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GEBIET DER
ERFINDUNG
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Diese
Erfindung betrifft Verfahren zur Herstellung transgener Pflanzen
mit hoher Wirksamkeit, worin die transgenen Pflanzen wenig wenn überhaupt
Vektorsequenzen enthalten, einfache Transgen-Integrationsmuster
aufweisen, das Transgen an nur einer oder wenigen Integrationsstellen
integriert haben, einige wenige Kopien des Transgens an jeder Integrationsstelle
enthalten und das Transgen in allen Entwicklungsstadien stabil exprimieren.
Wenige wenn überhaupt
welche der transgenen Pflanzen, die mittels dieses Verfahrens hergestellt
werden, weisen Verstummen von Transgenen auf. Das Verfahren umfasst
das Einführen
von "minimalen Transgen-Expressionskassetten", die Expressionskassetten
sind, die im Wesentlichen frei von Vektorsequenzen sind, durch direkte
DNA-Transferverfahren, insbesondere durch Partikelbeschuss von intakten
Pflanzenzellen.
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HINTERGRUND
DER ERFINDUNG
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Heutzutage
ist es ein Routineverfahren, transgene Pflanzen herzustellen, entweder
durch Agrobacterium-vermittelte Transformation oder durch direkte
DNA-Transferverfahren
(Gelvin, Curr. Opin. Biotechnol. 9, 227–232 (1998); Komari et al.,
Curr. Opin. Plant Biol. 1, 161–165
(1998); Tyagi et al., Crit. Rev. Biotechnol. 19, 41–79 (1999)).
Zahlreiche, im Handel bedeutende zweikeimblättrige und einkeimblättrige Spezies
wurden bereits transformiert. Wenn auch das Transformationsverfahren
selbst jedoch nicht weiter als limitierender Schritt betrachtet
wird, ist die Gewinnung solcher nützlichen transgenen Linien
durch variable Transgenexpressionsniveaus und durch Verstummen von
Transgenen eingeschränkt
(Flavell, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91, 3490–3496 (1994); Finnegan, Ann.
Rev. Plant Physiology 49, 223–247
(1998)). Vollständiges
oder teilweises Verstummen von Transgenen wurde bisher zahlreichen
Faktoren zugeschrieben, einschließlich der Kopienzahl der integrierten
Gene (Matzke & Matzke,
Plant Physiol. 107, 679–685
(1995), und Matzke et al., Mol. Gen. Genet. 244, 219–229 (1994)),
der Position von Transgenintegration (Hobbs et al., Plant Mol. Biol.
15, 581–864 (1990);
Peach & Velten,
Plant Mol. Biol. 17, 49–60
(1991); Matzke & Matzke,
Curr. Opin. Plant Biol. 1, 142–148 (1998)),
der Konfiguration und Struktur des transgenen Locus (Stam et al.,
Plant J. 12, 63–82
(1997)), der strukturellen Integrität einzelner Transgene (Kohli
et al., 1998) und der genetischen Eigenschaften der Wirtspflanze
(z.B. genetischer Hintergrund, Ploidie und Zygosität) (Beaujean
et al., Mol. Gen. Genet. 260, 362–371 (1998)).
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Vollständige Plasmidtransformation
ist in Pflanzensystemen noch immer beinahe universell. Der Grund
hierfür
ist eventuell im Erfordernis von Agrobacterium-Vektorsequenzen in
Agrobacterium-vermittelter Transformation zu finden: Der Agrobacterium-Vektor
trägt wesentliche
vir-Gene, die für
T-DNA-Ausschneiden, -Transfer und -Integration erforderlich sind.
In bereits beschriebenen Transformationsverfahren wird die Transgen-Kassette,
die für
ein erwünschtes
Produkt kodiert, in einen Vektor, z.B. ein Plasmid, ein Virus oder
ein Agrobacterium-Ti-Plasmid, kloniert, und der gesamte Vektor,
der die Transgen-Kassette enthält,
wird in die Pflanzenzelle eingeführt.
Vektorsequenzen erfüllen
jedoch keinen erforderten Zweck für DNA-Transfer und -Integration
in direkten DNA-Transferverfahren wie beispielsweise Partikelbeschuss.
Die Verfahren dieser Erfindung bilden transgene Pflanzen, die stabile
Transgenexpression mit einer höheren
Häufigkeit
als jene aufweisen, die mittels davor beschriebener Verfahren hergestellt
wurden. In Ausführungsformen,
worin zwei oder mehr Transgene gleichzeitig in die Pflanzen eingeführt werden,
ist die Häufigkeit
von Transgen-Co-Expression höher
als die Häufigkeit
von Co-Expression, die durch davor beschriebene Verfahren erzielt
wird. Die mittels der hierin beschriebenen Verfahren gebildeten
transgenen Pflanzen weisen einfache Integrationsmuster und geringe
Kopienzahlen des Transgens auf und zeigen im Allgemeinen kein Verstummen
des Transgens.
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KURZBESCHREIBUNG
DER ZEICHNUNGEN
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1 zeigt
einen Southern-Blot von genomischer DNA aus bar-transgenen Reispflanzen,
verdaut mit dem "Nicht-Schneider" SfiI (S) oder mit
HindIII (H), das einmal innerhalb der Transgen-Kassette schneidet
und mit einer bar-Sonde hybridisiert.
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2 zeigt
einen Southern-Blot genomischer DNA aus hpt-transgenen Reispflanzen,
verdaut mit SalI, das am 3'-Ende
der Transgen-Kassette schneidet, und hybridisiert mit einer hpt-Sonde.
M = Marker.
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3 zeigt
einen Southern-Blot von genomischer DNA aus 18 hpt-gusA-transgenen
Reispflanzen, verdaut mit NcoI, das am 5'-Ende der Transgenkassette schneidet,
und sondiert mit einer gusA-Sonde. M = Marker.
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DETAILLIERTE
BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG
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Eine
nicht erwünschte
Eigenschaft von Vektor-Hauptkettensequenzen ist ihre Neigung, Transgen-Neuanordnung
zu fördern. Über die
Einbindung der Vektor-Hauptkette
in Vektor-Vektor-Rekombinationsereignisse wurde von mehreren Gruppen
bereits berichtet, und zahlreiche Rekombinations-Hotspots wurden identifiziert,
die illegitime Rekombination durch die Bildung stabiler Sekundärstrukturen
stimulieren. Ein besonderer Hotspot ist der Replikationsursprung
des Vektors, der ein Target für
die Nucleasen und Topoisomerasen, die in illegitime Rekombinationsereignisse
eingebunden sind, darstellen kann. Tatsächlich sind Consensus-Topoisomerasestellen
häufig
in der Nähe
von Vektor-Vektor- und Vektor-Genom-Rekombinationsverbindungen in
Pflanzen und Tieren zu finden. Ein anderer Nachteil von Pflanzentransformation
mit Nucleinsäuremolekülen, die
Vektorsequenzen umfassen, ist das Problem, dass neue Replikons,
die Vektor-Replikationsursprünge
und genomische Pflanzen-DNA umfassen, in die Umwelt entkommen können. Weiters
können
rekombinationsgenetische Elemente in der Vektor-Hauptkette für komplexe
Vektor-Multimerisationsereignisse
verantwortlich sein, die auch Segmente genomischer DNA einbinden
und in der Integration großer
Transgenkomplexe resultieren. Mehr fach-Transgenkopien sind nicht
wünschenswert,
da von einer hohen Kopienzahl angenommen wird, dass sie Transgenexpression
inhibiert und zu Verstummen von Transgen beiträgt. Darüber hinaus können sehr
große
transgene Loci meiotisch instabil sein, was zu einem Ausschneiden
des Locus und zum Verlust von Transgenexpression in darauf folgenden
Generationen führt.
Somit sind Vektor-Hauptkettensequenzen
in DNA-Transferverfahren nicht wünschenswert
und überflüssig.
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Daher
ist es wünschenswert,
transgene Pflanzen mit geringen Transgen-Kopienzahlen, kleinen transgenen Loci,
wenig oder keinem Verstummen von Transgen und mit stabiler Transgenexpression
zu bilden. Die hierin beschriebenen Verfahren erzielen diese Resultate
durch Transformation von Pflanzenzellen mit minimalen Transgen-Expressionskassetten,
die DNA-Expressionskassetten sind, welche im Wesentlichen frei von Vektorsequenzen
sind, und mittels direkter DNA-Transferverfahren.
Dies ist der erste Bericht in Bezug auf stabile transgene Pflanzen,
die eine Expressionskassette enthalten, die frei von Sequenzen aus
dem Vektor ist, in den sie ursprünglich
kloniert wurde.
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Die
Häufigkeit
von transgenen Pflanzenlinien mit einfachen Integrationsereignissen
mit geringer Kopienzahl ist bei den mittels der Verfahren dieser
Erfindung hergestellten Pflanzen, d.h. Pflanzen, die aus Zellen neu
gebildet wurden, die mit minimalen Transgen-Expressionskassetten
und direkten DNA-Transferverfahren transformiert wurden, viel höher als
bei Pflanzenzellen, die mit superspiralisierten oder linearisierten
Vektoren, z.B. Plasmiden, transformiert wurden. Dies gilt sowohl
für selektierte
als auch für
nicht-selektierte Transgene. Wenn auch die Co-Transformationswirksamkeit
bei den minimalen Transgen-Expressionskassetten und den Plasmidkonstrukten
im Wesentlichen dieselbe ist, ist im Vergleich zu bereits früher beschriebenen
Verfahren bei jenen Pflanzen, die mittels der Verfahren dieser Erfindung
hergestellt wurden, das Eintreten von Verstummen des Transgens sehr
viel geringer und die Co-Expressionshäufigkeit für Mehrfach-Transgene signifikant höher. Im
Folgenden erörtern
die Erfinder diese Resultate in Bezug auf Co-Transformationsversuche
mit minimalen Transgen-Expressionskassetten, die selektierbare Marker gene
und Kassetten umfassen, die für
Produkte von landwirtschaftlichem Interesse kodieren.
