DE69434744T3

DE69434744T3 - Positive selektion auf mannose oder xylose basierend

Info

Publication number: DE69434744T3
Application number: DE69434744T
Authority: DE
Inventors: Kirsten Bojsen; Iain Donaldson; Anna Haldrup; Morten Joersboe; Jette Kreiberg; John Nielsen; Finn Okkels; Steen Petersen
Original assignee: Syngenta Participations AG
Current assignee: Syngenta Participations AG
Priority date: 1993-03-02
Filing date: 1994-02-28
Publication date: 2013-03-21
Anticipated expiration: 2014-03-01
Also published as: CA2157470A1; SK107095A3; JP4805309B2; EP0804599B2; DE69434744T2; DK0804599T3; EP0804599A1; EP0804599B1; HUT73387A; JP4426376B2; ES2265144T3; JP2004254705A; SK285107B6; US5767378A; ZA941467B; HU9502566D0; HU225771B1; JPH08509861A; AU6207794A; JP3698722B2

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zum Selektieren genetisch transformierter Pflanzenzellen, in die eine gewünschte Nucleotidsequenz eingebracht worden ist, indem den transformierten Zellen ein selektiver Vorteil vermittelt wird. Der selektive Vorteil, den die transformierten Pflanzenzellen besitzen, kann auf ihrer im Vergleich zu nicht-transformierten Zellen verstärkten Fähigkeit, eine zugesetzte Verbindung als Nährstoff, Wachstumsfaktor oder Energiequelle zu nutzen, beruhen.
Es ist bekannt, dass, wenn genetisches Material durch Transformation in eine Population von Zellen eingeführt werden soll, nur eine gewisse Anzahl der Zellen erfolgreich transformiert wird. Die Identifizierung und Abtrennung der transformierten Zellen wurde herkömmlich unter Anwendung von ”Negativselektion” bewerkstelligt, wobei die transformierten Zellen imstande sind, zu überleben und zu wachsen, während die nicht-transformierten Zellen einer Wachstumshemmung unterzogen oder sogar durch eine Substanz getötet werden, die die transformierten Zellen aufgrund ihrer Transformation, zu tolerieren in der Lage sind.
Wenn zum Beispiel eine Population von Pflanzenzellen transformiert wird, beruht die Selektion der transformierten Zellen typischerweise auf der Anwesenheit eines ”Selektionsgens” in den transformierten Zellen, das eine Antibiotikum- oder Herbizidresistenz zur Verfügung stellt. Das Selektionsgen, das an sich keine nützliche Funktion in der transformierten Pflanze aufweisen mag (und eigentlich in der Pflanze unerwünscht sein kann), wird mit dem gewünschten Gen, das in die Pflanze eingebracht werden soll, gekoppelt oder miteingebracht, so dass beide Gene in die Population von Zellen, oder vielmehr in manche der Zellen in der Population, eingebracht werden, da es in der Praxis schwierig, wenn nicht unmöglich, ist, alle der Zellen zu transformieren. Die Zellen werden dann auf oder in einem Medium, welches das Antibiotikum oder Herbizid enthält, gegen das die genetisch transformierten Zellen dank des Selektionsgens resistent sind, kultiviert, wodurch es ermöglicht wird, die transformierten Zellen zu identifizieren, weil die nicht-transformierten Zellen – die das Antibiotikum- oder Herbizid-Resistenzgen nicht enthalten – einer Wachstumshemmung unterworfen oder getötet werden.
Diese Negativselektions-Verfahren haben gewisse Nachteile. Zum Beispiel können die nicht-transformierten Zellen aufgrund der Anwesenheit von Antibiotika oder Herbiziden im Wachstumsmedium sterben. Als ein Ergebnis, wenn die Population von Zellen ein zusammenhängendes Gewebe ist, besteht die Gefahr, dass nicht nur die nicht-transformierten Zellen sondern auch die transformierten Zellen sterben können, und zwar aufgrund der Tatsache, dass der Tod der nicht-transformierten Zellen die Zufuhr von Nährstoffen zu den transformierten Zellen abschneiden kann oder weil die beschädigten oder sterbenden nicht-transformierten Zellen toxische Verbindungen ausscheiden können.
Ein weiterer Nachteil der Negativselektion besteht darin, dass das Vorhandensein eines unnötigen Gens, das beispielsweise eine Antibiotikumresistenz bereitstellt, unerwünscht sein kann. Es besteht die Sorge unter Umweltgruppen und Regierungsbehörden darüber, ob es sicher ist, Gene, die für Antibiotika-Resistenz codieren, in Pflanzen und Mikroorganismen einzubringen. Diese Sorge ist von besonderer Bedeutung für Nahrungspflanzen und für Mikroorganismen, die nicht dazu entworfen sind, in einer geschlossenen Umgebung verwendet zu werden (z. B. Mikroorganismen zur Verwendung in der Landwirtschaft), sowie für Mikroorganismen, die zur Verwendung in einer geschlossenen Umgebung entworfen sind, die aber versehentlich daraus freigesetzt werden könnten.
Ein weiterer Nachteil der Negativselektion besteht darin, dass Pflanzengewebe oder -zellen, die man mit toxischen Substanzen behandelt, anfälliger für eine bakterielle Infektion werden. Dies ist ein Problem, wenn Agrobacterium als ein Transformationsvektor verwendet wird, weil die behandelten Gewebe oder Zellen manchmal von den Bakterien überwuchert werden, selbst obwohl Antibiotika verwendet werden, um das Bakterienwachstum zu verhindern.
Darüber hinaus erfordert die Selektion von Zellen oder Geweben unter Anwendung von Negativselektion eine präzise Zeitgebung der Expression der eingebrachten Gene in Bezug auf das Selektionsverfahren. Wenn die transgenen Zellen mit einer toxischen Verbindung behandelt werden, bevor das entgiftende Gen exprimiert wird oder bevor genügend Genprodukte produziert sind, um die Wirkung der toxischen Verbindung zu schwächen, werden sowohl die transgenen als auch die nicht-transgenen Zellen getötet werden. Wenn die Selektion zu spät durchgeführt wird, kann die Selektion von transgenen Zellen oder Geweben zum Beispiel durch Schößlings- oder Kallusbildung von nicht-transgenen Zellen oder Geweben behindert werden, die eine Barriere gegen das Eindringen der Verbindung bildet, die man zum Selektieren der transformierten Zellen verwendet.
Piruzyan et al. (1989) Dokl. Akad. Nauk SSSR, 305(3), 729–731, berichtet über die Produktion von Tabakpflanzen, die mit einem bakteriellen Glucoseisomerase-Gen transformiert waren, das die Umwandlung von Glucose zu Fructose und die Umwandlung von Xylose zu Xylulose in E. coli katalysiert und E. coli-Zellen erlaubt, auf Xylose als einziger C-Quelle zu wachsen. Die Selektion von transformierten Pflanzenzellen wurde auf einem selektiven Medium, das Kanamycin als das selektive Agens enthält, durchgeführt. US-P 4 857 467 offenbart Hefestämme der Gattung Pichia, die mit DNA-Fragmenten transformiert sind, welche Genfunktionen codieren, die dem Wildtypstamm fehlen oder bezüglich derer der Wildtypstamm defizient ist. Die transformierten Hefezellen sind in der Lage zum Wachstum auf einer Kohlenstoffquelle, welche die Expression der Genfunktion, die von dem DNA-Fragment bereitgestellt wird, erfordert. Somit ermöglicht die Transformation mit solchen DNA-Fragmenten die Selektion von transformierten Stämmen.
Die WO 93/05163 wurde vor der vorliegenden Anmeldung eingereicht, aber nach dem Datum der Einreichung veröffentlicht. Sie offenbart ein Verfahren zum Selektieren genetisch transformierter Pflanzenzellen aus einer Population von Zellen, das die Versorgung der genannten Population mit einer Verbindung umfasst, welche durch das Expressionsprodukt einer Nucleotidsequenz, die in die transformierten Pflanzenzellen eingeführt worden sind, metabolisiert werden kann. Die Verwendung von Mannose in Kombination mit Mannose-6-phosphat-Isomerase wird spezifisch erwähnt.
Die oben erwähnten Nachteile der bekannten Negativselektionsschemen werden zumindest in einem wesentlichen Ausmaß durch das Verfahren gemäß der vorliegenden Erfindung überwunden (bezeichnet als ”Positivselektion” oder kombinierte ”positive/negative” Selektion), das es ermöglicht, genetisch transformierte Pflanzenzellen zu identifizieren und zu isolieren, und zwar ohne Beschädigen oder Töten der nicht transformierten Zellen in der Population und ohne Miteinbringung von Antibiotikum- oder Herbizidresistenzgenen. Zusätzlich zu der Tatsache, dass die Notwendigkeit von Antibiotika- oder Herbizidresistenzgenen eliminiert wird, ist das Positivselektionsverfahren gemäß der vorliegenden Erfindung oft weit effizienter als die herkömmliche Negativselektion, und eine Kombination von Positiv- und Negativselektion ergibt eine Selektionsfrequenz transgener Schößlinge, die so gut wie, wenn nicht höher als jene ist, die unter alleiniger Verwendung von Negativselektion erhalten wird. Weiterhin stellt die Verwendung der Positivselektion den Vorteil bereit, dass ein einziges Gen sowohl als Reportergen als auch als Selektionsgen verwendet werden kann, was zu einer Vereinfachung der Vektorkonstruktionen, stabileren Konstruktionen und einer 100%-Korrelation zwischen der Expression von Reporter- und Selektionsgenen führt.
Positivselektion kann auch die oben erwähnten Probleme in Bezug auf die Zeitgebung beheben, da selektive Verbindungen als Folge der Einwirkung von Genprodukten, die aus der Expression des eingebrachten Gens resultieren, auf bestimmte Substrate produziert werden können. Somit kann sich die selektive Verbindung als Folge der Expression des Selektionsgens akkumulieren, wobei der Selektionseffekt auftritt, wenn eine ausreichende Menge der selektiven Verbindung hergestellt worden ist.
Gemäß der vorliegenden Erfindung wird ein Verfahren zur Identifizierung oder Selektion aus einer Population von Pflanzenzellen bereitgestellt, die aus der Gruppe ausgewählt ist, bestehend aus Früchten, kleinkörnigen Getreiden, Gemüse, Canola, Sonnenblume, Tabak, Zuckerrübe, Mais und Baumwolle, die auf oder in einem Medium kultiviert werden, das mindestens eine Verbindung enthält, von Zellen, die einen metabolischen Vorteil als Ergebnis davon aufweisen, dass sie transformiert worden sind, wobei:

i) die Zellen mit einer Nucleotidsequenz oder einer miteingebrachten Nucleotidsequenz transformiert werden, wovon eine eine Region umfasst, die ein Enzymprotein codiert, das am Metabolismus der Verbindung beteiligt ist, die aus der Gruppe ausgewählt ist, bestehend aus Phosphozuckerisomerasen, Phophozuckermutasen, Phosphatasen und Zuckerepimerasen;
ii) die Verbindung Mannose oder Xylose oder ein Derivat oder ein Vorläufer von diesen oder ein Substrat des Enzymproteins, das entweder direkt oder indirekt am Metabolismus von Mannose oder Xylose beteiligt ist, ist, mit der Maßgabe, dass die Verbindung nicht Mannose ist, wenn das Protein Mannose-6-phosphat-Isomerase ist.

Die Erfindung schließt ebenfalls ein Verfahren zur Identifizierung oder Selektion aus einer Population von Pflanzenzellen ein, die aus der Gruppe ausgewählt ist, bestehend aus Früchten, kleinkörnigen Getreiden, Gemüse, Canola, Sonnenblume, Tabak, Zuckerrübe, Mais und Baumwolle, die auf oder in einem Medium kultiviert werden, das mindestens eine Verbindung enthält, von Zellen, die einen metabolischen Vorteil als Ergebnis davon aufweisen, dass sie transformiert worden sind, wobei:

i) die Zellen mit einer Nucleotidsequenz oder einer miteingebrachten Nucleotidsequenz transformiert werden, wovon eine eine Region umfasst, die ein Enzymprotein codiert, das am Metabolismus der Verbindung beteiligt ist, die aus der Gruppe ausgewählt ist, bestehend aus Phosphozuckerisomerasen, Phophozuckermutasen, Phosphatasen und Zuckerepimerasen;
ii) die Verbindung Mannose oder Xylose oder ein Derivat oder ein Vorläufer von diesen oder ein Substrat des Enzymproteins, das entweder direkt oder indirekt am Metabolismus von Mannose oder Xylose beteiligt ist, ist, und
iii) ein Mittel dem Medium zugegeben wird, das die Toxizität der Verbindung gegenüber den Zellen herabsetzt.

