DE60033512T2

DE60033512T2 - Verfahren zur Herstellung einer genetisch-verändereten Pflanze

Info

Publication number: DE60033512T2
Application number: DE60033512T
Authority: DE
Inventors: Robert David Hall; Tjitske Riksen Bruinsma; Guy Weyens; Jean Lathouwers; Marc Lefebvre
Original assignee: SES Europe NV SA
Current assignee: SES Europe NV SA
Priority date: 2000-07-17
Filing date: 2000-10-12
Publication date: 2007-10-31
Anticipated expiration: 2020-10-13
Also published as: ATE354664T1; ES2281338T3; EP1174513B1; DE60033512D1; EP1174513A3; EP1174513A2

Description

GEBIET DER ERFINDUNG
Diese Erfindung bezieht sich auf ein Verfahren zur Erlangung einer genetisch veränderten Pflanze. Noch genauer bezieht sich die Erfindung auf ein Verfahren zur genetischen Transformation von Pflanzenzellen, die Wiederherstellung von ganzen Pflanzen aus solchen transformierten Pflanzenzellen.
Besonders, aber nicht ausschließlich, hängt die Erfindung mit einem Verfahren für das Erhalten einer genetisch veränderten Pflanze vom Typ Beta vulgaris zusammen.
Diese Erfindung hängt zusammen mit neuen, genetisch modifizierten Pflanzen, die bevorzugt durch besagtes Verfahren erhalten werden.
HINTERGRUND DER ERFINDUNG
Pflanzen sind anfällig für Krankheiten verursacht durch Organismen wie zum Beispiel Viren, Parasiten, Insekten, Nematoden oder durch chemische Produkte. Diese Anfälligkeit besitzt große ökonomische Konsequenzen mit geschätzten Verlusten von mehreren Milliarden Dollar jedes Jahr.
Alternativ, aber auch gemeinsam mit dem Gebrauch von chemischen Produkten wie zum Beispiel Herbiziden und Insektiziden, sind pflanzengenetische Transformations-Techniken vorgeschlagen worden, dieses Problem zu überwinden. Das Endziel dieser Techniken ist, genetisch umgewandelte Pflanzen zu erhalten. Zu diesem Zweck muss das Gen von Interesse in die Pflanzenzellen transferiert werden. Stabil umgewandelte Pflanzenzellen, das heißt, Pflanzenzellen, die das besagte Gen von Interesse integriert haben in ihrem Genom, müssen dann ausgewählt werden und müssen für die Neubildung der vollständigen Pflanzen verwendet werden.
Zwei Parameter sind kritisch für den Erfolg der genetischen Transformations-Techniken: die Transformations-Frequenz von Pflanzenzellen, welche hoch sein muss und die Kapazität der transformierten Zellen, neue vollständige Pflanzen zu bilden.
Die Transformations-Techniken können klassifiziert werden in physikalische DNA-Zuführungsmethoden wie zum Beispiel Elektroporation, PEG-vermittelte DNA-Aufnahme, Biolistik und Methoden, die auf Agrobacterium-vermitteltem DNA-Transfer basieren.
Jedoch weisen alle gegenwärtigen Techniken als gemeinsamen Nachteil die Benutzung prokaryotischer oder Plasmid-basierter Nukleotid-Sequenzen auf, der mit dem Gen von Interesse für die Auswahl der transformierten Pflanzenzellen verbunden ist.
Zum Beispiel beschreibt die internationale Patentanmeldung WO 95/10178 ein Verfahren für die genetische Transformation von einer Pflanze durch die Einführung eines DNA Konstruktes, das ein auswählbares Markergen einschließt, in eine Schließzelle der Pflanze, wobei die Schließzelle vor der Neubildung in einen Protoplasten umgewandelt wird.
