UA57696C2 - Спосіб ідентифікації або селекції еукаріотичних клітин та трансформовані клітини - Google Patents

Abstract

Введення до популяції еукаріотичних клітин нуклеотидної послідовності, що кодує білок, наприклад фермент маннозо-6-фосфат ізомеразу, коли живильне середовище містить сполуку, токсичну для клітин або таку, що пригнічує їхній ріст, наприклад маннозу, при додаванні реагенту, що знижує токсичність або інгібуючу дію, дозволяє ідентифікувати і селекціонувати трансформовані клітини без небезпеки загибелі нетрансформованих клітин у популяції і без спільного введення генів стійкості до антибіотиків і гербіцидів (позитивна селекція). Позитивна селекція також спрощує використовувані векторні конструкції, тому що той самий ген може бути використаний у якості як репортерного, так і селективного гена.

Description

Опис винаходу

Предметом настоящего изобретения является способ селекции генетически трансформированньмх клеток, 2 при котором требуемую нуклеотидную последовательность вводят посредством обеспечения трансформированньїх клеток селективньм преймуществом. Селективное преимущество, которьм обладают трансформированнье клетки, может иметь место благодаря их усиленной по сравнению с нетрансформированньіми клетками способностью использовать вносимое соединение в качестве питательного вещества, фактора роста или источника знергии.

Известно, что в том случає, когда генетический материал должен бьть введен в популяцию клеток посредством трансформации, успешно трансформируеєется только определенное количество клеток.

Мдентификацию и оотделение трансформированньх клеток традиционно производят с применением "отрицательной селекции", при которой трансформированньсе клетки способнь! вьіживать и расти, в то время как нетрансформированнье клетки подвергаются ростовому ингибированию или, возможно, даже убиваются 72 веществом, к которому трансформированньєе клетки проявляют устойчивость в силу их трансформации.

Например, в случае трансформации популяции растительньїх клеток селекция трансформированньх клеток обьічно базируется на наличии в трансформированньїх клетках "селективного гена", которьій придает им устойчивость к антибиотику или гербициду. Селективньй ген, которьій сам по себе может не вьбіполнять никакой полезной функции в трансформированном растений (а может бьїть даже нежелательньм для растения), спаривают или вводят совместно с требуеємьм геном, которьій необходимо ввести в растениє, так что оба гена вводятся в популяцию клеток или, что правильнее, в определеннье клетки популяции, поскольку трудно, если не невозможно, практически трансформировать все клетки. Затем клетки культивируют на/в среде, содержащей антибиотик или гербицид, к которому генетически трансформированнье клетки обладают устойчивостью в силу наличия в них селективного гена, что позволяет идентифицировать трансформированнье клетки, поскольку с 22 нетрансформированньюе клетки, которье не содержат гена устойчивости к антибиотику или гербициду, Го) подвергаются ростовому ингибированию или погибают.

Подобнье методьй отрицательной оселекции ообладают рядом недостатков. Например, нетрансформированнье клетки могут погибать из-за присутствия антибиотиков или гербицидов в ростовой среде. В результате в том случає, когда популяция клеток представляет собой организованную ткань, о 30 существуєт опасность, что могут погибнуть не только нетрансформированнье клетки, но также и (с) трансформированньюе клетки в силу того, что гибель нетрансформированньх клеток может прервать поступление питательньїх веществ к трансформированньмм клеткам, либо в силу того, что угнетенньюе или о погибающие нетрансформированньсе клетки могут вьіделять токсичнье соединения. ї-

Другим недостатком отрицательной селекции является то, что присутствие несущественного гена, 35 например, гена, кодирующего устойчивость к антибиотику, является нежелательньм. Среди исследовательских о групп и государственньїх органов существуют определеннье сомнения в том, насколько безопасно вводить гень! антибиотикоустойчивости в растения и микроорганизмь. Зто опасение особенно существенно в отношений пищевьх растений и микроорганизмов, которне не предназначеньь для применения в замкнутьїх системах « (например, микроорганизмь!ї, предназначеннье для применения в сельском хозяйстве), также как и в отношений З 40 микроорганизмов, которье предназначеньь для применения в замкнутьх системах, но могут случайно с проникнуть за их предельїі. з» Другим недостатком отрицательной селекции является то, что растительнье ткани или клетки, обработаннье токсичньми веществами, становятся более чувствительньми к бактериальной инфекции. Зто представляет проблему при применениий в качестве вектора для трансформации Адгобрасіегічт, поскольку 45 обработанньює ткани или клетки иногда зарастают бактерией, даже при применении антибиотиков для і-й предотвращения бактериального роста. -і Кроме того, селекция клеток или тканей с применением отрицательной селекции требует строгого подбора времени зкспрессиий вводимьх генов по отношению к селекционному процессу. Если трансгеннье клетки б обработают токсичньім соегдинением перед тем, как произойдет зкспрессия гена детоксикации или перед тем,

Те) 20 как продуцируеєтся достаточно генньїх продуктов для того, чтобь! ослабить действиє токсичного соединения, то как трансгенньюе, так и нетрансгеннье клетки будут убитьі. Если селекцию проводят слишком поздно, то с селекции трансгенньїх клеток или тканей может помешать, например, формирование побега или каллуса из нетрансформированньїх клеток или тканей, которьй создаст барьер для проникновения соединения, применяемого для селекции трансформированньх клеток.

Вьішеуказаннье недостатки устраняются, по меньшей мере в значительной степени, способом согласно

ГФ) настоящему изобретению (именуемому "положительная селекция" или комбинированная "положительная/отрицательная селекция"), которьій делает возможной идентификацию и изоляцию генетически о трансформированньїх клеток без опасности гибели нетрансформированньїх клеток в популяции и без необходимости совместного введения генов устойчивости к антибиотикам или гербицидам. В дополнение к тому 60 факту, что устраняется потребность в генах антибиотико- или гербицидоустойчивости, способ положительной селекции согласно настоящему изобретению часто является намного более зффективньі!м, чем традиционная отрицательная селекция, а сочетание положительной и отрицательной селекции обеспечивает частоту селекции трансгенньїх побегов такую же, если не более вьісокую, чем частота, наблюдаемая при применений только одной оотрицательной селекции. Кроме того, применение положительной селекции дает то бо преимущество, что один ген может бьть использован в качестве как репортерного гена, так и селективного гена,

что приводит к упрощению векторньїх конструкций, большей стабильности таких конструкций и 10095-ной корреляции между зкспрессией репортерного и селективного генов.

