JP2022543863A - 新規抗トロポニンｔ抗体 - Google Patents

Abstract

本発明は、心筋トロポニンＴに結合し、親モノクローナル抗体Ｍ１１－７よりも良好なＫＤを有する改善されたバリアントモノクローナル抗体に関する。

Description

本発明は、ヒト心筋トロポニンＴ（配列番号１）に特異的に結合する抗体であって、ＣＤＲが、以下のアミノ酸配列または最大で１つのアミノ酸置換において異なるそのバリアントを含むことを特徴とする抗体：（ｉ）軽鎖可変ドメイン中の、配列番号２のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、配列番号３のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２、および配列番号４のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３を含み、（ｉｉ）重鎖可変ドメイン中の、配列番号５のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、配列番号６のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２、および配列番号７のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３、を含むことを特徴とする、新規モノクローナル抗体に関する。

本明細書では、特許出願および製造者のマニュアルを含む多くの文書が引用されている。これらの文書の開示は、本発明の特許性に関連するとは見なされないが、その全体が参照により本明細書とともに組み込まれる。より具体的には、参照されたすべての文書は、個々の文書が参照により組み込まれることが具体的かつ個々に示されている場合と同程度まで、参照により組み込まれる。

心筋トロポニンは、心臓損傷の高感度かつ特異的なバイオマーカーである。特に、心筋トロポニンＴ（ｃＴｎＴ）は心臓特異性が高く、非心筋筋または他の組織損傷後の血清中には存在しない。さらに、ｃＴｎＴは、心筋梗塞の診断に使用される他のバイオマーカーよりも持続性および感度の高いバイオマーカーであることが示されている。したがって、心筋トロポニンは一般的に急性心筋虚血の診断に有用であり、ｃＴｎＴは特に有用である。

心筋トロポニンＴは、心臓疾患の患者において広く使用されているバイオマーカーである。心臓疾患を有する患者におけるその有用性は、最近Ｗｅｓｔｅｒｍａｎｎら（Ｎａｔｕｒｅ Ｒｅｖｉｅｗｓ／Ｃａｒｄｉｏｌｏｇｙ，ｖｏｌ１４（２０１７）４７３－４８３によって総説されている。ｃＴｎＴの使用は、急性心筋梗塞（ＡＭＩ）が疑われる患者において十分に確立されているが、トロポニン測定は他の急性および非急性の状況においても使用される。ＡＭＩが疑われる患者では、迅速な治療およびさらなる診断評価を可能にするために、早期の意思決定が重要である。

トロポニンのより新しい高感度アッセイは、明らかにより低い濃度の検出を可能にする。これらのアッセイおよび非常に低いカットオフ濃度を使用して、急性心臓治療における診断を改善するためのいくつかの迅速な診断戦略が報告されている。さらに、トロポニンアッセイの非冠動脈および非急性適用、例えば、心不全、肺塞栓症、または安定冠動脈疾患の患者におけるバイオマーカーとしての適用は、兆しが見えており、これは個々のリスク層別化を改善し得る。

心筋トロポニンＴは、通常、サンドイッチ型免疫アッセイで測定され、少なくとも１つの抗体がｃＴｎＴを捕捉するために使用され、少なくとも第２の（標識された）抗体が試料中のｃＴｎＴを検出するために使用される。これは、Ｒｏｃｈｅ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ（ドイツ）によって販売されているｃＴｎＴの第５世代アッセイにも当てはまる。Ｅｕｒｏｐｅａｎ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ ｏｆ Ａｎｉｍａｌ Ｃｅｌｌ Ｃｕｌｔｕｒｅｓ，ＧＢに寄託されたハイブリドーマクローン７．１ Ａ １２．２－２２（ＥＣＡＣＣ ８９０６０９０１）によって産生されたモノクローナル抗体１２．１ Ａ １１．１１－７は、ｃＴｎＴのアッセイにおける最良の検出抗体としてほぼ３０年にわたって使用されてきた。この抗体が１９８９年に作製されて以来、ｃＴｎＴの検出のためのより良好なモノクローナル抗体は現れていない。

過去数年にわたって、例えばそのようなアッセイで使用される検出抗体の標識化のための高度な技術に基づいて、様々なトロポニンの測定のためのさらに高感度のアッセイが開発されてきた。

多くの研究で、トロポニンの様々な高感度アッセイが、ＡＭＩが疑われる患者のトリアージを改善する可能性ならびに臨床診断の他の分野における有用性の両方について評価されている。

最も高感度のトロポニンアッセイでさえ、一定の割合の健康な個体においてトロポニンを測定できないことが報告されている（例えば、上記のＷｅｓｔｅｒｍａｎｎらを参照のこと）。明らかに、アッセイ感度は、例えばｃＴｎＴの検出において最も重要であり、そのための改善は非常に望ましいものであろう。

この必要性は、特許請求の範囲に定義される実施形態を提供することによって本発明によって対処される。

ここで、非常に驚くべきことに、一方では抗体とｃＴｎＴとの複合体形成に悪影響を及ぼさないが、ｃＴｎＴとそのような変異体抗体との間で形成される複合体の安定性に関して有意な改善を表す、抗体１２．１Ａ １１．１１－７の相補性決定領域（ＣＤＲ）に特定の変異を導入することができることが見出された。これらの驚くべき特性により、優れた感度を有するｃＴｎＴのアッセイが実現可能である。

したがって、本発明は、ヒト心筋トロポニンＴ（配列番号１）に特異的に結合する抗体であって、ＣＤＲが、以下のアミノ酸配列または最大で１つのアミノ酸置換において異なるそのバリアントを含むことを特徴とする抗体：
（ｉ）軽鎖可変ドメイン中の、配列番号２のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、配列番号３のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２、および配列番号４のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３、ならびに
（ｉｉ）重鎖可変ドメイン中の、配列番号５のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、配列番号６のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２、および配列番号７のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３、を含むことを特徴とする、新規モノクローナル抗体に関する。

抗体の全体構造は当技術分野で周知であり、ジスルフィド結合によって連結された２つの重鎖および２つの軽鎖を含む。重鎖および軽鎖はそれぞれ、１つの定常ドメインおよび１つの可変ドメインからなる。抗原に対する結合特異性は、抗体を形成する軽鎖および重鎖の可変ドメインによって提供される。より具体的には、特異性を決定し、特異的リガンドと接触する抗体の部分は、相補性決定領域（ＣＤＲ）と称される。ＣＤＲは、分子の最も可変的な部分であり、これらの分子の抗原結合多様性に寄与する。各可変ドメインには、４つのフレームワーク領域（ＦＷ）に組み込まれた３つのＣＤＲ領域ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３が存在する。本明細書で使用される場合、ＣＤＲ－ＨＣ（またはＣＤＲ（ＨＣ））は、可変重鎖のＣＤＲ領域を表し、ＣＤＲ－ＬＣ（またはＣＤＲ（ＬＣ））は可変軽鎖のＣＤＲ領域に関連する。同様に、ＦＷ－ＨＣ（またはＦＷ（ＨＣ））は可変重鎖のフレームワーク領域を示し、ＦＷ－ＬＣ（またはＦＷ（ＬＣ））は可変軽鎖のフレームワーク領域に関連する。

本発明によって使用される「含む」という用語は、具体的に記載された配列および／または成分に加えてさらなる配列／成分が含まれ得ることを示す。しかしながら、この用語はまた、特許請求される主題が正確に、記載された配列および／または成分からなることも包含する。

本発明の抗体が、記載されたアミノ酸配列を超えるアミノ酸配列を含む実施形態においては、さらなるアミノ酸がＮ末端もしくはＣ末端のいずれかまたは両方に存在し得る。さらなる配列は、例えば、本明細書中下記で詳細に議論されるように、例えば精製または検出のために導入される配列を含み得る。さらに、個々の配列が記載された配列を「含む」場合、それらはまた、Ｎ末端若しくはＣ末端のいずれかまたは両方にさらなるアミノ酸を含み得る。

本発明によれば、抗体は、配列番号１のヒト心筋トロポニンＴ（ｃＴｎＴ）に特異的に結合する。本発明の抗体が上記で詳述したようなさらなるアミノ酸を含む場合にも、前記抗体は必然的にｃＴｎＴに特異的に結合しなければならないことは理解されるであろう。

本発明によれば、「特異的に結合する」（「特異的に相互作用する」とも称する）という用語は、抗体がｃＴｎＴのみに特異的に結合するが、異なるタンパク質、特に、例えばトロポニンＩ（配列番号２９）等の類似の構造の異なるタンパク質と交差反応しないか、または本質的に交差反応しないことを意味する。

抗体の特異性を分析するための対応する方法は、例えば、Ｈａｒｌｏｗ＆Ｌａｎｅ（１９８８）Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，ａｎｄ ｉｎ Ｈａｒｌｏｗ＆Ｌａｎｅ（１９９９）Ｕｓｉｎｇ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓに記載されている。適切な研究の非限定的な例は、例えば、構造的および／または機能的に密接に関連する分子を用いた結合研究、ブロッキングおよび競合研究である。これらの研究は、例えば、ＦＡＣＳ分析、フローサイトメトリー滴定分析（ＦＡＣＳ滴定）、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ、例えば、ＢＩＡｃｏｒｅ（登録商標）による）、等温滴定熱量測定（ＩＴＣ）、蛍光滴定等の方法によって、または放射性標識リガンド結合アッセイによって実施することができる。さらなる方法としては、例えば、ウエスタンブロット、ＥＬＩＳＡ（競合ＥＬＩＳＡを含む）－、ＲＩＡ－、ＥＣＬ－、およびＩＲＭＡ－検査が挙げられる。

本発明の文脈において、「抗体」という用語は、完全な免疫グロブリン分子、ならびにＦａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）_２、Ｆｖ等のその抗原結合フラグメントに関する。さらに、この用語は、改変および／または変化した抗体分子、ならびに組換えまたは合成で生成された／合成された抗体に関する。「抗体」という用語はまた、二機能性抗体、三機能性抗体、完全ヒト抗体、キメラ抗体、および一本鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）または抗体融合タンパク質のような抗体コンストラクトを含む。

本明細書で使用される「Ｆａｂフラグメント」は、１つの軽鎖と、１つの重鎖のＣ_Ｈ１および可変領域から構成される。Ｆａｂ分子の重鎖は、別の重鎖分子とジスルフィド結合を形成することはできない。「Ｆａｂ’フラグメント」は、Ｖ_ＨドメインおよびＣ_Ｈ１ドメインを含み、ならびにＣ_Ｈ１ドメインとＣ_Ｈ２ドメインの間の領域も含み、それにより、２つのＦａｂ’フラグメントの２つの重鎖の間に鎖間ジスルフィド結合を形成して、Ｆ（ａｂ’）_２分子を形成することができるように、１つの軽鎖と１つの重鎖の一部とを含有する。「Ｆ（ａｂ’）_２フラグメント」は、Ｃ_Ｈ１ドメインとＣ_Ｈ２ドメインの間の定常領域の一部を含有する２つの軽鎖と２つの重鎖とを含有しており、それにより２つの重鎖間に鎖間ジスルフィド結合が形成される。したがって、Ｆ（ａｂ’）_２フラグメントは、２つの重鎖間のジスルフィド結合によって結合している２つのＦａｂ’フラグメントから構成される。

Ｆａｂ／ｃフラグメントは、Ｆｃ決定基およびＦａｂ決定基の両方を含有しており、「Ｆｃ」領域は、抗体のＣ_Ｈ２およびＣ_Ｈ３ドメインを含む２つの重鎖フラグメントを含有する。２つの重鎖フラグメントは、２つ以上のジスルフィド結合およびＣ_Ｈ３ドメインの疎水性相互作用によって結合している。

「Ｆｖ領域」は、重鎖および軽鎖の両方からの可変領域を含むが、定常領域を欠いている。「一本鎖Ｆｖ」（「ｓｃＦｖ」とも略される）は、本発明の文脈において、抗体のＶ_ＨドメインおよびＶ_Ｌドメインを有する抗体フラグメントであり、これらのドメインは、単一のポリペプチド鎖に存在する。概して、ｓｃＦｖポリペプチドは、ｓｃＦｖによって抗原結合のための所望の構造を形成することができるＶ_ＨドメインとＶ_Ｌドメインとの間にポリペプチドリンカーをさらに含む。一本鎖抗体の産生について説明されている技術は、例えば、Ｐｌｕｃｋｔｈｕｎ ｉｎ Ｔｈｅ Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ ｏｆ Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，Ｒｏｓｅｎｂｕｒｇ ａｎｄ Ｍｏｏｒｅ編，Ｓｐｒｉｎｇｅｒ－Ｖｅｒｌａｇ，Ｎ．Ｙ．１１３（１９９４），２６９－３１５において説明されている。

本明細書で使用される「完全ヒト抗体」という用語は、ヒト免疫グロブリンタンパク質配列のみを含む抗体を指す。それにもかかわらず、完全ヒト抗体は、マウス、マウス細胞、またはマウス細胞に由来するハイブリドーマにおいて産生される場合、マウス炭水化物鎖を含有していてもよく、またはラット、ラット細胞、またはラット細胞に由来するハイブリドーマにおいて産生される場合、ラット炭水化物鎖を含有していてもよい。同様に、完全ヒト抗体は、ハムスター、例えばＣＨＯ細胞等のハムスター細胞、またはハムスター細胞に由来するハイブリドーマで産生される場合、ハムスター炭水化物鎖を含有し得る。一方、「マウス抗体（ｍｏｕｓｅ ａｎｔｉｂｏｄｙ）」または「マウス抗体（ｍｕｒｉｎｅ ａｎｔｉｂｏｄｙ）」は、マウス（ｍｏｕｓｅ）（マウス（ｍｕｒｉｎｅ））免疫グロブリンタンパク質配列のみを含む抗体であり、「ラット抗体」または「ウサギ抗体」は、それぞれラットまたはウサギ免疫グロブリン配列のみを含む抗体である。完全ヒト抗体と同様に、そのようなマウス、ラットまたはウサギ抗体は、そのような動物またはそのような動物の細胞で産生される場合、他の種由来の炭水化物鎖を含有し得る。例えば、抗体は、例えばＣＨＯ細胞等のハムスター細胞、またはハムスター細胞に由来するハイブリドーマで産生される場合、ハムスター炭水化物鎖を含有し得る。完全ヒト抗体は、例えば、完全ヒト抗体の産生およびスクリーニングを可能にする広く使用されているスクリーニング技術であるファージディスプレイによって産生され得る。また、本発明との関連においてファージ抗体を使用することができる。ファージディスプレイ法は、例えば、米国特許第５，４０３，４８４号、同第５，９６９，１０８号および同第５，８８５，７９３号に記載されている。完全ヒト抗体の開発を可能にする他の技術は、マウスハイブリドーマ技術の改変を含む。マウスを、自身のマウス遺伝子と交換してヒト免疫グロブリン遺伝子座を含有するようにトランスジェニックにする（例えば、米国特許第５，８７７，３９７号明細書を参照されたい）。

「キメラ抗体」という用語は、ヒトまたは非ヒト種の可変領域が、ヒトまたは非ヒト（例えば、マウス、ウマ、ウサギ、イヌ、ウシ、ニワトリ）のいずれかの別の種からの抗体領域（例えば、定常領域）に融合したまたはキメラ化したものを含む抗体を指す。

先に記載したように、「抗体」という用語はまた、抗体が、特定のアミノ酸配列によって本明細書に定義するドメインに加えて、組換え生成したコンストラクトの単離および／または調製のための追加のドメイン（複数可）を含む、抗体融合タンパク質などの抗体コンストラクトも包含する。

本発明の抗体は、それが組換え抗体、例えば組換えヒト抗体、またはヘテロハイブリッド抗体でありながら、本発明で開示および定義されるＣＤＲを含むように産生することができる。

「組換え抗体」という用語は、組換え手法によって調製、発現、作製または単離された全ての抗体、例えばヒト免疫グロブリン遺伝子についてトランスジェニックである動物（例えば、マウス）から単離された抗体、宿主細胞内へトランスフェクトされた組換え発現ベクターを使用して発現させた抗体、組換えコンビナトリアルヒト抗体ライブラリから単離された抗体、またはヒト免疫グロブリン遺伝子配列を他のＤＮＡ配列にスプライシングすることを包含するいずれかの他の手段によって調製、発現、作製、または単離された抗体を含む。組換えヒト抗体は、ヒト生殖細胞系免疫グロブリン配列に由来する可変領域および定常領域（存在する場合）を有する。しかしながら、そのような抗体は、インビトロ突然変異誘発（または、ヒトＩｇ配列に対するトランスジェニック動物を使用する場合、インビボ体細胞変異誘発）に供することができ、したがって、組換え抗体のＶ_Ｈ領域およびＶ_Ｌ領域のアミノ酸配列は、ヒト生殖細胞系のＶ_Ｈ配列およびＶ_Ｌ配列に由来し、ヒト生殖細胞系のＶＨ配列およびＶＬ配列に関連するが、インビボでヒト抗体生殖細胞系レパートリー内に天然に存在し得ない配列である。