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Eine
Ausführungsform
dieser Erfindung ist eine heterogene Population transgener Pflanzen,
worin zumindest 70% der transgenen Pflanzen ein einfaches Transgen-Integrationsmuster
und einen geringen Prozentsatz an Verstummen des Transgens aufweisen.
Vorzugsweise liegt der Prozentsatz bezüglich des Verstummens des Transgens
unter 20% der transgenen Pflanzen mit einem einfachen Integrationsmuster,
und noch bevorzugter erfahren weniger als 5% Verstummen des Transgens,
und am meisten bevorzugt erfährt
keine der Population transgener Pflanzen mit einfachen Integrationsmustern
Verstummen des Transgens.
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Eine
weitere Ausführungsform
dieser Erfindung ist ein Verfahren zur Transformation von Pflanzenzellen
durch direkten DNA-Transfer, insbesondere durch Partikelbeschuss,
mit einer oder mehreren minimalen Transgen-Expressionskassetten.
Minimale Transgen-Expressionskassetten sind Expressionskassetten,
die im Wesentlichen aus einem Transgen bestehen, das eine Nucleinsäuresequenz,
die für
ein erwünschtes
Produkt wie z.B. ein Enzym, ein Säugetier- oder Vogel-Protein,
z.B. einen Antikörper
oder einen Wachstumsfaktor, kodiert, oder einen Faktor für Resistenz
gegenüber
einem Antibiotikum oder Herbizid oder eine Antisense-RNA in operabler
Bindung mit Sequenzen umfasst, die die Expression der Nucleinsäuresequenz
regulieren. Die minimale Transgen-Expressionskassette umfasst zumindest
ein Transgen, das zumindest einen Promotor in operabler Bindung
mit einem Nucleinsäuremolekül umfasst,
das eine Sequenz aufweist, die für
ein erwünschtes
Produkt kodiert, und kann auch einen Operator, einen Enhancer, einen
Terminator oder ein Polyadenylierungssignal usw. umfassen, der oder
das die Expression des/der Transgens/e reguliert. Die minimale Transgen-Expressionskassette
ist im Wesentlichen frei von Sequenzen, die nicht für das erwünschte Produkt
kodieren oder nicht die Expression des erwünschten Produkts regulieren.
Beispielsweise sind weniger als 10–15% der Sequenzen der minimalen
Transgen-Expressionskassetten Vektorsequenzen, d.h. Nucleotidsequenzen, die
nicht für
ein erwünschtes
Produkt kodieren oder nicht die Expression dieses Produkts regulieren.
Vorzugsweise sind weniger als 50 Basen paare der minimalen Transgen-Expressionskassette
Vektorsequenzen. Noch bevorzugter umfasst die minimale Transgen-Expressionskassette
weniger als 20 Basenpaare, die Vektorsequenzen sind. Am meisten
bevorzugt ist die minimale Transgen-Expressionskassette vollständig frei
von Nucleotidsequenzen, die nicht Teil eines Elements sind, das
für das
transgene Produkt/die transgenen Produkte kodiert oder die Expression
des transgenen Produkts/der transgenen Produkte von Interesse reguliert.
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Die
Verfahren dieser Erfindung stellen transgene Pflanzen, die wenige
wenn überhaupt
Vektorsequenzen enthalten, einfache Integrationsmuster aufweisen,
das Transgen nur an einer oder an wenigen Integrationsstellen integriert
haben, wenige Kopien des Transgens an jeder Integrationsstelle aufweisen
und das Transgen in allen Entwicklungsphasen stabil exprimieren,
effizient her.
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Ein
einfaches Integrationsmuster zeigt zumindest eine und nicht mehr
als etwa fünf
Integrationsstellen innerhalb des Genoms der transgenen Pflanze,
worin jede Integrationsstelle zumindest eine und nicht mehr als
etwa fünf
Kopien des Transgens, insertiert an jeder Stelle, aufweist. Vorzugsweise
sind nicht mehr als drei Integrationsstellen im Pflanzengenom vorhanden.
Noch bevorzugter ist nicht mehr als eine Integrationsstelle im Pflanzengenom
vorhanden. Vorzugsweise gibt es zumindest eine und nicht mehr als
drei Kopien von jedem Transgen in jeder Integrationsstelle. Noch
bevorzugter gibt es eine Kopie von jedem der Transgene, die in einer
Integrationsstelle vorhanden sind.
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Das
einfache Transgen-Integrationsmuster kann an einem Southern-Blot
nachgewiesen werden. Beispielsweise an einem Southern-Blot, der
von Proben genomischer DNA transgener Pflanzen, verdaut mit (1) einem
Restriktionsenzym, das vor seiner Integration in die Pflanzen-DNA
keine Erkennungsstelle innerhalb der Transgenkassette aufweist und
die genomische Pflanzen-DNA nur selten schneidet, und (2) einem
Restriktionsenzym, das eine einzige Restriktionsstelle innerhalb
der Transgenkassette aufweist, erstellt wurde. Ein Enzym, das genomische
DNA nur selten schneidet, bringt genomische DNA-Fragmente von zumindest
etwa 64 kb hervor. Ein Beispiel für solch einen "seltenen Schneider" ist ein Restriktionsenzym,
das eine 8-bp-Sequenz erkennt.
Der Southern-Blot der verdauten DNA, hybridisiert an eine Transgen-spezifische
Sonde unter stringenten Bedingungen (z.B. 2 × SSC, 0,5% SDS bei 65°C 20 min
lang und 0,2 × SSC,
0,5% SDS bei 65°C
20 min lang, oder unter entsprechenden stringenten Bedingungen),
präsentiert
ein einfaches Integrationsmuster. Das einfache Integrationsmuster
zeigt sich als nur eine bis etwa drei Banden hybridisierender DNA
für die
genomische DNA, die mit dem Enzym verdaut wurde, das keine Erkennungsstelle
im Transgen aufweist, und diese Banden lösen sich in nur eine bis etwa
drei Banden für
die genomische DNA auf, die mit dem Enzym verdaut wurde, das eine
einzelne Erkennungsstelle innerhalb der Transgenkassette aufweist.
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Die
Verfahren dieser Erfindung stellen auf effiziente Weise transgene
Pflanzen her, worin das Transgen im Pflanzengewebe stabil exprimiert
wird. Vorzugsweise exprimieren zumindest etwa 70% der transgenen Pflanzen,
die aus den transformierten Pflanzenzellen gebildet werden, das
Transgen auf stabile Weise, und diese stabile Expression wird auf
die Nachkommenschaft der transgenen Pflanzen übertragen. Auch innerhalb des
Schutzumfangs dieser Erfindung werden Nachkommenpflanzen mit stabiler
Expression der Transgene und ihre Produktion durch klassisches Kreuzen
zweier transgener Pflanzen, die mittels der Verfahren dieser Erfindung
hergestellt wurden, erwogen.
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Pflanzen,
die eine Pflanzenzelle gemäß der Erfindung
umfassen, werden zusammen mit jeglichem Teil oder Fortpflanzungseinheit
davon, Samen, selbstbefruchteter oder hybrider Nachkommenschaft
und Abkömmlingen
ebenfalls bereitgestellt. Eine Pflanze gemäß der vorliegenden Erfindung
kann eine sein, die in einer oder mehreren Eigenschaften nicht sortenrein
ist. Pflanzensorten können
ausgeschlossen werden, insbesondere registrierbare Pflanzensorten
gemäß den Plant
Breeders' Rights
(Pflanzenzüchterrechten).
Es wird angemerkt, dass eine Pflanze nicht als eine "Pflanzensorte" betrachtet werden
muss, nur weil sie stabil innerhalb ihres Genoms ein Transgen enthält, das
in eine Zelle der Pflanze oder in einen ihrer Vorgänger eingeführt wurde.
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Pflanzenzellen
können
mit der minimalen Transgen-Expressionskassette unter Verwendung
jeglichen geeigneten direkten DNA-Transferverfahrens transformiert
werden, z.B. Partikel- oder Mikroprojektilbeschuss (
US 5100792 , EP-A-444882, EP-A-434616, hierin durch
Verweis eingebunden), Mikroinjektion (WO 92/09696, WO 94/00583,
EP 331083 ,
EP 175966 , Green et al., Plant Tissue
and Cell Culture, Academic Press (1987)), Elektroporation (
EP 290395 , WO 87/06614),
Liposomenvermittelte DNA-Aufnahme (z.B. Freeman et al., Plant Cell
Physiol. 29, 1353 (1984)), Zentrifugationsverfahren (Kindle, PNAS
USA 87, 1228 (1990)), Siliciumcarbidfasern (
US 5.302.523 ) und andere Formen direkter
DNA-Aufnahme (
DE 4005152 ,
WO 9012096,
US 4.684.611 ).
Einen Überblick über physikalische
Verfahren zur Transformation von Pflanzenzellen bietet beispielsweise
Oard, Biotech. Adv: 9, 1–11
(1991). Vorzugsweise werden die Pflanzenzellen durch Partikel- oder Mikroprojektilbeschuss
transformiert.
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Fachleuten
ist bekannt, dass verschiedene Verfahren zur Neubildung transgener
Pflanzen aus transformierten Zellen in Kultur verwendet werden können. Eine
Pflanze kann z.B. aus einzelnen Zellen, Kallusgewebe (Typ I oder
Typ II), Blattscheiben und unreifen oder reifen Keimlingen, Hypokotylen
und Kotyledonen, wie es nach dem Stand der Technik Standard ist,
neu gebildet werden. Beinahe jede Pflanze, z.B. Reis, Weizen, Mais,
Hafer, Gerste, Sorghum, Gemüsearten
und Holzarten, kann vollständig
aus Zellen, Geweben und Organen der Pflanze neu gebildet werden.