Положительная селекция также может устранить вьішеизложеннье проблемь! в отношений вьібора времени, так как селективнье соединения могут продуцироваться в следствий действия генньїх продуктов, образованньх в результате зкспрессии введенного гена, на специфические субстратьі. Позтому селективное соединение может накапливаться как следствие зкспрессии селективного гена, а селективное действие появляется тогда, когда продуцируется достаточное количество селективного соединения.

Согласно настоящему изобретению предлагается способ идентификации или селекции из популяции /о зукариотических клеток, культивируемьх на/в среде, содержащей по меньшей мере одно соединение, клеток, обладающих метаболическим преимуществом, являющимся результатом их трансформации, при котором: а) клетки трансформируют нуклеотидной последовательностью или вводимой совместно нуклеотидной последовательностью, одна из которьїх содержит область, которая(а) кодирует белок, участвующий в метаболизме указанного соединения, и/или (б) регулирует активность гена, кодирующего указанньй белок; и б) /5 соединение является маннозой или ксилозой либо их производньім или предшественником, либо субстратом для белка, либо оно может бьіть метаболизировано трансформированньіми клетками в такой субстрат, причем указанное соединение не является маннозой в случае, когда белок является маннозо-б6-фосфат-изомеразой.

Изобретение включает также способ идентификации или селекции из популяции зукариотических клеток, культивируемьїх на/в среде, содержащей по меньшей мере одно соединение, клеток, которне обладают 2о метаболитньім преимуществом, являющимся результатом их трансформации, при котором: а) клетки трансформируют нуклеотидной последовательностью или совместно вводимой нуклеотидной последовательностью, одна из которьїх содержит область, которая: (а) кодирует белок, участвующий в метаболизме указанного соединения, и/или (б) регулирует активность гена, кодирующего указанньй белок; и б) в среду добавляют реагент, которьій понижает токсичность указанного соединения для клеток. с

Предпочтительно, чтобь в том случаеє, когда реагент, понижающий токсичность, добавляют в культуральную среду, указанное соединение являлось бьі маннозой, а нуклеотидная последовательность или совместно і) вводимая нуклеотидная последовательность кодировала бьії маннозо-б6-фосфат-изомеразу.

Клетки, которне обладают "метаболитньм прейимуществом", помимо прочего способнь! к более бьістрому росту по сравнению с клетками, не обладающими таким преймуществом, и/или способньй утилизировать (о зо субстрать! (такие как предшественники питательньїх веществ и др.) которне клетки, не обладающие зтим преимуществом, утилизировать не способнь, и/или способньі! детоксифицировать субстрать!, которье являются б» токсичньїми или ингибирующими иньїм способом рост клеток, не обладающих указанньім преимуществом . «о

Белок, которьій "участвует в метаболизме соединения", является, как правило, но не исключительно, ферментом, которьій может бьіть ответственньім, прямо или косвенно, за продуцирование или утилизацию - з5 указанного соединения либо его производньїх или предшественников. Белок может таюке участвовать в ю метаболизме соединения, если он связьвается с ним, переносит из одного сайта в другой в пределах клетки либо ткани или организма или, в противном случає, изолирует его, изменяя тем самьм его локальную доступность.

Область нуклеотидной последовательности, "которая регулирует активность гена, кодирующего белок", « Может изменять уровень зкспрессии зндогенного гена в силу того, что она является промотором либо обладаєт (ЦЗ с промоторной активностью и локализована вблизи него. Под понятием "вблизи" подразумевают участок длиной до 10000т.п.о. С другой стороньії, непрямая регуляция может являться результатом изменения связьівания ;» РНК-полимеразьї с промотором структурного гена, кодирующего белок, или комплиментарного связьівания нуклеотидной последовательности с по меньшей мере частью структурного гена, понижая тем самьм

Количество белка в клетке. с Под "производньім" маннозьі или ксилозьі понимают любое соединение, способное утилизироваться, связьнваться, являться субстратом для или продуктом любого белка, участвующего, прямо или косвенно, в ш- метаболизме маннозь или ксилозьі В случаеє маннозьі к числу подобньїх производньїх относятся углеводь, б такие как глюкоза или галактоза, которне могут подвергаться действию зпимераз с образованием маннозь! либо ве производньїх или предшественников. Термин "производное" включает также остатки маннозь! или ксилозь, і, имеющие одну или более гидроксильньх групп, с которьіми остатки связань! ковалентной или ионной связью. К

Ф числу подобньїх связанньїх остатков относятся сложнозфирнье, зфирньсе группьі, аминогруппьі, амидогруппь, фосфатньсе группьі, сульфатнье группьї, карбоксильнье группьї, карбокси-алкильнье группьі и их сочетания.

Производньсе маннозь или ксилозь!ї могут включать также предшественников маннозьї или ксилозь! при условии, 5Б что модифицирующие группь могут бьіть удалень с образованием маннозь! или ксилозьі.

Термин "клетка" в контексте изобретения включает протопластьі, термин "популяция" включаеєт ткань, орган (Ф, или его часть, популяцию отдельньїхх клеток в/на субстрате либо цельй организм, например, растение. ка Настоящее изобретение включает также трансформированньсе клетки, которне селектируют с применением способа по изобретению, и такие трансформированньсе клетки, которье являются растительньми клетками, а бр таюке растения, потомство, или семена, полученнье из таких клеток. К числу растений, которье могут бьть отселектированьі согласно изобретению, относятся: фруктьї, включая томать, манго, персики, яблоки, груши, землянику, бананьй и дьню; полевье культурьі, такие как канола, подсолнечник, табак, сахарная свекла, зерновье с мелким зерном, такие как пшеница, ячмень и рис, кукуруза и хлопок, овощи, такие как картофель, морковь, салат, капуста и лук. 65 Найболее предпочтительньїми растениями являются сахарная свекла и кукуруза.

Применение настоящего способа положительной селекции іп міо найболее целесообразно, например, в применений к трансформации, проводимой на цельїх растениях или частях растений, при которой растения или их части содержат как трансформированньюе, так и нетрансформированнье клетки, поскольку селекцию трансформированньїх клеток проводят без непосредственного повреждения соседних нетрансформированньх Кклеток. Позтому трансформированнье клетки обладают селективньм "преимуществом" по сравнению с нетрансформированньіми клетками (например, способность формировать побеги), но нетрансформированньм клеткам не наносится при зтом никакого ущерба в том смьсле, что они могут бьіть повреждень или убить, как в случає отрицательной селекции с применением антибиотиков или гербицидов. "Селективное преимущество", которьім обладают трансформированнье клетки, может, как правило, 7/0 являться отличием или преимуществом, позволялющим идентифицировать трансформированнье клетки простьім визуальнь!м способом, то есть без применения специального анализа для определения присутствия маркерного гена.