Es ist bevorzugt, dass, falls ein die Toxizität herabsetzendes Mittel dem Kulturmedium zugegeben worden ist, die Verbindung Mannose ist und das Nucleotid, oder die miteingebrachte Nucleotidsequenz, Mannose-6-phosphat-Isomerase codiert.
Zellen, die einen ”metabolischen Vorteil” haben, sind unter anderem in der Lage, schneller als benachteiligte Zellen zu wachsen und/oder sind vorteilhafterweise in der Lage, Substrate (wie Nährstoffvorläufer, etc.) zu verwerten, die benachteiligte Zellen nicht nutzen können, und/oder sind in der Lage, Substrate, die toxisch oder anderweitig wachstumshemmend für benachteiligte Zellen sind, zu entgiften.
Ein Protein, das ”am Metabolismus einer Verbindung beteiligt ist” ist typischerweise, aber nicht ausschließlich, ein Enzym, welches direkt oder indirekt für die Herstellung oder Verwertung der Verbindung oder ihrer Derivate oder Vorläufer verantwortlich sein kann. Das Protein kann auch am Metabolismus einer Verbindung beteiligt sein, wenn es an diese bindet, diese von einem Ort zum anderen innerhalb der Zelle oder des Gewebes oder des Organismus überträgt oder diese anderweitig maskiert, wodurch ihre lokale Verfügbarkeit verändert wird.
Eine Region einer Nucleotidsequenz, die ”die Aktivität eines Gens, das ein Protein codiert, reguliert” kann den Spiegel der Expression eines endogenen Gens verändern, indem sie dafür ein Promotor ist oder Promotoraktivität aufweist, und indem sie in oder nahe seiner Nachbarschaft eingebracht wird. Mit ”nahe” wird bis zu 10000 kb gemeint. Alternativ kann eine indirekte Regulierung durch Verändern der Bindung von RNA-Polymerase an den Promotor eines Strukturgens, das ein Protein codiert, oder komplementäre Bindung der Nucleotidsequenz an wenigstens einen Teil des Strukturgens zustande kommen, wodurch typischerweise die Menge des Proteins in der Zelle verringert wird.
Mit ”Derivat” von Mannose oder Xylose ist jedwede Verbindung gemeint, die dazu in der Lage ist, verwertet zu werden, indem sie bindet an, ein Substrat ist für, oder ein Produkt ist von, einem beliebigen Protein, das entweder direkt oder indirekt am Metabolismus von Mannose oder Xylose beteiligt ist. Im Fall von Mannose versteht es sich, dass solche Derivate Kohlenhydrate, wie Glucose oder Galactose, einschließen, die den Einwirkungen von Epimerasen unterworfen sein können, wodurch sich Mannose oder Derivate oder Vorläufer von dieser ergeben. ”Derivat” schließt auch Mannose- oder Xylosereste ein, die eine oder mehrere Hydroxylgruppen aufweisen, an welche Reste kovalent oder ionisch gebunden sind. Solche gebundenen Reste schließen Ester, Ether, Aminogruppen, Amidogruppen, Phosphatgruppen, Sulfatgruppen, Carboxylgruppen, Carboxy-Alkylgruppen und Kombinationen davon ein. Mannose- oder Xylosederivate können auch Mannose- oder Xylosevorläufer einschließen, wenn die Derivatisierungen imstande sind, in einer solchen Weise entfernt zu werden, dass man Mannose oder Xylose erhält.
Der Begriff ”Zelle” schließt innerhalb des Kontexts der Erfindung Protoplasten ein, und der Begriff ”Population von Zellen” schließt ein Gewebe, ein Organ oder einen Teil davon, eine Population von einzelnen Zellen in oder auf einem Substrat oder einem ganzen Organismus, zum Beispiel, einer Pflanze, ein.
Die vorliegende Erfindung betrifft transformierte Zellen, die unter Verwendung des Verfahrens der Erfindung selektiert worden sind, und solche transformierte Zellen, welche Pflanzenzellen sind, sowie Pflanzen, Nachkommenschaft und Samen, die von solchen Zellen abgeleitet sind. Zu Pflanzen, die gemäß der Erfindung selektiert werden können, zählen: Früchte, einschließlich Tomaten, Mangos, Pfirsichen, Äpfel, Birnen, Erdbeeren, Bananen und Melonen; Feldfrüchte, wie Canola, Sonnenblume, Tabak, Zuckerrübe, kleinkörnige Getreide, wie Weizen, Gerste und Reis, Mais und Baumwolle, und Gemüse, wie Kartoffeln, Karotten, Kopfsalat, Kohl und Zwiebeln.
Die besonders bevorzugten Pflanzen sind Zuckerrübe und Mais.
Die Verwendung des vorliegenden Positiv-Selektionsverfahrens in vivo ist von besonderer Relevanz beispielsweise im Zusammenhang mit einer Transformation, die an ganzen Pflanzen oder Pflanzenteilen durchgeführt wird, wobei die Pflanzen oder Teile sowohl transformierte als auch nicht-transformierte Zellen umfassen, da die Selektion der transformierten Zellen ohne direkte Beschädigung der benachbarten nicht-transformierten Zellen erreicht wird. Die transformierten Zellen haben somit einen selektiven ”Vorteil” im Vergleich zu den nicht-transformierten Zellen (z. B. die Fähigkeit, Schößlinge bzw. Sprosstriebe zu bilden), aber die nicht-transformierten Zellen erleiden keinerlei schweren Nachteil im dem Sinne, dass sie beschädigt oder getötet werden, wie es bei der Negativselektion unter Verwendung von Antibiotika oder Herbiziden der Fall ist.
Der ”selektive Vorteil”, den die transformierten Pflanzenzellen besitzen, kann typischerweise ein Unterschied oder Vorteil sein, welcher ermöglicht, die transformierten Zellen durch einfache visuelle Mittel zu identifizieren, d. h. ohne die Verwendung eines separaten Assays, um das Vorhandensein eines Markergens zu bestimmen.
Eine Population von Pflanzenzellen kann auf oder in einem Medium, das mindestens eine Verbindung enthält, die inaktiv sein kann und die in den transformierten Zellen direkt oder indirekt aktiviert wird, kultiviert werden, wobei die Verbindung in nicht-transformierten Zellen inaktiv oder weniger aktiv ist als in transformierten Zellen, so dass die transformierten Zellen mit einem selektiven Vorteil versehen werden, der gestattet, dass sie aus der Zellpopulation heraus selektiert werden können.
Die Population von Pflanzenzellen kann auch auf oder in einem Medium kultiviert werden, das eine Verbindung enthält, die für die transformierten Zellen durch die Expression oder Transkription der Nucleotidsequenz verfügbar gemacht wird, wobei die Verbindung für die nicht-transformierten Zellen nicht verfügbar ist oder für nicht-transformierte Zellen weniger verfügbar ist, so dass die transformierten Zellen mit einem selektiven Vorteil ausgestattet werden.
Wenn ein Polypeptid, das durch die Nucleotidsequenz codiert wird, direkt eine inaktive Verbindung in den transformierten Pflanzenzellen aktiviert, können die nicht-transformierten Zellen endogen eine gewisse Menge des genannten Polypeptids, das typischerweise ein Enzym sein kann, enthalten oder produzieren. In solchen Fällen muss die ”inaktive Verbindung” in den nicht-transformierten Zellen nicht notwendigerweise vollständig inaktiv sein, da es ausreichend sein kann, dass die Verbindung oder der Nährstoff in nicht-transformierten Zellen lediglich wesentlich weniger aktiv ist als in transformierten Zellen. Mit anderen Worten kann ein qualitativer Unterschied zwischen den transformierten Zellen und den nicht-transformierten Zellen im Hinblick auf die Aktivierung der anfänglich inaktiven Verbindung für Selektionszwecke ausreichend sein. In solchen Fällen können Inhibitoren oder Substrate, die mit den nativen Enzymen konkurrieren, zu den Zellen hinzugesetzt werden. Besonders geeignet sind Inhibitoren, die durch das native Enzym aktiviert werden, was zur selbst-katalysierten Herstellung des aktiven Inhibitors bis zu einem Spiegel führt, bei dem das native Enzym im wesentlichen vollständig inhibiert ist.
Falls zwei Nucleotidsequenzen gemeinsam in Zellen eingebracht werden, können sie gegebenenfalls aneinander gekoppelt werden, oder anderweitig in einer solchen Weise zusammen eingebracht werden, dass das Vorhandensein einer Nucleotidsequenz in der Zelle das Vorhandensein oder die erhöhte Wahrscheinlichkeit des Vorhandenseins der anderen Sequenz in der Zelle anzeigt. Die zwei Nucleotidsequenzen sind somit typischerweise, obwohl nicht notwendigerweise, Teil desselben genetischen Konstrukts und können über den gleichen Vektor eingebracht werden.
Da es notwendig ist, dass die eingebrachten Nucleotidsequenzen in den transformierten Zellen exprimiert werden, wird ein genetisches Konstrukt, das die zwei Nucleotidsequenzen enthält, typischerweise regulatorische Sequenzen enthalten, die die Expression der Nucleotidsequenzen ermöglichen, z. B. bekannte Promotoren und Transkriptionsterminatoren. Somit ist die miteingebrachte Nucleotidsequenz typischerweise mit einem Promotor assoziiert, der konstitutiv oder regulierbar sein kann.
Die hierin beschriebenen Verfahren können auch angewandt werden, wenn die zwei Nucleotidsequenzen unabhängig eingebracht werden. Dies kann zum Beispiel unter Verwendung der gleichen Bakterien zur Einbringung beider Gene und Einbringen einer relativ großen Anzahl an Kopien der gewünschten Nucleotidsequenz in die Zellen durchgeführt werden, wodurch die Wahrscheinlichkeit relativ hoch ist, dass Zellen, die nachweislich die miteingebrachte Nucleotidsequenz exprimieren, auch die gewünschte Nucleotidsequenz enthalten und exprimieren. Von der unabhängigen Einbringung von zwei oder mehreren Genen, die zur Co-Expression der Gene in der gleichen Zelle führt, wird allgemein erwartet, eine geringe Wahrscheinlichkeit aufzuweisen, und daher wird von den verbesserten Selektionsfrequenzen, die durch das Positivselektionsverfahren erhalten werden, erwartet, in solchen Systemen besonders vorteilhaft zu sein.
Eine Verbindung, die für Selektionszwecke verwendet wird, kann außerdem sowohl einen positiven als auch einen negativen Effekt besitzen. Zum Beispiel ist Mannose in genügend hohen Konzentrationen für die meisten Pflanzen toxisch, aber in Zellen, die Mannose metabolisierende Enzyme enthalten, wird der negative Effekt aufgehoben, und die Zellen erlangen weiterhin den Vorteil, in der Lage zu sein, Mannose als Kohlenhydratquelle zu verwenden. In diesem Fall stellen eine einzige Verbindung und ein einzelnes Gen zusammen ein kombiniertes Positiv- und Negativselektionssystem bereit, obwohl ein solches System ebenfalls unter Verwendung von zwei oder mehreren Genen eingerichtet werden kann, die gemeinsam für die Inhibierung der negativen Effekte einer Verbindung und die Manifestation der positiven Effekte der Verbindung in den transformierten Zellen verantwortlich sind.
In einer weiteren Ausführungsform des Verfahrens führt die Expression oder Transkription der Nucleotidsequenz zur Blockierung des Metabolismus einer Verbindung, die der Population von Pflanzenzellen zugeführt wurde, oder zur Blockierung der Synthese einer Verbindung in den transformierten Zellen, wodurch die transformierten Zellen von den nicht-transformierten Zellen identifiziert oder herausselektiert werden können.
In noch einer weiteren Ausführungsform des Verfahrens können die transformierten Pflanzenzellen unter Verwendung einer Kombination von Positivselektion und Negativselektion selektiert werden, wobei die Nucleotidsequenz in den transformierten Zellen zusammen mit einer weiteren Nucleotidsequenz eingebracht wird, die Resistenz gegenüber mindestens einem Vertreter codiert, der aus der Gruppe ausgewählt ist, die aus Toxinen, Antibiotika und Herbiziden besteht, und das Medium, in oder auf dem die Zellen kultiviert werden, mindestens einen Vertreter umfasst, das aus der Gruppe ausgewählt ist, die aus Toxinen, Antibiotika und Herbiziden besteht, gegenüber denen die transformierten Zellen resistent gemacht werden. Es ist bevorzugt, dass die Nucleotidsequenz zusammen mit mindestens zwei verschiedenen Selektionsgenen eingebracht wird.