Die Bildung fruchtbarer transgener Pflanzen kann bei Getreidearten,
z.B. Reis, Mais, Weizen, Hafer und Gerste, erreicht werden (untersucht
in K. Shimamoto, Current Opinion in Biotechnology 5, 158–162 (1994);
Vasil et al., Bio/Technology 10, 667–674 (1992); Vain et al., Biotechnology
Advances 13: 4, 653–671
(1995); Vasil, Nature Biotechnology 14, 702 (1996)). Über verfügbare Verfahren
wird auch in Vasil et al., Cell Culture and Somatic Cell Genetics
of Plants, Bd. I, II und III, Laboratory Procedures and Their Applications,
Academic Press (1984); Weissbach & Weissbach,
Methods for Plant Molecular Biology, Academic Press (1989); und
auch Christou, Plant Mol. Biol. 163, 39–44 (1997); Cao et al., Plant
Gene Transfer, UCLA Symposium Molecular and Cellular Biology 129,
21–33
(1990), D'Halluin
et al., Plant Cell 4, 1495–1505
(1992), und Lowe et al., Bio/Technology 13, 677–682 (1995), berichtet. Die
minimale Transgen-Expressionskassette kann ein oder mehrere genetische
Markergene, "genetische
Marker", enthalten.
Fachleuten wird bekannt sein, dass es mehrere Arten von genetischen
Markern gibt, die in die minimale Transgen-Expressionskassette inkorporiert
werden können,
und dass die Nützlichkeit
eines genetischen Markers von dem Wirtssystem abhängt, in
dem der Marker zu exprimieren ist. Selektierbare genetische Marker,
die in dieser Erfindung nützlich
sind, umfassen jedes Gen, das für
ein Produkt kodiert, das für
einen Wachstumsvorteil transformierter Pflanzenzellen oder einen
Wachstumsvorteil transgener Pflanzen, die aus solchen Zellen gebildet wunden,
sorgt. Beispielsweise kann das Produkt Resistenz gegenüber einem
Antibiotikum, einem Herbizid oder einem Stoffwechselinhibitor verleihen.
Selektierbare genetische Marker können chimäre Gene sein, die selektierbare
Phänotypen
wie beispielsweise Resistenz gegenüber Antibiotika, wie z.B. Kanamycin,
Hygromycin, Phosphinothricin, Chlorsulfuron, Methotrexat, Gentamycin,
Spectinomycin, Streptomycin, Methotrexat, Imidazolinonen und Glyphosat,
verleihen. Der selektierbare Marker kann z.B. für Phospinothricin-Acetyltransferase
(pat) (DeBlock et al., EMBO J. 6, 2513–2518 (1987)), Hygromycin-Phosphotransferase
(hpt) (Datta et al., Bio/Technology 8, 736–740 (1990)) und andere Enzyme
wie z.B. Neomycin-Phosphotransferase,
Kanamycin-Phosphotransferase, epsp-Synthase, Acetolactat-Synthase und Mannose-Isomerase
kodieren. Vorzugsweise ist der selektierbare genetische Marker das
bar- oder hpt-Gen. Der genetische Marker kann auch ein Nucleinsäuremolekül sein,
das für
ein Produkt kodiert, das keinen Wachstumsvorteil unter bestimmten
Bedingungen verleiht, jedoch die Identifikation der Pflanzen, das "Screenen auf Pflanzen", ermöglicht,
die den genetischen Marker inkorporiert haben, z.B. sorgt es nicht
für Resistenz
gegenüber
einer zytotoxischen oder zytostatischen Verbindung, kodiert aber
für ein "screenfähiges" Produkt, wie z.B.
Luciferase (luc), grün
fluoreszierendes Protein (GFP) oder β-Glucuronidase (gusA).
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Die
minimale Transgen-Expressionskassette kann eine oder mehrere Nucleinsäuresequenzen,
die für ein
Produkt von Interesse, z.B. ein vorentworfenes synthetisches Polypeptid
(siehe beispielsweise das US-Patent Nr. 5.811.654), ein Enzym, einen
Wachstumsfaktor, ein Zelloberflächenrezeptormolekül, ein Samenspeicherprotein,
ein Fungizid oder Fragmente davon, einen Antikörper oder Fragmente davon,
z.B. Fab', F(ab')2, einkettige
Fv-Fragmente, bispezifische einkettige Fv-Fragmente und Diabodies,
kodiert, in operabler Bindung mit einem Promotor umfassen und kann
weiters einen Operator, einen Enhancer, eine Terminationssequenz, eine
Polyadenylierungssequenz oder andere flankierende Sequenzen, die
die Expression dieses Produkts innerhalb von Pflanzen regulieren,
umfassen. Das Transgen kann jeden beliebigen Promotor umfassen,
der für Expression
in Pflanzenzellen geeignet ist und pflanzlichen oder nicht pflanzlichen
Ursprungs sein kann, z.B. Säugetier-,
bakterielle oder virale Promotoren. Geeignete Promotoren umfassen
beispielsweise einen Samen-spezifischen Promotor, einen Chloroplasten-spezifischen
Promotor, einen Cytosol-spezifischen Promotor, einen Blatt-, Stamm-
oder Wurzel-spezifischen Promotor, einen Lectin-Gen-Promotor; ein
Opin-Synthase-Gen oder einen kleinen Untereinheits-Genpromotor von
Ribulose-1,5-bisphosphat, einen Osmotin-Gen-Promotor, einen Promotor
für Peanut
Chlorotic Streak Caulimovirus (PCLSV), einen Endosperm-spezifischen Promotor,
Isocitrat-Lyase-Promotor, den pea-ENOD12-Nodulin-Promotor und einen Gerste-α-Amylase-Promotor.
Der Promotor kann ein konstitutiver Promotor sein, sodass Expression
durch Pflanzengewebe oder durch Entwicklung oder beides eintritt,
oder ein induzierbarer oder Gewebe-spezifischer Promotor, der differentiell
innerhalb des/der Pflanzengewebes) entweder räumlich oder zeitlich während der
Entwicklung exprimiert wird. Vorzugsweise ist der Promotor ein CaMV-35s-Promotor (Gardner
et al., NAR 9, 2871–2888 (1981)),
ein Ubiquitin-Promotor, ein niedermolekularer Glutenin-Promotor
(Colot et al., EMBO J. 6, 3559–3564 (1987))
oder ein Glutelin-1-Promotor. (Siehe z.B. US 5.352.605; US 5.359.142;
US 5.424.200; US 5.510.474; US 5.614.399; EP 342.926 B1; US 6.020.190;
WO 98/10062; US 5.689.040; US 5.693.506; US 5.391.725; US 5.646.333;
US 5.034.322; US 5.850.018; US 5.837.849; US 5.874.626; US 5.850.019;
US 5.866.763; US 5.866.792; US 5.589.325; US 5.589.331; US 5.859.336
und US 5.830.724, wobei alle Promotoren offenbaren, die in Pflanzen
funktionieren.)
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Das
Transgen kann auch jeden beliebigen Terminator und jedes beliebige
Polyadenylierungssignal umfassen, der oder das für Pflanzenzellen geeignet ist.
Vorzugsweise ist der Terminator ein Nopalin-Synthase- (nos-) Terminator,
ein "Rubisco Small
Subunit"- (ssu-)
Terminator und ein CaMV-Terminator.
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Die
minimale Transgen-Expressionskassette kann für ein chimäres Produkt kodieren, das z.B.
ein Leader-Peptid oder ein Retentionssignal oder beides umfasst.
Geeignete Leader-Peptide umfassen z.B. prokatyotische oder eukaryotische
Leader-Peptide wie z.B. ein Amylase-Leader- oder ein Säugetier-Antikörper-Leader-Peptid.
Geeignete Retentionssignale umfassen z.B. ein endoplasmatisches
Retikulum- (ER-) Retentionssignal wie z.B. ein Peptid mit der Aminosäuresequenz
Lys Asp Glu Leu (KDEL) (Seq.-ID Nr. 1) oder His Asp Glu Leu (HDEL)
(Seq.-ID Nr. 2). Für
KDEL kann die Nucleotidsequenz 5'-AAA
GAT GAG CTC-3' (Seq.-ID
Nr. 3) kodieren, und für
HDEL kann 5' CAT
GAT GAG CTC 3' (Seq.-ID
Nr. 4) kodieren. Andere Sequenzen, die für die KDEL oder HDEL kodieren,
sich jedoch aufgrund von Degeneration des genetischen Codes von
diesen Nucleotidsequenzen unterscheiden, können verwendet werden. Die
für KDEL
oder HDEL kodierende Sequenz kann operabel an eine Kodiersequenz
für ein
Polypeptid gebunden sein, um für
eine Fusion des Polypeptids und des ER-Retentionssignals zu sorgen.
Im Allgemeinen wird das Retentionssignal am C-Terminus des Polypeptids
platziert, wobei es jedoch auch an anderen Positionen in der Polypeptidsequenz platziert
werden kann. Dem ER-Retentionssignal kann eine Linker-Sequenz, wie
z.B. (Gly)4Ser (Seq.-ID Nr. 5) und/oder
Arg Gly Ser Glu (RGSE) (Seq.-ID Nr. 6) vorangehen (Wandelt et al.,
Plant J. 2(2), 181–192
(1992)).