Популяцию клеток можно культивировать в/на среде, содержащей по меньшей мере одно соединение, которое может бьіть неактивньім и которое прямо или косвенно активируется в трансформированньйх клетках, /5 Зо соединение является неактивньм в нетрансформированньїх клетках или менее активньм в нетрансформированньїх клетках по сравнению с трансформированньми клетками таким образом, чтобь трансформированнье клетки обладали селективньмм прейимуществом, позволяющим проводить их селекцию из клеточной популяции.

Популяцию клеток можно также культивировать в/на среде, содержащей соединение, которое становится го доступньм для трансформированньх клеток за осчет озкспрессий или транскрипции нуклеотидной последовательности, при зтом такое соединение не является доступньім для нетрансформированньїх клеток или является менее доступньім для нетрансформированньїх клеток, посредством чего трансформированнье клетки приобретают селективное прейимущество.

В том случає, когда полипептид, кодируемьшй нуклеотидной последовательностью, прямо активирует с ге Ннеактивное соединение в трансформированньїх клетках, нетрансформированньюе клетки могут зндогенно о содержать или продуцировать определенное количество указанного полипептида, которьій чаще всего может представлять собой фермент. В таких случаях нет необходимости в том, чтобьі "неактивное соединение" бьіло полностью неактивньім в нетрансформированньх клетках, так как может оказаться вполне достаточньм, чтобь соединение или питательное вещество бьіло лишь существенно менее активньм в нетрансформированньх «о зо клетках по сравнению с трансформированньми клетками. Другими словами, качественное отличие трансформированньїх и нетрансформированньїх клеток в отношений активации изначально неактивного ме) соединения может являться достаточньім критерием для проведения селекции. В таких случаях к клеткам могут «о бьїть добавленьй ингибиторьї или субстрать, которье конкурируют с нативньми ферментами. Особенно подходящими являются ингибиторьї, активируемье нативньми ферментами, приводящими к - з5 самокатализируемому продуцированию зтого активного ингибитора в количестве, при котором указанньй ю лативньій фермент является по существу полностью ингибированньм.

Клетки также могут бьїть трансформированьі совместно вводимой нуклеотидной последовательностью, которая может кодировать пермеазу или другой транспортньй фактор, которьій позволяет соединению проникать через клеточную мембрану и поступать в трансформированнье клетки либо проникать через другую « (органельную) мембрану, так что "активация" неактивного соединения включаєт селективное поглощение в с соединения трансформированньми клетками, а поглощение нетрансформированньми клетками невозможно либо происходит в меньшей степени. Вместо того, чтобьї облегчать проникновение соединения в клетку, з совместно вводимая нуклеотидная последовательность может, напротив, направлять свой продукт в область, в которой локализовано неактивное соединениє, например за плазменную мембрану или в вакуоль либо зндоплазматический ретикулум. с В том случає, когда две нуклеотиднье последовательности совместно вводят в клетки, они могут бьть спареньі друг с другом либо вводиться совместно таким образом, что присутствие одной нуклеотидной - последовательности в клетке указьівает на присутствие или на повьішенную вероятность присутствия в клетке б другой последовательности. Зти две нуклеотидньіе последовательности являются, таким образом типичной, 5р Хотя и не необходимой частью одной и той же генетической конструкции и могут бьїть введеньії с помощью ісе) одного и того же вектора.

Ф Поскольку необходимо, чтобьі вводимье нуклеотиднье последовательности зкспрессировались в трансформированньх клетках, генетическая конструкция, содержащая две нуклеотиднье последовательности, обьчно имеет регуляторнье последовательности, способствующие зкспрессии // нуклеотидньх 5Б последовательностей, например, известнье промоторьі и терминаторьї транскрипции. Таким образом, совместно вводимая нуклеотидная последовательность обьічно ассоциирована с промотором, которьій может

Ф) бьіть констуитивнь!м или регуляторньм. ка Описаннье здесь способь! могут бьть таюке опримененьй в случає, когда две нуклеотиднье последовательности вводят независимо. Зто может бьіть осуществлено, например, путем использования одной вом той же бактерии для введения обоих генов и введения относительно большого количества копий требуемой нуклеотидной последовательности в клетку, в силу чего относительно вьісока вероятность того, что клетки, которье, как показано, зкспрессируют совместно вводимую нуклеотидную последовательность, также будут содержать и зкспрессировать требуемую нуклеотидную последовательность. Независимое введение двух или более генов, приводящее к совместной зкспрессии генов в одной и той же клетке имеет, как можно ожидать, 65 низкую вероятность, а улучшенньсе частоть! селекции, имеющие место при реализации способа положительной селекции, как следует позтому ожидать, являются особьім преимуществом в таких системах.

Соединение, применяемое для целей селекции, может, кроме того, оказьівать как положительное, так и отрицательное действие. Например, манноза в достаточно вьісоких концентрациях токсична для большинства растений, но в клетках, содержащих ферменть), метаболизирующие маннозу, ее отрицательное влияние Злимировано, и клетки дополнительно получают преимущество, заключающееся в способности использовать маннозу в качестве источника углеводов. В зтом случае одно соединение и один ген совместно обеспечивают комбинированную систему положительной и отрицательной селекции, хотя такая система может бьїіть создана и с применением двух или более генов, которье совместно отвечают за ингибирование отрицательного воздействия соединения и за проявление положительного воздействия соединения в трансформированньмх /о клетках.

В дальнейшей реализации способа, зкспрессия и транскрипция нуклеотидной последовательности приводит

Кк блокировке метаболизма соединения, вносимого в популяцию клеток, или блокировке синтеза соединения в трансформированньїх клетках, в силу чего трансформированньюе клетки могут бьіть идентифицировань! или отселектированьї от нетрансформированньмх клеток.

В дальнейшей реализации способа, трансформированнье клетки могут бьть отселектировань! путем применения комбинации положительной селекции и отрицательной селекции, нуклеотидную последовательность в трансформированнье клетки обьічно вводят совместно с дополнительной нуклеотидной последовательностью, кодирующей устойчивость к по меньшей мере одному компоненту, вьібранному из группьі, состоящей из токсинов, антибиотиков и гербицидов, а среда в/на которой клетки культивируют, 2о содержит, по меньшей мере, один компонент, вьібранньй из группьі, состоящей из токсинов, антибиотиков и гербицидов, к которьім трансформированньюе клетки оказьвшаются устойчивьми. Предпочтительно, чтобь нуклеотидную последовательность вводили совместно с по меньшей мере двумя различньіми селективньми генами.