Es ist bevorzugt, dass die Verbindung Mannose oder Xylose ist. Wie oben angedeutet, kann die Verbindung jedoch ein Mannosederivat, zum Beispiel Mannose-6-phosphat, oder ein Xylosederivat, wie ein Xylosephosphat, oder ein Mannose- oder Xylosevorläufer sein.
Die Zellen können mit einer beliebigen Nucleotidsequenz transformiert werden, von der erwünscht ist, sie darin einzubringen. Eine solche Nucleotidsequenz kann Gene codieren, die Virus-, Pilz-, Bakterien- oder Nematodenresistenz bereitstellen.
Die Pflanzenzellen können durch ein Bakterium, wie eine Agrobacterium-Spezies, die empfindlich gegenüber der Verbindung ist, transformiert sein, so dass die Selektion der transformierten Zellen durch die Verbindung den Vorteil der Verringerung des Risikos einer nach der Transformation erfolgenden Infektion der transformierten Zellen durch die Bakterien hat. Es wird richtig eingeschätzt werden, dass die Zellen durch beliebige geeignete bekannte Methoden transformiert werden können, einschließlich Elektroporation, Mikroinjektion, Verwendung der Mikroprojektil-Kanone und Transformation mit Ri- und Ti-Plasmiden. Die transformierten Zellen können, in geeigneten Fällen, zu ganzen Pflanzen regeneriert werden, bei denen die rekombinante DNA stabil in das Genom integriert ist.
Das Protein ist vorzugsweise ein Enzym, das am Mannose- oder Xylose-Metabolismus beteiligt ist. Solche Enzyme schließen Xyloisomerasen und Phosphomanno-Isomerasen, wie Mannose-6-phosphat-Isomerase und Mannose-1-phosphat-Isomerase; Phosphomanno-Mutase: Mannose-Epimerasen, wie solche, die Kohlenhydrate in Mannose oder Mannose in Kohlenhydrate, wie Glucose oder Galactose, umwandeln; Phospharasen, wie Mannose-6-Phospharase und Mannose-1-Phospharase, ein.
Das Mittel, das die Toxizität der Verbindung gegenüber den Zellen herabsetzt, ist typischerweise ein Glucosederivat, wie Methyl-3-O-glucose, oder Phloridzin.
Die vorliegende Erfindung wird aus einer Betrachtung des folgenden Textes in Verbindung mit den begleitenden Zeichnungen noch weiter ersichtlich werden, in denen:
1 die Herstellung eines Bcl1/HindIII-Restriktionsfragments zeigt, das die codierende Region der E. coli-Phosphomannose-Isomerase umfasst;
2 das Plasmid EPL (Pietrzak, M. et al. Nucleic Acids Res. 14 S. 5857–5868 (1986)) zeigt;
3 das binäre Plasmid pBKL4 (Nielsen, K. K. et al., Mol. Plant Microbe Interact. 6, S. 495–506 (1993)) zeigt;
4 das Plasmid pBKL4 zeigt, bei dem das man-A-Gen zwischen dem GUS-Gen und dem NPTII-Gen eingefügt ist.
Konstruktion des binären Plasmids p(BKL4-mannose), enthaltend die für E. coli-Phosphomannose-Isomerase codierenden Sequenzen
Das E. coli-Phosphomannose-Isomerase(EC 5.3.2.8)-Gen stammt aus dem Plasmid pGS63 (Miles, H., et al. Gene 32, S. 41–48 (1984)) (1), einer Konstruktion, die aus pBR322 abgeleitet wurde, in welchem die Region zwischen den einmaligen PstI- und HindIII-Stellen durch einen Abschnitt des E. coli-Chromosoms ersetzt worden ist, der das Strukturgen (man A) für Phosphomannose-Isomerase und ein Fragment des benachbarten Gens für Fumarase (fum A) trägt. pGS63 hat daher einen Teil des β-Lactamase-Gens verloren und muss auf Tetracyclin selektiert werden.
Das PstI/BamHI-Fragment (2466 bp), das das gesamte chromosomale PstI/HindIII-Fragment und einen 357 bp großen Abschnitt von pBR322 enthält, wurde in die Mehrfachklonierungsstelle von pUC18 hineinligiert, um pDO18 (siehe 1) zu bilden.
pDO18 wird mit HindIII verdaut, und die sich ergebenden zurückgesetzten 3'-Termini werden unter Verwendung von Klenow-Polymerase aufgefüllt. Das offene DO18-Plasmid mit der aufgefüllten HindIII-Stelle (HindIII*) (siehe 1) wird mit BclI verdaut, und das 1218 bp große BclI-HindIII*-Fragment, das die kodierende Region von Phosphomannoseisomerase enthält, wird in das Plasmid pEnhanced-Peter-Linker (pEPL) einkloniert, das zuerst mit SmaI und dann mit BamHI verdaut worden war. Das resultierende Plasmid wird als p(EPL-mannose) bezeichnet.
pEPL wird aus pCaMVCN (Fromm et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82, S. 5824 (1985); Fromm et al. Nature 319, S. 791 (1986)) konstruiert, in welchem das CAT-Gen durch einen PstI-Verdauu entfernt wird. Ein kleiner Linker (Linker: PstI-BamHI-BalI-PstI) wird in diese Plasmid-PstI-Stelle eingefügt, wodurch man das als pLise(pL) bezeichnete Plasmid erhält. pL wird mit HindII und BglII verdaut, und das resultierende Fragment, das den 35S-Promotor und den NOS-Terminator enthält, wird in ein anderes pL-Plasmid einkloniert, das mit EcoRV und BglII verdaut worden war. Sowohl EcoRV als auch HincII sind glattendige Stellen. Das resultierende Konstrukt wird als pEnhanced-Lise (pEL) bezeichnet. pEL unterscheidet sich im Wesentlichen von pCaMVCN dadurch, dass es einen Varianten-35S-Promotor mit einer Tandemduplikation der 250 bp der Stromaufwärts-Sequenz des Promotors enthält. Der Varianten-35S-Promotor hat eine ungefähr zehnmal stärkere Transkriptionsaktivität als der natürliche 35S-Promotor (Kay et al. Science 236, S. 1299–1302 (1987)). pEL wird mit PstI und BglII verdaut, wodurch der NOS-Terminator entfernt und stattdessen ein CaMV-Terminator (DW2t) eingefügt wird. Schließlich wird ein Linker (PstI-BamHI-SmaI-SacI-SacII-SphI) in die PstI-Stelle, die zwischen dem verstärkten Promotor und dem CaMV-Terminator liegt, eingefügt. Dieses Plasmid wird als pEPL bezeichnet (siehe 2).
pfEPL-mannose) wird mit HindIII verdaut, um das Fragment zu isolieren, das den gesamten verstärkten 355-Promotor, die codierende Region von E. coli-Phosphomannose-Isomerase und den CaMV-Terminator enthält. Das isolierte Fragment wird in die HindIII-Stelle des binären Vektors pBKL4 (4) kloniert. Das resultierende Plasmid wird als p(BKL-mannose) bezeichnet. Die HindIII-Stelle in pBKL4 liegt zwischen einem Kanamycin-Resistenzgen und dem β-Glucuronidase(GUS)-Gen (siehe 3). Das Mannose-Chimären-Gen, das Kanamycin-Resistenzgen (NPTII) und das GUS-Gen weisen jeweils einen Promotor und Terminator auf. Die 4 zeigt die p(BKL-mannose)-Konstruktion, die das chimäre Phosphomannose-Isomerase-Gen eingefügt zwischen dem GUS- und dem NPTII-Gen des Plasmids pBLK4 enthält.
Das Konstrukt p(BKL-mannose) wird aus E. coli isoliert und in den Agrobacterium tumefaciens-Stamm LBA4404, der das unschädlich gemachte Helferplasmid pAL4404 enthält (Hoekema et al. Nature, 303, S. 179–180 (1983); Ooms et al. Plasmid 7, S. 15–29 (1982)) durch die Einfrier-Auftau-Verfahren (Holsters et al., Mol. Gen. Genet. 163, 181–187 (1978)) transformiert.
Die Sequenz des Strukturgens (man A), das Phosphomannoseisomerase codiert, ist von Miles und Guest (Gene 32, 41–48 (1984)) veröffentlicht worden.
Axenische Stammkulturen.
Schößlingskulturen von Solanum tuberosum 'Saturna', 'Bintje' oder 'Dianella' werden gehalten, wie bei Linsmaier und Skoog (Physiol. Plant. 18: 100–127 (1965)) beschrieben, und zwar auf einem LS-Substrat (siehe unten), das mit 2 M Silberthiosulfat ergänzt ist, wobei die Temperatur 25°C beträgt, und die Kulturen Zyklen mit 16 h Licht/8 h Dunkelheit unterzogen werden. Die Stammkulturen werden nach 20–40 Tagen subkultiviert. Man entfernte die Blätter von den Schößlingen, und sie wurden zu Nodiensegmenten (ungefähr 0,8 cm) geschnitten, die jeweils einen Knoten bzw. Nodus enthielten.
Inokulation von Kartoffelgeweben.
Co-Kultivierung – Platten enthalten LS-Substrat (Saccharose 30 g/l), Agar (8 g/l), 2,4-Dichlorphenoxyessigsäure (2,0 mg/l) und trans-Zearin (0,5 mg/l).
Sprosse bzw. Schößlinge aus ungefähr 40 Tage alten Sprosskulturen (Höhe ungefähr 5–6 cm) werden in internodale Segmente (ungefähr 0,8 cm) zerschnitten. Die Segmente werden in flüssiges LS-Substrat (LS-Medium) platziert, das Agrobacterium tumefaciens enthält, der so transformiert war, dass er einen binären Vektor enthält, der Gene umfasst, von denen beabsichtigt ist, dass sie in die Kartoffelzellen eingebracht werden sollten. Zu solchen Gene zählen z. B. diejenigen, die β-Glucuronidase (GUS) codieren, das NPTII-Gen, das Resistenz gegen das Antibiotikum Kanamycin bereitstellt, und/oder Gene, die Proteine, welche am Mannose-Metabolismus beteiligt sind, zum Beispiel Mannose-6-phosphat-Isomerase, Mannose-Epimerasen, Phosphomannomutasen etc., codieren (siehe unten).
Die Agrobacterium werden über Nacht in YMB-Substrat (Dikaliumhydrogenphosphat (Trihydrat) (0,66 g/l); Magnesiumsulfat (Heptahydrat) (0,20 g/l), Natriumchlorid (0,10 g/l); Mannitol (10,0 g/l) und Hefeextrakt (0,40 g/l)), mit geeigneten Antibiotika (entsprechend dem Resistenzgen des Agrobacterium-Stamms), zu einer optischen Dichte bei 660 nm (OD-660) von ungefähr 0,8 kultiviert. Dann wird die Suspension zentrifugiert, und die Zellen in dem LS-Medium resuspendiert, so dass die OD-660 davon 0,5 beträgt.
Die oben erwähnten internodalen Segmente werden dann in der Suspension des resuspendierten Agrobacterium etwa 30 Minuten lang inkubiert, und dann wird der Überschuß an Bakterien von den Segmenten durch Abtupfen dieser auf steriles Faserpapier entfernt.
Co-Kultivierung der Schößlingssegmente und von Agrobacterium
Die Spross-Segmente werden mit Bakterien 72 Stunden lang auf Filterpapier auf LS-Substrat (wie oben definiert) in Petrischalen co-kultiviert, die mit weißen Tissue-Papiertüchern abgedeckt sind. Dieses Substrat wird hier nachfolgend als ”Co-Kultivierungs-Substrat” bezeichnet. Das Substrat und die Segmente werden mit sterilen Filterpapieren bedeckt, und die Petrischalen werden bei 25°C platziert und Zyklen von 16 h Licht/8 h Dunkelheit unterzogen.
Waschprozedur
Nach 48 Stunden der Co-Kultivierung werden die Spross-Segmente auf LS-Medium, das mit 800 mg/l Carbenicillin ergänzt ist, übertragen. Die so übertragenen Segmente werden dann sanft geschüttelt, um anhaftendes Agrobacterium abzulösen oder zu zerstören.
Selektion von transformiertem Gewebe
Die so gewaschenen Segmente werden dann auf LS-Substrat übertragen (wie oben), außer dass die trans-Zeatin-Konzentration 1 mg/l betrug, und das Substrat mit Gibberellinsäure (0,1 mg/l) und Carbenicillin (800 mg/l), und gegebenenfalls Kanamycinsulfat (50 mg/l) und/oder Mannose (0–20 g/l) und/oder Saccharose (0–20 g/l) ergänzt ist. Dieses Substrat wird hier nachstehend als ”Selektion/Regenerations-Substrat” bezeichnet.
Die Segmente werden in vierzehntägigen Intervallen oder wie unten beschrieben auf frisches Substrat subkultiviert. Innerhalb von 2 bis 4 Wochen, entwickelten sich Sprosse aus den Segmenten, und die Bildung neuer Sprosse währt etwa 3–4 Monate lang fort.
Bewurzelung der regenerierten Sprosse
Die regenerierten Sprosse werden auf Bewurzelungs-Substrat überführt, das sich aus LS-Substrat, welches mit Carbenicillin (500 mg/l) ergänzt ist, zusammensetzt.
Transfer von regenerierten Sprossen in Erdboden
Die neu bewurzelten regenerierten Sprosse (Pflanzen) (Höhe ungefähr 2–3 cm) werden vom Bewurzelungssubstrat in Erdboden umgepflanzt und in einer Wachstumskammer bei 21°C mit einem 16 Stunden Licht/8 Stunden Dunkelheit-Zyklus und 200–400 E/qm/sec-platziert. Wenn die Pflanzen ausreichend gut etabliert sind, werden sie in ein Gewächshaus übertragen, wo sie wachsen gelassen werden, bis sich Knollen entwickeln und der obere Teil der Pflanzen Seneszenz zeigt.
Überprüfung der genetischen Identität der Transformanten
Die transgenen Genotypen des regenerierten Sprosses werden überprüft bzw. verifiziert:

(a) durch Ausführen von NPTII-Assays, wie durch Radke et al. (Theor. Appl. Genet. 75, 685–694 (1988)) beschrieben; oder
(b) durch Ausführen eines GUS-Assays bezüglich des Enzyms, das durch das miteingebrachte β-Glucuronidase-Gen exprimiert wird, gemäß Hodal et al. (Plant. Sci. 87, 115–122 (1992)); oder
(c) durch Testen bezüglich der Expression der mRNA des eingebrachten Gens, das ein Enzym, beispielsweise Phosphomannose-Isomerase, kodiert, das am Mannose-Metabolismus beteiligt ist, oder durch Messen der Aktivität des Enzyms.

BEISPIEL 1
Regenerierte Pflanzen werden hergestellt, wie oben beschrieben, außer dass die Spross-Segmente nicht mit Bakterien co-kultiviert werden und der darauf folgende Waschvorgang ausgelassen wird. Die Anzahl an regenerierten Sprossen wird bis zum 40. Tag ab dem Beginn des Experiments bestimmt. Die Tabelle 1 zeigt die Inhibition der Regeneration von Sprossen aus Kartoffel-Stängelsegmenten, die nicht mit Agrobacterium transformiert worden waren, durch Mannose. Aus der Tabelle 1 kann ersehen werden, dass Mannose die Regeneration von solchen Sprossen effektiv hemmt, und dass Saccharose eine solche Regeneration fördert. Im Allgemeinen kann Mannose in den meisten Pflanzenarten nicht als eine Kohlehydratquelle verwendet werden. Wenn Mannose zu Pflanzen hinzugegeben wird, wird sie verstoffwechselt, und Mannose-6-phosphat sammelt sich an. Mannose-6-phosphat kann durch Mannose-6-phosphat-Isomerase zu Fructose-6-phosphat umgewandelt werden, wobei die umgewandelte Menge von der Aktivität der Isomerase abhängig ist. Derartiges Fructose-6-phosphat kann von Pflanzen verwertet werden, aber im Prinzip sind hohe Spiegel an Mannose (ob eine alternative Kohlenhydratquelle verfügbar ist, oder nicht) toxisch für Pflanzen. So wird, wie aus der Tabelle 1 ersehen werden kann, die Sprossbildung vollständig inhibiert, wenn sich die Mannosekonzentration auf 5–10 g/l beläuft, ungeachtet der Verfügbarkeit von Saccharose, selbst wenn diese in hohen Konzentrationen vorhanden ist. Tabelle 1 Inhibition der Regeneration von Sprossen aus nicht-transformierten Kartoffel-Stängelsegmenten durch Mannose.