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Ein
Leader-Peptid kann verwendet werden, um das Produkt auf ein bestimmtes
Zellkompartiment zu richten. Das Leader-Peptid kann von einem Säugetier
abstammen und kann ein Maus-Leader-Peptid sein, wie beispielsweise
ein Immunglobulin-Leicht- oder
-Schwerketten-Leader-Peptid. Die Nucleotidsequenz, die in diesem
Konstrukt verwendet wird, um für
das Leader-Peptid zu kodieren, kann für Expression in der Pflanze von
Interesse, vorzugsweise einkeimblättrig, z.B. Reis, Weizen, Mais
oder Gerste, Codon-optimiert sein. Ein bevorzugtes Leader-Peptid,
das gemäß diesem
Aspekt der vorliegenden Erfindung nützlich ist, ist jenes des TMV-Virion-spezifischen
mAb24 (Voss et al., Mol Breed 1, 39–50 (1995)). Modifizierte Formen
können
auch verwendet werden. Wie auch andere Elemente zur Verwendung in
Expressionskassetten gemäß verschiedenen
Aspekten der vorliegenden Erfindung kann die Kodiersequenz für einkeimblättrige Codon-Verwendung
gemäß Angenon
et al. (FEBS 271, 144–146
(1990)) Codon-optimiert sein. Das Leader-Peptid kann Vakuolen- Targetingsignal,
wie z.B. das Leader-Peptid eines Strictosidin-Synthase-Gens, z.B.
jenes der Catharanthus-roseus-Strictosidin-Synthase (McKnight et
al. (1990)) oder der Rauwolfia-serpentina-Strictosidin-Synthase (Kutchan
et al., FEBS Lett 237, 40–44
(1988)), sein. Einen Überblick über Vakuolen-Targeting-Sequenzen
bietet Neuhaus, Plant Physiol. Biochem. 34(2), 217–221 (1996).
Das Leader-Peptid kann ein Chloroplasten-Targetingsignal wie z.B.
die Erbsen-Rubisco-Leader-Peptid-Sequenz (Guerineau et al., NAR
16: 11, 380 (1988)) sein. Eine Überblick über Chloroplasten-Targeting-Peptide
bieten van Heijne et al. (Eur. J. Biochem. 180, 535–545 (1989))
oder Kavanagh et al. (MGG 215, 38–45 (1988)) oder Karlin-Neumann
et al. (EMBO J. 5, 9–13 (1986)).
Das Leader-Peptid kann eine 5'-Sequenz
eines Samenspeicherproteins, zweikeimblättrig oder einkeimblättrig; sein,
die Transport in Proteinkörper
verursacht, wie z.B. der Vicia-fabia-Legumin-B4-Leader (Bäumlein et
al., Mol. Gen. Genet. 225, 121–128
(1991)).
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In
einer Ausführungsform
der Erfindung umfasst die minimale Transgen-Expressionskassette mehr als ein für ein erwünschtes
Produkt kodierendes Transgen. Fachleuten wird bekannt sein, dass,
wenn die Größe der minimalen
Transgen-Expressionskassette
steigt, die Größe der transgenen
Loci auch zum Ansteigen tendiert. Es gibt jedoch keinen Beweis dafür, das Phänomen des
Gen-Verstummens unmittelbar mit der Größe der anfänglichen transformierenden
DNA in Verbindung zu bringen.
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Die
minimale Transgen-Expressionskassette kann aus jedem geeigneten
Vektor, z.B. Plasmid, Phagemid oder viralen Vektor, der auf dem
Gebiet der Erfindung bekannt ist, isoliert werden. Fachleuten sind
mit verschiedenen Arbeitsvorschriften zur Isolierung und Reinigung
von Nucleinsäuremolekülen durchwegs
vertraut (siehe z.B. Rogers & Benedich
in: Plant Molecular Biology Manual, 2. Auflage 1, 1–8 (1994),
hierin zur Gänze
durch Verweis aufgenommen). Beispielsweise kann ein Vektor mit einem
oder mehreren Restriktionsenzymen verdaut und die verdaute DNA in
einem SDS-Polyacrylamidgel oder ein Agarosegel Elektrophorese unterzogen
und das geeignete DNA-Fragment aus dem Gel unter Verwendung des
QuiaquickTM-Gelextraktionssets (Quiagen Ltd. Boundary
Court, Gatwick Road Crawley, West Sussex RH10 2AX (GB)) gemäß den Anweisungen
des Herstellers isoliert oder durch andere Verfahren wie z.B. Flüssigkeitschromatographie
(LC) oder Hochleistungsflüssigkeitschromatographie
(HPLC) usw. gereinigt werden.
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Ein
anderer Aspekt dieser Erfindung ist eine Population transformierter
Pflanzenzellen, die durch das Verfahren dieser Erfindung hergestellt
wird, und die Population transgener Pflanzen, die aus diesen Populationen
transformierter Zellen neu gebildet werden. Fachleuten wird bekannt
sein, dass die Population transgener Pflanzen, die aus der Population
transgener Pflanzenzellen neu gebildet werden, aus nichtidentischen Pflanzen
besteht, da das Transgen nicht notwendigerweise in dieselbe Stelle
in jeder Pflanzenzelle während der
Transformation integriert. Somit ist ein anderer Aspekt dieser Erfindung
eine Population nicht-identischer transgener Pflanzen, die durch
die Verfahren dieser Erfindung hergestellt wurden, worin zumindest
etwa 60% der Population transgener Pflanzen einfache Integrationsmuster
der integrierten Transgen-Kassette aufweisen und das Transgen stabil
exprimieren. Vorzugsweise weisen zumindest etwa 70% der Population
transgener Pflanzen ein einfaches Transgen-Kassetten-Integrationsmuster
auf und exprimieren das Transgen stabil. Zumindest etwa 40% der
transgenen Pflanzen weisen die Transgen-Kassette in höchstens
drei Integrationsstellen integriert auf.
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Die
aus transformierten Pflanzenzellen, die durch Beschuss mit minimalen
Transgen-Kassetten
hergestellt wurden, erhaltenen transgenen Pflanzenlinien weisen
eine reduzierte Häufigkeit
von Neuanordnungs-Ereignissen auf (siehe z.B. die 1, 2 und 3).
In den meisten Pflanzen weisen 1–3 Banden, nachgewiesen an
Southern-Blots von
genomischer DNA, die mit Restriktionsenzymen verdaut wurde, die
eine 6-Basen-Erkennungsstelle
(6-Basen-Schneider) aufweisen, auf die Gegenwart von 1 bis etwa
5 Transgenkopien hin. Linien mit mehr Kopien sind selten. Ohne hier
eine Einschränkung
auf eine bestimmte Theorie zu beabsichtigen, könnte die Integration von Mehrfachkopien
von minimalen Transgen-Expressionskassetten, die keine extensiven
Regionen von Vektorsequenzen enthalten, auf mehrere Arten eintreten.
Erstens könnten
verschiedene Kassetten gleichzeitig an einer beschädigten chromosomalen
Region integrieren, die mehrere DNA-Reparaturkomplexe angezogen
hatte.
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In
solch einem Fall könnten
die Kassetten mit genomischer DNA durchsetzt sein. Zweitens könnten die
Kassetten vor der Integration illegitime Endverbindungen eingehen
und als eine Einheit integrieren, wobei in diesem Fall die Kassetten
zusammenhängend
sein würden.
Schließlich,
wie erst jüngst
von Kohli et al. (Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95, 7203–7208 (1998))
erörtert
wurde, kann ein einzelnes integriertes Transgen Rekombination mit
exogener DNA erfahren, entweder, weil die exogene DNA zu Reparaturkomplexen,
die sich an der Integrationsstelle bilden, hin angezogen wird, oder,
weil Rekombination zwischen homologen Sequenzen im integrierten
Transgen und exogener DNA stattfindet. In Verfahren, die Nucleinsäuremoleküle mit extensiven
Vektorsequenzen verwenden, sind solche homologen Sequenzen üblicherweise
Vektor-Hauptkettensequenzen, doch in diesem Fall muss eine Sequenz
innerhalb der Transgen-Kassette verantwortlich sein. Kohli et al.
(Plant J. 17, 591–601
(1999)) zeigten, dass eine mögliche
kreuzförmige
Struktur, die die TATA-Box des CaMV-35S-Promotors umgibt (der in
manchen der Konstrukte in den Beispielen verwendet wird), einen
Rekombinations-Hotspot bildete, der in mehr als 40% der charakterisierten
Rekombinationsverbindungen eingebunden war.
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SfiI
erkennt die 8-bp-Sequenzen 5'-GGCCNNNNNCCGG-3' (Seq.-ID Nr. 7)
und schneidet die Transgen-Expressionskassetten aus Beispiel 1 vor
ihrer Integration in das Pflanzengenom. Southern-Blots von genomischer
DNA, die aus Pflanzen isoliert war, die mit jeder beliebigen der
in Beispiel 1 offenbarten Transgen-Expressionskassetten transformiert und
mit dem Nicht-Schneider SfiI verdaut worden waren, zeigten typischerweise
eine einzelne Bande, was darauf schließen ließ, dass die Integrationsstelle,
die Region des Pflanzengenoms, in die die Kopien des Transgens integrierten,
im Mittel kleiner als 65 kbp war (1). Die Gegenwart
von Mehrfachbanden nach dem Verdau von genomischer DNA mit anderen
Nicht-Schneidern (Restriktionsendonucleasen, die keine Erkennungsstellen
innerhalb des Transgens vor der Integration in das Pflanzengenom
aufweisen) zeigt jedoch zwei Möglichkeiten
auf: a) Neubildung von Restriktionsenzym-Erkennungsstellen als ein
Resultat von Neuanordnung; oder b) Einfang von genomischer DNA zwischen
transgenen Sequenzen vor oder während
der Integration (siehe z.B. Salomon & Puchta, "Capture of genomic and T-DNA sequences
during double-strand break repair in somatic plant cells", EMBO 17(20), 6086–6095 (1998)). Über die
eingestreute genomische DNA zwischen Transgen-Sequenzen berichteten
früher
bereits Kohli et al. (1998, s.o.) und Pawlowski & Somers, "Transgenic DNA integrated into the oat
genome is frequently interspersed by host DNA", PNAS 95(21), 12106–12110 (1998).
