CN100582223C - 转基因水稻的培育方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供在水稻基因组上的一个可以有效地整合了外源基因并使整合的外源基因可以稳定地表达、而又对受体植株的农艺性状没有明显的不良影响的特定位点。此外，还提供一种复合基因结构，该基因结构可以是由特定位点上下游旁侧的水稻基因组DNA序列，与该位点的外源基因DNA序列相整合，构成的遗传上稳定的复合转基因结构，并可以通过有性杂交和体细胞杂交技术重组到新的水稻种质中去，培育成为水稻新品种(系)。

Description

转基因水稻的培育方法

技术领域

本发明涉及水稻分子育种技术领域，具体地说，本发明涉及利用水稻基因组上特定位点培育转基因水稻的方法以及所得的转基因水稻细胞。

技术背景

改善水稻性状的一个主要方面在于提高其抗虫性，水稻螟虫等鳞翅目害虫是水稻丰产稳产的主要限制因素之一。迄今为止，在中国乃至世界上没有任何天然的稻种资源对水稻螟虫等鳞翅目害虫具有抗性。过去，对水稻螟虫的防治主要依赖于化学农药的使用，但大量的农药使用不仅对生物环境造成严重的残毒污染，而且也使稻米的卫生品质下降，从而影响人们的身体健康。另外，由于在钻入茎杆之前螟虫幼虫在稻株的外表面只停留极短的时间，使得化学农药对水稻螟虫等鳞翅目害虫的防治常常难以奏效。因此，培育抗虫水稻是水稻育种界长期追求的目标。

随着植物基因工程技术的发展，人们已逐渐尝试通过引入外源基因的方式来提高水稻的抗虫性，其中应用最广泛的外源基因是来自苏云金杆菌(Bacillus thuringiensis)即Bt的结晶性杀虫蛋白基因。

在毒理学上，Bt杀虫蛋白的毒性活性位点位于昆虫的中肠[EnglishLH and Cantley LC(1986)Delta endotoxin is a potent inhibitor of the(Na，K)-ATPase.J.Biol.Chem.261：1170-1173.]，并在那里毁坏中肠内膜上皮细胞[

H and Whiteley HR(1989)Insecticidal crystalprotein of Bacillus thringiensis.Microbiol Rev.53：242-255；Knowles BHand Ellar DJ(1987)Colloid-osmotic lysis is a general feature of themechanism of action of Bacillus thringiensis of δ-endotoxins withdifferent insect specificity.Biochem.Biophys.Acta 924：509-518]。从而造成目标昆虫中毒死亡。

Bt内源杀虫蛋白优于化学杀虫剂的主要优点之一就在于它们对昆虫的高度专一性，也即除目标害虫之外对其他非目标害虫和害虫天敌以及哺乳动物和鸟类等都不具有任何毒活性，并易于在环境中降解[McGauhey wh and Whalon ME(1992)Managing insect resistance toBacillus thurienginsis toxins.Science 258(27)：1451-1455]。

近年来，通过基因工程导入外源Bt基因成功获得转基因抗虫水稻已经有了大量报道[谢道昕，范云六，倪沛冲(1991)苏云芽孢杆菌杀虫基因导入中国栽培水稻品种中花11号获得转基因植的研究.中国科学(B辑)，8：830-834；Fujimoto H，Itoh K，Yamamoto m，kyozuka j，ShimamotoK(1993)Insect-resistant rice generated by introduction of a modified e-endotoxin gene of bacillus thuringiensis.Bio/Technology 11：1151-1155；李冬虎等(2004)转sck/cry1Ac双基因抗虫水稻对二化螟和稻纵卷叶螟的抗虫效果中国水稻科学18(1)：43-47；马柄田等(2004)转抗虫基因三系优良保持系的获得30(1)：60-65]。在以上这些报道中，研究者们大都采用基因枪或者农杆菌介导的方法，将外源的Bt基因导入水稻基因组中。但是，外源的Bt基因整合在水稻基因组上的哪一个位点是随机的、不确定的。外源基因整合在水稻基因组上的不同位点，可能带来不同的遗传效应。例如，同一个Ubiquitin启动子引导的Bt基因转化到同一个水稻恢复系明恢86形成的两个独立转基因系MSA和MSB在生长后期对二化螟的抗性就存在较大差异，前者的抗虫表现稳定，后者的抗虫性则随生育期进展呈显著下降(李冬虎等2004，出处同上)。另外不同的插入位点，还可能不同程度地影响或改变受体基因组的农艺性状，如粳稻秀水11在转化了cryIAb基因后，其农艺性状发生了明显改变，具体表现为株高降低，分蘖力增强、穗长、穗粒数、千粒重明显下降(崔海瑞等2001)。国外也有不少类似报道。另一方面，Tu Jumin等[(2000)Fieldperformance of transgenic elite commercial hybrid rice expressingBacillus thuringiensis δ-endotoxin.Nature/Biotechnology 18：1101-1104和马柄田等(2004，出处同上)]将Bt基因分别导入优良三系杂交稻恢复系明恢63和蜀恢527的基因组中，获得高效表达的转基因株系，它们在田间不但表现出抗虫性的明显提高，而且农艺性状都没有发生明显的变化。因而，在转基因育种实践上，往往需要创造大量的独立转化事件，然后筛选其中对农艺性状没有影响或者影响轻微的独立转化体，进而将其培育成为有商品价值的转基因抗虫水稻。在这样的有商品价值的转基因水稻中，其目的基因的DNA序列与插入位点上下游旁侧的水稻基因组DNA序列连接在一起共同组成遗传上稳定的复合转基因结构，并在水稻的有性繁殖过程中世代地遗传下去。利用该复合转基因结构可以改良其它水稻品种抵御虫害的能力。

发明内容

本发明通过研究发现，在水稻基因组的特定位点整合外源基因，可实现在将新的有益性状引入水稻品系的同时对受体植株的农艺性状没有明显的不良影响，由此完成了本发明。

本发明的目的在于提供一个在水稻基因组上可以有效地插入外源基因并使插入的外源基因可以稳定地表达、而又对受体植株的农艺性状没有明显的不良影响的特定位点，应用该位点改良水稻性状。

为实现上述目的，本发明提供下述技术方案。

本发明的第一方面在水稻基因组上找到一个可以有效地整合了外源基因并使整合的外源基因可以稳定地表达、而又对受体植株的农艺性状没有明显的不良影响的特定位点，该位点是位于水稻基因组第10染色体的第5354619至5354720位碱基之间的区域，其间的DNA序列可以因具体的受体品种的不同出现或多或少的差异。

本发明的第二方面在于提供一种复合转基因结构，所述复合转基因结构可以是由特定位点上下游旁侧的水稻基因组DNA序列，与该位点的外源基因DNA序列相整合，构成的遗传上稳定的复合转基因结构，并可以通过有性杂交和体细胞杂交技术重组到新的水稻种质中去，培育成为抗虫水稻新品种(系)。

