JP7333332B2 - 抗体のアフィニティ成熟のための方法 - Google Patents
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Description
心臓トロポニンTは、心疾患患者において広く用いられるバイオマーカーである。心疾患患者におけるその有用性は、近年、Westermannら(Nature Reviews/Cardiology, vol 14(2017) 473-483)によって概説されてきている。cTnTの使用は、急性心筋梗塞(AMI)と推測される患者においてよく確立されているが、トロポニン測定はまた、他の急性および非急性セッティングでも用いられている。AMIと推測される患者において、迅速な治療およびさらなる診断評価を可能にするため、早期の意思決定が非常に重要である。
したがって、本発明は、一連の増幅反応を実行することによって、抗体の可変鎖をコードするポリヌクレオチドのライブラリーを生成する新規方法に関する。これらのポリヌクレオチドライブラリーを、ターゲット抗原に対する増加したアフィニティなどの改善された特性を持つ抗体を同定するための選択法において用いてもよい。
i)抗体の第一のフレームワーク領域をコードするポリヌクレオチドを提供し、
ii)(i)のポリヌクレオチドに関する第一のPCRプライマーを提供し、
iii)各々、要素A-B-Cからなるポリヌクレオチドの混合物を提供し、
ここで
A)は第一のフレームワーク領域にハイブリダイズ可能なポリヌクレオチドであり、
各B)は、親CDRポリヌクレオチド配列と同じ数のコドンを含むポリヌクレオチドライブラリーのメンバーであり、ここで、前記ライブラリーのメンバーは、少なくとも1つのランダム化コドン、例えば1つのランダム化コドンまたは2つのランダム化コドンを含むよう設計されており、そして
C)は第二のフレームワーク領域にハイブリダイズ可能なポリヌクレオチドである、
iv)要素C)に関する第二のPCRプライマーを提供し、
v)ポリヌクレオチド(i)~(iv)に基づくPCRを実行し、それによってポリヌクレオチドのライブラリーを得て、そしてここでこうしたPCRは、親CDRポリヌクレオチド配列の非存在下で行われる
ことで特徴づけられる、前記方法に関する。
i)抗体の第一のフレームワーク領域をコードするポリヌクレオチドを提供し、
ii)各々、要素A-B-Cからなるポリヌクレオチドの第一の混合物を提供し、
ここで
A)は第一のフレームワーク領域にハイブリダイズ可能なポリヌクレオチドであり、
各B)は、第一の親CDRポリヌクレオチド配列と同じ数のコドンを含む第一のポリヌクレオチドライブラリーのメンバーであり、ここで、前記ライブラリーのメンバーは、少なくとも1つのランダム化コドン、例えば1つのランダム化コドンまたは2つのランダム化コドンを含むよう設計されており、そして
C)は第二のフレームワーク領域にハイブリダイズ可能なポリヌクレオチドである、
iii)要素C)に関する第一のPCRプライマーを提供し、
iv)各々、要素A’-B’-C’からなるポリヌクレオチドの第二の混合物を提供し、
ここで
A’)は前記の第一のフレームワーク領域にハイブリダイズ可能なポリヌクレオチドであり、
各B’)は、第二の親CDRポリヌクレオチド配列と同じ数のコドンを含む第二のポリヌクレオチドライブラリーのメンバーであり、ここで、前記ライブラリーのメンバーは、少なくとも1つのランダム化コドン、例えば1つのランダム化コドンまたは2つのランダム化コドンを含むよう設計されており、そして
C’)は第三のフレームワーク領域にハイブリダイズ可能なポリヌクレオチドである、
v)要素C’)に関する第二のPCRプライマーを提供し、
vi)ポリヌクレオチド(i)~(v)に基づくPCRを実行し、それによってポリヌクレオチドのライブラリーを得る、そしてここでこうしたPCRは、親CDRポリヌクレオチド配列の非存在下で行われる
ことで特徴づけられる、前記方法に関する。
用語「ポリヌクレオチド」は、本明細書において、複数のヌクレオチド、通常、少なくとも約10ヌクレオチドを含む分子を含み、リボヌクレオチド、デオキシリボヌクレオチド、およびヌクレオチド類似体を含む。特定の態様において、ヌクレオチドはデオキシリボヌクレオチドである。
a)本発明記載の抗体の第一の可変鎖をコードするポリヌクレオチドのライブラリーを転写/翻訳系で発現し、
b)前記抗体の第一の可変鎖の発現されたライブラリーと前記抗体の第二の可変鎖を組み合わせ、そして
c)改善された結合特性を有する第一の可変鎖および第二の可変鎖を含む抗体を選択する
工程を含んでもよい。
この態様にしたがって、各々、CDR1、CDR2およびCDR3を含む可変H鎖および可変L鎖から、第一および第二の可変鎖を選択してもよい。いくつかの態様にしたがって、第一の可変鎖は可変H鎖であり、そして第二の可変鎖は可変L鎖である。他の態様において、第一の可変鎖はL鎖であり、そして第二の可変鎖はH鎖である。しばしば、抗体の可変H鎖は抗原結合の主な部分に寄与することが知られる。こうした場合、発現テンプレートとしての単一の種または限定された数の種の可変L鎖と組み合わせられる、ディスプレイテンプレートとしての可変H鎖をコードするポリヌクレオチドのライブラリーを調製することが意図されてもよい。1つの態様において、可変H鎖由来のポリヌクレオチドのライブラリーを親可変L鎖と組み合わせ、そして結合特性が改善された抗体を選択する。
Kd=kd/ka
式中:
Kd=解離平衡定数[M]
kd=解離速度定数[s-1]
ka=会合速度定数[M-1s-1]
抗体の結合アフィニティに関するさらなる適切なパラメーターは以下のとおりである:
t/2=複合体解離半減期=ln2/kd/60[分]
Rmax=分析物の反応最大値[RU]
MR:モル比=分析物の反応最大値(Rmax)の比
本発明にしたがって、本発明の方法によって選択される抗体は、親抗体のアフィニティより高い、ターゲット抗原に関するアフィニティを有する。この改善されたアフィニティは、親抗体に比較して、少なくとも20%のt/2の増加によって示されてもよい。t/2の測定を、例えば実施例6に記載するように行ってもよい。
ここで、抗体は、式I:
FW(LC)1-CDR(LC)1-FW(LC)2-CDR(LC)2-FW(LC)3-CDR(LC)3-FW(LC)4(式I)
に示すようなフレームワーク領域(FW)およびCDRからなる軽鎖可変ドメイン
ならびに式II:
FW(HC)1-CDR(HC)1-FW(HC)2-CDR(HC)2-FW(HC)3-CDR(HC)3-FW(HC)4(式II)
に示すようなFWおよびCDRからなる重鎖可変ドメインを含み、
式中、FWは以下のアミノ酸配列または少なくとも85%同一であるその変異体を含み:
軽鎖中
FW(LC)1 配列番号14のアミノ酸配列;
FW(LC)2 配列番号15のアミノ酸配列;
FW(LC)3 配列番号16のアミノ酸配列;
FW(LC)4 配列番号17のアミノ酸配列;
重鎖中
FW(HC)1 配列番号18のアミノ酸配列;
FW(HC)2 配列番号19のアミノ酸配列;
FW(HC)3 配列番号20のアミノ酸配列;
FW(HC)4 配列番号21のアミノ酸配列;
そしてCDRは、以下のアミノ酸配列、(i)軽鎖可変ドメイン中、配列番号2のアミノ酸配列を含むCDR1、配列番号3のアミノ酸配列を含むCDR2、および配列番号4のアミノ酸配列を含むCDR3、ならびに(ii)重鎖可変ドメイン中、配列番号5;配列番号6;または配列番号7のアミノ酸配列を含むCDR1、配列番号8;または配列番号9のアミノ酸配列を含むCDR2、および配列番号10;配列番号11;配列番号12;または配列番号13のアミノ酸配列を含むCDR3を含み、ここで、CDRの少なくとも2つが、配列番号6または配列番号7のCDR1、配列番号9のCDR2、および配列番号12のCDR3より選択されるか、あるいはCDR1が配列番号7であり、CDR2が配列番号8であり、そしてCDR3が配列番号11または配列番号13であり、但し、配列番号6のCDR1が存在する場合、a)CDR3は配列番号11または配列番号13のいずれでもないか、あるいはb)抗体内のCDR2およびCDR3は、それぞれ、同時に配列番号8および配列番号12ではない、前記配列、あるいはCDRあたり最大1つのアミノ酸置換で異なるこれらのCDRの変異体を含む。
FW(LC)1-CDR(LC)1-FW(LC)2-CDR(LC)2-FW(LC)3-CDR(LC)3-FW(LC)4(式I)
に示すようなフレームワーク領域(FW)およびCDRからなる軽鎖可変ドメイン
ならびに式II:
FW(HC)1-CDR(HC)1-FW(HC)2-CDR(HC)2-FW(HC)3-CDR(HC)3-FW(HC)4(式II)
に示すようなFWおよびCDRからなる重鎖可変ドメイン
を含む抗cTnT抗体も開示し、、
式中、FWは以下のアミノ酸配列または少なくとも85%同一であるその変異体を含み:
軽鎖中
FW(LC)1 配列番号14のアミノ酸配列;
FW(LC)2 配列番号15のアミノ酸配列;
FW(LC)3 配列番号16のアミノ酸配列;
FW(LC)4 配列番号17のアミノ酸配列;
重鎖中
FW(HC)1 配列番号18のアミノ酸配列;
FW(HC)2 配列番号19のアミノ酸配列;
FW(HC)3 配列番号20のアミノ酸配列;
FW(HC)4 配列番号21のアミノ酸配列;
そしてCDRは、以下のアミノ酸配列、(i)軽鎖可変ドメイン中、配列番号2のアミノ酸配列を含むCDR1、配列番号3のアミノ酸配列を含むCDR2、および配列番号4のアミノ酸配列を含むCDR3、ならびに(ii)重鎖可変ドメイン中、配列番号5;配列番号6;または配列番号7のアミノ酸配列を含むCDR1、配列番号8;または配列番号9のアミノ酸配列を含むCDR2、および配列番号10;配列番号11;配列番号12;または配列番号13のアミノ酸配列を含むCDR3を含み、ここで、CDRの少なくとも2つが、配列番号6または配列番号7のCDR1、配列番号9のCDR2、および配列番号12のCDR3より選択されるか、あるいはCDR1が配列番号7であり、CDR2が配列番号8であり、そしてCDR3が配列番号11または配列番号13であり、但し、配列番号6のCDR1が存在する場合、a)CDR3は配列番号11または配列番号13のいずれでもないか、あるいはb)抗体内のCDR2およびCDR3は、それぞれ、同時に配列番号8および配列番号12ではない、前記配列を含む。
フレームワーク領域に関して、特定の度合いの可変性もまた、本明細書に想定され、すなわち個々のFWは、特に列挙されるアミノ酸配列または該配列に少なくとも85%同一であるアミノ酸配列を含んでもよいし、または該配列からなってもよい。好ましくは、同一性は少なくとも90%、より好ましくは少なくとも92.5%、より好ましくは少なくとも95%、さらにより好ましくは、同一性は少なくとも98%、例えば少なくとも99%、そして最も好ましくは、同一性は少なくとも99.5%である。異なるFWに関して、実際の配列、および例えばそれぞれのFW配列の長さ、ならびにそれぞれの可変鎖ドメイン内の位置に応じて、配列同一性の異なる度合いが許容されうる可能性もあることが認識されるであろう。