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Darüber hinaus
zeigten Southern-Blots, dass etwa 80% der transgenen Pflanzenlinien
aus Beispiel 1, die aus Zellen gebildet wurden, die mit einer einzelnen
transgenen Kassette, z.B. der hpt-Kassette, beschossen worden waren,
sehr einfache Integrationsmuster (nur eine oder zwei Banden an Southern-Blots
von genomischer DNA, verdaut mit einem seltenen Schneider) präsentierten.
Southern-Blots, hybridisiert mit einer gusA-spezifischen Sonde,
von genomischer DNA aus transgenen Pflanzen; die aus Zellen gebildet
wurden, welche mit gusA- und hpt-Kassetten co-beschossen und für Hygromycin-Resistenz
selektiert worden waren, wiesen ebenfalls einfache Integrationsmuster
auf. Dies zeigt, dass die Gewinnung eines großen Anteils der Pflanzen mit
einfachen Integrationsmustern nicht auf Selektionsdruck zurückzuführen war,
da es keine Selektion auf gusA gab. Dahingegen zeigten Southern-Blots
von genomischer DNA aus Pflanzenlinien, die durch Partikelbeschuss
mit superspiralisierten Plasmiden gebildet worden waren, dass nur
20 bis 30% der Pflanzenlinien einfache Integrationsmuster aufwiesen.
Die hierin dargestellten Resultate zeigen, dass die Verwendung von
unverzweigten minimalen Transgen-Expressionskassetten und nicht
von superspiralisierten oder schwach kontrollierten Plasmiden zur
Bildung transgener Pflanzen mit einfachen Integrationsmustern, geringen
Kopienzahlen und wenigen Fällen
von Transgen-Neuanordnung führt.
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Die
hierin beschriebenen Verfahren für
die Zufuhr und Integration von minimalen Transgen-Expressionskassetten
garantieren auch hohe Expressionsniveaus und Reduktion des Phänomens des
Verstummens. Expressionsanalyse der transgenen Pflanzen dieser Erfindung
in verschiedenen Entwicklungsstadien konnte kein Verstummen von
Transgen nachweisen, das ein häufiges
Phänomen
für Transgene
mit hohen Kopienzahlen ist.
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Transgenexpression
in im Wesentlichen allen transgenen Pflanzen, die durch das Verfahren
dieser Erfindung gebildet wurden, ist stabil und vererbbar. Dies
steht im Gegensatz zu früheren
Berichten, die offenbaren, dass typischerweise etwa 20–30 der
transgenen Pflanzen, die durch Partikelbeschuss mit ganzer Plasmid-DNA
gebildet wurden, geringe Transgen-Expressionsniveaus oder vollständiges Verstummen
von Transgen aufweisen, obwohl manche dieser transgenen Pflanzen
einfache Integrationsmuster zeigen (T. Elmayan & H. Vaucheret, "Expression of single copies of a strongly
expressed 35S transgene can be silenced post-transcriptionally,
Plant Journal 9(6), 787–797
(1996)).
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Obwohl
es eine reduzierte Häufigkeit
von komplexen Neuanordnungsmustern der Transgene in den transgenen
Pflanzen dieser Erfindung gibt (1), kann
die Transgen-Kassette selbst stets Rekombination und Neuanordnung
erleiden. Bestimmte der transformierten Pflanzenlinien, die durch
das Verfahren dieser Erfindung gebildet werden, enthalten Mehrfachkopien
der Transgenkassette am einzigen Locus. In den meisten transgenen
Pflanzen, die durch dieses Verfahren produziert wurden, übersteigt
jedoch die Kopienzahl des Transgens insgesamt nicht die Zahl 3 pro
Genom. Transgene Pflanzenlinien mit einer Kopienzahl von mehr als
drei waren sehr selten.
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Beispiel
1 zeigt die Resultate aus der Transformation von Pflanzenzellen
mit einer minimalen bar-Gen-Transgen-Expressionskassette. Sechsundzwanzig
unabhängige
transgene Pflanzen wurden aus den bar-transformierten Zellen neu
gebildet, und nur drei der 26 präsentierten
komplexe Integrationsmuster des bar-Gens. Alle Kopien des bar-Gens
waren am einzelnen Locus in diesen drei Linien angeordnet, und hohe Phosphinothricin-Acetyltransferase-
(PAT) Expressionsniveaus wurden in diesen drei Linien ebenfalls
nachgewiesen.
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Die
Expression von PAT wurde in allen 26 Linien in verschiedenen Entwicklungsstadien
(Keimling, Pflanze und Vermehrung) der T0-Pflanzen
analysiert, um zu sehen, ob Verstummen von Transgen in jedem Stadium
auftrat. Kein Verstummen des Transgens wurde in den Linien mit geringen
Kopienzahlen oder in den Linien mit ho hen Kopienzahlen festgestellt.
Diese Resultate liefern einen schlüssigen Beweis für die Vorteile der
Bildung von transgenen Pflanzen unter Verwendung der minimalen Sequenzen,
die für
Expression eines Transgens erforderlich sind.
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Manche
der transgenen Pflanzenlinien, unabhängig davon, ob mit einer minimalen
hpt-Transgenkassette oder einer minimalen bar-Transgenkassette transformiert,
weisen ein komplexes Integrationsmuster auf, und in manchen Fällen weisen
die Pflanzenlinien Mehrfachkopien der minimalen Transgen-Expressionskassette,
integriert in denselben Locus, auf. Diese Resultate lassen darauf
schließen,
dass die Mechanismen, die in die Integration von minimalen Transgen-Expressionskassetten
und linearisierten oder superspiralisierten Vektoren eingebunden
sind; zumindest in manchen Fällen ähnlich sind.
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Direkte
DNA-Transferverfahren, insbesondere Partikelbeschuss, sorgt für die gleichzeitige
Zufuhr von vielfachen Nucleinsäuremolekülen, die
für verschiedene
Produkte kodieren, z.B. Produkte landwirtschaftlicher Bedeutung
bis hin zu wirtschaftlich wichtigen Kulturpflanzen. Wurden sie im
Verfahren dieser Erfindung verwendet, so resultierte die gleichzeitige
Zufuhr von zwei minimalen Transgen-Kassetten, d.h. von minimalen hpt-
und gusA-Transgen-Expressionskassetten, durch Partikelbeschuss in
100% Co-Transformation.
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In
Beispiel 1 wurde Partikelbeschuss-vermittelte Transformation verwendet,
um minimale Transgen-Expressionskassetten, die ein Transgen umfassen,
entweder bar oder hpt, zu Reis-Keimlingen zuzuführen. Transgene Pflanzen wurden
dann aus den mit bar und hpt transformierten Reis-Keimlingen neu
gebildet. Annähernd
100% der transgenen Pflanzen, die mittels dieses Verfahrens hergestellt
worden waren, exprimierten die Transgene in allen Entwicklungsphasen.
Keine der transgenen Pflanzen, die durch das Verfahren dieser Erfindung
hergestellt worden waren, zeigte das Phänomen des Verstummens des Transgens.
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Die überraschenden
Resultate der Erfinder zeigten eindeutig, dass die Verwendung von
minimalen Transgen-Expressionskassetten in Kombination mit direkten
DNA- Transferverfahren,
insbesondere mit Partikelbeschuss, die Häufigkeit der Bildung von transformierten
Pflanzen mit Transgenen in geringer Kopienzahl, mit einfachem Integrationsmuster
mit nicht mehr als ein paar Integrationsstellen, mit einer reduzierten
Häufigkeit
an Verstummen des Transgens und mit stabiler Expression des Transgens
in Pflanzen in all ihren Entwicklungsphasen verbessert. Bis heute
konnten die Erfinder weder in einer der transgenen Pflanzen noch
in irgendeinem ihrer Nachkommen, die analysiert wurden, Verstummen
des Transgens detektieren.
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Das
hierin offenbarte Verfahren kann an jeder beliebigen Pflanzengewebezelle
angewandt werden, die durch direkte DNA-Transferverfahren, insbesondere
durch Partikelbeschuss, transformiert werden kann. Solche Pflanzengewebezellen
umfassen z.B. einzelne Zellen, Kallusgewebe (Typ I und Typ II),
Blattscheiben, unreife oder reife Keimlinge, Meristemzellen, Wurzelzellen,
Hypokotylen und Kotyledonen, Protoplasten oder Zellsuspensionen.
Vorzugsweise werden durch die Arbeitsvorschriften intakte Pflanzengewebe
transformiert, z.B. unreife oder reife Keimling-Pflanzenzellen, Kalluszellen (Typ I
und Typ II), Meristemzellen, Blattzellen, Wurzelzellen, Hypokotylen,
Kotyledonen und Sprosszellen. Auch innerhalb des Schutzumfangs dieser
Erfindung werden Nahrungsmittel- und Tierfuttermittelprodukte erwogen,
die die Pflanzen und ihre Nachkommenschaft und Pflanzenteile davon
umfassen. Darüber
hinaus werden auch Pflanzen mit landwirtschaftlichem und industriellem
Mehrwert oder für
alternative Verwendungen erwogen.