作为一个具体的例子，所述复合转基因结构具有SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2以及在上述两序列之间整合的外源基因双拷贝的复合体。

本领域的技术人员可以理解，通过天然或人工的方式，在所述复合结构基础上(包括其本身)通过插入、缺失、取代、替换、添加一个或多个碱基所得的功能等同的亚结构，只要在遗传上是稳定的，都可以通过有性杂交和体细胞杂交技术重组到新的水稻种质中去，培育成为水稻新品种，则这种经修饰的复合转基因结构也属于本发明的范围之内。

本发明的抗虫复合转基因结构或其功能等同的亚结构，可通过有性杂交方式或体细胞原生质融合技术转育到感虫的水稻品种中，并培育成抗虫的新品系。

本发明的第三方面在于提供一种本发明第一方面所述的特定位点中整合了外源基因序列的水稻细胞以及包含所述的水稻细胞的植物组织。具体说来，所述的水稻细胞可以是光温敏不育系水稻细胞，质核互作雄性不育系或者其保持系水稻细胞，雄性不育恢复系水稻细胞等各种在农业上可应用的水稻细胞。另一方面，在该位点整合的外源基因是抗虫基因，更进一步地，所述外源基因可以是如本发明第二方面所述的复合基因结构，Bt基因，包含Bt基因的融合基因，以及其它抗虫，抗除草剂基因等。特别地，所述外源基因可以是编码SEQ ID NO.3所示氨基酸序列的基因。

本发明的第四方面在于提供改善水稻抗性的方法，该方法包括应用上述任意一方面所述的水稻细胞或复合基因结构的步骤。

下面对本发明进行详细描述。

在一个具体的实施方案中，本发明涉及一个整合在水稻基因组上的可稳定表达Bt抗虫蛋白的复合转基因结构。该复合转基因结构能够赋于水稻对稻纵卷叶螟、二化螟和三化螟等鳞翅目害虫的抗性。这一发明适用于所有对鳞翅目害虫敏感的稻种。这些稻种包括亚洲栽培稻种、非洲栽培稻种和它们的近缘野生种。所述的复合转基因结构包括含有Bt基因双拷贝复合体，且复合体5′端连接着基因组DNA序列SEQID NO.1，3′端连接着基因组DNA序列SEQ ID NO.2，或者与该复合基因结构功能等同的至少包含一份完整的Bt基因拷贝，且其5′端连接着水稻基因组DNA序列SEQ ID NO.1，或其3′端连接着水稻基因组DNA序列SEQ ID NO.2的功能等同的类似结构。

本发明中，基因转化所使用的受体品种为明恢63及其所配杂种汕优63。明恢63是由福建三明市农科所选育的优良籼型细胞质雄性不育恢复系，用该系与优良的籼型细胞质雄性不育系珍汕97A配组，所生产的杂种即为汕优63。本发明中使用的明恢63种子由中国农业科学院品种资源所提供。

在该具体实施方案中，本发明使用的Bt抗虫基因为cry1Ab/cry1Ac融合基因，并由中国农业科学院生物技术研究开发中心范云六院士等人人工合成并提供使用(Jumin TU，等Expression and Function of aHybrid Bt Toxin Gene in Transgenic Rice Conferring Resistance toInsect Pest，Plant Botechnology，15(4)，195-203，1998)，基因全长1830bp，所编码的蛋白质由610个氨基酸残基组成，其分子量大小为60kDa。在氨基酸组成上该基因结合了cry1Ab高效的昆虫毒性活性位点和cry1Ac专一性极强的昆虫识别位点，并被置于能在禾本科作物组织中有效表达的ActinI启动子和nos终止子的调控之下。转化所获得的Bt明恢63株系及其杂交组合Bt汕优63也因此兼备以上这些特点。

本发明中目的Bt抗虫基因和用于转化子筛选的抗生素标记基因是分别构建在不同的质粒载体上，然后，应用共转化的策略由基因枪介导的基因转化方法导入到受体基因组中。事实上正是由于这种共转化策略的应用，使得本发明中的目的基因和标记基因分别插入在受体基因组的不同染色体上，并通过T1代的自交分离培育出不含标记基因的转基因株系。本发明所述的复合转基因结构即存在于这样的转基因株系中。

本发明中的目的基因转基因拷贝有两个，他们是以尾对头连接方式整合在受体基因组上。具体的整合顺序从5′端至3′端依次为：独立整合的185bp actin I启动子短序列，从actin I启动子的第98碱基开始至终止子结束的第一个非完整的Bt基因拷贝序列，由不同载体片段和中间包含一段51bp-actin I启动子短序列组成的总长度为796bp的拷贝间连接序列，从actin I启动子的第1碱基开始至终止子结束的第二个完整的Bt基因拷贝序列，之后是连同该拷贝一起整合的1692bp载体序列，再接着是另一段128bp载体序列。由于5′端的Bt基因拷贝的actinI启动子序列在其5′端被截短98bp，故推测其表达活性可能会有所下降或仅维持部分表达活性；而3′端的Bt基因拷贝是完整的，因而其表达活性是完全的。另外，在残留的1692bp载体序列上发现携带有一段653bp长的抗氨苄霉素标记基因编码序列，但由于它缺少了从起始密码子至中间的长度为208bp的短片段，且没有启动子序列，因此不能转录和翻译。因此，在本发明的转基因复合结构中，人们所担心的抗生素标记基因对环境生物的安全性威胁并不存在。

在该实施方式中的目的基因的整合位点位于水稻第10染色体短臂靠近着丝点的位置上，其具体的插入位置在该染色体的第5354669至5354670两个碱基之间。这两个碱基在正链上是AC，而在副链上是GT，根据本领域技术人员的常规以正链上的这两个碱基为起点分别向5′端和3′端延伸的50个碱基序列如SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示构成了本发明的特定插入位点。远离该插入位点上游(5′端)5.668kb和下游0.900kb处各有一个长度均为500bp的富AT序列，即所谓MAR序列。这两个MAR序列具有所有MAR序列应有的典型特征：如A盒(AATAAAAA/CAA)或T盒(TATAAA)；拓扑异构酶II识别序列(TATACGCATGCT)；复制起始点序列(ATTA，ATTTA和ATTTTA)；富TG区；卷曲DNA花式(AAAAn₇AAAn₇AAAA，TTTAAA)；弯曲DNA花式[TG(CA or TA)n_{2-4 or 9-12}TG(CA or TA)]和ATC规律等。在这两个MAR序列之间包含1个内源的水稻基因，这个内源的水稻基因与外源的两拷贝Bt转基因一起组成一个相对独立的转录单位。因而，能够稳定地遗传与表达。在该具体的实施方式中外源的两拷贝Bt基因由如SEQ ID NO.4所示的连接序列相连。