1つの態様において、フレームワーク領域のアミノ酸配列中の変異は、アミノ酸(単数または複数)の置換による。置換は、本明細書において上に定義するように、保存的アミノ酸置換または非保存的アミノ酸置換であってもよい。用語「置換」に関して、上に提供する定義および特に例示する態様は、変更すべきところは変更して適用される。1つの態様において、フレームワーク領域中の置換は、保存的アミノ酸置換である。
FW(LC)1 最大3アミノ酸変異;
FW(LC)2 最大2アミノ酸変異;
FW(LC)3 最大4アミノ酸変異;
FW(LC)4 最大1アミノ酸変異;ならびに
FW(HC)1 最大3アミノ酸変異;
FW(HC)2 最大2アミノ酸変異;
FW(HC)3 最大4アミノ酸変異;および
FW(HC)4 最大1アミノ酸変異。
さらなる態様において、軽鎖または重鎖可変ドメインフレームワーク領域中に存在する変異の総量は、最大9アミノ酸置換、例えば最大8アミノ酸置換、例えば最大6アミノ酸置換、例えば最大4アミノ酸置換、例えば最大3アミノ酸置換、例えば最大2アミノ酸置換である。さらなる態様において、軽鎖可変ドメインのフレームワーク領域1~4中に総計で、または重鎖可変ドメインのフレームワーク領域1~4中に総計で、1つのアミノ酸置換しか存在しない。
本発明はさらに、
(i)配列番号22のアミノ酸配列からなる軽鎖可変ドメインに少なくとも85%同一であるアミノ酸配列からなる軽鎖可変ドメイン、および
(ii)配列番号23;配列番号24;配列番号25;配列番号26;配列番号27;配列番号28;配列番号29;配列番号30;配列番号31;および配列番号32のアミノ酸配列より選択される重鎖可変ドメインに少なくとも85%同一であるアミノ酸配列からなる重鎖可変ドメイン
を含む抗体
ここで、該抗体はヒト心臓トロポニンTに特異的に結合し、そして37℃で10分間またはそれより長いt/2解離を有する
を開示する。
(i)配列番号22のアミノ酸配列からなる軽鎖可変ドメインに少なくとも85%同一であるアミノ酸配列からなる軽鎖可変ドメイン、および
(ii)配列番号23;配列番号24;配列番号25;配列番号26;配列番号27;配列番号28;配列番号29;配列番号30;配列番号31;および配列番号32のアミノ酸配列より選択されるアミノ酸配列の重鎖可変ドメイン
ここで、CDRは、以下のアミノ酸配列、(i)軽鎖可変ドメイン中、配列番号2のアミノ酸配列を含むCDR1、配列番号3のアミノ酸配列を含むCDR2、および配列番号4のアミノ酸配列を含むCDR3、ならびに(ii)重鎖可変ドメイン中、配列番号5;配列番号6;または配列番号7のアミノ酸配列を含むCDR1、配列番号8;または配列番号9のアミノ酸配列を含むCDR2、および配列番号10;配列番号11;配列番号12;または配列番号13のアミノ酸配列を含むCDR3を含み、ここで、CDRの少なくとも2つが、配列番号6または配列番号7のCDR1、配列番号9のCDR2、および配列番号12のCDR3より選択されるか、あるいはCDR1が配列番号7であり、CDR2が配列番号8であり、そしてCDR3が配列番号11または配列番号13であり、但し、配列番号6のCDR1が存在する場合、a)CDR3は配列番号11または配列番号13のいずれでもないか、あるいはb)この抗体内のCDR2およびCDR3は、それぞれ、同時に配列番号8および配列番号12ではない、
そして、該抗体はヒト心臓トロポニンTに特異的に結合し、そして37℃で10分間またはそれより長いt/2解離を有する
を含む抗体である。
(i)配列番号22のアミノ酸配列からなる軽鎖可変ドメイン、および
(ii)配列番号23;配列番号24;配列番号25;配列番号26;配列番号27;配列番号28;配列番号29;配列番号30;配列番号31;および配列番号32のアミノ酸配列より選択されるアミノ酸配列からなる重鎖可変ドメイン
を含む抗体に関する。
一般的に、当該技術分野に周知であるように、より低いKD値は、より高いまたは改善されたアフィニティに対応する。1つの態様において、突然変異体抗cTnT抗体は、5.8E-10MのKDを有する親抗体のKDと等しいかまたはそれより低い結合アフィニティを有する。
本発明はさらに、本明細書で上に定義する本発明の抗体の任意の1つの軽鎖可変領域をコードする核酸分子に関する。この核酸分子は、本明細書において、本発明の第一の核酸分子と称される。さらに、本発明はまた、本明細書で上に定義する本発明の抗体の任意の1つの重鎖可変領域をコードする核酸分子にも関する。この核酸分子は、本明細書において、本発明の第二の核酸分子と称される。
本発明の核酸分子は、例えば標準的化学合成法および/または組換え法によって合成されてもよいし、あるいは例えば化学合成および組換え法を組み合わせることによって、半合成的に産生されてもよい。確立された方法、例えば制限消化、連結および分子クローニングを用いて、転写制御要素および/または他のアミノ酸コード配列に対するコード配列の連結を行ってもよい。
(i)配列番号2のアミノ酸配列を含むCDR1、配列番号3のアミノ酸配列を含むCDR2、および配列番号4のアミノ酸配列を含むCDR3を含む;
(ii)本明細書で上に定義するような式Iのアミノ酸配列からなる;または
(iii)配列番号22のアミノ酸配列からなる軽鎖可変ドメインに少なくとも85%同一であるアミノ酸配列からなる
軽鎖可変領域をコードする。
(i)配列番号6のアミノ酸配列または最大1つのアミノ酸置換で異なるその変異体を含むCDR1、配列番号9のアミノ酸配列または最大1つのアミノ酸置換で異なるその変異体を含むCDR2、および配列番号12のアミノ酸配列または最大1つのアミノ酸置換で異なるその変異体を含むCDR3を含む;
(ii)配列番号7のアミノ酸配列または最大1つのアミノ酸置換で異なるその変異体を含むCDR1、配列番号8のアミノ酸配列または最大1つのアミノ酸置換で異なるその変異体を含むCDR2、および配列番号11のアミノ酸配列または最大1つのアミノ酸置換で異なるその変異体を含むCDR3を含む;