Konzent. (g/l) Saccharose Konzent. (g/l) Mannose Regenerierte Sprosse/Explantat (%)

0 0 0

0 5 0

0 10 0

0 20 0

10 0 50

10 5 3

10 10 0

10 20 0

20 0 53

20 5 0

20 10 0

20 20 0
BEISPIEL 2
Regenerierte Pflanzen werden wie oben beschrieben hergestellt. Die Agrobacteria, mit denen die Spross-Segmente coinkubiert werden, sind mit dem Konstrukt p(BKL-mannose), das wie oben beschrieben erhalten wurde, transformiert, so dass die Bakterien einen Vektor beherbergen, der die Gene umfasst, die für GUS und Mannose-6-phosphat-Isomerase codieren.
Transgene(GUS+)-Sprosse werden auf Basis ihrer Fähigkeit zur Metabolisierung von Mannose in Gegenwart eines Mittels (Methyl-3-O-glucose), welches die Toxizität der Mannose gegen die Sprosse herabsetzt, selektiert. Sprosse, die GUS+ sind, werden auf der Grundlage ihrer Fähigkeit, in Gegenwart von Mannose bei einer Konzentration von etwa 5 g/l zu wachsen, selektiert.
Es wurden auch Kontrollexperimente durchgeführt, in denen die Agrobacterium, die zum Transformieren der Spross-Segmente verwendet wurden, einen Vektor ähnlich zu p(BKL-mannose) beherbergten, außer dass ihm das Mannose-6-phosphat-Isomerase codierende Gen fehlte. Es wurden keine GUS+-Transformanten erhalten, als die regenerierten transformierten Sprosse in Gegenwart von Mannose bei 5 g/l und Saccharose bei 20 g/l wachsen gelassen wurden.
BEISPIEL 3
Ein weiteres Experiment wird durchgeführt, bei dem die Agrobacterium, die zum Transformieren der Spross-Segmente verwendet werden, einen Vektor ähnlich zu p(BKL-mannose) beherbergen, außer dass ihm das Mannose-6-phosphat-Isomerase codierende Gen fehlt. Ein derartiger Vektor umfasst das NPTII kodierende Gen, das in der Lage ist, damit transformierte Zellen resistent gegenüber Kanamycin zu machen. Demzufolge werden GUS+-Transformanten auf der Grundlage ihrer Resistenz gegenüber Kanamycin, das bei einer Konzentration von 50 mg/l vorhanden ist, selektiert. In dieser letzteren Selektion ist ein geringerer Anteil, als in Beispiel 2, der selektierten Zellen GUS+.
BEISPIEL 4
Beispiel 3 wird wiederholt, außer dass die Agrobacterium mit p(BKL-mannose) transformiert werden, und die GUS+-Transformanten auf der Grundlage ihrer Fähigkeit, auf Kanamycin (50 mg/ml) zu wachsen, selektiert werden. In diesem Fall ist ein geringerer Anteil, als in Beispiel 3, der selektierten Sprosse GUS+.
BEISPIEL 5
Die standardmäßige Blattscheiben-Prozedur für Tabak, wie in Beispiel 13 der PCT/92/00252 beschrieben, wird durchgeführt, außer dass die Inokulation mit Agrobacterium und der Cokultivierungs-Schritt weggelassen werden. Benzyladenin (1 mg/l) wird als Cytokinin verwendet, und der Kohlenhydratgehalt ist wie nachstehend angegeben. Die Anzahl an regenerierten Sprossen aus jeder Blattscheibe wird nach 21 Tagen registriert.
Die Tabelle 2 zeigt, dass D-Xylose die Sprossregeneration nicht hemmt, wenn Saccharose zugegen ist, und zusätzlich, dass D-Xylose nicht als eine Kohlehydratquelle verwendet wird. D-Xylulose ist eine gute Kohlenhydratquelle während der Sprossregeneration. Tabelle 2. Test der Fähigkeit von D-Xylose und D-Xylulose, während der Sprossregeneration aus Tabakblattscheiben als Kohlenhydratquellen zu fungieren.

Xylose g/l Saccharose g/l Xylulose g/l Anzahl an regenerierten Sprossen je Blattscheibe

0 0 0 0

10 0 0 0

10 10 0 4,3

0 10 0 2,3

0 0 10 4,1

0 10 10 11,7
Xylose kann durch Xyloseisomerase in Xylulose umgewandelt werden. Dementsprechend werden ein funktionelles Xyloseisomerase-Gen und ein weiteres Strukturgen unter der Steuerung geeigneter Promotoren und Terminatoren in Pflanzen oder Teile oder Zellen davon eingebracht, und die transformierten Pflanzen, Teile oder Zellen davon werden auf Grundlage ihrer Fähigkeit, Xylose als eine Kohlenhydratquelle zu verstoffwechseln, selektiert.
BEISPIEL 6
Explantate werden hergestellt und behandelt, wie oben unter ”Selektion von transformiertem Gewebe” beschrieben, außer dass das Selektion/Regenerations-Substrat nicht mit Kanamycin oder Carbenicillin ergänzt wurde, und dass Pflanzengewebe nicht transformiert ist. Somit liegt der einzige Subkultivierungsschritt dort vor, wo die Explantate aus dem Co-Kultivierungssubstrat zum Selektion/Regenerations-Substrat, das mit Xylose bei den unten angegebenen Konzentrationen ergänzt ist, übertragen werden. Die Anzahl an regenerierten Sprossen wird nach 12 Wochen aufgezeichnet. Tabelle 3. Die Fähigkeit von D-Xylose, als Kohlehydratquelle während der Sprossregeneration aus Kartoffel-Stengelsegmenten zu fungieren.

Xylose g/l Saccharose g/l Anzahl an regenerierten Sprossen für jedes Stengelsegment

0 0 0

5 0 0

10 0 0

20 0 0

0 10 6

5 10 3

10 10 0

20 10 0
Die Tabelle 3 zeigt, dass D-Xylose (im Vergleich zu D-Mannose) ein schwacher Inhibitor der Sprossregeneration ist, wenn Saccharose vorhanden ist, und dass D-Xylose außerdem nicht als Kohlenhydratquelle in Pflanzen fungiert, die in bezug auf ein Xylose-metabolisierendes Enzym oder Protein nicht-transgen sind. Darüber hinaus erlaubte D-Xylulose (5 g/l), das Substraten in Abwesenheit von Saccharose zugegeben wurde, die Regeneration von 2,2 Sprossen pro Explantat nach 9 Wochen.
BEISPIEL 7
Beispiel 5 wird wiederholt, mit der Ausnahme, dass das Selektions/Regenerations-Substrat mit Methyl-3-O-glucose (MOG) bei den in Tabelle 4 angegebenen Konzentrationen ergänzt wird. Der Prozentsatz an lebenden Explantaten wird nach 8 Wochen registriert.
Die Tabelle 4 zeigt, dass die Co-Behandlung mit MOG die toxischen Wirkungen von Mannose auf empfindliche Pflanzengewebe hemmt. Da Mannose bei Konzentrationen toxisch ist, die optimal für Verbindungen sind, die als Kohlehydratquellen fungieren, macht es die Zugabe von MOG möglich, das Substrat mit optimalen Kohlenhydratkonzentrationen in Form von Mannose zu ergänzen.
Dies macht es möglich, Mannose als ein positives Selektionsmittel, in Abwesenheit anderer Kohlenhydratquellen, zu nutzen. Tabelle 4. Inhibition der Toxizität von Mannose durch Co-Behandlung mit Methyl-3-O-glucose (MOG).