附图的简要说明：

图1、用于本发明的一个具体实施方案的目的基因和标记基因的质粒结构图。A：质粒pfhbt1携带cry1Ab/cry1Ac融合而成的Bt抗虫基因编码序列，并由能在禾本科作物基因组中有效表达的Actin I启动子和nos终止子驱动表达。该质粒系由中国农业科学院生物技术研究开发中心范云六院士等人构建并提供使用(Jumin TU，等Expression andFunction of a Hybrid Bt Toxin Gene in Transgenic Rice ConferringResistance to Insect Pest，Plant Botechnology，15(4)，195-203，1998)。B：质粒pGL2RC7携带抗潮霉素基因hph和抗真菌的几丁质酶基因RC7编码序列，两者都由烟草花叶病毒启动子CaMV35S和终止子nos驱动表达。在本发明中，该质粒用于与pFHBT1质粒共转化后所获得的转化子的筛选。单个大写英文字母表示各种核苷酸内切酶，B：BamH1；C：ClaI；H：HindIII；K：Kpnl；P：PacI；S：SstI。

图2、基于cry1Ab/cry1Ac整合基因编码序列推定的氨基酸序列。(Jumin TU，等，1998，出处同上)

图3、转基因当代植株TT2、TT35和TT51的Southern杂交分析。图中，上为Bt基因特异探针杂交结果，下为hph基因特异探针杂交结果。箭头所指为符合期望值的特异带。

图4、Bt转基因整合位点在TT51的T1中自交分离时的Southern杂交检测结果。NT：阴性对照；P：阳性对照；I：TT51-T₀；2-16：TT51-T₁单株。箭头所示的数字为各检测片段的分子量大小。

图5、TT51-1第二代(T2)纯系Bt抗虫蛋白的Western杂交分析。每孔上样量为50μg可溶性蛋白质。CryIAb Toxin：纯化的CryIAb杀虫蛋白；NT：非转基因对照蛋白样品；TT51-1(T2)；TT51-1的第二代纯系；1-7：TT51-1第二代纯系7株蛋白样品。箭头所指为期望分子量大小的阳性杂交带。

图6、外源转基因拷贝在转基因当代植株TT51、后代纯系TT51-1及其所配杂种基因组中的整合模式的Southern杂交分析。A：以Bt基因编码序列为特异探针的杂交结果；b：以hph基因编码序列为特异探针的杂交结果。箭头所示为各杂交片段的分子量大小。

图7、Bt转基因纯系TT51-1在大田种植和不打药条件下对人工接虫的三化螟的抗性反应。中间：原品种对照明恢63；两边相邻株行：Bt杂种。

图8、Bt转基因纯系TT51-1在大田种植和不打药条件下对自然发虫的稻纵卷叶螟的抗性反应；图中，上：TT51-1；下：对照明恢63。

图9、TT51-1转基因插入位点上游侧翼片段TAIL-PCR扩增结果。II、III分别为第二和第三轮的扩增产物，M为bp分子量标记。箭头所示为期望扩增带Bt1747AD5。

图10、TT51-1转基因插入位点上游侧翼片段TAIL-PCR扩增结果。II、III分别为第二和第三轮的扩增产物，M为200bp分子量标记。箭头所示为特异扩增带Bt1747AD2。

图11、TT51-1转基因插入位点上游克隆的侧翼序列Bt1747AD5，序列全长2303bp.下划线标出的是引物序列。

图12、TT51-1转基因插入位点上游克隆的侧翼序列Bt1747AD2，序列全长1420bp。下划线标出的是引物序列。

图13、TT51-1转基因插入位点下游侧翼片段TAIL-PCR扩增结果。II、III分别为第二和第三轮的扩增产物；M1：200bp DNA分子量标记；M2：λ-HindIII酶解的分子量标记；箭头所示为特异扩增产物Bt1747AD7。

图14、TT51-1转基因插入位点下游克隆的侧翼序列Bt1747AD7，序列全长2297bp。下划线标出的是引物序列。

图15、PCR扩增的转基因插入位点上游的紧领边界序列MHL2714Act266(图A泳道1)和下游的紧邻边界序列MHR1883Vec1993(图B泳道3)。M1：200bpDNA分子量标记；M2：λ-HindIII酶解的分子量标记。

图16、TT51-1转基因插入位点上下游克隆的紧邻边界序列Bt1747AD2(1479bp)和Vec1993MHR1883(2005bp)。下划线标出的是各引物序列。

图17、两个Bt转基因拷贝之间的连接序列的PCR扩增结果。1：引物对Bt1747和Act29；2：引物对Bt1747和Act266；M：200bpDNA分子量标记。箭头所示为期望的扩增带。

图18、TT51-1上两个Bt拷贝之间的连接序列。粗体打印的英文字母表示前一个Bt基因拷贝的终止子及其紧邻的载体序列；斜体标出的粗体英文字母表示的是反向插入的ActI内含子序列；下划虚线标出的正常字体表示的是前一个Bt基因拷贝上被反向插入的ActI内含子序列打断以后的载体序列；正常字体表示的是下一个Bt基因拷贝的载体及其紧邻的ActI启动子序列部分；下划线表示的是引物序列。

图19、TT51-1转基因插入位点的染色体位置(I)、转基因复合结构(II)和酶切片段长度(III)。染色体的长短臂分别用长短竖线条椭圆形表示，着丝点用空白小圆圈表示。1-10：分别表示的是引物AD2、AD5、MHL2714、Act266、Bt1747、Act29、Bt1747、Vec1993、AD7、MHR1883。

图20、9311和绵恢725转育系的插入位点的旁侧序列及Bt基因拷贝间的中间序列的PCR扩增结果。M1：λ-HindIII酶的分子量标记；M2：200bp DNA分子量标记；I：引物对Vec1993和MHR1883；2：引物对Bt1747和Act29；3：引物对MHL2714和Act266。箭头所示为扩增片段大小。

图21、9311和绵恢725转育系的目标基因的PCR扩增结果。M：200bpDNA分子量标记；1：引物对Bt1和Bt2；2：引物对Bt1533和Bt2。箭头所示为扩增片段大小。