「ヘテロハイブリッド抗体」という用語は、異なる生物に由来する軽鎖および重鎖を有する抗体を指す。例えば、マウス軽鎖と会合したヒト重鎖を有する抗体は、ヘテロハイブリッド抗体である。ヘテロハイブリッド抗体の例としては、キメラ抗体およびヒト化抗体が挙げられる。

本発明による抗体は、軽鎖ＣＲＤと重鎖ＣＲＤとの記載された組合せを含む。ＣＤＲが組み込まれるそれぞれの可変ドメインの周囲のフレームワーク配列は、当業者によってさらに難なく選択され得る。例えば、以下にさらに記載されるフレームワーク配列または添付の実施例において用いられる特定のフレームワーク配列を使用することができる。

本発明によれば、ＣＤＲは、具体的に記載された配列を含むことができ、またはそれと最大１つのアミノ酸置換において異なり得る。したがって、ＣＤＲのそれぞれにおける１つのアミノ酸は、異なるアミノ酸によって置換され得る。１つの鎖または１つの抗体の全てではないが一部のＣＤＲにアミノ酸置換が存在することも包含されることが理解されるであろう。

本発明による「置換」という用語は、アミノ酸を他のアミノ酸と置き換えることを指す。したがって、アミノ酸の総数は同じままである。特定の位置でのアミノ酸の欠失および異なる位置での１つ（または複数）のアミノ酸の導入は、「置換」という用語に明示的に包含されるものではない。本発明による置換は、保存的アミノ酸置換または非保存的アミノ酸置換であってよい。「保存的アミノ酸置換」という用語は当技術分野で周知であり、アミノ酸の、類似の構造特性および／または化学特性を有する異なるアミノ酸との置き換えを指す。このような類似性には、例えば、関与する残基の極性、電荷、溶解度、疎水性、親水性、および／または両親媒性の性質における類似性を含む。次の基の１つのうちのあるアミノ酸が、同じ基の別のアミノ酸によって置換された場合、保存的アミノ酸置換である。非極性（疎水性）アミノ酸には、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、チロシン、トリプトファン、およびメチオニンが含まれ、極性中性アミノ酸には、グリシン、セリン、トレオニン、システイン、アスパラギン、およびグルタミンが含まれ、正に帯電した（塩基性）アミノ酸には、アルギニン、リジン、およびヒスチジンが含まれ、負に帯電した（酸性）アミノ酸には、アスパラギン酸およびグルタミン酸が含まれる。一実施形態において、ＣＤＲのいずれか（または全て）における置換は、保存的アミノ酸置換である。ＣＤＲの１つまたは複数にそのような置換アミノ酸を有する抗体も、配列番号１のｃＴｎＴに特異的に結合する抗体でなければならないことが理解されよう。

一実施形態において、ヒト心筋トロポニンＴ（配列番号１）に特異的に結合する抗体は、軽鎖可変ドメインが、配列番号２のアミノ酸配列のＣＤＲ１、配列番号３のアミノ酸配列のＣＤＲ２、および配列番号４のアミノ酸配列のＣＤＲ３、またはＣＤＲあたり多くとも１つのアミノ酸置換において異なるこれらのＣＤＲの１つもしくは複数のバリアントを含み、重鎖可変ドメインが、配列番号５のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、配列番号６のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２、および配列番号７のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３を含む、抗体である。

一実施形態において、本発明は、
ヒト心筋トロポニンＴ（配列番号１）に特異的に結合するモノクローナル抗体であって、ＣＤＲが、以下のアミノ酸配列、（ｉ）軽鎖可変ドメイン中に、配列番号２のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、配列番号３のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２、および配列番号４のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３を含み、（ｉｉ）重鎖可変ドメイン中に、配列番号５のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、配列番号６のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２、および配列番号７のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３を含むアミノ酸置換を含むことを特徴とする、抗体を開示している。

さらに、本発明は、ヒト心筋トロポニンＴ（配列番号１）に特異的に結合する抗体にも関し、ここで、抗体は、式Ｉ：
ＦＷ（ＬＣ）１－ＣＤＲ（ＬＣ）１－ＦＷ（ＬＣ）２－ＣＤＲ（ＬＣ）２－ＦＷ（ＬＣ）３－ＣＤＲ（ＬＣ）３－ＦＷ（ＬＣ）４（式Ｉ）に表されるようなフレームワーク領域（ＦＷ）およびＣＤＲからなる軽鎖可変ドメイン、および式ＩＩ：
ＦＷ（ＨＣ）１－ＣＤＲ（ＨＣ）１－ＦＷ（ＨＣ）２－ＣＤＲ（ＨＣ）２－ＦＷ（ＨＣ）３－ＣＤＲ（ＨＣ）３－ＦＷ（ＨＣ）４（式ＩＩ）に表されるようなＦＷおよびＣＤＲからなる重鎖可変ドメインを含み、
ＦＷは、以下のアミノ酸配列またはそれと少なくとも８５％同一のそのバリアント：
軽鎖中に、
ＦＷ（ＬＣ）１ 配列番号８のアミノ酸配列；
ＦＷ（ＬＣ）２ 配列番号９のアミノ酸配列；
ＦＷ（ＬＣ）３ 配列番号１０のアミノ酸配列；
ＦＷ（ＬＣ）４ 配列番号１１のアミノ酸配列；
および重鎖において
ＦＷ（ＨＣ）１ 配列番号１２のアミノ酸配列；
ＦＷ（ＨＣ）２ 配列番号１３のアミノ酸配列；
ＦＷ（ＨＣ）３ 配列番号１４のアミノ酸配列；
ＦＷ（ＨＣ）４ 配列番号１５のアミノ酸配列を含み、
ＣＤＲは、以下のアミノ酸配列、（ｉ）軽鎖可変ドメイン中に、配列番号２のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、配列番号３のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２、および配列番号４のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３、（ｉｉ）重鎖可変ドメイン中に、配列番号５のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、配列番号６のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２、および配列番号７のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３をそれぞれ含むか、またはＣＤＲ１つあたり多くとも１つのアミノ酸置換において異なるこれらのＣＤＲのバリアントを含む。

さらに、本発明は、式Ｉ：
ＦＷ（ＬＣ）１－ＣＤＲ（ＬＣ）１－ＦＷ（ＬＣ）２－ＣＤＲ（ＬＣ）２－ＦＷ（ＬＣ）３－ＣＤＲ（ＬＣ）３－ＦＷ（ＬＣ）４（式Ｉ）に表されるようなフレームワーク領域（ＦＷ）およびＣＤＲからなる軽鎖可変ドメイン、および式ＩＩ：
ＦＷ（ＨＣ）１－ＣＤＲ（ＨＣ）１－ＦＷ（ＨＣ）２－ＣＤＲ（ＨＣ）２－ＦＷ（ＨＣ）３－ＣＤＲ（ＨＣ）３－ＦＷ（ＨＣ）４（式ＩＩ）に表されるようなＦＷおよびＣＤＲからなる重鎖可変ドメインを含む抗ｃＴｎｔ抗体を開示しており、
ここで、ＦＷは、以下のアミノ酸配列：
軽鎖において、
ＦＷ（ＬＣ）１ 配列番号８のアミノ酸配列；
ＦＷ（ＬＣ）２ 配列番号９のアミノ酸配列；
ＦＷ（ＬＣ）３ 配列番号１０のアミノ酸配列；
ＦＷ（ＬＣ）４ 配列番号１１のアミノ酸配列；
および重鎖において、
ＦＷ（ＨＣ）１ 配列番号１２のアミノ酸配列；
ＦＷ（ＨＣ）２ 配列番号１３のアミノ酸配列；
ＦＷ（ＨＣ）３ 配列番号１４のアミノ酸配列；
ＦＷ（ＨＣ）４ 配列番号１５のアミノ酸配列またはそれと少なくとも８５％同一のそのバリアントを含み、
ここで、ＣＤＲは、以下のアミノ酸配列、（ｉ）軽鎖可変ドメインにおいて、配列番号２のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、配列番号３のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２、および配列番号４のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３、（ｉｉ）重鎖可変ドメインにおいて、配列番号５のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、配列番号６のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２、および配列番号７のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３を含む。

式Ｉに示される一次構造は、本発明の抗体の軽鎖可変ドメインの構成要素のＮ末端からＣ末端までの順序を表す。式ＩＩに示される一次構造は、本発明の抗体の重鎖可変ドメインの構成要素のＮ末端からＣ末端までの順序を表す。それぞれの場合において、フレームワーク領域（ＦＷ）１は、それぞれの可変鎖ドメインの最もＮ末端の部分を表し、ＦＷ４は、それぞれの可変鎖ドメインの最もＣ末端の部分を表す。

上に定義されるように、それぞれのＦＷおよびＣＤＲ配列は、記載されたアミノ酸配列を「含む」。一実施形態において、それぞれのＦＷおよびＣＤＲ配列は、前記アミノ酸配列からなり、すなわち、本発明の抗トロポニンＴ抗体の軽鎖可変ドメインおよび重鎖可変ドメインは、それぞれ式Ｉおよび式ＩＩに表されるＦＷおよびＣＤＲからなり、それぞれのＦＷおよびＣＤＲ配列は、記載されたアミノ酸配列からなる。

ＣＤＲおよびそのバリアントに関して、上記で示した定義および具体的に例示された実施形態は必要な変更を加えて適用される。

フレームワーク領域に関して、特定の程度の可変性も本明細書で想定され、すなわち、個々のＦＷは、具体的に記載されたアミノ酸配列またはそれと少なくとも８５％同一のアミノ酸配列を含むか、それらからなっていてもよい。好ましくは、同一性は少なくとも９０％、より好ましくは少なくとも９２．５％、より好ましくは少なくとも９５％であり、さらにより好ましくは同一性は少なくとも９８％、例えば少なくとも９９％であり、最も好ましくは同一性は少なくとも９９．５％である。異なるＦＷについては、実際の配列、および例えばそれぞれのＦＷ配列の長さ、ならびにそれぞれの可変鎖ドメイン内のその位置に応じて、異なる程度の配列同一性が許容され得ることが理解されよう。

本発明によれば、「配列同一性％」という用語は、アミノ酸配列の全長（またはその全体的に比較される部分）を構成するアミノ酸残基の数と比較した、２つ以上の整列したアミノ酸配列の同一のアミノ酸のマッチ数（「ヒット」）を表す。同一性パーセントは、同一の残基の数を残基の総数で除算し、積に１００を掛けることによって決定される。換言すれば、アラインメントを使用して、同じ（例えば、８５％の同一性）アミノ酸残基のパーセンテージを、２つ以上の配列または部分配列について、これらの（部分）配列を比較ウィンドウにわたって、または当技術分野で公知の配列比較アルゴリズムを使用して測定して指定された領域にわたって、最大の対応関係を得るために比較およびアラインメントする際、または手作業でアラインメントおよび目視検査する際に決定され得る。
当技術分野の当業者は、例えば、ＮＣＢＩ ＢＬＡＳＴアルゴリズム（Ａｌｔｓｃｈｕｌ，Ｓ．Ｆ．ら［１９９７］Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２５：３３８９－３４０２）、ＣＬＵＳＴＡＬＷコンピュータプログラム（Ｔｏｍｐｓｏｎ，Ｊ．Ｄ．ら［１９９４］Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２２：４６７３－４６８０）またはＦＡＳＴＡ（Ｐｅａｒｓｏｎ，Ｗ．Ｒ．＆Ｌｉｐｍａｎ，Ｄ．Ｊ．［１９８８］Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．８５：２４４４－２４４８）に基づくようなアルゴリズムを使用して配列間のパーセント配列同一性を決定する方法を知っている。一実施形態において、ＮＣＢＩ ＢＬＡＳＴアルゴリズムが本発明によって使用される。アミノ酸配列の場合、ＢＬＡＳＴＰプログラムは、３のワード長（Ｗ）および１０の期待値（Ｅ）をデフォルトとして使用する。ＢＬＯＳＵＭ ６２スコアマトリクス（Ｈｅｎｉｋｏｆｆ，Ｓ．＆Ｈｅｎｉｋｏｆｆ，Ｊ．Ｇ．［１９９２］Ｐｒｏｃ．ナットＡｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．８９：１０９１５－１０９１９）は、５０のアラインメント（Ｂ）、１０の期待値（Ｅ）、Ｍ＝５、Ｎ＝４、および両鎖の比較を使用する。したがって、％配列同一性が示される実施形態では、ＮＣＢＩ ＢＬＡＳＴプログラムで少なくとも８５％の配列同一性を有すると決定される全てのアミノ酸配列が前記実施形態の範囲に入る。

それぞれの具体的に記載されたアミノ酸配列と比較したフレームワーク領域における上記の程度の変動は、（１つまたは複数の）アミノ酸の置換、挿入、付加、または欠失によるものであり得る。

「置換」という用語は、本明細書において上記で定義されている。それらの場合、２つ以上のアミノ酸が置換される場合、各アミノ酸は独立して別のアミノ酸で置換される、すなわち、除去される各アミノ酸について、異なるアミノ酸が同じ位置に導入される。

本発明による「挿入」という用語は、具体的に記載されたアミノ酸配列への１つまたは複数のアミノ酸の付加を指し、付加はポリペプチドのＮ末端またはＣ末端ではない。

本発明による「付加」という用語は、具体的に記載されたアミノ酸配列への１つまたは複数のアミノ酸の、ポリペプチドのＮ末端若しくはＣ末端、または両方における付加を指す。

本発明によって使用される「欠失」という用語は、具体的に記載されたアミノ酸配列からの１つまたは複数のアミノ酸の喪失を指す。

一実施形態において、フレームワーク領域のアミノ酸配列の変動は、（１つまたは複数の）アミノ酸の置換に起因する。本明細書で上に定義される置換は、保存的アミノ酸置換または非保存的アミノ酸置換であり得る。「置換」という用語に関して上に提供された定義および具体的に例示された実施形態は、必要な変更を加えて適用される。一実施形態において、フレームワーク領域内の置換は保存的アミノ酸置換である。

さらなる実施形態において、ＣＤＲは、上記の特定の配列（すなわち、変動なし）からなっており、上記のフレームワーク領域（ＦＷ）は、上記の特定の配列内に最大で以下の量のアミノ酸変動：
ＦＷ（ＬＣ）１ 最大３のアミノ酸変動；
ＦＷ（ＬＣ）２ 最大２のアミノ酸変動；
ＦＷ（ＬＣ）３ 最大４のアミノ酸変動；
ＦＷ（ＬＣ）４ 最大１のアミノ酸変動；および
ＦＷ（ＨＣ）１ 最大３のアミノ酸変動；
ＦＷ（ＨＣ）２ 最大２のアミノ酸変動；
ＦＷ（ＨＣ）３ 最大４のアミノ酸変動；および

ＦＷ（ＨＣ）４ 最大１のアミノ酸変動を含む。

さらなる実施形態において、ＦＷのアミノ酸変動は置換である。

さらなる実施形態において、軽鎖または重鎖可変ドメインフレームワーク領域に存在する変動の総量は、最大で９アミノ酸置換、例えば最大で８アミノ酸置換、例えば最大で６アミノ酸置換、例えば最大で４アミノ酸置換、例えば最大で３アミノ酸置換、例えば最大で２アミノ酸置換である。さらなる実施形態において、一緒になった軽鎖可変ドメインのフレームワーク領域１～４または一緒になった重鎖可変ドメインのフレームワーク領域１～４に、１つのアミノ酸置換のみが存在する。

ＦＷとして本明細書で定義される式Ｉおよび式ＩＩの部分は、可変鎖領域のフレームまたは骨格の一部を形成するアミノ酸配列であるため、前記配列内の置換、特に保存的アミノ酸置換の形態での置換は、多くの場合、抗ｃＴｎＴ抗体の結合能力に影響しない。これは、これらのアミノ酸が典型的にはｃＴｎＴへの結合に直接関与せず、タンパク質の三次元構造および折り畳みの変化が起こらないように適切な代替アミノ酸へのそれらの置換を設計することができるためである。一方、そのような置換は、特定の宿主における発現の改善、または例えばさらなるジスルフィド架橋の導入によるタンパク質の安定化ため等の多数の有益な効果を提供することができる。

抗体の「結合親和性」は、次式：
ＫＤ（またはＫ_Ｄ）＝ｋｄ／ｋａにより、標的抗原上のエピトープと抗体の結合部位との間の相互作用の強度を測定する。
式中、
ＫＤ＝解離平衡定数［Ｍ］
ｋｄ＝ｄｉｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ ｒａｔｅ ｃｏｎｓｔａｎｔ［ｓ^－１］
ｋａ＝会合速度定数［Ｍ^－１ｓ^－１］である。

抗体の結合親和性についてのさらに関連するパラメータは次のとおりである：
ｔ／２＝解離複合体半減期＝ｌｎ２／ｋｄ／６０［分］
Ｒｍａｘ＝分析物の最大応答値［ＲＵ］
ＭＲ：モル比＝分析物の最大応答比（Ｒｍａｘ）。