Die Transformation wird an einer Zellpopulation durchgeführt, die Schließzellen enthält. Das komplexe Verfahren zeigt jedoch mehrere Beeinträchtigungen auf, da das vererbbare Material eine Plasmid-DNA ist, die in E.coli hergestellt, gereinigt und in vollem Umfang benutzt wurde. Für ein direktes DNA-Transfer Verfahren können irgendeine Region oder die gesamte Plasmid-DNA beständig in das Pflanzengenom integriert werden. Dies bedeutet, dass der selektierbare Marker und die Zieltransgene, die ein Teil oder die gesamte bakterielle Plasmid-Sequenz (enthält bakteriell-antibiotisch auswählbare Marker wie zum Beispiel nptIII) darstellen, zusammen oder sogar getrennt in unterschiedliche genomische Stellen integriert werden können. Außerdem können die Ränder des Gens von Interesse, das in das Genom der Pflanze integriert werden soll, der Aktion von Exonukleasen unterworfen sein.
Die Integration von solchen prokaryotischen oder Plasmid-basierten Nukleotid-Sequenzen in das Pflanzengenom kann zu Pflanzenerkrankungen führen. Folglich besteht eine Notwendigkeit für genetisch veränderte Pflanzen, die nicht die auswählbaren Marker oder andere Gene, die von heterologen Spezies herrühren, aufnehmen, außer der genetischen Sequenz von Interesse.
Fu et al (2000, Transgenic Research 9: 11–19) offenbaren den Beschuß von Reisgewebe mit einem linearen DNA-Fragment, das aus einem Plasmid isoliert wurde, das mit einer minimalen Genexpressions-Kassette (Promotor, offener Leserahmen und Terminator) übereinstimmt. Die Transformation mit solchen minimalen Konstrukten resultiert vorwiegend in 'einfachen' Integrationsereignissen und einer niedrigen Frequenz von Transgen-Umlagerungen. Die Genexpression wurde erhalten, jedoch verbleiben einige Nachteile, wenn dieses Verfahren benutzt wird.
Holm et al (2000, Transgenic Research 9: 21–32) offenbaren die Transformation von Gerste durch Mikroinjektion in isolierte Zygoten-Protoplasten. Die Genexpression wurde nur selten erreicht.
ZIELE DER ERFINDUNG
Die vorliegende Erfindung zielt darauf ab, ein Verfahren bereitzustellen für die genetische Transformation von Pflanzenzellen mit einer genetischen Sequenz von Interesse und für die Neubildung von ganzen Pflanzen aus auf diese Weise erhaltenen transformierten Zellen, was einfach benutzt werden kann und das nicht die Nachteile des Standes der Technik aufzeigt.
Die vorliegende Erfindung zielt darauf ab, solch ein Verfahren für die genetische Transformation von Pflanzenzellen bereitzustellen, unter Benutzung von Techniken, die in einer genetisch veränderten Pflanze resultieren, welche frei oder im Wesentlichen frei ist von prokaryotischen oder Plasmid-basierten Nukleotidsequenzen (insbesondere auswählbare Marker, die eine antibiotische Resistenz gestatten).
KURZDARSTELLUNG DER ERFINDUNG
Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf ein Verfahren für das Erhalten einer genetisch veränderten Pflanze, umfassend die Schritte der:

(i) Transformation von Protoplasten, bevorzugt erhalten aus einer Umwandlung von stomatalen Zellen, durch Einführung eines vererbbaren Materials in die Protoplasten von der Pflanze, um Transformanten zu erhalten, die mindestens eine Kopie von dem vererbbaren Material pro Protoplast enthalten,
(ii) Auswahl eines stabilen Transformanten und
(iii) Neubildung von Pflanzenzellen oder einer ganzen Pflanze aus den Transformanten,

Mit „Nukleotidsequenz-Kassette" ist eine Sequenz gemeint, die nur aus einer Nukleotidsequenz von Interesse besteht, die in das Genom von der Pflanze eingefügt wird, verbunden mit einem oder mehr Promotoren und terminalen Nukleotidsequenzen und möglicherweise regulatorischen Sequenzen, die ausreichen, eine effiziente Expression der Sequenz von Interesse in der Pflanze zu erhalten.