Предпочтительно, чтобьі соединение являлось маннозой или ксилозой. Как бьло показано вьше, с 2г5 бсоединение, однако, может представлять собой производное маннозьі, например, манно-зо-б-фосфат, или производное ксилозь, такое как ксилозофосфат, либо предшественник маннозь! или ксилозь. і)

Клетки могут бьіть трансформированьї любой нуклеотидной последовательностью, предназначенной для введения в них. Такая нуклеотидная последовательность может кодировать геньї, придающие вирусную, грибную, бактериальную устойчивость либо устойчивость к нематодам. «о зо Клетки могут бьіть трансформировань! бактерией, такой как бактерия рода Адгобасіегішт, чувствительной к указанному соединению, так что селекция трансформированньїх клеток с помощью указанного соединения б» приобретает прейимущество, заключающееся в том, что уменьшается опасность послетрансформационного «о заражения трансформированньїх клеток бактерией. Следует отметить, что клетки могут бьть трансформированьй любьм из приемлемьмх известньїх способов, включая злектропорацию, - з5 Микроиньекцированиє, применение микрозарядной пушки и отрансформацию Кі- и Ті-плазмидами. ю

Трансформированнье клетки в соответствующих случаях могут бьїть регенерированьі в целье растения, в которьїх рекомбинантная ДНК стабильно введена в геном.

Предпочтительно, чтобьі белок представлял собой фермент, участвующий в метаболизме маннозь! или ксилозьі. К числу таких ферментов относятся ксилозоизомеразь, фосфоманнозоизомеразьІ, такие как « маннозо-6-фосфат-изомераза; маннозо-1-фосфат-изомераза; фосфоманномутаза, маннозозпимеразьа, пт») с которье превращают углеводьі в маннозу или маннозу в такие углеводьї как глюкоза и галактоза; фосфатазь,

Й такие как маннозо-б-фосфатаза и маннозо-1-фосфатаза; и пермеазь, которне участвуют в транспорте маннозь, а либо ее производного или предшественника, в клетку.

Реагентом, понижающим токсичность соединения для клеток, обьічно является производное глюкозь!, такое

Как метил-3-О-глюкоза или флоридзин. с Настоящее изобретение будет далее раскрьіто на оснований рассмотрения следующего текста совместно с прилагаемьмми иллюстрациями, на которьх:

Ш- На Фиг.1 представлена схема получения ВсіІ/НіпаїІї рестрикционного фрагмента, содержащего кодирующую

Ге» область фосфоманнозоизомеразь Е.соїЇ;

На Фиг.2 представлено строение плазмидь ЕРІ (11; ік На Фиг.3 представлено строение бинарной плазмидь рВКІ 4 |21;

Ф На Фиг.4 представлено строение плазмидь рвкКі 4, содержащей тап А ген, встроенньій между зИ5 геном и

МРТІЇ геном.

Конструирование бинарной плазмидь р(ВКІ4-нанноза), содержащей кодирующие последовательности в фосфонаннозоизомеразь! Е.соїї

Ген фосфоманнозоизомеразьі Е.соїї (ЕС 5.3.2.8) происходит из плазмидьі роОзб3З (|З) (Фиг.1), конструкции,

Ф) полученной из рВК322, в которой область между уникальньїми Рзії и НіпаїїЇ сайтами бьіла замещена участком ка Е.соїї хромосомьі, несущим структурньій ген (тап А) фосфоманнозоизомеразьі и фрагмент соседнего гена фумаразь (їшт А). Позтому в рО5ЗбЗ3 утеряна часть гена В-лактамазь и ее селекцию следует вести на бор тетрациклине.

В сайт множественного клонирования риС18 бьіл лигирован Рзі/ВатнНі фрагмент (2466бт.п.н), содержащий полньій Рзй/Ніпаїїї хромосомньй фрагмент и участок рВК322 длиной З357т.п.н., что привело к образованию роро18 (см. Фиг.1). роОрої18 расщепляют рестриктазой Ніпаїй, а полученнье недоступнье 3 концьї дострайвают с помощью 65 полимеразь Кленова. Линеаризованную 0018 плазмиду с заполненньім Ніпай! сайтом (НіпанП") (см. Фиг.1) расщепляют рестриктазой ВсіЇ, а полученньй ВеїІ-Ніпан" фрагмент длиной 1218т.п.н., содержащий кодирующую область фосфоманнозоизомеразь), клонируют в плазмиду рЕп-папсед-Регйег-І іпКег (усиленньій линкер Регег) (рЕРУ), которую сначала подвергли рестрикции по Зтаї, а затем - по ВатНі. Полученную плазмиду именуют

Р(ЕРІ-манноза). рРЕРІ. конструируют из рСаммсМм (4, 5), в которой САТ ген удален путем рестрикции по РвзіЇ. Небольшой линкер (линкер: Рзй-ВатнНі-ВаїІ-РзіїЇ) встрайвают в Рей сайт зтой плазмидь), в результате чего получают плазмиду, именуемую ріізе (рі). рі подвергают рестрикции по Ніпаі и Ва, а результирующий фрагмент, содержащий 355 промотор и МО5 терминатор, клонируют в другую рі плазмиду, подвергнутую рестрикции по

ЕсомМ и ВОЇЇЇ. Как ЕсокУ, так и Ніпсі! являются сайтами с тупьіми концами. Полученную конструкцию именуют 7/0 РЕппапсеа-І ізе (РЕ). рЕГ- существенно отличается от СаМУСМ тем, что она содержит вариант 355 промотора с тандемной дупликацией 250-ти пар оснований вьішележащей последовательности промотора. Вариант 355 промотора обладает транскрипционной активностью приблизительно в десять раз более вьісокой, чем природньїй 355 промотор (6). РЕ! подвергают рестрикции по Рзії! и ВаіїІї, удаляя тем самьім МОЗ терминатор, а вместо него встраивают СаммМ терминатор (0ОМУ2О. И наконец, в РзїЇ сайт, расположенньй между усиленньм 7/5 Зе5З промотором и СамМ терминатором, встрайвают линкер (Раі-Ватні-Зта!-Засі-за-П-зри!). Зту плазмиду именуют рЕРІ (см Фиг.2). р(рЕРІ-манноза) подвергают рестрикции по Ніпай для вьіделения фрагмента, содержащего полньй усиленньій 355 промотор, кодирующую область фосфоманнозоизомеразь! Е.сої и СамМм терминатор.

Вьіделенньій фрагмент клонируют в Ніпаїїї сайт бинарного вектора рВКІ4 (Фиг.4). Полученную плазмиду 2о именуют р(ВКІ-манноза). Ніпанії сайт в рРВКІ4 расположен между геном устойчивости к канамицину и геном

В-глюкуронидазь (505) (см. Фиг.3). Химерньй маннозньй ген, ген устойчивости к канамицину (МРІЇ) и ОЗ ген имеют каждьй собственньій промотор и терминатор. На Фиг.4 представлена р(ВКІ-манноза) конструкция, содержащая химерньїй ген фосфоманнозоизомеразь, встроенньій между 5И5 и МРТІЇ генами плазмидь рВІ КА.