(iii)配列番号7のアミノ酸配列または最大1つのアミノ酸置換で異なるその変異体を含むCDR1、配列番号8のアミノ酸配列または最大1つのアミノ酸置換で異なるその変異体を含むCDR2、および配列番号13のアミノ酸配列または最大1つのアミノ酸置換で異なるその変異体を含むCDR3を含む;
(iv)配列番号7のアミノ酸配列または最大1つのアミノ酸置換で異なるその変異体を含むCDR1、配列番号9のアミノ酸配列または最大1つのアミノ酸置換で異なるその変異体を含むCDR2、および配列番号13のアミノ酸配列または最大1つのアミノ酸置換で異なるその変異体を含むCDR3を含む;
(v)配列番号6のアミノ酸配列または最大1つのアミノ酸置換で異なるその変異体を含むCDR1、配列番号9のアミノ酸配列または最大1つのアミノ酸置換で異なるその変異体を含むCDR2、および配列番号10のアミノ酸配列または最大1つのアミノ酸置換で異なるその変異体を含むCDR3を含む;
(vi)配列番号7のアミノ酸配列または最大1つのアミノ酸置換で異なるその変異体を含むCDR1、配列番号9のアミノ酸配列または最大1つのアミノ酸置換で異なるその変異体を含むCDR2、および配列番号11のアミノ酸配列または最大1つのアミノ酸置換で異なるその変異体を含むCDR3を含む;
(vii)配列番号7のアミノ酸配列または最大1つのアミノ酸置換で異なるその変異体を含むCDR1、配列番号9のアミノ酸配列または最大1つのアミノ酸置換で異なるその変異体を含むCDR2、および配列番号12のアミノ酸配列または最大1つのアミノ酸置換で異なるその変異体を含むCDR3を含む;
(viii)配列番号7のアミノ酸配列または最大1つのアミノ酸置換で異なるその変異体を含むCDR1、配列番号9のアミノ酸配列または最大1つのアミノ酸置換で異なるその変異体を含むCDR2、および配列番号10のアミノ酸配列または最大1つのアミノ酸置換で異なるその変異体を含むCDR3を含む;
(ix)配列番号7のアミノ酸配列または最大1つのアミノ酸置換で異なるその変異体を含むCDR1、配列番号8のアミノ酸配列または最大1つのアミノ酸置換で異なるその変異体を含むCDR2、および配列番号12のアミノ酸配列または最大1つのアミノ酸置換で異なるその変異体を含むCDR3を含む;
(x)配列番号5のアミノ酸配列または最大1つのアミノ酸置換で異なるその変異体を含むCDR1、配列番号9のアミノ酸配列または最大1つのアミノ酸置換で異なるその変異体を含むCDR2、および配列番号12のアミノ酸配列または最大1つのアミノ酸置換で異なるその変異体を含むCDR3を含む;
(xi)本明細書で上に定義するような式IIのアミノ酸配列からなる;
(xii)配列番号23のアミノ酸配列からなる重鎖可変ドメインに少なくとも85%同一であるアミノ酸配列からなる;
(xiii)配列番号24のアミノ酸配列からなる重鎖可変ドメインに少なくとも85%同一であるアミノ酸配列からなる;
(xiv)配列番号25のアミノ酸配列からなる重鎖可変ドメインに少なくとも85%同一であるアミノ酸配列からなる;
(xv)配列番号26のアミノ酸配列からなる重鎖可変ドメインに少なくとも85%同一であるアミノ酸配列からなる;
(xvi)配列番号27のアミノ酸配列からなる重鎖可変ドメインに少なくとも85%同一であるアミノ酸配列からなる;または
(xvii)配列番号28のアミノ酸配列からなる重鎖可変ドメインに少なくとも85%同一であるアミノ酸配列からなる;
(xviii)配列番号29のアミノ酸配列からなる重鎖可変ドメインに少なくとも85%同一であるアミノ酸配列からなる;
(xix)配列番号30のアミノ酸配列からなる重鎖可変ドメインに少なくとも85%同一であるアミノ酸配列からなる;
(xx)配列番号31のアミノ酸配列からなる重鎖可変ドメインに少なくとも85%同一であるアミノ酸配列からなる;または
(xxi)配列番号32のアミノ酸配列からなる重鎖可変ドメインに少なくとも85%同一であるアミノ酸配列からなる
重鎖可変領域をコードする。
(i)本明細書で上に定義するオプション(i)にしたがった軽鎖可変ドメインおよび本明細書で上に定義するオプション(i)にしたがった重鎖可変ドメインをコードする核酸分子;
(ii)本明細書で上に定義するオプション(ii)にしたがった軽鎖可変ドメインおよび本明細書で上に定義するオプション(ii)にしたがった重鎖可変ドメインをコードする核酸分子;または
(iii)本明細書で上に定義するオプション(iii)にしたがった軽鎖可変ドメインおよび本明細書で上に定義するオプション(iii)にしたがった重鎖可変ドメインをコードする核酸分子
を含むベクターにさらに関する。
本発明のベクター、特にベクターのタイプまたは制御配列に関して、本明細書で上に提供するすべての定義および特に例示する態様は、変更すべきところは変更して適用される。ベクターのこの第二のタイプは、少なくとも2つの核酸分子、すなわち軽鎖可変ドメインをコードするものおよび重鎖可変ドメインをコードするものを含むベクターに関する。上記組み合わせから明らかであるように、軽鎖可変ドメインおよび重鎖可変ドメインは、本発明の機能性抗cTnT抗体の発現が可能であるように、ベクター中で組み合わせられる。この第二のタイプのベクターはまた、本明細書において、「本発明の組み合わせベクター」とも称される。
(i)本発明の組み合わせベクター;または