Vorzugsweise ist die Nukleotidsequenz-Kassette durch klassische Vervielfältigungs-Verfahren erhalten worden, unter Benutzung von Nukleotidsequenzen als Matrizen für den Beginn der genetischen Vervielfältigung.
Zweckmäßigerweise ist die Vervielfältigungs-Technik gewählt aus der Gruppe bestehend aus PCR, RTPCR, LCR, CPT, NASBA, ICR oder DNA-Vervielfältigungs-Techniken mittels Avalanche-Dioden, die dem Fachmann gut bekannt sind.
Zweckmäßigerweise werden die Matrizen vor der Transformation der Protoplasten durch Benutzung spezifischer, bekannter genetischer Werkzeuge, wie zum Beispiel Nuklease oder Restriktionsenzyme entfernt, und die resultierende Nukleotid-Kassette ist frei oder im Wesentlichen frei von anderen Nukleotidsequenzen (von bakteriellem oder anderen Ursprung) außer den Sequenzen von Interesse.
Mit dem Genom einer Pflanze, das frei oder im Wesentlichen frei ist von anderen prokaryotischen oder Plasmid-basierten Nukleotidsequenzen, insbesondere auswählbare Marker, die Antibiotika-Resistenz kodieren, ist die Tatsache gemeint, dass das Genom der Pflanze nicht eine regulatorische oder kodierende Nukleotidsequenz von heterologem Ursprung umfasst, außer der Kassetten-Sequenz, die in das Genom der Pflanze eingefügt wird und mit Ausnahme von wenigen Abschnitten der Nukleotidsequenzen von Prokaryoten, welche nicht komplett von der Nukleotidsequenz-Kassette nach der Vervielfältigung entfernt wurden.
Die Abschnitte der Nukleotidsequenzen umfassen weniger als 50 Nukleotide, vorzugsweise weniger als 20 Nukleotide, insbesondere weniger als 10 Nukleotide, die nicht prokaryotische Polypeptide umfassen oder Promotor-/Operator-Sequenzen von prokaryotischem Ursprung.
Das Verfahren gemäß der vorliegenden Erfindung umfasst vorzugsweise auch (als vorbereitende Schritte) die Schritte zur Bereitstellung eines intakten Gewebes von der Pflanze, das stomatale Zellen enthält und der Umwandlung der stomatalen Zellen in Protoplasten durch enzymatische Verdauung der Zellwände, wobei die Schritte vor der Transformation der Protoplasten durchgeführt werden, und wobei das Pflanzengewebe vorzugsweise ruhendes Blattgewebe oder Blattepidermis ist.
Vorzugsweise stimmen die stomatalen Zellen mit einer Zellpopulation überein, die Schließzellen enthält oder mit einer Zellpopulation, die Schließzellen angereichert enthält und der Schritt der Transformation der Protoplasten zweckmäßigerweise an einer Suspension von Protoplasten durchgeführt wird.
Vorzugsweise stimmt der Schritt der Transformation der Protoplasten mit der bekannten PEG-vermittelten genetischen Transformations-Technik überein (Krens et al., Nature 296, 72–74 (1982)) und umfasst das Mischen der Suspension der Protoplasten und des vererbbaren Materials, vorzugsweise ein Amplikon mit einer Konzentration von mehr als 1 μg, vorzugsweise zwischen 10 und etwa 100 μg DNA/1 × 10⁶ Protoplasten, wie beschrieben in dem Beispiel 10 des Dokumentes WO 95/10178, hierin durch Verweis eingetragen.
Vorzugsweise ist die Pflanze Beta vulgaris, welche bekannt ist, eine bei sehr niedriger Frequenz transformierbare Spezies zu sein. Gemäß der Erfindung schließt die Bezeichnung Beta vulgaris Zuckerrübe, Futterrübe, Rote Beete und Mangold ein.