一実施形態において、本明細書で上に開示される、ｃＴｎＴに結合するモノクローナル抗体は、３７°Ｃで１０分以上のｔ／２－ｄｉｓでｃＴｎＴに結合する。

本発明はさらに、
（ｉ）配列番号２７のアミノ酸配列からなる軽鎖可変ドメインと少なくとも８５％同一のアミノ酸配列からなる軽鎖可変ドメイン、および
（ｉｉ）配列番号２８の重鎖可変ドメインと少なくとも８５％同一であるアミノ酸配列からなる重鎖可変ドメインを含む抗体であって、
ヒト心筋トロポニンＴと特異的に結合し、３７°Ｃにおけるｔ／２－ｄｉｓが１０分以上である、抗体に関する。

本発明にはまた、
（ｉ）配列番号２７のアミノ酸配列からなる軽鎖可変ドメインと少なくとも８５％同一のアミノ酸配列からなる軽鎖可変ドメイン、および
（ｉｉ）配列番号２８のアミノ酸配列の重鎖可変ドメインを含む抗体であって、
ＣＤＲは、以下のアミノ酸配列、（ｉ）軽鎖可変ドメインにおいて、配列番号２のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、配列番号３のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２、および配列番号４のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３、（ｉｉ）重鎖可変ドメインにおいて、配列番号５のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、配列番号６のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２、および配列番号７のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３を含み、
ヒト心筋トロポニンＴと特異的に結合し、３７°Ｃにおけるｔ／２－ｄｉｓが１０分以上である、抗体が開示されている。

一実施形態において、本開示は、
（ｉ）配列番号２２のアミノ酸配列からなる軽鎖可変ドメイン、および
（ｉｉ）配列番号２８のアミノ酸配列からなる重鎖可変ドメインを含む抗体に関する。
本発明の抗ｃＴｎＴ抗体に関して本明細書で上に提供される全ての定義および具体的に例示された実施形態、特に言及された程度および種類の変動が必要な変更を加えて適用される。

本発明によれば、ｃＴｎＴに対する改善された結合特性（より良好なＫ_Ｄ値）を有し、それによって以前のアッセイと比較して優れた感度でｃＴｎＴの検出を可能にする新規な抗ｃＴｎＴ抗体が提供される。

「Ｋ_Ｄ」という用語は、平衡解離定数（平衡結合定数の逆数）を指し、当技術分野で提供される定義にしたがって本明細書で使用される。Ｋ_Ｄ値を決定するための手段および方法は、以下に簡潔に記載され、示される実施例に詳細に記載されている。

抗体、例えば抗ｃＴｎＴ抗体の結合特性は、Ｂｉａｃｏｒｅ技術が同義語となった表面プラズモン共鳴分光法のようなリアルタイムのバイオセンサー系分子相互作用測定を介して最も良好に決定される。実験の詳細を実施例５に示し、動態データを表２に示す。例えば、表２においてＡ１９２Ｗと標識された抗体は、ｃＴｎＴに対する改善された結合特性、すなわち、１．１Ｅ＋０６＜０．０１１／Ｍｓの会合定数（ｋ_ａ）、１Ｅ－０５未満の解離定数（ｋ_ｄ）（１１５５分超の解離のための半減期、したがって０．０１ｎＭ未満の全体的な親和定数（Ｋ_Ｄ）を有する。

本発明において開示および特許請求される変異抗体は、驚くべきことに、一方では、抗体とｃＴｎＴとの複合体形成に悪影響を及ぼさず、それらの全て「のＫａは親抗体と同じ範囲にある。一方で、より良好なＫ_Ｄ値に変換するｃＴｎＴ間に形成された複合体の安定性に関して有意な改善を達成することができた。

一実施形態において、本明細書で上に開示される、ｃＴｎＴに結合する本発明によるモノクローナル抗体は、３７°Ｃで１０分以上のｔ／２－ｄｉｓでｃＴｎＴに結合する。

一般的に、より低いＫ_Ｄ値は、当技術分野で周知のように、より高いまたは改善された親和性に対応する。一実施形態において、変異体抗ｃＴｎＴ抗体は、３ｎＭのＫ_Ｄを有する親抗体のＫ_Ｄ以下の結合親和性を有する。

可変軽鎖領域および可変重鎖領域の上記の配列は、添付の実施例で使用されているアミノ酸配列である。

本発明はさらに、本明細書の上記で定義される本発明の抗体のいずれか１つの軽鎖可変領域をコードする核酸分子に関する。この核酸分子は、本明細書において、本発明の第１の核酸分子と称する。さらに、本発明はまた、本明細書の上記で定義される本発明の抗体のいずれか１つの重鎖可変領域をコードする核酸分子に関する。この核酸分子は、本明細書において、本発明の第２の核酸分子と称する。

本発明によれば、本明細書において核酸配列またはポリヌクレオチドとも称する「核酸分子」という用語は、ＤＮＡ、例えばｃＤＮＡまたはゲノムＤＮＡを含む。

本発明の核酸分子は、例えば、標準的な化学合成法および／または組換え法によって合成してもよく、または例えば化学合成法と組換え法とを組み合わせることによって半合成的に産生してもよい。転写調節エレメントおよび／または他のアミノ酸コード配列へのコード配列のライゲーションは、制限消化、ライゲーションおよび分子クローニング等の確立された方法を使用して行うことができる。

本発明によれば、本発明の第１の核酸分子は、
（ｉ）配列番号２のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、配列番号３のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２、および配列番号４のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３を含む、
（ｉｉ）本明細書の上記で定義されるような式Ｉのアミノ酸配列からなる、または
（ｉｉｉ）配列番号２７のアミノ酸配列からなる軽鎖可変ドメインと少なくとも８５％同一のアミノ酸配列からなる、軽鎖可変領域をコードする。

同様に、本発明の第２の核酸分子は、
（ｉ）配列番号５のアミノ酸配列または最大でも１つのアミノ酸置換において異なるそのバリアントを含むＣＤＲ１、配列番号６のアミノ酸配列または最大でも１つのアミノ酸置換において異なるそのバリアントを含むＣＤＲ２、および配列番号７のアミノ酸配列または最大でも１つのアミノ酸置換において異なるそのバリアントを含むＣＤＲ３を含み、
（ｉｉ）本明細書の上記で定義されるような式ＩＩのアミノ酸配列からなる、
（ｉｉｉ）配列番号２８のアミノ酸配列からなる重鎖可変ドメインと少なくとも８５％同一のアミノ酸配列からなる、重鎖可変領域をコードする。

本発明はさらに、本発明の第１の核酸分子、すなわち本明細書の上記で定義される本発明の抗体のいずれか１つの軽鎖可変領域をコードする核酸分子を含むベクターに関する。本発明はさらに、本発明の第２の核酸分子、すなわち本明細書の上記で定義される本発明の抗体のいずれか１つの重鎖可変領域をコードする核酸分子を含むベクターに関する。そのようなベクターは、本明細書では「本発明の個々のベクター」とも称する。

多くの適切なベクターが分子生物学の当業者に知られており、その選択は所望の機能に依存する。ベクターの非限定的な例としては、プラスミド、コスミド、ウイルス、バクテリオファージ、および例えば遺伝子工学において従来から使用されている他のベクターが挙げられる。当業者に周知である方法は、種々のプラスミドベクターを構築するために使用することができ、例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら（ｌｏｃ ｃｉｔ．）ａｎｄ Ａｕｓｕｂｅｌ，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｇｒｅｅｎ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ ａｎｄ Ｗｉｌｅｙ Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ，Ｎ．Ｙ．（１９８９），（１９９４）において説明されている技術を参照されたい。

一実施形態において、ベクターは、発現ベクターである。本発明による発現ベクターは、宿主において本発明の核酸分子の複製および発現を指示することができ、したがって、選択された宿主においてそれによってコードされる本発明の抗トロポニンＴ抗体の可変鎖ドメインの発現を提供する。さらなる実施形態において、ベクターは、本発明の前記可変鎖ドメインだけでなく、本発明の前記可変鎖ドメインを含む全長ＩｇＧ抗体も発現することを確実にするためのさらなる配列を含む。

発現ベクターは、例えば、クローニングベクター、バイナリーベクターまたは組込みベクターであり得る。発現は、核酸分子から、例えば翻訳可能なｍＲＮＡ内への転写を含む。一実施形態において、ベクターは、モノクローナルウサギ抗体の重鎖および／または軽鎖の一過性組換え発現のための真核生物発現プラスミドである。そのようなベクターは具体的には、抗体発現だけでなく、例えば真核細胞、例えばＨＥＫ ２９３もしくはその誘導体またはＣＨＯ細胞の一過性トランスフェクションによる抗体産生のためにも開発されている。

ベクターの非限定的な例としては、ｐＱＥ－１２、ｐＵＣシリーズ、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）、ｐＥＴシリーズの発現ベクター（Ｎｏｖａｇｅｎ）またはｐＣＲＴＯＰＯ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、ラムダｇｔ１１、ｐＪＯＥ、ｐＢＢＲ１－ＭＣＳシリーズ、ｐＪＢ８６１、ｐＢＳＭｕＬ、ｐＢＣ２、ｐＵＣＰＫＳ、ｐＴＡＣＴ１、ｐＴＲＥ、ｐＣＡＬ－ｎ－ＥＫ、ｐＥＳＰ－１、ｐＯＰ１３ＣＡＴ、Ｅ－０２７ ｐＣＡＧ Ｋｏｓａｋ－Ｃｈｅｒｒｙ（Ｌ４５ａ）ベクター系、ｐＲＥＰ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、ｐＣＥＰ４（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、ｐＭＣ１ｎｅｏ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）、ｐＸＴ１（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）、ｐＳＧ５（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）、ＥＢＯ－ｐＳＶ２ｎｅｏ、ｐＢＰＶ－１、ｐｄＢＰＶＭＭＴｎｅｏ、ｐＲＳＶｇｐｔ、ｐＲＳＶｎｅｏ、ｐＳＶ２－ｄｈｆｒ、ｐＩＺＤ３５、Ｏｋａｙａｍａ－Ｂｅｒｇ ｃＤＮＡ発現ベクターｐｃＤＶ１（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）、ｐＲｃ／ＣＭＶ、ｐｃＤＮＡ１、ｐｃＤＮＡ３（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、ｐｃＤＮＡ３．１、ｐＳＰＯＲＴ１（ＧＩＢＣＯ ＢＲＬ）、ｐＧＥＭＨＥ（Ｐｒｏｍｅｇａ）、ｐＬＸＩＮ、ｐＳＩＲ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）、ｐＩＲＥＳ－ＥＧＦＰ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）、ｐＥＡＫ－１０（Ｅｄｇｅ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）ｐＴｒｉＥｘ－Ｈｙｇｒｏ（Ｎｏｖａｇｅｎ）およびｐＣＩＮｅｏ（Ｐｒｏｍｅｇａ）が挙げられる。ピキア・パストリスに適したプラスミドベクターの非限定的な例としては、例えばプラスミドｐＡＯ８１５、ｐＰＩＣ９ＫおよびｐＰＩＣ３．５Ｋ（全てＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）が挙げられる。アフリカツメガエル胚、ゼブラフィッシュ胚、ならびに広範の哺乳動物細胞および鳥類細胞においてタンパク質を発現させるのに適した他のベクターは、多目的発現ベクターｐＣＳ２＋である。

一般的に、ベクターは、クローニングまたは発現のための１つまたは複数の複製起点（ｏｒｉ）および遺伝系、宿主における選択、例えば抗生物質耐性のための１つまたは複数のマーカー、および１つまたは複数の発現カセットを含み得る。さらに、ベクターに含まれるコード配列は、確立された方法を使用して、転写調節エレメントおよび／または他のアミノ酸コード配列にライゲーションすることができる。そのような調節配列は当技術分野の当業者に周知であり、限定するものではないが、転写の開始を確実にする調節配列、内部リボソーム進入部位（ＩＲＥＳ）（Ｏｗｅｎｓ，Ｇ．Ｃ．ら［２００１］Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．９８：１４７１－１４７６）、および場合により転写の終結および転写産物の安定化を確実にする調節エレメントを含む。転写の開始を確実にするそのような調節エレメントの非限定的な例には、プロモーター、翻訳開始コドン、エンハンサー、インシュレーターおよび／または、本発明の核酸分子の下流に含まれる転写終結を確実にする調節エレメントが含まれる。さらなる例としては、コザック配列ならびにＲＮＡスプライシングのためのドナー部位およびアクセプター部位に隣接する介在配列、分泌シグナルをコードするヌクレオチド配列、または使用される発現系に応じて、発現されたタンパク質を細胞区画または培養培地に向けることができるシグナル配列が挙げられる。ベクターはまた、正しいタンパク質折り畳みを促進するために１つまたは複数のシャペロンをコードするさらなる発現可能なポリヌクレオチドを含有し得る。

適切な複製起点のさらなる例としては、例えば、完全長ＣｏｌＥ１、切断型ＣｏｌＥＩ、ＳＶ４０ウイルスおよびＭ１３複製起点が挙げられるが、適切なプロモーターのさらなる例としては、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーター、ＳＶ４０プロモーター、ＲＳＶプロモーター（ラウス肉腫ウイルス）、ｌａｃＺプロモーター、テトラサイクリンプロモーター／オペレーター（ｔｅｔ^ｐ／ｏ）、ニワトリβ－アクチンプロモーター、ＣＡＧプロモーター（ニワトリβ－アクチンプロモーターとサイトメガロウイルス前初期エンハンサーとの組合せ）、ｇａｉ１０プロモーター、ヒト伸長因子１α－プロモーター、ＡＯＸ１プロモーター、ＧＡＬ１プロモーター、ＣａＭキナーゼプロモーター、ｌａｃ、ｔｒｐまたはｔａｃプロモーター、Ｔ７またはＴ５プロモーター、ｌａｃＵＶ５プロモーター、オートグラファカ・リフォルニカ多重核多角体病ウイルス（ＡｃＭＮＰＶ）多面体プロモーターまたは哺乳動物細胞および他の動物細胞におけるグロビンイントロンが挙げられるが、これらに限定されない。エンハンサーの一例は、例えばＳＶ４０エンハンサーである。転写終結を確実にする調節エレメントの非限定的なさらなる例としては、ＳＶ４０－ポリＡ部位、ｔｋ－ポリＡ部位、ｒｈｏ非依存性ｌｐｐターミネーターまたはＡｃＭＮＰＶ多面体ポリアデニル化シグナルが挙げられる。選択マーカーのさらなる非限定的な例としては、メトトレキサートに対する耐性を付与するｄｈｆｒ（Ｒｅｉｓｓ，Ｐｌａｎｔ Ｐｈｙｓｉｏｌ．（Ｌｉｆｅ Ｓｃｉ．Ａｄｖ．）１３（１９９４）、１４３－１４９）、アミノグリコシドであるネオマイシン、カナマイシンおよびパラマイシンに対する耐性を付与するｎｐｔ（Ｈｅｒｒｅｒａ－Ｅｓｔｒｅｌｌａ、ＥＭＢＯ Ｊ．、２（１９８３）、９８７～９９５）、ならびにハイグロマイシンに対する耐性を付与するｈｙｇｒｏ（Ｍａｒｓｈ、Ｇｅｎｅ ３２（１９８４）、４８１－４８５）が挙げられる。さらなる選択可能な遺伝子、すなわち細胞がトリプトファンの代わりにインドールを利用することを可能にするｔｒｐＢ、ヒスチジンの代わりにヒスチノールを利用することを可能にするｈｉｓＤ（Ｈａｒｔｍａｎ、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ８５（１９８８）、８０４７）、マンノースを細胞が利用することを可能にするマンノース－６－ホスフェート（国際公開第９４／２０６２７号）およびオルニチンデカルボキシラーゼ阻害剤、２－（ジフルオロメチル）－ＤＬ－オルニチン、ＤＦＭＯに対する耐性を付与するＯＤＣ（オルニチンデカルボキシラーゼ）（ＭｃＣｏｎｌｏｇｕｅ，１９８７，Ｉｎ：Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｅｄ．）またはブラストサイジンＳに対する耐性を付与するアスペルギルス・テレウス由来のデアミナーゼ（Ｔａｍｕｒａ，Ｂｉｏｓｃｉ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．５９（１９９５）、２３３６－２３３８）が記載されている。

さらなる実施形態において、ベクターは、イントロンＡを含む５’ＣＭＶプロモーターおよび３’ＢＧＨポリアデニル化配列からなる発現カセットを含む真核生物発現プラスミドである。発現カセットに加え、プラスミドは、ｐＵＣ１８由来の複製起点と、大腸菌中のプラスミド増幅について、アンピシリン耐性を付与するβ－ラクタマーゼ遺伝子を含み得る。抗体の分泌のために、真核生物のリーダー配列を抗体遺伝子の５’にクローニングすることができる。