(ii)本発明の第一の核酸分子、すなわち本発明記載の軽鎖可変領域をコードする核酸分子を含む本発明の個々のベクター、および本発明の第二の核酸分子、すなわち本発明記載の重鎖可変領域をコードする核酸分子を含む本発明の個々のベクター、ここでこれらの2つのベクターは、上記オプション(i)~(iii)に定義するような軽鎖および重鎖可変領域をマッチさせるためにコードする核酸分子を含む
を含む宿主細胞または非ヒト宿主に関する。
組換え産生法で使用する宿主に応じて、発現された抗体はグリコシル化される可能性もあり、またはグリコシル化されない可能性もある。1つの態様において、本発明の抗体のコード配列を含有するプラスミドまたはウイルスを用い、そしてN末端FLAG-タグおよび/またはC末端His-タグに遺伝子融合させる。さらなる態様において、前記FLAG-タグの長さは、約4~8アミノ酸、例えば正確に8アミノ酸である。上記ベクターを用いて、一般の当業者に一般的に知られる技術のいずれを用いて、宿主を形質転換またはトランスフェクションしてもよい。さらに、融合された機能的に連結された遺伝子を調製し、そしてこれらを例えば哺乳動物細胞および細菌において発現するための方法が当該技術分野に周知である(Sambrook、同箇所)。
本発明はさらに:
(i)本発明の抗体、
(ii)本発明の核酸分子、
(iii)本発明のベクター、
(iv)本発明の宿主細胞、および/または
(v)本発明の方法によって産生される抗体
の少なくとも1つを含む組成物に関する。
1つの態様において、本発明の組成物は、当業者が、当該技術分野に周知のin vitroまたはex vivo法、例えばイムノアッセイのような方法を行うことを可能にする組成物である。
1つの態様において、本開示は、試料においてcTnTを検出する方法であって:a)本開示にしたがった抗cTnT抗体と試料を、抗cTnT抗体/cTnT複合体の形成のために十分な時間および条件下で接触させ;そしてb)抗cTnT抗体/cTnT複合体を測定する、ここでその複合体の量は、試料中のcTnTの濃度の指標となる、前記方法に関する。例えば「抗cTnT抗体/cTnT複合体」における用語「/」は、一方で抗cTnT抗体および他方でcTnTの間で、非共有複合体が形成されることを示すために用いられる。
用語「試料」または「関心対象の試料」または「試験試料」は、本明細書において交換可能に用いられる。試料はin vitro試料であり、in vitroで分析され、そして体内には戻されないであろう。試料の例には、限定されるわけではないが、液体試料、例えば血液、血清、血漿、滑液、尿、唾液、およびリンパ液、あるいは固形試料、例えば組織抽出物、軟骨、骨、滑膜、および結合組織が含まれる。1つの態様において、試料は、血液、血清、血漿、滑液および尿より選択される。1つの態様において、試料は、血液、血清および血漿より選択される。1つの態様において、試料は血清または血漿である。
(a)蛍光色素
蛍光色素は、例えば、Briggsら ”Synthesis of Functionalized Fluorescent Dyes and Their Coupling to Amines and Amino Acids,” J. Chem. Soc., Perkin-Trans. 1 (1997) 1051-1058)に記載されるとおりである。
発光色素または標識は、化学発光および電気化学発光色素にさらに下位分類することも可能である。
以下の実施例が本発明を例示する。
組換えDNA技術
Sambrook, J.ら, Molecular Cloning: A laboratory manual; Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York, 1989に記載されるような標準法を用いて、DNAを操作した。製造者の指示にしたがって分子生物学試薬を用いた。
Microsynth AG(スイス・バルガッハ)で行われる二本鎖配列決定によって、DNA配列を決定した。
Vector NT1 Advanceパッケージソフト、バージョン11.5.0を、配列生成、マッピング、分析、注釈および例示に用いた。
標準タンパク質化学および標識技術は、例えば、Hermanson, G. “Bioconjugate Techniques” 第3版 (2013) Academic Pressに提供される。
バイオインフォマティクス法は、例えば、Keith J.M. (監修) “Bioinformatics” Vol. IおよびVol. II, Methods in Molecular Biology Vol. 1525およびVol. 1526 (2017) Springerに、そしてMartin, A.C.R. & Allen, J. “Bioinformatics Tools for Analysis of Antibodies” : Duebel S. & Reichert J.M. (監修) “Handbook of Therapeutic Antibodies”中 Wiley-VCH (2014)に提供される。
イムノアッセイおよび関連法は、例えば、Wild D. (監修) “The Immunoassay Handbook” 第4版 (2013) Elsevierに提供される。電気化学発光標識としてのルテニウム複合体は、例えば、Staffilani M.ら Inorg. Chem. 42 (2003) 7789-7798に提供される。典型的には、電気化学発光(ECL)に基づくイムノアッセイの実行のため、Elecsys 2010分析装置または後継系、例えばRoche分析装置(Roche Diagnostics GmbH、ドイツ・マンハイム)例えば、E170、cobas e 601モジュール、cobas e 602モジュール、cobas e 801モジュール、およびcobas e 411、ならびにこれらの分析装置のために設計されたRoche Elecsysアッセイを、別に示さない限り、各々、標準条件を用いて、用いた。