Die Nukleotidsequenz von Interesse, die in die Pflanze oder Pflanzenzelle eingeführt wird, ist vorzugsweise ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Genen involviert in einer Resistenz gegenüber Pflanzenviren (insbesondere BNYVV-Resistenz in Zuckerrüben), Resistenz gegenüber Pflanzenparasiten (Nematoden, Pilze oder Insekten), Resistenz gegenüber Herbiziden (vorzugsweise Glyphosat, Imidazolinone wie Glufosinat und/oder Acetochlorid-Resistenz), Insektiziden oder Fungiziden, oder involviert in den Metabolismus von Kohlehydraten (verbesserte Produktion von Kohlehydraten, Polysacchariden, Oligosacchariden oder Monosacchariden, wie zum Beispiel Stärke, Fruktane, Glukose, Fruktose, ...)
Ein weiterer Aspekt der vorliegenden Erfindung bezieht sich auf eine Pflanze oder Pflanzenzelle, vorzugsweise eine Zuckerrübe (Beta vulgaris Pflanze oder Pflanzenzelle), in ihrem Genom ein vererbbares Material umfassend, das nur aus einer Nukleotidsequenz-Kassette besteht, wobei die Nukleotidsequenz-Kassette eine Nukleotidsequenz von Interesse aufweist, die in die Pflanze eingefügt werden soll, die verbunden ist mit einem oder mehreren Promotoren und terminalen Nukleotidsequenzen und möglicherweise regulatorischen Sequenzen, die ausreichen, eine effiziente Expression der Sequenz von Interesse in der Pflanze zu erhalten, wobei die Pflanze oder Pflanzenzelle frei ist oder im Wesentlichen frei ist von anderen heterologen prokaryotischen oder Plasmid-basierten Nukleotidsequenzen, insbesondere auswählbare Marker, die eine Antibiotikaresistenz kodieren.
Zweckmäßigerweise ist die Pflanze oder Pflanzenzelle, vorzugsweise eine Zuckerrübe (Beta vulgaris Pflanze oder Pflanzenzelle), durch das Verfahren gemäß der Erfindung erhalten worden.
Ein letzter Aspekt der Erfindung betrifft transgenes Pflanzengewebe von der Pflanze, welches vorzugsweise ausgewählt wird aus der Gruppe bestehend aus Früchten, Stängeln, Wurzeln, Knollen oder Samen.
Die Erfindung wird ausführlich in dem folgenden nicht beschränkten Beispiel in Bezugnahme auf die beiliegende Figur beschrieben.
KURZE BESCHREIBUNG DER ZEICHNUNGEN
1 stellt schematisch die Konstruktion von einer Genkassette dar, die in dem Verfahren gemäß der Erfindung benutzt wird, und den Ort und die Richtung der Primer für die Vervielfältigung von der Genkassette.
2 stellt eine Karte von pS63 dar.
AUSFÜHRLICHE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG
ISOLIERUNG VON PROTOPLASTEN AUS SCHLIESSZELLEN
Es wurde die Zuckerrüben-Züchtungslinie Bv-NF benutzt, erhalten aus einem Züchtungsprogramm bei Plant Research International, Niederlande.
Ein früher entwickeltes und komplett optimiertes Protokoll (beschrieben in dem Dokument WO 95/10178) für die Isolierung und Reinigung von Schließzellen-Protoplasten wurde benutzt, um eine große Anzahl von >90 % reinen Schließzellen-Protoplasten zu erhalten. Für jede Isolierung wurden 1,5 g Rippen-befreites Blattmaterial von 4 Wochen alten Zuckerrüben-Schößling-Kulturen geerntet. Dieses wurde in einem Mixgerät (Waring blender) bei maximaler Geschwindigkeit (23000 rpm) für etwa 60 Sek. in einem 250-ml Metallbecher, der 50 ml steriles Leitungswasser (4 °C) enthielt, gemixt. Die sauberen epidermalen Bruchstücke wurden auf einem 297-μm Nylonnetz (Nybolt, Zürich, Schweiz) gesammelt und mit 200 ml sterilem Leitungswasser gewaschen, bevor sie für 1 Stunde auf eine 9-cm Petri-Schale übertragen wurden, die 10 ml Vorinkubationsmedium enthielt (Krens et al., 1990). Zum Zurückgewinnen der Epidermis-Fraktion wurde die Suspension für 1 Min. bei 55 × g zentrifugiert und der Überstand verworfen. Die Zellwandverdauung fand über Nacht statt in einem Gesamtvolumen von 50 ml CPW9M Medium, angereichert mit 0,5 % (w/v) Cellulase RS und 3 % (w/v) Macerozyme R10 (beide Yakult Honsha, Tokyo, Japan), pH 5,8 in 10 6-cm Petri-Schalen (5 ml/Schale). Die Verdauung fand in der Dunkelheit bei 25 °C durch leichte Bewegung statt.