適切な細菌発現宿主は、例えば、ＪＭ８３、Ｗ３１１０、ＫＳ２７２、ＴＧ１、Ｋ１２、ＢＬ２１（例えば、ＢＬ２１（ＤＥ３）、ＢＬ２１（ＤＥ３）ＰｌｙｓＳ、ＢＬ２１（ＤＥ３）ＲＩＬ、ＢＬ２１（ＤＥ３）ＰＲＡＲＥ）またはＲｏｓｅｔｔａ由来の株を含む。ベクター改変、ＰＣＲ増幅およびライゲーション技術については、Ｓａｍｂｒｏｏｋ＆Ｒｕｓｓｅｌ［２００１］（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，ＮＹ）を参照のこと。

本発明の核酸分子および／またはベクターは、例えば、化学ベースの方法（ポリエチレンイミン、リン酸カルシウム、リポソーム、ＤＥＡＥ－デキストラン、ヌクレオフェクション）、非化学的方法（エレクトロポレーション、ソノポレーション、光トランスフェクション、遺伝子電気泳動、流体力学的送達、または細胞を本発明の核酸分子と接触させた際の天然形質転換）、粒子ベースの方法（遺伝子銃、マグネトフェクション、インパルフェクション）ファージベクターベースの方法およびウイルス法によって、細胞に導入するために設計することができる。例えば、レトロウイルス、ワクシニアウイルス、アデノ随伴ウイルス、ヘルペスウイルス、セムリキ森林ウイルスまたはウシパピローマウイルス等のウイルスに由来する発現ベクターを、標的細胞集団への核酸分子の送達に使用することができる。さらに、バキュロウイルス系を、本発明の核酸分子の真核生物発現系におけるベクターとして使用することもできる。一実施形態において、本発明の核酸分子および／またはベクターは、リン酸カルシウムによる化学的コンピテント大腸菌の形質転換のため、および／またはポリエチレンイミンまたはリポフェクタミンのトランスフェクションによるＨＥＫ２９３およびＣＨＯの一過性トランスフェクションのために設計される。

本発明はさらに、
（ｉ）本明細書の上記で定義される選択肢（ｉ）による軽鎖可変ドメインおよび本明細書の上記で定義される選択肢（ｉ）による重鎖可変ドメインをコードする核酸分子、
（ｉｉ）本明細書の上記で定義される選択肢（ｉｉ）による軽鎖可変ドメインおよび本明細書の上記で定義される選択肢（ｉｉ）による重鎖可変ドメインをコードする核酸分子、
（ｉｉｉ）本明細書の上記で定義される選択肢（ｉｉｉ）による軽鎖可変ドメインおよび本明細書の上記で定義される選択肢（ｉｉｉ）による重鎖可変ドメインをコードする核酸分子を含むベクターに関する。

一実施形態において、ベクターは、発現ベクターである。

本発明のベクター、特にベクターの種類または調節配列に関して本明細書で上に提供される全ての定義および具体的に例示された実施形態は、必要な変更を加えて適用される。この第２のタイプのベクターは、少なくとも２つの核酸分子、すなわち軽鎖可変ドメインをコードするものおよび重鎖可変ドメインをコードするものを含むベクターに関する。上記の組合せから明らかなように、軽鎖可変ドメインおよび重鎖可変ドメインは、本発明の機能的抗ｃＴｎＴ抗体の発現が可能になるようにベクター中で組み合わされる。この第２のタイプのベクターはまた、本明細書では「本発明の組合せベクトル」とも称する。

本発明はさらに、
（ｉ）本発明の組合せベクター、または
（ｉｉ）本発明の第１の核酸分子、すなわち、本発明による軽鎖可変領域をコードする核酸分子を含む本発明の個々のベクター、および本発明の第２の核酸分子、すなわち、本発明の重鎖可変領域をコードする核酸分子を含む本発明の個々のベクターを含む宿主細胞または非ヒト宿主に関し、ここで、これらの２つのベクターは、上記の選択肢（ｉ）～（ｉｉｉ）で定義される軽鎖可変領域および重鎖可変領域を一致させるためにコードする核酸分子を含む。

宿主細胞は、任意の原核細胞または真核細胞であり得る。「原核生物」という用語は、本発明のタンパク質の発現のためにＤＮＡまたはＤＮＡもしくはＲＮＡ分子で形質転換、形質導入またはトランスフェクトすることができる全ての細菌を含むことを意味する。原核生物宿主としては、グラム陰性細菌ならびにグラム陽性細菌、例えば大腸菌、サルモネラ・ティフィムリウム、セラチア・マルセッセンス、コリネバクテリウム（グルタミクム）、シュードモナス（フルオレッセンス）、ラクトバチルス、ストレプトミセス、サルモネラおよび枯草菌が挙げられる。

「真核生物」という用語は、酵母、高等植物、昆虫および哺乳動物細胞を含むことを意味する。典型的な哺乳動物宿主細胞としては、Ｈｅｌａ、ＨＥＫ２９３、Ｈ９、Ｐｅｒ．Ｃ６およびＪｕｒｋａｔ細胞、マウスＮＩＨ３Ｔ３、ＮＳ／０、ＳＰ２／０およびＣ１２７細胞、ＣＯＳ細胞、例えばＣＯＳ１またはＣＯＳ７、ＣＶ１、ウズラＱＣ１－３細胞、マウスＬ細胞、マウス肉腫細胞、ボーズメラノーマ細胞およびチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞が挙げられる。本発明による例示的な哺乳動物宿主細胞はＣＨＯ細胞である。他の適切な真核生物宿主細胞としては、ニワトリ細胞、例えばＤＴ４０細胞、または酵母、例えばサッカロミセス・セレビシエ、ピキア・パストリス、シゾサッカロミセス・ポンベおよびクリベロミセス・ラクティスが挙げられるが、これらに限定されない。発現に適した昆虫細胞は、例えば、ショウジョウバエＳ２、ショウジョウバエＫｃ、スポドプテラＳｆ９およびＳｆ２１またはトリコプルシアＨｉ５細胞である。適切なゼブラフィッシュ細胞株としては、ＺＦＬ、ＳＪＤまたはＺＦ４が挙げられるが、これらに限定されない。

記載されたベクターは、宿主のゲノムに組み込まれても、または染色体外に維持されてもよい。ベクターが適切な宿主に組み込まれると、宿主は、核酸分子の高レベル発現に適した条件下で維持され、所望に応じて、本発明の抗体の回収および精製が次いで行われ得る。上記の宿主細胞について適切な培養培地および条件は、当技術分野で公知である。

一実施形態において、記載された宿主は、ヒト細胞またはヒト細胞株等の哺乳動物細胞である。さらなる実施形態において、本発明のベクターで形質転換された宿主細胞は、ＨＥＫ２９３またはＣＨＯである。さらなる実施形態において、本発明のベクターで形質転換された宿主細胞は、ＣＨＯである。これらの宿主細胞ならびに適切な培地および細胞培養条件は、当技術分野で記載されており、例えば、Ｂａｌｄｉ Ｌ．ら、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ Ｐｒｏｇ．２００５ Ｊａｎ－Ｆｅｂ；２１（１）：１４８－５３、Ｇｉｒａｒｄ Ｐ．ら、Ｃｙｔｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ．２００２ Ｊａｎ；３８（１－３）：１５－２１およびＳｔｅｔｔｌｅｒ Ｍ．ら、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ Ｐｒｏｇ．２００７Ｎｏｖ－Ｄｅｃ；２３（６）：１３４０－６を参照されたい。

本発明による「～を含むベクター」という用語に関して、宿主細胞が本発明の抗ｃＴｎＴ抗体を産生するのに必要および／または十分なさらなる核酸配列がベクター中に存在することが理解される。そのようなさらなる核酸配列は、例えば、軽鎖の残りの部分をコードする核酸配列ならびに重鎖の残りの部分をコードする核酸配列である。

本発明による宿主細胞または非ヒト宿主は、本明細書で上記に定義される軽鎖可変領域と重鎖可変領域の両方をコードする１つのベクターを含むか、または２つの別個のベクターを含み、ここで、１つのベクターは本発明による軽鎖可変領域をコードする核酸分子を担持し、第２のベクターは本発明による一致する重鎖可変領域をコードする核酸分子を担持する。したがって、第１のベクターが、本明細書の上記の選択肢（ｉ）による軽鎖可変領域をコードする核酸分子を担持する場合、第２のベクターは、同様に上記の選択肢（ｉ）による重鎖可変領域をコードする核酸分子を担持する。選択肢（ｉｉ）および（ｉｉｉ）についても必要な変更を加えて同じことが適用される。

したがって、それぞれの場合において、本明細書の上記で記載される結合能からなる本発明の抗ｃＴｎＴ抗体の産生を確実にするために１つの抗体分子内に存在する必要があるそれらの核酸分子の発現は、互いに関連している。

本実施形態による宿主細胞は、例えば、本発明の大量の抗ｃＴｎＴ抗体を産生するために使用し得る。前記宿主細胞は、上記ベクターを宿主に導入することによって産生される。次いで、宿主中の前記ベクターの存在は、本発明の抗ｃＴｎＴ抗体の上記軽鎖可変ドメインおよび重鎖可変ドメインをコードする核酸分子の発現を媒介する。本明細書の上記で記載されるように、本発明のベクターは、完全長ＩｇＧ抗体の発現を可能にし、それにより、宿主細胞による完全長ＩｇＧ抗体の産生をもたらすさらなる配列を含むことができ、前記抗体は、本発明による可変軽鎖ドメインおよび／または重鎖ドメインの存在によって特徴付けられる。

本発明はさらに、配列番号１のｃＴｎＴに特異的に結合する抗体を産生する方法であって、本発明の宿主細胞を適切な条件下で培養すること、および産生された抗体を単離することを含む方法に関する。

本実施形態によれば、本発明の宿主中に存在するベクターは、発現ベクターであるか、またはベクターは、その発現が保証されるように、本発明の核酸分子の宿主細胞のゲノムへの安定な組込みを媒介する。本発明の抗ｃＴｎＴ抗体のそれぞれの軽鎖ドメインおよび重鎖ドメインをコードする核酸分子が、抗体の発現が確実になるように導入が成功した宿主細胞を選択するための手段および方法は、当技術分野で周知であり、記載されている（Ｂｒｏｗｎｅ，Ｓ．Ｍ．＆Ａｌ－Ｒｕｂｅａｉ，Ｍ．［２００７］Ｔｒｅｎｄｓ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２５：４２５－４３２；Ｍａｔａｓｃｉ，Ｍら［２００８］Ｄｒｕｇ Ｄｉｓｃｏｖ．Ｔｏｄａｙ：Ｔｅｃｈｎｏｌ．５：ｅ３７－ｅ４２；Ｗｕｒｍ，Ｆ．Ｍ．［２００４］Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２２：１３９３－１３９８）。

原核生物宿主細胞または真核生物宿主細胞を培養するための適切な条件は、当技術分野当業者に周知である。例えば、例えば大腸菌等の細菌は、ルリア・ベルターニ（ＬＢ）培地中、典型的には４～約３７℃の温度で通気下で培養し得る。発現産物の収率および溶解度を増加させるために、培地を緩衝するか、または両方を増強または促進することが公知の適切な添加剤を補充することができる。誘導性プロモーターが宿主細胞中に存在するベクター中の本発明の核酸分子を制御する場合、ポリペプチドの発現は、適切な誘導剤、例えばアンヒドロテトラサイクリンの添加によって誘導することができる。適切な発現プロトコルおよび戦略は当技術分野で記載されており（例えば、Ｄｙｓｏｎ，Ｍ．Ｒ．ら（２００４）．ＢＭＣ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．４，３２－４９およびＢａｌｄｉ，Ｌら（２００７）．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｌｅｔｔ．２９，６７７－６８４）、必要に応じて、特定の宿主細胞の必要性および発現されるタンパク質の要件に適合させることができる。

細胞の種類およびその特定の要件に応じて、哺乳動物細胞培養は、例えば、１０％（ｖ／ｖ）ＦＣＳ、２ｍＭ Ｌ－グルタミンおよび１００Ｕ／ｍｌペニシリン／ストレプトマイシンを含有するＲＰＭＩ、Ｗｉｌｌｉａｍｓ’ＥまたはＤＭＥＭ培地で行うことができる。細胞は、５％ＣＯ_２の水飽和雰囲気中で、ＤＴ４０ニワトリ細胞については例えば３７℃または４１℃に維持することができる。

昆虫細胞培養に適した培地は、例えば、ＴＮＭ＋１０％ ＦＣＳ、ＳＦ９００またはＨｙＣｌｏｎｅ ＳＦＸ－Ｉｎｓｅｃｔ培地である。昆虫細胞は、通常、接着または懸濁培養物として２７℃で増殖させる。

真核細胞または脊椎動物細胞に適した発現プロトコルは当業者に周知であり、例えばＳａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ＆Ｒｕｓｓｅｌ，Ｄ．Ｗ．［２００１］（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，ＮＹ）から入手することができる。

一実施形態において、本方法は、哺乳動物細胞、例えばＣＨＯまたはＨＥＫ２９３細胞を使用して実施される。さらなる実施形態において、本方法はＣＨＯ細胞を使用して実施される。

組換え産生手順で使用される宿主に応じて、発現される抗体はグリコシル化されてもよく、または非グリコシル化されてもよい。一実施形態において、本発明の抗体のコード配列、および遺伝子融合されたＮ末端ＦＬＡＧタグおよび／またはＣ末端Ｈｉｓタグを含むプラスミドまたはウイルスが使用される。さらなる実施形態において、前記ＦＬＡＧタグの長さは、約４～８アミノ酸、例えば厳密には８アミノ酸である。上記のベクターを使用して、当技術分野の当業者に一般的に知られている技術のいずれかを使用して宿主を形質転換またはトランスフェクトすることができる。さらに、融合した作動可能に連結された遺伝子を調製し、例えば哺乳動物細胞および細菌中でそれらを発現させる方法は、当技術分野で周知である（Ｓａｍｂｒｏｏｋ，ｌｏｃ ｃｉｔ．）。

形質転換された宿主は、バイオリアクター内で増殖させ、最適な細胞増殖を達成するために当技術分野で公知の技術によって培養することができる。次いで、本発明の抗体を増殖培地から単離することができる。例えば、本発明の微生物発現抗体の単離および精製は、例えば、アフィニティークロマトグラフィー（例えば、Ｓｔｒｅｐ－ｔａｇ ＩＩまたはＨｉｓ_６タグ等の融合タグを使用する）、ゲル濾過（サイズ排除クロマトグラフィー）、陰イオン交換クロマトグラフィー、陽イオン交換クロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー、高圧液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）、逆相ＨＰＬＣまたは免疫沈降等の任意の従来の手段によるものであり得る。これらの方法は当技術分野で周知であり、例えば一般的にはＳａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ＆Ｒｕｓｓｅｌ，Ｄ．Ｗ．［２００１］ （Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，ＮＹ）に記載されている。

本発明によれば、「産生された抗体の単離」という用語は、本発明の抗ｃＴｎＴ抗体の単離を指すことは理解されるであろう。

本発明はさらに、
（ｉ）本発明の抗体、
（ｉｉ）本発明の核酸分子、
（ｉｉｉ）本発明のベクター、
（ｉｖ）本発明の宿主細胞、および／または
（ｖ）本発明の方法によって産生される抗体の少なくとも１つを含む組成物に関する。

本発明によって使用される「組成物」という用語は、記載された化合物の少なくとも１つを含む組成物に関する。それは、場合により、本発明の化合物の特徴を変化させることにより、例えば、それらの機能を安定化、調節および／または増強することができるさらなる分子を含み得る。組成物は、固体または液体の形態であってもよく、とりわけ、粉末、錠剤または溶液の形態であってもよい。

組成物の成分は、水溶液として、または再構成のための凍結乾燥製剤として、容器または複数の容器、例えば密封アンプルまたはバイアルに包装することができる。凍結乾燥製剤の例として、１０ｍｌバイアルに５ｍｌの１％（ｗ／ｖ）または１０％（ｗ／ｖ）水溶液を充填し、得られた混合物を凍結乾燥する。使用のための溶液は、例えば治療用途のための注射用水または診断目的のための他の所望の溶媒、例えば緩衝液のいずれかを使用して凍結乾燥化合物を再構成することによって調製される。防腐剤および他の添加剤、例えば、抗菌剤、酸化防止剤、キレート剤、および不活性ガス等も存在し得る。

組成物の様々な成分は、使用説明書と共にキットとして包装され得る。

一実施形態において、本発明の組成物は、当業者が当技術分野で周知のインビトロまたはエクスビボ方法、例えばイムノアッセイ等の方法を実施することを可能にする組成物である。

本発明の抗体を利用することができるイムノアッセイの例は、直接フォーマットまたは間接フォーマットのいずれかでのイムノアッセイである。そのようなイムノアッセイの例は、酵素結合イムノソルベントアッセイ（ＥＬＩＳＡ）、酵素イムノアッセイ（ＥＩＡ）、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）、または発光、蛍光、化学発光もしくは電気化学発光の検出に基づくイムノアッセイである。