親抗体可変重鎖は、ネズミ起源のものである(配列番号34)。それぞれ、HCCDR1、HCCDR2および/またはHCCDR3の単一アミノ酸ランダム化を目的として、突然変異HCCDRを含むライブラリーを構築した。第一の工程において、各々、4つの異なる親抗体フレームワーク領域の1つをコードする4つのDNA断片を生成した。社内で、ポリメラーゼ連鎖反応によって、フレームワーク領域1、3および4を得て、フレームワーク領域2に相当する短い断片2(42bp)を、Metabion international AGで注文した(図1Aを参照されたい)。断片をゲル精製し、そして定量化した。これらのDNA断片の1つの100ngを、4つのアドオンPCR反応混合物の各々において、ポリヌクレオチドテンプレートとして用いた。親CDRと同じ数のコドンを含むポリヌクレオチドライブラリーの使用によってCDR領域を付加し、ここで前記ライブラリーのメンバーは、それぞれのHCCDRのそれぞれのコドン位各々に1つのNNKコドンを含むライブラリーメンバーを含むよう設計された。さらに、CDRライブラリー中のポリヌクレオチドは、それぞれのCDRに隣接するフレームワーク領域にハイブリダイズ可能な配列を含んだ。入れ子(nested)PCR増幅のため、末端プライマーを用いた。それによって(図1Bを参照されたい)、部分的に重複する配列を含む4つのDNA断片を生成した。FW1配列の3’端に、そしてFW4配列の5’端にハイブリダイズする末端プライマーを用いて、重複PCRを行って、4つの断片を直鎖DNAライブラリー構築物に連結した(図1Cを参照されたい)。典型的なPCR反応を、PCR等級の水で100μl反応混合物に満たし、該混合物は、MgSO4を含む10μlの10xPCR緩衝剤、200μM dNTP混合物、0.5μM順方向プライマーおよび逆方向プライマー、250ng DNAテンプレート、5単位のPwo DNAポリメラーゼを含有した。典型的なPCRは、94℃5分間の初期テンプレート変性で開始し、30サイクル(94℃2分間、60℃45秒間、72℃1分間)を使用し、そして72℃5分間の最終伸長工程を含有した。プライマー、テンプレートおよび断片配列を表1に列挙する。ライブラリー断片は、細胞不含系における転写および翻訳の成功に必要なすべての制御配列を含有した。当業者は、当該技術分野の方法によって、こうしたライブラリーを生成可能である。例えば、Hanes, J. & Pluckthun, A. (1997), “In vitro selection and evolution of functional proteins by using ribosome display”, Proc Natl Acad Sci U.S.A. 94, 4937-42を参照されたい。こうして生成した、3つのHC CDRを含み、そして約5・1011ライブラリーメンバーに相当するDNAライブラリー250ngを、in vitroディスプレイアプローチに用いた。
抗cTnT Fab断片ライブラリーの生成に用いた配列
Fabディスプレイ用の緩衝液を調製し、そして回転ローテーションで、4℃で一晩インキュベーションした。洗浄緩衝液、WB(60mM Tris;AcOHでpH7.5に調整、180mM NaCl、60mM酢酸マグネシウム、5%ブロッカーBSA、33mM KCl、200μg t-RNA、0.05%Tween20);ビーズ洗浄緩衝液BWB(100mM PBS、0.1%Tween20);停止緩衝液SB(50mM Tris、AcOHでpH7.5に調整、150mM NaCl、50mM酢酸マグネシウム、5%ブロッカーBSA(Pierce)、33mM KCl、0.5%Tween20、8.2mM酸化グルタチオン);溶出緩衝液(55mM Tris AcOHでpH7.5に調整、165mM NaCl、22mM EDTA、1mg BSA、5000U rRNA(5000U)、50μg tRNA)。
さらに、4つの対照試料をセットアップした。最初の2つの試料は、試料TおよびBGのmRNA単離後のDNA消化から得られ、そして潜在的に残っているDNAを増幅するPCRによって該試料を検証した。第三および第四は、PCR等級の水を用いた、RTの陰性対照および「RTに対するPCR」に関する陰性対照であった。
濃縮されたFab結合剤を単離するため、FabのヒトCH1ドメイン、ネズミVLドメインおよびヒトCLドメインを含有するphoATIR3-9bi Fab TN-T M7chim発現ベクター(図2を参照されたい)内に、ネズミ可変HCをクローニングした。発現ベクター内へのクローニングを可能にするため、リーダー配列Tir9に位置するBsiWI制限部位を、各選択プールに提供した。
詳細なBioacore分析のために、最適な突然変異Fab結合剤を明らかにするため、先の酵素連結免疫吸着アッセイ(ELISA)を実施した。ELISAセットアップを図3に示す。軌道振盪装置上で振盪することによって、ビオチン化組換え心臓トロポニンT(100nM)をストレプトアビジン-MTP96ウェルプレートにRTで1時間捕捉した。抗原トロポニンTを100μL IP緩衝液(PBS pH7.3、1%BSA)中で希釈した。続いて、マイクロプレート洗浄装置BioTek ELx405 Selectを用いて、ウェルを300μL 1x洗浄緩衝液(150mM NaCl、0.05%Tween20、0.2%Bronidox)で3回洗浄した。洗浄後、突然変異抗cTnT Fab結合剤を含有する未精製細胞抽出物をIP緩衝液で1:2に希釈し、そしてトロポニンTが捕捉されたウェルに移した。再び、ウェルを300μL 1x洗浄緩衝液で3回洗浄した。ヤギで産生された抗ヒトIgG(Fab特異的)-ペルオキシダーゼ標識抗体(検出抗体)を1:40000希釈(IP緩衝液中)で用いて、トロポニンT結合突然変異Fab断片を検出した。ウェルを再び300μLの1x洗浄緩衝液で3回洗浄して、未結合検出抗体を除去した。マイクロプレートを、RTで30分間、ウェルあたり100μLのABTSでインキュベーションした。405nmに設定したマイクロプレート読み取り装置BioTek Power wave XSで、光学密度を測定した。親抗cTnT抗体の野生型Fabを陽性対照として用いた。最初のヒットを同定し、そしてその未精製細胞抽出物を動力学分析に供した。