Nach etwa 16 Std. wurden im Allgemeinen viele Protoplasten schwimmend nahe der Oberfläche des Mediums gesehen. Nach leichter Bewegung der Suspension unter Benutzung einer sterilen Pipette, um zusätzliche Protoplasten freizusetzen, die noch immer an den Epidermis-Bruchstücken anhaften, wurden die Verdauungsansätze gesammelt und durch 297- und 55-μm Filter (Nybolt, Zürich, Schweiz) passiert. Das Filtrat wurde mit einem gleichen Volumen von iso-osmotischem Percoll gemischt, das 15 % (w/v) Sucrose enthält (Percoll15S), und auf 12 × 12-ml Zentrifugenröhrchen (Greiner, TC-Qualität) aufgeteilt. In jedes Röhrchen wurden zuerst 1 ml CPW15S (Krens et al., 1990, zur Vervollständigung) und dann 0,5 ml 9 % (w/v) Mannitol, das 1 mM CaCl₂ (9M) enthält, vorsichtig auf die Oberfläche der Protoplastensuspension geschichtet. Nach Zentrifugation bei 55 × g für 10 Min. (MSE Centaur 2, Fisons UK, Ausschwing-Rotor) wurden die lebenden Schließzellen mittels der 9M- Schicht gesammelt. Zum Konzentrieren der Protoplasten wurden diese Schichten vereinigt und mit Percoll15S gemischt, um ein Endvolumen von 16 ml zu erhalten. Dieses wurde dann auf zwei Zentrifugenröhrchen aufgeteilt, wieder wie oben angeführt geschichtet und erneut zentrifugiert. Vorsichtiges Entfernen von der 9M-Schicht lieferte die angereicherte Schließzellenfraktion, welche routinemäßig 70–95 % sauber war. Die Ausbeuten an Schließzellen-Protoplasten sind routinemäßig 1 – 3 × 10⁶/g Blattgewebe.
TRANSFORMATION, PROTOPLASTENKULTUR UND AUSWAHL
Transformationen wurden in 12-ml Zentrifugenröhrchen durchgeführt, wobei jedes etwa 1 × 10⁶ Protoplasten, suspendiert in 0,75 ml 9M-Medium, enthält. PCR-DNA oder Plasmid-DNA (50 μg) wurde hinzugefügt und unmittelbar nach dem Mischen wurden 0,75 ml PEG-Medium (40 % PEG 6000, gelöst in F-Medium (Krens et al., 1982, zur Vervollständigung), tropfenweise hinzu gegeben. Nach leichtem, aber sorgfältigen Mischen wurde die Suspension bei Raumtemperatur für 30 Min. mit gelegentlicher Bewegung inkubiert. Anschließend wurden zur Entfernung von PEG in 5-Minuten Intervallen 4 × 2-ml Aliquots F-Medium hinzu gegeben. Nach der Zentrifugation für etwa 5 Min. bei 55 × g wurde der Überstand verworfen und das Protoplasten-Pellet in 9M resuspendiert und erneut zentrifugiert. Die Zellen wurden zuletzt für die Zählung in 1 ml 9M resuspendiert. Protoplasten wurden in Ca-Alginat (62500/ml) eingebettet und in modifiziertem, flüssigen K8P-Medium (Hall et al., 1993, zur Vervollständigung) bei 28 °C in der Dunkelheit kultiviert. Zur Auswahl von stabil transformierten Zellen wurde nach 7 Tagen Bialaphos hinzu gegeben, um eine Endkonzentration von 200 μg/l zu erhalten. An Tag 18 wurden die Alginat-Scheiben in 3-mm Streifen geschnitten und in PG1B-Medium (de Greef und Jacobs, 