Конструкцию р(ВКІ -манноза) вьіделяют из Е.соїї и трансформимруют ею Адгобрасіегішт (штетасіепх штамм сч ов І ВА4404, которьій содержит обезоруженную хелперную плазмиду рАї4404 7, 8), методом замораживания-оттаивания (9). і)

Последовательность структурного гена (тап, А), коюодирующего фосфоманнозоизомеразу, бьіла опубликована

ІЗІ.

Аксеничнье исходнье культурь «о зо Культурьї побегов Зоіїапит (шрегозит "Зайшгпа, "Віпде или "ОіапеПйа поддерживают, как описано |10), на

Ї 5 субстрате (см. ниже) с добавлением 2ИМ тиосульфата серебра, при температуре 257С и циклической смене Ме освещенности: 16ч свет/ 8ч темнота. Йсходнье культурь! пересевали через 20 - 40 суток. Листья отделяли от Ге побегов и разрезали их на узловье сегменть (приблизит. О,8см), содержавшие по одному узлу.

Инокуляция тканей картофеля ї-

Чашки для сокультивирования содержат 15 субстрат (сахароза ЗОг/л), агар (8Гг/л), ю 2,4-дихлорфеноксиуксусная кислота (2,Омг/л) и транс-зеатин (0,5кг/л).

Побеги из примерно 40-суточньїх культур побегов (вьісота приблизит. 5 - бсм) разрезают на межузловье сегменть! (приблизит. О0,8см). Сегментьї помещают в жидкий І 5-субстрат (І 5-среда), содержащий Адгобасіегіт

Штегїасіепз, трансформированную таким образом, что он содержит бинарньй вектор, несущий геньі, которье « 0 предназначень для введения в клетки картофеля. К числу таких генов относятся, например, геньі, кодирующие в с В-глюкуронидазу (505), МРТ ген, кодирующий устойчивость к антибиотику канамицину и/или гень, кодирующие белки, участвующие в метаболизме маннозь, например, маннозо-б6-фосфат-изомераза, ;» маннозозпимеразьї, фосфоманномутазь и т.д. (см. ниже).

Адгорасіегішт культивируют в течение ночи в УМВ-субстрате (дикалий гидрофосфат (тригидрат) (0,6бг/л); бульфат магния (гептагидрат) (0,20г/л); хлорид натрия (0,10г/л); маннитол (10,0г/л) и дрожжевой зкстракт с (0,40г/л)), содержащем необходимье соответствующие антибиотики (соответствующие гену устойчивости штамма Аадгобрасіегішт), до тех пор, пока оптическая плотность при 660 нм (0П-660) не достигнет значения

Ш- приблизит. 0,8. Затем суспензию центрифугируют, а клетки ресуспендируют в І 5-среде так, чтобьї значение ОП

Ге» составило 0,5.

Вьішеуказаннье межузловье сегменть! затем инкубируют в суспензии ресуспендированной Адгобасіегішт в і, течение 30 минут, а затем избьток бактерий удаляют из сегментов путем промокания их стерильной

Ф фильтровальной бумагой.

Сокультивирование сегментов побегов и Адгорасіегійт

Сегментьї побегов сокультивируют с бактерией в течение 72 часов на фильтровальной бумаге на вв ІЗ-субстрате (как описано вьіше) в чашках Петри, покрьітьїх белой бумажной тканью. Зтот субстрат будет именоваться далее как "субстрат для сокультивирования". Субстрат и сегменть! покрьівают стерильной

Ф) фильтровальной бумагой, а чашки Петри вьідерживают при 257С и циклической смене освещения: 16ч свет/ вч ка темнота.

Процедура промьївки во Через 48 часов сокультивирования сегментьії побегов переносят на І З-среду, содержащую 80Омг/л карбенициллина. Зти пересаженнье сегменть! затем аккуратно покачивают для того, чтобь! смьіть и разрушить прилипшие клетки Адгорасіегіит.

Селекция трансформированной ткани

Промьїтье таким образом сегменть! переносят затем на І 5-субстрат (как и ранее), с тем отличием, что 65 Концентрация транс-зеатина составляла 1мг/л, а в субстрат добавляют гиббереллиновую кислоту (0,1мг/л) и карбенициллин (800Омг/л), допустимо добавление также канамицин сульфата (5Омг/л) и/или маннозь (0 - 20г/л)

и/или сахарозь (0 - 20г/л). Зтот субстрат далее именуют как "субстрат для селекции/регенерации". Сегменть! инокулируют на свежий субстрат с интервалами в две недели либо, как описано ниже. Через 2 - 4 недели из сегментов развиваются побеги, при зтом образование новьїх побегов продолжается около З - 4 месяцев.

Укоренение регенерировавших побегов

Регенерировавшие побеги переносят на субстрат для укоренения, представляющий собой І З-субстрат с добавлением карбенициллина (50Омг/л).

Перенос регенерировавших побегов в почву

Заново укорененнье регенерировавшие побеги (растения) (вьісота приблизит. 2 - Зсм) пересаживают из 7/0 субстрата для укоренения в почву и помещают в растильную камеру при 217С с циклическим освещением: 16 часов свет/ 8 часов темнота, и 200 - 400иЕ/м2/сек. После того, как растения достаточно хорошо приживутся, их переносят в теплицу, где их вніращивают до тех пор, пока не разовьются клубни, а надземная часть не увянет.

Контроль генетической подлинности трансформантов

Трансгеннье генотипь! регенерировавшего побега контролируют: (а) посредством проведения МРТІЇ анализов, как описано |111; или (б) посредством проведения ЗИ анализа на ферменте, зкспрессируемом совместно вводимьім геном

В-глюкуронидазь, согласно |121; или (в) посредством анализа зкспрессии мРНК введенного гена, кодирующего фермент, например, фосфоманнозоизомеразу, участвующего в метаболизме маннозь), либо посредством измерения активности фермента.