GE Healthcare T200装置上、詳細な動力学研究を37℃で行った。Biacore CM-5シリーズSセンサーを装置に搭載し、そして製造者の指示にしたがってあらかじめ調整した。システム緩衝液は、HBS-ET(10mM HEPES(pH7.4)、150mM NaCl、1mM EDTA、0.05%(w/v)Tween(登録商標)20)であった。試料緩衝液は、1mg/ml CMD(カルボキシメチルデキストラン、Fluka)を補充したシステム緩衝液であった。1つの態様において、抗ヒト抗体捕捉系をCM5バイオセンサー上で確立した。NHS/EDC化学を用いて、製造者の指示にしたがって、GAHF(ab’)2、(ヤギ抗ヒトF(ab’)2)(コード番号:109-005-097、ロット番号13.12.2005、Jackson Immuno Research)を固定した。10mM酢酸ナトリウム緩衝液(pH5.0)中の30μg/mlのGAHF(ab’)2を、フローセル1、2、3および4にあらかじめ濃縮し、そして10.000 RU GAHF(ab’)2で固定した。続いて、センサーを1MエタノールアミンpH8.5で飽和させた。
構築し、そして分析したすべての突然変異(対応するアミノ酸置換(単数または複数)を含む)の概観
表3:
アフィニティ成熟cTnT抗体Fab断片の動力学データ
標準法にしたがってキメラヒト/マウス抗体を得た。対応するベクターおよびクローニング法が、Norderhaugら J Immunol Methods. 1997 May 12;204(1):77-87に記載される。
実施例7にしたがって産生した抗体をサンドイッチイムノアッセイ(図4を参照されたい)中で試験した。IgGルテニウムコンジュゲートを生成し、そして親抗cTnT抗体と突然変異抗cTnT抗体の成績を比較するため、真正Roche Elecsysアッセイ、カタログ番号05092744190(Roche Diagnostics GmbH、ドイツ・マンハイム)中に含まれる元来の標準ルテニル化コンジュゲートの代わりに用い、そして比較した。突然変異mAbを、異なる標識化学量論で、ルテニウムにコンジュゲート化した。1つの態様において、ルテニウム標識モル比は、1:10抗体IgG:標識であった。抗cTnT抗体変異体由来のルテニウムコンジュゲートをElecsys R2試薬中で希釈し、そしてトロポニンT hsアッセイ明細を用いて、ブランク対照(普遍希釈剤、Id. 11732277122、希釈剤マルチアッセイ、Id. 03609987170、Roche Diagnostics GmbH、ドイツ・マンハイム)、トロポニンT hsCalSet由来のCal1およびCal2(Id. 05092752190、Roche Diagnostics GmbH、ドイツ・マンハイム)で、トロポニンT hsアッセイプロトコルを用いて、Cobas E170モジュール上で測定を行った。結果を図5に示す。それぞれ組み合わせ番号11および12に存在する突然変異を含む抗体は、親(非突然変異)抗体に比較して、改善されたシグナル対ノイズ比を示す。
Claims (13)
- 各々、既知の親CDRを含む関心対象の抗体のフレームワーク領域および少なくとも1つの隣接相補性決定領域(CDR)をコードするポリヌクレオチドのライブラリーを生成する方法であって、該親CDRが既知の親CDRポリヌクレオチド配列にコードされ、該方法は、
i)抗体の第一のフレームワーク領域をコードするポリヌクレオチドを提供し、
ii)(i)のポリヌクレオチドに関する第一のPCRプライマーを提供し、
iii)各々、要素A-B-Cからなるポリヌクレオチドの混合物を提供し、
ここで
A)は第一のフレームワーク領域にハイブリダイズ可能なポリヌクレオチドであり、
各B)は、親CDRポリヌクレオチド配列と同じ数のコドンを含むポリヌクレオチドライブラリーのメンバーであり、ここで、該ライブラリーのメンバーは、少なくとも1つのランダム化コドンを含むよう設計されており、そして、ランダム化が親CDRポリヌクレオチド配列を生成しないように設計される、そして
C)は第二のフレームワーク領域にハイブリダイズ可能なポリヌクレオチドである、
iv)要素(C)に関する第二のPCRプライマーを提供し
v)ポリヌクレオチド(i)~(iv)に基づくPCRを実行し、それによってポリヌクレオチドのライブラリーを得る、
そしてここでこうしたPCRは、親CDRポリヌクレオチド配列の非存在下で行われる
ことで特徴づけられる、前記方法。 - 前記の第一のフレームワーク領域は、FW1またはFW4のいずれかであり、前記の第二のフレームワーク領域は、該第一のものがFW1であればFW2であるか、または該第一のものがFW4であればFW3であり、そして前記CDRは、該第一のフレームワーク領域がFW1であればCDR1であるか、または該第一のフレームワーク領域がFW4であればCDR3である、請求項1の方法。