心筋トロポニンＴ（ｃＴｎＴ）は、例えば、それぞれ米国特許第６，３３３，３９７号および米国特許第６，３７６，２０６号に開示されているようなサンドイッチイムノアッセイによって最もよく検出され、ｃＴｎＴの測定のための本質的に全てのその後の世代のアッセイにおいて確認される。第５世代のｃＴｎＴアッセイである、Ｒｏｃｈｅ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ、ドイツによって販売されているｃＴｎＴ（ｈｓ－ｃＴｎＴ）の高感度アッセイでは、サンドイッチ免疫アッセイ原理が使用されている。このアッセイは、５ｎｇ／ｍｌの検出下限（ＬＯＤ）でｃＴｎＴを検出することができるため、高感度アッセイである。アッセイ時間は、使用されるアッセイプロトコルに依存し、それぞれ９または１８分という全体的に非常に短いインキュベート時間にもかかわらず、良好なＬＯＤが達成される。このアッセイでは、ビオチン化捕捉抗体およびルテニウム化検出抗体を含むサンドイッチが形成される。この複合体をストレプトアビジンコーティング磁気ビーズに結合させ、結合していない物質を洗い流す。当業者に明らかなように、Ｋｄが顕著でない場合、いくらかの解離が起こり、シグナル低下をもたらし、低下したＬＯＤに直接翻訳されるため、非常に重要である。

当業者に明らかなように、ｃＴｎＴの検出のための方法において本発明による抗体を使用することが有利であろう。一実施形態において、本開示は、ヒト心筋トロポニンＴ（配列番号１）を測定する方法であって、本明細書の上記に開示される抗体のヒト心筋トロポニンＴへの結合を検出することを含む方法に関する。

一実施形態において、本開示は、試料中のｃＴｎＴを検出する方法であって、ａ）抗ｃＴｎＴ抗体／ｃＴｎＴ複合体の形成に十分な時間および条件下で、試料を本開示による抗ｃＴｎＴ抗体と接触させるステップ、ｂ）抗ｃＴｎＴ抗体／ｃＴｎＴ複合体を測定するステップであって、その複合体の量が、試料中のｃＴｎＴの濃度を示す、ステップを含む方法に関する。例えば、「抗ｃＴｎＴ抗体／ｃＴｎＴ複合体」の「／」という用語は、一方では抗ｃＴｎＴ抗体と他方ではｃＴｎＴとの間に非共有結合複合体が形成されることを示すために使用される。

一実施形態において、本発明は、試料中のｃＴｎＴを検出する方法であって、ａ）試料をｃＴｎＴに対する第１の抗体およびｃＴｎＴに対する第２の抗体と接触させるステップであって、第２の抗体が、第１の抗ｃＴｎＴ抗体／ｃＴｎＴ／第２の抗ｃＴｎＴ抗体の複合体を形成するのに十分な時間および条件下で、検出可能に標識されているステップ、およびｂ）（ａ）で形成された複合体を測定するステップであって、その複合体の量が試料中のｃＴｎＴの濃度を示し、第１または第２の抗体のいずれかが本発明による抗体である、ステップを含む、方法に関する。

当業者には明らかなように、試料は、任意の所望の順序で、すなわち、第１の抗体が最初であり、第２の抗体、第１の抗体よりも最初に第２の抗体、または同時に、第１の抗ｃＴｎＴ抗体／ｃＴｎＴ／第二のｃＴｎＴ抗体の複合体を形成するのに十分な時間および条件下で、第１および第２の抗体と接触させてもよい。

当業者が容易に認識するように、特異的抗ｃＴｎＴ抗体とｃＴｎＴ抗原／分析物との間の複合体（＝抗ｃＴｎＴ抗体／ｃＴｎＴ複合体）の形成、またはｃＴｎＴに対する第１の抗体、ｃＴｎＴ（分析物）および第２の抗ｃＴｎＴ抗体複合体（＝第１の抗ｃＴｎＴ抗体／ｃＴｎＴ／第２の抗ｃＴｎＴ抗体複合体）を含む二次複合体またはサンドイッチ複合体の形成に適切または十分な時間および条件を確立することは常に、常用の実験法に他ならない。

抗ｃＴｎＴ抗体／ｃＴｎＴ複合体、または第１の抗ｃＴｎＴ抗体／ｃＴｎＴ／第２の抗ｃＴｎＴ抗体の複合体のそれぞれの検出は、任意の適切な手段によって行うことができる。当技術分野の当業者は、このような手段／方法に完全に精通している。

一実施形態において、本発明は、ヒト心筋トロポニンＴ（配列番号１）に特異的に結合する抗体であって、ＣＤＲが、以下のアミノ酸配列または最大で１つのアミノ酸置換において異なるそのバリアントを含むことを特徴とする抗体：（ｉ）軽鎖可変ドメイン中の、配列番号２のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、配列番号３のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２、および配列番号４のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３を含み、（ｉｉ）重鎖可変ドメイン中の、配列番号５のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、配列番号６のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２、および配列番号７のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３、を含むことを特徴とする抗体の使用、または本明細書の上記の任意の他の抗体のインビトロの診断方法における使用に関する。

「試料」または「目的の試料」または「試験試料」という用語は、本明細書では相互互換可能に使用される。試料は、インビトロでの試料であり、インビトロで分析されることになり、体内に戻されることはない。試料の例は、限定されるものではないが、血液、血清、血漿、滑液、尿、唾液、およびリンパ液などの流体試料、または組織抽出物、軟骨、骨、滑膜、および結合組織などの固形試料を含む。一実施形態において、試料は、血液、血清、血漿、滑液、および尿から選択される。一実施形態において、試料は、血液、血清、および血漿から選択される。一実施形態において、試料は、血清または血漿である。

本明細書で使用される「参照試料」という用語は、関心対象の試料と実質的に同一の様式で分析され、その情報が関心対象の試料の情報と比較される試料を指す。これにより、参照試料は、目的の試料から入手された情報の評価を可能にする標準を提供する。参照試料は、健常なまたは正常な組織、器官、または個体に由来することができ、それにより、組織、器官、または個体の健康状態の標準を提供する。正常な参照試料の状態と目的の試料の状態との間の差異は、疾患発症のリスクまたはそのような疾患もしくは障害の存在もしくはさらなる進行を示し得る。参照試料は、異常なまたは罹患した組織、器官、または個体に由来することができ、それにより、組織、器官、または個体の健康状態の標準を提供し得る。異常な参照試料の状態と目的の試料の状態との間の差異は、疾患発症のリスクの低下またはそのような疾患もしくは障害の非存在もしくは改善を示し得る。

指標の「上昇」または「増加」レベルという用語は、参照または参照試料中のそのような指標のレベルと比較して、試料中のそのような指標のレベルが高いことを指す。例えば、所与の疾患に罹患している１個体の流体試料中で、前記疾患に罹患していない個体の同じ流体試料中よりも高い量で検出可能なタンパク質は、上昇したレベルを有する。

特定の実施形態において、ｃＴｎＴに対する第１の抗体、ｃＴｎＴ（分析物）およびｃＴｎＴに対する第２の抗体を含むサンドイッチが形成され、第２の抗体は検出可能に標識されている。

多数の標識（色素とも称する）が利用可能であり、これらは概して、以下の区分に分類することができ、区分は全てまとまっており、およびその各々が本開示による実施形態を表している：
（ａ）蛍光色素
蛍光色素は、例えば、Ｂｒｉｇｇｓら「Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ｏｆ Ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌｉｚｅｄ Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ Ｄｙｅｓ ａｎｄ Ｔｈｅｉｒ Ｃｏｕｐｌｉｎｇ ｔｏ Ａｍｉｎｅｓ ａｎｄ Ａｍｉｎｏ Ａｃｉｄｓ」Ｊ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，Ｐｅｒｋｉｎ－Ｔｒａｎｓ．１（１９９７）１０５１－１０５８）によって記載されている。

蛍光標識または蛍光体には、希土類キレート（ユーロピウムキレート）、フルオレセイン型標識（ＦＩＴＣ、５－カルボキシフルオロセイン、６－カルボキシフルオロセインを含む）、ローダミン型標識（ＴＡＭＲＡを含む）、ダンシル、リサミン、シアニン、フィコエリトリン、テキサスレッド、およびこれらの類似体が含まれる。蛍光標識は、本明細書に開示される技術を使用して、標的分子内に含まれるアルデヒド基に結合させることができる。蛍光色素および蛍光標識試薬には、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ／Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ（Ｅｕｇｅｎｅ，Ｏｒｅｇｏｎ，ＵＳＡ）およびＰｉｅｒｃｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｉｎｃ．（Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，Ｉｌｌ．）から市販されるものが含まれる。
（ｂ）発光色素
発光色素または標識は、化学発光色素および電気化学発光色素にさらに下位分類することができる。

化学発光標識の異なるクラスには、ルミノール、アクリジニウム化合物、セレンテラジンおよび類似体、ジオキセタン、ペルオキシしゅう酸およびペルオキシしゅう酸誘導体に基づく系が含まれる。免疫診断手順のためには、主にアクリジニウム系標識が使用される（詳細な概要は、Ｄｏｄｅｉｇｎｅ Ｃ．ｅｔ ａｌ．，Ｔａｌａｎｔａ５１（２０００）４１５－４３９において付与されている）。

電気化学発光標識として使用される主な関連性のある標識は、それぞれルテニウムおよびイリジウム系の電気化学発光錯体である。電気化学発光（ＥＣＬ）は、高感度で選択的な方法として分析用途に非常に有用であることが証明された。ＥＣＬは、化学発光分析の分析上の利点（背景光信号の非存在）を、電極電位を適用することによる反応制御の容易さと組み合わせている。概して、ルテニウム錯体、特に液相または液固界面においてＴＰＡ（トリプロピルアミン）を用いて再生する［Ｒｕ（Ｂｐｙ）３］２＋（約６２０ｎｍで光子を放出）がＥＣＬ標識として使用される。近年、イリジウム系ＥＣＬ標識も説明されている（国際公開第２０１２１０７４１９号（Ａ１））。

放射性標識は、放射性同位体（放射性核種）、例えば、３Ｈ、１１Ｃ、１４Ｃ、１８Ｆ、３２Ｐ、３５Ｓ、６４Ｃｕ、６８Ｇｎ、８６Ｙ、８９Ｚｒ、９９ＴＣ、１１１Ｉｎ、１２３Ｉ、１２４Ｉ、１２５Ｉ、１３１Ｉ、１３３Ｘｅ、１７７Ｌｕ、２１１Ａｔ、または１３１Ｂｉを採用する。

（ｄ）撮像および治療目的のための標識として適切な金属キレート錯体は当技術分野で周知である（米国特許出願第２０１０／０１１１８５６、米国特許第５，３４２，６０６号、米国特許第５，４２８，１５５号、米国特許第５，３１６，７５７号、米国特許第５，４８０，９９０号、米国特許第５，４６２，７２５号、米国特許第５，４２８，１３９号、米国特許第５，３８５，８９３号、米国特許第５，７３９，２９４号、米国特許第５，７５０，６６０号、米国特許第５，８３４，４５６号、Ｈｎａｔｏｗｉｃｈら，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ６５（１９８３）１４７－１５７、Ｍｅａｒｅｓら，Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１４２（１９８４）６８－７８、Ｍｉｒｚａｄｅｈら，Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｃｈｅｍ．１（１９９０）５９－６５、Ｍｅａｒｅｓら，Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ（１９９０），Ｓｕｐｐｌ．１０：２１－２６、Ｉｚａｒｄら，Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｃｈｅｍ．３（１９９２）３４６－３５０、Ｎｉｋｕｌａら，Ｎｕｃｌ．Ｍｅｄ．Ｂｉｏｌ．２２（１９９５）３８７－９０、Ｃａｍｅｒａら，Ｎｕｃｌ．Ｍｅｄ．Ｂｉｏｌ．２０（１９９３）９５５－６２、Ｋｕｋｉｓら，Ｊ．Ｎｕｃｌ．Ｍｅｄ．３９（１９９８）２１０５－２１１０、Ｖｅｒｅｌら，Ｊ．Ｎｕｃｌ．Ｍｅｄ．４４（２００３）１６６３－１６７０、Ｃａｍｅｒａら，Ｊ．Ｎｕｃｌ．Ｍｅｄ．２１（１９９４）６４０－６４６、Ｒｕｅｇｇら，Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．５０（１９９０）４２２１－４２２６、Ｖｅｒｅｌら，Ｊ．Ｎｕｃｌ．Ｍｅｄ．４４（２００３）１６６３－１６７０、Ｌｅｅら，Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．６１（２００１）４４７４－４４８２、Ｍｉｔｃｈｅｌｌ，ｅｔ ａｌ，Ｊ．Ｎｕｃｌ．Ｍｅｄ．４４（２００３）１１０５－１１１２、Ｋｏｂａｙａｓｈｉ ｅｔ ａｌ Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｃｈｅｍ．１０（１９９９）１０３－１１１、Ｍｉｅｄｅｒｅｒら，Ｊ．Ｎｕｃｌ．Ｍｅｄ．４５（２００４）１２９－１３７、ＤｅＮａｒｄｏら，Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ４（１９９８）２４８３－９０、Ｂｌｅｎｄら，Ｃａｎｃｅｒ Ｂｉｏｔｈｅｒａｐｙ＆Ｒａｄｉｏｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ１８（２００３）３５５－３６３、ＮｉｋｕｌａらＪ．Ｎｕｃｌ．Ｍｅｄ．４０（１９９９）１６６－７６、Ｋｏｂａｙａｓｈｉら，Ｊ．Ｎｕｃｌ．Ｍｅｄ．３９（１９９８）８２９－３６、Ｍａｒｄｉｒｏｓｓｉａｎら，Ｎｕｃｌ．Ｍｅｄ．Ｂｉｏｌ．２０（１９９３）６５－７４、Ｒｏｓｅｌｌｉら，Ｃａｎｃｅｒ Ｂｉｏｔｈｅｒａｐｙ＆Ｒａｄｉｏｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ，１４（１９９９）２０９－２０）。

一実施形態において、ｃＴｎＴに対する第１の抗体、ｃＴｎＴ（分析物）およびｃＴｎＴに対する第２の抗体を含むサンドイッチが形成され、第２の抗体は検出可能に標識されており、第１の抗ｃＴｎＴ抗体は固相に結合することができるか、または固相に結合している。

一実施形態において、本発明に開示される抗ｃＴｎＴ抗体は、ｃＴｎＴを測定するためのイムノアッセイに使用される。一実施形態において、本明細書の上記に開示される抗ｃＴｎＴ抗体は、サンドイッチ型イムノアッセイで使用される。一実施形態において、本発明に開示される抗ｃＴｎＴ抗体は、検出抗体として使用される。一実施形態において、本明細書に開示される抗ｃＴｎＴ抗体は、発光色素、特に化学発光色素または電気化学発光色素によって検出可能に標識されている。

これらおよび他の実施形態は、本発明の明細書および実施例によって開示され、包含される。本発明によって採用される方法、使用、および化合物のいずれか１つに関するさらなる文献は、例えば、電子デバイスを使用して、公共の図書館およびデータベースから検索することができる。例えば、インターネット上で利用可能な公共データベース「Ｍｅｄｌｉｎｅ」は、例えば、ワールドワイドウェブのｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ＰｕｂＭｅｄ／ｍｅｄｌｉｎｅ．ｈｔｍｌで利用することができる。ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／、ｆｍｉ．ｃｈ／ｂｉｏｌｏｇｙ／ｒｅｓｅａｒｃｈ＿ｔｏｏｌｓ．ｈｔｍｌ，ｔｉｇｒ．ｏｒｇ／またはｉｎｆｏｂｉｏｇｅｎ．ｆｒ／等の、ワールドワイドウェブにおいて利用可能なさらなるデータベースおよびアドレスは、当技術分野の当業者に公知でありまた、ｌｙｃｏｓ．ｃｏｍの下でワールドワイドウェブにおけるアドレスを用いて入手することもできる。

別段の定義がない限り、本明細書で使用される全ての技術用語および科学用語は、本発明が属する技術分野の当業者によって一般的に理解されている意味と同じ意味を有する。矛盾する場合は、定義を含む特許明細書が優先される。

本明細書で提供されるすべてのアミノ酸配列は、当技術分野で慣習的に行われるように、最もＮ末端の残基で始まり、最もＣ末端の残基で終わり（Ｎ→Ｃ）、本発明のいたるところでアミノ酸を同定するために使用される１文字または３文字のコード略語は、アミノ酸について一般的に使用されるものに対応する。

