbi-cry1Ab1-3'ocs	0	11	9,6	0,2	0
pUbi-cry1C2-3'ocs + pUbi-cry1Ab2-3'ocs	0,1	11,8	12,7	0,4	0	1 planta, túnel de 2cm
controle 1	5,9	5,9	bainha foliar completa danificada	bainha foliar completa danificada	2,6; muitos escaparam 4°/5° ínstar e algumas pupas	100% túneis
controle 2	6,7	6,7	bainha foliar completa danificada	bainha foliar completa danificada	2,8; muitos escaparam 4°/5° ínstar e algumas pupas	100% túneis
controle 3	6,2	6,2	bainha foliar completa danificada	bainha foliar completa danificada	2; muitos escaparam 4°/5° ínstar e algumas pupas	100% túneis

[00104] Seleção adicional de plantas de arroz transformadas expressando a proteína Cry1C, ou expressando as proteínas Cry1C e Cry1Ab, é feita usando testes de inseto em broca-do-colmo amarelo, broca-do-colmo rosa e dobradores de folha na estufa. Para estes testes, várias séries de plantas transgênicas de cada evento de transformação pré-selecionado (bem como controles negativos) são cultivadas em uma estufa e infestadas com larvas neonatas de broca-do-colmo amarelo, broca-do-colmo cor de rosa ou do dobrador de arroz em etapas diferentes do desenvolvimento de arroz. As plantas de uma primeiPetição 870170072777, de 27/09/2017, pág. 66/162

64/68 ra série são infestadas com larvas neonatas de broca-do-colmo amarelo, broca-do-colmo rosa ou dobrador de arroz, na etapa de brotamento. Aproximadamente após três semanas, todas as plantas são dissecadas e classificadas para o dano por inseto para cada inseto testado (para a porcentagem de coração morto e sobrevivência larval da broca-do-colmo amarelo e de colmo rosa, e para porcentagem de brotos danificados, sobrevivência larval, e grau de dano (0 a 9) para o dobrador de folha de arroz). Uma segunda série de plantas é infestada com larvas neonatas de broca-do-colmo amarelo, ou broca-do-colmo rosa, na etapa de espigamento. Aproximadamente após três semanas todas as plantas são dissecadas e classificadas para o dano por inseto (para porcentagem de sobrevivência de cabeça branca e larval). Uma terceira série de plantas é infestada com larvas neonatas de broca-docolmo amarelo ou broca-do-colmo rosa, na etapa pós-florescência. Aproximadamente após três semanas, todas as plantas são dissecadas e classificadas para o dano por inseto (para porcentagem de sobrevivência de cabeça branca e larval).

[00105] As plantas de canola e arroz mostrando controle ótimo de inseto são selecionadas para análise e reprodução adicionais.

[00106] Plantas e sementes da progênie também são obtidas das plantas transformadas, selecionadas da invenção, e os genes da invenção são mostrados segregando em tal progênie de maneira Mendeliana esperada. Seleção das plantas transgênicas na estufa e no campo em múltiplas posições resulta na identificação de linhagens vegetais que têm estabilidade e expressão ótimas dos genes quiméricos crylC (ou crylC e crylAb) combinados com desempenho agronômico ótimo. O cruzamento dos melhores eventos de desempenho transgênico selecionados em diferente germoplasma comercial, após retrocruzamento repetido, resulta na presença do gene crylC da invenção, ou dos genes crylC e crylAb em contextos genéticos diferentes, otiPetição 870170072777, de 27/09/2017, pág. 67/162

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[00107] Todas as referências citadas são com isto incorporadas por referência no relatório descritivo. A citação de quaisquer destas referências não deve ser interpretada como um reconhecimento da exatidão de cada afirmação contida em tal referência, nem como um reconhecimento que tal referência é técnica prévia relevante, tendo uma revelação suficiente (ou capacidade), ou é parte do conhecimento geral comum em qualquer país.