ПРИМЕР 1

Регенерировавшие растения получают, как описано вьіше, с тем отличием, что сегменть! побегов не сокультивируют с бактерией, а последующую процедуру промьівки не проводят. Количество регенерировавших су побегов определяют на 40-е сутки от начала зксперимента. В Таблице 1 представлень! результать ингибирования маннозой регенерации опобегов из сегментов ствола картофеля, которье не бьли і) трансформированьї Адгорасіегішт. Из Таблиць 1 видно, что манноза зффективно ингибирует регенерацию таких побегов, а сахароза стимулирует такую регенерацию. Вообще говоря, маннозу нельзя применять в качестве источника углеводов для большинства видов растений. При добавлений к растениям маннозь!ї она Ге) метаболизируется и накапливаєтся маннозо-б-фосфат. Маннозо-б6-фосфат может бьть превращен во фруктозо-6-фосфат с помощью маннозо-6-фосфат-изомеразь, причем количество превращенного вещества о зависит от активности изомеразьі. Такой фруктозо-6-фосфат может бьіть утилизирован растениями, но в целом «(о вьісокие уровни маннозьі (независимо от того, имеется или нет другой источник углеводов) токсичнь! для растений. Таким образом, как видно из Таблицьі 1, образование побегов полностью ингибируется, когда - Кконцентрация маннозь! составляєт 5 - 10г/л, независимо от доступности сахарозьі, даже если она присутствует (цю в внісоких концентрациях . « 4 З ни А ПО ПО - ав :» аю нишнишшши шишишиииии ти юю сл ш ПИПНЕ ТИМИННЯ ПОЛ ГНН ПОЛ юю

Ф 6111 со 50 181116 ни ПЕ НЯ ПО с юю

ПРИМЕР 2

Регенерированнье растения получают, как описано вьіше. Адгорасіегічт, с которой соинкубируют сегменть побегов, била трансформирована конструкцией р(ВКІ -манноза), полученной, как описано вьіше, таким образом, о что бактерия несет вектор, содержащий геньії, коюодирующие 505 и маннозо-б6-фосфат-изомеразу. ко Трансгеннье побеги (5И5-) селектируют на оснований их способности метаболизировать маннозу в присутствии реагента (метил-3-О-глюкоза), которьій понижает токсичность маннозьі для побегов. Побеги, бо являющиеся БИ5, селектируют на оснований их способности расти в присутствии маннозь! в концентрации около 5г/л.

Проводили также контрольнье зксперименть, в которьїх Адго-басіегійт, применявшаяся для трансформации сегментов побегов, несла вектор, сходньій с р(ВКІ-манноза) с тем отличием, что у него отсутствует ген, кодирующий маннозо-б-фосфат-изомеразу. В случає, когда регенерировавшие трансформированнье побеги 65 росли в присутствий 5г/л маннозь и 20г/л сахарозьі, ЗО5- трансформанть не бьіли получень.

ПРИМЕР З

Проводят следующий зксперимент, в котором Адгорасіегшт, которую применяют для трансформации сегментов побегов, несет вектор, сходньій с р(ВКІ-манноза) с тем отличием, что у него отсутствует ген, кодирующий маннозо-б6-фосфат-изомеразу. Такой вектор содержит ген, коюодирующий МРТІЇ, которьій способен придавать трансформированньм клеткам устойчивость к канамицину. Соответственно зтому, БИ5Ж трансформанть! селектируют на оснований их устойчивости к канамицину, присутствующему в концентрации

БОмг/л. В зтой последней селекций (з305- генотип имела меньшая по сравнению с Примером 2 часть отобранньїх клеток.

ПРИМЕР 4 70 Повторяют Пример 3, с тем отличием, что Адгобрасіегійт трансформируют плазмидой р(ВКІ -манноза), а вузи трансформанть! отбирают на оснований их способности расти на канамицине (5Омг/мл). В зтом случає меньшая, чем в Примере 3, часть отобранньїх побегов является (35.

ПРИМЕР 5

Вьіполняют стандартную методику листовьїх дисков для табака, как описано в Примере 13 (13), с тем 7/5 отличием, что исключают инокуляцию Адгобасіегіцт и стадию сокультивации. В качестве цитокинина применяют бензиладенин (Імг/л), а содержание углеводов соответствует представленному ниже. Количество регенерировавших из каждого листового диска побегов регистрируют спустя 21 сутки.

Таблица 2 показьівает, что Ю-ксилоза не ингибирует регенерацию побегов в присутствий сахарозь и, кроме того, О-ксилоза не утилизируется в качестве источника углеводов. О-ксилулоза является хорошим источником 2о углеводов в ходе регенерации побегов. табака й см 1916961 61 16500000 ни о п ПО ЗВ ПО ен

ПОП ТИНИ ПОЛОН ПО ЗОН ПОЛОН НО КА йо

Ксилоза может бьть превращена в ксилулозу с помощью ксилозоизомеразь. В соответствии с зтим іш функциональньїй ген ксилозоизомеразьі, а также структурньій ген, находящиеся под контролем подходящих ч- промоторов и терминаторов, внедряют в растения, или их части, или их клетки, и трансформированнье

Зо растения (или их части, или их клетки) селектируют по их способности использовать ксилозу в качестве юю источника углевода.

ПРИМЕР 6

Зксплантать! получают и обрабатьввают, как описано вьіше в пункте "Селекция трансформированной ткани", « с тем отличием, что в субстрат для селекции/регенерации не бьіл добавлен канамицин или карбенициллин, а З растительная ткань не является трансформированной. Таким образом, единственной стадией с субкультивирования является перенос зксплантатов с субстрата для сокультивирования на субстрат для "з селекции/регенерации, обогащенньй ксилозой в концентрациях, указанньїх ниже. Количество регенерировавших побегов регистрируют спустя 12 недель. з с - в о вв

ФС

Пил т ПО ТИХ ПО НО т нн нн нн І в 7 юю о Из результатов, представленньїх в Таблице 3, видно, что Ю-ксилоза (по сравнению с О-маннозой) является слабьм ингибитором регенерации побегов в присутствии сахарозьі и, кроме того, О-ксилоза не является источником углеводов в растениях, которье являются нетрансгенньми по ферменту или белку, 60 метаболизирующему ксилозу. Более того, Ю-ксилоза (5г/л), добавленная в субстратьі при отсутствий в них сахарозь, вьізьівала регенерацию 2,2 побегов на зксплантат через 9 недель.

ПРИМЕР 7

Повторяют Пример 5, с тем оотличием, что субстрат для селекции/регенерации обогащен метил-3-О-глюкозой (МОГ) в концентрациях, приведенньх в Таблице 4. Процент живьх зксплантатов бо регистрировали через 8 недель.