本明細書、特に特許請求の範囲において特徴付けられる実施形態に関して、従属請求項において言及される各実施形態は、該従属請求項が依存する各請求項（独立または従属）の各実施形態と組み合わされることが企図される。例えば、３つの代替案Ａ、ＢおよびＣを列挙する独立請求項１、３つの代替案Ｄ、ＥおよびＦを列挙する従属請求項２、ならびに請求項１および２に依存し、３つの代替案Ｇ、ＨおよびＩを列挙する請求項３の場合、本明細書は、別段の具体的な記載がない限り、組み合わせＡ、Ｄ、Ｇ；Ａ、Ｄ、Ｈ；Ａ、Ｄ、Ｉ；Ａ、Ｅ、Ｇ；Ａ、Ｅ、Ｈ；Ａ、Ｅ、Ｉ；Ａ、Ｆ、Ｇ；Ａ、Ｆ、Ｈ；Ａ、Ｆ、Ｉ；Ｂ、Ｄ、Ｇ；Ｂ、Ｄ、Ｈ；Ｂ、Ｄ、Ｉ；Ｂ、Ｅ、Ｇ；Ｂ、Ｅ、Ｈ；Ｂ、Ｅ、Ｉ；Ｂ、Ｆ、Ｇ；Ｂ、Ｆ、Ｈ；Ｂ、Ｆ、Ｉ；Ｃ、Ｄ、Ｇ；Ｃ、Ｄ、Ｈ；Ｃ、Ｄ、Ｉ；Ｃ、Ｅ、Ｇ；Ｃ、Ｅ、Ｈ；Ｃ、Ｅ、Ｉ；Ｃ、Ｆ、Ｇ；Ｃ、Ｆ、Ｈ；Ｃ、Ｆ、Ｉに対応する実施形態を明確に開示していることは理解されたい。

同様に、また、独立請求項および／または従属請求項が代替案を列挙していない場合、従属請求項が複数の先行請求項を参照している場合、それによって網羅される主題のいずれかの組み合わせが明示的に開示されていると見なされることは理解される。例えば、独立請求項１、請求項１を参照する従属請求項２、および請求項２および１の両方を参照する従属請求項３の場合、請求項３および１の主題の組み合わせが、請求項３、２および１の主題の組み合わせと同様に、明確かつ明瞭に開示されていることが後に続く。請求項１～３のいずれか１項を指すさらなる従属請求項４が存在する場合、請求項４および１、請求項４、２および１、請求項４、３および１、ならびに請求項４、３、２および１の主題の組み合わせは、明確かつ明瞭に開示されていることが後に続く。

先の考慮は、添付の特許請求全部に対して必要な変更を加えて適用される。非限定的な例を与えるために、請求項１３、１２、および１（ｉ）の組合せは、請求項構造の観点から明確かつ明瞭に想定されている。同じことが、例えば、請求項１３、１１および４（ｉｉ）等の組合せに当てはまる。

本発明の特定の態様はまた、添付の図面によっても説明されている。

図１：１つまたは複数の重鎖ＣＤＲ内のアミノ酸置換をコードするＤＮＡライブラリの構築
変異体ライブラリの構築に必要な重鎖フラグメントの産生（ステップ１）。１回目（ＰＣＲ１）では、フラグメント１、３および４にそれぞれ対応する３つの異なる重鎖フラグメントを、対応するプライマーセットを用いて生成した。薄灰色の伸長部はＣＤＲを示す。主鎖配列を黒色で示す。水平の矢印は、使用されるプライマーを示す。垂直の矢印はＰＣＲの結果を指し示している。図中で取り消されている短い４２ｂｐのオリゴヌクレオチド（フラグメント２）は、ＰＣＲによって得られず、別個に化学合成された。 ＣＤＲ単一アミノ酸ランダム化によるＨＣライブラリ合成。第２のステップＰＣＲ２では、図１Ａに記載されているように得られた４つのフラグメントが鋳型として機能した（黒線）。十字形を有する水平の矢印は、各ＣＤＲコドン位置について縮重ＮＮＫコドンをそれぞれ含むポリヌクレオチドライブラリを示す。これらのポリヌクレオチドライブラリはさらに、必要に応じておよび示されるように、ステップ１のフラグメントの１つまたは２つにハイブリダイズすることができる配列伸長部を含む。フォワードおよびリバースプライマー（小さい矢印）をそれぞれ使用して、それぞれのＰＣＲを行った。 ライブラリ合成の最終ステップ：ステップ１のフラグメントの１つまたは２つにハイブリダイズすることができるさらなる配列伸長部は、ＨＣライブラリの産生における最終ステップ、すなわちＰＣＲ２の４つの産物すべてを使用した重複ＰＣＲを実施するために必要である。この重複ＰＣＲでは、末端プライマー（Ｆ１Ａ；Ｒ１Ａ）が使用され、フラグメント自体がメガプライマーとして作用する。 ペリプラズムＦａｂ発現のためのベクターマップ：示される図の説明はそれ自体を説明していると考えられ、全ての要素は当業者には公知である。 ｃＴｎＴ結合ＦａｂフラグメントのスクリーニングのためのＥＬＩＳＡ設定：ストレプトアビジンでコーティングしたマイクロタイタープレート（ＳＡプレート）を使用して、ビオチン化心筋トロポニンＴ（ｂｉ－ｃＴｎＴ）を固相に結合させる。組換え抗ｃＴｎＴ重鎖（＜ｃＴｎＴ＞－Ｆａｂ）を含むＦａｂフラグメントは、ＴｎＴに結合し、ペルオキシダーゼ（ＰＯＤ）標識抗マウスＦａｂ抗体（抗ｍｕＦａｂ－ＰＯＤ）を介して検出される。 Ｂｉａｃｏｒｅセンサーグラム：ＦａｂフラグメントｍＡｂ＜ＴｎＴ＞ｒＭ－１１－７のＡ１０２位における単一アミノ酸変異の影響を３７℃で動態分析した。相対応答単位（ＲＵ、関連単位）は、秒（ｓ）単位でモニターされるリアルタイムＳＰＲ測定のシグナルレベルを示す。ｍＡｂ＜ＴｎＴ＞ｒＭ－１１－７ Ｆａｂ Ａ１０２（野生型）、Ａ１０２Ｗ、Ａ１０２Ｆ、Ａ１０２Ｙ、Ａ１０２Ｈ、Ａ１０２Ｅ、Ａ１０２Ｒ、Ａ１０２Ｌ、Ａ１０２Ｎ、Ａ１０２Ｄ、Ａ１０２Ｒ、およびＡ１０２ＫのＢｉｏｃｏｒｅ測定値を示す。 正規化Ｂｉａｃｏｒｅセンサーグラム：Ｆａｂ／トロポニンＴ複合体動態の重ね合わせ。変異Ａ１０２Ｗは、Ａ１０２Ｆに次いで、複合体を最も良好に安定化させる。Ａ１０２Ｙは、野生型様（Ａ１０２）解離特性を示す。他の全ての変異は、親Ａ１０２ Ｆａｂフラグメントと比較した場合、むしろより速い複合体解離を示す。 Ｅｌｅｃｓｙｓ（登録商標）サンドイッチアッセイ：アッセイ設定を示すスキームを示す。（変異）ビオチン化（ｂｉ）捕捉抗体をストレプトアビジン（ＳＡ）コーティングビーズに結合させる。抗ｃＴｎＴ検出抗体をルテニウム化（Ｒｕ）し、改善された親和性の効果をＥＣＬ分析によって調査した。 ｃＴｎＴの測定のための親抗体および変異抗体の使用： 未成熟市販標準免疫試薬（左、親）およびビオチン化標準抗体コンジュゲートを成熟ビオチン化ｍＡｂ＜ＴｎＴ＞ｒＭ－１１－７（Ａ１０２Ｗ）－Ｆａｂ（右、Ａ１０２Ｗ）で置換した試薬を用いたｃＴＮＴ決定のための任意の光単位（カウント）を示す。白色カラム：希釈ユニバーサルブランク値。薄灰色カラム：１８ｐｇ／ｍｌの組換えＴｎＴ（ｒｅｃＴｎＴ、Ｒｏｃｈｅ）を含有するキャリブレータＣａｌ１。暗灰色カラム：４２００ｐｇ／ｍｌのｒｅｃＴｎＴを含有するキャリブレータＣａｌ２。

以下の実施例は、本発明を説明する。
実施例１：材料＆一般的な方法
組換えＤＮＡ技術
標準的な方法を使用し、Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ．ら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｍａｎｕａｌ；Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，１９８９に記載されるように、ＤＮＡを操作した。分子生物学的試薬は、製造者の指示にしたがって使用した。

ＤＮＡ配列決定
ＤＮＡ配列を、Ｍｉｃｒｏｓｙｎｔｈ ＡＧ（スイス、バルガッハ）で実施された二本鎖配列決定によって決定した。

ＤＮＡおよびタンパク質配列分析および配列データ管理
Ｖｅｃｔｏｒ ＮＴ１ Ａｄｖａｎｃｅ ｓｕｉｔｅバージョン１１．５．０を、配列の作成、マッピング、分析、注釈および例示のために使用した。

タンパク質化学および標識技術
標準的なタンパク質化学および標識技術は、例えば、Ｈｅｒｍａｎｓｏｎ，Ｇ．「Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ」３ｒｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ（２０１３）Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓにおいて提供されている。

バイオインフォマティクス
バイオインフォマティクス法は、例えば、Ｋｅｉｔｈ Ｊ．Ｍ．（編）’’Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ’’Ｖｏｌ．Ｉ ａｎｄ Ｖｏｌ．ＩＩ，Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ Ｖｏｌ．１５２５ ａｎｄ Ｖｏｌ．１５２６（２０１７）Ｓｐｒｉｎｇｅｒ，ａｎｄ ｉｎ Ｍａｒｔｉｎ，Ａ．Ｃ．Ｒ．＆Ａｌｌｅｎ，Ｊ．’’Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ Ｔｏｏｌｓ ｆｏｒ Ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ’’ｉｎ：Ｄｕｂｅｌ Ｓ．＆Ｒｅｉｃｈｅｒｔ Ｊ．Ｍ．（編）「Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ」Ｗｉｌｅｙ－ＶＣＨ（２０１４）に示されている。

電気化学発光イムノアッセイ
イムノアッセイおよび関連する方法は、例えば、Ｗｉｌｄ Ｄ．（編）「Ｔｈｅ Ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ Ｈａｎｄｂｏｏｋ」４ｔｈ Ｅｄｉｔｉｏｎ（２０１３）Ｅｌｓｅｖｉｅｒにおいて提供されている。電気化学発光標識としてのルテニウム錯体は、例えば、Ｓｔａｆｆｉｌａｎｉ Ｍ．らＩｎｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．４２（２００３）７７８９－７７９８において提供されている。通常、電気化学発光（ＥＣＬ）系免疫検定法の性能について、Ｅｌｅｃｓｙｓ（登録商標）２０１０分析装置または後継システムを使用し、例えば、Ｅ１７０、コーバスｅ６０１モジュール、コーバスｅ６０２モジュール、コーバスｅ８０１モジュールおよびコーバスｅ４１１などのＲｏｃｈｅ分析装置（Ｒｏｃｈｅ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ ＧｍｂＨ，Ｍａｎｎｈｅｉｍ Ｇｅｒｍａｎｙ）、ならびにこれらの分析装置に指定されるＲｏｃｈｅ Ｅｌｅｃｓｙｓ（登録商標）アッセイとし、特に明記されていない場合、標準条件下で各々使用した。

実施例２：ライブラリ構築
親抗体の可変重鎖はマウス起源である（配列番号３０）。変異ＨＣＣＤＲを含むライブラリを、それぞれＨＣＣＤＲ１、ＨＣＣＤＲ２および／またはＨＣＣＤＲ３における単一アミノ酸ランダム化を目的として構築した。第１のステップでは、４つの異なる親抗体フレームワーク領域の１つをそれぞれコードする４つのＤＮＡ断片を生成した。フレームワーク領域１、３および４を社内のポリメラーゼ連鎖反応によって得て、フレームワーク領域２を表す短いフラグメント２（４２ ｂｐ＝配列番号５０）をＭｅｔａｂｉｏｎ ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ ＡＧ（図１Ａを参照されたい。）に注文した。フラグメントをゲル精製し、定量した。これらのＤＮＡフラグメントの１つの１００ｎｇを、４つのアドオンＰＣＲ反応混合物のそれぞれにおけるポリヌクレオチド鋳型として使用した。親ＣＤＲと同じ数のコドンを含むポリヌクレオチドライブラリを使用することによってＣＤＲ領域を追加し、前記ライブラリのメンバーは、それぞれのＨＣＣＤＲの各コドン位置のそれぞれについて１つのＮＮＫコドンを有するライブラリメンバーを含むように設計された。ＣＤＲライブラリ中のポリヌクレオチドは、さらに、それぞれのＣＤＲに隣接するフレームワーク領域にハイブリダイズすることができる配列を含んでいた。末端プライマーをネステッドＰＣＲ増幅に使用した。これにより（図１Ｂを参照されたい）、部分的に重複する配列を有する４つのＤＮＡフラグメントを生成した。ＦＷ１配列の３’末端およびＦＷ４配列の５’末端にハイブリダイズする末端プライマーを用いた重複ＰＣＲを実施し、４つのフラグメントを線状ＤＮＡライブラリコンストラクトに連結した（図１Ｃを参照されたい）。典型的なＰＣＲ反応物をＰＣＲグレードの水で満たし、ＭｇＳＯ４、２００μＭのｄＮＴＰ混合物、０．５μＭのフォワードプライマーおよびリバースプライマー、２５０ｎｇのＤＮＡ鋳型、５単位のＰｗｏＤＮＡポリメラーゼと共に１０μｌの１０×ＰＣＲ緩衝液を含む１００μｌの反応混合物にした。典型的なＰＣＲは、９４℃で５分間の初期鋳型変性から開始し、３０サイクル（９４℃２分、６０℃４５秒、７２℃１分）を使用し、７２℃で５分間の最終伸長ステップを含んでいた。プライマー、鋳型およびフラグメント配列を表１に列挙する。ライブラリフラグメントは、無細胞系における転写および翻訳の成功に必要な全ての調節配列を含んでいた。当業者は、最新技術の方法に従ってそのようなライブラリを作製することができ、例えば、Ｈａｎｅｓ，Ｊ．＆Ｐｌｕｃｋｔｈｕｎ，Ａ．（１９９７）、「Ｉｎ ｖｉｔｒｏ ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ ａｎｄ ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ ｏｆ ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｂｙ ｕｓｉｎｇ ｒｉｂｏｓｏｍｅ ｄｉｓｐｌａｙ」、Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ Ｕ．Ｓ．Ａ．９４，４９３７－４２を参照されたい。
抗ｃＴｎＴ Ｆａｂフラグメントライブラリの生成に使用される配列

実施例３：インビトロディスプレイ
Ｆａｂディスプレイ用の緩衝液を調製し、４℃で一晩、転倒回転させてインキュベートした。洗浄緩衝液、ＷＢ（ＡｃＯＨでｐＨ７．５に調整した６０ｍＭトリス、１８０ｍＭ ＮａＣｌ、６０ｍＭ酢酸マグネシウム、５％ Ｂｌｏｃｋｅｒ ＢＳＡ、３３ｍＭ ＫＣｌ、２００μｇ ｔ－ＲＮＡ、０．０５％ Ｔｗｅｅｎ ２０）、ビーズ洗浄緩衝液ＢＷＢ（１００ｍＭ ＰＢＳ、０、１％ Ｔｗｅｅｎ２０）、停止バッファＳＢ（ＡｃＯＨでｐＨ７．５に調整した５０ｍＭトリス、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、５０ｍＭ酢酸マグネシウム、５％ Ｂｌｏｃｋｅｒ ＢＳＡ（Ｐｉｅｒｃｅ）、３３ｍＭ ＫＣｌ、０．５％ Ｔｗｅｅｎ ２０、８．２ｍＭ ｏｘグルタチオン）、溶出緩衝液（ＡｃＯＨでｐＨ７．５に調整した５５ｍＭトリス、１６５ｍＭ ＮａＣｌ、２２ｍＭ ＥＤＴＡ、１ｍｇ ＢＳＡ、５０００Ｕ ｒＲＮＡ（５０００Ｕ）、５０μｇ ｔＲＮＡ）。

必要体積の磁気ビーズ（ストレプトアビジンコーティングビーズ）を、１０μＬの初期懸濁液あたり１００μＬの洗浄緩衝液（ＷＢ）で４℃で一晩転倒回転させながらブロッキングした。標的／バックグラウンド試料あたり２５μＬのビーズをプレパンニングステップに使用し、２０μＬをパンニングに使用した。ビーズ保存緩衝液のアジ化ナトリウムを除去するため、ビーズ洗浄緩衝液（ＢＷＢ）で４回、ＷＢで３回洗浄した。これらのステップは、ビーズを回収するための磁場を２分間印加し、続いて上清を廃棄することによって行った。最終洗浄ステップの後、ビーズをその初期体積になるようにＷＢに再懸濁した。

無細胞インビトロ転写および翻訳系を、製造者の指示（ＰＵＲＥｆｒｅｘ（商標）ＤＳ２．０）にしたがって組み立てた。標的（Ｔ）用および１つはバックグラウンド（ＢＧ）用の１．５ｍＬ反応管を準備した。