Mannose (g/l) 0 5 10 0 5 10

Saccharose (g/l) 0 0 0 10 10 10

MOG (g/l)

0 71 4 0 100 1 4

5 13 54 0 100 100 5

10 47 82 9 100 100 41

20 50 98 88 100 100 100
BEISPIEL 8.
Das Beispiel 7 wird wiederholt, außer dass das Regenerations/Selektions-Substrat Mannose (15 g/l), Methyl-3-O-glucose bei den in Tabelle 5 angegebenen Konzentrationen enthält und keine Saccharose enthält. Das transformierte Pflanzenmaterial ist transgen bezüglich des Mannose-6-phosphat-Isomerase-Gens. Nach 21 Tagen werden die selektierten Sprosse geerntet. Alle geernteten Sprosse werden bezüglich der Expression des miteingeführten β-Glucuronidase-Gens getestet, und die Gesamtzahl (aus 2 Ernten) an transgenen β-Glucuronidase exprimierenden (GUS+)-Sprossen je Explantat wird berechnet, wie auch die Fraktion der β-Glucuronidase exprimierenden (GUS+) Sprosse an der Gesamtzahl an selektierten Sprossen (Tabelle 5.).
Die Tabelle 5 zeigt, dass, wenn Mannose zusammen mit Methyl-3-O-glucose zugesetzt wird, die Selektion von transgenen Sprossen sogar bei hohen Konzentrationen an Mannose, in Abwesenheit von anderen Kohlenhydratquellen, möglich ist. Tabelle 5. Der Effekt von Methyl-3-O-glucose auf die Selektion von transgenen Sprossen auf Mannose enthaltenden Substraten ohne Saccharose.

Mannose (g/l) 15 15 15 15 15

MOG (g/l) 0 2,5 5,0 10 15

GUS+ Sprosse/Explantat 0 0,2 1,0 0,5 0,6

GUS+ Sprosse/sel. Sprosse (%) 0 57 81 89 53
BEISPIEL 9

Das Beispiel 8 wird wiederholt, außer dass MOG durch Phloridzin ersetzt wird. Die Tabelle 6 zeigt, dass, wenn Mannose zusammen mit Phloridzin zugesetzt wird, die Selektion von 100% transgenen Sprossen bei hohen Konzentrationen an Mannose in Abwesenheit von anderen Kohlenhydratquellen möglich ist. Dies ist ein Beispiel dafür, wie Kreuz-Ernährung und die Produktion von Ausweichstoffen durch die Zugabe eines Kohlenhydrat-Transportinhibitors minimiert werden kann. Tabelle 6

0,5 g/l Phloridzin
g/l Mannose	GUS+ Sprosse/Sel. Sprosse		GUS+ Sprosse/Expl.
	+ Saccharose	÷ Saccharose	+ Saccharose	÷ Saccharose
5,0	94,0%	100,0%	1,2	0,08
7,5	88,0%	78,5%	0,5	0,5
10,0	100,0%	95%	0,5	0,5
12,5	100%	-	0,03	0,0
15,0	100%	-	0,03	0,0

BEISPIEL 10
Die Tabelle 7 zeigt an, dass andere Verbindungen außer Mannose als Selektionsmittel in transgenem Pflanzengewebe verwendet werden können, welches unter anderem das Mannose-6-phosphat-Isomerase-Gen aus E. coli umfasst. Tabelle 7. Anzahl an regenerierten Sprossen pro Explantat, selektiert mittels Verbindungen zusätzlich zu Mannose.

Anzahl an regenerierten Sprossen pro Explantat

Verbindung Genotyp

Wildtyp M-6-P-Isomerase

D-Mannose 0 1,1

D-Mannosamin 0 0,8

D-Mannose-6-phosphat 0 0,7
BEISPIEL 11

Zuckerrübe wird durch die sogenannte cot-pet-Methode transformiert, wie in der PCT-Patentanmeldung Nr. PCT/DK 92/00108 beschrieben, wobei Cotyledonen einschließlich des Blattstiels bzw. der Petiole als Explantate verwendet werden. Sämlinge werden aus Samen abgeleitet, die keimen und während 4–7 Wochen bei 12°C in einem 16 h-Tag/8 h-Nacht-Schema wachsen gelassen wurden. Cotyledonen werden 2–3 mm unterhalb des Knotens abgeschnitten, auseinander gerissen und entweder im Dunklen oder im Licht und in Gegenwart oder Abwesenheit von Xylose kultiviert. Die Tabelle 8 zeigt, dass Xylose von Zuckerrüben als eine Kohlenhydratquelle in Gegenwart von Licht verwertet wird, nicht aber bei Dunkelheit, was anzeigt, dass eine Xylose-basierte Positivselektion von Zuckerrüben, die unter anderem transgen für das Xyloseisomerase-Gen sind, im Dunkeln durchgeführt werden sollte. Tabelle 8

Untersuchung des Effekts von D-Xylose in Zuckerrüben in Kombination mit Saccharose mit und ohne Licht
Ergebnisse nach 3 Wochen (Licht)
D-Xylose (g/l)	Saccharose (g/l)	% Expl. mit Sprossen	Gewicht (nass) (g)	Grün (%)
0	10	98	7,41	100
0	0	13	0,64	60
10	0	90	1,53	90
10	10	97	5,47	100

Ergebnisse nach 2 Wochen Dunkelheit und 1 Woche Licht
D-Xylose (g/l)	Saccharose (g/l)	% Expl. mit Sprossen	Gewicht (nass) (g)	Grün (%)
0	10	50	1,38	97
0	0	0	0,36	47
10	0	13	0,37	77
10	10	80	0,89	97

BEISPIEL 12

Explantate, die, unter anderem, transgen für das Mannose-6-phosphat-Isomerase-Gen sind, werden hergestellt, und das Selektion/Regenerations-Substrat wird mit Mannose und Saccharose ergänzt, wie es in der Tabelle 9 angegeben ist. Die Anzahl an regenerierten Sprossen wird nach 11 Wochen registriert. Die Tabelle 9 zeigt die Anzahl an regenerierten Sprossen auf Substraten, die Methyl-3-O-glucose enthalten, als einen Prozentsatz der Anzahl an Sprossen, die auf Substraten ohne Mannose und Methyl-3-O-glucose regeneriert wurden. Tabelle 9

Methyl-3-O-glucose (g/l)
Mannose g/l	Saccharose g/l	Wildtyp		Man-6-P-Isomerase
Mannose g/l	Saccharose g/l	2,5	5,0	2,5	5,0
0	0	0	0	0	0
5	0	0	0	7	0
10	0	0	0	64	28
20	0	0	0	107	128

0	10	53	17	0	0
5	10	6	41	64	64
10	10	0	0	86	36
20	10	0	0	200	86

Die Regeneration von Sprossen auf Substrat, das Saccharose (10 g/l), keine Mannose und keine Methyl-3-O-glucose enthält:

Transgenes Gewebe: 1,4 Sprosse/Explantat

Wildtyp-Gewebe: 1,7 Sprosse/Explantat
Es wird richtig eingeschätzt werden, dass die vorliegende Erfindung nicht auf die oben dargelegten Beispiele beschränkt ist. Zum Beispiel kann die gewebespezifische Expression eines Gens, das ein Enzym codiert, das am Mannose- oder Xylose-Metabolismus oder dem Metabolismus eines Mannose- oder Xylosederivats oder eines Mannose- oder Xylosevorläufers beteiligt ist, verwendet werden, um die entwicklungsmäßige Regulierung derartiger Gewebe bei Aussetzung dieser an das Substrat des Modulators des genannten Enzyms zu steuern. Außerdem kann Mannose oder Xylose (einschließlich Derivaten oder Vorläufern von diesen) als ein selektives Herbizid verwendet werden, um selektiv Nutzpflanzen zu begünstigen, die transformiert worden sind, so dass sie Gene einschließen, die Proteine codieren, welche am Metabolismus solcher Xylose oder Mannose oder deren Vorläufern oder Derivaten beteiligt sind.
Es wird auch richtig eingeschätzt werden, dass die Anwendung des Verfahrens gemäß der Erfindung folgendes ergeben kann:

i) eukaryotische Organismen, die allgemein oder in manchen Geweben/Zelltypen erniedrigte Spiegel an Fructose-6-phosphat, oder Derivaten davon, dank der Einbringung eines beispielsweise Phosphomannoisomerase codierenden Gens, aufweisen;
ii) eukaryotische Organismen, die allgemein oder in manchen Geweben/Zelltypen erhöhte Spiegel an Mannose-6-phosphat, oder Derivaten davon, dank der Einbringung eines beispielsweise Phosphomannoisomerase codierenden Gens, aufweisen;
iii) eukaryotische Organismen, die in allen oder manchen Zelltypen erhöhte Phosphomannoisomerase-Aktivität dank der Einbringung eines Phosphomannoisomerase codierenden Gens in die Zellen davon aufweisen.