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1/3

Claims

REIVINDICAÇÕES

1. Gene quimérico, caracterizado pelo fato de que compreende as seguintes sequências operacionalmente ligadas:

a) uma região promotora capaz de expressão dirigida em células vegetais;

b) um DNA que codifica uma proteína inseticida Cry1C, compreendendo a sequência de DNA da SEQ ID N° 1; e

c) uma região 3' de poliadenilação e terminação de transcrito.
2. Gene quimérico de acordo a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a dita região promotora compreende a sequência de qualquer uma dentre as SEQ ID N°^s: 9, 10, 13 ou 14.
3. DNA, caracterizado pelo fato de que compreende o gene quimérico como definido na reivindicação 1 ou 2 , em que o DNA compreende ainda um segundo gene quimérico, o dito segundo gene quimérico compreendendo as seguintes sequências operacionalmente ligadas:

a) uma segunda região promotora capaz de direcionar a expressão em células vegetais;

b) uma segunda região de codificação que codifica uma proteína inseticida Cry1Ab, compreendendo a sequência de DNA da SEQ ID N° 11, e

c) uma região 3' de poliadenilação e terminação de transcrito.
4. DNA de acordo com a reivindicação 3, caracterizado pelo fato de que a dita segunda região promotora é diferente da região promotora do gene quimérico crylC, e que compreende a sequência de qualquer uma das SEQ ID N°^s: 9, 10, 13 ou 14.
5. Método para controlar pragas de inseto Lepidóptero de planta, caracterizado pelo fato de que compreende: plantação ou sePetição 870180045933, de 29/05/2018, pág. 9/17

2/3 meadura, em um campo, plantas compreendendo o gene quimérico como definido na reivindicação 1 ou 2, ou o DNA como definido na reivindicação 3 ou 4.
6. Método para controlar pragas de inseto Lepidóptero de planta, caracterizado pelo fato de que compreende: expressão dos genes quiméricos como definidos na reivindicação 1 ou 2, ou o DNA como definido na reivindicação 3 ou 4 em plantas de arroz.
7. Método de acordo com a reivindicação 5 ou 6, caracterizado pelo fato de que as ditas pragas de inseto Lepidóptero de planta são brocas do colmo de arroz ou dobradores de folha de arroz.
8. Processo para obtenção de uma planta de arroz resistente a Chilo suppressalis, Marasmia patnalis, Cnaphalocrocis medinalis, ou Scirpophaga incertulas, caracterizado pelo fato de que compreende transformação de uma planta de arroz com o gene quimérico como definido na reivindicação 1 ou 2, ou o DNA como definido na reivindicação 3 ou 4, e seleção de uma progênie da mesma que contém o referido gene ou DNA que confere resistência a Chilo suppressalis, Marasmia patnalis, Cnaphalocrocis medinalis, ou Scirpophaga incertulas.
9. Método para produção de plantas ou sementes resistentes a insetos Lepidópteros, caracterizado pelo fato de que compreende as etapas de:

a) obtenção de uma planta transformada com o gene como definido na reivindicação 1 ou 2, ou o DNA como definido na reivindicação 3 ou 4, e

b) seleção da progênie da dita planta, ou semente da mesma contendo o dito gene ou DNA, usando iniciadores ou sondas específicos.
10. Micro-organismo, caracterizado pelo fato de que compreende o gene quimérico como definido na reivindicação 1 ou 2, ou o DNA como definido na reivindicação 3 ou 4.

Petição 870180045933, de 29/05/2018, pág. 10/17

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11. Micro-organismo de acordo com a reivindicação 10, caracterizado pelo fato de que é do gênero Escherichia, Bacillus ou Agrobacterium.
12. Uso do gene quimérico como definido na reivindicação 1 ou 2, ou do DNA como definido na reivindicação 3 ou 4, caracterizado pelo fato de que é para controlar pragas de inseto Lepidóptero.
13. Uso do gene quimérico como definido na reivindicação 1 ou 2, ou do DNA como definido na reivindicação 3 ou 4, caracterizado pelo fato de que é para obter plantas de arroz resistentes a Chilo suppressalis, Marasmia patnalis, Cnaphalocrocis medinalis, ou Scirpophaga incertulas.
14. Método para controle de pragas de inseto Lepidóptero de arroz, caracterizado pelo fato de que compreende: expressão nas plantas de arroz de uma proteína inseticida Cry1C e uma proteína inseticida Cry1Ab, em que a dita proteína Cry1C compreende a sequência de aminoácido da SEQ ID N° 2 da posição do ami noácido 28 à posição do aminoácido 627, e em que a dita proteína Cry1Ab compreende a sequência de aminoácido de SEQ ID N° 12 da posição do aminoácido 30 à posição do aminoácido 617.
15. Método de acordo com a reivindicação 14, caracterizado pelo fato de que a dita proteína Cry1Ab compreende a sequência de aminoácido da SEQ ID N° 12 da posição do aminoácido 30 à posição do aminoácido 617.

Petição 870180045933, de 29/05/2018, pág. 11/17