具体实施方式

需要特别说明的是，除特别说明之外，本发明中所使用的实验方法和试剂、材料均是本领域技术人员常规采用的基因工程操作方法和普通可商购的试剂和材料。

实施例1：特定位点的鉴定

本发明的特定位点是通过下述试验材料及试验过程得以分析鉴定出的。

(1)包含有外源基因的质粒载体

本发明中有两个质粒DNA用于水稻转化(见图1)。其中，质粒pFHBT1携带由cry1Ab/cry1Ac融合而成的Bt抗虫基因编码序列，并由能在禾本科作物基因组中有效表达的ActinI启动子和nos终止子驱动表达。该质粒系由中国农业科学院生物技术研究开发中心范云六院士等人构建并提供使用。质粒pGL2RC7携带抗潮霉素基因和抗真菌的几丁质酶基因编码序列，两者都由烟草花叶病毒启动子CaMV35S和终止子nos驱动表达。在本发明中，该质粒用于与pFHBT1质粒共转化后所获得的转化子的筛选。

cry1Ab/cry1Ac融合基因编码序列的人工修饰

基于cry1Ab/cry1Ac融合基因编码序列推定的氨基酸序列见图2。该融合基因的首447个氨基酸残基与cry1Ab的对应区段一致，除了C4-R5、A303和Y384分别取代P5-N6-I7-N8-E9-C10-I11、D309和D390以外，余下的氨基酸序列从448至609则是没有任何变化地由cry1Ac截取。因此，从已知功能域上分析，该基因在氨基酸组成上结合了cry1Ab高效的昆虫毒性活性位点和cry1Ac专一性极强的昆虫识别位点，转化所获得的转基因株系也因此会兼备以上这些特点。另外，在融合前，该基因的密码子使用经过了三位A、T碱基被G或C碱基取代的优化过程，以便适应水稻基因组的高GC含量。作为这种取代的结果，该融合基因的总G+C含量达到48.0％，而来自cry1Ab和cry1Ac抗虫基因对应部分的原始DNA序列中的G+C含量仅为37.2％(JuminTU等1998，出处同上)。

(2)水稻转化

从网室栽培的稻株上采集授粉12天后的未成熟籽粒，并去掉内外颖。然后将去颖的籽粒浸入70％酒精1分钟，用50％(v/v)次氯酸钠(商品名Clorox)表面消毒15-20分钟。在超净工作台上于体视镜下分离幼胚(即外植体)，并盾片面向上地置于10ml加有3％(w/v)M麦芽糖，2mgL^-12，4-D，0.8％(w/v)I型琼脂糖(Sigma)或0.3％Gelrite(MERCK&CO.INC.，KELCO.DIV)的固体MS培养基(简称为MS2)上，于28℃黑暗条件下预培养，所用的培养皿直径为60mm。预培养16-18小时后的幼胚(80-100粒/皿)用伯乐公司(BIO-RAD，Hercules，CA)生产的PDC-1000/He系统进行轰击转化。所用的程序遵照厂家提供的操作步骤进行，即用Promega公司(Promega，Madison，WI)生产的魔幻大样(Magic Maxipreps)DNA纯化系统抽提的质粒DNA(hph∶Bt＝1∶4)包裹直径1μm金微粒，并于1100帕大气压下轰击目标外植体。轰击后的目标外植体幼胚直接转移到加有50mgL^-1潮霉素B的筛选培养基(简称MS2H)上进行筛选，所用的培养皿直径为90mm。产生的愈伤在相同的筛选培养基上每两周继代一次，5-7轮后得到的纯一抗性愈伤转移到20ml加有2mgL^-1激动素(Kinetin)、1mgL^-1α-萘乙酸(NAA)、2mgL^-1甘氨酸、1gL^-1水解酪蛋白(casein hydrolysate)，30gL^-1麦芽糖，3gL^-1Gelrite和50mgL^-1潮霉素B的培养皿(直径90mm)装N 6再生培养基(简称3N6)上，于28℃黑暗条件下预再生7-10天。之后，再转移到20ml去掉了潮霉素B的三角瓶(50ml)装3N6再生培养基上进行植株再生。再生出的两至三周大小的幼苗或移入Yoshida氏培养液过渡培养或直接移入盛土的盆栽钵中，并置于日温29℃，夜温23℃温室中栽培至成熟。

(3)转基因植株的分子分析和纯系培育

应用上述步骤转化后，总共获得32株可育和3株不育转基因苗。用HindIII-SstI内切酶组合酶切基因组DNA，以cry1Ab/cry1Ac编码序列为探针对其中30株可育株基因组DNA进行Southern杂交分析，结果显示16株呈阳性。其中，有3株包括TT2、TT35和TT51的整合模式相同(图3)，并且都呈现与cry1Ab/cry1Ac完整编码序列一致的1.8kb期望片段和一个比1.8kb小的缺失型重组片段。进一步以hph基因编码序列为特异探针，对这三株进行Southern杂交分析，检测到与该hph基因编码序列一致的1.1-kb期望带。这些结果证实目的基因和标记基因均完整地整合到这3株的受体基因组中，且来自同一转化体(图3)。

于孕穗期从上述三株阳性植株上截取8cm带叶鞘的茎杆3-5段，置于垫有湿润滤纸的直径为9cm的培养皿中，每段茎杆接种6头一龄三化螟幼虫，结果表明接种在这三株上的三化螟虫幼虫全部死亡，抗虫效率达到100％。

进一步以目的Bt基因编码序列单一切点酶HindIII对转基因株TT51的32株T1代植株进行酶切和分子遗传分析，结果表明Bt转基因符合多拷贝双位点整合模式，每位点整合两拷贝，部分植株的遗传分析结果见图4。在所检测的32株中，有17株携带双位点4拷贝，6株携带一位点的两拷贝(两高位杂交带)，7株携带另一位点的两拷贝(两低位杂交带)，以及2株未携带任何位点的任何拷贝(即无杂交信号)。经X²测验表明该两位点的分离比率符合独立遗传9∶3∶3∶1的分离比率，其符合概率P值大于0.95。

从上述经分子分析的T1代植株选20株自交获得T2株系，并将其栽培于人工封闭温室，里面的温度和湿度在白天分别设在29℃和85％，在夜间分别设在25℃和90％。每系取10株抽提叶片可溶性总蛋白用于Western分析。每株一致地呈现60kDa期望蛋白带和和一个截短的多肽分子便可初步地确定为纯系(图5)。然后，这些系中每一系的全部20个单株于最高分蘖期进行培养皿抗虫性试验，如一致地表现抗虫的即可进一步肯定为纯系。经如此鉴定的一个纯系，设计编号为TT51-1，其每一株的抗虫效率均达到100％，于是被选择进行自交留种，同时将其与珍汕97A等细胞质雄性不育系配组生产杂种，以便用于进一步的分子分析和大田抗虫实验。

TT51-1系细胞已于2005年3月16日提交中国典型培养物保藏中心(湖北省武汉市武汉大学中国典型培养物保藏中心)进行保藏，培养物名称：稻属籼亚种TT51-1(明恢63/Bt)保藏编号：CCTCC-P200501。