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Andere
Aspekte der Erfindung werden Fachleuten klar ersichtlich sein und
müssen
hierin nicht erläutert
werden. Die hierin verwendeten Bezeichnungen und Ausdrücke werden
als Bezeichnungen zur Beschreibung und nicht zur begrifflichen Einschränkung verwendet,
und Fachleute werden erkennen, dass verschiedene Modifikationen
innerhalb des Schutzumfangs der Erfindung möglich sind.
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BEISPIELE
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Beispiel 1
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Genkonstrukte
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Minimale
Expressionskassetten wurden nach Verdau von pWRG 2426 (Cooley et
al. (1995)) mit verschiedenen Kombinationen der Restriktionsenzyme
XhoI und XbaI (bar), SalI und KpnI (hpt) und NotI (gusA) unter vom
Hersteller empfohlenen Bedingungen isoliert. Restriktionsverdaue
für jedes
der drei chimären
Gene wurden unabhängig
voneinander durchgeführt.
Verdau von Plasmid pWRG 2426 (9260 bp) mit XhoI und XbaI ergab drei
Fragmente: ein 1896-bp-Fragment, das das chimäre barGen enthielt, ein 6950-bp-Fragment,
das hpt, gusA und die Vektorsequenzen enthielt, und eine 414-bp-Sequenz,
die zu einem Großteil
den CaMV35S-Promotor enthielt, der das hpt-Gen steuerte. Verdau
von pWRG 2426 mit SalI und KpnI ergab fünf Fragmente: ein 2032-bp-Fragment,
das das chimäre
hpt-Gen enthielt, ein 5787-bp-Fragment,
das das gusA-Gen, den Vektor und die CaMV35S-Sequenz, die das bar-Gen steuerte, enthielt,
und drei kleine Fragmente mit 253 bp, 313 bp und 875 bp. Diese drei
Fragmente enthalten Teile des chimären bar-Gens. Verdau von pWRG
2426 mit NotI ergab zwei Fragmente: ein 2628-bp-Fragment, das das
chimäre
gusA-Gen enthielt,
und den Rest des Plasmids in einem 6632-bp-Fragment. An beiden Seiten
von jeder Genkassette waren ein paar bp von Vektorsequenzen vorhanden.
Die bar-Genkassette enthielt 32 bp vor dem Start des Promotors und
3 bp nach dem Endes des Terminators. Die hpt-Kassette enthielt 24
bp vor dem Start des Promotors und 13 bp nach dem Ende des Terminators.
Die gusA-Kassette enthielt 19 bp vor dem Start des Promotors und
16 bp nach dem Ende des Terminators.
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Pflanzenmaterial
und -transformation
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Die
Verfahren zur Herstellung unreifer Reis-Keimlinge (Oryza Sativa
L.), die minimalen Transgen-Expressionskassetten, die die bar-,
hpt- oder gusA-Sequenzen für
Beschuss enthalten, und die darauf folgende Transformation und Neubildung
von trans formierten Pflanzen werden bereits an anderer Stelle beschrieben (Christou
et al., Bio/Technology 9, 957–962
(1991), hierin zur Gänze
durch Verweis aufgenommen).
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Kurz
zusammengefasst wurden Reis-Keimlinge, die 12–15 Tage alt waren, aus vermehrten
Rispen geerntet und mit 2% Natriumhypochlorit 5 min lang sterilisiert.
Anschließend
wurden sie wiederholt mit sterilem destilliertem Wasser gespült, und
die Spelzen wurden unter aseptischen Bedingungen unter einem Präpariermikroskop
entfernt und auf MS-Medium (Murashige et al., Plant Physiol. 15,
473–497
(1962)) oder CC (Potrykus et al., Theor. Appl. Genet. 54, 209–214 (1979)),
ergänzt
mit 2,4-D bei 0,5 oder 2,0 mg/l, mit der adaxialen Seite in Kontakt
mit dem Medium gegeben (Datta et al., Bio/Technology 8, 736–740 (4990),
s.o., Hartke et al., J. Genet. Breed. 43, 205–214 (1989)).
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Reifer,
keimabgeleiteter Kallus wurde wie von Sudhakar et al., Transgenic
Res. 7, 289–294
(1998), beschrieben hergestellt. Reissamen (Oryza sativa ssp. indica)
unterschiedlichen Ursprungs, CR-5272, M 7, ITA 212, IR 64, KDML
105, Basmati 370, M202, Jodon, Drew, Bengal, Cypress, Gulfmont,
wurden enthülst
und in 70% Ethanol 3 min lang und anschließend in einer 50%igen Natriumhypochloritlösung 30
min lang Oberflächen-sterilisiert
und in sterilem destilliertem Wasser gespült. Die Samen wurden zur Kallusinduktion
in eine Petri-Schale, die 40 ml Kulturmedium enthielt, gegeben:
MS-Basismedium, ergänzt
mit 2,5 mg/l 2,4-D, 3% (Gew./Vol.) Saccharose. Der pH wurde vor
dem 20-minütigen
Autoklavieren bei 120°C
auf 5,8 eingestellt. Die Samen wurden bei Dunkelheit und 27°C inkubiert.
Sich vermehrende reife Keimlinge wurden aus dem Endosperm 5–7 Tage
nach Inkubation abgetrennt. Die Explantate wurden einer osmotischen
Behandlung (Mannit, 0,4 M) 4 h vor und 16 h nach Beschuss unterzogen.
Unmittelbar vor dem Beschuss wurde das Gewebe an einem vorbereiteten
festen Träger
fixiert.
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Goldpartikel
wurden mit den unverzweigten minimalen Transgen-Expressionskassetten
wie für
die superspiralisierten Plasmide gemäß dem Verfahren von Christou
et al. (1991), s.o., beschrieben beschichtet. Für Co-Transformationsversuche
verwendeten die Erfinder ein Molverhältnis von 1:3 von hpt- (selektierbar)
zu gusA- (nicht- selektiert)
Kassetten. Partikelbeschuss und Gewinnung von transgenen Pflanzen
an selektivem Medium, ergänzt
mit Phosphinothricin (PPT) oder Hygromycin (hyg), wurde wie bereits
beschrieben durchgeführt (Klein
et al. (1987); Sudhakar et al. (1998); Vain et al. (1998)). Nach
Beschuss wurden die Explantate auf frischem Medium (ergänzt mit
Hygromycin, 50 mg/l) ausplattiert. Embryoide bildende Kallusjungpflanzen
wurden alle 15 Tage aus der Subkultur der Kalli, die gegen 50 mg/l
Hygromycin resistent waren, erhalten. Selektionsdruck wurde während der
gesamten Proliferations- und
Neubildungsphasen der In-vitro-Kultur aufrechterhalten.
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DNA-Isolierung
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Blatt-DNA
wurde unter Verwendung des Cetyltrimethylammoniumbromid- (CTAB-)
DNA-Extraktionsverfahrens (Rogers et al., Plant Molecular Biology
Manual, 2. Aufl. 1, 1–8
(1994), hierin durch Verweis aufgenommen) isoliert. Kurz zusammengefasst
wurde Blattmaterial in flüssigem
Stickstoff eingefroren und dann in Gegenwart von Seesand und 10
ml heißem
(60°C) CTAB-Puffer
(2% CTAB, 0,1 M Tris-HCl, pH 8,0, 0,02 M Na2-EDTA,
1,4 M CaCl, 1% PVP) gemahlen. Die Aufschlämmung wurde bei 60°C 1 h lang
inkubiert. Phenol/Chloroform/Isoamyl-Alkohol- (25:24:1) Mischung
wurde dann zugesetzt (10 ml). Nach gründlichem Vermischen wurde die
Aufschlämmung
bei 3.000 U/min 10 min lang zentrifugiert, um das feste Material
zu pelletieren. Der Überstand
wurde gesammelt und ein Volumen Isopropanol zugesetzt. Nach 1 h
bei 4°C
wurde die Mischung bei 3.000 U/min 10 min lang zentrifugiert, um
die Feststoffe zu pelletieren. Das Pellet wurde in 70% Ethanol gewaschen,
und nach dem Trocknen wurde es in 1 ml TE (Tris-Cl 10 mM:EDTA 1
mM) aufgelöst.
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Southern-Blot-Hybridisierung
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Aliquoten
von genomischer DNA (5 μg)
wurden über
Nacht mit den geeigneten Restriktionsenzymen (d.h. HindIII, EcoRI,
NheI, ClaI, SfiI, BstXI, SalI oder NcoI) verdaut, die verdaute DNA
wurde durch 0,8% Agarosegel-Elektrophorese fraktioniert und an den
Hybond-N+-Membranen (Amersham) gemäß den Anweisungen des
Herstellers alkalisch geblottet. Die unverzweigten Transgen-Kassetten,
die nur die Kodierregio nen der bar-, hpt- oder gusA-Gene, isoliert
aus pWRG 2426, enthielten, wurden als Sonden verwendet. Kurz zusammengefasst
wurde die bar- oder hpt-Sonden-DNA (25 μg) mit α-32P-markiertem
dCTP (3000 Ci/mmol) durch ein Zufalls-Primerverfahren radioaktiv markiert
(Feinburg & Iogelstein,
Anal. Bioc. 137, 266–267
(1994)). Southern-Blot-Hybridisierung wurde wie zuvor beschrieben
(Kohli et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95, 7203–7208 (1998))
durchgeführt.
Die Filter wurden prä-hybridisiert
und bei 65°C
in Gegenwart von Puffer mit hohem Salzgehalt, pH 6,8 (3 M NaCl/0,1
M Pipes/0,02 M Na2EDTA), Denhardts-Lösung und
Lachssperma-DNA
(100 mg/ml Hybridisierungsmischung) hybridisiert. Die Filter wurden
daraufhin zweimal in 2 × SSC, 0,5%
SDS und einmal in 0,2 × SSC
und 0,5% SDS bei 65°C
20 min lang gewaschen und einem Röntgenfilm ausgesetzt. Autoradiographie
wurde in einer Phosphoimager-Kassette zwei Tage lang mit Kodak-Röntgenfilm XoMat
durchgeführt.