1979; enthaltend 2 mg/l Glycin und 1 μM BAP) transferiert, das mit 250 μg/l Bialaphos ergänzt wurde und mit 0,9 % Agarose (Seaplaque, Duchefa, Haarlem, Niederlande) verfestigt. Zwei Wochen später waren die resistenten Calli aus dem Alginat herausgewachsen, um Kolonien von ± 1 mm Durchmesser zu bilden. Diese wurden auf frische Auswahlplatten transferiert und für weitere 2 Wochen kultiviert. Die Calli wurden hinterher subkultiviert in nicht-selektivem De Greef und Jacobs-Medium, ergänzt mit 2 mg/l Glycin, 1 mg/ml BAP und 2 mg/l NAA (PNB) und mit 0,9 % Agar (Daichin, Brunschwig chemie, Amsterdam, Niederlande) verfestigt, und zu der Lichtquelle (3000 Lux, Philips TLD fluoreszierend, 16 Std./8 Std. Dunkelheit) bei 25 °C überführt. Die Kulturen wurden alle 14 Tage überführt und die Neubildung geschah mittels somatischer Embryogenese innerhalb von 4 Wochen.
Somatische Embryos wurden uberführt in De-Greef und Jacobs-Medium, ergänzt mit 0,25 mg/l BAP und 0,5 S1000-Agar (B&V. Gattatico, Italien), auf welchem sie sich zu Pflanzen für die Durchwurzelung entwickelten und zum Überführen in Erde.
PCR-DNA PRÄPARATION
Anfängliche Transformationen wurden unter Benutzung von Kontroll-Plasmid-DNA, die durch das Standardverfahren hergestellt wurde und DNA hergestellt mittels PCR, durchgeführt. Die PCR-Fragmente, die für die Protoplasten-Transformationen benutzt wurden, wurden mit Standard-PCR-Techniken unter Benutzung einer Auswahl von möglichen PCR-Primern hergestellt. Vier verschiedene Primer (2 Vorwärts- und 2 Rückwärts-) wurden für das Plasmid pPG 5 (7347 bp) entworfen, um die 4 möglichen Fragmente anzufertigen, die alle die gesamte Genkassette für die PAT- und GUS-Gene, ungeachtet der F/R-Primer Kombination, enthielten. Der erste Vorwärts-Primer stimmt überein mit einer Sequenz nahe am Start des 35S Promotors von dem PAT-Gen (f1), beginnend bei Position 7277 mit der Sequenz 5`-GGCTCGTATGTTGTGTGGAA. Der zweite Vorwärts-Primer beginnt zusätzliche 200 bp vor dem Promotor (f2) bei Position 7092 bp und hat die Sequenz 5`-GAGTCAGTGAGCGAGGAAGC. Der erste Rückwärts-Primer stimmt überein mit einer Sequenz benachbart zu dem Terminator von dem GUS-Gen (r1) und beginnt bei Position 4788 bp mit der Sequenz 5`-CTGCAAGGCGATTAAGTTGG. Der zweite Rückwärts-Primer besitzt zusätzliche 200 bp auf der Terminator-Seite (r2) und beginnt bei Position 4913 bp mit der Sequenz 5`-GCACAGATGCGTAAGGAGAA. Die Orte und Richtungen von den Primern sind in 1 gezeigt. Mit diesen Primern konnten vier Fragmente hergestellt werden, nämlich: f1/r1, f1/r2, f2/r1 und f2/r2.
Die Reaktionen wurden durchgeführt unter Benutzung von 35 Zyklen mit 1 Min. Denaturierung bei 94 °C, 1 Min. Annealing bei 60 °C, 5 Min. Elongation bei 72 °C, mit einer endgültigen Extra-Elongationsperiode von 5 Min..