(4)独立遗传位点的验证及标记基因的去除

独立遗传位点的验证是通过一组包括完整Bt基因编码序列分离酶HindIII/SstI、质粒单切点酶KpnI和ClaI和质粒无切点酶PacI酶切分析来实现的。除PacI外，每一种内切酶在质粒上的酶切位点见质粒结构图(图1)。所用的植株DNA样品包括：转基因T₀代单株TT51及其后代纯系TT51-1和由该纯系配组的转基因杂种汕优63/Bt，并以质粒DNA作正对照。酶切后的DNA片段经1％凝胶电泳和转膜，用Bt基因完整编码序列作特异探针进行分子杂交。结果显示，在HindIII/SstI酶切样品中，质粒正对照、TT51、TT51-1和汕优63/Bt样本均检测到一致的1.8kb期望杂交带。这些结果表明Bt基因完整拷贝在上下代间能正常遗传传递。在KpnI和KpnI/ClaI两酶切样品中，TT51均呈现4条带，而它的后代纯系TT51-1及其所配杂种则只呈现上下两端的两条带，中间的两条带被自交分离出去。类似的结果也可从PacI和PacI/ClaI两酶切样品中观察到，如TT51-PacI释放两条带，TT51-PacI/ClaI释放三条带，而后代纯系TT51-1及其所配杂种两酶切样品中各有一条带被分离出去。因此，这些结果进一步验证了前述独立分离的试验结果。另外，从TT51-KpnI和TT51-KpnI/ClaI两酶切样品中释放数目相同的4条带且其中的两条小带大小差异也相同可知，各位点的两个Bt转基因拷贝是头尾相接的方式插入到受体基因组中，因为DNA内切酶KpnI和ClaI同位于Bt基因编码序列下游一侧，两者相距283bp，否则不会产生这样的结果。

用hph标记基因编码序列作特异探针对同一张DNA膜进行Southern杂交，发现HindHI(hph单切点酶)和SstI(hph无切点酶)内切酶组合的TT51酶切样品种释放两条杂交带(图6)，证实hph标记基因在受体基因组中的整合也是复拷贝，但阳性杂交信号只出现在TT51的各种酶切DNA样本上，而不出现在TT51-1及其所配杂种的酶切DNA样本上，表明hph转基因复拷贝的整合位点是单一的，且与Bt转基因的一个整合位点完全连锁，并一起从T₁代分离子TT51-1的基因组中分离出去。因此，上述这些试验结果表明经反复筛选鉴定的TT51-1是一个不带标记基因的仅保留一个Bt基因插入位点但有两个完整拷贝的转基因纯系。

(5)BT转基因的抗螟虫特性

为了检测Bt转基因在受体基因组中介导的抗螟虫特性，我们自1999年开始先后对TT51-1转基因纯系及其与珍汕97A等不育系所配的杂种进行了多年的大田中试、环境释放和生产示范等试验。受测试的目标害虫有三化螟和稻纵卷叶螟，抗虫鉴定方法有人工接虫法和自然发虫法。人工接虫所用的虫卵卵块一般于接虫前1-3天采集于当地稻田，并按每管一块卵放进盛有1ml蒸馏水的9cm长指型管中。然后，将其置于28℃黑暗条件下孵化24小时。幼虫孵化后于6小时内接种到稻株的基部。人工接虫的时期选在水稻生长的中后期即从秧苗最高分蘖期至抽穗期为止。人工接虫的虫量约为每株150条1龄幼虫(两块卵量/株)。接虫后7-10天观察记载稻株的受害情况。测试指标有枯心率、白穗率和受害株率。

自然发虫法的植株受害症状是在自然发虫达到高峰后5-7天进行调查。调查的指标有单株受害叶片数或分蘖数和受害株率。人工接虫田块的试验材料的田间设计采用双行区，每行插31株或150株，株行距为19.8cm×26.4cm，单本植。小区按顺序排列，重复3次。受试材料自移栽后不打农药。

试验结果表明：TT51-1及其杂交杂种在人工接虫和自然发虫后受三化螟为害的枯心率和白穗率均不到4％，极显著地低于明恢63和汕优63对照20-90％的水平(表1-4，图7)；受

表1、TT51-1在大田栽培条件下对人工接虫的三化螟的抗性反应(武汉，1999)

^＊＊表示与对照的差异达1％显著水平

表2、汕优63/Bt在大田栽培条件下对自然发生的稻纵卷叶螟和三化螟的抗性反应^a(武汉，1999)

^a数据来自每重复每材料30个样本；^b在T测验前三化螟危害数据先转换成平方根再计算；

^＊与对照的差异达5％显著水平；^＊＊与对照的差异达1％显著水平.

表3、TT51-1和汕优63/Bt在大田栽培条件下对人工接种的三化螟的抗性反应(武汉，2000)

每重复每系测定70株和每株接种150头一龄幼虫；^＊＊表示与对照的差异达1％显著水平

表4、TT51-1和汕优63/Bt在大田栽培条件下对自然发生的三化螟的抗性反应(武汉，2000)^＊

每重复每系测定70株；^＊＊表示与对照的差异达1％显著水平。

稻纵卷叶螟为害的叶片数每株少于0.5张，也极显著地低于对照的每株10-34张(表5和6)。

表5、TT51-1在大田栽培条件下对自然发生的稻纵卷叶螟的抗性反应(武汉，1999)

^＊＊表示与对照的差异达1％显著水平

表6、TT51-1和汕优63/Bt在大田栽培条件下对自然发生的稻纵卷叶螟的抗性反应^＊(武汉，2000)

就受害普遍程度而言，TT51-1及其杂交组合受三化螟为害的枯心株率和白穗株率平均为0-13.3％，而对照的枯心和白穗株率在人工接种条件下为70-100％(表1-4)，在自然发虫条件下为5-100％，两者的差异达极显著水平。受稻纵卷叶螟为害的受害株率在转Bt抗虫基因材料上为0-20％，在对照材料上为100％(表5和6，图8)。上述结果证实在大田种植和不打农药条件下，TT51-1及其杂交杂种基因组中所携带的Bt转基因对上述鳞翅目害虫的抗虫效果十分显著。

(6)Bt转基因的保产能力

Bt转基因的保产能力由杂种大田比产试验进行验证。参加产量比较试验的材料有：TT51-1、汕优63/Bt(珍汕97AX TT51-1)、II优63/Bt(II-32AXTT51-1)、协优63/Bt(协青早AX TT51-1)、马优63/Bt(马协AXTT51-1)和原恢复系及原杂种对照明恢63和汕优63。各实验材料的田间排列方式采用随机区组设计，小区面积60尺²，单本植，并设打药和不打药两个处理。处理内每小区重复3次。

试验结果表明：在不打药条件下，对照明恢63和汕优63因螟虫危害严重而大幅减产，平均亩产分别为218和322公斤；汕优63/Bt、II优63/Bt、协优63/Bt、马优63/Bt等四个杂交组合则因高度抗虫而充分显示其产量潜力，各组合实际产量折合亩产分别达620、773、758、751和854公斤，比对照增产1.4-2.5倍(表7)。在打药条件下，尽管虫害减轻，但TT51-1及其所配杂种较对照明恢63和汕优63的增产幅度仍然达到极显著水平(表8)。因此，这些结果证实外源Bt转基因的保产和稳产性能十分优异。