- 前記の第一のフレームワーク領域がFW1であり、前記の第二のフレームワーク領域がFW2であり、前記の第一のプライマーがFW1に関する順方向プライマーであり、そして前記の第二のプライマーがFW2に関する逆方向プライマーであり、そして前記CDRがCDR1である、請求項1または2の方法。
- 前記の第一のフレームワーク領域がFW4であり、前記の第二のフレームワーク領域がFW3であり、前記の第一のプライマーがFW4に関する逆方向プライマーであり、そして前記の第二のプライマーがFW3に関する順方向プライマーであり、そして前記親CDRがCDR3である、請求項1または2の方法。
- 各々、第一および第二の既知の親CDRを含む関心対象の抗体のフレームワーク領域および2つの隣接相補性決定領域(CDR)をコードするポリヌクレオチドのライブラリーを生成する方法であって、第一および第二の親CDRが、第一および第二の既知のCDRポリヌクレオチド配列によってコードされ、該方法は、
i)抗体の第一のフレームワーク領域をコードするポリヌクレオチドを提供し、
ii)各々、要素A-B-Cからなるポリヌクレオチドの第一の混合物を提供し、
ここで
A)は該第一のフレームワーク領域にハイブリダイズ可能なポリヌクレオチドであり、
各B)は、該第一の親CDRと同じ数のコドンを含む第一のポリヌクレオチドライブラリーのメンバーであり、ここで、該ライブラリーのメンバーは、少なくとも1つのランダム化コドンを含むよう設計されており、そして、ランダム化が親CDRポリヌクレオチド配列を生成しないように設計される、そして
C)は第二のフレームワーク領域にハイブリダイズ可能なポリヌクレオチドである、
iii)要素C)に関する第一のPCRプライマーを提供し、
iv)各々、要素A’-B’-C’からなるポリヌクレオチドの第二の混合物を提供し、
ここで
A’)は該第一のフレームワーク領域にハイブリダイズ可能なポリヌクレオチドであり、
各B’)は、該第二の親CDRポリヌクレオチド配列と同じ数のコドンを含む第二のポリヌクレオチドライブラリーのメンバーであり、ここで、該ライブラリーのメンバーは、少なくとも1つのランダム化コドンを含むよう設計されており、そして、ランダム化が親CDRポリヌクレオチド配列を生成しないように設計される、そして
C’)は第三のフレームワーク領域にハイブリダイズ可能なポリヌクレオチドである
v)要素C’)に関する第二のPCRプライマーを提供し、
vi)ポリヌクレオチド(i)~(v)に基づくPCRを実行し、それによってポリヌクレオチドのライブラリーを得る、
そしてここでこうしたPCRは、親CDRポリヌクレオチド配列の非存在下で行われる
ことで特徴づけられる、前記方法。 - 前記の第一のフレームワーク領域がFW2であり、前記の第二のフレームワーク領域がFW1であり、前記の第三のフレームワーク領域がFW3であり、前記第一の親CDRがCDR1であり、前記第二の親CDRがCDR2であり、要素C)に関する前記の第一のプライマーがFW1に関する順方向プライマーであり、要素C’)に関する前記の第二のプライマーがFW3に関する逆方向プライマーである、請求項5の方法。
- 前記の第一のフレームワーク領域がFW3であり、前記の第二のフレームワーク領域がFW2であり、前記の第三のフレームワーク領域がFW4であり、該第一の親CDRがCDR2であり、該第二の親CDRがCDR3であり、要素C)に関する前記の第一のプライマーがFW2に関する順方向プライマーであり、要素C’)に関する前記の第二のプライマーがFW4に関する逆方向プライマーである、請求項5の方法。
- 要素B)において、親CDRポリヌクレオチド配列の1つのコドンまたは2つのコドンがランダム化されている、請求項1~7のいずれか一項の方法。
- 抗体の可変鎖をコードするポリヌクレオチドのライブラリー、ここで可変鎖が可変H鎖または可変L鎖より選択される、
を生成するための請求項1~8のいずれか一項の方法により得られるポリヌクレオチドのライブラリーの使用であって、
該得られるライブラリーにおいて:
ポリヌクレオチドが抗体の可変鎖の1つのランダム化CDRまたは2つの隣接ランダム化CDRをコードし、そして
他の(ランダム化)ポリヌクレオチド配列に対する親ポリヌクレオチド配列の比が、1つのCDRがランダム化されている場合は1:106またはそれ未満であり、そして2つのCDRがランダム化されている場合には1:107またはそれ未満である、
前記使用。 - 請求項3、4、6および7にしたがって生成されるライブラリーに基づいて重複PCRを実行することによって、抗体の可変鎖をコードするポリヌクレオチドのライブラリーを生成するための方法。
- 抗体が第一の可変鎖および第二の可変鎖を含む抗体ライブラリーを生成するための方法であって、請求項10記載の方法により得られる抗体の第一の可変鎖をコードするポリヌクレオチドライブラリーが発現され、
ここで、該得られるライブラリーにおいて、
可変鎖がランダム化CDR1、ランダム化CDR2およびランダム化CDR3を含み、そして
他のポリヌクレオチド配列に対する親ポリヌクレオチド配列の比が1:5x107またはそれ未満である、
そして
該発現されるライブラリーは、前記抗体の第二の可変鎖と組み合わせられる、
前記方法。 - 請求項11にしたがって生成されたライブラリーから、第一の可変鎖および第二の可変鎖を含む抗体を選択する方法であって、選択された抗体が既知の親CDRを含む親抗体に比較して、改善された結合特性を有する、前記方法。
- 選択された抗体が、親抗体に比較して少なくとも20%の解離複合体半減期t/2の選択された増加を示す、請求項12の方法。
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