発現鋳型（ＬＣ）およびディスプレイ鋳型（ＨＣ）のＤＮＡインプットを２：１の分子比で適用した。ディスプレイをコードするＤＮＡおよび発現鋳型の量を、全てのＦａｂディスプレイサイクルにおいて一定に保った。インビトロ転写／翻訳反応混合物を３７℃で２時間インキュベートした。インキュベート後、５００μＬの停止緩衝液を添加することによって反応を停止させ、続いて１℃で１５分間、１４０００ｒｐｍで遠心分離ステップを行った。特段の記載がない限り、後続のステップは４℃で実施した。停止した翻訳混合物の上清（３００μＬ）を調製したビーズ懸濁液に添加し、揺動プラットフォーム上で３０分間インキュベートした。その後、懸濁液を１３０００ｒｐｍおよび１℃で１０分間遠心分離して、非特異的結合分子を有するビーズを、残りの三元複合体を有する上清から分離した。プレパンニングした上清（３００μＬ）を新しい２ｍＬ反応管に移し、予めＷＢでブロッキングし、さらに使用するまで氷上に保った。標的（組換えビオチン化ｃＴｎＴ）を、２ｎＭ～５０ｎＭの範囲の最終濃度で３００μＬのプレパンニングした上清に添加した。選択圧を上げるために、ビオチン化ｃＴｎＴ濃度をサイクルごとに低下させた。懸濁液を揺動プラットフォーム上で３０分間インキュベートした。溶液パンニングステップによって、ビオチン化ｃＴｎＴと三元複合体との間の特異的結合が可能になった。標的ｃＴｎＴに結合した三次複合体を、２０分間のインキュベートステップにおいてストレプトアビジンビーズによって捕捉した。サイクルＩＩでは、非特異的結合を防ぐために、ストレプトアビジンビーズの代わりにアビジンビーズを使用した。

洗浄ステップは、結合した標的三元複合体を有するビーズを磁場中で捕捉し、続いて上清を除去することを含む。ビーズを５００μＬの氷冷ＷＢで洗浄した。洗浄ステップの時間を５分から１時間に延長することによって、その後のディススプレイサイクルにおける選択圧を上昇させた。最終洗浄ステップを使用して、ビーズを新しいブロックされた２ｍＬ反応管に移した。続いて、ビーズを磁場で捕捉し、上清を除去した。ＥＤＴＡを含有する１×ＥＢ１００μＬを添加し、振盪しながら１０分間インキュベートすることによって、以下の溶出ステップを実施した。ｍＲＮＡは三元複合体から放出された。その後、溶出混合物を１℃で１０分間、１４０００ｒｐｍで遠心分離した。ＲＮｅａｓｙＭｉｎＥｌｕｔｅクリーンアップキット（Ｑｉａｇｅｎ）を製造者の指示にしたがって使用して、濃縮ＲＮＡを単離および精製した。ＲＮＡを、１６μＬのＲＮａｓｅを含まない水を用いて溶出させた。選択ステップからの残存ＤＮＡを消化するために、Ａｍｂｉｏｎ ＤＮＡ－ｆｒｅｅ^（商標）キットを製造者の指示にしたがって使用した。残存しているＤＮＡは、その後のＰＣＲ反応で増幅することができない。ＤＮａｓｅ不活性化後、懸濁液を１３０００ｒｐｍおよび室温で２分間遠心分離した。上清（５０μＬ）を氷上の新しい１．５ｍＬ反応管に移した。精製ＲＮＡを直ちに逆転写（ＲＴ）に使用した。残存している上清を－８０℃で保存した。

溶出したｍＲＮＡをｃＤＮＡに逆転写した。パンニングステップにおいて標的を含む２つの反応を試料Ｔに対して設定した。試料ＢＧおよび水を含む陰性対照についてさらに２つの反応を調製した。試料の数に応じてマスター混合物を調製し、プレミックスを氷上の０．２ｍＬ反応管に分配した。各反応液に１２μＬの溶出ＲＮＡおよび０．５μＬの逆転写酵素を接種した。陰性対照は、ＲＮＡの代わりに１２μＬのＲＮａｓｅ非含有水を用いて実施した。ＰＣＲサーモサイクラーにおいてて６５℃で４５分間逆転写を行った。次いで、ｃＤＮＡ試料を氷上で５分間インキュベートし、以下のステップで増幅した。コントロール試料は－２０℃で保存した。２つのＰＣＲ反応を実施した：プライマーＦｒｔおよびＲｒｔを用いて第１のＰＣＲ「ＲＴでのＰＣＲ」を行い、選択プールのｃＤＮＡを増幅した。インビトロ転写／翻訳のための調節エレメントを再付着させるために、プライマーＦ１ＡおよびＲ１Ａを使用した第２のＰＣＲ「ＲＴ－ＰＣＲでのＰＣＲ」を適用した。両方の反応をＰｗｏ ＤＮＡポリメラーゼを用いて行った。

十分な選択プールのＤＮＡ濃度を提供するために、試料ＴおよびＢＧのそれぞれについて４つの反応を設定した。

さらに、４つの対照試料を設定した。最初の２つの試料は、試料ＴおよびＢＧのｍＲＮＡ単離後のＤＮＡ消化物に由来し、潜在的に残存しているＤＮＡを増幅するためにＰＣＲによって検証した。第３および第４は、ＲＴの陰性対照およびＰＣＲグレードの水を使用した「ＲＴでのＰＣＲ」の陰性対照であった。

ＴのＰＣＲ産物を、ＱＩＡｑｕｉｃｋゲル抽出キットを用いて分取１％アガロースゲルから精製し、続いて定量し、「ＲＴ－ＰＣＲでのＰＣＲ」の鋳型として使用した。選択プールの３つの反応物およびＤＮＡ鋳型の代わりにＰＣＲグレードの水を用いた１つの陰性対照を調製した。各反応について、２５０ｎｇの予め精製した「ＲＴでのＰＣＲ」を使用した。ＰＣＲ産物を、ＱＩＡｑｕｉｃｋゲル抽出キットを用いて１％分取アガロースゲルから精製し、その後のディスプレイサイクルに使用するか、または適切な発現系へのサブクローニングのためにさらに改変した。

実施例４：濃縮結合剤のペリプラズム発現
濃縮されたＦａｂ結合剤を単離するために、変異マウス可変ＨＣを、ＦａｂのマウスＣＨ１ドメイン、マウスＶＬドメインおよびマウスＣＬドメインを含むｐ６０ｒｃ＿ＴｎＴ Ｍ－１１－７発現ベクター（図２参照）にクローニングした。鋳型ＤＮＡは、フォワードプライマー５’－ＧＣＴＡＣＡＡＡＣＧＣＧＴＡＣＧＣＴＡＴＧＣＡＧＡＴＴＣＡＧＣＴＧＧＴＧＣＡＧＡＧＣＧ－３’（配列（ＳＥＤ ＩＤ）番号９４）とリバースプライマーＲｒｔ ５’－ＧＧＡＡＡＧＣＣＴＣＴＧＡＧＧＡＣＣＡＧＣＡＣＧＧＡＴＧＣＣＣＴＧＴＧＣ－３’（配列番号８７）を用いてＰＣＲにより増幅した。選択プールをＢｓｉＷＩおよびＫｐｎＩ制限部位を介して発現ベクターにクローニングした。ペリプラズム発現を９６ウェルディープウェルブロック（ＤＷＢ）で行った。Ｉｎｔｅｇｒａ ＶＩＡＦｌｏ９６を使用して、前培養（「マスター」）ＤＷＢに１ウェルあたり１ｍＬ ＬＢ（１００μｇ／ｍＬアンピシリン）を充填し、先に実施したサブクローニングおよび形質転換の単離クローンを接種した。選択プールあたり約２００コロニー（サイクルＩＩＩ、ＩＶ、Ｖ）を選んだ。１ウェルを陰性対照として接種せずに残し、他のウェルに、陽性対照としてＴｎＴ Ｍ－１１－７（野生型）Ｆａｂ発現ベクターを形質転換したＸＬ１ ｂｌｕｅを接種した。ＤＷＢを空気透過性膜で密封し、オービタルシェーカーインキュベーター（７５０ｒｐｍ）中、３０℃で一晩インキュベートした。続いて、マスターＤＷＢの各ウェルからの５０μＬを、１１５０ｍＬのＣ．Ｒ．Ａ．Ｐ培地（１００μｇ／ｍＬアンピシリン）／ウェルで調製された、Ｓｉｍｍｏｎｓ，Ｌ．Ｃ．，Ｒｅｉｌｌｙ，Ｄ．，Ｋｌｉｍｏｗｓｋｉ，Ｌ．，Ｒａｊｕ，Ｔ．Ｓ．，Ｍｅｎｇ，Ｇ．，Ｓｉｍｓ，Ｐ．，Ｈｏｎｇ，Ｋ．，Ｓｈｉｅｌｄｓ，Ｒ．Ｌ．，Ｄａｍｉｃｏ，Ｌ．Ａ．，Ｒａｎｃａｔｏｒｅ，Ｐ．＆Ｙａｎｓｕｒａ，Ｄ．Ｇ．（２００２）「Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ｆｕｌｌ－ｌｅｎｇｔｈ ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎｓ ｉｎ Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ：ｒａｐｉｄ ａｎｄ ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ ａｇｌｙｃｏｓｙｌａｔｅｄ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ」、Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ ２６３，１３３－４７によって記載された新しい「発現」ＤＷＢに移した。ＤＷＢを空気透過性膜で密封し、オービタルシェーカーインキュベーター中、３０℃で一晩インキュベートした。Ｆａｂ発現の誘導は、リン酸制限Ｃ．Ｒ．Ａ．Ｐ培地を用いたｐｈｏＡプロモーターに基づく。２４時間後、発現したＦａｂを有する細胞を４０００ｒｐｍ、１０分間の遠心分離によって回収し、さらなる使用まで－２０℃で保存した。

４０％グリセロール９５０μＬを添加し、－８０℃で保存することにより、「グリセロールストック」に前培養マスターＤＷＢを使用した。密封したＤＷＢを５分間激しくボルテックスし、室温でさらに１０分間振盪することによって、細胞ペレットを５０μＬのＢ－ＰＥＲＩＩ Ｂａｃｔｅｒｉａｌ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ Ｒｅａｇｅｎｔ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）に再懸濁した。細胞溶解物を９５０μＬのトリス緩衝液（２０ｍＭトリスｐＨ７．５、１５０ｍＭ ＮａＣｌ）で希釈し、１０分間インキュベートした後、遠心分離した（１０分、４０００ｒｐｍ）。粗製細胞抽出物を含有する発現ブロックを、ＥＬＩＳＡまたはＳＰＲ動態研究でさらに使用するまで４℃に保った。

実施例５：ＥＬＩＳＡスクリーニング
詳細なＢｉａｃｏｒｅ分析のための最良の変異体Ｆａｂ結合剤を明らかにするために、以前の酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）を実施した。ＥＬＩＳＡ設定を図３に示す。ビオチン化組換え心筋トロポニンＴ（１００ｎＭ）を、オービタルシェーカーで振盪することによって室温で１時間、ストレプトアビジン９６ウェルプレート中で捕捉した。抗原トロポニンＴを１００μＬのＩＰ緩衝液（ＰＢＳ ｐＨ７．３、１％ ＢＳＡ）に希釈した。続いて、マイクロプレートウォッシャーＢｉｏＴｅｋ ＥＬｘ ４０５ Ｓｅｌｅｃｔを使用して、ウェルを３００μＬの１×洗浄緩衝液（１５０ｍＭ ＮａＣｌ、０．０５％ Ｔｗｅｅｎ２０、０．２％ Ｂｒｏｎｉｄｏｘ）で３回洗浄した。洗浄後、変異抗ｃＴｎＴ Ｆａｂ結合剤を含む粗製大腸菌細胞抽出物をＩＰ緩衝液で１：４に希釈し、トロポニンＴ捕捉ウェルに移した。再び、ウェルを３００μＬの１×洗浄緩衝液で３回洗浄した。ヤギで産生された抗マウスＩｇＧ（Ｆａｂ特異的）ペルオキシダーゼ標識抗体（検出抗体）を１：４０ ０００希釈（ＩＰ緩衝液中）で使用して、トロポニンＴに結合した変異Ｆａｂフラグメントを検出した。ウェルを３００μＬの１×洗浄緩衝液で再び３回洗浄して、非結合検出抗体を除去した。マイクロプレートをウェルあたり１００μＬのＡＢＴＳと共に室温で３０分間インキュベートした。マイクロプレートリーダーＢｉｏＴｅｋ Ｐｏｗｅｒ ｗａｖｅ ＸＳを４０５ｎｍに設定して光学密度を測定した。親抗ｃＴｎＴ抗体の野生型Ｆａｂを陽性対照として使用した。最初のヒットを同定し、その粗製細胞抽出物を動態分析に供した。

実施例６：ＳＰＲに基づく機能分析
ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ ８ｋ機器で３７℃において詳細な動態調査を行った。Ｂｉａｃｏｒｅ ＣＭ－５シリーズＳセンサーを機器に取り付け、製造者の指示にしたがってプレコンディショニングした。系緩衝液は、ＨＢＳ－ＥＴ（１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．４）、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、１ｍＭ ＥＤＴＡ、０．０５％（ｗ／ｖ）Ｔｗｅｅｎ（登録商標）２０）であった。試料緩衝液は、１ｍｇ／ｍｌのＣＭＤ（カルボキシメチルデキストラン、Ｆｌｕｋａ）を追加した系緩衝液であった。一実施形態において、ＣＭ５バイオセンサー上に抗マウスＦａｂフラグメント捕捉系を確立した。ウサギポリクローナルｐＡｂ抗Ｍ－ＩｇＧ、Ｆ（ａｂ’）２フラグメント（カタログ番号３１５－００５－０４７、Ｊａｃｋｓｏｎ Ｉｍｍｕｎｏ Ｒｅｓｅａｒｃｈ）を、ＮＨＳ／ＥＤＣ化学を使用して製造者の指示にしたがって固定化した。５μｌ／分で、１０ｍＭの酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ５．０）中３０μｇ／ｍｌのＲＡＭＦ（ａｂ’）２を各フローセル上に１０．０００ＲＵで固定化した。その後、センサーを１ＭのエタノールアミンｐＨ８．５で飽和させた。マウス抗ＴｎＴ抗体Ｆａｂ’フラグメントを、記載されるように大腸菌細胞でペリプラズム的に発現させ、公知の方法によって溶解した（技術的詳細については、Ａｎｄｅｒｓｅｎ，Ｄ．Ｃ．＆Ｒｅｉｌｌｙ，Ｄ．Ｅ．（２００４）；Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ ｆｏｒ ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ａｎｄ ｔｈｅｉｒ ｆｒａｇｍｅｎｔｓ（Ｃｕｒｒ Ｏｐｉｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ１５、４５６～６２参照）。溶解物を試料緩衝液で１：２０に希釈した。Ｆａｂ’フラグメントをバイオセンサー測定セル上の発現溶解物から５μｌ／分の流速で２分間捕捉し、続いて２０μｌ／分の１０倍濃縮ＨＢＳ－ＥＰ緩衝液で１５秒間の洗浄ステップを行った。応答単位（ＲＵ）におけるＦａｂフラグメント捕捉レベル（ＣＬ）をモニターした。組換えヒトＴｎＴ（Ｒｏｃｈｅ、３７ｋＤａ）を試料緩衝液で３０ｎＭに希釈し、０ｎＭ、３０ｎＭ、１０ｎＭ、３．３ｎＭ、１．１ｎＭ、０．３７ｎＭのＴｎＴ濃度で濃度系列を作成した。分析物濃度系列を８０μｌ／分で３分間の会合相に注入し、解離相を５分間モニターした。分析物会合相の終わりに、応答単位（ＲＵ）中の「結合遅延」（ＢＬ）という報告点をモニターした。動態速度決定の各サイクルの後、１０倍濃縮ＨＢＳ－ＥＰ緩衝液の１５秒間の注入、続いて２０μｌ／分での１００ｍＭ ＨＣｌの２回の１分間の注入によって、捕捉系を再生した。ｃＴｎＴ分析物の動態パラメータｋａ［１／Ｍｓ］、ｋｄ［１／ｓ］、ｔ１／２ ｄｉｓｓ［分］、ＫＤ［Ｍ］および結合化学量論（モル比）（詳細については、Ｓｃｈｒａｅｍｌ，Ｍ．＆Ｂｉｅｈｌ，Ｍ．（２０１２）Ｋｉｎｅｔｉｃ ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ ｉｎ ｔｈｅ ａｎｔｉｂｏｄｙ ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ｐｒｏｃｅｓｓ．Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ ９０１，１７１－８１を参照されたい）を、製造者の指示にしたがって、Ｂｉａｅｖａｌｕａｔｉｏｎ Ｓｏｆｔｗａｒｅ（ＧＥ ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を用いて各Ｆａｂフラグメント変異体について決定した。動態パラメータは、ＨＣ ＣＤＲ３変異と相関していた。