Nach der PCR-Reaktion wurde die DNA durch Fällung konzentriert und in einem kleinen Volumen sterilen Wassers wieder gelöst. Die DNA-Konzentration wurde bestimmt durch die Messung von OD 260 nm und die Fragmentgröße wurde durch Gelelektrophorese überprüft. Alle vier DNA-Fragmente wurden dann getrennt für die Transformationen der Protoplasten benutzt.
Zusätzlich wurden zwei kleinere PCR-Fragmente, die nur die PAT-Genkassette enthalten (ohne die GUS-Kassette), hergestellt unter Benutzung des Primers f2 und einem von den beiden Rückwärts-Primern r3 oder r4, von denen beide nahe am Ende von dem CaMV-Terminator des PAT-Gens liegen (1). Primer r3 beginnt bei Position 1232 bp mit der Sequenz 5`-GCGAAACCCTATAAGAACCC; Primer r4 beginnt bei Position 1340 bp mit der Sequenz 5`-AGCTCGGTACCCACTGGATT. Die Reaktionen wurden durchgeführt unter Benutzung von 35 Zyklen mit 1 Min. Denaturierung bei 94 °C, 1 Min. Annealing bei 65 °C, 2 Min. Elongation bei 72 °C, mit einer Elongationsperiode von 5 Min. Die weitere Präparation der DNA erfolgte wie oben beschrieben.
Bis heute erhaltene Resultate sind in den Tabellen 2c bis 7 für transgene Calli aufgelistet und diese Resultate deuten darauf hin, dass transgene Calli unter Benutzung der PCR-DNA von jeder getesteten Primerkombination produziert wurden. GUS-positive und somit stabil transformierte transgene Calli sind auch entdeckt worden in solchen Transformationen, die unter Benutzung von PCR-DNP, welche auch das GUS-Gen enthielt, ausgeführt wurden. Die ersten Pflanzen sind bereits hergestellt worden. Diese enthalten die Transgene. Die Daten sind in Tabelle 8 aufgelistet. Die Sonden in den Daten führen die Anzahl der Banden im Southern-Blot auf. Die Frequenzen der Transformation unter Benutzung von PCR-DNA sind nicht signifikant unterschiedlich zu den Transformationen, die unter Benutzung der Standard-Plasmid-DNA Isolation ausgeführt wurden. Die Anwesenheit der Randsequenzen (die extra +/–200-bp Sequenz vor und/oder nach dem Promotor/Terminator), welche als vielleicht notwendig angesehen wurden, eine potentielle Gen-Inaktivierung durch Exonuklease-Aktivität zu vermeiden, scheinen nicht die Transformations-Frequenz zu beeinflussen und werden deshalb nicht benötigt.
Tabelle 1 Menge der in der Protoplasten-Transformation mit PEG-Medium benutzten DNA Moleküle:

Tabelle 2a

Tabelle 2b: Zusammenfassung von Tabelle 2a
2 ist eine Karte von pS63, einem Plasmid, dass durch die Entfernung von 3 Regionen aus pIGPD7 erhalten wurde.

RB = rechte Randregion (ungefähr 220 bp, die den reellen rechten Rand beinhalten).
ORI = Ursprung der Replikation des Plasmids.
Bin19 = rechte Randsequenz (25 bp, GGTTTACCCGCCAATATATCCTGTC
Bin19 = linke Randsequenz (24 bp, ATTTACAATTGAATATATCCTGCC

Die Abnahme in der Größe von der Kassette bewirkt die Verbesserung der Transformations-Effizienz. Zusätzlich können ein oder beide T-DNA-Ränder benutzt werden. Vorzugsweise ist einer benutzt, aber beide können eingesetzt werden. Wir setzen am häufigsten die rechte Randsequenz der T-DNA (etwa 25 Basenpaare) ein, obwohl die linke gleich zweckdienlich erscheint. Folglich ist das Formen von genetisch modifizierten Pflanzen oder Pflanzenzellen, die in der Kassette der Nukleotidsequenz eine oder mehr T-DNA Randsequenzen haben, .... welche nicht notwendigerweise in irgendeiner spezifischen Stelle platziert ist, obwohl die Enden oft für diese Randregionen eingesetzt werden.