表7、TT51-1及其杂交组合在不打药条件下产量比较试验结果(武汉，2000)

表8、TT51-1及其杂交组合在打药条件下产量比较试验结果(武汉，2000)

就经济性状而言，转基因材料与对照的差异主要反映在亲本的生育期和亲本及杂种的有效穗两个方面。在生育期方面，TT51-1的生育期为130.5天，而原品种对照明恢63的生育期为128.2天，前者比后者长2.3天(表9和10)。就有效穗而言，无论是转基因亲本TT51-1，还是转基因杂种汕优63/Bt，在打药和不打药条件下均比原亲本和原杂种对照有显著增加，增幅达5％以上。其它经济性状则未见显著差异。

综上所述，TT51-1受体基因组中的Bt转基因不仅插入位点单一、整合的转基因拷贝数相对较少和抗抗生素标记基因已经通过自交分离去除，而且其遗传与表达稳定、抗螟虫等鳞翅目害虫的能力强。因此，可以认为，Bt基因在TT51-1基因组中的插入和整合的位点，就是符合本发明目的的特定位点。

实施例2：复合转基因结构的分离、测序分析和染色体定位

复合转基因结构即包含了外源插入序列和整合位点旁侧序列的全部DNA一级结构。要弄清复合转基因结构首先必须分离邻近插入位点的旁侧序列，然后再分离出该插入位点上的外源DNA序列，测序后即可确定其全部DNA一级结构。插入位点的染色体定位可通过网上生物信息学比对分析，利用水稻已知基因组序列进行确定。

邻近插入位点的旁侧序列的分离应用刘耀光等人发明的TAIL-PCR(Thermal asymmetric interlaced-PCR)即热不对称巢式PCR技术进行。TAIL-PCR利用一套巢式特异引物和短的随机简并引物(Shortarbitary degenerate primers)，在交错应用不同退火温度条件下，使靶标DNA得到优先扩增，并抑制非靶标DNA的扩增。所用的巢式特异引物和简并引物见表11和12。TAIL-PCR共分三轮完成，各轮反应体系略有不同，其中第一轮的反应体系如表13。

表11、TAIL-PCR反应中应用的随机简并引物(ADn)及其特点

注：退火温度根据Tm＝69.3+0.41(GC％)-650/L(L为引物长度)公式计算，平均退火温度为GC含量最高和GC含量最低时引物退火温度的平均值。

表12、TAIL-PCR或PCR反应中应用的特异引物(SP1-3)及其特点

表13、TAIL-PCR第一轮反应体系

^a用于第一轮反应的特异引物；^b用于第一轮反应的简开引物

第一轮PCR扩增后，将其产物稀释40倍，并取1μl作为第二轮扩增的模板，第二轮的反应体系如表14。第二轮PCR扩增后，其产物稀释10倍，并取1μl作为第三轮扩增的模板，第三轮的反应体系如表15。

表14、TAIL-PCR第二轮反应体系

^a用于第二轮反应的特异引物；^b用于第二轮反应的简并引物

表15TAIL-PCR第三轮反应体系

各轮TAIL-PCR的反应条件见表16。TAIL-PCR产物用1％凝胶电泳检测，电泳结果由凝胶成像系统拍摄保存。对经凝胶电泳鉴定为特异带的第二轮或第三轮TAIL-PCR产物，切胶后，用大连宝生物工程有限公司(TaKaRa)生产的琼脂糖胶DNA纯化试剂盒(TakaRaAgarose Gel DNA Purification Kit)纯化回收，然后用T₄ DNA连接酶将其连接到TA载体pMD 18-T上。连接反应系统遵照厂家提供的说明书进行。连接反应在PCR仪上进行，其反应条件如下：16℃10分钟，20℃5分钟，4℃2分钟；40个循环，然后65℃10分钟，反应完毕后于4℃保存。

表16、TAIL-PCR各轮反应的反应条件

注：延伸时间和退火温度可分别根据产物长度和引物不同作相应调整。

连接产物然后用热激法或电转化法转化到大肠杆菌DH5α感受态细胞中，用蓝白斑法选择阳性克隆，并用PCR扩增目标片段进行验证。验证后的阳性克隆送到上海生物工程有限公司或大连宝生物(Takara)工程有限公司进行测序。

(1)TT51-1转基因插入位点上游侧翼片段的克隆

首先用pFHBT1质粒单一切点酶KpnI酶切TT51-1的基因组总DNA，酶切后的DNA片段经1％凝胶电泳后按4-9kb、9-16kb和16-30kb分段回收，分别自连后作为模板；以Bt1533、Bt1593和Bt1747为巢式特异引物分别与随机简并引物AD1、AD2、AD3、AD4、AD5、AD6、AD7、AD8和AD9配对进行TAIL-PCR扩增，结果从16-30kb的自连片段中扩增出一条特异带，记为Bt1747AD5，其长度为2.303kb(图9)。为验证这一扩增结果，重新酶切TT51-1基因组DNA，经电泳回收16-30kb的片段，自连后用作模板进行TAIL-PCR扩增，结果再次获得Bt1747AD5特异片段。因此，初步认为Bt1747AD5是期望的侧翼片段。

换用Bt基因下游290bp处另一质粒单切点酶ClaI酶切TT51-1基因组总DNA，经电泳、分段回收和分别自连后作为模板，以pBt1533、pBt1593和pBt1747为特异引物分别与随机简并引物AD1、AD2、AD3、AD4、AD5、AD6、AD7和AD8配组进行TAIL-PCR扩增，结果得到多条特异带(图10)。分别对上述特异带进行克隆、测序和网上同源序列比较，发现ClaI酶切自连的扩增产物中有一个1.420kb的片段Bt1747AD2与先前用KpnI酶切并自连后的扩增产物Bt1747AD5(2.303kb)片段都位于水稻第10染色体的同一BAC克隆上(基因库收录编号是AC122146或AC091238)，两者仅相距3015bp。因而，证实这两个TAIL-PCR扩增产物确实是期望的侧翼片段。这两个扩增片段的测序结果见图11和图12。

(2)TT51-1转基因插入位点下游旁侧翼片段的克隆

直接以TT51-1基因组总DNA为模板，以pBt1533、pBt1593、pBt1747为特异引物，与随机简并引物AD1、AD2、AD3、AD4、AD5、AD6、AD7和AD8匹配作TAIL-PCR扩增，结果得到多条特异带(图13)。分别对这些特异带进行克隆、测序和网上同源序列比较，发现其中的一个2.3kb的片段Bt1747AD7的3′端含有48个碱基长度的水稻基因组序列(后证实为紧邻插入位点的边界序列)，紧接着反方向上朔为128bp的未知来源序列和2kb长的Bt基因及其载体序列。由网上同源序列比较的结果显示这个48bp短片段也是位于水稻第10染色体的同一个BAC克隆(AC122146或AC091238)上，它与上游的两个片段的3′端分别相距11,839bp和17,030bp。因此，证实这一短序列就是插入位点下游的旁侧序列(图14)。