Из результатов, представленньїх в Таблице 4, видно, что совместная обработка с МОГ ингибирует токсическое действие маннозьй на чувствительнье растительнье ткани. Так как манноза токсична в концентрациях, являющихся оптимальньми для соединений, служащих источниками углеводов, то добавление

МОГ создаєт возможность для обогащения субстрата углеводами в форме маннозьі в оптимальньх концентрациях. Зто делает возможньім применение маннозь! в качестве агента положительной селекции при отсутствий других источников углеводов. а оо Мманюа т | 00016010 1601510

Сакаратт 0000000100000010001000 моя 101 161611 ів 19611115 нини Ин сл НО ЗИ ПОН НОСИ ПОЕТ ПОН о »ю111вю ев 178 1лоо 17 лою оо

ПРИМЕР 8

Повторяют Пример 7, с тем отличием, что субстрат для регенерации/селекции содержит маннозу (15Гг/л), метил-3-О-глюкозу в концентрациях, приведенньїх в Таблице 5, и не содержит сахарозьі. Трансформированньй растительньій материал является трансгенньм по гену маннозо-б6-фосфат-изомеразь. Спустя 21 сутки отселектированнье побеги собирают. Все собраннье побеги анализируют на предмет зкспресии совместно введенного гена В-глюкуронидазь,, а затем вьічисляют общее количество (по двум сборам) трансгенньїх сч побегов, зкспрессирующих В-глюкуронидазу (3И05-), на зксплантать, как долю побегов, зкспрессирующих

В-глюкуронидазу (35) от общего количества отселектированньх побегов (Таблица 5). (о)

Из результатов, представленньїх в Таблице 5, видно, что при совместном добавлении маннозь! и метил-3-О-глюкозьі селекция трансгенньїх побегов возможна даже при вьісоких концентрациях маннозь! и отсутствий других источников углеводов. «со зо Ф їі мог. 01255005 м бив обетжстанат 00000000000000002101 0506

Іс) сиве побелтіотобр побелис) 11111016 8189153

ПРИМЕР 9

Повторяют Пример 8, с тем отличием, что МОГ заменяют флоридзином. Из Таблицьї 6 видно, что при « совместном добавлении маннозьї и флоридзина возможна селекция 10095 трансгенньїх побегов при вьісоких З7З 70 концентрациях маннозьі и отсутствий других источников углеводов. Зто является примером того, как с симбиотический рост на минимальной среде и продуцирование зксудатов может бьїть сведено к минимуму "з посредством добавления ингибитора углеводного транспорта. 2 -

Ф

Фо юю 100300000031 00 й ло | лою 171. 1ооз оо

ПРИМЕР 10 29 Из Таблиць 7 видно, что соединения, не являющиеся маннозой, могут бьїть примененьі в качестве

Ф! селектирующих агентов для трансгенной растительной ткани, которая онесет, среди прочего ген маннозо-б-фосфат-изомеразь из Е. сої. іме) во бмаюя 00000061 бо О-маннозамин |в) 08

ПРИМЕР 11

Сахарную свеклу трансформируют так назьіваемьм сої-реї (сем-гер) способом (|14), при котором в качестве 9 зксплантов используют семядоли, включая черешки. Проростки отделяют от семян, пророщенньх и вьращивавшихся в течение 4 - 7 недель при 12"С в световом режиме 16бч день/8ч ночь. Семядоли отрезают на 2 - Змм ниже узла, отделяют и культивируют либо в темноте, либо на свету в присутствиий или отсутствий ксилозьі. Из Таблицьї 8 видно, что ксилоза утилизируется сахарной свеклой в качестве источника углеводов в присутствии света, но не в темноте, что свидетельствует о том, что основанную на ксилозе положительную то селекцию сахарной свекльі, трансгенной, среди прочего, по гену ксилозо-изомеразь),, следует проводить в темноте. й 008011 016 1771111иа311овя 1 0681 20 016011 сч ж 01010701 0581 о ю71776131 03 т ою 177лю17во1оввї |в

ПРИМЕР 12 с

Получают зксплантать, трансгенньге, среди прочего, по гену маннозо-б6-фосфат-изомеразь, а в субстрат для 30 селекции/регенерации добавляют маннозу и сахарозу, как указано в Таблице 9. Количество регенерировавших /Ф) побегов регистрируют через 11 недель. В Таблице 9 представлено количество регенерировавших побегов на со субстратах, содержащих метил-3-О-глюкозу, как процент от количества побегов, регенерировавших на субстратах без маннозь! и метил-3-О-глюкозь. - щі ви

Манноза г/л |Сахароза г/л « 9 1 0 101010 о 7 5101019 710 що - лю | 0 1010164 8

І» 21010101 лов нг ЕЕ ЕВ ЕТ ПОЛО 5 | юю вів в сл 1176 000 вв | з лю | ло 10/10) оо | вв -І б Регенерация побегов на субстрате, содержащем сахарозу (1Ог/л) и не содержащем ни маннозу, ни метил-3-О-глюкозу: о 50

Трансгенная ткань: 1,4 побега/зксплантат щи Ткань дикого типа: 1,7 побега/зксплантат

Следует иметь ввиду, что настоящее изобретение не ограничивается приведенньмми вьіше Примерами. 22 Например, тканеспецифическая зкспрессия гена, коюодирующего фермент, участвующий в метаболизме маннозь!

ГФ! или ксилозь), либо в метаболизме производного маннозьї или ксилозьь или предшественника маннозь! или ксилозьі, может бьіть применена для контроля ростовой регуляции таких тканей при их культивирований на о субстрате, являющемся модулятором указанного фермента. Более того, манноза или ксилоза (включая их производнье или предшественники) могут бьіть использовань! в качестве селективного гербицида для культур, 60 обладающих селективньм преимуществом, которье бьли трансформированьй путем введения генов, кодирующих белки, участвующие в метаболизме ксилозьі или маннозьі либо их предшественников или производньх.

Следует также иметь ввиду, что применение способа согласно изобретению может охватьівать: а) зукариотические организмьї, обладающие в целом или в отдельньїх типах тканей/клеток пониженньіми бо уровнями фруктозо-б6-фосфата либо его производньїх, благодаря введению гена, кодирующего, например, фосфоманнозо-изомеразу;

б) зукариотические организмьї, обладающие в целом или в отдельньїх типах тканей/клеток повьішенньіми уровнями маннозо-б6-фосфата либо его производньїх, благодаря введению гена, кодирующего, например, фосфоманнозо-изомеразу; в) зукариотические организмь, обладающие во всех или в некоторьїх типах клеток повьішенной фосфоманнозо-изомеразной активностью благодаря введению гена, кодирующего фосфоманно-зоизомеразу, в зти клетки.

ЛИТЕРАТУРА

1. Ріеїгак, М. еї а!., Мисівїс Асідв. Кез. 14, рр. 5857 - 5868 (1986). 70 2. МіеіІзеп, К.К. еї аї., Мої. Ріапі Місгобе Іпіегасі. 6, рр. 495 - 506 (1993).