Schlüssel zu den Figuren
Fig. 1

PstI/BamHI digest = PstI/BamHI-Verdau
ligation = Ligation
BclI/BamHI digest = BclI/BamHI-Verdau

Fig. 2

ca. 3.7 kb = ca. 3,7 kb
DW2t: CaMV terminator Pst-KpnI fragment isolated from the pDW2 plasmid = DW2t: CaMV-Terminator, Pst-KpnI-Fragment, das aus dem pDW2-Plasmid isoliert wurde.

Fig. 3

term. = -Terminator
Restriction sites = Restriktionsstellen
ligated into = einligiert in
filled in HindIII site, filled in HindIII site blunt end ligated with SmaI = Aufgefüllte HindIII-Stelle, glattendig ligiert mit SmaI.
Coding sequence = codierende Sequenz
Direction unknown = Richtung unbekannt

Fig. 4

Right border = Rechte Border
Left border = Linke Border
promoter = -Promotor
terminator = -Terminator
13.95 Kb = 13,95 Kb

Claims

Verfahren zur Identifizierung oder Selektion aus einer Population von Pflanzenzellen, die aus der Gruppe ausgewählt ist, bestehend aus Früchten, kleinkörnigen Getreiden, Gemüse, Canola, Sonnenblume, Tabak, Zuckerrübe, Mais und Baumwolle, die auf oder in einem Medium kultiviert werden, das mindestens eine Verbindung enthält, von Zellen, die einen metabolischen Vorteil als Ergebnis davon aufweisen, dass sie transformiert worden sind, wobei (i) die Zellen mit einer Nucleotidsequenz oder einer miteingebrachten Nucleotidsequenz transformiert werden, wovon eine eine Region umfasst, die ein Enzymprotein codiert, das am Metabolismus der Verbindung beteiligt ist, die aus der Gruppe ausgewählt ist, bestehend aus Phosphozuckerisomerasen, Phophozuckermutasen, Phosphatasen und Zuckerepimerasen; (ii) die Verbindung Mannose oder Xylose oder ein Derivat oder ein Vorläufer von diesen oder ein Substrat des Enzymproteins, das entweder direkt oder indirekt am Metabolismus von Mannose oder Xylose beteiligt ist, ist, (iii) ein Mittel zugegeben wird, das die Toxizität der Verbindung gegenüber den Zellen herabsetzt.
Verfahren zur Identifizierung oder Selektion aus einer Population von Pflanzenzellen, die aus der Gruppe ausgewählt ist, bestehend aus Früchten, kleinkörnigen Getreiden, Gemüse, Canola, Sonnenblume, Tabak, Zuckerrübe, Mais und Baumwolle, die auf oder in einem Medium kultiviert werden, das mindestens eine Verbindung enthält, von Zellen, die einen metabolischen Vorteil als Ergebnis davon aufweisen, dass sie transformiert worden sind, wobei (i) die Zellen mit einer Nucleotidsequenz oder einer miteingebrachten Nucleotidsequenz transformiert werden, wovon eine eine Region umfasst, die ein Enzymprotein codiert, das am Metabolismus der Verbindung beteiligt ist, die aus der Gruppe ausgewählt ist, bestehend aus Phosphozuckerisomerasen, Phophozuckermutasen, Phosphatasen und Zuckerepimerasen; (ii) die Verbindung Mannose oder Xylose oder ein Derivat oder ein Vorläufer von diesen oder ein Substrat des Enzymproteins, das entweder direkt oder indirekt am Metabolismus von Mannose oder Xylose beteiligt ist, ist, mit der Maßgabe, dass die Verbindung nicht Mannose ist, wenn das Protein Mannose-6-phosphat-Isomerase ist.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 oder 2, wobei mindestens eine der Nucleotidsequenzen DNA umfasst, die so modifiziert wurde, dass Kodons, die von dem Organismus bevorzugt werden, in den die Sequenzen inseriert worden sind, verwendet werden, so dass die Expression der so modifizierten DNA in dem Organismus ein im Wesentlichen zu demjenigen ähnliches Enzymprotein ergibt, das durch Expression der unmodifizierten DNA in dem Organismus erhalten wird, in dem die Enzymprotein-codierenden Komponenten der Sequenzen endogen sind.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3, wobei die Zellen mit einer Nucleotidsequenz transformiert wurden, die regulatorische Sequenzen enthalten, die die Expression der Nucleotidsequenz ermöglichen.
Verfahren nach Anspruch 4, wobei die regulatorischen Sequenzen Promotoren und Transcriptionsterminatoren sind.
Verfahren nach Anspruch 5, wobei die Zellen mit einer Nucleotidsequenz transformiert wurden, die einen exogenen Promotor codieren, der zur homologen Rekombination mit einer DNA-Sequenz in oder in der Nähe eines Strukturgens, das durch den Promotor gesteuert zu werden vermag, in der Lage ist.
Verfahren nach einem der Ansprüche 5 oder 6, wobei der Promotor ein konstitutiver Promotor ist.
Verfahren nach einem der Ansprüche 5 oder 6, wobei der Promotor ein regulierbarer Promotor ist.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 8, wobei die Nucleotidsequenzen zusammen in die Pflanzenzellen eingebracht werden.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 8, wobei die Nucleotidsequenzen unabhängig in die Pflanzenzellen eingebracht werden.
Verfahren nach einem der Ansprüche 9 oder 10, wobei mindestens eine der zusammen oder unabhängig eingebrachten Nucleotidsequenzen virale, fungale, bakterielle oder nematodische Resistenz bereitstellt.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 11, wobei die Verbindung Mannose ist.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 12, wobei die Verbindung Mannose ist und das Nucleotid oder die miteingebrachte Nucleotidsequenz Mannose-6-phosphatisomerase codiert.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 11, wobei die Verbindung Mannose-6-phosphat, Xylose oder D-Mannosamin ist.
Verfahren nach Anspruch 14, wobei die Verbindung Xylose ist.
Verfahren nach Anspruch 15, wobei das Enzym Xyloseisomerase ist.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 11, wobei die Phosphozuckermutase Phosphomannomutase ist und die Phosphatase Mannose-6-phosphatase ist.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 17, wobei die Pflanzenzellen durch ein Verfahren transformiert werden, das aus der Gruppe ausgewählt ist, bestehend aus Elektroporation, Mikroinjektion, Verwendung der Mikroprojektilpistole und Transformation mit den Ri- und Ti-Plasmiden.
Verfahren nach Anspruch 18, wobei die Pflanzenzellen unter Verwendung einer Agrobacterium-Spezies transformiert werden.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 19, wobei die transformierten Zellen unter Verwendung einer Kombination von Positiv- und Negativselektion selektiert werden, wobei die Nucleotidsequenz in den transformierten Zellen zusammen mit einer weiteren Nucleotidsequenz eingebracht wird, die Resistenz gegenüber mindestens einem Vertreter codiert, der aus der Gruppe ausgewählt ist, bestehend aus Toxinen, Antibiotika und Herbiziden, und das Medium in oder auf dem die Zellen kultiviert werden, mindestens einen Vertreter umfasst, der aus der Gruppe ausgewählt ist, bestehend aus Toxinen, Antibiotika und Herbiziden, wogegen die transformierten Zellen resistent gemacht werden.
Verfahren nach Anspruch 20, wobei die Nucleotidsequenz zusammen mit mindestens 2 verschiedenen Selektionsgenen eingebracht wird.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 und 3 bis 21, wobei das Toxizität-herabsetzende Mittel aus der Gruppe ausgewählt ist, bestehend aus Methyl-3-O-glucose und Phloridzin.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 22, wobei die Pflanzenzellen aus Tomaten, Mangos, Pfirsichen, Äpfeln, Birnen, Erdbeeren, Bananen und Melonen stammen.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 22, wobei die Pflanzenzellen aus einer Pflanze stammen, die aus der Gruppe ausgewählt ist, bestehend aus Canola, Sonnenblume, Tabak, Zuckerrübe, Mais und Baumwolle.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 22, wobei die Pflanzenzellen aus einer Pflanze stammen, die aus der Gruppe ausgewählt ist, bestehend aus Weizen, Gerste und Reis.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 22, wobei die Pflanzenzellen aus einer Pflanze stammen, die aus der Gruppe ausgewählt ist, bestehend aus Kartoffeln, Karotten, Kopfsalat, Kohl und Zwiebeln.