(3)TT51-1转基因插入位点上下游旁侧翼片段的克隆

根据网上与TT51-1转基因插入位点对应的已知序列在转基因插入位点的上游及其下游各合成若干特异引物，并与载体序列上的一系列特异引物分别匹配进行PCR扩增，获得一系列特异片段。从中选择了两个长度为1.5kb和2.0kb的扩增产物(图15)，MHL2714Act266和MHR1883Vec1993进行克隆、测序和网上同源序列比较，结果证实它们分别是含转基因插入位点上游的紧邻边界序列和包含48bp短序列在内的下游的紧邻边界序列(图16)。

(4)TT51-1基因组中两个Bt转基因拷贝间连接序列的克隆

考虑到前述结果已经证实两个Bt转基因拷贝是以头尾相接的方式插入到受体基因组中这一事实，因此，要扩增这两个拷贝之间的连接序列，其引物对的设计方向必须是从5′端拷贝远下游的基因编码区到3′端拷贝远上游的启动子序列。依照此思路共设计了4个PCR特异引物Act3、AcT29、Act266和Act409，将其分别与Bt基因的1个特异引物Bt1747配对扩增两个Bt转基因拷贝之间的连接序列，结果都得到了期望大小的片段(图17)。从中选择一个1.2kb的亮带Bt1747Act29进行克隆和测序，并将测得的序列(图18)与已知的质粒载体和基因及启动子序列加以比较，发现自5′端开始，最前面的106bp是第一个Bt转基因拷贝的3′端编码序列，其中首20bp如下划线表出的为Bt1747引物序列；接下来的349bp是终止子及其紧邻的载体序列；接着是反向插入的长度为51bp的ActI内含子序列；再接下来的98bp仍然是第一个Bt转基因拷贝的载体序列，只是其中的123bp被反向插入的长度为51bp的ActI内含子序列所替换；紧接着的550bp和74bp分别是第二个Bt转基因拷贝的载体序列和ActI启动子序列，在末端用下划线表出的20bp为Act29引物序列。具体说来，在该实施方案中Bt基因之间的连接序列如SEQ ID NO.4所示。

(5)TT51-1复合转基因结构及其插入位点的染色体定位

将上述经分离、测序和验证的插入位点上下游旁侧序列、外源Bt基因及其启动子和终止子序列和转基因拷贝之间的连接序列拼接起来即为本发明所述的复合转基因一级DNA结构，也即复合转基因结构。将克隆的转基因插入位点的旁侧序列所在的BAC克隆基因库收录序号(GenBank Accession No)输入禾本科数据库(Gramene datab se)进行搜索，得出其插入位点位于水稻第10染色体短臂靠近着丝点的位置上，具体在第5354669至第5354670碱基之间。进一步按复合转基因结构各组成部分片段大小绘出的结构图及其各酶切片段长度见图19。

对插入位点两边的水稻基因组序列分析表明，远离该插入位点上游(5′端)5.668kb和下游0.900kb处各有一个长度均为500bp的富AT序列，即所谓MAR序列。这两个MAR序列具有所有MAR序列应有的典型特征：如A盒(AATAAAAA/CAA)或T盒(TATAAA)；拓扑异构酶II识别序列(TATACGCATGCT)；复制起始点序列(ATTA，ATTTA和ATTTTA)；富TG区；卷曲DNA花式(AAAAn₇AAAn₇AAAA，TTTAAA)；弯曲DNA花式[TG(CA or TA)n_{2-4 or 9-12}TG(CA or TA)]和ATC规律等。在这两个MAR序列之间包含1个内源的水稻基因，外源的两拷贝Bt转基因与这个内源的水稻基因一起组成一个相对独立的转录单位，因而，能够稳定地遗传与表达。

实施例3：外源Bt转基因复合结构的有性杂交转育

无特别说明的情况下，转育试验中采用的试验方法和试验材料均是本领域技术人员常规采用的。

1：转Bt基因复合结构的BT5193的选育

以TT51-1为供体亲本，以常规水稻品种9311为受体亲本进行杂交，杂交后代进行系谱选育，并在系谱选育过程中辅以分子标记选择来清除供体亲本的遗传背景和追踪外源Bt基因的传递情况，于F4代获得了含有本发明所述的复合转基因结构的稳定抗虫株系BT5193。从该株系叶片组织中提取DNA，扩增出Bt基因及其侧翼的DNA片断(图20-21)。经测序分析证证实，来自于供体亲本的由SEQ ID NO.1、Bt复合转基因结构和SEQ ID NO.2构成了插入在基因组上的外源Bt复合转基因结构保持不变，稳定的转育到新的受体材料之中。经田间抗虫性试验，所育成的抗虫株系BT5193具有良好的抗虫性，高抗水稻螟虫。

2：转Bt基因复合结构的BT51725的选育

以TT51-1为供体亲本，以水稻三系恢复系绵恢725为受体亲本进行杂交，杂交后代进行系谱选育，并在系谱选育过程中辅以分子标记选择来清除供体亲本的遗传背景和追踪外源Bt基因的传递情况，于F5代获得了含有本发明所述的复合转基因结构的稳定抗虫株系BT51725。从该株系叶片组织中提取DNA，扩增出Bt基因及其侧翼的DNA片断(图20-21)。经测序分析证证实，来自于供体亲本的由SEQ IDNO.1、Bt复合转基因结构和SEQ ID NO.2构成了插入在基因组上的外源Bt复合转基因结构保持不变，稳定的转育到新的受体材料之中。经田间抗虫性试验，所育成的抗虫株系BT5193具有良好的抗虫性，高抗水稻螟虫。

3：转Bt基因复合结构的水稻抗虫光温敏雄性不育系BT5118的培育

根据本领域技术人员的常规操作方法，以TT51-1为供体亲本，以水稻光温敏雄性不育系2018S为受体亲本进行一次杂交，3次回交和两次自交，并在回交过程中辅以分子标记选择来清除供体亲本的遗传背景和追踪外源Bt基因的传递情况，同时进行系谱选育和水稻光温敏雄性不育特性的选育，于BC3F2代获得了含有本发明所述的复合转基因结构的稳定具有光温敏雄性不育特性的株系BT5118。从该株系叶片组织中提取DNA，扩增出Bt基因及其侧翼的DNA片断，经测序分析证证实，来自于供体亲本的由SEQ ID NO.1、Bt复合转基因结构和SEQID NO.2构成了插入在基因组上的外源Bt复合转基因结构保持不变，稳定的转育到新的受体材料之中。应用与实施例1类似的方式，经田间抗虫性试验，所育成的抗虫株系BT5118具有良好的抗虫性，高抗水稻螟虫，并且具有光温敏雄性不育特性，可以用于两系杂交水稻制种应用。