Die Resultate sind in den 1–3 dargestellt.
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Kleintechnische
DNA-Isolierung für
PCR
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DNA
wurde aus einzelnen Blättchen
mit einer Länge
von etwa 2 cm gemäß dem Verfahren
von Edwards et al. ("A
simple and rapid method for the preparation of the plant genomic
DNA for PCR analysis",
Nucleic Acids Research 19(6), 1349 (1991)) isoliert.
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Kurz
zusammengefasst wurde ein einzelnes Blättchen, etwa 2 cm lang, in
flüssigem
Stickstoff eingefroren und in Gegenwart von Seesand und 200 μl Extraktionspuffer
(500 mM NaCl, 100 mM Tris-Cl (pH 8) und 50 mM Na2EDTA
(pH 8)) in einem 1,5-ml-Mikrozentrifugenröhrchen gemahlen,
um ein Homogenat zu erhalten. 20 μl
von 20% SDS wurden dann zum Homogenat zugesetzt und sorgfältig untergemischt.
Weitere 200 μl
Extraktionspuffer wurden zum Homogenat zugesetzt.
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Eine
Phenol/Chloroform/Isoamyl-Alkoholmischung (25:24:1) wurde anschließend zum
Homogenat zugesetzt (400 μl)
und wiederum sorgfältig
untergemischt. Das Homogenat wurde dann in einer Mikrozentrifuge bei
13.000 U/min 5 min lang zentrifugiert. Der Überstand wurde gesammelt und
in ein frisches Röhrchen
gegeben. Das Volumen des Überstands
wurde bestimmt, und ein gleiches Volumen an Isopropanol wurde zum Überstand
zugesetzt, gefolgt von 1/10 Volumen Natriumacetat (pH 4,8). Die
DNA wurde durch Zentrifugation bei 13.000 U/min pelletiert und getrocknet.
Das getrocknete Pellet wurde in 50 ml TE (10 mM Tris-Cl:1 mM EDTA)
aufgelöst,
und DNA-Konzentration wurde durch Laufenlassen der Proben auf einem
0,8%igen Agarosegel geschätzt.
Etwa 50 bis 70 ηg
DNA wurden für
PCR verwendet.
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Da
alle drei Transgen-Kassetten (gusA, hpt und bar) durch CaMV35S-Promotor
gesteuert waren, wurde jede DNA-Sequenz unter Verwendung desselben
Vorwärts-Primers, CaM F1:
5'-TAC AGT CTC AGA
AGA CCA AA-3' (Seq.-ID
Nr. 8), der an den CaMV-Promotor anelliert, amplifiziert. Die bar-
und hpt-Kassetten enthielten den nos-Terminator, daher wurden diese
Gene mit Rückwärts-Primer,
Nos R1: 5'-AAT CAT
CGC AAG ACC GGC AA-3' (Seq.-ID
Nr. 9), der an den nos-Terminator anelliert, amplifiziert. Die gusA-Kassette
wurde unter Verwendung eines Primers, Gus R1: 5'-GGG
AGG CTA CAG ATG CTT TGC-3' (Seq.-ID
Nr. 10), der an das 3'-Ende
der gusA-Kodiersequenz anelliert, amplifiziert. Die Erfinder verwendeten
ein Gesamtreaktionsvolumen von 25 μl, das 50 mM KCl, 10 mM Tris-Cl
(pH 8,2), 1 mM MgCl2, 0,1 mM jeweils von
den vier dNTPs, 100 nM von jedem Primer, 50–70 ng genomische DNA und 1
Einheit von Taq-DNA-Polymerase enthielt. Die Sequenzen wurden unter
den folgenden Reaktionsbedingungen amplifiziert: Denaturierung bei
95°C 5 min lang,
dann 30 Zyklen (94°C,
1 min; 60°C,
1 min; 72°C,
2 min) gefolgt von 7 min Endverlängerung
bei 72°C.
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Die
amplifizierten PCR-Produkte wurden an 0,8% Agarosegel, das EtBr
enthielt, getrennt. Getrennte PCR-Produkte wurden unter UV-Licht
sichtbar gemacht und photographiert. Die verwendet Molekulargewichtsmarker-DNA
war die 1-Kb-Leiter von Pharmacia.
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Enzymtests
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Histochemische
GUS-Tests wurden wie von Jefferson et al., EMBO J. 6, 3901–3907 (1987),
hierin durch Verweis aufgenommen, beschrieben durchgeführt. Hygromycin-Phosphotransferase-
(HPT-) Tests wurden mittels Dünnschichtchromatographie
(DC) gemäß dem Verfahren
von Datta et al., Bio/Technology 8, 736–740 (1992), durchgeführt.
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Blätter (100–150 mg)
wurden in flüssigem
Stickstoff eingefroren und unter Verwendung von Stößel und Mörser gemahlen.
Extraktionspuffer (0,5 M Tris-Cl, pH 7,5, 10% Glycerin, 0,1 M Phenylmethylsulfonylfluorid) wurde
zum gemahlenen Material zugesetzt (100 ml/100–150 mg Gewebe). Die Proben
wurden dann bei 13.000 U/min 5 min lang bei 4°C zentrifugiert, um die Feststoffe
zu pelletieren. Der Überstand
wurde gesammelt (der Rohextrakt) und bei –20°C gelagert. Um auf Hygromycin-Phosphotransferase-Aktivität zu testen, wurden
10 ml Reaktionsgemisch aus 50 mM Tris-Maleat, pH 7,0, 50 mM CaCl2, 0,05 mM ATP, 0,4 ml (g-32P) ATP (10 mCi/ml;
3,000 Ci/mmol), 62 mg Hygromycin-B und 5,6 ml Rohextrakt 30 min
lang bei 37°C
inkubiert. 1 ml der Reaktion wurde dann auf eine PEI-Cellulose-Dünnschichtchromatographie-
(-DC-) Platte (Whatman) aufgetragen. DC wurde in 50 mM Natriumformiat/Ameisensäure, pH
5,4, als Flüssigphase
durchgeführt.
Die Platten wurden trocknen gelassen und Autoradiographie unterzogen.
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Phosphinothricin-Acetyltransferase-
(PAT-) DC-Tests wurden wie von De Block et al., EMBO J. 6, 2513–2518 (1987),
beschrieben durchgeführt.
100 mg Blattgewebe, 50–100 μl Extraktionspuffer
(50 mM Tris-Cl, pH 7,5, 2 mM Na2EDTA, 0,15
mg/ml Leupeptin, 0,15 mg/ml Phenylmethylsulfonylfluorid (PMSF),
0,3 mg/ml Rinderserumalbumin (BSA), 0,3 mg/ml DTT) und 5 mg Seesand
wurden vermischt und in einem Eppendorf-Röhrchen gemahlen, um ein Homogenat
zu bilden. Das Homogenat wurde bei 13.000 U/min 2 min lang zentrifugiert.
Der Überstand
wurde gesammelt und wiederum bei 13.000 U/min 5 min lang zentrifugiert,
um jegliches partikuläres
Material zu entfernen und einen geklärten Extrakt zu bilden. 12,5 μl geklärter Extrakt
wurden mit PPT (0,75 ml von einer 1 mM Stammlösung in 50 mM Tris-Cl, pH 7,5,
2 mM Na2EDTA) und AcCoA (1,25 μl, 14°C) (58,1
mCi/mmol) vermischt. Das Reaktionsgemisch wurde bei 37°C 30 min
lang inkubiert. Eine 6-μl-Aliquote
des Reaktionsgemischs wurde dann auf eine Kieselgel-DC-Platte gesprenkelt.
Aufsteigende Chromatographie erfolgte in einem 3:2-Gemisch von 1-Propanol
und Ammoniumhydroxid (25% Ammoniak) bei 14°C und wurde durch Autoradiographie
(XAR-5-Kodak-Film über
Nacht) sichtbar gemacht.
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Gewinnung
transgener Pflanzen
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Insgesamt
108 voneinander unabhängige,
transgene Reispflanzenlinien, transformiert mit der bar-Kassette,
42 Linien, transformiert mit der hpt-Kassette; und 28 Linien, co-transformiert
mit den hpt- und gusA-Kassetten, wurden erhalten. PCR-Analyse wurde an
allen transgenen Pflanzen durchgeführt, um die Gegenwart der bar-
oder hpt-Kassetten, je nachdem, zu bestätigen. Die Gegenwart der gusA-Kassette wurde durch
PCR und histochemischen GUS-Test überprüft.
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Molekulare
Analyse von bar-Kassetten-Integrationsmustern
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Eine
repräsentative
Probe von 26 transgenen Pflanzen, die die bar-Kassette in sich trugen,
wurde im Detail analysiert. Genomische DNA aus jeder der transgenen
Linien wurde mit HindIII verdaut, die einmal am 5'-Ende der bar-Kassette
schneidet. Fünf
Enzyme, die keine Erkennungsstellen innerhalb der Kassette aufweisen
(Nicht-Schneider),
wurden ebenfalls verwendet (BstXI, ClaI, EcoRI, NheI und SfiI).
Diese Versuche ermöglichten
die Bestimmung der Anzahl transgener Loci in jeder Linie, lieferte
eine Schätzung
der Transgen-Kopienzahl und zeigte die spezifischen Integrationsmuster
für jede
primäre
Transformante auf. Die Resultate sind in Tabelle 1 zusammengefasst.