З. Мііев, Н. егаІ., Сепе 32, рр. 41 - 48 (1984). 4. Еготт ес аї., Ргос. Маїй!. Асай. 5сі. ОБА 82, р. 5824 (1985). 5. Гготт еї аї., Майшге 319, р. 791 (1986). 6. Кау ес аї., сіепсе 236, рр. 1299 - 1302 (1987). 7. НоеКета еї аї., Майте 303, рр. 179 - 180 (1983). 8. Ооїтз еї аї., Ріазтіа 7, рр. 15 - 29 (1982). 9. Ноіївіегз еї аі!., Мої. Сеп. Сепеї. 163, рр. 181 - 187 (1978). 10. "петаїег еї а!., РПїівіо!. РіІапі. 18, рр. 100 - 127 (1965). 11. Кайдке еї аї., Тнеог. Аррі. Сепеї. 75, рр. 685 - 694 (1988). 12. Нодіа! еї а|!., Ріапі Зсі. 87, рр. 115 - 122 (1992). 13. РСТ/92/00252. 14. Заявка РСТ/ОК 92/00108. 1. «8БрОСІ» Способ идентификации или селекции растительньїх клеток, обладающих метаболическим преимуществом, являющимся результатом их трансформации, из популяции растительньїхх клеток в/на среде, с содержащей, по меньшей мере, одно селективное соединение, отличающийся тем, что клетки трансформируют о нуклеотидной последовательностью или совместно вводимой нуклеотидной последовательностью, содержащей область, которая кодирует белок, участвующий в метаболизме указанного соединения, и/или регулирует активность гена, кодирующего указанньй белок. 2. Способ по п. 1, отличающийся тем, что селективное соегдинение используют в достаточно вьІсокКой «о зо Концентрации для оказания токсического или иньім образом ингибирующего зффекта на рост клеток, результатом которого является комбинирование позитивной или негативной селекции. б»

З. Способ по п. 2, отличающийся тем, что в среду добавляют реагент, которьій понижает токсичность «о указанного соединения для клеток. 4. Способ по п. 1, отличающийся тем, что указанное соединение является маннозой, а нуклеотидная или - з5 бСовместно вводимая нуклеотидная последовательность кодирует маннозо-6-фосфат-изомеразу. ю 5. Способ по п. 4, отличающийся тем, что, по меньшей мере, одна из указанньїх нуклеотидньх последовательностей содержит ДНК, которая модифицирована таким образом, что использовань! кодонь, предпочтительнье для оорганизма, в которьій вводят последовательности, при зтом зкспрессия модифицированной таким образом ДНК в указанном организме приводит к образованию белка, аналогичного в « целом белку, продуцируемому при зкспрессимй немодифицированной ДНК в организме, для которого в с компоненть! последовательности, кодирующие белок, являются зндогенньми. 6. Способ по любому из пп. 1-5, отгличающийся тем, что указанное соединение является неактивньм в ;» нетрансформированньїх клетках или менее активно в нетрансформированньїх клетках, чем в трансформированньїх клетках, либо менее токсично для трансформированньїх клеток, чем для нетрансформированньїх клеток, а зкспрессия или транскрипция указанной нуклеотидной последовательности с увеличивает доступность указанного соединения для клеток или приводит к увеличению активности фермента, зндогенно присутствующего в клетках таким образом, что активность указанного фермента в ш- трансформированньїх клетках больше его активности в нетрансформированньїх клетках, либо зкспрессия или б транскрипция указанной нуклеотидной последовательности приводит к блокировке метаболизма указанного соединения или к блокировке в синтезе указанного соединения в трансформированньх клетках, посредством і, чего трансформированньсе клетки могут бьіть отделеньії от нетрансформированньмх клеток.

Ф 7. Способ по любому из пп. 1-6, отличающийся тем, что используют клетки, трансформированнье нуклеотидной последовательностью, кодирующей зкзогенньй промотор, способньй ко гомологичной рекомбинации с ДНК последовательностью в/или вблизи структурного гена, которьій способен находиться под

Контролем указанного промотора. 8. Способ по любому из пп. 1-7, отличающийся тем, что указанное соединение является маннозой. (Ф, 9. Способ по любому из п.п. 1-34, отличающийся тем, что указанное соединение является ка маннозо-б6-фосфатом, ксилозой или ЮО-маннозамином. 10. Способ по любому из пп. 1-9, отгличающийся тем, что указанньій белок является ферментом. во 11. Способ по п. 10, отличающийся тем, что указанньій фермент вьбирают из группьі, состоящей из фосфосахароизомеразь, фосфосахаромутазь, фосфатазь, сахарозпимеразь,, сахаропермеазь! и фосфосахаропермеазь. 12. Способ по любому из пп. 1-7 или 9-11, отличающийся тем, что указанньй белок является маннозо-6-фосфат-изомеразой. 65 13. Способ по любому из пп. 1-11, отличающийся тем, что указанньій белок является ксилозо-изомеразой. 14. Способ по п. 11, отличающийся тем, что указанная фосфосахаромутаза является фосфоманно-мутазой,

а фосфатаза является маннозо-б-фосфатазой. 15. Способ по любому из пп. 1-14, отличающийся тем, что указаннье клетки трансформируют бактерией, чувствительной к указанному соединению. 16. Способ по любому из пп. 1-15, отличающийся тем, что трансформированнье клетки селектируют с помощью комбинации положительной и отрицательной селекции, а указанную нуклеотидную последовательность в трансформируемье клетки вводят совместно с дополнительной нуклеотидной последовательностью, кодирующей устойчивость, по меньшей мере, к одному компоненту, вьібранному из группьї, включающей токсиньї, антибиотики и гербицидь, а среда в/на которой культивируют указаннье клетки, 7/0 содержит по меньшей мере один компонент, вьібранньй из группьї, включающей токсиньі, антибиотики. и гербицидь, к которьім трансформированньсе клетки проявляют устойчивость. 17. Способ по любому из пп. 1-16, отличающийся тем, что требуемую нуклеотидную последовательность вводят с, по меньшей мере, двумя различньїми селективньіми генами. 18. Способ по любому из пп. 2-17, отличающийся тем, что реагент, понижающий токсичность, вьібирают из 7/5 Группьі, состоящей из метил-3-0-глюкозь! и флоридзина. 19. Способ по любому из пп. 1-16, отличающийся тем, что трансформированньіми клетками являются клетки растений. 20. Трансформированньсе клетки, отличающиеся тем, что представляют собой трансформированнье клетки растений, отобраннье с применением способа по любому из пп. 1-18. 0. й й й 0.

Офіційний бюлетень "Промислоава власність". Книга 1 "Винаходи, корисні моделі, топографії інтегральних мікросхем", 2003, М 7, 15.07.2003. Державний департамент інтелектуальної власності Міністерства освіти і науки України. с щі 6) (Се) (о) (Се) у

Іс) - . и? 1 -і (о) се) 4) іме) 60 б5