4：转Bt基因复合结构的水稻抗虫三系不育系的选育

以TT51-1为供体亲本，以水稻三系不育系保持系为受体亲本进行杂交，对杂交后代进行系谱选育，并在系谱选育过程中辅以分子标记选择来清除供体亲本的遗传背景和追踪外源Bt基因的传递情况，可以获得含有本发明所述的复合转基因结构的稳定抗虫保持系。用此保持系和其相应的不育系连续杂交两代并根据后代抗虫性分离情况的鉴定就可以获得含有本发明所述的复合转基因结构的稳定抗虫不育系。

同样地，从技术上分析，利用杂交系谱法和体细胞杂交法，也可达到相同的目的。另外，利用上述方法进行转育，所用的受体亲本除了恢复系、保持系和不育系以外，还可以是常规水稻品种。在分类上这些品种或系可以是籼稻粳稻、爪洼稻等亚洲栽培稻，亦可以是非洲栽培稻和它们的近缘野生种。

序列表

<110>浙江大学

<110>华中农业大学

<120>一种受植物系统获得性抗性诱导剂诱导的启动子及其应用

<170>PatentIn version 3.1

<210>1

<211>50

<212>DNA

<213>水稻(Oryza Sativa)

<400>1

CGACTTTCAA GCATCAGTAC AGGAAGGATA AAAAGTGCCG AACATGGAGA                50

<210>2

<211>50

<212>DNA

<213>水稻(Oryza Sativa)

<400>2

CAGATAAGCA GTAGTGGTGG GGCTACGAAC ATATTCCTTT TCCTTCTGGA                50

<210>3

<211>610

<212>氨基酸序列

<213>水稻(Oryza Sativa)

<400>3

MDNNCRPYNC LSMPEVEVLG GERIETGYTP IDISLSLTQF LLSEFVPGAG FVLGLVDIIW     60

GIFGPSQWDA FLVQIEQLIN QRIEEFARND AISRLEGLSN LYQIYAESFR EWEADPTNPA    120

LREEMRIQFN DMNSALTTAI PLFAVQNYQV PLLSVYVQAA NLHLSVLRDV SVFGQRWGFD    180

AATINSRYND LTRLIGNYTD HAVRWYNTGL ERVWGPDSRD WIRYNQFRRE LTLTVLDIVS    240

LFPNYDSRTY PIRTVSQLTR EIYTNPVLEN FDGSFRGSAQ GIEGSIRSPH LMDILNSITI    300

YTDDHRGEYY WSGHQIMASP VGFSGPEFTF PLYGTMGNAA PQQRIVAQLG QGVYRTLSST    360

LYRRPFNIGI NNQQLSVLDG TEFADGTSSN LPSAVYRKSG TVDSLDEIPP QNNNVPPRQG    420

FSHRLSHVSM FRSGFSNSSV SIIRAPMFSW IHRSAEFNNI IASDSITQIP AVRGNFLFNG    480

SVISGPGFTG GDLVRLNSSG NNIQNRGYIE VPINFPSTST RYRVRVRYAS VTPIHLNVNW    540

GNSSIFSNTV PATATSLDNL QSSDFGYFES ANAFTSSLGN IVGVRNFSGT AGVIIDRFEF    600

IPVTATLEAE                                                           610

<210>4

<211>797

<212>DNA

<213>水稻(Oryza Sativa)

<400>4

CATCGATGAT ATCAGATCTG CCGGTCTCCC TATAGTGAGT CGTATTAATT TCGATAAGCC    60

AGCACATCTA AGCCTGACGA AGCAGCAGAA ATATATAAAA ATATAAACCA TGCTCACTCA   120

AAGGCGGTAA CACGGTTATC CACAGAATCA GGGGATAACG CAGGAAAGAA CATGTGAGCA   180

AAAGGCCAGC AAAAGGCCAG GAACCGTAAA GCGTTTCTGG GTGAGCAAAA ACAGGAAGGC   240

AAAATGCCGC AAAAAAGGGA ATAAGGGCGA CACGGAAATG TTGAATACTC ATACTCTTCC   300

TTTTTCAATA TTATTGAAGC ATTTATCAGG GTTATTGTCT CATGAGCGGA TACATATTTG   360

AATGTATTTA GAAAAATAAA CAAATAGGGG TTCCGCGCAC ATTTCCCCGA AAAGTGCCAC   420

CTGACGTCTA AGAAACCATT ATTATCATGA CATTAACCTA TAAAAATAGG CGTATCACGA   480

GGCCCTTTCG TCTCGCGCGT TTCGGTGATG ACGGTGAAAA CCTCTGACAC ATGCAGCTCC   540

CGGAGACGGT CACAGCTTGT CTGTAAGCGG ATGCCGGGAG CAGACAAGCC CGTCAGGGCG   600

CGTCAGCGGG TGTTGGCGGG TGTCGGGGCT GGCTTAACTA TGCGGCATCA GAGCAGATTG   660

TACTGAGAGT GCACCATATG GACATATTGT CGTTAGAACG CGGCTACAAT TAATGCATAA   720

CCTTATGTAT CATACACATA CGATTTAGGT GACACTATAG AACTCGAGCA GCTGAAGCTT   780

GCATGCCTGC AGGTCGA                                                  797

Claims (7)

1.一种重组水稻细胞，其特征在于在该细胞的基因组的特定位点上携带了一种能稳定遗传的复合转基因结构，所述特定位点是水稻基因组第10染色体的第5354619与5354720位碱基之间的区域，所述的复合转基因结构是由以下几部分序列沿5′到3′方向顺序连接而成：

(i)SEQ ID NO.1所示的序列；

(ii)外源基因序列；

(iii)SEQ ID NO.2所示的核酸序列。

2.如权利要求1所述的水稻细胞，其特征在于，所述的细胞是光温敏不育系水稻细胞、雄性不育恢复系水稻细胞、质核互作雄性不育系水稻细胞或质核互作雄性不育系保持系水稻细胞。

3.如权利要求1或2所述的水稻细胞，其中(ii)中所述的外源基因是编码SEQ ID NO.3所示氨基酸序列的核酸序列。

4.如权利要求1或2所述的水稻细胞，其中(ii)中所述的外源基因是间以连接序列的两个拷贝的Bt基因。

5.如权利要求4所述的水稻细胞，其中所述的连接序列是如SEQID NO.4所示的核酸序列。

6.如权利要求1所述的水稻细胞，其特征在于，所述细胞是保藏号为CCTCC-P200501的细胞。

7.一种改善水稻抗虫特性的方法，该方法包括应用权利要求1-6中任意一项所述的水稻细胞的步骤。

Images