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Eine
Analyse von Southern-Blots, die an die bar-Sonde hybridisiert waren,
zeigte eine einzelne Bande von etwa 40% (9 von 26) der transformierten
Pflanzenlinien, wenn sie mit HindIII verdaut waren, und etwa 73% der
mit HindIII verdauten Proben präsentierten
sehr einfache Hybridisierungsmuster (zwischen einer und drei Ban den).
Es gab nur drei Pflanzenlinien, die mehr als fünf Hybridisierungsbanden bildeten
(A5-14, A5-15 und A13-2), wenn sie mit HindIII verdaut wurden (Tabelle
1).
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In
drei der Pflanzenlinien (A19-12, A19-14 und A19-17) löste sich
die einzelne Bande, die beobachtet wurde, wenn genomische DNA mit
HindIII verdaut worden war, in zwei Banden auf, wenn die DNA mit
NheI, einem Enzym, das keine Erkennungsstelle in der Kassette aufweist,
verdaut worden war (Tabelle 1). Dies wies darauf hin, dass die einzelne
HindIII-Bande nicht notwendigerweise eine einzelne Transgenkopie
aufwies. Wie in Tabelle 1 gezeigt, erhielten die Erfinder eine einzige
Hybridisierungsbande mit zumindest einem der fünf verwendeten Nicht-Schneider-Enzyme,
unter Ausnahme der Linien A13-2 und A19-7. Dies wies darauf hin,
dass in Fällen
von Mehrfachkopie-Integrationsereignissen alle integrierenden Kopien
an einem einzelnen transgenen Locus verblieben.
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1 zeigt
einen Southern-Blot von genomischer DNA für acht repräsentative Linien, die mit SfiI
oder HindIII verdaut worden waren und die bar-Kodiersequenz sondierten.
Die Anzahl an Banden, die nach HindIII-Verdau erhalten wurden, lagen
im Bereich von 1 bis 7, doch SfiI-Verdau (der nicht innerhalb der
Kassette schneidet) produzierte in allen Fällen eine einzige Bande, was
auf Kassettenintegration an einer einzelnen Stelle hinweist.
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Molekularanalyse
von hpt-Kassetten-Integrationsmustern
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Analyse
von transgenen Pflanzen, die die hpt-Kassette in sich tragen, zeigte
sogar noch einfachere Integrationsmuster. 2 zeigt
einen Southern-Blot von genomischer DNA aus 15 repräsentativen
Linien der 42 gebildeten Linien. Die DNA wurde mit SalI verdaut,
das eine einzelne Stelle am 3'-Ende
der Kassette proximal zum 3'-Ende des nos-Terminators
aufweist. Acht Linien zeigten eine einzige Bande, vier zeigten zwei Banden
und zwei Linien zeigten Mehrfachbanden (mehr als fünf). Sechs
Linien, die die hpt-Kassette in sich trugen, wurden unter Verwendung
der Nicht-Schneider
BstXI, ClaI, EcoRI, NheI und SfiI näher analysiert. Die Erfinder
erhielten eine einzige Bande in jeder der sechs Linien mit zumindest
einem der Nicht-Schneider.
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Molekularanalyse
von gusA-Kassetten-Integrationsmustern
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Schließlich analysierten
die Erfinder gusA-Kassetten-Integrationsmuster, die aus Co-Transformation mit
getrennten unverzweigten minimalen hpt- und gusA-Kassetten resultierten. 3 zeigt
einen Southern-Blot von genomischer DNA aus 18 repräsentativen
Linien, die mit NcoI verdaut wurden, das an einer einzigen Stelle
nahe des 5'-Endes der gusA-Kodierregion
schneidet, und an gusA-Sonde hybridisierten. Die Erfinder erkannten,
dass etwa 50% der Linien eine einzige Bande hervorbrachten und dass
keine der Linien mehr als vier Banden bildete. 13 der 18 Linien
zeigten einfache Integrationsmuster. Die Beobachtung solch einfacher
Integrationsmuster sowohl für
selektierte als auch nicht-selektierte Transgen-Kassetten weist
darauf hin, dass die Muster aus der Natur des exogenen DNA-Fragments
resultieren und nicht aus dem Selektionsdruck, der während der
Pflanzenneubildung entsteht und starke Expressoren mit einfachen
Transgenstrukturen begünstigen
könnte.
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Analyse von
Transgenexpression
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PAT-
und HPT-Dünnschichtchromatographie-Tests
wurden durchgeführt,
um Expression der bar- und hpt-Gene in verschiedenen Entwicklungsstadien
zu überprüfen. Blattproben
wurden in drei Entwicklungsstadien geerntet: a) wenn die Pflanze
aus dem Bewurzelungsmedium in den Boden umgepflanzt wurde; b) 40–45 Tage
nach der Übertragung
in den Boden (vor der Blüte);
und c) 70–90
Tage nach der Übertragung
in den Boden (nach der Blüte).
Die Erfinder wiesen PAT- und HPT-Aktivitäten in allen
drei Stadien nach. Sie verwendeten den histochemischen GUS-Test (Jefferson et
al. (1987), s.o.), um GUS-Aktivität in Kalluslinien nachzuweisen, und
beobachteten GUS-Aktivität
in allen außer
zwei Linien (Nip-1 und Nip-14), die mit der gusA-Genkassette transformiert
waren. Expression wurde über
die R4-Bildung von
transgenen Pflanzen überwacht,
und Transgenexpression blieb in allen Linien stabil. Tabelle
1 Zusammenfassung
von Southern-Blot-Resultaten für
transgene Linien, die die bar-Expressionskassette enthalten
- nb,
- nicht bestimmt
-
Beispiel 2 Co-Integration
und Co-Expression von Mehrfach-Transgenen
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Transgen-Integration
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Fünf verschiedene
Transgene in Form von minimalen Transgen-Kassetten wurden in Reisgewebe über Partikelbeschuss
wie oben beschrieben co-transformiert. Die Transgen-Kassetten umfassten
einen genetischen Marker, d.h. Phosphinothricin-Acetyltransferase (bar), β-Glucuronidase
(gusA), Hygromycin-Phosphotransferase (hpt), Glühwürmchen-Luciferase (luc) oder
Anthranilatsynthase (as), einen Promotor und einen Terminator. Die
bestimmten Komponenten der verschiedenen, in diesen Versuchen verwendeten
minimalen Transgen-Kassetten sind in Tabelle 2 gezeigt.
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Transgene
Pflanzen wurden auf Hygromycin-Resistenz selektiert und wurden unter
Verwendung von PCR und Southern-Blots analysiert, um die Anzahl
an unabhängigen
Transformationsereignissen, die Häufigkeit von Co-Integration
von 2 oder mehr der fünf
Transgene und die Integrationshäufigkeit
von jedem der Transgene zu bestimmen. Die Expression der verschiedenen
Transgene wurde auch getestet.
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Die
Tabellen 3a, 3b und 3c fassen die Integrations- und Co-Integrationshäufigkeiten
der verschiedenen Transgene zusammen. PCR- und Southern-Blot-Analysen
wurden verwendet, um die Integration der Transgene innerhalb des
Pflanzengenoms zu analysieren.
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Tabelle
2: Die für
Transformation verwendeten minimalen Transgen-Kassetten
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Achtunddreißig unabhängige transgene
Pflanzen, die zwei oder mehr verschiedene Typen an Transgen-Kassetten
integrierten, wurden nach der Co-Transformation mit den fünf minimalen
Transgen-Kassetten durch Partikelbeschuss und Selektion auf Hygromycin-Resistenz
gewonnen.
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Tabelle
3a zeigt die Gesamtanzahl und die Prozent der transgenen Pflanzen,
die 2, 3, 4 oder 5 Transgene, integriert in ihr Genom, enthielten.
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Tabelle
3b zeigt die Integrationshäufigkeit
von jedem Transgen.
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Tabelle
3c zeigt die verschiedenen Kombinationen von integrierten Transgenen
und die Häufigkeit,
mit der jede Kombination in den 38 Pflanzen gefunden wurde. Eine
Vielfalt an unterschiedlichen Transgen-Kombinationen wurde nachgewiesen.
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Tabelle
3a Co-Transformationshäufigkeit
von 2 oder mehr Transgenen
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Tabelle
3b Integrationshäufigkeit
für jedes
Transgen
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Tabelle
3c Integrationshäufigkeit
von verschiedenen Transgen-Kombinationen
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Transgen-Expression
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Expression
von allen fünf
Transgenen wurde auf mRNA-Ebene unter Verwendung von RT-PCR oder Northern-Blots
bestimmt. Alle Transgen-Produkte, außer Anthranilat-Synthase, wurden
auf Protein-Ebene durch Testen auf Enzymaktivität unter Verwendung von Standardverfahren
getestet. Nachdem Expression von jedem der Transgene in den verschiedenen
Pflanzen bestimmt worden war, wurden die Resultate tabellarisch dargestellt,
um die Häufigkeit
von Co-Expression der Transgene in jeder Pflanze zu bestimmen. Vierundzwanzig
der achtunddreißig
transgenen Pflanzen (63%) co-exprimierten zumindest zwei integrierte
Transgene.
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Tabelle
4a zeigt die Häufigkeit
von transgenen Pflanzen, die zwei oder mehr integrierte Transgene co-exprimieren,
unabhängig
von der Identität
des Transgens.
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Tabelle
4b zeigt die Expressionshäufigkeit
für jedes
der integrierten Transgene.
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Tabelle
4c zeigt die Anzahl der 38 unabhängigen
Pflanzenlinien, die verschiedene Kombinationen der fünf Transgene
exprimieren.
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Tabelle
4a Co-Expression multipler Transgene
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Tabelle
4b Häufigkeit
unabhängiger
Linien, die spezifische Transgene exprimieren
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Tabelle
4c Häufigkeit
von Co-Expression von verschiedenen Transgen-Kombinationen