Es zeigt 1 die kurzen Fragmente PatR1 und PatR2, die das gesamte pat Gene und den Promotor einschließen. Die Daten sind in Tabelle 2a und 2b gezeigt. Die Tabellen 2c bis 8 zeigen die Resultate der Southern-Blot Daten in tabellarischer Form.
Tabelle 2c: Fragment r1/f2
Tabelle 3: Fragment r1/f3
Tabelle 4: Fragment r4/f2
Tabelle 5: Fragment r4/f3
Tabelle 6 Fragment partr1/f2 (Anzahl der Banden auf Southern-Blot)
Tabelle 7: fragment partr2/f2
Tabelle 8: Pflanzen
SEQUENZPROTOKOLL

Claims

Verfahren für das Erhalten einer genetisch veränderten Pflanze, umfassend die Schritte der: (i) Transformation von Protoplasten in Gegenwart von PEG-Medium, durch Einführung eines vererbbaren Materials in die Protoplasten von der Pflanze, um Transformanten zu erhalten, die mindestens eine Kopie von dem vererbbaren Material pro Protoplast enthalten, (ii) Selektion eines stabilen Transformanten und (iii) Neubildung von Pflanzenzellen oder einer ganzen Pflanze aus dem Transformanten, dadurch gekennzeichnet, dass das vererbbare Material eine Nukleotidsequenz-Kassette ist, die in das Genom von der Pflanze eingefügt werden muss und frei ist oder im Wesentlichen frei ist von anderen prokaryotischen oder Plasmid-basierten Nukleotidsequenzen.
Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die Kassetten-Sequenz eine genetische Sequenz umfasst, die ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus genetischen Sequenzen involviert in die Resistenz gegenüber Pflanzenviren (insbesondere BNYW), Resistenz gegenüber Pflanzenparasiten (Nematoden, Pilze oder Insekten), Resistenz gegenüber Herbiziden (vorzugsweise Glyphosat, Glufosinat, Imathezethat und/oder Acetochlorid-Resistenz), Insektiziden oder Fungiziden, oder involviert in den verbesserten Metabolismus von Kohlehydraten.
Verfahren nach irgendeinem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die Protoplasten aus der Umwandlung von stomatalen Zellen erhalten wurden.
Verfahren nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, dass die stomatalen Zellen Schließzellen sind.
Verfahren nach irgendeinem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die Nukleotidsequenz-Kassette ein Amplikon ist, das aus genetischen Vervielfältigungsschritten resultiert.
Verfahren nach irgendeinem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass der Schritt der Transformation der Protoplasten der Pflanze, durch die Einführung eines vererbbaren Materials in die Protoplasten, mit Amplikons erhalten wird, die bei einer Konzentration von mehr als 10 μg DNA/1 × 10⁶ Protoplasten vorliegen.
Verfahren nach irgendeinem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass es den Schritt der Bereitstellung eines intakten Gewebes von der Pflanze umfasst, das stomatale Zellen enthält und der Umwandlung der stomatalen Zellen in Protoplasten durch enzymatische Verdauung der Zellwände, wobei der Schritt vor der Transformationsschritt der Protoplasten durchgeführt wird.
Verfahren nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, dass das Pflanzengewebe ruhendes Blattgewebe oder Blattepidermis ist.
Verfahren nach irgendeinem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die Pflanze eine Zuckerrübe (Beta vulgaris) ist.
Genetisch veränderte Zuckerrüben-Pflanze (Beta vulgaris) oder Zuckerrüben-Pflanzenzelle, erhältlich durch ein Verfahren nach irgendeinem der Ansprüche 2 bis 9.
Zuckerrüben-Pflanze oder Zuckerrüben-Pflanzenzelle nach Anspruch 10, wobei die einzufügende Nukleotidsequenz-Kassette eine oder mehrere T-DNA Randsequenzen einschließt.