表２中の略語：ｋａ：会合速度定数［Ｍ－１ ｓ－１］、ｋｄ：解離速度定数［ｓ－１］、ＫＤ：解離平衡定数ＫＤ［Ｍ］、ｔ／２－ｄｉｓｓ：複合体半減期、ｌｎ（２）／ｋｄ＊６０［分］、ＷＴ＝親（野生型）、Ｆａｂ＝所与のアミノ酸置換を伴わない（ＷＴ）または伴うＨＣ ＣＤＲ３を含むＦａｂフラグメント

Ｆａｂフラグメント誘導体内で、ｍＡｂ＜ＴｎＴ＞ｒＭ－１１－７ Ｆａｂ Ａ１０２Ｗは、最も高い分析物複合体安定性および野生型アナログ会合速度を示す（表２参照）。上記の表２からも分かるように、驚くべきことに、Ａ１０２Ｗ（アラニン（Ａ）のトリプトファン（Ｗ）への置換を有するアミノ酸位置１０２）の置換のみが、親和性の強い増加をもたらす。この変異体Ｆａｂフラグメントの野生型または他の変異体と比較して改善された特性は、それぞれ図４および図５からも容易に明らかになる。

実施例７：ＨＥＫ細胞における抗体Ｆａｂフラグメントの発現
ＳＰＲスクリーニング後、マウスＦａｂフラグメントリード候補抗体を標準的な細胞培養手順にしたがって産生させた。対応するベクターおよびクローニングプロセスは、Ｎｏｒｄｅｒｈａｕｇら、Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ．１９９７ Ｍａｙ１２；２０４（１）：７７－８７に記載されている。

重鎖および軽鎖をコードするｃＤＮＡを、ヒトサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）前初期エンハンサー／プロモーター領域の下流で、ＢＧＨポリアデニル化シグナルを続けて、別々のベクターにクローニングした。

懸濁液適合ヒト胎児由来腎臓ＦｒｅｅＳｔｙｌｅ ２９３－Ｆ細胞株（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を抗体の一過性遺伝子発現（ＴＧＥ）に使用した：製造者のガイドラインにしたがって、ＰＥＩｐｒｏ（Ｐｏｌｙｐｌｕｓ－トランスフェクションＳＡ、Ｓｔｒａｓｂｏｕｒｇ）トランスフェクション試薬によって複合体化された等量の両発現プラスミド（合計０．７ｍｇ／Ｌ細胞培養物）を用いて、細胞を約２×１０Ｅ６生存細胞／ｍｌでトランスフェクションした。トランスフェクションの３時間後、発現を増強するために、ＨＤＡＣ阻害剤であるバルプロ酸を添加した（最終濃度：４ｍＭ）。毎日、培養物に６％（ｖ／ｖ）のダイズペプトン加水分解物ベースの飼料を添加した。トランスフェクションの７日後、培養上清を遠心分離によって回収し、抗体を標準的な手順にしたがってそこから精製した。ｍＡｂ＜ＴｎＴ＞ｒＭ－１１－７（Ａ１０２Ｗ）－Ｆａｂ（ＩｇＧ１）－Ｑｔａｇ－Ｂｉフラグメントを公知の方法によって細胞培養上清から精製し、記載されているようにＫｕｔｚｎｅｒｉａ ａｌｂｉｄａトランスグルタミナーゼを使用してビオチンに部位特異的にコンジュゲートした（Ｓｔｅｆｆｅｎら、ＪＢＣ，Ｓｅｐｔ．２２，２９２，１５６２２－１５６３５，２０１７）。

実施例８：ＥＣＬ測定
抗体ＦａｂフラグメントｍＡｂ＜ＴｎＴ＞ｒＭ－１１－７（Ａ１０２Ｗ）－Ｆａｂ（ＩｇＧ１）－Ｑｔａｇをビオチン化Ｆａｂフラグメント、すなわち実施例７によるｍＡｂ＜ＴｎＴ＞ｒＭ－１１－７（Ａ１０２Ｗ）－Ｆａｂ（ＩｇＧ１）－Ｑｔａｇ－Ｂｉとして産生し、サンドイッチイムノアッセイで試験した（図６参照）。ＦａｂフラグメントｍＡｂ＜ＴｎＴ＞ｒＭ－１１－７（Ａ１０２Ｗ）－Ｆａｂ（ＩｇＧ１）－Ｑｔａｇ－Ｂｉを、市販のＲｏｃｈｅ Ｅｌｅｃｓｙｓ（登録商標）アッセイ、カタログ番号０５０９２７４４１９０（Ｒｏｃｈｅ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ ＧｍｂＨ、マンハイム、ドイツ）に含まれるようなＭＡＢ１１－７のビオチン化野生型Ｆａｂフラグメント（すなわち、配列番号１６のＣＤＲ３を含む）と比較した。これらのビオチン化試薬を、対応するアッセイプロトコルの試薬１（Ｒ１）として使用した。ルテニウム化検出抗体は、Ｒｏｃｈｅ Ｅｌｅｃｓｙｓ（登録商標）アッセイ、カタログ番号０５０９２７４４１９０（Ｒｏｃｈｅ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ ＧｍｂＨ、マンハイム、ドイツ）に含まれるものであった。ルテニウム化検出抗体は、Ｅｌｅｃｓｙｓ（登録商標）Ｒ２試薬に対応する。

トロポニンＴ ｈｓアッセイプロトコルを使用した、ブランク対照（Ｄｉｌｕｅｎｔ Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ，Ｉｄ．１１７３２２７７１２２，Ｄｉｌｕｅｎｔ Ｍｕｌｔｉ Ａｓｓａｙ，Ｉｄ．０３６０９９８７１７０，Ｒｏｃｈｅ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ ＧｍｂＨ、マンハイム、ドイツ）、トロポニンＴ ｈｓ ＣａｌＳｅｔ（Ｉｄ．０５０９２７５２１９０，Ｒｏｃｈｅ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ ＧｍｂＨ、マンハイム、ドイツ）からのＣａｌ１およびＣａｌ２と共に、トロポニンＴ ｈｓアッセイプロトコルを使用して、コーバスＥ１７０モジュールで測定を実施した。

アッセイは、コーバスｅ分析装置のアッセイプロトコル２に従い、試料、Ｒ１およびＲ２を第１のステップで９分間のインキュベートのために混合した後、ストレプトアビジンコーティングされた磁気ビーズを第２のステップでさらに９分間のインキュベートのために添加する。これに続いて、予備洗浄ステップが行われ、ここで、結合した免疫複合体を有するビーズは、反応キュベットの底部に磁気によって集束され、上清がＰｒｅｃｌｅａｎ Ｓｏｌｕｔｉｏｎ（Ｒｏｃｈｅカタログ番号０３００４８９９１９０）によって２回置換された後、混合物全体が測定セルに運ばれて、ビーズ上に構築された免疫複合体のＥＣＬシグナルが測定される。実行に使用したＲ１試薬（Ｂｉコンジュゲート）は、それぞれ、元の市販のＴＮＴ－ＨＳアッセイのもの、または２．５μｇ／ｍｌでＴＮＴ Ｒ１緩衝液中のｍＡｂ＜ＴｎＴ＞ｒＭ－１１－７（Ａ１０２Ｗ）－Ｆａｂ（ＩｇＧ１）－Ｑｔａｇ－Ｂｉを含むＲ１試薬のいずれかであった。

ルテニウム化（検出）抗体は、Ｒｏｃｈｅ Ｅｌｅｃｓｙｓ（登録商標）アッセイ、カタログ番号０５０９２７４４１９０（Ｒｏｃｈｅ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ ＧｍｂＨ、マンハイム、ドイツ）に含まれるものであった。ルテニウム化検出抗体は、Ｅｌｅｃｓｙｓ（登録商標）Ｒ２試薬に対応する。

Ｅｌｅｃｓｙｓ（登録商標）ストレプトアビジンコーティング磁気ビーズを常にＲ１およびＲ２試薬ボトルの１つと組み合わせて使用した。測定された試料には、試料希釈剤（Ｄｉｌｕｅｎｔ Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ＝緩衝液ブランク）およびＴｎＴ Ｅｌｅｃｓｙｓ（登録商標）アッセイの市販のキャリブレータ（Ｃａｌ１（約１８ｐｇ／ｍｌ ｒｅｃＴｎＴ）およびＣａｌ２（約４２００ｐｇ／ｍｌ ｒｅｃＴｎＴ））が含まれていた。

例示的な結果を図７に示す。図７から分かるように、変異抗体ｍＡｂ＜ＴｎＴ＞ｒＭ－１１－７（Ａ１０２Ｗ）を使用すると、ブランク値は９５４カウント（親）から７７７カウント（Ａ１０２Ｗ）に減少した。Ｃａｌ－１シグナルレベルは、１４３２カウント（親）から２４６０カウント（Ａ１０２Ｗ）に１．７倍増加した。Ｃａｌ－２カウントレベルは、５４６６０２（親）から９８０４３２（Ａ１０２Ｗ）カウントに１．８倍増加する。シグナル対ノイズ比はアッセイ動態および感度の増加を判断するための最も重要なパラメータであるため、驚くべきことに、新規（変異体）抗体全体が約２倍の感度の増加をもたらすことが示され得る。

Claims (15)

1. ヒト心筋トロポニンＴ（配列番号１）に特異的に結合する抗体であって、ＣＤＲが、以下のアミノ酸配列または最大で１つのアミノ酸置換において異なるそのバリアントを含むことを特徴とする抗体：
   （ｉ）軽鎖可変ドメイン中の、配列番号２のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、配列番号３のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２、および配列番号４のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３、ならびに
   （ｉｉ）重鎖可変ドメイン中の、配列番号５のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、配列番号６のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２、および配列番号７のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３。
2. 前記軽鎖可変ドメインが、配列番号２の前記アミノ酸配列のＣＤＲ１、配列番号３の前記アミノ酸配列のＣＤＲ２、および配列番号４の前記アミノ酸配列のＣＤＲ３、またはＣＤＲ１つあたり最大でも１つのアミノ酸置換において異なるこれらのＣＤＲの１つまたは複数のバリアントを含み、前記重鎖可変ドメインが、請求項１の（ｉｉ）に記載のＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３を含む、請求項１に記載の抗体。
3. ヒト心筋トロポニンＴ（配列番号１）に特異的に結合する抗体であって、ＣＤＲが、
   （ｉ）軽鎖可変ドメイン中の、配列番号２のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、配列番号３のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２、および配列番号４のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３、ならびに
   （ｉｉ）重鎖可変ドメイン中の、配列番号５のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、配列番号６のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２、および配列番号７のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３を含むことを特徴とする、抗体。
4. ヒト心筋トロポニンＴ（配列番号１）に特異的に結合する抗体であって、
   前記抗体が、式Ｉ：
   ＦＷ（ＬＣ）１－ＣＤＲ（ＬＣ）１－ＦＷ（ＬＣ）２－ＣＤＲ（ＬＣ）２－ＦＷ（ＬＣ）３－ＣＤＲ（ＬＣ）３－ＦＷ（ＬＣ）４（式Ｉ）に表されるフレームワーク領域（ＦＷ）およびＣＤＲからなる軽鎖可変ドメイン、および式ＩＩ：
   ＦＷ（ＨＣ）１－ＣＤＲ（ＨＣ）１－ＦＷ（ＨＣ）２－ＣＤＲ（ＨＣ）２－ＦＷ（ＨＣ）３－ＣＤＲ（ＨＣ）３－ＦＷ（ＨＣ）４（式ＩＩ）に表されるＦＷおよびＣＤＲからなる重鎖可変ドメインを含み、
   前記ＦＷが、
   軽鎖中に、
   ＦＷ（ＬＣ）１ 配列番号８のアミノ酸配列；
   ＦＷ（ＬＣ）２ 配列番号９のアミノ酸配列；
   ＦＷ（ＬＣ）３ 配列番号１０のアミノ酸配列；
   ＦＷ（ＬＣ）４ 配列番号１１のアミノ酸配列；および
   重鎖中に、
   ＦＷ（ＨＣ）１ 配列番号１２のアミノ酸配列；
   ＦＷ（ＨＣ）２ 配列番号１３のアミノ酸配列；
   ＦＷ（ＨＣ）３ 配列番号１４のアミノ酸配列；
   ＦＷ（ＨＣ）４ 配列番号１５のアミノ酸配列、を含むかまたはそれと少なくとも８５％同一であるそのバリアントを含み、
   前記ＣＤＲが、請求項１に定義される配列または最大でも１つのアミノ酸置換において異なるそのバリアントを含む、抗体。
5. 式Ｉ：
   ＦＷ（ＬＣ）１－ＣＤＲ（ＬＣ）１－ＦＷ（ＬＣ）２－ＣＤＲ（ＬＣ）２－ＦＷ（ＬＣ）３－ＣＤＲ（ＬＣ）３－ＦＷ（ＬＣ）４（式Ｉ）
   に表されるフレームワーク領域（ＦＷ）およびＣＤＲからなる軽鎖可変ドメイン、および式ＩＩ：
   ＦＷ（ＨＣ）１－ＣＤＲ（ＨＣ）１－ＦＷ（ＨＣ）２－ＣＤＲ（ＨＣ）２－ＦＷ（ＨＣ）３－ＣＤＲ（ＨＣ）３－ＦＷ（ＨＣ）４（式ＩＩ）に表されるＦＷおよびＣＤＲからなる重鎖可変ドメインを含み、
   前記ＣＤＲが請求項４に定義される配列を含み、前記ＦＷが、
   軽鎖中に、
   ＦＷ（ＬＣ）１ 配列番号８のアミノ酸配列；
   ＦＷ（ＬＣ）２ 配列番号９のアミノ酸配列；
   ＦＷ（ＬＣ）３ 配列番号１０のアミノ酸配列；
   ＦＷ（ＬＣ）４ 配列番号１１のアミノ酸配列；および
   重鎖中に、
   ＦＷ（ＨＣ）１ 配列番号１２のアミノ酸配列；
   ＦＷ（ＨＣ）２ 配列番号１３のアミノ酸配列；
   ＦＷ（ＨＣ）３ 配列番号１４のアミノ酸配列；
   ＦＷ（ＨＣ）４ 配列番号１５のアミノ酸配列、を含むかまたはそれと少なくとも８５％同一であるそのバリアントを含む、請求項４に記載の抗体。
6. ３７℃において、ｔ／２－ｄｉｓｓが１０分以上である、請求項１から５のいずれかに記載の抗体。
7. （ｉ）配列番号２７のアミノ酸配列からなる軽鎖可変ドメインと少なくとも８５％同一のアミノ酸配列からなる軽鎖可変ドメイン、および
   （ｉｉ）配列番号２８の重鎖可変ドメインと少なくとも８５％同一であるアミノ酸配列からなる重鎖可変ドメインを含み、
   ヒト心筋トロポニンＴと特異的に結合し、３７℃におけるｔ／２－ｄｉｓが１０分以上である、抗体。
8. （ｉ）配列番号２７のアミノ酸配列からなる軽鎖可変ドメインと少なくとも８５％同一のアミノ酸配列からなる軽鎖可変ドメイン、および
   （ｉｉ）配列番号２８の重鎖可変ドメインと少なくとも８５％同一であるアミノ酸配列からなる重鎖可変ドメインを含み、
   前記重鎖のＣＤＲが、請求項１に定義されたものからなり、
   ヒト心筋トロポニンＴと特異的に結合し、３７℃におけるｔ／２－ｄｉｓが１０分以上である、抗体。
9. （ｉ）配列番号２７のアミノ酸配列からなる軽鎖可変ドメインと少なくとも８５％同一のアミノ酸配列からなる軽鎖可変ドメイン、および
   （ｉｉ）配列番号２８のアミノ酸配列の重鎖可変ドメインを含む抗体であって、
   前記６つのＣＤＲが、請求項１に定義されたとおりであり、
   ヒト心筋トロポニンＴと特異的に結合し、３７℃におけるｔ／２－ｄｉｓが１０分以上である、抗体。
10. （ｉ）配列番号２７のアミノ酸配列からなる軽鎖可変ドメイン、および
    （ｉｉ）配列番号２８のアミノ酸配列からなる重鎖可変ドメインを含む、抗体。
11. 請求項１から１０のいずれか一項に記載の軽鎖可変領域をコードする核酸分子。
12. 請求項１から１０のいずれか一項に記載の重鎖可変領域をコードする核酸分子。
13. 請求項１１および／または請求項１２に記載の核酸分子を含む、ベクター。
14. （ｉ）請求項１から１０のいずれか一項に記載の抗体、
    （ｉｉ）請求項１１または１２に記載の核酸分子、および／または
    （ｉｉｉ）請求項１３に記載のベクター、の少なくとも１つを含む、組成物。
15. ヒト心筋トロポニンＴ（配列番号１）を測定する方法であって、請求項１から１０のいずれか一項に記載の抗体のヒト心筋トロポニンＴへの結合を検出することを含む、方法。
    

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